FI75491B - Foerfarande foer framstaellning av en ny heparinoid med antitrombotisk verkan pao basis av polysackarider. - Google Patents

Description

1 75491

Menetelmä uuden polysakkarideihin perustuvan antitromboot-tisesti vaikuttavan heparinoidin valmistamiseksi 5 Menetelmä koskee uuden veren hyytymisenestoaineen valmistamista, joka perustuu oligo- ja polysakkaridien seokseen.

Tiedetään, että tietyt mukopolysakkaridit vaikuttavat veren hyytymisominaisuuksiin. Parhaiten tunnettu muko-10 polysakkaridi on hepariini, sulfatoitu mukopolysakkaridi, jota käytetään suonien tromboosien ja trombo-embolian ennaltaehkäisyssä ja hoidossa. Hepariinin anti-tromboottinen teho perustuu anti-tromliini-III :n veren hyytymistä estävään vaikutukseen. Suurena vaikeutena hepariinin käytössä 15 tromboosin ja trombo-embolian ehkäisyssä ja hoidossa on hepariinin verenvuotoa aiheuttava ominaisuus. Optimoimalla annostus, käyttötapa ja -taajuus verenvuotoriskiä voidaan jossain määrin vähentää, mutta hepariinin anti-tromboottisten ominaisuuksien ja verenvuotoa aiheuttavien 20 ominaisuuksien luontaiseen suhteeseen ei voida vaikuttaa.

Sen seurauksena hepariinin ennaltaehkäisevää käyttöä on rajoitettu sellaisiin indikaatioihin, joissa hyytymis-systeemiä aktivoidaan vain lievästi, kuten syvien suonien tromboosin lievissä muodoissa. Lisäksi hepariinin haittana 25 on sen suhteellisen lyhyt vaikutusaika, niin että tehok kaassa ennaltaehkäisyssä annostus on annettava vähintään kahdesti päivässä.

On jo tehty erilaisia yrityksiä tuottaa "parannettuja hepariineja" tai heparinoideja, joiden ominaisuudet 30 ovat paremmat. Esimerkiksi GB-patenttijulkaisu 2002406 koskee oligo-heteropolysakkaridiseosta, jonka moolipainojakautuma on 3,32 x 10 21 - 4,98 x 10 2^g (2000 - 5000 daltonia) ja jota saadaan depolymeroimalla hepariinia ja/tai eristämällä se normaalin hepariininvalmistuksen emäliuoksesta, 35 minkä jälkeen saatu materiaali edelleen sulfatoidaan.

2 75491

Todetaan, että näin saadun materiaalin anti-tromboottisen tehon (in vivo-aktiivisuus) ja hyytymisenestotehon (in vit-ro-aktiivisuus) suhde on edullisempi kuin hepariinilla.

Nyt on löydetty uusi anti-tromboottisesti tehokas 5 heparinoidi, joka on oligo- ja heteropolysakkaridien seos ja jonka anti-tromboottisella aktiivisuudella ja verenvuotoa aiheuttavalla aktiivisuudella on silmiinpistävä ero.

Rotilla tehdyissä erilaisissa verenvuototesteissä (lihaksen verenvuototesti, kapillaarinen verenvuototesti) 10 uusi heparinoidi ei ole näkynyt aiheuttavan verenvuotoa ollenkaan tai juuri enempää kuin placebo, edelleen verenvuotoa aiheuttava vaikutus kasvoi vain vähän laajalla an-nostusalueella (10 - 250 mg/kg). Tunnetusti antitromboot-tinen vaikutus yksikköpainoa kohti on pienempi kuin hepa-15 riinilla, mutta hyöty/riski-suhde (s.o. antitromboottisen vaikutuksen ja verenvuotoa aiheuttavan vaikutuksen suhde) on 10 - 40 kertaa edullisempi kuin hepariinilla. Tätä kuvataan myöhemmin yksityiskohtaisemmin vertailevilla esimerkeillä.

20 Uusi anti-tromboottinen aine on luonnon alkuperää ja koostuu oligo- ja polysakkaridien seoksesta, jotka perustuvat heksoosiderivaattoihin kuten glukuronihappoon, iduronihappoon, glukosamiiniin, galaktosamiiniin ja niiden sulfatoituihin ja asetyloituihin derivaattoihin. Uusi 25 tuote on valkoinen, amorfinen, hieman hygroskooppinen pul veri, jolla on seuraavat ominaisuudet: a) moolipainojakautuma (määritetty vertaamalla dekstraaniin geelipermeaatiokromatografiällä suurihuokoi-sessa piidioksidimatriisissa (Nucleosil 50-5), eluanttina 30 0,5-molaarinen ammoniumasetaattipuskuri (pH = 5,0), on 3,32 x 10-21 - 6,64 x 10~21g (2000 - 40000 daltonia), ja päähuippu on välillä 4,15 x 10 2^ - 2,49 x 10 2^*g (2500 - -21 15000 daltonia), spesifisemmin välillä 6,64 x 10 -20 1,66 x 10 g (4000 - 1QQQ0 daltonia), keskimäärin 35 8,30 x 10”21 - 1,33 x 10“20g (5000 - 8000 daltonia), ja il -20 3 75491 tavallisesti lisäpiikki ja/tai olkapää välillä 2,49 x 10 -20 9,96 x 10 g (15Q0Q - 60000 daltonia), spesifisemmin välillä 4,98 x 10”20 - 8,30 x 10~20g (30000 - 50000 daltonia) -20 molekyylipainon ollessa keskimäärin noin 6,64 x 10 g 5 (40000 daltonia); b) spesifinen rotaatio (^ς720) välillä + 25° - + 80°, tarkemmin välillä + 30° - + 70°; c) typpipitoisuus välillä 1,5-4 painoprosenttia, edullisesti välillä 2,5 - 3,5 painoprosenttia; 10 d) rikkipitoisuus välillä 5 , 7,5 painoprosenttia, edullisesti välillä 5,5 - 6,5 painoprosenttia; e) ionisten ryhmien pitoisuus välillä 3-5 mekv/g, edullisesti välillä 3,5 - 4,5 mekv/g; f) sulfamidoryhmien pitoisuus välillä 0,5 - 1,5 15 mekv/g, edullisesti välillä 0,5 - 1,0 mekv/g; g) glukosamiinipitoisuus 0,5 - 1,5 mekv/g; h) galaktosamiinipitoisuus 0,0 - 0,6 mekv/g; i) idoosi (iduronihappo)/glukoosi (glukuronihappo)-suhde on 0,5 - 3, erityisemmin 1-3.

20 Vaikka on mahdotonta tarkasti spesifioida uuden tuotteen oligo- ja polysakkaridikoostumus, yllä mainitut parametrit kuvaavat tuotetta tyydyttävästi; erityisesti yhdessä farmakologisen profiilin kanssa.

Uuden heparinoidin farmakologista profiilia kuvataan 25 seuraavasti: 1) hyytymättömyysaktiivisuus (USP) on alle 10 kansainvälistä yksikköä milligrammaa kohti (IU/mg) ja se on vain murto-osa (tavallisesti alle 5 %) hepariini USP:n arvosta ; 30 2) mitätön anti-trombiiniaktiivisuus (alle 1 % hepa riini USP:n arvoista); 3) anti-X -aktiivisuus alle 20 % hepariinin arvoista, cl tavallisesti välillä 2,5 - 15 %; 4) anti-tromboottinen aktiivisuus (Umetsu-malli), 35 ID50-arvo noin 2-8 mg/kg i.v. (hepariini USP:n ID5Q-arvo 4 75491 on noin Q,4 - 0,5 mg/kg i.v.); 5) verenvuotoaktiivisuus, joka ei suurella annos-tusvälillä juuri kasva (300 mg:aan/kg i.v. asti), kun se hepariini USP:n annostuksella 1 mg/kg i.v. on selvästi 5 havaittava ja kasvaa nopeasti annosten suuretessa; 6) hyöty/riski suhde on 10 - 40 kertaa edullisempi kuin hepariini USPslla koskien anti-tromboottista aktiivisuutta verrattuna verenvuotoaktiivisuuteen; 7) puoliarvoaika on varmasti kaksi kertaa niin 10 pitkä kuin hepariini USP:lla.

Tämä kiinnostava profiili osoittaa uuden tuotteen erittäin sopivaksi verisuonitromboosin ja trombo-embolian ennaltaehkäisyyn ja hoitoon. Tämä tuote näyttää erityisen sopivalta ennen kaikkea DVT:n (syvien suonien tromboosin) 15 estämiseen potilailla, joille tehdään lantiokirurgia tai joille se on jo tehty.

Tähän asti ei ole ollut sopivia ennaltaehkäiseviä toimenpiteitä lantiokirurgiassa usein sattuvaa DVT:tä ja keuhkoemboliaa vastaan. Pienet hepariiniannokset (s.c.) 20 eivät ole tehokkaita ja korkeampia i.v. annoksia vastus tetaan suuren verenvuotoriskin takia.

Uudella tuotteella ei näytä olevan mutageenisiä ja toksisia ominaisuuksia edes suurina annoksina (400 mg:aan/ kg/päivä asti).

25 Uutta tuotetta voidaan saada eri tavoin. Nisäkkäi den kudokset, kuten keuhkot, haima, maksa, suolet ja erityisesti suolen limakalvo voivat olla perusmateriaalina. Nisäkkäiden kudoksista tuote erotetaan aluksi autolyysillä tai proteolyyttisillä entsyymeillä (esim. sian haimasta 30 saatavilla entsyymeillä tai bakteriaalisilla entsyymeillä kuten Bacillus subtilisssta saatavat proteaasit). Tuote erotetaan edelleen saostamalla orgaanisten liuottimien avulla, tavallisesti vesiliukoisten liuottimien, kuten alkoholien, esim. metanolin, avulla. Muita eristysmenetelmiä 35 ovat tuotteen sitominen kvaternaariseen alifaattiseen 5 75491 ammoniumemäkseen tai emäksiseen ioninvaihtimeen ja sitä seuraava tuotteen eluointi vesipitoisilla suolaliuoksilla. Tuotetta voidaan edelleen puhdistaa fraktiosaostuksella.

Yksityiskohtaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, 5 että käsittelemällä näin saatu tuote chondroitinaasi ABC :11a poistetaan suurin osa galaktosamiinia sisältävistä polysakkarideista, joiden molekyylipaino on suuri. Jäljelle jäävällä tuotteella (n. 70 - 75 %) alkuperäisestä tuotteesta) näkyy kuitenkin olevan miltei sama yllättävä farmakolo-10 ginen profiili kuin käsittelemättömällä tuotteella, toisin sanoen tuloksena mainitusta entsymaattisesta käsittelystä ratkaisevasti suurimolekyylinen ei-aktiivinen fraktio (25 - 30 paino-%) poistetaan.

Chondroitinaasi-ABC:11a käsitellyn tuotteen fysikaa-15 liset ominaisuudet pysyvät samoina kuin yo. uudelle hepari-noidille spesifioidut ominaisuudet, paitsi että moolipaino-jakaumassa suurimolekyylisen fraktion huippu ja/tai olkapää ovat miltei kokonaan kadonneet, spesifinen rotaatio näyttää kasvaneen arvoon + 45° - + 75°, ja galaktosamiinipitoisuus 20 vähenee käytännöllisesti katsoen nollaan. On selvää, että keksintö koskee myös tätä tuotetta.

Uusi tuote (tuotteet) voidaan valmistaa tavanomaisesti samoin kuin hepariinia on valmistettu farmaseuttiseen annosmuotoon, esim. hajoittamalla vedessä injektointiin 25 sopivaan muotoon, johon tarvittaessa lisätään muita farma seuttisesti hyväksyttyjä apuaineita (säilöntäaine, tiettyjä suoloja). Kliininen käyttö tapahtuu suonensisäisellä tai ihonalaisella (mahdollisesti ajoittaisella) injektiolla tai infuusiolla. Muut annostustavat ovat myös mahdollisia, 30 kuten keuhkonsisäinen käyttö inhalaation avulla, tai perä puikkojen käyttö.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki I

35 Härän keuhkoa (100 kg) käsiteltiin sian haimasta 6 75491 saaduilla proteolyyttisillä entsyymeillä. 15 tunnin inku-baation jälkeen (pH 8,5, 40°C) seos suodatettiin. Kirkkaaseen suodokseen tuotiin voimakkaasti emäksistä ioninvaihdin-ta (QAE Sephadex A5Q) ja systeemiä sekoitettiin 15 tuntia.

5 Sitten ioninvaihdin suodatettiin pois ja eluoitiin NaCl:n vesiliuoksella (200 g/1). Metanolia lisättiin eluaattiin 50 % sen tilavuudesta. Saatu sakka poistettiin ja sen jälkeen metanolia lisättiin emäliuokseen 75 % sen tilavuudesta. Sakka otettiin talteen, pestiin 100-%:sella metano-10 lilla ja kuivattiin. Saadulla valkoisella, amorfisella pul verilla (22,7 g) galaktosamiinipitoisuus oli 0,45 mmol/g, glukosamiinipitoisuus 0,54 mmol/g, keskimääräinen molekyyli ko paino 1,10 x 10 g (6600 daltonia), lisäpiikki keskimäärin -20 arvossa 6,31 x 10 g (38000 daltonia) (määritetty suh-15 teessä dekstraaniin), ä/d° -arvo oli + 34,2°, rikkipitoisuus 5,7 %, typpipitoisuus 2,6 %, ionisten ryhmien pitoisuus 3,90 mekv/g, sulfamidoryhmien pitoisuus 0,69 mmol/g ja iaoosi/glukoosi-suhde oli 2,1.

Tuote antoi kuvan 1 mukaisen elektroforeesimallin 20 (agaroosigeeli tasapainotettuna 0,2 molaariseen kalsium- asetaattiin, pH = 7,2, puskurina 0,2-molaarinen kalsium-asetaatti, 300 V max., 7 mA, 30 minuuttia).

Esimerkki II

Sian suolen limakalvoa (100 kg) käsiteltiin Bacillus 25 subtilis:n proteaasilla 35°C:ssa ja pH:n ollessa 8,2, 24 tunnin ajan. Seos suodatettiin ja kirkas suodos käsiteltiin samoin kuin esimerkissä I. Saanto oli 3,2 g valkoista amorfista pulveria, jonka galaktosamiinipitoisuus oli 0,38 mmol/g, glukosamiinipitoisuus 0,82 iranol/g, keskimääräinen -20 30 molekyylipaino 1,01 x 10 g (6100 daltonia) ja lisäpiikki -20 kohdalla 6,97 x 10 g (4200 daltonia) (määritetty suhteessa dekstraaniin), &72d° -arvo oli + 35,1°, rikkipitoisuus 5,9 %, typpipitoisuus 2,7 %, ionisten ryhmien pitoisuus 3,70 mekv/g, sulfamidiryhmien pitoisuus 0#73 mmol/g ja 35 idoosi/glukoosi—suhde oli 1,9. Tuote antoi kuvan 2

II

7 75491

mukaisen NMR-spektrin (4 % D20:ssa 50°C:ssa, 270 MHz). Esimerkki III

Härän suolen limakalvoa (10 m3) käsiteltiin pankrea-tiinilla (40°C, pH 8,5, 20 tuntia). Seos suodatettiin ja 5 suodos käsiteltiin esimerkin I mukaisella tavalla. Saanto oli 335 g valkoista, amorfista pulveria, jonka galaktosamii-nipitoisuus oli 0,28 mmol/g, glukosamiinipitoisuus 0,90 mmol/g, keskimääräinen molekyylipaino 9,30 x 10 g — 2 Π (5600 daltonia) ja lisäpiikki keskimäärin arvossa 6,81 x 10 10 g (41000 daltonia) (määritetty suhteessa dekstraaniin), 2o Λ75υ -arvo oli + 36,9, rikkipitoisuus 6,1 %, typpipitoisuus

2,8 %, ionisten ryhmien pitoisuus 4,0 mekv/g, sulfamidiryh-mien pitoisuus 0,75 mmol/g ja idoosi/glukoosi-suhde oli 1,8. Esimerkki IV

15 Esimerkin III tuotetta (100 g) käsiteltiin chondroiti naasi ABC:11a. Jäljelle jäävä tuote erotettiin metanolisa-ostuksella (50 - 75 % tilavuudesta). Saatiin 72 g tuotetta (valkoinen, amorfinen jauhe), jonka galaktosamiinipitoisuus oli 0,05 mmol/g, glukosamiinipitoisuus 1,20 mmol/g, keski- -21 20 määräinen molekyylipaino 8,97 x 10 g (5400 daltonia) ja -20 erittäin pieni lisäpiikki oli keskimäärin arvossa 6,64 x 10 g (40000 daltonia) (määritetty suhteessa dekstraaniin), 2 0 -arvo oli + 61,2°, rikkipitoisuus oli 6,2 %, typpipitoisuus 2,75 %, ionisten ryhmien pitoisuus 4,1 mekv/g, 25 sulfamidoryhmien pitoisuus 0,91 mmol/g ja idoosi/glukoosi- suhde 1,9.

Farmakologiset testit

Esimerkeissä I - IV saatu tuote tutkittiin muutamilla farmakologisilla testeillä verraten hepariini USPrhen.

8 75491

Vaikutus veren hyytymiseen Tuote Hyytymättönyys- Anti-trcmbiini- Anti-X - a aktiivisuus aktiivisuus aktiivisuus _(iu/mg)_(IU/mg)_(IO/mg)_ 5 hepariini 179 164 167

Esimerkki II 0,5 4,5

Esimerkki II 1 0,1 5

Esimerkki III 3 1,0 6

Esimerkki IV 4 1,3 8 10 _

Hyytymättömyysaktiivisuus määritettiin USP-menetelmän mukaan. Anti-trombiiniaktiivisuus ja anti-X -aktiivisuus

CL

saatiin selville käyttäen kromogeenistä substraattimenetel-mää, jossa käytettiin puhdistettua lehmän anti-trombiini 15 III:a ja substraatteja (Kabi AB, Ruotsi) S-2238 ja S2222, vastaavasti.

Anti-tromboottinen aktiivisuus

Anti-tromboottinen aktiivisuus määritettiin Umetsu-mallilla (Thrombos. Haemostas. 39, 74 - 83, 1978) rotilla.

20 Tässä mallissa veritulppia saatiin syntymään valtimosuonien sivukytkennöillä antamalla veren virrata pitkin silkkirih-maa 15 min. Mitataan placebovaikutusta ja testattavien aineiden vaikutusta veritulpan muodostukseen eri annostuksilla. Suhteesta annoksen ja veritulpan ehkäisyn välillä 25 placebovaikutukseen nähden voidaan johtaa ID^-arvo (annostus, jolla 50 % veritulpan muodostuksesta ehkäistään) .

Tuote ID^q (mg/kg) hepariini USP 0,5 30 esimerkki I 6,0 esimerkki II 5,0 esimerkki III 4,0 esimerkki IV 5,3

II

9 75491

Verenvuotoaktiivisuus a) Kapillaarinen verenvuototesti rotilla

Placebo tai tutkittavat tuotteet annostettiin nuku- tettuihin rottiin peniksen selkäsuonen kautta. Minuutin 5 kuluttua vedettiin nahansuikale käsin irti ajellulta vatsalta pitkin kahta aikaisemmin tehtyä viiltoa. Haava peitettiin harsositeellä ja nahansuikale pantiin takaisin siteen päälle. 10 minuutin kuluttua side poistettiin ja siinä oleva veri uutettiin 20 ml:11a vettä. Veden hemoglo-10 biinipitoisuus mitattiin spektrofotometrisesti ja käytettiin parametrina verenhukalle (ks. Thrombos. Haemostas. 42, 466, 1979) .

Tässä testissä vertailtiin esimerkin II tuotetta ja hepariinia erilaisilla annostuksilla, huomion ollessa anti-15 tromboottisten aktiivisuuksien erossa uuden tuotteen ja hepariinin välillä. Tulos on esitetty kuvassa 3. Vastaavat tulokset saatiin esimerkkien I, III ja IV tuotteille.

b) Lihasten verenvuototesti rotilla

Nukutetun rotan kaikkien käpälien koukistajalihas 20 (biceps femoris) otettiin pitkittäin ulos skalpelilla minuu tin kuluttua placebon tai tutkittavan tuotteen annostuksesta suonensisäisesti peniksen selkäsuoneen. Kukin haava peitettiin harsositeellä. 30 minuutin kuluttua siteet poistettiin. Verenhukka määritettiin samalla tavoin kuin kapil-25 laarisessa verenvuototestissä. Tässä testissä verrattiin esimerkin II tuotetta ja hepariinia. Tulos on esitetty kuvassa 4. Vastaavat tulokset saatiin esimerkkien I, III ja IV tuotteilla.

Kuvat 3 ja 4 osoittavat selvästi hepariinin paljon 30 suuremman verenvuototendenssin, joka uudella tuotteella ei eroa ollenkaan tai eroaa hyvin vähän placebosta laajalla annostusalueella. Hyöty/riski-suhde on aivan selvästi edullisempi uudelle tuotteelle.

Puoliarvoaika ja anti-tromboottinen vaikutus 35 Anti-tromboottisen vaikutuksen kestoa tutkittiin 10 75491

Umetsu-mallilla hepariinilla ja esimerkin II tuotteella, jolloin testattiin hepariinin ja uuden tuotteen IDj-q-arvon suhdetta (hepariini 2 mg/kg i.v. tuote II, 20 mg/kg i.v.). Tulos on esitetty kuvassa 5.

5 Uusi tuote on ilmeisesti tehokas pitemmän ajan kuin hepariini. Vastaavat tulokset saatiin esimerkkien I, III ja IV tuotteille.

ii

Claims (4)

11 75491

1. Menetelmä uuden antitromboottisesti vaikuttavan heparinoidin valmistamiseksi, joka perustuu sellaisten oli-5 go- ja polysakkaridien seokseen, jotka ovat glukuroniha-pon, iduronihapon, glukoosiamiinin ja galaktoosiamiinin jäännöksiä ja niiden sulfatoituja ja asetyloituja johdannaisia, jonka heparinoidin ominaisuudet ovat seuraavat: a) molekyylipaino on välillä 3,32 x 10 ja 6,64 x -20 10 10 g (2000-40000 daltonia), esiintyy pääpiikki kun mole- kyylipaino on välillä 4,415 x 10 2^ ja 2,49 x 10 2<^g (2500-15000 daltonia), mahdollisesti lisäpiikki ja/tai olkapää kun molekyy-lipaino on välillä 2,49 x 10"20 ja 9,96 x 10-20g (15000 -15 60000 daltonia); b) spesifinen rotaatio on välillä +25° ja +80°; c) typpipitoisuus on 1,5-4 paino-%; d) rikkipitoisuus on 5-7,5 paino-%; 20 e) ionisten ryhmien pitoisuus on 3-5 mekv/g; f) sulfamidoryhmien pitoisuus on 0,5-1,5 mekv/g; g) glukosamiinipitoisuus on 0,5-1,5 mekv/g; h) galaktoosiamiinipitoisuus on 0-0,6 mekv/g; i) idoosin (iduronihappo) ja glukoosin (glukuroni- 25 happo välinen suhde on 0,5-3; j) hyytymättömyysaktiivisuus (USP) on alle 10 kansainvälistä yksikköä per mg; k) trombiiniaktiivisuus on minimaalinen (alle 1% hepariini-USP-arvosta); 30 1) anti-X -aktiivisuus on alle 20%, tavallisesti 2,5- cl 15% hepariinin vastaavasta arvosta; m) antitromboottinen aktiivisuuden (Umetsu-malli) ID5Q-arvo on noin 2-8 mg/kg i.v.; n) verenvuotoaktiivisuus kasvaa tuskin ollenkaan 35 laajalla annostuksella (300 mg/kg i.v. asti); o) hyöty/riski-suhde on 10-40 kertaa edullisempi kuin hepariini-USP:11a koskien antitromboottista aktiivisuutta verrattuna verenvuotoaktiivisuuteen, 12 75491 p) puoliarvoaika on varmasti kaksi kertaa niin pitkä kuin hepariini-USP:11a, tunnettu siitä, että nisäkkään kudoksia, kuten keuhkoja, haimaa, maksaa, suolia ja suolen limakalvoa 5 käsitellään autolyysillä tai proteolyyttisillä entsyymeillä, seos suodatetaan, heparinoidi eristetään fraktiosaostuk-sella lisäämällä metanolia suodokseen enintään 50 til.-%, sakka poistetaan, lisää metanolia lisätään enintään 75 til.-% ja näin saatu sakka eristetään, tai suodosta käsi-10 tellään kvaternäärisellä alifaattisella ammoniumemäksellä tai emäksisellä ioninvaihtimella, erotettu emäs tai ionin-vaihdin eluoidaan vesipitoisella suolaliuoksella ja eluaat-ti alistetaan mainittuun fraktiosaostukseen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että eristettyä tuotetta käsitellään kondroitinaasi ABC:11a, jotta saataisiin suurin osa suurimolekyylisistä polysakkarideista poistetuksi, ja jäljelle jäävä tuote eritetään. Il 13 754 91

1. Förfarande för framställning av en ny heparinoid med antitrombotisk verkan pä basis av en blandning av oli-5 go- och polysackarider, vilka utgörs av äterstoder av glu-kuronsyra, iduronsyra, glukosamin och galaktosamin och de-ras sulfaterade och acetylerade derivat, vilken heparinoid har följande egenskaper: -21 a) molekylvikten är mellan 3,32 x 10 och 6,64 x — 20 10 10 g (2000-40000 dalton), det förekommer en huvudtopp dä -21 -20 molekylvikten är mellan 4,415 x 10 och 2,49 x 10 g (2500 - 15000 dalton), möjligen en ytterligare topp och/ -20 eller suldra dä molekylvikten är mellan 2,49 x 10 och 9,96 x 10_20g (15000-60000 dalton); 15 b) den specifika rotationen är mellan +25° och +80°; c) kvävehalten är 1,5-4 vikt-%; d) svavelhalten är 5-7,5 vikt-%; e) halten av joniska grupper är 3-5 mekv/g; 20 f) halten av sulfamidogrupper är 0,5-1,5 mekv/g; g) glukosaminhalten är 0,5-1,5 mekv/g; h) galaktosaminhalten är 0-0,6 mekv/g; i) förhällandet mellan idos (iduronsyra) och glukos (glukuronsyra är 0,5-3; 25 j) antikoaguleringsaktiviteten (USP) är under 10 internationella enheter per mg; k) trombinaktiviteten är minimal (under 1% av hepa-rin-USP-värdet; l) anti-X-aktiviteten är under 20%, vanligen 2,5-15% 30 av heparinets motsvarande värde; m) ID(-Q-värdet för antitrombotisk aktivitet (Umetsu-model) är cirka 2-8 mg/kg i.v.; n) blödningsaktiviteten stiger knappast icke alls inom ett stort doseringsomräde (ända upp tili 300 mg/kg 35 i.v.); o) nytto/risk-förhällandet är 10-40 gänger fördel-aktigare än hos heparin-USP gällande den antitrombotiska aktiviteten jämfört med blödningsaktiviteten;