DK157061B - Fremgangsmaade til fremstilling af et heparinoid med antitrombotisk virkning - Google Patents

Description

DK 157061 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmàde til frem-stilling af et hidtil ukendt heparinoid med antitrombotisk virkning pâ basis af en blanding af oligo- og polysaccharider, med den i krav 1 indledning angivne sammensætning og med de 5 sammesteds angivne egenskaber.

Fremgangsmàden ifolge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anferte.

10 Det er kendt, at visse mucopolysaccharider pâvirker blods ko-aguleringsegenskaber. Det bedste mucopolysaccharid er heparin, et sulfateret mucpolysaccharid, der anvendes til forebyggelse og behandlingen af venos trômbose og tromboembolisme. Den an-ti-trombotiske virkning af heparin er baseret pâ accélération 15 af inhiberingen af blodkoaguleringsfaktorer ved hjmlp af anti-thrombin III. En hovedvanskelighed ved anvendelse af heparin til forebyggelse og behandling af trombose og tromo-embolisme er heparins blodningsfremkaldende evne. Ved at optimere den anvendte dosismâde og hyppighed kan blodningsrisikoen reduce-20 res i nogen grad, men den reelle sammenhæng mellem heparins anti-trombotiske egenskaber og blodningsfremkaldende egenskaber kan ikke pâvirkes.

Som folge heraf er den profylaktiske anvendelse af heparin 25 blevet begrænset til de indikationer, hvor koagulationssyste-mets kun aktiveres modérât sàsom i tilfældet med milde former for dyb venetrombose. En yderligere mangel ved heparin er dets forholdsvis korte virkningsperiode, sàledes at der til opnâel-se af en effektiv forebyggelse normalt mâ administreres en do-30 sis mindst to gange dagligt.

Der er allerede gjort talrige forseg pâ at fremstille "forbed-rede hepariner" eller til at fremstille heparinoider med for-bedrede egenskaber. Britisk patentskrift nr. 2.002.406 angâr 35 f.eks. an oligo-heterôpolysaccharid-blanding med en molvægt-fordeling mellem 2000 og 5000 dalton, som opnâs ved depolyme-risation af heparin og/eller isoleres fra moderluden fra den normale heparinfremsti11ing, hvorefter det opnâede stof sulfa- 2

DK 157061 B

Det anferes, at forholdet mellem den anti-trombotiske virkning (in vivo-virkning) og anti-koagulationsvirkningen (in vitro-virkning) af det sâledes opnâede stof er mere gunstigt end for hepari n.

5

Man har nu fundet et hidtil ukendt anti-trombotisk virksomt heparinoid, som er en blanding af oligo- og heteropolysaccha-rider, med en slàende dissociation mellem den anti-trombotiske og den hæmorrhagiske virkning (bledningsfremkaldende evne).

10

Under forskellige bledningsundersegelser pâ rotter (muskel-blodningstest, kapi1larblodningstest) viser det hidtil ukendte heparinoid sig slet ikke at forârsage nogen blodning eller næppe forârsage mere bledning end en placebo, medens den hæ-15 morrhagiske virkning over et bredt dosisomrâde (10/250 mg/kg) kun voksede i ringe omfang. Den anti-trombotiske virkning pr. enhedsvægt er ganske vist ringere end heparins, men "nytte/ri-siko"-forholdet (dvs. forholdet mellem den anti-trombotiske virkning og den hæmorrhagiske virkning) er 10-40 gange mere 20 gunstig end for heparin. Dette vil blive belyst nærmere neden-for ved hjælp af sammenligningseksempler.

Det hidtil ukendte heparinoid med antitrombotisk virkning er af naturlig oprindelse og bestâr af en blanding af oligo- og 25 polysaccharider, som er baseret pâ hexosederivater sâsom glu-curonsyre, iduronsyre, glucosamin, galactosamin og sulfaterede og acetylerede derivater deraf. Det hidtil ukendte produkt er et hvidt, amorft, svagt hygroskopisk pulver med felgende egen-skaber: 30 a) en molvægtfordeling (bestemt ved sammenligning med dextran ved hjælp af gelpermeationkromatografi pâ en makropores sili-cagrundmasse (Nucleosil 50-5, Nucleosil er et i Danmark ikke registreret varemærke) med 0,5 molær ammoniumacetatpuffer (pH 35 = 5,0) som elueringsmiddel) mellem 2.000 og 40.000 dalton med en hovedtop mellem 2.500 og 15.000 dalton, mere specielt mellem 4.000 og 10.000 dalton og gennemsnitlig mellem 5.000 og 8.000 dalton og sædvanligvis en ekstra top og/eller skulder i 3

DK 157061 B

intervallet mellem 15.000 og 60.000 dalton, mere specielt mellem 30.000 og 50.000 dalton, med en gennemsnitsmolekylvægt pâ omtrent 40.000 dalton, 5 b) en specifik drejning {[a]20) mellem +25° og +80°, mere spe- 0 cielt mellem +30° og +70°, c) et nitrogenindhold mellem 1,5 og 4 vægtprocent, fortrinsvis 10 mellem 2,5 og 3,5 vægtprocent, d) et svovlindhold mellem 5 og 7,5 vægtprocent, fortrinsvis mellem 5,5 og 6,5 vægtprocent, 15 e) indhold af ioniske gruppe i meq/g mellem 3 og 5, fortrinsvis mellem 3,5 og 4,5, f) et indhold af suifamidgrupper i meq/g mellem 0,5 og 1,5, fortrinsvis mellem 0,5 og 1,0, 20 g) et glucosaminindhold i meq/g pâ 0,5 - 1,5, h) et galactosaminindhold i meq/g pâ 0,0 - 0,6, 25 i) et idose (iduronsyre)/g 1ucose (glucuronsyre)-forhold pâ 0,5 - 3, mere specielt 1-3.

Selv om det ikke er muligt nojagtigt at specificere det hidtil ukendte oligo- og polysaccharids sammensætning karakteriserer 30 de ovennævnte paramétré produktet i tiIstrækkelig grad, specielt i forbindelse med dets farmakologiske profil.

Den farmakologiske profil af det hidtil ukendte heparinoid er karakteristisk ved: 1) en anti-koagulationsvirkning (US P) pâ under 10 internationale enheder pr mg (IU/mg), sâledes kun en brekdel (sædvanlig-vis under 5%) af storrelsen af heparin USP, 35 4

DK 157061 B

2) en ubetydelig anti-trombin-virkning (under 1% af virkningen af hepari n USP), 3) en anti-Xavirkning pâ under 20% af heparins virkning, sad-5 vanligvis mellem 2,5 og 15%, 4) en anti-trombotisk virkning (Umetsumodel) med en ID50 omkring 2-8 mg/kg i.v. (ID50 af heparin USP er omkring 0,4-0,5 mg/kg i.v.), 10 5) en bledningsvirkning, som nappe stiger over et bredt dosis-interval (indtil 300 mg/kg i.v.)» medens bledningsvirkningen af heparin USP ved en dosis pâ 1 mg/kg i.v. nappe kan ses og vokser hurtigt ved hejere doser, 15 6) et ,,nytte-risiko"-forhold, som er 10-40 gange mere gunstigt end forholdet for heparin USP med hensyn til den anti-trombo-tiske virkning i sammenligning med den hamorrhagiske virkning, og 20 7) en halveringstid, som med sikkerhed er dobbelt sâ lang som halveringstiden af heparin USP.

Denne intéressante profil ger det hidtil ukendte produkt usad-25 vanligt velegnet til forebyggelsen og behandlingen af venes trombose og trombo-embolisme. Dette produkt viser sig sarligt velegnet specielt til forebyggelse af DVT (dyb venetrombose) i patienter, som har varet udsat for eller skal underkastes en hofteoperation. Man har ikke hidtil haft passende forebyggende 30 midler mod den hyppige forekomst af DVT og 1ungeembolismer i forbindelse med hofteoperationer. Lave doser (s.c.) af heparin er ikke effektive, og hejere i.v. doser er ikke tilrâdelige pâ grund af den store risiko for blodning.

35 Det hidtil ukendte produkt viser sig at vare uden mutagene og toksiske egenskaber selv i heje doser (indtil 400 mg/kg/dag).

Det hidtil ukendte produkt kan opnâs pâ forskellige mâder. Pattedyrsvæv, sâsom lunger, pancréas, lever, indvolde og spe- 6

DK 157061 B

cielt tarmslim kan tjene som grundmateriale. Produktet frigo-res forst fra pattedyrsvævet ved autolyse eller ved hjælp af proteoîytiske enzymer (f.eks. enzymer fra svinepancreas eller bakterielle enzymer, sâsom proteaser fra Bacillus subtilis).

5 Produktet isoleres derpâ ved udfældning med methanol.

André isoleringsmetoder gâr ud pè at binde produktet til en kvaternaer, alifatisk ammoniumbase eller en basisk ionbytter og derpâ eluerer produktet med vandige saltoplosninger. Yderlige-10 re rensning af produktet kan ske ved fraktioneret udfældning med methanol.

Nærmere undersogelser har vist, at ved at behandle det pâ denne mâde opnâede produkt med chondroitinase ABC, fjernes den 15 storstecdel af de tilstedeværende hojmolekylære galactosamin-holdige polysaccharider. Det resterende produkt {70-75% af produktet i begyndelsen) viser sig imidlertid at hâve næsten den samme overraskende farmakologiske profil som det ubehand-lede produkt; ved den nævnte enzymatiske behandling fjernes 20 med andre ord en overvejende hojmolekylær inaktiv fraktion (25-30 vægtprocent).

De fysiske egenskaber af dette produkt opnâet efter behandling med chondroitinase ABC er fortsat inden for de karakteristika, 25 som er angivet ovenfor for det hidtil ukendte heparinoid, bortset fra at i molvægtsfordelingen er toppen og/eller skul-deren af den hojmolekylære fraktion næsten forsvundet, den specifikke rotation viser sig at være foroget til en værdi mellem +45° +75°, og galactosaminindhold er reduceret prak-30 tisk tait til 0. Det er klart, at opfindelsen ogsâ omfatter dette produkt.

Det hidtil ukendte produkt eller de hidtil ukendte produkter kan pâ den til heparin sædvanligt anvendte mâde oparbejdes til 35 en farmaceutisk dosisform, f.eks. ved oplosning i vand, som er velegnet til injektionsformàl, hvortil, om nodvendigt, der er sat yderligere farmaceutisk acceptable hjælpestoffer (konser-veringsmiddel, visse salte). Klinisk applikation sker ved

DK 157061 B

6 hjælp af subkutan eller intravenes (eventuelt vekslende) in-jektion eller ved infusion. André doseringsmetoder kan ogsà anvendes, sâsom intra-pulmonar applikation via sprejteinhale-ring eller administration ved hjælp af en stikpille.

5

Opfindelsen vil blive beskrevet nærmere ved hjælp af felgende eksempler.

Eksempel I

10

Bovin lunge (100 kg) blev behandlet med proteolytiske enzymer fra svinepancreas. Efter 15 timers inkubation ved pH 8,5 og en temperatur pâ 40®C blev blandingen filtreret fra. Det klare filtrat blev bragt i kontakt med en kraftigt basisk ionbytter 15 (QAE Sephadex® A50) og omrert i 15 timer. :

Ionbytteren blev filtreret fra og elueret med en vandig oplos- ning af NaCl (200 g/1). Methanol blev sat til eluatet indtil 50% v/v. Det resulterende bundfald blev fjernet, hvorefter me- 20 thanol blev sat til moderluden indtil 75% v/v. Bundfaldet blev udvundet, vasket med 100% methanol og terret. Det opnâede amorfe, hvide pulver (22,7 g) havde et galactosaminindhold pâ 0,45 mmol/g, et glucosaminindhold pâ 0,54 mmol/g og en gennem- snitligsmolekylvægt pâ 6.600 dalton med en yderligere top ved 25 omkring 38.000 dalton (bestemte med hensyn til dextran), en

[a]20-værdi pâ +34,2®, et svovlindhold pâ 5,7%, et nitrogen-D

indhold pâ 2,6%, et indhold af ioniske grupper pâ 3,90 meq/g, et indhold af sulfamidgrupper pâ 0,69 mmol/g og et idose/glu-30 cose forhold pâ 2,1.

Produktets elektroforesemenster er vist i fig. 1 (agarosegel, bragt i ligevægt i 0,2 molær calciumacetat, pH-værdi = 7,2, puffer 0,2 molær calciumacetat, 300 V max, 7 mA, 30 minutter.

35 7

DK 157061 B

Eksempel II

Svinetarmslim (100 kg) blev behandlet med proteaser af Baci1-lus subtilis ved 35°C og en pH-værdi pà 8,2 i 24 timer. Blan-5 dingen blev filtreret, og det klare filtrat oparbejdet pâ til-svarende mâde som beskrevet i eksempel 1. Udbyttet var 3,2 g hvidt, amorft pulver med et galactoseaminindhold pâ 0,38 mmol/ g, et glucosaminindhold pâ 0,82 mmol/g, en gennemsnitlig mole-kylvægt pâ 6.100 dalton med en yderligere top ved et gennem-10 snit af 42.000 dalton (bestemt med hensyn tîl dextran), et [a]20

D

pâ 35,1°, et svovlindhold pâ 5,9%, et nitrogenindhold pà 2,7%, et indhold af ioniske grupper pâ 3,70 meq/g, et indhold af 15 sulfamidgrupper pâ 0,73 mmol/g og et idose/glucose-forhold pâ 1,9.

Produktet havde et kærnemagnetisk resonansspektrum (4% i O2O ved 500C, 270 MHz) som vist i fig. 2.

20

Eksempel III

Bovin tarmslim (10 m3) blev oparbejdet med pancreatin (40%, pH

8,5, 20 timer). Blandingen blev filtreret og filtratet opar-25 bejdet pâ den i eksempel I beskrevne mâde. Udbyttet var 335 g af et hvidt, amorft pulver med et galactosaminindhold pâ 0,28 mmol/g, et glucosaminindhold pâ 0,90 mmol/g, en gennemsnitlig molekylvægt pà 5.600 dalton med en yderligere top ved et gen-nemsnit af 41.000 dalton (bestemt med hensyn til dextran), en 30 I*)20

D

værdi pâ +36,9°, et svovlindhold pâ 6,1%, et nitrogenindhold pâ 2,8%, et indhold af ioniske grupper pà 4,0 meq/g, et indhold af sulfamidgrupper pâ 0,75 mmol/g og et idose/glucose- forhold pâ 1,8.

35 “ 8

DK 157061 B

Eksempel IV

Produktet fra eksempel III (100 g) blev behandlet med chondro-itinase ABC. Via methanoludfældning (50-75% v/v) blev det re-5 sterende produkt isoleret. Der blev opnâet 72 g produkt (hvidt, amorft pulver) med et galactosaminindhold 1,20 mmol/ g, en gennemsnitlig molekylvægt pâ 5.400 dalton med en ekstremt lille yderligere top ved et gennemsnit pâ 40.000 dalton (bestemt med hensyn til dextran), en [a]20-værdi pâ 10 D

+61,2°, et svovlindhold pâ 6,2%, et nitrogenindhold pâ 2,75%, et indhold af ioniske grupper pâ 4,1 meq/g, et indhold af sul-famidgrupper pâ 0,91 mmol/g og et idose/glucose-forhold pâ 1,9.

15

Farmakologiske undersoqelser

De i eksemplerne 1-4 opnâede produkter blev underkastet en række farmakologiske undersogelser i sammenligning med hepa-20 rin USP.

Indvirkninq pâ blodkoaqulation

Produkt Anti-koagu- Anti-trom- Anti-Xa 25 lationsvirk- binvirkning virkning _ning (IU/mg) (IU/mq)_(IU/mq)

Heparin 179 164 167

Eksempel I 1 0,5 4,5 "Il 1 0,1 5 " III 3 1,0 6 "IV 4 1,3 8 30 _______

Anti-koagulationsvirkningen blev bestemt i overensstemmelse med USP-metoden. Anti-trombinvirkningen og anti-Xavirkningen blev konstateret ved anvendelse af en kromogenisk substratme- tode, hvorved der blev anvendt henholdsvis renset koanti-trom-35 bin III, og substraterne (Kabi AB, Sverige) S-2238 og S-2222.

Resultaterne i tabellen viser, at produkterne ifelge eksemplerne I-IV udviser inhiberende aktivitet mod aktiverede koa- 9

DK 157061 B

gulationsfaktorer med en stor specificitet, dvs. de har en an-ti-Xa-vi rkni ng, der er st0rre end anti trombi nvirkni ngen. I modsætning til det ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen frem-stillede produkt udviser heparin ikke nogen specifik inhibe-5 ring rettet mod en af disse koagulationsfaktorer. Sàledes udviser heparin en stærk inhibering af den samlede koagulation, mens det ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen fremstillede produkt er modérât og sàledes giver en minimal risiko for blodni ng.

10

Anti-trombotisk virkning

Anti-trombotisk virkning blev bestemt ved hjælp af Umetsumo-dellen (Thrombos. Haemostas. 3J[, 74-83, 1978) i rotter. I den-15 ne model fremprovokeres tromber i arterio-venese shunter ved at lade blodet stremme langs en silketrâd i 15 minutter. Pla-cebovirkningen og indvirkningen af stofferne, der skal under-soges, i forskellige doser pâ trombedannelsen mâles, 20 pra sammenhængen mellem dosis og inhiberingen af trombedannel-se med hensyn til placebovirkningen er det muligt at udlede en ID5o_værdi (dosis som er nodvendig til 50% inhibering af trom bedannelsen ) .

25 Resultater

Produkt id50 1 m9/kg heparin USP 0,5

Eksempel I 6,0 30 " II 5,0 "III 4,0 "IV 5,3 35

DK 157061 B

1°

Hamorrhaqisk virkninq a) KapiΠarblcdninqstest i rotter 5 Plàcebo eller produkterne, der skal underseges, blev doserede via dorsalvenen af pénis af bedevede rotter. Efter et minuts forlob blev en strimmel hud afrykket manuelt fra den barbere-de bug langs med to forud anlagte snit. Sâret blev dækket med en gazebandage, og hudstrimlen blev lagt tilbage over gazen.

10 Efter 10 minutters forleb blev gazen fjernet, og det deri fo-rekommende blod blev ekstraheret med 20 ml vand. Hæmoglobin-koncentrationen i vandet blev mâlt spektrofotometrisk og an-vendt som parameter for blodtabet (se Thrombos. Haemostas. 42, 466, 1979).

15

Under denne undersogelse blev produktet fra eksempel II og he-parin sammenlignet ved forskellige doser, idet man tog for-skellen i anti-trombotisk virkning mellem det nye produkt og heparin i betragtning. Resultaterne er vist i fig. 3. Tilsva-20 rende resultater blev opnàet ved produkterne fra eksemplerne I, II og IV.

b) Muskelbledningsunderseqelser i rotter 25 Biceps femoris i hver pote pà en bedovet rotte blev udskâret pâ langs med en skalpel i 1 minut efter, at placebo eller produktet, der skal underseges, var blevet administreret intrave-nost via dorsalvenen af pénis. Hvert sâr blev dækket med en gazebandage. Efter 30 minutters forleb blev bandagerne fjer-30 net. Blodtabet blev bestemt pé samme mède som ved kapillar-blodningstesten. Produktet fra eksempel n og heparin blev sammenlignet i denne test. Resultaterne er vist i fig. 4. Til-svarende resultater blev opnâet med produkterne fra eksemplerne I, III og IV.

Figurerne 3 og 4 viser klart heparins langt sterre tendens til blodning, medens tendensen ikke afviger eller næppe afviger signifikant overhovedet fra placebo over et bredt dosisinter- 35

Claims (2)

1. Fremgangsmàde til fremsti11ing af et heparinoid med anti-20 trombotisk virkning pà basis af rester af glucuronsyre, idu-ronsyre, glucosamin og galactosamin og sulfaterede og acetyle-rede derivater deraf, hvilket heparinoid har folgende egenska-ber : 25 a) en molekylvægt mellem 3,32 x 10"21 0g 6,64 x I0-20g (2000- 40.000 dalton), hvor der forekommer en hovedtop pâ en molekyl-vægt mellem 4,415 x 10“21 og 2,49 x 10-20g (2500-15.000 dalton) og eventuelt en yderligere top og/eller skulder, hvor mo-lekylvægten er mellem 2,49 x 10“20 og 9,96 x 1020g (15.000-30 60.000 dalton) b) en specifik drejning ([.]«, -Un *25" og *80·,» c) nitrogenindhold mellem 1,5 og 4 vægtprocent, 35 d) et svovlindhold pâ mellem 5 og 7,5 vægtprocent, e) et indhold af ioniske grupper pâ mellem 3 og 5 meq/g, DK 157061 B \ f) et indhold af sulfamidgrupper pâ mellem 0,5 og 1,5 meq/g, g) et glucosamidindhold pâ 0,5-1,5 meq/g, 5 h) et galactosaminindhold pâ 0,0-0,6 meq/g, i) et idose (iduronsyre)/glucose (glucuronsyre)-forhold pâ 0,5-3, 10 j) en antikoaguleringsaktivitet (USP) pâ under 10 internationale enheder pr. mg, k) en minimal trombinaktivitet (under 1% af heparin-USP-værdi-en), 15 l) en anti-X-aktivitet pâ under 20%, sædvanligvis 2,5-15% af heparins tilsvarende værdi, m) en IDsg-værdi for antitrombotisk aktivitet (Umetsu-model) 20 pâ ca. 2-8 mg/kg i.v., n) bledningsaktiviteten stiger næsten ikke inden for et stort doseringsomrâde (helt op til 300 mg/kg i.v.), 25 o) nytte/risiko-forholdet er 10-40 gange fordelagtigere end hos heparin-USP for den antitrombotiske aktivitet i sammen-ligning med bledningsaktiviteten, p) halveringstiden er med sikkerhed dobbelt sâ lang som hos 30 heparin-USP, kendetegnet ved, at pattedyrsvæv sâsom lunger, bug-spytkirtel, lever, tarme og tarmslimhinde behandles ved auto-lyse eller med proteolytiske enzymer, filtrering af den resul-35 terende blanding, isolering af heparinoidet ved fraktioneret udfældning ved til filtratet at sætte hejst 50 rumfangs% me-thanol, fjernelse af udfældningen, yderligere tilsætning af hejst 75 rumfangs% methanol og isolering af den sâledes opnâe- DK 157061 B de udfældning, eller behandling af filtratet med en kvaternær ammoniumbase eller en basisk ionbytter, eluering af den sepa-rerede base eller ionbytter med en vandholdig saltoplosning og behandling af eluatet ved den ovennævnte fraktionerede udfæld-5 ning.

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendetegnet ved, at det isolerede produkt underkastes indvirkningen af chondroiti-nase ABC for at fjerne den storste del af de hojmolekylære po-10 lysaccharider, og det resterende produkt isbleres. 15 20 25 30 % 35