NO150801B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive heparinfragmenter - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av heparinfragmenter som har vist seg å ha selektiv antikoagulasjonsvirkning.

Heparin er et sulfatholdig polysaccharid som i stor ska-la isoleres fra tarmslim av svin eller lunge av kveg. Det har i flere tiår vært anvendt klinisk som et middel ved behandling og forebyggelse av blodpropp. Til tross for at anvendelsen av heparin i tromboseprofylakse og -terapi fortsetter å øke, er denne behandlingsform langt fra problemfri. Et viktig problem er at doseringen må avveies slik at en god trombosebeskyttelse erholdes samtidig som blødningskomplikasjoner unngåes. En vanskelighet i denne sammenheng er den store individuelle va-riasjon mellom forskjellige pasienter; denne avhenger på sin side sannsynligvis av at heparinet i forskjellig høy grad bindes til andre komponenter i blodplasmaen og derved nøytra-liseres. Et annet problem er at den forebyggende hepa,rinbe-handling bare er begrenset vellykket. Et tredje problem med nuværende type heparinterapi er dets dårlige effekt ved arte-riell trombose. Ved denne trombosetype utgjør trombocytaggregering et mer dominerende innslag enn ved den venøse trombose, hvor heparin har god effekt. Standardheparin stimulerer i en viss grad trombocytaggregering og har altså negativ effekt i denne henseende.

Mekanismen bak heparinets antikoagulasjonsaktivitet er nu kjent i vesentlige deler. Blodkoagulasjonen er basert på en kaskadelignende prosess hvor et antall proteolytiske enzymer aktiverer hverandre i en bestemt rekkefølge, i det siste trinn omvandles fibrinogen under innvirkning av det proteolytiske enzym trombin til uoppløselig fibrin, stammen i et blod-koagel. Heparin danner et kompleks med et plasmaprotein, antitrombin, og dette kompleks inhiberer flertallet av enzymer i koagulasjonskaskaden.

Det har nylig vist seg at heparinf raks joner av forskjellig molekylvekt påvirker koagulasjonsprosessen på forskjellige måter [L-0. Anderson et al., Thromb. Res. 9, 575

(1976)]. Dette initierte en studie over mulighetene til å få frem heparinfraksjoner med mer selektiv virkning. Ved behandling- av standardheparin med salpetersyrling i dimethoxyethan (glym) ved lav temperatur og en viss bestemt tid har man erholdt et spesielt fragment av heparin som hadde betydelig mer selektiv virkning enn standardheparin. Dette heparinderivat har meget liten effekt på inhibering av trombin, mens inhiberingen av aktivert koagulasjonsfaktor X kraftig påskyndes. Koagulasjonsfaktor X inntar en sentral posisjon i midten av koagulasjonskaskaden og inhiberingen av denne er av mange blitt bedømt som særlig viktig for å få en effektiv tromboseforebyggende effekt [S. Wessler, Thromb. Diath. Haemorrh. 33, 81 (1974)]. Det har videre helt overraskende vist seg at denne ty-pe fragment ikke nøytraliseres av blodkomponentene i samme utstrekning som standardheparin. Dette medfører dels at man får en mer effektiv utnyttelse av antikoagulasjonsaktivitet hos denne type fragment sammenlignet med nuværende klinisk anvendte heparinpreparater. Videre blir også doseringen let-tere å gjennomføre, da individvariasjonen i heparin-nøytrali-serende effekt blir mindre viktig å ta hensyn til. En annen overraskende egenskap hos fragmentet er at dets trombocyt-aggregasjonsinduserende aktivitet er meget lavere enn hvad heparin normalt har. Dette gjør det sannsynlig at denne ty-pe fragment er et bedre antikoagulasjonsmiddel enn standardheparin ved forebyggende behandling og behandling av arteri-elle tromboser. Man kan også anta at den minskede innvirkning på trombocyttene kan medføre mindre risiko for blødnings-komplikas joner . Det bør dessuten bemerkes at heparinets evne til å fri-gi enzymet lipoproteinlipase er sterkt molekylvektavhengig. Det lavmolekylære heparinfragment kan derfor antas å ha yt-terligere en verdifull egenskap, nemlig at det i mindre grad enn standardheparin øker innholdet av frie fettsyrer i blodet. Oppfinnelsen angår således en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive heparinfragmenter hvor disaccharidenheten L-iduronosyl-2-0-sulfat-N-sulfo-D-glucose-amin-6-0-sulfat er hovedbestanddelen, og hvor usulfatert L-iduronsyre er i en stilling 3-5 sukkerenheter fra den ureduserte endegruppe, og er fulgt av N-sulfo-D-glucose-aminsulfat eller N-acetylglucoseamin i sulfatert eller usulfatert form, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at (a) heparin behandles med salpetersyrling i dimethoxyethan,

eller

(b) heparin oxyderes med perjodat med lav pH og temperatur,

etterfulgt av alkalibehandling og reduksjon,

hvoretter det ifølge a) eller b) erholdte produkt underkastes affinitetskromatografi.

Metode a) er behandling av standardheparin med salpetersyrling i dimethoxyethan som ovenfor angitt. Da erholdes denne type fragment sammen med en rekke andre ikke-aktive fragmenter. De aktive fragmenter kan siden renses fra ikke-aktive fragmenter, blant annet ved affinitets-kromatografering på matrisebundet antitrombin III [Hook et al., FEBS Lett. £6, 90 (1976); Hopwood et al., FEBS

Lett. £9, 51 (1976); L-0. Andersson et al., Thromb. Res. 9, 575 (1976)].

De aktive fragmenter karakteriseres ved at de innehol-der 14 - 18 sukkerenheter. Strukturanalyse viser samme ho-vedstrukturkomponenter som i standardheparin, dvs. L-iduro-nosyl-2-0-sulfat (lct-4) -N-sulfo-D-glucoseamin-6-0-sulfat som dominerende saccharidenhet. Mengden av ikke-sulfatert iduronsyre er imidlertid betydelig høyere enn i utgangsmaterialet. Ved perjodatoxydering er det vist at denne komponent inntar en bestemt posisjon i molekylet, beliggende 3-5 sukkerenheter regnet fra den ikke-reduserende endegruppe. De aktive fragmenter har strukturen (U-G)n~I-G-(U-G)m, hvor n = 1 eller 2, og m = 5 eller 6; I = ikke-sulfatert L-iduronsyre, U = ikke-sulfatert L-iduronsyre, U = L-iduronsyre-2-0-sulfat og G = N-sulfo-D-glucoseamin-6-0-sulfat. Noen få U-enheter kan mangle 0-sulfat eller være erstattet med D-glucuronsyre, likesom noen få G-enheter kan mangle 0-sulfat eller være erstattet med N-acetyl-D-glucoseaminenheter. Reduserende og ikke-reduserende endeenheter kan variere med type fremstil-lingsmetode; efter deaminativ spaltning av heparin oppstår f.eks. fragment med 2,5-anhydro-D-mannose i reduserende ende-stilling. De aktive fragmenter kan karakteriseres med fysi-kalsk-kjemiske metoder omfattende f.eks. bestemmelse av mobi-litet i elektrisk felt, UV-, IR- og NMR-spektra. De erholdte sifferverdier gir imidlertid ikke noen komplett informasjon eftersom også koagulasjonsmessig inaktive fragmenter viser hovedsakelig likeartede karakteristika. Dette beror på at den biologiske aktivitet betinges av en spesifikk rekkefølge av sukkerrestene hvor stillingen av den ikke-sulfaterte uron-syre er spesielt viktig. Bare en viss bruttosammensetning og størrelse garanterer således ikke at komponenten har aktivitet.

Oppfinnelsen illustreres nærmere i de efterfølgende ek-sempler.

Eksempel 1 Fremstilling av heparinfragment ved depolymerisering av standardheparin med salpetersyrling

0,5 g heparin isolert fra svinetarm, oppløst i 150 ml vann, ble avkjølt til 4°C og ført gjennom en 3 x 7 cm kolonne av Dowex ® 50 W-X8 (H+<->form), 200 - 400 mesh. Kolonnen ble derefter vasket med 100 ml vann, hvorefter vaskevæsken ble kombinert med prøven. Til prøven ble tilsatt 250 ml dimethoxyethan (glym), kjølt til -20°C samt 10 ml isoamylnitrit, og blandingen som hadde en temperatur på ca. 10°C fikk stå

to minutter. Reaksjonen ble derefter avbrutt ved tilsetning av 10 ml 10 %'s Na<+->acetat. Efter tilsetning av 5,2 liter ethanol ble det utfeldte carbohydrat (heparinderivat) gjen-vunnet ved sentrifugering. Produktet ble oppløst i 500 ml 0,05M NaCl - 0,05M Tris-HCl, pH 7,4 (Tris-HCl betegner trishydroxymethylaminomethan«HCl). Denne oppløsning ble fraksjonert, oppdelt i lOO ml-porsjoner ved affinitetskroma-tografering på en kolonne inneholdende 75 ml antitrombin-Sepharose <®> (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala) (ca. 5 mg protein pr. ml gel). Kolonnen ble eluert med en saltgradient (500 ml 0,05M NaCl - 0,05M Tris-HCl i blandingskaret; 500 ml 3M NaCl - 0,05M Tris-HCl i tanken), hvorved mesteparten av det tilførte materiale enten passerte uretardert gjennom kolonnen eller ble eluert ved lav ionestyrke (<0,4M NaCl);

dette materiale mangler biologisk aktivitet. De aktive komponenter (renset heparinderivat) ble eluert i en bred topp 0,5M NaCl og 3M NaCl tilsvarende ca. 4 % av utgangsmaterialet. Disse fraksjoner ble oppsamlet, konsentrert og avsaltet ved gelkromatografering.

På denne måte fremstilt og renset heparinderivat har

en molekylstørrelse tilsvarende et tetradeka-octadekasaccha-rid (molvekt 3600 - 4800). Strukturanalyse viser samme struk-turkomponenter som i utgangsmaterialet, med L-iduronosyl-2-0-sulfat-(a-4)-N-sulfo-D-glucoseamin-6-0-sulfat som dominerende disaccharidenhet. Mengden ikke-sulfatert iduronsyre er imidlertid øket fra ca. 6 % utgangsmateriale til ca. 16 %. Strukturen forøvrig stemmer overens med den ovenfor angitte be-skrivelse.

Eksempel 2 Partiell depolymerisering av heparin eller heparinbiprodukt ved perjodatoxydasjon ved pH 3 og 4 C, efterfulgt av alkalibehandling og reduksjon

Under disse betingelser ble polysaccharidkjeden spaltet ved D-glucuronsyreenheter med bare moderat tap av antikoagu-las jonsaktivitet (Fransson & Lewis, FEBS Letters, 1979 in press). 0,5 g standardheparin ble oppløst i 250 ml av en oppløsning (4°C) inneholdende 0,02M NaI04, 0,2M NaC104 og 0,05M Na<+->citratbuffer, pH 3,0. Efter 3 timers inkubering i mørket ved 4°C ble oxydasjonen avbrutt ved tilsetning av et molart overskudd D-mannitol, hvorefter oppløsningen ble dia-lysert og frysetørket. Spaltning av polysaccharidkjedene ved oxyderte D-glucuronsyreenheter ble tilveiebragt ved behandling av produktet med alkali (5 mg/ml vannoppløsning innstil-let på pH 12 med IM NaOH) ved romtemperatur. Efter 30 minutter ble oppløsningen nøytralisert med IM eddiksyre, hvorefter materialet ble avsaltet ved gelkromatografering på dextran-materiale (Sephadex ® G-25, Pharmacia Fine Chemicals, ■ Uppsala). Det erholdte produkt kan reduseres med natrium-borhydrid.

Heparin som behandles på denne måte er betydelig depo-lymerisert sammenlignet med utgangsmaterialet; gelkromatografering viser at. de resulterende fragmenter har en størrelse tilsvarende 10 - 25 sukkerenheter, hvorfor de er noe større enn de fragmenter som isoleres efter behandling av standardheparin med salpetersyrling ifølge eksempel 1. Totalt ble ca. 20 % av uronsyrene i polysaccharidet ødelagt under per-jodatoxydasjonen (pH 3, 4°C, 3-6 timer). Rensning ved af-finitetskromatografering av oxydasjonsproduktene på antitrombin- agarose-Sepharose ga ca. 30 % utbytte av høyaffini-tetsmateriale efter tre timer og 15 % utbytte efter seks timers oxydasjon. De således erholdte produkter hadde en anti-faktor X cl-potensierende effekt bestemt ifølge eksempel B i plasma på over 1000 enheter/mg sammenlignet med 3rd International Heparin Standard.

Studier over antikoagulasjonsaktivitet

Det ifølge eksempel 1 fremstilte heparinfragment ble undersøkt med hensyn til sin evne til å: A) påskynde inhibering av koagulasjonsenzymet trombin; B) påskynde inhibering av aktivert koagulasjonsfaktor X; C) forlenge koagulasjonstiden i blodplasmakoagulasjonstesten APTT (activated partial thromboplastine time); D) nøytraliseres av blodplasmakompo-nenter; E) påvirke aggregering av trombocyter.

Eksempel A Inhibering av trombin

Heparinfragmentets evne til å potensiere inhiberingen av trombin med antitrombin III ble analysert ifølge en modi-fisering av en metode av Teien et al (Thrombosis Research, 11, sider 107 - 117, 1977). Heparinfragmentet ble funnet å ha en spesifikk aktivitet mindre enn 20 E/mg sammenlignet med 120 - 170 E/mg for standardheparin.

Eksempel B Inhibering av aktivert faktor X

Heparinfragmentets'evne til å potensiere inhiberingen av aktivert faktor X i plasma og i rent antitrombin III ble undersøkt ifølge en modifisert versjon av en metode av Teien et al. (Thrombosis Research 8, 413, 1976). Heparinf raks jo-ne n ble funnet å ha en spesifikk aktivitet på 500 E/mg i et rent antitrombin Ill-system og 2100 E/mg i et plasmasystem sammenlignet med 120 - 170 E/mg for standardheparin.

Eksempel C Forlengelse av koagulasjonstiden

Heparinfragmentets evne til å forlenge koagulasjonstiden for blodplasma ble undersøkt ifølge APTT (activated partial thromboplastine time)-metoden [Andersson et al., Thromb. Res. 9_, 575 (1976)]. Heparinfragmentet utviste en spesifikk aktivitet mindre enn 20 E/mg sammenlignet med 3rd International Heparin Standard. Standardheparin viser spesifikk aktivitet i området 120 - 170 E/mg.

Eksempel D Nøytralisering av heparinfragmentet

i blodplasma

Plasmakomponenters heparinnøytraliserende effekt ble undersøkt ved at man målte effekten av heparin og heparinfragmentet i plasma og i et rent antitrombinsystem. Dette ble ble gjort ved å måle den mengde aktivert faktor X som ble inhibert i de to systemer i nærvær av en viss mengde heparin eller heparinfragment. Av heparinfragmentets aktivitet ble 15 % nøytralisert av plasmakomponenter, mens tilsvarende ver-di for standardheparin var 75 %.

Eksempel E Trombocyttpåvirkning

Heparinfragmentets evne til å aggregere trombocytter ved kritiske ADP (AdenosineDiPhosphate)-konsentrasjoner ble undersøkt hovedsakelig som beskrevet av Beck, E.A. (Thromb Haem Stuttg. 1977, 3J3, 578). Det viste seg at heparinfragmentets trombocyttaggregerende evne var 10 ganger lavere enn den for standardheparin, beregnet på vekten.

Heparinfragmentet som fremstilles ifølge oppfinnelsen, innarbeides for klinisk anvendelse i farmasøytiske pre-parater, fortrinnsvis i steril vannoppløsning for injeksjon eller i salvepreparater for tilførsel via hud og slimhinner.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive heparinfragmenter, hvor disaccharidenheten L-idurono-syl-2-0-sulfat-N-sulfo-D-glucoseamin-6-0-sulfat er hovedbestanddelen, og hvor usulfatert L-iduronsyre er i en stilling 3-5 sukkerenheter fra den ureduserte endegruppe, og er fulgt av N-sulfo-D-glucose-aminsulfat eller N-acetylglucoseamin i sulfatert eller usulfatert form, karakterisert ved at

   (a) heparin behandles med salpetersyrling i dimethoxyethan, eller (b) heparin oxyderes med perjodat med lav pH og temperatur, etterfulgt av alkalibehandling og reduksjon, hvoretter det ifølge a) eller b) erholdte produkt underkastes affinitetskromatografi.