JP2002345455A - 軟骨培養用基材及び軟骨修復材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 優れた軟骨組織形成促進効果を示し、生体内
に移植可能な軟骨を形成する。 【解決手段】 生体吸収性の多孔質に脂質結合グリコサ
ミノグリカンを結合し、軟骨培養用基材とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、軟骨細胞を培養す
るための軟骨培養用基材及び生体内への移植用の軟骨修
復材に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、脂質結合グリコサミノグリカンと
しては例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号、特開
平4-82836号及び特開平9-30979号に記載されたものが知
られており、これらの物質は未分化な細胞の骨への分化
を誘導することが知られている（特開2000-212204
号）。

【０００３】また、脂質結合グリコサミノグリカンやプ
ロテオグリカンは基材などへの肝細胞等の接着を抑制す
る働きがあることが示唆されている（特開平5-236951号
など）。

【０００４】一方、軟骨細胞を培養し、軟骨を形成させ
るための様々な軟骨培養用の基材が探索されており、例
えば生体分解性ポリマーやその多孔体を軟骨細胞の培養
用基材として用いることが知られている（例えばWO90/2
091号、 WO98/31345号など）。これらの公知の軟骨培養
用の基材も生体吸収性を有し、軟骨細胞の培養において
一定の効果を示すため、生体に移植をすることが可能で
あるが、増殖効率などの点で更に改良の余地があり、現
実に生体移植用の軟骨培養に使用されるまでには至って
いない。

【０００５】軟骨細胞を培養し、軟骨を作り出す技術及
び軟骨の移植に対する社会的な要請は高く、従来得られ
ている軟骨培養基材よりも、より軟骨細胞の増殖を促進
し、優れた軟骨形成を可能とし、生体内に移植した際に
生体内で分解・吸収されうる新たな軟骨培養用基材に対
する期待が高まっている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、従来
得られている軟骨培養基材よりも、より軟骨細胞の増殖
を促進し、優れた軟骨形成を可能とし、生体内に移植し
た際に生体内で分解・吸収されうる新たな軟骨培養用基
材を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは従来の軟骨
培養基材より優れた軟骨組織形成効果を有し、また生体
内に移植した際にも軟骨形成の継続が可能な軟骨培養用
基材を鋭意探索した結果、脂質結合グリコサミノグリカ
ンを生体吸収性の多孔質担体に担持させて得られる材料
が優れた軟骨組織形成促進効果を示すことを発見し、本
発明を完成させた。

【０００８】すなわち本発明の要旨は以下の通りであ
る。

【０００９】本発明の第一の要旨は、脂質とグリコサミ
ノグリカンとが化学的に結合した脂質結合グリコサミノ
グリカン又はその薬理学的に許容される塩を担持する生
体吸収性多孔質担体を含む軟骨培養用基材である。当該
軟骨培養用基材は、従来の軟骨培養用基材と比して更に
高い軟骨組織形成促進効果を奏する。

【００１０】本発明の第二の要旨は、上記軟骨培養用基
材と、該基材上に保持された軟骨由来の細胞とから少な
くともなる軟骨修復材である。本発明の軟骨培養用基材
は生体吸収性を有し、優れた軟骨細胞増殖効果を奏する
ため、本発明の軟骨培養用基材上で軟骨由来の細胞を培
養し、基材上に軟骨由来の細胞を保持させることにより
得られた材料は、生体内に移植すると該生体内で軟骨形
成を促進することが可能な代用軟骨としての役割を果た
し得、軟骨形成を補助するための優れた軟骨修復材とし
て有用である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳述する。

【００１２】本発明の軟骨培養用基材は、脂質とグリコ
サミノグリカンとが化学的に結合した脂質結合グリコサ
ミノグリカン又はその薬理学的に許容される塩を担持す
る生体吸収性多孔質担体を含むことを特徴とする。

【００１３】＜脂質結合グリコサミノグリカン＞本発明
に使用される脂質結合グリコサミノグリカンに含まれる
グリコサミノグリカンは、D-グルコサミン又はD-ガラク
トサミンと、D-グルクロン酸、L-イズロン酸及び／又は
D-ガラクトースの2糖の繰り返し単位を基本骨格として
構成される多糖であり、動物等の天然物から抽出された
もの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは
酵素的に合成されたもの等のいずれも使用することがで
きる。具体的には例えばヒアルロン酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸A、コン
ドロイチン硫酸C、コンドロイチン硫酸D、コンドロイチ
ン硫酸E、コンドロイチン硫酸K等）、コンドロイチンポ
リ硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケ
ラタン硫酸及びケラタンポリ硫酸等が挙げられ、コンド
ロイチン硫酸、ヘパリン及びヒアルロン酸が好ましく、
特にコンドロイチン硫酸が好ましいが、これらに限定さ
れるものではない。

【００１４】コンドロイチン硫酸は、一般に分子量約1,
000〜100,000程度であるが、約2,000〜80,000程度が好
ましく、特に約3,000〜70,000が好ましい。ヘパリンは
一般に分子量約1,500〜60,000程度であるが、約2,000〜
18,000程度が好ましく、特に約2,500〜17,000が好まし
い。また、ヒアルロン酸は一般に分子量約10,000〜15,0
00,000程度であるが、約15,000〜10,000,000程度が好ま
しく、特に約20,000〜5,000,000が好ましい。尚、グリ
コサミノグリカンの分子量とは、通常平均分子量を意味
し、一般的には極限粘度から算出される重量平均分子量
を指称する。

【００１５】また、上述のグリコサミノグリカンに結合
させる脂質としては、動物、植物、微生物などの天然物
由来、又は化学的もしくは酵素的に合成もしくは部分的
に分解された複合脂質又は単純脂質を使用することがで
き、リン脂質等のグリセロ脂質、長鎖の脂肪酸、長鎖の
脂肪族アミン、コレステロール類、スフィンゴ脂質、セ
ラミド等いずれも使用することができる。特にホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホス
ファチジルセリン、ホスファチジルトレオニン、エタノ
ールアミンプラスマロゲン、セリンプラスマロゲン、リ
ゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルイノシト
ール等のリン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシル
グリセロール等の中性脂質等のグリセロ脂質が好まし
い。これらのうち、リン脂質が特に好ましい。

【００１６】アシル基を有する脂質中のアシル基の鎖長
及び不飽和度は特に限定されないが、炭素数6以上のも
のが好ましい。アシル基としては例えばパルミトイル
（ヘキサデカノイル）又はステアロイル（オクタデカノ
イル）などが例示される。また、これらの脂質は通常使
用される薬理学的に許容される塩であってもよい。

【００１７】グリコサミノグリカンの脂質との結合位置
は特に限定されるものではないが、グリコサミノグリカ
ンの末端部が好ましく、特に還元末端への結合が好まし
い。また、結合の形態は特に限定されないが、特に化学
結合が好ましく、その中でも共有結合による結合が最も
好ましい。

【００１８】グリコサミノグリカンと脂質とが共有結合
した脂質結合グリコサミノグリカンの場合、グリコサミ
ノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホル
ミル基（ヘミアセタール基も含む）、水酸基もしくは１
級アミノ基等の官能基、またはグリコサミノグリカンに
別途導入された前記官能基と、脂質のカルボキシル基、
ホルミル基もしくは１級アミノ基等の官能基、または脂
質に別途導入された前記官能基との間で形成される酸ア
ミド結合（-CO-NH-）、エステル結合またはアミノアル
キル結合（-CH₂-NH-）によって共有結合したものが好ま
しい。

【００１９】特に、グリコサミノグリカンの還元末端の
ピラノース環を開環させ、化学的処理によって形成され
たグリコサミノグリカンのカルボキシル基（ラクトンを
含む）と、脂質の１級アミノ基との反応によって形成さ
れた酸アミド結合（-CO-NH-）、グリコサミノグリカン
のウロン酸部分のカルボキシル基と、脂質の１級アミノ
基との反応によって形成された酸アミド結合（-CO-NH
-）、またはグリコサミノグリカンの還元末端のピラノ
ース環を開環させ、化学的処理によって形成されたグリ
コサミノグリカンのホルミル基と、脂質の１級アミノ基
との反応によって形成されたシッフ塩基を還元して形成
されたアミノアルキル結合（-CH₂-NH-）により結合され
たものが好ましい。

【００２０】なお、上記共有結合に関与するアミノ基、
カルボキシル基、ホルミル基（ヘミアセタール基を含
む）、水酸基はグリコサミノグリカンまたは脂質に元来
存在するもの、これらに化学的処理を施すことによって
形成されたもの、あるいは上記官能基を末端に有するス
ペーサー化合物を、予めグリコサミノグリカンまたは脂
質と反応させることによって別途導入されたもののいず
れであってもよい。

【００２１】特に好ましい脂質結合グリコサミノグリカ
ンである、脂質がグリコサミノグリカンの還元末端に共
有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製造法とし
ては、例えば特開平4-80201号、特開平4-80202号、特開
平4-82836号及び特開平9-30979号に開示された方法が挙
げられ、例えば以下のような方法が使用できる。

【００２２】（還元末端限定酸化法）この方法は、グリ
コサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクトー
ス残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を還元
し、限定酸化（部分酸化）することにより、還元末端の
ピラノース環を特異的に開環（開裂）させるとともに、
該グリコサミノグリカンの還元末端にホルミル基を形成
させてアルデヒド化合物とし、このアルデヒド化合物の
ホルミル基と脂質の１級アミノ基とを反応させてシッフ
塩基を形成させ、次いでシッフ塩基を還元し、アミノア
ルキル結合（-CH₂-NH）を形成させて、グリコサミノグ
リカンと脂質とを共有結合させる方法である。

【００２３】グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基
の還元は、グリコサミノグリカンに対して5〜50当量程
度、好ましくは25〜30当量の還元剤（水素化ホウ素ナト
リウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の水素化ホウ
素アルカリ塩等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、
水、ホウ酸塩緩衝液等）中、通常10〜30℃、好ましくは
15〜25℃で行うことができる。

【００２４】上記還元後、限定酸化を行ってグリコサミ
ノグリカンの還元末端にホルミル基を有するアルデヒド
化合物を製造する。限定酸化は、上記還元後のグリコサ
ミノグリカンに対して1〜10当量、好ましくは3〜6当量
の酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム
等の過ヨウ素酸アルカリ塩等）を用い、通常0〜10℃、
好ましくは0〜4℃で行うことができる。

【００２５】得られたアルデヒド化合物と１級アミノ基
を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリ
ン脂質等）とを反応させてシッフ塩基を形成させる反応
は、水性溶媒（水、リン酸塩緩衝液等）または適当な有
機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
等）に上記アルデヒド化合物を溶解した溶液と、適当な
有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）に脂質を溶解
した溶液とを混合し、通常15〜60℃の温度で反応させる
ことができる。この反応時または反応終了後に適当な還
元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナ
トリウム等の水素化ホウ素アルカリ塩等）を作用させて
シッフ塩基を還元することができる。

【００２６】なお、本反応方法で脂質結合グリコサミノ
グリカンを製造する際に、１級アミノ基を有する脂質の
代わりに、１級アミノ基を有する２価官能性のスペーサ
ー化合物（例えば、エチレンジアミン等のアルキレンジ
アミン、またはリジン等のアミノ酸等）と上記アルデヒ
ド化合物とを反応させて、アミノアルキル結合（-NH₂-N
H-）を形成させ、次いで上記スペーサー化合物の他方の
官能基（例えばアミノ基）と反応し得る官能基（例え
ば、カルボキシル基）を有する脂質（例えば、モノアシ
ルグリセロールコハク酸エステル等のモノアシルグリセ
ロールジカルボン酸エステル）と反応させてもよい。

【００２７】（還元末端ラクトン化法）この方法は、グ
リコサミノグリカンの還元末端の糖残基であるガラクト
ース残基、ウロン酸残基またはヘキソサミン残基を酸化
することにより、還元末端のピラノース環を特異的に開
環（開裂）させて該グリコサミノグリカンの還元末端に
カルボキシル基を形成させて、次いでラクトン形成反応
に付すことによって該グリコサミノグリカンの還元末端
をラクトン構造とし、このラクトンと脂質の１級アミノ
基とを反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させ
ることによって、グリコサミノグリカンと脂質とを共有
結合させる方法である。

【００２８】グリコサミノグリカンの還元末端の糖残基
の酸化は、グリコサミノグリカンに対して2〜20当量程
度、好ましくは5〜15当量程度の酸化剤（ヨウ素、臭素
等）を使用し、適当な水性溶媒（例えば、水、リン酸塩
緩衝液等）中、通常0〜40℃、好ましくは15〜30℃で行
うことができる。

【００２９】上記酸化反応後、強酸性陽イオン交換樹
脂、例えばダウエックス50（商品名；ダウケミカル社
製）、アンバーライトIR-120（商品名；オルガノ社製）
及び／または酸（塩酸、硫酸等の無機酸、または酢酸、
クエン酸、コハク酸等の有機酸の酸無水物）で処理する
ことによって、グリコサミノグリカンの還元末端が特異
的にラクトン化されたラクトン化合物を製造することが
できる。

【００３０】得られたラクトン化合物と１級アミノ基を
有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン等のリン
脂質）との反応は、適当な水性溶媒（水、リン酸塩緩衝
液等）または適当な有機溶媒（ジメチルホルムアミド、
ジメチルスルホキシド等）にラクトン化合物を溶解した
溶液と、適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール
等）に脂質を溶解した溶液とを混合し、5〜80℃、好ま
しくは30〜60℃の温度で反応させればよい。

【００３１】なお、還元末端限定酸化法の場合と同様
に、１級アミノ基を有する脂質の代わりに、１級アミノ
基を有する２価官能性のスペーサー化合物と上記ラクト
ン化合物とを反応させて酸アミド結合（-CO-NH-）を形
成させ、スペーサー化合物の他方の官能基と脂質の官能
基（例えばカルボキシル基）とを反応させてもよい。

【００３２】但し、脂質がグリコサミノグリカンの還元
末端に共有結合した脂質結合グリコサミノグリカンの製
造方法はこれらの方法に限定されるものではなく、グリ
コサミノグリカンの還元末端に脂質を結合しうる方法で
あれば他の任意の方法によっても製造することができ
る。

【００３３】グリコサミノグリカンの末端以外に脂質を
導入する方法としては、例えばグリコサミノグリカンの
ウロン酸部分のカルボキシル基と脂質の１級アミノ基と
を反応させて、酸アミド結合（-CO-NH-）を形成させる
方法が挙げられる。

【００３４】上記反応に際し、縮合剤（例えば、1-エチ
ル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド等）を用いて酸アミド結
合（-CO-NH-）を形成させるか、あるいはウロン酸部分
のカルボキシル基を該縮合剤の存在下、活性化剤（例え
ば、N-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェノー
ル、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール等）と反応させて
活性エステルとした後、該脂質と反応させて酸アミド結
合（-CO-NH-）を形成させることができる。この様な方
法により、一分子のグリコサミノグリカンに対して複数
個の脂質を結合させることも可能である。

【００３５】尚、上記反応においてはグリコサミノグリ
カンのウロン酸部分を有機溶媒に溶解可能な塩（トリエ
チルアミン、トリブチルアミン等のアミンの塩等）と
し、反応を有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、ピリジン等）中で行うことが好ましい。

【００３６】脂質結合グリコサミノグリカンの塩として
は、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；
カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩；ト
リアルキルアミン等のアミン塩；及びピリジン等の有機
塩基との塩等が挙げられ、特に限定されないが、特に薬
理学的に許容されるアルカリ金属塩が好ましく、ナトリ
ウム塩が最も好ましい。

【００３７】上記のような脂質結合グリコサミノグリカ
ンの具体例としては、ジパルミトイル-L-(α-ホスファ
チジル）エタノールアミン結合ヒアルロン酸、ジパルミ
トイル-L-(α-ホスファチジル)エタノールアミン結合コ
ンドロイチン硫酸、ステアロイルパルミトイルホスファ
チジルセリン結合コンドロイチン硫酸、モノステアロイ
ルグリセロール・コハク酸エステル結合コンドロイチン
硫酸、ジパルミトイル-L-(α-ホスファチジル)エタノー
ルアミン結合ヒアルロン酸、ジパルミトイル-L-(α-ホ
スファチジル)エタノールアミン結合ヘパリン等が挙げ
られる。

【００３８】＜生体吸収性多孔質担体＞本発明に使用さ
れる多孔質担体は、調製された多孔質担体に細胞を播種
した場合、該細胞が多孔質担体表面または内部に付着・
保持され、多孔質担体とともに培養された場合に細胞が
増殖できるような多孔質形状を有し、生体に移植した際
に軟骨が再生された後は分解・吸収される生体吸収性を
有する多孔質担体である。さらに多孔質担体は、細胞を
播種したときに代用軟骨として生体内に存在する軟骨と
同様の適当な強度、弾性を有していることが好ましく、
少なくとも、一定の形状を保持する程度の強度、弾性を
有することがより好ましい。

【００３９】本発明にいう多孔質形状とは、電子顕微鏡
等により該担体を観察した際に、表面に多数の小孔が観
察されると共に、該小孔が担体の内部に存在する空隙
（ポア）と部分的に連通した構造を有しており、内部に
培養液等の液体、軟骨細胞、脂質結合グリコサミノグリ
カン、グリコサミノグリカン、コラーゲン等の細胞外マ
トリックス等を担持することが可能な構造をいう。上記
のような多孔質形状は、具体的にはスポンジ状、蜂の巣
状又はそれらと同等なものが挙げられるが、好ましくは
スポンジ状の形状を有するものである。

【００４０】上記多孔質担体の表面の小孔及び内部の空
隙の孔径は、細胞、好ましくは軟骨細胞を保持または担
持できる構造であれば特に制限はされないが、通常10μ
m〜１mm、好ましくは50〜300μm程度であり、また多孔
質担体の密度は0.1〜10g/cm ^３、好ましくは１〜５g/cm
^３程度である。

【００４１】本発明における生体吸収性とは、生体内に
一定期間、例えば自家軟骨が再生されるまでの間、担体
がその形状又は物性を保持し、その後分解・吸収される
ことで生体内への導入部分から消失しうる性質を指称す
る。本発明の生体吸収性多孔質担体としては上記脂質結
合グリコサミノグリカンが担持された状態で一定期間経
過後、生体内で分解・吸収される多孔質担体であれば特
に限定はされないが、体内に埋殖された場合には、1年
以内、好ましくは6ヶ月以内に分解・吸収されるものが
好ましい。

【００４２】そのような性質を有する物質としては例え
ばグリコサミノグリカン、コラーゲン、ヒアルロン酸等
の生体高分子物質又はその誘導体、乳酸、グリコール酸
又はカプロラクトン等が単独重合又は共重合した合成高
分子物質等があげられる。

【００４３】例えば、上記多孔質担体は、合成の生体吸
収性高分子である乳酸の重縮合体（ポリ乳酸）、グリコ
ール酸の重縮合体（ポリグリコール酸）、カプロラクト
ンの重縮合体（ポリカプロラクトン）、乳酸とグリコー
ル酸との共重合体、グリコール酸とカプロラクトンとの
共重合体、乳酸とカプロラクトンとの共重合体又は乳
酸、グリコール酸及びカプロラクトンの共重合体のいず
れかからなるものとすることができる。

【００４４】上記共重合体は、ランダム共重合体又はブ
ロック共重合体のいずれであってもよい。これらのブロ
ック共重合体は、種々の長さの一連の鎖セグメントから
なり、各セグメントはモノマーのホモポリマーからなる
ものであってもよく、あるいは二種以上の共重合体を含
むランダム共重合体からなるものであってもよい。

【００４５】これらの重合体はそれぞれ単独で用いても
よく、二種以上の混合物として用いてもよい。共重合体
の構成モノマー比、二種以上の重合体の配合比は、上記
のような性質を有する多孔質担体が得られる限り特に制
限されない。

【００４６】上記重合体はいずれも公知の方法により製
造することができる。具体的には、例えば、本発明で好
ましく用いることができる乳酸重縮合体（ポリ乳酸）
は、光学活性を有するL体又はD体の乳酸から常法（C.E.
Lowe, U. S. P. 2, 668, 162号）に従って乳酸の環状
二量体であるラクチドを合成した後、そのラクチドを開
環重合することによって得られるものである。重合は、
一般に減圧下または不活性ガス雰囲気下において重合温
度100〜250℃で、スズ系、亜鉛系、アルミニウム系等の
化合物を触媒として行うことができる。グリコール酸の
重縮合体（ポリグリコール酸）、カプロラクトンの重縮
合体（ポリカプロラクトン）なども常法に従って製造す
ることができる。

【００４７】本発明に用いられる生体吸収性多孔質担体
の具体例としては、例えば乳酸、グリコール酸又はカプ
ロラクトンなどの重合体または共重合体を用いて調製し
た多孔体（例えば特開2000-197693号、特開平10-234844
号など）、ヒアルロン酸の架橋体を主成分とするスポン
ジ（例えば特開平5-255124号など）、多糖類の溶液を凍
結乾燥させることで得られるスポンジ（例えば特表2000
-512666号、特開平11-276571など）、コラーゲンを用い
たスポンジ（Biomaterials 17 (1996) 155-162等）、コ
ラーゲンと多糖類（グリコサミノグリカン、デキストラ
ン、デキストラン硫酸またはアルギネート等）からなる
マトリックス（WO98/31345号）などがあげられ、いずれ
も好ましく使用することができる。その中でも特に乳酸
及びカプロラクトンの共重合体を含む多孔質担体が好ま
しく、最も好ましくは、コラーゲンを含む乳酸とカプロ
ラクトンとの共重合体が例示される。

【００４８】これらの重合体の平均分子量は生体吸収性
が得られる限り特に制限されないが、重量平均分子量で
好ましくは１〜50万、より好ましくは５〜30万程度の範
囲である。

【００４９】本発明に使用される多孔質担体は、上記の
ような重合体の成形体から得られるが、上記の重合体の
重合時、成形時、及び／または成型後に適当な処理をす
ることにより上記のような多孔質形状が得られる。その
ような重合体の多孔質成形物を得る方法は公知であり、
特に制限されるものではないが、例えば、上記重縮合
体、共重合体などの重合体の溶液を所望の型枠に入れ、
凍結後、真空凍結乾燥することによって所望の形態のス
ポンジ状などの多孔質成形体を得ることができる。ある
いはそのような成形体から担体としての所望の形状をカ
ットして本発明に使用される多孔質担体を得ることもで
きる。

【００５０】本発明に使用される多孔質担体の強度は、
軟骨培養用基材あるいは軟骨修復材として適当な強度で
あれば特に制限されないが、その引張破断強度は0.1kgf
/cm ^２以上であることが好ましい。

【００５１】本発明に使用される多孔質担体の形状は特
に制限されず、目的に応じて適宜選択することができ
る。例えば耳介や鼻等、所望の軟骨再生対象物の形態を
考慮して、それらの形に適合するように加工することが
できる。

【００５２】また、本発明における多孔質担体は、更に
その多孔質表面が細胞接着促進物質によって被覆されて
いてもよい。

【００５３】細胞接着促進物質とは、細胞の接着を促進
する性質を有するものであればよく、特に制限はない
が、具体的にはコラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチ
ン、ラミニン等が例示される。

【００５４】被覆方法は特に制限されず、常法に従って
行うことができるが、簡便には後述の実施例３（実験
２）で示すように、多孔質担体を調製後、細胞接着促進
物質に浸漬し、その後、再度凍結乾燥する物理的な結合
方法の他、多孔質担体に存在するヒドロキシル基やカル
ボキシル基に細胞接着促進物質を公知の縮合剤などを用
いて化学的に結合させる方法が例示される。なお、この
細胞接着促進物質は、その分解・吸収特性を調節するた
めに、更に架橋処理されていてもよい。その方法につい
ても特に制限はないが、具体的には熱脱水法等が例示さ
れる。

【００５５】＜軟骨培養用基材＞本発明の軟骨培養用基
材は上記生体吸収性多孔質担体に脂質結合グリコサミノ
グリカンが担持された構造を有しているが、その担持の
様式は特に限定はされない。すなわち、上記生体吸収性
多孔質担体の材料自体が有する官能基、又は生体吸収性
多孔質担体の材料に更に化学的に導入した官能基と、脂
質結合グリコサミノグリカンが有する官能基又は脂質結
合グリコサミノグリカンに更に化学的に導入した官能基
とが化学的に結合されて担持されていてもよい。また、
例えば脂質結合グリコサミノグリカンが溶解した溶液に
生体吸収性多孔質担体を浸漬することで生体吸収性多孔
質担体に脂質結合グリコサミノグリカンを物理的に付
着、吸着又は吸収させることで担持させてもよい。特に
生体吸収性多孔質担体として疎水基を有する材料で調製
した多孔質担体を使用する場合は、脂質結合グリコサミ
ノグリカンに含まれる脂質部分と疎水結合させることで
担持させることも可能である。

【００５６】生体吸収性多孔質担体の調製時に、その原
料と脂質結合グリコサミノグリカンを混合して生体吸収
性多孔質担体を調製することで、本発明の軟骨培養用基
材の表面以外に内部にまで脂質結合グリコサミノグリカ
ンを担持させることも可能であるが、上述のように生体
吸収性多孔質担体を脂質結合グリコサミノグリカンの溶
液に浸漬することで該担体の表面のみに脂質結合グリコ
サミノグリカンを物理的な結合によって担持させること
が可能であり、調製が簡単であり好ましい。

【００５７】上記本発明の軟骨培養用基材は更に、軟骨
の構成物質（例えばコンドロイチン硫酸、コラーゲン等
の細胞外マトリックス、又はそれらの修飾物（例えば架
橋物）など）をその表面、内部などに付着、吸着又は吸
収させることにより含んでいてもよく、そのような構成
物質は軟骨形成において軟骨細胞の足場としての生体吸
収性担体の役割を助ける上で好ましい効果を奏する。そ
のような軟骨の構成物質を含む軟骨培養用基材は脂質結
合グリコサミノグリカンを担持した生体吸収性多孔質担
体を、上記構成物質を含む溶液に浸漬したり、あるいは
生体吸収性多孔質担体を調製する際に予め原料に混合し
ておくことで容易に調製することが可能である。

【００５８】本発明の軟骨培養用基材は軟骨由来の細胞
の増殖を促進すると共に、生体内で分解され吸収される
性質を有しているため、該基材上で培養された軟骨細胞
との共存下において生体内への移植用の軟骨修復材とし
て使用することが可能である。前記軟骨修復材は、本発
明の軟骨培養用基材、本発明の軟骨培養用基材上に軟骨
細胞を保持、例えば予め軟骨由来の細胞を数時間〜数週
間培養したもの、又は軟骨由来の細胞を本発明基材上に
播種したものであり、当該軟骨修復材を生体内に移植す
ることで優れた軟骨再生、及び補綴としての効果を奏す
る。上記軟骨由来の細胞はほ乳類の軟骨由来の細胞であ
って移植対象の動物に対して重篤な抗原性を示さないも
のであれば利用可能であり、当該軟骨修復材を移植する
対象の生物種により適宜選択される。当然のことである
が、抗原性などの生体防御機構の問題から、移植の対象
の生物種と生物系統学的に同一又は類似する生物の軟骨
由来の細胞を選択することが好ましい。この様な軟骨由
来の細胞は、公知の方法によって得ることができる。す
なわち、採取した軟骨をコラゲナーゼなどの酵素で分解
して細胞を取り出す方法、又は採取した軟骨片をそのま
ま培養し、軟骨片から出てきた細胞を採取する方法が挙
げられる。

【００５９】また、本発明の軟骨修復材は更にヘッジホ
ッグ・タンパク質（ソニック（Shh）、インディアン（I
hh）、デザート（Dhh）；Kintoら、FEBS Letters 404(1
997)319-323）またはBMP（bone morphogenetic protei
n）を含んでいてもよく、このようなタンパク質を含む
ことで生体内において本発明の軟骨修復材が移植された
周辺域での軟骨形成を助長することが可能である。尚、
BMPは、骨、軟骨、腱、および骨中に存在する分子であ
り、特にBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7は軟骨形成および
骨形成を同時に開始させる。このため、軟骨組織の修復
に関しては、同時に骨を誘導することなく、軟骨形成の
開始を達成することが有利であり、BMPの骨形成性を阻
害するBMPアンタゴニスト（例えば、ノギン（noggin：
Re'em-Kalmaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)1214
1-12145）、コージン（chordin：Sasaiら、Cell 79(199
4)779-790）、またはフォリスタチン（follistatin： N
akamuraら、Science 247(1990)836-838））も同時に本
発明の軟骨修復材に含ませておくことが好ましい。これ
らのタンパク質は、例えば生体吸収性多孔質担体の調製
に際し、材料に混合しておくこと又は生体吸収性多孔質
担体をこれらのタンパク質の溶液に浸漬することで、軟
骨修復材に含ませることが可能である。

【００６０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。

【００６１】実施例１ 軟骨培養用基材の調製 常法に従って調製した乳酸／カプロラクトン共重合体
（75:25）2gを100mlのジオキサンに加え、40℃で撹拌し
た。これをガラス製型枠に流延し、-12℃の冷凍庫に入
れ、１時間凍結させた後、40℃で24時間真空凍結乾燥を
行った。このようにして作成した厚さ2 mmのスポンジ
（基材１）をφ9 mmに切り出し、24穴マルチプレート内
に置いたセルカルチャーインサート（ケモタキセル、φ
9 mm、膜孔径8.0μm）内に設置した。これをエチレンオ
キサイドガス（以下「EOG」とも記載する）滅菌（60
℃、１時間）し、その後、60℃で5日間、真空状態に保
って残留EOGを除去して滅菌担体を得た。

【００６２】特開平4-80201の実施例１に記載された方
法により製造された、L-(α-ホスファチジル)エタノー
ルアミン・ジパルミトイルをそれぞれ還元末端に結合し
た、平均分子量23,000のヒアルロン酸（鶏冠由来：以下
「HA-PE」と略記する）、平均分子量20,000のコンドロ
イチン硫酸C（サメ軟骨由来：以下「CS-PE」と略記す
る）及び平均分子量10,000のヘパリン（ブタ小腸由来：
以下「Hep-PE」と略記する）（以下、これらを総括して
「GAG-PE」とも略記する）をそれぞれ1.0mg/mlとなるよ
うにリン酸緩衝生理食塩水（以下「PBS」と略記する）
に溶解させた。この溶液をそれぞれ遠心濾過滅菌し、HA
-PE溶液、CS-PE溶液、及びHep-PE溶液を得た。

【００６３】上記滅菌担体を70%エタノール水溶液で洗
浄して親水化した後、PBSで3回洗浄し、HA-PE溶液、CS-
PE溶液又はHep-PE溶液を56.3μl添加した。これを4℃で
16時間放置し、その後PBSで3回洗浄した。その後更に10
%の牛胎仔血清（以下「FBS」と略記する）を含むダルベ
ッコの調整イーグル培地（以下「DMEM」と記載する：ギ
ブコ社製）で1回洗浄し、軟骨培養用基材を調製した。
以下、このように調製された担体（軟骨培養用基材）
を、それぞれHA-PE担体、CS-PE担体、及びHep-PE担体と
記載する。

【００６４】実施例２ 軟骨細胞の採取と播種 Lewis系4週齢雄性ラット4匹から以下の方法により軟骨
細胞を採取した。すなわち、肋骨軟骨を摘出し、それを
5mm程度に細切した。その後0.1%エチレンジアミン四酢
酸（以下「EDTA」と記載する：ナカライテスク社製）/P
BS(-)（ローマン工業社製）に37℃で20分間浸漬し、更
に37℃で1時間0.25%のトリプシン（ギブコ社製）を含む
0.1%EDTA/PBSに浸漬した。このトリプシン処理軟骨片を
PBSで3回洗浄し、37℃で3時間0.1%コラゲナーゼ（和光
純薬工業株式会社製）/PBS(+)に浸漬した後、PBSで洗浄
した。このようにして得られた軟骨細胞をφ10cmの細胞
培養用ディッシュ20枚上に静置し10%FBSを含むDMEMを培
地として3週間培養した。

【００６５】培養した軟骨細胞をPBSで洗浄し、37℃で1
0分間0.25%トリプシンを含む0.1%EDTA/PBSに浸績した
後、細胞を回収した。コウルターカウンタによる細胞数
の計数の結果、培養後の細胞数は5.66×10⁶個であるこ
とがわかった。

【００６６】これらの細胞を1.14×10⁶個/mLとなるよう
に10%FBSを含むDMEM培地に分散させ、ケモタキセルの各
HA-PE担体、CS-PE担体、及びHep-PE担体上に、400μlず
つ添加して播種した。高密度培養による培地中の栄養分
の減少を防ぐため、ケモタキセル外に培地を1.2ml添加
し、37℃の5%インキュベータ内で9日間培養し、培養さ
れた軟骨細胞を保持した軟骨修復材（以下、それぞれHA
-PE材、CS-PE材、Hep-PE材といい、またこれらを総称し
てGAG-PE材という）を得た。

【００６７】実施例３ マウスへの移植と組織観察 （実験１）実施例２で得た各軟骨修復材（HA-PE材、CS-
PE材、及びHep-PE材）をヌードマウス（KSN-nuSlc：日
本エスエルシー）12匹（HA-PE材、CS-PE材、Hep-PE材、
及び対照群各3匹ずつ）の背部皮下に1匹あたり2個ずつ
移植した。4週間後、マウスを安楽死させ、移植したHA-
PE材、CS-PE材、及びHep-PE材をそれぞれ摘出し、常法
に従ってホルマリンで固定し、パラフィン包埋薄切切片
を作成した。このように作成した切片をヘマトキシリン
・エオジン染色及びアルシアンブルー（pH1.0）染色を
行い、光学顕微鏡下で固有組織像を観察した。

【００６８】アルシアンブルーは軟骨組織を染色するた
め、アルシアンブルーによって染色された陽性部分が認
められた切片は軟骨組織が形成されたと判定した（表
１：実験１）。

【００６９】また、軟骨組織が形成されたと判定された
対照群の個体の固有組織像と、GAG-PE材を用いて軟骨組
織が形成されたと判定された個体の固有組織像を比較す
ると、GAG-PE材を使用した固有組織像において、アルシ
アンブルーにより染色された面積が広い傾向が観察され
た（図１及び図２）。

【００７０】（実験２）0.15%コラーゲン溶液（I型、ブ
タ腱由来、pH3.0、新田ゼラチン株式会社製）を実施例
１で作成した基材１に十分浸漬させ、-30℃にて1時間凍
結させた後、真空凍結乾燥した。このようにして作成し
たものを120℃、真空下にて24時間、熱脱水架橋処理に
付した。このようにして得た基材を用いて実験１と同様
の実験を行った結果、実験１ではほとんど効果が見られ
なかったHA-PEを用いた場合においても軟骨の形成が観
察された（表１：実験２）。

【００７１】尚、軟骨細胞の増殖性は、採取した際の細
胞の状態が大きく反映されるため、軟骨組織形成に影響
を与えるが、GAG-PEを使用しなかった対照と比して、GA
G-PEを使用した個体で軟骨組織形成促進傾向が観察され
た。

【００７２】

【表１】

【００７３】

【発明の効果】本発明により、脂質結合グリコサミノグ
リカンが担持された新たな軟骨培養用基材が提供され、
生体に導入可能な培養軟骨の調製が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 CS-PEを使用した実験１において移植後に生
じた組織をアルシアンブルーにより染色した組織を示す
図面に代わる写真である。

【図２】 GAG-PEを使用しなかった実験１において移植
後に生じた組織をアルシアンブルーにより染色した組織
を示す図面に代わる写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 598167040 上田 実 愛知県日進市岩崎台２−415 (72)発明者 木全 弘治 愛知県名古屋市天白区植田山１丁目1404番 地 (72)発明者 杉浦 信夫 岐阜県羽島郡岐南町石原瀬１丁目43の５ (72)発明者 森川 訓行 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ 株式会社京都研究所内 (72)発明者 森田 真一郎 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地グンゼ 株式会社京都研究所内 (72)発明者 本田 雅規 愛知県大府市東新町５丁目55番地 (72)発明者 上田 実 愛知県日進市岩崎台２−415−１ (72)発明者 畠 賢一郎 愛知県刈谷市板倉町２−10−３ サンビレ ッジ板倉102 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X BC42 CA44 4C081 AB04 BA13 CD141 CD35 EA13

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脂質とグリコサミノグリカンとが化学的
   に結合した脂質結合グリコサミノグリカン又はその薬理
   学的に許容される塩を担持する生体吸収性多孔質担体を
   含む軟骨培養用基材。
2. 【請求項２】 脂質がリン脂質であることを特徴とする
   請求項１記載の軟骨培養用基材。
3. 【請求項３】 コラーゲンを含むことを特徴とする請求
   項１又は２記載の軟骨培養用基材。
4. 【請求項４】 請求項１記載の軟骨培養用基材と該基材
   上に保持された軟骨由来の細胞とから少なくともなる軟
   骨修復材。