JP2001270829A

JP2001270829A - 平滑筋細胞増殖促進剤

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Publication number: JP2001270829A
Application number: JP2000083637A
Authority: JP
Inventors: Yoji Mitsui; 洋司三井; Yasuo Tanaka; 靖生田中; Katsukiyo Sakurai; 勝清桜井; Yoji Onuki; 洋二大貫
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Seikagaku Corp
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Seikagaku Corp
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2001-10-02
Anticipated expiration: 2020-03-24
Also published as: JP4587148B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】優れた平滑筋細胞増殖促進剤及びこれを含
む血管新生促進剤の提供。【解決手段】硫酸基を有するグリコサミノグリカンの
混入量が０．０１％以下であり、平均分子料が１，００
００〜８，０００であるヒアルロン酸又はその薬理学的
に許容されうる塩を有効成分として含む平滑筋細胞の増
殖促進剤。【効果】本薬剤の平滑筋増殖促進活性成分は、糖尿病
性末梢血管傷害などの循環器疾病の処置剤（治療、予
防、進行抑制剤）、組織修復、創傷治癒促進等を目的と
した医薬として利用することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒアルロン酸又は
その薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含有す
る平滑筋細胞増殖促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血管の主な構成細胞は血管内皮細胞とそ
れを取り囲み、強度を維持する平滑筋細胞及び線維芽細
胞である。

【０００３】ヒアルロン酸が血管内皮細胞の増殖に影響
を及ぼすことが知られている。すなわち、ヒアルロン酸
は血管内皮細胞の増殖を抑制することが知られている
（特許第2667441号）。一方、低分子のヒアルロン酸（3
〜16糖）は、生体内で血管新生を促進し、また血管内皮
細胞の増殖を生体外で促進するが、平滑筋細胞に対して
は増殖促進効果を示さないことがExp. Cell Res. 1989
Jul;183(1):179-196に記載されているので、上述の血管
新生促進作用によって生じた血管は、血管内皮細胞を裏
打ちする平滑筋細胞の増殖が少なく外力に弱い血管であ
ると考えられていた。更に、3〜25のジサッカライドの
繰り返し単位で構成されるヒアルロン酸をリポソームの
表面に配した血管新生促進剤が知られている（特開平11
-292758）が、ヒアルロン酸が平滑筋細胞増殖を促進す
る活性を有することは何ら教示していない。

【０００４】また、硫酸基を有するグリコサミノグリカ
ン（ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケ
ラタン硫酸など；以下、硫酸化グリコサミノグリカンと
いう）は、平滑筋細胞の増殖を抑制することが知られて
いる（Microvasc Res 1986 Jan; 31 (1): 41-53）。

【０００５】一方、血管新生作用を有する種々の薬剤が
知られているが、これらの多くは血管内皮細胞の増殖を
促進し、平滑筋細胞増殖作用が不十分であるため、血管
新生促進剤として実用的に使用しうる平滑筋細胞増殖促
進剤が求められていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上述のごとく、平滑筋
細胞増殖促進剤及び平滑筋細胞の増殖を促進する活性に
基づき強靱な血管の新生を促進する血管新生促進剤が期
待されていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
の解決を鑑みて鋭意検討を重ねた結果、従来、平滑筋細
胞の増殖を促進することが知られていなかったヒアルロ
ン酸が、医薬品に使用する程度の純度であれば、平滑筋
細胞増殖促進活性があることを見いだし、平滑筋細胞増
殖促進剤及び平滑筋細胞増殖促進活性に基づく血管新生
促進剤として利用可能であることを見いだした。

【０００８】すなわち、本発明の要旨は以下の通りであ
る。（１）ヒアルロン酸又はその薬学的に許容されうる塩
を有効成分として含有する平滑筋細胞増殖促進剤。（２）前記ヒアルロン酸の重量平均分子量が1,000〜
8,000である（１）記載の平滑筋細胞増殖促進剤。（３）有効成分とするヒアルロン酸への硫酸化グリコ
サミノグリカンの混入量が、硫黄含量の電量滴定におい
て0.01%以下に相当する量であることを特徴とする
（１）又は（２）記載の平滑筋細胞増殖促進剤。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を発明の実施の形態
により詳説する。

【００１０】本発明薬剤はヒアルロン酸又はその薬学的
に許容される塩を有効成分とする平滑筋細胞増殖促進剤
及びこれを含む血管新生促進剤である。

【００１１】ヒアルロン酸は遊離型であっても良いが医
薬の有効成分として使用する際は、薬学的に許容されう
る塩の形態で使用することが好ましい。ヒアルロン酸の
薬学的に許容されうる塩としては、アルカリ金属塩（ナ
トリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩
（マグネシウム塩、カルシウム塩など）及び四級アンモ
ニウム塩等が挙げられるが、その中でもアルカリ金属塩
が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。以下の説明
において、「ヒアルロン酸」とは、特に断らない限りこ
の様な塩も包含する広義の用語として使用する。

【００１２】本明細書中において平滑筋細胞増殖促進活
性を有するとは、実施例記載の平滑筋細胞培養法に従っ
て培養する際、培地に薬剤を添加した場合に、薬剤を添
加しない対照と比較して細胞数を増加させる活性、又は
細胞内でのＤＮＡの複製を促進する活性等を指称する。
細胞数は例えば公知の細胞数の計数法を用いて計数する
方法により、ＤＮＡの複製は、ラジオアイソトープで置
換したチミジンなどの核酸の合成に必要とされる物質の
取り込み量等を測定する方法などによって測定すること
ができる。

【００１３】ヒアルロン酸としては、鶏冠、動物の臍
帯、皮膚又は硝子体由来、或いは微生物由来のヒアルロ
ン酸（特公昭61-8083、特公昭61-60081、特公昭61-2134
1、特公平6-8323、米国特許4,141,973、米国特許5,449,
104、米国特許4,946,780、米国特許4,780,414参照）を
使用することが可能であるが、特に医薬品として使用さ
れるヒアルロン酸と同等の純度を有するヒアルロン酸が
好ましい。

【００１４】本発明薬剤に使用されるヒアルロン酸の重
量平均分子量は、平滑筋増殖促進作用を有する限り特に
限定はされないが、特に重量平均分子量が1,000〜8,000
のヒアルロン酸を有効成分として用いることが好まし
い。そのようなヒアルロン酸は重量平均分子量数万から
数百万の公知のヒアルロン酸を低分子化することによっ
て調製することができる。ヒアルロン酸の低分子化は、
ヒアルロン酸分解酵素処理や酸処理等の当業者が通常用
いる方法によって容易に行うことができる。前記ヒアル
ロン酸分解酵素はヒアルロン酸を分解することが知られ
ているグリコサミノグリカン分解酵素であれば、リアー
ゼ、加水分解酵素など分解様式のいかんを問わずいずれ
も用いることができ、例えばコンドロイチナーゼABC（P
roteus vulgaris）、微生物（Streptococcus dysgalact
iae、Streptomyces hyalurolyticus等）由来のヒアルロ
ニダーゼ、羊や牛の睾丸由来のヒアルロニダーゼが挙げ
られ特に限定はされないが、牛の睾丸由来のヒアルロニ
ダーゼが最も好ましい。酵素による低分子化に際し、酵
素量及び反応条件と反応前のヒアルロン酸の分子量を適
宜選択、調製することによって、目的とする分子量の低
分子化ヒアルロン酸を調製することが可能である。反応
前及び反応後のヒアルロン酸の分子量は、例えば日本薬
局方の粘度測定法（第十二改正、日本薬局方解説書、B-
310〜321、1991年廣川書店発行）に基づいて極限粘度
を算出し、Laurent, T.C. et al, Biochem Biophys Act
a,42,476(1960)に記載された下記換算式を用いて極限粘
度から算出することができる。

【００１５】

【数１】〔η〕= 0.036・M^0.78 η：極限粘度（dl/
g）、M：分子量上記低分子化反応後、例えば反応液の容量の２〜４倍量
のエタノールを添加してヒアルロン酸を沈殿させた後、
沈殿を回収し、その沈殿を食塩水（0.1%〜5.0%、好まし
くは3%）に溶解して活性炭粉末による精製を１〜４回繰
り返し、最後に溶液の２〜４倍量のエタノールを添加し
て、生じた沈殿を回収して乾燥（風乾、凍結乾燥、減圧
乾燥等）することで、医薬品として使用されているもの
と同等の純度を有するヒアルロン酸を得ることが可能で
ある。

【００１６】本発明薬剤はグリコサミノグリカンとして
は実質的にヒアルロン酸のみを含み、硫酸化グリコサミ
ノグリカンを実質的に含まない。すなわち、試薬等とし
て市販されているヒアルロン酸には、ヘパリン、ヘパラ
ン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタ
ン硫酸等の硫酸基を有するグリコサミノグリカンが混入
していることが多いが、これらの硫酸化グリコサミノグ
リカンは平滑筋細胞増殖を阻害するため、本発明薬剤
は、硫酸化グリコサミノグリカンが混入していないもの
である。硫酸化グリコサミノグリカンのヒアルロン酸中
への混入量はヒアルロン酸中の硫黄含量を測定すること
で算出することが可能である。従って本発明薬剤の有効
成分となるヒアルロン酸は、硫黄含量が電量滴定（Ana
l. Chem.,20(1948),85）において0.03%以下であること
が好ましく、0.01%以下であることが最も好ましい。

【００１７】また、本発明薬剤の有効成分であるヒアル
ロン酸は、上述の通り、硫酸化グリコサミノグリカンを
実質的に含まないが、他の不純物も実質的に含まれてい
ないことが好ましい。具体的には生体や細胞に対して悪
影響を与えることが知られているエンドトキシン含量
が、好ましくは0.1EU（エンドトキシン単位）/10mg以
下、0.03EU/10mg以下であることがより好ましく（エン
ドトキシン試験：日本工業規格(JIS)生化学試薬通則K80
08 4.3による）、ヒアルロン酸の安定性を保つために、
鉄含量が好ましくは40ppm以下、より好ましくは20ppm以
下であり（原子吸光分析：JIS生化学試薬通則K0121によ
る）、生体に対して炎症反応の起因物質となるタンパク
質含量が好ましくは0.2%以下、0.1%以下であることがよ
り好ましい（ローリー法：Lowry, O.C. et al, J Biol.
Chem., 193, 265(1951)による）。

【００１８】本発明薬剤は例えば糖尿病性末梢血管傷害
などの循環器疾病の処置剤（治療、予防、進行抑制
剤）、組織修復、創傷治癒促進等を目的とした医薬とし
て利用することが可能である。また、例えば細胞培養に
おける培地への添加剤、組織エンジニアリング分野にお
ける生体外での組織形成の補助剤としても用いることが
可能である。

【００１９】本発明薬剤は、ヒアルロン酸の他に、緩衝
剤、水、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤な
どを含有することができ、また他の薬効を有する薬剤、
成長因子などと混合して複合的な作用を示す医薬組成物
として、温血動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスタ
ー、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等）へ非経
口的又は経口的に適用しうる医薬とすることが可能であ
る。

【００２０】本発明薬剤には、薬学的に許容される補助
剤、例えばpH調節剤、緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤、安
定化剤、無機塩類、界面活性剤、消泡剤、糖類、糖アル
コールなどを混合してもよい。

【００２１】本発明薬剤を、例えば循環器疾患への適用
を目的とする医薬として使用する場合の剤形としては、
ヒアルロン酸を医薬品に慣用される水性溶媒（例えば蒸
留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水など
が挙げられ、蒸留水又は緩衝液が好ましい）に溶解した
注射剤などが挙げられ、また創傷治癒を目的とする医薬
とするのであれば、錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、
軟膏剤などが挙げられるが、目的の用途で使用可能であ
る限り特に限定はされない。

【００２２】例えば本発明薬剤を血管障害の改善を目的
とする血管新生促進剤として使用する場合は、公知の血
管新生促進剤（例えば血管内皮細胞増殖因子（VEGF: va
scular endothelial growth factor）、線維芽細胞増殖
因子（FGF: fibroblast growth factor）、肝細胞増殖
因子（HGF: hepatocyte growth factor）, 血小板由来
増殖因子（PDGF: platelet-derived growth factor）、
トランスフォーミング増殖因子−α（TGF-α: transfor
ming growth factor）、サイトカイン（例えばIL-1、IL
-8等）、アラキドン酸代謝物、アンジオジェニン、モノ
ブチリン、チミジンホスホリラーゼ等）などの増殖因子
と同時に生体内に存在するように投与することで平滑筋
細胞増殖促進効果に基づく優れた血管新生促進効果を示
す。両者は一緒に製剤化しても良く、または別個に製剤
化しても良い。別個に製剤化する場合には、投与経路・
用法は同一でも良く、また別々であっても良い。

【００２３】また、本発明薬剤と公知の癒着防止材を併
用することも可能である。例えば、創傷部に本発明薬剤
を塗布した後に癒着防止材（カルボキシメチルセルロー
ス、コンドロイチン硫酸、架橋ヒアルロン酸など）を使
用することで癒着防止材による組織修復の遅れを改善す
ることも可能となる。本発明薬剤には上述したもの以外
にも医薬として許容される生理活性物質、例えば抗炎症
剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、接着因子等を添加す
ることもできる。

【００２４】本発明薬剤中のヒアルロン酸の配合量及び
投与量は、その製剤の投与方法、剤形、患者の具体的症
状、及び患者の体重に応じて適宜個別的に決定されるべ
き事項であり、特に限定はされないが、一般にヒアルロ
ン酸の投与量は１日あたり概ね100μg/kg〜100mg/kg程
度を例示することができる。また、上記製剤の投与回数
は１日１回程度でも可能であり、１日２〜４回、又はそ
れ以上の回数に分けて投与することも可能である。

【００２５】

【実施例】以下に本発明を実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例により限定されるもので
はない。

【００２６】調製例ヒアルロン酸の調製重量平均分子量66万のヒアルロン酸ナトリウム塩（ARTZ
（登録商標）：生化学工業株式会社製）18.2mg及び牛睾
丸由来ヒアルロニダーゼ（和光純薬工業株式会社製）1.
8mg/mlを0.1M酢酸緩衝液(pH5.0)100mlに添加して50℃で
攪拌した。7.8、13.5、30時間経過後に反応液を取り出
し、100℃で5分加熱後、それぞれに4倍量のエタノール
を加えて沈殿を得た。この沈殿を、再度精製水に溶解し
濾過後エタノール沈澱を行った。更に、沈殿を水に溶解
し活性炭処理、濾過を行い4倍量のエタノールを加えて
沈澱させて、沈澱を減圧下乾燥して白色粉末を得た。検
体ロット番号を7.8、13.5、30時間の順に、HA1、HA2、H
A3とした。

【００２７】重量平均分子量10万のヒアルロン酸（ブタ
皮由来）及び重量平均分子量120万のヒアルロン酸（ヒ
ト臍帯由来）を0.1Mの濃度で、エンドトキシンを含まな
い精製水50mlに溶解した。それぞれに活性炭200mgとエ
タノール5mlを加えて室温で6時間撹拌した。その後減圧
濾過を行い、濾液に4倍量のエタノールを加えて沈澱さ
せて、沈澱を減圧下乾燥して白色粉末を得た。各々の精
製後のヒアルロン酸をHA4及びHA5とした。

【００２８】HA1〜HA5につき、重量平均分子量、タンパ
ク質量、エンドトキシン量、鉄含量、及び硫黄含量を測
定した。重量平均分子量はLaurent, T.C. et al, Bioch
em Biophys Acta,42,476(1960)に記載の方法に従って極
限粘度から算出し、タンパク質量はLowry, O.C. et al,
J Biol. Chem., 193, 265(1951)記載の方法により測定
した。エンドトキシン量はJIS生化学試薬通則K8008 4.
3、鉄含量はJIS生化学試薬通則K0121に従って測定し、
硫黄含量はAnal. Chem.,20(1948),85の記載に基づいて
測定した。

【００２９】

【表１】

【００３０】*各サンプルの鉄含量は20ppm以下、硫黄含
量は0.01%以下であった。実施例１平滑筋細胞由来培養法マウス血管平滑筋細胞（VSMC: vascular smooth muscle
cells）はexplant法で単離した。すなわち、雄の８週
齢ICRマウスの大動脈を摘出し、血管外膜を除去した
後、残りの血管中膜組織を1mm角に細切した。この組織
片を培養フラスコの底面に付着させ、10%ウシ胎児血清
（FCS）、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプト
マイシン、8mMグルタミン含有ダルベッコ変法イーグル
培地（DMEM:Dulbecco's Modified Eagle's Medium）中
で5%CO₂条件下37℃で培養した。2週間後に、この組織片
から遊走してきたVSMCを継代し、以後の実験に用いた。
培養VSMC 2×10⁴cellsを24穴プレートに播種し、一晩培
養した後、培地を0.5%FCS含有DMEMに代えて更に2日間培
養した。その後、調製例で得たHA1〜HA5を添加した0.5%
FCS含有DMEM中で24時間培養した。ヒアルロン酸を添加
しないものを対照とした。培養終量の4時間前に0.5Ciの
[³H]チミジン（アマシャム-ファルマシア社製）を加え
てDNAを標識した。培地を除去し、PBSで洗浄した後、0.
4N NaOHを加え30分、37℃で保温した。グラスファイバ
ーペーパー上に不溶性画分を集めた後、乾燥し、液体シ
ンチレーションカウンター（LS5801:ベックマン社製）
で[³H]の放射能を測定した（表２）。

【００３１】

【表２】

【００３２】単位：dpm 対照と比較して、HA1〜HA5各々のサンプルを添加した場
合に平滑筋細胞の増殖が大幅に促進されていることが晟
かとなり、特に重量平均分子量が低いHA1〜HA3において
は、HA4及びHA5と比して100分の1及び1000分の1の濃度
でも同等或いはそれ以上の平滑筋細胞増殖促進活性が得
られることが判明した。

【００３３】この結果から、実質的に純粋なヒアルロン
酸は本発明薬剤の有効成分として使用することが可能で
あり、その中でも特に低分子量のヒアルロン酸、具体的
には重量平均分子量が1,000〜8,000のヒアルロン酸が有
用であることが判明した。実施例２製剤例（１）注射剤（液剤）調製例で得られたHA1及びHA2を用いて注射剤（液剤）を
製造した。すなわち、HA1又はHA2の粉末30mgを終濃度5m
g/mlとなるようにリン酸緩衝生理的食塩水（PBS）に溶
解し、これを無菌濾過した後、2mlずつアンプルに分注
して本発明薬剤（注射剤）を製造した。（２）軟膏剤調製例で得られたHA2及びHA3を用いて軟膏剤を製造し
た。すなわち、HA2又はHA3の粉末100mg、鉱油4g、石油
ゼリー8g、混合メチル／プロピルパラバン60mg、非イオ
ン性界面活性剤1g及び精製水30gを均一に混合した。こ
の混合物を容器に充填して本発明薬剤（軟膏剤）を製造
した。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、優れた平滑筋細胞増殖促
進剤が提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大貫洋二東京都東大和市南街３丁目58番３号矢崎コーポ201号室Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 EA25 MA01 MA04 NA14 ZA44 ZA89 ZB21 4C090 AA04 BA67 BB17 BB33 BB36 BB53 BC27 BD31 BD37 CA42 DA23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒアルロン酸又はその薬学的に許容され
うる塩を有効成分として含有する平滑筋細胞増殖促進
剤。
【請求項２】前記ヒアルロン酸の重量平均分子量が1,
000〜8,000である請求項１記載の平滑筋細胞増殖促進
剤。
【請求項３】有効成分とするヒアルロン酸への硫酸化
グリコサミノグリカンの混入量が、硫黄含量の電量滴定
において0.01%以下に相当する量であることを特徴とす
る請求項１又は２記載の平滑筋細胞増殖促進剤。