ES2926906T3 - Medios y método para tratar vasos sanguíneos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una solución para el tratamiento de vasos sanguíneos en la que la solución comprende un conjugado de heparina. La invención se refiere además al uso del conjugado como medicamento ya un método para recubrir tejido usando el conjugado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Medios y método para tratar vasos sanguíneos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una solución de tampón que comprende un conjugado macromolecular de heparina para su uso en el tratamiento de lesiones o enfermedades de los vasos sanguíneos en un paciente.
Antecedentes
La sangre circulante se mantiene en un delicado estado de equilibrio siempre que fluya en vasos sanguíneos imperturbables revestidos por un endotelio intacto. Sin embargo, existen numerosas situaciones en las que este equilibrio se ve afectado negativamente y se induce una trombosis, un evento potencialmente mortal que sigue siendo el principal asesino de hombres si no se trata. Por otro lado, si las reacciones involucradas en el inicio de la trombosis son dejadas de lado por una inhibición demasiado eficiente, puede producirse un sangrado excesivo y potencialmente mortal.
En general, se acepta que la pared vascular que está orientada hacia la sangre debe estar cubierta por una monocapa intacta de células endoteliales. Esta capa celular está cubierta por una red de proteoglicanos y glicoproteínas unidas a la membrana, denominada glicocálix endotelial. Durante la última década, la glicocálix endotelial se ha apreciado cada vez más como un compartimento intravascular que protege la pared del vaso contra las agresiones patogénicas. Se ha demostrado que el daño a la glicocálix endotelial mejora la adhesión de leucocitos y plaquetas al endotelio vascular, y también induce disfunción endotelial debido a efectos de mecano transducción alterados. Se ha informado que una alteración significativa de la glicocálix endotelial está asociada con, por ejemplo, diabetes, isquemia/reperfusión y aterosclerosis.
Hoy en día, los daños en la pared de los vasos causados por la dilatación u otros procedimientos quirúrgicos y las enfermedades se tratan mediante la administración sistémica de diversos fármacos.
La heparina tiene un largo historial como anticoagulante clínicamente aceptado al actuar como un potente acelerador de la antitrombina, una proteína natural en la sangre que es capaz de inhibir varias enzimas de la coagulación, incluida la trombina. La hirudina es un ejemplo de un inhibidor directo de la trombina. El uso de heparina o hirudina se asocia con un riesgo de sangrado menos que insignificante.
Se ha utilizado un conjugado macromolecular compuesto por múltiples cadenas de heparina unidas de manera covalente a una cadena principal inerte para modificar tanto superficies artificiales (documento WO93/05793) como biológicas (documento WO00/45837) de tal manera que estas superficies presenten heparina unida a la superficie de manera permanente para imitar la constitución química del endotelio de los vasos sanguíneos, que transporta sulfato de heparán localizado en la superficie. El documento US 2008/014239 describe un conjugado de heparina soluble en agua que comprende al menos 3-10 moléculas de glicosaminoglicano de heparina conectadas a una molécula central. Los conjugados de heparina se usan para inhibir la agregación de plaquetas sobre el colágeno en la sangre total que fluye en el sitio de la lesión e intervenciones vasculares o microvasculares.
Sumario de la invención
El ámbito de esta invención está definido por las reivindicaciones. Las realizaciones en la descripción relativas a los métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se divulgue en la descripción, pero que no esté cubierto por las reivindicaciones debe considerarse como presentado únicamente con fines ilustrativos. El objeto de la presente invención es presentar una composición para la administración a los vasos sanguíneos para la inhibición eficaz de reacciones trombogénicas. Dichas reacciones pueden ser inducidas por contacto de sangre con lesiones de vasos sanguíneos exponiendo colágeno, fibrina y células activadas depositadas sobre la lesión vascular presentando estructuras superficiales que no son compatibles con la sangre.
La presente invención se refiere a una solución acuosa que comprende agua y una cantidad eficaz de un conjugado de heparina macromolecular para usarse en el tratamiento de lesiones o enfermedades de los vasos sanguíneos en un paciente, en la que dicho conjugado de heparina macromolecular se administra sistémicamente a dicho paciente.
Realizaciones preferidas de la presente invención se definen en las reivindicaciones dependientes y se incorporan por la presente a la descripción.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 divulga los resultados de microscopía confocal de una arteria de cerdo que muestra la unión de estreptavidina-Cy5 (rojo) al CHC biotinilado adsorbido en la vasculatura.
La imagen de la izquierda muestra una arteria perfundida con CHC y la imagen de la derecha una arteria perfundida con PBS.
La figura 2 divulga la evaluación de Imaris de la unión de etreptavidina-Cy5 a CHC-biotina unida a un vaso sanguíneo.
La figura 3 divulga los resultados de la microscopía confocal después de 30 y 60 minutos de tratamiento con CHC (a la izquierda) y control (a la derecha).
Descripción detallada de la invención
En la presente solicitud, el término "glicosaminoglicanos sulfatados" se refiere no solo a las sustancias que normalmente se incluyen en el término, tal como, por ejemplo, heparina, sulfato de heparán, sulfato de dermatán y sulfato de condroitina, sino también a fragmentos y derivados de estas sustancias que son funcionales con el propósito.
El sulfato de heparán que expresa sitios de unión de antitrombina es un componente principal de la glicocálix endotelial. De acuerdo con la presente invención, se usa un conjugado macromolecular de heparina para restaurar la glicocálix endotelial de vasos sanguíneos aislados y vasos sanguíneos contenidos en órganos para reducir el daño que puede haberse producido por procesamiento isquémico y mecánico.
La presente invención presenta un conjugado de glicosaminoglicano macromolecular que se puede usar como medicamento para tratar daños o enfermedades de vasos o para tratar vasos antes de un trasplante.
La pared de un vaso sanguíneo saludable está cubierta por una capa coherente de células endoteliales que tienen una capa de carbohidratos llamada glicocálix frente al flujo sanguíneo. Un componente importante en la glicocálix es el sulfato de heparina que, en colaboración con la antitrombina, minimiza la generación de reacciones trombóticas. Diferentes formas de daños en los vasos sanguíneos, o enfermedades, pueden afectar negativamente a las propiedades de la glicocálix, por ejemplo, la isquemia.
Un conjugado de heparina macromolecular de acuerdo con la invención muestra resultados prometedores en relación con el efecto de unión a los componentes que se encuentran en la pared de un vaso sanguíneo dañado, tal como colágeno, fibrina y trombocitos activados. Cuando el conjugado de heparina de la presente invención se ha unido a la superficie del vaso sanguíneo y el conjugado de heparina unido a la superficie coopera con la antitrombina, se observa una disminución significativa de las reacciones trombogénicas.
Una aplicación de acuerdo con la presente invención es usar el conjugado de heparina para tratar pacientes cuyos vasos sanguíneos pueden dañarse durante un tratamiento médico o quirúrgico. El conjugado se administra al paciente disuelto en una solución acuosa en un intervalo de concentración de 0,001 - 10 mg/ml, tal como 0,001 mg/ml o más, o 0,01 mg/ml o más, o 0,1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos. La solución acuosa es una solución de tampón y el tampón podría ser cualquier tampón fisiológico, por ejemplo, un tampón de fosfato, PBS.
Se descubrió, bastante sorprendentemente, que un conjugado macromolecular compuesto por múltiples moléculas de heparina se une al colágeno lo suficientemente fuerte como para anular el carácter trombogénico del colágeno adsorbido sobre una superficie en contacto con la sangre, véase el Ejemplo 2. Este efecto protector y de unión del conjugado de heparina macromolecular contrasta fuertemente con la heparina ordinaria comercialmente disponible destinada a la administración intravenosa, que no tiene ningún efecto a este respecto. De manera similar, se encontró que un conjugado macromolecular compuesto por múltiples moléculas de heparina se une a la fibrina, pero no al fibrinógeno, véase el Ejemplo 3.
Un conjugado macromolecular de heparina de acuerdo con la invención es un conjugado que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más, pero 100 o menos, cadenas de heparina unidas a la cadena principal, en el que cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace simple a la cadena principal. Una determinada fracción de las moléculas de GAG participará en la unión al sustrato biológico, mientras que las moléculas de GAG restantes, que no participan en la unión, están libres para ejercer la actividad biológica de GAG, siendo el GAG heparina de acuerdo con la invención reivindicada. Debido a la unión múltiple entre las moléculas de GAG y el sustrato que tiene afinidad por los GAG, la fuerza de unión del conjugado macromolecular de GAG superará la del GAG ordinario, lo que dará como resultado un rendimiento superior. Para obtener la combinación ventajosa de unión fuerte y actividad biológica retenida, es preferible que múltiples cadenas de GAG estén orientadas de tal manera que puedan interactuar libremente con el sustrato que tiene afinidad por los GAG, y especialmente la heparina. El GaG debe unirse a la cadena principal preferiblemente mediante una unión de un solo punto. Una realización preferida de un conjugado macromolecular de GAG es el conjugado de heparina Corline (CHC), que se compone de aproximadamente 70 moléculas de heparina unidas a la cadena principal inerte (que se puede obtener por parte de Corline Systems AB, Uppsala, Suecia). El número de moléculas de heparina debería estar preferentemente entre 65 y 75 por cadena. El conjugado preferido se describe en el documento US5529986.
El conjugado macromolecular es un conjugado (macromolécula) biológicamente activo, al menos sustancialmente soluble en agua, preferiblemente en forma sustancialmente pura, que comprende un homo- o heteropolímero orgánico de cadena sustancialmente lineal que tiene una serie de grupos funcionales distribuidos a lo largo de la cadena principal del polímero, a través del cual 50 o más, pero 100 o menos, cadenas de heparina en una parte no activa del mismo están ancladas a través de enlaces covalentes.
Dicho conjugado puede describirse conceptualmente como un proteoglicano sintético, cuya composición relativa puede variarse de forma controlable y adaptarse a la aplicación prevista.
La cadena de polímero sustancialmente lineal que va a funcionar como la cadena principal para los residuos de glicosaminoglicano debería, por supuesto, ser biológicamente inerte después del acoplamiento del glicosaminoglicano o -glicanos en cuestión, en el sentido de que debería estar libre de al menos actividad biológica de interferencia. Como se comprende fácilmente, para permitir el acoplamiento de una pluralidad de residuos de glicosaminoglicano, la cadena principal debe estar provista de una serie de grupos funcionales, tales como, por ejemplo, grupos amino, amida, sulfato, vinilo, carbonilo, nitro, tiol, hidroxilo o carboxilo, distribuidos a lo largo de la cadena y capaces, después de una modificación opcional, de acoplarse con el glicosaminoglicano, ya sea directamente o mediante una secuencia de acoplamiento. En este contexto, debe señalarse que el GAG en cuestión, dependiendo del método de producción del conjugado, puede tener todavía asociado el residuo terminal de su proteína conjugada natural, y que la unión entonces, por supuesto, tendrá lugar ventajosamente a través de, por ejemplo, un aminoácido en dicho residuo.
Además, la cadena principal, preferentemente una cadena polimérica, debería tener preferentemente una buena solubilidad en agua. Al menos debería, de acuerdo con lo que se ha dicho anteriormente sobre el conjugado, ser al menos sustancialmente soluble en agua después del acoplamiento de los grupos glicosaminoglicanos. Las cadenas poliméricas específicas, que pueden ser adecuadas para los fines de la invención, serán fácilmente evidentes para el experto en la materia después de haber formado parte del concepto inventivo general. Este es, por supuesto, también el caso del grado de ramificación en la cadena polimérica que puede permitirse dentro del alcance de la expresión "sustancialmente lineal".
De acuerdo con la invención reivindicada, la cadena principal es un compuesto alifático inerte. Con respecto al hecho de que normalmente se desea que el glicosaminoglicano mantenga su actividad biológica después de la unión a la cadena principal del polímero, de acuerdo con la invención reivindicada, cada molécula de glicosaminoglicano está unida terminalmente y mediante un solo enlace al polímero principal. Por ejemplo, el glicosaminoglicano puede unirse a la cadena principal a través de un aminoácido terminal.
En una realización preferida de la invención, el conjugado macromolecular de heparina tiene un peso molecular superior a 70 kDa. Preferentemente, el peso molecular del conjugado de heparina macromolecular es superior a 200 kDa, más preferentemente superior a 400 kDa, e incluso más preferentemente superior a 600 kDa.
Aplicaciones de la invención
Una aplicación se refiere a un medicamento que comprende un conjugado de heparina que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más, pero 100 o menos, cadenas de heparina unidas a la cadena principal donde cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace a la cadena principal para su uso en el tratamiento de daños o enfermedades de los vasos sanguíneos. El daño de los vasos sanguíneos podría ser causado por la dilatación del vaso sanguíneo u otros procedimientos quirúrgicos y la enfermedad de los vasos sanguíneos podría ser isquemia. El conjugado podría disolverse en una solución salina fisiológica estéril y administrarse sistémicamente para permitir que el conjugado se disuelva en la sangre y, opcionalmente, se una a las lesiones vasculares donde el colágeno y/o la fibrina están expuestos para bloquear la formación de trombos que pueden inducirse en dichas lesiones. La solución salina podría ser cualquier solución de tampón tal como PBS y la concentración del conjugado de heparina podría oscilar entre 0,001 y 10 mg/ml, tal como 0,001 mg/ml o más, o 0,01 mg/ml o más o 0,1 mg/ml. o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos.
La lesión por reperfusión miocárdica es un síndrome multifactorial, aún poco conocido, asociado con una enfermedad cardíaca coronaria, que es la principal causa de muerte en todo el mundo. La lesión por reperfusión también es un factor importante que considerar en asociación con el trasplante de órganos. La isquemia induce daño vascular y una hipótesis es que tales lesiones vasculares pueden iniciar la activación plaquetaria y la generación de trombina con la exposición a la sangre durante la reperfusión. Los órganos aislados pueden beneficiarse de la perfusión con el conjugado de heparina descrito en el presente documento antes de trasplantar el vaso u órgano a un paciente en combinación con la administración sistémica del conjugado de la presente invención en relación con el inicio de la reperfusión.
La solución se puede usar en el trasplante de órganos a pacientes, en particular, riñones.
Por lo tanto, también se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para trasplantar un órgano a un paciente, que comprende las etapas de proporcionar un órgano a trasplantar, perfundir el órgano con una solución como se define en el presente documento en un tampón para que recubrir el tejido del órgano con una capa protectora y trasplantar el órgano al paciente. Adecuadamente, el órgano se perfunde con la solución durante un período de tiempo de al menos 1 hora, aunque el período puede ser más prolongado, tal como hasta 24 horas, o incluso más.
La perfusión se realiza conectando el riñón a un sistema de circulación en el que normalmente circula alrededor de 1 litro de solución tamponada hacia el órgano.
Después de dicha perfusión, los vasos sanguíneos del órgano se recubren con una capa protectora que evitará la isquemia/reperfusión del órgano trasplantado.
Ejemplos
Cada uno de los ejemplos a continuación debe considerarse como un ejemplo de referencia.
Ejemplo 1
La actividad biológica específica de la heparina y el CHC, respectivamente, se evaluó mediante un ensayo de inhibición de FXa. La heparina tenía una actividad de 200 UI/ml y el CHC tenía 30 UI/ml.
Ejemplo 2 - Superficie de colágeno modificada con CHC
Se recubrieron previamente tubos de PVC con colágeno (colágeno bovino de tipo I, Purecol) rotando los tubos con PBS suplementado con colágeno (60 pg/ml) durante tres horas y se dividieron en tres grupos. El grupo I no recibió más tratamiento, el grupo II se incubó con PBS suplementado con heparina (50 pg/ml) durante 30 minutos y el grupo III se incubó con PBS suplementado con CHC (50 pg/ml) durante 30 minutos. Se prepararon bucles de tubos de cada grupo y se rotaron a 37 °C con sangre humana recién extraída sin anticoagulante. Los grupos I y II indujeron la formación de coágulos sólidos en treinta minutos con el consumo total de plaquetas. No se produjo coagulación en el grupo III y, después de sesenta minutos, el recuento de plaquetas se mantuvo en más del 90 % del nivel inicial. Este ejemplo muestra que el CHC, pero no la heparina, es capaz de unirse al colágeno y, por lo tanto, transformar la superficie del colágeno trombogénico en una superficie de heparina no trombogénica.
Ejemplo 3 - Superficie de fibrina modificada con CHC
Bucles de tubos de PVC se rotaron con plasma citratado humano suplementado con CaCb (grupo II) a una concentración que provocó una coagulación visible (formación de fibrina) en 20 minutos. Después de que se produjera la coagulación, los tubos se drenaron y se enjuagaron cuidadosamente con PBS y se dividieron en dos grupos. El grupo I no recibió más tratamiento y el grupo II se incubó con PBS complementado con CHC (50 pg/ml) durante 30 minutos. Se prepararon bucles de tubos de cada grupo y se rotaron a 37 °C con sangre humana recién extraída sin anticoagulante. El grupo I indujo la formación de coágulos sólidos en treinta minutos con el consumo total de plaquetas. No se produjo coagulación en el grupo II y, después de sesenta minutos, el recuento de plaquetas se mantuvo en más del 90 % del nivel inicial. Este ejemplo muestra que el CHC, pero no la heparina, es capaz de unirse a la fibrina y, por lo tanto, transformar la superficie de fibrina trombogénica en una superficie de heparina no trombogénica.
Ejemplo 4 - Perfusión de un riñón aislado
En un modelo de trasplante porcino, se obtuvieron riñones de cerdos donantes en muerte cerebral con un peso de 30 kg. Después del lavado aórtico con solución de perfusión (UW, Universidad de Wisconsin), se recogieron los riñones y se colocaron en una máquina de perfusión comercial (Organ Assist, NL) donde los dos riñones se expusieron a una perfusión fría pulsátil controlada por presión con solución de perfusión mecánica durante un mínimo de 2 h a una concentración de 50 pg/ml. Se perfundió un riñón con una solución que comprendía CHC.
El consumo de CHC durante la perfusión de riñones aislados se controló utilizando un ensayo de azul de toluidina que puede usarse para detectar CHC en el intervalo de 10 - 50 pg/ml. Los experimentos con perfusión de riñones de cinco cerdos han demostrado que 10 - 15 mg de CHC se unen a los riñones perfundidos.
Ejemplo 5 - Unión de CHC a un vaso sanguíneo
Se recogieron segmentos de arteria ilíaca de un cerdo que había estado en muerte cerebral durante tres horas. Después de la perfusión con PBS (tampón de fosfato de sodio pH 7,4) se incubó un segmento con CHC (CHC biotinilado, 50 |jg/ml en PBS) y otro con PBS solamente. Se usó estreptavidina marcada con fluorescencia (estreptavidina-Cy5 que aparece en rojo) para detectar CHC-biotina unida a la superficie. La figura 1 divulga los resultados registrados por microscopía confocal que muestra una captación distinta de estreptavidina-Cy5 en rojo en la muestra de CHC-biotina con muy poca o ninguna señal de la muestra de control. La unión de un anticuerpo dirigido contra el factor de von Willebrand (mostrado en verde) fue comparable entre las dos muestras.
El análisis asistido por ordenador (Imaris) de la muestra con CHC-biotina verificó aún más la unión de CHC al vaso sanguíneo, consulte la figura 2.
Ejemplo 6 - Unión de CHC al colágeno evita el depósito de plaquetas
Se estableció una capa confluente de células endoteliales (EC) sobre portaobjetos de vidrio que se habían recubierto con colágeno de tipo I. Se creó una herida raspando las células EC usando una punta fina de una pipeta. Posteriormente, una muestra de prueba se incubó con CHC (50 jg/m l en tampón de PBS) durante 30 minutos y luego se enjuagó cuidadosamente con PBS. Se usó otra muestra como control sin ningún otro tratamiento posterior al raspado.
Ambas muestras se incubaron con sangre humana fresca durante 60 minutos usando un dispositivo especial para asegurarse de que la sangre fluía sobre las superficies. Los especímenes de prueba se enjuagaron y fijaron con paraformaldehído y se examinaron mediante microscopía confocal usando un anticuerpo fluorescente (mostrado en verde) dirigido contra CD 62 (p-selectina) expresado por plaquetas activadas. En las imágenes a continuación, la herida está delineada por líneas blancas delgadas, véase la figura 3. En la superficie de control se pudo detectar una densa capa de plaquetas activadas (izquierda, denominada Control), mientras que no se pudo observar ningún depósito de plaquetas en la muestra en la que se había permitido que el CHC se uniera al colágeno (derecha, denominada Heparina).

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una solución acuosa que comprende agua y una cantidad efectiva de un conjugado de heparina macromolecular, en la que el conjugado de heparina es un conjugado que comprende una cadena principal de un compuesto alifático inerte y 50 o más, pero 100 o menos, cadenas de heparina unidas a la cadena principal en la que cada heparina está unida terminalmente y por un solo enlace a la cadena principal;
en la que la solución acuosa es una solución de tampón, estando disuelto dicho conjugado en dicha solución de tampón,
para su uso en el tratamiento de lesiones o enfermedades de vasos sanguíneos en un paciente, en la que dicho conjugado de heparina macromolecular se administra sistémicamente a dicho paciente.
2. La solución para uso según la reivindicación 1, en la que la solución acuosa es una solución salina fisiológica estéril.
3. La solución para uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la concentración del conjugado de heparina en dicha solución es entre 0,001 y 10 mg/ml, tal como 0,001 mg/ml o más, como 0,01 mg/ml o más, o 0,1 mg/ml o más, o 1 mg/ml o más, o 3 mg/ml o más, o 10 mg/ml o menos, o 7 mg/ml o menos, o 5 mg/ml o menos.
4. La solución para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el daño de los vasos sanguíneos está causado por la dilatación del vaso sanguíneo u otros procedimientos quirúrgicos.
5. La solución para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la enfermedad de los vasos sanguíneos ha sido provocada por isquemia.
6. La solución para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho conjugado se une a las lesiones vasculares en las que el colágeno y/o la fibrina están expuestos para bloquear la formación de trombos.
7. La solución para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha administración sistémica de dicho conjugado se realiza después de que un órgano aislado haya sido perfundido con la misma solución y antes o al mismo tiempo que trasplantar el órgano a un paciente.
ES20209204T 2011-12-22 2012-12-17 Medios y método para tratar vasos sanguíneos Active ES2926906T3 (es)

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