CN104039331A - 包含肝素的大分子结合物的用于处理血管的水溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于处理血管的溶液，其中该溶液包含一种肝素结合物。本发明进一步涉及该结合物作为药剂的用途以及使用该结合物涂覆组织的方法。

Description

包含肝素的大分子结合物的用于处理血管的水溶液
发明领域
本发明涉及包含肝素的大分子结合物的用于处理血管的缓冲溶液、用于处理血管的药剂以及涂覆血管的方法。
背景
只要循环血液在衬有完整内皮的未受干扰的血管中流动，它就能被维持在微妙的平衡状态。然而，存在着不利地影响这种平衡的众多情形，从而导致血栓形成，这是威胁生命的事件，如果不加以治疗，它仍然是人类的第一号杀手。在另一方面，如果通过太有效的抑制而不顾涉及发动血栓形成的这些反应，则可能发生过度的威胁生命的出血。
人们普遍接受的是，面向血液的血管壁应当被未受损的单层内皮细胞覆盖。这个细胞层由被称为内皮糖萼的膜结合的蛋白聚糖类和糖蛋白类的网络所覆盖。在过去十年间，内皮糖萼已经逐渐被理解为保护血管壁免受致病性损害的血管内室。已经显示内皮糖萼的损伤增强白细胞(leucyte)和血小板粘附到血管内皮上，并且由于紊乱的机械转换效应(mechanotransducing effect)还诱发内皮功能障碍。已经报道内皮糖萼的严重紊乱与例如糖尿病、缺血/再灌注和动脉粥样硬化相关。
现在，通过不同药物的全身给药来治疗由扩张或其他手术操作和疾病引起的血管壁损伤。
通过充当抗凝血酶的有力促进剂，肝素长期以来被记录为临床上公认的抗凝剂，抗凝血酶是一种在血液中的能够抑制包括凝血酶在内的多种凝固酶的天然发生的蛋白质。水蛭素是凝血酶的直接抑制剂的实例。肝素或水蛭素的使用与比可忽略不计更低的出血风险相关。
已经利用了由多个共价连接到惰性主链上的肝素链组成的一种大分子结合物，用于以这样一种方式来修饰人工表面(WO 93/05793)和生物表面(WO 00/45837)，即这些表面持续存在表面结合肝素，从而模拟携带表面定位的硫酸类肝素的血管内皮的化学结构。
发明概述
本发明的目的是呈现用于给药至血管以便有效抑制血栓形成反应的组合物。可以通过使血液与暴露了沉积在血管损伤上的胶原、纤维蛋白、以及活化细胞的血管损伤相接触来诱导所述反应，这些血管损伤呈现了与血液不相容的表面结构。
在第一方面，本发明涉及一种包含水和有效量的大分子肝素结合物的用于体外处理血管的水溶液。在权利要求1中定义了该溶液。
在另一方面，本发明涉及一种大分子肝素结合物用作治疗血管损伤或疾病的药剂的用途。
在第三方面，本发明涉及一种在将血管或包含血管的器官移植到患者体内之前涂覆血管的内皮表面的体外方法，该方法包括使这些血管表面与包含水和有效量的大分子肝素结合物的水溶液接触。
在第四方面，本发明涉及治疗患者的方法，该方法包括使损伤血管的表面与包含水和有效量的大分子肝素结合物的水溶液接触。
在第五方面，本发明提供了一种将器官移植到患者体内的方法。
本发明的优选实施例如在从属权利要求中所定义并且在此将其结合在说明书中。
附图简要说明
图1披露了来自显示链霉亲和素-Cy5(红色)与吸附在血管上的生物素化CHC的结合的猪动脉的共聚焦显微镜检查的结果。在左边的图片显示了用CHC灌注的动脉，并且在右边的图片显示了显示了PBS灌注的动脉。
图2披露了与链霉亲和素-Cy5与附着到血管上的CHC-生物素的结合的Imaris评估。
图3披露了来自在用CHC(在左边)和对照(在右边)处理30和60分钟之后的共聚焦显微镜检查的结果。
发明详细说明
在本申请中，术语“硫酸化糖胺聚糖”不但是指通常包括在该术语中的这些物质，例如像肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素以及硫酸软骨素，而且是指有功能的用于这个目的的这些物质的片段和衍生物。
表达抗凝血酶结合位点的硫酸类肝素是内皮糖萼的主要组分。根据本发明，肝素的大分子结合物用来恢复离体血管以及包含在器官中的血管的内皮糖萼，从而减少可能由于缺血和机械处理而已经发生的损伤。
本发明提供了可以用作治疗血管损伤或疾病或在移植之前处理血管的药剂的大分子糖胺聚糖结合物。
健康的血管壁被具有一层面向血流的称为糖萼的碳水化合物的内皮细胞的凝聚层覆盖。在糖萼中的一种重要组分是硫酸肝素，硫酸肝素与抗凝血酶协作，将血栓形成反应的产生最小化。不同形式的血管损伤或疾病(例如缺血)可能以负面方式影响糖萼的特性。
根据本发明的大分子肝素结合物显示出有关与损伤血管壁上发现的组分(例如胶原、纤维蛋白以及活化的凝血细胞)的结合效应的有希望的结果。当本发明的肝素结合物已经结合到血管表面上并且在该表面上的结合的肝素结合物与抗凝血酶协作时，可以看到血栓形成反应的显著下降。
根据本发明的一种应用是使用肝素结合物来处理用于移植的器官或治疗在医学治疗或手术治疗期间其血管可能被损伤的患者。在另一个实施例中，当从患者体内取出血管或在将血管或包含这些血管的器官移植到患者体内之前时，本发明可以用来在体外处理血管。将溶解在水溶液中的该结合物以0.001-10mg/ml的浓度范围，例如0.001mg/ml或更高、或0.01mg/ml或更高、或0.1mg/ml或更高、或1mg/ml或更高、或3mg/ml或更高、或10mg/ml或更低、或7mg/ml或更低、或5mg/ml或更低给药至血管或患者。该水溶液可以是一种缓冲溶液并且该缓冲液可以是任何生理缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，PBS。
相当令人惊奇地发现，由多个肝素分子组成的大分子结合物足够强地与胶原结合，从而消除了吸附到与血液接触的表面上的胶原的血栓形成特征，参见实例2。大分子肝素结合物的这种结合和保护效应与旨在用于静脉内给药的在这一点上没有效果的普通可商购的肝素形成了鲜明的对比。类似地，发现由多个肝素分子组成的大分子结合物与纤维蛋白结合但不与纤维蛋白原结合，参见实例3。
根据本发明的大分子肝素结合物包含优选地共价连接到(优选经由单点附接)惰性主链上的多个非分割糖胺聚糖(GAG)(优选肝素)分子。每个结合物的GAG分子数量应当为至少十个，但优选地在20个和100个之间，即20个或更多、或50个或更多、或70个或更多、或100个或更少、或80个或更少。GAG分子的某个部分将参与结合到生物基质上，而不参与结合的剩余的GAG分子是游离的，从而发挥GAG的生物活性。由于在GAG分子与对GAG具有亲和力的该基质之间的多重结合，GAG的大分子结合物的结合强度将超过普通GAG的结合强度，从而产生优越的性能。为了获得强结合与保留的生物活性的有利结合，优选的是以这样的方式将多个GAG链定向，即它们可自由地与具有对GAG尤其是肝素的亲和力的基质相互作用。优选地通过单点附接将GAG附接到主链上。GAG的大分子结合物的一个优选实施例是科尔林(Corline)肝素结合物(CHC)，它由连接到惰性主链(从瑞典乌普萨拉的科尔林系统AB可获得)上的大约70个肝素分子组成。肝素分子的数量应当优选地在每个链65个与75个之间。优选的结合物描述于US5529986中，该文献通过引用将其结合在此。
该大分子结合物是至少基本上水溶性的有生物活性的结合物(大分子)，优选处于基本上纯的形式，包含基本上直链的有机均聚物或异聚物，该均聚物或异聚物具有多个沿着该聚合物主链分布的官能团，来自在其非活性部分中的硫酸化糖胺聚糖(GAG)的基团的至少约10个分子的基团经由这些官能团通过共价键锚定。
这样一种结合物可以在概念上描述为合成蛋白聚糖，其相对组成可以按照可控制的方式变化并适合于预期的应用。
当然，充当糖胺聚糖残基的主链的基本上线性的聚合物链在所讨论的糖胺聚糖或聚糖类的结合之后应当是基本上生物学惰性的，从这个意义上来说，应当至少没有妨碍生物活性。正如易于理解的，为了允许多个糖胺聚糖残基的结合，主链应当提供有沿着该链分布的多个官能团，例如像氨基、酰胺、硫酸根、乙烯基、羰基、硝基、巯基、羟基或羧基，并且这些基团在任选的修饰之后能够直接地亦或经由结合序列而结合糖胺聚糖。在这种背景之下应当注意的是，取决于产生该结合物的方法，所讨论的GAG仍然可具有结合到其上的其天然结合物蛋白的末端残基，然后必定将经由例如在这种残基中的氨基酸有利地发生该结合。
此外，该主链(优选一种聚合物链)应当具有良好的水溶性。根据先前关于结合物所述，至少它应当在结合这些糖胺聚糖基团之后是基本上水溶性的。在已经理解总的发明构思的一部分之后，可适合于本发明的目的的特异性聚合物链对于本领域的普通技术人员而言将是明显的。当然，这对于在表述“基本上线性的”的范围之内可允许的聚合物链的枝化度也是如此。
优选地，该聚合物链是天然或合成的多肽、多糖或脂肪族聚合物。在一个实施例中，该主链是一种惰性脂肪族化合物。作为特定非限制性实例，这些主链可以是聚赖氨酸、聚鸟氨酸、壳聚糖、聚亚胺和聚烯丙胺(poly allylamine)、淀粉、纤维素、甲壳质、透明质酸、聚酯类、聚醚类、聚酰胺类、聚胺类、聚氨酯类或它们的组合或混合物。
关于通常希望糖胺聚糖在结合到聚合物主链上之后维持其生物活性的事实，优选的是每个糖胺聚糖分子在末端结合并且仅通过单键结合到该主要的聚合物上。例如，该糖胺聚糖可以经由氨基酸(其次优选末端氨基酸)结合到主链上，但也可以使用葡糖胺单元的游离氨基。后者可以像这样游离存在或者可以已经通过脱硫或脱乙酰化而释放。
特别是在氨基官能的聚合物用作该主链的情况下，可能在以下情况下，尤其是当该主链被糖胺聚糖稀疏地取代时，有利的是封闭剩余的游离氨基，例如，这可以通过乙酰化来执行。替代性方法可以是用例如甲基在附接糖胺聚糖之前取代所希望数量的氨基。
在本发明的一个优选实施例中，该大分子肝素结合物具有高于70kDa的分子量。优选地，该大分子肝素结合物的分子量高于200kDa，更优选地高于400kDa，甚至更优选地高于600kDa。
本发明的应用
本发明的一种应用是用于涂覆胶原。例如，通过浸没在磷酸盐缓冲液(PBS)中持续至少一个小时，随后浸没在补充有范围从0.01mg/ml到10mg/ml浓度的CHC的PBS中持续5分钟到60分钟的时段，并且然后用PBS仔细冲洗三次，将胶原或明胶(水解胶原)的三维基质水化。
另一种应用是指组织样品(例如血管内皮表面)的涂覆。将预期用于移植到人体中的组织标本(暴露的胶原)浸没在补充有范围从0.001mg/ml到10mg/ml浓度，例如0.001mg/ml或更高、或0.01mg/ml或更高或0.1mg/ml或更高、或1mg/ml或更高、或3mg/ml或更高、或10mg/ml或更低、或7mg/ml或更低、或5mg/ml或更低的CHC的PBS溶液中持续5分钟到120分钟的时段，并且然后用PBS仔细冲洗三次。
另一种应用是指包含一种肝素结合物的药剂，该肝素结合物包含惰性脂肪族链的主链和连接到该主链上的至少一种肝素，用作用于治疗血管损伤或疾病的药剂。在另一个实施例中，该肝素结合物包含处于10个到100个间隔的肝素分子。该血管损伤可以由扩张血管或其他手术操作引起，并且该血管疾病可以是缺血。可以将该结合物溶解在无菌生理盐溶液中并且全身给药，从而允许该结合物溶解在血液中并且任选地结合到胶原和/或纤维蛋白暴露的血管病变上，以便阻断可能在这样的病变处诱发的血栓形成。这种盐溶液可以是任何缓冲溶液，例如PBS，并且该肝素结合物的浓度可以在0.001-10mg/ml的范围，例如0.001mg/ml或更高、或0.01mg/ml或更高、或0.1mg/ml或更高、或1mg/ml或更高、或3mg/ml或更高、或10mg/ml或更低、或7mg/ml或更低、或5mg/ml或更低。
心肌再灌注损伤是与冠状动脉心脏病相关的多因素的仍然缺乏了解的综合征，是世界范围内导致死亡的主要原因。再灌注损伤也是与器官移植相关的需要考虑的重要因素。缺血诱发了血管损伤，并且一个假设是，在再灌注期间血液暴露时这样的血管病变可以启动血小板活化以及凝血酶的产生。离体器官可以受益于在将该血管或器官移植到患者体内之前用本发明的肝素结合物溶液灌注，这可以与以下相组合：将本发明的结合物的全身给药与开始灌注相结合。
该溶液可用于将器官特别是肾脏移植到患者中。
因此，本发明提供了将器官移植到患者体内的方法，该方法包括以下步骤：将提供有待移植的器官，用根据权利要求1-6中任一项所述的溶液在缓冲剂中灌注该器官，从而将该器官的组织涂覆有一个保护涂层，并且将该器官移植到患者体内。适合地将该器官用该溶液灌注持续至少1个小时的时间段，虽然该时段可以更长，例如长达24小时或更长。
通过将肾脏连接到一个循环系统来进行灌注，其中通常约1升的缓冲溶液循环到该器官。
在这样的灌注之后，在该器官中的这些血管涂覆有保护层，这个保护层将防止该移植的器官的缺血/再灌注。
实例
实例1
通过FXa抑制试验分别评定了肝素和CHC的特异性生物活性。肝素具有200IU/ml的活性并且CHC具有30IU/ml的活性。
实例2-用CHC修饰的胶原表面
用胶原(I型牛胶原，Purecol)预涂覆多个PVC管，这是通过在三个小时中旋转具有补充有胶原(60微克/ml)的PBS的管来进行的，然后将这些管分成三个组。I组没有接受进一步的处理，II组用补充有肝素(50微克/ml)的PBS孵育30分钟，并且III组用补充有CHC(50微克/ml)的PBS孵育30分钟。从每个组制备管圈，并且将这些管圈与没有任何抗凝剂的新鲜采样的人血一起在37摄氏度旋转。I组和II组在三十分钟之内诱导了固体凝块的形成，其中血小板全部被消耗。在III组中没有发生凝固，并且在六十分钟之后血小板计数保持在基线水平的百分之90以上。这个实例表明，CHC而不是肝素能够结合到胶原上并且由此将血栓形成性胶原表面转化成非血栓形成性肝素表面。
实例3-用CHC修饰的纤维蛋白表面
将多个PVC管圈与补充有CaCl2(II组)的人枸橼酸钠血浆一起旋转，其中CaCl2处于在20分钟之内引起可见的凝固(纤维蛋白形成)的浓度。在已经发生凝固之后，将这些管排干，并且用PBS仔细冲洗，然后分成两个组。I组没有接受进一步的处理，并且II组用补充有CHC(50微克/ml)的PBS孵育30分钟。从每个组制备管圈，并且将这些管圈与没有任何抗凝剂的新鲜采样的人血一起在37摄氏度旋转。I组在三十分钟之内诱导了固体凝块的形成，其中血小板全部被消耗。在II组中没有发生凝固，并且在六十分钟之后血小板计数保持在基线水平的百分之90以上。这个实例表明CHC而不是肝素能够结合到纤维蛋白上并且由此将血栓形成性纤维蛋白表面转化成非血栓形成性肝素表面。
实例4-离体肾脏的灌注
在猪移植模型中，从重量为30kg的脑死亡的供体猪获得肾脏。在用灌注溶液(UW，威斯康辛大学)进行主动脉冲洗之后，收获这些肾脏，并将其置于商用灌注机(Organ Assist,NL)中，其中两个肾脏暴露于具有浓度为50微克/ml的机器灌注溶液的压力引导搏动冷灌注(pressure steeredpulsatile cold perfusion)持续至少2h。一个肾脏用包含CHC的溶液灌注。
使用甲苯氨蓝试验监测在离体肾脏灌注过程中CHC的消耗，该甲苯氨蓝试验可以用来检测在10微克/ml-50微克/ml范围内的CHC。来自五头猪的肾脏的灌注实验已经显示10mg-15mg的CHC结合到这些灌注的肾脏上。
实例5-CHC与血管的结合
从已经脑死亡三个小时的猪收获髂动脉段。在用PBS(磷酸钠缓冲液，pH7.4)灌注之后，一段用CHC(生物素化的CHC，50微克/ml，在PBS中)孵育，而另一段只用PBS孵育。使用荧光标记链霉亲和素(显出红色的链霉亲和素-Cy5)来检测表面附着的CHC-生物素。图1披露了通过共聚焦显微镜检查记录的结果，显示了呈红色的链霉亲和素-Cy5在CHC-生物素样品上的明显摄取，而对照样品具有很少的信号或没有信号。在这两个样品之间针对冯·威利布兰德(von willebrand)因子(显示为绿色)的抗体的结合是可比较的。
具有CHC-生物素的标本的计算机辅助分析(Imaris)进一步证实CHC与血管的结合，参见图2。
实例6-CHC与胶原的结合防止血小板沉积
在载玻片上建立内皮细胞(EC)的汇合层，这些载玻片已经涂覆有I型胶原。使用移液管的细尖端刮去这些EC细胞而产生一个伤口。随后将一个试验样品用CHC(50微克/ml，在PBS缓冲液中)孵育持续30分钟，然后用PBS仔细冲洗。另一个样品用作对照，在刮擦之后没有任何进一步处理。
两个样品均使用特殊装置用新鲜人血孵育持续60分钟，以确保血液流到这些表面上。将这些试验标本冲洗并且用多聚甲醛固定，然后使用针对由活化血小板表达的CD62(p-选择素)的荧光抗体(显示为绿色)通过共焦显微镜检查来进行检查。在以下这些图片中，用细的白线描绘出伤口的轮廓，参见图3。在对照表面上，可以检测到活化血小板的致密层(左边，表示对照)，而在其上已经允许CHC结合胶原的样品上没有看出血小板的沉积(右边，表示肝素)。

Claims (12)

1.一种包含水和有效量的大分子肝素结合物的用于体外处理血管的溶液，其中该肝素结合物是包含惰性脂肪族化合物主链和连接到该主链上的至少十个肝素链的一种结合物，并且其中肝素分子的数量是50个或50个以上，但在100个或100个以下。
2.根据权利要求1任一项所述的溶液，其中该溶液是一种缓冲溶液。
3.根据权利要求1或4所述的溶液，其中该肝素结合物的浓度在0.01mg/ml与10mg/ml之间，例如0.01mg/ml或更高、或0.1mg/ml或更高、或1mg/ml或更高、或3mg/ml或更高、或10mg/ml或更低、或7mg/ml或更低、或5mg/ml或更低。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的溶液，用作一种用于治疗血管损伤或疾病的药剂。
5.根据权利要求4所述的溶液，其中该血管损伤是由扩张血管或其他手术操作引起的。
6.根据权利要求4所述的溶液，其中该血管疾病是由缺血引起的。
7.一种在将血管或包含该血管的器官移植到患者体内之前涂覆该血管的内皮表面的体外方法，包括使该血管表面与根据权利要求1至6中任一项所述的水溶液接触。
8.如权利要求7所述的方法，其中该血管存在于用于移植的器官中。
9.一种治疗患者的方法，该方法包括使损伤血管的表面与权利要求1至6中任一项所述的水溶液接触。
10.如权利要求9所述的方法，其中该溶液是在血管成形术、置入血管支架或任何其他血管操作之前、期间或之后给药的。
11.一种将器官移植到患者体内的方法，包括以下步骤：
提供一个有待移植的器官；
将该器官用根据权利要求1至6中任一项所述的溶液在缓冲液中进行灌注，从而将该器官中的血管用一个保护涂层涂覆；并且
将该器官移植到患者体内。
12.根据权利要求11所述的方法，其中将该器官用该溶液灌注持续至少1个小时的时间段。
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