KR101104107B1 - 헤파린으로부터 유도된 다당류의 혼합물, 이의 제조방법 및이를 함유하는 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 평균 분자량이 1,500 내지 3,000Da이고 항-Xa/항-IIa 비가 30 이상인, 헤파린으로부터 유도된 다당류 혼합물 및 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다당류 혼합물, 헤파린, 항혈전성 약제, 평균 분자량, 항-Xa/항-IIa 비.

Description

헤파린으로부터 유도된 다당류의 혼합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물{Heparin-derived polysaccharide mixtures, preparation thereof and pharmaceutical compositions containing same}
본 발명은 헤파린으로부터 유도된 다당류의 혼합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
헤파린은 특히 항응고성 및 항혈전성을 위해 사용되는 동물성 황산염화 뮤코다당류의 혼합물이다.
그럼에도 불구하고, 헤파린은 사용 조건이 제한되는 단점이 있다. 특히, 높은 항응고 활성(항-IIa 활성)으로 인해 출혈을 일으킬 수 있다.
헤파린 에스테르의 기본적인 해중합에 의해 수득된 저분자량 헤파린이 제안되나(EP 40144), 이러한 제품은 여전히 항-IIa 활성이 높다.
분자량이 매우 낮은 헤파린이 또한 미국 특허 제6,384,021호에 기술된다. 그러나, 기술된 실시예에서 수득된 항-Xa 활성치는 120IU를 초과하지 않고, 수득된 항-Xa/항-IIa 비는 15 내지 50이다.
WO-0208295에서, 분자량이 매우 낮은 헤파린은 미국 특허 제6,384,021호와 상이한 방법에 의해 제조되고, 특정 용도 예에서 역시 매우 높은 항-Xa/항-IIa 비를 갖는 100 내지 150IU 범위의 활성을 나타낸다.
그러나, 약제 분야에서는 특히 150IU/mg보다 높은 활성을 수득하는 데 있어서 항-Xa 활성을 개선시키고 헤파린 유도체의 새로운 세대를 개발하고자 하는 지속적인 요구가 있다.
그러므로, 본 발명의 목적의 하나는 선행 기술에서 기술된 방법을 개질시킴으로써, 특히 해중합 단계 동안의 수분 %를 조절함으로써 항-Xa 활성 및 항-Xa/항-IIa 비를 개선시키는 것이다. 이와 같이 수득한 헤파린은 항혈전 활성이 우수하고 aIIa 활성이 매우 낮아 출혈 위험을 감소시키면서 헤파린과 유사한 aXa 활성을 갖는다. 마찬가지로, 본 발명의 생성물은 헤파린보다 반감기가 훨씬 우수하다.
그러므로, 본 발명의 대상은, 헤파린에 비해 활성화 인자 X(인자 Xa)와 활성화 인자 II(인자 IIa)에 대해 보다 선택적인 활성을 갖는, 헤파린으로부터 유도된 다당류의 신규한 혼합물이다.
평균 분자량이 1,500 내지 3,000Da인 다당류의 혼합물은 올리고당으로도 지칭될 수 있음을 이해해야 한다.
그러므로, 본 발명의 대상은 헤파린의 다당류 성분의 일반적인 구조식을 가지면서 다음과 같은 특징을 갖는 황산염화 올리고당의 혼합물이다:
- 당해 혼합물은 평균 분자량이 1,500 내지 3,000달톤이고, 항-Xa 활성이 120 내지 200IU/mg이고, 항-IIa 활성이 10IU/mg 미만이고, 항-Xa 활성/항-IIa 활성 비가 30을 초과한다;
- 당해 혼합물의 올리고당 성분은, 2 내지 26개의 당 단위를 함유하고 말단의 한쪽에 4,5-불포화 우론산 2-O-설페이트 단위를 가지며 다음과 같은 화학식의 육당류 ΔIIa-IIs-Is를 함유한다.
Figure 112005018577377-pct00001
본 발명에 기술된 올리고당의 혼합물에 함유된 육당류 ΔIIa-IIs-Is는 ATIII에 대한 친화도가 높고 aXa 활성이 740U/mg을 초과함을 특징으로 하는 서열이다.
본 발명에 기술된 올리고당의 혼합물은 알칼리염 또는 알칼리 토금속염의 형태이다.
알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염이 바람직하다.
평균 분자량은 직렬의 2개의 컬럼, 예를 들면, 상표명 TSK G3000 XL 및 TSK G2000 XL하에 시판되는 것들을 사용하여 고압 액체 크로마토그래피에 의해 측정한다. 검측은 굴절율 측정계에 의해 수행한다. 사용된 용출제는 질산리튬이고, 유속은 0.6ml/분이다. 당해 시스템은 아가로스-폴리아크릴아미드 겔(IBF)에서의 크로마토그래피에 의해 에녹사파린(제조원: Aventis)을 분별분리시켜 제조한 표준물을 사용하여 측정한다. 당해 제조방법은 문헌에 기술된 기술에 따라 수행된다[참 조: Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36(1997-78) or D.A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271(1977-78)]. 당해 결과는 GPC6 소프트웨어(제조원: Perkin Elmer)로 계산한다.
항-Xa 활성은 표준물로서 저분자량 헤파린에 대한 제1 국제 표준물을 사용하여 문헌에 기재된 색소성 기질에 대한 아미드분해법에 의해 측정된다[참조: Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410(1977)].
항-IIa 활성은 표준물로서 저분자량 헤파린에 대한 제1 국제 표준물을 사용하여 문헌에 기재된 기술에 의해 측정된다[참조: Anderson L.O. et al., Thromb. Res., 15, 531-541(1979)].
육당류 분획은 바람직하게는 올리고당의 혼합물의 15 내지 25%를 차지한다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 혼합물은 올리고당의 혼합물의 육당류 분획에서 육당류 ΔIIa-IIs-Is의 8 내지 15%를 함유한다.
육당류 분획 %는 TSK G3000 XL 및 TSK G2000 XL 컬럼에 대한 고압 액체 크로마토그래피에 의해 또는 다른 방법으로는 육당류 분획의 분취 분리에 의해 분석적으로 측정될 수 있다. 당해 혼합물은 이 경우 상표명 울트로겔(Ultrogel) ACA202R(제조원: Biosepra)하에 시판되는 것과 같은 폴리아크릴아미드 아가로스 유형의 겔로 충전된 컬럼에서 크로마토그래피된다. 당해 혼합물은 탄산수소나트륨 용액으로 용출시킨다. 바람직하게는, 탄산수소나트륨은 0.1 내지 1mol/l 용액이다. 보다 더 바람직하게는, 이러한 분리는 1mol/l의 농도에서 수행한다. 당해 측정은 자외선 분광계(254nm)에 의해 수행한다. 분별 이후, 탄산수소나트륨의 용액 중의 육당류 분획을 빙초산으로 중화시킨다. 이어서, 당해 용액을 감압하에 농축시켜 아세트산나트륨 농도가 30중량%가 초과하게 한다. 메탄올 3 내지 5용적을 첨가하여 육당류 분획을 침전시킨다. 제3호 소결 유리에 대해 여과하여 육당류를 회수한다. 수득한 육당류 혼합물을 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 분석하여 육당류 ΔIIa-IIs-Is의 함량을 측정할 수 있다. 육당류 ΔIIa-IIs-Is는 분취 HPLC 크로마토그래피에 의해 또는 당해 분야의 숙련가에 의해 사용된 기술에 따라 항트롬빈 III 세파로스 컬럼에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다[참조: M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood and U. Lindahl, F.E.B.S letters, vol 656(1)(1976)].
보다 특정하게는, 본 발명에 따르는 혼합물은 항-Xa 활성이 150 내지 200IU/mg의 범위이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 혼합물은 항-IIa 활성이 5IU/mg 미만이고, 가장 특정하게는 0.5 내지 3.5IU/mg이다. 후술된 용도의 예는 공정의 바람직한 특징이 사용되는 경우 1.1 내지 1.6IU/mg의 수치를 나타낸다.
바람직하게는, 당해 혼합물은 항-Xa 활성/항-IIa 활성 비가 50 초과, 가장 특정하게는 100 초과이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 혼합물은 평균 분자량이 2,000 내지 3,000달톤이고, 가장 특정하게는 평균 분자량이 2,400 내지 2,650달톤이다.
그러므로, 본 발명의 대상은 가장 특정하게는 항-Xa 활성이 150 내지 200IU/mg이고 항-IIa 활성이 0.5 내지 3.5IU/mg이며 평균 분자량이 2,400 내지 2,650달톤인 상술한 바와 같은 혼합물이다.
본 발명에 따르는 올리고당의 혼합물은, pKa가 바람직하게는 20을 초과하는 강한 유기 염기[이의 특성은, 예를 들면, 바람직하게는 문헌(참조: R. Schwesinger et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169(1987), R. Shwesinger et al., Angew. Chem. 105, 1420(1993))에 따라 정의된 포스파젠 부류와 유사하다]에 의한 유기 매질 속에서의 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염의 해중합; 해중합된 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 나트륨염으로의 전환; 잔여 에스테르의 비누화; 및 임의의 정제에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 따르는 방법은 WO 0208295에 기술된 바와 같은 방법의 주요 단계를 반복하면서, 상술한 바와 같은 물리화학적 특징 및 활성을 갖는 본 발명에 따르는 올리고당의 혼합물을 수득할 수 있도록 하는 필수적인 특징을 부가한다.
실제로, 본 발명에 따르는 올리고당의 특정 혼합물을 수득하기 위해, 해중합 단계 동안 혼합물의 수분 함량을 매우 정밀하게 조절함으로써 염기의 선택도를 조절할 필요가 있다.
본 발명에 따르는 방법은 실제로 해중합 동안 염기의 높은 선택도의 조절을 특징으로 한다. 헤파린을 해중합시키면서 본 발명에 기술된 육당류 ΔIIa-IIs-Is와 같은 ATIII에 대한 친화성을 갖는 서열을 가능한한 많이 보존할 수 있다. 당해 방법의 이러한 중요한 단계로 인해 본 발명에 따르는 다당류를 수득할 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 이러한 특징은 올리고당의 혼합물의 평균 분자량의 견지에서 예측치 못한 aXa 활성을 초래한다(평균 분자량이 2,000 내지 3,000Da인 경우 150IU/mg < aXa < 200IU/mg). 이러한 선택도는 pKa가 20을 초과하고 입체 장애성이 매우 높으며 친핵성이 약한 포스파젠 염기의 매우 특정한 물리화학적 특징에 기인한다.
이러한 효과는 반응 매질이 무수물인 경우 완전하게 발현된다. 한편, 반응 매질의 수분 함량이 증가하는 경우, 해중합의 선택도가 극적으로 감소되는 것이 관찰된다. ATIII에 대한 친화성을 갖는 서열의 보존이 감소하고, 그 결과 aXa 활성이 크게 감소한다. 소량의 물의 존재하에, 포스파젠 염기는 양성자화하고, 반응성 종이 4급 암모늄 수산화물이 된다. 이 경우, 매우 높은 입체 장애성과 약한 친핵성이 손실되고, 수득된 생성물의 품질이 커다란 영향을 받는다. 수분 함량을 측정, 조절하면서 해중합 시험을 수행하면, 이러한 효과가 완전히 발현됨을 알 수 있다.
다음 표 1에 해중합의 선택도에 미치는 수분 함량의 영향을 요약하였다(오직 수분 함량의 파라미터만이 당해 시험에서 가변적이다: 시약의 화학양론, 희석액 및 온도는 당해 분야의 숙련가의 요건에 따라 일정하다). 사용된 염기는 포스파젠 염기(2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린)이다.
Figure 112005018577377-pct00002
ATIII에 대한 친화성을 갖는 서열의 최적의 선택도 및 최대 보존을 위해, 헤파린의 벤질 에스테르, 벤제토늄 염에 대해 포스파젠 염기 1몰당량이 사용되는 경우 수분 함량 0.6% 미만, 가장 특정하게는 0.3% 미만에서 수행하는 것이 바람직하다.
그러므로, 본 발명의 대상은 가장 특정하게는, 포스파젠계 염기, 특히 수분 함량이 0.6% 미만인 디클로로메탄 용액 중의 포스파젠계 염기가 사용됨을 특징으로 하여, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라 수득한 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염을 해중합하는 단계이다. 바람직하게는, 수분 함량은 0.3% 미만, 가장 특정하게는 0.2% 미만이도록 선택되어야 한다.
유리하게는, 강염기/에스테르 몰 비는 0.2 내지 5, 바람직하게는 0.6 내지 2, 가장 특정하게는 0.8 내지 1.2이다. 그러므로, 등몰 비로 사용하는 것이 본 발명의 바람직한 양태의 일부를 형성한다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 비양성자성 용매(예: THF 또는 DMF)가 사용될 수 있다.
헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염은 바람직하게는 벤조토늄염, 세틸피리디늄염 또는 세틸트리메틸암모늄염이다.
포스파젠계 염기는 바람직하게는 화학식 1의 화합물이다.
Figure 112005018577377-pct00003
위의 화학식 1에서,
라디칼 R1 내지 R7은 동일하거나 상이하며, 알킬 라디칼이다.
특히, 본 발명의 대상은 해중합용으로 (단계 d에서) 사용된 염기가 다음 화학식의 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린(2-[1,1-디메틸에틸)이미노]-N,N-디에틸-1,2,2,2,3,5,6-옥타하이드로-1,3-디메틸-1,3,2-디아자포스포린-2-아민):
Figure 112005018578288-pct00008
, 또는 3급-부틸이미노트리(피롤리디노)포스포란이다.
화학식 1에서, 알킬 라디칼은 직쇄 또는 분지쇄 형태로서 1 내지 6개의 탄소원자를 함유한다.
그러므로, 본 발명의 대상은,
벤제토늄 클로라이드의 작용에 의한 나트륨 헤파린의 교환염화 단계(a),
벤질 클로라이드의 작용에 의한 벤제토늄 헤파리네이트의 에스테르화 단계(b),
수득한 벤질 에스테르의 4급 암모늄염으로의 교환염화 단계(c),
위에서 정의한 바와 같은 방법에 의한 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염의 해중합 단계(d),
4급 암모늄염의 나트륨염으로의 전환 단계(e),
수산화나트륨과 같은 염기의 작용에 의한 헤파린의 임의의 비누화 단계(f) 및
특히 과산화수소와 같은 산화제의 작용에 의한 임의의 정제 단계(g)를 포함하는, 본 발명에 따르는 올리고당의 혼합물의 제조방법이다.
다음 반응식 1은 본 발명을 설명한다:
Figure 112005018577377-pct00004
해중합된 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염의 나트륨염으로의 전환 단 계(e)는 통상 반응 매질을 15 내지 25℃의 온도에서 아세트산나트륨의 알콜 용액, 바람직하게는 메탄올 중의 아세트산나트륨의 10% 용액(중량/용적)으로 처리함으로써 수행된다. 첨가되는 아세테이트의 중량 기준의 당량은 바람직하게는 해중합 반응에서 사용된 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염의 질량보다 3배 이상 많다.
비누화 단계(f)는 통상 0 내지 20℃, 바람직하게는 0 내지 10℃ 범위의 온도에서 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화리튬과 같은 알칼리 금속 수산화물에 의해 수행된다. 알칼리 금속 수산화물 1 내지 5몰당량이 통상적으로 사용된다. 바람직하게는, 당해 비누화 단계는 1 내지 2 몰당량의 알칼리 금속 수산화물의 존재하에 수행될 것이다.
최종 생성물은 해중합된 헤파린을 정제하는 임의의 공지된 방법[참조: EP 0037319B1]에 의해 임의로 정제될 수 있다(단계(g)). 바람직하게는, 정제는 10 내지 50℃에서 수성 매질 속에서 과산화수소에 의해 수행된다. 바람직하게는, 당해 정제 공정은 20 내지 40℃의 범위에서 수행된다.
헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염은 다음 반응 방식에 따라 제조될 수 있다:
벤제토늄 헤파리네이트를 수득하기 위해, 헤파린을 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의해 나트륨염으로 전환시키는 단계(교환염화 단계)(a),
헤파린의 벤질 에스테르의 나트륨염을 수득하기 위해, 단계(a)에서 수득한 벤제토늄염을 벤질 클로라이드에 의해 에스테르화시키고 아세트산나트륨의 알콜 용 액으로 처리하는 단계(b) 및
헤파린의 벤질 에스테르의 나트륨 염을 4급 암모늄염, 바람직하게는 벤제토늄염, 세틸피리디늄염 또는 세틸트리메틸암모늄염으로 교환염화시키는 단계(c).
단계(a)의 반응은 15 내지 25℃의 온도 범위에서 나트륨 헤파린에 대한 과량의 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의해 수행한다. 유리하게는, 염/나트륨 헤파린 몰 비는 3 내지 4이다.
사용된 출발 헤파린은 바람직하게는 돼지 헤파린이다. 이는, 프랑스 특허 제2663639호에 기술된 방법에 따라 데르마탄 설페이트 수치를 감소시키기 위해 미리 정제될 수 있다.
단계(b)의 에스테르화 반응은 바람직하게는 25 내지 45℃에서, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 염소화 유기 용매(예: 클로로포름 또는 메틸렌 클로라이드)에서 수행된다. 이어서, 메탄올과 같은 알콜 중의 10중량%의 아세트산나트륨에 의해 침전시킴으로써 벤제토늄염 형태의 에스테르를 나트륨염의 형태로 회수한다. 알콜 1 내지 1.2용적이 반응 매질 1용적에 대해 통상 사용된다. 벤질 클로라이드의 양과 반응 시간을 조절하여 50 내지 100%, 바람직하게는 70 내지 90%의 에스테르화도를 수득한다. 바람직하게는, 벤질 클로라이드 0.5 내지 1.5중량부를 헤파린의 벤제토늄염 1중량부에 대해 사용한다. 마찬가지로, 바람직하게는 반응 시간이 10 내지 35시간이 될 것이다.
교환염화 단계(c)는 10 내지 25℃의 온도에서 수성 매질 속에서 4급 암모늄 클로라이드에 의해, 바람직하게는 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 또는 세틸트리메틸암모늄 클로라이드에 의해 수행된다. 유리하게는, 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 클로라이드/나트륨 염의 몰 비는 2 내지 3이다.
나트륨염 형태의 본 발명에 따르는 혼합물은 또 다른 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로 전환될 수 있다. 하나의 염으로부터 또 다른 염으로의 전환은 임의로 프랑스 특허 제73 13 580호에 기술된 방법을 사용하여 달성한다.
본 발명에 따르는 혼합물은 독성이 없으므로, 약제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 올리고당의 혼합물은 항혈전제로서 사용될 수 있다. 특히, 이들은 정맥 및 동맥 혈전증, 심정맥 혈전증, 폐 색전증, 불안정형 앙기나, 심근 경색, 심 허혈, 말초 동맥의 폐색 질환 및 심방세동의 치료 및 예방에 유용하다. 이들은 또한 평활근 세포의 증식, 아테롬성 동맥경화증 및 동맥경화증을 치료 및 예방하고, 맥관 생성 및 성장 인자를 조절함으로써 암을 치료 및 예방하며, 당뇨성 망막병증 및 신장병증과 같은 당뇨성 질환을 치료 및 예방하는 데 유용하다.
본 발명은 또한 활성 성분으로서 화학식 I의 혼합물을 임의로 하나 이상의 불활성 부형제와 조합하여 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
당해 약제학적 조성물은, 예를 들면, 피하내 또는 정맥내 경로로 주사될 수 있는 용액이다. 이들은 또한 폐 경로(흡입) 또는 경구 경로로 투여하기에 유용하다.
투여량은 환자의 연령, 체중 및 건강 상태에 따라 가변적일 수 있다. 성인의 경우, 1일 통상 20 내지 100mg의 투여량이 근육내 또는 피하내 경로로 투여된다.
다음 실시예는 본 발명을 설명하지만, 그렇다고 본 발명을 한정하지는 않는다.
실시예 A: 헤파리네이트의 벤질의 벤제토늄염의 제조
벤제토늄 헤파리네이트
물 125ml 중의 벤제토늄 클로라이드 25g의 용액을 물 100ml 중의 나트륨염 형태의 헤파린 10g의 용액에 가한다. 생성물을 여과하고 물로 세척한 다음, 건조시킨다.
헤파린의 벤질 에스테르(나트륨염)
벤질 클로라이드 16ml을 메틸렌 클로라이드 80ml 중의 벤제토늄 헤파리네이트 20g의 용액에 가한다. 당해 용액을 30℃에서 12시간 동안 가열한다. 이어서, 메탄올 중의 나트륨 아세테이트의 10% 용액 108ml를 가하고, 혼합물을 여과하고 메탄올로 세척한 다음, 건조시킨다. 이에 따라, 헤파린의 벤질 에스테르 7.6g이 나트륨염 형태로 수득되며, 이의 에스테르화도는 77%이다.
헤파린의 벤질 에스테르(벤제토늄염)
헤파린의 벤질 에스테르(나트륨염) 36g(0.0549mol) 및 증류수 540ml을 2리터 들이 삼각 플라스크 A 속에 도입시킨다. 약 20℃의 온도에서 균질화시킨 후, 담황 색 용액을 수득한다. 벤제토늄 클로라이드 64.45g(0.1438mol) 및 물 450ml를 자기 교반하면서 1리터 들이 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 삼각 플라스크 B 속의 용액을 약 35분에 걸쳐서 삼각 플라스크 A 중의 용액 속에 교반하면서 붓는다. 풍부한 백색 침전물의 형성이 관찰된다. 삼각 플라스크 B를 증류수 200ml로 세정하고, 세척수를 삼각 플라스크 A 속에 도입한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 12시간 동안 안정화시킨다. 일단 설정된 시간이 경과하면, 상청액의 투명한 부분을 제거하고 폐기한다. 물 560ml를 침강된 침전물(슬러리 발생)에 가하고, 혼합물을 20분 동안 교반한다. 침전물을 약 30분 동안 재침전시킨다. 상청액을 제거하고 폐기한다(560ml). 증류수 약 560ml로 세척하는 공정을 침강된 침전물에 대해 2회 반복한다. 최종 세척 공정에서, 침전물이 현탁 상태로 남고, 제3호 소결 유리를 통해 여과된다. 이어서, 케이크를 증류수 200ml로 4회 세척한다. 습윤 백색 고체를 배수시킨 다음, 60℃의 온도 영역에서 감압(2.7kPa)하에 건조시킨다. 12시간 동안 건조시킨 후, 벤질 헤파리네이트, 벤제토늄 염 87.5g을 수득한다. 수득된 수율은 94.9%이다.
실시예 B: 육당류 ATIII(ΔIIa-IIs-Is)의 설명
Figure 112005018577377-pct00005
D2O 중의 양성자 스펙트럼, 500 MHz, T=298 K, δ(ppm) : 1.97 (3H, s), 3.18 (1H, dd, 10 및 3Hz), 3.30 (1H, t, 8Hz), 3.37 (1H, dd, 10 및 3Hz), 3.60 (2H, m), 3.65 내지 3.85 (6H, m), 3.87 (2H, m), 3.95 (1H, d, 8Hz), 4.03 (1H, d, 8Hz), 4.05 내지 4.13 (4H, m), 4.16 내지 4.45 (8H, m), 4.52 (1H, d, 8Hz), 4.67 (1H, m), 5.06 (1H, d, 6Hz), 5.10 (1H, d, 3Hz), 5.33 (1H, d, 4Hz), 5.36 (1H, d, 3Hz), 5.46 (1H, d, 3Hz), 5.72 (1H, d, 4Hz).
4-데옥시-α-L-트레오-헥센피라노실-우론산-(1→4)-2-데옥시-2-아세토아미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노실-(1→4)-β-D-글루코피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-3,6-디-O-설포-α-D-글루코-피라노실)-(1→4)-2-O-설포-α-L-요오도피라노실우론산-(1→4)-2-데옥시-2-설파미도-6-O-설포-α-D-글루코피라노스의 데카나트륨염.
ㆍ 실시예 1 내지 7 및 12는 중합체 반응의 선택도와 수득된 생성물의 aXa 및 aIIa 활성에 미치는 수분 함량의 영향을 설명한다.
ㆍ 실시예 8 내지 10은 수득된 생성물의 aXa 및 aIIa 활성에 미치는 염기 당량가의 영향을 설명한다(수분함량 0.1%)
ㆍ 실시예 11은 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 이외의 포스파젠 염기의 용도: 3급-부틸이미노트리(피롤리디노)포스포란의 용도를 설명한다.
실시예 1
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 0.1%):
디클로로메탄 70ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득한 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 10g(0.006mol)를 교반하면서 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 0.1%로 조절한다. 당해 용액을 질소하에 40℃로 가열한다. 전체 용해 후, 용액을 20℃로 냉각시킨 다음, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 1.75ml(0.006mol)를 첨가한다. 생성된 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하는 동안, 메탄올 300ml 중의 무수 아세트산나트륨 30g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조하고, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트(Hyflo supercel Celite) 5g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 중의 반응 혼합물을 5℃에서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 자기 교반하면서 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 1시간 30분 동안 정치시킨다. 상청액 의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(220ml). 메탄올 220ml을 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 당해 침전물을 약 1시간 20분 동안 재침강되도록 둔다. 상청액을 분리하여 폐기한다(250ml). 메탄올 250ml을 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 100ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 셀라이트(5g) 중의 해중합된 헤파린의 나트륨염 2.51g을 수득한다. 수득된 수율은 64%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(5g) 중의 조 해중합된 헤파린, 나트륨염 2.5g(0.0038mol) 및 물 17ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 5ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 삼각 플라스크 150ml에 넣는다. 30% 가성 소다 0.4ml(0.004mol)을 5℃의 온도에서 자기 교반하면서 도입한다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N　HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 3g을 가한다. 용해 후, 메탄올 21ml를 반응 매질에 가한다. 15분 동안 교반한 후, 메탄올 44ml를 가하고, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 5℃에서 45분 동안 침강되도록 둔다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(90ml). 메탄올 90ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.31g을 수득한다. 수득된 수율은 66%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 1.3g 및 증류수 13ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 놓는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 온도를 40℃로 조절한다. 1N 수산화나트륨을 가하여 pH를 9.7 ±0.1로 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛의 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 0.07ml를 가한다. 20℃에서 약 2시간 동안 교반한 후, 생성된 혼합물을 1N HCl을 첨가하여 중화시킨 다음, 염화나트륨 2g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과시킨 다음, 메탄올 14ml를 붓는다. 이어서, 당해 용액을 10℃로 냉각시키고, 약 15분 동안 교반시킨다. 이어서, 메탄올 36ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 약 15분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 메탄올 50ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 25분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.13g을 수득한다. 수득된 수율은 87%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2600달톤
항-Xa 활성: 177IU/mg
항-IIa 활성: 1.5IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 118
실시예 2
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 0.2%)
디클로로메탄 70ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 10g(0.006mol)을 교반하면서 질소압하에 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 0.2%로 조절한다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 1.75ml(0.006mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 300ml 중의 무수 아세트산나트륨 30g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 5g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 5℃에서 자기 교반하면서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 2시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(220ml). 메탄올 220ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 2시간 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(230ml). 메탄올 230ml를 침강된 침전물에 가한다. 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 150ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 셀라이트(5g) 중의 조 해중합된 헤파린 2.63g을 수득한다. 수득된 수율은 67%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(5g) 중의 해중합된 헤파린의 나트륨염 2.5g(0.0038mol) 및 물 18ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 5ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 150ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 0.4ml(0.004mol)를 5℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 2g을 가한다. 메탄올 14ml를 반응 혼합물에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 36ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 5℃에서 45분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침 전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 48시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.3g을 수득한다. 수득된 수율은 65%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 1.4g 및 증류수 15ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.07ml을 가한다. 약 2시간 동안 40℃에서 교반시킨 후, 혼합물을 20℃의 온도로 냉각시킨 다음, 1N HCl을 가하여 중화시킨다. 염화나트륨 2g을 반응 매질에 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 14ml를 붓는다. 이어서, 당해 용액을 10℃로 냉각시키고, 15분 동안 교반한다. 이어서, 메탄올 36ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 15분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(40ml). 메탄올 40ml를 침강된 침전물(슬러리 발생)에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하고 폐기한다(50ml). 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml 로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.2g을 수득한다. 수득된 수율은 86%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2,650달톤
항-Xa 활성: 161IU/mg
항-IIa 활성: 1.4IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 115
실시예 3
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 0.3%)
디클로로메탄 70ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 10g(0.006mol)을 교반하면서 질소압하에 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 0.3%로 조절한다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 1.75ml(0.006mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 300ml 중의 무수 아세트산나트륨 30g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 5g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 5℃에서 자기 교반하면서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐 서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 1시간 10분 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(220ml). 메탄올 220ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 현탁액 속의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 100ml로 세척한다. 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 셀라이트(5g) 중의 조 해중합된 헤파린 2.57g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 66%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(5g) 중의 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 2.5g(0.0038mol) 및 물 18ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 5ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 150ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 0.4ml(0.004mol)를 5℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 3g을 가한다. 메탄올 15ml를 반응 혼합물에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 36ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 1시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(70ml). 메탄올 70ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 48시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.42g을 수득한다. 수득된 수율은 62%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 1.4g 및 증류수 14ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.07ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 2g을 가한다. 용해시킨 후, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 14ml를 붓는다. 이어서, 당해 용액을 10℃로 냉각시키고, 15분 동안 교반한다. 이어서, 메탄올 36ml를 가한 다음, 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 40분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 메탄올 50ml를 침강된 침전물(슬러리 발생)에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 25분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.24g을 수득한다. 수득된 수율은 89%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2400달톤
항-Xa 활성: 132IU/mg
항-IIa 활성: 1.4IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 94
실시예 4
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 0.4%)
디클로로메탄 70ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 10g(0.006mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 0.4%로 조절한다. 용액을 질소하에 30℃로 가열한다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 1.75ml(0.006mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 300ml 중의 무수 아세트산나트륨 30g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 5g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 5℃에서 자기 교반하면서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 2시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전 물을 약 1시간 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 현탁액 속의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 100ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 셀라이트(5g) 중의 조 해중합된 헤파린 3.25g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 83%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(10g) 중의 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 3.1g(0.0018mol) 및 물 21ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 6ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 150ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 0.7ml(0.007mol)를 5℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 4g을 가한다. 메탄올 28ml를 반응 혼합물에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 72ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 1시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(90ml). 메탄올 90ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 48시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.9g을 수득한다. 수득된 수율은 67%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 1.9g 및 증류수 19ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.1ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 2g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 14ml를 붓고, 당해 혼합물을 15분 동안 교반한다. 메탄올 36ml를 가한 다음, 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 15분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(40ml). 메탄올 40ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 메탄올 500ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 이어서, 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 72시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.56g을 수득한다. 수득된 수율은 82%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2350달톤
항-Xa 활성: 122IU/mg
항-IIa 활성: 1.3IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 94
실시예 5
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 0.57%)
디클로로메탄 140ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 20g(0.019mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 0.57%로 조절한다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 3.5ml(0.012mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 10g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 30분 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 메탄올 400ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 1시간 동안 정치시켜 재침강시 킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(420ml). 메탄올 420ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 200ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 셀라이트(10g) 중의 조 해중합된 헤파린 6.66g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 85%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(10g) 중의 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 6.66g(0.0101mol) 및 물 47ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 15ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 150ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 1.1ml(0.011mol)를 5℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 9.5g을 가한다. 메탄올 66ml를 반응 매질에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 171ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 5℃에서 ¾시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(160ml). 메탄올 160ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(180ml). 메탄올 180ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 상청액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다(90ml). 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 4.53g을 수득한다. 수득된 수율은 74%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 4.53g 및 증류수 45ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.25ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 5.5g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 38ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 100ml를 가한 다음, 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 20분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(90ml). 메탄올 90ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 25분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(100ml). 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시 킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 3.7g을 수득한다. 수득된 수율은 82%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2200달톤
항-Xa 활성: 120IU/mg
항-IIa 활성: 1.4IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 86
실시예 6
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 1.8%)
디클로로메탄 140ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 20g(0.019mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 1.8%로 조절한다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 3.5ml(0.012mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 10g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 30분 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투 명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 메탄올 400ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 1시간 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(420ml). 메탄올 420ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 200ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 셀라이트(10g) 중의 조 해중합된 헤파린 7.54g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 96%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(10g) 중의 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 7.54g(0.0101mol) 및 물 53ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 15ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 150ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 1.25ml(0.012mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 10.5g을 가한다. 메탄올 70ml를 반응 매질에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 190ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 ¾시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(180ml). 메탄올 180ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(180ml). 메탄올 180ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 5.53g을 수득한다. 수득된 수율은 80%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 5.53g 및 증류수 55ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.31ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 7g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 49ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 126ml를 가한 다음, 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 20분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(105ml). 메탄올 105ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 25분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(110ml). 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여 과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 55℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 4.53g을 수득한다. 수득된 수율은 82%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2600달톤
항-Xa 활성: 105IU/mg
항-IIa 활성: 3.1IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 34
실시예 7
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 2.5%)
디클로로메탄 140ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 20g(0.019mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 반응 매질의 수분 함량을 2.5%로 조절한다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 3.5ml(0.012mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 10g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 아세트산나트륨의 메탄올성 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 1시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 메탄올 400ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 200ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린 7.78g을 셀라이트(10g) 중의 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 99.6%이다.
비누화:
위에서 수득된 셀라이트(10g) 중의 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 7.78g(0.0119mol) 및 물 79ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 15ml로 2회 세정한다. 수득된 여과물을 150ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 1.3ml(0.012mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 10g을 가한다. 메탄올 60ml를 반응 매질에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 190ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 ¾시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(180ml). 메탄올 180ml를 침 강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(180ml). 메탄올 180ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 5.87g을 수득한다. 수득된 수율은 82%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 5.87g 및 증류수 59ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.34ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 7g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 49ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 126ml를 가한 다음, 약 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 20분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(105ml). 메탄올 105ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 25분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액 을 분리하여 폐기한다(110ml). 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 55℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 5.21g을 수득한다. 수득된 수율은 89%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 3550달톤
항-Xa 활성: 99IU/mg
항-IIa 활성: 13.4IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 7.4
실시예 8
해중합 및 나트륨염으로의 전환(염기 0.5당량)
디클로로메탄 140ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 20g(0.019mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 30℃에서 전체 용해시키고 20℃로 냉각시킨 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 1.75ml(0.006mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 메탄올성 아세트산나트륨 용액 속으로 붓는다. 1시간 동안 교반한 후, 현탁액을 2시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(420ml). 메탄올 420ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 침전물을 약 18시간 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 메탄올 400ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 상청액을 분리하여 폐기한다(400ml). 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 100ml로 2회 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 60℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린 5.7g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 73%이다.
비누화:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 5.7g(0.0086mol) 및 물 53ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 0.93ml(0.009mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 6g을 가한다. 메탄올 42ml를 반응 매질에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 108ml를 가한 다음, 30분 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 30분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(180ml). 메탄올 180ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(170ml). 메탄올 170ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 30ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 60℃의 온도에서 감압하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 3.5g을 수득한다. 수득된 수율은 67.4%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 3.5g 및 증류수 35ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.6 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.18ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 3.6g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 27ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 65ml를 가한 다음, 약 30분 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 30분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반한다. 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(70ml). 메탄올 70ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반한다. 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 30ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 60℃의 온도에서 감압하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.8g을 수득한다. 수득된 수율은 80%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2900달톤
항-Xa 활성: 146.1IU/mg
항-IIa 활성: 5.1IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 28.6
실시예 9
해중합 및 나트륨염으로의 전환(염기 0.6당량)
디클로로메탄 280ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 40g(0.024mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 30℃에서 전체 용해시키고 20℃로 냉각시킨 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 4.2ml(0.014mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 삼구 플라스크 A 속의 반응 혼합물의 절반을 4℃에서 자기 교반하면서 메탄올성 아세트산나트륨 용액 속으로 붓는다. 1시간 동안 교반한 후, 현탁액을 2시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(310ml). 메탄올 310ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 침전물을 약 18시간 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 메탄올 400ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 상청액을 분리하여 폐기한다(300ml). 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 100ml로 2회 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 60℃에서 감압하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린 6g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 77%이다.
비누화:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 6g(0.0091mol) 및 물 56ml를 250ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 30% 가성 소다 1ml(0.010mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 6.4g을 가한다. 메탄올 45ml를 반응 매질에 붓는다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 115ml를 가한 다음, 30분 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 30분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(170ml). 메탄올 170ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(140ml). 메탄올 140ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 30ml로 2회 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 60℃의 온도에서 감압하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 3.6g을 수득한다. 수득된 수율은 65.3%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 3.5g 및 증류수 35ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.6 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.18ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 3.5g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 25ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 63ml를 가한 다음, 30분 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 30분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(70ml). 메탄올 70ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 30분 동안 교반한다. 침전물을 몇분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 30ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 60℃의 온도에서 감압하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.5g을 수득한다. 수득된 수율은 71.4%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2600달톤
항-Xa 활성: 150.5IU/mg
항-IIa 활성: 3.2IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 47
실시예 10
해중합 및 나트륨염으로의 전환(염기 0.8당량)
디클로로메탄 70ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 10g(0.006mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 30℃에서 전체 용해시키고 20℃로 냉각시킨 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 1.38ml(0.004mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 300ml 중의 무수 아세트산나트륨 30g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 메탄올성 아세트산나트륨 용액 속으로 1분 15초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 1시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(190ml). 메탄올 190ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성 된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(190ml). 메탄올 190ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 상청액을 분리하여 폐기한다(190ml). 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 150ml로 2회 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린 3.05g을 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 80%이다.
비누화:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 3.05g(0.0048mol) 및 물 21ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 용액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 6ml로 2회 세정한다. 수득한 여과물을 150ml 삼각 플라스크 속에 넣는다. 30% 가성 소다 0.6ml(0.006mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 4g을 가한다. 메탄올 28ml를 반응 매질에 가한다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 72ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 30분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(80ml). 메탄올 80ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.6g을 수득한다. 수득된 수율은 57%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 1.6g 및 증류수 16ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.6 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.08ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 2g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 14ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 36ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 30분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 메탄올 50ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 1.25g을 수득한다. 수득된 수율은 78%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2400달톤
항-Xa 활성: 154.3IU/mg
항-IIa 활성: 1.6IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 96.4
실시예 11
해중합 및 나트륨염으로의 전환:
디클로로메탄 140ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 20g(0.019mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 40℃에서 전체 용해시키고 20℃로 냉각시킨 후, 3급-부틸이미노트리(피롤리디노)포스포란 3.5ml(0.011mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 10g을 당해 용액에 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 메탄올성 아세트산나트륨 용액 속으로 1분 30초에 걸쳐서 붓는다. 5분 동안 교반한 후, 현탁액을 30분 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(400ml). 메탄올 400ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 1시간 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(250ml). 메탄올 250ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 200ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(벤질 에스테르, 나트륨염) 5.39g을 수득한다. 수득된 수율은 69%이다.
비누화:
위에서 수득된 해중합된 헤파린(벤질 에스테르, 나트륨염) 5g(0.0076mol) 및 물 35ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 용액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 10ml로 2회 세정한다. 수득한 여과물을 250ml 삼각 플라스크 속에 넣는다. 30% 가성 소다 1ml(0.01mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 2시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 6g을 가한다. 메탄올 42ml를 반응 매질에 가한다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 104ml를 가한 다음, 15분 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(140ml). 메탄올 140ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 45분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(160ml). 메탄올 160ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 100ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 48시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.7g을 수득한다. 수득된 수율은 59%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 2.6g 및 증류수 25ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.15ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 3g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 21ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 54ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 20분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 메탄올 50ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 20분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 현탁액 중의 침전물을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 백색 케이크를 메탄올 50ml로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.35g을 수득한다. 수득된 수율은 90%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2400달톤
항-Xa 활성: 167.5IU/mg
항-IIa 활성: 1.1IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 152
실시예 12
해중합 및 나트륨염으로의 전환(수분 0.05%)
디클로로메탄 140ml를 삼각 플라스크 A에 넣는다. 실시예 A에서 기술한 바와 같이 수득된 헤파린의 벤질 에스테르(에스테르화도: 75%, 벤제토늄염) 20g(0.019mol)을 교반하면서 서서히 가한다. 4A 분자체 20g을 반응 매질에 가하고, 48시간 동안 서서히 교반하면서 수분 함량이 0.05%가 되도록 한다. 상청액을 불활성 대기하에 삼각 플라스크 A로 옮긴다. 전체 용해 후, 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,2,3-디아자포스포린 3.5ml(0.012mol)를 가한다. 당해 혼합물을 20℃에서 24시간 동안 교반한다. 이와 같이 교반하면서, 메탄올 600ml 중의 무수 아세트산나트륨 60g의 용액을 삼각 플라스크 B에서 제조한다. 전체 용해 후, 하이플로 슈퍼셀 셀라이트 10g을 가한다. 삼각 플라스크 A 속의 반응 혼합물을 4℃에서 자기 교반하면서 메탄올성 아세트산나트륨 용액 속으로 2분에 걸쳐서 붓는다. 15분 동안 교반한 후, 현탁액을 1시간 동안 정치시켜 침전시킨다. 상청액의 투명한 부분을 분리하여 폐기한다(420ml). 메탄올 420ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 15분 동안 교반한다. 침전물을 약 1시간 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(450ml). 메탄올 450ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 15분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 200ml로 세척한다. 담황색 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 16시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린 5.36g을 셀라이트(10g) 중의 나트륨염으로서 수득한다. 수득된 수율은 68.6%이다.
비누화:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린의 나트륨염 5.36g(0.0087mol) 및 물 50ml를 50ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과하고, 물 15ml로 4회 세정한다. 수득한 여과물을 150ml 삼각 플라스크 속에 넣는다. 30% 가성 소다 1.01ml(0.0122mol)를 4℃에서 자기 교반하면서 첨가한다. 첨가한 후, 혼합물을 3시간 동안 교반한다. 당해 용액을 1N HCl을 가하여 중화시키고, 염화나트륨 11g을 가한다. 메탄올 77ml를 반응 매질에 가한다. 15분 동안 교반시킨 후, 메탄올 200ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반시킨다. 이어서, 교반을 중지시키고, 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(240ml). 메탄올 240ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 10분 동안 교반한다. 이어서, 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시 킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(225ml). 메탄올 225ml를 침강된 침전물에 가하고, 생성된 혼합물을 10분 동안 교반한다. 이어서, 현탁액을 제3호 소결 유리를 통해 여과한다. 이어서, 수득된 케이크를 메탄올 50ml로 2회 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 40℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 조 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.65g을 수득한다. 수득된 수율은 53.7%이다.
정제:
위에서 수득된 조 해중합된 헤파린 2.65g 및 증류수 26.5ml를 100ml들이 삼각 플라스크에 넣는다. 당해 혼합물을 자기 교반하면서 40℃가 되도록 조절한다. 1N 수산화나트륨을 첨가하여 pH가 9.7 ±0.1이 되도록 조절한다. 반응 매질을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과하고, 수성 30% 과산화수소 용액 0.25ml을 가한다. 약 2시간 동안 20℃에서 교반시킨 후, 1N HCl을 가하여 혼합물을 중화시킨 다음, 염화나트륨 3g을 가한다. 이어서, 당해 용액을 0.45㎛ 멤브레인을 통해 여과한 다음, 메탄올 21ml를 10℃의 온도에서 붓는다. 이어서, 당해 용액을 20℃가 되도록 조절하고, 15분 동안 교반한다. 메탄올 54ml를 가한 다음, 1시간 동안 교반한다. 이어서, 교반을 중지하고, 현탁액을 45분 동안 정치시켜 침강시킨다. 이어서, 상청액을 분리하여 폐기한다(46ml). 메탄올 46ml를 침강된 침전물에 가하고, 혼합물을 5분 동안 교반한다. 침전물을 약 30분 동안 정치시켜 재침강시킨다. 상청액을 분리하여 폐기한다(50ml). 메탄올 50ml를 가하고, 현탁액 중의 침전물을 제4호 소 결 유리를 통해 여과한다. 수득된 백색 케이크를 메탄올 10ml로 2분획으로 세척한다. 당해 습윤 고체를 배수시킨 다음, 50℃의 온도에서 감압(6kPa)하에 건조시킨다. 18시간 동안 건조시킨 후, 순수 해중합된 헤파린(나트륨염) 2.363g을 수득한다. 수득된 수율은 89.1%이다.
이와 같이 수득된, 해중합된 헤파린의 특징은 다음과 같다:
평균 분자량: 2500달톤
항-Xa 활성: 192IU/mg
항-IIa 활성: 1.3IU/mg
항-Xa 활성/항-IIa 활성 비: 148

Claims (33)

  1. 헤파린의 다당류 성분의 일반적인 구조식을 갖는 황산염화 올리고당의 혼합물로서,
    평균 분자량이 1,500 내지 3,000달톤이고, 항-Xa 활성이 150 내지 200IU/mg이고, 항-IIa 활성이 10 IU/mg 미만이고, 항-Xa 활성/항-IIa 활성 비가 30을 초과하고,
    당해 혼합물의 올리고당 성분이, 2 내지 26개의 당 단위를 함유하고, 말단의 한쪽에 비치환되거나 2-위치에서 설페이트화된 4,5-불포화 우론산 단위를 가지며, 육당류 분획을 당해 황산염화 올리고당의 혼합물의 15 내지 25%의 양으로 함유하고, 황산염화 올리고당의 혼합물의 육당류 분획 중에서 육당류 ΔIIa-IIs-Is를 8 내지 15% 함유하며,
    알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염의 형태임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물.
    Figure 112011006171180-pct00009
  2. 제1항에 있어서, 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염이 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-IIa 활성이 5IU/mg 미만임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-Xa 활성/항-IIa 활성 비가 50 초과임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 평균 분자량이 2,000 내지 3,000달톤임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-Xa 활성이 150 내지 200IU/mg이고, 항-IIa 활성이 0.5 내지 3.5IU/mg이며, 평균 분자량이 2,400 내지 2,650달톤임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물.
  7. 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염을 pKa가 20을 초과하는 강한 유기 염기의 존재하에 유기 매질 속에서 해중합시킴을 포함하며, 사용된 유기 염기가 포스파젠계 염기로 이루어지고, 수분 함량이 0.3% 미만임을 특징으로 하는, 제1항에 따르는 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 수분 함량이 0.2% 미만임을 특징으로 하는, 제1항에 따르는 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 염이 벤제토늄염, 세틸피리디늄염 또는 세틸트리메틸암모늄염임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 포스파젠계 염기가 화학식 1의 화합물임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
    화학식 1
    Figure 112008070061950-pct00010
    위의 화학식 1에서,
    라디칼 R1 내지 R7은 동일하거나 상이하며, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분지된 알킬 라디칼이다.
  11. 제10항에 있어서, 해중합 단계를 수행하는 동안 사용된 포스파젠계 염기가 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린 또는 3급-부틸이미노트리(피롤리디노)-포스포란임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 강염기/에스테르 몰 비가 0.2 내지 5임을 특징으로 하는, 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
  13. 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의한 나트륨 헤파린의 교환염화 단계(a);
    벤질 클로라이드의 작용에 의해 수득된 벤제토늄 헤파리네이트의 에스테르화 단계(b);
    수득한 벤질 에스테르를 교환염화시켜 4급 암모늄염을 수득하는 단계(c);
    헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염을 pKa가 20을 초과하는 강한 유기 염기의 존재하에 유기 매질 속에서 해중합시키는 단계(d);
    4급 암모늄염의 나트륨염으로의 전환 단계(e);
    수산화나트륨과 같은 염기의 작용에 의한 헤파린의 임의의 비누화 단계(f); 및
    임의의 정제 단계(g)를 수행함을 포함하고;
    상기 단계(d)에서, 사용되는 유기 염기가 포스파젠계 염기로 이루어지고, 수분 함량이 0.3% 미만이며, 상기 포스파젠계 염기가
    Figure 112011085479773-pct00011
    (여기서, 라디칼 R1 내지 R7은 동일하거나 상이하며, 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분지된 알킬 라디칼이다), 또는 2-3급-부틸이미노-2-디에틸아미노-1,3-디메틸퍼하이드로-1,3,2-디아자포스포린 또는 3급-부틸이미노트리(피롤리디노)-포스포란인,
    제1항에 따르는 황산염화 올리고당의 혼합물의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계(a)의 반응이 15 내지 25℃의 온도 범위에서 나트륨 헤파린에 대한 과량의 벤제토늄 클로라이드의 작용에 의해 수행되고, 염/나트륨 헤파린 몰 비가 3 내지 4임을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 단계(b)의 에스테르화 반응을 25 내지 45℃에서 클로로포름 또는 메틸렌 클로라이드와 같은 염소화 유기 용매 속에서 수행하고, 이어서 반응 매질 1용적에 대해 알콜 1 내지 1.2용적의 비율로 메탄올과 같은 알콜 중의 10중량%의 아세트산나트륨에 의해 침전시킴으로써 나트륨염 형태의 에스테르를 회수함을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염의 에스테르화도가 50 내지 100%임을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서, 벤제토늄 헤파리네이트 1중량부에 대해 벤질 클로라이드 0.5 내지 1.5중량부를 사용하여 10 내지 35시간 동안 반응시킴을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  18. 제13항에 있어서, 교환염화 단계(c)가 10 내지 25℃의 온도에서 수성 매질 속에서 4급 암모늄 클로라이드에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄 클로라이드/나트륨 염의 몰 비가 2 내지 3임을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  20. 제13항에 있어서, 해중합된 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염의 나트륨염으로의 전환 단계(e)가 15 내지 25℃의 온도에서 반응 매질을 아세트산나트륨의 알콜 용액으로 처리함으로써 수행됨을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  21. 제13항에 있어서, 비누화 단계(f)가 0 내지 20℃의 온도 범위에서 수성 매질속에서 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화리튬과 같은 알칼리 금속 수산화물에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 알칼리 금속 수산화물 1 내지 5몰당량이 사용됨을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  23. 제13항에 있어서, 정제 단계(g)가 10 내지 50℃에서 수성 매질 속에서 과산화수소에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  24. 제1항 또는 제2항에 따른 황산염화 올리고당의 혼합물을 함유하는, 정맥 및 동맥 혈전증, 심정맥 혈전증, 폐 색전증, 불안정형 앙기나, 심근 경색, 심 허혈, 말초 동맥의 폐색 질환 및 심방세동, 평활근 세포의 증식, 아테롬성 동맥경화증 및 동맥경화증을 예방 또는 치료하고, 맥관 생성 및 성장 인자를 조절함으로써 암을 치료 및 예방하며, 당뇨성 망막병 및 신장병과 같은 당뇨성 질환을 치료 및 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 제24항에 있어서, 하나 이상의 약제학적 불활성 부형제 또는 비이클 또는 첨가제를 추가로 함유하는 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 피하내 또는 정맥내 경로로 주사될 수 있는 용액으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 폐 경로로 흡입하기 위한 제형으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 경구 경로로 투여하기 위한 제형으로 이루어짐을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  31. 헤파린의 벤질 에스테르의 4급 암모늄염을 pKa가 20을 초과하는 강한 유기 염기의 존재하에 유기 매질 속에서 해중합시킴을 포함하며, 사용된 유기 염기가 포스파젠계 염기로 이루어지고, 수분 함량이 0.3% 미만이며, 강염기/에스테르 몰 비가 0.2 내지 5인 방법에 의해 수득되는, 제1항에서 정의한 황산염화 올리고당의 혼합물.
  32. 제13항에 있어서, 정제 단계(g)가 과산화수소와 같은 산화제의 작용에 의해 수행됨을 특징으로 하는, 올리고당의 제조방법.
  33. 제18항에 있어서, 4급 암모늄 클로라이드가 벤제토늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드 또는 세틸트리메틸암모늄 클로라이드인 올리고당의 제조방법.
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