JP2000212204A - 骨誘導促進剤 - Google Patents
骨誘導促進剤Info
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- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
- A61K47/544—Phospholipids
Abstract
(57)【要約】
【課題】 より少ない薬剤量及び低い濃度でも効果的に
骨誘導を促進することが可能な新たな骨誘導促進剤を提
供する。 【解決手段】 グリコサミノグリカンに脂質が結合した
脂質結合グリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許
容される塩を有効成分として含有することを特徴とする
骨誘導促進剤。
骨誘導を促進することが可能な新たな骨誘導促進剤を提
供する。 【解決手段】 グリコサミノグリカンに脂質が結合した
脂質結合グリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許
容される塩を有効成分として含有することを特徴とする
骨誘導促進剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、グリコサミノグリ
カンに脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンま
たはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有
する骨誘導促進剤に関する。
カンに脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンま
たはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有
する骨誘導促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】医療分野、特に整形外科分野において
は、骨誘導促進活性を有する医薬または医療用具につい
て高い要請がある。
は、骨誘導促進活性を有する医薬または医療用具につい
て高い要請がある。
【０００３】骨誘導促進活性を有する物質の一つの種類
としてグリコサミノグリカンが知られており、例えば特
表平8-508973号は、分子量20,000〜60,000のヒアルロン
酸が0.5 mg/mlの濃度で骨誘導促進活性を有することを
開示している。また特開昭62-64367号は、グリコサミノ
グリカン、コラーゲン、及びアパタイト等の基材からな
る人工骨材を開示しており、この人工骨材により骨形成
が助長される旨記載されている。
としてグリコサミノグリカンが知られており、例えば特
表平8-508973号は、分子量20,000〜60,000のヒアルロン
酸が0.5 mg/mlの濃度で骨誘導促進活性を有することを
開示している。また特開昭62-64367号は、グリコサミノ
グリカン、コラーゲン、及びアパタイト等の基材からな
る人工骨材を開示しており、この人工骨材により骨形成
が助長される旨記載されている。
【０００４】しかしグリコサミノグリカン自体は水溶性
であるため生体内において急激に拡散し、従って投与の
目的部位において長時間高濃度に保ち、その骨誘導促進
効果を維持することが困難であった。
であるため生体内において急激に拡散し、従って投与の
目的部位において長時間高濃度に保ち、その骨誘導促進
効果を維持することが困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、より少ない薬剤量及び低い濃度でも効果的に骨誘導
を促進することが可能な新たな骨誘導促進剤を提供する
ことである。
は、より少ない薬剤量及び低い濃度でも効果的に骨誘導
を促進することが可能な新たな骨誘導促進剤を提供する
ことである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】グリコサミノグリカンに
脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンが知られ
ており、例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号、特
開平9-30979号等に開示されている。
脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンが知られ
ており、例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号、特
開平9-30979号等に開示されている。
【０００７】本発明者らは、この物質に着目して鋭意検
討を重ねた結果、これらの脂質結合グリコサミノグリカ
ンが骨誘導促進活性を有することを見出し、さらに驚く
べきことに、これらの脂質結合グリコサミノグリカンに
よれば、グリコサミノグリカンを単独で使用する場合と
比較して１００分の１程度の濃度であっても十分な骨誘
導促進効果を得られることを見出した。本発明はこれら
の知見に基づいて完成されたものである。
討を重ねた結果、これらの脂質結合グリコサミノグリカ
ンが骨誘導促進活性を有することを見出し、さらに驚く
べきことに、これらの脂質結合グリコサミノグリカンに
よれば、グリコサミノグリカンを単独で使用する場合と
比較して１００分の１程度の濃度であっても十分な骨誘
導促進効果を得られることを見出した。本発明はこれら
の知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】従って本発明は、グリコサミノグリカンに
脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンまたはそ
の薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するこ
とを特徴とする骨誘導促進剤を提供するものである。
脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカンまたはそ
の薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するこ
とを特徴とする骨誘導促進剤を提供するものである。
【０００９】本発明の好ましい態様によれば、グリコサ
ミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コン
ドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン
硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸及びケラタンポリ硫酸か
らなる物質群から選択される物質であることを特徴とす
る上記骨誘導促進剤；脂質がグリセロ脂質である上記骨
誘導促進剤；グリセロ脂質がリン脂質であることを特徴
とする上記骨誘導促進剤；リン脂質がホスファチジルエ
タノールアミンである上記骨誘導促進剤；グリコサミノ
グリカンがヒアルロン酸であり、脂質がホスファチジル
エタノールアミンである上記骨誘導促進剤；グリコサミ
ノグリカンの還元末端に脂質が共有結合していることを
特徴とする上記骨誘導促進剤が提供される。
ミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コン
ドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン
硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸及びケラタンポリ硫酸か
らなる物質群から選択される物質であることを特徴とす
る上記骨誘導促進剤；脂質がグリセロ脂質である上記骨
誘導促進剤；グリセロ脂質がリン脂質であることを特徴
とする上記骨誘導促進剤；リン脂質がホスファチジルエ
タノールアミンである上記骨誘導促進剤；グリコサミノ
グリカンがヒアルロン酸であり、脂質がホスファチジル
エタノールアミンである上記骨誘導促進剤；グリコサミ
ノグリカンの還元末端に脂質が共有結合していることを
特徴とする上記骨誘導促進剤が提供される。
【００１０】尚、本発明の骨誘導促進剤の活性成分であ
る脂質結合グリコサミノグリカンは上記の通り公知の物
質であるが、上記特開平4-82836、特開平6-72893号、及
び特開平9-30979号は、当該物質をそれぞれ癌転移抑制
剤、抗リウマチ剤及び神経疾患の治療剤として使用する
ことが可能であることを開示するものであり、脂質結合
グリコサミノグリカンが骨誘導促進活性を有することは
開示も示唆もしていない。
る脂質結合グリコサミノグリカンは上記の通り公知の物
質であるが、上記特開平4-82836、特開平6-72893号、及
び特開平9-30979号は、当該物質をそれぞれ癌転移抑制
剤、抗リウマチ剤及び神経疾患の治療剤として使用する
ことが可能であることを開示するものであり、脂質結合
グリコサミノグリカンが骨誘導促進活性を有することは
開示も示唆もしていない。
【００１１】また、上記の骨誘導促進活性、骨形成の助
長を開示するこれまでの技術については、特表平8-5089
73号はヒアルロン酸を使用するものであり、特開昭62-6
4367の人工骨材においてはコンドロイチン-4-硫酸を使
用しており、いずれもグリコサミノグリカン自体を使用
するものであり、グリコサミノグリカンの誘導体を使用
することは何ら開示も示唆もしていない。
長を開示するこれまでの技術については、特表平8-5089
73号はヒアルロン酸を使用するものであり、特開昭62-6
4367の人工骨材においてはコンドロイチン-4-硫酸を使
用しており、いずれもグリコサミノグリカン自体を使用
するものであり、グリコサミノグリカンの誘導体を使用
することは何ら開示も示唆もしていない。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳述する。
【００１３】本発明の骨誘導促進剤は、グリコサミノグ
リカンに脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカン
またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含
有することを特徴とする。
リカンに脂質が結合した脂質結合グリコサミノグリカン
またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含
有することを特徴とする。
【００１４】本発明に使用される脂質結合グリコサミノ
グリカンに含まれるグリコサミノグリカンは、D-グルコ
サミンまたはD-ガラクトサミンと、D-グルクロン酸、L-
イズロン酸及び／またはD-ガラクトースの2糖の繰り返
し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動物等
の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られ
たもの、化学的もしくは酵素的に合成されたもの等のい
ずれをも使用することができる。具体的には、例えばヒ
アルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（コ
ンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイ
チン硫酸E、コンドロイチン硫酸K等）、コンドロイチン
ポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、
ケラタンポリ硫酸等が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。これらのグリコサミノグリカンは通常
使用される薬理学的に許容される塩であってもよい。
グリカンに含まれるグリコサミノグリカンは、D-グルコ
サミンまたはD-ガラクトサミンと、D-グルクロン酸、L-
イズロン酸及び／またはD-ガラクトースの2糖の繰り返
し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動物等
の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られ
たもの、化学的もしくは酵素的に合成されたもの等のい
ずれをも使用することができる。具体的には、例えばヒ
アルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸（コ
ンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイ
チン硫酸E、コンドロイチン硫酸K等）、コンドロイチン
ポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、
ケラタンポリ硫酸等が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。これらのグリコサミノグリカンは通常
使用される薬理学的に許容される塩であってもよい。
【００１５】これらのグリコサミノグリカンの中では特
にヒアルロン酸が好ましい。ヒアルロン酸は、一般に分
子量数千〜約20,000,000程度であるが、10,000〜2,000,
000程度が好ましく、15,000〜1,000,000がより好まし
く、20,000〜800,000であることが特に好ましい。
にヒアルロン酸が好ましい。ヒアルロン酸は、一般に分
子量数千〜約20,000,000程度であるが、10,000〜2,000,
000程度が好ましく、15,000〜1,000,000がより好まし
く、20,000〜800,000であることが特に好ましい。
【００１６】また、上述のグリコサミノグリカンに結合
させる脂質としては、動物、植物、微生物等の天然物由
来、または化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的
に分解された複合脂質または単純脂質を使用することが
でき、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖
の脂肪酸アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、
セラミド等いずれも使用できる。特にホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリ
ンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホ
スファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグ
リセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグ
リセロ脂質が好ましい。特に１級アミノ基を有するリン
脂質が好ましい。脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度
は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好まし
い。アシル基としては例えばパルミトイル（ヘキサデカ
ノイル）またはステアロイル（オクタデカノイル）など
が例示される。また、これらの脂質は通常使用される薬
理学的に許容される塩であってもよい。
させる脂質としては、動物、植物、微生物等の天然物由
来、または化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的
に分解された複合脂質または単純脂質を使用することが
でき、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖
の脂肪酸アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、
セラミド等いずれも使用できる。特にホスファチジルエ
タノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジ
ルトレオニン、エタノールアミンプラスマロゲン、セリ
ンプラスマロゲン、リゾホスファチジルコリン、リゾホ
スファチジルイノシトール等のリン脂質、モノアシルグ
リセロール、ジアシルグリセロール等の中性脂質等のグ
リセロ脂質が好ましい。特に１級アミノ基を有するリン
脂質が好ましい。脂質中のアシル基の鎖長及び不飽和度
は特に限定されないが、炭素数６以上のものが好まし
い。アシル基としては例えばパルミトイル（ヘキサデカ
ノイル）またはステアロイル（オクタデカノイル）など
が例示される。また、これらの脂質は通常使用される薬
理学的に許容される塩であってもよい。
【００１７】グリコサミノグリカンの脂質との結合位置
は特に限定されるものではないが、グリコサミノグリカ
ンの末端部が好ましく、特に還元末端への結合が好まし
い。また、結合の形態は、特に化学結合が好ましく、そ
の中でも共有結合による結合が最も好ましい。
は特に限定されるものではないが、グリコサミノグリカ
ンの末端部が好ましく、特に還元末端への結合が好まし
い。また、結合の形態は、特に化学結合が好ましく、そ
の中でも共有結合による結合が最も好ましい。
【００１８】グリコサミノグリカンと脂質とが共有結合
した脂質結合グリコサミノグリカンの場合、グリコサミ
ノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホル
ミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基もしくは１
級アミノ基、またはグリコサミノグリカンに別途導入さ
れた前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基もし
くは１級アミノ基、または脂質に別途導入された前記基
との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、
エステル結合またはアミノアルキル結合（−ＣＨ2 −Ｎ
Ｈ−）によって共有結合したものが好ましい。
した脂質結合グリコサミノグリカンの場合、グリコサミ
ノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホル
ミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基もしくは１
級アミノ基、またはグリコサミノグリカンに別途導入さ
れた前記基と、脂質のカルボキシル基、ホルミル基もし
くは１級アミノ基、または脂質に別途導入された前記基
との間で形成される酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、
エステル結合またはアミノアルキル結合（−ＣＨ2 −Ｎ
Ｈ−）によって共有結合したものが好ましい。
【００１９】特に、グリコサミノグリカンの還元末端の
ピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成され
たグリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを
含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成さ
れた酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、グリコサミノグ
リカンのウロン酸部分のカルボキシル基と、脂質の１級
アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−
ＣＯ−ＮＨ−）、またはグリコサミノグリカンの還元末
端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成
されたグリコサミノグリカンのホルミル基と、脂質の１
級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還
元して形成されたアミノアルキル結合（−ＣＨ2−ＮＨ
−）により結合されたものが好ましい。
ピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成され
たグリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを
含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成さ
れた酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）、グリコサミノグ
リカンのウロン酸部分のカルボキシル基と、脂質の１級
アミノ基との反応によって形成された酸アミド結合（−
ＣＯ−ＮＨ−）、またはグリコサミノグリカンの還元末
端のピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成
されたグリコサミノグリカンのホルミル基と、脂質の１
級アミノ基との反応によって形成されたシッフ塩基を還
元して形成されたアミノアルキル結合（−ＣＨ2−ＮＨ
−）により結合されたものが好ましい。
【００２０】なお、上記共有結合に関与するアミノ基、
カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含
む）、水酸基はグリコサミノグリカンまたは脂質に元来
存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって
形成されたもの、あるいは上記官能基を末端に有するス
ペーサー化合物を、予めグリコサミノグリカンまたは脂
質と反応させることによって別途導入されたもののいず
れであってもよい。
カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含
む）、水酸基はグリコサミノグリカンまたは脂質に元来
存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって
形成されたもの、あるいは上記官能基を末端に有するス
ペーサー化合物を、予めグリコサミノグリカンまたは脂
質と反応させることによって別途導入されたもののいず
れであってもよい。
【００２１】特に好ましい脂質結合グリコサミノグリカ
ンである、脂質がグリコサミノグリカンの還元末端に共
有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造法とし
ては、例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号及び特
開平9-30979号に開示された方法が挙げられ、例えば以
下のような方法が使用できる。
ンである、脂質がグリコサミノグリカンの還元末端に共
有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造法とし
ては、例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号及び特
開平9-30979号に開示された方法が挙げられ、例えば以
下のような方法が使用できる。
【００２２】還元末端限定酸化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基
であるガラクトース残基、ウロン酸残基またはヘキソサ
ミン残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することによ
り、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）さ
せるとともに、該グリコサミノグリカンの還元末端にホ
ルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアル
デヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反
応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還
元し、アミノアルキル結合（−ＣＨ2−ＮＨ−）を形成
させて、グリコサミノグリカンと脂質とを共有結合させ
る方法である。
であるガラクトース残基、ウロン酸残基またはヘキソサ
ミン残基を還元し、限定酸化（部分酸化）することによ
り、還元末端のピラノース環を特異的に開環（開裂）さ
せるとともに、該グリコサミノグリカンの還元末端にホ
ルミル基を形成させてアルデヒド化合物とし、このアル
デヒド化合物のホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反
応させてシッフ塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還
元し、アミノアルキル結合（−ＣＨ2−ＮＨ−）を形成
させて、グリコサミノグリカンと脂質とを共有結合させ
る方法である。
【００２３】グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基
の還元は、グリコサミノグリカンに対して５〜５０当量
程度、好ましくは２５〜３０当量の還元剤（水素化ホウ
素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素
化ホウ素アルカリ塩等）を使用し、適当な水性溶媒（例
えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常１０〜３０℃、
好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
の還元は、グリコサミノグリカンに対して５〜５０当量
程度、好ましくは２５〜３０当量の還元剤（水素化ホウ
素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素
化ホウ素アルカリ塩等）を使用し、適当な水性溶媒（例
えば、水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常１０〜３０℃、
好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
【００２４】上記還元後、限定酸化を行ってグリコサミ
ノグリカンの還元末端に特異的にホルミル基を有するア
ルデヒド化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後の
グリコサミノグリカンに対して１〜１０当量、好ましく
は３〜６当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ
素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩等）を用い、通
常０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で行うことができ
る。
ノグリカンの還元末端に特異的にホルミル基を有するア
ルデヒド化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後の
グリコサミノグリカンに対して１〜１０当量、好ましく
は３〜６当量の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ
素酸カリウム等の過ヨウ素酸アルカリ塩等）を用い、通
常０〜１０℃、好ましくは０〜４℃で行うことができ
る。
【００２５】得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基
を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリ
ン脂質等）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応
は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）または適当な有
機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な
有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解
した溶液とを混合し、通常１５〜６０℃の温度で反応さ
せることができる。この反応時または反応終了後に適当
な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ
素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を作用さ
せてシッフ塩基を還元することができる。
を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリ
ン脂質等）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応
は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）または適当な有
機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な
有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解
した溶液とを混合し、通常１５〜６０℃の温度で反応さ
せることができる。この反応時または反応終了後に適当
な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ
素ナトリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を作用さ
せてシッフ塩基を還元することができる。
【００２６】なお、本反応方法で脂質結合グリコサミノ
グリカンを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の
代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサ
ー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジ
アミン、またはリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒ
ド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（−ＣＨ
2−ＮＨ−）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物
の他方の官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基
（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モ
ノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシル
グリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよ
い。
グリカンを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の
代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサ
ー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジ
アミン、またはリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒ
ド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（−ＣＨ
2−ＮＨ−）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物
の他方の官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基
（例えば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モ
ノアシルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシル
グリセロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよ
い。
【００２７】還元末端ラクトン化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基
であるガラクトース残基、ウロン酸残基またはヘキソサ
ミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース
環を特異的に開環（開裂）させて該グリコサミノグリカ
ンの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラ
クトン形成反応に付すことによって該グリコサミノグリ
カンの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂
質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ
−ＮＨ−）を形成させることによって、グリコサミノグ
リカンと脂質とを共有結合させる方法である。
であるガラクトース残基、ウロン酸残基またはヘキソサ
ミン残基を酸化することにより、還元末端のピラノース
環を特異的に開環（開裂）させて該グリコサミノグリカ
ンの還元末端にカルボキシル基を形成させて、次いでラ
クトン形成反応に付すことによって該グリコサミノグリ
カンの還元末端をラクトン構造とし、このラクトンと脂
質の１級アミノ基とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ
−ＮＨ−）を形成させることによって、グリコサミノグ
リカンと脂質とを共有結合させる方法である。
【００２８】グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基
の酸化は、グリコサミノグリカンに対して２〜２０当量
程度、好ましくは５〜１５当量程度の酸化剤（ヨウ素、
臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン
酸塩緩衝液等）中、通常０〜４０℃、好ましくは１５〜
３０℃で行うことができる。
の酸化は、グリコサミノグリカンに対して２〜２０当量
程度、好ましくは５〜１５当量程度の酸化剤（ヨウ素、
臭素等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン
酸塩緩衝液等）中、通常０〜４０℃、好ましくは１５〜
３０℃で行うことができる。
【００２９】上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹
脂、例えばダウエックス５０（商品名；ダウケミカル社
製）、アンバーライトＩＲ−１２０（商品名；オルガノ
社製）及び／または酸（塩酸、硫酸等の無機酸、または
酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処
理することによって、グリコサミノグリカンの還元末端
が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を製造する
ことができる。
脂、例えばダウエックス５０（商品名；ダウケミカル社
製）、アンバーライトＩＲ−１２０（商品名；オルガノ
社製）及び／または酸（塩酸、硫酸等の無機酸、または
酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処
理することによって、グリコサミノグリカンの還元末端
が特異的にラクトン化されたラクトン化合物を製造する
ことができる。
【００３０】得られたラクトン化合物と１級アミノ基を
有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン
脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝
液等）または適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した
溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール
等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、５〜８０℃、好
ましくは３０〜６０℃の温度で反応させればよい。
有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン
脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝
液等）または適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した
溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール
等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、５〜８０℃、好
ましくは３０〜６０℃の温度で反応させればよい。
【００３１】なお、還元末端限定酸化法の場合と同様
に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ
基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクト
ン化合物とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ
−）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂
質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させても
よい。
に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ
基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクト
ン化合物とを反応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ
−）を形成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂
質の官能基（例えばカルボキシル基）とを反応させても
よい。
【００３２】但し、脂質がグリコサミノグリカンの還元
末端に共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製
造方法はこれらの方法に限定されるものではなく、グリ
コサミノグリカンの還元末端に脂質を結合しうる方法で
あれば他の任意の方法によっても製造することができ
る。
末端に共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製
造方法はこれらの方法に限定されるものではなく、グリ
コサミノグリカンの還元末端に脂質を結合しうる方法で
あれば他の任意の方法によっても製造することができ
る。
【００３３】グリコサミノグリカンの末端以外に脂質を
導入する方法としては、例えばグリコサミノグリカンの
ウロン酸部分のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基と
を反応させて、酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成
させる方法が挙げられる。
導入する方法としては、例えばグリコサミノグリカンの
ウロン酸部分のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基と
を反応させて、酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成
させる方法が挙げられる。
【００３４】上記反応に際し、縮合剤（例えば、１−エ
チル−３−( ３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイ
ミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸
アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させるか、あるい
はウロン酸部分のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、
活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ
−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル等）と反応させて活性エステルとした後、該脂質と反
応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させる
ことができる。
チル−３−( ３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイ
ミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸
アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させるか、あるい
はウロン酸部分のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、
活性化剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ
−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル等）と反応させて活性エステルとした後、該脂質と反
応させて酸アミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を形成させる
ことができる。
【００３５】尚、上記反応においてはグリコサミノグリ
カンのウロン酸部分を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエ
チルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）と
し、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
カンのウロン酸部分を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエ
チルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）と
し、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。
【００３６】脂質結合グリコサミノグリカンの薬理学的
に許容される塩としては、例えばナトリウム、カリウム
等のアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のア
ルカリ土類金属塩；トリアルキルアミン等のアミン塩；
及びピリジン等の有機塩基との塩等が挙げられ、特に限
定されないが、特にアルカリ金属塩が好ましく、ナトリ
ウム塩が最も好ましい。
に許容される塩としては、例えばナトリウム、カリウム
等のアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウム等のア
ルカリ土類金属塩；トリアルキルアミン等のアミン塩；
及びピリジン等の有機塩基との塩等が挙げられ、特に限
定されないが、特にアルカリ金属塩が好ましく、ナトリ
ウム塩が最も好ましい。
【００３７】上記のような脂質結合グリコサミノグリカ
ンの具体例としては、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホス
ファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸、ジパ
ルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールア
ミン結合コンドロイチン硫酸、ステアロイルパルミトイ
ルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸、モノ
ステアロイルグリセロール・コハク酸エステル結合コン
ドロイチン硫酸、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファ
チジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸等が挙げら
れ、これらの脂質結合グリコサミノグリカンのより具体
的な構造、製造方法の詳細等については、特開平4-8020
1号、特開平4-80202号及び特開平9-30979号等に記載さ
れている。
ンの具体例としては、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホス
ファチジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸、ジパ
ルミトイル−Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールア
ミン結合コンドロイチン硫酸、ステアロイルパルミトイ
ルホスファチジルセリン結合コンドロイチン硫酸、モノ
ステアロイルグリセロール・コハク酸エステル結合コン
ドロイチン硫酸、ジパルミトイル−Ｌ−（α−ホスファ
チジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸等が挙げら
れ、これらの脂質結合グリコサミノグリカンのより具体
的な構造、製造方法の詳細等については、特開平4-8020
1号、特開平4-80202号及び特開平9-30979号等に記載さ
れている。
【００３８】本発明の骨誘導促進剤は、上述の脂質結合
グリコサミノグリカンを固体または液体の医薬用担体ま
たは希釈剤、すなわち賦形剤、安定剤等の添加剤ととも
に含む製剤とすることができる。すなわち、水、ゼラチ
ン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、動植物油脂、ベンジルアルコール、ポリアルキレン
グリコール、石油樹脂、椰子油、ラノリン等と共に、脂
質結合グリコサミノグリカンを0.1重量%〜90重量%程度
含むように調製することができる。
グリコサミノグリカンを固体または液体の医薬用担体ま
たは希釈剤、すなわち賦形剤、安定剤等の添加剤ととも
に含む製剤とすることができる。すなわち、水、ゼラチ
ン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、動植物油脂、ベンジルアルコール、ポリアルキレン
グリコール、石油樹脂、椰子油、ラノリン等と共に、脂
質結合グリコサミノグリカンを0.1重量%〜90重量%程度
含むように調製することができる。
【００３９】また、本発明の骨誘導促進剤は、様々な成
長因子と共に投与することで、本発明の目的である骨折
や骨欠損の治癒をより促進することが可能である。上記
成長因子としては、線維芽細胞増殖因子（FGF：aFGF、b
FGF等）、骨形成タンパク質（BMPs：TGF-β等）、血管
内皮細胞増殖因子（VEGF）、カルシトロフィックファク
ター（Calcitrophic factor）（エストロゲン、パラト
ルモン、1,25(OH)2D3（活性化ビタミンD）、デキサメタ
ゾン等）、または転写因子（cbfa1等）が挙げられる
が、本発明の骨誘導促進剤の有効成分である脂質結合グ
リコサミノグリカンを構成するグリコサミノグリカンと
親和性を有する成長因子であって、骨形成能あるいは骨
形成に伴う周辺組織の発達を促進する働きを有すること
がより好ましい。そのような成長因子としては例えばFG
F、BMPs、及びVEGF等が挙げられる。上述のグリコサミ
ノグリカンと親和性を有する成長因子を本発明の骨誘導
促進剤と共に目的部位（例えば骨折部位や骨欠損部位
等）に投与することで、上記成長因子の目的部位からの
拡散が遅延するため、目的部位における上記成長因子の
働きがより長時間維持される。
長因子と共に投与することで、本発明の目的である骨折
や骨欠損の治癒をより促進することが可能である。上記
成長因子としては、線維芽細胞増殖因子（FGF：aFGF、b
FGF等）、骨形成タンパク質（BMPs：TGF-β等）、血管
内皮細胞増殖因子（VEGF）、カルシトロフィックファク
ター（Calcitrophic factor）（エストロゲン、パラト
ルモン、1,25(OH)2D3（活性化ビタミンD）、デキサメタ
ゾン等）、または転写因子（cbfa1等）が挙げられる
が、本発明の骨誘導促進剤の有効成分である脂質結合グ
リコサミノグリカンを構成するグリコサミノグリカンと
親和性を有する成長因子であって、骨形成能あるいは骨
形成に伴う周辺組織の発達を促進する働きを有すること
がより好ましい。そのような成長因子としては例えばFG
F、BMPs、及びVEGF等が挙げられる。上述のグリコサミ
ノグリカンと親和性を有する成長因子を本発明の骨誘導
促進剤と共に目的部位（例えば骨折部位や骨欠損部位
等）に投与することで、上記成長因子の目的部位からの
拡散が遅延するため、目的部位における上記成長因子の
働きがより長時間維持される。
【００４０】また更に、上述のグリコサミノグリカンに
対して親和性を有する成長因子を、予め本発明の骨誘導
促進剤と混合することで、本発明の骨誘導促進剤の有効
成分である脂質結合グリコサミノグリカンのグリコサミ
ノグリカンに結合させ、上記成長因子が結合した脂質結
合グリコサミノグリカンを有効成分とする骨誘導促進剤
を目的部位に投与し、目的部位及びその周辺部に本発明
の骨誘導促進剤から上記成長因子を徐放させる薬剤とす
ることも可能であり、骨折や骨欠損のより早期の治癒を
達成することが容易となる。
対して親和性を有する成長因子を、予め本発明の骨誘導
促進剤と混合することで、本発明の骨誘導促進剤の有効
成分である脂質結合グリコサミノグリカンのグリコサミ
ノグリカンに結合させ、上記成長因子が結合した脂質結
合グリコサミノグリカンを有効成分とする骨誘導促進剤
を目的部位に投与し、目的部位及びその周辺部に本発明
の骨誘導促進剤から上記成長因子を徐放させる薬剤とす
ることも可能であり、骨折や骨欠損のより早期の治癒を
達成することが容易となる。
【００４１】本発明の骨誘導促進剤の剤形及び投与形態
としては、細粒剤、軟膏剤または液剤等の剤形にし、骨
誘導を促進したい投与の目的部位を切開して直接塗布ま
たは液剤であれば切開はせずに注射により投与すること
ができる。また、公知の骨形成の基材または人工骨素材
あるいは骨補強材となるハイドロキシアパタイト、チタ
ニウムロッドまたはチタニウムメッシュ等の素材を予め
本発明の骨誘導促進剤の液剤等に浸漬してそれら素材の
表面に本発明の骨誘導促進剤を結合、吸着または含浸さ
せ、必要に応じて成型し、その後、前記基材等を前記目
的部位に導入することで、間接的に本発明の骨誘導促進
剤を目的部位に投与して目的の骨誘導促進効果を得るこ
とも可能である。
としては、細粒剤、軟膏剤または液剤等の剤形にし、骨
誘導を促進したい投与の目的部位を切開して直接塗布ま
たは液剤であれば切開はせずに注射により投与すること
ができる。また、公知の骨形成の基材または人工骨素材
あるいは骨補強材となるハイドロキシアパタイト、チタ
ニウムロッドまたはチタニウムメッシュ等の素材を予め
本発明の骨誘導促進剤の液剤等に浸漬してそれら素材の
表面に本発明の骨誘導促進剤を結合、吸着または含浸さ
せ、必要に応じて成型し、その後、前記基材等を前記目
的部位に導入することで、間接的に本発明の骨誘導促進
剤を目的部位に投与して目的の骨誘導促進効果を得るこ
とも可能である。
【００４２】本発明の骨誘導促進剤の投与量は、患者の
状態や体重によって適宜選択すべきであるが、有効成分
として含有される脂質結合グリコサミノグリカンの重量
として一般に1μg〜2000 mg／部位程度を投与すること
が好ましい。
状態や体重によって適宜選択すべきであるが、有効成分
として含有される脂質結合グリコサミノグリカンの重量
として一般に1μg〜2000 mg／部位程度を投与すること
が好ましい。
【００４３】本発明の骨誘導促進剤のマウスに対する腹
腔内投与での急性毒性（LD50）は、ホスファチジルエタ
ノールアミンを結合したコンドロイチン硫酸及びホスフ
ァチジルエタノールアミンを結合したヒアルロン酸の双
方で2000 mg/kg以上であったので、生体への投与におい
ても十分な安全性を有していると考えられる。
腔内投与での急性毒性（LD50）は、ホスファチジルエタ
ノールアミンを結合したコンドロイチン硫酸及びホスフ
ァチジルエタノールアミンを結合したヒアルロン酸の双
方で2000 mg/kg以上であったので、生体への投与におい
ても十分な安全性を有していると考えられる。
【００４４】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に詳述す
る。 実施例１ 培養細胞に対する脂質結合グリコサミノグリカンの骨細
胞誘導活性 (1) ラット頭蓋冠由来細胞の調製 ラットの頭蓋冠由来細胞を、生後3日のWistar系ラット
（三協ラボ社より購入）から以下の方法によって単離し
た。
る。 実施例１ 培養細胞に対する脂質結合グリコサミノグリカンの骨細
胞誘導活性 (1) ラット頭蓋冠由来細胞の調製 ラットの頭蓋冠由来細胞を、生後3日のWistar系ラット
（三協ラボ社より購入）から以下の方法によって単離し
た。
【００４５】すなわち、ラットを屠殺後、断頭し、頭蓋
冠を取り出した。ピンセットにより組織をほぐした後、
EDTAを0.04%、コラゲナーゼ（crude type IA：SIGMA社
製：0.1%）、トリプシン（0.05%）を含む酵素処理液中
に懸濁し、37℃条件下で30分間処理した。その後、酵素
処理液を回収し、酵素処理液中に遊離した細胞を、遠心
分離によって回収した（RC-I）。組織に再度新たに酵素
処理液を添加して37℃で30分間消化し、酵素処理液中に
遊離してくる細胞を回収してRC-IIとした。
冠を取り出した。ピンセットにより組織をほぐした後、
EDTAを0.04%、コラゲナーゼ（crude type IA：SIGMA社
製：0.1%）、トリプシン（0.05%）を含む酵素処理液中
に懸濁し、37℃条件下で30分間処理した。その後、酵素
処理液を回収し、酵素処理液中に遊離した細胞を、遠心
分離によって回収した（RC-I）。組織に再度新たに酵素
処理液を添加して37℃で30分間消化し、酵素処理液中に
遊離してくる細胞を回収してRC-IIとした。
【００４６】得られたRC-I及びRC-IIを混合して以下で
使用した（RC-IとRC-IIを混合した細胞を以下RC-I,II細
胞と記載する）。この細胞群は、細胞外マトリクスの分
泌が少ない未分化な細胞群であり、骨芽細胞の前駆細胞
である。上記RC-I,II細胞は骨芽細胞のマーカー（T.R.
Arnett et al, Methods in Bone Biology, 1998, Chapm
an & Hall）となるアルカリホスファターゼ（ALP）、タ
イプIコラーゲン（COL1）、及びオステオカルシン（O
C）の遺伝子をほとんど発現していなかった。
使用した（RC-IとRC-IIを混合した細胞を以下RC-I,II細
胞と記載する）。この細胞群は、細胞外マトリクスの分
泌が少ない未分化な細胞群であり、骨芽細胞の前駆細胞
である。上記RC-I,II細胞は骨芽細胞のマーカー（T.R.
Arnett et al, Methods in Bone Biology, 1998, Chapm
an & Hall）となるアルカリホスファターゼ（ALP）、タ
イプIコラーゲン（COL1）、及びオステオカルシン（O
C）の遺伝子をほとんど発現していなかった。
【００４７】(2) 脂質結合グリコサミノグリカンの調製 特開平4-80201の実施例１に記載された方法に従い、以
下のようにして脂質結合グリコサミノグリカンを調製し
た。
下のようにして脂質結合グリコサミノグリカンを調製し
た。
【００４８】500 mgのヒアルロン酸（ナトリウム塩：鶏
冠由来、分子量約23,000、HA）を水10 mlに溶解し、0.1
Mヨウ素のメタノール溶液5 mlを加えて室温で6時間反
応させた。その後、反応液に0.1 N水酸化カリウムを約5
ml加えて遊離のヨウ素の色を消失させた。この溶液に
酢酸カリウム飽和エタノールを加えて生じた沈澱を濾取
し、充分にエタノールで洗浄し、減圧乾燥し、分子量約
23,000の還元末端酸化ヒアルロン酸（ナトリウム塩）42
3 mgを得た。
冠由来、分子量約23,000、HA）を水10 mlに溶解し、0.1
Mヨウ素のメタノール溶液5 mlを加えて室温で6時間反
応させた。その後、反応液に0.1 N水酸化カリウムを約5
ml加えて遊離のヨウ素の色を消失させた。この溶液に
酢酸カリウム飽和エタノールを加えて生じた沈澱を濾取
し、充分にエタノールで洗浄し、減圧乾燥し、分子量約
23,000の還元末端酸化ヒアルロン酸（ナトリウム塩）42
3 mgを得た。
【００４９】400 mgの上記の還元末端酸化ヒアルロン酸
を水10 mlに溶解し、50 mlの強酸性イオン交換樹脂(Dow
ex 50 (H+))を1時間かけて通過させ、390 mgの還元末端
ラクトンヒアルロン酸を含む水溶液を得た。
を水10 mlに溶解し、50 mlの強酸性イオン交換樹脂(Dow
ex 50 (H+))を1時間かけて通過させ、390 mgの還元末端
ラクトンヒアルロン酸を含む水溶液を得た。
【００５０】上記の水溶液をトリ-n-ブチルアミン中で
中和し、凍結乾燥して400 mgの還元末端ラクトンヒアル
ロン酸のトリ-n-ブチルアミン塩を得た。
中和し、凍結乾燥して400 mgの還元末端ラクトンヒアル
ロン酸のトリ-n-ブチルアミン塩を得た。
【００５１】400 mgの上記で製造した還元末端ラクトン
ヒアルロン酸トリ-n-ブチルアミン塩を200 mlのジメチ
ルホルムアミドに溶解し、27.6 mgのL-(α-ホスファチ
ジル)エタノールアミン・ジパルミトイルのクロロホル
ム溶液を加えて、70℃で2時間反応させ、クロロホルム
を溜去し、過剰の酢酸ナトリウム水溶液を加えてナトリ
ウム塩にした後、酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え
た。生じた沈澱を濾取し、0.3 M酢酸アンモニウム溶液
に溶解し、疎水クロマトグラフィーカラム(TSKgelフェ
ニルトヨパール650M、400 ml)に吸着させ、0.3 M酢酸ア
ンモニウム水溶液で充分に洗浄し、30％メタノール水溶
液で目的とする上記物質を溶出した。30％メタノール水
溶液溶出画分を減圧下濃縮し、凍結乾燥して精製し、36
mgのL-(α-ホスファチジル)エタノールアミン・ジパル
ミトイル結合ヒアルロン酸（以下「HA-PE」と略記す
る）を得た。
ヒアルロン酸トリ-n-ブチルアミン塩を200 mlのジメチ
ルホルムアミドに溶解し、27.6 mgのL-(α-ホスファチ
ジル)エタノールアミン・ジパルミトイルのクロロホル
ム溶液を加えて、70℃で2時間反応させ、クロロホルム
を溜去し、過剰の酢酸ナトリウム水溶液を加えてナトリ
ウム塩にした後、酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え
た。生じた沈澱を濾取し、0.3 M酢酸アンモニウム溶液
に溶解し、疎水クロマトグラフィーカラム(TSKgelフェ
ニルトヨパール650M、400 ml)に吸着させ、0.3 M酢酸ア
ンモニウム水溶液で充分に洗浄し、30％メタノール水溶
液で目的とする上記物質を溶出した。30％メタノール水
溶液溶出画分を減圧下濃縮し、凍結乾燥して精製し、36
mgのL-(α-ホスファチジル)エタノールアミン・ジパル
ミトイル結合ヒアルロン酸（以下「HA-PE」と略記す
る）を得た。
【００５２】(3) 脂質結合グリコサミノグリカンの骨細
胞誘導活性の評価 上記で製造したHA-PEを、ハンクス液に5 μg/mlの濃度
で溶解し、このハンクス液の2 mlを10 cmのポリスチレ
ン製の培養皿に分注し、4℃で16時間静置することによ
り培養皿にHA-PEを固着させた。HA-PEを含まないハンク
ス液で処理した培養皿を対照として用いた。
胞誘導活性の評価 上記で製造したHA-PEを、ハンクス液に5 μg/mlの濃度
で溶解し、このハンクス液の2 mlを10 cmのポリスチレ
ン製の培養皿に分注し、4℃で16時間静置することによ
り培養皿にHA-PEを固着させた。HA-PEを含まないハンク
ス液で処理した培養皿を対照として用いた。
【００５３】この培養皿に、上記で調製したRC-I,II細
胞を1×104 細胞/cm2培養皿となるように播き、10%牛胎
児血清（FBS：GIBCO社製）及び1%抗生・抗マイコプラズ
マ溶液（50μg/ml アスコルビン酸、5 mM β-グリセ
ロリン酸を含む、GIBCO社製）を含むα-最少イーグル培
地（MEM：GIBCO社製）で培養した。
胞を1×104 細胞/cm2培養皿となるように播き、10%牛胎
児血清（FBS：GIBCO社製）及び1%抗生・抗マイコプラズ
マ溶液（50μg/ml アスコルビン酸、5 mM β-グリセ
ロリン酸を含む、GIBCO社製）を含むα-最少イーグル培
地（MEM：GIBCO社製）で培養した。
【００５４】細胞が飽和状態になった直後、その1週間
後、及び2週間後にグアニジン-フェノール-クロロホル
ム法により細胞の全RNAを抽出して、ノザンブロッティ
ング法により骨芽細胞への分化の指標となるALP、COL
1、及びOC遺伝子の発現を解析した。結果を図１に示
す。図１中、Et-BrはリボソームRNAについてエチジウム
ブロミドにより染色した標準を示す。また、上記のノザ
ンブロッティングのイメージを、リボソームRNAについ
てエチジウムブロミドにより染色したものに対して標準
化することによりQuantity Oneプログラム（TOYOBO社
製）を用いて数値化して解析した結果を図２に示す。
後、及び2週間後にグアニジン-フェノール-クロロホル
ム法により細胞の全RNAを抽出して、ノザンブロッティ
ング法により骨芽細胞への分化の指標となるALP、COL
1、及びOC遺伝子の発現を解析した。結果を図１に示
す。図１中、Et-BrはリボソームRNAについてエチジウム
ブロミドにより染色した標準を示す。また、上記のノザ
ンブロッティングのイメージを、リボソームRNAについ
てエチジウムブロミドにより染色したものに対して標準
化することによりQuantity Oneプログラム（TOYOBO社
製）を用いて数値化して解析した結果を図２に示す。
【００５５】図１及び図２、特に数値化した図２に示し
た結果から明らかな通り、HA-PEをコートした培養皿で
培養したRC-I,II細胞において、顕著にALP、COL1及びOC
遺伝子の発現が増強されており、HA-PEは未分化な細胞
の骨芽細胞への分化を有意に誘導することが明かとなっ
た。
た結果から明らかな通り、HA-PEをコートした培養皿で
培養したRC-I,II細胞において、顕著にALP、COL1及びOC
遺伝子の発現が増強されており、HA-PEは未分化な細胞
の骨芽細胞への分化を有意に誘導することが明かとなっ
た。
【００５６】
【発明の効果】本発明により、脂質結合グリコサミノグ
リカンを有効成分として含有する、新たな骨誘導促進剤
が提供され、骨折または骨欠損を伴う疾病または傷害の
治癒期間の大幅な短縮が可能となる。
リカンを有効成分として含有する、新たな骨誘導促進剤
が提供され、骨折または骨欠損を伴う疾病または傷害の
治癒期間の大幅な短縮が可能となる。
【図１】 図１は、HA-PEにより誘導されたALP、COL1及
びOC遺伝子発現を分析したノザンブロッティングにおい
て得られたオートラジオグラムを示す。
びOC遺伝子発現を分析したノザンブロッティングにおい
て得られたオートラジオグラムを示す。
【図２】 図２は、図１のノザンブロッティングのイメ
ージを数値化して比較したグラフを示す。
ージを数値化して比較したグラフを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C090 AA09 BA66 BA67 BA68 BA76 BA78 BB64 BB91 DA09 DA23
Claims (7)
- 【請求項１】 グリコサミノグリカンに脂質が結合した
脂質結合グリコサミノグリカンまたはその薬理学的に許
容される塩を有効成分として含有することを特徴とする
骨誘導促進剤。 - 【請求項２】 グリコサミノグリカンが、ヒアルロン
酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、コンドロイ
チンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫
酸及びケラタンポリ硫酸からなる物質群から選択される
物質であることを特徴とする請求項１に記載の骨誘導促
進剤。 - 【請求項３】 脂質がグリセロ脂質である請求項１また
は２に記載の骨誘導促進剤。 - 【請求項４】 グリセロ脂質がリン脂質であることを特
徴とする請求項３に記載の骨誘導促進剤。 - 【請求項５】 リン脂質がホスファチジルエタノールア
ミンである請求項４に記載の骨誘導促進剤。 - 【請求項６】 グリコサミノグリカンがヒアルロン酸で
あり、脂質がホスファチジルエタノールアミンである請
求項１に記載の骨誘導促進剤。 - 【請求項７】 グリコサミノグリカンの還元末端に脂質
が共有結合していることを特徴とする請求項１〜６のい
ずれかに記載の骨誘導促進剤。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11019712A JP3032824B1 (ja) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | 骨誘導促進剤 |
| EP00250026A EP1044691A3 (en) | 1999-01-28 | 2000-01-27 | Use of glycosaminoglycan lipid conjugates for inducing osteogenesis |
| US10/291,658 US20030064960A1 (en) | 1999-01-28 | 2002-11-12 | Medicine for inducing osteogenesis |
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| JP11019712A JP3032824B1 (ja) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | 骨誘導促進剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3032824B1 JP3032824B1 (ja) | 2000-04-17 |
| JP2000212204A true JP2000212204A (ja) | 2000-08-02 |
Family
ID=12006913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11019712A Expired - Lifetime JP3032824B1 (ja) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | 骨誘導促進剤 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1044691A3 (ja) |
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| US9561260B2 (en) | 2010-12-28 | 2017-02-07 | Depuy Mitek, Llc | Compositions for treating joints comprising bone morphogenetic protein and hyaluronic acid |
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| US6005161A (en) * | 1986-01-28 | 1999-12-21 | Thm Biomedical, Inc. | Method and device for reconstruction of articular cartilage |
| JPS63229058A (ja) * | 1987-03-17 | 1988-09-22 | 大鳥 泰雅 | 骨形成材料の製法 |
| US5403592A (en) * | 1987-08-25 | 1995-04-04 | Macnaught Pty Limited | Lubricant composition for rheumatism |
| CA2067211C (en) * | 1990-07-24 | 2004-06-15 | Katsukiyo Sakurai | Phospholipid- or lipid-linked glycosaminoglycan, process for producing the same and metastasis inhibitor |
| IT1260148B (it) * | 1992-04-17 | 1996-03-28 | Fidia Spa | Impiego di preparazioni di acido ialuronico per la formazione di tessuto osseo |
| JP3714683B2 (ja) * | 1992-07-30 | 2005-11-09 | 生化学工業株式会社 | 抗リウマチ剤 |
| US5785975A (en) * | 1995-06-26 | 1998-07-28 | Research Triangle Pharmaceuticals | Adjuvant compositions and vaccine formulations comprising same |
| US5843919A (en) * | 1996-11-25 | 1998-12-01 | Burger; John A. | Composition and method for the treatment of arthritis |
-
1999
- 1999-01-28 JP JP11019712A patent/JP3032824B1/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-27 EP EP00250026A patent/EP1044691A3/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-11-12 US US10/291,658 patent/US20030064960A1/en not_active Abandoned
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| US9682099B2 (en) | 2015-01-20 | 2017-06-20 | DePuy Synthes Products, Inc. | Compositions and methods for treating joints |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP1044691A2 (en) | 2000-10-18 |
| EP1044691A3 (en) | 2003-06-11 |
| US20030064960A1 (en) | 2003-04-03 |
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