WO2021133000A1 - 항염 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물 - Google Patents

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WO2021133000A1
WO2021133000A1 PCT/KR2020/018678 KR2020018678W WO2021133000A1 WO 2021133000 A1 WO2021133000 A1 WO 2021133000A1 KR 2020018678 W KR2020018678 W KR 2020018678W WO 2021133000 A1 WO2021133000 A1 WO 2021133000A1
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hyaluronic acid
sulfated
pharmaceutical composition
group
sulfated hyaluronic
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PCT/KR2020/018678
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양정아
서혜원
소진언
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주식회사 엘지화학
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    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for anti-inflammatory or anti-angiogenesis.
  • Hyaluronic acid is an unsulfated glycosaminoglycan, a natural polysaccharide in which D-glucuronic acid (GlcUA) and N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) are linked in a repeated sequence.
  • the hyaluronic acid is present in various parts of the animal's eye vitreous, cartilage, synovial fluid, placenta, and skin, and is in the form of mucopolysaccharide.
  • Hyaluronic acid is involved in absorbing moisture from the extracellular matrix or providing flexibility between cells, and is involved in cell signaling, wound healing, and morphogenesis.
  • hyaluronic acid exhibits anti-inflammatory activity by inhibiting phagocytosis of macrophages.
  • hyaluronic acid has been used as a treatment for arthritis, wound healing, and as an adjuvant in eye and middle ear surgery.
  • hyaluronic acid has excellent biocompatibility, and its use is gradually increasing in tissue engineering and regenerative medicine.
  • sulfated hyaluronic acid is known to have anti-inflammatory (anti-inflammation), anti-VEGF efficacy.
  • anti-inflammatory and anti-VEGF efficacy may vary greatly depending on the sulfated substitution rate of sulfated hyaluronic acid, and since sulfated hyaluronic acid is not a natural substance, toxicity may appear depending on the substitution rate.
  • sulfated hyaluronic acid is known to have blood anticoagulant activity like heparin, which may appear as an unintended side effect depending on the intended use.
  • sulfated hyaluronic acid In order to use sulfated hyaluronic acid as an effective drug, it is important that it has excellent anti-inflammatory and anti-angiogenic effects while not showing cytotoxicity, and it is important that it has no blood anticoagulant activity in order to eliminate unintended side effects. Accordingly, it is necessary to develop sulfated hyaluronic acid that exhibits anti-inflammatory, anti-VEGF efficacy, and does not show cytotoxicity and blood anticoagulant activity.
  • the present invention provides an anti-inflammatory or anti-angiogenic pharmaceutical composition
  • sulfated hyaluronic acid, its derivatives and salts which have excellent anti-inflammatory and anti-angiogenic efficacy, and do not show cytotoxicity and blood anticoagulation properties.
  • the present invention provides an anti-inflammatory pharmaceutical composition
  • an anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid having an average sulfated substitution rate of 200 to 300% for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid, derivatives and salts thereof do.
  • the present invention provides an antiangiogenic agent comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid having an average sulfate substitution rate of 200 to 300% for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid, derivatives and salts thereof to provide a medical composition.
  • the present invention relates to an inflammatory eye disease or blood vessel comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid, its derivatives and salts having an average sulfated substitution rate of 200 to 300% for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid. It provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of neoplastic eye disease.
  • the present invention relates to a medicament for the treatment or prevention of arthritis comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid having an average sulfate substitution rate of 200 to 300% for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid, derivatives and salts thereof to provide a medical composition.
  • the present invention provides an anticancer agent comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid having an average sulfated substitution rate for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid of 200 to 300%, derivatives and salts thereof.
  • an anti-inflammatory or anti-angiogenic pharmaceutical composition comprising high-potency and low-toxic sulfated hyaluronic acid, its derivatives and salts, while exhibiting excellent anti-inflammatory and anti-angiogenic efficacy, and not showing cytotoxicity and anticoagulation properties can provide
  • the pharmaceutical composition for anti-inflammatory or anti-angiogenesis according to the present invention can be effectively used as a preventive or therapeutic agent for arthritis, eye disease, etc., and an anti-cancer agent.
  • 1 is a 1H NMR result for confirming the substitution of sulfated hyaluronic acid (SHA).
  • 3 is an anti-inflammatory effect evaluation graph according to the molecular weight of the sulfated hyaluronic acid of the present invention.
  • Example 4 is a graph showing the degree of MMP13 secretion during the treatment of sulfated hyaluronic acid of Example 1, Comparative Examples 1, and 3-4.
  • FIG. 5 is an optical micrograph for observing the inhibitory efficacy of tube formation upon treatment with sulfated hyaluronic acid in VEGF-treated samples of HUVEC cells.
  • FIG. 6 is a graph evaluating the cell proliferation inhibitory efficacy of HUVEC cells when treated with sulfated hyaluronic acid of Examples 2 to 4 and Comparative Examples 1, 3, and 5;
  • the present invention provides an anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid having an average sulfated substitution rate of 200 to 300% for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid, derivatives and salts thereof do.
  • the present invention provides an antiangiogenic agent comprising at least one selected from the group consisting of sulfated hyaluronic acid having an average sulfate substitution rate of 200 to 300% for alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid, derivatives and salts thereof to provide a medical composition.
  • the sulfated hyaluronic acid means that at least one or more alcoholic hydroxyl groups of hyaluronic acid have been substituted by sulfate, and the sulfated hyaluronic acid derivatives mean other chemically modified sulfated hyaluronic acid or substituted sulfated hyaluronic acid .
  • the sulfated hyaluronic acid derivative is a sulfated hyaluronic acid-poloxamer derivative, a sulfated hyaluronic acid-polyethylene glycol derivative, a sulfated hyaluronic acid-(CH 2 ) x -CH 3 derivative (x is an integer of 1 to 20) ), sulfated hyaluronic acid-(CH 2 ) y -NH 2 derivatives (y is an integer of 1 to 20), sulfated hyaluronic acid-benzyl ester derivatives, sulfated hyaluronic acid-chitosan derivatives, sulfated hyaluronic acid-PLGA derivatives , sulfated hyaluronic acid-gelatin or sulfated hyaluronic acid-collagen derivatives.
  • the sulfated hyaluronate is, for example, sodium hyaluronate sulfate, potassium sulfate sulfate, calcium sulfate hyaluronate, magnesium sulfate sulfate, zinc sulfate hyaluronate, cobalt sulfate hyaluronate, or hyaluronate sulfate. It may be composed of one or more selected from tetrabutylammonium ronic acid. Alternatively, the sulfated hyaluronic acid may be, for example, represented by the following formula.
  • R 1 and R 2 may each independently be SO 3 H or H, and n is an integer of 1 or more.
  • sulfated hyaluronic acid refers to both sulfated hyaluronic acid and derivatives and salts thereof.
  • Hyaluronic acid has a total of 4 -OH groups, including 1 primary -OH group and 3 more secondary -OH groups per repeating unit.
  • the secondary -OH group can be sulfated as the reaction progresses, and all -OH of hyaluronic acid is sulfated. can be 400%.
  • having a sulfated substitution rate of 100% or more is that a primary -OH group with good reactivity is substituted by sulfuration, and then a secondary -OH group is also substituted by sulfuration.
  • the present invention relates to sulfated hyaluronic acid having an average sulfated substitution rate of 200 to 300% per repeating unit, that is, sulfated hyaluronic acid in which an average of 2 to 3 of 4 alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid are substituted with sulfate.
  • sulfated hyaluronic acid having an average sulfated substitution rate of 200 to 300% per repeating unit, that is, sulfated hyaluronic acid in which an average of 2 to 3 of 4 alcoholic hydroxyl groups per repeating unit of hyaluronic acid are substituted with sulfate.
  • the sulfate substitution rate is 210 to 300%, 210 to 280%, 210 to 260%, 220 to 300%, 220 to 280%, 220 to 260%, 240 to 300%, 240 to 280%, or 240 to 260%.
  • the sulfated hyaluronic acid, its derivative or salt may have a weight average molecular weight (Mw) of 500 to 3,000 kDa. More preferably, it may be 1,000 to 2,500 kDa, and more preferably 1,400 to 2,200 kDa.
  • Mw weight average molecular weight
  • Sulfated hyaluronic acid, its derivative or salt within the above weight average molecular weight range has excellent anti-angiogenic efficacy, almost no blood anticoagulant reaction, and long residence time in the body, so it is suitable for use in actual pharmaceuticals, and the viscosity is too high. may be suitable for production and use.
  • the sulfated hyaluronic acid having an average sulfated substitution rate per repeating unit according to the present invention of 200 to 300% has excellent anti-inflammatory or anti-angiogenic efficacy. In addition, it does not exhibit cytotoxic and blood anticoagulant properties. Accordingly, the pharmaceutical composition comprising the sulfated hyaluronic acid according to the present invention can be effectively used as a preventive or therapeutic agent for arthritis, a preventive or therapeutic agent for eye diseases, an anticancer agent, and the like.
  • the "pharmaceutical composition” may include the sulfated hyaluronic acid of the present invention and other chemical components such as a diluent and carrier. Accordingly, the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or excipient, or a combination thereof, as needed.
  • the pharmaceutical composition facilitates administration of the compound into an organism.
  • Various techniques for administering a compound exist, including, but not limited to, oral, injection, aerosol, parenteral, and topical administration.
  • the present invention may provide a method for preventing or treating arthritis in a mammal by administering a pharmaceutical composition comprising the sulfated hyaluronic acid.
  • a representative example that can be treated through the pharmaceutical composition comprising the sulfated hyaluronic acid of the present invention is for the treatment of osteoarthritis or rheumatoid arthritis, or gout or calcium pyrophosphate deposition disease. It may also be used in other inflammatory arthritis, such as (calcium pyrophosphate dihydrate deposition disease), or in the reduction or prevention of adhesions that may form after surgical procedures.
  • the pharmaceutical composition comprising the sulfated hyaluronic acid of the present invention
  • it can be used for inflammatory or neovascular eye diseases such as dry eye syndrome, uveitis, macular degeneration, and diabetic retinopathy.
  • the pharmaceutical composition comprising the sulfated hyaluronic acid of the present invention may be particularly useful for treating chronic or acute inflammation.
  • treatment means stopping, delaying, or alleviating the progression of a disease when used in an object showing symptoms of onset
  • prevention means reducing the symptoms of an onset when used in a subject that does not show symptoms of onset but is at high risk. means to stop, delay or alleviate.
  • Sulfur trioxide pyridine complex was added 18 mole times of HA-TBA derivative monomer, reacted with nitrogen gas for 2 hours at 5°C, and purified through ethanol precipitation to replace 180% sulfuric acid It was carried out in the same manner as in Example 1, except that the sulfated hyaluronic acid was obtained.
  • Sulfur trioxide pyridine complex was added 50 mole times of HA-TBA derivative monomer, reacted with nitrogen gas for 3 hours at 5°C, and purified through ethanol precipitation to replace 320% sulfate It was carried out in the same manner as in Example 1, except that the sulfated hyaluronic acid was obtained.
  • Sulfur trioxide pyridine complex was added 100 mole times of HA-TBA derivative monomer, reacted with nitrogen gas for 3 hours at 5°C, and purified through ethanol precipitation to replace 370% sulfate It was carried out in the same manner as in Example 1, except that the sulfated hyaluronic acid was obtained.
  • Sulfur trioxide pyridine complex was added 16 mole times of the HA-TBA derivative monomer, reacted with nitrogen gas for 2 hours at 5°C, and purified through ethanol precipitation to replace 150% sulfuric acid It was carried out in the same manner as in Example 1, except that the sulfated hyaluronic acid was obtained.
  • sulfated hyaluronic acid prepared in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 5 was synthesized through 1H NMR analysis, and the sulfated substitution rate was confirmed through EA (elemental analysis). and molecular weight was confirmed through MALLS/RI analysis. The results are shown in FIG. 1 (NMR analysis results) and Table 1 (EA and MALLS/RI analysis results).
  • Example 1 is an NMR analysis result for Example 1, and referring to FIG. 1, a peak of 3.4 ppm disappears as sulfation proceeds, and a peak between 4.1 and 4.3 ppm appears. It was confirmed that the boa sulfated group was introduced.
  • chondrocyte and FLS fibroblast-like synoviocyte
  • SHA sulfated hyaluronic acid
  • the molecular weight showed similarly excellent anti-inflammatory efficacy at the level of 300 to 2000 kDa.
  • Example 1 having a substitution rate of 200% showed excellent inhibitory efficacy, but Comparative Examples 3 to 4 having a substitution rate of 300% or more showed a tendency to increase secretion.
  • HUVEC cells The effect of HUVEC cells on angiogenesis (tube formation) and proliferation inhibition was confirmed.
  • sulfated hyaluronic acid samples (Examples 2 to 3, Comparative Examples) while carrying out 3D culture of VEGF-treated HUVEC cells using Matrigel 1, 4) was confirmed through a microscope image whether the inhibition of angiogenesis (tube formation) when treated.
  • an anti-VEGF drug as a comparative drug of sulfated hyaluronic acid, incubated for 6 hours, and then the blood vessel (tube) The degree of formation was confirmed through an optical microscope. The results are shown in FIG. 5 .
  • vascular structures were generated at a level similar to that of the control group, but in Examples 2 to 3 and Comparative Example 4 in which the sulfate substitution rate was 200% or more, blood vessels were generated It can be seen that this is rarely done. However, in Comparative Example 1 in which the sulfate substitution rate was less than 200%, a vascular structure was generated.
  • sulfated hyaluronic acid (Examples 2 to 4, Comparative Examples 1, 3, 5) in HUVEC cells using a sample group treated or not treated with VEGF, FGF and FBS, respectively, as a control group ) and the anti-VEGF drug, Avastin, was confirmed that cell proliferation was inhibited after treatment by concentration.
  • HUVEC cells were treated at 7,500 cells/well in 96 wells, and VEGF was treated at 100ng/ml, each sulfated hyaluronic acid and avastin sample was treated by concentration. Cell population was confirmed while incubating for 72 hours in Incucyte equipment. The results are shown in FIGS. 6 and 7 .
  • sample treatment group showed a tendency to suppress cell proliferation according to the concentration, and at high concentrations, the proliferation of HUVEC cells up to the level of the negative control group not treated with VEGF, FGF, and FBS. suppressed.
  • the anti-VEGF drug Avastin
  • a high concentration was required, but by blocking various growth factors, the cell proliferation inhibitory effect was superior to that of Avastin.
  • HUVEC and chondrocytes were seeded at 7500 cells/well in 96 wells, respectively, and 1 mg/ml of each sample was treated. The population of cells was confirmed using the Incucyte equipment while incubating for 70 hours. The results are shown in FIG. 8 .
  • a blood anticoagulation test was performed using the sulfated hyaluronic acid of Examples 2-3 and Comparative Examples 1, 3, and 4.
  • the Example 2 sample was heat-treated to prepare sulfated hyaluronic acid (SHA) having a molecular weight of 1,700 kDa, 1,000 kDa, 400 kDa, and 200 kDa, and the effect of molecular weight was also evaluated.
  • SHA sulfated hyaluronic acid
  • the degree of inhibition of the activity of Factor IIa and Factor Xa was measured by a chromogenic assay. The results are shown in Table 2.
  • the inhibitory activity of Factor IIa and Factor Xa of sulfated hyaluronic acid is 500 times or more lower than that of heparin.
  • the anticoagulant reaction hardly occurred in the case of Example 3 because the inhibitory activity of Factor IIa and Factor Xa of Example 3 was significantly lower than that of Comparative Examples 3 to 4 having a high sulfate substitution rate.
  • the inhibitory activity of Factor IIa and Factor Xa was further lowered.

Abstract

본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항염용 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

항염 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물
관련출원과의 상호인용
본 출원은 2019년 12월 23일자 한국 특허 출원 제10-2019-0173213호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 항염 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
히알루론산(HA)은 비황화 글리코사미노글리칸으로서, D-글루쿠론산(GlcUA) 및 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)이 반복된 서열로 결합되어 있는 천연 다당류이다. 상기 히알루론산은 동물의 안구 유리체, 연골, 활액, 태반 및 피부 등 여러 부위에 존재하며, 점액성 다당류의 형태이다.
히알루론산은 세포외 기질이 수분을 흡수하거나 세포 간의 유연성을 부여하는데 관여하고, 세포의 신호전달, 상처 치유, 형태 형성에 관여한다. 특히, 히알루론산은 대식세포의 식세포 작용을 억제하여 항염증 활성을 나타낸다.
이러한 활성 때문에 히알루론산은 관절염 치료제, 상처 치유, 눈 및 중이 수술의 보조제로서 사용되고 있다. 또한, 히알루론산은 생체 적합성이 우수하여 조직공학 및 재생의학에서 그 활용이 점차 증가하고 있다.
한편, 황산화 히알루론산은 항염증성(anti-inflammation), 항-VEGF 효능이 알려져 있다. 그러나, 황산화 히알루론산의 황산화 치환율에 따라 항염증성 및 항-VEGF 효능이 매우 달라질 수 있으며, 황산화 히알루론산은 천연 물질이 아니기 때문에 치환율에 따라 독성이 나타날 수도 있다. 또한, 황산화 히알루론산은 헤파린과 같은 혈액 항응고 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 사용 목적에 따라 의도치 않은 부작용으로 나타날 수 있다. 황산화 히알루론산을 실제 효능이 있는 의약품으로 사용하기 위해서는 항염 및 항혈관신생의 효능은 뛰어나면서 세포 독성을 보이지 않는 것이 중요하며, 의도치 않은 부작용을 없애기 위하여 혈액 항응고 활성이 없는 것이 중요하다. 이에, 항염증성, 항-VEGF 효능을 나타내면서, 세포 독성 및 혈액 항응고 활성을 보이지 않는 황산화 히알루론산의 개발이 필요하다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국공개특허 제2017-0120991호
본 발명은 항염 및 항혈관신생 효능이 뛰어나며, 세포 독성 및 혈액 항응고 특성을 보이지 않는 고효능, 저독성의 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염을 포함하는 항염 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항염용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항혈관신생용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 염증성 안질환 또는 혈관신생성 안질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 관절염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항암제를 제공한다.
본 발명에 따르면, 우수한 항염 및 항혈관신생 효능을 나타내면서 세포 독성및 혈액 항응고 특성을 보이지 않는 고효능, 저독성의 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염을 포함하는 항염 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 항염 또는 항혈관신생용 약제학적 조성물은 관절염, 안질환 등의 예방 또는 치료제, 항암제로서 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 황산화 히알루론산(SHA)의 황산화 치환을 확인하기 위한 1H NMR 결과이다.
도 2는 실시예 3~4 및 비교예 1~4의 황산화 히알루론산의 항염 효능 평가 그래프이다.
도 3은 본 발명의 황산화 히알루론산의 분자량에 따른 항염 효능 평가 그래프이다.
도 4는 실시예 1, 비교예 1, 3~4의 황산화 히알루론산 처리시 MMP13 분비 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 HUVEC 세포의 VEGF 처리 샘플에 황산화 히알루론산 처리시의 혈관 생성(tube formation) 억제 효능을 관찰하기 위한 광학 현미경 사진이다.
도 6은 실시예 2~4, 비교예 1, 3, 5의 황산화 히알루론산 처리시 HUVEC 세포의 세포 증식 억제 효능을 평가한 그래프이다.
도 7은 실시예 3~4, 비교예 1~4의 황산화 히알루론산의 세포 독성 평가 그래프이다.
이하에서는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이때, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항염용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항혈관신생용 약제학적 조성물을 제공한다.
종래의 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염은 항염증성, 항-VEGF 효능이 알려져 있으나, 황산화 치환율 및 분자량에 따른 항염증성, 항-VEGF 효능 및 독성에 대한 연구가 부족한 상황이었으며, 헤파린과 같은 혈액 항응고 효능이 있다는 점도 알려져 있어 실제 사용시 의도치 않은 부작용이 발생할 수 있는 문제가 있었다. 이에, 본 발명에서는 히알루론산의 반복 단위 당 평균 황산화 치환 정도를 200 내지 300%가 되도록 함으로써, 항염 및 항혈관신생에 있어서 고효능이면서 저독성을 나타내도록 하였으며, 혈액의 항응고 활성이 나타나지 않도록 하였다. 이러한 고효능 및 저독성의 항염, 항혈관신생용 약제학적 조성물은 관절염 예방 또는 치료제, 안질환의 예방 또는 치료제, 항암제로서 효과적으로 사용할 수 있다.
상기 황산화 히알루론산은 히알루론산의 알코올성 수산기가 적어도 하나 이상 황산화 치환된 것을 의미하며, 상기 황산화 히알루론산 유도체는 그 외에 화학적으로 변형된 황산화 히알루론산 또는 치환된 황산화 히알루론산을 의미한다. 예를 들어, 황산화 히알루론산 유도체는 황산화 히알루론산-폴록사머 유도체, 황산화 히알루론산-폴리에틸렌글리콜 유도체, 황산화 히알루론산-(CH2)x-CH3 유도체(x은 1 내지 20의 정수), 황산화 히알루론산-(CH2)y-NH2 유도체(y는 1 내지 20의 정수), 황산화 히알루론산-벤질에스터 유도체, 황산화 히알루론산-키토산 유도체, 황산화 히알루론산-PLGA 유도체, 황산화 히알루론산-젤라틴 또는 황산화 히알루론산-콜라겐 유도체에서 선택되는 1종 이상으로 구성될 수 있다. 상기 황산화 히알루론산 염은 예를 들어, 황산화 히알루론산 나트륨, 황산화 히알루론산 칼륨, 황산화 히알루론산 칼슘, 황산화 히알루론산 마그네슘, 황산화 히알루론산 아연, 황산화 히알루론산 코발트 또는 황산화 히알루론산 테트라부틸암모늄에서 선택되는 1종 이상으로 구성될 수 있다. 또는, 상기 황산화 히알루론산은 예를 들어, 하기 화학식과 같이 표시될 수 있다.
[화학식]
Figure PCTKR2020018678-appb-I000001
상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 SO3H 또는 H 일 수 있으며, n은 1 이상의 정수이다.
이하에서는 편의상 달리 지시되지 않는 한, 황산화 히알루론산은 황산화 히알루론산과, 그 유도체 및 염을 모두 지칭한다.
히알루론산은 반복 단위 당 프라이머리(primary) -OH 그룹 1개와, 이외에 세컨더리(secondary) -OH 그룹 3개를 더 포함해 총 4개의 -OH 그룹을 가지는데, 황산화 치환 반응시 반응성이 좋은 프라이머리(primary) -OH 그룹이 먼저 황산화 치환되고, 반응이 더 진행될수록 세컨더리(secondary) -OH 그룹이 황산화 치환될 수 있고, 히알루론산의 모든 -OH가 황산화 치환됐을 때 총 황산화 치환율은 400%가 될 수 있다. 이때, 100% 이상의 황산화 치환율을 갖는 것은 반응성이 좋은 프라이머리(primary) -OH 그룹이 황산화 치환되고 난 후, 세컨더리(secondary) -OH 그룹도 황산화 치환된 것이다. 본 발명은 반복 단위 당 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 즉, 히알루론산의 반복 단위 당 4개의 알코올성 수산기 중 평균 2개 내지 3개가 황산화 치환된 황산화 히알루론산에 관한 것이다. 상기 황산화 히알루론산의 평균 황산화 치환율이 200% 미만일 경우 항염 및 항혈관신생의 효능이 현저히 미비하며, 300%를 초과할 경우 세포 독성이 발생하였다. 구체적으로, 상기 황산화 치환율은 210 내지 300%, 210 내지 280%, 210 내지 260%, 220 내지 300%, 220 내지 280%, 220 내지 260%, 240 내지 300%, 240 내지 280%, 또는 240 내지 260%일 수 있다.
상기 황산화 히알루론산, 그 유도체 또는 염은, 중량 평균 분자량(Mw)이 500 내지 3,000kDa일 수 있다. 보다 바람직하게는 1,000 내지 2,500kDa일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1,400 내지 2,200kDa일 수 있다. 상기 중량 평균 분자량 범위 내의 황산화 히알루론산, 그 유도체 또는 염은 항혈관신생 효능이 우수하며, 혈액 항응고 반응이 거의 일어나지 않으며, 체내 잔류 시간이 길어 실제 의약품에 사용하기 적절하고, 점도가 너무 높지 않아 생산 및 사용에 적절할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 반복 단위 당 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산은 우수한 항염 또는 항혈관신생의 효능을 갖는다. 또한, 세포 독성 및 혈액 항응고 특성을 나타내지 않는다. 이에, 본 발명에 따른 상기 황산화 히알루론산을 포함하는 약제학적 조성물은 관절염의 예방 또는 치료제, 안질환의 예방 또는 치료제, 항암제 등으로 효과적으로 사용될 수 있다.
상기 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 황산화 히알루론산과 희석제, 담체 등과 같은 다른 화학 성분들을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합이 필요에 따라 포함될 수 있다. 약제학적 조성물은 생물체 내로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 황산화 히알루론산을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여, 포유동물에서 관절염의 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 상기 황산화 히알루론산을 포함하는 약제학적 조성물을 통하여 치료할 수 있는 대표적인 예로는, 골관절염(osteoarthritis) 또는 류머티스성 관절염(rheumatoid arthritis)의 치료에, 또는 통풍(gout) 또는 칼슘 피로포스페이트 침착 질환(calcium pyrophosphate dihydrate deposition disease)과 같은 다른 염증성 관절염에, 또는 수술 과정 후 형성될 수 있는 유착(adhesion)의 감소 또는 예방에서 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명의 상기 황산화 히알루론산을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하여, 염증성 안질환 및 혈관신생 안질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다. 대표적인 예로는, 안구건조증, 포도막염, 황반변셩, 당뇨성 망막변증과 같은 염증성 또는 혈관신생 안질환에 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 황산화 히알루론산을 포함하는 약제학적 조성물은 만성 또는 급성 염증을 치료하는데 특히 유용할 수 있다.
본 명세서에서 "치료"란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단, 지연 또는 완화시키는 것을 의미하며, "예방"이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단, 지연 또는 완화시키는 것을 의미한다.
다음 실시예는 당업자에게 본원에서 제공된 화합물, 조성물, 및 방법이 어떻게 만들어지고 평가되는지의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 순전히 예시적인 것으로 의도된다. 따라서, 실시예는 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하기 위한 것이 결코 아니다. 반응 조건, 예를 들어, 구성요소 농도, 원하는 용매, 용매 혼합물, 온도, 압력, 및 다른 반응 파라미터 및 순도, 수율, 등과 같은 생성물 특성을 최적화하기 위해 이용될 수도 있는 조건의 많은 변형 및 조합이 있다. 이러한 것들은 또한 본원의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 모든 가능한 변화에서 상기 설명된 요소의 어떤 조합도 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥상 달리 분명하게 부인되지 않으면 본 발명에 의해 포함된다.
[실시예 1]
히알루론산(HA)에 테트라부틸 암모늄 염(tetrabutyl ammonium salt)을 도입한 HA-TBA 유도체를 유기 용매인 디메틸폼아마이드(DMF)에 3mg/mL의 농도로 녹인 후 설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 25몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 1시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 200% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득하였다.
[실시예 2]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 30몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 0.5시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 210% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[실시예 3]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 20몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 2시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 240% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[실시예 4]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 30몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 3시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 280% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[비교예 1]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 10.6몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 2시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 110% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[비교예 2]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 18몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 2시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 180% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[비교예 3]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 50몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 3시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 320% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[비교예 4]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 100몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 3시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 370% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[비교예 5]
설퍼 트리옥사이드 피리딘 컴플렉스(sulfur trioxide pyridine complex)를 HA-TBA 유도체 모노머의 16몰(mole)배 투입한 뒤, 질소가스, 5℃에서 2시간을 반응 후 에탄올 침전을 통하여 정제하여 150% 황산화 치환된 황산화 히알루론산을 수득한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
[실험예 1: 황산화 치환율 확인]
실시예 1~4, 비교예 1~5에서 제조된 황산화 히알루론산(SHA)을 1H NMR 분석을 통하여 황산화 히알루론산이 합성된 것을 확인하였으며, EA(원소 분석)을 통하여 황산화 치환율을 확인하였으며, MALLS/RI 분석을 통해 분자량을 확인하였다. 그 결과를 도 1(NMR 분석 결과) 및 표 1(EA 및 MALLS/RI 분석 결과)에 나타내었다.
도 1은 실시예 1에 대한 NMR 분석 결과이며, 도 1을 참조하면 설페이션(sulfation)이 진행되면서 3.4ppm의 피크(peak)가 사라지고, 4.1-4.3ppm 사이의 피크(peak)가 나타나는 것으로 보아 황산화 그룹이 도입된 것을 확인하였다.
황산화 치환율(%) 분자량(kDa)
실시예1 200 1,911
실시예2 210 1,730
실시예3 240 2,142
실시예4 280 1,922
비교예1 110 1,628
비교예2 180 1,969
비교예3 320 1,992
비교예4 370 1,937
비교예5 150 2,731
표 1을 참조하면, 실시예 1~4의 황산화 히알루론산은 황산화 치환율이 200 내지 300% 범위 내였으며, 비교예 1~5의 황산화 히알루론산은 황산화 치환율이 상기 범위를 벗어나는 것을 확인하였다.
[실험예 2: 항염 효능 평가]
실시예 3~4 및 비교예 1~4에서 제조된 황산화 히알루론산(SHA)을 사용하여 연골세포(chondrocyte), FLS(fibroblast-like synoviocyte) 2종류 세포의 항염 효능 평가를 실시하였다.
연골세포 및 FLS 2종류의 세포를 각각 24 well에 5x104 및 2x104 cells/well로 시딩(seeding)하고, TNF-alpha를 5ng/ml 및 2ng/ml 처리하여 오버나이트(overnight)로 세포를 활성화한 후, 배지를 교체하고 각 샘플을 1mg/ml 처리하였다. 샘플 처리 후 추가로 24시간 인큐베이션(incubation) 후 배지 내 세포의 사이토카인(cytokine) 분비량을 ELISA를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 연골세포, FLS 2종류의 세포에서 모두 황산화 치환율이 높을수록 IL-6, IL-8 사이토카인의 분비 억제 효능이 뛰어난 것으로 확인되었다. 치환율이 100%대인 비교예 1~2의 경우 HA와 유사한 수준의 미비한 항염 효능을 나타내었으나 200% 이상의 치환율을 가지는 실시예 3~4, 비교예 3~4의 경우 두 세포에서 모두 IL-6와 IL-8의 분비를 억제하였다.
황산화 치환율 이외에 분자량에 따른 효능을 확인하기 위하여, 실시예 3~4를 열분해하여 분자량만 작게 조절한 샘플을 이용하여 상기와 동일한 세포 실험을 진행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 황산화 치환율이 240~280%인 수준에서는 분자량이 300~2000kDa 수준에서 비슷하게 우수한 항염 효능을 보였다.
IL-6, IL-8 이외에 상기 세포 배지 샘플을 이용하여 염증에 관련된 인자인 MMP13의 분비 정도를 ELISA를 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, MMP13의 경우에는 치환율 200%의 실시예 1은 뛰어난 억제 효능을 보였으나, 치환율 300% 이상의 비교예 3~4에서는 오히려 분비가 증가하는 경향을 보였다.
[실험예 3: 항혈관신생 효능 평가]
HUVEC 세포의 혈관 생성(tube formation) 및 증식 억제 효능을 확인하였다.
HUVEC 세포의 혈관 생성 억제 효능 확인을 위하여, VEGF를 처리한 HUVEC 세포를 매트리젤(Matrigel)을 이용하여 3차원 배양(3D culture)을 진행하면서 황산화 히알루론산 샘플(실시예 2~3, 비교예 1, 4)을 처리하였을 때의 혈관 생성(tube formation) 억제 여부를 현미경 이미지를 통해 확인하였다. 또한, VEGF를 처리한 HUVEC 세포를 매트리젤이 코팅되어 있는 96 well에 시딩(seeding) 후 황산화 히알루론산 비교 약물로서 항-VEGF 약물인 아바스틴을 처리하여 6시간 인큐베이션(incubation) 후 혈관(tube)의 형성 정도를 광학 현미경을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, 아바스틴 및 히알루론산(HA) 처리군은 대조군(Control)과 비슷한 수준으로 혈관 구조가 생성되었으나, 황산화 치환율이 200% 이상인 실시예2~3, 비교예 4의 경우 혈관 생성이 거의 이루어지지 않음을 확인할 수 있었다. 그러나, 황산화 치환율이 200% 미만인 비교예 1의 경우 혈관 구조가 생성되었다.
HUVEC 세포의 증식 억제 효능 확인을 위하여, VEGF, FGF 및 FBS를 각각 처리하거나 비처리한 샘플군을 대조군으로 하여, HUVEC 세포에 황산화 히알루론산(실시예 2~4, 비교예 1, 3, 5) 및 항-VEGF 약물인 아바스틴을 농도 별로 처리 후 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
HUVEC 세포를 96 well에 7,500 cell/well로 처리한 뒤 VEGF를 100ng/ml로 처리 후 각 황산화 히알루론산 및 아바스틴 샘플을 농도별로 처리하였다. Incucyte 장비에 72시간 동안 인큐베이션(incubation)하면서 세포 수(cell population)를 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6을 참조하면, 실시예 2~4 샘플 처리군의 경우 농도에 따라 세포 증식이 억제되는 경향을 보였으며, 고농도에서는 VEGF, FGF, 그리고 FBS를 처리하지 않은 음성대조군 수준까지 HUVEC 세포의 증식을 억제하였다. 항-VEGF 약물인 아바스틴의 경우 상대적으로 낮은 농도에서도 VEGF가 없는 대조군 수준까지 세포 증식을 억제하였다. 실시예 2~4의 황산화 히알루론산의 경우 높은 농도가 필요하지만, 다양한 성장인자(growth factor)를 블로킹(blocking)하여 아바스틴보다 세포 증식 억제 효능이 뛰어났다. 황산화되지 않은 히알루론산의 경우 세포 증식 억제 효능을 보이지 않으며, 고농도에서는 오히려 세포 증식 효과를 보였다. 비교예 1의 경우, 고농도에서도 cell confluence가 VEGF 처리군과 비슷한 수준으로 나타나 HUVEC 세포의 증식을 억제하는 효과가 미비하였다. 비교예 5의 경우, HUVEC 세포의 증식을 억제하기 위해서는 실시예 2-4보다 높은 농도가 필요하여 세포 증식 억제 효능이 더 낮았다. 비교예 3의 경우 낮은 농도에서도 세포가 증식하지 못했다.
[실험예 4: 세포 독성 평가]
실시예 3, 4, 비교예 1~4에서 제조된 황산화 히알루론산(SHA)을 사용하여 HUVEC, 연골세포(chondrocyte) 2종류의 세포의 세포 독성을 각각 평가하였다.
HUVEC, 연골세포 2종류의 세포를 각각 96 well에 7500cells/well로 시딩(seeding) 후 각 샘플을 1mg/ml 처리하였다. 70시간 동안 인큐베이션(incubation)하면서 Incucyte 장비를 이용하여 세포의 군(population)을 확인하였다. 그 결과를 도 8 나타내었다.
도 7을 참조하면, 실시예 3, 4 및 비교예 1, 2를 처리한 샘플 군에서는 세포의 증식 속도에는 영향을 받을 수 있으나 독성은 보이지 않았다. 그러나, 비교예 3, 4를 처리한 샘플 군의 경우 세포 독성을 보였다. 그러므로, 황산화 히알루론산을 치료제로 개발하기 위해서는 치환율 300% 이하일 필요가 있다.
[실험예 5: 혈액 항응고 평가]
실시예 2~3 및 비교예 1, 3, 4의 황산화 히알루론산을 이용하여 혈액 항응고 시험을 수행하였다. 특히, 실시예 2 샘플을 열처리하여, 분자량 1,700kDa, 1,000kDa, 400kDa, 200kDa의 황산화 히알루론산(SHA)을 제조하여 분자량의 영향도 평가하였다. 상기 각 황산화 히알루론산을 사용하여, Factor IIa와 Factor Xa의 활동 저해 정도를 발색분석법(Chromogenic assay)으로 측정하였다. 그 결과를 표 2 에 나타내었다.
Anti-IIa activity [IU/mg] Anti-Xa activity [IU/mg]
Heparin 209 209
비교예1 0.00 0.05
실시예3 0.13 0.17
비교예3 0.42 0.29
비교예4 0.42 0.42
실시예2 1,700kDa 0.06 0.21
실시예2 1,000kDa 0.09 0.17
실시예2 400kDa 0.22 0.17
실시예2 200kDa 0.22 0.16
상기 표 2 및 도 8을 참조하면, 헤파린 대비하여 황산화 히알루론산의 Factor IIa 및 Factor Xa 저해 활동이 500배 이상 낮은 것을 확인할 수 있다. 또한, 황산화 치환율이 높은 비교예 3~4 대비 실시예 3의 Factor IIa 및 Factor Xa 저해 활동이 현저히 낮아 실시예 3의 경우 항응고 반응이 거의 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 2의 경우 분자량이 1,000kDa 이상일 때가 Factor IIa 및 Factor Xa 저해 활동이 더욱 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항염용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상은, 중량 평균 분자량(Mw)이 500 내지 3,000kDa인 항염용 약제학적 조성물.
  3. 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항혈관신생용 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상은, 중량 평균 분자량(Mw)이 500 내지 3,000kDa인 항혈관신생용 약제학적 조성물.
  5. 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 관절염의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 조성물은 관절염, 골관절염, 류머티스성 관절염, 통풍 또는 칼슘 피로포스페이트 침작 질환의 치료 또는 예방 용도인 것인 약제학적 조성물.
  7. 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 염증성 안질환 또는 혈관신생성 안질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 안구건조증, 포도막염, 황반변성 또는 당뇨병성 망막변증의 치료 또는 예방 용도인 것인 약제학적 조성물.
  9. 히알루론산의 반복 단위 당 알코올성 수산기에 대한 평균 황산화 치환율이 200 내지 300%인 황산화 히알루론산, 그 유도체 및 염으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 포함하는 항암제.
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ANDRE R. JORDAN, LOKESHWAR SOUM D., LOPEZ LUIS E., HENNIG MARTIN, CHIPOLLINI JUAN, YATES TRAVIS, HUPE MARIE C., MERSEBURGER AXEL S: "Antitumor activity of sulfated hyaluronic acid fragments in pre-clinical models of bladder cancer", ONCOTARGET, IMPACT JOURNALS LLC, UNITED STATES, vol. 8, no. 15, 11 April 2017 (2017-04-11), United States, pages 24262 - 24274, XP055691118, ISSN: 1949-2553, DOI: 10.18632/oncotarget.10529 *

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