WO1992001720A1 - Phospholipid- or lipid-combining glycosaminoglycan, production thereof, and cancer metastasis inhibitor - Google Patents

Description

明 細 書 燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン、 その製造法 及び癌転移抑制剤

[技術分野 ]

本発明は、 燐脂質又は脂質結合グリ コサ ノ グ リ カ ン、 そ の製造法及び癌転移抑制剤に関する。

[背景技術

癌転移は、 血管内ゃリ ンバ管内に流出した癌細胞が、 血管 内皮細胞やその下の基底膜と呼ばれる血管内皮細胞の細胞外 マ ト リ ッ ク スと接着し、 接着した癌細胞が細胞外マ ト リ ッ ク ス内に浸潤、 透過して新しい組織内に転移巣を作る こ とが知 られている _β 例えば S, Korachらは (Cancer Research G, 3624〜3629, (1986)) 癌細胞のク ロ一ユ ングで高転移性細胞 と低転移性細胞の群に分け、 培養内皮細胞に対する in vi tro での接触試験で、 高転移性の癌細胞は高い接着率を示し、 低 転移性のものは低い接着率を示すこ とから、 血管内皮細胞や その細胞外マ ト リ ッ クスに対する接着性が癌の転移と深 く か かわっている こ とを報告している。

また、 細胞外マ ト リ ッ ク ス成分である フ イ ブロネ ク チ ンの 細胞接着部位の G R G D S (Gly-Arg-Gly- Asp Ser)配列を もつぺプチ ド部分は、 拮抗的に細胞と細胞外マ ト リ ッ ク ス と の結合を阻害する。 山田らは （Science 467〜470, (19 86) ) こ のペプチ ド . G R G D S力 B 1 6 F i 0細胞のマウ ス における肺転移を抑制することを示している。 このことから、 微量で細胞接着阻害活性を特異的に持つ物質は癌転移抑制剤 として利用し得ることを示唆している。

本発明は、 燐脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ンが、 上記の癌細胞の血管内皮細胞や細胞外マ ト リ ッ ク スへの接着 を阻害することにより、 癌の転移を抑制する知見を得て本発 明をなした。

[発明の開示]

本発明は、 燐脂質又は脂質結合グリ コサミノ ダリカン、 そ の製造法及びそれら又はそれらの塩を舍有する癌転移抑制剤 である。

グリ コサミノ グリ カンは表 1 に示すように、 D—ダルコサ ミ ン又は D —ガラ ク ト サ ミ ンと、 D —グルク ロ ン酸、 L ー ィ ズロン酸及び/又は D —ガラク ト一スの 2糖又は 4糖の繰り 返し単位より構成されている長い鎖状の多糖であり、 ヒ アル ロ ン酸、 コ ン ドロイ チン、 コ ン ドロ イ チン硫酸 A、 コ ン ドロ ィチン硫酸 C、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 D、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 E、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K、 コ ン ドロ イ チ ンポ リ硫酸、 デル マタ ン硫酸、 へパリ ン、 へパラ ン硫酸及びケ ラタ ン硫酸、 ケ ラタ ンボリ硫酸が知られている。

o δ

グ リ コ サ ミ ノ ダリ カ ン へキ ソ サ ミ ン ゥ ロ ン酸

ヒ アノレ口 ン酸 G £ cNAc G ί cUA

(MW 100(^1000万）

コ ン ド ロ ィ チ ン Ga i NAc G i cUA

(MW 1000~10万）

コ ン ド ロ イ チN NDODDLン硫酸 A Ga £ NAc(4S) G i cUA

(MW 1000~10万）

コ ン ド ロ イ チ ン硫硫ガァァ酸ググイ c Ga ί NAc(6S) G i cUA

(MW 1000~10万） 酸ルルセセズラ

コ ン ドロイ チ ン硫酸 D Ga NAc(

チチコククロ ί 6S) G i cUA(2S)

(MW 1000~10万）

コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 E ルルサロント

Ga ί Ac(4S,6S) G i cUA

(MW 1000~10万） 酸一D Dンミ

コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 K Ga酸ス一一ン £ NAc (4S) G i cUA(3S)

(MW 1000~10万） ガグ N

0 コ ン ドロ イ チ ンボ リ硫酸 Ga i NAcル一ラ(S) G £, cUA(S)

( ν» πΙ πΔ 1 ηηπ-χ,ι ς ΤΪ j Ί 硫コク

デルマタ ン硫酸 Ga t NAc(4S酸)サト IduUA, G £ cUA

(MW 1000- 2万）

ン サミ

G H cNS(6S) G H cUA 、 IduUA (2S)

ンミ

(MW 1000- 2万）

へパラ ン硫酸 G £ cNS(NAc, S) Gン £ cUA 、 IduUA (2S)

(MW 1000- 2万）

ケラタ ン硫酸 G ί cNAc(6S) Ga £

(MW 1000- 2万 )

5 ケ ラタ ンボ リ硫酸 G ί cNAc(6S) Ga £ (6S)

(MW 1000- 2万）

G i cNAc

Ga £ NAc

G i cNS

G £ cUA

IduUA

Ga i

S

本発明の磷脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ンは、 そ の塩である こ とができ、 好ま し く はナ ト リ ウム、 カ リ ウムの よ う なアルカ リ金属塩 ； カルシウム、 マグネ シウ ムのよ う な アルカ リ土類金属塩 ； ト リ アルキルァ ミ ン、 ビ リ ジ ンのよ う なァ ミ ン塩である こ とができ る。 本発明の璘脂質又は脂質結合ダリ コサ ノ グリ カ ンは、 次 のものを包含する。

一般式

GAG

を有する燐脂質結合グリ コサミ ノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示し、 ( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チン、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 A、 Cも し く は E、 デルマタ ン硫酸、 へパ リ ンから 還元性末端のグルク ロ ン酸部分を除いたグリ コサミ ノ グリ カ ン残基のとき、 或いはデルマタ ン硫酸から還元性末端のィ ズ ロ ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R³ は 3位に置換し、 R ²は C00H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロ イ チン硫酸 K又はコ ン ドロ イ チ ンポ リ硫酸から還元性末端のダルク口 ン酸部分を除いたグリ コサ ミノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置 換し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0S0₃H 基を示す。

( 3 ) G A Gがケラタ ン硫酸から還元性末端のガラク トース 部分を除いたグリ コサミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3 位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ² は CH₂0H 基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 4 ) G A Gがケ ラタ ンポ リ硫酸から還元性末端のガラ ク ト ース部分を除いたグリ コ サ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A G は 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

一般式

CH_z0H ( Π )

/ C /

H

GAG

P を有する燐脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示し、

( 1 ) G A Gがヒアル口 ン酸又はコ ン ド ロ イ チ ンから還元性 末端のへキ ソサ ミ ン部分を除いたダ リ コ サ ミ ノ ダリ カ ン残基 のとき、 R ¹ は NHC0CH₃ 基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ド ロ イ チ ン硫酸 Aも し く は K、 コ ン ド ロ ィ チ ンボ リ硫酸又はデルマタ ン硫酸から還元性末端のへキ ソ サ ミ ン部分を除いたグリ コ サ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 R ¹ は NHC0CH₃ 基を示し、 R ³ は 0S0₃H 基を示す。

( 3 ) G A Gがケラタ ン硫酸又はケラタ ンポリ硫酸から還元 性末端のガラク トース部分を除いたグリ コサ.ミノ グリ カ ン残 基のとき、 R ' 及び R ³ は 0H基を示す。

一般式

OH CHs -P¹

( I )

CHz-P¹

GAG を有する憐脂質結合グリ コサ ミノ グリ カ ン又はその塩。 、 上記式中、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示し、 G A Gはケラタ ン硫酸又はケラタ ンポリ硫酸から還元性末端の ガラク トース部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基を示す 一般式

0H

2

CO - P¹ ( IV)

3

GAG

を有する燐脂質結合グリ コサミノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級ア ミノ基を有する燐脂質を示し、

( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 A、 Cも し く は E、 デルマタ ン硫酸、 へパリ ン、 又 はへパラ ン硫酸から還元性末端のダルク ロ ン酸部分を除いた グリ コサ ミノ グリ カ ン残基のとき、 或いはデルマタ ン硫酸か ら還元性末端のィ ズロン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ' は 0H基を示し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロイ チ ン硫酸！）から還元性末端のダル ク 口 ン酸部分を除いたグリ コサミ ノ グリ カ ン残基のとき、 或 いはへパリ ン又はへパラ ン硫酸から還元性末端のィ ズロ ン酸 部分を除いたグリ コサミ ノ グリ 力 ン残基のとき、 G A Gは 4 位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は 0S0₃H 基を示し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。 ( 3 ) G A Gがコ ン ドロイ チン硫酸 Kから還元性末端のグル ク ロ ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は 0H基を示し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0S0₃H 基を示す。

( 4 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ンボリ硫酸から還元性末端のグ ルク ロ ン酸部分を除いたグリ コサ ミノ グリ 力 ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ および R ³ の少 な く とも一つは 0S0₃H 基を示し、 他は 0H基を示し、 R ^z は C00H基を示す。

( 5 ) G A Gがケラタ ン硫酸から還元性末端のガラク トース 部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3 位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示し、 R ² は CH₂0H 基を示す。

( 6 ) G A Gがケラタ ンボリ硫酸から還元性末端のガラク ト —ス部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A G は 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示す。

( 7 ) G A Gがヒアル口 ン酸又はコ ン ドロイ チンから還元性 末端のへキソサ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基 のとき、 G A Gは 3位に R ³ は 4位に置換し、 R ' は NHC0CH₃ 基を示し、 R ^z は CH₂0H 基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 8 ) G A Gがコ ン ドロイ チン硫酸 Aもし く は K又はデルマ タ ン硫酸から還元性末端のへキソサ ミ ン部分を除いたグリ コ サ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に 置換し、 R ¹ は NHC0CH₃ 基を示し、 R ² は CH₂0H 基を示し、 R ³ は 0S0₃H 基を示す。

( 9 ) G A Gがコ ン ドロイ チン硫酸 C又は Dから還元性末端 のへキソサ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミノ グリ カ ン残基のと き、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ は NHC0CH₃ 基を示し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 1 0 ) G A Gがコ ン ドロ イ チン硫酸 Eから還元性未端のへ キソサ ミ ン部分を除いたグリ コサミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ は NHC0CH₃ 基を 示し、 R ^z は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0S0₃H 基を示す。 ( 1 1 ) G A Gがコ ン ドロイ チンポリ硫酸から還元性末端の へキソサ ミ ン部分を除いたグリ コサミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ' は NHC0CH₃ 基を 示し、 R ² は CH₂0H 基で R ³ は 0S0₃H 基を示すか、 又は R ² は CH₂0S0₃H基で R ³ は 0H基もし く は 0S0₃H 基を示す。

( 1 2 ) G A Gがへパリ ンから還元性末端のへキソサ ミ ン部 分を除いたダリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位 に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は NHS0₃H基を示し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 1 3 ) G A Gがへパラ ン硫酸から還元性未端のへキソ サ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は NHC0CH₃ 基又は NHS0₃H 基を示し、 R ² は CH₂0H 基で R ³ は 0S0₃H 基を示すか、 又は R ² は CH₂0S0₃H基で R ³ は 0H基もし く は 0S0₃H 基を示す。

( 1 ) G A Gがケラタ ン硫酸又はケラ タ ンボリ ^酸から還 元性未端のへキソサミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ 力 ン 残基レ とき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は NHCOCHa 基を示し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を 示す 4。

一般式 Rヽ 2

OH

( V ) ノ、

CHz-NH- (CH₂)_n-NHC0- (CH₂) _£-C0-P

GAG

を有する燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミノ ダリ カ ン又はその 上記式中、 P ^z は燐脂質又は脂質を示し、 mは 1 〜 8を示 し、 £ は 1〜 1 0を示す。

( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 A、 C も し く は E、 デルマタ ン硫酸、 へバ リ ン又は へパラ ン硫酸から還元性末端のダルク口ン酸部分を除いたグ リ コサミノダリカ ン残基のとき、 或いはデルマタ ン硫酸から 還元性末端のィ ズロ ン酸部分を除いたダリ コサミ ノ ダリ カ ン 残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ン硫酸 K又はコ ン ドロ イ チ ンポ リ硫酸から還元性末端のダルク口 ン酸部分を除いたグリ コサ ミノ ダリ カ ン残基のとき、 . G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置 換し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す。

( 3 ) G A Gがケラタ ン硫酸から還元性末端のガラク トース 部分を除いたグリ コサミノダリカン残基のとき、 G A Gは 3 位に、 R³ は 4位に置換し、 R ² は CH₂0H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。'

( ) G A Gがケラタンポリ硫酸から還元性末端のガラク ト ース部分を除いたグリ コサミノ グリカ ン残基のとき、 G A G は 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

一般式 O- P²

を有する焼脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリカン又はその 塩。

上記式中、 G A G、 R ¹ 及び R ³ は前記一般式 （ II ) に記 載と同じであり、 m、 及び P ² は前記一般式 （ V) に記載 と同じである。

一般式

R¹ を有する烧脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ン又はその 上記式中、 G A G、 R ¹ 、 1¾ ²及び }？ ³ は前記一般式 （ IV ) に記載と同じであり、 m、 £及び P ² は前記一般式 （ V ) に 記載と同じである。

一般式

を有する燐脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示し、 η はダリ コサ ミ ノ グリ カ ンに存在するカルボキシル基の数以下 ¾：示し、

( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸、 コ ン ド ロ イ チ ン、 コ ン ドロイ チン硫酸 A、 C もし く は E、 又はデルマタ ン硫酸のグリ コサ ミ ノ グリ カ ン鎮のとき、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ン硫酸 Dのグリ コ サ ミ ノ グリ カ ン鎖のとき、 R ¹ は 0S0₃H 基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 3 ) G A Gがコ ン ド ロ イ チ ン硫酸 Kのグ リ コ サ ミ ノ グ リ カ ン鎮のとき、 R ¹ は 0H基を示し、 R ³ は 0S0₃H 基を示す _e ( 4 ) G A Gがコ ン ドロ イ チンボリ硫酸のグリ コサ ミ ノ グリ カ ン鎖のとき、 R ¹ 及び R ³ の少な く とも 1 つは 0S0₃H 基を 示し、 他は 0H基を示す。 ( 5 ) G A Gがへパリ ン又はへパラ ン硫酸のダリ コサ ミノ グ リ カ ン鎮のとき、 R ¹ は OH基又は OS0₃H 基を示し、 R ³ は OH 基を示す。

グリ コサ ミ ノ グリ力 ンの分子量は好ま し く は表 1 に記載の ものが用いられる。

上記式 （ I ) 、 （ n ) 、 （m ) 、 （iv) 及び （von の p ¹ で示される 1級ァ ミ ノ基を有する燐脂質としては、

式 CH₂- 0-R⁴

I 0 p 0 =I - H

CH-0-R⁵ 0

Y (K)

CH₂-0

(式中、 R ⁴ 及び R ⁵ はそれぞれ水素、 — CH-CHR⁶又は -COR⁷ ( R ⁶ 及び R ⁷ は C₆~_2<のアルキル基） であり、 Yは 一 Ci CHzNH—又は— CH_ZCHNH —である）

C00H

で示されるものが用いられる。 特に R⁴ 及び R ⁵ がともにへ キサデカノ ィ ル又はォクタデカノ ィ ルのような一 C0R⁷である か、 R ⁴ が— CH = CHR⁶で R ⁵ が— C0R⁷であるものが好ま しい, また、 上記式 （V ) 、 （VI) 及び （VI) の P ² で示される 燐脂質又は脂質としては、

式 CH_Z- O-β⁸ CH₂-0-R⁸

CH-O-R⁹ ( X ) CH-0- (XI)

CH₂-0- CH_z-0-R⁹ CH₂-0- CH-O-R¹⁰

0 (X Π ) 又 I:

II

CH₂-0

OH

c c c !- H H H

o一 o o

R

o

0 (X in )

II

一 P-O- OH

(式中、 R⁸ 、 R ⁹ 及び R '。はそれぞれ水素、 アルキル基、 一 CH-CHR⁶又は一 COR⁷ ( R ⁶ 及び R⁷ は前記と同じ） であ り、 Wは— CH₂CH₂N ⁺ (CH₃) ₃又はイ ノ シ トール残基である） で示される ものが用いられる。 特に R⁸ 及び R⁹ がともにへ キサデカノ ィ ル又はォクタデカノ ィ ルのような一 C0R⁷である 力、、 R ⁸ が水素で、 R⁹ が— C0R⁷である式 （X) 又は （XI) の脂質、 或いは R '。が— COR⁷である式 un) 又は um) の燐 脂質が好ま しい。

上記、 烧脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ンの本発明 による製造法は、 次の通りである。

下記一般式 （ I 一 1 ) で表されるグリ コ サ ミ ノ グリ カ ンの 還元性末端を還元及び開裂させて、 下記一般式 （ I - 2 ) で 表される還元体を得、 この還元体を酸化する こ とによ り 、 下 記一般式 （ I 一 3 ) で表される酸化体を得、 該酸化体のアル デヒ ド基と辚脂質が有する 1級ァ ミ ノ基とを反応させる こ と を特徴とする前記一般式 （ I ) で表される燐脂質結合グリ コ サミノ グリ カ ン又はその塩の製造方法,

H - 0H ( I 一 1 )

GAG

R

(式中、 G A G、 R ² 、 R ³ は、 前記一般式 （ I ) 記載のも の.と同義である。 ）

下記一般式 （ Π— 1 ) で表されるグリ コサ ミ ノ グリ カ ンの 還元性末端を還元、 開裂させて、 下記一般式 （ Π — 2 ) で表 される還元体を得、 この還元体を酸化することにより、 下記 一般式 （ Π— 3 ) で表される酸化体を得、 該酸化体のアルデ ヒ ド基と憐脂質が有する 1 級ァ ミ ノ 基とを反応させる こ とを 特徵とする前記一般式 （ U ) で表される憐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ 力 ン又はそめ塩の製造方法。

zOH ( Π — 3 )

R

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ³ は、 前記一般式 （ Π ) に記載の ものと同義である。 Rは、 0Η又は 0S0₃H である。 ）

前記一般式 （ Π — 2 ) で表される還元体を酸化することに より、 下記一般式 （ 1 1 ) で表される酸化体を得、 該酸化体 のアルデヒ ド基と璘脂質が有する 1 級ァ ミ ノ基とを反応させ るこ とを特徴とする前記の一般式 （ II ) で表される燐脂質結 合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩の製造方法。

HO CH0

… （ 1 1 )

CH0

GAG (式中、 GA Gは、 前記一般式 （ Iff ) に記載のものと同義で ある。 ）

下記一般式 （ 1 2 ) で表されるグリ コサ ミノ ダリ カ ンの還 元性末端を酸化、 開裂させて、 下記一般式 （ 1 3 ) で表され る酸化体を得、 この酸化体から下記一般式 （ 1 4 ) で表され るラク ト ンを得、 このラク ト ンと燐脂質が有する 1級ァ ミ ノ

2

基とを反応させることを特徴とする前記一般式 （IV) で表さ れる燐脂質桔合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩の製造方法

Η·0Η ( 1 2 )

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R R ³ は、 前記一般式 （IV) に 記載のものと同義である。 Aは、 アルカ リ金属を表す。 ） 前記の一般式 （ I 一 3 ) で表されるアルデヒ ド化合物をァ ルキ レ ン ジァ ミ ンと反応させて、 下記一般式 （ 1 5 ) の誘導 体を得、 一方、 璘脂質または脂質とジカルボン酸またはシカ ルボン酸の無/水, 物とを反応させて、 カルボキ シル基をもつ燐 脂質または脂質誘導体を得、 一般式 （ 1 5 ) の誘導体の 1 級 ァ ミ ノ 基と燐脂質または脂質誘導体が有する力ルボキ シル基 とを反応させる こ とを特徴とする前記の一般式 （ V ) で表さ れる燐脂質または脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩 の製造方法。

0H

^Λ、

( 1 5 )

CH₂-NH- (CH₂) _n-NH_z

GAG

(式中、 G A G、 R ² 、 R ³ mは、 前記一般式 （ V ) に記 載のものと同義である。 ）

前記一般式 （ Π — 3 ) で表されるアルデヒ ド化合物をアル キ レ ンジァ ミ ン と反応させて、 下記一般式 （ 1 6 ) の誘導体 を得、 一方、 燐脂質または脂質とジカルボン酸またはジカル ボン酸の無水物とを反応させて、 カルボキ シル基をもつ璘脂 質または脂質誘導体を得、 一般式 （ 1 6 ) の誘導体の 1 級ァ ミ ノ基と燐脂質または脂質誘導体が有する力ルボキ シル基と を反応させる こ とを特徴とする前記一般式 （VI ) で表される 燐脂質または脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ 力 ン又はそ O塩 Ο製 造方法。

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R³ 、 mは前記一般式 （VI ) に記載 のものと同義である。 ）

前記の一般式 （ 1 4 ) で表されるラク ト ン化合物をアルキ レ ンジァ ミ ンと反応させて、 下記一般式 （ 1 7 ) の誘導体を 得、 一方、 燐脂質または脂質とジカルボン酸またはジカルボ ン酸の無水物とを反応させて、 カルボキ シル基をもつ璘脂質 または脂質誘導体を得、 一般式 （ 1 7 ) の誘導体の 1級ァ ミ ノ基と燐脂質または脂質誘導体が有するカルボキシル基とを 反応させるこ とを特徴とする前記一般式 （VI) で表される燐 脂質または脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩の製造 方法。

R

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ² 、 R ³ 、 mは前記一般式 （VI) に記載のものと同義である。 ）

下記の一般式 （ 1 8 ) で表されるグリ コサ ミ ノ グリ カ ンの カルボキシル基と憐脂質が有する 1級ァ ミ ノ基とを縮合剤の 存在下に反応させることを特徴とする前記一般式 （珊） で表 される燐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩の製造方 法。

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ³ 、 n は前記一般式 （ VDI ) に記載 のものと同義である。 ）

上記一般式 （ 1 8 ) で表されるグリ コサ ミ ノ ダリ カ ンの力 ルボキ シル基を活性化し、 この活性化カルボキシル基と燐脂 質が有する 1級ァ ミ ノ基とを反応させる こ とを特徴とする前 記一般式 （\1 ) で表される燐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン 又はその塩の製造方法。

以下に、 本発明の燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ンの製造法について詳し く説明する。

還元末端限定酸化法

この方法は、 グリ コサ ミ ノ グリ カ ンの還元性末端ゥ ロ ン酸 部分もし く はガラ ク トース部分又はへキソサ ミ ン部分を還元 及び部分酸化するこ とにより開裂させてアルデヒ ドを形成さ せ、 このアルデヒ ドと燐脂質の 1 級ァ ミ ノ基との間の還元的 アルキル化反応により 、 燐脂質結合ダリ コサ ミ ノ グリ 力 ンを 製造する方法である。 この方法を反応式て'示せば次のとおり である。

( A ) 還元性末端糖のダルク ロン酸又はィズロン酸に反応 する場合

酸化

(1) (2)

( R ³ は前述と同じ、 P ¹ は 1級アミノ基を有する焼脂質を 示す）

還元性末端が C — 2に 0 Hを有する D —ダルク口ン酸又は L ーィズロ ン酸である式 （ 1 ) のヒアルロ ン酸、 コ ン ドロイチ ン、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 A、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 C、 コ ン ド ロ イ チン硫酸 E、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K、 コ ン ドロ イ チンポ リ硫酸、 デルマタ ン硫酸、 へパリ ンを原料として使用したと き、 上記反応式に従い、 式 （ I 一 a ) の燐脂質結合グリ コサ ミノ グリカ ンが製造できる。

( B ) 還元性末端糖のダルコサミ ン又はガラク トサミ ンに 酸化

HzOH

NHCOCH: NHCOCH:

(4) (5)

;

(6) ( Π - a )

(式中、 R ³ は前述と同じ、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐 脂質を示す）

還元性末端の C一 5 に CH₂0H を有するダルコサ ミ ン又はガ ラ ク ト サ ミ ンである式 （ 4 ) のヒアルロ ン酸、 コ ン ド ロ イ チ ン、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 A、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K、 コ ン ド ロ イ チ ンポリ硫酸又はデルマタ ン硫酸を原料として使用した とき、 上記反応式に従い、 式 （ Π — a ) の憐脂質結合グリ コ サミ ノ グリ カ ンが製造できる。

( C ) 還元性末端糖のガラ ク トースに反応する場合 CH_z0H/CH_z0S0₃fl CH₂0H/CH₂0S0₃H

(7) (8)

CH₂0H/CH_z0S0₃H CHEOH/CH_ZOS0₃H

OH OH 燐脂質 OH -OH

( I - b )

CHO ノ Λ CH₂-P'

GAG GAG EOH

( D - b )

(6)

GAG GAG

(10

(式中、 R ³ は前述と同じ、 P ¹ は 1級アミノ基を有する燐 脂質を示す）

還元性末端糖がガラ ク トースである式 （ 7 ) のケ ラ タ ン硫 酸又はケラタ ンポリ硫酸を原料として使用したとき、 上記反 応式に従い、 式 （ I 一 b ) 、 （ Π - b ) 及び （ ΠΙ ) の燐脂質 結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ンが製造できる。

上記 （ A ) 、 ( B ) 及び （ C ) の方法においては、 先ず、 上記式 （ 1 ) 、 （ 4 ) 及び （ 7 ) で示されるグリ コサ ミ ノ グ リ 力 ンを還元して還元性末端糖部分を開裂させて式 （ 2 ) 、 ( 5 ) 及び （ 8 ) の化合物とする。

この還元に使用しう る還元剤と しては、 水素化ホウ素ナ ト リ ゥム、 シァノ水素化ホウ素ナ ト リ ゥムなどの水素化ホウ素 アルカ リ塩等を用いる こ とができる。

また、 上記還元反応における溶媒は、 水又は 0. 0 5 Mホウ 酸塩緩衝液 （PH 8. 3 ) 等を用いるこ とができる。

また還元反応温度は、 通常 1 0〜 3 0 て、 好ま し く は 1 5 〜 2 5 'Cで行う こ とができる。

還元剤の使用量は、 その種類等によっても異なるが、 一般 には式 （ 1 ) 、 （ 4 ) 又は （ 7 ) の化合物 1 モルに対して 5 〜 5 0 当量、 好ま し く は 2 5〜 3 0 当量の範囲である。

得られる式 （ 2 ) 、 （ 5 ) 及び （ 8 ) の化合物を次いで部 分的に酸化すると、 式 （ 3 ) 、 （ 6 ) 、 （ 9 ) 、 （ 1 0 ) 及 び （ 1 1 ) のアルデヒ ド化合物が生成する。

この酸化反応に使用しう る酸化剤と しては、 過ヨウ素酸ナ ト リ ゥム、 過ヨウ素酸力 リ ゥムなどの過ヨウ素酸アル力 リ塩 等を用いる こ とができる。

酸化剤の使用量は、 式 （ 2 ) 、 （ 5 ) 又は （ 8 ) の化合物 1 モルに対して 1〜 1 0 当量、 好ま し く は 3〜 6 当量の範囲 である。 酸化反応温度は、 0〜 1 0 'C、 好まし く は 0〜 4 'Cの範囲 で行う ことができる。

生成した （ 3 ) 、 （ 6 ) 、 （ 9 ) 、 （ 1 0 ) 及び （ 1 1 ) のアルデヒ ド化合物は、 それ自体既知の還元的アルキル化法 に従い、 燐脂質の 1級ァ ミノ基と反応させることができ、 こ れによつて本発明が目的とする一般式 （ I一 a ) 、 ( Π - a ) ( I — b ) 、 （ II _ b ) 及び （ HI ) で示される焼脂質結合グ リ コサミノ グリ カ ンを得ることができる。

上記反応に用いることのできる燐脂質としては、 L— ( —ホスファ チジル） エタノ ールァ ミ ン、 D L—ホスファチジ ルー Lーセ リ ン、 エタノ ールァ ミ ンプラスマロゲン、 セ リ ン プラスマロゲン等を挙げることができる。

上記還元的アルキル化反応は、 水、 0.0 5 Mリ ン酸緩衝液 ( pH 7.0 ) 又はジメ チルホルムア ミ ドのような溶媒中におい て、 式 （ 3 ) 、 （ 6 ) 、 （ 9 ) 、 （ 1 0 ) 又は （ 1 1 ) のァ ルデヒ ド化合物とク口口ホルム等に溶解した燐脂質とを混合 して均一な溶液にし、 通常 1 5〜 6 O 'Cの温度で反応させ、 それと同時に又はその後に、 例えばシァノ水素化ホウ素ナ ト リ ゥム等の還元剤を用いて還元することにより一般式 （ I 一 a ) 、 （ II— a ) 、 （ I — b ) 、 （ Π— b ) 及び （ I ) の化 合物を製造することができる。

上記還元末端限定酸化法で製造される化合物を、 表 Aに具 体的に示す。 表 A 化合物

構造式 原料グリ コ サ ミ ノ ダリ カ ン

C00H ヒ アノレロ ン酸、 コ ン ド ロ ィ チ ン、 コ

0H ン ド ロ イ チ ン硫酸 A、 Cも し く は E

I 一 (1) 0H デルマタ ン硫酸、 へパリ ン、 へバラ

GAG CHz-P¹ ン硫酸

C00H

コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K、 コ ン ド ロ イ チ ンボ リ硫酸

CHEOH

ケラ タ ン硫酸

ケラタ ンポリ硫酸

A (つづき）

Π一 (1) ₂0H ヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン

NHCOCH;

HOaSO CH_Z -P¹

コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Aも し く は K

I — (2) CHEOH

コ ン ドロ イ チ ンポ リ硫酸、 デルマ

GAG

タ ン硫酸

NHCOCH:

HO CH₂ -P¹

Π一 (3) CH_z0H ケラタ ン硫酸、 ケラタ ンポリ硫酸

GAG

OH

HO CHz-P¹

I ケラタ ン硫酸、 ケラタ ンボリ硫酸

GAG CH_Z-P

還元末端ラク ト ン化法

この方法は、 グリ コサ ミ ノ ダリ カ ンの還元性末端ゥ ロ ン 酸部分もし く はガラク トース部分又はへキソサミ ン部分を酸 化することにより該末端糖部分を開裂させ、 更にラク ト ンを 形成させて、 このラク ト ンと燐脂質の 1級ァ ミノ基との反応 により磷脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ンを製造する方法であ る。 この方法を反応式で示せば次のとおりである。

δ

04)

(式中、 R ¹ 、 R ² 及び R³ は前記と同じ、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示す。 Aはアルカ リ金属を示す。 ）5 本方法において、 先ず、 式 （ 1 2 ) で示されるグリ コサミ ノグリカンを酸化して還元性末端部分を開裂させ、 式 （ 1 3 ) のカルボキ シ化合物とする。

式 （ 1 2 ) のヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ドロイ チ ン硫酸 A、 コ ン ドロイ チン硫酸 C、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 D、0 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 E、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K、 コ ン ドロ イ チ ンボ リ硫酸、 デルマタ ン硫酸、 へパリ ン、 へパラ ン硫酸、 ケラタン硫酸又はケラタ ンポリ硫酸を原料として使用するこ とができる。

この酸化に使用しうる酸化剤としては、 ヨウ素、 臭素等を 用いることができる。 酸化剤の使用量は、 式 （ 1 2 ) の化合物 1 モルに対して 2 〜 2 0 当量、 好ましく は 5〜 1 5 当量の範囲である。

酸化反応における溶媒は、 水又は 0. 0 5 Mリ ン酸緩衝液 (PH 7. 0 ) 等を用いることができる。

酸化反応温度は、 0〜 4 0 'C、 好ましく は 1 5〜 2 0 'Cで 行う ことができる。

生成する式 （ 1 3 ) の化合物は、 次いで酸で処理すること により式 （ 1 4 ) のラク ト ン化合物にすることができる。

ここで用いることのできる酸としては、 強酸性陽ィオ ン交 換樹脂、 例えばダウエックス 5 0、 ア ンバーライ ト I R 1 2 0 等を挙げることができる。

得られる式 （ 1 4 ) のラク ト ン化合物は、 次いで焼脂質と 反応させることにより、 前記一般式 （IV) の燐脂質結合グリ コサミノ グリカンを製造することができる。

上記反応に用いるこ とのできる燐脂質としては、 前記還元 末端限定酸化法において例示したものを用いることができる。 式 （ 1 4 ) のラク トン化合物と燐脂質との反応は、 水、

0. 0 5 Mリ ン酸緩衝液 （ pH 7. 0 ) 又はジメチルホルムア ミ ド 等に溶解した式 （ 1 4 ) のラク ト ン化合物と、 クロ口ホルム 等に溶解した燐脂質とを混合して均一な溶液にし、 5〜 8 0 •C、 好ましく は 3 0〜 6 0ての温度で反応させることにより 一般式 （IV) の化合物を製造することができる。

上記還元末端ラク ト ン化法で製造される化合物を、 表 Bに 具体的に示す。

o δ t

表 B 化合物

番 号 i 造式 原料グリ コ サ ミノ グ リ カ ン

C00H ヒアノレロ ン酸、 コ ン ド ロ イ チ ン、 コ

0H ン ドロ イ チ ン硫酸 A、 Cも し く は E

N― (1) OH CO-P¹デルマタ ン硫酸、 へノヽ' リ ン、 へノヾ フ

GAG 、！_

ン硫酸

0H

C00H

0

0H コ ン ドロ イ チ ン硫酸 D、 へパリ ン

IV― (2) 0H C0-P へバラ ン硫酸

GAG

0S0_aH

C00H

OH

IV— (3) 0S0₃H CO-P' コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K

GAG

OH 0

C00H

IV - (4) - -P¹ コ ン ド ロ イ チ ンポリ硫酸

0S0₃H B (つづき）

COOH

OH

IV - (4) - b 0S0₃H CO - P コ ン ドロ イ チ ンポリ萨

GAG

OH

COOH

OH

W - (4) - c (OH CO- P コ ン ドロイチ ンボリ硫酸

GAG

OSOsH

IV- (5) ケ ラタ ン硫酸

OH

CHzOSOsH

HO OH

W— (6) CO-P ケラ タ ンボ リ硫酸

GAG

OH B (つづき）

CHzOH

HO OH

I -(7) CO-P ヒアルロ ン酸、 コ ン ド ロ イ チン

GAG

NHCOCH;

CH₂0H

H0₃S0 J ~~ OH コ ン ドロイ チン硫酸 Aもし く は K I -(8) CO-P デルマタ ン硫酸

GAG

NHCOCH,

CH₂0S0₃H

HO OH

コ ン ドロイ チン硫酸 Cも し く は D

IV— (9) CO-P

GAG

NHCOCH

コ ン ドロイ チン硫酸 E

NHCOCH; 表 B (つづき）

コ ン ドロ イ チ ンポリ硫酸

IV一 (II)一 a

NHCOCH:

CHzOSOsH コ ン ドロイ チ ンポリ硫酸 1

NHCOCH;

CH₂OS0₃H コ ン ドロ イ チ ンボリ硫酸 1

NHCOCH

バリ ン

NHS0₃H 表 B (つづき ）

CH_z0H へノヽ' フ

P¹

NHC0CH₃/NHS0₃H

CHEOS0₃H へパラ ン硫酸 P¹

NHCOCHs/NHSOaH

へパラ ン硫酸

IV一 03)— c ¹

NHCOCH₃/NHS0₃H

ケラタ ン硫酸、 P¹

ケラタ ンボリ硫酸

NHC0CH; 還元关端ァ ミ ン法

この方法は、 前記式 （ 3 ) 、 （ 6 ) 、 （ 9 ) 及び （ 1 0 ) のァルデヒ ド化合物並びに （ 1 4 ) のラク ト ン化合物にアル キ レンジァ ミ ンを反応させ、 末端に 1級ア ミ ノ基をもつダリ コサミノ ダリ カ ン誘導体と し、 次にこの 1級ア ミノ基をもつ グリ コサミ ノ グリ カ ン誘導体と力ルボキシル基をもつ燐脂質 又は脂質誘導体とを反応させ、 ァ ミノ基とカルボキ シル基と の結合により、 燐脂質又は脂質結合グリ コサミ ノ グリ カ ンを 製造する方法である。

この方法を反応式で示せば次のとおりである。

(3) (9) (15)

(6) (10) (16)

/ R -

2

OH

' λ

/ S

3 Ά 、'

— CHzNH- (CH₂)_W -NHCO- (CH_Z)_£ -CO-P²

GAG

(V)

R³/CH₂NH- (CH₂)_n-NHC0- (CH山 -CO-P²

I

CH₂OH

GAG

(IV)

OH

- \ CO-NH- (CH₂) _m -NHCO- (CH_Z)_£ -CO-P:

GAG

R¹

(W)

(式中、 R ¹ 、 R ² 及び R ³ は前述と同じ、 P ² は燐脂質又 は脂質を示す）

還元末端に 1級ァ ミ ノ基をもつグリ コサ ミノ グリ 力 ン誘導 体、 式 （ 1 5 ) 、 （ 1 6 ) 及び （ 1 7 ) は、 前記還元末端限 定酸化法又は還元末端ラ ク ト ン化法によ って製造される式 ( 3 ) 、 （ 9 ) 、 .（ 6 ) 、 （ 1 0 ) 及び （ 1 4 ) の化合物と アルキ レ ンジァ ミ ンとを還元剤の存在下で反応させる こ とに よって得られる。

この反応に使用できるアルキ レ ンジァ ミ ンと して一般式 NH ₂ - (CH ₂ ) _n - NH _z

(式中、 mは 1〜 8 の整数）

で示される化合物を用いる こ とができる。

還元剤としては、 シァノ水素化ホウ素ナ ト リ ウム等を用い ることができる。

還元剤の使用量は、 上記反応に使用するグリ コサ ミノ グリ カ ンのモル数の 1 0〜 1 0 0倍モル量である。

反応溶媒は、 水又は 0. 0 5 Mリ ン酸緩衝液等を用いる こと ができる。

反応温度は、 0〜 6 0 'C、 好ま し く は 4〜 2 5 'Cで行う。 また、 カルボキシ基をもつ燐脂質又は脂質誘導体は、 グリ セロール骨格に水酸基をもつ璘脂質又は脂質とジカルボン酸 又はジカルボン酸の無水物とを反応させて得られる。

この反応に使用できる磷脂質又は脂質と しては、 モノ ァ シ ルグリ セ ロール、 ジァ シルグリ セ ロール、 リ ゾホスフ ァ チジ ルコ リ ン又はリ ゾホスファ チジルイ ノ シ トール、 エーテル脂 質又はエーテル燐脂質等を用いるこ とができる。

ジカルボン酸としては、 コハク酸、 グルタル酸、 ァジピン 酸等を用いることができる。 無水ジカ ルボン酸としては、 無水マ レイ ン酸、 無水コハク 酸、 無水フマル酸等を用いるこ とができる。

縮合剤としては、 1 一ェチル一 3 — (ジメ チルア ミ ノ ブ口 ピル） 一カルボジイ ミ ド、 ジシク ロへキ シル力ルボジィ ミ ド 等を用いるこ とができる。

反応溶媒としては、 ク ロ 口ホルム、 ァセ トァニリ ド、 ジメ チルホルムア ミ ド等を用いることができる。

反応温度は、 縮合剤の存在下でジカルボン酸を使用すると きは 0〜 6 0 てを、 また無水ジカルボン酸を使用するときは 2 0〜 8 0 ΐで行う こ とができ る。

還元末端に 1級ア ミ ノ基をもつグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン誘導 体とカルボキシ基をもつ燐脂質又は脂質誘導体とを反応させ る方法は、 先ず該燐脂質又は脂質誘導体をべプチ ド化学の分 野でよ く知られている方法に従って該燐脂質又は脂質誘導体 のカルボキシ基を活性化し、 次いで該グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン 誘導体と反応させる方法で行う ことができる。

上記燐脂質又は脂質誘導体のカルボキシ基を活性化する方 法と しては、 上記焼脂質又は脂質誘導体と Ν — ヒ ドロキ シス ク シ ンイ ミ ド、 p —ニ ト α フ エ ノ ール、 Ν — ヒ ド ロ キ シベン ゾ ト リ アゾ一ル、 Ν — ヒ ドロキ シビペリ ジ ン、 Ν — ヒ ドロキ シスク シ ンア ミ ド、 2 , 4 , 5 — ト リ ク ロ 口 フ エ ノ ール等と を縮合剤の存在下で反応させ、 該カルボキシ基を活性エステ ルに変える方法で行う こ とができ る。

反応溶媒と しては、 ク ロ 口ホルム、 ァセ ト ニ ト リ ル、 ジメ チルホルムア ミ ド又は該溶媒の混合液を用いる こ とができ る。 縮合剤としては、 1 ーェチルー 3— (ジメ チルァ ミ ノ プロ ピル） 一カルボジイ ミ ド、 ジシク ロへキ シル力ルボジィ ミ ド 等を用いるこ とができる。

反応温度は、 0〜 6 0 'Cで行う。

上記方法によつて得られたカルボキシ基が活性化された上 記燎脂質又は脂質誘導体と、 1級ア ミノ基をもつグリ コサ ミ ノ グリ 力 ン誘導体 （ 1 5 ) 、 （ 1 6 ) 又は （ 1 7 ) とを反応 させれば、 燐脂質又は脂質結合グリ コ サ ミ ノ ダリ カ ン （ V ) 、 (VI) 及び （VI) を得ることができる。

上記反応溶媒としては、 ク ロ 口ホルム、 ァセ ト ニ ト リ ル、 ジメ チルホルムア ミ ド又は該溶媒の混合液を用いることがで き る。

また反応温度は、 0〜 6 0 'Cで行う。

上記還元末端ア ミ ン法で製造される化合物を、 表 Cに具体 的に示す。

表 C

(R = NH- (CH_z)_m-NHC0- (CH₂)_£ -CO-P²) 化合 構 造 式 原料グリ コサ ミ ノ グリ カ ン 番 万

C00H

ン酸、 コ ン ド ロ イ ン ド ロ イ チ ン硫酸

V一 (1) しは E 、 デルマ へバリ ン、 へパ

GAG

C00H

OH コ ン ドロイ チ ン硫酸 κ、 コ

V一 (2) ン ド ロ イ チ ンボ リ硫酸

( 0S0₃H

^ ~~ CH_Z-R

GAG

CH_z0H

HO OH

V一 (3) ケラ タ (nil

CH₂-R

GAG

CH_z0S0₃H

HO OH

V一 (4) ケ ラ タ ンポ リ硫酸

CH_Z-R

GAG 表 C (つづき ） ヒアクレ口 ン酸、 コ ン ドロ イ

VI - (1) チ ン

NHCOCH:

VI一 (2)

NHCOCH:

チ Aタラヒリく

HO /CH_Z-R 硫、アはンンンン

ケラタ ン硫酸、 ケ ラタ ンポ 酸、硫硫ル Kcド

VI一 (3) レ CHzOH リ硫酸

s酸酸コ Π Πも

デゝコィンンし

GAG 酸ルチへンくド

OH 、パマは口ンド

硫タ Πロィ Eリ

酸ヽチインンン

C00H 硫、 Aチデンド 酸硫ルへもロン

OH 酸パポマィし

VI—（1) ί OH CO-R

GAG

OH

W—（2) コ ン ドロイ チン硫酸 D、 パ リ ン、 へパラ ン硫酸

OSOaH 表 C (つづき ）

COOH コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 K

OH

COOH コ ン ド ロ イ チ ンポリ硫酸

OS0₃H

COOH

OH

- (4) -b コ ン ド ロ イ チ ンポ リ

OS0₃H CO-R

GAG

OH

COOH I- (4) -c コ ン ドロイ チ ンボリ硫酸

G

0S0₃H 表 C (つづき）

CHEOH

HO OH

一 (5) ケラタ ン硫酸

CO-R

GAG

OH

CHzOS0₃H

HO OH

— (6) ケラタ ンボリ硫酸

CO-R く

GAG

OH

CHzOH

HO OH

VI—（7) ヒアルロ ン酸、 コ ン ト-、ロイ

CO-R チン

GAG

NHCOCH;

CH₂0H

H0₃S0 OH

一 (8) ン ドロイ チン硫酸 Aもし

CO-R は 、 デルマタ ン硫酸

GAG

NHC0CH: 表 C (つづき ）

CHEOS0₃H

VI—（9) コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Cも し

-R く は D

NHCOCH;

CH₂0S0₃H

H0₃S0 OH

W一 (10) コ ン ドロイ チ ン硫酸 E

CO-R

GAG

NHCOCH;

CH_Z0H コ ン ドロイ チ ンボリ硫酸 R

NHCOCH;

コ ン ド ロ イ チ ンボ リ硫酸

NHCOCH 表 C (つづき）

CHzOSOsH

HOsSO OH

it コ ン ドロ イ チ ンポ リ

W- (ll)-c CO-R

GAG

NHCOCH;

\1一 (12) へ リ ン

R

CH_z0H へパラ ン硫酸

NHCOCH₃/NHS0₃H

CHzOSOaH

パラ ン硫 i

-(13)-b OH CO-R

GAG

NHCOCH₃/NHS0₃H 表 C (つづき）

CHzOSOsH

I

-OH

へノヽ' フ

广 f

o o H

t S NHCOCH3/NHSO3H

CH₂0S0₃H

OH

ケラタ ン硫酸、 ケラタ ンボ

\ 一 (14) CO-R リ硫酸

GAG

NHC0CH:

縮合剂使用法

ケラタ ン硫酸及びケラタ ンボリ硫酸以外のグリ コサ ミ ノ グ リ カ ンは D—グルク ロ ン酸又は Lーィ ズロ ン酸を含有し、 こ れらのゥ ロ ン酸は C一 5にカルボキシ基を有する。

この方法は、 ゥ ロ ン酸のカルボキシ基と燐脂質の 1級ア ミ ノ基とを縮合剤の存在下で反応させ、 焼脂質結合ダリ コ サ ミ ノ グリ 力 ンを製造する方法である。

この方法を反応式で示せば次のとおりである。

CO-P

ヽ

(VID)

GAG ί R: GAG、、、」： R ³ 、- f

j GAG GAG

R'

(18) (式中、 R ¹ 、 R ³ 、 n及び P ¹ は前述と同じ）

本方法で原料として用いるこ とのできるダリ コサミノ グリ カ ン （ 1 8 ) は、 ヒアノレロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ドロ ィ チン硫酸 A、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 C、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 D、 コ ン ドロィチ ン硫酸 E、 コ ン ドロ イ チ ン硫酸 K、 コ ン ド ロ イ チンポ リ硫酸、 デルマタ ン硫酸、 へバリ ン又はへパラ ン 硫酸である。

燐脂質としては、 前記還元末端限定酸化法において例示し たものを用いることができる。

縮合剤としては、 ジェチルカルボジイ ミ ド、 ジイ ソプロ ビ ル力ルボジィ ミ ド、 メ チルプロ ピル力ノレボジイ ミ ド、 ジシク 口へキ シルカルポジィ ミ ド、 へキサメ チ レ ンカルボジイ ミ ド、 へブタ ンメ チ レ ンカルボジイ ミ ド、 1 ーェチルー 3 — （ 3 — ジメ チルァ ミ ノ プロビル） カルボジイ ミ ド、 1 ー シク ロへキ シルー 3 — ( 2 —モルホ リ ノ エチル） カルボジィ ミ ドメ ソ 一 P — トルエ ンスルホネー ト、 1 一 t —ブチル一 3 — ( 3 — ジ メ チルァ ミ ノ プロ ピル） カルボジィ ミ ド、 ジフヱニルカルボ ジイ ミ ド、 4 , 4 ' —ジニ ト ロ ジフエニルカルボジイ ミ ド、 ジー P — ト リ ル力ルボジイ ミ ド又はビス （ ト リ メ チノレシ リ ル） 力ルボジイ ミ ド等を挙げることができる。

縮合剤の使用量は、 燐脂質又は脂質の使用モル量の 1 0〜 1 0 0倍モル量を用いるこ とができ る。

溶媒としては、 ジメ チルホルムア ミ ド、 ク π 口 ホル厶又は 該镕媒の混合液等を用いるこ とができ る。

反応温度は、 4〜 6 0て、 好ましく は 1 5〜 2 5てで行う。 上記縮合剤使用法で製造される化合物を表 Dに具体的に示 す

表 D

化合物 構 造 式 原料グリ コ サ ミ ノ グリ カ ン 可

硫はィヒ

酸デァチ

ル Aルン

コ ン ドロイ チ

、、マ Π ン硫酸 D タ ncン

酸あンン

硫 、しド

酸 Π口く

はィン チ Eド 又ロン コ ン ドロイ チン硫酸 K

Vffi - (4) - a コ ン ドロ イ チ ンボ リ 石 Ull

GAG

D (つづき ）

コ ン ドロ イ チ ンポリ硫 G

0S0₃H - (4)-c コ ン ドロ イ チ ンポリ硫

-(5)-a へノヽ 'リ ン、 へ ノヾラ ン硫 i

- (5)-b へノヽ。リ ン、 へノヽ。ラ On I

OSO3H グリ コサミ ノ グリ カ ン活性化法

この方法は、 上記縮合剤使用法と同様に、 ゥ α ン酸のカル ボキシ基を活性化し、 燐脂質の 1級ァ ミ ノ基と結合させるこ とにより、 烧脂質結合グリ コサミ ノ ダリ カ ン （Μ ) を製造す る方法である。

本方法で使用することのできるグリ コサ ミ ノ グリ カ ン及び 燐脂質としては、 上記縮合剤使用法と同様のものを用いるこ とができる。

カルボキ シ基を活性化する方法としては、 ペプチ ド化学の 分野でよ く 知られている方法に従って、 グリ コサ ミ ノ グリ カ ンのゥ 口 ン酸部分のかルボキシ基を活性化する こ とができる。 活性化する方法としては、 例えばグリ コサ ミ ノ ダリ カ ンに Ν — ヒ ド ロキ シスク シ ンィ ミ ド、 p —二 ト ロ フエノ ール、 Ν — ヒ ドロキ シベンゾ ト リ ァゾール、 Ν — ヒ ドロキシビペリ ジ ン、 Ν — ヒ ド ロキ シスク シ ンア ミ ド、 2 , 4 , 5 — ト リ ク ロ 口フ ノ 一ル等を縮合剤の存在下で反応させて、 該カルボキ シ基を活性エステルに変えるこ とができ る。

ゥ口 ン酸部分のカルボキシ基はそのア ミ ン塩と して反応さ せる こ と もでき る。

ァ ミ ン塩のァ ミ ンの種類としては、 ト リ （ η —プチル） ァ ミ ン、 ト リ ェチルァ ミ ン、 ピリ ジ ン等を挙げるこ とができ る。 反応溶媒としては、 ジメ チルホルムア ミ ド、 ビ リ ジ ン、 ジ メ チルスルホキ シ ド等を用いることができる。

縮合剤としては、 1 —ェチル— 3 — （ジメ チルァ ミ ノ プ ピル） 一 シルボジィ ミ ド、 ジシク ロへキ シルカルボジィ ミ ド 等を用いるこ とができる。

反応温度は、 0 〜 6 0 て、 好ま し く は 4 〜 2 0 ΐで行う。 上記方法によつて得られた、 カルボキシ基が活性化された グリ コサ ミ ノ グリ 力 ンを燐脂質と反応させれば、 一般式 （VI ) の燐脂質結合グリ コサミ ノ ダリ カ ンを得るこ とができる。

上記反応は、 ジメ チルホルムア ミ ド、 ク ロ 口 ホルム又は該 溶媒の混合液の溶液において、 上記活性化グリ コサ ミ ノ グリ カ ンと燐脂質とを 0 〜 9 0 'C、 好ま し く は 2 5 〜 6 O 'Cで反 応させる。

また、 本発明の一般式 （ I ) 〜 （珊） で示される燐脂質又 は脂質結合グリ コサミ ノ グリ カ ンの燐脂質又は脂質の含有量 ― は、 0. 0 0 5 〜 5 0 %、 好ま し く は 2 〜 1 0 %の範囲である。 以上に述べた各種の方法で製造される燐脂質又は脂質結合 グリ コサ ミ ノ グリ カ ンの分離、 精製方法としては、 反応液に 酢酸ナ ト リ ウム飽和エタノ一ルを加えて生じた沈殺物を濾取 するこ とで未反応の燐脂質又は脂質を除き、 さ らに該沈殺物 を疎水ク ロマ ト に負荷し、 酢酸ア ンモニゥ ム、 塩化ァンモニ ゥム、 塩化ナ ト リ ゥム等の塩の水溶液で洗浄する こ とで未反 応のグリ コサ ミ ノ グリ カ ンを除まする。 この後、 該疎水ク ロ マ トに吸着した燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ンを 1 0 〜 5 0 %メ タ ノ ール水溶液で溶出する方法で行う こ とが できる。

本発明の癌転移抑制剤は、 前記一般式 （ I ) 〜 （ 1 ) で表 わされる璘脂質又は脂質結合グリ コサ ミノ ダリ カ ン又はその 薬学的に許容される塩を、 固体又は液体の医薬用担体又は希 釈剤、 即ち、 賦形剤、 安定剤等の添加剤とともに舍む製剤と するこ とが好ましい。

燐脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ンの塩は水溶性で あるため、 注射剤として用いる場合に最適である。 該医薬製 剤において、 前記有効成分の担体成分に対する割合は、 1〜 9 0重量％の間で変動させうる。

剤形及び投与形態としては、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 錠剤、 カブセル剤、 丸剤もしく は液剤等の剤形にして、 又は原末の まま経口投与してもよいし、 注射剤として静脈内投与、 筋肉 内投与又は皮下投与してもよい。 また、 坐剤、 軟膏剤、 バッ プ剤、 貼付剤、 リ ニメ ン ト剤、 ローショ ン剤等の剤形にして、 外用剤として用いることもできる。 また、 注射用の粉末にし て、 用時調製して使用してもよい。

経口、 経腸、 非経口もしく は局所投与に適した医薬用の有 機又は無機の、 固体又は液体の担体もしく は希釈剤を、 本発 明の燐脂質又は脂質結合グリ コサミノダリカ ン又はその塩を 舍む医薬製剤を調製するために用いることができる。 水、 ゼ ラチ ン、 乳糖、 デンプン、 ステア リ ン酸マグネシウ ム、 タル ク、 動植物油脂、 ベンジルアルコール、 ガム、 ポ リ アルキ レ ングリ コール、 石油樹脂、 やし油、 ラノ リ ン又は医薬に用い られる他のキ ャ リ アー （担体） は全て、 本発明品の担体とし て用いることができる。 また、 安定剤、 湿潤剤、 乳化剤や、 浸透圧を変えたり、 製剤の適切な P Hを維持するための塩類を 補助製剤として適宜用いることもできる。

顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 錠剤又はカ プセル剤の場合には、 該医薬製剤は本発明品を 5〜 8 0重量％舍有していることが 好ましく、 液剤の場合には、 1 〜 3 0重量％舍有レているこ とが好ましい。 また、 注射剤の場合は 1 〜 1 0重量％、 坐剤 の場合は 1 〜 5 0重量％が好ましい。 局所投与用である軟膏 剤又はパップ剤等として用いる場合は、 0. 1〜 1 0重量％舍 有していることが好ましい。

臨床投与量は、 経口投与の場合、 成人に対し有効成分とし て、 1 日量 1 0 0〜 2 0 0

を内服することが好ましぃが、 年令、 症状により適宜増減することも可能である。 前記 1 日 量を 1 回、 又は適当な間隔をおいて 2 もしく は 3回に分けて 投与することが好ましい。

また、 注射剤として用いる場合には、 成人に対し有効成分 として、 1回量 1 0〜 1 0 0 0 mgを投与することが好まし く、 軟膏剤又はパップ剤等として用いる場合は、 前記舍有割合の ものを適当量患部に塗布することが好ましい。

本有効成分の急性毒性は、 4週齢の Sic-ddy 系雌雄マウ ス を 1週間の予備飼育の後、 雄 2 3〜 3 0 g、 雌 2 0〜 2 5 g の体重になつた時点で、 後記 HA1- PPEADP (ロ ッ ト番号 3 0 0 ) 、 CS(S3)- PPEADP (口 ッ ト番号 3 0 2 — 2 ) を投与し、 投与方法 は、 最も毒性の症状がでやすい腹腔内投与で、 検体は各々 5 %の濃度になるように局方生理食塩液に溶解して投与した。

雌雄それぞれ 1群 1 0匹を用いた。 その結果 L D ₅。はいずれ も 2 0 0 0 tngZkg以上であり、 医薬として安全性に問題はな い。

〔図面の簡単な説明〕 第 1図〜第 6図は、 燐脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ンの疎水ク ロマ トグラフィーを示し、 第 1図は実施例 1 一 ( 2 ) — 1 ) の目的物、 第 2図は実施例 2 — （ 2 ) — 1 ) の 目的物、 第 3図は実施例 2 — ( 3 ) の目的物、 第 4図は実施 例 4 一 ( 1 ) の目的物、 第 5図は実施例 5 - ( 1 ) の目的物、 第 6図は実施例 5 — （ 2 ) の目的物である。

〔発明を実施するための最良の形態〕 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、 本発 明は、 実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、 焼脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ンのリ ン舍量、 燐脂質又は脂質舍量、 及びグリ コサ ミ ノ グリカ ン. （ G A G ) 含量は、 以下の方法で測定した。

測定法

1 . G A Gの定量

( 1 ) ゥロ ン酸を舍有する G A G ： 力ルバゾール硫酸法

(Bitter-Muir法) ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 4, 330-334 (1962)

( 2 ) ガラク トースを舍有するケラタ ン硫酸又はケラタ ン ポリ硫酸 ： ア ンスロ ン法 Biochem.J. 50, 298-303 (1952)

2. 燐脂質又は脂質の定量

( 1 ) リ ンの定量： モ リ ブデンブルー法、 無機応用比色分 折、 4、 共立出版株式会社、 編集代表 平野四蔵 130〜135 頁

( 2 ) 脂肪酸の定量 ： 1 0〜 5 0 mgの G A G -脂質を 1 0 の 1 N—水酸化ナ ト リ ゥム水溶液に溶解し、 i 0 0 て ） 時間加水分解する。 反応液を 1 N—塩酸水溶液で酸性にした 後、 クロ口ホルムで抽出し、 ク ロ口ホルム相を水で洗浄する。 脱水ボウ硝で乾燥後、 減圧下で溶媒を除去、 残渣に 3 %塩酸 (ガス） 含有メタノ一ルを加え、 封管中、 1 0 0でで 3時間 加熱後、 石油エーテルで 3回抽出する。 石油エーテルを 3回 水洗し、 混入した塩酸を除き、 脱水ポゥ硝で乾燥後、 減圧濃 縮し、 次の （ G L C ) 用試料とする。

気相液相ク口マ トグラフィー （ G L C )

G C— 1 5 Α (島津製作所）

充塡剤 ： PEG-HT 5 % Uniport HP 60/80

ガスク 口工業㈱

運転条件 ：試料気化室温度 3 5 0て

力ラム温度 ： 1 9 0〜 2 0 0て

カラム ： 3 <5 x 2 m

流速 ： N ₂ 4 5 Zmin

実施例 1

還元末端限定酸化法による燐脂質結合グリ コサミノグリ カ ンの製造

( 1 ) 還元末端限定酸化グリ コサミ ノ グリ カ ンの製造

1 ) 還元末端残基開環ヒアルロ ン酸の製造

ヒアルロ ン酸 （鶏冠由来、 MW 1万 ： H A 1 ) 2 0 0 0 mg を 2 0 0 «ώの 0.0 5 Mホゥ酸塩緩衝液 （ΡΗ8. 3 ) に溶解し、 1 8 2 mgの水素化ホウ酸ナ ト リ ゥムを加えて室温で 5時間反 応させた。 酢酸で PH4.5にしてエタノールを加えて生成物を 沈殺させ、 次いで生成物をエタノ ールで洗浄した。 これによ り ロ ッ ト番号 1 0 0 の還元末端残基開環ヒアル口 ン酸 （ R —

H A 1 ) を 1 8 0 0 mg得た。

2 ) 還元末端限定酸化ヒアルロ ン酸の製造

1 7 0 0 mgの R— H A 1 (ロ ッ ト番号 1 0 0 ) を 2 5 0 ^ の 4 0 mMイ ミダゾール （pH6. 5 ) に溶解し、 O 'Cで 139.96mg の過ヨウ素酸ナ ト リ ウムを加え、 1 時間反応させた。 反応液 にエタノ ールを加えて生成物を沈殺させ、 次いでエタノ ール で洗浄した。 これにより ロ ッ ト番号 2 0 0 の還元末端限定酸 化ヒアルロ ン酸 （ 0— H A ) 1 6 0 0 mgを得た。

3 ) 他のグリ コ サ ミ ノ ダ リ カ ンの還元末端限定酸化物

( 0— G A G ) の製造

ヒアルロ ン酸 （鶏冠由来、 MW 5万 ： H A 5 , W 1 5万 ： H A 1 5 ) 、

コ ン ドロイ チン （コ ン ドロイ チン硫酸 Aから酸性メ タノ ー ル溶液で脱硫酸したもの、 MW 1. 5万 ： C H ) 、

コ ン ドロイ チン硫酸 C (鲛軟骨由来、 MW 1 万 ： C S ( S 1 ) 、 MW 3万 ： C S ( S 3 ) 、 MW 6万 ： C S ( S 6 ) ) . コ ン ドロ イ チン硫酸 A (鲛軟骨由来、 MW 3万 ： C S ( W)) デルマタ ン硫酸 （豚皮由来、 MW 1. 5万 ： D S ) 、

へパリ ン （豚小腸由来、 M W 1. 5万 ： H e p ) 、

へバラ ン硫酸 （牛腎由来、 MW 1. 5万 ： H S )

ケラタ ン硫酸 （牛角膜由来、 MW 1. 5万 ： K S )

を原料と して上記の 1 ) に準じて表 Eの条件で還元未端残基 開環グリ コサ ミ ノ グリ カ ン （ R — G A G ) を製造した _e ひき つづき、 上記の 2 ) の方法に準じて表 Fの条件で還元末端限 定酸化グリ コサ ミノ ダリ カ ン （ 0— GA G ) を製造した 表 E σ ッ 卜 ¾ Κτ

J5 l rifOr as ϋ忏 Η . 重

GAG/NaBH₄ (mg/nig) (mgj η π C i

Ιΰυ- ό Κ- ΠΜΟ n

100-ύ R- ΗΑΙο 1UUU/ b，dl b 1

1 1 ΠU 11 し Η 1 l ΠU ΠU ΠU/ /Cbo . Λ Ub O oCbT ί

102 R-CS (S1 O O Λ

1000/94. oo

102-2 R-CSCS3) 1000/31.50 897

102-3 R-CS(S6) 1000/15.76 869

103 R-CS(W) 1000/31.50 823

104 R-DS 150/ 9.46 130

105 R-Hep 1000/63.05 772

106 R-HS 40/ 2.55 35

107 R-KS 20/ 1,28 14.6

表 F

( 2 ) L— ( or—ホスフ ァ チジル） エタ ノ ールァ ミ ン ' ジバ ルミ ト イ ル結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン （GAG-PPEADP) の製造

1 ) L— ( α—ホスフ ァ チジル） エタ ノ ールァ ミ ン ' ジパ ルミ ト イ ル結合ヒアルロ ン酸の製造

0

II

CH₂-0-C - (CH_Z) , ₄CH

0

II

COOH CHzOH COOH 0 HC-O-C- (CH_Z) , ₄CI1₃

— 0 0 /CHZNH-CHE-CHZ-O P O-CHZ

H ' 0

'卞 - レ OH OH CHzOH OH

HO レ HO

OH NHAc OH NHAc

ノ 及び oo

0

- (CHz) I ₄CH CH_Z) , ₄CH₃

n ： 平均 2 4

1 0 0 0 mgのロ ッ ト番号 2 0 0 の 0 — H Aを 0. 0 5 Μ リ ン 酸塩緩衝液 （ρΗ 7. 0 ) 1 0 0 に溶解し、 ク ロ πホルム ： メ タノ ール = 2 ： 1 の溶媒で （ 1 mgノ ) に溶解した L — ( 一ホス フ ァ チジル） エタ ノ ールァ ミ ン . ジパル ミ ト イ ル (PPEADP)を 6 9. 2 加えた。 さ らに、 メ タノ ールを加えて均 一な溶液にして、 5 0 てで 1 時間反応させ、 その後、 シァノ 水素化ホウ素ナ ト リ ゥムを 2 5 mgを加えた。 2時間 5 0 てて 反応させ、 減圧下濃縮し、 酢酸飽和のエタノ ールを 5倍量加 えて生じた沈殺を濾取した。 沈毅を 0. 3 M塩化ア ンモニゥ ム 塩で溶解し、 疎水ク 口マ トカ ラ ム (TSKgelフヱニル ト ヨパ一 ノレ 6 5 0 M 4 0 0 mi ) に吸着し、 充分に 0. 3 M塩化ア ンモ 二ゥム水溶液で洗浄し、 3 0 %メ タノ 一ル水溶液で溶出した。 素通り及び洗浄画分に未反応の H A 1 が溶出され、 3 0 %メ タノ 一ル水溶液の画分に目的とする本品が溶出した。 3 0 % メ タノ ール水溶液溶出画分を減圧下濃縮し、 透析で脱塩後、 谏結乾燥して口 ッ ト番号 3 0 0 の白色粉末を得た。

収量 ： 4 0 mg

PPEADP含量 ： 6. 2 1 %

ヒアルロ ン酸舍量 ： 6 2. 1 2 %

疎水ク ロマ トグラム ： 第 1 図

疎水ク ロ マ トグラ フ ィ 一の条件

カ ラ ム ： TSK gel フエニル 5 ( 7. δ X 7. 5 cm ) 溶媒 ： 0 〜 5分 0. 3 M塩化ア ンモ ニ ゥ ム水溶^

5 〜 5 0分 3 0 %メ タ ノ ール水溶液

溶出速度 ： ϋ. δ /分 圧 ： 7 kg/ 0. 5 cm²

分画容量 ： 1 管

検出 ： U U Z 20 n m

検体 ： 1 0 0 ( 1 mg/ O. 3 M塩化アンモニゥム水溶 液）

2 ) その他の燐脂質結合グリ コサミノグリ カ ンの製造 表 Fに示した◦一 G A Gと PPEADPと表 Gに示した条件で、 上記 （ 2 ) — 1 ) の方法に準じて燐脂質結合グリ コサミノ グ リ 力 ンを製造した。 得られた生成物の分析値を表 Gに示した。

表 G

実施例 2

還元末端ラク ト ン化法による燐脂質結合グリ コサ ミノ グリ 力 ンの製造

( 1 ) 還元末端酸化グリ コサ ミ ノ グリ カ ンの製造

1 ) 還元末端酸化ヒアルロ ン酸の製造

5 0 0 mgのヒアルロ ン酸 （鶏冠由来、 MW 1万 ： H A 1 ) を水 1 0 に溶解し、 0, 1 Mヨウ素のメ タノ ール溶液 5 を 加えて室温で 6時間反応させた。 その後、 反応液に 0. 1 N水 酸化カ リ ウムを約 5 fflfi加えて遊離のョゥ素の色を消失させた。 この溶液に酢酸力 リ ゥム飽和エタノ一ルを加えて生じた沈瘵 を濾取し、 充分にエタ ノ ールで洗浄し、 減圧乾燥した。

これによ.り ロ ッ ト番号 4 0 0の還元末端酸化ヒアルロ ン酸

4 2 3 mgを得た。

ソモジ一ネルソ ン法による還元糖の有無 ： 無

2 ) 還元末端ラク ト ンヒアルロ ン酸の製造

4 0 0 mgのロ ッ ト番号 4 0 0 の還元末端酸化ヒアルロ ン酸 を水 1 0 に溶解し、 強酸性ィ ォ ン交換樹脂 （Dowex 50(H⁺ ))

5 0 fflfiに 1時間を要して通過させ、 還元末端ラク ト ンヒアル ロ ン酸 3 9 0 mgを含む水溶液を得た。

ソモ ジ一ネルソ ン法による還元糖の有無 ： 無

上記の水溶液を ト リ 一 η—ブチルア ミ ンで中和し、 凍結乾 燥して還元未端ラク ト ンヒ アルロ ン酸の ト リ 一 η—プチルァ ミ ン塩 （ロ ッ ト番号 5 0 0 ) 4 0 0 mgを得た。

3 ) 他の還元末端ラ ク ト ングリ コサ ミ ノ グリ カ ンの製造方 法 コ ン ドロ イ チ ン （ M W 1. 5万 ： C H ) 、

コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 C ( M W 1万 ： C S ( S 1 ) 、 M W 3 万 ： C S ( S 3 ) 及び MW 6万 ： C S ( S 6 ) 、

デルマタ ン硫酸 （ M W 1.5万 ： D S ) 、

へパリ ン （ M W 1.5万 ： H e p ) 、 及び

へパラ ン硫酸 （MW 1.5万 ： H S )

を原料と して、 上記 1 ) に準じて表 Hの条件で還元末端酸化 グリ コサ ミ ノ グリ カ ンを製造した。 ひきつづき、 上記 2 ) に 準じて表 I の条件で還元末端ラク ト ングリ コサ ミノ グリ カ ン を製造した。

表 H

CD

ソ モ ジ一ネルソ ン ： ソ モジ一ネルソ ン法によ る還元糖の有無 （有は I 、 無は で示す）

表 I

en

ソ モ ジ一ネルソ ン ： ソ モ ジ一ネルソ ン法によ る還元糖の有無 （有は t 、 無は で示す）

( 2 ) L 一 （ α—ホスファ チジル） エタ ノ ールァ ミ ン ' ジパ ルミ ト イ ル結合グリ コ サ ミ ノ ダリ カ ン （GAG - PPEADP) の製造

1 ) L 一 （ 一ホスフ ァ チジル） エタノ ールァ ミ ン ' ジパ ノレミ トイ ル結合ヒアルロ ン酸の製造

0

II

CH₂ 0 C- (CH_Z) , ₄CH_;

(CH_Z) , ₄CH:

及び -j

H

n ： 平均 2 5

4 0 0 mgのロ ッ ト番号 5 0 0 の還元末端ラク ト ンヒアルロ ン酸を 2 0 0 ^のジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 2 7. 6 mg の PPEADPのクロ口ホルム溶液を加えて、 7 0てで 2時間反応 させ、 ク ロ口ホルムを留去し、 過剰の酢酸ナ ト リ ウム水溶液 を加えてナ ト リ ウム塩にしてから、 酢酸ナ ト リ ウム飽和エタ ノ ールを加えた。 生じた沈澱を濾取し、 0. 3 M酢酸ア ンモニ ゥム溶液に溶解し、 実施例 1 ( 2 ) に準じて精製し、 口 ッ ト 番号 6 0 0 の目的物 3 6 mgを得た。

リ ン舍量 ： 0. 3 0 %

PPEADP舍量： 6. 4 4 %

ヒアルロ ン酸舍量 ： 8 2. 3 7 %

疎水ク 口マ トグラム ： 第 2図

測定条件は前記と同じ。

2 ) その他の L— ( or—ホスファ チジル） エタノールア ミ ン ' ジバルミ トイル結合グリ コサミノ ダリ カ ンの製造

表 I に示した還元末端ラク ト ングリ コサミノ ダリ カンと PPEADPとを表 Jに示した条件で、 上記 （ 2 ) — 1 ) の方法に 準じて製造した。 得られた生成物の分圻値を表 Kに示した。

表 J ロ ッ ト番可 生 成 物 反応条件 (mg/mg)

1 GAG-ラ ク ト ン /PPEADP

U υ i f 1K1-P Γ ΓPF fAiilJlPr 700/32.3

602 CS(S1)-PPEADP 800/55.4 _t

602- 2 CS(S3) -PPEADP 400/ 9.26

602- 3 CS(S6) -PPEADP 800/ 9.00

604 DS-PPEADP 90/ 4.15 ！

605 Hep - PPEADP 800/36.91

606 HS-PPEADP 70/ 3.31

！

表 κ

( 3 ) '1;ス フ ァ チ ジルセ リ ンステア ィ ルパル ミ ト イ ノレ結合コ ン ド ィ チ ン硫酸 Cの製造 お 0-G (Cllz) , ₄C!I: o

-j 、び o

o Π

、ノ δ δ

4 0 O mgのロ ッ ト番号 5 0 0 — 2 の還元末端ラク ト ンコ ン ド ロ イ チ ン硫酸 Cを 2 0 0 のジメ チルホルムア ミ ドに溶解 し、 9 mgのホス フ ァ チジルセ リ ンステア レー ト ノヽ 'ルミ テ一 ト のク ロ 口ホルム溶液を加えて、 7 0 てで 2時間反応させた。 ク ロ 口ホルムを留去し、 過剰の酢酸ナ ト リ ゥム水溶液を加え てナ ト リ ウム塩にしてから、 酢酸ナ ト リ ウ ム飽和エタ ノ ール を加えて生じた沈殺を濾取した。 沈殺を 0. 3 M塩化ア ンモ ニ ゥ ム溶液で溶解し、 実施例 1 一 （ 2 ) に準じて処理した。 二 れによ り ロ ッ ト番号 7 0 0 — 2 のホス フ ァ チ ジルセ リ ン ス テ

10 ァ ロ イ ルパルミ ト イ ル結合コ ン ドロイ チン硫酸 Cを 2 0. 8 mg 得た。

リ ン舍量 ： 0. 1 0 %

コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 C含量 ： 8 6. 1 5 %

疎水ク 口マ トグラム ： 第 3図

測定条件は前記と同し。

実施例 3

還元末端ァ ミ ン法による燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グ リ 力 ンの製造

( 1 ) 還元末端ァ ミ ノ ーグリ コサ ミ ノ ダリ カ ンの製造 0 1 ) 還元末端ァ ミ ノ ーコ ン ドロイ チ ン硫酸 C (CS(S3))の製 l O O mgのロ ッ ト番号 2 0 2 - 2 の還元末端限定酸化コ ン ド ロ イ チン硫酸 Cを 5 0 の 0. 0 5 M リ ン酸塩緩衝液 （pH 7. 0 ) に溶解し、 2 4 mgのエチ レ ンジァ ミ ン塩酸塩を加えて 5 O 'Cで 3 0分反応させた。 その後、 2 0 mgのシァノ水素化 ホウ素ナ ト リ ウムを加えて 5 0 てで 2時間反応させた。 反応 液に酢酸ナ ト リ ウム飽和エタノールを加えて生じた沈殺を濾 取した。 沈澱を水に溶解し、 透析により脱塩し、 5 の DEAE—ィォン交換樹脂に吸着させ、 0. 1 M 〜 1 Mの食塩水溶 液のグラジェン トで溶出した。 0. 4 M食塩濃度で還元末端ァ ミノ ーコ ン ドロイチン硫酸 Cが溶出され、 遊離のコ ン ドロイ チン硫酸 Cは 0. 7 5 M食塩濃度で溶出した。 0. 4 M食塩溶液 画分を透折により脱塩し、 凍結乾燥し、 ロ ッ ト番号 8 0 2 - 2の還元末端ァ ミノ ー コ ン ドロイ チン硫酸 C 8 0 mgを得た。

2 ) 還元末端ァ ミ ノ — へパリ ン（H ep) の製造

上記の方法に準じて、 1 0 0 mgのロ ッ ト番号 2 0 5還元末 端限定酸化へパリ ンを使用し、 ロ ッ ト番号 8 0 5 の還元末端 ア ミ ノ ー へパリ ン 7 7 mgを得た。

( 2 ) 脂質のコハク酸誘導体の製造

1 ) グリ セ ロールモノ ステア レー ト のコハク酸エステルの

1 0. 7 4 g のグリ セ 口一ルモノ ステア レー ト を 3 ffl2のピリ ジ ンを舍む 2 0 0 のベンゼンに溶解し、 6 g の無水コハク 酸を加えて 6時間還流した。 反応液を減圧濃縮し、 生じた沈 澱をアセ ト ンで再結晶し、 グリ セ ロールモノ ステア レー ト の コハク酸エステル 8. 2 gを得た。

2 ) グリ セロールモノ ステアレー ト のコハク酸エステルを N — ヒ ドロキ シコ ハク酸ィ ミ ドによる活性エステルの製造 上記 1 ) のエステル 8 gをベンゼンに溶解して、 2 g の N ー ヒ ド α キ シコ ハク酸ィ ミ ドを加え、 1 0 g のジ シク ロへキ シルカルボジィ ミ ドを加えて室温で 2 0時間反応させた。 反 応液を滅圧濃縮して、 沈殺をベンゼン Zn—へキサンで再結 晶し、 ロ ッ ト番号 G M S - 1 の標記活性エステル 7. 4 gを得 た。

( 3 ) グリ セロールモノ ステアレー ト結合コ ン ドロイ チン硫 酸 Cの製造

(CH₂) , ₆CH₃

n ： 平均 6 0

8 O mgのロ ッ ト番号 8 0 2 — 2 の還元末端ア ミ ノ ーコ ン ド ロ イ チ ン硫酸 Cを 5 の水に溶解し、 6. 9 5 nigのロ ッ ト番号 G M S - 1 の活性エステルのジメ チルホルムアミ ド溶液を加 えて室温で 2 0時間反応させた。 反応液に酔酸ナ ト リ ウム飽 和エタノールを加え、 生じた沈殺を濾取した。 沈殺を 0. 3 M 塩化ァ ンモニゥム水溶液に溶解し、 実施例 1 一 （ 2 ) — 1 ) に準じて精製し、 ロ ッ ト番号 9 0 2 — 2の標記目的物 3 8 mg を得た。

ステア リ ン酸舍量 ： 0. 8 6 %

コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 C舍量 ： 9 8. 2 %

( 4 ) 燐脂質のコハク酸誘導体の製造

1 ) リ ゾレシチ ンのコハク酸エステルの製造

次式のリ ゾレシチン

CHEOCO- (CH₂) , ₄-CH₃

I

HOCH I

CHz0P0(0-)0CH_ZCH_ZN⁺ (CH₃) ₃

4 9 5 mgをクロ口ホルム 2 0 0 JRfiに溶解し、 無水コハク酸

1 0 0 mgと 7 9 mgのピリ ジンを加えて室温で 2 0時間反応さ せた。 反応液を減圧濃縮し、 生じた沈殺をァセ ト ンで再結晶 し、 リ ゾレシチ ンのコハク酸エステルを得た。

2 ) リ ゾレシチ ンのコハク酸エステルの N — ヒ ドロキ シコ ハク酸ィ ミ ドによ る活性エステルの製造

上記エステル 2 8 8. 5 mgをジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、

5 7. 5 mgの N — ヒ ドロキ シコ ハク酸ィ ミ ドと 1 0 3 mgのジ シ ク ロへキ シルカルポジィ ミ ドを加えて室温で 2 0時間反 さ せた。 沈殺を除去し、 上記活性エステルのジメ チルホルムァ ミ ドに溶液を得た。

( 5 ) リゾレシチ ン結合グリ コ サ ミ ノ ダリ カ ンの製造

1 ) リ ゾレシチン結合コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Cの製造

ゝ、

0 n ： 平均 6 0

上記 （ 4 ) — 2 ) で得られた上記活性化エステルのジメ チル ホルムァ ミ ド溶液に口 ッ ト番号 8 0 2 - 2の還元末端ァミノ —コ ン ドロイチン硫酸 C 1 gの水溶液を加えて室温で 2 0時 間反応させた。 精製は実施例 1 に準じて、 疎水クロマ トダラ フ ィ 一で精製した。

収量 ： 0. 5 2 g

リ ン舍量 ： 0. 1 0 5 %

リ ゾレシチン舍量 ： 1. 9 6 %

コ ン ドロイチン硫酸舍量 ： 9 8. 0 4 %

ィォゥ含量 ： 5. 7 8 %

( 6 ) グリ セ ロールジステアレー ト結合コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Cの製造

上記 （ 1 ) 一 1 ) で得られたロ ッ ト番号 8 0 2 — 2の還元 末端アミノ ーコ ンドロ イ チ ン硫酸 Cと上記 （ 2 ) — 2 ) と同 様な方法で得られたグリ セロールジステアレー トのコハク酸 エステルの活性エステル （ロ ッ ト番号 G D S— 2 ) とを、 上記 （ 3 ) に準じて反応させ、 精製して、 ロ ッ ト番号 9 0 4 の標記化合物 2 7 mgを得た。

実施例 4

縮合剤使用法による燐脂質結合グリ コサミノ グリカ ンの製 造

( 1 ) L— ( o —ホスフ ァ チジル） エタノ ールァ ミ ン ' ジパ ルミ ト イ ル結合コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Cの製造 0

II

CH_Z- 0- C- (CH_Z) , ₄CH;

0

O=P-0-CH₂

0

CHz

CH_Z

—j

OH

m I n ： 平均 6 0

4 0 0 iagのコ ン ドロイチン硫酸 C (CSCS3)) の ト リ ー n— プチルァ ミ ン塩を 1 0 0 fflfiのジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 6. 9 2 mgの PPEADPのクロロホルム溶液を加えた。 更に、 38.4 mgの 1 —ェチル一 3 — ( 3 —ジメ チルァ ミノ プロ ビル） カル ボジィ ミ ド塩酸塩を加えて室温で 2 0時間反応させた。 反応 液を減圧下で濃縮し、 過剰の齚酸ナ ト リ ゥム水溶液を加えて ナ ト リ ウム塩にした。 この水溶液にエタノールを加えて生じ た沈殺を濾取した。 沈澱を 0. 3 M塩化ァンモニゥム水溶液に 溶解し、 実施例 1 — ( 2 ) — 1 ) に準じて精製し、 ロ ッ ト番 号 1 0 0 2 — 2の標記化合物を 6 3 mg得た。

リ ン舍量 ： 0. 0 9 9 %

PPEADP舍量： 2. 2 5 %

コ ン ドロイチン硫酸 C舍量 ： 9 6. 6 1 %

疎水ク口マ トグラム ：第 4図

測定条件は前記と同じ

( 2 ) 他の L— ( α—ホスファチジル） エタノールァ ミ ン ' ジバルミ トイル結合グリ コサミノ グリ カ ン （GAG-PPEADP) の 製造

各種のグリ コサミノグリカンと PPEADPとを表 Lに示した条 件で上記 （ 1 ) の方法に準じて燐脂質結合グリ コサミノダリ カ ンを製造した。 得られた生成物の分折値を表 Mに示した。 in

実施例 5

グリ コサミノ グリカン活性化法による燐脂質結合グリ コサ ミ ノグリ カ ンの製造

( 1 ) L — ( or —ホスフ ァ チジル） エタ ノ ールァ ミ ン ' ジパ ルミ トイル結合コ ン ドロイチン硫酸 Cの製造

0

II

CHz-O-C- (CH_Z) , ₄CH:

0

II

OH HC-O-C- (CH_Z) , CH₃ 0=P-0-CH₂

0

I

CH_Z CH_Z

N-H

m ト n ： 平均 6 0

4 0 0 mgのコ ン ドロイチン硫酸 C ( CS (S3) ) の ト リ ー n — プチルァ ミ ン塩を 3 0 O ffl£の D M Fに溶解し、 9. 9 mgの N - ヒ ドロキシスク シンィ ミ ドと 2 0. 6 mgのジシク ロへキシルカ ボジィ ミ ドを加えて室温で 2 0時間反応させた。 反応液に過 剰の酢酸ナ ト リ ゥム水溶液を加えてナ ト リ ウム塩にしてから にエタノールを加えて生じた沈毅を濾取した。 即座に 3 の水で溶解し、 6. 9 2 mgの PPEADPのクロロホルム溶液を加え て、 更にジメ チルホルムアミ ドを加えて均一な溶液とした。 室温で 6時間反応させ、 反応液を滅圧濃縮して、 酢酸飽和の エタノールを加えた。 生じた沈殺を 0. 3 M酢酸アンモニゥム 水溶液に溶解し、 実施例 1 — ( 2 ) — 1 ) に準じて精製し、 口 ッ ト番号 1 1 0 2 — 2の標記の目的物を 2 9. 7 mg得た。 リ ン舍量 ： 0. 1 0 0 %

PPEADP舍量 ： 2. 1 6 %

コ ン ドロイ チン硫酸 C舍量 ： 9 5. 9 8 %

疎水ク 口マ トグラム ：第 5図

測定条件は前記と同じ

( 2 ) L— （ α —ホフファチジル） エタノールア ミ ン · ジバ ルミ トイル結合コ ン ドロイ チンポリ硫酸の製造

1 gのコ ン ドロイチンポリ硫酸 （ CSP ( H ) )の ト リ — η —ブ チルァ ミ ン塩 （ィォゥ舍量 1 3. 0 %、 分子量 10000 ) を 5 0 ίδ£のジメ チルホルムア ミ ドに溶解し、 1 Ί 7 0 mgの N —ヒ ド ロキシスク シンィ ミ ドと 3 1 8 mgのジシク ロへキシルカルボ ジィ ミ ドを加えて 4てで一晩反応させた。 反応液に 1 0 諕の 水を加えて室温で 1 5分間反応させ、 生じた沈殺を除去した 後、 こ の溶液に 6 9. 2 «gのホスファチジルェタノ ールァ ミ ン • ジバルミ ト ィ ル （PPEADP) のクロロホルム溶液を加えて室 温で 6時間反応させた。 反応液を減圧濃縮し、 酢酸ナ ト リ ゥ ム飽和のヱタノ一ルを加えて生じた沈殺を集めた。 沈毅を 0. 3 Mの酢酸ァ ンモニゥム水溶液に溶解し、 実施例 1 一（2 ) — 1 ) に準じて精製し、 ロ ッ ト番号 1 1 0 8の標記の目的物 6 7 mgを得た。

リ ン含量 ： 0. 2 9 1 %

PPEADP舍量 ： 6. 5 %

コ ン ドロ イ チ ンポ リ硫酸舍量 ： 9 2. 8 %

ィォゥ舍量 ： 1 2. 0 5 %

疎水クロマ トグラム ： 第 6図

測定条件は前記と同じ

実施例 6

フ ィ ブロネク チンを予め塗布した培養皿に塗布した燔脂質 又は脂質結合ダリ コサミノ ダリ カ ンの B H K細胞の接着に対 する効果

9 6穴培養皿を 5 g / 1 ゥ シ血漿フイブロネク チ ン 100 £ で塗布した後、 洗浄し、 実施例 1 〜 5 で得た各種燐脂質 又は脂質結合グリ コサミノ ダリカ ン 1 0 0 // £ノ穴を表 Nに 示す各濃度で塗布した。

別に、 1 0 O n*径の培養皿に培養した B H K細胞 （新生ハ ムスター臂細胞） を 0. 1 の濃度の ト リ プシ ン溶液 5 i を加え、 3 7 てで 5分間処理した。 次いで、 l mg / の大豆 ト リ ブシ ンイ ンヒ ビター溶液 5 を加え、 ト リ プシンを不活 性化した後、 遊離した細胞を遠心により集めた。 細胞は 2回 洗浄後、 1 あたり 1 X 1 0 ⁵ 個細胞となるように単一細胞 懸濁液とした。

得られた単一細胞懸濁液 1 0 0 〃 £ ( 1 X 1 0 ⁴ 個細胞） を、 上記フイブロネクチンと燐脂質又は脂質結合グリ コサミ ノ グリ カンを塗布した培養皿に加え、 3 7 'Cで一時間処理し た。 接着しなかった細胞を洗浄した後、 接着した細胞を 2 % ホルムアルデヒ ドで固定し、 直接位相差顕微鏡で観察して、 その細胞数を力ゥン ト した。

結果を表 Nに示す。 表 Nは、 各濃度における細胞接着の 変動を示す。 値は 3回ないし 4回の測定の平均を示し、 誤差 (標準偏差） もあわせて表した。

なおそれぞれの遊離グリ コサミノ グリカンおよび未結合の 脂質のみでは高濃度にしても全く細胞接着阻害効果を示さな かった。

表 N

口ッ ト番号 3 0 2 - 3 6 0 0 6 0 1 6 0 2

( μ /mi) (CS(S6)- PPEADP) (HA1-PPEADP) (CH-PPEADP) (CS(SD- PPEADP)

0.1

0.2 87.4%土 8.8%

0.5 89.1%士 15.3%

1

X 0. OA 5.2%

2 60.9%土 4.5% 85.0%土 2.6% 33.5%土 6.9%

5 23.0%土 0.2% 73.5¾± 1.3¾ 81.6%土 6.0% 24.4%土 0.5%

10 1.3%土 1.2% 72.5¾± 8.8% 80.5%土 6.9% 12.8%土 2.4%

20 29.9 土 2.6% 63.8¾± 2.7¾ 3.2%土 1.1%

50 3.6¾± 0.5% 65.5%± 10.0%

100 0.8%土 0.1% 44.4 ± 4.2%

200 0·3¾土 0.2¾ 33.8%土 3.8%

500

表 N (つづき）

+1

00

00 ロツ ト番号 1 0 0 5

( μ e /m&) (Hep-PPEADP)

0.1

0.2

0.5

1

2

5

10

20 95.3%土 0.9%

50 75.0%士 12. U

100

200 45. 土 1.0¾

500

実施例 7

各種培養細胞の細胞接着物質に対する燐脂質又は脂質結合 グリ コサ ミ ノ ダリカ ンの接着阻害効果

実施例 1 〜 5で得た燐脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ンについて、 B H K 2 1細胞 （新生ハムスター腎細胞） 、 C E F (二ヮ ト リ胚線維芽細胞） 、 B 1 6 F 1 0 (高転移性 マウスメ ラノ ーマ細胞） 、 C H O (チャイ ニーズハムスター 卵巣細胞） 、 及び b a E C (ゥ シ大動脈内皮細胞） の各種細 胞群に対しての、 フ イ ブロネクチン （ F N ) 、 ラ ミ ニン （ L N ) 、 I型コ ラーゲン （ C 0 1 1 ) 及びビ ト ロネクチン （ V N ) による接着に対する阻害効果を検討した。

各 5 n gZetfのゥ シ血漿フイブロネクチン、 マウス E H S 腫瘍細胞由来ラ ミノ ン、 ラ ッ ト腿由来 I型コラーゲン、 及び ゥ シ血清ビ トロネクチンをそれぞれ 9 6穴培養皿に塗布し、 実施例 6 と同様にして、 実施例 1 〜 5で得た燐脂質又は脂質 結合グリ コサミノ グリカンを塗布した後、 それぞれ B H K21 細胞、 C E F細胞、 B 1 6 F 1 0細胞、 C H O細胞、 及び b a E C細胞の単一細胞懸濁液 1 0 0 ( 1 X 1 0⁴ 個細 胞） を加え細胞接着の変動を見た。 対照として燐脂質又は脂 質結合グリ コサミノ グリ カ ンを添加せず、 接着物質のみの細 胞接着を 1 0 0 %と した。 結果を表 0に示す。

なお、 表 0中で相対接着細胞数として、 全 く あるいは殆 ど細胞接着しなかった場合 （ 0〜 1 0 %未満） を一、 1 0〜 3 0 %未満を十 、 3 0〜 5 0 %未満を +十 、 5 0〜 7 0 %未 満を +十 十、 7 0〜 9 0 %未満を +十 十 十、 そして 90〜： 100 %の細胞が接着した場合を + + + + +と半定量的に表した。 ) 他の燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリ力ンの細胞接着阻害の結果

表 0

細胞 z接着物質 (5 μ g/id)

口ッ ト番号 用量 μ z/mi) BHK21 し ur B16F10 CHO

Γ n V VN 1 Γ n · VW FN し N FN U

300(HA1-PPEADP) 10 +

100

30KCH-PPEADP) 10 + + + + + ++++

100 + + + +++

302(CS(Sl)-PPBftDP) 10 + + + + ++

100 + +

302-2 (CS (S3) -PPEADP) 10

100 CD

302-3 (CS(S6)-PPEADP) 10 + + ++ ++ + O

100 + +

303 (CS(W) -PPEADP) 10

100

304 (DS- PPEADP) 10 + + +

100

305 (Hep- PPEADP) 10 + + + + +

100 + + +

οζ卜 ι τ 6

LO LO

〇

表 0 (つづき）

細胞 接着物質 （5 / g/ )

ロッ ト 用量 d g /id) BHK21 CEF B16F10 CHO

FN VN FN VN FN LN FN LN

HA1 100 +++++ + +++ + + ++++ +++++

HA5 100 +++++ ++++ + +++++ ++++ +

HA15 100 +++++ + ++++ 4.4.4.4.4.

CH 100 +++++ + ++++ +++++ +++++

CS(S1) 100 +++++ +++++ + + +++++

CS(S3) 100 +++++ +++++ +++++ +++++

CS(S6) 100 +++++ + + + + + +++++ +++++

CS(W) 100 +++++ ++ + + + +++++ +++++

DS 100 + + + H + + +++ +++++ +++++

Hep 100 + + + + + + + +++ +++++ CO

HS 100 + + + + + +++++ +++++ +++++

100 + + + + + +++++ +++++ + H + +

cps(n) 100 + + +++ ++++ + +++++ +++++

PPEADP 100 + +++ + ++++ + +++++ +++++

実施例 8

血管内皮培養細胞の細胞外マ ト リ ッ ク スにおける高転移性 癌細胞の接着に対する燔脂質結合コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Cの抑 制効果

マウス由来血管内皮細胞を 2 4穴の I型コラーゲンでコー ト した培養皿で集密状態になるまで培養し、 細胞単層に 0. 5

% ト リ ト ン X — 1 0 0で室温 3 0分間処理し、 破壌された細 胞片をダルベ ッ コ の緩衝液 （Dulbecco's PBS ( + ))で洗浄し て内皮細胞の細胞外マ ト リ ッ ク スを得た。

一方、 1 0 0 »«柽の培養皿に培養したマウス由来高転移性 癌細胞 B 1 6 F 1 0 に 5 «£ ト リ プシン溶液 （ 0. 1 ng/i PBS (一））を加え、 3 7 'Cで 5分間処理した。 次いで、 大豆 ト リ プシン阻害剤 5 «« ( 1 Mg/ g ) を加え、 ト リプシンを不活性 化した後、 遊離した細胞を遠心により集めた。 さらに細胞を リ ン酸塩緩衝液 （ P B S (—））で 2回洗浄後、 1 あたり 2

X 1 0 ⁵ 個の細胞数になるように単一細胞懸濁液 （Hanks'

BSS-20mM HEPES、 H 7. 4 ) を調製した。

ロ ッ ト番号 6 0 2 — 2 (CS(S3)-PPEADP)の燐脂質桔合コ ン ドロ イ チ ン硫酸 Cど、 B 1 6 F 1 0 の単一細胞懸濁液 5 0 0 u £ ( 1 X 1 0 ⁵ 偭細胞） を、 前述した細胞外マ ト リ ッ クス を調製した 2 4穴培養皿に加え、 3 7 てで 1時間、 5 %炭酸 ガス培養器内で静置した。

上清を静かに集め、 さ らにハンクス緩衝液で 1回穏やかに 洗った。 その上情と洗液を合わせて、 細胞外マ ト リ ッ ク スに 接着しなかった細胞としてその細胞数をコールターカウ ンタ 一 （コールター * エレク トロニクス社製） で計数した。 対照 としてロ ッ ト番号 6 0 2 - 2 (CS(S3)-PPEADP)を舍まない緩 衝液のみのもの （無添加） と、 遊離のコン ドロイチン硫酸 C を添加したものを比較した。

細胞の接着率は、 最初に添加した全細胞数から計数した非 接着細胞数を引き、 その値を全細胞数で割った値を百分率で 表した。 その結果を表 Pに示す。

表 P 添 加 量 接 着 率 サ ン ブ ル

(%) 無添加 一 8 2. 8 %

遊離コ ン ドロイチン硫酸 C 5 0 g 8 2. 6 %

602-2(CS(S3)-PPEADP) 5 0 g 5 0.7 %

この結果から、 本発明の燐脂質結合グリコサミノダリカ ン は血管内皮細胞の細胞外マ ト リ ックスに対する高転移性癌細 胞の接着を抑制することがわかる。 遊離のコ ン ドロイ チン硫 酸 Cではそのような作用は全く認められなかった。

実施例 9

高転移性癌細胞の転移に対する燒脂質結合コ ン ドロイチン 硫酸 Cの抑制効果

1 0 0 mm径の培養皿に培養したマウス由来高転移性癌細胞 B 1 6 F 1 0 に 5 の E D T A溶液 （ 0. 0 2 %ノ P B S (—）） を ¾Πえ 3 7 てで 5分処理後、 ビペッティ ングにより遊離させ た細胞を遠心により集めた。 さ らに細胞をリ ン酸塩緩衝液 ( P B S (一））で 2 回洗浄後、 あたり に 1 0 ⁶ 個の細胞 を舍む単一細胞懸濁液を調製した。 この懸濁液 0. 1 mfi ( 1 0 個の細胞） と α ッ ト番号 6 0 2 - 2 (CS(S3)- PPEADP)の燐脂 質結合コ ン ドロイ チ ン硫酸 Cの P B S溶液 0. 1 ( 0. 1 mgま たは 1 mgまたは 5 mgを舍む） を混合液 C 5 7 B L / 6 マウ ス に尾静脈より投与した。 投与 2週間後に開胸して肺表面に転 移したメ ラ ノ 一マのコ ロニー数を数えた。 対照と して、 ロ ン ト番号 6 0 2 — 2 (CS(S3)- PPEADP)を含まない緩衝液のみの もの （無添加） と、 遊離のコ ン ドロイ チン硫酸 Cを添加した ものを比較した。

一匹当たりの肺表面に転移したコ ロニー数を計測した結果 を表 Qに示す。

表 Q 投与量 コ ロ ニー数 サ ン プ ル

(mg/匹） (個/匹) 無添加 4 9. 9 ± 3 2. 3 遊離コ ン ドロイ チ ン硫酸 c 5 mg 2 4. 0 土 8. 0

602-2(CS(S3)-PPEADP) 0， 1 mg 4 7. 2 ± 2 8. 1

1 mg 2 2. 0 ± 1 4. 8

5 mg 4. 0 ± 3. 5

燐脂質結合コ ン ド口 イ チ ン硫酸 Cは投与量を増やすにつれ より癌の転移を抑制した。 この結果から、 本発明の璘脂質 結合グリ コサミノグリカンは高転移性癌細胞の転移を抑制す ることが分かる。 遊離のコ ン ドロイチン硫酸 Cでも少し転移 を抑制するが、 燐脂質結合コ ン ドロイチン硫酸 C程の抑制は みせなかった （ P < 0. 0 0 1 ) 。

〔産業上の利用可能性〕

本発明品の燐脂質又は脂質結合ダリ コサミノグリカ ン又は その塩は、 細胞接着阻害作用を有し、 かつ毒性もないので癌 転移抑制剤として有用である。

Claims

1 . 一般式

GAG

請

を有する燐脂質結合ダリ コ サ ミ ノ グリ カ ン又はその塩。

求

上記式中、 P ¹ は 1 級ア ミ 9ノ基を有する燐脂質を示し、 の 9

( 1 ) G A Gがヒ アルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ド ロ イ チ ン硫酸 A、 Cも し く は E、 デルマタ ン硫酸、 へパ リ ンから 西

還元性末端のダルク 口 ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 或いはデルマタ ン硫酸から還元性末端のィ ズ 口 ン酸部分を除いたグリ コサミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ²は C00H基を示し、 R ² は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ン硫酸 K又はコ ン ド ロ イ チ ンボ リ硫酸から還元性末端のダルク 口 ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置 換し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す。

( 3 ) G A Gがケラタ ン硫酸から還元性末端のガラク ト 一ス 部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3 位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ² は CH_z0H基を示し、 li OH基を示す。

( 4 ) G A Gがケラタ ンポリ硫酸から還元性末端のガラ ク ！ ース部分を除いたグリ コサミノ グリ カ ン残基のとき、 G A G は 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

2. 一般式

を有する燐脂質結合グリ コサミノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級アミノ基を有する燐脂質を示し、

( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸又はコ ン ドロ イ チ ンから還元性 末端のへキソサミ ン部分を除いたグリ コサミノ ダリ カ ン残基 のとき、 R ¹ は NHC0CH₃基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロ イ チン硫酸 Aもしく は K、 コ ン ドロ ィ チ ンポ リ硫酸又はデルマタ ン硫酸から還元性末端のへキソ サ ミ ン部分を除いたグリ コ サ ミ ノダリ カ ン残基のとき、 R ' は NHC0CH₃基を示し、 R ³ は OS0₃H基を示す。

( 3 ) G A Gがケラタン硫酸又はケラタンボリ硫酸から還元 性末端のガラク トース部分を除いたグリ コサミノ グリ カ ン残 基のとき、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示す。

般式

を有する燐脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ' は 1 級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示し、 G A Gはケラタ ン硫酸又はケラタ ンポリ硫酸から還元性末端の ガラク トース部分を除いたグリ コサ ミノ グリ カ ン残基を示す

4. 一般式

0H

ヽ C0-P ( IV)

GAG を有する燐脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級ア ミ ノ基を有する燐脂質を示し、 ( 1 ) G A Gがヒ アルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ドロ イ チン硫酸 A、 Cも し く は E、 デルマタ ン硫酸、 へパリ ン又は へバラ ン硫酸から還元性末端のダルク 口 ン酸部分を除いたグ リ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 或いはデルマタ ン硫酸から 還元性末端のィ ズロ ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ 力 ン 残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は 0H基を示し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロイ チン硫酸 Dから還元性末端のグル ク ロ ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 或 はへバリ ン又はへパラ ン硫酸から還元性末端のィ ズロ ン酸部 分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位 に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は 0S0₃H基を示し、 R は COOH基を示し、 R ³ は OH基を示す。

( 3 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ン硫酸 Kから還元性末端のグル ク 口ン酸部分を除いたグリ コサミノダリカ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は 0H基を示し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す。

( 4 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ンポ リ硫酸から還元性末端のグ ルク ロ ン酸部分を除いたグリ コサミノ ダリ カ ン残基のとき、

G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ および R ³ の少 な く とも一つは 0S0₃H基を示し、 他は 0H基を示し、 R ² は C00H基を示す。

( 5 ) G A Gがケラタン硫酸から還元性末端のガラク ト一ス 部分を除いたグリ コサミノダリ カン残基のとき、 G A Gは 3 位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示し、 R ² は CH₂0H基を示す。

( 6 ) G A Gがケラタ ンボリ硫酸から還元性末端のガラク —ス部分を除いたグリ コサミノダリ カ ン残基のとき、 GA G は 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示し、 R ² は CH_z0S0₃H基を示す。

( 7 ) G A Gがヒアルロ ン酸又はコ ン ドロ イ チンから還元性 末端のへキソサミ ン部分を除いたグリ コサミノ ダリ カ ン残基 のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ は

NHCOCHs 基を示し、 R ² は CH₂0H基を示し、 R ³ は 0H基を示 す。

( 8 ) G A Gがコ ン ド αィ チ ン硫酸 Aも し く は K又はデルマ タ ン硫酸から還元性末端のへキソサミ ン部分を除いたグリ コ サ ミノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に 置換し、 R ¹ は NHC0CH₃基を示し、 R は CH₂0H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す。

( 9 ) G A Gがコ ン ド ロ イ チ ン硫酸 C又は Dから還元性末端 のへキソサ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミノ ダリ カ ン残基のと き、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ は NHC0CH₃ 基を示し、 R ² は CH_z0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 1 0 ) G A Gがコ ン ドロイ チ ン硫酸 Eから還元性末端のへ キソサ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ は NHC0CH₃基を 示し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す。

( 1 1 ) G A Gがコ ン ドロイ チンボリ硫酸から還元性末端の へキサ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ¹ は NHC0CH₃基を 示し、 R ^z は CH_z0H基で R ³ は 0S0₃H基を示すか、 又は R ² は CH₂0S0₃H基で R ³ は 0H基もし く は 0S0₃H基を示す。

( 1 2 ) G A Gがへバリ ンから還元性末端のへキ ソサ ミ ン部 分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位 に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は NHS0₃H基を示し、 R ² は CH20S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 1 3 ) G A Gがへバラ ン硫酸から還元性末端のへキ ソサ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ' は NHC0CH₃基又は NHS0₃H 基を示し、 R ² は CH₂0H基で R ³ は 0S0₃H基を示すか、 又は R ² は CH₂0S0₃H基で R ³ は 0H基もし く は 0S0₃H基を示す。 ( 1 4 ) G A Gがケラタ ン硫酸又はケラタンボリ硫酸から還 元性末端のへキソ サ ミ ン部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ 力 ン 残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ¹ は、 NHCOCHs 基を示し、 R ² は CH₂0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を 示す。 R

2

5. —般式

を有する燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその 上記式中、 P ² は燐脂質又は脂質を示し、 mは 1〜 8を示 し、 は 1 〜 ： 1 0 を示す。

( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チ ン、 コ ン ドロ イ チン硫酸 A、 Cも し く は E、 デルマタ ン硫酸、 へパリ ン又は へパラ ン硫酸から還元性末端のダルク 口 ン酸部分を除いたグ リ コ サ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 或いはデルマタ ン硫酸から 還元性末端のィ ズロ ン酸部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン 残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置換し、 R ²は CO OH基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロ イ チ ン硫酸 K又はコ ン ド ロ イ チ ンポ リ硫酸から還元性末端のダルク 口 ン酸部分を除いたグリ コサ ミノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 4位に、 R ³ は 3位に置 換し、 R ² は C00H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す。

( 3 ) G A Gがケラタ ン硫酸から還元性末端のガラク トース 部分を除いたグリ コサ ミ ノ グリ カ ン残基のとき、 G A Gは 3 位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ^z は CH₂0H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

( 4 ) G A Gがケラタ ンポリ硫酸から還元性末端のガラ ク ト —ス部分を除いたグリ コサ ミ ノ ダリ カ ン残基のとき、 G A G は 3位に、 R ³ は 4位に置換し、 R ² は CH_z0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。

6. 一般式

R を有する焼脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその 上記式中、 G A G、 R ¹ 及び R ³ は請求項 2 に記載と同じ であり、 m、 £及び P ² は請求項 5 に記載と同じである。 7. 一般式

1 ひ 6

を有する璘脂質又は脂質結合グリ コサミノ グリ カ ン又はその 上記式中、 G A G、 R ¹ 、 R ² 及び R ³ は請求項 4 に記載 と同じであり、 m、 £及び P ² は請求項 5に記載と同じであ る。

8. 一般式

を有する燐脂質結合グリ コサミノグリ カン又はその塩。

上記式中、 P ¹ は 1級ア ミノ基を有する燐脂質を示し、 n はグリ コサ ミノ ダリ カ ンに存在するカルボキシル基の数以下 を示し、

( 1 ) G A Gがヒアルロ ン酸、 コ ン ドロ イ チン、 コ ン ドロイ チン硫酸 A、 Cもし く は E、 又はデルマタ ン硫酸のグリ コサ ミ ノグリ カ ン鎖のとき、 R ¹ 及び R ³ は 0H基を示す。

( 2 ) G A Gがコ ン ドロイ チン硫酸 Dのグリ コサ ミノ グリ カ ン鎮のとき、 R ¹ は 0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H基を示す。 ( 3 ) G A Gがコ ン ドロイ チン硫酸 Kのグリ コサ ミ ノ グリ カ ン鎮のとき、 は 0H基を示し、 R ³ は 0S0₃H基を示す c ( 4 ) G A Gがコ ン ドロイ チンポリ硫酸のグリ コサミ ノ グリ カ ン鎖のとき、 R ¹ 及び R ³ の少な く とも 1つは 0S0₃H基を 示し、 他は OH基を示す。

( δ ) G A Gがへバリ ン又はへパラ ン硫酸のグリ コサ ミ ノ グ リ カ ン鎖のとき、 R ¹ は 0H基又は 0S0₃H基を示し、 R ³ は 0H 基を示す。

9. 下記一般式 （ 1 — 1 ) で表されるグリ コサ ミ ノ グリ カ ンの還元性末端を還元、 開裂させて、 下記一般式 （ I — 2 ) で表される還元体を得、 この還元体を酸化する ことにより 、 下記一般式 （ I 一 3 ) で表される酸化体を得、 該酸化体のァ ルデヒ ド基と燐脂質が有する 1級ァ ミノ基とを反応させる こ とを特徴とする請求項 1記載の一般式 （ I ) で表される憐脂 質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩の製造方法。

H.0H ( I 一 1 )

OH

CHEOH ( I 一 2 )

GAG

OH

R^Z

(

OH

( I - 3 )

ノ-ヽ L CHO

GAG

δ (式中、 G A G、 R ² 、 R ³ は、 請求項 1記載のものと同義 である。 ）

1 0. 下記一般式 （ H — 1 ) で表されるグリ コサミノグリ 力 ンの還元性末端を還元、 開裂させて、 下記一般式 （ Π — 2 ) で表される還元体を得、 この還元体を酸化するこ とにより、 下記一般式 （ Π — 3 ) で表される酸化体を得、 該酸化体のァ ルデヒ ド基と燐脂質が有する 1級ァミノ基とを反応させるこ とを特徴とする請求項 2記載の一般式 （ Π ) で表される燐脂 質結合グリ コサミノ グリ カン又はその塩の製造方法。

0 zOH ( Π - 3 )

G

R' (式中、 G A G、 R ¹ 、 R ³ は、 請求項 2記載のものと同義 である。 Rは、 0H又は 0S0₃H基である。 )

1 1 . 請求項 1 0記載の一般式 （ Π — 2 ) で表される還元 体を酸化する こ とにより、 下記一般式 （ 1 1 ) で表される酸 化体を得、 該酸化体のアルデヒ ド基と烧脂 Sが有する 1 級ァ ミ ノ基とを反応させる こ とを特徴とする請求項 3記載の一般 式 （ Π ) で表される燐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ 力 ン又：ょそ の塩の製造方法。

0【 Ηϋ

卜: ( 1 1 )

"~ CH0

GAG

(式中、 G A Gは、 請求項 3記載のものと同義である。 ）

1 2. 下記一般式 （ 1 2 ) で表されるグリ コサ ミ ノ グリ 力 ンの還元性未端を酸化、 開裂させて、 下記一般式 （ 1 3 ) で 表される酸化体を得、 この酸化体から下記一般式 （ 〗 4 ) で 表される ラ ク ト ンを得、 このラ ク ト ンと燐脂質が有する 1 級 ァ ミノ基とを反応させるこ とを特徴とする請求項 4記載の一 般式 （ IV ) で表される憐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ 力 ン又 その塩の製造方法。

R²

R .

\、

=0

GAG

R i、 \

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ² 、 R ³ は、 請求項 4記載のもの

4

と同義である。 Aは、 アルカ リ金属を表す。 ）

1 3. 請求項 9記載の一般式 （ I 一 3 ) で表されるアルデ ヒ ド化合物をアルキ レンジア ミ ンと反応させて、 下記一般式 ( 1 5 ) の誘導体を得、 一方、 燐脂質または脂質とジカルボ ン酸またはジカルボン酸の無水物とを反応させて、 カルボキ シル基をもつ焼脂質または脂質誘導体を得、 一般式 （ 1 5 ) の誘導体の 1級ア ミノ基と焼脂質または脂質誘導体が有する 力ルボキ シル基とを反応させることを特徴とする請求項 5記 載の一般式 （V) で表される癀脂質または脂質結合グリ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩の製造方法。

(式中、 G A G、 R ² 、 R ³ 、 mは、 請求項 5記載のものと 同義である。 ）

1 . 請求項 1 0記載の一般式 （ Π — 3 ) で表されるァル デヒ ド化合物をアルキ レンジァ ミ ンと反応させて、 下記一般 式 （ 1 6 ) の誘導体を得、 一方、 燐脂質または脂質とジカル ボン酸またはジカルボン酸の無水物とを反応させて、 カルボ キ シル基をもつ燐脂質または脂質誘導体を得、 一般式（ 1 6 ) の誘導体の 1級ア ミ ノ基と燔脂質または脂質誘導体が有する カルボキ シル基とを反応させる こ とを特徴とする請求項 6記 載の一般式 （VI) で表される燐脂質又は脂質結合ダリ コサ ：:、 ノ グリ 力 ン又はその塩の製造方法。

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ³ 、 mは請求項 6記載のものと同 義である。 ）

1 5. 請求項 1 2記載の一般式 （ 1 4 ) で表される ラ ク I ン化合物をア ルキ レ ン ジ ァ ミ ン と反応さ せ て . 下記

( 1 7 ) の誘導体を得、 一方、 憐脂質または脂質とジカルォ ン酸またはジカルボン酸の無水物とを反応させて、 カルボキ シ ル基をもつ燐脂質または脂質誘導体を得、 一般式 （ 1 7 ) © 誘導体の 1級ァ ミ ノ基と燐脂質または脂質誘導体が有する力 ルボキ シル基とを反応させるこ とを特徴とする請求項 7記載 の一般式 （VI) で表される憐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩の製造方法。 ヽ

R²

ノ 0H

( 1 7 )

C0-NH- (CH₂)_m-NH;

GAG

R¹

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ² 、 R ³ 、 mは請求項 7記載のも のと同義である。 ）

1 6. 下記一般式 （ 1 8 ) で表されるグリ コサ ミ ノ グリ 力 ンのカルボキ シル基と焼脂質が有する 1級ァ ミ ノ基とを縮合 剤の存在下に反応させる ことを特徴とする請求項 8記載の一 般式 （H) で表される燐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又は その塩の製造方法。

上式中、 G A G、 R ¹ 、 R ³ 、 nは請求項 8記載のものと同 義である。 ）

1 7. 下記一般式 （ 1 8 ) で表されるグリ コサ ミ ノ グリ カ ンのカルボキ シル基を活性化し、 こ の活性化カルボキ シル基 と烧脂質が有する 1級ァ ミ ノ基とを反応させるこ とを特徴と する請求項 8記載の一般式 （\1) で表される燐脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩の製造方法。

(式中、 G A G、 R ¹ 、 R ³ 、 nは請求項 8記載のものと同 義である。 ）

1 8. 燐脂質又は脂質結合グリ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその 塩を舍有する癌転移抑制剤。

1 9. 請求項 1記載の一般式 （ I ) を有する璘脂質結合グ リ コサ ミ ノ ダリ カ ン又はその塩を舍有する瘙転移抑制剤 c

2 0. 請求項 2記載の一般式 （ D ) を有する燐脂質結合グ リ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩を舍有する癌転移抑制剤。

2 1. 請求項 3記載の一般式 （ m ) を有する燐脂質結合グ リ コサ ミ ノ グリ カ ン又はその塩を舍有する癌転移抑制剤。

2 2. 請求項 4記載の一般式 （ IV) を有する燐脂質結合 " リ コサ ミ ノ グリ 力 ン又はその塩を舍有する癌転移抑制剤。 ■ -- 0 PCT/JP91/00995

1 1 4

2 3. 請求項 5記載の一般式 （V ) を有する燐脂質又は脂 質結合グリ コサミノグリカン又はその塩を舍有する癌転移抑 制剤。

2 4. 請求項 6記載の一般式 （VI) を有する燐脂質又は脂 質結合グリ コサミノ グリ カ ン又はその塩を舍有する瘙転移抑 制剤。

2 5. 請求項 7記載の一般式 （VI) を有する焼脂質又は脂 質結合グリ コサミノ グリ カン又はその塩を舍有する瘙転移抑 制剤。

2 6. 請求項 8記載の一般式 （U) を有する燐脂質結合グ リ コサミノ グリ カン又はその塩を舍有する癌転移抑制剤。