DK172798B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære hepariner ved depolymerisation af normal heparin - Google Patents

Description

i DK 172798 B1

Den foreliggende opfindelse angår en ny og forbedret fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære heparinfraktioner med en molekylvægt i intervallet fra ca. 4000 til ca.

12000 Dalton. De lavmolekylære heparinfraktioner fremstillet ved den foreliggende fremgangsmåde har et forhold mellem antithrombotisk aktivitet og antikoagulerende 5 aktivitet, som er bemærkelsesværdigt bedre end det tilsvarende forhold for normal heparin.

En fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære hepariner, der har bedre farmakologiske og terapeutiske egenskaber, er beskrevet i amerikansk patent nr. 4.281.108. Ifølge dette patent fremstilles lavmolekylære hepariner, som har et forhold mellem antithrom-10 botisk aktivitet og antikoagulerende aktivitet, som er bedre end hos normal heparin, ved en fremgangsmåde omfattende følgende trin (a) syrning af normal heparin til dannelse af heparinsyre, (b) depolymerisation af heparinsyren ved opvarmning i nærværelse af peroxider til dannelse af en lavmolekylær heparamin, og 15 (c) sulfatering af heparaminen til dannelse af lavmolekylær heparin.

Heparinfraktioneme fremstillet i overensstemmelse med den beskrevne fremgangsmåde har et forhold mellem antithrombotisk virkning og antikoagulerende virkning, der er betydeligt større end 1:1 sammenlignet med normal heparin, som til det foreliggende formål har et forhold på 1:1. Selv om den beskrevne fremgangsmåde var vellykket til 20 fremstilling af dette forbedrede lavmolekylære heparin, bevirkede depolymerisationstrin-net frigørelse af nogle N-sulfatgrupper, som nødvendiggjorde sulfateringen (trin c) for at genindføre de tabte N-sulfatgrupper. Endvidere indføres nogle urenheder også i slutproduktet under sulfateringen.

2 DK 172798 B1

Formålet med den foreliggende opfindelse er at udvikle en fremgangsmåde, ved hvilken normal heparin kan depolymeriseres, men uden at frigøre N-sulfatgrupper, og samtidig producere lavmolekylær heparin, der har det førnævnte bedre forhold mellem antithrom-botisk og antikoagulerende aktivitet.

5 Overraskende er dette opnået ved at udføre depolymerisationen i nærværelse af et per-oxid i et pH-interval fra ca. 3 til ca. 5.1 dette pH-interval påvirker depolymerisationen ikke sulfatgruppeme og giver uventet et bedre udbytte af depolymeriseret fraktion, eliminerer sulfateringstrinnet og giver også et renere produkt.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære heparin-10 fraktioner med en molekylvægt i intervallet fra ca. 4000 til ca. 12000 Dalton, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at (a) normal heparin syrnes til dannelse af he-parinsyre med en pH-værdi i intervallet fra ca. 3 til ca. 5, og (b) den dannede heparin-syre depolymeriseres ved opvarmning i nærværelse af et peroxid ved en pH-værdi mellem ca. 3 og ca. 5.

15 Heparin er et velkendt og stabilt monovalent eller divalent salt af den ustabile heparinsyre, Det er en polymer af en disaccharidenhed dannet af hexuron (D-glucuron og L-iduron) syrer og glucosamin, O- og N-sulfater sammenbundne med alfa 1-4 glycosidbindinger.

Heparin findes i forskellige former i mange væv og celler og er mere eller mindre løst bundet til en proteindel. I huden 20 og delvis i lungerne hos forskellige arter findes heparin i højmolekylær form. I denne form er heparin følsom for virkningen af ascorbinsyre eller af forskellige enzymer, der antages at findes i tarmslimhinde. Efter behandling med enten ascorbinsyre eller homogenater af tarmslimhinde kan disse makromolekylære former af hud- eller lungeheparin reduceres 25 til samme molekylstørrelse som heparin isoleret af tarmslimhinde.

r n s 1 !i DK 172798 B1 3

Heparin isoleret fra tarmslimhinde, der har en gennemsnitsmolekylvægt (MW) på 15.000 Dalton, eller heparin fra andre kilder, såsom hud eller lunger, der er blevet behandlet som 5 ovenfor diskuteret med enten ascorbinsyre eller homogenater af tarmslimhinde, har den mindst mulige molekylstørrelse for naturlig heparin, dvs. ca, 15,000 Dalton som gennemsnitsmolekylvægt, Til den foreliggende opfindelses formål vil sådant heparin blive omtalt som normal heparin.

10

Der er faktisk ingen enzymer i legemet, der kan spalte heparin fremkommet af tarmslimhinde til lavmolekylære fraktioner, og der er heller ikke blevet opdaget nogen kemisk fremgangsmåde ud over den, der er beskrevet i amerikansk patent nr.

15 4.281.108, til depolymerisering af normal heparin uden et to talt tab af biologisk aktivitet. Som ovenfor diskuteret har den fremgangsmåde imidlertid sine ulemper.

Heparin blev først opdaget og isoleret af væv i 1917 og har 20 fra den tid været kendt for sin antikoagulerende evne. I den seneste tid er den antikoagulerende evne, dvs. aktivitet, blevet bedømt i forbindelse med dens antithrombotiske akti-tet. Til farmakologiske og terapeutiske formål er det modificerede forhold enten in vitro eller in vivo mellem anti-25 thrombotisk aktivitet og antikoagulerende aktivitet den vigtigste faktor. Det måles ved følgende forhold: antj-Xa-test

APTT

30 hvor: anti-Xa-test = Yins' test APTT = Aktiveret partiel thromboplastin-tid.

Normal heparin, dvs. med MW på ca, 15.000 Dalton har en total 35 antikoagulerende virkning £ 150 IU/mg og et = 1, 4 DK 172798 B1 medens hepariner fremstillet ved fremgangsmåden ifølge amerikansk patent nr. 4.281.108 og den foreliggende fremgangsmåde har en total antikoagulerende virkning < 150 IU/mg og et 5 antl-Xa-test ,

APTT

Interessant nok har forbindelsen iy i amerikansk patent nr. 4.281.108 et forhold på næsten 2, hvilket betyder, at dette 10 heparin har en antithrombotisk virkning, som er to gange den af normal heparin baseret på samme antikoagulerende virkning. Udtrykt ved antikoagulerende virkning kræves med andre ord en halv dosis af en sådan forbindelse til at frembringe samme antithrombotiske virkning, som produceres af et hel dosis normal heparin.

Overraskende resulterer den foreliggende opfindelse i et lavmolekylært heparin med samme fordelagtige forhold, men uden at sulfateringstrinnet er nødvendigt. Overraskende er også 20 udbytterne af fremgangsmåden ifølge opfindelsen bedre end det, der fås ifølge amerikansk patent nr. 4.281.108, og det fremkomne produkt er mere rent, hvilket eliminerer behovet for yderligere rensning.

25

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter følgende trin: (a) syrning af normal heparin til dannelse af heparinsyre med en pH-værdi i intervallet fra ca, 3 til ca. 5, og 30 (b) depolymerisering af heparinsyren i nærværelse af peroxider til dannelse af lavmolekylære fraktioner af heparin.

Det således producerede heparin har en MW, der ligger mellem ca. 4.000 og 12.000 3 5 Dalton og har samme bedre forhold mellem antithrombotisk aktivitet og antikoagulemde aktivitet som de lavmolekylære heparinfraktioner, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge amerikansk patent nr. 4.281.108. Desuden er udbyttet af disse lavmolekylære fraktioner forbedret, og der fremstilles et renere produkt.

5 DK 172798 B1

Fremgangsmåden har ligesom den kendte fremgangsmåde den fordel, at der produceres lavmolekylære heparinfraktioner med en molekylvægt, der ligger fra ca. 4.000 til 12.000 Dalton. Det er således muligt at vælge fraktioner med forskellige forhold mellem anti-thrombotisk virkning og antikoagulerende virkning til forskellige terapeutiske og farma-5 kologiske formål.

Dette frembyder mange fordele. En patient i thrombogen tilstand med meget forkortet koaguleringstid kunne f.eks. anvende et antithrombotisk middel med en ret høj antikoagulerende aktivitet. På den anden side kunne en patient/ der er underkastet kirurgisk indgreb, og som har både risikoen for ^ blødning og postoperativ thrombose anvende et antithrombotisk middel med en lav antikoagulerende aktivitet.

Syrningstrinnet i den foreliggende fremgangsmåde kan udføres ved simpel syrning af normal heparin med kendte syrer eller fortrinsvis ved behandling med kationbytterharpiks. Den vigtige faktor i dette trin er producering af heparinsyre med J5 en pH-værdi 1 intervallet fra ca. 3 til ca, 5.

Heparinsyren depolymeriseres så i nærværelse af et peroxid ved en pH-værdi mellem ca. 3 og ca. 5. Depolymerisationen kan f.eks. udføres i en autoklav i nærværelse af hydrogenperoxid. I så tilfælde opvarmes autoklaven til et tryk, fortrinsvis mellem ca. 1 og 2 atmosfærer. Autoklaveringen kan standses efter forud valgte intervaller, såsom 15, 30, 60, 120 og 240 min. for at få lavmolekylære 9Π * heparinfraktioner med varierende MW, Deres fif? vil variere fra ca. 4.000 til 12,000 MW Dalton afhængende af autoklaveringstiden, idet de længere tider producerer de mindre fraktioner .

Fremgangsmåden ifølge amerikansk patent nr. 4.281.108 giver ca. 65% polymeriserede fraktioner, men udbytterne ved den foreliggende fremgangsmåde er bedre. Desuden produceres et renere slutprodukt, der er fri for fremmede stoffer, såsom fri pyridin, trimethylamin og ureagerede sulfotrioxider, som 6 DK 172798 B1 indføres i produktet ifølge amerikansk patent nr. 4.281.108 som følge af det nødvendige sulfateringstrin. Behovet for et rensningstrin elimineres derved.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere af det følgende eksempel.

Eksempel· 70 g industriel heparin (af injektionskvalitet ifølge U.S. Pharmacopoeia, leveres af Hepar Industries Inc., Ohio, USA) opløses i 350 ml destilleret vand og afkøles til 5-10°C. En egnet stærk kationbytterharpiks (Duolite®, leveres af DuPont, USA), tilsættes, indtil pH-værdien falder til 3,0 - 3,5, og harpiksen fjernes ved filtrering. 14 ml 30 vægt% hydrogen-peroxidopløsning tilsættes, og opløsningen autoklaveres straks 10 i 10 min. ved 125°C og 21 psi. Efter at opløsningen er afkølet til 25-40°C , indstilles pH-værdien til 6,8 med 3 N natriumhydroxid, og ethylalkohol tilsættes, indtil der nås en koncentration på ca. 50%. Bundfaldet opsamles og tørres under vakuum. Der opnås 56 g af slutproduktet svarende til et udbytte på ca. 80 vægt%, 15

Produktet havde følgende egenskaber:

Middelmolekylvægt: 4900 Dalton,

Optisk drejning: +47°

Nitrogenindhold: 2,12 vægt%

Organisk sulfatindhold: 32,1% APTT: 38 IU/mg Anti-Xa: 108 IU/mg ^ Forhold mellem anti-Xa og APTT: 2,8.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylære heparinfraktioner med en molekylvægt i intervallet fra ca. 4000 til ca. 12000 Dalton, kendetegnet ved, at 5 (a) normal heparin symes til dannelse afheparinsyre med en pH-værdi i intervallet fra ca. 3 til ca. 5, og (b) den dannede heparinsyre depolymeriseres ved opvarmning i nærværelse af et peroxid ved en pH-værdi mellem ca. 3 og ca. 5.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at pH-værdien i trin (a) er 10 i intervallet fra ca. 3,0 til ca. 3,5.

3. Fremgangsmåde ifølge krav I,kendetegnet ved, at depolymerisationen finder sted i en autoklav.

4. Fremgangsmåden ifølge krav 1,kendetegnet ved, at syrningen udføres med en kationbytterharpiks.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at peroxidet er hydrogen-peroxid.