CN108379288B - 作为细胞因子活性调节剂的硫酸化的透明质酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为细胞因子活性调节剂的硫酸化的透明质酸。本发明的目的涉及硫酸化的透明质酸(HAS)作为细胞因子活性(促炎和抗炎)调节剂的新且惊奇的用途，从而HAS用于制备新药物，用于预防和治疗与促炎和抗炎性质的细胞因子的激活和/或缺乏相关的病症。事实上申请人发现其在调节这些特定蛋白质的活性中的独特能力，他们研究了作用机理并证实技术发展水平已知的不同硫酸化类型之间的本职差异，但是最重要的是他们证实HAS对不同类型和品系的疱疹病毒、HIV、巨细胞病毒和水疱性口腔炎病毒的意外高活性。

Description

作为细胞因子活性调节剂的硫酸化的透明质酸
本申请为2010年5月11日提交的、发明名称为“作为细胞因子活性调节剂的硫酸化的透明质酸”的PCT申请PCT/EP2010/003044的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2011年11月11日，申请号为201080020643.2。
发明领域
多年来，科学/专利文献研究并描述了硫酸化的透明质酸，所述的硫酸化的透明质酸是根据技术发展水平(EP0940410B1和EP0702699B1)中所描述的由透明质酸(HA)开始适当地硫酸化后获得的，这归因于抗凝作用。HAS还可以通过脱乙酰化以及随后的HA的葡糖胺的硫酸化而获得(定义为HA-NS)(EP0971961B1)，用于制备外科物品和药物组合物。还已知专利EP0754460B1和EP1385492B1，其中描述了HAS在病症(pathologies)例如ARDS、关节风湿病、类风湿性关节炎和皮炎中的用途。
本发明的一个目的涉及HAS作为细胞因子活性调节剂的新的且惊奇的用途，因为申请人已经发现HAS具有调节特别的细胞因子的独特能力(促炎和抗炎)，已经研究了其作用机理并揭示了两种类型的硫酸化产物(HAS和HA-NS)之间的基本差异，但是总之申请人已经惊讶地发现对不同类型和菌株的疱疹病毒、HIV、巨细胞病毒和疱疹性口炎病毒的出乎意料的高活性。
自1970年，科学家认识到所选的淋巴样细胞群能产生和释放蛋白质性质但不可同化为抗体的分子进入循环层，定义为术语“细胞因子”。它们代表新类型的“激素”，能作用于体内多种区域的不同细胞靶标。
与这些蛋白质合成和生物学/生物化学功能相关的科学知识的进展已经改变了相同科学世界中对免疫系统(I.S.)“旧的”看法，并在认识其多种功能中开辟了新阶段，从而对于治疗局部和/或全身的不同病症创造了新前景，还包括与癌症的免疫治疗相关的新疗法的可能性。
中心IS细胞是淋巴细胞，其代表约20％的所有白血细胞，并且基于它的多种功能，形成3组：淋巴细胞B、淋巴细胞T和杀伤性淋巴细胞。很多细胞因子是由淋巴细胞和/或单核细胞产生的可溶性蛋白质，能作用于其它细胞/组织，这些细胞/组织还位于远离细胞因子产生的部位。它们具有免疫功能，事实上，还在由I.S.的不同细胞或由I.S.引发的级联反应中涉及的靶细胞合成其它细胞因子中具有调节功能。
目前已经研究了多种不同的细胞因子，而且具有多种不同的缩写，但是本申请人特别研究的那些是：白介素1和2，白介素6、7和12，后文定义为IL-1、IL-2、IL-6、IL-7和IL-12，其和TNF被定义为具有促炎性质的细胞因子，而相反白介素10(IL-10)是具有很强抗炎性质的细胞因子。
第一个被研究的细胞因子确定是以α和β两种形式存在的IL-1，是局部和全身炎性过程的有效的诱导物。它主要是在细菌刺激或包括其它细胞因子的部分其它试剂刺激后由淋巴细胞B、T和巨噬细胞产生；它还由肺泡、腹腔巨噬细胞、Kupffer细胞、外周嗜中性粒细胞、内皮、上皮和平滑肌细胞、成纤维细胞，皮肤的Langerhans细胞、破骨细胞、滑膜细胞和很多其它类型的细胞分泌。其还存在于脑脊髓液中，在脑脊髓液中产生并运输细胞因子。这两种形式都结合相同的受体并且具有非常相似的生物学活性(如果不是完全一致的话)。很多它们的促炎功能与刺激其它细胞因子相关，所述的其它细胞因子例如IL-6和IL-8，并且它们的合成可以通过细胞因子例如TNF、干扰素、细菌内毒素、病毒和不同类型的其它抗原来诱导。其涉及脓毒性休克，但是还应当注意的是最近研究已经表明IL-1能够活化某些癌基因的表达，并且随后参与肿瘤的发病。此外，在患有白血病的患者的循环层中存在的白色系列母细胞生长的自分泌控制系统被认为产生这类细胞因子：事实上这些母细胞无法控制地产生IL-1，其反过来刺激增强相同母细胞增殖的那些生长因子的合成。联合其它细胞因子，从而IL-1代表了炎性过程的主要调节剂之一：事实上其刺激T-细胞，从而产生IL-2，并且刺激B-细胞，从而产生免疫球蛋白。因此其参与多种病症例如星形胶质细胞增生和神经纤维脱髓鞘，其对产生胰岛素的Langerhans胰腺细胞具有细胞毒，并且其还参与骨的结石过程，活化破骨细胞并且抑制新骨的形成，这两个过程涉及骨质疏松症的病理学。通过增加下丘脑中枢中前列腺素的释放，其能用作内源性热原，从而导致体温升高。其还参与类风湿性关节炎和关节病的发病：事实上在患有类风湿性关节炎和/或骨关节病的患者的滑液中发现大量的IL-1。最后，其参与血管损伤的建立例如静脉血栓形成，并且存在于具有动脉/动脉粥样硬化(arterioschlerotic)类型的病理学的所有血管中。对于这类细胞因子，目前试验的是受体拮抗剂，因为阻断受体证明是治疗其中IL-1起主要作用的这些病症的有效方法。
TNF：坏死因子是细胞因子组的部分，其促进急性全身炎症相的反应。因此，TNF参与极为广泛的过程，例如细胞增殖、分化和凋亡，癌发生和病毒复制。
其主要由巨噬细胞和一系列其它细胞类型产生，所述的其它细胞类型包括肥大细胞、淋巴样细胞、肌细胞和内皮细胞、成纤维细胞和神经细胞。其合成可以通过细菌内毒素、其它细胞因子例如IL-2、干扰素和IL-1刺激，并且其可以被类固醇抑制。
通过作用于多种器官和系统，通常与其它细胞因子一起，其参与很多发病过程的建立和调节：
-其调节很多蛋白质和重要细胞因子(例如IL-1和IL-6)的表达，从而参与很多皮肤病症，例如皮炎、白癜风和湿疹；
-其刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴，增加某些类型激素的释放；
-其抑制食欲；
-其引起发烧(其用作内源性热原，诱导下丘脑产生前列腺素)；
-其刺激滑膜细胞中胶原酶的合成，并且由于该原因，在患有关节病和类风湿性关节炎的患者的滑液中已经发现了大量的TNF；
-其活化破骨细胞，从而诱导骨的重吸收，特征在于骨质疏松症病症；
-其还参与神经系统的病理学，例如星形细胞增生和脱髓鞘；
-其强烈吸引嗜中性粒细胞，并且帮助它们将其吸附到内皮细胞上，从而外渗；
-其刺激具有氧化作用的分子的巨噬细胞的(macrophagic)产生；
-其特别参与心脏循环系统的病理学，参与静脉血栓形成、动脉硬化和血管炎的发病；
-其增加对胰岛素的抗性，其增加肌肉中的蛋白质分解代谢，但其抑制脂肪组织中脂肪生成代谢。
高浓度的TNF能诱导休克样症状，但延长暴露于低浓度能导致恶病质，一种导致组织(特别是肌肉和脂肪组织)的蛋白质和脂质消耗的综合征。TNF能自身结合两种受体，TNF-R1(1型TNF的受体)和TNF-R2(2型TNF的受体)，其在除红细胞之外的所有体细胞中有表达。简而言之，TNF促进炎性响应，其反过来触发自身免疫性质的多种病症，例如类风湿性关节炎、克隆病、银屑病和哮喘。目前科学研究尝试完善“生物学”药物(例如单克隆抗体)，其抑制TNF的合成和/或阻断其受体。
IL-2：这是强的促炎、致动脉粥样硬化的细胞因子，主要由淋巴细胞T产生，其合成是通过类固醇和环孢菌素抑制。白血病细胞合成上述细胞因子，并且同时表达其受体，从而在刺激其生长中产生自分泌系统，其导致白血病病症的恶化。在调节免疫响应中IL-2具有重要作用：事实上其刺激外周白细胞中IFN的合成，并诱导IL-1和TNF的产生。IL-2还能破坏血脑屏障和脑血管内皮的完整性，导致神经精神障碍，例如定向障碍和抑郁。
因此，有多种病症与IL-2的异常产生有关，所述的病症例如霍奇金淋巴瘤、器官移植排斥、多发性硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、糖尿病和AIDS。
IL-6：由上述所有I.S.中的很多细胞类型产生，与TNF一起，其是炎性过程急性期的化学调节剂组中最重要的成员，并且因此其参与含有强炎性组分的病症，例如哮喘(其中其参与炎性过程的出现和维持)、慢性肠炎(克隆病)、类风湿性关节炎和关节病。如上所确定的，事实上，细胞因子(例如TNF、IL-1和IL-6)已经证明了极大地参与退化的关节骨关节病过程，因为它们在调节金属蛋白酶(负责软骨退化)的表达中、在前列腺素的产生中和破骨细胞活化中具有重要作用，由于该原因，在患有关节病和类风湿性关节炎(R.A.)的患者的滑液中表现出高细胞因子水平。这些发现激励了在以上白介素和/或受体拮抗剂中应用抑制剂作为关节病病症的新治疗策略。
在经历移植的患者的尿中发现高浓度的IL-6，并且它的存在代表器官排斥反应的早期体征之一。在很多患有肿瘤的患者(例如骨髓瘤、白血病、心脏粘液瘤或在病症例如淋巴结病和肝硬化中)中该细胞因子的血清水平也显著增加，并且其还可以用作监控肿瘤质量大小的指示剂。最后，最近的研究将癌症与寿命关联，并且揭示了某些肿瘤是如何受到患者细胞因子蛋白质性质/量情况的影响：简而言之，最新证据将IL-10的低分布和IL-6的高分泌关联到在临床存活的患有肿瘤病症的患者中的恶化，而能产生和维持高水平IL-10的基因型可能有利于存活。因此，具有高抗炎细胞因子水平和低浓度促炎细胞因子的个体通常具有更长的寿命(Caruso C.等人,Ann N.Y.Acad.SCI.,2004,1028:1-13)。
IL-7：主要由骨髓间质细胞产生的细胞因子，其还由胸腺和角质形成细胞分泌。IL-7诱导炎性细胞因子的合成，所述的炎性细胞因子例如IL-1、IL-6和TNF，从而参与某些皮肤疾病(例如银屑病和皮肤淋巴瘤)和骨关节系统的发病。事实上在患有R.A.的患者中发现了高水平的IL-7，因为IL-1和TNF(强烈参与以上病症的细胞因子)能增加IL-7的间质产生，其反过来刺激TNF的巨噬细胞合成。最后，IL-7能诱导破骨细胞的成熟，随后增加骨吸收，从而引起关节退化。
IL-12：该蛋白质在调节I.S.功能中也发挥重要作用。事实上其作用于淋巴细胞的分化，其诱导干扰素和TNF的合成，并且其产生可以通过IL-10来抑制。产生过量的该蛋白质参与自身免疫性质疾病的发病，所述的自身免疫性质疾病例如结肠炎、关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、脑脊髓炎、银屑病和多发性硬化(Brahmachari S.等人,Minerva Med.,2008,99(2):105-118)。
IL-10：主要由淋巴细胞产生，其是抗炎性质的细胞因子，能抑制淋巴细胞T产生的IL-2和干扰素的合成。IL-10的抗炎作用还表现在能抑制用细菌毒素刺激的巨噬细胞中IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF的合成。IL-10缺乏与病症例如糖尿病和慢性肠炎(例如克隆病)有关。最近证据引导IL-10试验作为新的治疗方法，用于治疗红斑狼疮。通常在患有病症例如白癜风、银屑病、湿疹和皮炎的患者的皮肤组织中观察到低IL-10水平。应当注意的是在常规免疫抑制疗法治疗炎症和器官排斥过程中，皮质类固醇和环孢菌素增加这类白介素从相关感受态细胞中产生和/或释放(Zhou X.等人,Current Drug Targets-Immune,Endocrine&Metabolic Disorders,2005,5(465475)。试验数据还证实其在减少体外被人滑膜细胞上的TNF诱导的前列腺素和环氧合酶释放中的有效性，从而表明IL-10具有降低炎性过程的能力，所述的炎性过程包括骨关节退化侵袭的关节(Alaaeddine N.等人,Arthritis&Rheumatism,1999,42:710-718)。最近研究证实在支气管高反应性试验动物模型中其对哮喘病症的治疗有效性，显示出这类细胞因子在降低炎症中如何具有高的治疗潜力，所述的炎症特征在于哮喘患者的气道，其中在支气管洗涤液中和/或在血清水平和/或组织水平上发现高浓度的TNF、IL-1、IL-5、IL-6和IL-8(Stankiewicz W.等人,Mediatorsof Inflammation,2002,11:307-312)。对于该白介素，由此假定维持免疫内稳态的调节细胞因子的重要作用。
哮喘可以是一种极端无效的疾病，全世界约20亿人患有此病，每年超过5,000人死亡。其是基于I.S.对环境因素歪曲的响应的病症，因此与促炎细胞因子的恶化的产生有关，所述的细胞因子用于肥大细胞和嗜酸性粒细胞以及I.S.的其它类型细胞的生长和分化。这种免疫系统失衡活性的原因仍未完全清楚，然而遗传、环境、病毒以及营养因素以不同的方式引起这种病症的发生。因此，发现有效的疗法，用于其预防和/或治疗，该疗法能中止或减少类固醇的应用(常规治疗方法)，对于更严重的形式(因为它在任何情况下能减少类固醇的应用)和对于不太严重的病例，该疗法代表一种有效的解决方式，因为中止类固醇治疗将是全面的(total)。
发明详述
本发明的一个目的是HAS作为细胞因子活性调节剂的新且惊奇的用途，因为申请人已经发现其在调节特别的细胞因子的活性中具有独特的能力，申请人研究了其作用机理并且揭示了技术发展水平已知的多种类型的硫酸化产物之间的基本差异，但是总之申请人已经发现了对不同类型和菌株的疱疹病毒、HIV、巨细胞病毒和疱疹性口炎病毒的出乎意料的高活性。适合于本发明目的的硫酸化的透明质酸是根据EP 702699B1中描述的方法制备的：硫酸化是借助络合物SO3-吡啶完成的，并且涉及多糖链中存在的醇羟基，从任何来源(例如从鸡冠花提取、发酵或技术)衍生的HA开始，所述的HA分子量范围为400至3×106Da、特别是1×104Da至1×106Da、甚至更特别是10,000至50,000Da、150,000至250,000Da和500,000至750,000Da。
获得的衍生物保持了未被改变的起始聚合物的所有物理特性，特别是起始HA的分子量没有被硫酸化过程改变，从而保持了起始多糖的所有物理-化学特性。硫酸化涉及二糖单元的多个羟基，并且因此如技术发展水平已知的，通过改变引入的SO3-吡啶的量来获得不同硫酸化度(0.5至3.5)(表示每个二糖单元的硫酸基团的数量)是可能的。
在完成的所有试验中所用的衍生物通常具有1度或3度硫酸化，并且后文定义为HAS1和HAS3。HA中所有游离的羧基可以与有机和/或无机来源的阳离子成盐。
两种程度的HAS在水中是可溶的，并且它们还可以用本领域专家已知的常规技术灭菌，即使应用高压灭菌器的灭菌是优选的。
在下文描述的试验中，申请人证实：
·HAS能刺激新mRNA的产生和抗炎细胞因子(例如IL-10)的蛋白质合成，从而增加细胞以及整个器官的免疫防御能力。上述细胞因子的抗炎作用体现在抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和TNF、所有促炎性质的蛋白质的合成的能力。
·就部分滑膜细胞(对于IL-12)和I.S.的细胞组分而言，HAS在减少新的mRNA合成中和在显著减少IL-2、IL-7和IL-12的蛋白质合成中是有效的，在这两种情况中无需免疫响应，而且特别是在炎性应激事件中，免疫细胞通过产生细胞因子级联来响应，并且总之在该情况中，出现的数据表明HAS更大的抑制作用。
·HAS在抑制TNF、IL-1和IL-6与它们的受体结合中是有效的。这些结果是非常重要的，因为它们证明了硫酸酯的行为完全类似于特别的单克隆抗体对上述促炎蛋白质的受体的行为，从而能阻断它们的功能，即使它们不具备这种特异性。这种受体阻断表示拮抗TNF、IL-1和IL-6因子的促炎和肿瘤作用的最有效方式，从而在临床试验中开创了新的水平，在治疗和/或预防非常多病症中提供完美的新疗法，这是考虑到TNF、IL-1和IL-6在多种疾病的发作和进程中具有的作用。
因此，申请人描述并且要求HAS在制备药物中的新用途：
·用于预防和/或治疗与免疫缺陷相关的病症，并且特别是IL-10缺陷，刺激抗炎细胞因子的合成，作为病症的新的局部和全身疗法，所述的病症例如白癫风、湿疹、银屑病和皮炎；
·用于预防和/或治疗与IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12和TNF的升高/活化相关的病症；
·用于预防和/或治疗与IL-1、IL-6和TNF的活化相关的哮喘、类风湿性关节炎和关节病；
·用于预防和/或治疗与血管内皮损伤相关的病症；
·用于预防和/或治疗皮肤疾病，例如皮炎和皮肤淋巴瘤；
·用于预防和/或治疗自身免疫性质的疾病，例如类风湿性关节炎、克隆病(以及所有慢性肠炎)、银屑病和哮喘、糖尿病、脑脊髓炎、多发性硬化、红斑狼疮，以及用于治疗器官移植排斥；
·用于预防和/或治疗瘤形成，例如白血病和霍奇金淋巴瘤；
·用于预防和/或治疗星形胶质细胞增生、星形细胞增生和神经纤维脱髓鞘；
·用于预防和/或治疗与破骨细胞的活化相关的病症，例如骨质疏松症；
·用于预防和/或治疗与TNF、IL-1和IL-6的活化相关的动脉/动脉粥样硬化类型、静脉血栓形成和血管炎的血管病症；
·用于预防和/或治疗发烧病症。
在下文描述的试验中，申请人还证实了HAS对不同类型的病毒的有效抗病毒作用：
·获得的结果显示HAS(1度和3度)在抑制HIV 1和2的病毒复制中的有效性。该试验还证实了并非技术发展水平已知的所有硫酸化的透明质酸都能有效地作用于病毒复制，因为仅其中硫酸化单独发生在羟基的HAS被证实是有效的，其中HA-NS在阻断病毒细胞病原性中是无效的。
·试验数据证实HAS1和HAS3对单纯疱疹病毒1型和2型以及对疱疹性口炎病毒(VSV)的抗病毒作用。第一种形式非常广泛地会出现特征性发烧水疱，其通常影响面部皮肤(嘴唇、鼻孔)；其也称为唇单纯性疱疹。由唇疱疹引起的感染容易复发，因为病毒存活在细胞内部，并且使用有效的药物也难以清除。第二种形式是生殖器感染，也称为生殖器疱疹。两种都是由身体和性接触引起的。由于神经节中病毒体的位置，它们长时间保持休眠，疱疹感染具有复发特征，对应于免疫系统的应激事件，并且通常在最初部位复发。疱疹性口炎病毒是RNA-病毒，其感染哺乳动物(主要是动物)，并在实验室用于研究RNA-病毒的生命周期发展。HA-NS1和HAS1之间的比较再次显示并非所有硫酸化的透明质酸是等同的，因为HA-NS1被证实根本无效，而HAS 1和3显示出对单纯疱疹以及VSV非常强的抗病毒活性。测试的样品没有证明对宿主细胞有细胞毒性，事实上获得的最小细胞毒性浓度等于临床实践中治疗疱疹通常所用的参考药物浓度，并且已经证明平均比在抑制病毒复制显示有效的浓度高100倍。
·对HAS1和HAS3获得的试验数据表明对巨细胞病毒的清晰且显著的抗病毒结果：巨细胞病毒是一种特别类型的病毒，其进入我们机体的某些类型的细胞中，在其中它自我复制，寄生性导致它们的死亡。它属于唇疱疹和生殖器疱疹、水痘和感染性单核细胞增多症的相同家族。上皮细胞、粘膜、淋巴结是多种原发感染的部位。其在外周血、肾小管上皮和唾液腺上皮中保持终生潜伏态。在涉及多器官免疫减弱的个体(例如患有AIDS的那些和处于免疫抑制治疗中的移植个体)中发现严重形式：肺炎、肝炎、结肠炎、食道炎、肾炎。治疗方案包括施用药物，例如更昔洛韦、缬更昔洛韦和膦甲酸(病毒DNA合成的抑制剂)。而且在这种情况下，证实HA-NS1在抑制病毒增殖中是无效的，确定两种类型的硫酸化产物之间作为抗病毒能力的绝对多样性。
因此本申请人描述并且要求HAS在制备药物中的新用途：
·用于预防和/或治疗HIV；
·用于预防和/或治疗唇单纯性疱疹和生殖器疱疹；
·用于预防和/或治疗疱疹性口炎病毒；
·用于预防和/或治疗巨细胞病毒。
最后，本申请人描述了包含作为单独活性成分的HAS或组合其它药理学和/或生物学活性剂的多种药物制剂/组合物的制备，所述的其它药理学和/或生物学活性剂例如类固醇、激素、蛋白质、营养因子、维生素、非甾体抗炎药(FANS)、化疗药、钙拮抗剂、抗生素、抗病毒剂、抗凝血药和/或纤维蛋白溶解剂、局部麻醉药、酶例如胶原酶和/或透明质酸酶和/或其它蛋白酶；其可以与聚合物例如透明质酸及其衍生物、羧甲基纤维素和/或天然(例如胶原)或合成性质的其它聚合物一起配制。
所述药物组合物可以全身施用(静脉内或动脉内、肌内、腹膜内、皮下或口服施用)，其可以用于局部应用，通过皮肤和/或经皮吸收，其可以通过吸入剂/气雾剂施用(特别是用于治疗哮喘病症)，关节内施用或其可以通过直接注射直接施用于所治疗的部位。
所述药物组合物可以配制成软膏剂、脂质体、水凝胶、唇膏、乳膏剂、阴道胚珠(ovules)和探条(bougies)、泡沫、粘膜凝胶、眼用制剂、冲洗剂、漱口剂、皮肤和/或经皮吸收的贴剂(特别是FANS和激素的贴剂)、吸入应用的溶液剂。
制备HAS 1和3度、包含它的药物制剂的某些实施例连同体外试验获得的结果仅作为描述和非限制的目的提供。
实施例1
制备平均分子量等于200KD(范围为150,000至250,000Da)的透明质酸(HA)的四丁 基铵盐
将5.00g发酵的钠盐来源的透明质酸(200KD)溶于250mL水中，并且将产生的溶液经预填充100cm3四丁基铵(TBA)形式的Dowex树脂的玻璃柱过滤。将HA-TBA盐的洗脱溶液收集并且冷冻干燥。获得7.50g产物。
实施例2
从平均分子量为200KD的HA开始合成硫酸化的HA并且硫酸化度等于每个重复单元 3个硫酸酯基团(sulfate groups)
方法A
将10.0g根据实施例1制备的平均分子量为200KD的透明质酸的TBA盐溶于300mL二甲亚砜(DMSO)中，将26.0g络合物SO3-吡啶(三氧化硫和吡啶，下文缩写为PySO3)分散于150mL DMSO中，然后加入到HA溶液中。在温度为21℃下机械搅拌20小时后，加入0.1体积的水中止反应；加入2体积的乙醇后通过沉淀分离粗反应产物。将获得的固体分散在150mL水中并且用NaOH 1M将pH调至中性。将混合物通过截留分子量为12-14,000Da的膜彻底对水透析。将透析的产物冷冻干燥。获得9.7g产物，硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸酯基团(产率＝88％)。
方法B
将32.0g根据实施例1制备的平均分子量为200KD的透明质酸的TBA盐溶于900mLN-甲基-吡咯烷酮(NMP)中；将100g PySO3分散于600mL NMP中，然后加入到HA溶液中。在温度为21±1℃下机械搅拌20小时后，加入0.5体积的水中止反应；将最初低于2.5的pH用NaOH(溶液)调至中性。加入2.5体积的甲醇后通过沉淀分离反应粗产物，并且用2体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体重新溶解并且通过截留分子量为12-14,000Da的膜彻底对水透析。获得30.4g产物，硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸酯基团(产率＝86％)。
实施例3
从平均分子量为200KD的HA开始合成硫酸化的HA并且硫酸化度等于每个重复单元 1个硫酸酯基团
应用实施例1中描述的方法，制备10.0g HA的TBA盐，将其溶于350mL DMSO中。将10.0g络合物PySO3分散于100mL DMSO中，然后加入到HA溶液中。在温度为21℃下机械搅拌20小时后，加入0.1体积的水中止反应；加入2.5体积乙醇后通过沉淀分离粗反应产物。将获得的固体分散在150mL水中并且用NaOH 1mol/L将pH调至中性。将混合物通过截留分子量为12-14,000Da的膜彻底对水透析。将透析的产物冷冻干燥。获得7.54g产物，硫酸化度等于每个重复单元1.0个硫酸酯基团(产率＝93％)。
实施例4
从低分子量(平均MW为10KD，范围为10,000至50,000Da)的HA开始合成硫酸化的HA 并且硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸酯基团
应用实施例1中描述的方法，制备12.4g低分子量透明质酸的TBA盐，将其溶于300mL NMP中。将40g PySO3分散于100mL NMP中，然后加入到HA溶液中。在温度为21℃下机械搅拌20小时后，加入0.5体积的水中止反应。将最初低于2.5的pH用NaOH 4M调至中性。加入2.5体积的甲醇后通过沉淀分离反应粗产物，并且用2体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体重新溶解并且通过截留分子量为3,500Da的膜彻底对水透析。获得12.0g产物，硫酸化度等于每个重复单元3.0个硫酸酯基团(产率＝85％)。
实施例5
从低平均分子量的HA开始合成硫酸化的HA并且硫酸化度等于每个重复单元1个硫 酸酯基团
应用实施例1中描述的方法，将12.4g HA的TBA盐溶于300mL DMSO中。将16.0gPySO3分散于100mL DMSO中，然后加入到HA溶液中。在温度为21℃下机械搅拌20小时后，加入0.1体积的水中止反应；加入2.5体积的乙醇后通过沉淀分离反应粗产物。将获得的固体分散在150mL水中并且用NaOH 1mol/L将pH调至中性。将混合物通过截留分子量为3,500Da的膜彻底对水透析。将透析产物冷冻干燥。获得9.04g产物，硫酸化度等于每个重复单元1.0个硫酸酯基团(产率＝90％)。
实施例6
从分子量范围为500-730KD Da的HA开始合成硫酸化的HA并且硫酸化度等于每个 重复单元3个硫酸酯基团
将21.0g提取来源的透明质酸钠盐(500-730KD)溶于1.5L水中，并且将产生的溶液经预填充450cm3TBA形式的Dowex树脂的玻璃柱过滤。将HA-TBA盐的洗脱溶液收集并且冷冻干燥。获得32.0g产物，将其溶于1.35L NMP中；将100g PySO3分散于650mL NMP中，然后加入到HA溶液中。在温度为23±1℃下机械搅拌20小时后，加入0.5体积的水中止反应。将最初低于2.5的pH通过加入NaOH(溶液，浓度为4mol/L)调至中性。加入2.5体积的甲醇后通过沉淀分离反应粗产物，并且用3.5体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体重新溶解并且通过截留分子量为12-14,000Da的膜彻底对水透析。获得30.3g产物，硫酸化度等于每个重复单元3个硫酸酯基团(产率＝83％)。
实施例7
从分子量范围为500-730KD的HA开始合成硫酸化的HA并且硫酸化度等于每个重复 单元1个硫酸酯基团
将21.0g提取来源的透明质酸钠盐(500-730KD)溶于1.5L水中，并且将产生的溶液经预填充450cm3TBA形式的Dowex树脂的玻璃柱过滤。将HA-TBA盐的洗脱溶液收集并且冷冻干燥。获得32.0g产物，将其溶于1.65L NMP中；将40g PySO3分散于350mL NMP中，然后加入到HA溶液中。在温度为25±1℃下机械搅拌20小时后，加入0.5体积的水中止反应。将最初低于2.5的pH通过加入NaOH(溶液，浓度为4mol/L)调至中性。加入3.5体积的甲醇后通过沉淀分离反应粗产物，并且用3.5体积的甲醇/水混合物8/2洗涤。将固体重新溶解并且通过截留分子量为12-14,000Da的膜彻底对水透析。获得22.5g产物，硫酸化度等于每个重复单元1.0个硫酸酯基团(产率＝87％)。
实施例8
HAS 1度和3度对人滑膜细胞中IL-10和IL-12的基因表达的调节作用的评估
将先前在37℃含10％FCS的DMEM培养基中体外扩增和维持温育的人滑膜细胞以每孔20,000个细胞的浓度接种。然后在培养基中加入如实施例1-3描述制备的硫酸化的HA 1度(HAS1)和3度(HAS3)，浓度为0.1和0.5mg/mL(对于两种样品)，而对照处理是通过平均分子量(MW)为200KD的非硫酸化的HA表示的。处理3天后，进行实时PCR来评估IL-10和IL-12的基因表达：根据供应商的说明(TRIZOL试剂,LIFE Techonologies,GIBCO BRL)，用“Trizol”法提取细胞RNA。简而言之，通过加入1.0mL Trizol将细胞裂解，并且通过测量260nm处的吸收来定量总的RNA。应用软件Primer3(Roche Molecular Diagnostics,Pleasanton,CA,USA)，选择适合的引物用于扩增每条基因。基因表达是借助Rotor-gene TM5500(Corbettresearch,Sydney,Australia)完成的实时PCR来评估的。PCR反应是用引物在300nm和SYBRGreen(Invitroge,Carlsbad,CA,USA)扩增40个循环来完成的，扩增条件95℃下15秒，以及60℃下1分钟。荧光阈值(Ct)”是通过软件自动测定的，评估所研究的基因的扩增系数在92至110％之间。对于每个cDNA样品，基因表达值是借助管家基因(即β-肌动蛋白的基因，其代表对照基因，因为它存在于每个细胞中而且不受HAS的影响)的ct和兴趣基因(即IL-10和IL-12的基因)的ct之间的比值来表示的，因此，管家基因ct/基因ct值在纵坐标轴上表示，从而其表示所研究的基因表达的mRNA的量。获得的结果显示在图1和2中：
图1：与用非硫酸化的HA处理的对照相比，用HAS1和HAS3处理的人滑膜细胞引起细胞因子IL-10的基因表达显著增加。
图2：在本实验中，与用非硫酸化的HA处理的对照相比，两种硫酸化度(1度和3度)的HAS被证实能显著降低IL-12的基因表达，减半其mRNA的合成。因此，硫酸化的透明质酸证实具有：
·能刺激新mRNA的产生，用于合成抗炎细胞因子，从而增强细胞以及整个有机体的防御能力，对先前描述的那些病症，其中IL-10被证实对缓解和/或改善IL-10参与的疾病非常重要，所述的疾病例如哮喘、类风湿性关节炎、关节病和所有炎症。
·有效地减少高度促炎细胞因子IL-12的新mRNA的合成，证实是有效的抗炎药，能干扰在无效疾病病理中参与的蛋白质的表达，所述的无效疾病例如银屑病、关节炎和所有上述的那些疾病。
实施例9
抑制TNF与单核细胞系中表达的受体的结合：评估不同MW值的HAS 1度和3度的有 效性
这些试验实现了评估测试样品(根据实施例1-4制备的)对抑制TNF与其受体结合的能力的有效性，所述的受体是通过这类试验体外通常所用的I.S.细胞表达的，用碘化的细胞因子组分进行试验，用于在放射性配体结合试验中评估。
试验方法是如Baglioni C.等人,J Biol Chem,1985,260:13395-13397中描述的那样完成的。
简而言之，应用淋巴瘤U937的人组织细胞系，特征在于单核细胞对TNF的细胞毒性敏感并表达其相关受体。将细胞最初与125I-TNF 0.028nM(在水中进行)，同时与分析的样品(浓度为1mg/mL，该浓度证实是引起最大抑制的最低浓度)在4℃下在温育缓冲液中温育3小时，所述的温育缓冲液包含50mM Tris-HCL pH 7.4,0.5mM EDTA。
温育结束后，将细胞与邻苯二甲酸二丁酯/邻苯二甲酸二壬酯2/1离心，并且在γ-计数器中计数所获得的团块。
获得的结果显示在图3中：
获得的结果表明1度和3度且中等和低MW的HAS完全(100％)抑制TNF与其受体结合的有效性。这些结果是非常重要的，因为它们证实了硫酸化的产物的行为完全类似于特异性针对TNF受体的单克隆抗体的行为，因此能阻断其功能。因此，该受体阻断代表了拮抗TNF因子的促炎和致瘤作用的最有效方法。
实施例10
抑制细胞因子IL-1与成纤维细胞系中表达的受体结合：评估不同MW值的HAS 3度 的有效性
这些试验实现了评估测试样品(根据实施例1-3和4制备的)对抑制IL-1与其受体结合的能力的有效性，所述的受体是通过这类试验体外通常所用的小鼠3T3细胞表达的，用碘化的细胞因子组分进行试验，用于放射性配体结合试验的评估。
试验方法是如Chin J等人,J Exp Med,1987,165:70-86中描述的那样完成的。
简而言之，应用鼠成纤维细胞3T3细胞系，该细胞对IL-1的细胞毒性敏感并表达其相关受体。将细胞最初与125I-IL-1 10pM(在水中进行)，同时与分析的样品(浓度为1mg/mL，该浓度证实是引起最大抑制的最低浓度)在37℃下在温育缓冲液中温育2小时，所述的温育缓冲液包含含20mM HEPES pH 7.2和1％BSA的RPMI 1640。温育结束后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，然后溶于2.5M NaOH中并且在γ-计数器中计数。
获得的结果显示在图4中：
获得的结果表明HAS(中等和低MW)在抑制IL-1与其受体结合中有效性达30％。这些结果非常有意义，因为它们证实了硫酸化产物的行为完全类似于特异性针对讨论的细胞因子受体的单克隆抗体的行为，因此能阻断其功能。该受体阻断代表拮抗IL-1的促炎和致瘤作用的最有效方法，如先前所描述的。
实施例11
抑制细胞因子IL-6与人骨髓瘤细胞表达的受体结合：评估不同MW值的HAS 3度的 有效性
这些试验实现了评估测试样品(根据实施例1-3和4制备的)对抑制IL-6与其受体结合的能力的有效性，所述的受体是通过这类试验体外通常所用的人骨髓瘤U266表达的，用碘化的细胞因子组分进行试验，用于放射性配体结合试验的评估。
试验方法是如Taga T.等人,J Exp Med,1987,166:967-981中描述的那样完成的。
简而言之，应用人骨髓瘤U266细胞系，该细胞对IL-6的细胞毒性敏感并表达其相关受体。将细胞最初与125I-IL-6 0.08nM(在水中进行)，同时与分析的样品(浓度为1mg/mL，该浓度证实是引起最大抑制的最低浓度)在4℃下在温育缓冲液中温育16小时，所述的温育缓冲液包含含25mM HEPES pH 7.1和10％BSA的RPMI 1640。温育结束后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，以9,000rpm离心，并且在γ-计数器中计数团块。
获得的结果显示在图5中：
获得的结果表明中等和低MW的HAS在抑制IL-6与其受体结合中的有效性达100％。因此，这些结果证实硫酸化产物的行为在这种情况下完全类似于特异性针对讨论的细胞因子受体的单克隆抗体的行为，因此能阻断其功能。该受体阻断代表阻断IL-6的促炎作用的最有效方法。
实施例12
评估HAS 1度和3度对人PBMC中细胞因子IL-2、IL-7、IL-10和IL-12的蛋白质合成 的抑制作用
对于这些试验，采用衍生自很多不同宿主的人外周血的单核细胞(PBMC)，用于评估HAS对以上列出的细胞因子产生的作用，应用：
-非硫酸化的HA(平均MW：200KD)，
-HAS1和HAS3(实施例1-3中描述制备的)(平均MW：200KD)。
PBMC(
Figure BDA0001674818350000171
A.,Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl,1968,97:77-89)的分离是应用产品Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)并且按照供应商标明的方案完成的。在第0天，以每孔100,000个细胞接种在200μL培养基RPMI 1640中，向其中加入10％胎牛血清、HEPES 10mM、谷氨酰胺2mM、1％青霉素-链霉素100U/mL。所有样品的作用是在下列细胞中评估的：未用刺激细胞因子合成的试剂处理的PBMC或用脂多糖LPS(10μg/mL)(很强的促炎作用)或用植物凝集素PHA(10μg/mL)(能刺激淋巴细胞自身分裂的物质)刺激的PBMC，两种试剂能刺激细胞因子的合成。将细胞分别用浓度为0.1mg/mL或1mg/mL的三种化合物处理。在37℃(5％CO2)下温育24小时后，从每孔中取出100μL上清液，用于分析IL-2、IL-7、IL-10和IL-12的产量。
炎症介质的定量是借助
Figure BDA0001674818350000172
技术完成的，按照供应商在技术卡片中标明的方案，应用Custom Human 9-Plex Array板。
获得的结果显示在图6-9中：
这些图清楚地表明当细胞没有被刺激时以及相反当它们被特异且有效的炎性因子和/或促细胞分裂剂刺激时，HAS 1度和3度能显著降低部分单核细胞上IL-2、IL-7和IL-12的合成。因此，HAS证实是具有明确药理学特征的分子，能调节/调整具有显著抗炎活性的细胞因子的合成，在免疫响应没有被刺激以及特别是炎性应激事件(其中免疫细胞通过产生细胞因子级联而响应)的情况中，总之在该情况中，呈现的数据表明更大的HAS调节作用。
另一方面，图9证实了是IL-10的产生以及对于属于免疫系统的细胞如人单核细胞(除滑膜细胞之外)的明显的刺激。因此，再次证实了HAS能调节细胞因子的合成，刺激抗炎的那些细胞因子以及抑制促炎细胞因子的合成。
实施例13
评估HAS 1度和3度和HA-NS的抗病毒作用：
HIV-1(IIIB)和HIV-2(ROD)病毒
测试样品的活性是通过评估抑制细胞病原性来测定，所述的细胞病原性是通过MT-4细胞中的HIV-1病毒(由IIIB型病毒感染的T淋巴细胞获得的)和HIV-2病毒(由ROD型病毒感染的T淋巴细胞获得的)测定的。试验方法如Baba M.等人,ANTIMICROB.AGENTSCHEMOTHER.,1988,32:1742-1745中所描述的那样完成的。
简而言之，由HIV-1病毒株IIIB和HIV-2病毒株ROD感染的人T淋巴细胞(称为MT-4)用于本分析。不同浓度的测试样品用于本测试，应用硫酸葡聚糖作为阳性对照，所述的硫酸葡聚糖是一种已知能抑制不同类型病毒的多糖。测试样品是：
1.HS-NS1：通过硫酸化葡糖胺，随后脱乙酰基制备的硫酸化的透明质酸，1度(EP0971961)，将其与下面样品比较
2.HAS1：仅在其羟基中硫酸化的透明质酸，1度，和
3.HAS3：仅在其羟基中硫酸化的透明质酸，3度，如实施例1-3中描述的那样制备的(所有样品平均MW：200KD)。
测试样品的抗病毒活性是以抑制50％的病毒细胞病原性所需的最小浓度表示的：IC50。将细胞用感染剂量的HIV感染后立刻加入多种浓度的以上样品进行处理。在37℃下5天后，用MTT试验确定活细胞数量：四唑盐仅通过活细胞的线粒体酶进行氧化还原反应。感染的和未处理的细胞失去将四唑盐转化成甲
Figure BDA0001674818350000181
的进行性能力，因此，如果这些细胞在感染和处理后保持完整的这种能力，这意味着这种处理抑制了病毒作用，从而阻断病毒的致病性(Dezinot F.等人,J Immunol.Methods,1986,22(89):271-277)。
获得的结果显示在图10中：
获得的结果证实HAS(1度和3度)在抑制病毒HIV 1和2的病毒复制中的有效性，这种有效性完全比得上阳性对照(由多糖硫酸葡聚糖代表)。该试验还证实并非技术发展水平已知的所有硫酸化的透明质酸对所研究的病毒复制具有有效作用，因为申请人证实仅羟基发生硫酸化的HAS证明具有有效的抗病毒作用，因为HA-NS在阻断病毒细胞病原性中是无效的。
单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、疱疹性口炎病毒
测试样品的活性是通过评估抑制由单纯疱疹病毒-1(HSV-1:KOS,F和McIntyre株)和由单纯疱疹病毒-2(HSV-2:G,196和Lyons株)在E6SM成纤维细胞中引起的细胞病原性来测定的，所述的E6SM成纤维细胞衍生自肌肉/胚胎皮肤组织。此外，测试对疱疹性口炎病毒(疱疹性口炎病毒：VSV)感染的E6SM细胞的抗病毒活性。HSV-1是优先感染口腔粘膜的病毒，而HSV-2攻击生殖器粘膜。试验方法是如Baba M.等人,ANTIMICROB.AGENTS CHEMOTHER.,1988,32:1742-1745中描述的那样完成的。
简而言之，在样品HS-NS1(EP0971961)、如实施例1和2描述制备的HAS1和HAS3(所有样品平均MW：200KD)存在下，将融合的细胞培养物暴露于感染剂量的上述病毒。在37℃下温育1小时后，将培养基用新鲜的仅含测试样品的培养基替换。病毒的细胞病原性是在温育的第2天测试的。抑制病毒的细胞病原性的测量是通过测定抑制“感染”细胞中DNA和RNA的合成来评估的，并且进行上述的处理：将细胞接种在含不同浓度测试样品以及每mL含2.5μCi 3H-胸苷和3H-尿苷的培养基的微孔中。在37℃下16小时后，将细胞用三氯乙酸处理，在乙醇中洗涤，放置干燥并且在7.5mL液体中通过闪烁计数。测试样品的抗病毒活性是以抑制50％的病毒细胞病原性所需的最小浓度表示的：IC50。此外，为了同时评估测试样品的细胞毒性，测定了引起所用细胞形态学损伤(用光学显微镜观察)所需的最小浓度。完成了与硫酸葡聚糖和药物阿昔洛韦的比较(两种分子具有已知的抗病毒功效，因此用作阳性对照)。
获得的结果显示在图11中：
试验数据证实了对于HIV所观察到的，即HAS1和HAS3的有效抗病毒作用：HA-NS1和HAS1之间的比较表明并非所有硫酸化的透明质酸是等同的，因为HA-NS1没有被证实是有活性的，并且这种功效的差异不取决于分子量或透明质酸的硫酸化度，因此其完全在于HA-NS1和HAS1的结构，即在硫酸化上。事实上，HAS显示出功效等同于硫酸葡聚糖的功效，并且比得上阿昔洛韦的功效，所述的阿昔洛韦是治疗单纯疱疹的参考药物。此外，应当指出的是阿昔洛韦对VSV是无活性的，而HAS 1度和3度对VSV具有非常强的抗病毒活性。
所有的测试样品对宿主细胞无细胞毒性，事实上，获得的最小细胞毒性浓度等于临床实践中治疗疱疹通常所用的参考药物的浓度，并且证实比在抑制病毒复制中被证明有活性的浓度平均高100倍。
巨细胞病毒
测试样品的活性是通过评估抑制细胞病原性来测定的，所述的细胞病原性是应用先前的方案通过巨细胞病毒(CMV:AD-169和Davis株)来测定的。抗病毒活性是对HEL细胞(肺胚胎细胞)测试的，并且以抑制50％的上述病毒形成的斑块数量所需的浓度表示。
获得的结果显示在图12中：
该表显示对于HAS1和HAS3获得清晰且显著的阳性结果，其再次证实了它们作为有效的抗病毒剂。而且在该情况中，HA-NS1没有被证明在抑制病毒增殖中是有效的，从而证实了两种类型的1度硫酸化产物在具有抗病毒能力中的绝对多样性。
实施例14
制备包含硫酸化透明质酸1度的吸入溶液剂形式的制剂
将40mg(或20mg，如果HAS具有500-730KD的MW)低或中等MW的硫酸化透明质酸1度引入到50mL玻璃烧瓶中，之后加入15mL的灭菌的PBS 0.2M pH 7.4。将混合物进行搅拌约30分钟，直至粉末完全溶解。当获得完全溶解时，加入2mL丙二醇和另外的灭菌的PBS 0.2M pH7.4，直至达到总体积20mL。将溶液在搅拌下维持数分钟。
实施例15
制备包含硫酸化透明质酸3度的吸入溶液剂形式的制剂
将100mg由HA 200KD获得的硫酸化透明质酸3度引入到50mL玻璃烧瓶中，之后加入15mL灭菌的PBS 0.2M pH 7.4。将混合物进行搅拌约30分钟，直至粉末完全溶解。当获得完全溶解时，加入2mL丙二醇和另外的灭菌的PBS 0.2M pH 7.4，直至达到总体积20mL。将溶液在搅拌下维持数分钟。
实施例16
制备包含硫酸化透明质酸1度的用于关节内应用的可注射溶液剂形式的制剂
将500mg由MW为500-730KD的HA获得的硫酸化透明质酸1度引入到50mL玻璃烧瓶中，然后加入灭菌的PBS 0.2M pH 7.4，直至达到总体积20mL。将混合物进行搅拌约60分钟，直至粉末完全溶解。
实施例17
制备包含HAS、HA和CMC的亲水凝胶形式的制剂
将对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯在80℃下溶于纯水中。溶液冷却至室温后，在搅拌下加入透明质酸钠直至溶解，随后加入HAS1(或HAS3)，维持搅拌直至完全溶解。然后在搅拌下加入甘油和丙二醇直至完全溶解。最后加入羧甲基纤维素钠(CMC)，并且将混合物混合直至获得胶状溶液。
实施例18
制备包含HAS和HA的用于粘膜应用的亲水凝胶形式的制剂(不含防腐剂)
将透明质酸钠然后HAS1(或HAS3)在搅拌下溶于制剂中设定的约90％量的水中。加入丙二醇、Symdiol 68，随后加入MP Diol Glycol，并且将混合物混合直至多种组分完全溶解。随后加入卡波姆974P，并且维持搅拌直至后者均匀分散。将氢氧化钠小珠溶于剩余的10％水中，并且将该溶液加入到上面获得的溶液中，从而获得凝胶化的水相。
实施例19
制备包含HAS和HA的唇膏形式的制剂
将生产制剂中标明的适合量的液体石蜡装入适合的容器中。将其加热至88-92℃，然后在搅拌下加入白软石蜡、硬石蜡、白蜂蜡、地蜡、arlacel，维持搅拌直至多种组分完全熔化。然后掺入全-外消旋-α-生育酚乙酸酯、尿囊素(allantoine)、丁羟基甲苯、对羟基苯甲酸丙酯，并且将混合物混合直至完全溶解，维持物质在88-92℃。
将制剂中设定量的纯水分别装入适合的容器中，然后在搅拌下加入透明质酸钠、HAS1(或HAS3)，直至完全溶解，随后加入依地酸二钠，维持搅拌直至溶解。
将水相在搅拌下转移到含熔化的物质的容器中，维持体系在88-92℃，并且搅拌直至获得澄清溶液。然后在搅拌下加入两种芳化剂，并且将混合物混合10’。将熔化的物质倾倒入模具中，并且立刻冷却至T<0℃，直至获得固体条状物。
实施例20
制备含HAS和HA的阴道胚珠形式的制剂
将明胶在85℃下在70％纯水中膨胀；将透明质酸钠和HAS1(或HAS3)溶于剩余量的水中，并且将该溶液与相同温度的甘油混合。将甘油溶液加入到膨胀的明胶溶液中，并且维持搅拌直至明胶完全溶解。将物质倾倒入模具中，并且冷却至T<0℃，直至获得固体胚珠。
实施例21
制备含HAS和HA的亲水乳膏剂形式的制剂
油相是通过在搅拌和50℃下熔化液体石腊、硬脂酸和Tefose 1500制备的。水相是分别通过如下操作制备的：在80℃下最先溶解对羟基苯甲酸甲酯，随后冷却至室温，并且在搅拌下掺入甘油、透明质酸钠，随后掺入HAS1(或HAS3)，直至多种组分完全溶解。
将水相与油相结合，并且完成乳化，将获得的乳状液O/A在搅拌下冷却至室温。
实施例22
制备含HAS的软膏剂形式的制剂
基质软膏是通过在搅拌和70℃下熔化轻质液体石蜡和白凡士林来制备的。冷却至室温后，在搅拌下掺入HAS1(或HAS3)并且将混合物混合直至获得均匀的悬浮液。
实施例23
制备含HAS的胶囊剂(硬明胶)形式的制剂
通过逐级稀释将HAS1(HAS3)与磷酸钙、硬脂酸镁和二氧化硅混合。然后填充胶囊。
实施例24
制备含HAS的片剂形式的制剂
将HAS1(或HAS3)与含水和约70％总量的CMC钠的配体(ligand)溶液在流化床中进行湿法制粒。将获得的颗粒在0.8mm网上筛分。
将剩余成分(硫酸钙、微晶纤维素、CMC钠和二氧化硅)混合并且在0.8mm网上筛分。
将先前获得的颗粒与包含剩余成分(额外的颗粒)的混合物混合，最后与硬脂酸镁(先前在0.8mm网上筛分过)混合，随后压制。
实施例25
制备含HAS的注射溶液剂形式的制剂
在制备(在室温下)pH 6.4-7.2的生理缓冲液后，将乳糖在搅拌下溶解，最后溶解HAS1或HAS3。从而将获得的溶液经0.22微米过滤。
表
亲水凝胶(实施例17)
组分 量(mg/1g水凝胶)
HAS1(HAS3) 40mg(10mg)
CMC 20mg
甘油 100mg
丙二醇 66.75mg
透明质酸钠 2mg
对羟基苯甲酸甲酯 2mg
对羟基苯甲酸丙酯 0.2mg
纯水 适量至1g
粘膜用的亲水凝胶(实施例18)
组分 量(mg/1g水凝胶)
HAS1(HAS3) 10mg
卡波姆974P 15mg
丙二醇 100mg
氢氧化钠 0.33mg
透明质酸钠 2mg
MP-Diol Glycol 37.5mg
SymDiol 68 90mg
纯水 适量至1g
唇膏(实施例19)
组分 量(mg/1g唇膏)
HAS1(HAS3) 30mg(10mg)
液体石蜡 253.2mg
白软石蜡 326.2mg
硬石蜡 144.3mg
白蜂蜡 96mg
地蜡 28.2mg
Arlacel 582 95.8mg
透明质酸钠 2mg
尿囊素 1.1mg
全-外消旋-α生育酚乙酸酯 1.1mg
对羟基苯甲酸丙酯 0.4mg
丁羟基甲苯 0.4mg
纯水 19.2mg
依地酸二钠 1.1mg
香草味矫味剂 0.5mg
甜味矫味剂 0.5mg
阴道胚珠(实施例20)
组分 量(mg/1g胚珠)
HAS1(HAS3) 10mg
甘油 580
明胶 200
透明质酸钠 2
纯水 适量至1g
亲水乳膏剂(乳状液O/A)(实施例21)
组分 量(mg/1g乳膏剂)
HAS1(HAS3) 10mg
Tefose 1500 110mg
甘油 80mg
硬脂酸 33mg
透明质酸钠 2mg
液体石蜡 40mg
对羟基苯甲酸甲酯 1mg
纯水 适量至1g
软膏剂(实施例22)
组分 量(mg/1g软膏剂)
HAS1(HAS3) 20mg
轻质液体石蜡 200mg
白凡士林 适量至1g
胶囊剂(硬明胶)(实施例23)
Figure BDA0001674818350000251
Figure BDA0001674818350000261
片剂(实施例24)
组分 量(mg/片剂)
HAS-1(HAS-3) 120mg
磷酸钙 200
微晶纤维素 185
羧甲基纤维素钠 10
硬脂酸镁 10
二氧化硅 15
注射制剂(实施例25)
组分 量(mg/mL溶液)
HAS-3 50mg
乳糖 0.93mg
磷酸氢二钾 0.36
磷酸二氢钾 0.23
氯化钠 9
显然由此描述的说明和这些方法可以以多种方式修饰。不应当认为这些修饰偏离了本发明的精神和观点，并且对于本领域技术人员可以明显出现的所有修饰包括在以下权利要求的范围内。

Claims (3)

1.硫酸化的透明质酸在制备用于预防和/或治疗HSV-1唇单纯性疱疹、HSV-2生殖器单纯性疱疹、VSV疱疹性口炎病毒、CMV巨细胞病毒的药物中的用途；所述的硫酸化的透明质酸(HA)的制备涉及多糖链中存在的醇羟基，从分子量范围为150,000至250,000Da的HA开始，并且所述的硫酸化的透明质酸(HA)的硫酸化度等于3。
2.权利要求1的用途，其用于全身施用。
3.权利要求1的用途，其用于局部或吸入施用。
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