ES2854748T3 - Una solución acuosa que comprende un conjugado macromolecular de heparina para el tratamiento de vasos sanguíneos - Google Patents

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Abstract

Una solución acuosa que comprende agua y una cantidad efectiva de un conjugado de heparina macromolecular, en donde el conjugado de heparina es un conjugado que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más pero 100 o menos cadenas de heparina unidas a la cadena principal en donde cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace a la cadena principal, para su uso en un método de tratamiento de un vaso sanguíneo dañado en un paciente, en donde dicho método comprende poner, mediante su administración a dicho paciente, la superficie del vaso sanguíneo dañado de dicho paciente en contacto con una cantidad efectiva de dicho conjugado de heparina macromolecular.

Description

DESCRIPCIÓN
Una solución acuosa que comprende un conjugado macromolecular de heparina para el tratamiento de vasos sanguíneos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un conjugado macromolecular de heparina para su uso en un método de tratamiento de vasos sanguíneos dañados en un paciente, y a un método in vitro para recubrimiento de vasos sanguíneos.
Antecedentes
La sangre circulante se mantiene en un delicado estado de equilibrio mientras fluya en vasos sanguíneos sin perturbaciones revestidos por un endotelio intacto. Sin embargo, existen numerosas situaciones en donde este equilibrio se ve afectado negativamente de tal forma que induce una trombosis, un evento potencialmente mortal que sigue siendo el principal responsable de muertes humanas si no es tratado. Por otro lado, si las reacciones implicadas en la aparición de la trombosis se anulan por una inhibición excesivamente eficiente, puede producirse una hemorragia excesiva y que pone en riesgo la vida.
En general se acepta que la pared vascular que está en contacto con la sangre debe estar cubierta por una monocapa intacta de células endoteliales. Esta capa celular está cubierta por una red de proteoglicanos y glicoproteínas unidos a la membrana, denominados glicocáliz endotelial. Durante la última década, el glicocáliz endotelial se ha apreciado cada vez más como un compartimento intravascular que protege la pared del vaso contra las agresiones patógenas. Se ha demostrado que el daño del glicocáliz endotelial mejora la adhesión de leucocitos y plaquetas al endotelio vascular y también induce disfunción endotelial debido a efectos mecanotransductores alterados. Se ha informado que una alteración significativa del glicocáliz endotelial está asociada por ejemplo con diabetes, isquemia/reperfusión y aterosclerosis.
Hoy en día, los daños en la pared de los vasos, causados por dilatación u otros procedimientos quirúrgicos y enfermedades, se tratan mediante la administración sistémica de diversos fármacos.
La heparina tiene un largo historial como anticoagulante clínicamente aceptado al actuar como un potente acelerador de la antitrombina, una proteína presente de forma natural en la sangre que es capaz de inhibir varias enzimas de coagulación, incluida la trombina. La hirudina es un ejemplo de inhibidor directo de la trombina. El uso de heparina o hirudina se asocia con un riesgo de hemorragia menos que insignificante.
Se ha utilizado un conjugado macromolecular compuesto de múltiples cadenas de heparina unidas covalentemente a una cadena principal inerte para modificar superficies tanto artificiales (WO93/05793) como biológicas (WO00/45837) de tal manera que estas superficies presenten heparina unida a la superficie de manera permanente para imitar la constitución química del endotelio de los vasos sanguíneos, que porta sulfato de heparano localizado en la superficie.
El documento WO 2007/004975 describe un método in vitro para proporcionar tejidos biológicos, por ejemplo de un implante o trasplante, con un recubrimiento de heparina. La heparina que está unida a los tejidos biológicos es preferiblemente un conjugado de heparina macromolecular. El documento US 2008/014239 describe un conjugado de heparina soluble en agua que comprende al menos 3-10 moléculas de glicosaminoglicano de heparina conectadas a una molécula central. Los conjugados de heparina se utilizan para inhibir la agregación plaquetaria sobre el colágeno en el flujo de sangre entera en el lugar de la lesión e intervenciones vasculares o microvasculares.
Resumen de la invención
El alcance de esta invención está definido por las reivindicaciones. Las realizaciones de la descripción relativas a métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se divulgue en la descripción pero que no esté cubierto por las reivindicaciones debe considerarse tal como se presenta sólo con fines ilustrativos.
El objeto de la presente invención es presentar una composición para administración a vasos sanguíneos para la inhibición eficiente de reacciones trombogénicas, in vitro o in vivo. Dichas reacciones pueden ser inducidas por el contacto de sangre con lesiones de vasos sanguíneos exponiendo colágeno, fibrina y células activadas depositadas sobre la lesión vascular que presentan estructuras superficiales que no son compatibles con la sangre.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de heparina macromolecular para uso como medicamento para el tratamiento de daños o enfermedades de los vasos sanguíneos, como se define adicionalmente en el presente documento.
La presente invención también se refiere a un método in vitro para recubrir la superficie endotelial de un vaso sanguíneo antes de trasplantar el vaso o un órgano que contiene vasos sanguíneos a un paciente, en donde dicho método consiste en poner las superficies de los vasos sanguíneos en contacto con una solución acuosa. que comprende agua y una cantidad efectiva de un conjugado de heparina macromolecular.
La presente invención también se refiere a una solución acuosa que comprende agua y una cantidad efectiva de un conjugado de heparina macromolecular para su uso en un método de tratamiento de un paciente que comprende poner la superficie de un vaso sanguíneo dañado en contacto con la solución acuosa que comprende agua y una cantidad efectiva de un conjugado de heparina.
Las realizaciones preferidas de la presente invención son las definidas en las reivindicaciones dependientes y se incorporan aquí en la descripción.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 describe los resultados de microscopía confocal de arteria de cerdo que muestra la unión de estreptavidina-Cy5 (rojo) a CHC biotinilado adsorbido en la vasculatura.
La imagen de la izquierda muestra una arteria perfundida con CHC y la imagen de la derecha una arteria perfundida con PBS.
La Figura 2 describe la evaluación de Imaris de la unión de Estreptavidina-Cy5 a CHC-biotina unida a un vaso sanguíneo.
La Figura 3 describe los resultados de microscopía confocal después de 30 y 60 minutos de tratamiento con CHC (a la izquierda) y control (a la derecha).
Descripción detallada de la invención
En la presente solicitud, el término "glicosaminoglicanos sulfatados" se refiere no solo a las sustancias, que normalmente se incluyen en el término, como por ejemplo heparina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano y sulfato de condroitina, pero también fragmentos y derivados de estas sustancias que son funcionales para tal fin.
El sulfato de heparano que expresa los sitios de unión a antitrombina es un componente principal del glicocáliz endotelial. De acuerdo con la presente invención, se usa un conjugado macromolecular de heparina para restaurar el glicocáliz endotelial de vasos sanguíneos aislados y vasos sanguíneos contenidos en órganos para reducir el daño que puede haber ocurrido por procesamiento isquémico y mecánico.
La presente invención presenta un conjugado de glicosaminoglicano macromolecular que puede usarse como un medicamento para tratar daños o enfermedades de los vasos o para tratar los vasos antes del trasplante.
La pared de los vasos sanguíneos sanos está cubierta por una capa coherente de células endoteliales que tiene una capa de carbohidratos llamada glicocáliz en contacto con el flujo sanguíneo. Un componente importante del glicocáliz es el sulfato de heparina que, en colaboración con la antitrombina, minimiza la generación de reacciones trombóticas. Diferentes formas de daños o enfermedades de los vasos sanguíneos pueden afectar las propiedades del glicocáliz de manera negativa, por ejemplo la isquemia.
Un conjugado de heparina macromolecular de acuerdo con la invención muestra resultados prometedores con respecto al efecto de unión a componentes que se encuentran en la pared de un vaso sanguíneo dañado, tales como colágeno, fibrina y trombocitos activados. Cuando el conjugado de heparina de la presente invención se ha unido a la superficie del vaso sanguíneo y el conjugado de heparina unido a la superficie coopera con la antitrombina, se observa una disminución significativa de las reacciones trombogénicas.
Una aplicación de acuerdo con la presente invención es usar el conjugado de heparina para tratar órganos para trasplante o para tratar pacientes cuyos vasos sanguíneos pueden dañarse durante un tratamiento médico o quirúrgico. En otra realización, la presente invención puede usarse para tratar vasos sanguíneos in vitro cuando se extraen de un paciente y antes de trasplantar los vasos o el órgano que contiene los vasos a un paciente. El conjugado se administra a los vasos o al paciente, disuelto en una solución acuosa en un rango de concentración de 0.001-10 mg/ml, como 0.001 mg/ml o más, o 0.01 mg/ml o más, o 0.1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos. La solución acuosa podría ser una solución reguladora y el regulador podría ser cualquier regulador fisiológico, por ejemplo, un regulador fosfato, PBS.
Sorprendentemente, se descubrió que un conjugado macromolecular compuesto de múltiples moléculas de heparina se une al colágeno con la fuerza suficiente para anular el carácter trombogénico del colágeno adsorbido en una superficie en contacto con la sangre, véase el Ejemplo 2. Este efecto de unión y protección de la heparina macromolecular el conjugado contrasta claramente con la heparina ordinaria disponible comercialmente destinada a la administración intravenosa, que no tiene ningún efecto a este respecto. De manera similar, se encontró que un conjugado macromolecular compuesto por múltiples moléculas de heparina se une a la fibrina pero no al fibrinógeno, véase Ejemplo 3.
Un conjugado macromolecular de heparina de acuerdo con la invención es un conjugado que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más pero 100 o menos cadenas de heparina unidas a la cadena principal, en donde cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace simple a la cadena principal. Una cierta fracción de las moléculas de GAG participará en la unión al sustrato biológico mientras que las moléculas de GAG restantes, que no participarán en la unión, están libres para ejercer la actividad biológica de GAG, por lo que GAG es heparina en la invención reivindicada. Debido a la unión múltiple entre las moléculas de GAG y el sustrato que tiene afinidad por los GAG, la fuerza de unión del conjugado macromolecular de GAG superará la del GAG ordinario, lo que da como resultado un rendimiento superior. Para obtener la combinación ventajosa de unión fuerte y actividad biológica retenida, es preferible que múltiples cadenas de GAG estén orientadas de tal manera que estén libres para interactuar con el sustrato que tiene afinidad por GAG y especialmente heparina. El GAG debe estar unido a la cadena principal, preferiblemente mediante una unión de un solo punto. Una realización preferida de un conjugado macromolecular de GAG es el Conjugado de Heparina Corline (CHC), que está compuesto por aproximadamente 70 moléculas de heparina unidas a la cadena principal inerte (Obtenible de Corline Systems AB, Uppsala, Suecia). El número de moléculas de heparina debería estar preferiblemente entre 65 y 75 por cadena. El conjugado preferido se describe en el documento US5529986. El conjugado macromolecular es un conjugado (macromolécula) biológicamente activo al menos sustancialmente soluble en agua, preferiblemente en forma sustancialmente pura, que comprende un homo o heteropolímero orgánico sustancialmente de cadena lineal que tiene varios grupos funcionales distribuidos a lo largo de la cadena principal del polímero, a través de cuyas 50 o más pero 100 o menos cadenas de heparina en una parte no activa de las mismas están ancladas a través de enlaces covalentes.
Dicho conjugado puede describirse conceptualmente como un proteoglicano sintético, cuya composición relativa puede variarse de forma controlable y adaptarse a la aplicación pretendida.
La cadena de polímero sustancialmente lineal que debe funcionar como la cadena principal para los residuos de glicosaminoglicano debe, por supuesto, ser sustancialmente inerte biológicamente después del acoplamiento del glicosaminoglicano o glicanos en cuestión, en el sentido de que debe estar libre de al menos interferencia a la actividad biológica. Como se comprende fácilmente, para permitir el acoplamiento de una pluralidad de residuos de glicosaminoglicano, la cadena principal debe estar provista de varios grupos funcionales, como por ejemplo grupos amino, amida, sulfato, vinilo, carbonilo, nitro, tiol, hidroxilo o carboxilo, distribuidos a lo largo de la cadena y capaces de, después de una modificación opcional, acoplar el glicosaminoglicano, ya sea directamente o mediante una secuencia de acoplamiento. En este contexto, debe tenerse en cuenta que el GAG en cuestión, dependiendo del método de producción del conjugado, aún puede tener el residuo terminal de su proteína conjugada natural asociado al mismo, y que la unión, por supuesto, tendrá lugar ventajosamente a través de por ejemplo un aminoácido en tal residuo.
Además, la cadena principal, preferiblemente una cadena de polímero, debe tener preferiblemente una buena solubilidad en agua. Al menos debería, de acuerdo con lo que se ha dicho anteriormente sobre el conjugado, ser al menos sustancialmente soluble en agua después del acoplamiento de los grupos glicosaminoglicanos. Las cadenas de polímero específicas, que pueden ser adecuadas para los propósitos de la invención, serán fácilmente evidentes para el experto en la materia después de haber tomado parte del concepto inventivo general. Este es, por supuesto, también el caso del grado de ramificación en la cadena de polímero que se puede permitir dentro del alcance de la expresión "sustancialmente lineal".
De acuerdo con la invención reivindicada, la cadena principal es un compuesto alifático inerte. Con respecto al hecho de que habitualmente se desea que el glicosaminoglicano mantenga su actividad biológica después de la unión a la cadena principal del polímero, de acuerdo con la invención reivindicada cada molécula de glicosaminoglicano está unida terminalmente y sólo por un enlace sencillo al polímero principal. Por ejemplo, el glicosaminoglicano puede unirse a la cadena principal a través de un aminoácido terminal.
En una realización preferida de la invención, el conjugado de heparina macromolecular tiene un peso molecular superior a 70 kDa. Preferiblemente, el peso molecular del conjugado de heparina macromolecular es superior a 200 kDa, más preferiblemente superior a 400 kDa, e incluso más preferiblemente superior a 600 kDa.
Aplicaciones de la invención
Una aplicación de la presente invención es para recubrir colágeno. Por ejemplo, las matrices tridimensionales de colágeno o gelatina (colágeno hidrolizado) se hidratan por inmersión en una solución reguladora de fosfato (PBS) durante al menos una hora seguida de inmersión en PBS suplementado con CHC a una concentración que varía de 0.01 a 10 mg/ml durante un período de 5 a 60 minutos y luego enjuagar cuidadosamente tres veces con PBS.
Otra aplicación se refiere al recubrimiento de muestras de tejido como la superficie endotelial de un vaso sanguíneo. Los especímenes de tejido (que exponen el colágeno) destinadas a la implantación en el cuerpo humano se sumergen en una solución de PBS suplementada con CHC en una concentración que varía de 0.001 a 10 mg/ml, como 0.001 mg/ml o más, o 0.01 mg/ml o más o 0.1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos, durante un período de 5 a 120 minutos y luego enjuague cuidadosamente tres veces con PBS.
Otra aplicación se refiere a un conjugado de heparina que comprende una cadena principal de una cadena alifática inerte y al menos una heparina unida a la cadena principal para su uso en un método para el tratamiento de daños o enfermedades de los vasos sanguíneos en un paciente, como se define adicionalmente en el presente documento. En otra realización, el conjugado de heparina comprende moléculas de heparina en el intervalo de 10 a 100. El daño de los vasos sanguíneos podría ser causado por la dilatación del vaso sanguíneo u otros procedimientos quirúrgicos y la enfermedad de los vasos sanguíneos podría ser isquemia. El conjugado podría disolverse en una solución salina fisiológica estéril y administrarse sistémicamente para permitir que el conjugado se disuelva en sangre y, opcionalmente, se una a las lesiones vasculares en donde el colágeno y/o la fibrina están expuestos para bloquear la formación de trombos que pueden inducirse en tales lesiones. La solución salina podría ser cualquier solución reguladora como PBS y la concentración del conjugado de heparina podría oscilar entre 0.001 y 10 mg/ml, como 0.001 mg/ml o más, o 0.01 mg/ml o más o 0.1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos.
La lesión por reperfusión miocárdica es un síndrome multifactorial, aún poco conocido, asociado con la cardiopatía coronaria que es la principal causa de muerte en todo el mundo. La lesión por reperfusión también es un factor importante por considerar en asociación con el trasplante de órganos. La isquemia induce daño vascular y una hipótesis es que tales lesiones vasculares pueden iniciar la activación plaquetaria y la generación de trombina en la exposición a la sangre durante la reperfusión. Los órganos aislados pueden beneficiarse de la perfusión con la solución de conjugado de heparina de la presente invención antes de trasplantar el vaso u órgano a un paciente pueden estar en combinación con la administración sistémica del conjugado de la presente invención en relación con el inicio de la reperfusión.
La solución se puede utilizar en el trasplante de órganos a pacientes, en particular riñones.
Se describe además en el presente documento un método de trasplante de un órgano a un paciente, que comprende las etapas de proporcionar un órgano para trasplante, perfundir el órgano con una solución en un regulador como se define en el presente documento para recubrir el tejido del órgano con un recubrimiento protector y trasplante del órgano al paciente. De forma adecuada el órgano se perfunde con la solución durante un período de tiempo de al menos 1 hora, aunque el período puede ser más largo como hasta 24 horas o incluso más.
La perfusión se realiza conectando el riñón a un sistema de circulación en donde normalmente circula alrededor de 1 litro de solución regulada al órgano.
Después de dicha perfusión, los vasos sanguíneos del órgano se recubren con una capa protectora que evitará la isquemia/reperfusión del órgano trasplantado.
Ejemplos
Ejemplo 1
La actividad biológica específica de heparina y CHC, respectivamente, se evaluó mediante un ensayo de inhibición de FXa. La heparina tenía una actividad de 200 UI/ml y la CHC tenía 30 UI/ml.
Ejemplo 2 - Superficie de colágeno modificada con CHC
Se recubrieron tubos de PVC previamente con colágeno (colágeno Bovino tipo I, Purecol) mediante tubos rotativos con PBS suplementado con colágeno (60pg/ml) durante tres horas y se dividieron en tres grupos. El Grupo I no recibió más tratamiento, el grupo II se incubó con PBS suplementado con heparina (50 pg/ml) durante 30 minutos y el grupo III se incubó con PBS suplementado con CHC (50 pg/ml) durante 30 minutos. Se prepararon bucles de tubo de cada grupo y se hicieron rotar a 37°C con sangre humana recién extraída sin ningún anticoagulante. Los grupos I y II indujeron la formación de coágulos sólidos en treinta minutos con el consumo total de plaquetas. No se produjo coagulación en el grupo III y, después de sesenta minutos, el recuento de plaquetas se mantuvo en más del 90 % del nivel inicial. Este ejemplo muestra que el CHC, pero no la heparina, es capaz de unirse al colágeno y de ese modo transformar la superficie del colágeno trombogénico en una superficie de heparina no trombogénica.
Ejemplo 3 - Superficie de fibrina modificada con CHC
Se hicieron rotar bucles de tubos de PVC con plasma citratado humano suplementado con CaCl2 (grupo II) a una concentración que provocó una coagulación visible (formación de fibrina) en 20 minutos. Una vez que se produjo la coagulación, se drenaron los tubos y se enjuagaron cuidadosamente con PBS y se dividieron en dos grupos. El grupo I no recibió más tratamiento y el grupo II se incubó con PBS suplementado con CHC (50 pg/ml) durante 30 minutos. Se prepararon bucles de tubo de cada grupo y se hicieron rotar a 37°C con sangre humana recién extraída sin ningún anticoagulante. El grupo I indujo la formación de coágulos sólidos en treinta minutos con el consumo total de plaquetas. No se produjo coagulación en el grupo II y, después de sesenta minutos, el recuento de plaquetas se mantuvo en más del 90% del nivel inicial. Este ejemplo muestra que el CHC, pero no la heparina, es capaz de unirse a la fibrina y de ese modo transformar la superficie de la fibrina trombogénica en una superficie de heparina no trombogénica.
Ejemplo 4 - Perfusión de un riñón aislado
En un modelo de trasplante de cerdos, se obtuvieron riñones de cerdos donantes con muerte cerebral con un peso de 30 kg. Después del lavado aórtico con solución de perfusión (UW, University of Wisconsin), se extrajeron los riñones y se colocaron en una máquina de perfusión comercial (Organ Assist, NL) donde los dos riñones se expusieron a una perfusión fría pulsátil dirigida a presión con una solución de perfusión de máquina durante un mínimo de 2 horas a una concentración de 50 pg/ml. Se perfundió un riñón con una solución que comprendía CHC.
El consumo de CHC durante la perfusión de riñones aislados se controló usando un ensayo de azul de toluidina que puede usarse para detectar CHC en el rango de 10-50 pg/ml. Los experimentos con la perfusión de los riñones de cinco cerdos han demostrado que entre 10 y 15 mg de CHC se unen a los riñones perfundidos.
Ejemplo 5 - Unión de CHC a un vaso sanguíneo
Se extrajeron segmentos de la arteria iliaca de un cerdo que había tenido muerte cerebral durante tres horas. Después de la perfusión con PBS (regulador de fosfato de sodio pH 7.4), se incubó un segmento con CHC (CHC Biotinilado, 50 pg/ml en PBS) y otro con PBS solamente. Se usó estreptavidina marcada con fluorescencia (Estreptavidina-Cy5 que aparece en rojo) para detectar CHC-biotina adherida a la superficie. La Figura 1 describe los resultados registrados por microscopía confocal que muestra una captación clara de Estreptavidina-Cy5 en rojo en la muestra de CHC-biotina con muy poca o ninguna señal de la muestra de control. La unión de un anticuerpo dirigido hacia el Factor von Willebrand (mostrado en verde) fue comparable entre las dos muestras.
El análisis asistido por ordenador (Imaris) de la muestra con CHC-biotina verificó aún más la unión de CHC al vaso sanguíneo, véase figura 2.
Ejemplo 6 - La unión de CHC al colágeno evita la deposición de plaquetas
Se estableció una capa confluente de células endoteliales (CE) sobre portaobjetos de vidrio que se habían revestido con colágeno tipo I. Se creó una herida raspando las células de Ce utilizando una punta fina de una pipeta. Posteriormente, una muestra de prueba se incubó con CHC (50 pg/ml en regulador PBS) durante 30 minutos y luego se enjuagó cuidadosamente con PBS. Se usó otra muestra como control sin ningún tratamiento adicional después del raspado.
Ambas muestras se incubaron con sangre humana fresca durante 60 minutos usando un dispositivo especial para asegurarse de que la sangre fluyera sobre las superficies. Las muestras de prueba se enjuagaron y fijaron con paraformaldehído y se examinaron mediante microscopía confocal utilizando un anticuerpo fluorescente (mostrado en verde) dirigido contra CD 62 (p-selectina) que se expresaba mediante plaquetas activadas. En las imágenes de abajo, la herida está delimitada por las líneas blancas delgadas, véase figura 3. En la superficie de control se pudo detectar una capa densa de plaquetas activadas (izquierda, denotado como Control), mientras que no se pudo ver ningún depósito de plaquetas en la muestra en cuyo CHC se había permitido unirse al colágeno (a la derecha, denotado como Heparina).

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una solución acuosa que comprende agua y una cantidad efectiva de un conjugado de heparina macromolecular, en donde el conjugado de heparina es un conjugado que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más pero 100 o menos cadenas de heparina unidas a la cadena principal en donde cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace a la cadena principal, para su uso en un método de tratamiento de un vaso sanguíneo dañado en un paciente, en donde dicho método comprende poner, mediante su administración a dicho paciente, la superficie del vaso sanguíneo dañado de dicho paciente en contacto con una cantidad efectiva de dicho conjugado de heparina macromolecular.
2. La solución para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la solución es una solución reguladora.
3. La solución para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la concentración del conjugado de heparina está entre 0.01 y 10 mg/ml tal como 0.01 mg/ml o más, o 0.1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos.
4. La solución de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso para el tratamiento de daños o enfermedades de vasos sanguíneos.
5. La solución para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el daño de los vasos sanguíneos es causado por la dilatación del vaso sanguíneo u otros procedimientos quirúrgicos.
6. La solución para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la enfermedad de los vasos sanguíneos ha sido causada por isquemia.
7. Un método in vitro de recubrimiento de la superficie endotelial de un vaso sanguíneo con una cantidad efectiva de un conjugado de heparina macromolecular antes de trasplantar el vaso o un órgano que lo contiene a un paciente, en donde dicho método consiste en poner, mediante la administración del mismo, la superficie del vaso sanguíneo en contacto con una cantidad efectiva de dicho conjugado de heparina macromolecular, en donde el conjugado de heparina está presente en una solución acuosa y es un conjugado que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más pero 100 o menos cadenas de heparina unidas a la cadena principal en donde cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace a la cadena principal.
8. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la solución es una solución reguladora.
9. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde la concentración del conjugado de heparina está entre 0.01 y 10 mg/ml tal como 0.01 mg/ml o más, o 0.1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, 8 o 9, en donde el vaso sanguíneo está presente en un órgano para trasplante.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el órgano se perfunde con la solución durante un período de tiempo de al menos 1 hora.
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