JP2000513350A - 細胞接着阻害化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式（Ｉ） ［式中、Ｘａａ₁は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されたＬ−アミノ酸；Ｐｈｅ及びＭｅｔから選択されたＤ−アミノ酸、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬ−及びＤ−アミノ酸；及びＭｅＩｌｅから選択されたものであり；Ｘａａ₂、Ｘａａ₃及びＸａａ₄は、それぞれそのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬｅｕ、Ａｓｐ及びＶａｌであり；Ｘ¹は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）及びＡｒｇ（Ｐｍｃ）から選択されたＤ−アミノ酸；式（ＩＩ） ；ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中ｙは１又は２である）から選択されたものであり；Ｘ²は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒｎ（Ｍｅ₂）から選択されたＤ−アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）_XＣＯ（式中Ｘは２又は３である）から選択されたものであり；Ｘａａ₅及びＸａａ₆は、各々無関係に、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸であり；ｐは０又は１であり；ｑは０であるか又はｐが１である場合にはｑは０又は１である］の環状ペプチド又はその塩。この環状ペプチドは、血管細胞接着分子−１及びフィブロネクチンとインテグリン超遅発性抗原（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）４（α４β１）との間の相互作用及び粘膜接着細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ−１）とインテグリンα４β７との相互作用を阻害する。これらは、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、喘息、乾せん、炎症性腸疾患及びインシュリン依存性糖尿病での治療に適用される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞接着阻害化合物 多数の細胞−細胞及び細胞−細胞外基質相互作用は、蛋白質リガンド（例えば フィブロネクチン、ビトロネクチン及びＶＣＡＭ−１）及びそれらのインテグリ ン受容体［例えばＶＬＡ−４（α４β１）］により媒介される。最近の研究によ り、これらの相互作用が多くの生理的（例えば胚発生及び傷治癒）及び病理学的 （例えば腫瘍細胞侵入及び転移、炎症、アテローム性動脈硬化症及び自己免疫病 ）状態で重要な役割を演じることが実証された。これらの相互作用を選択的に阻 害する作用物質が多くの病気の治療に有用であることは明らかである。 インテグリンは、非共有結合したα及びβサブユニットから成るヘテロ二重性 細胞表面受容体である。分子生物学及び蛋白質化学を用いて、多数のα及びβサ ブユニットが確認されている。インテグリン族は更にβサブユニットに基づく複 数の種類に分けることができ、これは１個以上のαサブユニットと結合していて よい。最も広い分布のインテグリンはβ１クラスに属し、超遅発性（ｖｅｒｙ ｌａｔｅ）抗原（ＶＬＡ）としても公知である。インテグリンの２番目のクラス は、白血球−特異性受容体であり、β２蛋白質と錯結 合した３つのαサブユニット（αＬ、αＭ又はαＸ）の中の一つから成る。サイ トアドヘシンαＩｌｂβ３及びαｖβ３が、３番目のクラスのインテグリンを構 成する。４番目のクラスのインテグリンにはα４β７が含まれる。 非常に多様な蛋白質がインテグリン受容体のリガンドとして働く。通常の場合 、インテグリンにより認識される蛋白質は、細胞外基質蛋白質、血漿蛋白質及び 表面分子の３クラスの一つに分かれる。細胞外基質蛋白質、例えばコラーゲン、 フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン、トロンボスポンジン及びビト ロネクチンは、多数のインテグリンと結合する。これら接着性蛋白質の多くは、 血漿中にも循環しており、活性化血液細胞と結合する。インテグリンのリガンド である血漿中の付加的成分には、フィブリノーゲン及び因子Ｘが含まれる。細胞 結合補体Ｃ３ｂｉ及び幾つかの膜透過蛋白質、例えばＩｇ−様細胞接着分子（Ｉ ＣＡＭ−１，２，３）及び血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）（Ｉｇスーパーフ ァミリーの一員である）も、ある種のインテグリンの細胞表面リガンドとして働 く。粘膜アドレシン細胞接着分子−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）はＩｇスーパーファ ミリーのもう一つの成員であり、インテグリンα４β７により結合される。 多数のインテグリンの標的アミノ酸配列が確認されている。例えばα５β１、 αＩＩβ３及びαｖβ３中 の標的配列は、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、トロンボスポンジン、１ 型コラーゲン、ビトロネクチン及びｖＷＦの様な蛋白質中で発見されたＡｒｇ− Ｇｌｙ−Ａｓｐトリペプチドである。しかし、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列は、 接着性リガンドにより用いられる唯一のインテグリン認識モチーフではない。そ の他のインテグリンα４β１は、フィブロネクチンの異なる領域（ＣＳ１）と配 列Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌを介して結合し、血小板インテグリンαＩＩｂβ３も 、フィブリノーゲンのγ鎖のカルボキシ末端での配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌを 認識する。 本発明は原則的に、リガンドＶＣＡＭ−１のそのインテグリン受容体ＶＬＡ− ４（α４β１）に対する相互作用を阻害する剤に関する［ＶＬＡ−４に関する論 評の文献：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＶＬＡ−４ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｅｌｌ−Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｒｉｘ Ａ ｄｈｅｓｉｏｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ｅ．Ｈｅｍｌｅｒ、Ｍ．Ｊ．Ｅｌｉ ｃｅｓ）Ｃ．Ｐａｒｋｅｒ ａｎｄ Ｙ．Ｔａｋａｄａ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ） １１４（１９９０）４５〜６５］。インテグリンα ４β１は、造血前駆物質、末梢及び細胞毒性Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、胸 腺 細胞及び好酸球を含めて、多数の造血細胞及び確立されたセルライン上で発現さ れる。細胞−細胞外基質相互作用にのみ関与するその他のβ１インテグリンとは 異なり、α４β１は、細胞−細胞及び細胞−細胞外基質相互作用の両方を媒介す る。細胞発現活性化α４β１は、フィブロネクチンのカルボキシ−末端細胞結合 ドメイン（非Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ媒介）に、内皮細胞上で発現されるＶＣＡ Ｍ−１に及び相互に結合して、ホモ型凝集を促進させる。内皮細胞によるＶＣＡ Ｍ−１の発現は、前炎症性サイトカイン、例えばＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α及びＩ Ｌ−１βによりアップレギュレートされる。 本発明は、リガンドＭＡｄＣＡＭ−１及びインテグリンα４β７の相互作用を 阻害する剤にも関する。 α４β１媒介細胞接着の調節は、Ｔ細胞増殖、胚中心へのＢ細胞局在定位及び 活性化Ｔ細胞及び好酸球の内皮細胞への接着を含めて、多数の生理学的過程で重 要である。更にインテグリンα４β１媒介過程は、腫瘍細胞転移及びリンパ球、 単球又は好酸球漸増と関連する疾患、例えば多発性硬化症、リウマチ性関節炎、 喘息、乾せん、インシュリン依存性糖尿病、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、虚血性 心疾患、心筋炎、末梢血管疾患、移植拒絶反応、例えば慢性同種移植片拒絶及び アレルギー疾患に関係している。ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１相互作用の前記疾患 過程における関与の証拠は 、ペプチドＣＳ−１及びＶＬＡ−４又はＶＣＡＭ−１に特異的な抗体の役割を、 炎症（例えばマウスにおける接触性皮膚過敏反応）、実験的自己免疫脳脊髄炎、 肺抗原攻撃、糖尿病、潰瘍性大腸炎、腎炎及び同種移植片拒絶の種々の試験管内 及び生体内実験モデルで調べることによって集められた。更に、インテグリンα ４β７−媒介過程は、例えば炎症性腸疾患及びインシュリン依存性糖尿病のよう な病気におけるリンパ球漸増に関係している。 例えば関節炎の実験モデル（同系交配の雌のルイスラットでＡ連鎖球菌細胞壁 からのペプチドグリカン−多糖類フラグメントの１回の腹腔内注射で誘発させた 関節炎）で、慢性関節炎の動物で関節炎の初期（０〜４日；３００μｇ／日）又 は１１〜１６日目におけるＣＳ−１の静脈内投与により、急性及び慢性の両方の 炎症を抑制した［文献：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｐｅｐ ｔｉｄｅｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ ｂｙＩ ｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒ ｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ、Ｓ．Ｍ．Ｗａｈｌ、Ｊ．Ｂ．Ａｌｌｅｎ、Ｋ．Ｌ．Ｈｉ ｎｅｓ、Ｔ．Ｉｍａｍｉｃｈｉ、Ａ．Ｍ．Ｗａｈｌ、Ｌ．Ｔ．Ｆｕｒｃｈｔ ａ ｎｄ Ｊ．Ｂ．ＭｃＣａｒｔｈｙ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９４（１９ ９４）６５５〜６６２］。 もう一つの炎症モデル（オキサゾロン又は２，４−ジニトロフルオロベンゼン −感作マウスにおける接触性過敏反応）で、抗α−４特異性モノクローナル抗体 Ｒ１−２又はＰＳ／２の静脈内適用（攻撃の４〜６時間前）が遠心性応答を有意 に阻害した（耳腫脹を５０〜６０％減少）［文献：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α−４Ｓｕｂｕｍｉｔ Ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ Ｍｕｒｉｎｅ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓ ｉｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐ．Ｌ．Ｃｈｉｓｈｏｌｍ、Ｃ．Ａ．Ｗｉ ｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｒ．Ｒ．Ｌｏｂｂ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、 ２３（１９９３）６８２〜６８８］。腸炎症モデル（コットン−トップタマリン における急性腸炎）で、ＶＬＡ−４と結合する抗α４インテグリンモノクローナ ル抗体ＨＰ１／２は、急性腸炎を有意に緩和した。反対に、２種類の抗Ｅ−セレ クチンモノクローナル抗体（ＢＢ１１及びＥＨ８）は、コットン−トップタマリ ンにおいて治療期間１０日後に僅かに腸炎を緩和したにすぎない［文献：Ａｔｔ ｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆＣｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｔｔｏｎ−ｔｏｐ Ｔａｍａｒｉｎ ｂｙ Ａｎｔｉ−α４Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎ ａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｄ．Ｋ．Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、Ｒ．Ｌｏｂｂ、Ｎ．Ｋｉ ｎｇ、Ｃ．Ｄ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｂ．Ｐｅｐｉｎ ｓｋｙ、Ｐ．Ｓｅｈｇａｌ ａｎｄ Ｍ．ｄｅＢｅａｕｍｏｎｔ、Ｊ．Ｃｌｉｎ ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２（１９９３）３７２〜３８０］ 。 更にこれら抗体は、自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のモデルでも有効であると実 証された。ＥＡＥは多発性硬化症と同様に中枢神経系の炎症状態である。このモ デルでは、炎症を実験的に誘発させる。ＥＡＥ及び多発性硬化症の両方で、循環 白血球が血液脳関門に浸透し、髄鞘を損傷させ、神経伝導障害及び麻痺を引き起 こす結果となる。ＥＡＥは動物にＣＮＳ蛋白質、例えば髄鞘塩基蛋白質（ＭＢＰ ）を与えるか又はこれらＣＮＳ抗原に特異的である活性化リンパ球を注射するこ とによって活性に誘発させることができる。種々のモノクローナル抗体であるＭ Ｋ／１（抗ＶＣＡＭ−１）及びＰＳ／２及びＬＰＡＭ−１（抗α４インテグリン ）は、照射雌（ＰＬ／Ｊ×ＳＪＬ）Ｆ１マウスに注射すると、病気の発現を遅ら せた。α４インテグリンに対する抗体（例えばＬＰＡＭ−１及びＰＳ／２）の注 射を病気発現後まで３日毎に続けると、病気の発現が遅くなっただけでなく、こ の症例で病気の重症度も有意に低下した［文献：Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ ｏｆ α４ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｙ ＣＤ４ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｉ ｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｉｒ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ Ｂｒａｉ ｎ Ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ、Ｊ．Ｌ：Ｂａｒｏｎ、Ｊ ．Ａ．Ｍａｄｒｉ、Ｎ．Ｈ．Ｒｕｄｄｌｅ、Ｊ．Ｈａｓｈｉｍ ａｎｄ Ｃ．Ａ ．Ｊａｎｅｗａｙ、Ｊｒ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７（１９９３）５７〜 ６８］。 ＶＣＡＭ−１（Ｍ／Ｋ−１）及びＶＬＡ−４（ＰＳ−２）に対するモノクロー ナル抗体は、また、実験的喘息モデル（抗原誘発好酸球及びＴ細胞漸増）で有効 であると実証された。これらの双方の抗体は吸入による卵白アルブミン攻撃の２ ４時間前に腹腔内に注射すると、マウスで好酸球侵入を有意に減少させた（７３ 〜７４％）［文献：Ｒｏｌｅ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓ ｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１／ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎａ ｎｔｉｇｅｎ ４ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １／ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃ ｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ １ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｔｉ ｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ａｎｄ Ｔ−ｒｅｃｒｕｉｔ ｍｅｎｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ）Ｈ．Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｈ．Ｓａ ｎｏ、Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）Ｓ．Ｙｏｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｉ．Ｉｗａｍｏ ｔｏ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９（１９９４）１１４５〜１１５４］。同様 な結果が、抗−ＶＬＡ−４モノクローナル抗体ＨＰ１／２を卵白アルブミン攻 撃前に注射した（３〜１０ｍｇ／ｋｇ）場合に、モルモットで得られた［文献： Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏｖｅｒｙ ｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉ ｇｅｎ４ ｐｒｅｖｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｒｏｎｃｈｉ ａｌ ｈｙｐｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｆｉ ｌｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇ ａｉｒｗａｙｓ、Ｍ ．Ｐｒｅｔｏｌａｎｉ、Ｃ．Ｒｕｆｆｉｅ、Ｊ−Ｒ Ｌａｐａ ｅ Ｓｉｌｖａ 、Ｄ．Ｊｏｓｅｐｈ、Ｒ．Ｒ．Ｌｏｂｂ ａｎｄＢ．Ｂ．Ｖａｒｇａｆｔｉｇ、 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０（１９９４）、７９５〜８０５及びＲｏｌｅ ｏ ｆ ｔｈｅ ＶＬＡ−４ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｉｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｒｅｃ ｒｕｉｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉ ｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｕｉｎｅａ−ｐｉｇ、Ａ．Ａ．Ｙ．Ｍｉｌｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｊ．Ｐｉｐｅｒ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． 、２８２（１９９５）、２４３〜２４９］。 α４−インテグリン（ＬＰＡＭ−１）及びそのリガンドの一つであるＶＣＡＭ −１の両方に特異的な抗体はまた、非肥満性糖尿病マウスでのインシュリン依存 性糖尿病の治療に有効であると実証された。インシュリン依存性糖尿病は、活性 化Ｔリンパ球が膵島のインシュリンを生産するβ細胞を破壊する自己免疫病であ ると考えられている。抗体Ｒ１−２は、非肥満糖尿病マウスで膵島炎の発現を用 量に依存して抑制した。病気の抑制に伴って、ランゲルハンス島のリンパ球浸潤 が著しく減少していた［文献：Ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｄ ｏｐｔｉｖｅ Ｍｕｒｉｎｅ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅ ｑｕｉｒｅｓ ａｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ α４−Ｉｎｔ ｅｇｒｉｎｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏ ｌｅｃｕｌｅ−１、Ｊ．Ｌ．ＢａｒｏｎＮＥ−Ｐ．Ｒｅｉｃｈ、Ｉ．Ｖｉｓｉｎ ｔｉｎ ａｎｄ Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ、Ｊｒ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ ｔ．、９３（１９９４）１７００〜１７０８］。 細胞発現インテグリンα４β１は、ヘパリンＩＩ結合ドメイン中の配列及びフ ィブロネクチンのカルボキシ末端細胞結合ドメイン中に位置する選択的スプライ ス型ＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）と結合することが示されている。ＩＩ ＩＣＳ領域内で、α４β１は高い親和性でペプチド配列末端ＣＳ−１（２５−ア ミノ酸ペプチド）と結合し、これがフィブロネクチン中でα４β１相互作用の主 要位置であることを示唆している。トリペプチドＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌは、造 血細胞接着を支持するか又はフィブロネクチンへのα４β１−媒介細胞の結合を 阻害することができるＣＳ−１内の最小配列である［ＣＳ１に関する文献：Ｔｈ ｅ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓ ｓｅｎｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｍａｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｉ ｔｅ（ＣＳ１）Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉ ｃｅｄ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｄｏｍａ ｉｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓ Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔ ｉｃ Ａｃｉｄ−Ｖａｌｉｎｅ、Ａ．Ｋｏｍｏｒｉｙａ、Ｌ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎ 、Ｍ．Ｍｅｒｖｉｃ、Ｓ．Ｓ．Ｙａｍａｄａ、Ｋ．Ｍ．Ｙａｍａｄａ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３（１９９１）１ ５０７５〜１５０７９；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｒｅｃｏ ｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈ ｅ ＬＤＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｖ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｆｉ ｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、 Ｅ．Ａ．Ｗａｙｎｅｒ ａｎｄ Ｎ．Ｌ．Ｋｏｖａｃｈ 、Ｊ．Ｃｅ１１ Ｂｉｏｌ．、１１６（１９９２）４８９〜４９７］ 。 前記配列を含有するＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌに加えて、環状オクタペプチド１ −アダマンタネアセチル−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（２個のシステイン基の間にジスルフィド橋を含有する）が、 ペプチドＣｙｓ−Ｌｅｕ− Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ− Ｔｈｒを含有するＬＤＶと同様に、ＣＳ−１塗布プレートへのジャルカット細胞 接着を阻害する（ＩＣ₅₀３０μＭ）ことに有効であると報告されている。環状ペ プチドもフィブロネクチン塗布プレートへのジャルカット細胞の結合を阻害する 。α４β１誘発接着を阻害する他に、このオクタペプチドは、αｖβ３並びにα ＩＩｂβＩＩＩａ−依存分析でも機能を阻害する。従ってこのペプチドはα４β １−媒介接着に関して選択的ではない［文献：Ｃｙｃｌｉｃ ＲＧＤ Ｐｅｐｔ ｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ α４β１ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃ ｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ １ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅ ｌｌ ＡｄｈｅｓｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅ、Ｐ．Ｍ．Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ、Ｒ ．Ｒ．Ｃｏｂｂ、Ｄ．Ｍ．Ｎｏｗｌｉｎ、Ｗ．Ｓｃｈｏｌｚ、Ｆ．Ｇｏｒｃｓａ ｎ、Ｍ．Ｍｏｓｃｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｙａｓｕｈａｒａ、Ｓ−Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｌｏｂｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９（１９９４） １８６６８〜１８６７３］。 二三の小さな非ペプチド化合物［文献：Ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ Ｓｕｒｒ ｏｇａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ ｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａ ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓ ｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｕｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ、ＹＥＤＡ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、ＷＯ９４／ ０２４４５、１９９４年２月３日発行］もα４β１誘発接着を抑制すると報告さ れている。 更に１９９６年１月１１日発行のＷＯ９６／００５８１中に、Ｌｅｕ−Ａｓｐ −Ｖａｌ配列及び少なくとも１個のＣｙｓアミノ酸基及び／又はＧｌｕアミノ酸 基を含有する多数の環状ペプチドが、α４β１インテグリンのＶＣＡＭ−１又は フィブロネクチンへの結合を阻害すると報告されている。しかしこの特許出願で 開示された３種類の環状ペプチド［即ち、ｃ（Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ −Ｖａｌ）、ｃ（Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ）及びｃ（ Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ− Ａｓｐ−Ｖａｌ）、式中Ｃはアミノ酸配列が閉環していることを示す］は、ＨＬ −６０細胞のＶＣＡＭ−１−ＩｇＧ融合蛋白質への結合の極めて弱い阻害剤であ ると判明した（９４のＩＣ₅₀値、各々＞１０００及び＞１０００μＭ）［文献： Ｐ．Ｖａｎｄｅｒｓｌｉｃｅ、Ｋ．Ｒｅｎ．、Ｊ．Ｋ．Ｒｅｖｅｌｌｅ、Ｄ．Ｃ ．Ｋｉｍ、Ｄ．Ｓｃｏｔｔ、Ｒ．Ｊ．Ｂｊｅｒｃｋｅ、Ｅ．Ｔ．Ｈ．Ｙｅｈ、Ｐ ．Ｊ．Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｔ．Ｐ．Ｋｏｇａｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１ ５８、（１９９７）、１７１０〜１７１８］。 ジスルファイド環状ペンタペプチド、Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−チオプロリン −Ｃｙｓ（チオプロリン=チアゾリジン−４−カルボン酸）もフィブロネクチン への白血球細胞接着の阻害剤であると報告されている。更に、環状ペプチドはま た、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ中央細胞結合ドメインを含有する、フィブロネクチ ンの１２０ｋＤａキモトリプトフラグメントへの結合を阻害すると報告されてい る。この場合もこのペプチドはα４β１及びα５β１の両方に選択的には結合し なかった［文献：Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｎｔａｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ α４β１ ａｎｄ α５β１ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｍｅｄｉ ａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ、Ｄ．Ｍ．Ｎｏｗｌｉｎ、Ｆ．Ｇｏｒｃ ｓａｎ、Ｍ．Ｍｏｓｃｉｎｓｋｉ、Ｓ−Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ、Ｔ．Ｊ．Ｌｏｂｌａ ｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８（１ ９９３）２０３５２〜２０３５９］。 同時係属ＰＣＴ出願ＷＯ９６／２０２１６（１９９６年７月４日発行）には、 α４β１インテグリンのＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンへの結合を阻害する Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌを含有する環状ペプチドが報 告されている。 ＶＣＡＭ−１及びフィブロネクチンとインテグリンＶＬＡ４の相互作用を阻害 する多数のペプチドが発見されたが、この相互作用を阻害する代替化合物、特に 徐放製剤中に調剤することができる化合物が依然として必要とされている。ＭＡ ｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７との相互作用を阻害する化合物も求められ ている。 本発明の態様の一つにより、式［式中、Ｘａａ₁は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されたＬ−アミノ酸； Ｐｈｅ及びＭｅｔから選択されたＤ−アミノ酸、そのα−炭素又はα−アミノ基 上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬ−及びＤ−アミノ酸；及びＭｅＩ ｌｅから選択されたものであり；Ｘａａ₂は、そのα−炭素又はα−アミノ基上 でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬｅｕであり；Ｘａａ₃は、そのα− 炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｓｐであり ；Ｘａａ₄は、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換され ていてよいＶａｌであり；Ｘ¹は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜 4} アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、 ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒ ｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）及びＡｒｇ（Ｐｍｃ ）から選択したＤ−アミノ酸； ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中ｙは１又は２であ る）；から選択したものであり；Ｘ²は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上 でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ｈ Ａｒｇ（Ｅｔ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒｎ（Ｍｅ₂）から選択されたＤ −アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ；及びＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ（式中ｘは ２又は３である）から選択されたものであり；Ｘａａ₅及びＸａａ₆は、各々無関 係に、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよ いＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸であり；ｐは０又は１であり； ｑは０であるか又はｐが１である場合には、ｑは０又は１であり；その際、Ｘａ ａ₁がＭｅＩｌｅであり、Ｘａａ₂がＬｅｕであり、Ｘａａ₃がＡｓｐであり、Ｘ ａａ₄がＶａｌであり、ｐ及びｑが両方とも０である場合には、 ｉ）Ｘ¹がＤ−Ａｌａである場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｒｇ又はＤ−Ｌ ｙｓではなく；ｉｉ）Ｘ¹が である場合には、Ｘ²はＤ−Ａｒｇではなく； ｉｉｉ）Ｘ¹がＤ−Ａｒｇである場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｒｇ又はＤ −Ｈｉｓではなく； ｉｖ）Ｘ¹がＤ−Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）又はＤ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）である場合には 、Ｘ²はＤ−Ａｌａではなく； ｖ）Ｘ¹がＤ−Ｌｙｓである場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓではなく ； ｖｉ）Ｘ¹がＤ−Ｐｈｅ又はＤ−Ｔｒｐである場合には、Ｘ²はＤ−Ｌｙｓ又はＤ −Ａｒｇではないという条件を伴う］の環状ペプチド又はその塩が得られる。 この環状ペプチドは、有利には、下記のＭＯＬＴ−４細胞−−フィブロネクチ ン分析でＩＣ₅₀＜１０μＭ、更に有利には＜５μＭを有するか又は下記のＭＯＬ Ｔ−４細胞／組み換え可溶性ＶＣＡＭ−１分析でＩＣ₅₀＜３０μＭ、より有利に は＜５μＭを有する。 環状ペプチドは、下記のＪＹ細胞／ＭＡｄＣＡＭ−１接着分析でも活性である 。 アミノ酸は他に記載のない限り、Ｌ−配置を有し、基成分は全て、即ち環状ペ プチドを形成するＸａａ₁〜Ｘａａ₆、Ｘ¹及びＸ²は、アミノ（Ｎ−末端）からカ ルボキシル（Ｃ−末端）基の方向に左から右へ記載されているものとする。基成 分は、１個の基のカルボ キシル末端が隣接基のアミノ末端と結合しているように結合している。天然起源 アミノ酸は１個以上のカルボキシル及び／又はアミノ基を有する場合に、結合は 各々α−カルボキシル及びα−アミノ基を介している。基Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂ 、Ｄ−Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｄ−Ｏｒｅｎ（Ｍｅ₂）、Ｄ−Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂ ）及びＤ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）の結合は、下記の図に関連して定義されている。環 状ペプチド中の天然起源のアミノ酸基は、通常三文字コードで表わされ、その際 、Ａｌａはアラニン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅはイソロイシン、Ｌｙｓはリ ジン、Ａｒｇはアルギニン、Ｖａｌはバリン、Ａｓｐはアルパラギン酸、Ｍｅｔ はメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｌｅｕはロイシン、Ｔｒｐはトリプ トファンである。ＭｅＰｈｅ及びＭｅＩｌｅは各々Ｎ−メチルフェニルアラニン 及びＮ−メチルイソロイシンである。Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂、Ｄ−Ｏｒｎ（Ｃ ＨＭｅ₂）、Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｄ−Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）及びＤ−Ａｒｇ（ Ｐｍｃ）は下記の図で定義されている。 例えば‘アルキル’の様な属名には直鎖状又は枝分かれ鎖状の両方のものが含 まれるものと理解すべきである。本発明の化合物は、溶媒化合物、例えば水和物 を包含し、プロドラッグ、例えば生体内で加水分解可能なエステルを包含する。 Ｘａａ₁は、Ｌ−ＭｅＩｌｅ、Ｌ−ＭｅＰｈｅ、Ｌ −Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｐｈｅ及びＤ−Ｍｅｔを含む。Ｘａａ₂、Ｘａａ₃及 びＸａａ₄の有利な値は、各々Ｌｅｕ、Ａｓｐ及びＶａｌである。Ｘ¹は有利には Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨ Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）及びＡｒｇ（Ｐｍｃ）から選択されたＤ−アミノ 酸；及び ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ；及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中、ｙは１又は ２である）から選択するのが有利である。Ｘ²は、Ａｌａ）Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈ ｉｓ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒｎ（Ｍｅ₂）から選択 したＤ−アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ（式中 、ｘは２又は３である）から選択するのが有利である。Ｘａａ₅及びＸａａ₆は有 利には各々無関係に、Ｄ−Ａｌａ又はＤ−Ａｒｇである。 式中のＸ¹、Ｘ²、（Ｘａａ₅）_p及び（Ｘａａ₆）_qのいずれか２つがＤ−Ａｒｇ を表わす環状ペプチド又はその塩が、本発明の特に有利な態様である。 本発明のもう一つの態様によれば、環状ペプチドは、式［式中、Ｘａａ₁は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択したＬ−アミノ酸；Ｐ ｈｅ及びＭｅｔから選択されたＤ−アミノ酸、場合によりそのα−炭素又はα− アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＬ−及びＤ−アミノ酸；及び ＭｅＩｌｅから選択されたものであり；Ｍｅ、Ｐｈｅが最も有利であり；Ｘａａ₂ は、場合によりそのα−炭素又はα−アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で 置換されたＬｅｕであり；Ｘａａ₃は、場合によりそのα−炭素又はα−アミノ 基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＡｓｐであり；Ｘａａ₄は、場合に よりそのα−炭素又はα−アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＶ ａｌであり；Ｘ¹は、場合によりそれらのα−炭素又はα−アミノ基上で１個の Ｃ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＴｒｐ、ｈ Ａｒｇ（Ｅｔ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂ ）及びＡｒｇ（Ｐｍｃ）から選択したＤ−アミノ酸；及び ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ；ＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中ｙは１又は２であ る）；から選択されたものであり；Ｘ²は、場合によりそれらのα−炭素又はα −アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換された、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ 、Ｔｒｐ及びＨｉｓ、ｈＡ ｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒｎ（Ｍｅ₂）から選択されたＤ− アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ；及びＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ（式中ｘは２ 又は３である）；から選択されたものであり；Ｘａａ₅及びＸａａ₆は、各々無関 係に、場合によりそのα−炭素又はα−アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で 置換されたＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸であり；ｐは０又は１ であり；ｑは０であるか又はｐが１である場合にはｑは０又は１であり、その際 、ｐ及びｑが両方とも０である場合には、Ｘａａ₁がＭｅＩｌｅでないという条 件を伴う］を有するか又はその塩である。このような環状ペプチド中で、Ｘａａ₁ がＭｅＩｌである場合には、ｐは１であり、ｑは０又は１である。 本発明のもう一つの態様によれば、環状ペプチドは式 ［式中、Ｘａａ₁は、ＭｅＰｈｅ及びＭｅＩｌｅから選択されたＬ−アミノ酸で あり；Ｘａａ₂は、場合によりそのα−炭素又はα−アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4} アルキル基で置換されたＬｅｕであり；Ｘａａ₃は、場合によりそのα−炭素又 はα−アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＡｓｐであり；Ｘａａ₄ は、場合によりそのα−炭素又はα−アミノ基上で １個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＶａｌであり；Ｘ¹は、場合によりそれら のα−炭素又はα−アミノ基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＡｌａ及 びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸； 及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中ｙは１又は２である）から選択され たものであり；Ｘ²は、場合によりそれらのα−炭素又はα−アミノ基上で１個 のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸 ；ＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ（式中ｘは２又は３である）から選択されたものであり； Ｘａａ₅及びＸａａ₆は、各々無関係に、場合によりそのα−炭素又はα−アミノ 基上で１個のＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されたＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ −アミノ酸であり；ｐは１であり；ｑは０又は１である］を有するか又はその塩 である。 本発明による特に有利な環状ペプチドは、下記第２表の化合物１〜３８の構造 を有する環状ペプチド又はその塩である。構造１〜３８中のアミノ酸は、場合に よりα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル（特にメチル）で置換されて いる。有利な環状ペプチドは、化合物８、２０〜２３、２５〜３２、３７及び３ ８のいずれかである。更に有利な環状ペプチドは、化合物２０、２１、２７及び ３１のいずれかである。 本発明の環状ペプチドは、少なくとも１個の下記の利点を有する：それらは、 我々の試験で公知化合物、例えばＣＳ−１（２５−アミノ酸ペプチド）よりも強 力である；それらはＣＳ−１よりも小さく、従って合成がより簡単であり、環状 であるので酵素分解に対してより安定である；それらは徐放製剤と相容性である 。 有利な化合物は、マウスにおける多数のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングで、例 えば皮膚中でオキサゾロンにより誘発させた遅発性過敏反応（接触性過敏症、Ｃ ＨＳ）又は足でオバルブミンにより誘発させた遅発性過敏反応（遅発性過敏症、 ＤＴＨ）、コラーゲン−誘発関節炎、抗原誘発細気管支洗浄好酸球増加症及び実 験的アレルギー性脳脊髄炎で有効性が実証された。例えばＤＴＨにおける５０％ 最大阻害応答を生じるのに必要なＣＳ−１の用量は、１ｍｇ／ｋｇ／日であった が、化合物２０では０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であった。本発明の化合物では有効 量で毒性は全く観察されなかった。 本発明によるもう１つの態様によれば、本発明の環状ペプチド及び製薬的に認 容性の希釈剤から成る薬剤組成物が得られる。本発明により、本発明による環状 ペプチドの製薬的に認容性の塩及び製薬的に認容性の希釈剤又は賦形剤から成る 薬剤組成物も得られる。 製薬的に認容性の塩には、例えば十分に塩基性であ る環状ペプチド、例えばアルギニンの様に遊離グアニジノ基を有するようなもの の例には、例えば生理的に認容性のアニオンを形成する酸との塩、例えば鉱酸、 例えばハロゲン化水素、例えば塩化水素及び塩化臭素、スルホン酸及びホスホン 酸との塩；有機酸、特に酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸、ｐ−トルエンスルホ ン酸、メタンスルホン酸等との塩が包含される。十分に酸性である環状ペプチド 、例えば１個の遊離カルボン酸基を有するようなものの例には、生理的に認容性 のカチオンを形成する塩基との塩、例えばアルカリ金属、例えばナトリウム及び カリウム、アルカリ土類金属、例えばマグネシウム及びカルシウム；アルミニウ ム及びアンモニウム塩及び有機塩基、例えばエタノールアミン、メチルアミン、 ジエチルアミン、イソプロピルアミン、トリメチルアミン等との塩が挙げられる 。この様な塩は、当業者の公知の任意の方法により製造することができる。 組成物は、経口適用に好適な形で、例えば錠剤、カプセル、水性又は油性の溶 液、懸濁液又は乳濁液；鼻用には、例えば鼻吸入剤、鼻スプレー又点鼻剤；膣又 は直腸適用のためには、例えば坐薬；吸入適用のためには、例えば微細粉末又は 液体エーロゾル；舌下又は口内適用のためには、例えば錠剤又はカプセル；又は 腸管外適用（静脈内、皮下、筋肉内、静脈内又は注入）のためには、例えば滅菌 の水性又は油性の溶液又は 懸濁液又は生物分解性ポリマー中に配合した薬剤を有するデポー製剤の形であっ てよい。組成物は局所適用に好適な形、例えばクリーム、軟膏及びジェルであっ てよい。皮膚貼り薬も可能である。一般的な処方は、“コンプリヘンシブ メデ ィシナル ケミストリー（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）”（Ｈａｎｓｃｈ その他編集、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒ ｅｓｓ、１９９０年）第５巻、第２５．２章に記載されている。 通常は前記組成物は、常用の佐薬を使用して常法で製造することができる。し かし、経口適用のための組成物の場合には、環状ペプチド作用成分を胃中での酵 素の作用から保護するために、組成物がコーチングを有することが有利である。 本発明の有利な組成物は、各単位用量で環状ペプチド２．５〜５００ｍｇ、有 利には１０〜１００ｍｇを含有する単位用量形で経口投与するために好適なもの 、例えば錠剤又はカプセル又は溶液１ｍｌ当たり環状ペプチド０．５〜１００ｍ ｇ、有利には１〜１０ｍｇを含有する腸管外投与に好適なものである。 腸管外組成物は有利には、必要な場合にはｐＨ５〜９に緩衝された等張食塩水 又は等張ブドウ糖中の溶液である。この代わりに腸管外組成物は徐放目的のもの であってもよく、この場合には、単位用量当たりの環状ペプチドの量は、常用の 注射可能な処方物を使用す る場合より通常多い。有利な徐放処方物は、連続放出処方物、例えば欧州特許第 ５８４８１号明細書に記載されているような処方物である。ポリ乳酸／ポリグリ コール酸をベースとするポリマーを含有する徐放処方物のためには、本発明の環 状ペプチドが塩基性基を含有するのが有利である。この様な環状ペプチドのため に、代わりの徐放処方物が、国際特許出願ＷＯ９３／２４１５０号公報に記載さ れている。塩基性アミノ酸は、その側鎖中に塩基性官能基、例えばアミノ又はグ アニジノ（このいずれも場合によりＣ_{1 〜4}アルキルで置換されていてよい）を含 有するようなものである。このような特に有利な塩基性アミノ酸はアルギニンで ある。本発明の特に有利な態様では、式Ｉの環状ペプチド中でＸ¹、Ｘ²、（Ｘａ ａ₅）_q及び（Ｘａａ₆）_qのいずれか２個がＤ−Ａｒｇである。このような塩基性 アミノ酸を含有する環状ペプチドは、酸末端ポリエステル、例えばポリラクチド といわゆる‘ペプチド−ポリマー’塩を形成することができる。これらの塩は、 有利な溶解特性を有し、それによって、有利な放出プロフィルを有し、貯蔵の際 に安定である徐放腸管外処方物を製造するために特に好適となる。有利な徐放性 腸管外処方物は、単位用量当たり環状ペプチド１〜１００ｍｇを含有する。有利 な製薬的組成物は、少なくとも５日間に渡る徐放するように設計された腸管外投 与を目的とする。 本発明の組成物は、通常の場合に１日当たりの経口用量が０．１〜５０ｍｇ／ ｋｇ） １日の腸管外用量が５、有利には２０マイクログラム／ｋｇ〜１０ｍｇ ／ｋｇとなるように適用される。 本発明のもう一つの態様によれば、このような治療を必要とする温血哺乳類、 例えばヒトで、ＶＣＡＭ−１及び／又はフィブロネクチンとインテグリン受容体 ＶＬＡ−４との間の相互作用を阻害する方法が得られ、これは前記動物に有効量 の本発明の環状ペプチド又はその製薬学的に認容性の塩を投与することを特徴と する。更に本発明は、このような環状ペプチド又はその製薬学的に認容性の塩を フィブロネクチン及び／又はＶＣＡＭ−１（特にＶＣＡＭ−１）とインテグリン 受容体ＶＬＡ−４との間の相互作用により媒介される病気又は医学的症状の治療 に使用するための新規薬剤を製造するために使用することにも関する。研究用の 道具として使用することも考慮に入れられる。 本発明のもう一つの態様によれば、このような治療を必要とする温血哺乳類、 例えばヒトで、ＭＡｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７との間の相互反応を阻 害する方法が提案され、これは前記動物に有効量の本発明の環状ペプチド又はそ の製薬学的に認容性の塩を適用することを特徴とする。更に本発明は、このよう な環状ペプチド又はその製薬学的に認容性の塩を、ＭＡｄＣＡＭ−１とインテグ リンα４β７との間の相互 作用により媒介される病気又は医学的症状の治療で使用するための新規薬剤を製 造するために使用することにも関する。研究用の道具として使用することも考慮 に入れられる。 本発明のもう一つの態様によれば、医薬として使用するための前記したような 本発明による環状ペプチドが得られる。本発明のもう一つの態様によれば、この ような治療を必要とする哺乳類で、ＶＣＡＭ−１及び／又はフィブロネクチンと インテグリン受容体ＶＬＡ−４との間の相互作用を阻害する方法が得られ、これ は前記動物に有効量の前記製薬学的組成物を投与することよりなる。有利な１態 様で、治療が必要な哺乳類は、多発性硬化症又はリウマチ性関節炎を患っている 動物である。 もう一つの有利な態様では、治療が必要な哺乳類は喘息又は乾せんを患ってい てよい。 本発明のもう一つの態様により、このような治療を必要とする哺乳類で、ＭＡ ｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７との間の相互作用を阻害する方法が得られ 、これは前記哺乳類に有効量の前記製薬学的組成物又はその製薬学的に認容性の 塩を投与することよりなる。有利な１態様では、治療を必要とする哺乳類は、炎 症性腸疾患及びインシュリン依存性糖尿病を患っている。 本発明によるも一つの態様によれば、本発明の環 状ペプチド又はその製薬学的に認容性の塩をＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチン とインテグリン受容体ＶＬＡ−４との間の相互作用により媒介される疾患又は医 学的症状の治療に使用するための薬剤の製造に使用する方法が得られる。 本発明によるもう一つの態様によれば、本発明の環状ペプチド又はその製薬学 的に認容性の塩をＭＡｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７間の相互作用により 媒介される疾患又は医学的症状の治療に使用するための薬剤の製造に使用するこ とが提案される。 合成の詳細な説明 本発明の環状ペプチドは、類似の化合物の合成に適切なペプチド化学業界で公 知の方法により製造することができる。従って、例えば本発明の環状ペプチドは 、アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）及びシェパード（Ｓｈｅｐｐａｒｄ）著“ソ リッド フェイス ペプチド シンセシス：ア プラクティカル アプローチ（ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）”（ＩＲＬｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年出版）、シュチュワート（Ｓｔ ｅｗａｒｔ）及びヤング（Ｙｏｕｎｇ）著“ソリッド フェイス ペプチド シ ンセシス（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）” （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、１９８４年出版）、Ｍ．ボーダ ンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）著”プリンシプルズ オブ ペプチド シンセ シス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）” 、Ｍ．ボーダンスキー及びＡ．ボダンスキー著“ザ プラクティス オブ ペプ チド シンセシス（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｓ）”（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎｅ Ｈｅｉ ｄｅｌｂｅｒｇ、１９８４年出版）及び“アミノ アシッド、ペプチドズ アン ド プロテインズ（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ）”シリーズ（第１〜２６巻；２６巻、１９９５年出版）（ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 、英国）中に記載の方法と同様の方法により得ることができる。これらの本の他 に多数の論文［例えば“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ：ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ａｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ”、Ｇ． Ｂａｒａｎｙ、Ｎ．Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｉｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｍｕｌ ｌｅｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｃｈ、３０（１９８７）７０５〜７３９ ；“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ Ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ ｃａｒｂｏｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ”、 Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎ ｄ Ｒ．Ｌ．Ｎｏｂｌｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３５（１９９ ０）１６１〜２１４］もペプチドの合成に関して発表されている。合成も米国、 欧州及び日本のペプチドシンポジウムの会報で発表されている。合成は自動的に 行ってもよいし、手作業で行ってもよい。 本発明のもう一つの態様によれば、下記から選択される本発明の環状ペプチド の製法が得られる： （ａ）必要な線状ペプチドを段階的方法で（１回に１個のアミノ酸を加える）合 成し、次いで任意のＮ−Ｃ−末端保護基を選択的に除去し、閉環させ、最後に脱 プロトン化して、本発明による環状ペプチドにし、場合により、必要に応じてこ うして得た生成物をその塩に変える； （ｂ）一つはカルボン酸基又はその反応性誘導体を含有し、もう一つはアミノ基 を含有する、２個のペプチド単位を結合させることによって１つのアミド結合を 形成させて、本発明の保護されたか又は保護されていない環状ペプチドを製造し 、必要に応じて下記の（ｃ）法を用いて保護基を離脱させ、所望により、こうし て得た生成物をその塩に変え；及び （ｃ）１個以上の慣用のペプチド保護基を、Ａｓｐの側鎖中の酸基上に保護基を 有する保護された環状ペプチドから除去して、本発明の環状ペプチドを生成し、 場合により、同時にか又は引き続いて、存在するその他の慣用のペプチド保護基 を除去し、場合により、所望の場合にはこうして得た生成物をその塩に変える。 前記脱保護及び結合工程は、固体支持体上で（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙ ｎｔｈｅｓｉｓ）又は溶液中で有機化合物の合成で使用される通常の方法を使用 して実施することができる。固体支持体を除いて、その他の全ての保護基、カッ プリング試薬、脱ブロック試薬及び精製法は、固体相及び溶液相の両方のペプチ ド合成法におけると同様である。 固体支持体上のペプチド合成のために、樹脂から開裂後に遊離カルボキシル基 を生じるか又は選択的に脱保護されてＣ−末端カルオキシル基を生じさせること ができるペプチド誘導体のいずれかを生じることができる、適切な樹脂を選択す る。固体支持体は、ポリスチレンビーズ、ポリジメチルアクリルアミドビーズ、 ポリジメチルアクリルアミド−ポリスチレン複合材料（Ｐｏｌｙｈｉｐｅ）又は ポリスチレン−ポリオキシエチレン樹脂（Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂）からなってい てよい。ペプチドの固体相合成で使用される固体支持体を含有する好適なリンカ ー基の二三の例を下記に記載する。記載のリンカーの他に、その他のリンカー、 例えばヒドロキシクロトノイルアミドメチル（ＨＹＣＲＡＭ）を使用することも できる。最初のアミノ酸をペプチドの合成用に本明細書に記載した方法によって か又はペプチド合成で使用される任意のカップリング試薬を用いることによって 結合させる。カップリング試薬の例もいくつか本明細書に記載する。 ペプチドの合成の間に、反応に参加しないアミノ酸官能性基は、種々の保護基 によって保護されている。例えばＮ−末端及び側鎖アミノ基は、９−フルオレニ ルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ビフ ェニルイソプロポキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、２−［３，５−ジメトキシフェ ニル］プロピル−２−オキシカルボニル（Ｄｄｚ）、アダマンチルオキシカルボ ニル（Ａｄｏｃ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｏｃ）、２，２，２−トリク ロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル及び種々の置 換されたベンジルオキシカルボニル基を用いて保護することができる。これらの 保護基は所望により標準的方法（例えば酸又は塩基処理、接触性水素添加及びＰ ｄ（Ｏ）処理又は亜鉛／酢 酸処理）により開裂させることができる。 α−カルボキシル又は側鎖カルボキシル基を保護するために使用される好適な 保護基は、種々のエステル（例えばメチル、エチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ニ トロベンジル、アリル及び９−フルオレニルメチル）を包含する。 アルギニン残基を含有するペプチド中の側鎖グアニジノ基の保護のために使用 される好適な保護基には、ニトロ、アダマンチルオキシカルボニル、４−メトキ シ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、２，２，４，６， ７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）及び２，２ ，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）基が包含され る。ヒスチジン残基を含有するペプチド中の側鎖イミダゾール基の保護のために 使用される好適な保護基には、トリチル、トシル、ジニトロフェニル、Ａｄｏｃ 、Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ基が包含される。 保護基開裂反応は、温度４〜４０℃（有利には室温、約２５℃で）で行うこと ができる。この開裂反応は１０分間〜２４時間かかる。 個々のアミノ酸又はペプチドフラグメントの結合のために使用される好適なカ ップリング法には、常用のアジド、対称無水物、混合無水物及び種々の活性エス テル及びカルボジイミドが包含される。種々のカルボ ジイミド（例えばジシクロヘキシル−又はジイソプロピル−カルボジイミド）の 場合には、多数の添加物（例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びＮ−ヒ ドロキシスクシンイミド）を添加することもできる。更に、アミノ酸又はフラグ メントカップリングは、多数のその他の試薬、例えば１Ｈ−ベンゾトリアゾール −１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフ ェート（ＰｙＢＯＰ）、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１， １，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）及 び（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメ チルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）］を使用して達成す ることもできる。 このカップリング反応は、温度−２０〜４０℃で行うことができる。反応完了 に必要な時間は１０分間〜２４時間である。 中間生成物及び最終生成物の好適な精製法には、向流分配、イオン交換、ゲル 濾過及び高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む種々のその他のクロマ トグラフィー法並びに有機化学で使用される多数のその他の標準技術（例えば溶 剤抽出及び結晶化）が含まれる。 次に本発明を実施例につき詳説するが、本発明はこれに制限されるものではな い。実施例中、第１図は、 化合物１（第２表）の合成を図解説明しており；第２図は、化合物２０（第２表 ）の合成を図解説明しており；第３図は、化合物２４（第２表）の合成を図解説 明しており；第４図は、Ｄ−Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）の構造を図解説明しており； 第５図は、Ｄ−Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）の構造を図解説明しており；第６図は、Ｄ −Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）の構造を図解説明しており；第７図は、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ ）₂の構造を図解説明しており；及び第８図は、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）の構造を 図解説明している。 第４図から第８図中で矢印は、結合点又は直接結合（即ち−ＣＨ₂−基ではな い）を示す。例えば、化合物４（第１表）中のＤ−Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）（第５ 図）に関して、窒素上の矢印結合は、ＶａｌのＣ−末端で−Ｃ（Ｏ）−と結合し 、−Ｃ（Ｏ）−上の矢印結合は、Ｄ−ＡｌａのＮ−末端で窒素原子と結合してい る。 下記の略語を使用した： ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂ ホモ−Ａｒｇ（Ｅｔ）₂Ｏｒｎ オルニチン。実施例 化合物１〜３８（第１表及び第２表参照）の合成 本発明による環状ペプチドは、第１表及び第２表のNo．１〜３８である。これ らは、相応する前駆物質（通常は線状）ペプチド、第１表のNo．３９〜７５を閉 環させることによって得られた。化合物No．１、２０及び２４の合成法は下記に 詳説する（第１〜３図参照）。他の化合物の場合には、標準方法から異なる点の みを記載する。例１ １．化合物１の合成（第１図） 環状ペプチド（第１図、第５工程）は、固相法により２−クロロトリチルクロ リド樹脂を用いて製造した。部分的に保護された線状ペプチドを樹脂上に会合さ せた後、ペプチドを樹脂から開裂させ、精製せずに次の工程に使用した。しかし 、最終生成物は、同定前に逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により 充分に精製した。 １．１．化合物１の合成（第１図、第１工程） ジクロロメタン（５０ｍｌ）中のブロモ酢酸ｔ−ブチル（４．８８ｇ）２５ミ リモル）を、ジクロロメタン（３０ｍｌ）中のｔ−ブチル−１−ピペラジン カ ルボキシレート（４．６５ｇ、２５ミリモル）及びトリエチルアミン（３．５ｍ ｌ、２５ミリモル）の溶液に加えた。反応混合物を１晩攪拌し、１晩分離した固 体を濾過して除去し、濾液を蒸発乾固させた。残分を酢酸エチルと水の間に分配 させ、次いで有機層を水で 洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発乾固させた。残分をエーテルイソヘキサ ンから晶出させ、生成物（５．６６ｇ、７５％、融点９９〜１００℃）が得られ た［元素分析：実測値Ｃ５９．８％、Ｈ９．６％、Ｎ９．１％；Ｃ₁₅Ｈ₂₈Ｎ₂Ｏ₄ の計算値Ｃ６０．０％、Ｈ９．４％、Ｎ９．３３％。シリカゲルを用いる薄層ク ロマトグラフィーでは、１個のスポットを生じた；Ｒｆアセテート−イソヘキサ ン（１：１）中で０．３８及びメタノール−クロロホルム（１：９）中で０．６ ８］。 １．２．化合物１の合成（第１図、第２工程） １．１節に記載の化合物（５ｇ、１６．６ミリモル）をトリフルオル酢酸−水 の混合物（９５：５；５０ｍｌ）で１時間処理した。酸を真空中で蒸発により除 去し、残留した油状物をエーテルで摩砕して固体を生じさせ、これを集め、エー テルで洗浄し、Ｐ₂Ｏ₅／ＫＯＨ上で真空下で乾燥させた（６．２５ｇ、融点１７ ７〜１８２℃）。次いで固体を炭酸カリウム（６．９２ｇ、３当量）を含有する 水及びアセトンの混合物（１：１、１５０ｍｌ）中に溶解させた。アセトン（３ ０ｍｌ）中の９−フルオレニルメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５．６ ６ｇ、１６．７ミリモル）を攪拌しながら２０分間かけて加えた。溶液のｐＨを 、Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃溶液の添加により約９に維持した。室温で１晩攪拌後、アセトン を真空下で蒸発により除去 し、水溶液をＫＨＳＯ₄溶液で酸性にした。生成物を酢酸エチル中に抽出し、溶 液を水（６回）及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥 させ、蒸発させて、油状物を生じさせ、これはイソヘキサン及びエーテルで摩砕 する際に固化した（収量３．７２ｇ、６０％）。試料をエタノール−エーテルか ら再結晶させた、融点１７９〜１８２℃）（Ｍ＋Ｈ）⁺３６７。 １．３．化合物１の合成（第１図、第３及び第４工程） ジクロルメタン（１５ｍｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１．０５ｍｌ 、３当量）中の前記Ｆｍｏｃ−ピペラジン誘導体（７３２ｍｇ、２ミリモル）を ２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ．、２．０５ｇ）に 加え、反応混合物を６０分間静かに振り混ぜた。メタノール（１０ｍｌ）中のジ イソプロピルエチルアミンの１０％溶液を加え、１０分間振り混ぜ続けた。樹脂 を濾別し、ジクロルメタン、ジメチルホルムアミド、ジクロルメタン、エーテル で順次洗浄し、真空炉中で５０℃で乾燥させた（重量２．５５ｇ）。 前記樹脂を焼結ガラスディスク付き反応容器中に入れた。次いで次の反応を手 作業で実施して、所望のペプチド樹脂が得られた。 （ａ）Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド中の２０％ ピペリジン（１×５分間及び１×１５分間）の２回の処理により除去し、次いで ジメチルホルムアミドで５回洗浄して、過剰の試薬及び開裂生成物を除去した。 （ｂ）ジメチルホルムアミド（８ｍｌ）中でＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イ ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオルホスフェート （ＨＢＴＵ）（１．９０ｇ）５ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（１ ．７５ｍｌ）１０ミリモル）を用いて活性化されたＦｍｏｃ−Ｖａｌ（１．７０ ｇ、５ミリモル）を１時間の間にアシル化した。樹脂を再びジメチルホルムアミ ドで５回洗浄して、過剰の試薬を除去した。 前記脱保護及びカップリングサイクルをＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢＵ^t）（２． ０６ｇ、５ミリモル）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ（１．７７ｇ、５ミリモル）、Ｆｍｏ ｃ−Ｍｅｌｌｅ（１．８３ｇ、５ミリモル）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ） （３．７６ｇ、５ミリモル）を用いて繰り返した。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂ ｆ）の場合には、アミノ酸誘導体をＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−イル） −１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（Ｈ ＡＴＵ）（１．９０ｇ）５ミリモル）により活性化した。次いで、樹脂の半分を 脱ブロックし、ＨＢＴＵ（１．１４ｇ、３ミリモル）及びジイソプロピルエチル アミン（１．０５ｍｌ、６ミリモル）を用いてＦｍｏ ｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ（９１１ｍｇ、３ミリモル）と反応させて、クロ ロトリチル樹脂に結合した保護ペンタペプチド誘導体を生じさせた（第３工程） 。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン（１×５分 間及び１×１５分間）で開裂させ、ペプチド樹脂をジメチルホルムアミド、ジク ロルメタン及びエーテルで順次洗浄し、真空炉中で５０℃で乾燥させた。 ペプチド樹脂を酢酸−トリフルオロエタノール−ジクロロメタン（２：２：６ ）の混合物で１時間処理した。樹脂を濾過により除去し、再び開裂試薬で１時間 処理した。合わせた濾液を蒸発させ、残分をエーテルで摩砕して、線状ペンタペ プチド誘導体を酢酸塩として生じさせた（８２４ｍｇ、０．６８２ミリモル）。 次いで酢酸塩を水−アセトニトリル（２：１、６０ｍｌ）の混合物中に溶解させ 、０℃に冷却し、１ＮのＨＣｌ１．０５当量を添加し、内容物を凍結乾燥させる ことによって塩酸塩に変えた。 １．４．化合物１の合成（第１図、第５工程） 線状ペプチドを閉環させ、ｃ（ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａ ｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）（化合物２４）に関して下記の方法により同じ 工程で脱保護して、最終環状ペプチド最終生成物（１）を生じさせた。 ２．ｃ（ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ− Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ）の合成（化合物２０、第２図） 環状ペプチドは、固相法により２−クロロトリチルクロリド樹脂を用いて製造 した。合成の詳細な説明は下記に記載する。部分的に保護した線状ペプチドを樹 脂上に会合させた後に、ペプチドを樹脂から開裂させ、精製せずに次の工程に使 用した。しかし、最終生成物は、同定前に逆相高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ ＰＬＣ）により充分に精製した。 ２．１．Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−クロロトリチル樹脂の製造（第２図、第１工程） ２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ａｌｅｘｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； Ｃｌ１．３１ミリモル／ｇ；１０ｇ）をジクロロメタン（４０ｍｌ）（分子篩を 通して乾燥）中で５分間膨潤させた。ジクロロメタン（２０ｍｌ）中のＦｍｏｃ −Ｖａｌ（３．３９ｇ、１０ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（５． ６ｍｌ、３２ミリモル）の溶液を加え、この懸濁液を機械的に４５分間振り混ぜ た。メタノール（９ｍｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１ｍｌ）を加え、 引き続き５分間振り混ぜ続けた。樹脂を濾過により集め、ジクロロメタン、ジメ チルホルムアミド及びジクロロメタンで順次洗浄し、直ぐに次の工程（２．２． ）の合成のために使用した。 ２．２．Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａ ｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ −クロロトリチル樹脂の製造（第２図、第２及び第３工程） 前記Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ樹脂を焼結ガラスディスク付き反応容器中に入れた。次 いで一連の下記の反応を手作業で行って、所望のペプチド樹脂が得られた。 （ａ）ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン（１×５分間及び１×１５分 間）の２回の処理によりＦｍｏｃ基を除去し、次いでジメチルホルムアミドで５ 回洗浄して、過剰の試薬及び開裂生成物を除去した。 （ｂ）ジメチルホルムアミド（２２ｍｌ）中のＯ−（ベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェー ト（ＨＢＴＵ）（５．７０ｇ、１５ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン （５．２５ｍｌ）３０ミリモル）を用いて活性化されたＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢ Ｕ^t）（６．１７ｇ、１５ミリモル）を用いて、１時間アシル化した。樹脂を再 びジメチルホルムアミドで５回洗浄して、過剰の試薬を除去した。 前記脱保護及びカップリングサイクルをＦｍｏｃ−Ｌｅｕ（５．２９ｇ、１５ ミリモル）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＰｈｅ（６．０１ｇ、１５ミリモル）、Ｆｍｏｃ− Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）（１１．２７ｇ、１５ミリモル）及びＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｒ ｇ（Ｐｂｆ）（１１．２７ｇ、１５ミリモル）を用いて繰り返して、Ｆｍｏｃ− Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰｈ ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ−クロロトリチル樹脂を生じさせた。 化合物１の場合のように、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ誘導体のカップリングは、Ｏ− （７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウ ロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及びジイソプロピルエチル アミンを使用することによって達成した。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基をジメチルホルム アミド中の２０％ピペリジン（１×５分間及び１×１５分間）で開裂させ（第３ 工程）、ペプチド樹脂、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰ ｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌクロロトリチル樹脂をジメチルホル ムアミド及びジクロルメタンで順次洗浄した。 ２．３．Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ− Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ、ＨＣｌの製造（第２図、第４工程） ペプチド樹脂、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰｈｅ− Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌクロロトリチル樹脂を、酢酸−トリフルオ ロエタノール−ジクロロメタンの混合物（２：２：６）（１００ｍｌ）中に１時 間懸濁させた。樹脂を濾過により除去し、同じ混合物で更に１時間再処理した。 合わせた濾液を蒸発させ、残分をエーテルで摩砕して、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）− Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌを酢 酸塩として生じさせた（１１．６６ｇ）。次いで酢酸塩を水−アセトニトリル（ ２：１、３５０ｍｌ）中に溶解させ、０℃に冷却し、１ＮのＨＣｌ１．０５当量 を加え、内容物を凍結乾燥させることによって塩酸塩に変えた（重量１１．５ｇ ）。 ２．４．ｃ（Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＭｅＰｈｅ−Ｌｅ ｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ）の製造（第２図、第５工程） 前記線状ペプチド塩酸塩Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｍｅ Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ（ＨＣｌ）（１１．５ｇ、８．１ ミリモル）をジメチルホルムアミド（８０００ｍｌ）中に溶解させ、Ｏ−（７− アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウ ム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（４．６２ｇ、１２．１５ミリモ ル）及びジイソプロピルエチルアミン（５．６７ｍｌ、３２．４ミリモル）をこ の溶液に加えた。閉環反応を分析ＨＰＬＣによりモニターした。反応完了（室温 で２時間）に際して、反応混合物を真空中で蒸発乾固させた。残分を１０％炭酸 水素ナトリウム水溶液で摩砕した。固体を集め、１０％炭酸水素ナトリウム、水 、１０％硫酸水素カリウム溶液及び最後に水で洗浄した。固体を、Ｐ₂Ｏ₅上で４ ５℃で真空炉中で乾燥させ［Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム上の滞留時間２４ ．８０分、流量１．０ｍｌ ／分で３０分間かけて０．１％トリフルオロ酢酸（４０〜８０％）を含有するア セトニトリル−水の傾斜濃度液を用いて］、精製せずに次の工程に使用した。 ２．５．ｃ（ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ） の製造（第２図、第６工程） 前記保護環状ペプチドｃ（Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｍ ｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ）を、トリフルオロ酢酸−水の 混合物（９５：５、８０ｍｌ）及びトリイソプロピルシラン（３ｍｌ）で９０分 間処理して、アルギニン及びアスパラギン酸側鎖保護基を除去した。反応混合物 を蒸発させて少量にし、水とエーテルとの間に分配させた。水相をエーテルで４ 回洗浄し、凍結乾燥させて、粗生成物１０．９ｇを生じさせた。粗生成物をＶｙ ｄａｃＣ₁₈２１８ＴＰ１０１５１００カラム（４インチ×２５ｃｍ）上のＨＰＬ Ｃで０．１％トリフルオロ酢酸（１５〜３５％）を含有するアセトニトリル−水 の傾斜濃度液を用いて、流量１８０．０ｍｌ／分で８０分間かけて精製した。生 成物含有フラクションを集め、凍結乾燥させて精製された環状ペプチドを生じさ せた（３．６３ｇ）。ペプチドをアミノ酸分析及び質量分析法により同定した（ 第２表）。 ３．ｃ（Ｄ−Ａｒｇ−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ −Ａｌａ）の合成（化合物 ２４、第３図） 環状ペプチドを、固相法により２−クロロトリチルクロリド樹脂を用いて製造 した。部分的に保護された線状ペプチドを樹脂上に集めた後、このペプチドを樹 脂から開裂させ、精製せずに次の工程に使用した。しかし、最終生成物は、同定 前に逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により充分精製した。 ３．１．Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−クロロトリチル樹脂の製造（第３図、第１工程 ） ２−クロロトリチルクロリド樹脂（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．；Ｃｌ １． ３５ミリモル／ｇ；１ｇ）をジクロロメタン（１０ｍｌ）（分子篩上で乾燥）中 で５分間膨潤させた。ジクロロメタン（８ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（３ １１ｍｇ、１ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（５２５μｌ）３ミリ モル）の溶液を加え、この懸濁液を機械的に４５分間振り混ぜた。メタノール（ ９ｍｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１ｍｌ）を加え、引き続き５分間振 り混ぜ続けた。樹脂を濾過により集め、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド 、ジクロロメタン、イソプロパノール及びエーテルで順次洗浄し、最後に５０℃ で真空炉中で乾燥させた（重量１．５１ｇ）。 ３．２．Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖ ａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−クロロトリチル樹脂（第３図、第２及び第３工 程） 前記Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ樹脂を焼結ガラスディスク付き反応容器中に入れた 。次いで一連の下記反応を手作業で行って、所望のペプチド樹脂が得られた。 （ａ）ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン（１×５分間及び１×１５分 間）の２回の処理によりＦｍｏｃ基を除去し、次いでジメチルホルムアミドで５ 回洗浄して、過剰の試薬及び開裂生成物を除去した。 （ｂ）ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）中の、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオルホスフェー ト（ＨＢＴＵ）（７６０ｍｇ、２ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（ ７００μｌ、４ミリモル）を用いて活性化されたＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ（６２２ ｍｇ、２ミリモル）を用いて１時間アシル化した。樹脂を再びジメチルホルムア ミドで５回洗浄して、過剰の試薬を除去した。 前記脱保護及びカップリングサイクルをＦｍｏｃ−Ｖａｌ（６７８ｍｇ、２ミ リモル）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）（８２２ｍｇ）２ミリモル）、Ｆｍｏ ｃ−Ｌｅｕ（７００ｍｇ、２ミリモル）、Ｆｍｏｃ−ＭｅＩｌｅ（７３４ｍｇ、 ２ミリモル）及びＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）（１．４０ｇ、２ミリモル） を用いて繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ− Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａ ｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−クロロトリチル樹脂を生じさせた。化合物１の場 合のように、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ誘導体のカップリングは、Ｏ−（７−アザベ ンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘ キサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及びジイソプロピルエチルアミンを使用 することによって行われた。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド中の２ ０％ピペリジン（１×５分間及び１×１５分間）で開裂させ（第３工程）、ペプ チド樹脂、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）− Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−クロロトリチル樹脂をジメチルホルムアミド 、ジクロルメタン及びエーテルで順次洗浄し、真空炉中で５０℃で乾燥させた（ 重量２．５ｇ）。 ３．３．Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖ ａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ（ＨＣｌ）の製造（第３図、第４工程） ペプチド樹脂、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａクロロトリチル樹脂を、酢酸−トリフル オルエタノール−ジクロロメタンの混合物（２：２：６）（２５ｍｌ）中に１時 間かかって懸濁させた。樹脂を濾過により除去し、同じ混合物で更に１時間再処 理した。合わせた濾液を蒸発させ、残分をエーテルで摩砕して、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐ ｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅ ｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａが酢酸塩として得ら れた（１．１８ｇ）。この次いで酢酸塩を水−アセトニトリル（２：１、６０ｍ ｌ）中に溶解させ、０℃に冷却し、１ＮのＨＣｌ１．０５当量を加え、内容物を 凍結乾燥させることによって塩酸塩に変えた。 ３．４．ｃ（Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t） −Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）の製造（第３図、第５工程） 前記線状ペプチド塩酸塩Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ （ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ（ＨＣｌ）（１．１８ｇ、１． ０２ミリモル）をジメチルホルムアミド（１００００ｍｌ）中に溶解させ、Ｏ− （ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（３９５ｍｇ、１．０２ミリモル） 及びジイソプロピルエチルアミン（５４５μｌ、３．１ミリモル）をこの溶液に 加えた。閉環反応を分析ＨＰＬＣによりモニターした。反応完了（室温で２時間 ）時に、反応混合物を真空中で蒸発乾固させた。残分を酢酸エチルと水との間に 分配させた。次いで有機層を１Ｍクエン酸、飽和塩化ナトリウム、１０％炭酸水 素ナトリウム及び飽和塩化ナトリウムで順次洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥 させ、真空中で蒸発乾固させた。生成物を集め［滞留 時間２７．０６分、Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム上、流量１．０ｍｌ／分で ３０分間かけて、０．１％トリフルオロ酢酸（２０〜８０％）を含有するアセト ニトリル−水の傾斜濃度液を用いて］、精製せずに次の工程に使用した。 ３．５．ｃ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｐ−Ｖａｌ）（化合物２４）の製造（第３図、第６工程） 前記保護環状ペプチドｃ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）− ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^t）−Ｖａｌ）を、トリフルオロ酢酸−水 の混合物（９５：５、３０ｍｌ）及びトリイソプロピルシラン（１ｍｌ）で４時 間処理して、アルギニン及びアスパラギン酸側鎖保護基を除去した。蒸発により 少量にし、次いでエーテルで摩砕し、粗環状ペプチド（５７５ｍｇ）を生じさせ た。この粗生成物をＤｅｌｔａｐａｋ Ｃ₁₈カラム（３０×３０ｍｍ）上で０． １％トリフルオロ酢酸（１０〜３０％）を含有するアセトニトリル−水の傾斜濃 度液を用いて、流量３０．０ｍｌ／分で８０分間かけて調製逆相ＨＰＬＣにより 精製した。生成物含有フラクションを集め、凍結乾燥させて、精製された環状ペ プチドを生じさせた（３５３ｍｇ）。ペプチド［ＨＰＬＣで単一ピーク、滞留時 間２１．１９分、Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ５４カラム上、０．１％トリフルオロ酢 酸（１０〜４０％）を含有 するアセトニトリル−水の傾斜濃度液を用いて、流量１．０ｍｌ／分で３０分間 かけて］をアミノ酸分析及び質量分析法により特徴付けた（第２表）。 ４．化合物２の合成 化合物１のために使用した方法（第１図参照）により、β−アラニンの代わり にγ−アミノ酪酸を使用するという点は変えて、化合物２を合成した。 ５．化合物３〜５の合成 環状ペプチドｃ（ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ｏ ｒｎ）又はｃ（ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ ）を必要なアルデヒド又はケトン及びシアノ水素化硼素ナトリウムと反応させる ことによって前記環状ペプチドを製造した。例えば化合物３は、環状ペプチドＣ （ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ｏｒｎ）（１００μ モル）を無水アセトン（２ｍｌ）中に溶解させ、シアノ水素化硼素ナトリウム（ １０当量）と反応させることによって製造した。１時間後、反応混合物を蒸発乾 固させ、水（５ｍｌ）中に溶解させ、酢酸で酸性にし、高度真空下で蒸発させた 。粗製ペプチドをＨＰＬＣにより精製した。 親環状ペプチドｃ（ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ− Ｏｒｎ）及びｃ（ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌ ａ）は、図３の化合物２４用に記載した方法により合 成された。 ６．化合物６〜８の合成 化合物６〜８のために必要な線状ペプチドＤ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂−ＭｅＩｌ ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ） ２−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ｐｈｅ及びＤ−ｈ Ａｒｇ（Ｅｔ）₂−Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂−ＭｅＩｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯＢ ｕｔ）−Ｖａｌは、化合物２４のために記載した方法により得られた。この合成 は必要なＣ−末端アミノ酸、即ち、化合物６のためにはＤ−Ａｌａ）化合物７の ためにはＤ−Ｐｈｅ及び化合物８のためにはＶａｌから出発した。Ｂｏｃ−Ｄ− ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂に関する合成法は、既にこれまで文献に報告されている［Ｈ ．Ｂ．Ａｒｚｅｎｏその他、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｓ、２０（１９９０）３４３３〜３４３７；Ｊ．Ｊ．Ｎｅｓｔｏｒ、Ｊｒ．その 他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５（ １９９２）３９４２〜３９４８］。この誘導体を標準的方法によりＦｍｏｃ−Ｄ −ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂に変え、前記線状ペプチドの合成時に使用した。次いで化 合物６〜８は相応する線状ペプチドから、第３図の化合物２４のために記載した 閉環法により得られた。 ７．化合物９〜１９の合成 化合物２４に関して記載した方法と同様にして環状ペプチド９〜１９を合成し た。第１表に記載したように、線状ペプチドは、全てＦｍｏｃ−Ｖａｌｉｎｅか ら出発してクロロトリチル樹脂上で合成された。 ８．化合物２１〜２３及び２５〜３２の合成 化合物２０に関して記載した方法と同様にして環状ペプチド２１〜２３及び２ ５〜３２を合成した。第１表に記載したように、線状ペプチドは全てＦｍｏｃ− Ｖａｌｉｎｅから出発してクロロトリチル樹脂上で合成された。 ９．化合物３３〜３５の合成 化合物２０のために記載した方法と同様にして環状ペプチド３３〜３５を合成 した。しかし第１表で明らかなように、３種類の線状ペプチドが、クロロトリチ ル樹脂上でＦｍｏｃ−Ｖａｌｉｎｅの代わりに、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₅−Ｃ ＯＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ又はＦｍｏｃ−ＮＨ （ＣＨ₂）₂−Ｓ−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ誘導体から出発して合成された。 市販されているアミノヘキサン酸とは異なり、他の２つの硫黄含有アミノ酸誘 導体は、下記の方法により合成した。Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₂−Ｓ−ＣＨ₂− ＣＯＯＨ（前記で使用）は、２−アミノエタンチオール及び２−ブロモ酢酸から 得られた。２−アミノエタンチオールヒドロクロリド（５．６８ｇ、５０ミリモ ル）を水（２００ｍｌ）中に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（２５．２ｇ、３０ ０ミリモル）をこれに加えた。アセトニトリル（１００ｍｌ）中に溶解させた２ −ブロモ酢酸（６．９５ｇ、５０ミリモル）を前記の攪拌溶液に３０分間かけて 少量宛加えた。室温で１時間後に、アセトニトリル（１５０ｍｌ）中の９−フル オレニルメチル−Ｎ−ヒドロスクシンイミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）（１６．８５ ｇ、５０ミリモル）の溶液を加え、１６時間攪拌を続けた。僅かに混濁した溶液 を蒸発させて、大部分のアセトニトリルを除去し、残留水溶液を酢酸エチルで抽 出し（３×５０ｍｌ）、塩酸の添加により酸性にした（ｐＨ２）。白色固体を集 め、水で洗浄し、真空中で４５℃で乾燥させた。収量１７ｇ（９５％）、（Ｍ＋ Ｈ）⁺３５８．０。 Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₂−Ｓ−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨは、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ ＣＨ₂）₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨのための前記の方法により、誘導体３−ブロモ プロピオン酸及び２−アミノエタンエチオールを使用することによって得られた 。（Ｍ＋Ｈ）⁺３７２。 １０．化合物３６〜３８の合成 化合物２０のために記載した方法と同様にして環状ペプチド３６〜３８を合成 した。第１表に記載したように、化合物６１は除いて線状ペプチドは全て、クロ ロトリチル樹脂上でＦｍｏｃ−Ｖａｌｉｎｅから出発して合成された。第２図で 明らかなように、化合物６ １はＦｍｏｃ−Ａｌａから出発して製造された。硫黄を含有するアミノ酸基−Ｎ Ｈ（ＣＨ₂）₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＯ−は、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ₂）₂−Ｓ−ＣＨ₂− ＣＯＯＨを使用することによって、線状ペプチドの合成の任意の段階で組み入れ られた。 例２−試験管内及び生体内分析 この例で次の略語及び材料を使用する。 ＭＯＬＴ−４細胞−リンパ球Ｔセルライン（ＡＴＣＣ誘導） フィブロネクチン−Ｅ．ネングバル（Ｎｅｎｇｖａｌｌ）、Ｅ．ルースラーティ （Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）著Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ第２０巻、１〜５頁（１９ ７７年）及びＪ．フォルシス（Ｆｏｒｓｙｔｈ）その他著Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第２１５巻、３１１〜３１６頁（１９９２年）に記載の 方法により製造されたもの又は試薬級ヒトフィブロネクチン（ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）。後者はヒトの血漿からゼ ラチン−セファローゼ親和性クロマトグラフィーにより精製した。供給源：バイ オ プロダクツ エルストリー英国（Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｅｌｓｔｒｅ ｅ ＵＫ）。製造番号９１３６。フィブロネクチンに関する論文は“フィブロネ クチン−アドヘシブ グリコプロテインズ オブ セル サーフェス アンド ブラッドである（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎｓ−Ａｄｈ ｅｓｉｖｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ）”Ｋ．Ｍ．ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）及びＫ．オルデン（Ｏ ｌｄｅｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７５（１９７８）１７９〜１８４ 。ｒｓＶＣＡＭ−１−（参照文献源：Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １９９１ １７８Ｎ３；１４９８〜１５０４）。ＶＣＡＭ−１は、 特定の炎症性刺激に反応して血管内皮により並びにマクロファージ様及びダンド リティック（ｄａｎｄｒｉｔｉｃ）細胞タイプで製造された細胞表皮糖蛋白質で ある。ＶＣＡＭ−１は、単核白血球上に存在するインテグリンＶＬＡ−４と相互 に作用する。 ＶＣＡＭ−１のｃＤＮＡを、ＩＬ−１β−活性化ヒト内皮細胞からｃＤＮＡラ イブラリーをスクリーニングすることによって単離した。多量の蛋白質が昆虫細 胞中でバクロウィルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）表現系を使用して発現させた 。ＶＣＡＭ−１表現細胞は、種々のＶＬＡ−４表現セルラインと特異的に結合す ることが実証された（Ｊｕｒｋａｔ、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７）。 ＶＣＡＭ−１に関するその他の文献は、“エクスプレション アンド ファン クショナル キャラクタリゼイション オブ リコンビナント ヒューマン バ スキュラール セル アドヘジョン モレキュール− １（ＶＣＡＭ−１）シンセサイズド バイ バクロビールス−インフェクティド インセクト セルズ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍ ａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ （ＶＣＡＭ−１）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｄ ｂｙ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−Ｉ ｎｆｅｃｔｅｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｋ．Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒ ｇ、Ｒ．Ａ．Ｓｔｒａｎｅｙ、Ｒ．Ｊ．Ｔｒｉｔｃｈ、Ｗ．Ｍ．Ｍａｃｋｉｎ ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｇｅｏｒｇｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ ｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）４（１９９３）５８５〜５９３）である。 ＲＰＭＩ１６４０−細胞培地。源：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ Ｎｏ３１８７０−０２５）。 ＦＣＳ−胎児コウシ血清。源：Ａｄｖａｎｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕ ｃｔｓ（Ｗｅｓｔ Ｍｉｄｌａｎｄｓ ＵＫ）Ｃａｔ Ｎｏ ＡＳ−３０２−５ ０。 ＢＣＥＣＦ−ＡＭ−２’，７’−ビス（２−カルボキシエチル）−５−（ε６） −カルボキシフルオロセイン アセトキシメチル エステル）。源：Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ ＵＳＡ；Ｃａｔ Ｎｏ Ｂ−１１５０。 ＣＨＯ ＤＧ４４−チャイニーズハムスタ−卵巣セルライン（ＡＴＣＣ誘導；文 献：Ｓｏｍ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ１９８６；１２；５５５〜６６６） ＤＭＥＭ−ダルベッコの変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆ ｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）。源；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ Ｎｏ４１９６６−０２９）。 抗生物質−ペニシリン−ストレプトマイシン。源；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆ ｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ Ｎｏ１５０７０−０２２）。 Ｆｌｕｏｒｓｋａｎ^TM−は蛍光計である。 ＨＵＶＥＣ−ヒト膀静脈内皮細胞。組織試料から製造した初代培養。（文献：Ｊ ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９７３ ５２；２７４５〜２７４７）。 組み換えヒトＴＮＦα−腫瘍壊死因子 アルゼット浸透ミニポンプ−皮下移植マイクロ浸透ポンプ、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ。 下記分析及びモデルで化合物に関する文献は、本発明の環状ペプチドに関する 。 ２．１ 細胞／不動化リガンド分析 ２．１．１ ＭＯＬＴ−４細胞／フィブロネクチン−ＶＣＡＭ−１接着分析 ＭＯＬＴ−４細胞／フィブロネクチン−ＶＣＡＭ−１接着分析を用いて、ＭＯ ＬＴ−４細胞膜上に表現されるインテグリンＶＬＡ４（Ｖｅｒｙ Ｌａｔｅ Ａ ｎｔｉｇｅｎ、α４／β１）のフィブロネクチン又は組み換え可溶性ＶＣＡＭ− １（ｒｓＶＣＡＭ−１）との相互作用を調べた。フィビロネクチン又はｒｓＶＣ ＡＭ−１をポリスチレン９６ウエルマイクロ滴定プレート上に各々２０μｇ／ｍ ｌ及び１μｇ／ｍｌの濃度で１晩４℃で塗布した。これに次いで、濃ＢＳＡ溶液 （１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて非特異的結合部位を遮断した。これらの溶液を吸引 後、同じ容量の化合物及びＭＯＬＴ−４細胞懸濁液（細胞１ｘ１０Ｅ６／ｍｌ） を加えた。接着は３７℃で２時間培養の間に起こり、非接着細胞又は緩い接着細 胞を静かな攪拌、次いで真空吸引により除去した。残りの接着細胞の定量は、分 光光度計で読みとる酸ホスファターゼ活性の比色分析により行った。接着を阻害 した化合物の吸光度値はより低かった。標準、対照及び試験条件を３回分析した 。阻害％を、各プレートで全体（阻害剤なし）及び非特異的（フィブロネクチン なし）標準に対して算出した。 ２．１．２ ＪＹ細胞／ＭＡｄＣＡＭ−１接着分析 ＪＹ細胞（ヒトリンパ芽球）／ＭＡｄＣＡＭ−１接着分析を使用して、ＪＹ細 胞膜上で表現されるインテグリンα４β７の組み換え可溶性ＭＡｄＣＡＭ−１と の相互作用を調べた。ＭＡｄＣＡＭ−１をポリスチレン９６ウエルマイクロ滴定 プレート上に１時間１０μｇ／ｍｌの濃度で塗布した。これに次いで、濃ＢＳＡ 溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、非特異的結合部位を遮断した。これらの溶液 を吸引後、同じ容量の化合物及びＪＹ細胞懸濁液（細胞１ｘ１０Ｅ６／ｍｌ）を 加えた。分析はＪＹ細胞上でα４β７を活性化するために最終濃度０．２ミリモ ルでマンガンを含有した。接着は３７℃で２０分間の培養の間に行われた。非接 着細胞又は緩く接着細胞を静かな攪拌、次いで真空吸引により除去した。次いで 接着細胞を５％グルタルアルデヒドで２０分間固定し、２０分間０．１％クリス タルバイオレット溶液で染色した。クリスタルバイオレットは１０％酢酸を添加 することによって溶解させ、接着細胞数を分光光度計で４０５ｎｍで吸光度を測 定することによって定量した。接着を阻害した化合物の吸光度値はより低かった 。標準、対照及び試験状態は５回分析した。阻害％を全体（阻害剤なし）及び非 特異性（ＭＡｄＣＡＭ−１）標準に関して各プレートで算出した。 ２．２ 細胞−細胞アッセイ ２．２．１ ＶＣＡＭ−１ＣＨＯ細胞 ＭＯＬＴ−４細胞（ＦＣＳ５％及びＬ−グルタミン２ミリモルを補充したＲＰ ＭＩ１６４０）を蛍光染料ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（細胞３Ｘ１０Ｅ６当たり３０μｇ ／ｍｌ）で標識付けした。全部の長さのＶＣＡＭ−１ｃＤＮＡで遺伝子移入した ＣＨＯＤＧ４４をＦＡＣＳ分析によるＶＣＡＭ−１表現のために選択し、９６ウ エル組織培養プレート中で増殖させて融合させた。接着分析に使用する前に、Ｃ ＨＯ ＤＧ４４細胞を３回洗浄した（ＦＣＳ５％及びＬ−グルタミン２ミリモル を補充したＤＭＥＭ）。ＭＯＬＴ−４（細胞１０Ｅ５／ウエル）細胞をＶＣＡＭ −１表現ＣＨＯ細胞上に塗り、３７℃、５％ＣＯ₂で３０分間培養した。非接着 細胞をプレートを３回（ＦＣＳ５％及びＬ−グルタミン２ミリモルで補充したＤ ＭＥＭ）洗浄することによって除去し、次いでプレートをティッシュペーパー上 で吸い取り乾燥させた。２％トリトンＸ−１００ １００μｌを各ウエルに加え 、プレートをフルオロスキャン（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ）を用いて読みとった（ 励起＝４８５ｎＭ、放射＝５３８ｎＭ）。ＨＵＶＥＣ培地に添加する前に、化合 物を適当な溶剤中に溶解させ、ＭＯＬＴ−４細胞に加えた。接着阻害を、対照賦 形剤処理細胞と化合物処理細胞の接着（蛍光）濃度を比較することによって算出 した。 ２．２．２ ヒト臍静脈内皮細胞 ＭＯＬＴ−４細胞（ＦＣＳ５％及びＬ−グルタミン２ミリモルを補充したＲＰ ＭＩ１６４０）を蛍光染料ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（細胞３Ｘ１０Ｅ６当たり３０μｇ ／ｍｌ）で標識付けした。一次ＨＵＶＥＣを９６ウエ ル組織培養プレート中で増殖させ融合させ、１８時間組み換えヒトＴＮＦα２Ｕ ／ｍｌと一緒に培養した。接着分析に使用する前に、ＨＵＶＥＣ単層を３回洗浄 した（ＦＣＳ５％、Ｌ−グルタミン２ミリモル及び抗生物質２％を補充したＭ１ ９９）。ＭＯＬＴ−４（細胞１０Ｅ５／ウエル）細胞を一次ＨＵＶＥＣ上に塗り 、３７℃、ＣＯ₂５％で３０分間培養した。非接着細胞をプレートを３回洗浄す る（ＦＣＳ５％及びＬ−グルタミン２ミリモルを補充したＲＰＭ１ １６４０） ことによって除去し、ティッシュペーパー上で拭き取ることにより乾燥させた。 ２％トリトンＸ−１００１００μｌを各ウエルに加え、プレートをフルオロスキ ャンを用いて読みとった（励起＝４８５ｎＭ）放射＝５３８ｎＭ）。ＨＵＶＥＣ 培地に添加する前に、化合物を適当な溶剤中に溶解させ、ＭＯＬＴ−４細胞に加 えた。接着阻害を、対照賦形剤処理細胞と化合物処理細胞の接着（蛍光）濃度を 比較することによって算出した。 ２．３生体内接触性過敏反応 オキサゾロン（アセトン／オリーブ油中０．２４％５０μｌ）を背中の剃毛し た皮膚に局所適用することによって、Ｂａｌｂ／Ｃ雄マウス（２０〜２５ｇ）を 感作させる。７日後、オキサゾロン（アセトン／オリーブ油中０．２５％２５μ ｌ）を耳表面に局所適用することによってこのマウスを攻撃する。耳の膨張は２ ４時間に渡って起こり、その後耳の厚さを測定し、攻撃前と比較して、耳の厚さ の増加％を計算する。化合物は、１０〜０．００１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内の用 量で、オキサゾロン攻撃の２４時間前に移植しておいた皮下アルゼット浸透ミニ ポンプから連続注入により送達させる。炎症反応の阻害をベヒクル処置動物を化 合物処置群と比較して計算する（ｎ＝１群当たり動物６匹）。 ２．４ 生体内卵白アルブミン遅延型過敏症モデル Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス（２０〜２５ｇ）を蛋白アルブミン（Ｓｉｇｍａ；完全 フロインドアジュバント；Ｄｉｆｃｏと混合した（１：１）溶液２ｍｇ／ｍｌの 皮下注射０．１ｍｌ）の乳濁液で脇腹を免疫処理した。７日後に、卵白アルブミ ン（食塩水中１％熱凝縮卵白アルブミン３０μｌ）の左後足中への足底下注射に よってマウスを攻撃した。足の膨張は２４時間に渡って起こり、その後足の厚さ を測定し、攻撃前の厚さと比較した。足の厚さの増加％を計算した。化合物は、 １０〜０．００１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内の用量で、オキサゾロン攻撃の２４時 間前に移植しておいた皮下アルゼット浸透ミニポンプから連続注入により送達さ せた。炎症反応の阻害をベヒクル処置動物を化合物処置群と比較して計算する（ ｎ＝１群当たり動物５匹）。 ２．５ 生体内抗原誘発関節炎モデル マウスに免疫付与し、７日後に完全フロインドアジュバント中のメチル化ＢＳ Ａ１００μｇ（皮下）、次いで百日咳菌の腹腔内注射によりブースト（追加抗原 刺激）した。ブーストの２週間後に、動物をメチル化−ウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）１００μｇで関節内に攻撃し、炎症／関節炎の程度を関節の膨張、急性相 蛋白質の病歴及び変化を測定することによって調べた。化合物は、３０〜０．０ ０１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内の用量で、攻撃の２４時間前に移植しておいた皮下 アルゼット浸透ミニポンプから連続注入により送達させる。炎症／関節炎の程度 を対照動物及び反対側膝と比較する。 ２．６ 実験的自己免疫脳脊髄炎モデル 疾患は、百日咳毒素の腹腔内注射と組み合わせた脊髄ホモジェネート、髄鞘塩 基蛋白質（ＭＢＰ）又は脳脊髄ペプチドと完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ ）との混合物の皮下注射により誘発させた。急性病気用に百日咳注射を免疫処理 ２日後に繰り返した。慢性病気用には百日咳を省略し、マウスにはＣＦＡ中の抗 原の注射を２回７日間隔で行った。病気は組織学により臨床評価により評価した 。化合物は、１０〜０．００１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内の用量で、攻撃の２４時 間前に移植しておいた皮下アルゼット浸透ミニポンプから連続注入により投与し た。症状を対照動物と比較した。 ２．７ マウス細気管支洗浄好酸球増加モデル 雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０〜２５ｇ）を、卵白アルブミン１００μｇ及 び水酸化アルミニウム２．５ｍｇを含有する食塩水０．１ｍｌの腹腔内注射によ り４〜５日間隔で３回感作した。最後の感作注射の１０〜１４日後に、動物をペ ルスペックス（Ｐｅｒｓｐｅｘ）室に入れ、食塩水中に溶解させた（１５ｍｇ／ ｍｌまで）エーロゾル化した卵白アルブミンを約３１／分で室に入る空気蒸気中 へ、ドビリビスアエロソニツク（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ Ａｅｒｏｓｏｎｉｃ）噴 霧器を用いて送り込んで、卵白アルブミンに曝した（０．５〜１時間）。マウス は３〜４日間、２〜４回、エーロゾル化させた卵白アルブミンで処理し、最後に 処理した日に過剰量のナトリウムバルビタールで殺した。各マウスの気管支を出 し、球尖端針でカニューレ挿入し、気管支肺胞洗浄を食塩水４×１ｍｌで行った 。たまった洗浄液中の細胞をガラス顕微鏡スライド上に塗布し、固定し、ロイコ スタット（Ｌｅｕｋｏｓｔａｔ）染色で染色した。微分細胞数を白血球２００個 の最小値を数えることによって行い、好酸球の％を計算した。試験化合物は、１ ０〜０．００１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内の用量で、エーロゾル化卵白アルブミン 攻撃の２４時間前に移植しておいた皮下アルゼット浸透ミニポンプから連続注入 により投与した。好酸球の阻害をベヒクル又は化合物を投与したマウスを比較す ることによって計算した（１群当たりｎ＝５〜１０）。 ２．８コラーゲン誘発関節炎モデル ＤＢＡ／１雄マウス（ｅｘ Ｈａｒｌａｎ／Ｏｌａｃ英国）を同重量部の０． ０５Ｍ酢酸中のウシコラーゲンＩＩ型（２ｍｇ／ｍｌ）及び完全フロインドアジ ュバント（Ｓｉｇｍａ）の混合物０．１ｍｌで免疫処理した。この混合物を尾の 根元に注射した。２０日後、化合物又はベヒクルを１０〜３ｍｇ／ｋｇ／日の範 囲内の用量で、皮下アルゼット浸透ミニポンプから投与した。次の日に各動物に 酢酸中のコラーゲンＩＩ型０．１ｍｌの腹腔内注射を行った。ベヒクルで処理し た動物及び化合物で処理した動物の関節炎の程度を比較した。 調製ＨＰＬＣは、逆相（Ｃ₁₈）直径１インチヴィダック（Ｖｙｄａｃ）カラム （２１８ＴＰ１０２２、２２×２５０ｍｍ）を用いて実施した。若干の場合（表 に記載してある）に、デルタパック（Ｄｅｔａｐａｋ）カラム（３０×３００ｍ ｍ）又はヴィダック（Ｖｙｄａｃ）４”カラムを使用した。溶剤系は水及びアセ トニトリルから成っていた（各々０．１％トリフルオロ酢酸を含有する）。カラ ムをヴィダックカラムに関しては１０ｍｌ／分、デルタパックカラムに関しては ３０ｍｌ／分及び４”ヴィダックカラムに関しては１００ｍｌ／分の速度で、ア セトニトリル濃度を増大させた傾斜濃度液（溶剤比及び時間は表に記載してある ）を使用して溶離した。 分析ＨＰＬＣは、逆相（Ｃ₁₈）ヴィダックカラム（２１８ＴＰ５４、４．６× ２５０ｍｍ）又はノヴァパック（Ｎｏｖａｐａｋ）カラム（３．９×１５０ｍｍ ）のいずれかを用いて行った。前記表に他に記載のない限り、ヴィダックを化合 物用に使用した。溶剤系は水及びアセトニトリルから成っていた（各々０．１％ トリフルオロ酢酸を含有する）。カラムを１ｍｌ／分の速度で、アセトニトリル 濃度を増大させた傾斜濃度液（溶剤比及び時間は表に記載してある）を使用して 溶離した。アミノ酸分析で非天然アミノ酸の存在が観察されたが、量は測定しな かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 29/00 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/78 Ｃ０７Ｋ 14/78 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＺＷ 【要約の続き】 を阻害する。これらは、リウマチ性関節炎、多発性硬化 症、喘息、乾せん、炎症性腸疾患及びインシュリン依存 性糖尿病での治療に適用される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式 ［式中、Ｘａａ₁は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されたＬ−アミノ酸； Ｐｈｅ及びＭｅｔから選択されたＤ−アミノ酸、そのα−炭素又はα−アミノ基 上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬ−及びＤ−アミノ酸；及びＭｅＩ ｌｅから選択されたものであり；Ｘａａ₂は、そのα−炭素又はα−アミノ基上 でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬｅｕであり；Ｘａａ₃は、そのα− 炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｓｐであり ；Ｘａａ₄は、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換され ていてよいＶａｌであり；Ｘ¹は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜 4} アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、 ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭ ｅ₂）及びＡｒｇ（Ｐｍｃ）から選択されたＤ−アミノ酸； ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂ ）_yＣＯ（式中ｙは１又は２である）から選択されたものであり；Ｘ²は、それら のα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｌａ 、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒ ｎ（Ｍｅ₂）から選択されたＤ−アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ及びＮＨ （ＣＨ₂）_xＣＯ（式中ｘは２又は３である）から選択されたものであり；Ｘａａ₅ 及びＸａａ₆は、各々無関係に、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アル キル基で置換されていてよいＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸であ り；ｐは０又は１であり；ｑは０であるか又はｐが１である場合にはｑは０又は １であるが；その際、Ｘａａ₁がＭｅＩｌｅであり、Ｘａａ₂がＬｅｕであり、Ｘ ａａ₃がＡｓｐであり、Ｘａａ₄がＶａｌであり、ｐ及びｑが両方とも０である場 合で、 ｉ）Ｘ¹がＤ−Ａｌａである場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｒｇ又はＤ−Ｌ ｙｓではなく； ｉｉ）Ｘ¹が である場合には、Ｘ²はＤ−Ａｒｇではなく； ｉｉｉ）Ｘ¹がＤ−Ａｒｇである場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｒｇ又はＤ −Ｈｉｓではなく；ｉｖ）Ｘ¹がＤ−Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）又はＤ−Ａｒ ｇ（Ｐｍｃ）である場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａではなく； ｖ）Ｘ¹がＤ−Ｌｙｓである場合には、Ｘ²はＤ−Ａｌａ又はＤ−Ｌｙｓではなく ； ｖｉ）Ｘ¹がＤ−Ｐｈｅ又はＤ−Ｔｒｐである場合には、Ｘ²はＤ−Ｌｙｓ又はＤ −Ａｒｇではないという条件を伴う］の環状ペプチド又はその塩。 ２．式中のＸａａ₁は、ＭｅＩｌｅ、ＭｅＰｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇから選択され たＬ−アミノ酸；及びＰｈｅ及びＭｅｔから選択されたＤ−アミノ酸から選択さ れたものであり、Ｘａａ₂、Ｘａａ₃及びＸａａ₄は、各々、Ｌｅｕ、Ａｓｐ及び Ｖａｌであり；Ｘ¹は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、ｈＡｒｇ（ Ｅｔ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｏｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）及びＡ ｒｇ（Ｐｍｃ）から選択されたＤ−アミノ酸； ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ；及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中、ｙは１又は ２である）から選択されたものであり、Ｘ²は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ ｓ、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒｎ（Ｍｅ₂）から選択さ れたＤ−アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ（式中 、ｘは２又は３である）から選択され たものであり；Ｘａａ₅及びＸａａ₆は、各々無関係に、Ａｌａ又はＡｒｇから選 択されたＤ−アミノ酸である、請求項１に記載の環状ペプチド又はその塩。 ３．式中のＸ¹、Ｘ²、（Ｘａａ₅）_p及び（Ｘａａ₆）_qのいずれか２つが、Ｄ−Ａ ｒｇを表わす、環状ペプチド又はその塩。 ４．式 ［式中、Ｘａａ₁は、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されたＬ−アミノ酸； Ｐｈｅ及びＭｅｔから選択されたＤ−アミノ酸、そのα−炭素又はα−アミノ基 上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬ−及びＤ−アミノ酸；及びＭｅＩ ｌｅから選択されたものであり；Ｘａａ₂は、そのα−炭素又はα−アミノ基上 でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＬｅｕであり；Ｘａａ₃は、そのα− 炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｓｐであり ；Ｘａａ₄は、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換され ていてよいＶａｌであり；Ｘ¹は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜 4} アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、 ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）、Ｏ ｒｎ（Ｍｅ₂）、Ｌｙｓ（ＣＨＭｅ₂）及びＡｒｇ（Ｐｍｃ）から選択されたＤ− アミノ酸； ＮＨ（ＣＨ₂）₅ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中ｙは１又は２で ある）から選択されたものであり；Ｘ²は、それらのα−炭素又はα−アミノ基 上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｌａ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、 ｈＡｒｇ（ＥＴ）₂、Ｏｒｎ（ＣＨＭｅ₂）及びＯｒｎ（Ｍｅ₂）から選択したＤ −アミノ酸；ＮＨ（ＣＨ₂）₂ＳＣＨ₂ＣＯ及びＮＨ（ＣＨ₂）_xＣＯ（式中ｘは２ 又は３である）から選択されたものであり；Ｘａａ₅及びＸａａ₆は、各々無関係 に、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよい Ａｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸であり；ｐは０又は１であり；ｑ は０であるか又はｐが１である場合にはｑは０又は１であるが、その際、ｐ及び ｑが両方とも０である場合には、Ｘａａ₁はＭｅＩｌｅでないという条件を伴う ］の環状ペプチド又はその塩。 ５．式中のＸａａ₁がＭｅＰｈｅである、請求項４に記載の環状ペプチド。 ６．式 ［式中、Ｘａａ₁は、ＭｅＰｈｅ及びＭｅＩｌｅから選択されたＬ−アミノ酸で あり；Ｘａａ₂は、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換 されていてよいＬｅｕであり；Ｘａａ₃は、そのα−炭素又はα−アミノ基上で Ｃ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＡｓｐであり；Ｘａａ₄は、そのα−炭 素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されていてよいＶａｌであり； Ｘ¹は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル基で置換されて いてよいＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸； 及びＮＨ（ＣＨ₂）₂Ｓ（ＣＨ₂）_yＣＯ（式中ｙは１又は２である）から選択され たものであり；Ｘ²は、それらのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アルキル 基で置換されていてよいＡｌａ及びＡｒｇから選択されたＤ−アミノ酸及びＮＨ （ＣＨ₂）_xＣＯ（式中ｘは２又は３である）から選択されたものであり；Ｘａａ₅ 及びＸａａ₆は、各々無関係に、そのα−炭素又はα−アミノ基上でＣ_{1 〜4}アル キル基で置換されていてよいＡｌａ及びＡｒｇから選択され たＤ−アミノ酸であり；ｐは１であり；ｑは０又は１である］の環状ペプチド又 はその塩。 ７．式中のｐが１であり、ｑが１である、請求項６に記載の環状ペプチド又はそ の塩。 ８．式中のｐが１であり、ｑが０である、請求項６に記載の環状ペプチド又はそ の塩。 ９．環状ペプチドが、 から選択されたものである、請求項１に記載の環状ペプチド。 10．から選択されたものである、請求項９に記載の環状ペプチド。 11．式：ｃ（ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｈｉｓ） の請求項１０に記載の環状ペプチド。 12．式：ｃ（ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ） の請求項１０に記載の環状ペプチド。 13．式：ｃ（ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ− Ｄ−Ａｒｇ）の請求項１０に記載の環状ペプチド。 14．式：ｃ（ＭｅＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ− Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇｓ）の請求項１０に記載の環 状ペプチド。 15．請求項１から１４のいずれか１項に記載の環状ペプチド又は製薬的に認容性 のその塩と製薬的に認容性の希釈剤又は賦形剤から成る製薬的組成物。 16．請求項１から１４のいずれか１項に記載の環状ペプチド又は製薬的に認容性 のその塩を製造するに当たり、 （ａ）必要な線状ペプチドを段階的方法（１回に１個のアミノ酸を加える）で会 合させ、次いで任意のＮ−及びＣ−末端保護基を選択的に除去し、閉環させ、最 後に脱プロトン化して、請求項１から１４までのいずれか１項記載の環状ペプチ ドにし、場合により、所望に応じてはこうして得た生成物をその塩に変える； （ｂ）カルボン酸基を含有する一つ又は誘導体及びアミノ基を含有するもう一つ からの、２個のペプチド単位を結合させることによってアミド結合を形成させて 、請求項１から１４のいずれか１項に記載の保護されたか又は保護されていない 環状ペプチドを製造するようにし、所望により、保護基を工程（ｃ）を用いて除 去し、場合により、所望によりこうして得た生成物をその塩に変える； （ｃ）１個以上の慣用のペプチド保護基を、式 ［式中、Ｐｒ¹はＸａａ₃の側鎖中の酸基上の保護基である］の保護された環状ペ プチドから除去して、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の環状ペプチ ドを生じさせ、場合により、同時にか又は引き続いて、存在するその他の付加的 な慣用のペプチド保護基を除去し、場合により、所望の場合にはこうして得た生 成物をその塩に変える ことから選択された工程を特徴とする、環状ペプチド又はその塩の製法。 17．請求項１から１４までのいずれか１項に記載の環状ペプチド又はその製薬学 的に認容性の塩の有効量を、治療を必要とする哺乳類に投与することを特徴とす る、治療を必要とする哺乳類におけるＶＣＡＭ−１及び／又はフィブロネクチン とインテグリン受容体ＶＬＡ−４の間の相互作用を阻害する方法。 18．多発性硬化症、リウマチ性関節炎、喘息又は乾せんを治療するための請求項 １７に記載の方法。 19．治療が必要な哺乳類でＭＡｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７の間の相互 作用を抑制するに当たり、前記哺乳類に有効量の請求項１から１４のいずれか１ 項に記載の環状ペプチド又はその塩又は請求項１５に記載の製薬的組成物を投与 することを特徴と する、治療が必要な哺乳類でＭＡｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７の間の相 互作用を抑制する方法。 20．ＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンとインテグリン受容体ＶＬＡ−４の間の 相互作用により媒介される病気又は症状の治療に使用するための医薬の製造にお ける、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の環状ペプチド又はその製薬 的に認容性の塩の使用。 21．ＭＡｄＣＡＭ−１とインテグリンα４β７の間の相互作用により媒介される 病気又は症状の治療に使用するための医薬の製造における、請求項１から１４ま でのいずれか１項に記載の環状ペプチド又はその製薬的に認容性の塩の使用。