HU190687B

HU190687B - Process for preparing new antithrombotic of polysaccharide base further pharmaceutical compositions containing such substance as active material

Info

Publication number: HU190687B
Application number: HU821620A
Authority: HU
Inventors: Adrianus L M Sanders; Dirk G Meuleman; Huibert C T Moelker; Gijsbert W K Dedem; Francois E A Houdenhoven
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1981-05-21
Filing date: 1982-05-20
Publication date: 1986-10-28
Also published as: IE53255B1; NZ200688A; DK227282A; AU550317B2; JPS57197221A; IE821118L; DK157061B; ES8307098A1; ES512464A0; DE3265781D1; PT74928A; GR76794B; EP0066908B1; US4438108A; FI75491C; PT74928B; EP0066908A1; JPH0216733B2; CA1186646A; ZA823248B

Description

A találmány tárgya eljárás oligo- és poliszacharidkeverék-alapú, új antitrombotikum, valamint ezt hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

Ismeretes, hogy egyes mukopoliszacharidok befolyásolják a vér alvadási sajátságait. A legismertebb mukopoliszacharid, a heparín, egy szulfurált mukopoliszacharid, amelyet vénás trombózis megelőzésére, illetve kezelésére használnak. A heparín antitrombotikus hatása azon alapul, hogy antitrombin III révén meggyorsítja a véralvadási faktorok gátlását. A heparín trombózis és trombo-embolizmus kezelésére, illetve megelőzésére történő alkalmazásánál a legfőbb nehézséget a heparín vérzést kiváltó hatása jelenti. Igaz, hogy ha a dózis, az alkalmazási mód és gyakoriság optimális, a vérzés veszélye valamivel kisebb, de a heparín antitrombotikus ée vérzést kiváltó tulajdonságai közötti belső („intrinsic) arány nem befolyásolható.

Ennek következtében a heparín preventív alkalmazása azokra az indikációkra korlátozódik, amelyeknél a véralvadási rendszer csak kis mértékben aktivált, mint például a mély vénák trombózisos megbetegedései. A heparín további hátránya, hogy hatás-periódusa viszonylag rövid, ezért hatékony kórmegelőzés céljára általában legalább napi kétszeri dózist kell alkalmazni.

Számos kísérlet történt már „javított heparinok”, vagy javított tulajdonságokkal rendelkező heparinoidok kidolgozására. A 2 002 406 sz. közzétett nagy-britanniai szabadalmi leírás például 2 000 és 5 000 dalton közötti mólsúly-eloszlású oligo-heteropoliszacharidok keverékére vonatkozik, amelyet heparin depolimerezésc útján nyernek és/vagy normál heparín készítmények anyalúgjából izolálnak, majd ezt követően a kapott anyagot tovább szulfurálják. Megállapították, hogy az így kapott anyag antitrombotikus (in vivő aktivitás) és alvadáegátló (in vitro aktivitás) hatása közötti arány kedvezőbb, mint a hoparinnál.

A jelen találmány szerint előállítható új, antitrombotikus hatású heparinoid oligo- és heteropoliszacharidok olyan keverékéből áll, amelynél az antitrombotikus és a haemorrhagiás aktivitás meglepően szétválik.

Patkányokon végzett különböző vérzéses kísérletek (izomvérzéses teszt, hajszáléi— -vérzéses teszt) azt mutatták, hogy az új heparinoid nem okoz vérzést, vagy alig valamivel többet, mint a placebo, ugyanakkor a haemorrhagiás hatás széles dózistartományban (10-250 ing/kg) csupán kis mértékben nőtt. Kétségtelen, hogy a súlyegységre eső antitrombotikus hatás kisebb, mint a heparín esetén, de a „hasznosság/kockázal” arány (azaz az antitrombotikus és haemorrhagiás aktivitás aránya) 10-40-ezer kedvezőbb, mint a heparín esetén. Ezt a későbbiekben összehasonlító vizsgálatok segítségével részletesen szemléltetjük.

A természetes eredetű új anlitrorabotikum hexóz-származékalapú (pl. glukuronsuv, iduronsav, glukóz-amin, gálák tóz-amin és szulfátéit és ocilezelt származékaik) oligo- és poliszacharitlok keverékéből áll. Az új termék fehér, amorf, enyhén higroszkópos por, amely az alábbi jellemzőket mutatja:

a) 2 000 és 40 000 dalton közötti niólsúly-elos7.tás (amit dextránnal történő össz.ehasonlitás útján, gél-permeabilitási kromatográfiával, makroporózus szilika-mátrixon (Nucleosil 50-5), 0,5 mólos aminónium-aeelál puffer eluáriskénl. vnló felhasználósával határoztuk meg), fő csúcs ' 2 500 és 15 000 dalion között, még jellegzetesebben 4 000 és 10 000 dalton között, átlug-mólsúly 5 000 és 8 000 dalion közöli, és általában egy másodlagos csúcs és/vagy váll a 15 000 és 60 000 dalton közötti tartományban, közelebbről 30 000 és 50 000 dalion között, hozzáveLóleg 40 000 daltori átlagmólsúllyal,

b) specifikus rotáció ((ic)^¹] +25° és +80° között, még jellegzetesebben +30 és +70° közölt,

c) 1,5 és 4 súly% közötti, előnyösen 2,5 és

3.5 súl.y% közölti nitrogén-tartalom,

d) 5 és 7,5 súly% közötti, előnyösen 5,5 és

6.5 súly% közötti kén-tartalom,

e) meq/g-ban kifejezve 3 és 5, előnyösen

3.5 és 4,5 kózölLi ionoscsoport-turtalom,

f) meq/g-ban kifejezve 0,5 és 1,5, előnyösen 0,5 és 1,0 közötti szulfamido-csoport-tartalom,

g)	meq/g-ban kifejezve 0,5 glukóz-amin-tartalom,	és	1,5	közötti
h)	meq/g-ban kifejezve 0,0 galaktóz-amin-tartalom,	és	0,6	közötti
i)	0,5 és 3 közötti, főképpen	]	ŐR 3	közölti

idóz (iduronsav) glükóz (glükuronsav) arány.

Habár az új termék oligo- és poiiszachurid összetételét pontosan nem lehel meghatározni, a fenti paraméterek megfelelően jellemzik a terméket, különösképpen farmakológiái hatásprofilja szempontjából.

Az új heparinoid farmakológiai hatásprofilját az alábbiakkal jellemezzük:

1) mg-onkénl 10 nemzetközi egységnél (IlJ/mg) kisebb alvadásgátló aktivitás (USP), azaz csupán a töredéke (általában kevesebb, mint 5%-a) a heparin alvudásgátló aktivitásának;

2) elhanyagolható antitrombin aktivitás (kevesebb, mint 1%-a a heparin USP antitrombin aktivitásának);

3) a heparin nntí-X.i aktivitásának 20%-ánál kisebb anti-Xa aktivitás (általában 2,5 és 15% közötti);

4) antitromboLikus oklivilás (Umetsu modell), amit hozzávetőleg 2 és 8 mg/kg közötti i.v. 1Ü50 jellemez (a heparin USP 1050-je körülbelül 0,4-0,5 mg/kg i.v.);

5) vérzés-aktivitás, amely egy tág dózis-tartomány bán (30 mg/kg i.v,-ig) alig nő, ugyanakkor a heparin vérzés-akti-vitása 1 mg/kg i.v, dózisban tisztán észlelhető, és nagyobb dózisokban gyorsan nő;

(>) „hasznosság/koekázat” arány, ami 10-40-szer kedvezőbb, mint a heparin USP esetén [az antitrombotikus és haemorrhagiás aktivitás arányát értve ezen); és

7) félérték-idő, amely bizonyosan kétszer olyan hosszú, mint a heparin USP félérték-ideje.

Ennek az érdekes hatásprofilnak tulajdonítható, hogy az új termék rendkívül alkalmas vénás trombózis és trombo-embolizmus kezelésére, illetve megelőzésére, A termék különösen alkalmasnak tűnik mindenekelőtt DVT (a mély vénák trombózisos megbetegedése) megelőzésére olyan betegek esetén, akiken csípő-műtétet hajtanak vagy hajtottak végre. Mindezideig a csípő-műtéteknél gyakran fellépő DVT és tüdőembólia megelőzésére nem álltak rendelkezésre megfelelő eszközök. A heparin alacsony dózisban (s.c.) nem hatékony, magasabb (i.v.) dózisok pedig ellenjavalltak a vérzés nagy kockázata miatt.

Az új termék még magasabb dózisokban (egészen 400 mg/kg/nap dózisig) sem mutat mutagén vagy toxikus sajátságokat.

Az új termék többféle módon előállítható. Emlősök zsigerezövete, így például tüdő, hasnyálmirigy, máj, belek és különösen bélnyálka szolgálhat alapanyagként. Az emlős szövetből a terméket kezdetben fehérjebontó enzimek (pl. sertés hasnyálmirigyéből kivont enzim, vagy bakteriális enzimek, mint. például a Bacillug subiilig-iöí származó proteózok) segítségével szabadítjuk fel. Az izolálás módja az, hogy a terméket bázikus ioncserélőn megkötjük, majd ezután vizes sóoldattal eluáljuk. A termék szerves oldószeres frakciónak kicsapással tovább tisztítható.

Alaposabb vizsgálatok azt mutatták, hogy ha az ilyen módon kapott terméket chondroitináz ABC enzimmel kezeljük, a jelenlévő nagy-molekulájú galaktóz-amin-tartalmú poliszacharidok legnagyobb része eltávolítható. A visszamaradó termék (a kezdeti termék kb. 70-75%-a) azonban csaknem ugyanazt a meglepő farmakológiai hatásprofilt mutatja, mint a kezeletlen termék, vagyis az említett enzimatikus kezelés eredményeként a túlnyomóan nagy-molekulájú inaktív frakció (25-30 súly%) eltávolítható.

A chondroitináz ABC enzimmel történő kezelés után kapott termék fizikai tulajdonságai az új heparinoid fentebb részletezett jellemzőin belül maradnak, kivéve, hogy a mólsúly-eloszlásban a nagy-moiekulá jú frakcióra jellemző csúcs és/vagy váll csaknem eltűnt, a jellegzetes rotáció felfelé tolódott, +45° és +75° között van, a gálák tóz-amin-tartalom pedig gyakorlatilag nullára csökkent. A találmány szerinti eljárás természetesen ennek a terméknek az előállítását is magában foglalja.

Az új termék (ok) a heparin esetén hagyományosan alkalmazott módon alakítható! k) gyógyászati dózis-formává, például injektálható készítmény előállítása céljából vízben oldjuk, amelyhez, ha szükséges, további, gyógyászatilag alkalmas segédanyagokat (tartósító anyag, bizonyos sók) adunk. A klinikai alkalmazás subcután vagy intravénás (esetleg időszakos) injekció vagy infúzió segítségével történik. Egyéb adagolási módszerekre ugyancsak lehetőség van (pl. intrapulinonáris alkalmazás spray-belégzés útján vagy kúp formájában történő beadás).

A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy oltalmi igényünket a példákra korlátoznánk:

I. példa

Marhatüdőt (100 kg) sertés hasnyálmirigyéből származó proteolitikus enzimmel kezeltünk. 15 órai, 8,5-es pH-n, 40 °C hőmérsékleten történő inkubálás után az elegye! kiszűrtük. A tiszta szűrletet erősen bázikus ioncserélővel (QAE Sephadex A50) hoztuk érintkezésbe, és 15 órán át kevertük. Ezután az ioncserélőt kiszűrtük, vizes nátrium-klorid olduttal (200 g/1) eluáltuk. Az eluátumhoz 50 térfogat% koncentrációig metanolt adtunk. A keletkező csapadékot eltávolítottuk, ezután az anyalúghoz 75 térfogatai koncentrációig metanolt adtunk. A csapadékot kinyertük, 100%-os metanollal mostuk és megszárítottuk. A kapott fehér amorf por (22,7 g) galaktóz-amin-tartalma 0,45 mmól/g, glukóz-ainin-lartalma 0,54 mmól/g, áltagos molekulasúlya 8 600 dalton, másodlagos csúcs 38 000 dalion átlagnál (a meghatározás dextránra vonatkoztatva történt), (cc)²j° ⁼ +34,2, kén-tartalma 5,7%, nitrogén-tartalma 2,6%, ionos csoport-tartalma 3,90 meq/g, szulfamido-csoport-tortalma 0,69 mmól/g, idóz/glükóz arány 2:L.

A termék az 1. ábrán látható elektroforézis-mintát mutatja (agaróz gél, 0,2 mólos kalcium-aceLálban egyensúlyban, pH - 7,2, puffer: 0,2 mólos kalcium-acetát, 300 V max., 7 mA, 30 perc).

Π. példa

Sertés bélnyálkát (100 kg) 35 °C-on, pH = 8,2-nél 24 órán át Itocillus suhtilis-től szármáz/) proteázzal kezeltünk. Az eíegyet szűrtük, és a tiszta szűrletet az 1. példában leírt módon kezeltük. Λ kapott termék 3,2 g súlyú fehér, amorf por, galnktóz-amin-tartnlinn 0,38 mmól/g, glukóz-amin-tarlalnin 0,82 mmól/g, átlagos molekulnsúlya 6 100 dalion, másodlagos csúcs 42 000 dalton átlagnál (dextránra vonatkoztatva határoztuk meg), (<)^ = +35,1°, kéntartalma 5,9%, nitrogén-36

-tartalma 2,7%, ioncsoport-tartalma 3,70 meq/g, azulfamido-csoport-tartalma 0,73 mmól/g, idóz/glükóz arány 1,9.

A termék a 2. ábrán látható NMR spektrumot adta {4% DjO-ban 50 ’C-on, 270 MHz).

III. példa

Az alvadásgátló aktivitást az USP módszer szerint határoztuk meg. Az. antitrombin és az. anli-Xa aktivitást chroinogén szubsz.trátum módszerrel határoztuk meg, amikoris tisztítóit lehéri-antitrombin Ill-t, illetve S-2238 és S-2222 szubsztrátumokal (Rabi AB, Svédország) alkalmaztunk.

«»

Marha bélnyálkát (10 m^J) pankreatinnal iq kezeltünk (40 ’C, ph = 8,5, 20 óra). Az elegyet szűrtük, és a szűrletet az I. példában leírt módon dolgoztuk fel. 335 g fehér, amorf port kaptunk. Gálák tóz-amin-tartalma 0,28 inól/g, glukóz-amin-tartalma 0,90 mmól/g, át- 15 lag mólsúlya 5 600 dalion, másodlagos csúcs 41 000 dalton átlagnál (a meghatározás dexlránra vonatkoztatva történt), (ar)^J = +36,9°, kén-tartalma 6,1%, nitrogén-tartalma 2,8, ionos csoport-tartalma 4,0 meq/g, szulfamido 20 -csoport-tartalma 0,75 mmól/g, idóz/glükóz arány 1,8.

IV. példa 25

A III. példa szerint előállított terméket (100 g) chondroitináz ABC enzimmel kezeltük. Melanolos kicsapás (50-75 térfogat%) után a visszamaradó terméket elkülönítettük. 72 g 30 terméket kaptunk (fehér, amorf por), galaktóz-amin-tartalma 0,05 inmöl/g, glukóz-amin-tsrtalma 1,20 mmól/g, átlagos mólsúlya 5 400 dalton, másodlagos csúcs 40 000 dalton átlagnál (a meghatározás dextránra vonatkoztatva 35 történt), (cc)$> = 61,2°, kén-tartalma 6,2%, nitrogén-tartalma 2,75%, ionos csoport-tartalma 4,1 meq/g, szulfamido-csoport tartalma 0,91 mmól/g, idóz/glükóz arány 1,9.

Anlitrombotikus aktivitás

Az anlitrombotikus aktivitást patkányon, Umeteu modell (Thrombos. Haemostas. 39, 74-83, 1978) alapján határoztuk meg. Eszerint az. arteriovenosus fistulában vérrögöket idéz.Lünk elő oly módon, hogy a vért 15 pei— cen át selyemszál mentén folyattuk. Mértük a placebo hatást és a vizsgálandó anyag hatását különböző dózisoknál a vérrögképződésre.

A dózis és a vérrög-képz.ődéa gátlása közötti összefüggésből, a placebo hatására vonatkoztatva származtatható az IDso (a vérrög-képződés 50%-os gátlásához szükséges dózis).

Eredmények:

Termék

IDso (mg/kg) he parin USP

I. példa

II. példa

III. példa

IV, példa

0.5

6.5

5.0

4.0

5.3

Haemorrhagiás aktivitás

a) Hajszálér-vérzéses kísérlet patkányon

Farmakológiai kísérletek'.

Az I-IV, példa szerint előállított termékeket számos farmakológiai kísérletben vizsgáltuk. Összehasonlító anyagként heparin USP-t alkalmazunk.

A véralvadásra gyakorolt hatás

Termék	Alvadás- gátló aktivitás (IU/mg)	Anli- trombin aktivitás (IU/mg)	Anti-Xa aktivitás (IU/ing)
heparin	179	164	167
I. példa	l	0.5	4.5
II. példa	1	0.1	5
III. példa	3	1.0	f>
IV. példa	4	1.3	8

A piacéból vagy a vizsgálandó anyagot altatott patkányok hímvesszőjének hátulsó (dorsnlis) vénáján keresztül adagoltuk. 1 perc múlva két, előzőleg ejtett bevágás mentén kézzel egy bőrcsikoL Léptünk le az állat leborotváll. hasáról. A sebet, gézzel bekötöztük, ős a bördarabkát a gézre ráfektettük. 10 perc múlva a gézt eltávolítottuk, és a benne lévő vért 20 ml vízzel extraháltuk. A víz hacmoglobin-lartalmát spektrofotometriásán mértük, és a vérveszteséghez paraméterként alkalmaztuk (Lásd Thrombos. Haeinoslns. 42_; 466 (1979)1.

E kísérlet során a 11. példa szerinti terméket és a heparinl hasonlítottuk össze különböző dózisokban, megfigyelve az új termék és a heparin nntilrombotikus aktivitása közti különbséget,. Az eredményt a 3. ábra mutatja. Hasonló eredményeket kaptunk az [., III. és [V. példa szerinti termékkel is.

b) Izom-vérzéses kísérlet patkányon

AltatoLt patkány minden lábának biceps femoralisát hosszirányban szikével kivágtuk, egy perccel azután, hogy a piacéból vagy a vizsgálandó vegyületet intravénásán, a hímvessző hátsó vénáján át beadtuk. A sebeket gézzel bekötöztük. 30 perccel később a kötéseket eltávolítotluk. A vérveszteséget ugyanúgy határoztuk meg, mint az előző tesztnél. Ebben a kísérletben a ΓΙ. példa vegyületet és a heparint hasonlítottuk össze. Az eredményt a 4. ábra mutatja. Hasonló eredményeket kaptunk az I., III. és IV. példák termékével is.

A 3. és 4. ábra világosan mutatja, hogy a heparin vérzéskiváltó hatása jóval erősebb, ugyanakkor az új termék vérzéskiváltó hatása tág dózis-tartományban nem különbözik, vagy csak alig különbözik szignifikánsan a placeboétól. A „hasznosság/kockázat arány nyilvánvalóan kedvezőbb az új terméknél.

Félérték-idő antitrombotikus hatás esetén

Az antitrombotikus hatás tartamát heparinra és a II. példa vegyületére az Umetsu modell szerint határoztuk meg, amikoris a heparint és az új terméket IDso-jük arányában vizsgáltuk (heparin 2 mg/kg i.v., II. példa szerinti termék 20 mg/kg i.v.). Az eredményt az 5. ábra mutatja.

Látható, hogy az új termék hosszabb időtartamig hatásos, mint a heparin. Hasonló eredményeket kaptunk az 1., III. és IV. példa termékével is.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás új, oligo- és poliszacharid-kcverék-nlapú, az alábbiakkal jellemezhető antitrombotikum előállítására:

a) 2 000 és 40 000 dulton közötti mólsulyeloBzlás, fő csúcs 2 500 és 15 000 dalion között, és esetenként másodlagos csúcs és/vagy váll a 15 000 és 60 000 dalion közötti tartományban;

1 ) specifikus rotáció I. M²⁰1+25° és +80° között;

5 c) 1,5 és 4 súly% közöt.Li nitrogén-tartalom;

ri) 5 és 7,5 súly% közötti kén-tartalom;

e) 3 és 5 meq/g közötti ionos csoporL-tartalom;

f) 0,5 és 1,5 mcq/g közötti szálfámido-cso10 port-tartalom;

g) 0,5 és 1,5 mcq/g közötti glukóz-amin-tartaloin;

h) 0,0 és 0,6 ineg/g közötti gulnktóz-amin- tartalom; és

15 i) 0,5 és 3 közötti idéz (iduronsav)/glükóz (glükuronsav) arány, azzal jellemezve, hogy emlős zsigerszóvetet proteolitikus enzim hatásának vetünk alá, a kapott elegyel, szűrjük, a terméket bázikus

20 ioncserélővel történő egyesítés és ezt követő, vizes sóoldallal végzett eluálás útján elkülönítjük, a terméket frakciónak kicsapással tovább tisztítjuk, és kívánt esetben a terméket a nagy molekula jó poliszacharidok ellávo25 ítása céljából chondroitináz ABC enzim hatásának tesszük ki, és a visszamaradó terméket izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a termék frakciónak kicsa30 pasa céljából a szűrlethez 50 térfogat% koncentrációig metanolt adunk, a csapadékot eltávolítjuk, a metanolt 75 térfognt% koncentrációig Lovábbadagoljuk, és az így kapott csapadékot elkülönítjük.

35
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a frakciónak kicsapás után elkülönített terméket a nagy-molekulájú poliszacharidok eltávolítása céljából chondroitináz ABC enzim hatásának tesszük

40 ki, és a visszamaradó terméket izoláljuk.
4. Eljárás antitrombotikus hatású gyógyszerkészítmény előállítására azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított terméket a gyógyszerkészilésben szoká45 sós segédanyagokkal keverve gyógyszerré alakítjuk.