JPH0480201A

JPH0480201A - 燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン

Info

Publication number: JPH0480201A
Application number: JP2193817A
Authority: JP
Inventors: Katsukiyo Sakurai; 桜井　勝清; Nobuo Sugiura; 信夫杉浦; Hiroharu Kimata; 弘治木全; Akira Suzuki; 鈴木　旺
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1990-07-24
Publication date: 1992-03-13
Anticipated expiration: 2015-01-11
Also published as: JP2997018B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、癌転移抑制剤として有用な燐脂質又は脂質結
合グリコサミノグリカン又はその塩に関する。

［従来の技術］癌転移は、血管内やリンパ管内に流出した癌細胞が、血
管内皮細胞やその下の基底膜と呼ばれる血管内皮細胞の
細胞外マトリックスと接着し、接着した癌細胞が細胞外
マトリックス内に浸潤、透過して新しい組織内に転移巣
をつ（ることか知られている。例えばＳ、　Ｋｏｒａｃ
ｈらは（（：ａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　４６．３６
２４−３６２９．　　（１９８６））癌細胞のクローニ
ングで高転移性細胞と低転移性細胞の群に分け、培養内
皮細胞に対するｉｎ　ｖｉｔｒｏでの接触試験で、高転
移性の癌細胞は高い接着率を示し、低転移性のものは低
い接着率を示すことから、血管内皮細胞やその細胞外マ
トリックスに対する接着性が癌の転移と深くかかわって
いることを報告している。

また、細胞外マトリックス成分であるフィブロネクチン
の細胞接着部位にあるペプチドＧＲＧＤＳは、拮抗的に
細胞と細胞外マトリックスとの結合を阻害する。山田ら
はｆｓｃｉｅｎｃｅ　２３３４６７〜４７０．　　（１
９８６１１このペプチド・ＧＲＧＤＳがＢ１６ＦｌＯ細
胞のマウスにおける肺転移を抑制することを示している
。このことから、非常に微量で細胞接着阻害活性を持つ
物質は癌転移抑制剤として利用し得ることを示唆してい
る。

［発明が解決しようとする課題］本発明は、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンが
、上記の癌細胞の血管内皮細胞や細胞外マトリックスへ
の接着を阻害することにより、癌の転移を抑制する知見
を得て本発明をなした６［課題を解決するための手段］本発明は、下記燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカ
ン又はその塩である。

グリコサミノグリカンは表１に示すように、Ｄ−グルコ
サミン又はＤ−ガラクトサミンと、Ｄ−グルクロン酸、
Ｌ−イズロン酸及び／又はＤ−ガラクトースの２糖又は
４糖の繰り返し単位より構成されている長しＮ１貞４大
の多糖であり、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンド
ロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチ
ン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸
Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸、デルシマクン硫酸、ヘパ
リン、ヘパラン硫酸及びグラタン硫酸、ケラタンポリ硫
酸が知られてｌ／する。

表ＧＮｃＮＡｃ　：　Ｄ−グルコサミピＮ−アセチＪしＧ
ａＮＡｃ　：　Ｄ−ガラクトサミンＮ−アセチル（Ｊ’
ｃＮＳ　　：　Ｄ−グルコサミンＮ−石蚕９・〇−硫酸本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンは、
その塩であることができ、好ましくはナトリウム、カリ
ウムのようなアルカリ金属塩；カルシウム、マグネシウ
ムのようなアルカリ土類金属塩ニトリアルキルアミン、
ピリジンのようなアミン塩であることができる。

本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンは、
次のものを包含する。

一般式を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩。

上記式中、Ｒ１はＯＨ，Ｏ２０，ＨｌＮＨＣＯＣＨ，又はＮＨ３０３Ｈを示し、Ｒ２はＣ０Ｏ
Ｈ，ＣＨ，ＯＨ又はＣＨ，，０５Ｏ８Ｈを示し、Ｒ３は
水素又はＳ　Ｏｓ　Ｈを示し、ＧＡＧはヒアルロン酸、
コンドロイチン、コンドロイチン硫ＭＡ、Ｃ，Ｄ、Ｅも
しくはＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、
ヘノ（１）ン、ヘノ＜ラン硫酸、ケラタン硫酸又ｔまケ
ラタン硫酸力）ら還元′１生末端のへキソサミン部分又
Ｇまウロン酸部分もしく（まガラクトース部分を除し）
たグ１ノコサミノグ１ツカ′残基を示し、Ｐｌは１級ア
ミノ基を有する憐口旨質を示す。

一般式を有する燐脂質又は脂質８合グ）ノコサミノグゝフカン
又はその塩。

上記式中、ＧＡＧはヒアルロン酸、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ，Ｅもしく【まＫ、フンドロイ
チンボＩＪ硫酸、デルシマクン硫酸・ヘノ（リン、ヘパ
ラン硫酸、ケラタン硫酸又Ｃよケラクンポリ硫酸から還
元性末４のへキソサミン部分を除いたグリコサミノグ’
Ｊカンタ曵基を示し、ｍｉｄ１〜８を示し、℃は１〜１
０を示し、Ｒ２は燐脂質又は脂質を示す。

一般式を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩。

上記式中、Ｒ１はＯＨ又はＮＨＣＯＣ）Ｉ　３を示し、
Ｒ３は水素又はＳＯ，Ｈを示し、ＧＡＧはヒアルロン酸
、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸ＡもしくはＫ又
はデルマタン硫酸から還元性末端のへキソサミン部分を
除いたグリコサミノグリカン残基、或いはケラタン硫酸
又はケラタンポリ硫酸から還元性末端のガラクトース部
分を除いたグリコサミノグリカン残基な示し、ｍ、ｆ２
及びＲ２は式（ＩＩ）に記載と同しである。

上記式中、Ｒ’、Ｒ２，Ｒ３及びＧＡＧは式（Ｉ）に記
載と同しであり、ｍ、１２及びＲ２は式（ＩＩ）に記載
と同じである。

上記式中、Ｒ３は水素又はＳＯ，Ｈを示し、ＧＡＧはヒ
アルロン酸、コンドロイチン硫ＭＡ、Ｃ，Ｄ、Ｅもしく
はＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパ
リン又はヘパラン硫酸中のグリコサミノグリカン鎖を示
し、Ｐｌは１級アミノ基を有する燐脂質を示し、ｎはグ
リコサミノグリカンに存在するカルボキシ基の数以下の
数を示す。

グリコサミノグリカンの分子量は好ましくは表１に記載
のものが用いられる。

上記式（Ｉ）及び（Ｖ）のＰｌて示される１級アミノ基
を有する燐脂質としては、弐　　　ＣＨ２−０−Ｒ’ ＣＨ（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ水素、ＣＨ＝ＣＨＲ’
又は−ＣＯＲ’　　（Ｒ６及びＲ７はＣ６〜２４のアル
キル基）てあり、ＹはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−又は−ＣＨ２
ＣＨＮＨ−ＯＯＨである）で示されるものが用いられる。特にＲ４及びＲ５がとも
にヘキサデカノイル又はオクタデカノイルのような−Ｃ
ＯＲ７であるか、Ｒ４がＣＨ＝ＣＨＲ’でＲ５が−ＣＯ
Ｒ’ であるものが好ましい。

また、上言己式（ＩＩ）、（Ｉｌｌ　）及び（ＩＶ）の
Ｒ２で示される燐脂質又は脂質としては、式ＣＨ２−０−Ｒ８ＣＨ２−０−Ｒ８ＣＨ−０−Ｒ９（ＶＵ　）　　　ＣＨ−０−（ＶＩ［ｌ
　）ＣＨ２−０−、ＣＨ２−０−Ｒ９ＣＨ２−０− ＣＨＣＨ２−０−Ｒ” ＣＨ−０ＣＨｚ−０−−−Ｐ−０−Ｗ　　　（Ｘ　）ＣＨ（式中、Ｒ’、Ｒ９及びＲＩｏはそれぞれ水素、アルキ
ル基、−ＣＨ＝ＣＨＲ６又は−ＣＯＲ７（Ｒ６及びＲ７
は前記と同し）であり、Ｗ：ま−ＣＨ，ＣＨ２Ｎ”　　
（ＣＨ３）　　３又はイノシトル残基である）で示されるものが用いられる。特にＲ９及びＲ１０がと
もにヘキサデカノイル又はオクタデカノイルのような−
ＣＯＲ’であるか、Ｒ８が水素で、Ｒ″が一〇ＯＲ’で
ある式（■）又は（■）の脂質、或いはＲ１０が−ＣＯ
Ｒ’である式（ＩＸ）又は（Ｘ）の燐脂質が好ましい。

以下に、本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリ
カンの製造法について詳しく説明する。

−−１ラクトンイ法この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端ウロン
酸部分もしくはガラクトース部分又はヘキソサミン部分
を酸化することにより該末端糖部分を開裂させ、更にラ
クトンを形成させて、このラクトンと燐脂質の１級アミ
ノ基との反応により燐脂質結合グリコサミノグリカンを
製造する方法である。この方法を反応式で示せば次のと
おりである。

（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前述と同し、Ｐｌは１級
アミノ基を有する燐脂質を示す）本方法において、先ず
、式（１２）で示されるグリコサミノグリカンを酸化し
て還元性末端部分を開裂させ、式（１３）のカルボキシ
化合物とする。

式（１２）のヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロ
イチン硫ＨＡ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン
硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ
、フンドロイチンボリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン
、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸を
原料として使用することができる。

この酸化に使用しつる酸化剤としては、ヨウ素、臭素等
を用いることができる。

酸化剤の使用量は、式（１２）の化合物１モルに対して
２〜２０当量、好ましくは５〜１５当量の範囲である。

酸化反応における溶媒は、水又は０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）等を用いることができる。

酸化反応温度は、０〜４０℃、好ましくは１５〜２０℃
で行うことができる。

生成する式（１３）の化合物は、次いで酸で処理するこ
とにより式（１４）のラクトン化合物にすることができ
る。

ここで用いることのできる酸としては、強酸性陽イオン
交換樹脂、例えばダウニツクス５ｏ、アンバーライトｌ
Ｒ１２０等を挙げることができる。

得られる式（１４）のラクトン化合物は、次いで燐脂質
と反応させることにより、前記一般式（Ｉ）の燐脂質結
合グリコサミノグリカンを製造することができる。

上記反応に用いることのできる燐脂質としては、Ｌ−（
ａ−ホスファチジル）エタノールアミン、ＤＬ−ホスフ
ァチジル−し−セリン、エタノールアミンプラスマロゲ
ン、セリンプラスマロゲン等を用いることができる。

式（１４）のラクトン化合物と燐脂質との反応は、水、
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）又はジメチルホ
ルムアミド等に溶解した式（１４）のラクトン化合物と
、クロロホルム等に溶解した燐脂質とを混合して均一な
溶液にし、５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃の温度
で反応させることにより一般式（１）の化合物を製造す
ることができる。

Ｉ元Ｊ」Ｌ乙’ｉ＞店この方法は、次の還元末端限定酸化法で製造される式（
３）、（６ン、（９）及び（１０）のアルデヒド化合物
又は前記式（１４）のラクトンにアルキレンジアミンを
反応させ、末端に１級アミン基をもつグリコサミノグリ
カン誘導体とし、次にこの１級アミン基をもつグリコサ
ミノグリカン誘導体とカルボキシ基をもつ燐脂質又は脂
質誘導体とを反応させ、アミノ基とカルボキシ基との結
合により、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンを
製造する方法である。

アルデヒド化合物は次のようにして製造される。

−一　端　−酸化法グリコサミノグリカンの還元性末端のウロン酸部分もし
くはガラクトース部分又はヘキソサミン部分を還元及び
部分酸化することにより開裂させてアルデヒドを形成さ
せる方法である。この方法を反応式で示せば次のとおり
である。

（Ａ）還元性末端糖のグルクロン酸又はイズロン酸に反
応する場合還元性末端がＣ−２にＯＨを有するＤ−グルクロン酸又
はＬ−イズロン酸である式（１）のヒアルロン酸、コン
ドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫
酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸に、
コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン又
はヘパリン硫酸を原料として使用したとき、上記反応式
に従い、式（３）のアルデヒド化合物が製造できる。

（Ｂ）還元性末端糖のグルコサミン又はガラクトサミン
に反応する場合（式中、Ｒ３は前述と同し）還元性末端のＣ−５にＣＨ２０Ｈを有するグルコサミン
又はガラクトサミンである式（４）のヒアルロン酸、コ
ンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン
硫ｒＪｉＫ、コンドロイチンボッ硫酸又はデルマタン硫
酸を原料として使用したとき、上記反応式に従い、式（
６）のアルデヒド化合物が製造できる。

（Ｃ）還元性末端糖のガラクトースに反応する場合０月上記反応式に従い、式（９）及び（１０）のアルデヒド
化合物が製造できる。

上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ’）の方法においては、先
ず、上記式（１）、（４）及び（７）で示されるグリコ
サミノグリカンを還元して還元性末端糖部分を開裂させ
て式（２）、（５）及び（８）の化合物とする。

この還元に使用しうる還元剤としては、水素化ホウ素ナ
トリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化
ホウ素アルカリ塩等を用いることができる。

また、上記還元反応における溶媒は、水又は０．０５Ｍ
ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，３）等を用イることができる
。

また還元反応温度は、通常ｌＯ〜３０℃、好ましくは１
５〜２５℃で行うことができる。

還元剤の使用量は、その種類等によっても異なるが、一
般には式（１）、（４）又は（７）の化合物１モルに対
して５〜５０当量、好ましくは２５〜３０当量の範囲で
ある。

得られる式（２）、（５）及び（８）の化合物を次いで
部分的に酸化すると、式（３）、（６）、（９）及び（
ｌＯ）のアルデヒド化合物が生成する。

この酸化反応に使用しつる酸化剤としては、過ヨウ素酸
ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの過ヨウ素酸アル
カリ塩等を用いることができる。

酸化剤の使用量は、式（２）、（５）又は（８）の化合
物１モルに対して１〜１０当量、好ましくは３〜６当量
の範囲である。

酸化反応温度は、０〜ｌ　０℃、好ましくはＯ〜４℃の範囲で行うことができる９更に還元末端アミン法を反応式で示せば次のとおりであ
る。

（１ニア）（ＩＩ）（式中、Ｒ１、Ｒ２及ＵＲ”はｔＵ述と同し、Ｒ２は燐
脂質又は脂質を示す）還元末端に１級アミノ基をもつグリコサミノグリカン誘
導体式（１５）、（１６）及び〔１７）は、前記還元末
端限定酸化法又は還元末端ラクトン化法によって製造さ
れる式（３）、（９）、（６）、　（ｌＯ）及び（１４
）の化合物とアルキレンジアミンとを還元剤の存在下で
反応させることによって得られる。

この反応に使用できるデルキレンジアミンとしては一般
式％式％（式中、ｍは１〜８の整数）で示される化合物を用いるができる。

還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等を用
いることができる。

還元剤の使用量は、上記反応に使用するグリコサミノグ
リカシのモル数の１０〜１００倍モル量である。

反応溶媒は、水又は００５Ｍリン酸緩衝液等を用いるこ
とができる。

反応温度は、０〜６０°Ｃ１好ましくは４〜２５°Ｃで
行う。

また、カルボキシ基をもつ燐脂質又は脂質誘導体は、グ
リセロール骨格に水酸基をもつ燐脂質又は脂質とジカル
ボン酸又はジカルボン酸の無水物とを反応させて得られ
る。

この反応に使用できる燐脂質又は脂質とじては、モノア
シルグリセロール、ジアシルグリセロール、リゾホスフ
ァチジルコリン又はリゾホスファチジルイノシトール、
エーテル脂質又はエーテル燐脂質等を用いることができ
る。

ジカルボン酸としでは、コハク酸、グルタル酸、アジピ
ン酸等を用いることができる６無水ジカルボン酸として
は、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水フマル酸等を
用いることができる。

縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミド、ジシクロへキシルカルボジ
イミド等を用いることができる。

反応温媒としては、クロロホルム、アセドアニット、ジ
メチルホルムアミド等を用いることができる。

反応温度は、縮合剤の存在下でジカルボン酸を使用する
ときは０〜６０°Ｃを、また無水ジカルボン酸を使用す
るときは２０〜８０°Ｃで行うことができる。

還元末端に１級アミン基をもつグリコサミノグツカン誘
導体とカルボキシ基をもつ燐脂質又は脂質誘導体とを反
応させる方法は、先ず該燐脂質又は脂質誘導体をペプチ
ド化学の分野でよく知られている方法に従って該燐脂質
又は脂質誘導体のカルボキシ基を活性化し、次いで該グ
リコサミノグツカン誘導体と反応させる方法で行うこと
ができる。

上記燐脂質又は脂質誘導体のカルボキシ基を活性化する
方法としては、上記燐脂質又は脂質誘導体とＮ−ヒドロ
キシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシピペリジン
、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２．４．５−トリク
ロロフェノール等とを縮合剤の存在下で反応させ、該カ
ルボキシ基を活性エステルに変える方法で行うことがて
きる。

反応（各課としては、クロロホルム、アセトニドノル、
ジメチルホルムアミド又は該溶媒の混合液を用いること
ができる。

縮合剤としては、ｌ−エチル−３−（ジメチルアミノプ
ロピル）−力ルポジイミド、ジシクロへキシルカルボジ
イミド等を用いることができる。

反応温度は、０〜６０°Ｃで行う。

上記方法によって得られたカルボキシ基が活性化された
上記燐脂質誘導体と、１級アミノ基をもつグリコサミノ
グリカン誘導体（１５）（１６）又は（１７）とを反応
させれば、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン（
ＩＩ　）、（ＩＩＩ　）及び（１■）を得ることができ
る。

上記反応温媒としては、クロロホルム、アセトニトリル
、ジメチルホルムアミド又は該溶媒の混合液を用いるこ
とができる。

また反応温度は、０〜６０°Ｃて行う。

監含五璽」」ケラタン硫酸及びケラタンポリ硫酸以外のグリコサミノ
グリカンはＤ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸を含有
し、これらのウロン酸はＣ−５にカルボキシ基を有する
。

この方法は、ウロン酸のカルボキシ基と燐脂質の１級ア
ミン基とを縮合剤の存在下で反応させ、燐脂質結合グリ
コサミノグリカンを製造する方法である。

この方法を反応式で示せば次のとおりである。

（式中、Ｒ３及びＰｌは前述と同じ）本方法で原料として用いることのできるグリコサミノグ
リカン（１８）は、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロ
イチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン
硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘ
パリン又はヘパラン硫酸である。

燐脂質としては、前記還元末端ラクトン化法において例
示したものを用いることができる。

縮合剤としては、ジエチルカルボジイミド、ジイソプロ
ピルカルボジイミド、メチルプロピルカルボジイミド、
ジシクロへキシルカルボジイミド、ヘキサメチレンカル
ボジイミド、ヘプタメチレンカルボジイミド、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド、１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル
）カルボジイミドメソ−ｐ−トルエンスルホネート、１
−ｔ−ブチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド、ジフェニルカルボジイミド、４．４゛　
−ジニトロジフェニルカルボジイミド、ジ−ｐ−トリル
カルボジイミド又はビス（トリメチルシリル）カルボジ
イミド等を挙げることができる。

縮合剤の使用量は、燐脂質又は脂質の使用モル量の１０
〜１００倍モル量を用いることができる。

溶媒としては、ジメチルホルムアミド、クロロホルム又
は該溶媒の混合液等を用いることができる。

反応温度は、４〜６０℃、好ましくは１５〜２５℃で行
う。

グリコサミノグリカン活性化法この方法は、上記縮合剤使用法と同様に、ウロン酸のカ
ルボキシ基を活性化し、燐脂質の１級アミノ基と結合さ
せることにより、燐脂質結合グリコサミノグリカン（Ｖ
）を製造する方法である。

本方法で使用することのできるグリコサミノグツカン及
び燐脂質としては、上記縮合剤使用法と同様のものを用
いることができる。

カルボキシ基を活性化する方法としでは、ペプチド化学
の分野でよく知られている方法に従って、グリコサミノ
グリカンのウロン酸部分のカルボキシ基を活性化するこ
とができる６活性化する方法としては、例えばグリコサミノグリカン
にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノー
ル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキ
シピペリシン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２．４
　５−１リクロロフエノール等を縮合剤の存在下で反応
させて、該カルボキシ基を活性エステルに変えることが
できる。

ウロン酸部分のカルボキシ基はそのアミン塩として反応
させることもできる。

アミン塩のアミンの種類としては、トリ（ｎ−ブチル）
アミン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることが
できる。

反応溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ピノジン、
ジメチルスルホキシド等を用いることができる。

縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメチルアミノプ
ロピル）−力ルポジイミド、ジシクロへキシルカルボジ
イミド等を用いることができる。

反応温度は、０〜６０°Ｃ１好ましくは４〜２０℃で行
う。

上記方法によって得られた、カルボキシ基が活性化され
たグリコサミノグリカンな燐脂質と反応させれば、〜般
式（Ｖ）の燐脂質結合グリコサミノグリカンを得ること
ができる、上記反応は、ジメチルホルムアミド、クロロホルム又は
該溶媒の混合液の溶液において、上記活性化グリコサミ
ノグリカンと燐脂質とを０〜９０°Ｃ１好ましくは２５
〜６０で反応させる。

また、本発明の一８９式（１）〜（Ｖ）で示される燐脂
質又は脂質結合グリコサミノグリカンの燐脂質又は脂質
の含有量は、０．００５〜５０％好ましくは２〜１０％
の範囲である。

以上に述べた各種の方法で製造される燐脂質又は脂質結
合グリコサミノグリカンの分離、精製方法としては、反
応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加えて生した沈
澱物を、・戸取することで未反応の燐脂質又は脂質を除
き、さらに該沈澱物を疎水クロマトに負荷し、酢酸アン
モニウム、塩化アンモニウム又は塩化ナトリウム等の塩
の水渚ｌ夜で洗浄することて未反応のグリコサミノグリ
カンを除去する。この後、該疎水クロマトに吸着した燐
脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンを１０〜５０％
メタノール水忍液で溶出する方法で行うことができる。

本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その薬学的に許容される塩を、固体又は液体の医薬用相
体又は希釈剤、即ち、賦形剤、安定剤等の添加剤ととも
に含む製剤とすることが好ましい。

燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンの塩は水溶性
であるため、注射剤として用いる場合に最適である。該
医薬製剤において、前記有効成分の担体成分に対する割
合は、１〜９０重量％の間で変動させつる。

剤形及び投与形態としては、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠
剤、カプセル剤、丸剤もしくは液剤等の剤形にして、又
は原末のまま経口投与してもよいし、注射剤として静脈
内投与、筋肉的投与又は皮下投与してもよい。また、坐
剤、軟膏剤、パップ剤、貼付剤、’／ニメント剤、ロー
ション剤等の剤形にして、外用剤として用いることもて
きる。また、注射用の粉末にして、用時調製して使用し
てもよい。

経口、経腸、非経口もしくは局所投与に適した医薬用の
有機又は無機の、固体又は液体の担体もしくは希釈剤を
、本発明の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又
はその塩を含む医薬製剤を調製するために用いることが
できる。水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸
マグネシウム、タルク、動植物油脂、ベンジルアルコー
ル。

ガム、ポリアルキレングルコール、石油樹脂、やし油、
ラノリン又は医薬に用いられる他のキャリアー（担体）
は全て、本発明品の担体として用いることができる。ま
た、安定剤、湿潤剤、乳化剤や、浸透圧を変えたり、製
剤の適切なｐ）ｌを維持するための塩類を補助薬剤とし
て適宜用いることもできる。

顆粒剤、細粒剤、散剤１錠剤又はカプセル剤の場合には
、該医薬製剤は本発明品を５〜８０重量％含有している
ことが好ましく、液剤の場合には、１〜３０重■％含有
していることが好まＬい。また、注射剤の場合は１〜１
０重量％、坐剤の場合は１〜５０重量％が好ましい。局
所投与用である軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合
は、Ｏ１〜１０重量％含有していることが好ましい。

臨床投与量は、経口投与の場合、成人に対し有効成分と
して、１日量１００〜２０００ｍｇを内服することが好
ましいが、年令、症状により適宜増減することも可能で
ある。前記１日量を１回、又は適当な間隔をおいて２も
しくは３回に分けて投与することが好ましい。

また、注射剤として用いる場合には、成人に対し有効成
分として、１目量１０〜１０００ｍｇを投与することが
好ましく、軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合は、
前記含有割合のものを適当量患部に塗布することが好ま
しい。

［発明の効果］本発明品の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグツカン又
はその塩は、細胞接着阻害作用を有し、かつ毒性もない
ので癌転移抑制剤として有用である。

［実施例］次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明は、実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、燐脂質又は脂質結合グリコサミ
ノグリカンのリン含量、燐脂質又は脂質含量、及びグリ
コサミノグリカン（ＧＡＧ）含量は、以下の方法で測定
した。

Ｌ足」１、ＧＡＧの定量（１）ウロン酸を含有するＧＡＧ　　カルバゾール硫酸
法ｆＢｉｔｔｅｒ−Ｍｕｉｒ法）　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ
ＬＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　４．３３０−３３４　（
１９６２）（２）ガラクトースを含有するケラクン硫酸
又はケラタンポリ硫酸、アンスロン法　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｊ５０、２９８−３０３　ｆ１９５２）２　燐脂質又は脂質の定量（１）リンの定量　モリブデンブルー法、無機応用比色
分析、４、共立出版株式会社、編集代表　平野四藏　１
３０〜１３５頁（２）脂肪酸の定量　ＩＣ）−５０ｍｇのＧＡＧ−脂質
を１０−のｌＮ−水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、１
００℃で１時間加水分解する。反応液をＩＮ−塩酸水溶
液で酸性にした後、クロロホルムで抽出し、クロロホル
ム相を水で洗浄する。脱水ボウ硝で乾燥後、減圧下で溶
媒を除去。残渣に３％塩Ｍ（ガス）含有メタノールを加
え、封管中、１００℃で３時間加熱後、石油エーテルで
３回抽出する。石油エーテルを３回水洗し、混入した塩
酸を除き、脱水ボウ硝で乾燥後、減圧濃縮し、次の（Ｇ
ＬＣ）用試料とする。

気相液相クロマトグラフィー（ＧＬＣ）ＧＣ−１５Ａ（
高沸製作所）充填剤：　ＰＥＧ−ＨＴ　　５％　Ｕｎｉｐｏｒｔ　Ｈ
Ｐ　６０／８０ガスクロ工業■ 運転条件：試料気（ｅ室温度　３５０℃カラム温度：１
９０〜２００℃ カラム：３φＸ２ｍ流速＋　Ｎ　、　４５　ｉ／ｍｉｎ製造例１（’１）還元末端限定酸化グリコサミノグリカンの製造１）還元末端残基開環ヒアルロン酸の製造ヒアルロン酸
（鶏冠由来、Ｍｌｌ　１万　ＨＡＩ＋２０００ｍｇを２
００１ｎ１の００５Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８、３）に
溶解し、１８２ｍｇの水素化ホウ酸ナトリウムを加えて
室温で５時間反応させた。

酢酸でｐＨ４，５にしてエタノールを加えて生成物を沈
澱させ、次いで生成物をエタノールで洗浄した。これに
よりロット番号１００の還元末端残基開環ヒアルロン酸
（Ｒ−ＨＡＩＩ　を１８００ｍｇ得た。

２）還元末端限定酸化ヒアルロン酸の製造１７００ｍｇ
のＲ−ＩＡＩ　（ロット番号１００）を２５０１ｎｌの
４０ｍＭイミダゾール（ｐＨ６，５：ｌに溶解し、０℃
で１３９．９６ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを加え、１
時間反応させた。反応液にエタノールを加えて生成物を
沈澱させ、次いでエタノールで洗浄した。これによりロ
ット番号２００の還元末端限定酸化ヒアルロン酸（０−
ＨＡｌ　１６００ｍｇを得た。

３）他のグリコサミノグリカンの還元末端限定酸化物（
０−ＧＡＧＩの製造ヒアルロン酸（鶏冠由来、ＭＷ　５万・ＨＡ５．　ＭＷ
ｌ５万：　ＨＡｌ５）、コンドロイチン（コンドロイチン硫酸Ａから酸性メタノ
ール溶液で脱硫酸したもの、ＭＷｌ、５万、：　ＣＨ）コンドロイチン硫酸Ｃ（鮫軟骨由来、ＭＷｌ万・ｃｓ（
ｓｉ）、　ＭＷ３万：　Ｃ５ｆＳ３１、　ＭＷ６万：　
Ｃ３ｆＳ６））、コンドロイチン硫酸Ａ（鮫軟骨由来、
ＭＷ３万Ｃ３＋Ｗ＋　１、デルマタン硫酸（豚皮由来、ＭＷｌ、５万：　ＤＳ）、
ヘパリン（豚小腸由来、ＭＷｌ、５万：　Ｈｅｐｌ、ヘ
パラン硫酸（牛腎由来、Ｍｌｌｌｌ、５万：　Ｈ３）、
ケラクン硫酸（牛角膜由来、ＭＷｌ、５万：　ＫＳ）を
原料として上記の１）に準じて表２の条件で還元末端残
基開環グリコサミノグリカンｆＲ−ＧＡＧＩを製造した
。ひきつづき、上記の２）の方法に準して表３の条件で
還元末端限定酸化グリコサミノグリカンＴＯ−ＧＡＧＩ
　を製造した。

表表実施例１還元末端ラクトン化法による燐脂質結合グリコサミノグ
リカンの製造（１）還元末端酸化グリコサミノグリカンの製造１）還元末端酸化ヒアルロン酸の製造５００ｍｇのヒアルロン酸（鶏冠由来、　ＭＷ１万ＨＡ
１１を水１０−に溶解し、０．ＩＪ４ヨウ素のメタノー
ル溶液５−を加えて室温で６時間反応させた。その後、
反応液に０．ＩＮ水酸化カリウムを約５−加えて′Ｍ雌
のヨウ素の色を消失させた。この溶液に酢酸カリウム飽
和エタノールを加えて生した沈澱を枦取し、充分にエタ
ノールで洗浄し減圧乾燥した。

これによりロット番号４００の還元末端酸化ヒアルロン
酸４２３ｍｇを得た。

ソモシーネルソン法による還元糖の有無　無２）還元末
端ラクトンヒアルロン酸の製造４００ｍｇのロフト番号
４００の還元末端酸化ヒアルロン酸を水１０＋Ｊに溶解
し、強酸性イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ　５０ｆＨ’ｌ
）　５０−に１時間を要して通過させ、還元末端ラクト
ンヒアルロン酸３９０ｍｇを含む水溶液を得た。

ソモジーネルソン法による還元糖の有無、無上記の水溶
液をトリーｎ−ブチルアミンで中和し、凍結乾燥して還
元末端ラクトンヒアルロン酸のトリーローブチルアミン
塩（ロット番号５００）４００ｍｇを得た。

３）他の還元末端ラクトングリコサミノグリカンの製造
方法コンドロイチンｆＭＷ１．５万　ＣＨ）、コンドロイチ
ン硫酸Ｃ（ＭＷ１万：　Ｃ３ｆＳ１］、ＭＷ３万：　Ｃ
３（Ｓ３）及Ｕ　ｋｌＷ６万：　Ｃ］Ｓ６］）、テルマ
クン硫酸ｆＭＷ１．５万：　ＤＳ）、ヘパリン（Ｍ■１
５万：　Ｈｅｐ）、及びヘパラン硫酸ｆＭＷ１．５万　
Ｈ３）を原料としで、上記ｌ）に準して表４の条件で還元末端
酸化グリコサミノグリカンを製造した。ひきつづき、上
記２）に準して表５の条件で還元末端ラクトングリコサ
ミノグリカンを製造した。

（２）Ｌ−（ａ−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合グリコサミノグリカンｆＧＡＧ−Ｐ
ＰＥＡＤＰＩの製造１１Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジ
パルミトイル結合ヒアルロン酸の製造４００ｍｇ０ロッ
ト番号５００の還元末端ラクトンヒアルロン酸を２００
−のジメチルホルムアミドに溶解し、２７．６ｍｇのＰ
ＰＥＡＤＰのクロロホルム溶液を加えて、７０℃で２時
間反応させ、クロロホルムを溜去し、過剰の酢酸ナトリ
ウム水ｍＨを加えてナトリウム塩にしてから、酢酸ナト
リウム飽和エタノールを加えた。生じた沈澱を？戸数し
、０．３Ｍ酢酸アンモニウム溶液に溶解し、疎水クロマ
トカラム（ＴＳＫｇｅｌフェニルトヨパール６５０Ｍ　
　４００ｍ／）に吸着し、充分に０６３Ｍ塩化アンモニ
ウム水溶液で洗浄し、３０％メタノール水溶液で溶出し
た。素通り及び洗浄画分に未反応のＩＡＩが溶出され、
３０％メタノール水溶液の両分に目的とする本島が溶出
した。３０％メタノール水溶液溶出画分を減圧下濃縮し
、透析で脱塩後、凍結乾燥して精製し、ロット番号６０
０の目的物３６ｍｇを得た。

リン含量：０．３０％ＰＰＥＡＤＰ含量：６．４４％ヒアルロン酸含量：８２．３７％疎水クロマトグラフ　図−１に示す。

疎水クロマトグラフィの条件カラム：　ＴＳＫ　ｇｅｌフェニル５ＰＷ（７５φｘ７
．５ｃｍ１溶媒二〇〜５分　　０．３Ｍ塩化アンモニウム水溶液５〜５０分　３０％メタノール水溶液溶出速度：０．５−／分圧７　ｋｇｌｏ、５ｃｍ２分画容量；１−／管検出　ＯＤ２□。。

検体　１００ｐｌ　（１ｍｇ／ｍｌ　０．３Ｍ塩化アン
モニウム水洟液）２）その他のＬ−（α−ホスファチジル）エタノールア
ミン・ジパルミトイル結合グリコサミノグリカンの製造表５に示した還元末端ラクトングリコサミノグツカンと
ＰＰＥＡＤＰとを表６に示した条件で、上記（２）−］
）の方法に準して製造した。得られた生成物の分析値を
表７に示した。

表表４００ｍｇのロフト番号５００−２の還元末端ラクトン
コンドロイチン硫酸Ｃを２００−のジメチルホルムアミ
ドに溶解し、９ｍｇのホスファチジルセリンステアレー
トパルミテートのクロロホルム溶液を加えて、７０°Ｃ
て２時間反応させた。クロロホルムを溜去し、過剰の酢
酸ナトリウム水溶液を加えてナトリウム塩にしてから、
酢酸ナトリウム飽和エタノールを加えて生した沈澱を１
片爪した。沈澱を０．３Ｍ塩化アンモニウム溶液で溶解
し、実施例１−　（２）−１１に準じて処理した。これ
によりロット番号７００−２のホスファチジルセリンス
テアロイルバルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃを２
０．８ｍｇ得た。

ノン含量・０．１０％コンドロイチン硫酸Ｃ含量　８６１５％疎水クロマトグ
ラフ　図−２に示す。

測定条件は前記と同し。

実施例２還元末端アミン法による燐脂質又は脂質結合グツコサミ
ノグリカンの製造（１）還元末端アミノ−ゲルコサミノグリカンの製造１）還元末端アミノ−コンドロイチン硫ＭＣ（Ｃ３ｆ３
３１　）の製造１００ｍｇのロット番号２０２−２の還元末端残基開環
コンドロイチン硫酸Ｃを５０１ｄｌの０．０５Ｍリン酸
塩緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、２４ｍｇのエチレン
ジアミン塩酸塩を加えて５０℃で３０分反応させた。そ
の後、２０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え
て５０℃で２時間反応させた。反応液に酢酸ナトリウム
飽和エタノールを加えて生じた沈澱をｔ戸数した。沈澱
を水に溶解し、透析により脱塩し、５０ｔｔ’のＤＥＡ
Ｅ−イオン交換樹脂に吸着させ、０．１Ｍ食塩水溶液か
ら１Ｍ食塩水溶液のグラジェントで溶出した。０．４Ｍ
食塩濃度で還元末端アミノーコンドロイチ硫Ｍ　Ｃ、＋
！１５溶出され、遊離のコンドロイチン硫酸Ｃは０．７
５Ｍ５Ｍ食塩濃溶出した。

０．４Ｍ食塩溶液画分を透析により脱塩し、凍結乾燥し
、ロット番号８０２−２の還元末端アミン−コンドロイ
チン硫酸Ｃ８０ｍｇを得た。

２）還元末端アミノ−ヘパリン（Ｈｅｐ　）の製造上記
の方法に準じて、ｌ１００ＩＩ１のロット番号２０５還
元末端限定酸化ヘパリンを使用し、ロット番号８０５の
還元末端アミノ−ヘパリン７７ｍｇを得た。

（２）脂質のコハク酸誘導体の製造１）グリセロールモノステアレートのコハク酸エステル
の製造１０．７４ｇのグリセロールモノステアレートを３−の
ピリジンを含む２００−のベンゼンに渚解し、６ｇの無
水コハク酸を加えて６時間還流した。反応液を減圧濃縮
し、生じた沈澱をアセトンで再結晶し、グリセロールモ
ノステアレートのコハク酸エステル８２ｇを得た。

２）グリセロールモノステアレートのコハク酸エステル
をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドによる活性エステルの
製造上記１）のエステル８ｇをベンゼンに溶解して、２ｇの
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを加え、１０ｇのジシク
ロへキシルカルボジイミドを加えて室温で２００時間反
応せた。反応液を減圧濃縮して、沈澱をベンゼン／ｎ−
ヘキサンで再結晶し、ロット番号ＧＭＳ−１の標記活性
エステル７．４ｇを得た。

（３）グリセロールモノステアレート結合コンドロイチ
ン硫酸Ｃの製造舌　。ヨ己ゝ−−フｂ−一−１８０ｍｇのロット番号８０２−２の還元末端アミノ−コ
ンドロイチン硫酸Ｃを５−の水に溶解し、６．９５ｍｇ
のロット番号ＧＭＳ−１の活性エステルのジメチルホル
ムアミドｆｆ１Ｍを加えて室温で２０時間反応させた９
反応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え、生した
沈澱を炉取した。沈澱を０．３Ｍ塩化アンモニウム水溶
液に溶解し、実施例１−　（２）−１１に準じて精製し
、ロット番号９０２−２の標記目的物３ＢＩＴ１ｇを得
た。

ステアリン酸含量　０８６％フンドロイチン硫酸Ｃ含量　９８．２％疎水クロマトグ
ラフ　図−２に不す。

測定条件は前記と同し。

（４）燐脂質のコハク酸誘導体の製造１）リゾレシチンのコハク酸エステルの製造次式のりゾ
レシチンＣ１ｈＯＣＯ−ｆｃＩＩ２）　、４−ＣＩ＋３ＨＯＣＩ
（ＣＨ２０ＰＯ（０−＋　０ＣＩＩ２Ｃ１１２Ｎ”　ｆｃ
１１３１３４９５ｍｇをクロロホルム２００−に溶解し
、無水コハク酸１００ｍｇと７９ｍｇのピリジンを加え
て室温で２０時間反応させた。反応液を減圧？！縮し、
生じた沈澱をアセトンで再結晶し、リゾレシチンのコハ
ク酸エステルを得た。

２）リゾレシチンのコハク酸エステルのＮ−ヒドロキシ
コハク酸イミドによる活性エステルの製造上記エステル２８８．５ｍｇをジメチルホルムアミドに
溶解し、５７．５ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド
と１０３ｍｇのジシクロへキシルカルボジイミドを加え
て室温で２０時間反応させた。沈澱を除去し、上記活性
エステルのジメチルホルムアミド溶液を得た。

（５）リゾレシチン結合グリコサミノグリカンの製造１）リゾレシチン結合コンドロイチン硫酸Ｃの製造上記（４）−２１で得られた上記活性化エステルのジメ
チルホルムアミド溶液にロット番号８０２−２の還元末
端アミノ−コンドロイチン硫酸Ｃ１ｇの水溶液を加えて
室温で２０時間反応させた。精製は実施例１に準じて、
疎水クロマトグラフィーで精製した。

収量：０．５’２ｇリン含ｉｉ：ｏ、１０５％リゾレシチン含量：ｌ　９６％コンドロイチン硫酸含量　９８０４％イ才つ含量　５７８％（６）グルセロールジステアレート結合コンドロイチン
硫酸Ｃの製造上記（１）−１＋で得られたロット番号８０２−２の還
元末端アミノ−コンドロイチン硫酸Ｃと上記（２）−２
１と同様な方法で得られたグリセロルジステアレートの
コハク酸エステルの活性エステル（ロット番号ＧＤＳ−
２）とを、上記（３）に準して反応させ、精製して、ロ
ット番号９０４の補記化合物２７ｍｇを得た。

実施例３縮合剤使用法による燐脂質結合グリコサミノグリカンの
製造（１）Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃの製造４００＋ｎｇのコンドロイチン硫酸Ｃ（ＣＳ（３３１）
のトリーｎ−ブチルアミン塩を１００−のジメチルホル
ムアミドに溶解し、６．９２ｍｇのＰＰＥＡＤＰのクロ
ロホルム溶液を加えた。更に、３８．４ｍｇの１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩を加えて室温で２０時間反応させた１反応液を
減圧下で濃縮し、過剰の酢酸ナトリウム水溶液を加えて
ナトリウム塩にした。この水溶液にエタノールを加えて
生じた沈澱を炉取した。沈澱を０．３Ｍ塩化アンモニウ
ム水溶液に溶解し、実施例１−　（２）　−１１に準じ
て精製し、ロット番号１００２−２の標記目的物を６３
ｍｇ得た。

リン含量：０．０９９％ＰＰＥＡＤＰ含量：２．２５％コンドロイチン硫酸Ｃ含量：９６．６１％疎水クロマト
グラフィ：図−３に示す測定条件は前記と同しく２）他のＬ−（α−ホスファチジル）エタノールアミ
ン・ジパルミトイル結合グリコサミノグリカン（ＧＡＧ
−ＰＰＥＡＤＰＩの製造各種のグリコサミノグリカンとＰＰＥＡＤＰとを表８に
示した条件で上記（１）の方法に準じて燐脂質結合グリ
コサミノグリカンを製造した。得られた生成物の分析値
を表９に示した。

表＊１トリーｎ−ブチルアミン塩表実施例４グリコサミノグリカン活性化法による燐脂質結合グリコ
サミノグリカンの製造（１）Ｌ−（ａ−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合コンドロイチン硫酸Ｃの製造４００ｍｇのコンドロイチン硫酸Ｃ（Ｃ３（３３１）の
トリーｎ−ブチルアミン塩を３００−のＤＭＦに溶解し
、９．９ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと２０．
６ｍｇのジシクロへキシルカルボジイミドを加えて室温
で２００時間反応せた０反応液に過剰の酢酸ナトリウム
水溶液を加えてナトリウム塩にしてからにエタノールを
加えて生じた沈澱を炉取した。即座に３０−の水で溶解
し、６９２ｍｇのＰＰＥＡＤＰのクロロホルム溶液を加
えて、更にジメチルホルムアミドを加えて均一な溶液と
した。

室温で６時間反応させ、反応液を減圧濃縮して、酢酸飽
和のエタノールを加えた。生じた沈澱を０．３Ｍ酢酸ア
ンモニウム水溶液に溶解し、実施例１−　（２）−”１
１に準して精製し、ロット番号１１０２−２の榎記の目
的物を２９．７ｍｇ得た。

ノン含量　０．１００％ＰＰＥＡＤＰ含量　２．１６％コンドロイチン硫酸Ｃ含量＋９５．９８％疎水クロマト
グラフィ　図−４に示す測定条件は前記と同しく２）Ｌ−（ａ−ホスファチジル）エタノールアミン・
ジパルミトイル結合コンドロイチンポリ硫酸の製造１ｇのコンドロイチンポリ硫酸（Ｃ５Ｐ（ＩＩＩＩのト
リーローブチルアミン塩（イオウ含量１３．０％、分子
量１００００）を５０ｗＩＩのジメチルホルムアミドに
溶解し、１７７０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
と３１８ｍｇのジシクロへキシルカルボジイミドを加え
て４℃で一晩反応させた。

反応液に１０１Ｒ１の水を加えて室温で１５分間反応さ
せ、生じた沈澱を除去した後、この溶液に６９．２ｍｇ
のホスファチジルエタノールアミン・ジパルミトイル（
ＰＰＥＡＤＰ）のクロロホルム溶液を加えて室温で６時
間反応させた０反応液を減圧濃縮し、酢酸ナトリウム飽
和のエタノールを加えて生じた沈澱を集めた。沈澱を０
，３Ｍの酢酸アンモニウム水溶液に溶解し、実施例１−
（２）−１１に準じて精製し、ロット番号１１０８の標
記の目的物６７ｍｇを得た。

リン含量：０．２９１％ＰＰＥＡＤＰ含量：６．５％コンドロイチンポリ硫酸含量：９２．８％イ才つ含量：
１２．０５％疎水クロマトグラフィ：図−５に示す測定条件は前記と同じ参考例１フィブロネクチンを予め塗布した培養皿に塗布した燐脂
質又は脂質結合グリコサミノグリカンのＢＨＫ２１細胞
の接着に対する効果９６穴培養皿を５Ｍｇ／−ウシ血漿フィブロネクチン１
００ｍで塗布した後、洗浄し、実施例１〜４で得た各種
燐脂質又は脂質結合グリコサミノグルカン１００ＩＬＩ
／穴を表１０に示す各濃度で塗布した。

別に、１００ｍｍ径の培養皿に培養したＢＨＫ２１細胞
（新生ハムスター腎細胞）をＯ，１ｍｇ／−の濃度のト
リプシン溶液５−を加え、３７℃で５分間処理した１次
いで、１ｍｇ／ｌａＩ！の大豆トリプシンインヒビター
溶ｍ５−を加え、トリプシンを不活性化した後、遊離し
た細胞を遠心により集めた。細胞は２回洗浄後、１−あ
たりｌＸｌ０’個細胞となるように単一細胞懸濁液とし
た。

得られた単一細胞懸濁液１００１（ＩＸＩＯ’個細胞）
を、上記フィブロネクチンと燐脂質又は脂質結合グリコ
サミノグリカンを塗布した培養皿に加え、３７℃で１時
間処理した。接着しなかった細胞を洗浄した後、接着し
た細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、直接位相差顕
微鏡で観察して、その細胞数をカウントした。

結果を表１Ｏに示す０表１０は、各濃度における細胞接
着の変動を示す、値は３回ないし４回の測定の平均を示
し、誤差（標準偏差）もあわせて表した。

なおそれぞれの遊離グリコサミノグリカンおよび未結合
の脂質のみでは高濃度にしても全く細胞接着阻害効果を
示さなかった。

参考例２各種培養細胞の細胞接着物質に対する燐脂質又は脂質結
合グリコサミノグリカンの接！阻害効果実施例１〜４で
得た燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンについて
、ＢＨＫ２１細胞（新生ハムスター腎細胞）、ＣＥＦに
ワトリ胚線維芽細胞）、Ｂ１６ＦｌＯ（高転移性マウス
メラノーｖ細胞）　、　ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞）、及びｂａＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）の
各種細胞群に対しての、フィブロネクチン（ＦＮ）、ラ
ミニン（ＬＮ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｉｌ）及びビト
ロネクチン（ＶＮ）による接着に対する阻害効果を検討
した。

各５μｇ／−のウシ血漿フィブロネクチン、マウスＥＨ
５腫瘍細胞由来ラミノン、ラット肺由来Ｉ型コラーゲン
、及びウシ血清ビトロネクチンをそれぞれ９６穴培養皿
に塗布し、参考例１と同様にして、実施例１〜４で得た
燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカンを塗布した後
、それぞれＢＨＫ２１細胞、ＣＥＦ細胞、Ｂ１６Ｆ１０
細胞、ＣＨＯ細胞、及びｂａＥＣ細胞の単一細胞懸濁液
１００ｐ−１（ＩＸＩＯ’個細胞）を加え細胞接着の変
動を見た。対照として燐脂質又は脂質結合グリコサミノ
グリカンを添加せず、接着物質のみの細胞接着を１００
％とした。結果を表１１に示す。

なお、表１１中で相対接着細胞数として、全くあるいは
殆ど細胞接着しなかった場合（０〜１０％未満）を−、
１０〜３０％未満を＋、３０〜５０％未満な＋＋、５０
〜７０％未満を＋＋＋、７０〜９０％未満を＋＋＋＋、
そして９０〜１００％の細胞が接着した場合を＋＋＋＋
＋と半定量的に表した。

参考例３血管内皮培養細胞の細胞外マトリックスにおける高転移
性癌細胞の接着に対する燐脂質結合コンドロイチン硫酸
Ｃの抑制効果マウス由来血管皮細胞を２４穴の１型コラーゲンでコー
トした培養皿で集密状態になるまで培養し、細胞単層に
０５％トリトンＸ−１００で室温３０分間処理し、破壊
された細胞片をダルベツコの緩衝液　（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ　ＰＢＳ　（＋ｌｌで洗浄して内皮細胞の細胞外
マトリックスを得た。

一方、１００ｍｍ径の培養皿に培養したマウス由来高転
移性癌細胞Ｂ１６Ｆ１０に５−トリプシン溶液（０，１
ｍｇ／ｍｌ’　ＰＢＳ　（−１１を加え、３７℃で５分
間処理した。次いで、大豆トリプシン阻害剤５−（１ｍ
ｇ／＋ｎｆ）を加え、トリプシンを不活性化した後、遊
離した細胞を遠心により集めた。さらに細胞をリン酸塩
緩衝液（ＰＢＳ（−＋１で２回洗浄後、１−あたり２Ｘ
１０’個の細胞数になるように星−細胞懸濁液（Ｈａｎ
ｋｓ’　Ｂ５Ｓ−２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐｌ＋７．４
）を調製した。

ロット番号６０２−２　ｆｃｓ（５３１−ＰＰＥＡＤＰ
）の燐脂質結合コンドロイチン硫酸Ｃと、Ｂ１６Ｆ１０
（７）単一細胞懸濁液５０ＯＮ（’Ｉ　Ｘ　１０　’個
細胞を、前述した細胞外マトリックスを調製した２４穴
培養皿に加え、３７°Ｃで１時間、５％炭酸ガス培養器
内で静置した。

上清を静かに集め、さらにハンクス緩衝液で１回穏やか
に洗った。その上清と洗液を合わせて、細胞外マトリッ
クスに接着しなかった細胞としてその細胞数をコールタ
−カウンター（コールタ−・エレクトロニクス社製）で
計数した。対照としてロット番号６０２−２１ｃｓ　（
Ｓ３）−ＰＰＥＡＤＰ）を含まない緩衝液のみのもの（
無添加）と、遊離のコンドロイチン硫酸Ｃを添加したも
のを比較した。

細胞の接着率は、最初に添加した全細胞数から計数した
非接着細胞数を引き、その値を全細胞数で割った値を百
分率で表した。その結果を表１２に示す。

表無添加８２．８％遊離コンドロイチン硫酸Ｃ５０ｕｒ　　　８２．６％こ
の結果から、本発明の燐脂質結合グリコサミノグリカン
は血管内皮細胞の細胞外マトリックスに対する高転移性
癌細胞の接着を抑制することがわかる。遊離のコンドロ
イチン硫酸Ｃではそのような作用は全く認められながっ
た。

【図面の簡単な説明】

図１〜５は、燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン
の疎水クロマトグラフィーを示し、図１は実施例１−　
（２）−１１の目的物、図２は実施例１−（３）の目的
物、図３は実施例３−（１）の目的物、図４は実施例４
−　（１）の目的物、図５は実施例４−　（２）の目的
物である。図図４図５

Claims

【特許請求の範囲】１、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩。上記式中、Ｒ＾１はＯＨ、ＯＳＯ＿３Ｈ、ＮＨＣＯＣＨ＿３又はＮＨＳＯ＿３Ｈを示し、Ｒ＾２は
ＣＯＯＨ、ＣＨ＿２ＯＨ又はＣＨ＿２ＯＳＯ＿３Ｈを示
し、Ｒ＾３は水素又はＳＯ＿３Ｈを示し、ＧＡＧはヒア
ルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ
、Ｄ、ＥもしくはＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマ
タン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又は
ケラタン硫酸から還元性末端のヘキソサミン部分又はウ
ロン酸部分もしくはガラクトース部分を除いたグリコサ
ミノグリカン残基を示し、Ｐ＾１は１級アミノ基を有す
る燐脂質を示す。２、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II）を有する憐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩。上記式中、ＧＡＧはヒアルロン酸、コンドロイチン、コ
ンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、ＥもしくはＫ、コンドロイチ
ンポリ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸
、ケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸から還元性末端の
ヘキソサミン部分を除いたグリコサミノグリカン残基を
示し、ｍは１〜８を示し、ｌは１〜１０を示し、Ｐ＾２
は燐脂質又は脂質を示す。３、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III）を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩。上記式中、Ｒ＾１はＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ＿３を示し、
Ｒ＾３は水素又はＳＯ＿３Ｈを示し、ＧＡＧはヒアルロ
ン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａもしくは
Ｋ又はデルマタン硫酸から還元性末端のヘキソサミン部
分を除いたグリコサミノグリカン残基、或いはケラタン
硫酸又はケラタンポリ硫酸から還元性末端のガラクトー
ス部分を除いたグリコサミノグリカン残基を示し、ｍ、
ｌ及びＰ＾２は請求項２に記載と同じである。４、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IV）を有する燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン又は
その塩。上記式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３及びＧＡＧは請求項
１に記載と同じであり、ｍ、ｌ及びＰ＾２は請求項２に
記載と同じである。５、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｖ）を有する燐脂質結合グリコサミノグリカン又はその塩。上記式中、Ｒ＾３は水素又はＳＯ＿３Ｈを示し、ＧＡＧ
はヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅも
しくはＫ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫酸、
ヘパリン又はヘパラン硫酸中のグリコサミノグリカン鎖
を示し、Ｐ＾１は１級アミノ基を有する燐脂質を示し、
ｎはグリコサミノグリカンに存在するカルボキシ基の数
以下の数を示す。