ES2671844A1 - Dispositivos médicos, sistemas y métodos que utilizan composiciones de anti-trombina heparina. - Google Patents

Dispositivos médicos, sistemas y métodos que utilizan composiciones de anti-trombina heparina. Download PDF

Info

Publication number
ES2671844A1
ES2671844A1 ES201790052A ES201790052A ES2671844A1 ES 2671844 A1 ES2671844 A1 ES 2671844A1 ES 201790052 A ES201790052 A ES 201790052A ES 201790052 A ES201790052 A ES 201790052A ES 2671844 A1 ES2671844 A1 ES 2671844A1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
heparin
ath
catheter
antithrombin
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
ES201790052A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2671844B1 (es
Inventor
Leslie Roy Berry
Anthony Kam Chuen Chan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Attwill Medical Solutions Inc
Original Assignee
Attwill Medical Solutions Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Attwill Medical Solutions Inc filed Critical Attwill Medical Solutions Inc
Publication of ES2671844A1 publication Critical patent/ES2671844A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2671844B1 publication Critical patent/ES2671844B1/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/0005—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L33/0011—Anticoagulant, e.g. heparin, platelet aggregation inhibitor, fibrinolytic agent, other than enzymes, attached to the substrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/0005—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L33/0011—Anticoagulant, e.g. heparin, platelet aggregation inhibitor, fibrinolytic agent, other than enzymes, attached to the substrate
    • A61L33/0041—Anticoagulant, e.g. heparin, platelet aggregation inhibitor, fibrinolytic agent, other than enzymes, attached to the substrate characterised by the choice of an antithrombatic agent other than heparin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L29/00—Materials for catheters, medical tubing, cannulae, or endoscopes or for coating catheters
    • A61L29/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. lubricating compositions
    • A61L29/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L33/00—Antithrombogenic treatment of surgical articles, e.g. sutures, catheters, prostheses, or of articles for the manipulation or conditioning of blood; Materials for such treatment
    • A61L33/0005—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L33/0011—Anticoagulant, e.g. heparin, platelet aggregation inhibitor, fibrinolytic agent, other than enzymes, attached to the substrate
    • A61L33/0029—Anticoagulant, e.g. heparin, platelet aggregation inhibitor, fibrinolytic agent, other than enzymes, attached to the substrate using an intermediate layer of polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/42—Anti-thrombotic agents, anticoagulants, anti-platelet agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Se describen productos sanitarios, sistemas y métodos para el tratamiento de afecciones, que utilizan conjugados de antitrombina-heparina. Por ejemplo, los productos sanitarios pueden revestirse con antitrombina-heparina (ATH) con el resultado de una reducción en la trombogenicidad. Igualmente, pueden tratarse diversas afecciones con ATH.

Description

Dispositivos médicos, sistemas y métodos que utilizan composiciones de anti-trombina heparina.
Antecedentes
La coagulación es el proceso mediante el cual la sangre pasa del estado líquido a un estado de gel. Esto forma parte de la hemostasis, o el proceso mediante el cual el organismo 10 detiene la pérdida de sangre a través de los vasos sanguíneos dañados. Aunque la coagulación es una función conocida del organismo humano, la coagulación puede dar lugar a arduos problemas durante procedimientos médicos como la cirugía y la cateterización intravenosa o intra-arterial. Una parte considerable de la población también puede experimentar trastornos de coagulación, en cuyo caso la presencia de coágulos de sangre no deseados supone un grave
15 riesgo para la salud.
Los procedimientos invasivos, como el bypass cardiopulmonar (BPC), generan enormes cantidades de micro-émbolos de fibrina que pueden alojarse en el cerebro y provocar disfunciones cognitivas a largo plazo. El BPC se lleva a cabo en todo el mundo para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares. La utilización del BPC en el área pediátrica
20 representa una operación especializada y sensible. Cada año se practican en Canadá unas 750 operaciones pediátricas, siendo de 7.500 la cifra correspondiente a los EE.UU. o a Europa. Si se incluyen las operaciones practicadas en adultos, todos los años se practican más de
800.000. El coste estimado de una sola operación de BPC en Canadá es de más de $10.000. En la actualidad, la heparina es el medicamento utilizado en el BPC y su coste anual es de 25 aproximadamente $50/BPC, o lo que es lo mismo, $40.000.000 anuales. La heparina no puede impedir que los tromboembolismos se desplacen hacia el cerebro durante el BPC, lo que se encuentra asociado a la disfunción cognitiva, tanto crónica como aguda. Los tromboembolismos también constituyen un factor de riesgo para otras muchas cirugías invasivas. La hemorragia descontrolada tras el BPC es una de las principales fuentes de preocupación a la hora de
30 atender a estos pacientes de alto riesgo.
El tromboembolismo venoso (TEV) es otro problema asociado a la coagulación sanguínea no deseada. Cada año, el TEV afecta a 1-2 de cada 1000 personas, generalmente en forma de trombosis venosa profunda (TVP) de la pierna, o de embolismo pulmonar (EP). La tasa de incidencia aumenta de 1 caso cada 10.000, en el caso de los individuos menores de 40 años, a 1 de cada 100 en el de los mayores de 60 años. Cada año desarrollan TVP aproximadamente 1 millón de personas en los EE.UU., y otras 500.000 desarrollan EP, resultando mortal en un 30% de los casos. En general, aproximadamente dos terceras partes de todos los casos de TEV requieren hospitalización. En un estudio realizado entre 66.000 pacientes con cáncer neutropénico en adultos, la tasa de mortalidad entre los pacientes hospitalizados era sustancialmente más elevada entre aquellos que desarrollaron TEV (14,85%) en comparación con lo que no lo desarrollaron (7,98%). El TEV también se considera responsable del 46,3% de todas las muertes posteriores a una intervención quirúrgica por cáncer. En el Reino Unido, el Gobierno ha calculado que se producen más de 25.000 muertes cada año provocadas por TEV, una cifra superior a la de la suma del número de fallecimientos provocados por cáncer de mama, VIH, y accidentes de tráfico. Está previsto que aumente el número de casos de lEV, debido al envejecimiento de la población en general y a la mayor exposición a factores de riesgo, como la cirugía, los anticonceptivos orales, los viajes de larga distancia y unos niveles de obesidad más elevados.
La deficiencia de plasminógeno es un trastorno muy conocido, que hace que unos niveles reducidos de plasminógeno causen el desarrollo de pseudo-membranas en las superficies de las mucosas. Uno de estos problemas es la conjuntivitis leñosa. La conjuntivitis leñosa es otro ejemplo de una enfermedad en la que se da una coagulación peligrosa. Los pacientes pediátricos que presentan una mutación que provoca una deficiencia de plasminógeno homocigótico tienen como expresión fenotípica una membrana sobre sus ojos (conjuntivitis leñosa) provocada por la coagulación, que causa la formación de coágulos de fibrina. Estas lesiones oculares pseudo-membranosas pueden provocar problemas oculares crónicos, que pueden resultar graves, hasta el punto de una pérdida de visión prácticamente completa. En 2003, se describieron más de 100 casos de niños de todo el mundo que padecían esta afección, pero en los últimos años se han identificado muchos más. El tratamiento actual consiste en raspados frecuentes de la córnea. No obstante, estas manipulaciones quirúrgicas no ofrecen un alivio duradero, y el remodelado de las capas de la superficie epitelial puede causar daños permanentes que afecten a la función ocular. El avance de la enfermedad a largo plazo, aun cuando se efectúe esta retirada física intermitente, puede provocar en los niños
afectados un menor desarrollo físico y dificultades en el proceso de aprendizaje. De este modo, aparte del importante sufrimiento físico padecido por cada individuo, se trata de un problema muy grave, que afecta enormemente a la salud del niño a lo largo de toda su vida. Seria muy deseable que se concibiese un método no invasivo que preserve la vista de estos pacientes. Se desconoce el número actual de pacientes afectados por la conjuntivitis leñosa. Sin embargo, en un estudio realizado en 1996 se demostró que la prevalencia de la deficiencia de plasminógeno heterocigótico de tipo I era del 0,25% (25 de 9611 sujetos) , lo que se corresponde con una prevalencia del compuesto homocigótico/heterocigótico de 1,6 por cada 1.000.000 habitantes. Los tratamientos por vía tópica mediante corticosteroides, hialuronidasa y antibióticos han tenido un éxito variable. Normalmente, suele llevarse a cabo una intervención quirúrgica para extirpar la masa leñosa, pero sirve de poco para impedir la recurrencia del problema, por lo que es necesario repetir el procedimiento.
El Síndrome de Dificultad Respiratoria (SDR) es un trastorno común que implica la existencia de fibrosis pulmonar. Aproximadamente un 1% de todos los niños nacen con un peso inferior a 1.500 gramos, y la gran mayoría padece SDR. Los bebés con un peso inferior a 1.000 gramos en el momento del nacimiento tienen una incidencia muy elevada de SDR, y entre el 50 y el 80% de eslos niños lallecen o desarrollan displasia broncopulmonar (DBP). De hecho, el SDR sigue siendo la principal causa de mortalidad y morbilidad entre los recién nacidos prematuros. Aunque el uso de agentes tensioactivos ha reducido la gravedad y ha mejorado ligeramente la tasa de mortalidad causada por SDR en niños prematuros, sigue dándose una importante incidencia de SDR/DBP y de casos graves de DBP. Tanto en el caso de los niños como en el de los adultos, las infecciones, los factores medioambientales y los componentes genéticos pueden provocar episodios agudos de SDR que evolucionen a estados disfuncionales crónicos de la enfermedad, que implican una remodelación del tejido y de las estructuras pulmonares.
El daño pulmonar es una situación que ejerce un gran impacto sobre la calidad de vida, y que puede implicar un significativo riesgo de mortalidad. Las causas subyacentes conocidas de las lesiones pulmonares son consecuencia de factores tanto crónicos como agudos. Recientemente, se piensa de forma cada vez más extendida que los daños mecánicos provocados por un elevado estrés pulmonar contribuyen de forma importante a la aparición de lesiones pulmonares. El tratamiento de respiración asistida mediante ventilación mecánica puede provocar un trauma que fomente el avance de lesiones localizadas en pacientes con SDR agudo. Aunque un volumen tidal bajo puede ofrecer unos mejores resultados, la
mortalidad sigue resultando inaceptable mente elevada. De hecho, los ventiladores pueden provocar directamente daños pulmonares por sí mismos, y los informes están destacando actualmente los marcadores biológicos de las lesiones pulmonares asociadas a la ventilación. Tras las causas básicas que llevan a daños clínicos en los pulmones, se está dando una creciente concienciación de las asociaciones con nuevos mecanismos de interbloqueo. Desde hace muy poco está comprobándose cada vez más que la coagulación, desencadenada por una lesión pulmonar inicial, contribuye al desarrollo de una inflamación pulmonar y de fibrosis en casos de SOR agudo. El aumento del factor tisular (FT) es un marcador asociado al desarrollo del SOR. Durante algún tiempo se ha sabido que la deposición de fibrina alveolar puede predisponer a los bebés a complicaciones relacionadas con la DBP, aunque los daños relacionados con la fibrina durante el SDR/DBP no resultan siempre obvios, debido a su rápida separación del pulmón. No obstante, aún en ausencia de coágulos de fibrina entrecruzada, unos bajos niveles de productos de monómeros de fibrina interlieren con la función tensioactiva y coadyuvan a la remodelación de la superficie alveolar y a la fibrosis causada por la acumulación de fibroblastos. De forma parecida, se están admitiendo las relaciones entre las lesiones pulmonares inducidas por la ventilación y la coagulación. Una vez más, se sugiere que el aumento de la expresión del FT causado por la agresión ventilatoria es uno de los factores que contribuyen a las complicaciones causadas por trombos, y que provocan un aumento de los daños pulmonares. De hecho, el tratamiento de ventilación con un elevado volumen tidal puede causar coagulación pulmonar y sistémica asociada al FT en neo natos.
La coagulación sanguínea también puede provocar problemas con los dispositivos que se encuentran en contacto con la sangre, como los catéteres y stents. Estos dispositivos tienden a sufrir fallos provocados por la trombosis inducida por la superlicie. La coagulación es un importante problema clínico con los catéteres de acceso venoso central. Los catéteres se utilizan para extraer sangre y administrar medicamentos a numerosos pacientes afectados por diversos problemas que requieren acceso venoso frecuente y a largo plazo. En condiciones ideales, debería ser posible dejar un catéter colocado durante meses o incluso años, pero los catéteres se caracterizan por su proclividad hacia los coágulos. De hecho, en el caso de los niños, la mayoría de las trombosis están relacionadas con los catéteres. Por ejemplo, un 89% de las trombosis venosas y arteriales en neo natos implican la presencia de un catéter intravascular, y un 78% de las trombosis aórticas en niños están relacionadas con los catéteres. Un estudio llegaba a la conclusión de que la presencia de un catéter constituía el mayor factor de riesgo de trombosis en niños. En total, de los pacientes de todas las edades a los que se
aplican catéteres venosos, hasta un 26% sufren complicaciones trombóticas relacionadas con el catéter. Aunque el mecanismo de la trombosis inducida por la superficie no se ha llegado a elucidar por completo, se cree que la absorción de la proteína tiene lugar muy poco después de que la superficie entre en contacto con la sangre, y está seguida por una adherencia y activación de las plaquetas, así como de los leucocitos, lo que tiene como consecuencia en último término la formación de un coágulo. Los trombos formados en el interior dellumen de un catéter hacen que el catéter resulte inservible para la extracción de la sangre o la administración de líquidos y medicamentos. Los coágulos que se forman en la parte exterior del catéter pueden provocar una trombosis venosa profunda y embolización, y puede dañar la integridad del vaso, con los consiguientes dolores e inflamación. Ambas situaciones provocan incomodidad al paciente, alteran el cuidado médico del paciente y hacen que sean necesarios más recursos para su atención. El tratamiento de un catéter obstruido requiere una terapia trombolítica o la sustitución del catéter. El resultado es una mayor incomodidad e inconveniencia para el paciente, así como un mayor coste del tratamiento.
La sustitución de un catéter venoso central (CVC) es un procedimiento muy invasivo que hace que los pacientes experimenten dolores y tengan que sufrir estancias hospitalarias prolongadas, y que impide a los médicos disponer de tiempo suficiente para atender a otros pacientes, por causa de la cirugía sustitutiva. La atención al paciente también se degrada, ya que los tratamientos se interrumpen o cancelan debido al fallo de sus CVC. Los coágulos que se forman en los CVCs también pueden disgregarse y viajar a través del torrente sanguíneo hacia otras partes del organismo, causando graves complicaciones. Por lo tanto, estos coágulos pueden conducir a una prolongada estancia hospitalaria, a la interrupción del tratamiento esencial a los pacientes, a disfunciones neurocognitivas e incluso a la muerte.
Es de esperar que el envejecimiento de la población tenga como resultado un aumento de la incidencia de las enfermedades arteriales coronarias, insuficiencias cardíacas y accidentes cerebro-vasculares. Por lo tanto, también se espera que aumenten los problemas provocados por enfermedades relacionadas con la coagulación, la formación no deseada de coágulos en productos sanitarios y la coagulación durante las intervenciones médicas, lo que acarreará una pesada carga financiera para el sector de la sanidad.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 A es un gráfico de los valores de la constante de segundo orden (k2) para la inhibición de Ila por parte de ATH y el conjugado AT + H no covalenle, según los ejemplos de la presente invención.
La figura 1 B es un gráfico de los valores de la constante de segundo orden (k2) para la inhibición de Xa por parte de ATH y el conjugado AT + H no covalente, según los ejemplos de la presente invención .
La figura 2 es un gráfico que muestra el tiempo de retardo de la inhibición de la formación de fibrina inducida por Ila provocada por ATH y AT + H en presencia de endotelio, según los ejemplos de la presente invención ..
La figura 3A es un gráfico que muestra el tiempo de retardo de la inhibición de la formación de fibrina inducida por Ila ligada al heparán sulfato (HS), según los ejemplos de la presente invención.
La figura 38 es un gráfico que muestra el tiempo de retardo de la inhibición de la formación de fibrina inducida por Ila ligada a la trombomodulina (TM), según los ejemplos de la presente invención.
La figura 4A es un gráfico que muestra el tiempo de coagulación de muestras de plasma procedente de ratas tratadas con una solución tampón de P8S intrapulmonar, con y sin un elevado volumen de ventilación mecánica durante una hora, según los ejemplos de la presente invención.
La figura 48 es un gráfico que muestra el tiempo de coagulación de muestras de plasma procedente de ratas tratadas con ATH intrapulmonar, con y sin un elevado volumen de ventilación mecánica durante una hora, según los ejemplos de la presente invención.
La figura 5 muestra inmunotransferencias de medios celulares incubados con una solución tampón (de control) o con ATH, según los ejemplos de la presente invención.
Cabe señalar que las figuras no constituyen sino meros ejemplos de diversas realizaciones, y no pretenden establecer limitación alguna al alcance de la presente tecnología.
Descripción detallada
A continuación se hará referencia a una serie de ejemplos de realización, y se utilizará un lenguaje específico para describirlos. No obstante, ha de entenderse que ello no pretende introducir limitación alguna en el alcance de la invención. Cualesquiera alteraciones y modificaciones adicionales de las características de la invención que se describen en el
presente documento, así como las aplicaciones adicionales de los principios de la tecnología que aquí se describen, y que podrían ocurrírsele a cualquier experto en la técnica que se encuentre en posesión de esta invención, han de considerarse incluidas dentro del alcance de la invención. Asimismo, antes de pasar a revelar y describir las realizaciones específicas, ha de entenderse que dicha revelación no se limita al proceso y materiales especificas que se describen en el presente documento, ya que pueden variar en cierta medida. También ha de entenderse que la terminología usada en este documento se utiliza tan sólo con el fin de describir unas realizaciones especificas, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que viene definida exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas y otras equivalentes a las mismas.
A la hora de describir y reivindicar la presente tecnología se utilizará la siguiente terminología.
Las formas en singular, "un," y "el" incluyen las referencias al plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Así pues, por ejemplo, la referencia a "un aditivo" incluye referencias a uno o más de dichos componentes, "una solución" incluye referencias a uno o más de dichos materiales, y "una fase de mezcla" se refiere a una o más de dichas fases.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "sustancial" cuando se usa en referencia a una cantidad de un material, o a una característica específica del mismo, se refiere a una cantidad suficiente para conseguir el efecto que pretende conseguir dicho material o característica. El grado exacto de desviación permisible puede depender en ocasiones del contexto específico.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "aproximadamente" se refiere a un grado de desviación basado en el error experimental característico de la propiedad especifica identificada. La latitud inherente al término "aproximadamente" dependerá del contexto específico y de la propiedad concreta, y podrá ser fácilmente percibida por cualquier experto en la técnica. El término "aproximadamente" no pretende expandir ni limitar el grado de equivalentes que en otro caso podrían asignarse a un valor específico. Además, a menos que se indique otra cosa, el término "aproximadamente" incluye expresamente "exactamente," en línea con lo que se comenta más abajo en relación con rangos y datos numéricos.
Las concentraciones, dimensiones, cantidades y otras magnitudes numéricas pueden adoptar en este documento un formato de rango. Ha de entenderse que dicho formato de rango se utiliza exclusivamente por fines de conveniencia y brevedad, y que ha de interpretarse de forma flexible, a fin de que incluya no sólo los valores numéricos explícitamente indicados como
límites del rango, sino también la totalidad de los valores numéricos individuales o sub-rangos incluidos en dicho rango, como si se enumerase explícitamente cada uno de los valores numéricos y sub-rangos. Por ejemplo, un rango que oscile desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 200 habrá de interpretarse de forma que incluya no sólo los límites explícitamente enumerados de 1 y 200, sino también magnitudes individuales, como 2, 3, 4, Y sub-rangos, como de lOa 50, de 20 a 100, etc.
Tal y como se utiliza en el presente documento, una pluralidad de componentes, elementos estructurales, elementos compositivos, y/o materiales puede presentarse por comodidad en una lista común. No obstante, dichas listas habrian de interpretarse como si cada uno de los integrantes de la lista se identificase individualmente como un integrante único y diferenciado. De este modo, no podrá interpretarse que ninguno de los integrantes individuales de dicha lista constituye un equivalente de facto a cualquier otro integrante de la misma lista, basándose exclusivamente en su presentación dentro de un grupo común sin que medie indicación alguna en otro sentido.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "hexosa" se refiere a un carbohidrato (CSH120 S) con seis átomos de carbono Las hexosas pueden ser aldohexosas, como por ejemplo, glucosa, manosa, galactosa, idosa, gulosa, talosa, alosa y altrosa, cuya forma de cadena abierta contiene un grupo aldehído. Alternativamente, las hexosas pueden ser cetosas, como fructosa, sorbosa, alulosa y tagatosa, cuya forma de cadena abierta contiene un grupo cetona.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "ácido urónico" se refiere al ácido carboxílico formado por la oxidación del grupo hidroxilo primario de un carbohidrato, y normalmente reciben su nombre del carbohidrato del que se han obtenido. Por lo tanto, mediante la oxidación del hidroxilo C6 de la glucosa se obtiene ácido glucurónico, con la del hidroxilo CS de la galactosa se obtiene ácido galacturónico, y mediante la oxidación del hidroxilo CS de la idosa se obtiene ácido idurónico
Tal y como se utiliza en el presente documento, "hexosamina" se refiere a un derivado de la hexosa en el que al menos un grupo hidroxilo, normalmente el grupo hidroxilo C2, ha sido sustituido por una amina. La amina puede haber sido opcionalmente alquilada, acilada (por ejemplo, con ácido murámico), normalmente mediante un grupo acetilo, sulfonada (N-sulfatada), sulfonilada, fosforilada, fosfonilada y similares. Entre los ejemplos representativos de las hexosaminas se encuentran la glucosamina, la galactosamina, la tagatosamina, la fructosamina, sus análogos modificados y similares.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "glicosaminoglicano" se refiere a cadenas lineales largamente repetitivas de unidades de disacáridos que contienen una hexosamina y un ácido urónico. Las identidades precisas de la hexosamina y del ácido urónico pueden experimentar grandes variaciones, y en las anteriores definiciones pueden encontrarse ejemplos representativos de cada una. Opcionalmente, el disacárido puede modificarse mediante alquilación, acilación, sulfonación (0-o N-sulfatado), sulfonilación, fosforilación, fosfonilación y similares. El grado de dicha modificación puede variar mucho, y puede encontrarse en un grupo hidroxilo o en un grupo amino Normalmente, el hidroxilo e6 y la amina C2 están sulfatados. La longitud de la cadena puede ser variable, y el glicosaminoglicano puede tener un peso molecular superior a 200.000 daltons, normalmente de hasta 100.000 daltons, y más normalmente, inferior a 50.000 daltons. Los glicosaminoglicanos pueden encontrarse normalmente como mucopolisacáridos. Entre los ejemplos más representativos se encuentran la heparina, el sulfato de dermatán, el sulfato de heparán, el condroitín-6-sulfato, el condroitín-4sulfato, el sulfato de queratán, el condroitín, el ácido hialurónico, polímeros que contienen Nacetil monosacáridos (como el ácido N-acetilneuramínico, la N-acetil glucosamina, la N-acetil galactosamina, y el ácido N-acetil murámico) y similares, así como gomas, como la goma arábiga, la goma tragacanto y similares.
La "heparina" es un polisacárido sulfatado que en buena medida consiste en una secuencia alternante de ácido hexaurónico y 2-amino-2-desoxi-D-glucosa. La heparina y un compuesto relacionado con ella, el dermatán sulfato, funcionan apropiadamente como anticoagulantes de uso clínico en la prevención de la trombosis y enfermedades relacionadas. Son miembros de la familia de los glicosaminoglicanos, (GAGs), que son cadenas lineales de unidades de disacáridos repetitivos sulfatados que contienen una hexosamina y un ácido urónico. La anticoagulación mediante GAGs (como la heparina y el dermatán sulfato) se lleva a cabo mediante sus catálisis de inhibición de enzimas coagulantes (siendo una de las más importantes la trombina) mediante inhibidores de la serina proteasa (serpinas) como la antitrombina 111 (denominada simplemente "antitrombina" o "AT" en este documento) y el cofactor 11 de la heparina (HCII). El enlace de las serpinas por los catalizadores tiene lugar por acción las anteriores, y se produce mediante secuencias específicas a lo largo de la cadena lineal de carbohidratos del glicosaminoglicano (GAG). La heparina actúa uniéndose a la Al mediante una secuencia de pentasacáridos, potenciando de esta forma la inhibición de diversas enzimas coagulantes (en el caso de la trombina, la heparina también se une a la enzima). La heparina también puede potenciar la inhibición de la trombina mediante su enlace con la
serpina HCI!. El dermatán sulfato actúa enlazándose específicamente al HCII mediante una secuencia de hexasacáridos, potenciando de este modo tan sólo la inhibición de la trombina. Teniendo en cuenta que los glicosaminoglicanos (especialmente, la heparina) pueden unirse a otras moléculas in vivo o perderse del emplazamiento de la acción a causa de diversos mecanismos, resultaría ventajoso mantener a los GAG permanentemente asociados a la serpina mediante un enlace covalente. De forma más detallada, resultaría deseable proporcionar conjugados covalentes de heparina y glicosaminoglicanos semejantes que conservan una elevada actividad biológica (por ejemplo, su actividad anticoagulante) y unas mejores propiedades farmacocinéticas, así como unos métodos sencillos de preparación.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "proteína" incluye, entre otras, las albúminas, globulinas (por ejemplo, inmunoglobulinas), histonas, lectinas, protaminas, prolaminas, glutelinasfosfolipasas, proteínas antibióticas y escleroproteínas, así como proteínas conjugadas, como fosfoproteínas, cromoproteínas, lipoproteínas, glicoproteínas y nucleoproteínas.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "serpina" se refiere a un inhibidor de la serina proteasa, y entre sus ejemplos se encuentran especies como la antitrombina y el cofactor I1 de la heparina.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "amina" se refiere a aminas primarias, RNH2, aminas secundarias, RNH(RI, y aminas terciarias, RN(R')(R").
Tal y como se utiliza en el presente documento, "amino" se refiere al grupo NH o NH2•
Tal y como se utiliza en el presente documento, "imina" se refiere al grupo C=N y a sus sales.
Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos ''tratamiento'' de una condición y/o de una enfermedad en un mamífero, significa: la prevención de dicha condición o enfermedad, es decir, evitar cualquier tipo de síntomas clínicos de la enfermedad; inhibición de la condición o enfermedad, es decir, detener el desarrollo o el avance de los síntomas clínicos; y/o aliviar la condición o enfermedad, es decir, provocar el retroceso de los síntomas clínicos. Tratamiento también incluye la utilización de las composiciones según la presente invención asociadas a un procedimiento médico, administrándose antes, durante o después de dicho procedimiento médico.
De acuerdo con la información preliminar descrita anteriormente, la presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de las afecciones que implican coagulación. En un ejemplo, un método de revestimiento de una superficie polimérica con un
conjugado de antitrombina-heparina puede incluir el poner en contacto la superficie polimérica con una solución del conjugado de antitrombina-heparina. El conjugado de antitrombinaheparina puede revestir directamente la superficie de poliuretano sin ningún grupo ligante entre el conjugado de antitrombina-heparina y la superficie polimérica.
En otro ejemplo, un producto sanitario con una reducida trombogenicidad puede incluir una superficie polimérica revestida con un conjugado de antitrombina-heparina sin grupos ligantes entre el conjugado de antitrombina-heparina y la superficie polimérica.
En un ejemplo adicional, un método de revestimiento de una superficie polimérica de un producto sanitario mediante liofilización puede incluir la puesta en contacto de la superficie polimérica del producto sanitario con una solución de antitrombina-heparina que comprenda un conjugado de antitrombina-heparina y un disolvente, en ausencia de grupos ligantes. De ese modo, el exceso de solución de antitrombina-heparina puede eliminarse de la superficie polimérica dejando que se seque. A continuación puede evaporarse el disolvente de la superficie polimérica, en un vacío al menos parcial.
Un ejemplo adicional implica un método de tratamiento de una afección médica mediante la inhibición de la trombogénesis en un mamífero. El método puede incluir la administración al mamífero de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina, en la que al menos un 98% de las cadenas de heparina del conjugado de antitrombina-heparina tienen un peso molecular superior a 3.000 daltons.
En otro ejemplo, un método de tratamiento de la conjuntivitis leñosa en un mamífero puede incluir la administración de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina en uno de los ojos del mamífero.
En otro ejemplo adicional, un método de tratamiento de una lesión causada a un mamífero por la ventilación mecánica puede incluir la administración de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina en el pulmón lesionado del mamífero.
En un ejemplo adicional, un método de tratamiento de la gingivitis leñosa en un mamífero puede incluir la administración de una dosis de un conjugado de antitrombinaheparina en las encías del mamífero.
En un ejemplo independiente, una solución de lavado y sellado de un catéter intravenoso o intra-arterial puede incluir un conjugado de antitrombina-heparina.
Otro ejemplo se refiere a un método para el mantenimiento de la permeabilidad de un catéter. El método puede incluir la inserción de un catéter en una vena o arteria de un paciente, de forma que se abra una abertura interior del catéter en el interior de la vena o arteria,
abriéndose una abertura exterior del catéter en el exterior del paciente. Puede inyectarse en el catéter una solución que contenga un conjugado de antitrombina-heparina a través de la abertura exterior del catéter. A continuación, la abertura exterior del catéter puede precintarse, de forma que al menos una parte de la solución que comprende el conjugado de antitrombinaheparina permanezca en el interior del catéter.
En otro ejemplo adicional, una composición para el tratamiento de coágulos de sangre puede incluir antitrombina, heparina, y fibrina. Al menos un 50 % en peso de la heparina puede conjugarse con antitrombina para la obtención de un conjugado de antitrombina-heparina. Al menos una porción de la fibrina puede adherirse al conjugado de antitrombina-heparina.
En otro ejemplo, un método para el tratamiento de una afección o enfermedad puede incluir la administración, a un mamífero que lo precise, de un conjugado de antitrombinaheparina preparado de acuerdo con los ejemplos de la tecnología actual. De forma más detallada, estos tratamientos pueden llevarse a cabo mediante la administración de los conjugados de heparina y antitrombina de la presente invención a un paciente, como un ser humano, que necesite dicho tratamiento. Las afecciones y enfermedades que pueden ser tratadas mediante la utilización de las composiciones de conjugados que se describen en el presente documento incluyen los infartos de miocardio y una gran variedad de estados trombÓticos. Entre estos se encuentran los depósitos de fibrina en el caso del síndrome de dificultad respiratoria neonatal, el síndrome de dificultad respiratoria en adultos, carcinoma primario del pulmón, linfomas no-Hodgkins, alveolitis fibrosante, y transplantes de pulmón, por nombrar tan sólo unos cuantos. Igualmente, mediante la presente invención pueden tratarse los estados de deficiencia adquirida de AT, como el síndrome de dificultad respiratoria neonatal, la deficiencia inducida por la L-asparaginasa, la deficiencia inducida por un bypass cardiopulmonar, la sepsis o los estados de deficiencia congénita de AT. En el caso de la deficiencia congénita de AT, pueden producirse complicaciones trombóticas que representen una amenaza para la vida, con unos niveles de AT inferiores a 0,25 Unidades/mi en heterozigotos que requieran AT más heparina, en hasta 1 o 2 niños al año en los EE.UU. Las afecciones y enfermedades tratadas mediante la presente invención incluyen aquellas que se caracterizan por un exceso de generación o actividad de la trombina. A menudo se producen estas condiciones cuando el paciente se ha visto expuesto a un trauma, por ejemplo en el caso de los pacientes quirúrgicos. Los traumas provocados por las heridas o la cirugía generan daños vasculares y la activación secundaria de la coagulación de la sangre. Estos efectos no deseables pueden darse tras una intervención de cirugía general u ortopédica, cirugía
ginecológica, cirugía cardíaca o vascular, u otros procedimientos quirúrgicos. Un exceso de trombina también puede complicar la evolución de enfermedades naturales, como la arterioesclerosis, lo que puede ser causa de ataques cardíacos, accidentes cerebro-vasculares
o gangrena de los miembros. Por lo tanto, los métodos y composiciones de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento, la prevención o la inhibición de diversas complicaciones cardiovasculares, incluyendo angina inestable, infarto de miocardio agudo (ataque cardíaco), accidentes cerebro-vasculares (ictus), embolismos pulmonares, trombosis venosa profunda, trombosis arterial, etc. Las composiciones y métodos de la invención se pueden utilizar para reducir o prevenir la coagulación durante la diálisis y reducir o prevenir la coagulación intravascular durante los procedimientos quirúrgicos a corazón abierto. De forma más detallada, en algunos aspectos de la invención , se facilitan métodos y composiciones para prevenir o inhibir la generación de trombina o su actividad en pacientes con un mayor riesgo de desarrollo de trombos, a causa de afecciones médicas que perturban la hemostasis (por ejemplo, enfermedad arterial coronaria, arterioesclerosis, etc.). En otro aspecto, se facilitan métodos y composiciones para pacientes que sufran un mayor riesgo de desarrollar un trombo con posterioridad a un procedimiento médico, como cirugía cardíaca, cirugía vascular o intervenciones coronarias percutáneas. En una realización , se utilizan los métodos y composiciones de la presente invención para procedimientos quirúrgicos de bypass cardiopulmonar. Las composiciones se pueden administrar antes, durante y después de dicho procedimiento.
Volviendo ahora al conjugado de antitrombina-heparina utilizado en las composiciones y tratamientos que se describen en la presente invención, el conjugado de antitrombina-heparina aporta diversas ventajas como anti-trombótico frente a la heparina.
El conjugado de antitrombina-heparina (ATH) puede prepararse mediante una unión covalente de cadenas de heparina a la antitrombina (AT). La heparina contiene enlaces terminales de aldosa que coexisten en equilibrio entre las formas hemiacetal y aldehído. La heparina puede conjugarse con la antitrombina mediante la reducción de la base de Schiff simple formada espontáneamente entre el aldeh ído de la aldosa terminal de la heparina y un amino lisil O N-terminal de la antitrombina. La heparina queda sin modificarse (sin reducir sus actividades) con anterioridad a la conjugación, y se une en un emplazamiento específico en uno de los extremos de la molécula sin ningún grupo de activación no bloqueado ni intercambio de enlaces de la antitrombina.
Normalmente, la reacción se lleva a cabo a un pH de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 9, o de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8, o incluso de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8. La reacción tiene lugar por lo general en medio acuoso. No obstante, los medios orgánicos, y especialmente los disolventes orgánicos hidrófilos polares, como los alcoholes, éteres, formamidas y similares se pueden utilizar en unas proporciones de hasta aproximadamente un 40% para aumentar la solubilidad o reactividad de los reactivos, si fuese necesario. También pueden utilizarse amortiguadores no nucleófilos, como fosfato, acetato, bicarbonato y similares.
Las iminas formadas por la condensación de las aminas de la AT con los residuos de la heparina de la aldosa terminal pueden reducirse y obtenerse las correspondientes aminas. Esta reducción puede llevarse a cabo simultáneamente con la formación de la imina o con posterioridad a esta. Puede utilizarse una amplia gama de agentes reductores, con agentes reductores de los hidruros, siendo ejemplos específicos útiles el borohidruro de sodio o el cianoborohidruro de sodio. En general, puede utilizarse cualquier agente reductor que no reduzca los enlaces disulfuro.
Alternativamente, si no se desea la reducción de la imina intermedia, la imina puede incubarse durante un período de tiempo suficiente, generalmente de un día a un mes, más generalmente de entre 3 días y 2 semanas, a fin de permitir la transposición de Amadori en la amina intermedia. Los residuos de aldosa terminal de la heparina conjugada mediante los métodos descritos en esta invención pueden poseer grupos hidroxilo C2 en el residuo de aldosa terminal, es decir, una fracción 2-hidroxi carbonil que se convierte en una imina 2-hidroxi por condensación con la amina de la AT conjugada con la heparina. En la transposición de Amadori, la imina a-hidroxi (imina en C1, hidroxi en C2) formada por la condensación inicial puede transponerse para formar una a-cetoamina por enolización y reprotonación (ceto en C2, amina en C1 ). La amina a-carbonil resultante se ve favorecida termodinámicamente con respecto a la imina precursora a-hidroxi, facilitando de este modo un aditivo estable con una mínima disrupción de la cadena heparina. De este modo, la heparina puede conjugarse covalentemente en el C1 del residuo de la aldosa terminal de la heparina para obtener una cadena de AT que contiene aminas mediante un enlace con amina. Pueden formarse complejos covalentes simplemente mezclando heparina y AT en una solución tampón y dejando que se forme espontáneamente una ceto-amina a través de una transposición de Amadori entre el terminal aldosa de la heparina y una lisil-AT o grupo amino N-terminal. De este modo, la transposición de Amadori se puede utilizar para elaborar conjugados de heparina con AT. Este
método de conjugación resulta especialmente útil y sencillo, y minimiza la modificación del glicosaminoglicano, maximizando de este modo el mantenimiento de su actividad biológica.
En algunos casos, el conjugado de antitrombina-heparina puede prepararse utilizando heparina no fraccionada. En otros casos, el conjugado de antitrombina-heparina puede prepararse utilizando heparina de la cual se hayan eliminado las cadenas de heparina de bajo peso molecular. Como ya se sabe, la heparina puede obtenerse con facilidad en forma no fraccionada, que contiene moléculas con una amplia gama de pesos moleculares. Al eliminar la mayor parte o la totalidad de las moléculas de heparina con unos pesos moleculares inferiores a 3.000 daltons con anterioridad a la conjugación de la heparina con la antitrombina, puede mejorarse la actividad del conjugado de antitrombina-heparina. En una realización adicional, las moléculas de heparina con un peso molecular inferior a 5.000 daltons pueden eliminarse en su mayoria o completamente con anterioridad a su conjugación con antitrombina.
Los conjugados de antitrombina-heparina formados utilizando heparina de la que se han eliminado las moléculas de heparina de bajo peso molecular difieren en su composición de otros conjugados de antitrombina-heparina. Las cadenas de heparina de bajo peso molecular pueden eliminarse de la heparina con anterioridad a su reacción con la AT para sintetizar el conjugado de antitrombina-heparina (ATH). Por lo tanto, se eliminan de la ATH las cadenas de heparina de bajo peso molecular conjugadas con la AT.
Las cadenas de heparina de bajo peso molecular pueden eliminarse de la heparina disponible comercialmente antes de hacer reaccionar la heparina con la AT para obtener el ATH. De este modo se obtiene un ATH cuya composición difiere de la del ATH formado a partir de la heparina no fraccionada sin eliminar las heparinas de bajo peso molecular antes de su reacción con la AT. Adicionalmente, la formación del ATH a partir de heparina no fraccionada y la posterior eliminación de los conjugados de ATH de bajo peso molecular, no permite obtener el mismo producto que el ATH de la presente invención. Sin tener que aferrarse a ninguna teoria específica, se cree que las cadenas de heparina de bajo peso molecular (como las de menos de 3.000 daltons o menos de 5.000 daltons) compiten con las heparinas de cadena más larga por la conjugación con la AT. Las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tienen una elevada proporción de terminales aldosa que reaccionan con la AT. Por lo tanto, las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tienden a conjugarse con la AT con mayor rapidez, superando a las cadenas de heparina con un mayor peso molecular. No obstante una vez que las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular se enlazan a la AT, las cadenas dejan de tener suficientes huecos o longitud para los enlaces de la trombina y el Factor Xa, una
enzima que participa en la cascada de coagulación. La actividad inhibitoria frente al factor Xa y la trombina desciende de forma dramática en el rango de moléculas de heparina de menor peso molecular. De este modo, el ATH formado a partir de estas cadenas de heparina de muy bajo peso molecular tiene esencialmente cero actividad para la prevención de la trombogénesis. Aunque la heparina de grado comercial contiene un porcentaje relativamente pequeño de cadenas de heparina de menos de 5.000 Daltons, estas cadenas de heparina de muy bajo peso molecular presentan una reactividad con la AT tan elevada que una cantidad muy importante del ATH formado contiene cadenas de heparina de muy bajo peso molecular.
Si no se elimina la heparina de muy bajo peso molecular con anterioridad a la conjugación, habrá una mayor proporción de terminales reactivos en esta población frente a la de la heparina con un peso molecular más elevado, lo que superará al resto de las moléculas de heparina en una proporción variable a lo largo de todo el espectro de pesos moleculares (ya que la proporción de terminales aldosa varía de forma continua a lo largo de toda la gama de pesos moleculares de heparina). Esto puede tener un efecto adverso sobre el ATH final. En primer lugar, el ATH contendrá una significativa población de moléculas de ATH que contengan cadenas de heparina muy pequeñas sin actividad. En segundo lugar, el resto de moléculas de ATH (aparte de este rango de moléculas de ATH de muy bajo peso molecular) contendrá una población de heparina con una reducida proporción de cadenas de heparina situada en unos rangos discretos de pesos moleculares y que tengan menos terminales aldosa para competir con las cadenas inactivas de heparina de bajo peso molecular. Este tipo de heparina baja en aldosa suele tener cadenas mucho más largas, pero no está enteramente definido por una relación directa entre la longitud de las cadenas de heparina y los terminales aldosa necesarios para en lazarse a la AT.
Además, la heparina con al menos 18 unidades de monosacáridos puede ser más eficaz en la inhibición de la trombina. Se utilizan al menos 18 unidades de monosacáridos para unir la antitrombina y la trombina. El mecanismo mediante el cual la heparina se une a la antitrombina y la trombina se denomina mecanismo de plantilla o puente. La heparina puede ejercer su efecto a través de su activación conformacional enlazándose a la AT y convirtiendo de forma alostérica la Al en una forma estructural que es mucho más reactiva frente a las proteasas de la coagulación. Alternativamente, la heparina puede actuar como una plantilla, enlazándose tanto con el inhibidor como con la enzima, localizando de este modo las moléculas para la reacción. En este mecanismo se produce la activación conformacional de la Al mediante la heparina, pero la mejora adicional de la tasa de reacción se obtiene mediante el enlace
simultáneo de la heparina con la enzima, colaborando de este modo al acercamiento del factor de coagulación al inhibidor activado. La longitud mínima específica de la cadena de 18 monosacáridos puede explicar por qué se produce una caída muy brusca en la actividad frente a la trombina dentro de la fracción de heparina con un menor peso molecular. Partiendo de la
5 estructura correspondiente a un ácido urónico monosulfatado-disacárido de glucosamina heparina bisulfatado, es decir, sin el sodio ni otros iones que puedan encontrarse en un formato de sal, el peso molecular de una cadena de 18 sacáridos (9 disacáridos) estaría situado en torno a 4.500 daltons.
Las cadenas de heparina con un peso molecular algo menor pueden resultar útiles para
10 la inhibición del factor Xa. Una secuencia específica de pentasacárido de la heparina puede unirse a la AT y activar la AT para la inhibición del factor Xa. La secuencia de pentasacárido específica está disponible por sí misma como el fármaco "Fondaparinux," pero la secuencia también puede darse en cadenas de heparina. la secuencia de monosacáridos se muestra en la fórmula 1:
o
COO·
HN, _
OH SO, O
~o
HN, . OSO;
SO,
(1)
De este modo, las cadenas de heparina que contengan menos de 18 monosacáridos que a su vez contengan esta secuencia de pentasacárido pueden ser capaces de activar la AT para
20 inhibir el factor Xa aun cuando las cadenas no sean lo suficientemente largas como para unirse a la AT y la trombina.
En algunos casos, las cadenas de heparina más largas pueden presentar la mayor actividad inhibitoria. No obstante, algunas cadenas de heparina de pesos moleculares medios y bajos pueden presentar unas tasas significativamente menos indeseables de enlace con otras 25 proteínas del plasma y plaquetas. Por lo tanto, estas cadenas de heparína de típo medía pueden ser más selectivas para la inhibición de la trombina y del factor Xa sin causar efectos
'"
colaterales no deseados, como disfunciones de las plaquetas, al dejar de unirse a las plaquetas y unirse a otros materiales.
El aislamiento del ATH de mayor peso molecular tras la conjugación, para obtener un ATH de cadena muy larga proporciona un producto diferente y menos deseable en comparación con la presente invención, que separa (sustancialmente o en su totalidad) la heparina con anterioridad a la conjugación. Por ejemplo, la proporción de 2 moléculas de pentasacáridos de elevada actividad en esta sub-población puede alterarse a causa de una capacidad diferencial de estas cadenas de elevada actividad para competir por la conjugación con las heparinas de muy bajo peso molecular. Adicionalmente, el aislamiento del ATH de peso molecular elevado tras la conjugación elimina las moléculas de ATH con cadenas de heparina medianas y pequeñas, que también están activas y presentan otras características deseables, como los enlaces reducidos no selectivos con las proteínas del plasma y las plaquetas.
Alternativamente, los intentos de hacer reaccionar con la AT todas las cadenas de heparina con terminales aldosa incrementando la proporción de AT frente a heparina en la mezcla de la reacción no tienen grandes posibilidades de éxito, ya que muchos experimentos han demostrado que se obtiene tan sólo una tasa máxima de conversión de AT en ATH del 60 % en peso, aún cuando el contenido de aldosa de la heparina supere en varias veces las concentraciones prácticas más elevadas. Si se reduce aún más la proporción de heparina frente a la AT disminuirá aún más el rendimiento del ATH, sin ninguna promesa de que vaya a incorporarse al producto la totalidad de las cadenas activas más largas.
En algunas realizaciones, una composición para la prevención de la trombogénesis puede contener ATH obtenido a partir de heparina de grado comercial, de la cual se haya eliminado la práctica totalidad de las cadenas de heparina con un peso molecular inferior a
3.000 daltons (por ejemplo, al menos un 98 % en peso del resto de las cadenas de heparina puede tener un peso molecular superior a 3.000 daltons). En otras realizaciones, las cadenas de heparina con un peso molecular inferior a 5.000 daltons pueden eliminarse sustancial o totalmente. De este modo, el producto ATH puede contener cadenas de heparina cuyo peso molecular oscile entre 3.000 daltons (o 5.000 daltons) y los pesos moleculares más elevados que contiene la heparina comercial. En algunos ejemplos, este rango de pesos moleculares puede oscilar entre 3.000 daltans y 50.000 daltans, a entre 5.000 daltans y 50.000 daltans. En los ejemplos adicionales, al menos una porción de las cadenas de heparina pueden encontrarse en un rango medio de pesos moleculares. Por ejemplo, al menos una porción de las cadenas de heparina del ATH puede tener un peso molecular que oscile entre 3.000 daltons y 30.000
dallans, enlre 3.000 dallans y 20.000 dallans, enlre 3.000 dallans y 15.000 dallans, enlre 3.000 dallans y 10.000 dallans, enlre 5.000 dallans y 30.000 dallans, enlre 5.000 dallans y 20.000 daltons, entre 5.000 aaltons y 15.000 daltons, o entre 5.000 daltons y 10.000 daltons. De este modo, puede eliminarse del ATH la totalidad o la práctica totalidad de las cadenas de heparina cuyo peso molecular sea inferior a 3.000 Daltons o 5.000 Daltons.
Normalmente, la heparina comercial puede contener una serie de cadenas de heparina cuyos pesos moleculares oscilen entre 1.000 daltons o menos y 50.000 daltons o más. La fracción de menor peso molecular, como las cadenas cuyo peso molecular es inferior a 3.000 o
5.000 daltons, pueden eliminarse mediante cualquier método adecuado. Entre algunos de los métodos de eliminación de las cadenas de bajo peso molecular se encuentran la diálisis, la diafiltración, la filtración mediante gel y la electroforesis. La diálisis y la diafiltración pueden llevarse a cabo en condiciones de elevada salinidad. Por ejemplo, entre las condiciones elevada salinidad para la diálisis o la diafiltración se encuentran las concentraciones salinas de entre aproximadamente NaCI 1 M Y aproximadamente NaCI 4 M. También pueden utilizarse otras sales distintas del NaCI. La elevada concentración salina puede ayudar a que las cadenas pequeñas se desplacen a través de membranas con unos tamaños de poro adecuados. La filtración mediante gel puede llevarse a cabo utilizando unos medios adecuados para la separación de moléculas en función de su tamaño. En un ejemplo concreto, el filtrado mediante gel puede llevarse a cabo en SephadeX® G-200, que es un medio en forma de gel para la separación de moléculas con unos pesos moleculares que oscilan entre 1.000 y 200.000 daltons. La heparina comercial puede filtrarse mediante gel en una columna de gel, y una serie de fracciones se pueden eluir con las primeras fracciones que contienen las cadenas de mayor peso molecular y las posteriores fracciones que contienen unos pesos moleculares gradualmente inferiores. Pueden determinarse los pesos moleculares de la heparina de cada fracción, y pueden agruparse las fracciones que tengan los pesos moleculares deseados. Utilizando este método, pueden excluirse las fracciones que contengan heparina con unos pesos moleculares inferiores al umbral de 3.000 o 5.000 daltons. Si así se desea, las cadenas de heparina que superen un umbral determinado también pueden excluirse. Por ejemplo, las fracciones que contengan heparina con un peso molecular de más de 50.000 daltons, 30.000 daltons, 20.000 daltons, 15.000 daltons, o 10.000 daltons pueden excluirse, si así se desea. Las fracciones agrupadas que posean el rango deseado de pesos moleculares pueden utilizarse entonces para sintetizar el ATH.
Cabe señalar que los métodos de eliminación de las cadenas de heparina de muy bajo peso molecular que se han descrito más arriba constituyen tan sólo ejemplos, y no deberían considerarse exhaustivos. En la presente invención puede utilizarse cualquier método de tratamiento de la heparina comercial para la eliminación de las cadenas de heparina que se encuentren por debajo de un determinado umbral de peso molecular.
En varias realizaciones de la presente invención , los tratamientos y métodos que aquí se describen pueden llevarse a cabo utilizando ATH al que se le haya eliminado la heparina de bajo peso molecular, o alternativamente, utilizando ATH formado a partir de heparina no fraccionada.
El ATH puede formarse conjugando la AT con la heparina de la que se han retirado las cadenas de bajo peso molecular. Pueden encontrarse ejemplos de métodos de conjugación de la heparina con AT en la Patente de los EE.UU. N2 7.045.585, que queda incorporada al presente documento por referencia. Estos métodos pueden aplicarse a la formación de ATH utilizando heparina de la que se han eliminado las cadenas de muy bajo peso molecular, como se describe en este documento. La heparina puede conjugarse con AT mediante un sencillo proceso que consta de una sola etapa, y que permite el enlace covalente directo de la amina de una fracción que contenga aminas (como por ejemplo, entre otros, los oligo(poli)sacáridos que contienen aminas, los lípidos, proteínas, y ácidos nucleicos que contienen aminas, así como cualquier xenobiótico que contenga aminas) con un residuo de aldosa terminal de una cadena de heparina. Para la formación del ATH, la fracción que contiene aminas se encuentra presente en la AT, aunque pueden conjugarse otras proteínas utilizando los mismos métodos. Los métodos de mínimo procesamiento y no destructivos que aquí se describen permiten preservar al máximo la actividad biológica de la proteína y permiten el enlace directo de la proteína sin necesidad de grupos separadores intermedios.
En una realización, la heparina se incuba con AT a un pH adecuado para la formación de iminas entre la amina y el residuo de aldosa o cetosa terminal de la heparina. Los residuos terminales de aldosa y cetosa suelen existir en equilibrio entre la forma cíclica de anillo cerrado hemiacetal o hemicetal y los correspondientes equivalentes de aldehído o cetona de anillo abierto. Por lo general, las aminas son capaces de reaccionar con la forma de anillo abierto para producir una imina (base de Schiff). Normalmente, las aldosas son más reactivas debido a que los correspondientes aldehídos de la forma en anillo abierto son más reactivos frente a las aminas. Por lo tanto, la formación del conjugado covalente entre las aminas y los residuos de
aldosa terminal de la heparina permite un método de unión con la heparina de la AT que contiene una amina.
Normalmente, la reacción se lleva a cabo a un pH situado entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 9, y más normalmente de entre aproximadamente 5 a aproximadamente 8, e incluso más normalmente, de entre aproximadamente 7 a aproximadamente 8. La reacción suele llevarse a cabo en un medio acuoso. No obstante, pueden emplearse medios orgánicos, y especialmente disolventes orgánicos hidrófilos polares, como alcoholes, éteres y fomamidas y similares, en unas proporciones de hasta un máximo aproximado del 40% para aumentar la solubilidad o reactividad de los reactivos, si fuese necesario. También pueden utilizarse soluciones tampón no nucleófilas, como fosfato, acetato, bicarbonato y similares.
En algunos casos, las iminas formadas por condensación de las aminas de la AT con los residuos de aldosa terminales de la heparina se reducen a las aminas correspondientes. Esta reducción puede llevarse a cabo simultáneamente con la formación de iminas o con posterioridad a la misma. Pueden utilizarse diversos agentes reductores, como agentes reductores de los hidruros, incluyendo borohidruro sódico o cianoborohidruro sódico. En un ejemplo, puede utilizarse cualquier agente reductor que nbo reduzca los enlaces disulfuro.
Alternativamente, si no se desea la reducción de la imina intermedia, la imina puede incubarse durante un período de tiempo suficiente, normalmente de entre un día y un mes, más normalmente entre 3 días y 2 semanas, para permitir que se lleve a cabo la transposición de Amadori en la imina intermedia. Los residuos de aldosa terminal de las heparinas conjugadas mediante los métodos que se describen en esta invención suelen poseer grupos hidroxilo C2 en el residuo de la aldosa terminal, es decir, una fracción 2-hidroxicarbonil que se convierte a una 2-hidroximina por condensación con la amina de la AT que está conjugándose con la heparina. En la transposición de Amadori, que resulta especialmente frecuente en los carbohidratos, la ahidroximina (imina en C1, hidroxi en C2) formada por la condensación inicial puede transponerse para formar una a-cetoamina mediante enolización y reprotonación (ceto en C2, amina en C1 )). La a-carbonilamina resultante se ve termodinámicamente favorecida frente a la a-hidroximina precursora, facilitando de este modo un aditivo estable con una mínima disrupción de la cadena de heparina. De este modo, en esta realización, la invención permite obtener una cadena de heparina conjugada de forma covalente en el C1 del residuo de aldosa terminal de la heparina con una amina que contenga AT, mediante un enlace amina. Si así se desea, el conjugado resultante puede reducirse o etiquetarse mediante reducción del grupo
carbonil C2 con un reactivo de etiquetado, como una radioetiqueta (por ejemplo, NaB3H4), o conjugarse con una segunda especie, como una etiqueta fluorescente.
Aunque la anterior descripción se centra en la heparina y la AT, existen diversas especies que contienen aminas y que pueden conjugarse para obtener diversos glicosaminoglicanos mediante los métodos que aquí se describen. La amina primaria puede encontrarse en una molécula pequeña, como por ejemplo, un fármaco o etiqueta fluorescente o cromofórica o una macromolécula, como por ejemplo, una proteína (anticuerpos, enzimas, receptores, factores de crecimiento y similares), un polinucleótido (ADN, ARN Y mezclas de sus polímeros), un lípido o un polisacárido. En general, cuando las proteínas se conjugan para formar glicosaminoglicanos, los enlaces se efectuarán a través de los grupos r.-amino de los residuos de lisina. Alternativamente, los enlaces también pueden llevarse a cabo mediante el grupo a-amino del residuo ácido del amilo terminal N. Además, pueden utilizarse otros muchos métodos conocidos para cualquier experto en la técnica para la introducción de una función amina en una macromolécula.
Concretamente, la presente tecnología puede aplicarse a una diversidad de otras proteínas terapéuticamente útiles cuando pueden resultar de utilidad consideraciones del tipo de promedio de vida más prolongado y coagulación de la sangre. Entre éstas se encuentran las enzimas de la sangre, los anticuerpos, las hormonas y similares, así como los activadores del plasminógeno con ellos relacionados, la estreptoquinasa y sus derivados. Concretamente, esta tecnología proporciona conjugados de heparina o dermatán sulfato con antitrombina, cofactor 11 de la heparina (HCII) o análogos del colactor II de la heparina.
Los métodos de la presente invención proporcionan conjugados de glicosaminoglicano con una máxima retención de la actividad biológica. Concretamente, se proporcionan conjugados de heparina o dermatán sulfato con AT o HCII, que poseen> 60 % en peso, normalmente > 90 % en peso, más normalmente> 95 % en peso, y sobre todo > 98 % en peso de actividad de antitrombina heparina intacta no conjugada. Los métodos de la presente invención proporcionan moléculas de heparina intactas conjugadas con antitrombina o cofactor 1I de la heparina. De este modo, se evita la pérdida de la actividad biológica asociada a la fragmentación o cualquier otra modificación de la heparina con anterioridad a la conjugación. Los conjugados de heparina de la invención retienen su actividad anticoagulante debido a su preparación a partir de heparina intacta. Por lo tanto, los métodos que aquí se describen pueden utilizarse para preparar conjugados activos de heparina añadiendo en primer lugar grupos ligantes y separadores a las especies que se quieren conjugar con heparina (o con el
glicosaminoglicano que se esté utilizando) y añadiéndolos posteriormente a la heparina. Se describen numerosos métodos de incorporación de grupos amino reactivos en otras moléculas y soportes sólidos en ellmmunoTechnology Catalog and Handbook, Pierce Chemical Company (1990), que queda incorporado por referencia. Por lo tanto, cualquier especie que posea grupos amino reactivos o que sea capaz de modificarse a fin de contener dichos grupos amino, mediante cualquier método conocido en la actualidad o que pueda conocerse en el futuro, puede conjugarse de forma covalente con glicosaminoglicanos, como la heparina, mediante los métodos que aquí se describen, y la totalidad de dichos conjugados queda contemplada por la presente invención.
Como se ha descrito anteriormente, la presente tecnología aprovecha el hecho de que la heparina nativa (aislada de la mucosa intestinal), así como el dermatán sulfato, ya contienen moléculas con aldosas terminales, que existirían en equilibrio entre las formas hemiacetal y aldehído. De este modo, la heparina o el dermatán sulfato pueden conjugarse para formar serpinas de antitrombina por reducción de la base de Schiff formada espontáneamente entre el aldehído terminal de la aldosa en la heparina o el dermatán sulfato y un amino de la serpina. La heparina o el dermatán sulfato quedan sin modificar (sin reducir sus actividades) antes de la conjugación, y se enlaza en un punto especifico de uno de los extremos de la molécula, sin que existan grupos de activación no bloqueados ni entrecruzamiento de la serpina.
En otro aspecto de la presente invención , pueden producirse complejos covalentes mezclando simplemente heparina y AT en una solución tampón y dejando que se forme espontáneamente una ceto-amina mediante una transposición de Amadori entre la aldosa terminal de la heparina y un grupo amino de la AT. De este modo, esta tecnología proporciona métodos de utilización de la transposición de Amadori para elaborar conjugados de glicosaminoglicanos con especies que contienen aminas, y sobre todo con proteinas. Este es un método de conjugación especialmente sencillo, que minimiza la modificación del glicosaminoglicano, maximizando de este modo la retención de su actividad biológica.
Otro aspecto de esta tecnología proporciona conjugados covalentes de glicosaminoglicanos, y especialmente de heparina, etiquetados en su extremo con una especie que contiene aminas en el residuo terminal de aldosa del glicosaminoglicano. Por ejemplo, la heparina y la AT pueden enlazarse directamente entre si de forma que la secuencia activa de pentasacárido para la AT en la heparina se encuentra muy cercana para su enlace. Este es uno de los motivos fundamentales de realización de un complejo heparina-AT covalente, ya que la heparina acelera la inhibición a través de la AT tan sólo en el caso de que la AT pueda enlazar
la secuencia activa. Resulta notable que el ATH tenga la propiedad exclusiva de que la H (heparina) del conjugado activa estequiométricamente la AT endógena mientras activa catalíticamente la AT exógena. Normalmente, una especie que contenga aminas se enlazará a cada glicosaminoglicano. No obstante, es evidente que puede reducirse la proporción entre las especies que contienen aminas y el glicosaminoglicano por debajo de la unidad, ajustando las proporciones molares de los reactivos o el tiempo de reacción.
Los glicosaminoglicanos se encuentran disponibles en diversas formas y pesos moleculares. Por ejemplo, la heparina es un mucopolisacárido, aislado a partir de intestinos de cerdo o pulmones bovinos, y es heterogénea con respecto al tamaño molecular y la estructura química. Consiste básicamente en residuos enlazados (1-4) de 2-amino-2-desoxi-a-Dgluopiranosil, y de ácido a-L-idopiranosilurónico con una cantidad relativamente reducida de residuos de ácido j3-D-glucopiranosilurónico. Los grupos hidroxilo y amina se derivan en diversos grados mediante sulfatación yacetilación.
Las moléculas de heparina también se pueden clasificar en función de su contenido en pentasacárido. Alrededor de una tercera parte de la heparina contiene cadenas con una copia del pentasacárido único con una elevada afinidad por la AT, mientras que una proporción mucho más reducida (calculada en torno al 1% de la heparina total) consiste en cadenas que contienen más de una copia del pentasacárido de elevada afinidad. El resto (aproximadamente 66%) de la heparina no contiene el pentasacárido. De este modo, la denominada "heparina estándar" constituye una mezcla de las tres especies, la heparina de "baja afinidad" que carece de una copia del pentasacárido, la heparina de "alta afinidad", que está enriquecida para las especies que contienen al menos una copia del pentasacárido, y la heparina de "muy alta afinidad" que se refiere aproximadamente al 1% de moléculas que contienen más de una copia del pentasacárido. Estas tres especies pueden separarse entre sí recurriendo a métodos cromatográficos rutinarios, como la cromatografía sobre una columna de afinidad de antitrombina.
Una ventaja de formar un conjugado entre heparina y una especie que contenga al menos un grupo amino primario (por ejemplo, AT) utilizando el proceso de glicación lenta que se describe en este documento es la aparente selección de cadenas de heparina con dos pentasacáridos. De este modo, por ejemplo, el ATH preparado conforme al método de esta invención parece estar enriquecido en lo que respecta a las especies de heparina que contienen dos pentasacáridos. Cuando la heparina estándar (que contiene aproximadamente un 1% de heparina formada por dos pentasacáridos) se utiliza como material de partida , por lo
general más del 10% del ATH resultante comprende heparina de dos pentasacáridos, con frecuencia más de un 20% aproximadamente, frecuentemente más del 35%, y más frecuentemente en torno al 50% del ATH comprende heparina de dos pentasacáridos.
Este enriquecimiento puede ser el responsable de una serie de propiedades útiles del ATH. El ATH de la presente invención activa la AT con la que está conjugado, de forma estequiométrica, pero activa la AT exógena de forma catalítica. De este modo, la heparina que se encuentra en el complejo ATH actúa catalíticamente, tanto cuando el ATH se administra como coagulante sistémico como cuando el ATH se utiliza para revestir las superficies y hacerlas no trombogénicas. Con el método de la invención se obtiene un complejo ATH con una actividad específica anti-factor Ila muy elevada. Además, la segunda cadena de pentasacárido del complejo ATH puede interactuar con moléculas de AT exógena, permitiendo así que la heparina conjugada tenga una actividad catalítica. Además, la heparina del complejo ATH puede orientarse de tal forma que el pentasacárido quede disponible para enlazar y activar la circulación de moléculas de AT cuando el complejo ATH se una a una superficie protésica.
Se observará que un conjugado de heparina que revista interés (por ejemplo, ATH) también puede obtenerse incubando una especie que contenga al menos un grupo amino primario (por ejemplo, Al) con heparina purificada de muy elevada afinidad (es decir, que contenga dos grupos pentasacáridos) o una fracción enriquecida para una heparina de muy alta actividad.
Aunque esta tecnología se ha ilustrado básicamente con respecto a la heparina, es evidente que todos los glicosaminoglicanos, independientemente de su peso molecular y derivatización, pueden conjugarse mediante los métodos descritos en esta invención, siempre que posean un residuo de aldosa terminal. Los conjugados de todos estos glicosaminoglicanos y su preparación a través de los métodos que aquí se indican se encuentran dentro del alcance de estas invención. Por ejemplo, los conjugados de heparina derivatizados con fosfatos, sulfonalos y similares, así como los glicosaminoglicanos con unos pesos moleculares inferiores
o superiores a los pesos moleculares de la heparina se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
En un aspecto adicional de la presente invención, un método de fabricación de una composición para la prevención de la trombogénesis puede incluir la conjugación de AT con heparina en el exterior del cuerpo de un sujeto para obtener un conjugado de antitrombinaheparina, donde la cantidad de antitrombina obtenida en el conjugada de antitrombina-heparina es superior al 60 % en peso, superior al 65 % en peso, superior al 75 % en peso, superior al 85
% en peso, superior al 90 % en peso, superior al 95 % en peso, o superior al 99 % en peso en función de la antitrombina inicial utilizada en la síntesis. El rendimiento puede incrementarse mediante diversos métodos. En un ejemplo, la AT puede conjugarse con heparina mediante los métodos descritos anteriormente. Tras la conjugación, cualquier Al no enlazada puede reciclarse y utilizarse en otra reacción de conjugación con heparina. Tras cada etapa de incubación de Al con heparina, la Al no enlazada puede reciclarse y utilizarse para obtener AlH adicional.
En otro ejemplo, el rendimiento del AlH puede incrementarse utilizando como catalizador una transposición de Amadori. Entre algunos de los ejemplos de catalizadores que pueden aumentar la proporción de la transposición de Amadori se encuentran la 2hidroxipiridina, las sales de aminas terciarias, el malonato de etilo, la fenilacetona y el ácido acético, así como otros ácidos. En un ejemplo concreto, puede hacerse reaccionar la Al y la heparina en presencia de 2-hidroxipiridina mientras se calientan en agua o en disolventes muy anfifílicos, como la formamida. En ejemplos adicionales, puede hacerse reaccionar a la AT y la heparina en presencia de trimetilamina o de sales de trimetilamina.
La velocidad de la transposición de Amadori también se puede incrementar mediante sistemas de disolventes aceleradores de la transposición de Amadori. Entre los ejemplos de dichos disolventes se encuentran las mezclas de agua con formamida, dimetilformamida, dioxano, etanol, dimetilsulfósido, piridina, ácido acético, trimetilamina, trietilamina, acetonitrilo y sus combinaciones. Se puede hacer reaccionar la heparina y la Al en estos sistemas disolventes para acelerar la transposición de Amadori para la obtención de ATH.
Un método adicional de incrementar la velocidad de la conjugación de la aldosa de heparina con una molécula que contenga una amina implica la utilización de un agente ligante. El agente ligante puede ser un agente heterobifuncional, con un grupo que reacciona a la aldosa de la heparina en un extremo y un grupo diferente en otro extremo que se puede utilizar para unirse a la AT o a un segundo agente ligante que a su vez puede unirse a la Al. En un ejemplo concreto, el agente ligante puede contener hidracina en un extremo y un grupo amino en el otro extremo, como 2-aminoetilhidracina. Este agente ligante puede hacerse reaccionar con la heparina para formar una hidrazona con el aldehído de la aldosa de la heparina. El producto puede dializarse o diafiltrarse con membranas que permitan la eliminación de cadenas de heparina con un peso molecular inferior a 3.000 o 5.000 Daltons junto con cualquier agente ligante que no haya reaccionado. El producto heparina-hidrazona puede entonces hacerse reaccionar con una gran cantidad de un agente ligante secundario. El agente ligante secundario
puede ser un reactivo homobifuncional que posea grupos carboxilo activados en cada uno de sus extremos, como el éster del ácido succínico di(N-hidroxisuccinimida) (preparado mediante la esterificación del ácido succinico con N-hidroxisuccinimida utilizando agentes de condensación como el carbonildiimidazol o una carbodiimida) para que el grupo amino del agente ligante que contiene hidracina reaccione con tan sólo uno de los carboxilos activados del agente ligante secundario. La mezcla de reacción puede dializarse o diafiltrarse para eliminar el agente ligante secundario que haya quedado sin reaccionar. En este punto, el producto será heparina modificada mediante el agente ligante que contiene amino-hidracina, así como el agente ligante secundario. Este producto puede incubarse con AT en una solución tampón de H20 de forma que el grupo amino de la AT reaccione con el segundo grupo carboxilo activado del agente ligante secundario para formar un conjugado de AT-Heparina, donde la AT y la heparina están enlazadas a través del agente ligante y el agente ligante secundario.
Tras la formación del ATH, el ATH puede liofilizarse (desecarse por congelación) para su almacenamiento. En una realización, el ATH puede prepararse en una solución que contenga exclusivamente agua y liofilizarse posteriormente. En otra realización, el ATH puede prepararse en una solución con agua y alanina a una concentración que oscile entre 0,01-0,09 molar, liofilizándose posteriormente. En otra realización adicional, el ATH puede prepararse en una solución que contenga agua y manitol, y liofilizarse a continuación. Cada uno de estos métodos se puede utilizar independientemente, y cada uno de ellos posee sus propias ventajas. Tras la liofilización utilizando cualquiera de estos métodos, el ATH puede reconstituirse y preservar un importante nivel de actividad de inhibición de la trombina, en comparación con su nivel de actividad previo a la liofilización. En algunos casos, el ATH puede retener al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, o al menos un 98% de su actividad inhibidora de la trombina. Se ha demostrado que mediante la utilización de otros métodos de liofilización del ATH, como la preparación del ATH en una solución que contenga sal en una concentración de más de 1 molar con anterioridad a la liofilización se puede destruir la actividad del ATH.
Tanto si se ha liofilizado el ATH o no, el ATH se puede preparar en una solución acuosa que contenga entre 9 y t t mg/mL de ATH con respecto a la totalidad del volumen de la solución . Se ha demostrado que si se preparan soluciones con una concentración de ATH superior a 11 mg/mL se puede producir una agregación del ATH que resulta difícil o imposible de revertir. No obstante, pueden prepararse soluciones acuosas estables con unas concentraciones de ATH de 9-11 mg/ml. Esta solución puede formularse para su administración
a un paciente para el tratamiento de cualquiera de las afecciones que se describen en el presente documento. La solución también puede incluir diversos aditivos que resulten adecuados para su administración a un paciente.
En la práctica clínica, los conjugados de heparina de la presente invención pueden utilizarse en general de la misma manera y en el mismo formato de preparación farmacéutica que la heparina disponible comercialmente para su uso clínico. De este modo, los conjugados de heparina facilitados por la presente invención pueden incorporarse a soluciones acuosas para inyección, (intravenosa, subcutánea y similares) o infusión intravenosa, o en preparaciones de ungüentos para su administración a través de la piel y de las membranas mucosas. Puede realizarse cualquier tipo de terapia, tanto profiláctica como curativa, conocida en la actualidad o disponible en el futuro, mediante los conjugados de heparina facilitados por esta tecnología.
Los conjugados de heparina de la presente invención resultan especialmente útiles para el tratamiento del síndrome de dificultad respiratoria (SOR) en neonatos y adultos. Al contrario de lo que sucede con la utilización de complejos no covalentes de heparina-AT, la utilización de los conjugados covalentes de heparina de la presente invención previene la pérdida de la heparina en el espacio pulmonar provocada por su disociación de la AT. En este caso, puede ofrecerse una solución formada por un complejo covalente en una solución reguladora, en forma de pulverización atomizada en el pulmón a través de las vías respiratorias mediante un catéter o inhalador. Debido a su gran tamaño, el ATH permanecerá en los alvéolos durante un período de tiempo prolongado. El ATH también es útil para el tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopática.
Su utilización a largo plazo en el torrente circulatorio puede llevarse a cabo mediante inyección intravenosa o subcutánea de complejo en una solución reguladora fisiológica. Los conjugados covalentes de esta tecnología también se pueden utilizar en el tratamiento de los estados adquiridos de déficit de AT caracterizados por complicaciones trombóticas, como el bypass cardiopulmonar, la oxigenación molecular extracorpórea, etc. ya que la vida media más larga del complejo covalente permite reducir el número de tratamientos y el control. Adicionalmente, esta invención permite el tratamiento profiláctico de pacientes adultos con riesgo de trombosis venosa profunda.
El conjugado de ATH de la presente invención presenta numerosas ventajas con respecto a la AT no compleja y la heparina estándar. Dado que la AT está unida a la heparina mediante un enlace covalente, la unión no especifica del ATH a las proteínas del plasma será menor que en el caso de la heparina estándar, con el resultado de una menor variación
interindividual en la respuesta a la dosis en el caso del ATH que la que se da con la heparina estándar. La más prolongada vida media del ATH tras su inyección intravenosa en seres humanos significa que puede lograrse un efecto anticoagulante sostenido con una administración menos frecuente de ATH que la que se precisaría en el caso de la AT no compleja y la heparina estándar. El ATH es un desactivador de la trombina y del factor Xa mucho más eficiente que la AT, y puede resultar eficaz cuando se utiliza en concentraciones mucho más reducidas que la AT en pacientes con déficit de AT. Además, el ATH puede acceder a la trombina ligada a la fibrina e inhibirla. Por último, cuando se encuentra unido (por ejemplo, mediante enlaces covalentes) a superficies protésicas (por ejemplo, injertos endovasculares), el ATH ha demostrado tener una actividad antitrombítica in vivo muy superior a la de la AT unida mediante enlace covalente, la heparina unida mediante enlace covalente, o la hirudina unida mediante enlace covalente.
Los bebés prematuros tienen una mayor incidencia del síndrome de dificultad respiratoria (SOR), una grave enfermedad pulmonar que requiere tratamiento mediante ventilación asistida. La ventilación asistida a largo plazo lleva a la aparición de displasia broncopulmonar (oBP) como resultado de la lesión pulmonar, que permite que las proteínas de la coagulación del plasma se desplacen por los espacios alveolares del pulmón. El resultado es la generación de trombina y posteriormente de fibrina. Se ha observado constantemente una extendida presencia de fibrina en el tejido pulmonar y los espacios aéreos de bebés fallecidos a causa del SOR. Este gel de fibrina situado en el interior de los espacios aéreos dificulta el transporte de fluido desde los espacios aéreos del pulmón, con el resultado de un edema persistente y agravado. La presente invención permite el tratamiento de dichas enfermedades mediadas por la fibrina en el tejido pulmonar, al impedir la formación de fibrina intra-alveolar, al mantener un "entorno anti-trombótico" y/o mejorar la fibrinolisis en el interior del tejido pulmonar, reduciendo de este modo la carga de fibrina en los espacios aéreos del pulmón.
Los conjugados de heparina pueden administrarse directamente en los espacios aéreos del pulmón a través de las vías respiratorias, de forma profiláctica (antes de que el bebé respire por primera vez). De este modo se garantiza que el agente antitrombótico está disponible directamente en el punto en que puede tener lugar la deposición de fibrina, y que se evita el riesgo de hemorragia asociado a las terapias antitrombóticas sistémicas. Además, el agente antitrombótico ya se encontrará presente en el pulmón con anterioridad al comienzo del soporte ventila torio asociado a la lesión inicial, es decir, a diferencia de la administración sistémica de antitrombina en la que el paso del fármaco administrado a través del espacio aéreo de los
pulmones no se produce hasta después de que tenga lugar la lesión pulmonar. Dado que la heparina está unida a la AT de forma covalente, permanecerá en los espacios aéreos del pulmón. También puede consistir en una terapia complementaria de los tensioactivos que se estén administrando para prevenir el SDR y la DBP. "Tensioactivo pulmonar" significa la sustancia jabonosa que suele encontrarse presente en los espacios aéreos del pulmón, cuya función principal consiste en impedir el colapso del espacio aéreo, y colaborar en la transferencia de gases. Los conjugados también se pueden administrar repetidamente a través del tubo endotraqueal o como un aerosol inhalado. La terapia complementaria también puede practicarse con medicaciones contra el asma administradas mediante inhalador (por ejemplo, esteroides antiinflamatorios como el dipropionato de beclometasona), otros medicamentos contra el asma, como el cromolín sódico (sal disódica de 1,3-bis(2-carboxicromon-5-iloxi)-2hidroxipropano, ("INTAL") y broncodilatadores como el sulfato de albuterol.
Mediante la administración de los conjugados de la presente invención pueden tratarse otras diversas enfermedades asociadas a una elevada actividad de la trombina y/o depósitos de fibrina. Los procesos inflamatorios típicos del síndrome de dificultad respiratoria en adultos son básicamente similares al SDR neo natal, y pueden tratarse mediante la terapia antitrombótica descrita. También se ha demostrado que la fibrosis pulmonar espontánea activa las cascadas de coagulación/fibrinolítica en los espacios aéreos del pulmón. La enfermedad fibrótica del pulmón suele ser con frecuencia un efecto secundario asociado a la quimioterapia contra el cáncer y la administración antitrombótica en caso de SDR de los conjugados covalentes de heparina de la presente invención puede realizarse con carácter profiláctico con anterioridad a la quimioterapia contra el cáncer, para prevenir la fibrosis pulmonar. La administración se repite con posterioridad a la quimioterapia para asegurarse de que no se ha formado fibrina. También se ha documentado muy bien un descenso en la actividad de la antitrombina y un aumento de la actividad de la trombina en el caso de la sepsis. La sepsis constituye el factor de riesgo más común para el desarrollo del SDR en adultos. De este modo, los conjugados de heparina de la presente invención pueden utilizarse para reducir la mortalidad asociada al choque séptico.
Los conjugados de la presente invención pueden administrarse a una dosis terapéuticamente efectiva, es decir, la cantidad que, al administrarse a un mamífero que la precise, resulta suficiente para efectuar el tratamiento, como se ha descrito más arriba (por ejemplo, para reducir o tratar en otra forma la trombosis en el mamífero, o para desactivar la trombina relacionada con la coagulación , o para inhibir la acumulación de trombos). La administración de los componentes activos y las sales que se describen en este documento
puede realizarse mediante cualquiera de las modalidades aceptadas de administración de agentes que sirvan a propósitos similares.
En general, una dosis diaria aceptable se encuentra aproximadamente entre 0,001 y 50 mg por kilogramo de peso corporal del receptor y por día, aproximadamente entre 0,05 y 25 mg por kilogramo de peso corporal y por día, o aproximadamente entre 0,01 y 1 °mg por kilogramo de peso corporal y por día. De este modo, para su administración a una persona de 70 kg, la dosis puede oscilar dentro de un rango aproximado de entre 0,07 mg y 3.5 g por día, de aproximadamente entre 3.5 mg y 1.75 g por día, o de aproximadamente entre 0,7 mg y 0,7 g por día, en función de los individuos y de la situación de la enfermedad que está tratándose. En el caso del ATH, su larga vida media permite que el compuesto se administre con menor frecuencia que la heparina estándar (por ejemplo, una o dos veces por semana).
La administración puede llevarse a cabo mediante cualquier ruta local o sistémica aceptada, por ejemplo, por vía parenteral, intravenosa, nasal, inhalación bronquial (es decir, formulación en aerosol), por vía transdérmica o tópica, en forma de dosis sólida, semisólida o líquida, como por ejemplo, comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas, polvo, soluciones, suspensiones, aerosoles, suspensiones o similares, como dosis unitarias adecuadas para administrar de forma sencilla una dosis precisa. Por lo general, pueden utilizarse formulaciones acuosas. El conjugado puede formularse en un medio excipiente no tóxico, inerte y farmacéuticamente aceptable, con un pH de en torno a 3-8 o con un pH de en torno a 6-8. Por lo general, la formulación acuosa puede ser compatible con el medio de cultivo o perfusión. Las composiciones incluirán un vehículo o excipiente farmacéutico convencional, y un conjugado del glicosaminoglicano, y además, podrán incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, excipientes, adyuvantes, etc. Los vehículos pueden seleccionarse de entre los diversos aceites, incluyendo los derivados del petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, como por ejemplo, el aceite de cacahuete, el aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Entre los vehículos líquidos adecuados se encuentran el agua, soluciones salinas, dextrosa, acuosa o manitol, y los glicoles, especialmente para soluciones inyectables. Entre los excipientes farmacéuticos más adecuados se encuentran el almidón, la celulosa, el talco, la glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato sódico, monoestearato de glicerol, cloruro sódico, leche desnatada concentrada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Se describen otros excipientes farmacéuticos adecuados y sus formulaciones en Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin (1985).
Si se desea, la composición farmacéutica que va a administrarse puede también contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH y similares, como por ejemplo, acetato sódico, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
Los compuestos de la invención pueden administrarse como una composlclon farmacéutica que comprende un excipiente farmacéutico combinado con ATH. El nivel del ATH en una formulación puede variar dentro de la totalidad del rango utilizado por los expertos en la materia, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 por ciento en peso (% p/p) Y aproximadamente 99,99% p/p del fármaco, basado en la formulación total, entre aproximadamente un 0,01% p/p Y 99,99% p/p de excipiente. En un ejemplo, la formulación puede contener entre aproximadamente un 3,5 y un 60% en peso del compuesto farmacéuticamente activo, siendo el resto excipientes farmacéuticos adecuados.
La presente invención también se extiende a los tratamientos de diversas afecciones mediante ATH. En algunos ejemplos, esto incluye métodos de tratamiento , composiciones que contienen ATH, y productos sanitarios que comprenden ATH. Tal y como se describe en este documento, el ATH presenta diversas ventajas sobre la heparina. Normalmente se utilizan anticoagulantes heparinoides para el tratamiento y la prevención de enfermedades trombóticas. Los heparinoides funcionan catalizando la actividad anticoagulante del inhibidor de la proteasa del plasma, la antitrombina. La heparina no fraccionada (UFH) y sus derivados de bajo peso molecular (LMWH) presentan diversas carencias, incluyendo su reducido promedio de vida, su respuesta anticoagulante variable, su limitada eficacia a la hora de inhibir la trombina (especialmente, la trombina vinculada a la coagulación), la inducción de hemorragia y la inducción de trombocitopenia.
El ATH puede resolver muchos de estos problemas cuando se utiliza como agente terapéutico. En comparación con los heparinoides tradicionales, el AlH tiene un promedio de vida más prolongado, una menor vinculación con las proteínas del plasma y las células endoteliales y una mayor eficacia antitrombótica en modelos animales sin un incremento del riesgo de hemorragia. In vitro, el ATH inhibe directamente diversos factores de coagulación, con unas tasas significativamente más elevadas en comparación con las mezclas no covalentes de Al y UFH (Al+H). El AlH también resulta más eficaz a la hora de inhibir la trombina relacionada con la coagulación, en comparación con Al+H.
En algunas realizaciones de la presente invención, el AlH puede utilizarse para fabricar revestimientos para productos sanitarios. En una realización, un método de revestimiento de
una superlicie polimérica con un conjugado de antitrombina-heparina puede incluir la puesta en contacto de la superlicie polimérica con una solución del conjugado de antitrombina-heparina, de forma que el conjugado de antitrombina-heparina recubra directamente la superlicie de poliuretano, sin presencia de grupos ligantes entre el conjugado de antitrombina-heparina y la superlicie polimérica.
Pueden utilizarse los métodos conocidos de fijación covalente de las moléculas a las superlicies poliméricas para fijar el ATH a una superlicie polimérica de un producto sanitario. Por ejemplo, la superlicie polimérica se puede activar en primer lugar mediante su tratamiento con un oxidante o reductor, y después se puede unir un grupo ligante a la superlicie activada. A continuación, el ATH puede unirse al monómero. En un ejemplo, se activa una superficie de poliuretano haciéndola reaccionar con hipoclorito sódico o con hidruro de litio y aluminio. A continuación, se injerta alil glicidil éter en la superlicie, para que actúe como grupo ligante. A continuación, el ATH se une al grupo ligante.
Aunque el ATH puede fijarse de este modo a las superlicies utilizando grupos ligantes, se ha demostrado que, sorprendentemente, el ATH también puede unirse directamente a una superlicie polimérica, sin ningún grupo ligan te. De este modo, la presente invención proporciona unos métodos muy sencillos para el revestimiento de las superficies poliméricas con ATH sin activar la superlicie polimérica ni unir un grupo ligante a la superlicie. En algunos ejemplos, simplemente se puede poner en contacto la superlicie polimérica con una solución de ATH mediante inmersión o por cualquier otro método. El ATH se puede unir directamente a la superlicie y permanecer unido a ella incluso tras el lavado con detergentes. Este método puede resultar útil para el revestimiento de productos sanitarios que entran en contacto con la sangre, a fin de reducir la trombogenicidad de los productos sanitarios.
La superlicie polimérica puede estar compuesta por cualquier polímero utilizado para la fabricación de productos sanitarios. En algunas realizaciones, la superlicie polimérica puede ser una superlicie de poliuretano, una superlicie de polietileno, una superlicie de polipropileno, una superlicie de tetrafluoruro de polietileno, una superlicie de polidimetilsiloxano, una superficie de copolímero de etileno-ácido acrílico, una superlicie de Dacron, una superlicie de poliésterpoliuretano, una superlicie de poliuretano-policarbonato, una superlicie de cloruro de polivinilo, una superlicie de silicona, una superlicie de goma látex, una superlicie de nitinol, una superlicie de Nylon, una superlicie de Tereftalato de polietileno, una superlicie de poliestireno, o combinaciones de dichos productos. En otras realizaciones, la superlicie polimérica puede incluir materiales de loplex y otros hidrogeles, como los basados en metacrilato de 2-hidroxietilo
o acrilamida y ureas de poliéter poliuretano (PEUU), incluyendo Biomer (Ethicon Corp.) y Avcothane (Avco-Everretl Laboratories).
La superficie polimérica puede formar parte de un producto sanitario que entra en contacto con la sangre. En algunas realizaciones, el producto sanitario puede ser un catéter intravenoso, un catéter intra-arterial, un catéter central de inserción periférica, un catéter central, un catéter de Swan-Ganz, un stent coronario, una derivación arteriovenosa, un filtro de la vena cava inferior, un catéter de diálisis, una línea de circuito sanguíneo de diálisis, una membrana de diálisis, una línea extracorpórea de oxigenación de la membrana, una membrana de oxigenación de la membrana extracorpórea, una prótesis in vivo, un electrodo de marcapasos, una sutura, un filtro de sangre, una válvula mecánica, un órgano artificial, o un contenedor de almacenamiento de sangre. Cualquier producto sanitario interno o externo que entre en contacto con la sangre y a causa del cual resultaría deseable reducir la coagulación de la sangre podría estar revestido con ATH.
En una realización específica, el producto sanitario puede ser un catéter con un revestimiento de ATH. Los catéteres suelen fallar debido a la trombosis inducida por la superficie. El revestimiento de estos dispositivos con anticoagulantes convencionales, como la heparina, puede aportar mejoras de carácter limitado, pero sigue siendo un serio problema la oclusión del dispositivo a causa de los coágulos. Los dispositivos revestidos con ATH exhiben unas propiedades antitrombóticas netamente superiores, y pueden utilizarse sin que se produzca ninguna oclusión causada por trombos.
En un ejemplo, se puede revestir un catéter con ATH, sumergiendo el catéter en una solución de ATH. El interior del catéter puede ponerse en contacto con la solución de ATH haciendo llegar la solución hasta el lumen del catéter utilizando una jeringa. A continuación, el catéter puede dejarse incubando durante un período de tiempo, para permitir que el ATH se adhiera a las superficies poliméricas del catéter. Este período de tiempo puede oscilar, por ejemplo, entre 0,1 Y 48 horas, 1 y 48 horas, 1 y 24 horas, 2 y 8 horas, o cualquier otro periodo de tiempo que sea suficiente para que el ATH se adhiera a la superficie polimérica. A continuación, el catéter puede retirarse de la solución de ATH, y puede vaciarse el exceso de solución de ATH del catéter, dejando secar el resto de revestimiento de la solución de ATH. El secado puede durar un período de tiempo suficiente para que el disolvente se evapore de la solución de ATH con la que está revestido el catéter. En una realización, el catéter puede secarse al aire, a temperatura ambiente. El tiempo de secado puede oscilar, por ejemplo, entre 1 y 48 horas, 1 y 24 horas, 1 y 8 horas, o entre 1 y 2 horas. En otras realizaciones, el catéter
puede dejarse secar al chorro de aire procedente de un dispositivo de soplado, al aire ambiente
o por exposición a a un chorro de aire caliente (que puede ser aire calentado a aproximadamente 60 "C), o al aire ambiente o por exposición a chorro de aire deshumidificado, en atmósfera de nitrógeno o por exposición a a un chorro de nitrógeno, en atmósfera de gas noble o por exposición a a un chorro de gas noble, o al vacío, parcial o total. El tiempo de secado puede reducirse cuando se utiliza un chorro, de aire o de otro gas, deshumidificado o caliente. El tiempo de secado también se puede reducir sustancialmente cuando se efectúa al vacío, parcial o total. Por ejemplo, el tiempo de secado puede oscilar entre 1 minuto y 48 horas, 1 minuto y 24 horas, 1 minuto y 1 hora, de 1 a 30 minutos, o cualquier otro tiempo de secado que resulte suficiente. Una vez secado, el catéter puede utilizarse in vitro o esterilizarse para su utilización en aplicaciones médicas. Un método de esterilización puede incluir la colocación del catéter en un recipiente hermético que contenga una membrana permeable al gas y esterilizando el catéter y el contenedor mediante su exposición al óxido de etileno.
Pueden utilizarse diversos métodos de revestimiento de un catéter u otro producto sanitario con ATH. Por ejemplo, un producto sanitario se puede sumergir en una solución de ATH e incubarse durante un período de tiempo suficiente para permitir que el ATH se adhiera a las superficies del producto sanitario. En otra ejemplo, puede utilizarse un método de circulación, en el cual se pone en contacto el producto sanitario con una solución de ATH circulante. En un ejemplo concreto, el producto sanitario puede ser un catéter, y la solución de ATH puede circular alrededor del catéter a fin de que la solución de ATH circule por las superficies exteriores e interiores del catéter. La solución de ATH puede reciclarse continuamente y circular a través del catéter durante un período de tiempo suficiente para que el ATH se adhiera a las superficies del catéter.
Pueden revestirse simultáneamente múltiples dispositivos médicos en un solo lote de solución de ATH. Por ejemplo, puede prepararse un volumen suficiente de solución de ATH para sumergir cualquier número de productos sanitarios para su incubado en la solución. Adicionalmente, la solución de ATH se puede utilizar para revestir múltiples lotes de productos métodos de forma secuencial. Teniendo en cuenta que el revestimiento de ATH formado sobre la superficie del producto sanitario puede tener un espesor de tan sólo una molécula, la mayor parte del ATH de la solución seguirá manteniéndose en la solución con posterioridad al revestimiento de un producto sanitario. Por ejemplo, una capa de ATH con un espesor de una molécula puede contener alrededor de 2 pmoles de ATH/cm2 de superficie. No obstante, 100 mL de una solución de 1 mg ATH/mL contienen un total de 1,69 x 106 pmoles de ATH. Por lo
tanto, la solución contiene suficiente ATH para formar un revestim iento con un espesor de una molécula en muchos productos sanitarios. En una realización, puede prepararse un lote con una solución de ATH, y a continuación se puede sumergir una pluralidad de productos sanitarios e incubarse en la solución de ATH. Tras la incubación, pueden retirarse los productos sanitarios, y la solución de ATH sobrante puede verterse de nuevo en el lote de solución de ATH. A continuación, este mismo lote de solución de ATH puede reutilizarse para revestir otra pluralidad de productos sanitarios. Este proceso puede repetirse en múltiples ocasiones para revestir un elevado número de productos sanitarios con un único lote de solución de ATH. En algunos casos, el proceso puede repetirse hasta en cinco ocasiones, hasta en 10 ocasiones, hasta en 20 ocasiones, o incluso hasta en 50 ocasiones antes de preparar un nuevo lote de solución de ATH.
En un método de circulación continua, la solución de ATH podría potencialmente reciclarse indefinidamente de forma que llegue a utilizarse todo el ATH de la solución. Por ejemplo, la solución de ATH puede reciclarse a medida que se reviste con la solución una serie de productos sanitarios. Cuando la concentración de ATH de la solución de ATH cae por debajo de un valor umbral, como 0,1 mg ATH/mL, 0,5 mg ATH/mL, 0,8 mg ATH/mL, o 0,9 mg ATH/mL, puede añadirse más ATH a la solución de este ejemplo.
En un ejemplo especifico, un grupo formado por 50 catéteres puede revestirse con ATH. Esta operación puede llevarse a cabo sumergiendo los catéteres en 200 mL de una solución tampón de 1 mg ATH/mL para sumergir simultáneamente los 50 catéteres. Alternativamente, pueden revestirse por inmersión 5 o 10 catéteres simultáneamente utilizando un solo lote de solución de ATH. De este modo, el lote de solución de ATH requerido podrá reducirse de 200 mL a 40 mL o 20 mL.
Los catéteres y demás productos sanitarios revestidos con ATH pueden mantenerse operativos durante un periodo de tiempo considerablemente mayor que los dispositivos revestidos con heparina. Por ejemplo, los catéteres revestidos con ATH pueden mantenerse permeables en una vena o artera hasta un máximo de un año sin utilizar ningún tipo de anticoagulante. En ciertos casos, un catéter revestido con ATH puede mantenerse permeable en una vena o arteria durante un periodo de entre 1 semana y 1 año, de entre 1 mes y 6 meses, de entre 2 y 6 meses o cualquier otro período de tiempo prolongado. En algunos casos, un producto sanitario revestido con ATH puede mantenerse indefinidamente libre de coágulos, o al menos durante el tiempo que se utilice el producto. De este modo, no es necesario retirar y sustituir el dispositivo implantado a un paciente debido a la formación de coágulos. Esta mayor
capacidad del ATH puede deberse, al menos parcialmente, al hecho de que el ATH puede ser un anticoagulante sustancialmente 100% activo, mientras que la heparina puede contener un elevado porcentaje de cadenas inactivas de heparina.
En una realización específica, puede recurrirse al revestimiento por liofilización para revestir una superficie polimérica de un producto sanitario con ATH. La superficie polimérica puede ponerse en contacto con la solución de ATH en ausencia de grupos ligantes. El exceso de solución de ATH puede dejarse que escurra de la superficie polimérica. A continuación, se puede dejar que el disolvente se evapore de la superficie polimérica bajo vacío, al menos parcial. Esto puede formar un revestimiento seco de ATH sobre la superficie polimérica. En algunos casos, el revestimiento liofilizado puede tener una mayor uniformidad en comparación con los revestimientos obtenidos mediante otros métodos de revestimiento.
Además de revestir catéteres y otros productos sanitarios con ATH, la presente invención también se extiende a soluciones de lavado y sellado de catéteres. Muchas instituciones tienen la costumbre de lavar y sellar los catéteres con una solución de heparina diluida para prevenir la aparición de coágulos, aunque no existe un acuerdo básico en la literatura científica acerca de la eficacia del lavado con heparina para mantener los catéteres permeables. Como anticoagulante, la heparina presenta diversas limitaciones, incluyendo su dependencia de unos adecuados niveles de antitrombina en el plasma, y el hecho de que tan sólo una tercera parte de los preparados comerciales de heparina tienen actividad anticoagulante. La dependencia de la antitrombina del funcionamiento de la heparina es un tema de especial preocupación en niños muy jóvenes, cuando los neonatos, y especialmente los bebés prematuros, tienen unas concentraciones de antitrombina en plasma notablemente inferiores a las de los adultos.
Los revestimientos con heparina se utilizan frecuentemente para hacer que las superficies resulten más antitrombogénicas. Sin embargo, estas superficies no resultan ideales, debido a las filtraciones de la heparina de la superficie, a la sustitución no uniforme y las diferentes actividades anticoagulantes del producto. Teniendo en cuenta que dos terceras partes de la heparina estándar no fraccionada no contienen la secuencia de pentasacáridos requerida para la anticoagulación, esta circunstancia limita el nivel de actividad anticoagulante que puede conseguirse en la superficie modificada. Además, las cadenas de heparina no anticoagulante pueden seguir favoreciendo la deposición de proteínas sobre la superficie, lo que puede favorecer la aparición de trombos. Estos problemas se pueden evitar utilizando ATH.
En una realización, una solución para el lavado y el sellado de un catéter intravenoso o intra-arterial puede incluir un conjugado de antitrombina-heparina. En otra realización, un sistema de lavado y sellado puede incluir: un catéter intravenoso
o intra-arterial; una solución de limpieza y sellado configurada para su introducción a través del catéter, comprendiendo dicha solución de limpieza y sellado un conjugado de antitrombinaheparina; y una jeringa configurada para inyectar la solución de limpieza y sellado en el catéter.
En otra realización adicional, un método de mantener la permeabilidad de un catéter puede incluir: la inserción de un catéter en una vena o arteria de un paciente, de forma que una abertura interior del catéter se abra al interior de la vena o arteria, y una abertura exterior del catéter se abra hacia el exterior del paciente; la inyección de una solución que comprenda un conjugado de antitrombina-heparina en el catéter a través de la abertura exterior del catéter; y el sellado de la abertura exterior del catéter de forma que al menos una parte de la solución que comprende el conjugado de antitrombina-heparina permanezca en el interior del catéter.
Cuando se utiliza de este modo una solución de limpieza y sellado con un catéter, el catéter permanece en contacto con la solución de ATH tras su preparación y cierre. Mientras el catéter se mantiene en contacto con la solución de ATH, el ATH puede fijarse a las superlicies del catéter como se ha descrito anteriormente. De este modo, cada vez que el catéter se lava y prepara con una solución de ATH, el catéter puede segur revistiéndose mediante ATH. Cuando la solución de limpieza y sellado se inyecta a través del catéter, el ATH puede fijarse tanto a las superlicies interiores como a la boquilla del catéter. De este modo se puede prevenir la formación de trombos en el interior dellumen del catéter, así como en la punta del catéter.
El ATH puede encontrarse presente en la solución de limpieza y sellado en una cantidad variable entre 0,01-10 mg ATH/mL, 0,1-1 mg ATHJmL, u otra cantidad efectiva. Otros componentes de la solución pueden incluir agua, cloruro sódico y reguladores.
Teniendo en cuenta que la fracción de heparina presente en el ATH ya cuenta con una molécula de AT permanentemente enlazada, la parte de la cadena de heparina que se encuentra plenamente disponible para su interacción con las proteínas del plasma y las superlicies celulares es menor que la heparina total. El ATH se une menos a las proteínas del plasma y superficies endoteliales (de capa única HUVEC) en comparación con la heparina. Si el revestimiento de ATH se une a las plaquetas, a diferencia de los revestimientos de heparina, el ATH no activa las plaquetas. Por lo tanto, los catéteres que cuentan con el revestimiento de ATH permanecen libres de trombos cuando en los catéteres con revestimiento de heparina se empezarían a formar trompos y se quedarían atascados. Aun cuando se activen las plaquetas a
causa de la estasis u otros fenómenos biofísicos, el ATH es superior a la heparina (UFH) en lo que respecta a la inhibición del complejo protrombinasa y la generación de trombina concomitante en las superficies activadas de las plaquetas. Teniendo en cuenta la gran superioridad del ATH como anticoagulante frente a la heparina, el ATH puede resultar mucho más eficaz a la hora de prevenir el inicio de la coagulación. Esto se ve especialmente subrayado por el hecho de que, aunque la heparina no será capaz de inhibir los factores de coagulación activados en el interior de la boquilla del catéter, a menos que también se encuentre presente AT del plasma, el ATH ya cuenta con una molécula de AT extremadamente reactiva que puede inhibir directamente los factores de coagulación.
Adicionalmente, el ATH presenta unas actividades anti-Xa o anti-Ila, y una catálisis de la inhibición por parte de la AT del factor Xa o trombina muy superiores. De hecho, se ha demostrado que la potencia del complejo ATH es más de cuatro veces superior, en lo que respecta a la tasa de inhibición de la trombina, que la de la AT + H (heparina). También se ha demostrado que la actividad catalítica del anti-factor Xa es similar para el ATH frente a la heparina. El ATH también puede inhibir directamente por sí mismo los factores de coagulación sin necesidad de añadir AT, algo que no puede hacer la heparina. El ATH puede inhibir directamente todos los factores de coagulación de la cascada de coagulación. Por el contrario, se ha documentado perfectamente la necesidad de AT en el mecanismo anticoagulante de la heparina. A diferencia de la heparina, el ATH puede inhibir fácilmente la trombina adherida a los coágulos de fibrina e inhibir el factor Xa adherido a complejos con superficie de fosfolípidos, como la protrombinasa. De hecho, una vez que el ATH inhibe la trombina de la superficie de los coágulos, el complejo ATH permanece adherido, convirtiendo la superficie del coágulo en un anticoagulante debido a la cadena activa de heparina del ATH. Estas y otras ventajas convierten al ATH en un producto muy útil para su uso en una solución de limpieza y sellado. Teniendo en cuenta la superior potencia del ATH, así como otras ventajas, se precisarán unas concentraciones mucho menores de ATH en la solución de sellado en comparación con las soluciones de heparina. Por ejemplo, el ATH puede presentar al menos 5 veces más actividad inhibitoria anti-Xa catalítica en comparación con la heparina no fraccionada.
A veces se utiliza citrato para las soluciones de limpieza y sellado. En comparación con el citrato como solución de limpieza y sellado, el ATH puede mantener la permeabilidad del catéter durante un periodo de tiempo más prolongado a concentraciones más bajas. El Citrato impide que se produzca la coagulación mediante la quelación del calcio de la sangre. No obstante, una vez que el citrato se ha unido a un ión calcio, ya no podrá impedir la coagulación
uniéndose a más calcio. Así pues, una vez que el citrato queda saturado, habrá más calcio del flujo sanguíneo que inicie la cascada de la coagulación. Por otra parte, el ATH puede continuar catalizando la inhibición mediante la presencia de AT en el plasma. De este modo, el ATH no se satura ni se consume nunca, y continuará operando.
El ATH puede inhibir la trombina directamente (sin AT añadida) 3,2 veces más rápido que la AT + heparina. El ATH puede inhibir los complejos del factor Vlla con factor de tejido 28 veces más rápido que la AT + heparina. En función de estas diferencias, una concentración de ATH 3,2 x 28 = 89,6 menor puede dar una velocidad de reacción equivalente a la hora de inhibir la cascada de coagulación, en comparación con la heparina. De este modo, la concentración de ATH puede ser al menos 89,6 veces menor que la concentración de heparina utilizada en las soluciones de limpieza y sellado, incluso sin tener en cuenta el revestimiento no covalente de la superficie del catéter con ATH que se producirá a causa de la presencia de la solución de sellado de ATH.
Las actuales soluciones de limpieza y sellado que contienen heparina tienen como consecuencia que un 20% de los catéteres venosos centrales se obstruyan y precisen ser sustituidos. Si se utiliza ATH en la solución de limpieza y sellado, este 20% de CVCs podrán mantener su permeabilidad sin precisar ser sustituidos.
La sustitución de catéteres se eleva a una media de 10.000 unidades diarias tan sólo en los EE.UU. a causa de las complicaciones. La utilización de soluciones de limpieza y sellado a base de ATH puede reducir el número de catéteres que han de ser reemplazados. Esto reduciría los costes de sustitución, aumentaría la calidad de vida del paciente (menor tiempo de hospitalización), impediría que se perdiesen días de tratamiento (como en el caso de las terapias contra el cáncer que han de detenerse mientras se espera a que se programe una intelVención para un cambio de CVC), reduciría los costes quirúrgicos y aumentaría el tiempo del que dispondría el médico para atender a otros pacientes.
En un ejemplo, se utilizó ATH para revestir de forma permanente la superficie de los stents y de los CVCs, que a continuación se probaron en modelos animales. Los stents y CVCs con revestimiento de ATH exhibieron una menor formación de coágulos en comparación con los stents y CVCs revestidos con heparina y los stents y CVCs sin revestimiento.
Dado que no resulta factible revestir con un anticoagulante los diferentes tipos y marcas de CVCs, muchas instituciones optan por enjuagar los catéteres con una solución anticoagulante para impedir la aparición de coágulos relacionados con el catéter. La utilización
de una solución de limpieza y sellado que contenga ATH puede resultar más eficaz que el uso de una solución de heparina.
La presente invención también se extiende a métodos de tratamiento de afecciones utilizando ATH. El ATH se puede utilizar para el tratamiento de diversas afecciones que requieren la inhibición de la trombogénesis. En algunos casos, puede utilizarse ATH formado a partir de heparina no fraccionada. En otros casos, el ATH puede fabricarse a partir de heparina de la que se hayan eliminado las cadenas de heparina de bajo peso molecular. En una realización, un método de tratamiento de una afección médica mediante la inhibición de la trombogénesis en un mamífero puede incluir la administración al mamífero de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina, donde al menos el 98% de las cadenas de heparina del conjugado de antitrombina-heparina tengan un peso molecular superior a 3.000 Daltons.
En algunas realizaciones, el ATH puede administrarse durante un procedimiento invasivo para reducir el riesgo de complicaciones tromboembólicas. Los procedimientos invasivos, como el bypass cardiopulmonar (BPC), generan cantidades masivas de microémbolos de fibrina que pueden alojarse en el cerebro, pudiendo provocar disfunciones cognitivas a largo plazo. Se ha demostrado que el ATH reduce significativamente las Señales transitorias de alta intensidad (H ITS) en las arterias carótidas de los cerdos sometidos a bypass cardiopulmonar (BPC). La reducción de las HITS puede indicar un menor riesgo de complicaciones tromboembólicas durante el BPC y una reducción de las disfunciones neurológicas post-quirúrgicas con ello relacionadas. El descenso de las HITS con ATH, en comparación con el tratamiento mediante UFH + AT, se logró sin un incremento significativo del sangrado (durante o después del BPC). La superior capacidad del ATH para inhibir la trombina relacionada con coágulos de fibrina y su mayor vida media en comparación con la heparina pueden ser responsables de esta mejora del rendimiento durante el BPC.
Con fines profilácticos (en pacientes protrombóticos no sometidos a un tratamiento de coagulación), el ATH se puede administrar por vía intravenosa a una dosis variable entre 1 unidad (en términos de actividad del anti-factor Xa) por kilogramo (unidad/kg) y 1000 unidadeslkg, estando la dosis típica en torno a 100 unidadeslkg. Si el ATH muestra una actividad del anti-factor Xa de 130 unidades por miligramo (unidades/mg), en términos del componente AT del ATH, las dosis de ATH pueden oscilar entre aproximadamente 0,008 mg y aproximadamente 8 mg , siendo una dosis típica de aproximadamente 0,8 mg. Las dosis también pueden determinarse en términos de mg del componente heparina del ATH sabiendo que la proporción de AT frente a heparina en el ATH es de 59 mg frente 18 mg. Teniendo en
cuenta la mayor vida media intravenosa del ATH que la de la heparina, el ATH no precisa administrarse con tanta frecuencia. De este modo, el ATH podría administrarse entre una vez al día y una vez a la semana, siendo lo más corriente una vez al día.
Para la resolución de un coágulo, el ATH se puede administrar por vía intravenosa con una dosis variable entre 50 unidades (en términos de actividad del anti-factor Xa) por kilogramo (unidades/kg) y 2000 unidades/kg, siendo la dosis típica de aproximadamente 300 unidades/kg. Si el ATH tiene una actividad anti-factor Xa de 130 unidades/mg (en términos del componente AT del ATH), las dosis de ATH podrán oscilar entonces entre aproximadamente 0,4 mg y aproximadamente 15 mg , siendo la dosis típica de aproximadamente 2,3 mg. Teniendo en cuenta que la vida media intravenosa del ATH es más prolongada que la de la heparina, no tendrá que administrarse con tanta frecuencia. Así pues, el ATH podrá administrarse entre tres veces al día y dos veces por semana, siendo lo más corriente dos veces al día. Una vez que ha disminuido suficientemente el tamaño el coágulo, pueden reducirse la dosis y la frecuencia del tratamiento con ATH, o interrumpirse dicho tratamiento.
En el caso de la administración profiláctica durante una intervención quirúrgica, la dosis puede depender del tipo de cirugía, siendo los procedimientos más invasivos los que requieren unas dosis de ATH más elevadas. Una de las cirugías más invasivas y que provoca más daños es la cirugía de bypass, que puede tratarse con dosis de ATH (en términos del componente AT del ATH) variables entre 1 y 6 mg/kg de peso corporal. En algunos casos, puede utilizarse una dosis de ATH de 3 mglkg durante la cirugía de bypass.
El ATH puede administrarse por vía intravenosa, en forma de una solución que contenga sales simples iso-osmóticas (como NaCI 0,15 M) Y reguladores fisiológicamente aceptables (como HEPES a un pH de 7,4). No se precisa ninguna otra proteína, disolvente, adyuvante u otro tipo de aditivos, pero pueden incluirse opcionalmente sin que ello produzca ningún efecto perjudicial significativo sobre la función del ATH.
El ATH puede aportar diversas ventajas frente a la heparina como anticoagulante sistémico. Uno de los problemas asociados a los anticoagulantes es el sangrado. Puede producirse el sangrado cuando se tiene demasiado anticoagulante en sangre. El ATH tiene una alta actividad anticoagulante, pero provoca un menor sangrado, comparado con la heparina. El ATH también presenta otras ventajas frente a la heparina. La AT del ATH siempre está activada y se ha eliminado el paso de unión de la heparina a la AT, que es lo que determina la frecuencia. Adicionalmente, el ATH inhibe directamente los factores de coagulación activados, como la trombina, con unas tasas más rápidas que la heparina. La heparina puede unirse de
forma no selectiva a las proteínas del plasma y de la superticie celular in vivo, y sin embargo, dicha unión no selectiva se reduce con el ATH. Además, el ATH tiene una vida media intravenosa más prolongada que la heparina. Por último, ya que la AT unida de forma covalente abarca una porción significativa de las cadenas de heparina del ATH, se reducen las interacciones adversas con las plaquetas, de forma que se mantiene la función normal de la plaqueta.
En otra realización de la presente invención, el ATH se puede utilizar para el tratamiento de la conjuntivitis leñosa. Un método de tratamiento de la conjuntivitis leñosa en un mamífero puede incluir la administración de una dosis del conjugado de antitrombina-heparina en un ojo del mamífero.
La oclusión retinal venosa causada por la trombosis ocular sólo está superada por la retinopatía diabética como causa de deficiencias o pérdidas de visión provocadas por enfermedades vasculares retinales. En el caso de que exista una deficiencia de plasminógeno, se produce la conjuntivitis leñosa provocada por una membrana de fibrina que cubre el ojo y oscurece la visión. El tratamiento de este problema trombótico con colirios a base de plasminógeno tiene unas proporciones modestas debido a los inhibidores, y los colirios a base de heparina son tan sólo parcialmente eficaces debido a la presencia variable de la antitrombina del plasma que es activada por la heparina. El ATH, a diferencia de la heparina, puede quedarse aislado fuera de los espacios vasculares, debido a sus grandes dimensiones. Asimismo, el ATH contiene antitrombina, por lo que no depende del sistema del paciente para aportar este agente a fin de que opere la heparina como anticoagulante. De este modo, el ATH puede tratar o prevenir con mayor eficacia la trombosis ocular. En un ejemplo, la conjuntivitis leñosa puede tratarse mediante la administración diaria de un colirio que contenga ATH. El ATH puede estar presente en el colirio con una concentración de 0,01 a 10 mg de ATH/mL, de 0,1 a 2 mg de ATH/mL, o de aproximadamente 1 mg de ATH/mL.
En otra realización, puede revestirse una lente de contacto con ATH. El paciente podrá llevar en el ojo la lente revestida para prevenir la trombosis ocular.
La gingivitis leñosa es otra afección relacionada con la deficiencia de plasminógeno. Puede utilizarse el ATH para el tratamiento de la gingivitis leñosa. En una realización, puede aplicarse periódicamente una solución de ATH por vía tópica en las encías del paciente, para prevenir la formación de fibrina en las encías.
En una realización adicional, puede utilizarse el ATH para el tratamiento de desórdenes de coagulación en los pulmones. Estos pueden incluir el síndrome de dificultad respiratoria
(SOR) Y las lesiones pulmonares agudas, causadas, por ejemplo, por la ventilación mecánica. Los experimentos realizados en plasma sobre células epiteliales pulmonares distales fetales (FOLE) han confirmado que el ATH inhibe la generación de trombina en mayor medida que una dosis equivalente de AT + UFH. Este resultado demuestra que el ATH se puede utilizar para la prevención o el tratamiento de la coagulación intrapulmonar. Mediante la instilación intratraqueal de ATH se consigue una elevada actividad anticoagulante en el líquido de lavado a lo largo de 48 h, sin actividad sistémica mensurable. Además, el ATH muestra una tendencia a la proliferación selectiva de epitelio en relación con los fibroblastos. Así pues, el ATH presenta muchas de las características necesarias para aliviar los principales factores que contribuyen al SOR, OBP Y enfermedades pulmonares inducidas por la ventilación.
El SOR neonatal y en adultos se caracteriza por la fuga de proteínas del plasma de diversos tamaños al espacio aéreo, lo que tiene como consecuencia la generación de trombina intersticial e intra-alveolar, con la consiguiente deposición de fibrina. Existen serias y convincentes evidencias que muestran claramente que la coagulación, que provoca la formación de fibrina, sigue siendo uno de los efectores, clave en las lesiones pulmonares. Ausente en un pulmón normal, la presencia de fibrina en los compartimentos alveolares e intersticiales, a lo largo de la evolución de las lesiones alveolares difusas, sigue siendo una de las características más prominentes del SOR. Desde la introducción de las terapias con surfactantes, se ha reducido la cantidad de fibrina directamente observada en pacientes de SOR. Sin embargo, teniendo en cuenta que en el SOR se encuentra presente una importante actividad de la trombina pulmonar, puede darse una carencia de polímero de fibrina entrecruzada debido al hecho de que la fibrina puede abandonar rápidamente el pulmón , como sucede con diversos tumores sólidos. De hecho, se ha observado que la mejora en la fibrinolisis intrapulmonar disminuye la fibrosis, lo que es otra demostración de la actividad de la fibrina en las lesiones pulmonares. La rotación de la fibrina en los pulmones de pacientes de SOR/OBP se ve alterada a nivel local, de forma similar a lo que sucede con el SOR agudo. Además, los depósitos de fibrina en la vasculatura y en la arteria pulmonar indican la existencia de mecanismos vasoconstrictores cuando se produce una mayor resistencia vascular pulmonar en el SOR. Los depósitos de fibrina intra-alveolar pueden tener importantes efectos negativos, tanto a corto como a largo plazo. Se ha demostrado que la fibrina perjudica de forma significativa la función tensioactiva, mientras que los productos relacionados con la degradación de la fibrina están vinculados a una mayor permeabilidad de la membrana alveolar-capilar, aumentando así las fugas al espacio aéreo de proteínas del plasma. Otra prueba de la
activación de los sistemas coagulantes y fibrinolíticos en el espacio intra-alveolar la constituye la presencia de un exceso de procoagulante y un déficit de actividades fibrinolíticas en el líquido de lavado bronco-alveolar (BAL) procedente de pacientes de SOR. Las fugas de proteína hacia los pulmones se han asociado a la activación sistémica de los linfocitos polimorfonucleares, linfocitos complemento y linfocitos de la coagulación. Los fibroblastos son activados por la fibrina y proliferan en áreas que la contiene, lo que conlleva un remodelado inadecuado de los tejidos pulmonares, como en el caso de la fibrosis.
La fibrina se produce por la división del fibrinógeno por la trombina, entrecruzándose posteriormente. Se ha demostrado que el inicio de la coagulación in vivo es básicamente el resultado de la aparición del factor tisular activo (FT). Los experimentos en los que se ha investigado la generación de trombina procedente de plasma en una mezcla de células pulmonares FDLE y fetales han demostrado que la actividad procoagulante en el epitelio pulmonar o los fibroblastos era debida a la activación del factor Vlla por el FT adherido a la superficie celular. De hecho, se ha identificado al FT como el único activador de la coagulación en cultivos de células de cáncer de pulmón. Los datos adicionales han demostrado que los neonatos prematuros presentan en el espacio aéreo una actividad trombótica similar a la del FT. Como característica conjuntiva, los pulmones menos desarrollados en el estado prematuro
o fetal son más permeables que los de los adultos a las moléculas que acceden al espacio aéreo procedentes de la circulación sistémica. De este modo, cualquier sustrato pulmonar del FT u otra actividad coagulante tiene mayores oportunidades de contactar con los factores de la cascada de coagulación en los recién nacidos, produciendo los depósitos de fibrina y las complicaciones detectadas en el SOR. De este modo, el estado de desarrollo puede influir sobre la susceptibilidad del individuo para las agresiones protrombóticas. Otras lesiones agudas pueden producirse como consecuencia de factores biológicos o mecánicos, que pueden estar asociados a patologías coagulantes. Por ejemplo, en el caso de una infección, existen importantes evidencias de generación de trombina pulmonar con resultados perjudiciales. Más recientemente, se ha demostrado la existencia de ciertos mecanismos físicos que provocan la generación de trombina y los depósitos de fibrina. Desde hace algún tiempo se sabe que los pacientes (especialmente los más jóvenes) que requieren ventilación mecánica prolongada muestran evidencias de daños en las estructuras tisulares del pulmón. Además, se ha indicado la existencia de coagulación pulmonar y circulatoria como resultado de la ventilación, que puede contrarrestarse mediante la administración de AT sistémica. Asimismo, el volutrauma ventilatorio ha producido lesiones pulmonares, que a su vez han provocado un deterioro en el
intercambio de gases, que se ha visto mejorado por la heparina. Una vez más puede inferirse que los daños inducidos por la ventilación asociados a la trombosis resultan especialmente importantes en los pacientes jóvenes. Los experimentos han demostrado que una ventilación con un elevado volumen tidal en ratas causa la liberación de FT funcional, tanto en la circulación como en las vías aéreas del pulmón. La generación de FT y trombina sólo se indujo en neonatos, pero no en animales adultos. Esto está en linea con otros resultados, en los que la actividad coagulante relacionada con el FT sólo se expresaba en humanos adultos con unos volúmenes tidales muy elevados, y sin presión espiratoria final positiva. La aparición de picos de actividad trombótica en ratas recién nacidas se produjo al cabo de menos de 15 min y persistió a lo largo de periodos de una hora de duración. Teniendo en cuenta la relación existente entre los depósitos de fibrina y la viabilidad pulmonar, el control de la actividad procoagulante del FT durante una lesión aguda (ventilatoria) o crónica (DBP) puede beneficiar la resistencia a la disfunción pulmonar y a la alteración adversa de los tejidos. Resulta interesante que es probable que el control de los daños también atenúe la permeabilidad del tejido pulmonar, lo que lleva a la presencia de fibrina y otras proteínas del plasma que inhiben la acción tensoactiva. De hecho, un agente que pudiese neutralizar la acción del FT, bloquear las vías que conducen a la disfunción de las células pulmonares y a una remodelación moderada de los tejidos durante una lesión pulmonar mejoraría enormemente el resultado en los pacientes, especialmente entre la población pediátrica.
El ATH puede hacer frente a muchas de las limitaciones que se encuentran en el tratamiento de los depósitos de fibrina pulmonar por parte de la UFH. El ATH presenta una actividad inhibitoria directa no catalítica frente a la trombina que es de 4 a 10 veces más rápida que la de las mezclas no covalentes de AT + UFH. La rápida tasa de inhibición directa de la trombina por parte del ATH garantizaría la neutralización de los bajos niveles de trombina implicados en la activación de la generación de trombina, y se encontraría presente en el líquido del edema, en el que las concentraciones de AT del plasma podrían ser insuficientes para inhibir la trombina. Además, la gran capacidad del ATH para catalizar la reacción de la AT con la trombina le permitiría también utilizar cualquier AT que acceda a los espacios alveolares. Aparte de la rápida inhibición de la trombina en la fase líquida, el ATH puede inhibir la trombina adherida a la fibrina que es resistente a la reacción con AT·UFH no covalente. La inhibición de la trombina adherida a los coágulos contribuye a reducir los coágulos venosos por parte del ATH sin que aumenten de forma significativa los efectos secundarios hemorrágicos. En el caso de las superficies FDLE, el ATH ha demostrado ser muy superior a la hora de inhibir la
generación de trombina de plasma en comparación con dosis similares de AT + UFH. Además, la comparación del ATH con heparinas no fraccionadas y de bajo peso molecular ha demostrado que el ATH puede inhibir con mayor potencia la generación de trombina en plasmas de adultos, niños o neonatos. La administración intra-traqueal de ATH en conejos y ratas recién nacidas demostró que pueden detectarse unos elevados niveles de actividad anticoagulante en el líquido de lavado al menos de 2 a 4 días más tarde, sin ninguna presencia de antígenos o actividad a nivel sistémico. De este modo, el ATH puede utilizarse como un anticoagulante rápido y potente, que puede inhibir los depósitos de fibrina pulmonar a lo largo de períodos de tiempo prolongados, sin efectos secundarios sistémicos. Tras una sola administración en los pulmones de bebés prematuros con riesgo de lesión pulmonar aguda, el ATH ejerce un interesante efecto diferencial en el crecimiento epitelial in vitro frente a fibroblastos, opuesto al impacto ejercido por la Al. La amplia investigación realizada sobre ATH inmovilizado en catéteres de poliuretano e injertos endoluminales ha demostrado que el conjugado presenta una actividad inhibitoria significativamente mayor frente a la trombina in vitro y una actividad anticoagulante in vivo. El ATH adherido a las matrices alveolares también puede ayudar a controlar el exceso de generación de trombina a nivel local y la acumulación de fibroblastos en comparación con otras células.
Concretamente, el ATH se puede administrar al proporcionar ventilación mecánica. La ventilación mecánica puede dañar los pulmones, especialmente en el caso de neo natos prematuros. Por lo tanto, mediante la administración de ATH a los pulmones de los neo natos, antes o durante la ventilación mecánica, pueden evitarse las complicaciones causadas por la formación de fibrina en los pulmones. Una sola dosis de ATH puede ser suficiente para aportar efectos anticoagulantes en los pulmones durante un prolongado período de tiempo. Por ejemplo, una sola dosis puede tener una duración de entre 6 horas y 1 semana, en algunos casos.
La presente invención también se extiende a una composición específica que incluye ATH junto con la fibrina. El ATH puede incubarse con fibrina fuera del organismo, de forma que la fibrina se adhiera al ATH. A continuación puede utilizarse esta composición para el tratamiento de los coágulos de la sangre. La composición puede inyectarse o administrarse de otra forma para atacar un coágulo. El complejo ATH:Fibrina de la composición tiende a unirse a la otra fibrina presente en el coágulo. Cuando el complejo ATH:Fibrina se adhiere a la superficie del coágulo, la superticie del coágulo adquiere una propiedad anticoagulante neta. De este modo se detiene el crecimiento del coágulo y se permite que se rompa.
En una realización, una composición para el tratamiento de los coágulos de sangre puede contener antitrombina, heparina, y fibrina. Al menos un 50 % en peso de la heparina puede conjugarse con antitrombina para obtener un conjugado de antitrombina-heparina. Al menos una porción de la fibrina puede unirse al conjugado de antitrombina-heparina. En
5 algunos casos, al menos un 50 % en peso de la fibrina puede unirse al conjugado de antitrombina-heparina. El porcentaje puede ser más elevado, uniéndose del orden del 90-100 % en peso de la fibrina de la composición al conjugado de antitrombina-heparina.
La composición del complejo ATH:Fibrina puede prepararse mezclando una solución de ATH con una solución de fibrina. La fibrina puede estar suficientemente diluida o contener un
10 inhibidor de la polimerización de la fibrina, como la amida glicina-prolina-arginina-prolina, de forma que la fibrina no se polimerice en la solución. Cuando la fibrina se une al ATH, si es necesario, puede separarse el complejo ATH:Fibrina de cualquier fibrina no enlazada, a fin de que la composición no introduzca fibrina activa adicional en el organismo del paciente.
15 Ejemplos
Los siguientes ejemplos muestran las realizaciones de la invención que mejor se conocen en la actualidad. No obstante, ha de entenderse que cuanto sigue no son sino ejemplos ilustrativos de la aplicación de los principios de la presente invención. Cualquier
20 experto en la materia podría concebir numerosas modificaciones y composiciones, métodos y sistemas alternativos sin alejarse del espíritu y el alcance de la presente invención. Las reivindicaciones adjuntas tratan de abarcar dichas modificaciones y configuraciones. De este modo, aunque la presente invención se ha descrito anteriormente de forma particularizada, los siguientes ejemplos facilitan detalles adicionales relativos a lo que en la actualidad se
25 consideran realizaciones prácticas de la invención.
Ejemplo 1
La incubación directa del ATH con un catéter de poliuretano se llevó a cabo de la forma
30 siguiente. Se preparó una solución de ATH, marcada con ATH radioetiquetado C251-ATH, ATH radioetiquetado utilizando Na1251(de Perkin Elmer, Woodbridge, ON) y marcadores iodobeads (de Thermo Fisher, Ottawa, ON) conforme a las instrucciones del fabricante), utilizándose para realizar las incubaciones con catéteres no activados. Dos de los catéteres (catéteres de
poliuretano de 15 cm de long. y calibre FR 7 fabricados por Saloman) se sumergieron en un cilindro que contenia 53 mL de una solución de 1 mg/mL ATH¡'25 I-ATH en PBS diluido tltO. Se absorbió el líquido del interior de cada catéter mediante una jeringa fijada al mismo, manteniéndose en su lugar mediante la jeringa fija. A continuación, los catéteres se incubaron 5 durante 24 horas a temperatura ambiente agitando con una varilla. Tras las 24 horas de incubación, los catéteres se extrajeron de la solución de incubación y se transfirieron a otro recipiente para su lavado. Los catéteres se lavaron secuencialmente, en volúmenes de 60 mL de: a) fosfato sódico 0,15 M, pH 8.0, b) NaCI 2 M fosfato sódico 0,15 M, pH 8.0, e) 0,1% SDS fosfato sódico 0,15 M, pH 8.0 (efectuándose 3 veces en esta solución), d) NaCI 0,15 M, fosfato 10 sódico 0,02 M pH 7.4 Y e) H20 . Durante cada lavado, la solución de lavado se agitó con una varilla y se hizo subir y bajar por el interior del catéter 50 veces con una jeringa. Tras el lavado, se cortaron segmentos de muestra de 0,5 cm (3 por catéter) y se sometieron a recuento de gamma-radioactividad a fin de determinar la cantidad de ATH radioetiquetado que permanecía adherido al catéter. Cada segmento tenía una superficie total de 1 cm2 (interior + exterior). Los
15 resultados se muestran en la tabla 1: Tabla 1
Número de muestra del catéter
Recuentos por minuto pmoles de ATH calculados
1
t7583 0,265
2
13642 0,206
3
18070 0,273
4
15746 0,237
5
14727 0,222
6
14567 0,220
Promedio
15723 0,237
Los valores de "pmoles de ATH calculados" se calcularon con arreglo a un factor de conversión de que 66.300 recuentos por minuto equivalían a 1 pmol de ATH. Los ensayos ELlSA de
20 segmentos de 0,5 cm correspondientes a segmentos de catéteres semejantes para calcular la cantidad de ATH superficial (en términos de la AT detectada por el ensayo) verificaron que la masa total de ATH del catéter también era del orden de una décima de 1 pmol. Este experimento demuestra que, sorprendentemente, el ATH libre de la solución puede adherirse fuertemente a la superficie del catéter no modificado. Esto también demuestra que
una solución de limpieza y sellado a base de ATH puede ayudar a anticoagular el catéter en la superficie del catéter, ya que el ATH se adherirá a la superficie. Sucede lo contrario que con la heparina, que no se adhiere a la superficie de los catéteres. El ATH siguió adherido tras un copioso lavado con una solución tampón, detergente y un alto contenido de sal. Por el contrario, no se observó que la heparina se adhiriese a las superficies de poliuretano.
Ejemplo 2
El incubado directo de ATH con un catéter de poliuretano, incluyendo secado, puede realizarse como sigue. El siguiente ejemplo muestra en detalle como puede aplicarse un revestimiento de antitrombina-heparina (ATH) covalente no modificada a superficies de polímero no reactivas y pasivas sin modificar ni activar previamente el ATH o la superficie de polímero. Se prepara una solución de ATH con un líquido regulador adecuado (con un rango de pH variable entre 4,0 y 10,0, Y en algunos casos de aproximadamente 7,4) con una concentración de ATH (en términos de la fracción de AT) variable entre 0,01 mg/mL y 10 mg/mL y en algunos casos situada en torno a 1 mg/mL. Se sumergieron hasta 20 catéteres (como por ejemplo, catéteres de poliuretano de 15 cm de longitud) en un cilindro que contenia 53 mL de la solución de ATH. El líquido se aspiró del interior de cada catéter medianta una jeringa fijada al mismo y se retuvo mediante la jeringa. A continuación, los catéteres se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente agitando con una varilla. Tras las 24 horas de incubación, se retiraron las jeringas de la solución de incubación, se retiraron los catéteres de la solución de incubación, cada catéter se mantuvo en vertical con el extremo inferior en contacto con un filtro de papel de celulosa, y se dejó que saliese el líquido por gravedad desde el interior y el exterior del catéter a lo largo de un período de tiempo (normalmente, en torno a 1 minuto). A continuación, los catéteres se suspendieron verticalmente para que se secasen (evaporación del disolvente) sin que la punta inferior tocase superficie sólida alguna. El secado, durante un máximo de 48 horas (en algunos casos, alrededor de 18 horas) puede efectuarse: al aire, a temperatura ambiente, en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente, en atmósfera de gases nobles a temperatura ambiente, en una atmósfera abierta de gas calentado a 60 grados Celsius o en vacío (para liofilización). Una vez secos, los catéteres se utilizan in vitro o se colocan en bolsas precintadas (con membranas permeables al gas) y se esterilizan por exposición a óxido de etileno, para su uso en el futuro en pacientes o en otras aplicaciones médicas.
Ejemplo 3
Efectividad de la inhibición por parte del ATH de los factores de Coagulación en las Células endoteliales que cubren los vasos sanguíneos (superficie de vasos sanguíneos artificiales). Las investigaciones in vitro de la inhibición del coagulación por parte del ATH se han llevado a cabo básicamente en plasma o soluciones tampón que contenían proteínas purificadas. In vivo, la superficie endotelial puede modular la coagulación de diversas formas, como facilitando emplazamientos para el enlace de receptores de proteína para la trombina que alteren su actividad (por ejemplo, thrombomodulin (TM)), y expresando moléculas de glicosaminoglicano anticoagulante (GAG) (por ejemplo, heparán sulfato (HS)). El objetivo de este estudio consistió en comparar las actividades anticoagulantes del ATH y del AT +H en presencia de endotelio.
Se adquirieron células endoteliales venosas procedentes de cordones umbilicales humanos (HUVEC), EBM-2 media y EGM-2MV Bullet Kits a Lonza (Walkersville, MD, EE.UU.). Se adquirió un Medio Mínimo Esencial (MEM) a Invitrogen. El Ila y el Xa procedían de Enzima Research Laboratories (50uth Bend, IN, EE.UU.). Los lotes de plasma humano normal y de Al humana purificada procedían de Affinity Biologicals (Ancaster, ON, CA). La heparina, el bromuro de hexadimetrina (polybrene), el heparán sulfato y la gelatina se adquirieron a Sigma (Mississauga, ON, CA). El Fibrinógeno (plasminógeno, fibronectina, sin FXIII) y la trombomodulina recombinante humana procedían de American Diagnostica Inc. (Stamford, CT, EE.UU.). El 5-2238 Y el 5-2222 procedian de Diapharma (West Chester, OH, EE.UU.). El AlH se produjo en la forma descrita anteriormente. El resto de reactivos consistía en reactivos comerciales.
Se cultivaron las células HUVEC sobre plástico tratado con un cultivo tisular (Primaria, BO, Mississauga,ON, CA) revestido con un 2% de gelatina. Para los experimentos, las células se sembraron en 96 placas pocillo a razón de 20000-40000 células/mL y se cultivaron hasta la confluencia en un medio de EBM-2 suplementado con el EGM-2MV Bullet kit, en una atmósfera de aire humidificado -5% CO2. Las células se utilizaron entre los pases 2 y 5.
Se midieron los valores de la constante de segundo orden (kú para la inhibición del conjugado ATH y la inhibición de AT + H no covalente de Ilay Xa a 37"C mediante un ensayo discontinuo bajo unas condiciones de pseudo-primer orden (relación inhibidor:enzima = 10:1). El Ila, Xa, AT, UFH y ATH se diluyeron en un Medio Mínimo Esencial (MEM) que contenía
10mM de HEPES a pH 7,4 Y 0,1% (p/v) de PEG3000 (MEMPH). Ellla o Xa se incubaron con AT+H O ATH en pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía placas únicas confluentes de HUVEC. Las capas únicas se lavaron con MEMPH antes de añadirles los componentes de la reacción. Las proporciones molares de H:AT en las mezclas no covalentes de AT+H fueron de
23:1 y 10:1 para las reacciones con Ila y Xa respectivamente. Se observó previamente que estas proporciones H:AT producían unos valores máximos de k2 para inhibición en ausencia de HUVEC. Tras la incubación a lo largo de diversos intervalos de tiempo, las reacciones se detuvieron al añadir 1,25 mg/mL de polibreno en una solución reguladora de TSP (20mM de Tris-CI, 150mM de NaCI, 0,6% (p/v) de PEG8000 pH 7.4) que contenía 0,4 mg/mL del sustrato cromogénico adecuado (8-2238 para Ila o 8-2222 para Xa). Las actividades residuales de la enzima en cada pocillo se midieron como el cambio en A405 a lo largo del tiempo, utilizando un espectrómetro SpectraMax Plus 384 (Molecular Oevices, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Los valores de k2 se calcularon tomando el valor negativo de la pendiente de los trazados de la actividad enzimática residual frente al tiempo de inhibición con anterioridad a la adición del polibreno/sustrato y dividiendo este valor negativo de la pendiente por la concentración de inhibidor (es decir, ATH o AT). También se realizaron idénticos ensayos en una superlicie plástica (no HUVEC) para comparación, utilizando placas no tratadas de 96 pocillos Falcon ProBind de fondo plano (BO, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.).
En experimentos separados, los pocillos que contenían monocapas HUVEC se lavaron con MEMPH, y se añadieron 20 ~L de 2nM Ila (disuelto en MEMPH) a múltiples pocillos. Tras 3 min de incubación a 37"C, se añadieron simultáneamente a todos los pocillos 80 IlL of MEMPH que contenía 1 mg/mL de fibrinógeno humano y diversas concentraciones de AT +H o ATH (01,25nM ATH o AT con una proporción H:AT de 23:1). La formación de coágulos de fibrina a 37"C se controló por turbidimetría, midiendo el valor de 00350 mediante un espectrómetro 8pectraMax Plus 384. El tiempo de retardo en la formación de coágulos se definió como el tiempo que tardaba el 00350 en alcanzar un valor de 0,005. Si el 0 0 350 no alcanzaba dicho valor de 0,005 al cabo de 90 min, se asignaba un tiempo de retardo de 90 mino También se realizaron ensayos sobre plástico (no HUVEC) para comparación. En algunos ensayos realizados en plástico, se mezclaron 2nM de Ila con 10nM de trombomodulina (TM) o 5~M de heparán sulfato (H8) con anterioridad a la etapa de incubación de 3 mino
Los resultados se expresan como la media de ± 8EM. El análisis de la importancia estadística utilizando el {-test de Student, donde p<0,05 se consideró significativo. El {-test de 8tudent se llevó a cabo utilizando Minitab 13 para Windows.
Para evaluar el efecto del endotelio en la inhibición de Ila and Xa catalizada por heparina por parte de AT+H o ATH no covalentes, se determinaron los valores de k2 para las tasas de inhibición de estas proteasas en ausencia o presencia de una monocapa de HUVEC. Las FIGs. 1 A Y 1 B muestran la tasa de inhibición de los factores de coagulación por AT +H Y ATH en presencia de endotelio. Los valores de K2 se determinaron para la inhibición de Ila (A) y Xa (8) por ATH y AT +H en pocillos con superficie plástica, o en pocillos cubiertos por una capa única de HUVEC. Los valores K2 se midieron en condiciones de pseudo primer orden , utilizando un método discontinuo. Las proporciones molares de H:AT en la mezcla AT+H fueron de 23:1 (A) y
10:1 (B), que se ha demostrado previamente que ofrece kas máximos valores de k2 para la inhibición de Ila y Xa respectivamente. Los datos representan la media de ± SEM (n2::S). En ausencia de HUVEC, los valores de k2 para la inhibición de Ila y Xa por el ATH eran más elevados que los valores de k2 correspondientes a la inhibición por AT +H no covalente (FIGs. 1A y 18). El grado de incremento era mayor en el caso dellla, situándose en un factor de 2,3. Cuando se hallaba presente endotelio, la inhibición de Ila y Xa por ATH era nuevamente más rápida que con AT+H (FIGs. 1Ay 1B). En comparación con el plástico, los valores absolutos de k2 para ATH y AT +H en células endoteliales disminuyeron significativamente (p<O,OS) en el caso de lIa (FIG. tAl, Y se redujeron ligera, pero no significativamente para Xa (p>O,t) (FIG. 1 B).
La inhibición de Ila se investigó adicionalmente mediante un ensayo de formación de fibrina, en el cual se incubó Ila en pocillos con o sin una monocapa de HUVEC, seguido de la adición de fibrinógeno y anticoagulantes a los pocillos. La figura 2 muestra la inhibición de la formación de fibrina inducida por Ila por parte de AT+H y ATH en presencia de endotelio. Ellla se incubó en pocillos de plástico o recubiertos de HUVEC, antes de añadir una mezcla de fibrinógeno purificado, CaCI2 y AT +H o ATH. La concentración final de Ila era de 0,4nM. Las concentraciones finales de inhibidor (AT o ATH) se indican en el eje de abscisas, y la proporción molar de H:AT en la mezcla de AT +H era de 23:1. La formación de Fibrina se controló por turbidimetría, y el tiempo de retardo representa el tiempo necesario para alanzar un valor 00350 = 0,005. Los datos representan la media ± SEM (n2::5). La figura 2 muestra que, al contrario que en los experimentos de tasa, la presencia de endotelio no ejercía efectos sobre la inhibición de Ila mediante la actividad de clivaje del fibrinógeno por el ATH o el AT+H. Al igual que en el caso de los experimentos de tasa. El ATH se mostró más efectivo que el AT+H a lIa hora de impedir la formación de fibrina por parte de lIa.
Las dos moléculas que constituyen los principales puntos de enlace del factor lI a en la superficie endotelial son HS y TM. Para determinar si el enlace del Ila a cualquiera de estas moléculas ha afectado a la actividad anticoagulante, se preincubaron HS o TM solubles con lIa y se evaluó la formación de fibrina en presencia o ausencia de ATH o AT +H. HS no afectó a la formación de fibrina inducida por Ila (tiempo de inicio = 97,3 ± 6,6 s frente a 95.4 ± 6,4 s en presencia y ausencia de HS respectivamente, n=9). La presencia de TM retardó significativamente la formación de fibrina con un tiempo de inicio de 122,4 ± 1,7 s, comparado con 97,9 ± 6,4 s en ausencia de TM (p=O,003, n<!:8). Las figuras 3A y 38 muestran la inhibición de la formación de fibrina inducida por Ila adherido en HS o TM. Ellla se mezcló con un exceso de HS (A) o TM (B) antes de llevar a cabo los ensayos de formación de fibrina en pocillos de plástico, como se describe en la figura 2. Las concentraciones finales de Ila, HS and TM fueron de O,4nM, 1~M y 4nM respectivamente. Las concentraciones finales del inhibidor (AT o ATH) se indican en el eje Xy la proporción molar de H:AT en la mezcla AT+H fue de 23:1. Los datos representan la media ± SEM (n<!:4). El ATH mantuvo su superior función anticoagulante en comparación con AT +H en presencia de HS (FIG. 3A) Y TM (FIG. 38).
Ejemplo 4
Lavado y sellado de catéteres utilizando una solución de ATH. Se preparó una solución de ATH en NaCI 0,15 M, con o sin una solución tampón (como HEPESO,05 M) fijando el pH en 7,4. La concentración de ATH en esta solución está en torno a 1,5 U/mL en términos de la actividad del anti-factor Xa, pero en algunos casos puede oscilar entre 0,01 U/mL y 100 U/mL de actividad del anti-factor Xa. La solución de ATH se esteriliza por filtrado a través de un filtro estéril con poros de 0,2 micrómetros en el interior de una campana de flujo laminar con flujo de aire estéril. Cuando todavía se encuentra en el interior del entorno estéril, la solución estéril filtrada de ATH se sella en el interior de botellas estériles que contienen un tabique para su posterior retirada mediante jeringas estériles inmediatamente antes de su utilización, o se toman cantidades medidas en jeringas esterilizada que a continuación se taponan.
Tras la inserción de un catéter en una vena o arteria del paciente, se conecta una jeringa que contenga alrededor de 2 mL (en algunos casos, entre 0,1 mL y 50 mL de volumen total) de la solución esterilizada de ATH, como se ha descrito anteriormente, al extremo exterior del catéter, y toda la solución de ATH de la jeringa se inyecta en el catéter, seguido del precintado del catéter con un tapón esteril.
Después de transcurrido un período variable entre 1 hora y 7 días, puede retirarse el tapón y sustituirse por una jeringa, de tal forma que pueda extraerse una muestra de sangre o pueda inyectarse medicación. Tras la extracción de la sangre o la inyección de la medicación, la jeringa utilizada para extraer muestras de sangre o administrar la medicación se sustituye por
5 otra jeringa que contenga una solución de ATH similar a la anterior, inyectándose la solución de ATH y tapando el catéter como en el aso anterior. Este proceso se repite siempre que sea necesario, hasta la retirada del catéter.
Ejemplo 5
10 Tratamiento de la conjuntivitis leñosa. Se prepara una solución de ATH en NaCI 0,15 M, con o sin regulador (como HEPES 0,05 M) con un pH de 7,4. La concentración de ATH en esta solución estaría normalmente en torno a 1 miligramo/mL (en términos del contenido de AT) pero podría oscilar entre 0,001 miligramos/mL y 11 miligramos/mL. La solución de ATH se esteriliza
15 por filtrado a través de un filtro estéril con poros de 0,2 micrómetros dentro de una campana de flujo laminar con caudal de aire estéril.
Un paciente que requiera tratamiento para impedir la aparición de conjuntivitis leñosa en las superficies de los tejidos que se encuentran fuera del sistema vascular recibe regularmente partes alícuotas de una solución que contenga ATH. En el caso de la conjuntivitis leñosa del
20 ojo, se aplican una o más veces al día 1 o más gotas (volumen aproximado de la gota situado entre 10 microlitros y 100 microlitros) de la solución de ATH descrita anteriormente, en función de la gravedad de la enfermedad del paciente específico. Este proceso se repite continuamente durante toda la vida del paciente.
25 Ejemplo 6
Los datos preliminares más recientes sugieren que el ATH ejerce un interesante efecto diferencial sobre el crecimiento epitelial frente al del fibroblasto in vitro que es opuesto al impacto ejercido por la AT (véase a continuación la Tabla 2). Las extensas investigaciones
30 realizadas sobre el ATH inmovilizado en catéteres de poliuretano e injertos endoluminales han demostrado que el conjugado ATH presentaba una significativamente mayor actividad inhibitoria frente a la trombina in vitro y una actividad anticoagulante in vivo. Estos resultados
sugieren que el ATH adherido a las matrices alveolares puede ayudar a controlar la generación de un exceso de trombina y la acumulación de fibroblastos en relación con otras células.
Tabla 2. Efecto de la AT y del ATH sobre el crecimiento de las células del pulmón en un medio MEM
Porcentaje de cambio en el número de células con respecto a la solución de Control
Tratamiento Células epiteliales del Fibroblasto células pulmón pulmón
500 nM AT -19,3 ± 3,3 -0,141 ± 1,76 500 nM ATH 29,1 ± 13,6" 13,9 ± 4,16"·
Se prepararon cultivos de células pulmonares primarias de ratas recién nacidas en 24 pocillos de una placa de pocillos durante 1 día en una atmósfera húmeda con un 5% de 10 CO2/95% de aire a 37 0 C en un medio MEM suplementado con antitrombina (AT) o ATheparina (ATH) covalente. A continuación se liberaron las células de la monocapa utilizando tripsina, y se determinó el número total de células utilizando un hemocitÓmetro. Los resultados se expresan como el valor medio ± SEM (n=5) del porcentaje de cambio en el número de células con respecto a cultivos de control en un medio MEM no suplementado. Se indican unas
15 importantes diferencias en los resultados con ATH frente a los obtenidos con AT en el mismo grupo de células r, .. y ••• media P = 0,002, P = 0,026 Y P = 0,027, respectivamente). Aunque la AT por sí sola inhibió significativamente la proliferación de células epiteliales, pero no de fibroblastos, el ATH mejoró preferencialmente el crecimiento epitelial frente a los fibroblastos.
20 Ejemplo 7
Investigación del tratamiento con ATH de pulmones que sufrían estrés/lesiones agudas. Se realizaron experimentos preliminares utilizando ATH por vía intratraqueal en animales recién nacidos que de forma aleatoria respiraban normalmente o se sometieron a un elevado volumen
25 (1 h) de ventilación mecánica. La figura 4 muestra los tiempos de coagulación de muestras de plasma recalcificadas procedentes de sangre citrada procedente de ratas de 2 a 6 días de edad tratadas por vía intrapulmonar con ATH o una solución reguladora de PBS, con o sin un elevado
volumen de ventilación mecánica durante 1 hora. Los ensayos de coagulación demostraron fehacientemente que con respecto a las soluciones de control instiladas con un regulador, el ATH eliminó el reducido tiempo de coagulación del plasma derivado de la actividad sistémica del factor tisular (FT) asociada a la ventilación (véase la figura 4). Dada la evidente generación de trombina pulmonar y la formación de fibrina relacionada con el FT, la neutralización directa del complejo clave Vlla-FT por el conjugado ATH bloquearía la activación de la coagulación en el pulmón, donde los inhibidores del plasma serán escasos.
Ejemplo 8
Se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto del ATH en la producción de tensioactivos en las células pulmonares para medir el potencial de instilación de ATH en el pulmón (para prevenir el SOR o daños pulmonares provocados por la ventilación mecánica) a fin de aumentar los niveles de tensioactivos e impedir el colapso del espacio aéreo y mejorar la transferencia de gases. Se recopilaron los siguientes datos preliminares (véase la figura 5). Se aisló epitelio pulmonar distal fetal (FOLE) de ratas fetales de 20 días y se cultivó en 24 pocillos de una placa de pocillos de cultivo. El medio de cultivo se suplementó con 100 ~g/mLde ATH o con una solución tampón de control. La figura 5 muestra inmunotransferencias de medios celulares producidos por células epiteliales pulmonares distales fetales de ratas (FDLE) incubadas con una solución tampón o con ATH (100 ¡.Jg/mL medio de cultivo), en las que se detectó la proteína tensioactiva C. Las inmunotransferencias de medios celulares mostraron un incremento en la proteína tensioactiva C producida por células FOLE incubadas con ATH (100 ¡.Jg/mL de medio de cultivo).
Ejemplo 9
ATH:Fibrina Anticoagulante para el tratamiento de un coágulo. A continuación se indica la metodología propuesta para la preparación de ATH enlazado a un manó mero de fibrina que puede inyectarse para tratar un coág ulo en un paciente, y hacer que la superficie del coágulo adquiera propiedades anticoagulantes netas. La utilización de ATH :Fibrina puede suponer un agente neutralizador de la coagulación muy eficaz, que puede utilizarse a bajas concentraciones en comparación con la inyección de ATH solamente, ya que el complejo ATH:Fibrina tenderá a unirse a otras fibrinas presentes en una concentración importante, como
en el caso de un coágulo que contenga fibrina polimerizada. A diferencia del ATH ya adherido a la fibrina, el ATH libre acabaría llegando a otros objetivos, además del coágulo de fibrina y por lo tanto, podría necesitar ser administrado a unas concentraciones mucho más elevadas. A continuación se indica un método para la preparación de ATH adherido al monómero de Fibrina y su administración a un paciente que tenga un coágulo.
Se prepara una solución madre de monómero de fibrina en ácido acético, como sigue. Se utiliza fibrinógeno disponible comercialmente (Enzima Research Laboratories, South Bend, IN, EE.UU.). En los experimentos anteriores, se siguió el siguiente protocolo para preparar soluciones de fibrina soluble. Inicialmente se eliminó cualquier resto de fibronectina contaminante del fibrinógeno comercial mediante 2 incubaciones de 15 mL de 130 11M de fibrinógeno (masa molecular molecular 340000 Da) con 5 mL agarosa de gelatina (Sigma, Mississauga, Ontario, Canadá) durante 30 min, seguido de centrifugado y recogida del sobrenadante que contiene el fibrinógeno. La concentración del Fibrinógeno se determinó mediante absorbencia a 280 nm utilizando una absorbencia de 10 mg/mL = 15,1 (tras la corrección por dispersión de luz a 320 nm utilizando la ecuación corregida A280 = A280 -1,7 x ~2{l) . El monómero de fibrina soluble se preparó mediante el método siguiente. El fibrinógeno purificado (60 -100 ~M) se incubó con 2 nM de trombina (Enzima Research Laboratories, South Bend, IN, EE.UU.) a 37 ° C durante 4 -6 horas, seguido de un centrifugado a 2000 g durante 5 minoEl pellet del polímero de fibrina se situó en una bolsa de diálisis (12000 -14000 peso molecular cortado), se dializó frente a H20 (4 "C) para eliminar los fibrinopéptidos A y B Y se volvió a dializar frente a ácido acético 0,02 M hasta que se disolvió la fibrina (-8 horas). La concentración de la fibrina soluble en la solución se obtuvo mediante absorbencia a 280 nm y utilizando un peso molecular de 340000 y absorbencia de 10 mg/mL = 14,0. Típicamente se obtuvieron 100 11M de fibrina soluble y se almacenaron a -80 0 C.
Para la preparación de soluciones de fibrina para su enlace con ATH, se neutralizaron 6 volúmenes de la fibrina soluble en 0,02 M de ácido acético con 4 volúmenes de Tris-HCI 1 M con pH 7,5 que contenían 10 mM de GPRP-NH2 (Sigma, Mississauga, Ontario, Canadá) para bloquear la polimerización de la fibrina en condiciones neutrales. El monómero resultante de fibrina soluble neutralizada de 40000 nM podía diluirse aun más o mantenerse a esa concentración antes de combinarlo con el ATH. Aunque pueden prepararse soluciones con diversas proporciones molares de fibrina:ATH, puede añadirse ATH a la fibrina (a un pH situado en torno a 7,5 en presencia de GPRP-NH2) a unas concentraciones molares aproximadamente iguales hasta un ligero exceso molar (en torno a un 10%) comparado con la
fibrina. En un experimento típico, se mezcló rápidamente 1 volumen de 40000 nM de ATH en Tris-HCI 0,02 M NaCI 0,15 M Y glical de palietilena 8000 al 0,6% con un pH de 7,4 (TSP) que contenía GPRP-NH2 0,01 M con un volumen equivalente de la solución de fibrina neutralizada de 40000 nM. La mezcla resultante, designada como solución 1 de ATH:Fibrina contiene 20000
5 nM de ATH + 20000 nM de monómero de fibrina soluble.
Las soluciones de ATH + fibrina pueden inyectarse por vía intravenosa en pacientes con coágulos, para neutralizar la actividad procoagulante del coágulo, de forma que el propio sistema fibrinolítico nativo del organismo pueda digerir satisfactoriamente el coágulo para eliminarlo. La dosis de producto ATH:Fibrina a suministrar al paciente puede variar ampliamente
lOen función del grado de trombosis o de actividad coagulatoria o tamaño del coágulo del paciente. Utilizando la solución de ATH:Fibrina descrita anteriormente, puede administrarse cualquier cantidad entre 0,01 mUkg de peso corporal y 10 mLlkg de peso corporal mediante inyección intravenosa, siendo lo más corriente 0,5 mUkg de peso corporal.
Otras opciones de preparación de soluciones de ATH + monómero de fibrina incluyen la
15 rápida disolución de 100 ~M de fibrina en ácido acético 0,02 M con Tris-Hel 0,02 M NaCI 0,15 M Y 0,6% de glicol de polietileno 8000 a un pH de 7,4 (TSP) hasta una concentración de < 100 nM, donde la fibrina no se polimerizará con demasiada rapidez. Un volumen equivalente de ATH a la misma concentración se mezclará entonces rápidamente en la solución de fibrina diluida y la mezcla resultante se inyectará a unas dosis variables entre 0,1 mLlkg de peso
20 corporal hasta 10 mLlkg de peso corporal, siendo lo más común 2 mUkg de peso corporal. Ha de entenderse que las configuraciones anteriores pretenden ilustrar la aplicación de los principios de la presente invención. De este modo, aunque la presente invención se ha descrito más arriba en relación con los ejemplos de realización, será evidente para cualquier experto en la materia que pueden efectuarse numerosas modificaciones y configuraciones
25 alternativas sin alejarse de los principios y conceptos de la invención , tal y como se establecen en las reivindicaciones.

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método de revestimiento de una superficie polimérica con un conjugado de antitrombina-heparina, que comprende la puesta en contacto de la superficie polimérica con una
    5 solución de conjugado de antitrombina-heparina de forma que el conjugado de antitrombinaheparina recubra directamente la superficie polimérica sin grupos ligantes entre el conjugado de antitrombina-heparina y la superficie polimérica.
  2. 2. El método según la reivindicación 1, donde la superficie polimérica se selecciona
    10 entre los integrantes del grupo formado por una superficie de poliuretano, una superficie de polietileno, una superficie de polipropileno, una superficie de politetrafluoruro, una superticie de polidimetilsiloxano, una superficie de copolímero de etileno-ácido acrílico, una superficie de Dacron, una superficie de poliéster-poliuretano, una superficie de poliuretano-policarbonato, una superficie de cloruro de polivinilo, una superficie de silicona, una superficie de
    15 polidimetilsiloxano, una superficie de acero inoxidable, una superficie de titanio, una superficie de goma látex, una superficie de nitinol, una superficie de Nylon, una superficie de Tereftalato de polietileno, una superficie de poliestireno, y combinaciones de dichos productos.
  3. 3. El método según la reivindicación 1, donde la superficie polimérica es una superficie 20 de poliuretano.
  4. 4. El método según la reivindicación 1, donde la superficie polimérica es una superficie de un producto sanitario seleccionado entre los integrantes del grupo formado por un catéter intravenoso, un catéter intra-arterial, un catéter central insertado periféricamente, un catéter
    25 central, un catéter de Swan-Ganz, un stent coronario, un shunt arteriovenoso, una válvula mecánica, un órgano artificial, un catéter de diálisis, una línea de circuito sanguíneo de diálisis, una membrana de diálisis, una línea extracorpórea de oxigenación de la membrana, una membrana de oxigenación de la membrana extracorpórea, y un contenedor de almacenamiento de sangre.
  5. 5. El método según la reivindicación 1, donde la superficie polimérica es una superficie interior de un lumen de un catéter, y donde la puesta en contacto de la superficie polimérica con
    la solución de conjugado de antitrombina-heparina comprende la inserción de la solución en el lumen del catéter y la incubación del catéter con la solución durante un período de tiempo.
  6. 6.
    El método según la reivindicación 5, donde el período de tiempo varía entre 5 minutos y 48 horas.
  7. 7.
    El método según la reivindicación 5, que comprende adicionalmente el vaciado de la solución tras la incubación y la evaporación del disolvente de la solución residual contenida en ellumen.
  8. 8.
    El método según la reivindicación 1, donde la superficie polimérica es una superficie exterior de un catéter, y donde la puesta en contacto de la superficie polimérica con la solución de conjugado de antitrombina-heparina comprende la inmersión del catéter en la solución y la incubación del catéter con la solución durante un período de tiempo.
  9. 9.
    El método según la reivindicación 8, donde el período de tiempo oscila entre 5 minutos y 48 horas.
  10. 10.
    El método según la reivindicación 8, que comprende adicionalmente el vaciado de la solución tras la incubación y la evaporación del disolvente de la solución residual contenida en el catéter.
  11. 11.
    Un producto sanitario de reducida trombogenicidad, comprendiendo dicho producto sanitario una superficie polimérica revestida con un conjugado de antitrombina-heparina sin grupos ligantes entre el conjugado de antitrombina-heparina y la superficie polimérica.
  12. 12.
    El producto sanitario según la reivindicación 11 , donde la superficie polimérica es una superficie de poliuretano.
  13. 13.
    El producto sanitario según la reivindicación 11 , donde el producto sanitario se selecciona entre los integrantes del grupo formado por un catéter intravenoso, un catéter intraarterial, un catéter central insertado periféricamente, un catéter central, un catéter de SwanGanz, un stent coronario, un shunt arteriovenoso, una válvula mecánica, un órgano artificial, un
    catéter de diálisis, una línea de circuito sanguíneo de diálisis, una membrana de diálisis, una línea extracorpórea de oxigenación de la membrana, una membrana de oxigenación de la membrana extracorpórea, una prótesis in vivo y un contenedor de almacenamiento de sangre.
    5 14. Un método de revestimiento por liofilización de una superficie polimérica de un producto sanitario, que comprende:
    La puesta en contacto de la superficie polimérica del producto sanitario con una solución de antitrombina-heparina que comprenda un conjugado de antitrombina-heparina y un disolvente en ausencia de grupos ligantes;
    10 Permitir que se vacíe el exceso de solución de antitrombina-heparina de la superficie polimérica; y Evaporar el disolvente de la superficie polimérica al menos bajo vacío parcial.
  14. 15. Un método de tratamiento de una afección médica mediante la inhibición de la
    15 trombogénesis en un mamífero, comprendiendo dicho método: la administración de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina al mamífero, donde al menos un 98% de las cadenas de heparina del conjugado de antitrombina-heparina tienen un peso molecular de más de 3.000 daltons.
    20 16. El método según la reivindicación 15, donde la afección médica es el síndrome de dificultad respiratoria y donde la administración de la dosis del conjugado de antitrombinaheparina comprende la administración del conjugado de antitrombina-heparina en un pulmón del mamífero.
  15. 17. Un método para el tratamiento de la conjuntivitis leñosa en un mamífero, que
    25 comprende la administración de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina en un ojo del mamífero.
  16. 18. Un método para prevenir o tratar lesiones producidas por ventilación mecánica en
    mamíferos, que comprende la administración de una dosis de un conjugado de antitrombina30 heparina en un pulmón del mamífero.
  17. 19. Un método para el tratamiento de la gingivitis leñosa en un mamífero, que comprende la administración de una dosis de un conjugado de antitrombina-heparina en las encías del mamífero.
    5 20. Una solución de lavado y sellado de un catéter intravenoso o intra-arterial, que comprende un conjugado de antitrombina-heparina.
  18. 21.
    Un sistema de lavado y sellado, que comprende: Un catéter intravenoso o intra-arterial; 10 Una solución de limpieza y sellado configurada para ser introducida a través del catéter,
    donde la solución de limpieza y sellado comprende un conjugado de antitrombina-heparina; y Una jeringa configurada para inyectar la solución de limpieza y sellado en el catéter.
  19. 22.
    Un método para el mantenimiento de la permeabilidad de un catéter, que 15 comprende:
    La inserción de un catéter en una vena o arteria de un paciente de forma que una abertura interior del catéter se abra en el interior de la vena o arteria y una abertura exterior del catéter se abra fuera del paciente ; La inyección de una solución que comprende un conjugado de antitrombina-heparina en
    20 el catéter a través de la abertura exterior del catéter;
    El sellado de la abertura exterior del catéter de tal forma que al menos una porción de la solución que comprende el conjugado de antitrombina-heparina permanezca en el interior del catéter.
    25 23. Una composición para el tratamiento de coágulos de sangre, que comprende antitrombina, heparina, y fibrina, donde al menos un 50 % en peso de la heparina se conjuga con la antitrombina para obtener un conjugado de antitrombina-heparina, y donde al menos una porción de la fibrina se adhiere al conjugado de antitrombina-heparina.
    30 24. La composición según la reivindicación 23, donde al menos un 50 % en peso de la fibrina se adhiere al conjugado de antitrombina-heparina.
ES201790052A 2015-06-11 2016-06-10 Dispositivos médicos, sistemas y métodos que utilizan composiciones de anti-trombina heparina. Active ES2671844B1 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562174308P 2015-06-11 2015-06-11
US62/174,308 2015-06-11
PCT/US2016/036855 WO2016201202A1 (en) 2015-06-11 2016-06-10 Medical devices, systems, and methods utilizing antithrombin-heparin compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2671844A1 true ES2671844A1 (es) 2018-06-08
ES2671844B1 ES2671844B1 (es) 2019-03-22

Family

ID=57504735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES201790052A Active ES2671844B1 (es) 2015-06-11 2016-06-10 Dispositivos médicos, sistemas y métodos que utilizan composiciones de anti-trombina heparina.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11752242B2 (es)
JP (1) JP2018524067A (es)
AU (1) AU2016274868B2 (es)
CA (1) CA2989110A1 (es)
ES (1) ES2671844B1 (es)
GB (1) GB2556531A (es)
WO (1) WO2016201202A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201415062D0 (en) * 2014-08-26 2014-10-08 Aplagon Oy Therapeutic
JP2020525416A (ja) * 2017-06-29 2020-08-27 アドヴァイテ エルエルシー． 眼表面障害の治療及び診断

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0353018A1 (en) * 1988-07-25 1990-01-31 Kiyoshi Kita Intraocular anticoagulant
US20030124705A1 (en) * 1995-11-30 2003-07-03 Berry Leslie Roy Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
US6702850B1 (en) * 2002-09-30 2004-03-09 Mediplex Corporation Korea Multi-coated drug-eluting stent for antithrombosis and antirestenosis
US20090281059A1 (en) * 2007-02-21 2009-11-12 Robert Falotico Coating for a medical device having an anti-thrombotic conjugate

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR76223B (es) 1981-07-31 1984-08-04 Alza Corp
US4533348A (en) 1983-07-29 1985-08-06 Alza Corporation In-line drug dispenser for use in intravenous therapy
JPS60138544U (ja) 1984-02-28 1985-09-13 三菱鉛筆株式会社 注入器
AU592546B2 (en) 1984-12-03 1990-01-18 Baxter International Inc. Drug delivery apparatus preventing local and systemic toxicity
US4874366A (en) 1984-12-03 1989-10-17 Baxter Internatiional Inc. Housing enabling passive mixing of a beneficial agent with a diluent
IT1213023B (it) 1986-01-16 1989-12-07 Rolando Barbucci Materiale capace di adsorbire stabilmente elevate quantita' di eparina, e suo procedimento di preparazione.
JPS62119944U (es) 1986-01-20 1987-07-30
US4929242A (en) * 1986-11-26 1990-05-29 Baxter International Inc. Solution and method for maintaining patency of a catheter
GB8720502D0 (en) 1987-08-29 1987-10-07 Giltech Ltd Antimicrobial composition
US5030203A (en) 1987-11-16 1991-07-09 Baxter International Inc. Ampule for controlled administration of beneficial agent
US4963132A (en) 1988-11-11 1990-10-16 Gibson Roger M Capped fluidic connector
US5205820A (en) 1989-06-16 1993-04-27 Science, Incorporated Fluid delivery apparatus
SE8903563D0 (sv) 1989-10-26 1989-10-26 Haessle Ab A novel dissolution system
US5006114A (en) 1990-04-20 1991-04-09 Rogers Bobby E Medical valve assembly
US5098394A (en) 1990-05-31 1992-03-24 Luther Ronald B Biased shut off valve assembly for needle and catheter
US5547471A (en) 1992-11-19 1996-08-20 Baxter International Inc. In-line drug delivery device for use with a standard IV administration set and a method for delivery
WO1994022522A1 (en) 1993-03-30 1994-10-13 Medex, Inc. Medical devices having antimicrobial properties and methods of making and using
EP0714412A1 (en) 1993-08-19 1996-06-05 Minnesota Mining And Manufacturing Company Heparin functional affinity supports
FR2719479B1 (fr) 1994-05-04 1996-07-26 Sanofi Elf Formulation stable lyophilisée comprenant une protéine: kit de dosage.
US5962794A (en) 1995-05-01 1999-10-05 Science Incorporated Fluid delivery apparatus with reservior fill assembly
US6491965B1 (en) * 1995-11-30 2002-12-10 Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. Medical device comprising glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
GB9706902D0 (en) 1997-04-04 1997-05-21 Browne Albert Ltd Test device and method
US5984373A (en) 1998-03-12 1999-11-16 Elcam Plastic Kibbutz Bar-Am Luer connector
US6194394B1 (en) 1998-07-01 2001-02-27 Sigma-Aldrich Co. Coagulation controls for prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) assays
US6428505B1 (en) 1999-11-19 2002-08-06 Prismedical Corporation In-line IV drug delivery pack with controllable dilution
KR100356643B1 (ko) * 2000-03-31 2002-10-18 한국과학기술연구원 생리활성 물질이 결합된 생체적합성 의료용 금속 재료 및이의 제조 방법
AU2001259063A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002005873A2 (en) 2000-07-13 2002-01-24 Ash Medical Systems, Inc. Devices and methods for infusing a liquid into a catheter
US7081109B2 (en) 2002-08-22 2006-07-25 Baxa Corporation Sterile docking apparatus and method
US20070042015A1 (en) * 2003-02-20 2007-02-22 Berry Leslie R Coating composition for polymeric surfaces comprising serpin or serpin derivatives
CA2535446A1 (en) 2003-08-12 2005-02-17 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Methods for preventing neurological events
JP2007513083A (ja) * 2003-11-10 2007-05-24 アンジオテック インターナショナル アーゲー 医療用移植片および繊維誘発剤
US20050124970A1 (en) 2003-12-05 2005-06-09 Medical Components, Inc. Luer cap with antibacterial property
AU2005280443B2 (en) 2004-07-30 2011-02-03 Avent, Inc. Antimicrobial silver compositions
US7771383B2 (en) 2004-10-22 2010-08-10 Medegen, Inc. Fluid control device with valve and methods of use
TWI376234B (en) 2005-02-01 2012-11-11 Msd Oss Bv Conjugates of a polypeptide and an oligosaccharide
DE102006008613A1 (de) 2006-02-24 2007-08-30 Dade Behring Marburg Gmbh Stabilisierte Zubereitungen von Serin-Endopeptidasen, deren Herstellung und Verwendung
US20070212387A1 (en) * 2006-03-08 2007-09-13 Sahajanand Medical Technologies Pvt. Ltd. Coatings for implantable medical devices
US20080027401A1 (en) 2006-07-28 2008-01-31 Becton, Dickinson And Company Vascular access device filtration
EP2056865B1 (en) * 2006-08-28 2013-12-25 Omnio Healer AB Novel drug target of preventing and treating periodontal disease, improving healing of periodontal wounds and promoting oral health
JP5161452B2 (ja) 2006-10-03 2013-03-13 日本コヴィディエン株式会社 医療用具の製造方法、医療用具の表面に抗生物質を付与する方法および医療用具
US20080097407A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 Michael Plishka Luer activated device with compressible valve element
US20080140055A1 (en) 2006-12-08 2008-06-12 Utah Medical Products, Inc. Lockable enteral feeding adapter
EP2125074A4 (en) 2007-01-16 2012-04-04 Univ Utah Res Found STACKABLE STERILITY PROTECTION CAPS FOR SEPARATE CONNECTORS
IL186290A0 (en) 2007-09-25 2008-01-20 Medimop Medical Projects Ltd Liquid drug delivery devices for use with syringe having widened distal tip
CA2646265A1 (en) 2007-12-20 2009-06-20 Tyco Healthcare Group Lp Cap assembly for use with a prefilled lock solution syringe
US8802075B2 (en) * 2009-02-18 2014-08-12 Eyeon Particle Sciences Llc Bi-functional co-polymer use for opthalmic and other topical and local applications
US9248093B2 (en) 2009-06-11 2016-02-02 Becton, Dickinson And Company Catheter locking solution having antimicrobial and anticoagulation properties
WO2011019710A2 (en) 2009-08-10 2011-02-17 Proviflo, Llc Catheter lock solutions utilizing tocopheraol and mid-chain fatty acids
US9149624B2 (en) 2009-09-02 2015-10-06 Carefusion 303, Inc. Disinfecting male luer connector caps
WO2011034323A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Samyang Corporation Transdermal delivery system, method for manufacturing the same, and transdermal delivery method using the system
WO2011066586A1 (en) 2009-11-30 2011-06-03 Catheter Connections, Inc. Disinfecting caps having sealing features and related systems and methods
US9480833B2 (en) 2010-07-15 2016-11-01 Becton, Dickinson And Company Antimicrobial IV access cap
EP2593039B1 (en) 2010-07-16 2022-11-30 Micell Technologies, Inc. Drug delivery medical device
US9878143B2 (en) 2010-09-30 2018-01-30 Covidien Lp Antimicrobial luer adapter
JP6084221B2 (ja) 2011-08-11 2017-02-22 アットウィル メディカル ソルーションズ ステリフロー エル． ピー． ルアー式接続のための挿入体
US8784388B2 (en) 2011-09-30 2014-07-22 Becton, Dickinson And Company Syringe with disinfecting tip feature
GB2498774A (en) 2012-01-27 2013-07-31 Bruce Roser Glass-stabilised biological materials and syringe
CA2937232C (en) 2014-01-16 2023-01-10 Attwill Medical Solutions Sterilflow L.P. Active-agent inserts for connectors and related methods

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0353018A1 (en) * 1988-07-25 1990-01-31 Kiyoshi Kita Intraocular anticoagulant
US20030124705A1 (en) * 1995-11-30 2003-07-03 Berry Leslie Roy Glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
US6702850B1 (en) * 2002-09-30 2004-03-09 Mediplex Corporation Korea Multi-coated drug-eluting stent for antithrombosis and antirestenosis
US20090281059A1 (en) * 2007-02-21 2009-11-12 Robert Falotico Coating for a medical device having an anti-thrombotic conjugate

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
De Cock R et al. TOPICAL HEPARIN IN THE TREATMENT OF LIGNEOUS CONJUNCTIVITIS.. Ophthalmology United States. , 31/10/1995, Vol. 102, Nº 11, Páginas 1654 - 1659 ISSN 0161-6420 (Print), (DOI: pubmed:9098258) *
FINE et al. . SUCCESSFUL TREATMENT OF LIGNEOUS GINGIVITIS WITH WARFARIN. Oral Surg. Oral Med. Oral Radiol Endod., 01/01/2009, Vol. 107, Nº 1, Páginas 77-80 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016274868B2 (en) 2021-02-18
WO2016201202A1 (en) 2016-12-15
AU2016274868A1 (en) 2018-02-01
ES2671844B1 (es) 2019-03-22
US20180177924A1 (en) 2018-06-28
CA2989110A1 (en) 2016-12-15
JP2018524067A (ja) 2018-08-30
GB201800471D0 (en) 2018-02-28
US11752242B2 (en) 2023-09-12
GB2556531A (en) 2018-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2321082T3 (es) Productos medicos que comprenden un revestimiento hemocompatible, produccion y uso de los mismos.
ES2242980T3 (es) Dermatan disulfato, un inhibidor de la generacion de trombina y de la activacion del complemento.
ES2710313B1 (es) Composicion para la prevencion de la trombogenesis y procedimiento para fabricacion de la misma
ES2224541T3 (es) Polisacaridos sulfatados nuevos del tipo heparinicos.
Balan et al. Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A review
CA2237159C (en) Glycosaminoglycan-antithrombin iii/heparin cofactor ii conjugates
US6491965B1 (en) Medical device comprising glycosaminoglycan-antithrombin III/heparin cofactor II conjugates
US7045585B2 (en) Methods of coating a device using anti-thrombin heparin
JP3398150B2 (ja) 新規接合体、その調製および使用ならびにその接合体を用いて調製された基体
JP3927118B2 (ja) 疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途
ES2644369T3 (es) Entidades biológicas inmovilizadas
TW201718028A (zh) Ve-鈣黏蛋白結合性生物結合物
Coombe et al. Heparin mimetics
Dumitriu et al. Polymeric Biomaterials: Medicinal and Pharmaceutical Applications, Volume 2
US20110189752A1 (en) Complex
ES2671844B1 (es) Dispositivos médicos, sistemas y métodos que utilizan composiciones de anti-trombina heparina.
PT91524B (pt) Processo de preparacao de um medicamento a base de fraccoes e/ou fragmentos de heparina
US20110165244A1 (en) Bioresponsive polymer formulations for delivery of bioactive agents
Raimova et al. Anti-thrombotic action of sulfated polysaccharides on thrombosis caused by thromboplastin
ES2295087T3 (es) Heparinas desulfatadas no anticoagulantes como medicamentos.
ES2732659T3 (es) Potenciadores de la resorción como aditivos para mejorar la formulación oral de heparinas de bajo peso molecular
JP4633223B2 (ja) 血管内皮細胞増殖因子依存性血管内皮細胞増殖の抑制剤
ES2854748T3 (es) Una solución acuosa que comprende un conjugado macromolecular de heparina para el tratamiento de vasos sanguíneos
JP4166851B2 (ja) 新規虚血・再灌流障害抑制剤
PT2035047E (pt) Composição de matriz extracelular

Legal Events

Date Code Title Description
FG2A Definitive protection

Ref document number: 2671844

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: B1

Effective date: 20190322