JPH04235922A - グリコサミノグリカン誘導体を用いた細胞接着阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、Ａｒｇ−　Ｇｌｙ−　
Ａｓｐのトリペプチドを必須単位として有するグリコサ
ミノグリカン誘導体あるいはその塩を有効成分とする、
動物細胞の接着阻害剤に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】フィブロネクチンは細胞−細胞外基質の
接着に関与するタンパク質であり、血小板凝集やガン転
移にも関与していると考えられている。これらの相互作
用は一連の細胞表面のレセプターにより仲介され、フィ
ブロネクチンは分子量約２５万の巨大分子であるにもか
かわらず、これらのレセプターがそのＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐ　配列を特異的に認識することが明らかにされ、
レセプターとの相互作用に重要なものであることが報告
されている（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３０９　
巻、３０頁、１９８４年）。以来、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ　配列を有するオリゴあるいはポリペプチドを用い
る研究が成されている。 【０００３】例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　配列を
有する種々の鎖状および環状のオリゴペプチドを用いて
血小板凝集を阻害する方法（高分子学会予稿集（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，　Ｊａｐａｎ）、第３
８巻、３１４９頁、１９８９年、特開平２−１７４７９
７号）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　配列を有するペプチ
ドを細胞移動抑制剤として用いる方法（特開平２−４７
１６号）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　を固定化したＰＭ
ＭＡ膜を細胞接着膜として用いる方法（　高分子学会予
稿集（ＰｏｌｙｍｅｒＰｒｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ
）　、第３７巻、７０５　頁、１９８８年）が報告され
ている。さらに、ポリマーにＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　
を必須構成単位とするペプチドを共有結合させ動物細胞
培養基体、生体複合人工臓器用基体として用いる方法（
特開平１ー３０９６８２号、特開平１ー３０５９６０号
）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ　配列（配列番号
１）を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護剤と
して用いる方法が開示されている（特開昭６４ー６２１
７　号）。また、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　配列を有す
るオリゴペプチドあるいはその繰り返し構造を有するポ
リペプチドを用いて、ガン転移を抑制する方法が知られ
ている（（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．
）　、第１１巻、２３　頁、１９８９　年、同誌、第１
１巻、２２６頁、１９８９　年、（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ．）　第６０巻、７２２頁、１９８９　
年）。 【０００４】動物の粘液から得られたアミノ糖を含む一
群の多糖は、その起源である粘液（ｍｕｃｕｓ　）にち
なんでｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ムコ多
糖）と名づけられたが、アミノ糖とウロン酸を含む基本
骨格が明かとなり、化学的系統名であるグリコサミノグ
リカンという名称が広く使用されるようになった。硫酸
基を含むものと含まないものが知られており、ヒアルロ
ン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン
硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等が主なものである。ケ
ラタン硫酸はウロン酸を含まず代りにガラクトースを含
む。グリコサミノグリカンは通常は遊離の糖としては存
在せず、生体内で蛋白質と共有結合したプロテオグリカ
ンとして存在し、動物の結合組織の基質や体液に広く分
布している。結合組織のグリコサミノグリカンはケラタ
ン硫酸を除いていずれもアミノ糖とウロン酸との二糖単
位の繰返し構造からなる長い直鎖状の複合多糖で、硫酸
基またはカルボキシル基の存在によって高い負電荷をも
つポリアニオンである。 グリコサミノグリカンは従来から細胞や組織の安定化、
潤滑剤としての役割、電解質の調節、水分の保持に与っ
ていると考えられていたが、最近は様々な生理的な機能
に深く係わっていることが明らかと成っている。従って
、グリコサミノグリカンとコラーゲンの複合体あるいは
グリコサミノグリカンに接着性ペプチドを導入した、火
傷及び創傷治癒促進剤が報告されている。 【０００５】しかし、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　を必須
単位とするオリゴペプチドあるいはその繰返し構造を有
するポリペプチドを導入したグリコサミノグリカン誘導
体を有効成分とする、動物細胞の接着阻害剤及び血小板
の凝集・粘着抑制剤は知られておらず、導入した場合に
はレセプターとの結合能の増強及び血液中での安定化が
期待できる。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
なグリコサミノグリカン誘導体またはその塩を有効成分
とする動物細胞の接着阻害剤を提供することである。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、グリコサミノ
グリカンの側鎖にアミド結合、エステル結合、エーテル
結合、ウレタン結合のいずれかを介し、下記一般式（１
）で表される接着性ペプチドを必須単位として有するグ
リコサミノグリカン誘導体またはその塩を有効成分とす
る動物細胞の接着阻害剤である。 一般式（１） −［Ｒ１］−［ＣＯ］−（［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−［Ｙ］）ｎ　−［Ｚ］−［Ｒ２］−　【０００８
】［　　］は存在するかあるいは存在しなくともよく、
存在する場合はＸ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓ
ｎ，Ｐｒｏから選択されるアミノ酸残基又はペプチド残
基を示し、Ｚは−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。 Ｒ１　、Ｒ２　のいずれか一方は、水素原子又は炭素数
が１〜９の直鎖または分岐のアルキル基、または炭素数
が６〜９のアリ−ル基であり、置換基を有していても良
い。 他方は、水素原子又は炭素数が１〜９の直鎖または分岐
のアルキレン基、または炭素数が６〜９のアリ−レン基
であり、置換基を有していても良い。ｎは１〜５の整数
を示す。置換基としては、カルボニル基、カルボキシル
基、アミノ基、ヒドロキシル基、スルホ基、ハロゲン原
子、アリール基、ニトロ基、シアノ基、不飽和基の２重
結合、３重結合等があげられ、同一鎖に２つ以上有して
いても良い。 【０００９】本発明は、コンドロイチン硫酸、デルマタ
ン硫酸、ヘパラン硫酸及びヒアルロン酸に、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐを必須単位として有する接着性ペプチドを
共有結合してなるグリコサミノグリカン誘導体またはそ
の塩を有効成分とする動物細胞の接着阻害剤である。こ
の動物細胞接着阻害の意味は広い範囲で解釈されるべき
であり、例えば血小板凝集・粘着抑制もこの動物細胞接
着阻害の中に包含される。グリコサミノグリカン誘導体
の分子量は好ましくは２０万以下、特に３０００〜１０
万の範囲で、室温で水溶性であることが好ましい。本発
明に係わる接着性ペプチドに用いられるアミノ酸はＬ体
、Ｄ体どちらでも良いが、好ましくはＬ体である。本発
明のグリコサミノグリカン誘導体の塩として例えば、塩
酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩等の無機酸
との塩や、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリフルオロ
メタンスルホン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との
塩にしても良く、そのような塩への変換は慣用手段で行
なうことができる。 【００１０】ペプチド合成方法としては特に限定しない
が、液相法、固相法、および自動合成装置による合成方
法が挙げられる。これらの合成方法の詳細については、
生化学実験講座“タンパク質の化学ＩＶ”ｐ２０７−４
９５（日本生化学会編、東京化学同人）、“続生化学実
験講座タンパク質の化学（下）”（日本生化学会編、東
京化学同人）、泉屋ら編”ペプチド合成の基礎と実験”
（丸善）に記載されている。また、市販されている合成
ペプチドを利用することも可能である。 【００１１】グリコサミノグリカンと接着性ペプチドの
結合には、臭化シアン、酸アジド、水溶性カルボジイミ
ド等を利用したアミド結合合成方法が挙げられる。本発
明のグリコサミノグリカン誘導体は、細胞接着性蛋白質
のコア配列Ａｒｇ−　Ｇｌｙ−　Ａｓｐを有し、該コア
配列を介して細胞接着性蛋白質と同様の機序で細胞に接
着する。そのため、細胞接着性蛋白のアゴニストまたは
アンタゴニストとして種々の生物活性を示し、免疫調整
作用、創傷治癒作用、毛細血管中で起こる癌細胞による
血小板凝集抑制作用、神経疾患治癒作用などの広範な生
物活性が認められている。 【００１２】従って、本発明のグリコサミノグリカン誘
導体は、そのすくなくとも一種を、場合により慣用の担
体または医薬用助剤とともに、癌転移抑制剤、創傷治癒
剤、免疫調整剤、血小板凝集粘着抑制剤として患者に投
与することが可能である。特に、動物細胞接着阻害剤ま
たは血小板凝集粘着抑制剤としての使用が好ましい。そ
の投与量は、０．２μｇ／ｋｇ〜４００ｍｇ／ｋｇの範
囲で、症状、年齢、体重等に基づいて決定される。 【００１３】本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、
ペプチド系医薬に一般に使用されている投与方法、即ち
非経口投与方法、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下
投与等によって投与するのが好ましい。そのような注射
用製剤を製造する場合、本発明のグリコサミノグリカン
誘導体を例えば、後記実施例で示すようにＰＢＳまたは
生理食塩水に溶解して、注射用製剤としてもよく、ある
いは０．１Ｎ程度の酢酸水等に溶解した後、凍結乾燥製
剤としても良い。この様な製剤には、グリシンやアルブ
ミン等の慣用の安定剤を添加しても良い。さらに、本発
明のグリコサミノグリカン誘導体は、例えばリポソーム
中に包容したマイクロカプセル剤とすれば、経口投与す
ることも可能であり、座剤、舌下錠、点鼻スプレー剤等
の形にすれば、消化菅以外の粘膜からも吸収させること
も可能である。 【００１４】 【実施例】以下実施例により本発明を更に説明するが本
発明はこれに限定されるものではない。 【００１５】製造例１　　　　　　接着性ペプチドの固
相法による合成 Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ方式によるペプチド合成装置を用
いて合成を行なった。αアミノ基の保護にはＢｏｃ基を
用い、樹脂から切出した後分取用ＨＰＬＣ（高速液体ク
ロマトグラフィー）で精製し、単一ピークを示す接着性
合成ペプチドを得た。 【００１６】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表
１　　　　　　　　　　　　　　接着性合成ペプチド名
称　　　　　　　　　　構造式　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　略号　　　　収率
　　　　配列番号ペプチド−１　　Ｈ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−ＯＨ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｒ
ＧＤ　　　　　　３７％　　　　　　−ペプチド−２　
　Ｈ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）２−ＯＨ　　　　　
　　　　　　　　（ＲＧＤ）２　　　　２８％　　　　
　　２ペプチド−３　　Ｈ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
）３−ＯＨ　　　　　　　　　　　　　（ＲＧＤ）３　
　　　１９％　　　　　　３ペプチド−４　　Ｈ−（Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）２−ＯＨ　　　　　　
　　　（ＲＧＤＳ）２　　　２１％　　　　　　４ペプ
チド−５　　Ｈ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）
３−ＯＨ　　　　　　　　　（ＲＧＤＳ）３　　　１１
％　　　　　　５ペプチド−６　　Ｈ−（Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）−ＯＨ　　　Ｇ
ＲＧＤＳＰ　　　２４％　　　　　　６【００１７】製
造例２ ペプチド−７ Ｈ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）−Ｎ
Ｈ２　（配列番号７）ペプチド−７を逐次延長法により
液相法で合成した。 （１）ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　の合成Ｂ
ｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）５９ｇ（０．２ｍｏｌ）をＣＨ２
　Ｃｌ２　　４００ｍｌに溶解しＤＣＣ　　４１．２ｇ
（０．２ｍｏｌ）を氷冷下加えた。この溶液に、Ｇｌｙ
ＮＨ２　・ＨＣｌ　　２２．１ｇをＣＨ２　Ｃｌ２　　
　４００ｍｌに溶かしてから、Ｎ−メチルモリホリン２
０．２ｇで氷冷下中和した溶液を添加した。氷冷下３時
間撹拌してから、さらに室温で終夜撹拌した。沈殿物を
ろ別してから減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨ
ＣＯ３　水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液
の順に洗浄し、Ｎａ２　ＳＯ４　で乾燥してから減圧乾
固して白色粉末５８．３ｇ（収率８３％）を得た。 【００１８】（２）ＢｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（
Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　の合成 ＢｏｃＳｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　　　５６．２ｇ
（０．１６ｍｏｌ）にＴＦＡ／ＣＨ２　Ｃｌ２　＝１／
１　　４００ｍｌを加え室温で１時間撹拌した後、ＴＦ
ＡとＣＨ２　Ｃｌ２　を減圧濃縮した。これを酢酸エチ
ルに溶解しＮａＨＣＯ３　水溶液で中和した後ＮａＣｌ
水溶液で洗浄した。Ｎａ２　ＳＯ４　で乾燥してから酢
酸エチルを減圧留去した。この化合物と、ＢｏｃＡｓｐ
（ＯＢｚｌ）　　５１．７ｇ（０．１６ｍｏｌ）をＣＨ
２　Ｃｌ２　　　８００ｍｌに溶解し、ＤＣＣ　　３３
ｇ（０．１６ｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから
、さらに室温で終夜撹拌した。減圧下ＣＨ２　Ｃｌ２　
を留去してから酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ３　
水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗
浄し、Ｎａ２　ＳＯ４　で乾燥してから減圧乾固して白
色粉末　　７１．２ｇ（収率８０％）を得た。 【００１９】（３）ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓ
ｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　（配列番号８）の合成Ｂ
ｏｃＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２
　　　６６．７ｇ（０．１２ｍｏｌ）にＴＦＡ：ＣＨ２
　Ｃｌ２　＝１：１　　４００ｍｌを加えて室温で１時
間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ２　Ｃｌ２　を減圧濃縮し
た。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ３　水溶液で
中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ２　ＳＯ４
　で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。この化合
物とＢｏｃＧｌｙ　　５１．７ｇ（０．１２ｍｏｌ）を
ＣＨ２　Ｃｌ２　７００ｍｌに溶解し、ＤＣＣ２４．７
ｇ（０．１２ｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから
、さらに室温で終夜撹拌した。ＤＣｕｒｅａをろ別して
から減圧濃縮し酢酸エチルに溶解した。ＮａＨＣＯ３　
水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ水溶液の順に洗
浄し、Ｎａ２　ＳＯ４　で乾燥してから減圧乾固して白
色粉末　　６１．８ｇ（収率８４％）を得た。 【００２０】（４）ＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓ
ｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　の合成
ＢｏｃＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｇｌ
ｙＮＨ２　６１．３ｇ（０．１ｍｍｏｌ）にＴＦＡ：Ｃ
Ｈ２　Ｃｌ２　＝１：１　　４００ｍｌを加えて室温で
１時間撹拌した後、ＴＦＡとＣＨ２　Ｃｌ２　を減圧濃
縮した。これを酢酸エチルに溶解しＮａＨＣＯ３　水溶
液で中和した後ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。Ｎａ２　Ｓ
Ｏ４　で乾燥してから酢酸エチルを減圧留去した。この
化合物とＢｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）　　４５．６ｇ（０．
１ｍｏｌ）をＤＭＦ８００ｍｌに溶解し、ＤＣＣ　　２
２．５ｇ（０．１ｍｏｌ）　　ＨＯＢｔ　　１４ｇ（０
．１ｍｏｌ）を氷冷下加え３時間撹拌してから、さらに
室温で終夜撹拌した。ＤＣｕｒｅａをろ別してから減圧
濃縮し酢酸エチルに溶解した。 ＮａＨＣＯ３　水溶液、１Ｍクエン酸水溶液、ＮａＣｌ
水溶液の順に洗浄し、Ｎａ２　ＳＯ４　で乾燥してから
減圧乾固して白色粉末　　４２．８ｇ（収率４５％）を
得た。 【００２１】（５）ペプチド−７　　保護体の脱保護Ｂ
ｏｃＡｒｇ（Ｍｔｓ）ＧｌｙＡｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｓｅｒ
（Ｂｚｌ）ＧｌｙＮＨ２　　　５ｇ（５．３ｍｍｏｌ）
のＴＦＡ溶液に、１Ｍー　　トリフルオロメタンスルホ
ン酸−チオアニソール−ｍー　クレゾールのＴＦＡ溶液
を氷冷下加えて１時間反応させ、ペプチド側鎖および末
端の保護基の脱保護を行なった。反応液をエーテル中に
投入しオイル状の沈殿物を蒸留水に溶解し酢酸エチルで
洗浄した後、陰イオン交換樹脂カラム（アンバーライト
ＩＲＡ−４００；Ｃｌ型）に通して塩酸塩とし凍結乾燥
した。 白色固体２．１７ｇ（収率８６％）が得られた。（製造
物２） 【００２２】合成例１　　　　　　　　コンドロイチン
硫酸Ａ−ＲＧＤＳの合成 コンドロイチン硫酸Ａ（４−硫酸／６−硫酸＝８０／２
０）（生化学工業製）１．００ｇ（２．０００ｅｑ．）
をｐＨ７．４リン酸バッファー３５ｍｌに溶解し、０℃
に保ちながら水溶性カルボジイミド〔１−エチル−３−
３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド〕３
２９ｍｇ（２．１２ｍｍｏｌ）の５ｍｌリン酸バッファ
ー溶液を加えて、１．５時間反応させた。ついで、１０
ｍｌのリン酸バッファーに溶解した接着性ペプチド　　
ＲＧＤＳ（国産化学工業製）１．００ｇ（２．３１ｍｍ
ｏｌ）を添加し４℃で一晩反応させた。反応溶液を、Ｖ
ｉｓｋｉｎｇ　　ｔｕｂｅに入れイオン交換水、ついで
純水に対して透析し低分子量成分を除いて精製、凍結乾
燥した。収量　　１．０７ｇ　　構造の確認は、ＩＲお
よびアミノ酸分析により行なった。（合成物１）　　以
下の計算式に従いアルギニン残基濃度とグルコサミン濃
度の比よりＲＧＤＳフラグメントの導入率を計算し約１
０％の値を得た。尚、以下の合成例アミノ酸分析の計算
は同様の方法で行なった。 導入率＝［Ａｒｇ］／［グルコサミン］＊１００ＩＲ：
　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　１６５
０ｃｍ−１ 【００２３】合成例２　　　　　　　　コンドロイチン
硫酸Ｃ−ＧＲＧＤＳの合成 コンドロイチン硫酸Ｃ（４−硫酸／６−硫酸＝１０／９
０）１．００ｇ（２．００ｍｍｏｌ）、水溶性カルボジ
イミド３２９ｍｇ（２．１２ｍｍｏｌ）、ＧＲＧＤＳ１
．００ｇ（２．０３ｍｍｏｌ）を用い合成例１と同様に
してＧＲＧＤＳフラグメントを結合させた。　　　　　
　収量　　１．１３ｇ　　　　構造の確認は、ＩＲおよ
びアミノ酸分析により行なった。アミノ酸分析の結果Ｒ
ＧＤＳフラグメントの導入率は約１２％であった。（合
成物２）ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮
振動　　１６４８ｃｍ−１ 【００２４】合成例３　　　　　　　　ヒアルロン酸−
ＲＧＤヒアルロン酸（生化学工業製）０．３０ｇ（０．
７５ｍｅｑ．）をｐＨ７．４リン酸バッファーに溶解し
、０℃に保ちながら水溶性カルボジイミド１１６ｍｇ（
０．７５ｍｍｏｌ）の２．６ｍｌリン酸バッファー溶液
を加えて、１．５時間反応させた。ついで、８ｍｌのリ
ン酸バッファーに溶解したＧＲＧＤＳ４００ｍｇ（０．
８２ｍｍｏｌ）を添加し４℃で一晩反応させた。反応溶
液を、Ｖｉｓｋｉｎｇ　　ｔｕｂｅに入れイオン交換水
、ついで純水に対して透析し低分子量成分を除いて精製
、凍結乾燥した。　　　　収量０．２９ｇ　　　　構造
の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。ア
ミノ酸分析の結果ＲＧＤフラグメントの導入率は約１１
％であった。（合成物３） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６５０ｃｍ−１ 【００２５】合成例４　　　　　　　　コンドロイチン
硫酸Ｃ−（　ＲＧＤ）２ コンドロイチン硫酸Ｃ０．３０ｇ（０．６０ｍｅｑ．）
、水溶性カルボジイミド９３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）
、（ＲＧＤ）２　４００ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）を用
い合成例３と同様にして（ＲＧＤ）２　フラグメントを
共有結合させた。収量　　０．３４ｇ構造の確認は、Ｉ
Ｒおよびアミノ酸分析により行なった。アミノ酸分析の
結果（ＲＧＤ）２　フラグメントの導入率は約１２％で
あった。（導入率＝［Ａｒｇ］／［グルコサミン］／２
＊１００）（合成物４） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６５２ｃｍ−１ 【００２６】合成例５　　　　　　　　ヒアルロン酸−
（ＲＧＤ）３　 ヒアルロン酸０．３０ｇ（０．７５ｍｅｑ．）、水溶性
カルボジイミド１１６ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）、（Ｒ
ＧＤ）３　４００ｍｇ（０．３８ｍｍｏｌ）を用い合成
例３と同様にして（ＲＧＤ）３　フラグメントを共有結
合させた。収量　　０．３６ｇ構造の確認は、ＩＲおよ
びアミノ酸分析により行なった。アミノ酸分析の結果Ｒ
ＧＤＳフラグメントの導入率は約９％であった。（導入
率＝［Ａｒｇ］／［グルコサミン］／３＊１００）（合
成物５） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６５０ｃｍ−１ 【００２７】合成例６　　　　　　　　コンドロイチン
硫酸Ａ−ＲＧＤＳＧ−　ＮＨ２　 コンドロイチン硫酸Ａ０．３０ｇ（０．６０ｍｅｑ．）
、水溶性カルボジイミド９３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）
、製造物２のＲＧＤＳＧ−　ＮＨ２　４００ｍｇ（０．
８２ｍｍｏｌ）を用い合成例３と同様にしてＲＧＤＳＧ
ーＮＨ２　フラグメントを共有結合させた。　　収量　
　０．３６ｇ　　構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分
析により行なった。アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳＧー　
ＮＨ２　フラグメントの導入率は約１４％であった。（
合成物６） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６５３ｃｍ−１ 【００２８】合成例７　　　　　　　　ヒアルロン酸−
ＧＲＧＤＳＰ ヒアルロン酸０．３０ｇ（０．７５ｍｅｑ．）、水溶性
カルボジイミド１１６ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）、ＧＲ
ＧＤＳＰ４００ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）を用い、合成
例３と同様にしてヒアルロン酸−ＧＲＧＤＳＰを合成し
た。　　　　収量０．３３ｇ　　構造の確認は、ＩＲお
よびアミノ酸分析により行なった。アミノ酸分析の結果
ＧＲＧＤＳＰフラグメントの導入率は約１１％であった
。（合成物７） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６５４ｃｍ−１ 【００２９】合成例８　　　　　　　　コンドロイチン
硫酸Ａ−（ＲＧＤＳ）２　 コンドロイチン硫酸Ａ０．３０ｇ（０．６０ｍｅｑ．）
、水溶性カルボジイミド９３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）
、（ＲＧＤＳ）２　４００ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）を
用い、合成例３と同様にしてコンドロイチン硫酸Ａ−（
ＲＧＤＳ）２　を合成した。　　収量０．３７ｇ構造の
確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。アミ
ノ酸分析の結果（ＲＧＤＳ）２　フラグメントの導入率
は約９％であった。（導入率＝［Ａｒｇ］／［グルコサ
ミン］／２＊１００）（合成物８） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６４８ｃｍ−１ 【００３０】合成例９　　　　　　　　コンドロイチン
硫酸Ｃ−（ＲＧＤＳ）３　 コンドロイチン硫酸Ｃ０．３０ｇ（０．６０ｍｅｑ．）
、水溶性カルボジイミド９３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）
、（ＲＧＤＳ）３　４００ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）を
用い、合成例３と同様にしてコンドロイチン硫酸Ａ−（
ＲＧＤＳ）３　を合成した。　　収量０．３４ｇ構造の
確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により行なった。アミ
ノ酸分析の結果（ＲＧＤＳ）３　フラグメントの導入率
は約８％であった。（導入率＝［Ａｒｇ］／［グルコサ
ミン］／３＊１００）（合成物９） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６５０ｃｍ−１ 【００３１】合成例１０　　　　　　デルマタン硫酸−
ＲＧＤＳ デルマタン硫酸Ａ０．３０ｇ（０．６０ｍｅｑ．）、水
溶性カルボジイミド９３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）、Ｒ
ＧＤＳ４００ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を用い合成例３
と同様にしてＲＧＤＳフラグメントを共有結合させた。 　　収量　　０．３６ｇ構造の確認は、ＩＲおよびアミ
ノ酸分析により行なった。アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳ
フラグメントの導入率は約１４％であった。（合成物１
０）ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動
　　１６５２ｃｍ−１ 【００３２】合成例１１　　　　　　ヘパラン硫酸−Ｒ
ＧＤＳヘパラン硫酸０．３０ｇ、水溶性カルボジイミド
９３ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）、ＲＧＤＳ４００ｍｇ（
０．９２ｍｍｏｌ）を用い合成例３と同様にしてＲＧＤ
Ｓフラグメントを共有結合させた。　　収量　　０．３
２ｇ　　構造の確認は、ＩＲおよびアミノ酸分析により
行なった。アミノ酸分析の結果ＲＧＤＳフラグメントの
導入率は約１１％であった。　　（合成物１１） ＩＲ：　　アミドカルボニル（Ｃ＝Ｏ）の伸縮振動　　
１６４９ｃｍ−１ 【００３３】試験例１　　細胞接着性阻害活性の測定本
発明のグリコサミノグリカン誘導体が細胞のフィブロン
ネクチンやビトロネクチンに対する接着を阻害する活性
測定方法を以下に示す。本実験例で用いられた競争法は
基本的に生化学分野では広く用いられているものであり
例えば　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　８２　８０３−８３１　（１９８１），特開平１ー
３０９６８２、同　　２ー１７４７９７に開示されてい
る。 【００３４】実験方法 １．フィブロネクチンおよびビトロネクチン吸着プレー
トの作製 市販のフィブロネクチン（ヒト由来：生化学工業（株）
より購入）あるいはビトロネクチン（ヒト由来　　フナ
コシ薬品（株）より購入）をＰＢＳで各々１．０μｌ／
ｍｌ、２．０μｌ／ｍｌに希釈しその希釈液０．５ｍｌ
を２４穴のプラスチックプレートにいれ３７℃。一晩保
温しコーティングした。次に非特異的吸着を防ぐ目的で
牛血清アルブミン（ＢＳＡ　　１％）を加え３７℃、１
時間保温し、その後通常の洗浄操作（ＰＢＳ）を加え充
分に水切りしてフィブロネクチン吸着プレートを作製し
た。 同様の操作によりビトロネクチン吸着プレートを作製し
た。 【００３５】２．接着阻害実験 凍結乾燥により得たグリコサミノグリカン誘導体をＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　
Ｍｅｄｉｕｍ　（以下ＤＭＥＭと略記する）を用い、０
、０．２５、０．５、１．０、１．５ｍｇ／ｍｌの各濃
度のグリコサミノグリカン誘導体溶液とした。この溶液
０．２５ｍｌを上記方法で作製したプレートに入れ、そ
こへ血管内皮細胞（４ｘ１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の
懸濁液を０．２５ｍｌ加え３７℃で１時間保温し細胞を
接着させた。ＤＭＥＭ倍地で３回洗浄し、未接着の細胞
を剥離し、２％トリパンブルーで染色して細胞数を計測
した。結果を表２及び表３に示す。 【００３６】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表２　　　　　　　　フィブロネク
チンに対する細胞接着阻害（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　濃度（ｍｇ／ｍｌ　）　　　
　添加化合物　　　　　　　　０　　　　０．２５　　
０．５　　　　１．０　　　　１．５　　　　合成物　
　１　　　　　　　　×　　　　　　△　　　　　　　
　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　合
成物　　２　　　　　　　　×　　　　　　△　　　　
　　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　
　　合成物　　３　　　　　　　　×　　　　　　△　
　　　　　　　△　　　　　　　　○　　　　　　　　
○　　　　合成物　　４　　　　　　　　×　　　　　
　△　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　　
　　　○　　　　合成物　　５　　　　　　　　×　　
　　　　△　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　
　　　　　　○　　　　合成物　　６　　　　　　　　
×　　　　　　△　　　　　　　　○　　　　　　　　
○　　　　　　　　○　　　　合成物　　７　　　　　
　　　×　　　　　　△　　　　　　　　○　　　　　
　　　○　　　　　　　　○　　　　合成物　　８　　
　　　　　　×　　　　　　△　　　　　　　　○　　
　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　合成物　　
９　　　　　　　　×　　　　　　△　　　　　　　　
○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　合成
物１０　　　　　　　　×　　　　　　△　　　　　　
　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　
合成物１１　　　　　　　　×　　　　　　△　　　　
　　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　
　　製造物　　２　　　　　　　　×　　　　　　×　
　　　　　　　△　　　　　　　　△　　　　　　　　
△　　　　ＲＧＤ　　　　　　　　　　　　×　　　　
　　×　　　　　　　　×　　　　　　　　×　　　　
　　　　△　　　　ＲＧＤＳ　　　　　　　　　　×　
　　　　　×　　　　　　　　×　　　　　　　　△　
　　　　　　　△　　（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）；　　
○：５０以下、△：５０〜１００、×：１００以上【０
０３７】表３ 　　　　　　　　ビトロネクチンに対する細胞接着阻害
（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
濃度（ｍｇ／ｍｌ　）　　　　添加化合物　　　　　　
　　０　　　　　　　　１０　　　　　　５０　　　　
　　１００　　　　３００　　　　合成物　　１　　　
　　　　　×　　　　　　　　　　○　　　　　　　　
○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　合成
物　　２　　　　　　　　×　　　　　　　　　　○　
　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　
○　　　　合成物　　３　　　　　　　　×　　　　　
　　　　　△　　　　　　　　○　　　　　　　　○　
　　　　　　　○　　　　合成物　　４　　　　　　　
　×　　　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　
　　　　　○　　　　　　　　○　　　　合成物　　５
　　　　　　　　×　　　　　　　　　　○　　　　　
　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　
　合成物　　６　　　　　　　　×　　　　　　　　　
　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　　
　　　○　　　　合成物　　７　　　　　　　　×　　
　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　
　○　　　　　　　　○　　　　合成物　　８　　　　
　　　　×　　　　　　　　　　○　　　　　　　　○
　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　合成物
　　９　　　　　　　　×　　　　　　　　　　○　　
　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○
　　　　合成物１０　　　　　　　　×　　　　　　　
　　　○　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　
　　　　　○　　　　合成物１１　　　　　　　　×　
　　　　　　　　　○　　　　　　　　○　　　　　　
　　○　　　　　　　　○　　　　製造物　　２　　　
　　　　　×　　　　　　　　　　×　　　　　　　　
△　　　　　　　　△　　　　　　　　△　　　　ＲＧ
Ｄ　　　　　　　　　　　　×　　　　　　　　　　×
　　　　　　　　×　　　　　　　　△　　　　　　　
　△　　　　ＲＧＤＳ　　　　　　　　　　×　　　　
　　　　　　×　　　　　　　　△　　　　　　　　△
　　　　　　　　○　　（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）；　
　○：１００以下、△：１００〜２００、×：２００以
上【００３８】試験例２　　血小板凝集阻害活性の測定
本発明において合成したグリコサミノグリカン誘導体の
ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ系での血小板凝集阻害作用をヒト多
血小板血漿を用いて検討した。以下にその実験方法を示
す。 【００３９】実験方法 新鮮なヒト血液に１／９量の３．８％クエン酸ナトリウ
ムを加え遠心分離（１０００ｒｐｍ，１０分）し、上層
を多血小板血漿として分取した。凍結乾燥より得たグリ
コサミノグリカン誘導体を生理食塩水に０ー１．５ｍｇ
／ｍｌの種々の濃度になるように溶解した。グリコサミ
ノグリカン誘導体溶液２５μｌを血漿２００μｌに加え
３７℃で３分間でインキュベートしたのち、５０μＭ　
　アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）溶液あるいは２００μ
ｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を２５μｌ加え凝集の様子を
アグリゴメーターを用いて透過度を測定することにより
検定した。結果を表４に示す。 凝集阻害率（１−Ｔ／Ｔ０　）×　　１００％Ｔ０　＝
グリコサミノグリカン誘導体の塩、非添加時の透過度 Ｔ　　＝グリコサミノグリカン誘導体の塩、添加時の透
過度 【００４０】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表４　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　血小板凝集阻害　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　阻害活性　　　　添加化合物　　　　　　　　　
　ＡＤＰ刺激　　　　　　　　　　　　　　コラーゲン
刺激　　　　合成物　　１　　　　　　　　　　　　　
　○　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　○　　　　合成物　　２　　　　　　　　　　　　　
　○　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　○　　　　合成物　　３　　　　　　　　　　　　△
〜○　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物　　４　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物　　５　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物　　６　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物　　７　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物　　８　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物　　９　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○
　　　　合成物１０　　　　　　　　　　　　　　○　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○　
　　　合成物１１　　　　　　　　　　　　　　○　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　○　　
　　製造物　　２　　　　　　　　　　　　△〜○　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　△〜○　　　　
ＲＧＤ　　　　　　　　　　　　　　　　△〜○　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　△〜○　　　　Ｒ
ＧＤＳ　　　　　　　　　　　　　　△〜○　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　△〜○　　ＩＣ５０（
μｇ／ｍｌ　）；　　○：４０以下、△：８０〜４０、
×：８０以上【００４１】 【発明の効果】本発明の細胞接着阻害剤は、Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ　を必須単位とするオリゴペプチドあるい
はその繰り返し構造を有するポペプチドを導入したグリ
コサノグリカン誘導体を有効成分とするため、レセプタ
ーとの結合が増強され、また血液中で安定である。 【００４２】 【配列表】 【００４３】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ　 １　 【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 【００４８】配列番号：６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 【００４９】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 【００５０】配列番号：８ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ　

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グリコサミノグリカンの側鎖にアミド結合
   、エステル結合、エーテル結合、ウレタン結合のいずれ
   かを介し、下記一般式（１）で表される接着性ペプチド
   を必須単位として有するグリコサミノグリカン誘導体ま
   たはその塩を用いた細胞接着阻害剤。 一般式（１） −［Ｒ１］−［ＣＯ］−（［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
   ｓｐ−［Ｙ］）ｎ　−［Ｚ］−［Ｒ２］−　［　　］は
   存在するかあるいは存在しなくともよく、存在する場合
   はＸ，ＹはＳｅｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ａｓｎ，Ｐｒｏか
   ら選択されるアミノ酸残基又はペプチド残基を示し、Ｚ
   は−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。Ｒ１　、Ｒ２　のいず
   れか一方は、水素原子又は炭素数が１〜９の直鎖または
   分岐のアルキル基、または炭素数が６〜９のアリ−ル基
   であり、置換基を有していても良い。他方は，水素原子
   又は炭素数が１〜９の直鎖または分岐のアルキレン基、
   または炭素数が６〜９のアリ−レン基であり、置換基を
   有していても良い。ｎは１〜５の整数を表す。
2. 【請求項２】分子量が約３，０００〜１００，０００の
   範囲である請求項１記載のグリコサミノグリカン誘導体
   またはその塩を用いた細胞接着阻害剤。
3. 【請求項３】請求項１、２記載のグリコサミノグリカン
   誘導体を有効成分とする動物細胞の接着を阻害する薬剤
   。