JPS6344764B2 - - Google Patents
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- JPS6344764B2 JPS6344764B2 JP55500234A JP50023480A JPS6344764B2 JP S6344764 B2 JPS6344764 B2 JP S6344764B2 JP 55500234 A JP55500234 A JP 55500234A JP 50023480 A JP50023480 A JP 50023480A JP S6344764 B2 JPS6344764 B2 JP S6344764B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
請求の範囲
１ 構造
（Ｕ−Ｇ）o−Ｉ−Ｇ−（Ｕ−Ｇ）n
（式中、ｎは１もしくは２でありそしてｍは５
もしくは６であり、Ｉは硫酸化されてないＬ―イ
ズロン酸であり、ＵはＬ―イズロン酸―２―Ｏ―
スルフエートであり、そしてＧはＮ―スルホ―Ｄ
―グルコサミン―６―Ｏ―スルフエートであり、
そして少数のＵ単位はＯ―スルフエートを欠いて
いるかあるいはＤ―グルクロン酸で置換されてい
てもよく、そして少数のＧ単位はＯ―スルフエー
トを欠いているかあるいはＮ―アセチル―Ｄ―グ
ルコサミン単位によつて置換されていてもよい）
を有することを特徴とするヘパリンフラグメン
ト。
もしくは６であり、Ｉは硫酸化されてないＬ―イ
ズロン酸であり、ＵはＬ―イズロン酸―２―Ｏ―
スルフエートであり、そしてＧはＮ―スルホ―Ｄ
―グルコサミン―６―Ｏ―スルフエートであり、
そして少数のＵ単位はＯ―スルフエートを欠いて
いるかあるいはＤ―グルクロン酸で置換されてい
てもよく、そして少数のＧ単位はＯ―スルフエー
トを欠いているかあるいはＮ―アセチル―Ｄ―グ
ルコサミン単位によつて置換されていてもよい）
を有することを特徴とするヘパリンフラグメン
ト。
２ (a) ジメトキシエタン中でヘパリンを亜硝酸
で処理しそして得られる物質を精製するか、あ
るいは (b) ヘパリンをそれぞれ低いPHおよび温度で過沃
素酸塩酸化するか、あるいは (c) ヘパリンをヘパリナーゼを用いて部分的に解
重合するか、あるいは (d) カルボキシル基のエステル化によりヘパリン
を部分的に解重合しそして次いで得られる物質
をアルカリ性β―脱離に付するか、あるいは (e) 部分的Ｎ―脱硫酸化からのヘパリンを部分的
に解重合しそして次いで得られる物質を亜硝酸
を用いて脱アミノ化する ことを特徴とする、構造 （Ｕ−Ｇ）o−Ｉ−Ｇ−（Ｕ−Ｇ）n （式中、ｎは１もしくは２でありそしてｍは５
もしくは６であり、Ｉは硫酸化されてないＬ―イ
ズロン酸であり、ＵはＬ―イズロン酸―２―Ｏ―
スルフエートであり、そしてＧはＮ―スルホ―Ｄ
―グルコサミン―６―Ｏ―スルフエートであり、
そして少数のＵ単位はＯ―スルフエートを欠いて
いるかあるいはＤ―グルクロン酸で置換されてい
てもよく、そして少数のＧ単位はＯ―スルフエー
トを欠いているかあるいはＮ―アセチル―Ｄ―グ
ルコサミン単位によつて置換されていてもよい）
を有するヘパリンフラグメントの製法。
で処理しそして得られる物質を精製するか、あ
るいは (b) ヘパリンをそれぞれ低いPHおよび温度で過沃
素酸塩酸化するか、あるいは (c) ヘパリンをヘパリナーゼを用いて部分的に解
重合するか、あるいは (d) カルボキシル基のエステル化によりヘパリン
を部分的に解重合しそして次いで得られる物質
をアルカリ性β―脱離に付するか、あるいは (e) 部分的Ｎ―脱硫酸化からのヘパリンを部分的
に解重合しそして次いで得られる物質を亜硝酸
を用いて脱アミノ化する ことを特徴とする、構造 （Ｕ−Ｇ）o−Ｉ−Ｇ−（Ｕ−Ｇ）n （式中、ｎは１もしくは２でありそしてｍは５
もしくは６であり、Ｉは硫酸化されてないＬ―イ
ズロン酸であり、ＵはＬ―イズロン酸―２―Ｏ―
スルフエートであり、そしてＧはＮ―スルホ―Ｄ
―グルコサミン―６―Ｏ―スルフエートであり、
そして少数のＵ単位はＯ―スルフエートを欠いて
いるかあるいはＤ―グルクロン酸で置換されてい
てもよく、そして少数のＧ単位はＯ―スルフエー
トを欠いているかあるいはＮ―アセチル―Ｄ―グ
ルコサミン単位によつて置換されていてもよい）
を有するヘパリンフラグメントの製法。
明細書
本発明は、選択的血液凝固阻止活性を有するこ
とが示されているヘパリンフラグメント、その製
法、およびかかるフラグメントを含有している治
療用組成物に関する。
とが示されているヘパリンフラグメント、その製
法、およびかかるフラグメントを含有している治
療用組成物に関する。
ヘパリンは豚の腸粘膜あるいは牛の肺から大規
模に単離されるスルフエート含有多糖類である。
これは血栓症の予防および治療のための医薬剤と
して臨床的に使用されてきた。血栓症の予防およ
び治療におけるヘパリンの利用はまだ増大してい
るという事実にもかかわらず、この治療の形態は
問題なしとするには程遠い。重要な問題は出血合
併症が回避されると同時に良好な血栓症保護が得
られるように薬用量が平衡していなければならな
いことである。これに関連する難点は異なる患者
の間の個人差が大きいことである。これは次にお
そらくヘパリンが血漿中の他の成分に種々の程度
に結合されそしてそれにより中和されているとい
う事実に関係していよう。もう一つの問題は予防
的なヘパリン治療が限られた成功しか達成できな
いことである。現在の種類のヘパリンの第三の問
題は動脈血栓症への効果が弱いことである。この
型の血栓症では、ヘパリンが良好な結果を生ずる
静脈血栓症におけるよりも栓求集合がより優勢な
特徴である。標準的なヘパリンはある程度までは
栓球集合を刺激し、そして従つてこの点において
否定的な効果を生ずる。
模に単離されるスルフエート含有多糖類である。
これは血栓症の予防および治療のための医薬剤と
して臨床的に使用されてきた。血栓症の予防およ
び治療におけるヘパリンの利用はまだ増大してい
るという事実にもかかわらず、この治療の形態は
問題なしとするには程遠い。重要な問題は出血合
併症が回避されると同時に良好な血栓症保護が得
られるように薬用量が平衡していなければならな
いことである。これに関連する難点は異なる患者
の間の個人差が大きいことである。これは次にお
そらくヘパリンが血漿中の他の成分に種々の程度
に結合されそしてそれにより中和されているとい
う事実に関係していよう。もう一つの問題は予防
的なヘパリン治療が限られた成功しか達成できな
いことである。現在の種類のヘパリンの第三の問
題は動脈血栓症への効果が弱いことである。この
型の血栓症では、ヘパリンが良好な結果を生ずる
静脈血栓症におけるよりも栓求集合がより優勢な
特徴である。標準的なヘパリンはある程度までは
栓球集合を刺激し、そして従つてこの点において
否定的な効果を生ずる。
ヘパリンの血液凝固阻止活性の機構は今や本質
的に知られている。血液凝固は、多数の蛋白質分
解酵素が一定の順序で相互に活性化作用する段階
（カスケード）状過程に基づいている。最終段階
でフイブリノーゲンが蛋白分解酵素たるトロンビ
ンの作用下に血液凝固塊（コアゲル）中の基本構
造である不活性フイブリンに変換される。ヘパリ
ンは血漿蛋白質と複合体を形成し、そしてこの複
合体が凝固段階中で酵素の大部分を抑制する。
的に知られている。血液凝固は、多数の蛋白質分
解酵素が一定の順序で相互に活性化作用する段階
（カスケード）状過程に基づいている。最終段階
でフイブリノーゲンが蛋白分解酵素たるトロンビ
ンの作用下に血液凝固塊（コアゲル）中の基本構
造である不活性フイブリンに変換される。ヘパリ
ンは血漿蛋白質と複合体を形成し、そしてこの複
合体が凝固段階中で酵素の大部分を抑制する。
最近、種々の分子量のヘパリン画分が凝固過程
に種々の形で影響することが明らかにされた〔L.
O.Andersson氏他「Thromb.Res.」第９巻第575
頁（1976）参照〕。このことがより選択的な作用
を有するヘパリン画分を開発する可能性の研究を
開始させた。標準的なヘパリンをジメトキシエタ
ン（グライム中で亜硝酸と低温においてそしてあ
る一定時間処理すると標準ヘパリンより相当高い
選択的作用を有する特別なヘパリンフラグメント
を生ずる。このヘパリン誘導体はトロンビンの抑
制には非常に少ししか作用せず、他方活性化され
た凝固因子Ｘの抑制は大いに促進される。凝固因
子Ｘは凝固段階の中央で中心的位置を占めそして
その抑制は効果的な血栓症防止効果を得るために
は特に重要であると考えられている〔S.Wessler
氏「Thromb.Diath.Haemorrh.」第33巻第81頁
（1974）参照〕。
に種々の形で影響することが明らかにされた〔L.
O.Andersson氏他「Thromb.Res.」第９巻第575
頁（1976）参照〕。このことがより選択的な作用
を有するヘパリン画分を開発する可能性の研究を
開始させた。標準的なヘパリンをジメトキシエタ
ン（グライム中で亜硝酸と低温においてそしてあ
る一定時間処理すると標準ヘパリンより相当高い
選択的作用を有する特別なヘパリンフラグメント
を生ずる。このヘパリン誘導体はトロンビンの抑
制には非常に少ししか作用せず、他方活性化され
た凝固因子Ｘの抑制は大いに促進される。凝固因
子Ｘは凝固段階の中央で中心的位置を占めそして
その抑制は効果的な血栓症防止効果を得るために
は特に重要であると考えられている〔S.Wessler
氏「Thromb.Diath.Haemorrh.」第33巻第81頁
（1974）参照〕。
さらに極めて意外にも上記された種類のフラグ
メントは血液成分によつて標準ヘパリンと同じ程
度には中和されないことが示された。このこと
は、なかんずく、現在の臨床的に使用されている
ヘパリン製剤と比較してこの種類のフラグメント
の血液凝固阻止活性の一層効率的な利用を生ず
る。さらに、ヘパリン中和効果の個人差は考慮に
入れるにはあまり重要でなくなるので投薬も一層
実施容易である。このフラグメントのもう一つの
驚くべき性質はその栓球集合誘起作用がヘパリン
により通常示される作用よりはるかに低いことで
ある。従つて、動脈血栓症の予防的処置および治
療にとつてこの種のフラグメントが標準的ヘパリ
ンより良好な血液凝固阻止剤であることはありう
る。また、栓球に対する影響の減少は出血合併症
の危険の低下につながることも想定されよう。
メントは血液成分によつて標準ヘパリンと同じ程
度には中和されないことが示された。このこと
は、なかんずく、現在の臨床的に使用されている
ヘパリン製剤と比較してこの種類のフラグメント
の血液凝固阻止活性の一層効率的な利用を生ず
る。さらに、ヘパリン中和効果の個人差は考慮に
入れるにはあまり重要でなくなるので投薬も一層
実施容易である。このフラグメントのもう一つの
驚くべき性質はその栓球集合誘起作用がヘパリン
により通常示される作用よりはるかに低いことで
ある。従つて、動脈血栓症の予防的処置および治
療にとつてこの種のフラグメントが標準的ヘパリ
ンより良好な血液凝固阻止剤であることはありう
る。また、栓球に対する影響の減少は出血合併症
の危険の低下につながることも想定されよう。
酵素脂肪蛋白質リパーゼを放出するためのヘパ
リンの能力は分子量に強く依存していることも注
意されねばならない。従つて、低分子量ヘパリン
フラグメントはそれが標準ヘパリンより少ない程
度に血液中の遊離脂肪酸の含量を増大させるとい
う点でもう一つの価値ある性質を有すると考えら
れる。
リンの能力は分子量に強く依存していることも注
意されねばならない。従つて、低分子量ヘパリン
フラグメントはそれが標準ヘパリンより少ない程
度に血液中の遊離脂肪酸の含量を増大させるとい
う点でもう一つの価値ある性質を有すると考えら
れる。
この特殊なタイプのヘパリンフラグメントはい
くつかの異なる方法で製造されうる。一つの方法
ａ）は標準ヘパリンを前述のようにジメトキシエ
タン中で亜硝酸で処理することからなる。該方法
は一連の不活性フラグメントと共にこのタイプの
フラグメントを生ずる。次いで活性フラグメント
はマトリツクス結合されたアンチトロンビン上
でのアフイニテイクロマトグラフイーによるよう
に不活性要素から除かれる〔Ho¨o¨k氏他「FEBS
Lett.」第66巻第90頁（1976），Hopwood氏他
「FEBS Lett.」第63巻第51頁（1976），L.O.
Andersson氏他「Thromb.Res.」第９巻第575頁
（1976）〕。その他のフラグメント製造法は、ｂ）
低PHおよび低温での過沃素酸塩酸化、ｃ）ヘパリ
ナーゼを用いる部分的解重合、ｄ）カルボキシル
基のエステル化によるヘパリンの部分的解重合お
よびそれに続くアルカリ性β―脱離、そしてｅ）
部分的Ｎ―脱硫酸化によるヘパリンの部分的解重
合およびそれに続くPH3.9での亜硝酸での脱アミ
ノ化である。方法ａ）およびｂ）は実施例に記載
されている。
くつかの異なる方法で製造されうる。一つの方法
ａ）は標準ヘパリンを前述のようにジメトキシエ
タン中で亜硝酸で処理することからなる。該方法
は一連の不活性フラグメントと共にこのタイプの
フラグメントを生ずる。次いで活性フラグメント
はマトリツクス結合されたアンチトロンビン上
でのアフイニテイクロマトグラフイーによるよう
に不活性要素から除かれる〔Ho¨o¨k氏他「FEBS
Lett.」第66巻第90頁（1976），Hopwood氏他
「FEBS Lett.」第63巻第51頁（1976），L.O.
Andersson氏他「Thromb.Res.」第９巻第575頁
（1976）〕。その他のフラグメント製造法は、ｂ）
低PHおよび低温での過沃素酸塩酸化、ｃ）ヘパリ
ナーゼを用いる部分的解重合、ｄ）カルボキシル
基のエステル化によるヘパリンの部分的解重合お
よびそれに続くアルカリ性β―脱離、そしてｅ）
部分的Ｎ―脱硫酸化によるヘパリンの部分的解重
合およびそれに続くPH3.9での亜硝酸での脱アミ
ノ化である。方法ａ）およびｂ）は実施例に記載
されている。
活性フラグメントはそれらが14〜18個の糖単位
を含有していることを特徴とする。構造分析は標
準ヘパリンと同じ主要構造成分、すなわちＬ―イ
ズロノシル―２―Ｏ―スルフエート―（1α―４）
―Ｎ―スルホ―Ｄ―グルコサミン―６―Ｏ―スル
フエートを優勢な糖類（サツカライド）単位とし
て示している。しかしながら、硫酸化されてない
イズロン酸の量は出発物質中におけるよりも相当
高い。過沃素酸塩酸化は、この成分が非還元性末
端から数えて３〜５番目の糖単位に位置されてい
る分子中の特定位置をとりそしてＮ―スルホ―Ｄ
―グルコサミンスルフエートあるいは硫酸化され
ているかもしくは硫酸化されてない形のＮ―アセ
チル―グルコサミンが続いていることを示してい
る。これらの活性フラグメントは構造 （Ｕ−Ｇ）o−Ｉ−Ｇ−（Ｕ−Ｇ）n を有する。ここでｎは１もしくは２でありそして
ｍは５もしくは６であり、Ｉは硫酸化されてない
Ｌ―イズロン酸であり、ＵはＬ―イズロン酸―２
―Ｏ―スルフエートであり、そしてＧはＮ―スル
ホ―Ｄ―グルコサミン―６―Ｏ―スルフエートで
ある。少数のＵ単位はＯ―スルフエートを欠いて
いるかあるいはＤ―グルクロン酸で置換されてい
てよいし、そして同様に少数のＧ単位はＯ―スル
フエートを欠いているかあるいはＮ―アセチル―
Ｄ―グルコサミン単位によつて置換されていても
よい。還元性もしくは非還元性末端単位は使用さ
れる製法の種類と共に変動しうる。従つて、例え
ばヘパリンを脱アミン的分解すると還元性末端に
２，５―アンヒドロ―Ｄ―マンノースの形成をき
たす。活性フラグメントは電場における運動性お
よびUV，IRならびにNMRスペクトルの測定の
ような物理化学的方法により特性づけられる。し
かしながら、得られる多数の値は完全な情報を与
えるものではない。何故ならば凝固に対して不活
性なフラグメントも実質上同様の特性を示すから
である。このことは生物学的活性が硫酸化されて
ないウロン酸の位置が特に重要である糖残基の特
定順序から誘導されるという事実に依存してい
る。従つて、全体の組成および大きさのみがその
成分が活性であるのを保証するものではない。
を含有していることを特徴とする。構造分析は標
準ヘパリンと同じ主要構造成分、すなわちＬ―イ
ズロノシル―２―Ｏ―スルフエート―（1α―４）
―Ｎ―スルホ―Ｄ―グルコサミン―６―Ｏ―スル
フエートを優勢な糖類（サツカライド）単位とし
て示している。しかしながら、硫酸化されてない
イズロン酸の量は出発物質中におけるよりも相当
高い。過沃素酸塩酸化は、この成分が非還元性末
端から数えて３〜５番目の糖単位に位置されてい
る分子中の特定位置をとりそしてＮ―スルホ―Ｄ
―グルコサミンスルフエートあるいは硫酸化され
ているかもしくは硫酸化されてない形のＮ―アセ
チル―グルコサミンが続いていることを示してい
る。これらの活性フラグメントは構造 （Ｕ−Ｇ）o−Ｉ−Ｇ−（Ｕ−Ｇ）n を有する。ここでｎは１もしくは２でありそして
ｍは５もしくは６であり、Ｉは硫酸化されてない
Ｌ―イズロン酸であり、ＵはＬ―イズロン酸―２
―Ｏ―スルフエートであり、そしてＧはＮ―スル
ホ―Ｄ―グルコサミン―６―Ｏ―スルフエートで
ある。少数のＵ単位はＯ―スルフエートを欠いて
いるかあるいはＤ―グルクロン酸で置換されてい
てよいし、そして同様に少数のＧ単位はＯ―スル
フエートを欠いているかあるいはＮ―アセチル―
Ｄ―グルコサミン単位によつて置換されていても
よい。還元性もしくは非還元性末端単位は使用さ
れる製法の種類と共に変動しうる。従つて、例え
ばヘパリンを脱アミン的分解すると還元性末端に
２，５―アンヒドロ―Ｄ―マンノースの形成をき
たす。活性フラグメントは電場における運動性お
よびUV，IRならびにNMRスペクトルの測定の
ような物理化学的方法により特性づけられる。し
かしながら、得られる多数の値は完全な情報を与
えるものではない。何故ならば凝固に対して不活
性なフラグメントも実質上同様の特性を示すから
である。このことは生物学的活性が硫酸化されて
ないウロン酸の位置が特に重要である糖残基の特
定順序から誘導されるという事実に依存してい
る。従つて、全体の組成および大きさのみがその
成分が活性であるのを保証するものではない。
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例 １
亜硝酸の標準ヘパリンの解重合によるヘパリン
フラグメントの調製 豚の腸から単離されそして水150ml中に溶解さ
れたヘパリン（0.5ｇ）を４℃に冷却しそして200
〜400メツシユの「ダウエツクス（Dowex）」（登
録商標）50W―28（H+型）の３×７cmカラムに通
す。次いでこのカラムを水100mlで洗いそして洗
浄液を試料と合する。この試料に−20℃に冷却し
たジメトキシエタン（グライム）250mlおよび亜
硝酸イソアミル10mlを加え、そして約10℃の温度
を有するこの混合物を２分間放置する。次いで10
％酢酸ナトリウム10mlを添加することにより反応
を止める。エタノール5.2を添加したのち、沈
殿した炭水化物（ヘパリン誘導体）を遠心分離に
より回収する。生成物をPH7.4の0.05M NaCl―
0.05Mトリス（Tris）HCl500ml中に溶解させる。
この溶液をアンチトロンビン―「セフアロース
（Sepharose）」（登録商標）Pharmacia Fine
Chemicals社製品75ml（蛋白質約５mg／ゲル１
ml）を含有するカラム上でのアフイニテイクロマ
トグラフイーにより分別して100mlずつに分ける。
カラムを塩傾斜（混合容器中0.05M NaCl―
0.05M トリスHCl500ml、受器中3M NaCl―
0.05M トリスHCl500ml）により溶離し、適用
された物質の主要部分はカラムを遅滞なく通過す
るかあるいは低いイオン強度（0.4M NaCl以下）
で溶離される。この物質は生物学的活性を有しな
い。活性成分（精製されたヘパリン誘導体）は広
い頂部0.5M NaClおよび3M NaCl中に溶離さ
れ、出発物質の約４％に相当する。これらのフラ
クシヨンは集められそしてゲルクロマトグラフイ
ーにより脱塩される。
フラグメントの調製 豚の腸から単離されそして水150ml中に溶解さ
れたヘパリン（0.5ｇ）を４℃に冷却しそして200
〜400メツシユの「ダウエツクス（Dowex）」（登
録商標）50W―28（H+型）の３×７cmカラムに通
す。次いでこのカラムを水100mlで洗いそして洗
浄液を試料と合する。この試料に−20℃に冷却し
たジメトキシエタン（グライム）250mlおよび亜
硝酸イソアミル10mlを加え、そして約10℃の温度
を有するこの混合物を２分間放置する。次いで10
％酢酸ナトリウム10mlを添加することにより反応
を止める。エタノール5.2を添加したのち、沈
殿した炭水化物（ヘパリン誘導体）を遠心分離に
より回収する。生成物をPH7.4の0.05M NaCl―
0.05Mトリス（Tris）HCl500ml中に溶解させる。
この溶液をアンチトロンビン―「セフアロース
（Sepharose）」（登録商標）Pharmacia Fine
Chemicals社製品75ml（蛋白質約５mg／ゲル１
ml）を含有するカラム上でのアフイニテイクロマ
トグラフイーにより分別して100mlずつに分ける。
カラムを塩傾斜（混合容器中0.05M NaCl―
0.05M トリスHCl500ml、受器中3M NaCl―
0.05M トリスHCl500ml）により溶離し、適用
された物質の主要部分はカラムを遅滞なく通過す
るかあるいは低いイオン強度（0.4M NaCl以下）
で溶離される。この物質は生物学的活性を有しな
い。活性成分（精製されたヘパリン誘導体）は広
い頂部0.5M NaClおよび3M NaCl中に溶離さ
れ、出発物質の約４％に相当する。これらのフラ
クシヨンは集められそしてゲルクロマトグラフイ
ーにより脱塩される。
該方法により製造且つ精製されたヘパリン誘導
体はテトラデカ―オクタ―デカ多糖類（分子量
3600〜4800）のそれに相当する分子大きさを有す
る。構造分析では出発物質におけると同じ構造成
分を示しており、Ｌ―イズロノシル―２―Ｏ―ス
ルフエート―（1α―４）―Ｎ―スルホ―Ｄ―グ
ルコサミン―６―Ｏ―スルフエートが主要二糖類
単位である。しかしながら、硫酸化されてないイ
ズロン酸の量は出発物質中の約６％から約16％に
増大している。構造は他の点に関しては上記記載
と一致する。
体はテトラデカ―オクタ―デカ多糖類（分子量
3600〜4800）のそれに相当する分子大きさを有す
る。構造分析では出発物質におけると同じ構造成
分を示しており、Ｌ―イズロノシル―２―Ｏ―ス
ルフエート―（1α―４）―Ｎ―スルホ―Ｄ―グ
ルコサミン―６―Ｏ―スルフエートが主要二糖類
単位である。しかしながら、硫酸化されてないイ
ズロン酸の量は出発物質中の約６％から約16％に
増大している。構造は他の点に関しては上記記載
と一致する。
実施例 ２
PH値３および４℃における過沃素酸塩酸化およ
び続いてのアルカリ処理および還元によるヘパ
リンあるいはヘパリン副生物の部分的解重合 これらの条件下に多糖類鎖がＤ―グルクロン酸
単位において解裂されて血液凝固阻止活性のわず
かに中程度の損失を生ずる〔Frassonおよび
Lewis氏「FEBS Lett.」1979年印刷中〕。標準ヘ
パリン（0.5ｇ）を0.02M NaIO4，0.2M
NaClO4、および0.05Mのクエン酸ナトリウム緩
衝液を含有するPH3.0の溶液（４℃）250ml中に溶
解させる。４℃で暗所で３時間培養したのちにＤ
―マンニトールのモル過剰を加えることにより酸
化を止め、そして次にこの溶液を透析しそして凍
結乾燥する。酸化されたＤ―グルクロン酸単位で
の多糖類鎖の解裂は生成物を室温でアルカリで処
理することにより行われる（５mg／mlの水溶液を
1M NaOHでPH12に調整する）。10分後この溶液
を1M酢酸を用いて中和しそしてこの物質をデキ
ストラン物質（セフアデツクスＧ―25、フアルマ
シア・フアイン・ケミカルズ社製品）上でゲルク
ロマトグラフイーすることにより脱塩する。得ら
れる生成物は水素化硼素ナトリウムで還元でき
る。
び続いてのアルカリ処理および還元によるヘパ
リンあるいはヘパリン副生物の部分的解重合 これらの条件下に多糖類鎖がＤ―グルクロン酸
単位において解裂されて血液凝固阻止活性のわず
かに中程度の損失を生ずる〔Frassonおよび
Lewis氏「FEBS Lett.」1979年印刷中〕。標準ヘ
パリン（0.5ｇ）を0.02M NaIO4，0.2M
NaClO4、および0.05Mのクエン酸ナトリウム緩
衝液を含有するPH3.0の溶液（４℃）250ml中に溶
解させる。４℃で暗所で３時間培養したのちにＤ
―マンニトールのモル過剰を加えることにより酸
化を止め、そして次にこの溶液を透析しそして凍
結乾燥する。酸化されたＤ―グルクロン酸単位で
の多糖類鎖の解裂は生成物を室温でアルカリで処
理することにより行われる（５mg／mlの水溶液を
1M NaOHでPH12に調整する）。10分後この溶液
を1M酢酸を用いて中和しそしてこの物質をデキ
ストラン物質（セフアデツクスＧ―25、フアルマ
シア・フアイン・ケミカルズ社製品）上でゲルク
ロマトグラフイーすることにより脱塩する。得ら
れる生成物は水素化硼素ナトリウムで還元でき
る。
この方法で処理されたヘパリンは出発物質に比
較してかなりに解重合されている。ゲルクロマト
グラフイーでは、得られるフラグメントが10〜25
個の糖単位に相当する大きさを有し、そして従つ
てこれらは実施例１による亜硝酸での処理後に単
離されるフラグメントより若干大きいことが示さ
れる。多糖類中のウロン酸の合計約20％が過沃素
酸塩酸化（PH３，４℃、３〜６時間）下に破壊さ
れる。アンチトロンビン―アガロース―セフアロ
ース上で酸化生成物をアフイニテイクロマトグラ
フイーにより精製すると、３時間後に約30％の高
親和性（アフイニテイ）物質を生じ、そして６時
間の酸化後に収量15％を生ずる。かくして得られ
る生成物は実施例Ｂにより測定して第３国際ヘパ
リン標準に比較して1000単位／mgより大きい血漿
中の抗因子Xa強化作用を有している。
較してかなりに解重合されている。ゲルクロマト
グラフイーでは、得られるフラグメントが10〜25
個の糖単位に相当する大きさを有し、そして従つ
てこれらは実施例１による亜硝酸での処理後に単
離されるフラグメントより若干大きいことが示さ
れる。多糖類中のウロン酸の合計約20％が過沃素
酸塩酸化（PH３，４℃、３〜６時間）下に破壊さ
れる。アンチトロンビン―アガロース―セフアロ
ース上で酸化生成物をアフイニテイクロマトグラ
フイーにより精製すると、３時間後に約30％の高
親和性（アフイニテイ）物質を生じ、そして６時
間の酸化後に収量15％を生ずる。かくして得られ
る生成物は実施例Ｂにより測定して第３国際ヘパ
リン標準に比較して1000単位／mgより大きい血漿
中の抗因子Xa強化作用を有している。
血液凝固阻止活性についての研究
実施例１により製造されるヘパリンフラグメン
トを以下におけるその能力の見地から研究する。
トを以下におけるその能力の見地から研究する。
Ａ 凝固酵素トロンビン抑制の促進、
Ｂ 活性化された凝固因子Ｘの抑制の促進、
Ｃ 血漿凝固試験における凝固時間の延長
APTT（活性化部分トロンボプラスチン時間）、 Ｄ 血漿成分による中和、および Ｅ 栓球の集合への影響。
APTT（活性化部分トロンボプラスチン時間）、 Ｄ 血漿成分による中和、および Ｅ 栓球の集合への影響。
実施例 Ａ
トロンビンの抑制
アンチトロンビンでのヘパリンフラグメント
のトロンビン抑制を強化する能力はTeien氏他に
よる方法〔「Thrombosis Research」第11巻第
107〜117頁（1977）〕の変形により分析された。
ヘパリンフラグメントは標準ヘパリンの120〜
170E／mgに比較して20E／mg以下の比活性を有し
ていることが判つた。
のトロンビン抑制を強化する能力はTeien氏他に
よる方法〔「Thrombosis Research」第11巻第
107〜117頁（1977）〕の変形により分析された。
ヘパリンフラグメントは標準ヘパリンの120〜
170E／mgに比較して20E／mg以下の比活性を有し
ていることが判つた。
実施例 Ｂ
活性化された因子Ｘの抑制
血漿中および純粋なアンチトロンビン中にお
いて活性化された因子Ｘの抑制を強化するヘパリ
ンフラグメントの能力はTeien氏他の方法
〔「Thrombosis Research」第８巻第413頁
（1976）〕の変形により研究された。ヘパリンフラ
グメントは標準ヘパリンについての120〜170E／
mgに比較して純粋なアンチトロンビン系中で
500E／mgそして血漿系中で2100E／mgの比活性を
有していることが示される。
いて活性化された因子Ｘの抑制を強化するヘパリ
ンフラグメントの能力はTeien氏他の方法
〔「Thrombosis Research」第８巻第413頁
（1976）〕の変形により研究された。ヘパリンフラ
グメントは標準ヘパリンについての120〜170E／
mgに比較して純粋なアンチトロンビン系中で
500E／mgそして血漿系中で2100E／mgの比活性を
有していることが示される。
実施例 Ｃ
凝固時間の延長
血漿の凝固時間を延長する能力はAPTT（活性
化された部分トロンボプラスチン時間）法
〔Andersson氏他「Thromb.Res.」第９巻第575頁
（1976）〕により研究された。ヘパリンフラグメン
トは第３国際ヘパリン標準に比較して20E／mg以
下の比活性を示す。標準ヘパリンは120〜170E／
mgの範囲の比活性を示す。
化された部分トロンボプラスチン時間）法
〔Andersson氏他「Thromb.Res.」第９巻第575頁
（1976）〕により研究された。ヘパリンフラグメン
トは第３国際ヘパリン標準に比較して20E／mg以
下の比活性を示す。標準ヘパリンは120〜170E／
mgの範囲の比活性を示す。
実施例 Ｄ
血漿中のヘパリンフラグメントの中和
血漿成分のヘパリンを中和する作用は血漿およ
び純粋なアンチトロンビン系中でのヘパリンおよ
びヘパリンフラグメントの効果を測定することに
より研究された。これはある量のヘパリンあるい
はヘパリンフラグメントの存在下に２種の系の中
で抑制される活性化された因子Ｘの量を測定する
ことにより行われる。ヘパリンフラグメントの活
性は血漿成分による15％中和を示し、他方標準ヘ
パリンの相当する値は75％であることが示され
る。
び純粋なアンチトロンビン系中でのヘパリンおよ
びヘパリンフラグメントの効果を測定することに
より研究された。これはある量のヘパリンあるい
はヘパリンフラグメントの存在下に２種の系の中
で抑制される活性化された因子Ｘの量を測定する
ことにより行われる。ヘパリンフラグメントの活
性は血漿成分による15％中和を示し、他方標準ヘ
パリンの相当する値は75％であることが示され
る。
実施例 Ｅ
栓球の影響
臨界的ADP（アデノシンジホスフエート）濃度
でのヘパリンフラグメントの栓球を集合させる能
力が実質上E.A.Beck氏〔「Thromb.Haem.」第
38巻第578頁（1977）〕の方法により研究された。
ヘパリンフラグメントの栓球集合能力は、重量に
基づいて計算して標準ヘパリンのそれより1/10少
ないことが示される。
でのヘパリンフラグメントの栓球を集合させる能
力が実質上E.A.Beck氏〔「Thromb.Haem.」第
38巻第578頁（1977）〕の方法により研究された。
ヘパリンフラグメントの栓球集合能力は、重量に
基づいて計算して標準ヘパリンのそれより1/10少
ないことが示される。
本発明によるヘパリンフラグメントは、臨床使
用のための製剤、好ましくは注射用水溶液中ある
いは皮膚および粘膜を通して投与するための軟膏
製剤中に混入される。
用のための製剤、好ましくは注射用水溶液中ある
いは皮膚および粘膜を通して投与するための軟膏
製剤中に混入される。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE7900164 | 1979-01-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56500066A JPS56500066A (ja) | 1981-01-22 |
| JPS6344764B2 true JPS6344764B2 (ja) | 1988-09-06 |
Family
ID=20336970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55500234A Expired JPS6344764B2 (ja) | 1979-01-08 | 1980-01-07 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4303651A (ja) |
| EP (1) | EP0014184B2 (ja) |
| JP (1) | JPS6344764B2 (ja) |
| AT (1) | ATE8998T1 (ja) |
| CA (1) | CA1136620A (ja) |
| DE (1) | DE3068924D1 (ja) |
| DK (1) | DK160764C (ja) |
| NL (1) | NL930104I2 (ja) |
| NO (1) | NO150801C (ja) |
| SU (1) | SU1209033A3 (ja) |
| WO (1) | WO1980001383A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4692435A (en) * | 1978-11-06 | 1987-09-08 | Choay, S.A. | Mucopolysaccharide composition having a regulatory action on coagulation, medicament containing same and process of preparation |
| US4500519A (en) * | 1978-11-06 | 1985-02-19 | Choay S.A. | Mucopolysaccharides having biological properties, preparation and method of use |
| FR2478646A2 (fr) * | 1980-03-20 | 1981-09-25 | Choay Sa | Composition mucopolysaccharidique ayant une activite regulatrice de la coagulation, medicament la contenant et procede pour l'obtenir |
| FR2440376A1 (fr) * | 1978-11-06 | 1980-05-30 | Choay Sa | Composition mucopolysaccharidique ayant une activite regulatrice de la coagulation, medicament la contenant et procede pour l'obtenir |
| FR2482611B1 (fr) * | 1980-05-14 | 1986-03-07 | Pharmindustrie | Nouveaux polysaccharides sulfates, procedes pour leur preparation et leur utilisation comme medicaments |
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| FR2503714B1 (fr) * | 1981-04-10 | 1986-11-21 | Choay Sa | Procede d'obtention de mucopolysaccharides biologiquement actifs, de purete elevee, par depolymerisation de l'heparine |
| FR2504535B1 (fr) * | 1981-04-28 | 1987-08-14 | Choay Sa | Disaccharides derives d'un acide uronique et d'une glucosamine et compositions pharmaceutiques les contenant pour le controle de la coagulation sanguine |
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| EP0337327A1 (en) * | 1988-04-09 | 1989-10-18 | Bioiberica, S.A. | Process for the preparation of new oligosaccharide fractions by controlled chemical depolimerization of heparin |
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