FI103279B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten fosfolipidi- tai lipidiliit teisten glykosaminoglykaaniyhdisteiden valmistamiseksi - Google Patents

Description

103279

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten fosfolipidi- tai lipidiliitteisten glykosaminoglykaaniyhdisteiden valmistamiseksi 5 Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee menetelmää fosfolipidi- tai lipidiliitteisten glykosaminoglykaanien valmistamiseksi. Nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia etäispesäkeinhibiitto-reina.

10 Keksinnön tausta

Etäispesäkkeen kehitysprosessista tiedetään, että verisuoneen tai imusuoneen kulkeutunut syöpäsolu tarttuu endoteelisoluun tai sen solunulkoiseen matriisiin (niin kutsuttuun tyvikalvoon), ja näin tarttunut syöpäsolu tun-15 keutuu solunulkoiseen matriisiin kehittäen uuden etäis- pesäkevaurion kudokseen. Esimerkiksi S. Korach et ai. (Cancer Research 46 (1986) 3624 - 3629) ilmoittivat jakaneensa syöpäsolut voimakkaasti etäispesäkkeitä muodostavaan ryhmään ja heikosti etäispesäkkeitä muodostavaan ryh-20 mään ja syöpäsolukloonaustutkimustensa välityksellä suo rittivat syöpäsolujen in vitro -tarttumiskokeita viljeltyihin endoteelisoluihin, [joista kokeista] tuloksena [he totesivat, että] syöpäsolujen tarttuvuus verisuonten endoteelisoluihin tai niiden solunulkoisiin matriiseihin kor-25 reloi läheisesti syöpäsolujen etäispesäkkeitä muodostavaan ominaisuuteen, koska voimakkaasti etäispesäkkeitä muodostavan ryhmän syöpäsolut osoittivat voimakasta tarttuvuutta, kun taas heikosti etäispesäkkeitä muodostavat solut osoittivat heikkoa tarttuvuutta.

30 Toisaalta peptidisekvenssi GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-

Ser) fibronektiinin solutarttumisosassa, joka on solunul-v koisen matriisin rakenneosa, inhiboi kilpailevasti syöpä solujen ja solunulkoisen matriisin välistä sitoutumista. Yamada et ai. (Science 233 (1986) 467 - 470) ilmoittivat, 35 että peptidi GRGDS inhiboi B16F10-solujen etäispesäkemuo- 2 103279 dostuksen keuhkoon hiirissä. Nämä tulokset osoittavat, että ainetta, jolla on solutarttumista inhiboivaa aktiivisuutta pienessä määrässä, voitaisiin käyttää etäispesäke-muodostuksen inhibiittorina.

5 Esillä oleva keksintö on tehty sen havainnon no jalla, että tietyn tyyppiset fosfolipidi- tai lipidiliit-teiset glykosaminoglykaanit voivat inhiboida syöpäsolujen tarttumista verisuonten endoteelisoluihin ja niiden so-lunulkoisiin matriiseihin ja siitä tuloksena voivat inhi-10 boida syöpäsolujen etäispesäkkeitä muodostavaa ominai suutta .

Kuvaus keksinnöstä

Esillä oleva keksintö koskee fosfolipidi- tai li-pidiliitteisten glykosaminoglykaanien valmistusta. Nämä 15 yhdisteet ja niiden suolat ovat tehokkaita etäispesäkemuo- dostuksen inhibiittoreita.

Kuten esitetään taulukossa 1, glykosaminoglykaani on pitkäketjuinen polysakkaridi, joka koostuu toistuvista yksiköistä disakkarideja tai tetrasakkarideja mukaan lu-20 kien D-glukosamiini tai D-galaktosamiini, D-glukuronihap- po, L-iduronihappo ja/tai D-galaktoosi. Esimerkkejä tunnetuista glykosaminoglykaaneista ovat hyaluronihappo, kon-droitiini, kondroitiinisulfaatti-A, kondroitiinisulfaatti-C, kondroitiinisulfaatti-D, kondroitiinisulfaatti-E, kon-25 droitiinisulfaatti-K, kondroitiinipolysulfaatti, derma- taanisulfaatti, hepariini, heparaanisulfaatti, kera- taanisulfaatti ja kerataanipolysulfaatti.

1C3279

Taulukko 1

Glykosaminoglykaani Heksosamiini Uronihappo

Hyaluronihappo GlcNAc GlcUA

(mp. 1 000 - 10 000 000)

* 5 Kondroitiini GalNAc GlcUA

(mp. 1 000 - 100 000)

Kondroitiinisulfaatti-A GalNAc (4S) GlcUA

(mp. 1 000 - 100 000)

Kondroitiinisulfaatti-C GalNAc (6S) GlcUA

10 (mp. 1 000 - 100 000)

Kondroitiinisulfaatti-D GalNAc (6S) GlcUA (2S) (mp. 1 000 - 100 000)

Kondroitiinisulfaatti-E GalNAc (4S,6S) GlcUA

(mp. 1 000 - 100 000) 15 Kondroitiinisulfaatti-K GalNAc (4S) GlcUA (3S) (mp. 1 000 - 100 000)

Kondroitiinipolysulfaatti GalNAc (S) GlcUA (S) (mp. 1 000 - 150 000)

Dermataanisulfaatti GalNAc (4S) IduUA,GlcUA

20 (mp. 1 000 - 20 000)

Hepariini GlcNS (6S) GlcUA,IduUA

(mp. 1 000 - 20 000) (2S)

Heparaanisulfaatti GlcNS (NAc, S) GlcUA,IduUA

(mp. 1 000 - 20 000) (2S) 25 Kerataanisulfaatti GlcNAc (6S) Gal (mp. 1 000 - 20 000)

Kerataanipolysulfaatti GlcNAc (6S) Gal (6S) (mp. 1 000 - 20 000)

GlcNAc: N-asetyyli-D-glukosamiini ' 30 GalNAc: N-asetyyli-D-galaktosamiini

GlcNS: D-glukosamiini-N-sulfaatti ' ’ ’ GlcUA: D-glukuronihappo

IduUA: L-iduronihappo Gal: D-galaktoosi 35 S: O-sulfaatti 103279

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettuja fosfolipidi- tai lipidiliitteistä glykosaminoglykaania voidaan käyttää suolana, edullisesti alkalimetallin, kuten natriumin, kaliumin tai vastaavan, maa-alkalimetallin, 5 kuten kalsiumin, magnesiumin tai vastaavan ja amiinin, kuten trialkyyliamiinin, pyridiinin tai vastaavan kanssa muodostettuna suolana.

Seuraavat ovat esimerkkejä esillä olevan keksinnön mukaisisesti valmistetuista fosfolipidi- tai lipidiliit-10 teisistä glykosaminoglykaaneista.

Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten fosfolipidiliitteis-ten glykosaminoglykaanien tai niiden suolojen valmistamiseksi i 15 ^R2 ! ^ 20 R3^/3-CHj-P1

GAG

jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fos-' folipidistä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: 25 ch2-o-r4 " CH-O-R5 O (IX) i il

CH,0-P-O-Y

i» l 30 ' jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja i R7 ovat molemmat C6.24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai - -CH2CH(COOH)NH-, ja (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa i 35 3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos- 5 1032'/y aminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroitiinistä, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataanisulfaatista tai hepariinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygluku-ronihapporyhmää, tai kun GAG on glykos- aminoglykaanitähde 5 dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pää- tyiduronihapporyhmää; ' (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R1 sijaitsee asemassa 3, R2 on COOH-ryhmä ja R1 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykos-aminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-K:sta tai kond- 10 roitiinipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pää- tyglukuronihapporyhmää; (3) GAG sijaitsee asemassa 3, R1 sijaitsee asemassa 4, R2 on CH2OH-ryhmä ja R1 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos- aminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta 15 pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; ja (4) GAG sijaitsee asemassa 3, R1 sijaitsee asemassa 4, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R1 on OH-ryhmä, kun GAG on gly-kosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää.

20 Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: glykosaminoglykaani, jonka kaava on (1-1) :

« K/, Λ rV-^H-OH

0 GAG

pelkistetään ja avataan rengas pelkistävässä päätyryhmäs-ν sä, jolloin saadaan pelkistetty tuote, jonka kaava on (1-2) : 103279 5 V \ (1-2)

* V7 i CH,OH

'fr/

GAG OH

10 joka pelkistetty tuote hapetetaan hapetetun tuotteen saa miseksi, jonka kaava on (1-3) : x.

GAG

20 minkä jälkeen näin muodostetun, hapetetun tuotteen aldehy- diryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen ami-noryhmän kanssa, jolloin GAG, R2 ja R3 määritellään kuten edellä.

Keksinnön kohteena on myös menetelmä kaavan (II) 25 mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen foslipidiliit- teisen glykosaminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, R3 CHj-P1 30 y ( CH,0H (II) •A-/ r1 : 35 # -103279 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi-distä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: CH2-0-R4 5 CH-O-R5 O (IX) I 11

CH20--P-O-Y

!)h jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja 10 R7 ovat molemmat C6.24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(COOH)NH-, (1) R1 on NHCOCH3-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroi-tiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos- 15 amiiniryhmää; (2) R1 on NHCOCHj - ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatista A tai K, kondroitiinipolysulfaatista tai dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; ja 20 (3) R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista tai kera-taanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty-galaktoosiryhmää.

Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää ;" 2 5 seuraavat vaiheet: glykosaminoglykaani, jonka kaava on (11-1) : ch2r R3 1 (/ °\ (II-l) ' 30 r \

Vl /^h-oh

v ’ gag'' N I

R1 pelkistetään ja avataan rengas pelkistävässä päätyryhmäs-35 sä, jolloin saadaan pelkistetty tuote, jonka kaava on 103279 (II-2) : ch2r V ^ 5 ( CHjOH dl'2)

>LV

GAG I

R1 joka pelkistetty tuote hapetetaan hapetetun tuotteen saa- 10 miseksi, jonka kaava on (II-3) :

R3 CHO

V CH,OH

X/ 15 CAG I, minkä jälkeen näin muodostetun, hapetetun tuotteen aldehy-diryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen ami-noryhmän kanssa, jolloin GAG, R1 ja R3 määritellään kuten edellä ja R on OH- tai 0S03H-ryhmä.

20 Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä kaavan (I- II) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fos-folipidiliitteisen glykosaminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, HO ΟΗ,-Ρ1 v A (III) gag' m-cHrpl f \ 30 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi- * distä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: CH2-0-R4 CH-O-R5 O (IX)

i II

CH20-P-O-Y

! 35 <3H

j s 103279 jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(COOH)NH-, ja ja GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista 5 tai kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää.

Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: kaavan (II-2) mukainen pelkistetty tuote 1o ch2r r3

f f-OH

C / (II-2) V ch2oh 15 GAG^^ ^ R1 hapetetaan hapetetun tuotteen saamiseksi, jonka kaava on (11) :

HO CHO

20 Y

V] (11) GAG/N-CH0 jossa GAG määritellään kuten edellä, minkä jälkeen näin 25 muodostetun, hapetetun tuotteen aldehydiryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa.

Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä kaavan (IV) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidiliit-teisen glykosaminoglykaanin tai sen suolan valmistamisek-30 si, /^r2

ς : /-SQ-OH

V N. CO-P1 (IV)

GAG R

103279 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi-distä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: 5 CH2-0-R4 CH-O-R5 O (IX) I II .

CH20- P-O-Y

bn 10 jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(COOH)NH-, ja (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun 15 GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroi- tiinista, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataani-sulfaatista, hepariinista tai heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lu- 20 kuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on OSOjH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-D:stä, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihappo- *. 25 ryhmää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepa riinista tai heparaanisulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (3) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, 30 kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti- K:sta lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyh-mää ; (4) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, ainakin jompikumpi R1 tai R3 on 0S03H-ryhmä, kun toinen 35 on OH-ryhmä, ja R2 on COOH-ryhmä, kun GAG on glykosamino- 103279 glykaanitähde kondroitiinipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää; (5) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH2OH-ryhmä, 5 kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; (6) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH20S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaa- 10 tista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; (7) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroitiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos- 15 amiiniryhmää; (8) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä, ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatista A tai K tai dermataanisulfaatista, lukuun ot- 20 tamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (9) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatista C tai D, lukuun ottamatta pelkistävää päätyhek- ;" 25 sosamiiniryhmää; (10) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatti-E:stä lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos- 30 amiini ryhmää ; (11) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa _ · ' 4, R1 on NHCOCHj-ryhmä, R2 on CH20H-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryh mä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä tai 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipo- 35 lysulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää päätyhek- s o s amiiniryhmää; 103279 12 (12) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHS03H-ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh-mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; 5 (13) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHCOCHj - ryhmä tai NHS03H-ryhmä; R2 on CH2OH-ryhmä, : ja R3 on 0S03H-ryhmä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH- ryhmä tai 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty-] 10 heksosamiiniryhmää; (14) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaa-' tista tai kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pel- ! 15 kistävää päätyheksosamiiniryhmää.

Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: r glykosaminoglykaani, jonka kaava on (12): r*2 7 20 f

-Q

y \ V (12) i /^h-oh ; . .

GAG r! hapetetaan ja avataan rengas pelkistävässä pääteryhmässä, jolloin saadaan hapetettu tuote, jonka kaava on (13): rRj

30 S

/-S?-OH

y\ (13> 35 GAG R1 13 103279 josta hapetetusta tuotteesta muodostetaan laktoni, jonka kaava on (14): : ' -Ih -

GAG

10 minkä jälkeen näin valmistetun laktonin annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa, jolloin GAG, R1, R2 ja R3 määritellään kuten edellä ja A on aikaiimetal-li .

15 Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä kaavan (V) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykos- aminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, 20 ς*3 R3 / -CH2-NH- ( CH2) m-NHC0- (CH2) ^-CO-P2 . 25 /

GAG

jossa P2 on fosfolipidistä tai lipidistä peräisin oleva ryhmä, jolla on kaava m r 103279 CH,-0-R8 CH2-0-R8

I I

CH-O-R9 (X) CH-O- (XI) ^ I I a CHj-O- CHj-0-Rs ch2-o- ch-o-r10 CH-O-R10 ° fXII> 0 10 I 1 ( 1 f 0 1 (χΙΙΙ1

CH2-0 P-O-W tai ch2-o-P-O-W

0H OH

joissa R8 on vety, R9 on a 1 kyy li ryhmä, R10 on -CH=CHR6 tai 15 -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2N+- (CH3) 3 tai inositolitähde, tn on kokonaisluku 1 -8 ja 1 on t kokonaisluku 1 - 10; ja (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos- 20 aminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroitiinista, f kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataanisulfaatista, : hepariinista tai heparaanisulfaatista lukuun ottamatta : pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun GAG on gly- kosaminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lukuun otta-25 matta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 1 3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykos- aminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-K:sta tai kond-roitiinipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pää-30 tyglukuronihapporyhmää; '· (3) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa ’ 4, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos- 7 aminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta r pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; ja 103279 15 (4) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on gly-kosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää.

5 Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: aldehydiyhdisteen, jonka kaava on (1-3),

Sr

-CHO

GAG

15 annetaan reagoida alkyleenidiamiinin kanssa johdannaisen saamiseksi, jonka kaava on (15): ζ"’ ? (15)

JT

/ 3-CHj-NH- ( ch2 ) m-m2

GAG

25 jossa GAG, R2, R3 ja m määritellään kuten edellä, jolloin erikseen fosfolipidi tai lipidi saatetaan reagoimaan di-karboksyylihapon tai dikarboksyylihappoanhydridin kanssa fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen saamiseksi, jossa on karboksyyliryhmä, minkä jälkeen kaavan (15) mukaisen joh-30 dannaisen primaarinen aminoryhmä saatetaan reagoimaan ·' fosfolipidi- tai lipidi johdannaisen karboksyy li ryhmän * kanssa.

Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä kaavan (VI) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidi- tai 35 lipidiliitteisen glykos- aminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, I 16 103279 H3 CH2-NH- (CHj) m-NH-CO— (CH2) ,-CO-P3 V ™ Λ /v' GAG -1 R1 (1) R1 on NHCOCHj - ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroi- 10 tiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos- ami ini ryhmää; (2) R1 on NHCOCHj - ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatista A tai K, kondroitiinipolysulfaatista tai dermataanisulfaatista, 15 lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; ja (3) R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista tai kera-taanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty-galaktoosiryhmää, 20 P2 on fosfolipidistä tai lipidistä peräisin oleva ryhmä, jolla on kaava . 25 CH2-0-R" CHj-O-R» CH-O-R3 (X) CH-O- (XI) ch2-o- ch2-o-r3 1 CHj-O- CH-O-R10 CH-O-R10 I (XII) iH-0- O (XIII) ch2-o-P-o-w tai CIl2_0-p-o-w

OH OH

103279 joissa R8 on vety, R9 on alkyyliryhmä, R10 on -CH=CHR6 tai -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2N+-(CH3)3 tai inositolitähde, m on kokonaisluku 1 - 8 ja 1 on kokonaisluku 1-10.

5 Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: aldehydiyhdisteen, jonka kaava on (II-3),

E3 CHO

10 v (j CH2OH (II-3) GAG7 f R1 15 annetaan reagoida alkyleenidiamiinin kanssa johdannaisen saamiseksi, jonka kaava on (16): R3 CH2-NH-(CH2)m-NH2 \ ch2oh (16) X / G AG -[ R1 jossa GAG, R1, R3 ja m määritellään kuten edellä, jolloin erikseen fosfolipidi tai lipidi saatetaan reagoimaan di-.· 25 karboksyylihapon tai dikarboksyylihappoanhydridin kanssa

fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen saamiseksi, jossa on karboksyyliryhmä, minkä jälkeen kaavan (16) mukaisen johdannaisen primaarinen aminoryhmä saatetaan reagoimaan fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen karboksyyliryhmän kanssa. 30 Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä kaavan VII

mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidi- tai * lipidiliitteisen glykos- aminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, 18 103279 5 l/\ (VII) «V, > CO-NH- ( CH2) m-NHCO~ ( CH2 ) ^-CO-P2

i "37W

GAG H1 10 (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa ! 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun t ' GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroi- * tiinista, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataani- sulfaatista, hepariinista tai heparaanisulfaatista, lukuun t l 15 ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on 0S03H-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, 20 kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti- D:stä lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyh- »' i mää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista, tai heparaanisulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; 25 (3) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa I 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, - kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-

Krsta lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää; π 30 (4) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, ainakin jompikumpi R1 tai R3 on 0S03H-ryhmä, kun toinen on OH-ryhmä, ja R2 on COOH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipolysulfaatista, lukuun ottamat- — ta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää; tm 19 103279 (5) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH2OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; 5 (6) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH20S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; (7) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 10 4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroitiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosami ini ryhmää; (8) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 15 4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, r2 on CH2OH-ryhmä, ja R3 on 0S03H- ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatista A tai K tai dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (9) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 2 0 4 , R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatista C tai D lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosami iniryhmää; (10) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 25 4, R1 on NHCOCH3-ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on 0S03H- ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatti-E:stä, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosami ini ryhmää ,- (11) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 30 4 , R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OS03H-ryh- mä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä tai 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipo-lysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosami iniryhmää ; 103279 (12) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHSOjH- ryhmä, R2 on CH20S03H - ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; 5 (13) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHCOCH3 - ryhmä tai NHS03H-ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä, ja R3 on OSO3H-ryhmä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä tai 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty-10 heksosamiiniryhmää; (14) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3 , R1 on NHCOCH3-ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh-mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaa-tista tai kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pel-15 kistävää päätyheksosamiiniryhmää, ja P2 on fosfolipidistä tai lipidistä peräisin oleva ryhmä, i ! jolla on kaava ch2-o-r8 ch2-o-r8 2 0 CH-O-R9 (X) CH-O- (XI)

I I

ch2-o- ch2-o-r9 *|H2—°— CH-O-R10 I ... 25 CH-O-Rl» O {xii) I (XIII) ; ch2-o-P-0-W ta. JH2.0-'

I 0H OH

joissa R8 on vety, R9 on alkyyliryhmä, R10 on -CH=CHR6 tai 30 -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2N+- ! (CH3) 3 tai inositolitähde, m on kokonaisluku 1 -8 ja 1 on kokonaisluku 1-10.

Menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: ! 35 laktoniyhdisteen, jonka kaava on (14), 21 103279 J&- - GAG R1 10 annetaan reagoida alkyleenidiamiinin kanssa johdannaisen saamiseksi, jonka kaava on (17): G^T0H (17) 3 ^ ^ CO-HH- (CH2 ) „-NHj 20 GAG Rl jossa GAG, R1, R2, R3 ja m määritellään kuten edellä, jolloin erikseen fosfolipidi tai lipidi saatetaan reagoimaan dikarboksyylihapon tai dikarboksyylihappoanhydridin kanssa 25 fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen saamiseksi, jossa on karboksyyliryhmä, minkä jälkeen kaavan (17) mukaisen johdannaisen primaarinen aminoryhmä saatetaan reagoimaan fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen karboksyyliryhmän kanssa.

Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä kaavan 30 (VIII) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfoli- pidiliitteisen glykos- aminoglykaanin valmistamiseksi, joka sisältää uronihapporyhmän, tai sen suolan valmistamiseksi , 103279 ^-CO-P1 5 / -° ^j(r3 / °x <viii> R1 10 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi- distä peräsin oleva ryhmä, jonka kaava on: i I ch2-o-r4 ! CH-O-R5 O (IX) 1 "

! 15 CH20- P-O-Y

j tiH

f jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai 2 0 -CH2CH(COOH)NH-, ja R1 ja R3 merkitsevät toisistaan riippumatta OH-ryh-mää tai S03H-ryhmää.

' Menetelmälle on tunnusomaista, että fosfolipidi, joka sisältää ryhmän P1, saatetaan kondensoivan aineen läs-25 nä ollessa reagoimaan kaavan (18) mukaisen glykosaminogly- ! kaanin kanssa, joka sisältää uronihapporyhmän,

x'-COOH

30 -o U8)

JtX

R1 35 23 103279 jossa R1 ja R3 määritellään kuten edellä, tai glykosamino-glykaanin karboksyyliryhmä aktivoidaan ja aktivoidun kar-boksyyliryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa.

5 Glykosaminoglykaanien edullisia molekyylipainoja on lueteltu taulukossa 1.

Fosfolipidi, jossa on primaarinen aminoryhmä, jota edustaa P1 edeltävissä kaavoissa (I) , (II), (III), (IV) ja (VIII), on yhdiste, jonka kaava on: 10 i CH,-0-R4 1 s o CH-O-R5 ° i il ce,o-p-o-y

15 OH

jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(COOH)NH-. Erityisen edullisia ovat yhdisteet, joissa joko R4 tai R5 on -COR7-ryhmä, kuten heksadekanoyyli tai 20 oktadekanoyyli, tai joissa R4 on -CH=CHR6-ryhmä ja R5 on -COR7-ryhmä.

Fosfolipidi tai lipidi, jota edustaa P2 edeltävissä kaavoissa (V) , (VI) ja (VII), on yhdiste, jota esittävät kaavat: 24 103279 CH,-0-R8 CH2-0-R8

I , I

CH-O-R9 (X) CH-O- (XI)

| I

5 ch2-o- ch2-o-r9 ^2“°“ CH-O-R10 CH-O-R10 0 ,γγτ> Λ 0 I II (XII) f"°" ||

ch2-o p-o-w ch2-o-P-O-W

I 2 I

0H OH

joissa R8 on vety, R9 on alkyyliryhmä, R10 on -CH=CHR6 tai 15 -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2N+- (CH3) 3 tai inositolitähde. Erityisen edullinen on lipidi, jonka kaava on (X) tai (XI) , jossa joko R8 tai R9 on -C0R7-ryhmä, kuten heksadekanoyyli tai oktadekanoyyli, tai jossa R8 on vety ja R9 on -COR7-ryhmä, tai fosfolipidi, jonka kaa-20 va on (XII) tai (XIII), jossa R10 on -C0R7-ryhmä.

Menetelmiä kaavojen (I) - (VIII) mukaisten fosfolipidi- tai lipidiliitteisten glykosaminoglykaanien tuottamiseksi kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisesti.

Pelkistävän päätyryhmän rajoitettu hapettaminen ! 25 Tässä menetelmässä glykosaminoglykaanin pelkistävä päädyssä sijaitseva uronihappo-, galaktoosi- tai heksos-amiiniryhmä hapetetaan osittain ja sen rengas aukaistaan aldehydiryhmän muodostamiseksi ja näin muodostetulle alde-hydiryhmälle suoritetaan pelkistävä alkylointireaktio fos-30 folipidin primaarisella aminoryhmällä fosfolipidiliittei- .· sen glykosaminoglykaanin saamiseksi. Tämän menetelmän t reaktiokaaviota kuvataan seuraavassa.

(A) Tapauksessa, jossa pelkistävänä päätysokerina on glukuroni- tai iduronihappo, suoritetaan seuraava reak-35 tio: 25 103279

^COOH s-COOR

/ \ / · { r3 Vv^H-OH Pelkl5tg|-^ 3 cH2OH hapetus 5 GAG- GAG^-^

OH OH

(1) (2)

10 ^-COOH ^-COOH

f--OH r--OH

/ / (I-a) / , fosfolipidi / , \ R3 ' -^ U3 15 GAG '-CHO GAG^-0Η2-Ρ! (3) jossa R3 määritellään, kuten edellä ja P1 on fosfolipidi, jossa on primaarinen aminoryhmä.

20 Tapauksessa, jossa lähtöaineena käytetään hyaluro- nihappoa, kondroitiinia, kondroitiinisulfaatti-A:ta, kondroitiinisulfaatti-C:tä, kondroitiinisulfaatti-E:tä, kondroitiinisulfaatti-K:ta, kondroitiinipolysulfaattia, dermataanisulfaattia ja hepariinia, joita esittää kaava 25 (1) ja joissa on pelkistävä pääty-D-glukuronihappo tai -L- iduronihappo, jonka OH-ryhmä on liitetty hiiliatomiin asemassa 2, fosfolipidiliitteinen glykosaminoglykaani, jonka kaava on (I-a), valmistetaan edeltävän reaktiokaavion mukaan.

30 (B) Tapauksessa, jossa glukosamiini tai galaktos- amiini on pelkistävänä päätysokerina, suoritetaan seuraava : reaktio: 26 1 0 3 2 7 9 ch2oh ch2oh R3 _o R3 I___ Y, Vh.oh ^lki^ , Y. ch2oh 5 GAG | GAG^^ ^ NHCOCH3 NHCOCH3 (4) (5) R3 CHO R3 CHj-P1 ]/ fosfolipidi ^11 3 ^ ch2oh -*" ^ch2oh

GAG' GAG

'3HCOCH3 NHCOCH3 15 (6)

Jossa R3 määritellään kuten edellä ja P1 on fosfolipidi, jossa on primaarinen aminoryhmä.

Tapauksessa, jossa lähtömateriaalina käytetään hya-20 luronihappoa, kondroitiinia, kondroitiinisulfaatti-A:ta, kondroitiinisulfaatti-K:ta, kondroitiinipolysulfaattia ja dermataanisulfaattia, joiden kaava on (4) ja joissa pelkistävänä päätyryhmänä on glukosamiini tai galaktosamiini, jossa CH2OH-ryhmä on liitetty hiiliatomiin asemassa 5, fos-25 folipidiliitteinen glykosaminoglykaanl, jonka kaava on (Il-a), valmistetaan edeltävän reaktiokaavion mukaan.

5 (C) Tapauksessa, jossa galaktoosi on pelkistävänä päätysokerina suoritetaan seuraava reaktio: j 27 1 0 3 2 7 9 ch2oh/ch2oso3h ch2oh/ch2oso3h

OH I-o OH I-0H

L V.H-OH pelkiSt-7S > V, CH2OH

5 /\_/ /N_/ GAGX f GAG' OH OH NSS^ (7) (8) 10 ch2oh/ch2oso3h ch2oh/ch2oso3h

OH I-0H , oh)-0H

/ fosfplipldi / (I-b)

15 Xl X

gag7 N-CH0 gag7 N-CHrP

(9) 20 0H/Cm OR, CHj-P1 , λ /-TT ™ fosfolipidi / (I-L-b) X /¾08-- VI ch2oh

25 gag/W

OH '

OH

(6) 30 0H/CH0 OH CH2-pl - " \A fosfolipidi. / ( m) r.r/^-CHO /\ r„ _pl

GAG gag7 CH3 P

35 J.

i (11) 28 103279 jossa R3 määritellään, kuten edellä ja P1 on fosfolipidi, jossa on primaarinen aminoryhmä.

Tapauksessa, jossa lähtömateriaalina käytetään ke-rataanisulfaattia ja kerataanipolysulfaattia, jonka kaava 5 on edeltävä kaava (7) ja jossa pelkistävänä päätysokerina on galaktoosi, fosfolipidiliitteinen glykosaminoglykaani, jonka kaava on (I-b), (ΙΙ-b) tai (III), valmistetaan edeltävän reaktiokaavion mukaan.

Edeltävissä menetelmissä (A) , (B) ja (C) kaavojen 10 (1), (4) ja (7) mukaisten glykosaminoglykaanien pelkistä ville päätysokeriryhmille suoritetaan ensin pelkistävä renkaan avaus vastaavien yhdisteiden (2), (5) ja (8) saa miseksi .

Käyttökelpoinen pelkistin käytettäväksi pelkistys-15 vaiheessa on borohydridin alkalisuola, kuten natriumboro- hydridi, natriumsyaaniborohydridi tai vastaava.

Liuottimena käytettäväksi edeltävässä pelkistysreaktiossa voidaan käyttää vettä tai 0,05-%:ista boraat-tipuskuria (pH 8,3).

20 Pelkistysreaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 10 - 30 °C, edullisesti 15 - 25 °C.

Pelkistimen määrä, joka tosin vaihtelee pelkistimen tyypistä riippuen, on 5 - 50 ekvivalenttia, edullisesti 25 - 30 ekvivalenttia kohden moolia yhdistettä (1) , (4) 25 tai (7) .

Näin saaduille kaavojen (2), (5) ja (8) mukaisille yhdisteille suoritetaan sitten osittainen hapetus aldehy-diyhdisteiden muodostamiseksi, joiden kaava on (3) , (6) , (9), (10) tai (11).

Λ 30 Käyttökelpoinen hapettimena käytettäväksi hapetus- reaktiossa on perjodihapon alkalisuola, kuten natriumper-jodaatti, kaliumperjodaatti tai vastaava.

Hapettimen määrä on 1 - 10 ekvivalenttia, edullisesti 3-6 ekvivalenttia kohden moolia yhdistettä (2), 103279 (5) tai (8). Hapetusreaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 0 - 10 °C, edullisesti 0 - 4 °C.

Kukin näin muodostetuista aldehydiyhdieteistä (3), (6) , (9), (10) ja (11) voidaan saattaa reagoimaan fosfo- 5 lipidin primaarisen aminoryhmän kanssa tunnetun pelkistävän alkylointireaktion mukaan. Täten saadaan esillä olevan keksinnön mukaiset fosfolipidiliitteiset glykosamino-glykaanit, joiden kaava on (I-a), (Il-a), (I-b), (Il-b) tai (III).

10 Esimerkkejä fosfolipidistä käytettäväksi edeltä vässä reaktiossa ovat L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiini, DL-fosfatidyyli-L-seriini, etanoliamiiniplasmalogeeni, serii-niplasmalogeeni ja vastaavat.

Pelkistävä alkylointireaktio yhdisteiden tuottami-15 seksi, joiden kaava on (I-a), (Il-a), (I-b), (ΙΙ-b) tai (III), voidaan suorittaa sekoittamalla aldehydiyhdiste (3), (6), (9), (10) tai (11) ja fosfolipidi liuotettuna kloroformiin tai vastaavaan tasaisesti liuottimeen, kuten veteen, 0,05 M fosfaattipuskuriin (pH 7,0) tai dimetyyli-20 formamidiin, minkä jälkeen seoksen annetaan reagoida lämpötilassa 15 - 60 °C, jolloin samanaikaisesti tai tämän jälkeen suoritetaan pelkistysreaktio käyttäen pelkistintä, kuten natriumsyaaniborohydridiä tai vastaavaa.

Esimerkkejä yhdisteistä, jotka valmistetaan hapet-• 25 tamalla rajoitetusti pelkistävää päätyryhmää, esitetään taulukossa A.

*

Taulukko A

30 1 0 3 2 7 9

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

COOH

5 'N

s hyaluronihappo, kondroitiini, f kondroitiinisulfaatti A, C tai f E, dermataanisulfaatti, hepa- / Qg riini, heparaanisulfaatti j\l 1 GAG N-CHj-P1 10

COOH

^ I—(2) / kondroitiinisulfaatti K, / kondroitiinipolysulfaatti

15 N. 0S03H

GAG ^- CHj-P1 ch2oh 20 }-OH kerataanisulfaatti I~(3) HO/ ί GAG'^//'-CH2-pl 25 »

CH,OSO,H

)-OH

I— (4) 20 / kerataanipolysulfaatti

30 L

GAG^-CH2-pl Ψ

Taulukko A (jatkoa) 103279 31

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali 5 H? /CH’-Pl II — (1) \/ hyaluronihappo, kondroitiini

Y Λ CH30H

X_y GAGX f NHCOCH3 10 ΟΗ,-Ρ1 ho3so / 2 ^”(2) / kondroitiinisulfaatti A tai K, v CH2OH kondroitiinipolysulfaatti, / dermataanisulfaatti 15 gag/^-( NHCOCH3 ΟΗ,-Ρ1 HO / 2 11-(3) / kerataanisulfaatti, 2 0 ' / V CH OH kerataanipolysulfaatti >0_/ 2 GAGX f

OH

25 ΟΗ,-Ρ1 H? / / kerataanisulfaatti, v kerataanipolysulfaatti GAG^-ca2-pl 30 Laktonin muodostaminen pelkistävästä päätyryhmästä Tässä menetelmässä glykosaminoglykaanin pelkistä-välle päädyssä sijaitsevalle uronihappo-, galaktoosi- tai heksosamiiniryhmälle suoritetaan hapetus pelkistävän pää-tysokeriryhmän renkaan avaamiseksi, minkä jälkeen avatusta 35 tuotteesta muodostetaan laktoni ja se saatetaan reagoimaan 32 103279 fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa fosfolipidi-liitteisen glykosaminoglykaanin saamiseksi. Tätä reaktio-kaaviota havainnollistetaan alla.

GAG Rl rin R GAG Ri <12) . (13) 15 X~r2 S <tr2 9\\ X/ ' /==0 fosfolipifli (IV) 20 «’-γΙ—Υ ~Λ/0'ΡΙ GAG il / GAG R1 (14) jossa kukin R1, R2 ja R3 määritellään, kuten edellä, P1 on .· 25 fosfolipidi, jossa on primaarinen aminoryhmä, ja A on al- kalimetalli.

Tämän menetelmän mukaan kaavan (12) mukaiselle gly-kosaminoglykaanille suoritetaan ensin hapetus sen pelkistävän päätyryhmän renkaan avaamiseksi, jolloin saadaan 30 kaavan (13) mukainen karboksyyliyhdiste.

Käyttökelpoisia lähtömateriaalina ovat edeltävän kaavan (12) mukaiset yhdisteet mukaan lukien hyaluronihap-po, kondroitiini, kondroitiinisulfaatti-A, kondroitii-nisulfaatti-C, kondroitiinisulfaatti-D, kondroitiinisul-35 faatti-E, kondroitiinisulfaatti-K, kondroitiinipolysul- 33 103279 faatti, dermataanisulfaatti, hepariini, heparaanisulfaatti, kerataanisulfaatti ja kerataanipolysulfaatti.

Hapetusvaiheessa käytettynä hapettimena voidaan käyttää jodia, bromia tai vastaavaa.

5 Hapettimen määrä on 2 - 20 ekvivalenttia, edulli sesti 5-15 ekvivalenttia moolia kohden kaavan (12) mukaista yhdistettä.

Hapetusreaktiossa käytettynä liuottimena voidaan käyttää vettä tai 0,05 M fosfaattipuskuria (pH 7,0).

10 Hapetusreaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 0 - 40 °C, edullisesti 15 - 20 °C.

Näin saatuun kaavan (13) mukaiseen yhdisteeseen kohdistetaan sitten happokäsittely kaavan (14) mukaisen laktoniyhdisteen muodostamiseksi.

15 Happokäsittelyssä voidaan käyttää voimakkaasti ha panta kationinvaihtohartsia kuten Dowex 50, Amberlite IR 120 tai vastaavaa.

Näin muodostettu kaavan (14) mukainen laktoniyh-diste saatetaan sitten reagoimaan fosfolipidin kanssa 20 esillä olevan keksinnön mukaisen fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin tuottamiseksi, jonka kaava on (IV).

Tässä reaktiovaiheessa voidaan käyttää samoja fos-folipidiyhdisteitä kuin kuvattiin edeltävässä pelkistävän päätyryhmän rajoitetun hapettamisen menetelmässä.

, 25 Kaavan (14) mukaisen laktoniyhdisteen reaktio fos folipidin kanssa kaavan (IV) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi voidaan suorittaa liuottamalla kaavan (14) mukainen laktoniyhdiste liuottimeen, kuten veteen, 0,05 M fosfaattipuskuriin (pH 7,0) tai dimetyyliformamidiin, minkä 30 jälkeen liuos sekoitetaan fosfolipidiin, joka on liuotet-. tu kloroformiin tai vastaavaan, tasaisesti ja seoksen an netaan reagoida lämpötilassa 5-80 °C, edullisesti 30 -60 °C.

Esimerkkejä yhdisteistä, jotka valmistetaan muo-35 dostamalla laktoni pelkistävästä päätyryhmästä, esitetään taulukossa B.

Taulukko B

34 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

s- COOH

5

i-OH

IV-(1) / hyaluronihappo, kondroitiini, / kondroitiinisulfaatti A, C tai K OH CO-P1 E' äermataanisulfaatti, hepa- \| / riini, heparaanisulfaatti GAG ^1

10 OH

s- COOH

n—oh IV-(2) / kondroitiinisulfaatti D, ΐς / , hepariini, hepariinisulfaatti N0H /°-p GAG -f

0S03H

20

COOH

}-OH

IV—(3) / kondroitiinisulfaatti K

/ OSO3H co_pl 25 >\ / GAG N-/

OH

Taulukko B (jatkoa) 35 1 0 3 2 7 9

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali COOH 5

)-OH

IV-(4) —a / kondroitiinipolysulfaatti l OSO3H co-p1 GAG N-/

10 OSO3H

COOH

_Qg 15 IV-(4)-b / kondroitiinipolysulfaatti / OSO3H co-pl GAG N-/

OH

20

COOH J-OH

IV—(4)—c / kondroitiinipolysulfaatti . 25 i\fH /co'pl : GAG N-/

OSO3H

103279

Taulukko B (jatkoa)

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

CH,0H

5 I

__ _ }-OH

XV— (5) HO / kerataanisulfaatti Ϊ . CO-P1 gägAL_/

10 L

ch2oso3h

J-OH

15 IV (6) HO / kerataanipolysulfaatti gagV_Ap1

OH

20

CH,OH

ψ J—°5 IV—{7) ( / hyaluronihappo, kondroitiini 25 O. CO-P1 T’ GAG'N-/ nhcoch3

Taulukko B (j atkoa) 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaaninateriaali ch2oh 5

\_QJJ

IV-(8) HOjSO / kondroitiinisulfaatti A tai K, / , dermataanisulfaatti V . co-p1

GftGAl/ 10 NHCOCH3

CH,OSO,H

Li

^ IV-(9) HO / kondroitiinisulfaatti C tai D

Ci /co'pl GAG^N_/ NHCOCH3 20 ch2oso3h

l QTT

IV-(10) HO3SO / kondroitiinisulfaatti E

=· 25 GftGl_ nhcoch3 38 103279

Taulukko B (j atkoa)

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

CH,OH

J

ly— (11)-a HO SO f kondroitiinipolysulfaatti \ r" GAG'/N_ /

10 I

NHCOCH3

CH,OSO,H

LI

15 IV- (11) -b HO / kondroitiinipolysulfaatti : vi /°-pi GAG/N_/ nhcoch,

20 J

ch2oso,h

Li IV-(11)-C HO3SO / kondroitiinipolysulfaatti 25 CO-P1 gÄGAL·/ NHCOCH3 103279

Taulukko B (jatkoa)

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

CH,OSO,H

5 I

IV-(12) f 0H hepariini

KT /°-pI

GAG N-/

10 NHS03H

CH,OH 1—OH

15 IV—(13)—a / heparaanisulfaatti /0SO3H CO-P1

gagNL_V

NHCOCH3/NHSO3H

20 ch2oso,h

lL

}--OH

IV- (13) -b / heparaanisulfaatti 25 k?H CO-P1 GAG ^^

NHCOCH3/NHSO3H

40 103279

Taulukko B (j atkoa)

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

5 CH20S03H

J-OH

IV-(13)-C / heparaanisulfaatti /oso3h CO-P1 GAG^*-/

10 I

NHCOCH3/NHSO3H

ch3oso,h n_ IV-(14) / kerataanisulfaatti, / kerataanipolysulfaatti / OH CO-P1 oK-/ 20 NHCOCH3

Pelkistävän päätyryhmän amidointi Tässä menetelmässä kaavojen (3), (6), (9) ja (10) mukaisista aldehydiyhdisteistä kunkin sekä kaavan (14) mukaisen laktoniyhdisteen annetaan reagoida alkyleenidiamii-25 niyhdisteen kanssa glykosaminoglykaanijohdannaisen saarni-• seksi, jossa on primaarinen aminoryhmä pelkistävänä pääty- ryhmänä. Näin saadun glykosaminoglykaanijohdannaisen, jossa on primaarinen aminoryhmä, annetaan sitten reagoida fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen kanssa, jossa on kar-30 boksyyliryhmä, jolloin primaarinen aminoryhmä ja karbok-syyliryhmä liittyvät yhteen. Täten valmistetaan fosfolipidi- tai lipidiliitteinen glykosaminoglykaani. Tämän menetelmän reaktiokaaviota havainnollistetaan alla.

4i 103279 ir —%k R3 x CHO K3 x /\ ch2nh- ( ch2 ) „j—NH2

GAG GAG

(3)(9) (15) 10 ^R2 -

/-yr--OH

15 S/Λ ->- y \ 4 \s ' R3 / AL-CH2NH- (CH2) m-NHCO- (CH2) £-CO-P2

GAG

(V) 20 R3 ch0 R3 CHj-NH-ICHj).,-^ . V/“·" —- x/"°'

:· GAG' ^ { GAG I

r1 r1 (6)(10) (16) ( 42 1C3279

R3 CH2NH-(CH2)raNHC0-(CH2)Ä-C0-P2 \ ,CH,OH

i Λ /

GAG x-T

5 r1 (VI) i ” <τζ\ ' 15 GAG R1 GAG R1 5 <14) (17) 1 .

_. 9V

‘Jxj > C0-NH-(CH2)„-NHC0-(CH2)t-C0-P2 - R3yV/ 25 GAG Rl - .· (VII) jossa kukin R1, R2 ja R3 määritellään, kuten edellä ja P2 on fosfolipidi tai lipidi.

Glykosaminoglykaanijohdannainen, jossa on primaa-! 30 rinen aminoryhmä pelkistävänä päätynä edeltävän kaavan I (15), (16) tai (17) mukaisesti, saadaan antamalla kunkin yhdisteen (3), (6), (9) ja (10), jotka on valmistettu edellä mainitulla pelkistävän päädyn rajoitetun hapetuksen menetelmällä, sekä yhdisteen (14), joka on valmistet-35 tu edellä mainitulla menetelmällä laktonin muodostamisek- 43 1 0 3 2 7 9 si pelkistävästä päädystä, reagoida alkyleenidiamiiniyh-disteen kanssa pelkistimen läsnä ollessa.

Tässä reaktiossa käyttökelpoinen alkyleenidiamii-niyhdiste voidaan valita yhdisteistä, joiden kaava on: 5 NH2-(CH2)b-NH2 jossa m on kokonaisluku 1-8.

Pelkistimenä voidaan käyttää natriumsyaaniborohyd-10 ridiä tai vastaavaa.

Pelkistimen määrä on 10 - 100 moolia kohden moolia reaktiosysteemissä käytettävää glykosaminoglykaania.

Reaktioliuottimena voidaan käyttää vettä tai 0,05 M fosfaattipuskuria.

15 Reaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 0-60 °C, edullisesti 4-25 °C.

Fosfolipidi- tai lipidijohdannainen, jossa on kar-boksyyliryhmä, voidaan saada saattamalla fosfolipidi- tai lipidiyhdiste, joka käsittää glyserolirakenteessaan hyd-20 roksyyliryhmän, reagoimaan dikarboksyylihapon tai dikar-boksyylihappoanhydridin kanssa.

Esimerkkejä tässä reaktiossa käytettävästä fosfolipidi- tai lipidiyhdisteestä ovat monoasyyliglyseroli, diasyyliglyseroli, lysofosfatidyylikoliini, lysofosfati-. 25 dyyli-inositoli, eetterilipidit, eetterifosfolipidit ja vastaavat.

Dikarboksyylihappona voidaan käyttää meripihkahap-poa, glutaarihappoa, adipiinihappoa tai vastaavaa.

Dikarboksyylihappoanhydridinä voidaan käyttää ma-30 leiinihappoanhydridiä, meripihkahappoanhydridiä, fumaari-; happoanhydridiä tai vastaavaa.

Käyttökelpoisia kondensoivana aineena ovat 1-etyy-li-3-(dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi, disyklohek-syylikarbodi-imidi tai vastaavat.

44 . 10 3 2 7 9

Reaktioliuottimena voidaan käyttää kloroformia, asetanilidia, dimetyyliformamidia tai vastaavaa.

Reaktiolämpötila voi olla 0 - 60 °C käytettäessä dikarboksyylihappoa kondensoivan aineen läsnä ollessa, tai 5 20-80 °C käytettäessä dikarboksyylihappoanhydridiä.

Glykosaminoglykaanijohdannaisen, jossa on primaarinen aminoryhmä pelkistävänä päätyryhmänä, reaktio fos-folipidi- tai lipidijohdannaisen kanssa, jossa on karbok-syyliryhmä, voidaan suorittaa ensin aktivoimalla karbok-10 syyliryhmä fosfolipidi- tai lipidijohdannaisessa peptidi-kemian alalta hyvin tunnettujen keinojen mukaan, minkä jälkeen näin aktivoidun yhdisteen annetaan reagoida gly-kosaminoglykaanijohdannaisen kanssa.

Fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen karboksyyli-15 ryhmän aktivointi voidaan suorittaa muuttamalla karbok-syyliryhmä aktiiviseksi esteriksi saattamalla fosfolipidi -tai lipidijohdannainen reagoimaan N-hydroksisukkin-imidin, p-nitrofenolin, N-hydroksibentsotriatsolin, N-hyd-roksipiperidiinin, N-hydroksisukkinamidin, 2,4,5-trikloo-20 rifenolin tai vastaavan kanssa kondensoivan aineen läsnä ollessa.

Reaktioliuottimena käyttökelpoisia ovat kloroformi, asetonitriili, dimetyyliformamidi tai vastaavat tai mainittujen seos. Kondensoivana aineena käyttökelpoisia . 25 ovat l-etyyli-3-(dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi, disykloheksyylikarbodi-imidi tai vastaavat.

Reaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 0 - 60 °C.

Näin saatu fosfolipidi- tai lipidijohdannainen, jonka karboksyyliryhmä on aktivoitu, saatetaan sitten 30 reagoimaan glykosaminoglykaanijohdannaisen (15), (16) tai (17) kanssa, jossa on primaarinen aminoryhmä, fosfolipi-di-tai lipidiliitteisten glykosaminoglykaanien (V), (VI) ja (VII) saamiseksi. Tässä reaktiossa käytetty liuotin on kloroformi, asetonitriili, dimetyyliformamidi tai niiden 35 seos. Reaktiolämpötila on 0 - 60 °C.

45 1 0 3 2 7 9

Havainnollistavia esimerkkejä yhdisteistä, jotka tuotetaan edeltävällä pelkistävän päätyryhmän aminointi-menetelmällä, esitetään taulukossa C.

5 Taulukko C

(R=NH- (CH2) m-NHCO- (CH2) ^-CO-P2)

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

^-COOH

-Qtl / hyaluronihappo, kondroitiini, ( ^ ) / kondroitiinisulfaatti A, C tai / OH E, drmataanisulfaatti, heparii- |\ ni, heparaanisulfaatti

GAG ^-CH2-R

COOH J-OH

20 · V—(2) / kondroitiinisulfaatti K, / kondroitiinipolysulfaatti

/ 0S03H

GAG N-Ch2-r 25

CH,OH

U_

J-QU

HO / kerataanisulfaatti GAGAj

30 GAG N-CH2-R

«

Taulukko C (j atkoa) « 103279 5

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

CH,OSO,H

}-OH

V-(4) HO/ kerataanipolysulfaatti

10 GAG'N-CH2-R

-- Ξ J.O VI—(1) CHjOH hyaluronihappo, kondroitiini gag'm_ S NHCOCH3 20 - ch2-r HO,SO / J / kondroitiinisulfaatti A tai K, ~ / kondroitiinipolysulfaatti, V-d CH2OH dermataanisulfaatti " gag^n_/ 25 1 ! nhcoch3 47

Taulukko C (jatkoa) 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali 5 p^2~^ HO / VI-(3) 1/ kerataanisulfaatti, kerataa- \ CH OH nipolysulfaatti GAG/N__|//

10 OH

S- COOH

VII-(l) /hyaluronihappo, kondroitiini, / kondroitiinisulfaatti A, C tai K OH co-R E' ^ermataanisu^-faatti, hepa- J\l / riini, heparaanisulfaatti GAG ^-(

OH

20

s- COOH

r~-OH

VII—(2)· / kondroitiinisulfaatti D, / hepariini, hepariinisulfaatti

K OH .CO-R

, * Jn_y oso3h 48

Taulukko C (jatkoa) 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

' 5 COOH

I u»

VII~(3) / kondroitiinisulfaatti K

/ 0S03H CO-R GAG ^-( 10

OH

COOH

15 J-OH

VII-( 4)-a / kondroitiinipolysulfaatti

/ OSO3H C0-R

GAG ^-/

20 OSO3H

COOH )-OH

VII-(4)-b / kondroitiinipolysulfaatti 25 /

Ϊ.' 0S03H CO-R

GAG N-/

. OH

49

Taulukko C (jatkoa) 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

5 COOH

)-OH

. VII— (4)-c / kondroitiinipolysulfaatti M" /*-· 10 GAG N-f

0S03B

ch2oh

15 I—OH

gQ / kerataanisulfaatti

\ CO-R

GAG-^I_/

20 OH

ch2oso3h VII—(6) / kerataanipolysulfaatti : \ co-r gagAL/ oh

Taulukko C (jatkoa) 5° 1C 3279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

5 CH,OH

ho)

/ )-OH

VII (7) ( / hyaluronihappo, kondroitiini 10 nhcoch3

CH,OH

15 |J_ y — Qg VII- ( 8) / kondroitiinisulfaatti A tai K, 1/ dermataanisulfaatti

\ ^ CO-R

ohgALV

20 NHCOCH3

CH,OSO,H

LI

VII-{9) HO I kondroitiinisulfaatti C tai D

V

\ >1 CO-R

oagX_Y

NHCOCH3

Taulukko C (jatkoa) 51 1C3279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

5 CH,OSO„H

1—

VII-(IO) ho3sof 0H kondroitiinisulfaatti E

10 NHCOCH3

CH,OH

15 I_ VII-(11)-a HO,SO / ^ kondroitiinipolysulfaatti t GAr:^N_ / 20 NHCOCHj

CH,OSO,H

rl VII-(ll)-b HO f kondroitiinipolysulfaatti 25 1/

Vl /C0'R

GAG'/M— / NHCOCH3

Taulukko C (j atkoa) 52 103279

Yhdiste 5 nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali ch2oso,h L_1 VII — (—c H03S0 / kondroitiinipolysulfaatti

VI /C0'R

10 gagAI_/ NHCOCHj

15 CHjOSOjH

; VII — (12) / 03 hepariini ! Λοη co-r gag -/

20 I

NHSO3H

CH,OH

Li 25 VI-(13)-a / °H heparaanisulfaatti

/0SO3H CO-R

GAG^L-j^

NHCOCH3/NHSO3H

Taulukko C (Jatkoa) 53 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali

5 CH20S03H

r—-—qjj IV- (13) —b / heparaanisulfaatti f\?H CO-R GAG ^--/ 10

NHCOCH3/NHSO3H

CH2OS03H

15 )--OH

IV—(13)-c / heparaanisulfaatti

/0SO3H CO-R

gag^--/

20 NHCOCH3/NHSO3H

ch2oso3h

a /-0H

IV-(14) / kerataanisulfaatti, 25 / kerataanipolysulfaatti ; Λοη co.r GAG N-f NHCOCH3 30 Kondensoivan aineen käyttö

Kukin glykosaminoglykaaniryhmän jäsen lukuun ottamatta kerataanisulfaattia ja kerataanipolysulfaattia sisältää D-glukuronihapon tai L-iduronihapon uronihapporyh-mänä, ja kummassakin näistä hapoista karboksyyliryhmä on 35 liittynyt hiiliatomiin asemassa 5.

103279 Tässä menetelmässä fosfolipidiliitteinen glykos-aminoglykaani tuotetaan antamalla uronihappokarboksyyli-ryhmän reagoida fosfollpldln primaarisen aminoryhmän kanssa kondensoivan aineen läsnä ollessa.

5 Tämän menetelmän reaktiokaavio esitetään alla: f ^-COOH \ / ^.CO-P1 \ I / —\ I / / —0 1 | \ ·· fr fr . 15 (18) (VIII) jossa kukin R1, R3, n ja P1 määritellään, kuten edellä.

| Lähtömateriaalina käytettävät kaavan (18) mukaiset yhdisteet valitaan hyaluronihaposta, kondroitiinista, 20 kondroitiinisulfaatti-A:sta, kondroitiinisulfaatti-C:stä, kondroitiinisulfaatti-D:stä, kondroitiinisulfaatti-E:stä, kondroitiinisulfaatti-K:sta, kondroitiinipolysulfaatista, dermataanisulfaatista, hepariinista ja heparaanisulfaa-tista.

j · 25 Fosfolipidinä voidaan käyttää mitä tahansa yhdis teistä, joita kuvattiin edeltävässä esityksessä pelkistävän päätyryhmän rajoitetun hapetuksen menetelmästä.

Esimerkkejä kondensoivasta aineesta ovat dietyyli- i karbodi-imidi, di-isopropyylikarbodi-imidi, metyylipro-30 pyylikarbodi-imidi, dlsykloheksyylikarbodi-imidi, heksa- metyleenikarbodi-imidi, heptaanimetyleenikarbodi-imidi, f < l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi,1-syk- i : 1 i loheksyyli-3-( 2-morfolinoetyyli )karbodi-imidi-meso-p-to- lueenisulfonaatti, l-t-butyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyy- 35 li)karbodi-imidi, difenyylikarbodi-imidi, 4,4'-dinitrodi- 103279 fenyylikarbodi-imidi, di-p-tolyylikarbodi-imidi, bis-(tri-metyylisilyyli)karbodi-imidi ja vastaavat.

Kondensoivaa ainetta voidaan käyttää määrä 10 -100 moolia kohden moolia käytettävää fosfolipidiä tai li-5 pidiä.

Reaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 4 - 60 °C, edullisesti 15 - 25 °C, dimetyyliformamidin, kloroformin tai mainittujen seoksen kaltaisessa liuottimessa.

Havainnollistavia esimerkkejä yhdisteistä, jotka 10 valmistetaan kondensoimismenetelmällä, esitetään taulukossa D.

56 103279

Taulukko D

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali 5 f ^-CO-P1 \ VIII-(l) -O hyaluronihappo, kondroitiini,

/ \ kondroitiinisulfaatti A, C

GAG K OH N\q tai E' dermataanisulfaatti / f'*1 \

/ I_ \ kondroitiinisulfaatti D

GAG^ ( OH

ΓΊ K- \ 0S°3H jn / CO-P1 \

25 / ~ \ kondroitiinisulfaatti K

VIII-(3) )-O

GAG \ K OSO,H / Ό >JYzy

\ /\» AG

30 \ 0H /n

Taulukko D (jatkoa) 103279

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali 5 / CO-P1 \ / I \ / )-O kondroitiinipolysulfaatti GAG \ K OSO,H / Ό fr / “·” \ VIII (4) b I ) O kondroitiinipolysulfaatti GAG \ K OH / Ό rY % 20 f OS03H / / CO-P1 \ VIII-(4)-c /--Ό kondroitiinipolysulfaatti

25 /V

gag^1J\?S03h/ °\

\ POAG

\ 0S03H /„

Yhdiste nro Kaava Glykosaminoglykaanimateriaali 58 103279

Taulukko D (jatkoa) 5 / CO-P1 \ VHI-(5)-a / j-o hepariini, heparaanisulfaatti GAG v. K OH /\> 15 f A-O \ (5) -b /1 \ \ hepariini, heparaanisulfaatti

Hlw\l \ f Nag 20 \ 0S°3H /

Glykosaminoglykaanln aktivointi Tässä menetelmässä, kuten edellä mainitun menetelmän kohdalla, jossa käytettiin kondensoivaa ainetta, fos-25 folipidiliitteinen glykosaminoglykaani (VIII) tuotetaan

• I

aktivoimalla uronihapon karboksyyliryhmä ja sitten sitomalla aktivoitu karboksyyliryhmä fosfolipidin primaariseen aminoryhmään.

Tässä menetelmässä voidaan käyttää samoja glykos-30 aminoglykaaniyhdisteitä ja fosfolipidiyhdisteitä kuin ku-vattiin edeltävässä menetelmässä, jossa käytettiin kon- < densoivaa ainetta.

Karboksyyliryhmän glykosaminoglykaaniyhdisteen uronihapporyhmässä aktivointi voidaan suorittaa peptidi-35 kemian alalta hyvin tunnetuilla keinoilla, esimerkiksi „ 103279 muuttamalla karboksyyliryhmä aktiiviseksi esteriksi saattamalla glykosaminoglykaaniyhdiste reagoimaan N-hydroksi-sukkinimidin, p-nitrofenolin, N-hydroksibentsotriatsolin, N-hydroksipiperidiinin, N-hydroksisukkinamidin, 2,4,5-tri-5 kloorifenolin tai vastaavan kanssa kondensoivan aineen läsnä ollessa.

Uronihapporyhmän karboksyyliryhmä voidaan saattaa reagoimaan amiinisuolan muodossa, kuten tri(n-butyyli)-amiinisuolana, trietyyliamiinisuolana, pyridiinisuolana 10 tai vastaavana.

Reaktioliuottimena voidaan käyttää dimetyyliform-amidia, pyridiiniä, dimetyylisulfoksidia tai vastaavia.

Käyttökelpoisia kondensoivana aineena ovat 1-etyy-li-3-(dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi, disyklohek-15 syylikarbodi-imidi tai vastaavat.

Reaktio voidaan suorittaa lämpötilassa 0 - 60 °C, edullisesti 4 - 20 °C.

Antamalla glykosaminoglykaanin, jossa karboksyyliryhmä on täten aktivoitu, reagoida fosfolipidin kanssa 20 saadaan kaavan (VIII) mukainen fosfolipidiliitteinen gly- kosaminoglykaani.

Tämä reaktio voidaan suorittaa antamalla aktivoidun glykosaminoglykaanin reagoida fosfolipidin kanssa lämpötilassa 0-90 °C, edullisesti 25 - 60 °C, liuottimessa, 25 kuten dimetyyliformamidissa, kloroformissa tai niiden seoksessa.

Fosfolipidi- tai lipidiosien osuus esillä olevan keksinnön mukaisissa fosfolipidi- tai lipidiliitteisissä glykosaminoglykaaneissa, joiden kaava on (I) - (VIII), voi 30 olla 0,005 - 50 %, edullisesti 2 - 10 %.

: Edellä mainituilla eri menetelmillä saatujen fos folipidi- tai lipidiliitteisten glykosaminoglykaanien erotus ja puhdistus voidaan suorittaa esimerkiksi seuraavalla tavalla. Kunkin menettelyn viimeinen reaktioliuos sekoite-35 taan etanoliin, joka on kyllästetty natriumasetaatilla, ja 103279 muodostunut sakka suodatetaan eroon reagoimatta jääneen fosfolipidin tai lipidin poistamiseksi. Näin erotetuilla sakoilla suoritetaan hydrofobinen kromatografia-ajo ja kantaja pestään ammoniumasetaatin, ammoniumkloridin, nat-5 riumkloridin tai vastaavan suolan vesiliuoksella reagoi- matta jääneen glykosaminoglykaanin poistamiseksi. Sen jäl- ' keen kantajaan absorboitu fosfolipidi- tai lipidiliittei- nen glykosaminoglykaani eluoidaan vesiliuoksella, jossa on 10 - 50 % metanolia.

I 10 Etäispesäkemuodostusinhibiittori voidaan valmistaa edullisesti sekoittamalla kutakin jonkin kaavan (I) (VIII) mukaista fosfolipidi- tai lipidiliitteistä gly-kosaminoglykaania tai sen farmakologisesti hyväksyttävää * -t suolaa lääkekäyttöön tarkoitettuihin kiinteisiin tai nes- 15 temäisiin kantajiin tai laimentimiin, eli lisäaineisiin, kuten täyteaineet, stabiloimisaineet ja vastaavat.

Koska fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykosami-noglykaanin suolamuoto on liukoinen veteen, tämä sopii koostettavaksi ruiskeena annettaviksi liuoksiksi. Vaikut-20 tavan ainesosan määrä lääkevalmisteessa voi olla 1 90 paino-% laskettuna kantajien painosta.

Vaikuttavaa yhdistettä voidaan antaa suun kautta rakeina, hienojakoisina rakeina, jauheina, tabletteina, kapseleina, pillereinä tai liuoksina, sekä irtojauheina, 25 tai se voidaan antaa laskimonsisäisenä, lihaksensisäisenä ! · II tai ihonalaisena ruiskeena. Vaikuttavaa yhdistettä voidaan samoin käyttää ulkoisesti käytettävissä valmisteissa, ku- = .. ten peräpuikoissa, voiteissa, puurohauteissa, lääkelaasta- • reissä, linimenteissä, vesissä ja vastaavissa. Samoin se

TS

; 30 voidaan valmistaa ruiskeeseen tarkoitetuksi jauheeksi, : joka liuotetaan käyttöajankohtana sopivaan nesteeseen.

p:; Farmaseuttisten aineiden valmistamiseksi, jotka sisältävät esillä olevan keksinnön mukaisia fosfolipidi-tai lipidiliitteisiä glykosaminoglykaaneja tai niiden 61 103279 suoloja, voidaan käyttää mitä tahansa orgaanista tai epäorgaanista ja kiinteää tai nestemäistä kantajaa tai lai-menninta edellyttäen, että tällaiset lisäaineet voidaan hyväksyä annettaviksi suun kautta, suoleen, ruoansulatus-5 kanavan ulkopuolisesti tai paikallisesti. Esillä olevassa keksinnössä käytettäviä kantajia ovat vesi, gelatiini, laktoosi, tärkkelys, magnesiumstearaatti, talkki, eläin-ja kasviöljyt, bentsyylialkoholi, kumi, polyalkyleenigly-koli, raakaöljyhartsit, kookosöljy, lanoliini ja muut 10 kantajat lääkekäyttöön. Lisäksi [voidaan lisätä] vaihte-levia tasoja stabiloimisaineita, kostuttavia aineita, emulgaattoreita, sekä suoloja farmaseuttisten valmisteiden osmoottisen paineen säätämiseksi tai sopivan pH-arvon säilyttämiseksi.

15 Kun kyseessä ovat rakeet, hienojakoiset rakeet, jauheet, tabletit tai kapselit, farmaseuttinen valmiste voi sisältää esillä olevan keksinnön mukaista vaikuttavaa ainesosaa edullisesti määrän 5-80 paino-%, kun taas 1 -30 paino-% saattaa olla edullinen liuoksien kohdalla. 20 Edelleen vaikuttavan ainesosan edullinen pitoisuus voi olla 1-10 paino-% ruiskeiden kohdalla, 1-50 paino-% peräpuikkojen kyseessä ollessa, ja 0,1 - 10 paino-% voiteiden, puurohauteiden ja vastaavien ollessa kyseessä paikalliseen käyttöön.

25 Kliininen annos voi edullisesti olla 100 - 2 000 mg laskettuna vaikuttavan ainesosan määränä päivää kohden täysikasvuiselle, kun kyseessä on lääkkeen antaminen suun kautta, joskin annosta voidaan vaihdella riippuen [potilaiden] iästä ja oireista. Edullisesti edeltävä päivit-30 täinen annos voidaan antaa kerran päivässä tai kaksi tai 'm kolme kertaa päivässä jakaen annos tämän mukaisesti.

Ruiskeita käytettäessä edullinen annos voi olla 100 - 1 000 mg laskettuna vaikuttavan ainesosan määränä päivää kohden täysikasvuiselle. Voiteina, puurohauteina ja 35 vastaavina käytettyinä näitä valmisteita, jotka sisältävät 62 1 0 3 2 7 9 edellä mainitut määrät vaikuttavaa ainesosaa, voidaan levittää sairastuneeseen kohtaan tarkoituksenmukainen määrä.

Vaikuttavan ainesosan välittömän myrkyllisyyden testaamiseksi suoritettiin seuraavalla tavalla eläinko-5 keitä. 4 viikon ikäisiä uros- ja naaraspuolisia Sic-ddy-hiiriä ruokittiin ensin 1 viikon ajan, minkä jälkeen uroksien saavutettua painon 23 - 30 g ja naaraiden painon 20 - 25 g HAI-PPEADP:tä (eränro 300) ja CS(S3)-PPEADP:tä (eränro 302-2; kumpaakin PPEADP;tä kuvataan jäljempänä) 10 liuotettiin Japanin farmakopean mukaiseen fysiologiseen suolaliuokseen pitoisuus 5 % ja liuosta annettiin vatsaontelon sisäisesti hiirille. Tässä kokeessa käytettiin vatsaontelon sisäistä lääkkeenantoa, koska tämä tapa useimmiten kehittää myrkyllisyysoireita. Kussakin testi-15 ryhmässä käytettiin 10 urosta ja 10 naarasta. Tuloksena todettiin, että LD50-arvo kussakin testierässä oli 2 000 mg/kg tai enemmän, mikä osoittaa esillä olevan keksinnön mukaisen yhdisteen turvallisuuden lääkkeenä.

Suppea kuvaus piirroksista 20 Kuvioissa 1-6 esitetään tulokset hydrofobisesta kromatografia-ajosta fosfolipidi- tai lipidiliitteisillä glykosaminoglykaaneilla, jotka tuotettiin esimerkissä 1-(2)-1), esimerkissä 2-(2)-1), esimerkissä 2-(3), esimerkissä 4-(1), esimerkissä 5-(l) ja vastaavasti esimerkissä 25 5-(2).

Paras muoto keksinnön harjoittamiseksi

Esillä olevaa keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisesti liittyen oheisiin esimerkkeihin, joiden ei tulkita rajoittavan esillä olevan keksinnön kattamaa 30 aluetta.

; Seuraavissa esimerkeissä fosforin, fosfolipidin tai lipidin ja glykosaminoglykaanin (GAG) pitoisuus fosfolipidi- tai lipidiliitteisessä glykosaminoglykaanissa mitattiin seuraavalla tavalla.

63 103279

Mittausmenetelmä 1. GAG:n määritys (1) Uronihappoa sisältävä GAG: Karbatsolirikkihap-pomenetelmä (Bitter-Muir-menetelmä, Analytical Blochem- 5 istry 4 (1962) 330 - 334).

(2) Galaktoosia sisältävä kerataanisulfaatti tai kerataanipolysulfaatti: Antroni-menetelmä (Biochem.J. 50 (1952) 298 - 303).

2. Fosfolipidin tai lipidin määritys 10 (1) Fosfori: Molybdeenisinimenetelmä ("Inorganic

Applied Colorimetric Analysis, osa 4, päätoimittaja Shiro Hirano, kustantaja Kyoritsu Shuppan, ss. 130 - 135).

(2) Rasvahappo: 10 - 50 mg:n erä GAG-lipidiä liuotetaan 10 ml:aan 1 N natriumhydroksidiliuosta ja hydroly-15 soidaan 100 °C:ssa 1 tunnin ajan. Saadun reaktioseoksen pH säädetään happamaksi lisäämällä 1 N kloorivetyhappoliuos-ta ja uutetaan kloroformilla, minkä jälkeen saatu kloro-formifaasi pestään vedellä, se kuivataan vedettömällä Glauber-suolalla ja poistetaan sitten liuotin alipainees-20 sa. Saatu jäännös suljetaan koeputkeen yhdessä sopivan tilavuuden kanssa 3 % HCl:ää (kaasu) sisältävää metanolia, kuumennetaan 100 °C:ssa 3 tunnin ajan ja uutetaan sitten kolmeen kertaan petrolieetterillä. Saatu petrolieetteri-faasi pestään kolmeen kertaan vedellä epäpuhtaan kloori-25 vetyhapon poistamiseksi. Kuivataan Glauber-suolalla, min- « kä jälkeen saatu tuote haihdutetaan alipaineessa kuiviin ja jäännöksellä suoritetaan seuraava kaasu-nestekromato-grafia-ajo:

Kaasu-nestekromatografia (GLC): 30 GC-15A (Shimadzu Corp.) : Pakkausmateriaali: PEG-HT 5 % Uniport HP 60/80 (Gasukuro Kogyo Inc.)

Käyttöolosuhteet: Kaasuuntumiskammio, 350 °C

Kolonnilämpötila: 190 - 200 °C 35 Kolonni: halkaisija 3 mm x 2 m

Virtausnopeus: N2 45 ml/min 103279

Esimerkki 1

Fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin valmistus hapettamalla rajoitetusti pelkistävää päätyryh- mää 5 (1) Glykosaminoglykaanin valmistus, jossa pelkis tävä päätyryhmä on rajoitetusti hapetettu 1) Hyaluronihapon valmistus, josta pelkistävä pää-tytähde on lohkaistu 2 000 mg:n erä hyaluronihappoa (HAI; mp. 10 000; 10 kukonheltta-alkuperä) liuotettiin 200 ml:aan 0,05 M bo-raattipuskuria (pH 8,3). Liuokseen lisättiin 182 mg nat-riumborohydridiä, minkä jälkeen saatua seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 5 tunnin ajan reaktion suorittamiseksi. Reaktioseoksen pH säädettiin etikkahappoa lisäämällä 15 4,5:ksi, minkä jälkeen se sekoitettiin etanoliin sakan muodostamiseksi. Näin saatu sakka pestiin etanolilla, jolloin saatiin 1 800 mg hyaluronihappoa, josta pelkistävä päätytähde oli lohkaistu (R-HA1; eränro 100).

2) Hyaluronihapon valmistus, jossa pelkistävä pää- 20 tyryhmä on rajoitetusti hapetettu 1 700 mg:n erä R-HAl:tä (eränro 100) liuotettiin 250 ml:aan 40 mM imidatsolia (pH 6,5). Liuokseen lisättiin 139,96 mg natriumperjodaattia 0 °C:ssa, minkä jälkeen saatua seosta inkuboitiin mainitussa lämpötilassa 1 tunnin 25 ajan reaktion suorittamiseksi. Reaktioseokseen lisättiin etanolia sakan muodostamiseksi. Näin saatu sakka pestiin etanolilla, jolloin saatiin 1 600 mg hyaluronihappoa, jossa pelkistävä päätyryhmä on rajoitetusti hapetettu (0-HA; eränro 200).

30 3) Muiden glykosaminoglykaanien valmistus, joissa pelkistävä päätyryhmä on rajoitetusti hapetettu (0-GAG)

Glykosaminoglykaaneja, joista on lohkaistu pelkistävä päätytähde (R-GAG), valmistettiin edeltävän menettelyn 1) mukaan käyttäen taulukossa E esitettyjä olosuhtei-35 ta ja kutakin seuraavista lähtömateriaaleista: hyaluroni- 103279 65 happo (HA5; mp. 50 000; HA15; mp. 150 000; kukonheltta-alkuperä), kondroitlinl (CH; mp. 15 000; tuote, jossa kondroltllnlsulfaattl-A;sta on poistettu rikkihappoa käyttäen hapanta metanoliliuosta), kondroitiinisulfaatti-5 C (CS (SI); mp. 10 000; CS (S3); mp. 30 000; CS (S6); mp. 60 000; hainrustoalkuperä), kondroitiinisulfaatti-A (CS (W); mp. 30 000; hainrustoalkuperä), dermataanisulfaatti (DS; mp. 15 000; siannahka-alkuperä), heparilni (Hep; mp. 15 000; sianohutsuolialkuperä), heparaanisulfaatti (HS; 10 mp. 15 000; naudanmunuaisalkuperä) ja kerataanisulfaatti (KS; mp. 15 000; siansarveiskalvoalkuperä). Näin saaduille R-GAG-näytteille suoritettiin edeltävä menettely 2) taulukossa F esitetyissä olosuhteissa glykosaminoglykaa-nien tuottamiseksi, joissa pelkistävä päätyryhmä on ra-15 joitetusti hapetettu (0-GAG).

Taulukko E

Reaktio-olosuhteet Saanto

Erä nro Tuote_ GAG/NaBH< (mq/mq) (mq) 20 100-2 R-HA5 5000/94,58 4720 100-3 R-HA15 1000/6,31 971 101 R-CH 1000/63,05 867 102 R-CS (SI) 1000/94.58 880 25 - 102-2 R-CS (S3) 1000/31,50 897 102-3 R-CS (S6) 1000/15,76 869 103 R-CS (W) 1000/31,50 823 30 104 R-DS 150/9,46 130 105 R-Hep 1000/63,05 772 • » 106 R-HS 40/2,55 35 107 R-KS 20/1,28 14,6 35 / 103279

Taulukko F

Erä Reaktio-olosuhteet Saanto nro Tuote _ R-GAG/NaIOa (mq/mq) (mg) 200-2 0-HA5 4500/77.0 4310 5 ' 200-3 0-HA15 900/5f14 815 201 O-CH 800/45,65 766 202 O-CS (SI) 800/68,48 715 10 202-2 O-CS (S3) 800/22,83 774 ' 202-3 O-CS (S6) 800/11,41 699 203 O-CS (W) . 800/22,83 697 f 204 O-DS 100/5,71 82 15 205 Ο-Hep 700/39,95 666 2 206 O-HS 30/1,71 22 s 207 O-KS 10/0,57 7 _ 20 (2) L- (α-fosfatidyyli )etanoliamiinidipalmitoyyli- ” liitteisen glykosamlnoglykaanln (GAG-PPEADP) valmistus 1) L-(α-fosfatidyyli)etanoliamilnidlpalmltoyyli- _ liitteisen hyaluronihapon valmistus _ i 67 1 0 3 2 7 9 r»

X

CJ m

» K

O *r n r-( K ~ ~ a" i u

°=V T

o o-v s „ « ? »" _= 5 u-u— u m 3 K I te <—» O UM.

= (L_o T u ° ? o =<-> —

0 II

1 o o =o

(N I I

K M M O es u s* te | w I O U-u — u r< m te i te a υ o V u\ i ia i X—S o — ^—o ^ ? te 'n u I a € ? « / a V'Nv a te υ ^1-o te ° a o

Bo a u—U— o—?*— 7 7 ,_f-_=, /-/-^ 7 s a o>V-^ „ cr —z a a o

o M

rs a ^ a u—U-— ,—7*— m

P ' f I

/ L S

‘--y sr~ a (=> -^i ° a c a o o o a 8_L g J_ ^^7 « ' / N_^_/ N--f-1 a a 103279 1 000 mg eränroa 200 O-HA liuotettiin 100 ml:aan 0,05 M fosfaattipuskuria (pH 7,0) ja liuokseen lisättiin 69,2 ml kloroformi/metanoli-liuotinsysteemiä (2:1), jossa oli L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmitoyyliä (PPEADP) 5 (1 mg/ml). Saatu seos sekoitettiin edelleen metanoliin tasaisen liuoksen saamiseksi seoksesta ja liuosta inkuboi-tiin 50 °C:ssa 1 tunnin ajan. Saatuun reaktioseokseen lisättiin 25 mg natriumsyaaniborohydridiä ja inkuboimista jatkettiin 50 °C:ssa 2 tunnin ajan, minkä jälkeen seosta 10 konsentroitiin alipaineessa. Konsentroituun seokseen lisättiin 5 tilavuutta etikkahapolla kyllästettyä etanolia sakan muodostamiseksi ja sakka otettiin talteen suodattamalla. Näin saatu sakka liuotettiin 0,3 M ammonium-kloridiliuokseen, ja liuos panostettiin hydrofobiseen 15 kromatografiakolonniin (TSK-geeli Phenyl Toyopearl 650M; 400 ml) ja kolonni pestiin perusteellisesti 0,3 M ammo-niumkloridiliuoksella, minkä jälkeen sitä eluoitiin meta-nolin 30-%:isella vesiliuoksella. Kiinnostava reaktiotuote oli 30 %:n metanolifraktiossa, kun taas reagoimatta 20 jäänyt HAI löytyi ei-absorboituneista ja pois pestyistä fraktioista. 30-%:isella metanoliliuoksella eluoitua fraktiota konsentroitiin alipaineessa, siitä poistettiin suolat dialysoimalla ja se kylmäkuivattiin sitten, jolloin saatiin valkeana jauheena eränro 300.

25 Saanto: 40 mg PPEADP-pitoisuus: 6,21 %

Hyaluronihappopitoisuuus: 62,12 %

Hydrofobinen kromatogrammi: Esitetään kuviossa 1.

Hydrofobinen kromatografia-ajo suoritettiin seu- 30 raavissa olosuhteissa:

Kolonni: TSK-geeli Phenyl 5 PW (halkaisija 7,5 mm x 7,5 cm)

Liuotin: 0-5 minuuttia, 0,3 M ammoniumkloridi-liuos; 5-50 minuuttia, 30-%:inen metanoliliuos 35 Virtausnopeus: 0,5 ml/min 69 103279

Paine: 7 kg/0,5 cm2 Fraktiotilavuus: 1 ml/putki

Detektio: OD220 nm (optinen tiheys 220 nm:n aallonpituudella ) 5 Näyte: 100 μΐ (1 mg/ml -liuos 0,3 M ammoniumklori- diliuoksessa) 2) Muiden fosfolipidiliitteisten glykosaminogly-kaanien valmistus

Fosfolipidiliitteisiä glykosaminoglykaaneja valio mistettiin edeltävän menettelyn (2)-1) mukaan taulukossa F esitetyistä 0-GAG-näytteistä ja PPEADP:stä taulukossa G esitetyissä olosuhteissa. Tulokset näin saatujen tuotteiden analyyseistä esitetään taulukossa G.

15 Taulukko G

Erä Reaktio-olosuhteet Saanto PPEADP GAG

. nro Tuote O-CAG/PPEADP/NaBH-iCN f mg) (%) (¾) 300-2 R-HA5-PPEADP 1000/13,84/5.03 42 1^33 63,43 300-3 R-HA15-PPEADP 700/3,23/1.17 35 0,46 63,35 301 CH-PPEADP 700/32,29/11.73 30 4,27 59,10 302 CS(SI)-PPEADP 700/48,44/17.60 36 5,89 63;04 302-2 CS(S3)-PPEADP 700/16,15/5.89 29 2,22 65,52 25 302-3 CS(S6)-PPEADP 500/5,77/2.09 20 1,07 67,13 303 CS(W)-PPEADP 500/11,53/4.19 22 2,23 67,48 304 DS-PPEADP 50/2,3.1/0.84 3,7 . 4,21 66, 305 Hep-PPEADP 500/23,07/8.38 3,8 4,30 74,65 30 306 HS-PPEADP 20/0,92/0.34 3,3 4,09 68,40 307 KS-PPEADP 7/0,33/0.12 0,5 3,97 66,24 70 103279

Esimerkki 2

Fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin valmistus muodostamalla laktoni pelkistävästä päätyryh- mästä 5 (1) Glykosaminoglykaanin valmistus, jossa pelkis tävä päätyryhmä on hapetettu 1) Hyaluronihapon valmistus, jossa pelkistävä pää-tyryhmä on hapetettu 500 mg hyaluronihappoa (HAI; mp. 10 000; kukon-10 heltta-alkuperä) liuotettiin 10 ml:aan vettä ja liuos sekoitettiin 5 ml:aan jodin 0,1 M liuosta metanolissa ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 6 tunnin ajan reaktion suorittamiseksi. Saatuun reaktioseokseen lisättiin noin 5 ml 0,1 N kaliumhydroksidiliuosta värin poistamiseksi va-15 paista jodimolekyyleistä. Saatuun liuokseen lisättiin ka-liumasetaatilla kyllästettyä etanolia sakan muodostamiseksi ja saostettu tuote otettiin suodattamalla talteen, pestiin perusteellisesti etanolilla ja kuivattiin sitten alipaineessa. Näin saatiin 423 mg hyaluronihappoa, jossa 20 pelkistävä päätyryhmä on hapetettu (eränro 400). Tuotteesta ei todettu pelkistävää sokeria Somogyi-Nelson-me-netelmällä tarkastettuna.

2) Hyaluronihapon valmistus, jossa pelkistävästä päätyryhmästä on muodostettu laktoni 25 400 mg hyaluronihappoa, jossa pelkistävä päätyryh mä on hapetettu, eränro 400, liuotettiin 10 ml:aan vettä ja liuos käytettiin 50 ml:n kolonnin läpi, jossa oli voimakkaasti hapanta ioninvaihtohartsia (Dowex 50(H+)), missä kului 1 tunti. Täten saatiin liuos, joka sisälsi 390 mg 30 hyaluronihappoa, jonka pelkistävästä päädystä on muodostettu laktoni. Pelkistävää sokeria ei todettu liuoksesta Somogyi-Nelson-menetelmällä tarkastettuna.

Näin saatu liuos neutraloitiin tri-n-butyyliamii-nilla ja kylmäkuivattiin sitten, jolloin saatiin tri-n- 71 103279 butyyllamllnlsuolana 400 mg hyaluronlhappoa, jonka pelkistävästä päädystä on muodostettu laktoni, (eränro 500).

3) Muiden glykosaminoglykaanien valmistus, joissa pelkistävästä päädystä on muodostettu laktoni 5 Glykosaminoglykaaneja, joissa pelkistetty pääty- ryhmä on hapetettu, valmistettiin edeltävän menettelyn 1) mukaan taulukossa H esitetyissä olosuhteissa käyttäen kutakin seuraavista lähtömateriaaleista: kondroitiini (CH; mp. 15 000), kondroitiinisulfaattl-C (CS (SI); mp. 10 000; 10 CS (S3); mp. 30 000; ja CS (S6); mp. 60 000), dermataani-sulfaatti (DS; mp. 15 000), hepariini (Hep; mp. 15 000) ja heparaanisulfaatti (HS; mp. 15 000). Näin saaduilla näytteillä suoritettiin edeltävä menettely 2) taulukossa I esitetyissä olosuhteissa glykosaminoglykaanien tuottami-15 seksi, joissa pelkistävästä päätyryhmästä on muodostettu laktoni.

Taulukko H

Reaktio-olosuhteet

Erä GAG/0,1 M l2/ saanto Somogyi- zu nro Tuote 0.1 N Κ0Η (mg/ml/ml) (%) Nelson, 401 CH-C00K 1000/13,4/13 ,4 828 402 CS(S1)-C00K 1000/19,8/19,8 901 402-2 CS(S3)-COOK 1000/3,3/3,3 895 25 402-3 CS(S6)-COOK 1000/4,95/4,95 913 404 DS-COOK 100/0,67/0,67 91 405 Hep-COOK 1000/6,7/6,7 902 30 406 HS-COOK .100/1,34/1,34 88 w

Somogyi-Nelson: Pelkistävän sokerin läsnäolo (+) tai puuttuminen (-) on määritetty Somogyi-Nelson-menetelmällä.

72 103279

Taulukko I

Reaktio-olosuhteet

Erä GAG-COOK/ Saanto Somogyi- nro Tuote Dovex 50 (mq/ml) l%) Nelson ! 5 joy CH-lactone 800/400 780 502 CS(Sl)-lactone 900/450 805 502-2 CS(S3)-lactone 800/400 850 502-3 CS(S6)-lactone 900/450 887 ! 10 504 DS-lactone 90/100 96 505 Hep-lactone 900/400 946 i 506 HS-lactone 80/40 72 15 *Somogyi-Nelson: Pelkistävän sokerin läsnäolo (+) tai puuttuminen (-) on määritetty Somogyi-Nelson-menetelmällä.

(2) L-(a-fos£atidyyli)etanollamiinidipalmitoyyli-liitteisen glykosaminoglykaanin (GAG-PPEADP) valmistus 1) L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmitoyyli-20 liitteisen hyaluronihapon valmistus

»I

73 103279 m

K

Ο π

r EC

rt (_) rr ft rt K — U m

— K

i o o=u r ? 0==v S* 9 " U «n ?ΐ Λ ec ec u-o—u rH u 33 | —' ry O (N rt | ffi EC — O = p<-O O ™ '— «33 0 to 1 0=0 γ

rt I I

EC O 0=0 0 i i 1 ™ O rt

rt K I JU

K O-O-o O EC |

I O

as i ec

Z 0 = Λ—O

O ^ ό g °N '* g ° s M ]

►rt N

o_S4· i

o I

/ O

"X\. as o -o

o “A ° EC

EC O

O O EC

O EC O-k— O —4- o—ο-β— ^7 /

p / C

--f--/ j ΰ~Λ / \ EC nr —x z QT -A-z EC u

EC O

O >« ™ as / ' «e • O utf O ; e / / 3 / 1—7\— ω 4-/ \ EC *

Ed ry —X o ^ n~° a: c

« O

o O 33 8- -U o-L u-0,^o^L_ "^^7 « X ό , ~ \_β_/ \--1 /

ύ K

74 103279 400 mg hyaluronihappoa, jossa pelkistävästä päädystä on muodostettu laktoni, eränro 500, liuotettiin 200 ml:aan dimetyyliformamidia ja liuokseen lisättiin 27,6 mg PPEADP:tä, joka oli liuotettu kloroformiin. Saatua seosta 5 inkuboitiin 70 °C:ssa 2 tunnin ajan. Kloroformi poistettiin reaktioseoksesta tislaamalla, minkä jälkeen jäännökseen lisättiin ylimäärätilavuus natriumasetaatin vesi-liuosta reaktiotuotteen muuttamiseksi natriumsuolaksi.

' Tähän lisättiin natriumasetaatilla kyllästettyä etanolia = 10 sakan muodostamiseksi ja näin muodostettu sakka otettiin I talteen suodattamalla. Sakka liuotettiin 0,3 M ammonium- s asetaattiliuokseen ja puhdistettiin esimerkin l-(2) me- ^ nettelyn mukaan, jolloin saatiin 36 mg haluttua tuotetta (eränro 600).

15 Fosforipitoisuus: 0,30 % 3 PPEADP-pitoisuus: 6,44 %

Hyaluronihappopitoisuus: 82,37 % , Hydrofobinen kromatogrammi: Esitetään kuviossa 2.

« Mittausolosuhteet ovat samat kuin kuvattiin edel- - 20 lä.

(2) Muiden L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmi-toyyliliitteisten glykosaminoglykaanien valmistus Nämä näytteet valmistettiin taulukossa I esitetyistä glykosaminoglykaaneista, joiden pelkistävästä päädystä . 25 oli muodostettu laktoni, ja PPEADPrstä edeltävän menette- __ lyn (2)-1) mukaan taulukossa J esitetyissä olosuhteissa.

Tulokset näin saatujen tuotteiden analyyseistä esitetään — taulukossa K.

IES

75 1Π3279

Taulukko J

Reaktio-olosuhteet

Erä nro Tuote__GAG-lactone/PPEADP (mq/mq) 601 CH-PPEADP 700/32,3 5 602 CS(SI)-PPEADP 800/55,4 602-2 CS(S3)-PPEADP 400/9,26 602-3 CS(S6)-PPEADP 800/9,00 604 DS-PPEADP 90/4.15 10 ' 605 Hep-PPEADP 800/36,91 606 HS—PPEADP 7 0/3,31

Taulukko K

15 Saanto PPEADP GAG

Erä nro _Tuote__ (mq ) ( % ) ( % ) 601 CH-PPEADP 70,2 4,30 90,90 602 CS (SI) -PPEADP 88,0 6,41 85,17 20 602-2 CS {S3) -PPEADP 20 2,01 89,70 602-3 CS (S6) -PPEADP 56,2 1,08 92,00 604 DS-PPEADP 4,5 4,00 90,66 605 Hep-PPEADP 24 4,11 90,01 25 606 HS-PPEADP 5,74 4,22 88,21 (3) Fosfatidyyliseriinistearoyylipalmitoyyliliit-telsen kondroitiinisulfaatti-C:n valmistus 103279

CC

(J r>

-* CC

-t CJ

— vo n i-t K ~ P.

I u °=V r 0 O = U n

1 I K

<H O Γ» U rn

EC I K o· CC

U-U-u ^ u x ° J i o = 0,-O 9, 53*

0 1 U

V o =u ~

(S II

K ? °=V

u K ' Λ 1 O T J7*

KO S Λ CC

u—o u-y — a

1 * I

CC o

2 I K

I n O = P-i-O

K Pk ä Λ f*> M w 9 § ° T-z i" ™ u cc cc 1 o

o I

/ ° / u.

*-7 V cc \ cc cc o -o CT -O κ CC o o o cc O CC U-U- O—71— u—U^- o— / ,—/-^ Z^_ jp

CC / v v < n // \ M

\ CC O CT -2 O or -Cs-2 w

en O

O <N

IN CC

CC O-k— !-7!- o ^p- i o ,° a

/ L__ S

' >·ν cc * cc CT -o -0 K e

CC Q

o o cc o cc u—L-— o—J— O-k— O—^ / X "S \ P / \_JE_/ π '-~f- I κ s 103279 400 mg kondroitiinisulfaatti-C:tä, jonka pelkistävästä päädystä oli muodostettu laktoni, eränro 500-2, liuotettiin 200 ml:aan dietyyliformamidia ja liuokseen lisättiin 9 mg fosfatidyyliseriinistearaattipalmitaattia 5 kloroformissa. Saatua seosta inkuboitiin 70 °C:ssa 2 tunnin ajan. Kloroformi poistettiin reaktioseoksesta tislaamalla, minkä jälkeen jäännökseen lisättiin ylimäärätila-vuus natriumasetaatin vesiliuosta reaktiotuotteen muuttamiseksi natriumsuolaksi. Tähän lisättiiin natriumasetaa-10 tiliä kyllästettyä etanolia sakan muodostamiseksi ja näin muodostettu sakka otettiin suodattamalla talteen. Sakka liuotettiin 0,3 M ammoniumkloridiliuokseen, ja puhdistettiin sitten esimerkin l-(2) menettelyn mukaan, jolloin saatiin 20,8 mg fosfatidyyliseriinistearoyylipalmitoyyli-15 liitteistä kondroitiinisulfaatti-C:tä (eränro 700-2).

Fosforipitoisuus: 0,10 %

Kondroitiinisulfaatti-C-pitoisuus: 86,15 % Hydrofobinen kromatogrammi: Esitetään kuviossa 3. Mittausolosuhteet ovat samat kuin kuvattiin edel- 20 lä.

Esimerkki 3

Fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykosaminogly-kaanin valmistus aminoimalla pelkistävä päätyryhmä (1) Glykosaminoglykaanin valmistus, jossa pelkis-: 25 tävä päätyryhmä on aminoitu 1) Kondroitiinisulfaatti-C:n valmistus, jossa pelkistävä pääty on aminoitu (CS(S3)) 100 mg kondroitiinisulfaatti-C:tä, jossa pelkistävä päätyryhmä on rajoitetusti hapetettu (eränro 202-2), 30 liuotettiin 50 ml:aan 0,05 M fosfaattipuskuria (pH 7,0), ja liuos sekoitettiin 24 mg:aan etyleenidiamiinihydroklo-ridia. Saatua seosta inkuboitiin 50 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen reaktioseokseen lisättiin 20 mg nat-riumsyaaniborohydridiä ja inkuboimista jatkettiin 50 °C:ssa 35 2 tunnin ajan reaktion saattamiseksi loppuun. Saatuun 78 103279 reaktioseokseen lisättiin natriumasetaatilla kyllästettyä etanolia reaktiotuotteen saostamiseksi, joka otettiin sitten talteen suodattamalla. Sakka liuotettiin veteen ja liuos absorboitiin 50 ml:aan DEAE-ioninvaihtohartsia, min-5 kä jälkeen eluoitiin käyttäen gradienttia 0,1 M -* 1 M nat-riumkloridi vesiliuoksessa. Saatu kondroitiinisulfaatti-C, jossa pelkistävä pääty oli aminoitu, eluoitui 0,4 M natriumkloridiliuoksella, kun taas vapaa kondroitiinisul-faatti-C eluoitui 0,75 M natriumkloridiliuoksella. 0,4 M 10 natriumkloridifraktiosta poistettiin suolat dialysoimalla, minkä jälkeen se kylmäkuivaamalla saatiin 80 mg kondroi-tiinisulfaatti-C:tä, jonka pelkistävä päätyryhmä on aminoitu (eränro 802-2).

2) Hepariinin valmistus, jossa pelkistävä pääty on 15 aminoitu (Hep)

Edeltävä menettely toistettiin lukuun ottamatta, että käytettiin 100 mg hepariinia, jonka pelkistävä päätyryhmä oli rajoitetusti hapetettu, eränro 205. Näin saatiin 77 mg hepariinia, jonka pelkistävä pääty oli aminoi-20 tu (eränro 805).

(2) Meripihkahappojohdannaisen valmistus lipidistä 1) Glyserolimonostearaatin meripihkahappoesterin valmistus 10,74 g glyserolimonostearaattia liuotettiin 200 25 ml:aan bentseeniä, joka sisälsi 3 ml pyridiiniä. Liuok seen lisättiin 6 g meripihkahappoanhydridiä, minkä jälkeen saatua seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 6 tunnin ajan. Saatua reaktioseosta konsentroitiin alipaineessa, minkä jälkeen tällöin muodostunut sakka asetonista 30 uudelleenkiteyttämällä saatiin 8,2 g glyserolimonostea- *. raatin meripihkahappoesteriä.

2) Aktiivisen esterin valmistus glyserolimonostea raatin meripihkahappoesteristä käyttäen N-hydroksimeri-pihkahappoimidiä 35 89 edeltävässä menettelyssä 1) saatua esteriä liuotettiin bentseeniin ja liuos sekoitettiin 2 g: aan 103279 N-hydroksimeripihkahappoimidiä ja 10 g:aan disykioheksyy-likarbodi-imidiä. Saatua seosta inkuboitiin huoneenlämpö-tilassa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseosta konsentroitiin alipaineessa reaktiotuotteen saamiseksi sak-5 kana. Sakka uudelleenkiteytettiin bentseeni/n-heksaani-liuotinsysteemistä, jolloin saatiin 7,4 g haluttua aktiivista esteriä (eränro GMS-1).

(3) Glyserolimonostearaattiliitteisen kondroitii-nisulfaatti-C:n valmistus * « ψ 80 1 0 3 2 7 9 π a υ to

>—t N

K

U

a: 1 O 0-0 ΓΊ O ΓΊ a i a u-u — a

a i O

0 u

(N

<N

a u i 0 u a z rs

M

a 0 a z i

(N

a w a f u o o a u—^— / /° / / ΕΓΛ a /—? vr < ^ X \ a O rr —^-z w ^ o ΓΝ 33 o i

O E

/ S

\ a cr -o a c o o a u—k—· o—71—

\ 72 I

a 81 103279 5 ml:aan vettä liuotettiin 80 mg kondroitiinisul-faatti-C:tä, jossa pelkistävä pääty oli aminoitu, eränro 802-2. Saatu liuos sekoitettiin 6,95 mg:aan aktiivista esteriä erästä nro GMS-1 liuotettuna dimetyyliformamidiin.

5 Saatua seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseos sekoitettiin natrlumase-taatilla kyllästettyyn etanoliin reaktiotuotteen saostami-seksi, joka otettiin sitten suodattamalla talteen. Näin talteen otettu sakka liuotettiin ammoniumkloridin 0,3 M 10 vesiliuokseen ja saatua liuosta puhdistettiin samalla tavalla kuin esimerkin 1-(2)-1) menettelyssä, jolloin saatiin 38 mg haluttua yhdistettä (eränro 902-2).

Steariinihappopitoisuus: 0,86 %

Kondroitiinisulfaatti-C-pitoisuus: 98,2 % 15 (4) Meripihkahappojohdannaisen valmistus fosfoli- pidistä 1) Meripihkahappoesterin valmistus lysolesitiinis-tä 200 ml:aan kloroformia liuotettiin 495 mg lysole-20 sitiiniä, jonka kaava oli seuraava: CH2OCO-(CH2)14-CH3

HOCH

CH20P0(0')OCH2CH2N+ (CH3)3 25

Saatuun liuokseen lisättiin 100 mg meripihkahappoanhydri-diä ja 79 mg pyridiiniä. Seosta inkuboitiin huoneenlämpö-tilassa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen reaktioseosta konsentroitiin alipaineessa sakan muodostamiseksi. Näin muo-30 dostettu sakka uudelleenkiteytettiin asetonista, jolloin • saatiin lysolesitiinin meripihkahappoesteri.

2) Aktiivisen esterin valmistus lysolesitiinin me-ripihkahappoesteristä käyttäen N-hydroksimeripihkahappo-imidiä 35 288,5 mg edellä saatua esteriä liuotettiin dime tyyliformamidiin ja liuos sekoitettiin 57,5 mg:aan N-hyd- 82 103:279 roksimeripihkahappoimidiä ja 103 mg:aan disykloheksyyli-karbodi-imidiä. Näin valmistettua seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan, minkä jälkeen saostuneet materiaalit saadusta reaktioseoksesta poistamalla saatiin 5 halutun aktiivisen esterin liuos dimetyyliformamidissa.

(5) Lysolesitiiniliitteisen glykosaminoglykaanin valmistus 5) Lysolesitiiniliitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n valmistus i 83 103279 π

K

u

+ 2 I

n m

K K

u V

*r I

rl M

— K

n U

K I

U O

I I

O o = Λ— o

U I

o o cn n a w u—S—o o o 0

(N

n

K

U

0 a a 2

(N

ΓΝ a 0 ««*-» a

2 I

<N

a S

a o u o o a CJ—o—}— ^7 /° " \ a O r~f _iv,_2

«J U

O

(N

a o u-^sc/~ : . / «a O e L_- -¾ a

cr -5*|-O

a I c o o a a—1^— o—J— ^7 '-7*-' a 84 103279

Aktiivisen esterin dimetyyliformamidiliuos, joka saatiin edeltävässä menettelyssä (4)-2), sekoitettiin ve-! siliuokseen, jossa oli 1 g kondroitiinisulfaatti-C:tä, jonka pelkistävä pääty oli aminoitu, eränro 802-2, ja 5 seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan reaktion suorittamiseksi. Reaktiotuotetta puhdistettiin suorittamalla hydrofobinen kromatografia-ajo esimerkin 1 menettelyn mukaan.

Saanto: 0,52 g 10 Fosforipitoisuus: 0,105 %

Lysolesitiinipitoisuus: 1,96 % Kondroitiinisulfaattipitoisuus: 98,04 % Rikkipitoisuus: 5,78 % (6) Glyserolidistearaattiliitteisen kondroitiini- 15 sulfaatti-C:n valmistus

Glyserolidistearaatin meripihkahappoesteristä valmistettiin aktiivinen esteri edeltävän menettelyn (2)-2) " mukaan (eränro GDS-2). Tämän annettiin reagoida kondroi- ” tiinisulfaatti-C:n kanssa, jonka pelkistävä pääty oli f; 20 aminoitu (eränro 802-2), ja joka saatiin edeltävässä me nettelyssä (1)-1), edeltävän menettelyn (3) mukaan, minkä 1 jälkeen puhdistettiin. Täten saatiin 27 mg haluttua yh distettä (eränro 904).

Esimerkki 4 25 Fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin valmis tus kondensoivaa ainetta käyttäen i __ (1) L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmitoyyli- i ^ liitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n valmistus ? « 103279 a o

-i-Z-SN

/ \ a cr -^j-o a s-Lä ^"7 /° - jp a 0 en u K o

Un rs» »k a ~ υ-Λ-Γ—.L- tä ~ o— ~ a™ / 1 o © °=v r \._.·-./_/

o o«u ZZZ

a i a >v S

u-u — u cr -o a i o rs <n a o td i a a i n a o — a — o — o— u — z — u—U— o—7— o /°

/ J JA

n \ a O rT -N-z en u o rs o a ^ U-J^fy s g-T^ s ' § o j3 / m / a> / _ Ι/^'χ a e cr —o f , a ε o o a o—le— o—^l— ^7 '-f-' a 103279 400 mg kondroitiinisulfaatti-C:n tri-n-butyylisuo-laa (CS(S3)) liuotettiin 100 mlraan dimetyyliformamidia. Saatuun liuokseen lisättiin 6,92 mg PPEADPrtä liuotettuna kloroformiin ja 38,4 mg l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopro-5 pyyli)karbodi-imidihydrokloridia. Saatua seosta inkuboi-tiin huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan reaktion suorittamiseksi. Seosta konsentroitiin alipaineessa, minkä jälkeen jäännökseen lisättiin ylimäärätilavuus natriumasetaa-tin vesiliuosta reaktiotuotteen muuttamiseksi natriumsuo- : 10 läksi. Tähän lisättiin etanolia suolan saostamiseksi ja i näin muodostettu sakka otettiin suodattamalla talteen. Sakka liuotettiin 0,3 M ammoniumkloridiliuokseen, ja liuosta puhdistettiin sitten esimerkin 1-(2)-1) menettelyn mukaan. Täten saatiin 63 mg haluttua yhdistettä (erä- i 15 nro 1002-2).

i i Fosforipitoisuus: 0,099 % PPEADP-pitoisuus: 2,25 % 1 Kondroitiinisulfaatti-C-pitoisuus: 96,61 %

Hydrofobinen kromatogrammi: Esitetään kuviossa 4.

20 Mittausolosuhteet ovat samat kuin kuvattiin edel lä.

- (2) Muiden L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmi- toyyliliitteisten glykosaminoglykaanien valmistus (GAG- - PPEÄDP) 25 Fosfolipidiliitteisiä glykosaminoglykaaneja val- s mistettiin erilaisista glykosaminoglykaaneista ja

~ PPEADPrstä edeltävän menettelyn (1) mukaan taulukossa L

~ esitetyissä olosuhteissa. Tulokset näin saatujen tuottei- | den analyyseistä esitetään taulukossa M. 1 87 103279

Taulukko L

Reaktio-olosuhteet

Erä nro _ _Tuote_ GAG11/PPEADP/WSC (mq/mq/mq) 1000 HA1-PPEADP 420/20,76/103 5 1001 CH-PPEADP 420/13,84/68,8 1002-1 CS(SI)-PPEADP 400/20r76/103 1002-3 CS(S6)-PPEADP 400/3r46/17r2 1003 CS(2)-PPEADP 400/6.92/34,3 10 7 1004 DS-PPEADP 40/1,38/6,88 1005 Hep-PPEADP ( 400/13,8/68,8 1006 HS-PPEADP 13/0,46/2,3 15 11: tri-n-butyyliamiinisuola

Taulukko M

Saanto PPEADP GAG

Erä nro _Tuote_ (mq ) ( % ) 20 1000 HA1-PPEADP 28 6,21 90,05 1001 CH-PPEADP 25,8 4,01 88,64 1002-1 CS(SI)-PPEADP 51,9 5,28 92,40 1002-3 CS(S6)-PPEADP 42,2 1,04 97,81 25 1003 CS (W) -PPEADP 41,9 2,17 96,62 1004 DS-PPEADP 29 4,41 89,12 1005 Hep-PPEADP 101,3 4,04 90,03 1006 HS-PPEADP 1,2 4.00 88-,22 30 ,· Esimerkki 5

Fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin valmistus glykosaminoglykaanin aktivointimenetelmällä (1) L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmitoyyli-35 liitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n valmistus es ^03279 a o r~t~-λ a CT -X-o a §—L O^- i .

a ‘ s< n / \ a

O rf —N-Z

n W

a o U rn J* » a . a ->o ' a —k— /—y— ί i 8 «" “ / ^ 1 ia o °=v r \_/-1

* ? σ==ν ZZZ

: « O ^ / \ i-ri a i a X- g u-a — a σ ^ a i o (n f'* a o ai a a i n a = o — a — o — u — a — z — a—k— o—J— ; ά : /° e ^ /-f-ίΓλ a 1 y-c < o cr -^i z w - O o

= (M iO

K C

u—XC/ s

: §7^ I

' a O m / a) X. a c cr —o i a ε s : 8 a a—— ^7 V-f-/ a 89 103279 400 mg kondroitiinisulfaatti-C:n tri-n-butyyli-amiinisuolaa (CS(S3)) liuotettiin 300 ml:aan DMF:ää. Saatuun liuokseen lisättiin 9,9 mg N-hydroksisukkinimidiä ja 20,6 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä. Saatua seosta in-5 kuboitiin huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan. Saatuun reaktioseokseen lisättiin ylimäärätilavuus natriumasetaa-tin vesiliuosta reaktiotuotteen muuttamiseksi natriumsuo-laksi, minkä jälkeen lisättiin etanolia muodostuneen sakan ottamiseksi talteen suodattamalla. Näin talteen otet-10 tu sakka liuotettiin välittömästi 30 ml:aan vettä ja liuos sekoitettiin 6,92 g:aan PPEADP:tä, joka oli liuotettu kloroformiin. Tähän lisättiin edelleen dimetyyliformamidia tasaisen liuoksen saamiseksi. Näin saatua liuosta inkuboi-tiin huoneenlämpötilassa 6 tunnin ajan, minkä jälkeen 15 reaktioseosta konsentroitiin alipaineessa ja jäännös sekoitettiin sitten etikkahapolla kyllästettyyn etanoliin sakan muodostamiseksi. Sitten näin muodostettu sakka otettiin suodattamalla talteen ja liuotettiin 0,3 M ammonium-asetaattiliuokseen, mitä seurasi puhdistus esimerkin 20 1-(2)-1) menettelyn mukaan. Näin saatiin 29,7 mg haluttua yhdistettä (eränro 1102-2).

Fosforipitoisuus: 0,100 % PPEADP-pitoisuus: 2,16 %

Kondroitiinisulfaatti-C-pitoisuus: 95,68 % .· 25 Hydrofobinen kromatogrammi: Esitetään kuviossa 5.

Mittausolosuhteet ovat samat kuin kuvattiin edellä.

(2) L-(a-fosfatidyyli)etanoliamiinidipalmitoyyli-liitteisen kondroitiinipolysulfaatin valmistus 30 1 g kondroitiinipolysulfaatin tri-n-butyyliamiini- suolaa (rikkipitoisuus, 13,0 %; mp. 10 000) (CSP(II)) liuotettiin 50 ml:aan dimetyyliformamidia. Saatuun liuokseen lisättiin 1 770 mg N-hydroksisukkinimidiä ja 318 mg disykloheksyylikarbodi-imidiä. Saatua seosta inkuboitiin 35 yön yli 4 °C:ssa. Sen jälkeen reaktioseokseen lisättiin 90 103279 10 ml vettä ja seoksen annettiin edelleen reagoida huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan. Muodostunut sakka poistettiin, minkä jälkeen saatu liuos sekoitettiin 69,2 g:aan fosfatidyylietanoliamiinidipalmitoyyliä (PPEADP), joka oli 5 liuotettu kloroformiin, ja seoksen annettiin reagoida huoneenlämpötilassa 6 tunnin ajan. Saatua reaktioseosta konsentroitiin alipaineessa, minkä jälkeen se sekoitettiin natriumasetaatilla kyllästettyyn etanoliin sakan muodostamiseksi. Sen jälkeen näin muodostettu sakka otettiin tallo teen suodattamalla ja liuotettiin 0,3 M ammoniumasetaatti- liuokseen, mitä seurasi puhdistaminen esimerkin 1-(2)-1) menettelyn mukaan. Näin saatiin 67 mg haluttua yhdistettä (eränro 1108).

Fosforipitoisuus: 0,291 % 15 PPEADP-pitoisuus: 6,5 %

Kondroitiinipolysulfaattipitoisuus: 92,8 % Rikkipitoisuus: 12,05 %

Hydrofobinen kromatogrammi: Esitetään kuviossa 6. Mittausolosuhteet ovat samat kuin kuvattiin edel- 20 lä.

Esimerkki 6 BHK-solujen tarttuminen fosfolipidi- tai lipidi-liitteinen glykosaminoglykaani -kerrokseen, joka on laminoitu petrimaljan fibronektiinillä päällystet-25 tyyn sisäseinään s '· · 96-kuoppaisen inkubointilevyn kukin kuoppa päällystettiin 100 pl:lla liuosta, jossa oli 5 pg/ml nauta-seerumista saatua fibronektiiniä. Pesun jälkeen kukin kuoppa päällystettiin edelleen 100 pl:lla kutakin esimer-30 keissä 1-5 saatua fosfolipidi- tai lipidiliitteistä glykosaminoglykaania, joiden pitoisuudet esitetään taulukossa N.

Erikseen BHK-soluja (vastasyntyneen hamsterin mu-nuaissoluja) viljeltiin maljassa, jonka halkaisija oli 35 100 mm, minkä jälkeen niitä käsiteltiin 5 ml:11a 0,1 mg/ml iti 91 103279 -trypsiiniliuosta 37 °C:ssa 5 minuutin ajan. Näin käsiteltyihin soluihin lisättiin 5 ml liuosta, jossa oli 1 mg/ml soijapaputrypsiini-inhibiittoria, trypsiinin inaktivoimi-seksi. Sen jälkeen näin erotetut solut otettiin sentrifu-5 goimalla talteen ja pestiin kahdesti, minkä jälkeen niistä valmistettiin yksisoluliete, jossa tiheys oli 1 x 105 so-lua/ml.

100 pl:n erä näin saatua yksisolulietettä (1 x 104 solua) kaadettiin kuhunkin kuoppaan inkubointilevyllä, 10 joka oli kaksinkertaisesti päällystetty fibronektiinillä ja fosfolipidi- tai lipidiliitteisellä glyskosaminogly-kaanilla, kuten edellä kuvattiin. 1 tunnin inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen solut, jotka eivät olleet tarttuneet, pestiin pois, ja jäljelle jääneet tarttuneet solut kiinni-15 tettiin 2-%:isella formaldehydiliuoksella, minkä jälkeen niitä tarkasteltiin suoraan faasikontrastimikroskoopissa tarttuneiden solujen lukumäärän laskemiseksi.

Taulukossa N esitetään pitoisuudesta riippuvaiset muutokset tarttuneiden solujen lukumäärässä. Kukin tulok-20 sista on ilmoitettu 3 tai 4 mittauksen keskiarvona. Virhe (standardipoikkeama) kussakin kokeessa on niinikään esitetty.

Kun vapaita glykosaminoglykaaneja tai ei-kytkettyjä lipidejä käytettiin fosfolipidi- tai lipidiliitteisten 25 glykosaminoglykaanien asemesta, ne eivät osoittaneet mitään solujen tarttumista inhiboivaa vaikutusta korkeinakaan pitoisuuksina.

103279 de <¥> «*> de de O, vo vo o cu σ» vo

Q · I I

< rr n rv) rH o o

W -H-H-H-H-H-H-H-H

CL, de de t*> c¥> c*> <*> cl, co (n ct> r~ •»r σ» τΤ I ·- ·- I I * · » O Ui ino tt 10 cn o

VO Q CO CO -H

a, Q dededededededede < cnmHvoor^mo ω u - ^ * ^ • v O cu oohcohooo

CL, -H-H+l-H-H-H-H-H

ro I dededededededede l t— cr»rooor~ioroo

fNJ VO

o en eocr»inoiNHHo

LO —i CT» CO CO tt H

CU

Q

< fcj dededededededede

\ Cu CT» CO LO CO LO ΓΟ tT H

I *k.

! |OrOTTLDCT»HOO

j — -H-H-H-H-H-H-H-H

(N ro dededededededede IW [-'TTCOr-TTrOCOr'' C>4 w ·. ·>. » *^ ·_ *- *, o en oocNCTi'a’irtTTCNo LO U CT» CO TT TT ΓΟ

CU

Q

- de 3 co de π de de de de de

OCU CO ·- CN CT» LO tt rH

3 „. £ Pj - m ·- -- *-

z c | CO H UO LO O CN H

η,Λ— -H-H-H-H-H-H+l de de de de de de de m ui m Tr rH γμ lti n· co cj ^ s«> K K K, o en r~ σ» o ro tt cn co 15 vo ej co co tn co cn ,η ^ de de de de de o de de 04 LO o ct» - (N co Q ·-- T- CO ,

< CN VO VO CN H TT CO

=- ω -H +1 -H H -H -H -H

0 de de de de de de de cu o vo m co in tt co

Hl * r- *' · · r o CC m h o ro in tt n . LO ej co CO CO LO LO tt ro

CU de dP de de de dB

Q ro co vo in h (N

— e£ * ·- ·- »

W H CO 04 O O O

CU -H -H -H -H -H -H

Cu de de de de de de I in in σ» vo co ro O ,-t * T * 4- * o < ro cn σ» ro o o vo K cn

CU

Q

< H de de de de cu co m m cn

cu - - τι LO TT O H

— H -H "H +1 ro vo de de de de I en tt σ» o ro (N — -- o en H o ro h ro ej σ» LO n»

»—I

ε H CN m _ s ^ = rcx»oooHCNinoooooo

m 3. H CN in O O O

Z H CN in 93 103279 de

Pl, de r-λ de de

Q σι *- rH O

< ΓΗ - t

CO O F—{ F—I H

P. +1 -H +1 +1 PL, de de de de

m i n o σι rH

o O · — o ai in in in in rH K σι r- in tt de de de dP de de pu oo ττ σι r- i-ι σι Q τ · »- *- te r~ o τ m h ·<τ

Cd +1 -H +1 -H -H -H

PL, de de de de de de tt pl, m en LO o oj p' O I k »v o en en σι m Ln lp m •H Q σι oo Γ' LO in tt

Ph de Q lo de de de en «c *- oo Tr r~ U Cd vo — - 1.

Ph fH tt TT ro — ΓΝ Ph +1 -H +) Ή <ö I I de de de de 9 cn >— ro LD LO ih HJ O ro ^ ► ra o en co <n r~-

n O rH — 00 in rH

^ H

c 2 »o O Vi

AS W

-¾ Ph dB de de de ,2 Q co TT vo ro p * ·- · (0 Cd o· in o o

H Ph -H -H +i -fH

Ph dP dP dP de οι LO in in o O rH * f · o < in o ro in Ή EC σι co Γ' in

dP de dP de de dB

Ph VO in ro TT rH o Q r .· < o o o o o o ω -h -h -h -h -h hh

Ph de de de de de de

Ph σι Γ'- o ro o σι vo i ^ o en TT in γη rH rH o

^ SC rH

Ph dP dB dB dB dB dP dB

Q ro TT σι o in tt γη r r, k F *„

Cd rH in vo m ro (N

’! Ph -H-H-H+IHH+I+I

Ph de dP dB dB dP dB dB

I r- rH in o o ro LO

in O ·- r, w~ ·..

o ω LO LD O TT VO r- rH

LO EC OO LO TT TT rH rH

ij ^ rH γη in >. \ ·' T- ffccjiooo,—ΙΓΜίηοαοοοο 2- P I-H tN in o o o — rH cn in 103279

Esimerkki 7

Fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykosaminogly-kaanin vaikutus inhiboitaessa erilaisten viljeltyjen solulinjojen solujen tarttumista solujen tart-5 tumista edistävien aineiden läsnä ollessa

Esimerkeissä 1-5 saatujen fosfolipidi- tai lipi-diliitteisten glykosaminoglykaanien vaikutuksia tutkittiin inhiboitaessa erilaisten solulinjojen solujen tarttumista solujen tarttumista edistävien aineiden läsnä ol-10 lessa käyttäen BHK-21:tä (vastasyntyneen hamsterin mu-nuaissolu), CEFriä (linnun sikiön sidekudosmuodostusso-lu), B16FlO:tä (hiiren hyvin voimakkaasti etäispesäkkeitä muodostava melanoomasolu), CH0:ta (kiinalaisen hamsterin munasarjasolu) ja baEC:tä (naudan aortan endoteelisolu) 15 solulinjoina ja fibronektiiniä (FN), laminiinia (LN), kollageenia tyyppi I (Coll) ja vitronektiiniä (VN) solujen tarttumista edistävinä aineina.

5 pg:n/ml erä kutakin naudan veriplasmasta saatua fibronektiiniä, hiiren EHS-kasvainsolusta saatua laminii-20 nia, rotan reidestä saatua kollageenia tyyppi I ja nauta-seerumista saatua vitronektiiniä päällystettiin 96-kuop-paiselle inkubointilevylle ja kutakin esimerkeissä 1-5 saatua fosfolipidi- tai lipidiliitteistä glykosaminogly-kaania päällystettiin edelleen samalla tavalla kuin esi-; 25 merkissä 6. Sen jälkeen 100 μ1:η erä yksisolulietettä (1 x 104 solua) kustakin BHK-21-, CEF-, B16F10-, CHO- ja baEC-soluista kaadettiin kuhunkin kuoppaan muutoksien solujen tarttumisessa tarkastelemiseksi. Verrokkina toistettiin sama menettely - lukuun ottamatta, ettei fosfolipidi- tai 30 lipidiliitteistä glykosaminoglykaania käytetty - ja saatu ; solujen tarttuminen ilmaistiin 100 %:na. Tulokset esite tään taulukossa O.

Taulukossa O suhteelliset tarttuneiden solujen lukumäärät ilmaistaan puolikvantitatiivisesti joka 35 merkitsee ei lainkaan tai vähäistä tarttumista (0 - alle 95 103279 10 %), " + ", joka merkitsee 10 - alle 30 %:n tarttumista, "++", joka merkitsee 30 - alle 50 %:n tarttumista, "+++", joka merkitsee 50 - alle 70 %:n tarttumista, "++++", joka merkitsee 70 - alle 90 %:n tarttumista, ja "+++++", joka 5 merkitsee 90 - 100 %:n tarttumista.

m « 9S 103279 z I I + I it o

K

u z

Cl, : +

— I I + I I I

rH

ε \ ί σ 3

1 Z

in j

-° II II

Ou a) \o .5 ·-* >z - mj k* > '3 11 11 ω Ή Ό d) +j 2 w > ä iiii’ o 5 fci n -P w « t:u + rH + + 5 c + + +

b + + + I I I II

1 ' iH

o _ w

3 Z

, > + S N +1,,++,, ad

DC

mz ί ί k« +++ ++ + + +++ + + + + ; - + + + + + I I + + I I + + +

>—I

H

£\ oo oo oo oo o o o o o o o o

irdCH ΉΟ HO H O rl O HO H O Η O HO

- «0 3 r-H r-| r-H r-H rH r-| rH rH

Σ ou a,

— Q Q

‘ G, < < ·— . Q Ci3 W CL, — < 0, 0< a Oh

: ... · CL'-CdCuC^C—.Q

Q a, ο, ί , w a, <

OcCQQ,^.^,ftQW g M < I m vo Ph < pl,

Dh W ^ to to , W fl< inj P* CU r-i **—' w > 04 f I cucnwwsokcu

i w h I — .U U >- I QJ

cCÄtO'--'— cototr; KUOcNnUQ'—

Oi—ICNfN(Nrn^3*Ln OOOOOOOO E . nnronnronm 103279 z j

I I

o a: u z t,

— I I

H

E

σ z in j

“S

Cl.

0> VO

•H *"* s mz

Hfl ^ + > + +

jo ++ it II II it ++ + I

U)

♦H

0) CÖ r-r ~ P £ ftJ W >

o -H II

^ § Cl,

p p S

m +1 W

*r™> 4-1 U

— u nj >7 o * a! o c 3 £ I I I .

3 0

»—I H

3 O

ns m + — h _, > ^ 1 ' 1 ' sc m z + ·' 114 ΐ ί + ++ + + + +++ + + ++ II II II II II ++ +1 ++ + + «C £ ,¾ \ oo oo oo o o o o oo oo oo oo oo oo

,HjCT> HO ,ΗΟ HO I—ΙΟ H O tHO <—IO rH O rH O rH O ,-HO

S ^ H >-l H rH rH r-H rH rH rH rH rH

. D?

— Q Q

Λ < < — Q W — t] yj Τ' < a, m tx, a. s: -—-

Oj'-'CdCX, . Or — Q — CJ CO

0θ,θτΐο.ια,<θτΐΩ

P<Q04 — I — Q W Q — CJ

I m Π IO < CL, < cn | t· o< ω — co co co u ο, ω co · — uoprOrrH^ — ^— Or I Or — Π

H I Or CO CO CO CO Or Qr O, CO CO

“ H > —' CJ U CJ I Q) I CJ — <p:co — — — comco — co

CC CJ Ο ΓΝ fN n Q -— CCrHCJ

OHCNCMCNCNTTiniOCN'T

ooooooooooo

Loiomior~iovo\oioo\(T\ 98 1 0 3 2 7 9 — f—t e • σ 3 in “ 4. + + + + + + + + + ω r-1 4- ++ 4- + j. j. + + + + + + + + + c O ί i t t + i 11 '1 + « + lti + + + + + + + + + -H £ + t+ + ++ + + + + + + + + + + n) ^ T + + + + + + + + +

«O

>

KO

•P

ω £ u Ό m 01 n rd +j

W

•H ( § 4, + + + + 4- + + + + JJ -2· 4.4. 4.4.+ + + + + + + + + +J +l??ll II II II τ+χι +++++++++ U ** t+ + + + + + + + + + + + jg + + + + + + + + + + ; c ji ω — -n 3 *—1 ~ o

(0 W

O \

" M -P

-P 3

fÖ »H

II -n O ^

'—LO rH

O '2 E o _o _ o _o _ o _ o _ o _ o o o o o o o o o o

.¾ \ 2 O °o °o ° o °o 2 O 2 0 2°® 0 0 0 0 0 0 0 O

Γ S s2 3 r—1 3 11 to _ ^ O, Cl,

— Ω O

Λ < < Q M W — — <C D-t Pk Ou

Cu — WCUPu—· Q —

Q CU CU I I Pu < CU

oCQCU - — QWQ

pw< 1 n 10 < cu < CCUM — couiDqcuw

uC O* D« rH >— — Di 1 CU

Ui I CU C/ί UJ l/} CU CU CU

ω -h 1 — u u 1 qj i <ffiC0^'-'C/)tCC0 — — — Pk EJUUC'JmQ'—»K »h m id Ω — ^ — 1 1 — — m tn w <

Οι—ΙΓΜ<ΝΓΜτί"ΐΓ>10.—I ^ ^ CU W

j,i o o o o o o o o «ίΚΜΜωω ΐ)ΜΡ<

: :: 10 10 id id id 10 id id ffiUUUUQKCGCU

99 103279 2

►J

I I

o 2

U

2

Cm — I 1

H

E

σ =1 2 in j

Pl,

Q) VD

-S -1 * k» > 4J 11

W

•H

Ό Q)

(TJ

+j 2 (0 (/) > O H || 3

m JJ W

n -MO — μ ο -μ ψ- +

Cm + + + Ο C ++4- + 3 ,®. + + + I I I II + + 3 3 γΗ γΗ 3 Ο <ΰ οι Ε-ι \ 3 ξ Γ} . > +

Ο ^ + I I I + + I I

2 03 „ + + + Ζ + + + + + tm + + + + + + + + + ++++ + + ++++ + . + +++++ II ++ II ++++ + 1—ι iftJ g ίο \ οο ο ο σο οο ο ο ο ο οο ο ο οο σο «0 en Γ-40 1-4 Ο 1-40 ι-4 Ο .-40 .-40 .-4 0 40 .-40 ΗΟ

S 3- r-4 ι I ι-4 .-4 ι—I γ-4 ι—I ι—I I—I ι—I

Οι D-. ^ —* Q Ο Ομ

Cm < < — Q

Q U3 U3 Ο. — <

, " < o, O, Q Οι CJ

• ο.·—-03θιθι<·—·ο^~-α< • αοιθ.ιιωρ,<ο<θι <00.-^ — P.QWQ ι „ W < I +> Ο 0< <£ Cm < —- ° cm ω — in ιο ι id cm ω w c tii cm .-4 — ·—- - cm ι Οι ι—ι - ι tmcococoscrncmcm — ·« -—« ι — u ο ι mien hj < CC CO . — —- CO CO o CO a,

"cnaUfNrouQ'-'CEU

o^4n)tNirNr-|-+miDC0 oooooooooo ooooooooo.—ι m ι-4^4^4ι-4γ-4^4ι—I ι—1.-4.-4 100 103279 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + z + + + + + + + + + + + + + + w + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

O

EC

U

+ + + + + + + + + + + + + + z + + + + + + + + + + + + + + W + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + — + + + + + + + + + + + + + +

E

σ + + + + + + + + + + + + + + ^ + + + + + + + + + + + + + + z + + + + + + + + + + + + + + _ J + + + + + + + + + + + + + + ° + + + + + + + + + + + + + + f“l

Cl.

C « [rt m + + + + + + + + + + + + + + Z + + + + + + + + + + + + + + id W + + + + + + + + + + + + + + > + + + + + + + + + + + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +

CO

•H

^ + + + + + + + + + + + + + + rO + + + + + + + + + + + + + + + Z + + + + + + + + + + + + + + “> + + + + + + + + + + +.+ + + U'g + + + + + + + + + + + + + + o B w m 4-1 ω + + u •ί^ϊα + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + oc + + + + + + + + + + + + + + 0 + + + + + + + + + + + + + +

3 -H

ο o + + + + + + + + + + + + + + (ΰ 4-1 + + + + + + + + + + + + + + 3 Ζ + + + + + + + + + + + + + + 7J_,> + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ►τ' 2 + + + + + + + + + + + + + + ζ + + + + + + + + + + + + + + £*4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ' + + + + + + + + + + + + + + *—ί itc ε μ\οοοοοοοοοοοοοο

rfdQvOOOOOOOOOOOOOO ^ ^3- 1—I ι—I ι—I ι—I ι—Η ι—I ι—I ι—! ι—I r—I '—I ι—| rH f—I

o

M

c t-Ö M _ f

— ~ M CU

>—( n vo ·—» m Q

m to co co 3: — <

i-f ir> rH --- — — ·— G, coW

• <<«i:kcococococo «ucoeocucu

KECECUUCJUUQffiKSrfUPU

101 103279

Esimerkki 8

Fosfolipidiliitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n vaikutus inhiboitaessa erittäin voimakkaasti etäispesäkkeitä muodostavien syöpäsolujen tarttumista 5 viljeltyjen verisuoniendoteelisolujen solunulkoi- seen matriisiin

Hiiren verisuoniendoteelisoluja viljeltiin 24-kuoppaisella inkubointilevyllä, joka oli päällystetty tyypin I kollageenilla siten, että solut kasvo!vat yhteen. 10 Yksisolukerrosta käsiteltiin 0,5-%:isella Triton X-100 -valmisteliuoksella huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen näin hajotetut solukerrospalaset pestiin Dulbeccon PBS( + )-puskurilla endoteelisolujen solunulkoisen matriisin saamiseksi.

15 Erikseen hiirestä peräisin olevia hyvin voimak kaasti etäispesäkkeitä muodostavia syöpäsoluja (B16F10), joita oli viljelty maljassa, jonka halkaisija oli 100 mm, käsiteltiin 5 ml:11a trypsiiniliuosta (0,1 mg/ml PBS(-)) 37 °C:ssa 5 minuutin ajan. Näin käsiteltyihin soluihin 20 lisättiin 5 ml 1 mg/ml -soijapaputrypsiini-inhibiittori-liuosta trypsiinin inaktivoimiseksi. Sen jälkeen näin erotetut solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja pestiin kahdesti fosfaattipuskurilla (PBS(-)), minkä jälkeen niistä valmistettiin yksisoluliete (Hankin BSS, 20 mM He-; 25 pes, pH 7,4), jossa tiheys oli 2 x 105 solua/ml.

Erän nro 602-2 fosfolipidiliitteistä kondroitiini-sulfaatti-C:tä (CS(S3)-PPEADP) ja 500 μΐ näin valmistettua Bl6F10-yksisolulietettä (1 x 105 solua) siirrettiin kuhunkin kuoppaan edellä mainitulla 24-kuopan inkubointi-30 levyllä, joka sisälsi solunulkoista matriisia, ja inku-boitiin staattisesti 37 °C:ssa 1 tunnin ajan inkubaatto-rilla, johon johdettiin 5 % hiilidioksidia.

Supernatanttineste kustakin kuopasta poistettiin varovaisesti, jäännös pestiin kerran varovaisesti Hankin 35 puskurilla ja kummatkin neste-erät yhdistettiin. Sen jäi- 102 103279 keen solujen lukumäärä yhdistetyssä näytteessä laskettiin solulaskijaa käyttäen (Coleter Electronics) niiden solujen laskemiseksi, jotka eivät tarttuneet solunulkoiseen matriisiin. Verrokkeina käytettiin puskuriliuosta, joka ei 5 sisältänyt erän nro 602-2 yhdistettä (ei lisäystä), sekä puskuria, joka sisälsi vapaata kondroitiinisulfaatti-C: tä.

Solujen tarttumissuhde laskettiin vähentämällä laskettujen ei-tarttuneiden solujen lukumäärä alunperin lisätystä kokona!ssolumäärästä ja jakamalla jäännös koko-" 10 naissolumäärällä. Tulokset esitetään taulukossa P.

Taulukko P

Näyte Lisätty määrä Tarttumissuhde

Ei lisäystä - 82,8 % 15 Vapaa kondroitiini- = sulfaatti-C 50 ug 82,6 %

M

602-2 (CS(S3)-PPEADP) 50 yg 50,7 %

f:l I I

Kuten edeltävistä tuloksista ilmenee, esillä ole-20 van keksinnön mukainen fosfolipdiliitteinen glykosamino- glykaani voi inhiboida erittäin voimakkaasti etäispesäk-™ keitä muodostavien syöpäsolujen tarttumisen verisuonten endoteelisolujen solunulkoisiin matriiseihin, kun puoles-5 taan vapaa kondroitiinisulfaatti-C ei kykene vaikuttamaan : r 25 tällä tavalla.

Esimerkki 9

Fosfolipidiliitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n vaikutus erittäin voimakkaasti etäispesäkkeitä muodostavien syöpäsolujen etäispesäkemuodostusta inhi-™ 30 hoitaessa “ Hiirestä peräisin olevia erittäin voimakkaasti ; — · etäispesäkkeitä muodostavia syöpäsoluja (B16F10), joita oli viljelty maljassa, jonka halkaisija oli 100 mm, käsi-teltiin 5 ml:11a EDTA-liuosta (0,02 %/PBS(-)) 37 °C:ssa 5 35 minuutin ajan, minkä jälkeen solut erotettiin pipetoimal- 103279 la. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja ne pestiin kahdesti fosfaattipuskurilla (PBS(-)), minkä jälkeen niistä valmistettiin yksisoluliete, jossa tiheys oli 1 x 106 solua/ml. 0,1 ml:n erä tätä solulietettä (105 solua) 5 sekoitettiin 0,1 ml:aan PBS-liuosta, jossa oli fosfolipi-diliitteistä glykosaminoglykaania erästä nro 602-2 (CS(S3)-PPEADP) (0,1 mg, 1 mg tai 5 mg/0,1 ml), ja saatua seosta annettiin C57BL/6-hiirille häntälaskimoon. Rintakehän leikkaus suoritettiin 2 viikkoa tämän annon jälkeen 10 melanoomapesäkkeiden lukumäärän laskemiseksi, jotka olivat muodostuneet etäispesäkkeinä keuhkojen pinnalle. Puskuriliuosta, joka ei sisältänyt yhdistettä erästä nro 602-2 (CS(S3)-PPEADP) (ei lisäystä), ja puskuria, joka sisälsi vapaata kondroitiinisulfaatti-C:tä, käytettiin verrok-15 keina.

Taulukossa Q esitetään tulokset niiden pesäkkeiden laskemisesta, jotka olivat muodostuneet etäispesäkkeinä keuhkojen pinnalle hiirtä kohden.

20 Taulukko Q

Näyte Annos Pesäkkeitä (mg/hiiri) (kpl/hiiri)

Ei lisäystä - 49,9 +/- 32,3 25 Vapaa kondroitiinisulfaatti-C 5 mg 24,0 +/- 8,0 602-2 (CS(S3)-PPEADP) 0,1 mg 47,2 +/- 28,1 1 ml 22,0 +/- 14,8 5 mg 4,0 +/- 3,5 30

Syöpäsolujen etäispesäkemuodostus inhiboitu! fos-folipidiliitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n annoksen kasvaessa. Kuten näistä tuloksista ilmenee, esillä olevan keksinnön mukainen fosfolipidiliitteinen glykosaminogly-35 kaani voi inhiboida hyvin voimakkaasti etäispesäkkeitä 103279 muodostavien syöpäsolujen etäispesäkemuodostuksen. Vapaa kondroitiinisulfaatti-C inhiboi niinikään etäispesäkemuo-dostusta, mutta sen vaikutus oli heikompi kuin fosfolipi-diliitteisen kondroitiinisulfaatti-C:n (p < 0,001).

5 Teollinen soveltuvuus

Esillä olevan keksinnön mukaiset fosfolipidi- tai lipidiliitteiset glykosaminoglykaanit tai niiden suolat, joilla on solujen tarttumista inhiboivaa aktiivisuutta ja jotka eivät ole myrkyllisiä, ovat käyttökelpoisia etäis-10 pesäkemuodostuksen inhibiittoreina. 1 : - 7

I I

: - *

Claims (38)

105 103279

1. Menetelmä kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten fosfolipidiliitteisten glykosaminoglykaa-5 nien tai niiden suolojen valmistamiseksi s- r2 s-yf-oh 10 4y^/\ ^ (I) R3' -CHj-P1 v GAG jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fos-15 folipidistä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: CH,-0-R4 I a , CH-O-R5 J (IX) <Ιή2ο-p-o-Y

2. OH jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH (COOH)NH-, ja * 25 (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa

3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos-aminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroitiinista, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataanisulfaatista tai hepariinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygluku-30 ronihapporyhmää, tai kun GAG on glykos- aminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty i duronihapporyhmää ; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykos-35 aminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-K:sta tai kond- .106 103279 roitiinipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pää-tyglukuronihapporyhmää; (3) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on g lyko s- 5 aminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; ja (4) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on gly-kosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaatista, lukuun ot- 10 tamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: glykosaminogly-kaani, jonka kaava on (1-1): ! Äv R3/0L_/

20 GAG pelkistetään ja avataan rengas pelkistävässä päätyryhmäs-sä, jolloin saadaan pelkistetty tuote, jonka kaava on (1-2) : : . * C2 /"x -0H y\ (i-2)

1 CH,0H R3/^L V : 30 GAG OH · joka pelkistetty tuote hapetetaan hapetetun tuotteen saa-, 1 miseksi, jonka kaava on (1-3) : 103279 9v !α/ ^ (Ι_3)

5 R3 -CHO GAG minkä jälkeen näin muodostetun, hapetetun tuotteen aldehy-diryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen ami-10 noryhmän kanssa, jolloin GAG, R2 ja R3 määritellään kuten edellä.

2. Menetelmä kaavan (II) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen foslipidiliitteisen glykosaminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, 15 R3 CH,-?1 V ( CH,0H (II) λ /

20 GAGX N-[ R1 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi-distä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: 25 t ch2-o-r4 CH-O-R5 O (IX) CH,0·-l-O-Y l OH 30 jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(C00H)NH-, (1) R1 on NHCOCHj - ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG 35 on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroi- 103279 tiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos-amiiniryhmää; (2) R1 on NHCOCH3-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatista A tai

5 K, kondroitiinipolysulfaatista tai dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; ja (3) R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista tai kera-taanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty- 10 galaktoosiryhmää, tunnettu siitä, että se kasit- j tää seuraavat vaiheet: glykosaminoglykaani, jonka kaava on (II-l) : ch2r p3 I 15 (/ \ (II-l) Y Y^H-OH GAG7 I RX : 20 T pelkistetään ja avataan rengas pelkistävässä päätyryhmäs- sä, jolloin saadaan pelkistetty tuote, jonka kaava on (II-2) : ch2r 2R R3 1 . r f-oh V CHjOH (II-2) GAG7 I ; 30 r1 joka pelkistetty tuote hapetetaan hapetetun tuotteen saa- . · miseksi, jonka kaava on (II-3) : 105279

109 R3 CHO V CH2OH /\_/

5 GAG I R1 minkä jälkeen näin muodostetun, hapetetun tuotteen aldehy-diryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen ami-noryhmän kanssa, jolloin GAG, R1 ja R3 määritellään kuten 10 edellä ja R on OH- tai 0S03H-ryhmä.

3. Menetelmä kaavan (III) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, i ς HO ΟΗ,-Ρ1 v Vi (III) /'L-ng -pi GAG lh2 * 20 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi- distä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: CH2-0-R4 CH-O-R5 O (IX) t R

25 CH20-P-O-Y OH jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6.24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai 30 -CH2CH(COOH)NH-, ja ja GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista tai kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: kaavan (II-2) mukainen pelkis-35 tetty tuote no 103279 ch2r ¢-,, ch2oh (11-2) GAG ^ j R1 hapetetaan hapetetun tuotteen saamiseksi, jonka kaava on (ID :

10 HO CHO - V Xl (n) -CHO GAG 15 jossa GAG määritellään kuten edellä, minkä jälkeen näin muodostetun, hapetetun tuotteen aidehydiryhmän annetaan : reagoida fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa.

4. Menetelmä kaavan (IV) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidiliitteisen glykosaminoglykaanin ^ 20 tai sen suolan valmistamiseksi, -OH V \ CO-P1 : . ·· .,Αγ ' oi GAG K ! ! jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi-:' 30 distä peräisin oleva ryhmä, jonka kaava on: t " · CH,-0-R4 CH-O-R5 j) (IX) CH20-|-0-Y

35 OH 103279 jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(COOH)NH-, ja (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 5 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroi-tiinista, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataani-sulfaatista, hepariinista tai heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun 10 GAG on glykosaminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lu kuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa

3, R1 on OSO3H-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-

15 D:stä, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihappo ryhmää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista tai heparaanisulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (3) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 2 0 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-K:sta lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää ; (4) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 2 5 3, ainakin jompikumpi R1 tai R3 on 0S03H-ryhmä, kun toinen on OH-ryhmä, ja R2 on COOH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää,· (5) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 30 4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH2OH-ryhmä, . kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; (6) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa

4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH20S03H-ryhmä, 35 kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaa tista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; 112 103279 (7) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroitiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos- 5 ami ini ryhmää; (8) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa

4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2 OH-ryhmä, ja R3 on OSO3H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatista A tai K tai dermataanisulfaatista, lukuun ot- 10 tamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (9) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh-mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisul-faatista C tai D, lukuun ottamatta pelkistävää päätyhek- 15 sosamiiniryhmää; (10) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH2 OS 03H-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatti-E:stä lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos- 20 amiiniryhmää; (11) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryh-mä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä tai 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipo- 25 lysulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää päätyhek- s o s amiiniryhmää; (12) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHSOjH-ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista, lu- 30 kuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (13) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHCOCH3 - ryhmä tai NHS03H-ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä, ja R3 on OSOjH-ryhmä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä tai OSO3H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde 35 heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty heksosamiiniryhmää ; 113 103279 (14) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista tai kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pel-5 kistävää päätyheksosamiiniryhmää, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: glykosaminoglykaani, jonka kaava on (12): C 10 /'“V”-0 ΧΛ Vh-OH R3/^L_Y GAG R1 15 hapetetaan ja avataan rengas pelkistävässä pääteryhmässä, jolloin saadaan hapetettu tuote, jonka kaava on (13) C

20 -OH γ\ (13) e COOA "TrY GAG R1 25 « josta hapetetusta tuotteesta muodostetaan laktoni, jonka kaava on (14): c’ 30

35 GAG R1 „4 103279 114 minkä jälkeen näin valmistetun laktonin annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa, jolloin GAG, R1, R2 ja R3 määritellään kuten edellä ja A on alkalimetal-li.

5. Menetelmä kaavan (V) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykos-aminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, s- R2 - 10 -0H ; S/\ (v)

4 S- I r3/yk-CH2-NH- ( CHj ) ^-ΝΗΟΟ- (CHj ) ,-CO-P2 : 15 GAG -=jj jossa P2 on fosfolipidistä tai lipidistä peräisin oleva - ryhmä, jolla on kaava CH,-0-R8 CH2-0-R8

20 I 2 | CH-O-R9 (X) CH-O- (XI) ch2-o- ch2-o-r9 • 25 ch2-o- ch-o-r10 I (χΙ1> ca-o- ° (XIII, CH2-0 P-0-W tai CH2-0-P-0-W ;; OH OH 30 joissa R8 on vety, R9 on alkyyliryhmä, R10 on -CH=CHR6 tai I, -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2N+- (CH3)3 tai inositolitähde, m on kokonaisluku 1 -8 ja 1 on kokonaisluku 1 - 10; ja (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 35 3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos- 103279 aminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroitiinistä, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataanisulfaatista, hepariinista tai heparaanisulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun GAG on gly-5 kosaminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lukuun otta matta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa

3, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryhmä, kun GAG on glykos-aminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-K:sta tai kond- 10 roitiinipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pää tyglukuronihapporyhmää ; (3) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa

4, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykos-aminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta 15 pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; ja (4) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 4, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on gly-kosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää, tunnettu 20 siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: aldehydiyhdis- teen, jonka kaava on (1-3), 25 (/\ 0H (I-3> GAG 30 annetaan reagoida alkyleenidiamiinin kanssa johdannaisen . saamiseksi, jonka kaava on (15): X. 103279 R1 / -CH2-NH- (CH2 ) m-NH2 GAG 10 jossa GAG, R2, R1 ja m määritellään kuten edellä, jolloin erikseen fosfolipidi tai lipidi saatetaan reagoimaan di-karboksyylihapon tai dikarboksyylihappoanhydridin kanssa 1 fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen saamiseksi, jossa on karboksyyliryhmä, minkä jälkeen kaavan (15) mukaisen joh- ! 15 dannaisen primaarinen aminoryhmä saatetaan reagoimaan fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen karboksyyliryhmän kanssa.

6. Menetelmä kaavan (VI) mukaisen, terapeuttisesti f* käyttökelpoisen fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykos- 20 aminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, I R1 CH2-NH- (CH2) ^-NH-CO- (CH2) t-CO-P2 y ^ 25 \ ,CH20H : ' X / GAG | R1 I « 0 (1) R1 on NHCOCHj - ryhmä ja R1 on OH-ryhmä, kun GAG l’ä · on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroi- tiinista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos-amiiniryhmää; - (2) R1 on NHCOCHj - ryhmä ja R1 on 0S03H-ryhmä, kun GAG 35 on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatista A tai 117 103279 K, kondroitiinipolysulfaatista tai dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; ja (3) R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista tai kera-5 taanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää pääty- galaktoosiryhmää, P2 on fosfolipidistä tai lipidistä peräisin oleva ryhmä, jolla on kaava 10 ch2-o-r8 ch2-o-r8

15 CH-O-R9 (X) CH-O- (XI) I I CH2_0— CH2-°-r9 CH,-0- CH-O-R10 | 2 I

20 CH-O-Rl» O (XII) CH-O- ° (XIII) ch2-o-P-0-W tai Ch2-o--p-o-w OH OH 25 joissa R8 on vety, R9 on alkyyliryhmä, R10 on -CH=CHR6 tai -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2N+-(CH3) j tai inositolitähde, m on kokonaisluku 1 - 8 ja 1 on ' 30 kokonaisluku 1-10; tunnettu siitä, että se kä sittää seuraavat vaiheet: aldehydiyhdisteen, jonka kaava on (II-3), 103279 R3 CHO Y CH2OH

5 X_/ (II-3) GAG/ I R1 annetaan reagoida alkyleenidiamiinin kanssa johdannaisen 10 saamiseksi, jonka kaava on (16): \ CH,0H (16) X/ GAG [ R1 jossa GAG, R1, R3 ja m määritellään kuten edellä, jolloin erikseen fosfolipidi tai lipidi saatetaan reagoimaan di-20 karboksyylihapon tai dikarboksyylihappoanhydridin kanssa fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen saamiseksi, jossa on karboksyyliryhmä, minkä jälkeen kaavan (16) mukaisen johdannaisen primaarinen aminoryhmä saatetaan reagoimaan fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen karboksyyliryhmän kanssa. ; 25 7. Menetelmä kaavan VII mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidi- tai lipidiliitteisen glykos-aminoglykaanin tai sen suolan valmistamiseksi, ; 30 (7^T°H (VII) •Xs. Λ CO-NH- (CH2) η,-NHCO- (CH2) ^-CO-P2 R3vW .

2. GAG R 103279 (1) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta, kondroi-tiinista, kondroitiinisulfaatista A, C tai E, dermataani- 5 sulfaatista, hepariinista tai heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyiduronihapporyhmää; (2) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 10 3, R1 on 0S03H-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-D: stä lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää, tai kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista, tai heparaanisulfaatista lukuun ottamatta pelkistävää pää-15 tyiduronihapporyhmää; (3) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on OH-ryhmä, R2 on COOH-ryhmä ja R3 on OS03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisulfaatti-K:sta lukuun ottamatta pelkistävää päätyglukuronihapporyh- 2. mää; (4) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, ainakin jompikumpi R1 tai R3 on 0S03H-ryhmä, kun toinen on OH-ryhmä, ja R2 on COOH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipolysulfaatista, lukuun ottamat- • 25 ta pelkistävää päätyglukuronihapporyhmää; (5) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa

4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH2OH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; 30 (6) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa , 4, R1 ja R3 ovat molemmat OH-ryhmiä ja R2 on CH20S03H-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätygalaktoosiryhmää; (7) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 35 4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä, i l20 1 0 3 2 7 9 i kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hyaluronihaposta tai kondroitiinistä, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos-Γ amiiniryhmää; (8) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 5 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä, ja R3 on 0S03H- ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini- — 9 sulfaatista A tai K tai dermataanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (9) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 10 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinisul-faatista C tai D lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (10) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 15 4, R1 on NHCOCH3 - ryhmä, R2 on CH2OSOjH-ryhmä ja R3 on 0S03H- ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiini-sulfaatti-E:stä, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksos-r“ ami ini ryhmää ; ^ (11) GAG sijaitsee asemassa 3, R3 sijaitsee asemassa 20 4, R1 on NHCOCHj - ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä ja R3 on 0S03H-ryh- mä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryhmä tai 0S03H- L. ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kondroitiinipo- ^ lysulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyhek- H sosamiiniryhmää; ' = · "25 (12) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa [2' 3, R1 on NHS03H-ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh- mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde hepariinista, lu-kuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; (13) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 30 3, R1 on NHCOCH3 - ryhmä tai NHS03H-ryhmä, R2 on CH2OH-ryhmä, i_ . ja R3 on OSOjH-ryhmä, tai R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH- ryhmä tai OSOjH-ryhmä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde heparaanisulfaatista, lukuun ottamatta pelkistävää päätyheksosamiiniryhmää; 121 103279 (14) GAG sijaitsee asemassa 4, R3 sijaitsee asemassa 3, R1 on NHCOCHj-ryhmä, R2 on CH20S03H-ryhmä ja R3 on OH-ryh-mä, kun GAG on glykosaminoglykaanitähde kerataanisulfaa-tista tai kerataanipolysulfaatista, lukuun ottamatta pel-5 kistävää päätyheksosamiiniryhmää, ja P2 on fosfolipidistä tai lipidistä peräisin oleva ryhmä, jolla on kaava ch,-o-r' ch2-o-r8

10 I 1 CH-O-R5 (X) CH-O- (XI) I 1 CHj-O- CHj-O-R9 ^Η2-0- ch-o-r10

15 CH-O-R10 5 {XII> I n O | | (XII) ψ~° n (XIII) CH2-0 P-0-W tai CH2-0-P-0-W 0H OH 20 joissa R8 on vety, R9 on alkyyliryhmä, R10 on -CH=CHRS tai -COR7, joissa R6 ja R7 ovat, kuten edellä ja W on -CH2CH2IT-(CH3) 3 tai inositolitähde, m on kokonaisluku 1 -8 ja 1. on kokonaisluku 1-10; tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: laktoniyhdisteen, jonka kaava on : 25 (14), GAG ^1 annetaan reagoida alkyleenidiamiinin kanssa johdannaisen 35 saamiseksi, jonka kaava on (17) : 122. 103279 Xo. 5 /^1 ^ CO-NH-(CH2 (17) GAG R1 10 jossa GAG, R1, R2, R3 ja m määritellään kuten edellä, jol loin erikseen fosfolipidi tai lipidi saatetaan reagoimaan dikarboksyylihapon tai dikarboksyylihappoanhydridin kanssa fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen saamiseksi, jossa on karboksyyliryhmä, minkä jälkeen kaavan (17) mukaisen 15 johdannaisen primaarinen aminoryhmä saatetaan reagoimaan fosfolipidi- tai lipidijohdannaisen karboksyyliryhmän kanssa.

8. Menetelmä kaavan (VIII) mukaisen, terapeuttisesti käyttökelpoisen fosfolipidiliitteisen glykos- 20 aminoglykaanin valmistamiseksi, joka sisältää uronihap- poryhmän, tai sen suolan valmistamiseksi, ^-CO-P1 /-0 25. v \R3 ) (VIII) R1 30 jossa P1 on primäärisen aminoryhmän sisältävästä fosfolipi- z · distä peräsin oleva ryhmä, jonka kaava on: CH,-0-R4 (JH-O-R5 O (IX) CH20-^-0-Y

35 OH 123 103279 jossa R4 ja R5 ovat kumpikin vety, -CH=CHR6 tai -COR7 (R6 ja R7 ovat molemmat C6_24-alkyyliryhmiä) ja Y on -CH2CH2NH- tai -CH2CH(COOH)NH-, ja R1 ja R3 merkitsevät toisistaan riippumatta OH-ryh-5 mää tai S03H-ryhmää; tunnettu siitä, että fosfoli- pidi, joka sisältää ryhmän P1, saatetaan kondensoivan aineen läsnä ollessa reagoimaan kaavan (18) mukaisen gly-kosaminoglykaanin kanssa, joka sisältää uronihapporyhmän, 10 ^-COOH 15 (18) R1 jossa R1 ja R3 määritellään kuten edellä, tai glykosamino-glykaanin karboksyyliryhmä aktivoidaan ja aktivoidun kar-20 boksyyliryhmän annetaan reagoida fosfolipidin primaarisen aminoryhmän kanssa. m « « ,)7? /τ\' 124 103279 t '