NO157580B - Fremgangsmaate ved fremstilling av oligosakkarider med selektiv antikoaguleringsaktivitet. - Google Patents

Abstract

Søknaden vedrrer et oligosakkarid som inneholder 4-8 monosakkaridenheter og som erat de inneholder minst en glukosaminenhet som er 3-0-sulfatert, og minst en ytterligere glukosaminenhet, idet disse enheter er bundet gjennom en mellomliggende monosakkaridenhet, som er bundet til den reduserende ende av den 3-0-sulfaterte glukosaminenhet. Videre vedrører søknaden en farmasøytisk blanding som inneholder en eller flere slike oligosakkarid, og en fremgangsmåte for fremstilling av disse oligosakkarider.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte av den

art som er angitt i kravets ingress.

Heparin er et sulfatholdig polysakkarid som kan isoleres

fra tarmslim fra svin eller lunger fra storfe. Det brukes klinisk som et middel for behandling og forebygning av trombose. Imidlertid er bruken -.v heparin forbundet med prob-lemer såsom risk for blødningskomplikasjoner og stor indi-viduell variasjon mellom forskjellige pasienter. Et annet problem med nåværende type av heparinterapi er den svake virkning på arteriell trombose. Ved denne type trombose er trombosittaggregeringen et mer dominerende trekk enn ved venøs trombose hvor heparin gir en god virkning. Standard heparin stimulerer i en viss grad trombosyttaggregering og gir følgelig en negativ virkning i denne henseende. Det er vist at heparinfraksjoner med forskjellige molekylvekter på-virker koaguleringsforløpet på forskjellige måter [L.-O. Andersson et al, Thromb. Res. 9_, 575 (1976).]. Koaguleringsfaktor X inntar en sentral stilling i midten av koaguleringstrinnene og inhiberingen derav betraktes av mange som spesielt viktig for å oppnå en effektiv trombose-forebyggende virkning [S. Wessler, Thromb. Diath. Haemorrh. 33, 81 (1974)].

Ifølge foreliggende oppfinnelse har det vist seg å være mulig å oppnå oligosakkarider med god selektiv antikoaguleringsaktivitet in vivo og in vitro, spesielt affinitet til antitrombin og evne til å forbedre reaksjonsevnen for antitrombin med koaguleringsfaktorer X og XII. Dyreforsøk har vist at oligosakkarider av denne type gir effektiv forebyggende virkning mot trombose uten noen tilsvarende øket virkning til tendens til blødning. I oligosakkaridene, som er fremstilt ifølge forelig<g>ende oppfinnelse, består sekvensen av mono-sakkarider som oppbygger polysakkaridene av bestemte monosakkaridenheter i en bestemt intern rekkefølge som skal defi-

neres i det følgende.

Oppfinnelsen vedrører fremstilling av slike

oligosakkarider som kan avledes fra heparin som er særpreget ved at de har en glukosaminenhet som er 3-O-sulfatert, og en ytterligere glukosaminenhet, hvorunder disse enheter er forbundet med en mellomliggende monosakkaridenhet som er bundet til de reduserende ender av den 3-0-sulfaterte glukosaminenhet. Ifølge en utførelsesform er den 3-0-sulfaterte glukosaminenhet også 2-N-sulfatert. Videre kan den ytterligere glukosaminenhet som gjennom en mellomliggende monosakkaridenhet er bundet til den reduserende ende av den 3~-0-sulfaterte glukosaminenhet være 2-N-sulfatert. Den mellomliggende monosakkaridenhet er fortrinnsvis en sulfatert iduronsyreenhet, hvor sulfateringen normalt består av en 2-0-sulfatgruppe. Oppfinnelsen vedrører spesielt oligosakkarider hvor den 3-0-sulfaterte glukosaminenhet er en enhet i en sekvens av monosakkaridrester med 8 enheter Eionosakkaridrester.

De fremstilte oligosakkarider kan ifølge de foregå-

ende definisjoner også kan inneholde en ikke-sulfatert iduronsyreenhet bundet i C 4-stilling av den 3-0-sulfaterte glukosaminenhet mellom 2 mellomliggende monosakkaridenheter, idet fortrinnsvis en av disse mellomliggende monosakkaridenheter er en acetylert glukosaminenhet som kan være 6-0-sulfatert og den andre monosakkaridenhet er fortrinnsvis en glukuronsyreenhet.

En eller flere ytterligere monosakkaridenheter kan gå forut for disse enheter, fortrinnsvis en glukosaminenhet, og foran denne kan igjen sitte en uronsyreenhet.

2,5-anhydro-D-mannoseenheten innføres fortrinnsvis ved fremstillingen av oligosakkarider ved spaltning (deamine-rende spaltning) av et utgangsmateriale med høyere molekyl-vekt.

01igosakkaridene kan fremstilles fra naturlig heparin eller eventuelt fremstilles syntetisk. Når naturlig heparin anvendes som utgangsmateriale kan de følgende metoder anvendes: (a) behandle heparin med salpetersyrling i dimetoksyetan og

rense det erholdte materiale, eller

(b) behandle heparin med nitrit, fortrinnsvis natriumnitrit

i vandig løsning og rense det erholdte materiale,

og fremgangsmåten er særpreget ved det som er angitt i kravets karakteriserende del.

Separasjonsmetoden for isolering av de sterkt aktive forbin-delser og separere de svakt aktive eller inaktive bestanddeler kan utføres ved affiniteteskromatografi på matrisebundet antitrombin III [H55k et al,. FEBS Lett. 66, 90 (1976); Hopwood et al,. FEBS Lett. 69, 51 (1976); L.-0. Andersson et al,. Thromb. Res. 9, 575 (1976)].

Oppfinnelsen illustreres videre gjennom fLe/ følgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av heparinfragmenter ved depolymerisering av standard heparin med salpetersyrling

Heparin (0,5 g) isolert fra svinetarmer og oppløst i 150 ml vann avkjøles til +4°C og føres gjennom en 3x7 cm kolonne av Dowetf*%0 W-28 (H+ forml, 200-400 mesh. Kolonnen vaskes så med 100 ml vann og vaskevæsken kombineres med prøven. Prøven tilsettes 250 ml dimetoksyetan (glyml avkjølt til ;-20°C og 10 ml isoamylnitrit og blandingen får ved en temperatur på nøyaktig -10°C stå i 35 minutter. Reaksjonen av-brytes så ved en tilsetning av 10 ml 10% Na<+->acetat. Etter tilsetning av 5,2 liter etanol utvinnes utfelt karbohydrat (heparinderivater) ved sentrifugering. Produktet oppløses ;i 500 ml 0,05 M NaCl - 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4. Denne løs-ning oppdeles i 100 ml porsjoner og fraksjoneres ved affinitetskromatografi på en kolonne som inneholder 75 ml antitrombin - Sepharose<4*> (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) (ca. 5 mg protein pr. ml gel).. Kolonnen elueres med en saltgradient (500 ml 0,05 NaCl - 0,05 M Tris-HCl i

blandebeholderen; 500 ml 3 M NaCl - 0,05 M Tris-HCl i reser-voiret), idet hoveddelen av det påsatte materialet enten går uretardert gjennom kolonnen eller elueres ved lav ionestyrke (mindre enn 0,4 M NaCl); dette materialet har ingen biologisk aktivitet. De aktive bestanddeler (renset oligosakkaridmate-rialeX elueres i en bred topp 0,5 M NaCl og 3 M Na Cl tilsvarende ca. 3% av utgangsmaterialet. Disse fraksjoner slås sammen, konsentreres og avsaltes ved gelkromatografi.

Oligosakkarider fremstilt og renset på denne måten har en dominerende molekylstørrelse som svarer til den for et okta-sakkarid ifølge oppfinnelsen.

Studier av antikoaguleringsaktivitet

Oligosakkaridene fremstilt ifølge eksempel 1 ble undersøkt med hensyn til deres evne til å: A), påvirke inhiber ingen av koaguler ingsenzymet trombin; B). påvirke inhiberingen av aktivert koaguleringsf aktor X; Cl påvirke inhiberingen av aktivert faktor IX; D). påvirke inhiberingen av aktivert faktor XI;

El påvirke inhiberingen av aktivert faktor XII;

Fl forlenge koaguleringstiden i blodplasmakoaguleringsfor-søket APTT (Aktivert Partiell Tromboplastin Tidl;

Gl nøytraliseres av blodplasraabestanddeler;

H) påvirke aggregeringen av trombocytter.

Eksempel A. Inhibering av trombin

Oligosakkaridenes evne til å forsterke inhiberingen av trombin med antitrombin III ble analysert ifølge en modifikasjon av metoden til Teien et al. (Thrombosis Research 11, s. 107-117, 1977).. Oligosakkaridene ble funnet å ha en spesifikk aktivitet på 8 E/mg sammenlignet med 120-170 E/mg for standard heparin.

Eksempel B. Inhibering av aktivert faktor X

Oligosakkaridenes evne til å forsterke inhiberingen av aktivert faktor X i plasma og i rent antitrombin III ble under-søkt ifølge en modifisert versjon av metoden til Teien et al.

(Thrombosis Research 8, 413, 1976L. Oligosakkaridene ble vist å ha en spesifikk aktivitet på 500 E/mg i et rent antitrombin III system og 1900 E/mg i et plasmasystem sammenlignet med 120-17 0 E/mg for standard heparin.

Eksempel C. Inhibering av aktivert faktor IX

Oligosakkaridenes evne til å forsterke inhiberingen av aktivert faktor IX i rent antitrombin III ble undersøkt ifølge Holmer et al. (Biochem. J. 1981, Volume 193 s. 395-4001. Oligosakkaridene ble vist å ha en spesifikk aktivitet på 18 E/mg sammenlignet med 120-180 E/mg for standard heparin.

Eksempel D. Inhibering av aktivert faktor XI

Oligosakkaridenes evne til å forsterke inhiberingen av aktivert faktor XI i rent antitrombin III ble undersøkt ifølge Holmer et al. (Biochem. J. 1981. Volume 193 s. 395-400). Oligosakkaridene ble vist å ha en spesifikk aktivitet på 40 E/mg sammenlignet med 120-170 E/mg for standard heparin.

Eksempel E. Inhibering av aktivert faktor XII

Oligosakkaridenes evne til å forsterke inhiberingen av aktivert faktor XII i rent antitrombin III ble studert ifølge Holmer et al. (Biochem. J. 1981. Volume 193 s. 395-400). Oligosakkaridene ble funnet å ha en spesifikk aktivitet på 470 E/mg sammenlignet med standard heparin 120-170E/mg.

Eksempel F. Forlengelse av koaguleringstiden

Oligosakkaridenes evne til å forlenge koaguleringstiden for blodplasma ble undersøkt ifølge APTT (Aktivert Partiell Tromboplastin Tid), metoden [Andersson et al,. Thromb. Res.

9_ 575 (1976)]. Oligosakkaridene viste en spesifikk aktivitet på 12 E/mg sammenlignet med tredje Internasjonale Heparin Standard. Standard heparin viste en spesifikk aktivitet i området 120-170 E/mg.

Eksempel G. Nøytralisering av oligosakkaridene i blodplasma

Den nøytraliserende virkning på oligosakkaridene av plasma-komponenter ble studert ved å måle virkningen til heparin og til oligosakkaridene i- plasma og i et rent antitrombin-system. Dette ble utført ved å måle den mengde aktivert faktor X som var inhibert i de to systemer i nærvær av en viss mengde heparin eller oligosakkarid. Oligosakkaridenes aktivitet viste en 18% nøytralisering av plasmabéstanddeler, mens det tilsvarende tall for standard heparin hie vist å være 7 5%.

Eksempel H. TrombocyttLnnflytelse

Oligosakkaridenes evne til å aggregere trombocytter ved kri-tisk ADP (Adenosine DiPhosphate).-konsentrasjoner ble studert hovedsakelig ifølge E.A. (Thromb Haem Stuttg. 1977, 38_, 578). Det ble vist at den trombocyttaggregerende evnen til oligosakkaridene var ti ganger lavere enn den for standard heparin, beregnet ut fra vekt.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et oligosakkarid omfattende 8 monosakkaridenheter, hvilket monosakkarid utviser selektiv koaguleringsaktlvitet ved affinitet til antitrombin og forøker reaktiviteten for antitrombin mot faktor X, hvilket oligosakkarid har følgende egenskaper: (a) inneholder minst én glukosaminenhet som er 3-0-sulf atert og 2-N-sulfatert, (b) inneholder minst én ytterligere glukosaminenhet som er 2-N-sulfatert og forbundet til den reduserende ende av den 3-0- og 2-N-sulfaterte glukosaminenhet via en sulfatert iduronsyreenhet, (c) inneholder en ikke-sulfatert iduronsyreenhet bundet til posisjon C^ i den 3-0-sulfaterte glukosaminenhet via to mellomliggende monosakkaridenheter, idet fortrinnsvis én av disse mellomliggende monosakkaridenheter er en acetylert glukosaminenhet som kan være 6-0-sulfatert, og den andre monosakkaridenhet fortrinnsvis er en glukuronsyreenhet og (d) den siste enhet er en 2,5-anhydro-D-mannoseenhet, som kan være sulfatert eller ikke-sulfatert, hvorved heparin underkastes depolymerisering med salpetersyrling i dimetoksyetan eller med nitritt i en vandig oppløsing,

   karakterisert ved at depolymeriseringen foregår ved en temperatur på ca. -10°C i ca. 35 minutter inntil dannelse av oktasakkaridet, hvoretter det erholdte materiale på kjent måte renses ved affinitetskromatografi på matrisebundet antitrombin III.