DK160764B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af terapeutisk aktive heparinfragmenter - Google Patents

Description

i

DK 160764 B

Den foreliggende opfindelse angår en anal ogi fremgangsmåde til fremstilling af terapeutisk aktive herapinfragmenter, hvori disac-charidenheden L-iduronosyl-2-0-sulfat-N-sulfo-D-glucosamin-6-0-sul-fat er hovedbestanddelen, og hvor ikke-sul fateret L-iduronsyre 5 foreligger i en position 3-5 sukkerenheder fra den ikke-reducerede terminalgruppe og efterfølges af N-sulfo-D-glucosaminsul fat eller N-acetylglucosamin i sulfateret eller ikke-sul fateret form.

Heparin er et sulfatholdigt polysaccharid, som i stort omfang 10 isoleres fra tarmslim fra svin eller lunger fra kvæg. Det er i adskillige årtier blevet anvendt klinisk som et middel til behandling og forebyggelse af blodpropper. Selv om anvendelsen af heparin i thromboseprofylakse og -terapi er stadig stigende, er denne form for behandling langt fra uproblematisk. Et stort problem er, at 15 dosis må afbalanceres på en sådan måde, at der opnås en god throm-bosebeskyttelse samtidig med, at blødningskomplikationer undgås. En vanskelighed i denne sammenhæng er den store individuelle variation mellem forskellige patienter; dette skyldes sandsynligvis, at heparinet bindes i forskellig grad til andre komponenter i blod-20 plasmaet og derved neutraliseres. Et andet problem er, at den forebyggende heparinbehandling er en begrænset succes. Et tredie problem ved den foreliggende heparintype er dens svage virkning på arteriel thrombose. Ved denne thrombosetype er thrombocytaggrega-tionen et mere dominerede træk end ved den venøse thrombose, hvor 25 heparin giver en god virkning. Standardheparin stimulerer i en vis grad thrombocytaggregation og giver følgelig en negativ virkning i denne henseende.

Mekanismen bag heparins antikoagulationsaktivitet kendes nu i det 30 væsentlige. Blodkoagulationen er baseret på en kaskadelignende proces, hvor et antal proteolytiske enzymer aktiverer hinanden i en bestemt rækkefølge. I det sidste trin omdannes fibrinogen under indvirkning af det proteolytiske enzym thrombin til uopløselig fibrin, som er den fundamentale struktur i et blodkoagel. Heparin 35 danner et kompleks med et plasmaprotein, og dette kompleks hæmmer flertal let af enzymerne i koagulationskaskaden.

Det er for nylig påvist, at heparinfraktioner med forskellige molekylvægte påvirker koagulationsprocessen på forskellige måder (L.-0.

DK 160764 B

2

Andersson et al., Tromb. Res. 9, 575 (1976)). Dette initierede en undersøgelse af mulighederne for at udvikle heparinfraktioner, der har en mere selektiv virkning. Ved behandling af standardheparin med salpetersyrling i dimethoxyethan (glyme) ved lav temperatur og i en 5 nærmere bestemt tid har man opnået et specielt heparinfragment, der har en betydeligt større selektiv virkning end standardheparin.

Dette heparinderivat har en meget lille virkning på hæmningen af thrombin, medens hæmningen af aktiveret koagulationsfaktor X er meget forøget. Koagulationsfaktor X indtager en central position i 10 midten af koagulationskaskaden, og hæmningen deraf anses af mange for at være speciel vigtig til opnåelse af en effektiv thrombose- forebyggende virkning (S. Wessler, Thromb. Diath. Haemorrh. 33, 81 (1974)).

15 Det har endvidere helt overraskende vist sig, at denne type fragment ikke neutraliseres af blodkomponenterne i samme grad som standardheparin. Dette medfører bl.a., at man får en mere effektiv udnyttelse af antikoagulationsaktiviteten af denne fragmenttype sammenlignet med den nuværende kliniske anvendelse af heparinpræparater.

20 Endvidere bliver også doseringen lettere at gennemføre, da det bliver mindre vigtigt at tage hensyn til den individuelle variation i den heparin-neutral i serende virkning. En anden overraskende egenskab ved fragmentet er, at dets thrombocytaggregationsinduceren-de aktivitet er meget lavere, end den heparin sædvanligvis udviser.

25 Det er derfor sandsynligt, at denne fragmenttype er et bedre anti-koagulationsmiddel end standardheparin til forebyggende behandling og behandling af arteriel thrombose. Man kan også formode, at den nedsatte virkning på thrombocyterne kan reducere risikoen for blødni ngskompli kati oner.

30

Det bør endvidere bemærkes, at heparins evne til at frigøre enzymet lipoproteinlipase er stærkt afhængig af molekylvægten. Det lavmolekylære heparinfragment kan derfor formodes at have en yderligere værdifuld egenskab ved i mindre grad end standardheparin at forøge 35 indholdet af frie fedtsyrer i blodet.

Heparinfragmenter med de indledningsvis angivne karakteristika og med ovennævnte egenskaber fremstilles ved anal ogi fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved,

DK 160764 B

3 (a) at heparin behandles med salpetersyrling i dimethoxyethan, eller (b) at heparin oxideres med periodat ved lavt pH og lav temperatur, 5 behandles med alkali, neutraliseres og reduceres, eller (c) at heparin partielt depolymeriseres ved forestring af carboxyl -grupper, og det opnåede materiale derefter udsættes for alkalisk /J-eliminering, 10 og at det opnåede produkt oprenses til fremstilling af heparinfrag-menterne.

De ved nedbrydningen af heparinmolekyler frembragte heparinfragmen-15 ter består af aktive såvel som ikke-aktive fragmenter, og de aktive fragmenter oprenses, dvs. befries for ikke-aktive fragmenter, såsom ved affinitetskromatografi på matriks-bundet antithrombin III (Hook et al., FEBS Lett. 66, 90 (1976), Hopwood et al., FEBS Lett. 63, 51 (1976), L.-O. Andersson et al., Thromb. Res. 9, 575 (1976)). Meto-20 derne beskrives i eksemplerne.

De aktive fragmenter er ejendommelige ved, at de indeholder fra 14 til 18 sukkerenheder. Strukturanalyse viser samme hovedstrukturkomponenter som i standardheparin, dvs. L-iduronosyl-2-0-sulfat-(la-4)-25 N-sulfo-D-glucosamin-6-0-sulfat som den dominerende saccharid-enhed.

Mængden af ikke-sulfateret iduronsyre er imidlertid betragteligt større end i udgangsmaterialet. Ved periodatoxidation har det vist sig, at denne komponent har en bestemt position i molekylet, beliggende fra 3 til 5 sukkerenheder regnet fra den ikke-reducerende 30 terminal. De aktive fragmenter har strukturen (U-G)n-I-G-(U-G)m, hvor n er 1 eller 2, og m er 5 eller 6, I betegner i kke-sul fateret L-iduronsyre, U betegner L-iduronsyre-2-0-sulfat, og G betegner N-sulfo-D-glucosamin-6-0-sulfat. Nogle få U-enheder kan mangle O-sulfat eller kan være erstattet med D-glucuronsyre, ligesom nogle 35 få G-enheder kan mangle 0-sulfat eller kan være erstattet med N-acetyl-D-glucosaminenheder. Reducerende eller ikke-reducerende terminal enheder kan variere med den anvendte fremstillingsmetode; f.eks. fører deaminativ spaltning af heparin således til dannelsen af 2,5-anhydro-D-mannose i reducerende terminalposition. De aktive

DK 160764 B

4 fragmenter kan karakteriseres ved fysisk-kemi ske metoder, såsom bestemmelse af mobilitet i et elektrisk felt og ved UV-, IR- og NMR-spektre. De opnåede nummeriske værdier giver dog imidlertid ikke en fuldstændig information, eftersom endog koagulationsmæssigt 5 inaktive fragmenter udviser i alt væsentligt lignende egenskaber.

Dette beror på, at den biologiske aktivitet hidrører fra en specifik sekvens af sukkerresterne, hvor positionen af den ikke-sulfaterede uronsyre er specielt vigtig. En vis bruttosammensætning og størrelse garanterer således ikke, at komponenten er aktiv.

10

Opfindelsen illustreres yderligere ved følgende eksempler: EKSEMPEL 1 15 Fremstilling af heparinfraamenter ved depolvmerisering af standard-heparin med salpetersyrling.

Heparin (0,5 g) isoleret fra svinetarm og opløst i 150 ml vand afkøles til +4°C og føres gennem en 3x7 cm søjle af Dowex®50 W-28 20 (H+ form), 200-400 mesh. Søjlen vaskes derefter med 100 ml vand, og vaskevæsken kombineres med prøven. Til prøven sættes 250 ml dimeth-oxyethan (glyme) afkølet til -20°C samt 10 ml isoamylnitrit, og blandingen, som har en temperatur på ca. +10°C, henstår i 2 minutter. Reaktionen afbrydes derefter ved tilsætning af 10 ml 10% 25 Na+-acetat. Efter tilsætning af 5,2 liter ethanol indvindes præcipi-teret kulhydrat (heparinderivater) ved centrifugering. Produktet opløses i 500 ml 0,05 M NaCL - 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4. Denne opløsning fraktioneres, opdelt i 100 ml portioner, ved affinitetskromatografi på en søjle, der indeholder 75 ml antithrombin-Sepha-30 rose® (Phamacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) (ca. 5 mg protein pr. ml gel). Søjlen elueres med en saltgradient (500 ml 0,05 M NaCl - 0,05 M Tris-HCl i blandingsbeholderen; 500 ml 3 M NaCl - 0,05 M Tris-HCl i reservoiret), hvorved hovedparten af det påførte materiale enten passerer uforsinket gennem søjlen eller bliver elueret ved 35 en lav ionstyrke (mindre end 0,4 M NaCl); dette materiale har ingen biologisk aktivitet. De aktive komponenter (rensede heparinderiva-ter) elueres i en bred top med 0,5 M NaCl og 3 M NaCl svarende til ca. 4% af udgangsmaterialet. Disse fraktioner samles og afsal tes ved gel kromatografi.

DK 160764 B

5

Heparinderivater, der er fremstillet og renset på nævnte måde, har en molekyl størrelse, som svarer til molekylstørrelsen for et tetra-deca-octadecasaccharid (molekylvægt 3600-4800). Strukturanalyse viser de samme strukturkomponenter som i udgangsmaterialet, med 5 L-iduronosyl-2-0-sulfat-(la-4)-N-sulfo-D-glucosamin-6-0-sulfat som den dominerende disaccharidenhed. Mængden af ikke-sul fateret iduron-syre er imidlertid steget fra ca. 6% i udgangsmaterialet til ca.

16%. Strukturen iøvrigt stemmer overens med beskrivelsen ovenfor.

10 EKSEMPEL 2

Partiel depolvmerisering af heparin eller heparinbi produkt ved periodat oxidation ved en pH-værdi på 3 og en temperatur på 4*C. efterfulgt af al kali behandling og reduktion.

15

Under disse betingelser spaltes polysaccharidkæden ved D-glucoron-syreenheder resulterende i kun moderat tab af antikoagulationsaktivitet (Fransson og Lewis, FEBS Letters, 1979). Standardheparin (0,5 g) opløses i 250 ml af en opløsning (4°C) indeholdende 0,02 M 20 NalO^, 0,2 M NaClO^ og 0,05 M Na+-citratpuffer, pH 3,0. Efter 3 timers inkubation i mørke ved 4*C afbrydes oxidationen ved tilsætningen af et molært overskud af D-mannitol, hvorefter opløsningen dialyseres og frysetørres. Spaltning af polysaccharidkæderne ved oxiderede D-glucoronsyreenheder udføres ved behandling af produktet 25 med alkali (5 mg/ml vandig opløsning indstillet til pH 12 med 1 M NaOH) ved stuetemperatur. Efter 10 minutter neutraliseres opløsningen med 1 M eddikesyre, og materialet afsaltes derefter ved gelkromatografi på dextranmateriale (Sephadex® G-25, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige). Det opnåede produkt kan reduceres med 30 natriumborhydrid.

Heparin, der behandles på denne måde, er stærkt depolymeriseret sammenlignet med udgangsmaterialet; gel kromatografi viser, at de fremkomne fragmenter har en størrelse, der svarer til 10-25 sukker-35 enheder, og de er derfor noget større end de fragmenter, der isoleres efter behandling med salpetersyrling ifølge eksempel 1. I alt ødelægges ca. 20% af uronsyrerne i polysaccharidet under periodat-oxidationen (pH 3, 4°C, 3-6 timer). Rensning ved affinitetskromatografi af oxidationsprodukterne på antithrombin-agarose-Sepharose® 6

DK 160764 B

giver et udbytte på ca. 30% højaffinitetsmateriale efter 3 timer og et udbytte på 15% efter 6 timers oxidation. De således opnåede produkter havde en anti faktor X -pontentierende effekt bestemt ifølge eksempel B i plasma på mere end 1000 enheder/mg sammenlignet 5 med 3. Internationale Heparinstandard.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af heparinfraamenter ved partiel deoolvmerisering af 10 heparin med forestrede carboxvlgrupper og alkalisk θ-eliminerina af det opnåede produkt.

Natriumheparin fra svinetarmslimhinde (20 g) blev opløst i vand (100 ml) og under omrøring dråbevis sat til en opløsning af Hyamin® 1622 15 (diisobutylphenoxyethoxyethyl)-dimethylbenzylammoniumchlorid (100 g) i vand (500 ml). Blandingen blev omrørt i yderligere én time og derpå afkølet i et køleskab natten over. Supernatanten blev fraskilt, og præcipitatet blev vasket med vand (400 ml) og centrifugeret i ½ time. Præcipitatet blev tørret ved 60°C i vakuum natten 20 over. Den opnåede, klæbrige gummi blev opløst i dichlormethan (400 ml), og der blev tilsat a-bromotoluen (45 ml). Opløsningen blev omrørt i 72 timer ved 23°C. Den dannede benzyl ester blev derpå præcipi teret ved tilsætning af natriumacetat opløst i methanol (15 vægt/volumen, 500 ml). Præcipitatet blev centrifugeret i ½ time, 25 vasket med methanol (250 ml) og igen centrifugeret. Det opnåede præcipitat blev opløst i vand (50 ml) og methanol (50 ml). Der blev derpå tilsat natriumacetat (15 g). Efter omrøring i 1 time blev blandingen filtreret gennem Cel ite®, og til filtratet blev der sat methanol (500 ml). Præcipitatet blev til slut vasket med methanol, 30 centrifugeret og tørret i vakuum natten over. Udbyttet af heparin- benzylester var 14 g.

Heparinbenzylester (1,0 g) blev opløst i vand (5 ml) og opvarmet til 60®C. Natriumhydroxid (0,40 M, 5 ml) blev tilsat, og opløsningen 35 blev omrørt i 2 timer ved 60eC. Efter afkøling af blandingen til stuetemperatur blev der tilsat en kationbytter (Dowex® 50 W-X8 H) til neutralisering af den basiske opløsning. Harpiksen blev frafiltreret og vasket med vand (1 ml). pH af de forenede opløsninger (filtrat og vaskevand) blev justeret til pH 7 ved tilsætning af

DK 160764 B

7 fortyndet natriumhydroxid og derpå frysetørret. Udbyttet var 1,0 g.

Den gennemsnitlige molekylvægt for dette heparinfragment var 5000.

Undersøgelse af antikoaaulationsaktivitet.

5

Det ifølge eksempel 1 fremstillede heparinfragment blev undersøgt med hensyn til dets evne til: A) at fremme hæmningen af koagulationsenzymet thrombin; B) at fremme hæmningen af aktiveret koagulationsfaktor X; C) at forlænge koagulationstiden i blodplasma-10 koagulationsprøven APTT (Activated Partial Thromboplastine Time); D) at blive neutraliseret af blodplasmakomponenter og E) at påvirke aggregationen af trombocyter.

Eksempel A

15 Hæmning af thrombin.

Heparinfragmentets evne til at potentiere hæmningen af thrombin med antithrombin III analyseredes ifølge en modifikation af en metode af 20 Teien et al. (Thrombosis Research 11, s. 107-117, 1977). Heparin- fragmentet udviste en specifik aktivitet på mindre end 20 E/mg sammenlignet med 120-170 E/mg for standardheparin.

Eksempel B

25 Hæmning af aktiveret faktor X.

Heparinfragmentets evne til at potentiere hæmningen af aktiveret faktor X i plasma og i rent anti thrombin III undersøgtes ifølge en 30 modificeret version af en metode af Teien et al. (Thrombosis Re search 8, 413, 1977). Heparinfraktionen udviste en specifik aktivitet på 500 E/mg i et rent antithrombin Ill-system og 2100 E/mg i et plasmasystem sammenlignet med 120-170 E/mg for standardheparin.

35 Eksempel C

Forlængelse af koaoulationstiden.

Evnen til at forlænge koagulationstiden for blodplasma undersøgtes

DK 160764 B

8 ifølge APTT-metoden (Activated Partial Thromboplastine Time method) (Andersson et al., Thromb. Res. 9, 575, 1976)). Heparinfragmentet udviste en specifik aktivitet på mindre end 20 E/mg sammenlignet med 3. International Heparinstandard. Standardheparin viser en specifik 5 aktivitet i området 120-170 E/mg.

Eksempel D

Neutralisering af heparinfraomenter i blodplasma.

10

Plasmakomponenters heparinneutral iserende effekt undersøgtes ved at måle effekten af heparin og heparinfragmentet i plasma og i et rent antithrombinsystem. Dette udførtes ved at måle mængden af aktiveret faktor X, som hæmmedes i de to systemer i nærværelse af en vis 15 mængde heparin eller heparinfragment. Aktiviteten af heparinfragmentet blev 15% neutraliseret af plasmakomponenter, medens den tilsvarende værdi for standardheparin viste sig at være 75%.

Eksempel E

20

Thrombocvtpåvirkning.

Heparinfragmentets evne til at aggregere thrombocyter ved kritiske ADP-koncentrationer (ADP = adenosindiphosphat) blev undersøgt i alt 25 væsentligt ifølge Beck, E.A: (Thromb Haem Stuttg. 1977, 38, 578).

Det påvistes, at heparinfragmentets thrombocytaggregerende evne var 10 gange lavere end standardheparins, beregnet på vægtbasis.

Heparinfragmenter fremstillet ved anal ogi fremgangsmåden ifølge 30 opfindelsen kan inkorporeres i farmaceutiske præparater til klinisk brug, fortrinsvis i vandige opløsninger til injektion eller i salvepræparater til indgivelse gennem hud og slimhinder.

35

Claims (1)

1. DK 160764 B Patentkrav. Anal ogi fremgangsmåde til fremstilling af terapeutisk aktive herapin-fragmenter, hvori disaccharidenheden L-iduronosyl-2-0-sulfat-N-sul-fo-D-glucosamin-6-O-sulfat er hovedbestanddel en, og hvor ikke-sulfa-teret L-iduronsyre foreligger i en position 3-5 sukkerenheder fra 5 den ikke-reducerede terminal gruppe og efterfølges af N-sulfo-D-glu-cosaminsulfat eller N-acetylglucosamin i sulfateret eller ikke-sul-fateret form, kendetegnet ved, (a) at heparin behandles med salpetersyrling i dimethoxyethan, 10 eller (b) at heparin oxideres med periodat ved lavt pH og lav temperatur, behandles med alkali, neutraliseres og reduceres, eller 15 (c) at heparin partielt depolymeri seres ved forestring af carboxyl- grupper, og det opnåede materiale derefter udsættes for alkalisk ^-eliminering, og at det opnåede produkt oprenses til fremstilling af heparinfrag-20 menterne.