BR122023002098B1 - Métodos para preparar vasos sanguíneos personalizados - Google Patents

Abstract

A presente divulgação refere-se a métodos de preparar vasos sanguíneos personalizados, úteis para o transplante com compatibilidade melhorada do hospedeiro e suscetibilidade reduzida à trombose. Também fornecidos são vasos sanguíneos personalizados produzidos pelos métodos e uso dos mesmos em cirurgia.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS Dividido do BR112021001541-8, depositado em 02.08.2019.

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA No 62/714,200, depositado em 3 de agosto de 2018.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[002] A presente divulgação se refere a vasos sanguíneos perso nalizados e métodos de preparar vasos sanguíneos personalizados. Em várias modalidades, os vasos sanguíneos personalizados produzidos pelos métodos considerados aqui podem ser úteis no transplante com compatibilidade melhorada do hospedeiro, integração de tecido e suscetibilidade reduzida à trombose.

FUNDAMENTOS

[003] Doenças vasculares constituem um problema de saúde sério e constantemente crescente em uma escala global. As opções para a substituição de vasos sanguíneos danificados são limitadas atualmente. O transplante autólogo requer vaso adequado no paciente e leva à morbidez do sítio doador. Substituições de vaso sintético estão disponíveis, mas estas carecem de integração biológica no tecido hospedeiro e pa- tência a longo prazo. Existe uma necessidade de enxertos completamente biológicos individualizados por paciente.

[004] A publicação internacional número WO/2013/136184 divulga “métodos para a recelularização de vasos sanguíneos”; por exemplo “para produzir uma veia alogênica, em que uma veia do doador é des- celularizada e depois recelularizada usando células-tronco do sangue total ou medula óssea”.

[005] A publicação internacional número WO/2015/181245 divulga “métodos para a recelularização de válvulas em veias portadoras de válvulas”; por exemplo “para produzir uma válvula venosa alogênica, em que uma veia portadora de válvula do doador é descelularizada e depois recelularizada usando células-tronco do sangue total ou medula óssea”.

SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO

[006] Um aspecto da presente divulgação se refere a um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado compreendendo, contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com uma amostra de sangue total não diluída de um indivíduo em necessidade do vaso sanguíneo personalizado, em que o contato é realizado por mais do que 2 dias.

[007] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um mé todo de preparar um vaso sanguíneo personalizado, compreendendo contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com uma suspensão compreendendo uma amostra de sangue total de um indivíduo em necessidade do vaso sanguíneo personalizado, em que a amostra de sangue total é diluída em uma solução fisiológica. Em algumas modalidades, a solução fisiológica mantém a pressão oncótica coloidal do ambiente extracelular, tampona o pH em um manter independente de CO2 e/ou fornece um efeito protetor ou antioxidante celular.

[008] Em algumas modalidades, uma população de células pre sentes na amostra de sangue total preenche a estrutura.

[009] Em algumas modalidades, a amostra de sangue total com preende um ou mais fatores não celulares, em que um ou mais fatores não celulares do sangue total preenchem a estrutura e em que um ou mais fatores não celulares promovem a celularização da estrutura tubular acelular e a compatibilidade do hospedeiro do vaso após o enxerto.

[010] Em algumas modalidades, a amostra de sangue total não diluída ou a suspensão compreendendo a amostra de sangue total compreende ainda um fator antitrombótico.

[011] Em algumas modalidades, o fator antitrombótico compre ende um agente anticoagulante.

[012] Em algumas modalidades, o agente anticoagulante compre ende heparina ou um dextrano.

[013] Em algumas modalidades, a heparina está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 0,5 IU/mL a cerca de 150 IU/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[014] Em algumas modalidades, a heparina está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 6,7 IU/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[015] Em algumas modalidades, o dextrano é dextrano-40.

[016] Em algumas modalidades, o dextrano está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 1 g/L a cerca de 55 g/L no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[017] Em algumas modalidades, o agente antitrombótico compre ende ácido ascórbico.

[018] Em algumas modalidades, o ácido ascórbico está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 0,2 μg/mL a cerca de 200 μg/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[019] Em algumas modalidades, a concentração de ácido ascór- bico está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentra- ção de cerca de 5 μg/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[020] Em algumas modalidades, o fator antitrombótico compre ende ácido acetilsalicílico.

[021] Em algumas modalidades, o ácido acetilsalicílico está pre sente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 0,2 μg/mL a cerca de 200 μg/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[022] Em algumas modalidades, o ácido acetilsalicílico está pre sente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 5 μg/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelu- lar.

[023] Em algumas modalidades, a amostra de sangue total ou a suspensão compreendendo a amostra de sangue total compreende ainda igual a ou mais do que o nível fisiológico médio da população de um fator de crescimento selecionado a partir do grupo consistindo em: fator estimulante de colônia de granulócito e macrófago (GM-CSF), in- terleucina (IL)-3, IL-4, neutrofina (NT)-6, pleiotrofina (HB-GAM), midkina (MK), proteína-10 induzível por interferon (IP-10), fator plaquetário (PF)- 4, proteína-1 quimiotática monocítica (MCP-1), RANTES (CCL-5, ligante 5 de quimiocina (motivo C-C)), IL-8, IGFs, fator de crescimento de fi- broblasto (FGF)-l, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF- 8, FGF-9, fator de crescimento transformante (TGF)-β, VEGF, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-1 e quaisquer combinações dos mesmos.

[024] Em algumas modalidades, o fator de crescimento é um fator de crescimento de fibroblasto (FGF)-2.

[025] Em algumas modalidades, o FGF-2 é FGF-2 humano.

[026] Em algumas modalidades, o FGF-2 está presente na amos tra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 0,5 ng/mL a cerca de 200 ng/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[027] Em algumas modalidades, a concentração do FGF-2 está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão com-preendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 10 ng/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[028] Em algumas modalidades, o fator de crescimento é um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

[029] Em algumas modalidades, o VEGF é VEGF humano.

[030] Em algumas modalidades, o VEGF está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 4 ng/mL a cerca de 800 ng/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular ace- lular.

[031] Em algumas modalidades, o VEGF está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 80 ng/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[032] Em algumas modalidades, a amostra de sangue total ou a suspensão compreendendo a amostra de sangue total compreende ainda albumina sérica humana, em que a concentração de albumina sé- rica humana no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular é cerca de 55 g/L a cerca de 105 g/L.

[033] Em algumas modalidades, a solução fisiológica compreende um sal inorgânico e um sistema tampão.

[034] Em algumas modalidades, o sistema tampão compreende um sistema tampão independente de CO2.

[035] Em algumas modalidades, o sistema tampão independente de CO2 compreende um sistema tampão de fosfato.

[036] Em algumas modalidades, a solução fisiológica exibe uma pressão osmótica substancialmente similar a sangue total, que preferi-velmente é de cerca de 270 mOsm/kg H2O a cerca de 310 mOsm/kg H2O.

[037] Em algumas modalidades, a solução fisiológica compreende ainda um fator oncótico e/ou um nutriente.

[038] Em algumas modalidades, o fator oncótico compreende al bumina sérica.

[039] Em algumas modalidades, a concentração de albumina sé- rica humana VEGF está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 55 g/L a cerca de 105 g/L no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[040] Em algumas modalidades, o nutriente compreende um ou mais de um açúcar, um aminoácido ou uma vitamina.

[041] Em algumas modalidades, o açúcar é D-glicose.

[042] Em algumas modalidades, a solução fisiológica compreende um fator de crescimento e fator antitrombótico, um nutriente e um fator oncótico; em que o fator de crescimento compreende FGF-2 humano e VEGF humano; em que o fator antitrombótico compreende um ou mais de ácido acetilsalicílico, heparina ou dextrano; e em que o nutriente compreende D-glicose.

[043] Em algumas modalidades, o método não requer contatar a estrutura tubular acelular com um meio de cultura celular depois do contato com sangue total para preparar o vaso sanguíneo personalizado.

[044] Em algumas modalidades, o contato da superfície da estrutura tubular acelular é por mais do que 3 dias, mais do que 4 dias, mais do que 5 dias, mais do que 6 dias, mais do que 7 dias, por 2 a 21 dias, por 3 a 21 dias, por 4 a 21 dias, por 5 a 21 dias, por 6 a 21 dias, por 7 a 21 dias ou por 7 a 9 dias.

[045] Em algumas modalidades, em que a estrutura tubular acelu- lar é contatado com a suspensão compreendendo a amostra de sangue total e o método compreende ainda monitorar uma pluralidade de parâmetros ambientais e/ou uma concentração de um nutriente durante a preparação do vaso sanguíneo personalizado.

[046] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulga ção compreendem ainda ajustar a pluralidade de parâmetros ambientais.

[047] Em algumas modalidades, a pluralidade de parâmetros ambientais compreende temperatura, pH, oxigênio e/ou CO2.

[048] Em algumas modalidades, a estrutura tubular acelular é contatado com a suspensão compreendendo a amostra de sangue total e o método compreende ainda monitorar uma concentração de um nutriente na suspensão.

[049] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulgação compreendem ainda ajustar contínua ou regularmente a concentração do nutriente.

[050] Em algumas modalidades, o nutriente é D-glicose e em que a concentração de D-Glicose é ajustada contínua ou regularmente para manter a concentração de D-glicose em torno de 3 a cerca de 11 mmol/L.

[051] Em algumas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada medindo-se a concentração de D-glicose em uma amostra coletada da suspensão.

[052] Em algumas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é medida uma vez a cada dia.

[053] Em algumas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada medindo-se a concentração de D-glicose usando um sensor que está em contato com a suspensão.

[054] Em algumas modalidades, o sensor está continuamente em contato com a suspensão durante o contato.

[055] Em algumas modalidades, D-glicose é adicionada quando a concentração medida de D-glicose na suspensão está abaixo de 4 mmol/L.

[056] Em algumas modalidades, D-glicose é adicionada para atin gir uma concentração final de 10 mmol/L de D-glicose na suspensão.

[057] Em algumas modalidades, a superfície da estrutura tubular acelular é a superfície interna da estrutura tubular acelular.

[058] Em algumas modalidades, o sangue total compreende san gue periférico ou sangue do cordão umbilical.

[059] Em algumas modalidades, o método compreende ainda mo nitorar uma concentração de albumina sérica humana, em que a concentração de albumina sérica humana é cerca de 55 g/L a cerca de 105 g/L no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular.

[060] Em algumas modalidades, em que contatar a estrutura tubu lar acelular resulta em proliferação e/ou diferenciação de uma pluralidade de células progenitoras a uma pluralidade de células endoteliais.

[061] Em algumas modalidades, a pluralidade de células endoteli- ais expressa VE-caderina, AcLDL, vWF e/ou CD31.

[062] Em algumas modalidades, a estrutura tubular acelular é um vaso sanguíneo descelularizado.

[063] Em algumas modalidades, a estrutura tubular acelular é con tinuamente perfundido com a suspensão ou sangue total.

[064] Em algumas modalidades, a estrutura tubular acelular é per fundido em uma velocidade de cerca de 0,1 mL a cerca de 50 mL per minuto.

[065] Em algumas modalidades, a estrutura tubular acelular é per fundido em uma velocidade de cerca de 2 mL por minuto.

[066] Em algumas modalidades, a estrutura é perfundido com uma recirculação fechada da suspensão ou sangue total.

[067] Em algumas modalidades, o contato contínuo é a perfusão conduzida usando um biorreator.

[068] Em algumas modalidades, o contato é conduzido in vitro.

[069] Em algumas modalidades, o contato é conduzido em torno de 8°C a cerca de 40°C.

[070] Em algumas modalidades, em que o contato é conduzido em torno de 20°C a cerca de 25°C.

[071] Em algumas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado é uma veia.

[072] Em algumas modalidades, a veia é uma veia femoral.

[073] Em algumas modalidades, os métodos da presente divulga ção compreendem ainda avaliar a função da válvula venosa do vaso sanguíneo personalizado usando um teste de competência de válvula.

[074] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um vaso sanguíneo personalizado preparado pelo método de qualquer um dos métodos de preparar um vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui.

[075] Em algumas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado foi implantado em um indivíduo por cirurgia.

[076] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um mé todo de cirurgia compreendendo implantar o vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[077] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um vaso sanguíneo personalizado para o uso em um método de cirurgia, em que o método compreende implantar o vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui em um indivíduo em necessidade do mesmo.

[078] Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.

[079] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um biorreator para preparar um vaso sanguíneo personalizado, o biorreator compreendendo uma bomba peristáltica, um recipiente compreendendo uma porta de amostragem, um primeiro conector e um segundo conector, em que o primeiro e o segundo conectores são direta ou indiretamente conectados ao recipiente, em que cada conector é conectado a uma extremidade de uma estrutura tubular para preparar um vaso sanguíneo personalizado preparado pelos métodos divulgados aqui, em que quando o primeiro e o segundo conectores são conectados às duas extremidades de uma estrutura tubular, a bomba peristáltica medeia a circulação de uma suspensão ou solução em um circuito fechado.

[080] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo conecto res são conectores de Luer.

[081] Em algumas modalidades, a porta de amostragem é uma porta de injeção.

[082] Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda uma porta de injeção.

[083] Em algumas modalidades, a porta de injeção é conectada a um reservatório de D-glicose.

[084] Em algumas modalidades, o primeiro recipiente é direta mente conectado ao recipiente por um tubo e/ou o segundo recipiente é diretamente conectado ao recipiente por um tubo.

[085] Em algumas modalidades, o biorreator compreende uma ou mais portas de amostra.

[086] Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda um ou mais sensores para medir o nível de glicose.

[087] Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda um módulo de ajuste de pH.

[088] Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda um módulo de ajuste de CO2.

[089] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um mé todo de preparar um vaso sanguíneo personalizado, o método compreendendo contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com um componente contido no sangue total, que é enriquecido ou selecionado antes do uso em contatar a superfície.

[090] Em algumas modalidades, o componente é selecionado a partir de trombócitos, células nucleadas, proteínas, fatores de crescimento, fatores de sinalização, imunoglobulinas e quaisquer combinações dos mesmos.

[091] Em algumas modalidades, o componente é enriquecido por centrifugação, centrifugação de gradiente; ou selecionado por adesão seletiva, filtração ou separação.

[092] Em algumas modalidades, a superfície é uma superfície in terna da estrutura tubular acelular.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[093] As FIGs. 1A a 1B são angiogramas de uma veia cava ope rada de forma simulada (FIG. 1A) e uma P-TEV transplantada (FIG. 1B). Clipes metálicos são indicados por pontas de setas para localizar as anastomoses.

[094] As FIGs. 2A a 2B são uma série de imagens que mostram coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) e coloração com 4‘,6-dia- midino-2-fenilindol (DAPI) de transplantes de veia cava nativa (“Nativa”, FIG. 2A) e P-TEV (“P-TEV”, FIG. 2B) a partir de seções adjacentes 3 dias, 2 semanas, 17 dias e 4 a 5 semanas após a cirurgia.

[095] As FIGs. 3A a 3D descrevem imagens que mostram a celu-larização da veia cava duas semanas após a cirurgia. As FIGs. 3A a 3D são uma série de histogramas imunológicos que mostram cloração com DAPI e imunocloração com CD31 da veia cava duas semanas após a cirurgia. A FIG. 3A mostra a veia cava nativa proximal às anastomoses. As FIGs. 3B a 3D mostram as partes proximais (FIG. 3B), centrais (FIG. 3C) e distais (FIG. 3D) da P-TEV. Pontas de setas indicam células CD31-positivas.

[096] As FIGs. 4A a 4D descrevem imagens que mostram a celu- larização da veia cava quatro semanas após a cirurgia. As FIGs. 4A a 4D são uma série de histogramas imunológicos que mostram cloração com DAPI e imunocloração com CD31 da veia cava 4 a 5 semanas após a cirurgia. A FIG. 4A mostra a veia cava nativa proximal às anastomoses. As FIGs. 4B a 4D mostram as partes proximais (FIG. 4B), centrais (FIG. 4C) e distais (FIG. 4D) da P-TEV. Pontas de setas indicam células CD31-positivas.

[097] As FIGs. 5A a 5B descrevem imagens que mostram uma morfologia de célula luminal quatro semanas após a cirurgia. As FIGs. 5A a 5B são uma série de imagens em ampliação de 40* que mostram coloração com H&E do transplante de veia cava nativa (FIG. 5A) e P- TEV (FIG. 5B) 4 a 5 semanas após a cirurgia. Setas indicam células endoteliais no tecido nativo e células com morfologia semelhante à célula endotelial plaqueada no transplante de P-TEV.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DIVULGAÇÃO

[098] A presente divulgação é baseada, inter alia, na descoberta de que células e fatores não celulares no sangue foram capazes de con-dicionar estruturas tubulares acelulares (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpresso) para produzir vasos sanguíneos personalizados. A presente divulgação fornece ainda, inter alia, o contato de estruturas tubulares acelulares com amostras de sangue total não diluídas ou uma suspensão compreendendo uma amostra de sangue total diluída em uma solução fisiológica em um processo in vitro produz vasos sanguíneos personalizados com compa-tibilidade melhorada do hospedeiro e suscetibilidade reduzida à trombose.

[099] Consequentemente, um aspecto da presente divulgação se refere a um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado com-preendendo, contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com uma amostra de sangue total não diluída de um indivíduo em necessidade do vaso sanguíneo personalizado, em que o contato é realizado por mais do que 2 dias.

[0100] Um outro aspecto da presente divulgação se refere a um mé todo de preparar um vaso sanguíneo personalizado, compreendendo contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com uma suspensão compreendendo uma amostra de sangue total de um indivíduo em necessidade do vaso sanguíneo personalizado, em que a amostra de sangue total é diluída em uma solução fisiológica. Em algumas modalidades, a superfície da estrutura tubular acelular é a superfície interna da estrutura tubular acelular.

[0101] Como usado aqui, o termo “vaso sanguíneo personalizado” se refere a uma estrutura tubular capaz de carregar sangue através de um tecido ou órgão que não seja um vaso sanguíneo nativo. A estrutura tubular pode ser preparada descelularizando-se um vaso sanguíneo nativo de um doador, obtendo desse modo uma estrutura acelular e recon- dicionando-se/recelularizando-se a estrutura usando células de um outro indivíduo. Uma estrutura acelular também pode ser obtido montandose um material biocompatível in vitro (por exemplo, bioimpressão ou au- tomontagem de polímero). Como usado aqui, os termos “recondição”, “recondicionamento” e “recondicionado” são usados para descrever a modificação da estrutura acelular por componentes da solução de rece- lularização/recondição (RC) contendo sangue total. Como usado aqui, os termos “recelularizar”, “recelularizando” e “recelularização” são usados em qualquer contexto e não requerem que o material de partida inicial tenham células ligadas. Um vaso sanguíneo personalizado pode ser uma veia, artéria ou capilar personalizados. Em certas modalidades, um vaso sanguíneo personalizado é útil para substituir um vaso sanguíneo nativo.

Preparação da estrutura tubular acelular a partir do doador

[0102] O método de preparar um vaso sanguíneo personalizado como divulgado aqui emprega uma estrutura tubular acelular. Como usado aqui, o termo “estrutura tubular acelular” se refere a uma estrutura tubular que é substancialmente isenta de célula. Uma estrutura tubular acelular pode ser preparada descelularizando-se um vaso sanguíneo nativo a partir de um doador. O doador pode ser um ser humano ou um animal de uma espécie adequada. Uma estrutura acelular também pode ser obtida montando-se um material biocompatível in vitro (por exemplo, bioimpressão ou automontagem de polímero).

[0103] A estrutura tubular acelular pode ser preparada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, descelularização de um vaso sanguíneo nativo. O vaso sanguíneo nativo pode ser de origem humana ou pode ser obtido a partir de espécie animal adequada. Uma estrutura tubular pode ser preparada por métodos de cultura de tecido a partir de andaime e células biocompatíveis in vitro e pode servir como o material de partida para a preparação de uma estrutura acelular. Em certas modalidades, a estrutura tubular acelular é obtida por um método de descelularização divulgado aqui. Em certas modalidades, o método de preparar um vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui compreende ainda descelularizar um vaso sanguíneo nativo, obtendo desse modo uma estrutura tubular acelular.

[0104] Como usado aqui, o termo “descelularizar”, “descelulari- zado”, “descelularizando” ou “descelularização” se refere ao processo de remover células de um vaso sanguíneo (incluindo qualquer válvula venosa no vaso sanguíneo). A descelularização eficaz é ditada por fatores tais como densidade e organização teciduais, propriedades geométricas e biológicas desejadas para o produto final e a aplicação clínica alvejada. A descelularização de vasos sanguíneos com preservação da integridade e bioatividade de ECM pode ser otimizada por aqueles técnicos no assunto, por exemplo, escolhendo-se os agentes e técnicas específicos durante o processamento.

[0105] A descelularização bem-sucedida é definida como a ausên cia de células, tal como células endoteliais, células musculares lisas e núcleos em seções histológicas usando procedimentos de coloração histológica padrão. Embora a maioria dos agentes e métodos de remoção celular possam alterar a composição de ECM e causar algum grau de rompimento de ultraestrutura, a minimização destes efeitos indesejáveis é desejada. Métodos de descelularização são conhecidos na técnica, por exemplo, na Publicação de Patente dos EUA No 2017/0071738.

[0106] Consequentemente, em certas modalidades, o processo de descelularização remove todos os núcleos, como detectado por um método conhecido na técnica (por exemplo, cloração com DAPI, quantificação de DNA). Em certas modalidades, o processo de descelulariza- ção reduz ou remove os antígenos de HLA classe-I e antígenos de HLA classe-II, como detectado por um método conhecido na técnica (por exemplo, ensaios imuno-histoquímicos para antígenos de HLA classe-I e classe-II).

[0107] Em certas modalidades, os componentes de ECM são substancialmente retidos no processo de descelularização. Durante o processo de descelularização e a seguir do mesmo, a morfologia e a arquitetura do ECM pode ser examinada visualmente e/ou histologicamente para verificar que o processo de descelularização não comprometeu a estrutura tridimensional e a bioatividade da estrutura de ECM. Análise histológica por coloração (por exemplo, coloração com H&E, coloração com Tricromo de Masson ou coloração com Verhoeff-Van Gieson) pode ser útil para visualizar a arquitetura do vaso sanguíneo descelularizado e a preservação de componentes de ECM, tal como colágeno I, colá- geno IV, laminina e fibronectina. Outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar a preservação de componentes de ECM, tais como glicosaminoglicanos e colágeno.

[0108] Uma ou mais soluções de rompimento celular podem ser usadas para descelularizar um vaso sanguíneo. Uma solução de rompimento celular geralmente inclui pelo menos um detergente, tal como SDS, PEG ou Triton X. Um detergente particularmente preferido é Triton X (por exemplo, Triton X-100). Uma solução de rompimento celular pode compreender um solvente orgânico, por exemplo, Fosfato de Tri-n-Bu- tila (TNBP). Uma solução de rompimento celular também pode ter uma pressão osmótica substancialmente mais baixa do que o sangue, desse modo facilitando a lise celular. Alternativamente, uma solução de rompimento celular pode ser isotônica. A solução de rompimento celular também pode incluir enzimas tais como, sem limitação, uma ou mais nucleases (por exemplo, DNases ou RNases) e proteinases (por exemplo, colagenases, dispases ou tripsina). Uma solução de rompimento celular que compreende DNase I também pode incluir cloreto de cálcio e cloreto de magnésio (A12858, Life Technologies) para ativar a enzima. Em certas modalidades, uma solução de rompimento celular compreende ainda um ou mais inibidores de protease (por exemplo, fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF), inibidores de colagenase). Em certas mo-dalidades, uma solução de rompimento celular pode incluir ainda um antibiótico (por exemplo, penicilina, estreptomicina ou anfotericina) ou ácido etilenediaminotetraacético (EDTA).

[0109] Em certas modalidades, métodos de perfusão podem ser usados para tratar o vaso sanguíneo (por exemplo, veia portadora de válvula) com soluções de rompimento celular para a descelularização do vaso sanguíneo. Alternar a direção da perfusão (por exemplo, ante- rógrada e retrógrada) pode ajudar a eficazmente descelularizar uma veia portadora de válvula. A descelularização como descrito aqui essencialmente remove as células que revestem as veias portadoras de válvulas de dentro para fora, resultando em muito pouco dano a ECM. Dependendo do tamanho e peso do vaso sanguíneo e do(s) detergente(s) particular(es) e concentração de detergente(s) na solução de rompimento celular, uma veia portadora de válvula é geralmente perfundida entre 4 e 48 horas; ou entre 8 e 24 horas com meio de rompimento celular. Incluindo lavagens, um vaso sanguíneo pode ser perfundido por até cerca de 48 horas ou 24 horas para Triton X, cerca de 8 horas para TNBP, cerca de 16 horas para DNase, cerca de 1 hora de lavagens totais e cerca de 48 horas de lavagem final. Em algumas modalidades o procedimento de perfusão anteriormente mencionado é repetido por 1 a 14 ciclos; 1 a 5 ciclos; 2 a 4 ciclos; 1 a 3 ciclos; ou 2 ciclos; ou 3 ciclos; ou 4 ciclos; ou 5 ciclos; ou 6 ciclos. Em certas modalidades, a descelu- larização é realizada por perfusão com os reagentes anteriormente mencionados continuamente por 100 horas, 110 horas, 120 horas, 130 horas, 140 horas, 150 horas, 160 horas, 170 horas, 180 horas, 190 horas, 200 horas, 210 horas, 220 horas, 230 horas, 240 horas, 250 horas, 260 horas, 270 horas, 280 horas, 290 horas, 300 horas, 310 horas, 320 horas, 330 horas, 340 horas, 350 horas ou mais. A perfusão geralmente é ajustada a condições fisiológicas incluindo fluxo pulsátil, taxa e pressão. A descelularização de perfusão como descrito aqui pode, em algumas modalidades, ser comparada à descelularização de imersão como descrito, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nos 6.753.181 e 6.376.244. Em certas modalidades, a descelularização é conduzida de acordo com o método de descelularizar um vaso sanguíneo como fornecido no exemplo 1 infra.

[0110] Em certas modalidades, a estrutura tubular acelular é uma estrutura sintetizada e/ou montada, por exemplo, uma estrutura obtida montando-se um material biocompatível in vitro. Métodos de preparar tal estrutura, por exemplo, bioimpressão ou automontagem de polímero, são conhecidos na técnica e exemplos não limitantes são fornecidos na Publicação de Patente dos EUA Nos 2017/0304503 e 2016/0354194.

[0111] Consequentemente, em certas modalidades, o método divulgado aqui compreende ainda uma etapa de preparar uma estrutura de vaso sanguíneo tubular bioimpresso usando uma estrutura polimérico bioimpresso. A estrutura de vaso sanguíneo bioimpresso é preparada em um polímero (natural ou sintético), que pode estar em uma forma de gel, forma de esponja, forma de espuma, forma de emplastro ou uma forma semilíquida/fluida. Em certas modalidades, uma estrutura bioim- pressa é perfundida com sangue total ou sangue total diluído em uma solução, por exemplo, uma suspensão, que inclui sangue total.

[0112] Em certas modalidades, os componentes de ECM podem ser adicionados ao polímero em uma forma de pó. Na presente divulgação o pó para preparar a composição da presente divulgação é preparado tratando-se um tecido com um produto químico, secando-se por congelamento o tecido quimicamente tratado e por homogeneização do seco por congelamento. Em certas modalidades, o pó é filamentoso.

[0113] Em certas modalidades, a estrutura polimérica bioimpressa pode incluir gelatina e fibrina. A gelatina e fibrina podem formar uma rede polimérica interpenetrante que imita ECM natural e pode ser otimizada para fixação celular, bioimpressão, transparência e biocompatibili- dade.

[0114] Em certas modalidades, os componentes do ECM são ou po dem ser isolados e/ou purificados de um tecido de um mamífero (por exemplo, um porco, uma vaca, um cordeiro, uma cabra, uma ovelha, um chimpanzé, um macaco, um ser humano ou outro primata) ou gerados usando tecnologia de DNA recombinante envolvendo gene ou fragmentos de gene de um mamífero (por exemplo, um porco, uma vaca, um cordeiro, uma cabra, uma ovelha, um chimpanzé, um macaco, um ser humano ou outro primata) que codifica o respectivo componente de ECM (por exemplo, colágenos, elastinas, lamininas, glicosaminoglica- nos, proteoglicanos, antimicrobianos, quimioatraentes, citocinas e fatores de crescimento) e expressados a partir de um sistema de expressão adequado (procariótico ou eucariótico (por exemplo, células de levedura, inseto ou mamíferas)) e subsequentemente isolados e/ou purificados por método adequado na técnica. Em certas modalidades, um ou mais dos componentes de ECM podem ser adicionados à estrutura po- limérica para preparar uma estrutura polimérica bioimpressa e depois a estrutura é perfundida com sangue total ou sangue total diluído em uma solução, por exemplo, uma suspensão, que inclui sangue total, para preparar um vaso sanguíneo personalizado.

[0115] Em algumas modalidades, a estrutura tubular pode ser preparada por métodos tais como impressão 3D de diferentes materiais, automontagem, fabricação química ou bioquímica. Em algumas modalidades, a estrutura tubular é fabricada a partir de material de partida biológico e não biológico.

Sangue total do paciente

[0116] Em algumas modalidades, uma população de células pre sentes na amostra de sangue total preenche a estrutura. O sangue total do paciente pode ser usado não diluído ou diluído com uma solução de perfusão fisiológica tal como descrito nos exemplos 4 a 5 ou outras soluções preservantes de órgão tais como por exemplo Perfadex™, STEEN™, solução Euro Collins, solução de armazenamento a frio da Universidade de Wisconsin ou solução Celsior®.

[0117] Em certas modalidades, o sangue total compreende sangue periférico (por exemplo, sangue venoso periférico). Em certas modalidades, o sangue total é sangue periférico (por exemplo, sangue venoso periférico). Em certas modalidades, o sangue total compreende sangue do cordão umbilical. Em certas modalidades, o sangue total é sangue do cordão umbilical.

[0118] Os termos “paciente” e “indivíduo” são usados permutavel-mente nesta divulgação e se referem a um animal humano ou não humano (por exemplo, um mamífero). Exemplos não limitantes incluem seres humanos, bovinos, ratos, camundongos, cães, gatos, macacos, cabra, ovelha, vacas e cervos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

Sangue total do paciente não diluído

[0119] Um aspecto da presente divulgação se refere a um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado compreendendo, contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com uma amostra de sangue total não diluída de um indivíduo em necessidade do vaso sanguíneo personalizado, em que o contato é realizado por mais do que 2 dias.

[0120] Em certas modalidades, as células e/ou células progenitoras presentes no sangue preenchem a estrutura. Em algumas modalidades, uma população de células presentes na amostra de sangue total preenche a estrutura. O termo “sangue total” se refere ao sangue retirado de um corpo, órgão ou tecido, do qual nenhum dos componentes foi removido.

[0121] O técnico no assunto avaliaria que durante a coleta do sangue total, um pequeno volume de um agente antitrombótico pode ser adicionado durante ou imediatamente depois que a amostra de sangue é retirada de um indivíduo. Onde o volume do agente antitrombótico não excede cerca de 5 % ou pelo menos não 10 % do volume do sangue com o qual o agente antitrombótico é misturado, o sangue total desse modo preparado é considerado não diluído. Similarmente, em certas modalidades, o sangue total pode ser suplementado com um ou mais agentes adicionais (por exemplo, agentes antitrombóticos, nutrientes, diluente, preservantes e sistema tampão independente de CO2), em que o volume total da(s) substância(s) adicionada(s) — não incluindo qualquer agente antitrombótico inicialmente introduzido no momento da coleta — não excede cerca de 5% ou pelo menos não cerca de 10% do volume do sangue total, o sangue total suplementado é considerado não diluído.

[0122] Em certas modalidades, o método não requer contatar a estrutura tubular acelular com um meio de cultura celular para preparar o vaso sanguíneo personalizado. Em certas modalidades, o sangue total é usado no método divulgado aqui dentro de cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 8 horas, cerca de 12 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias ou cerca de 1 semana depois da coleta do sangue total. Em certas modalidades, o sangue total é armazenado em torno de 2 °C a cerca de 8°C antes do uso no método.

Sangue total do paciente diluído

[0123] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a contatar a estrutura tubular acelular com o sangue total do paciente diluído.

[0124] O sangue total do paciente é considerado diluído se o san gue total retirado do paciente for diluído com qualquer tipo de solução, tampão ou líquido aquoso pelo menos 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % ou 200 %. Em algumas modalidades, a amostra de sangue total é diluída 1:1, isto é, 1 volume de sangue total é misturado com 1 volume de diluente. Em alguma modalidade, a amostra de sangue total pode ser diluída 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10.

[0125] Em certas modalidades, o sangue total é diluído em uma so lução fisiológica. Em certas modalidades, o diluente é uma solução fisiológica contendo fatores oncóticos adicionais e outros fatores como descrito nos exemplos x-y ou outras soluções preservantes de órgão tais como por exemplo Perfadex™ (ver o Ex. 5 abaixo), STEEN™ (solução salina fisiológica não tóxica compreendendo albumina sérica humana e dextrano 40 ou uma solução como descrito na Pat. dos EUA No 8.980.541) solução Euro Collins (ver o Ex. 5 abaixo), solução de armazenamento a frio da Universidade de Wisconsin (ver o Ex. 5 abaixo) ou solução Celsior® (ver o Ex. 5 abaixo). Em certas modalidades, a solução fisiológica é solução STEEN™.

[0126] Em algumas modalidades, os fatores oncóticos considerados a ser usados para regular a pressão osmótica da solução fisiológica compreendem albumina sérica, globulina ou fibrinogênio. Em algumas modalidades, o fator oncótico compreende albumina sérica. Em algumas modalidades, gelatina pode ser usada para regular a pressão on- cótica da solução.

[0127] Uma solução fisiológica pode compreender ainda um ou mais nutrientes (por exemplo, aminoácido, monossacarídeo (por exemplo, D-glicose), vitamina, íon inorgânico, oligoelemento e/ou sal) e/ou fatores de crescimento, por exemplo, em concentrações fisiológicas, para suportar a sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação de células. Em algumas modalidades, o nutriente compreende um ou mais de um açúcar, um aminoácido ou uma vitamina. Em algumas modalidades, o açúcar é D-glicose.

[0128] Em algumas modalidades, a solução fisiológica compreende um sal inorgânico e um sistema tampão. Em algumas modalidades, o sistema tampão compreende um sistema tampão independente de CO2. Em algumas modalidades, o sistema tampão independente de CO2 compreende um sistema tampão de fosfato. A solução fisiológica pode conter qualquer um dos agentes adicionais a serem adicionados ao sangue total ou sangue total diluído como descrito abaixo.

Agentes adicionais adicionados a amostras de sangue total ou sangue total diluído

[0129] Em algumas modalidades, agentes adicionais descritos aqui são adicionados à amostra de sangue total ou à suspensão de sangue total ou à amostra de sangue total diluído antes ou durante o contato com a estrutura tubular acelular com o sangue total. Como explicado acima, contanto que a adição dos fatores descritos aqui não dilua o sangue total com mais do que 5 ou pelo menos não mais do que 10 %, a amostra de sangue total ainda é considerada não diluída. Se a amostra de sangue total for diluída mais do que 15 % com os fatores descritos aqui, então a amostra de sangue total é diluída.

[0130] Em certas modalidades, a suspensão com sangue total ou sangue total diluído ou o sangue total não diluído compreendem ainda um agente antitrombótico. Em certas modalidades, um agente antitrom- bótico é ou foi introduzido ao sangue total antes de contatar a estrutura tubular acelular. Em certas modalidades, o agente antitrombótico compreende um agente anticoagulante. Em certas modalidades, o agente anticoagulante compreende heparina, um dextrano. Em certas modalidades o agente antitrombótico compreende um inibidor de plaqueta tal como ácido ascórbico.

[0131] Em certas modalidades, o agente anticoagulante compre ende heparina. Concentrações eficazes de heparina para prevenir a co-agulação são conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a he- parina está presente na amostra de sangue total não diluída ou na suspensão compreendendo a amostra de sangue total em uma concentração de cerca de 0,5 IU/mL a cerca de 150 IU/mL no começo do contato da superfície da estrutura tubular acelular. Em certas modalidades, a concentração de heparina no começo do contato é cerca de 5 a cerca de 50 IU/ml. Em certas modalidades, a concentração de heparina no começo do contato é cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15 ou cerca de 20 IU/mL. Em certas modalidades, a concentração de heparina no começo do contato é cerca de 6,7 IU/ml. Em algumas modalidades o biorreator com tubulação e veia é pré-lavado com uma heparina de 50 IU/ml em solução de PBS (por exemplo por 1 hora), depois esvaziado e preenchido com solução sanguínea; e em várias modalidades, uma diluição a 1:10 é obtida pela comutação de soluções resultando em torno de 5 IU/ml de heparina na solução sanguínea. Em certas modalidades, tubos vacutainer contendo 17 IU de heparina/mL de sangue total são usados resultando em cerca de 8,5 IU de heparina na solução sanguínea.

[0132] Em certas modalidades, o agente anticoagulante compre ende um dextrano. Dextrano de qualquer peso molecular médio pode ser usado. Em certas modalidades, o dextrano tem um peso molecular médio de cerca de 40 kD, isto é, o dextrano é dextrano-40. Em certas modalidades, o dextrano tem um peso molecular médio de cerca de 60 kD, isto é, o dextrano é dextrano-60. Em certas modalidades, o dextrano tem um peso molecular médio de cerca de 70 kD, isto é, o dextrano é dextrano-70. Em certas modalidades, a concentração de o dextrano no começo do contato é cerca de 1 a cerca de 55 g/L. Em certas modalidades, a concentração do dextrano no começo do contato é cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 4,5, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20 g/L. Em certas modalidades, a concentração do dex- trano no começo do contato é cerca de 5 g/L.

[0133] Em certas modalidades, o agente antitrombótico compreende ácido ascórbico. Em certas modalidades, a concentração de ácido ascórbico no começo do contato é cerca de 0,2 a cerca de 200 μg/ml. Em certas modalidades, a concentração de ácido ascórbico no começo do contato é cerca de 1, cerca de 5, cerca de 10, cerca de 20, cerca de 50 ou cerca de 100 μg/mL. Em certas modalidades, a concentração de ácido ascórbico no começo do contato é cerca de 5 μg/mL.

[0134] Dois ou mais agentes antitrombóticos (por exemplo, agentes anticoagulantes) podem ser combinados na presente invenção. Em certas modalidades, a suspensão compreende dois ou mais dos agentes selecionados a partir do grupo consistindo em heparina, dextrano (por exemplo, dextrano-40) e ácido ascórbico. Em certas modalidades, a suspensão compreende heparina, dextrano (por exemplo, dextrano-40) e ácido ascórbico. O técnico no assunto avaliaria que quando dois ou mais agentes antitrombóticos são combinados, pelo menos um deles pode ser usado em uma concentração mais baixa do que a concentração na qual ele seria usado sozinho. Em certas modalidades, a suspensão compreende cerca de 6,7 IU/mL de heparina, cerca de 6,7 mg/mL de dextrano-40 e cerca de 4,5 μg/mL de ácido ascórbico. Em certas modalidades, a suspensão compreendida pelo menos cerca de 6,7 IU/mL de heparina, cerca de 6,7 mg/mL de dextrano-40 e cerca de 4,5 μg/mL de ácido ascórbico.

[0135] Em certas modalidades, a suspensão com sangue total ou sangue total diluído ou o sangue total não diluído compreende ainda um fator de crescimento selecionado a partir do grupo consistindo em: fator estimulante de colônia de granulócito e macrófago (GM-CSF), interleu- cina (IL)-3, IL-4, neutrofina (NT)-6, pleiotrofina (HB-GAM), midkina (MK), proteína-10 induzível por interferon (IP-10), fator plaquetário (PF)-4, pro- teína-1 quimiotática monocítica (MCP-1), RANTES (CCL-5, ligante 5 de quimiocina (motivo C-C)), IL-8, IGFs, fator de crescimento de fibroblasto (FGF)-l, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, fator de crescimento transformante (TGF)-β, VEGF, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-1 e quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o fator de crescimento é um fator de crescimento humano. Em certas modalidades, a concentração do fator de crescimento é igual ao nível fisiológico médio da população do fator de crescimento. Em certas modalidades, a concentração de o fator de crescimento é mais do que o nível fisiológico médio da população do fator de crescimento. Em certas modalidades, o fator de crescimento é suplementado como uma proteína recombinante.

[0136] Em certas modalidades, o fator de crescimento é um fator de crescimento de fibroblasto (FGF)-2. Em certas modalidades, o FGF-2 é FGF-2 humano. Em certas modalidades, a concentração do FGF-2 no começo do contato é cerca de 0,5 a cerca de 200 ng/ml. Em certas modalidades, a concentração do FGF-2 no começo do contato é cerca de 10 ng/ml. Em certas modalidades, o FGF-2 é suplementado antes do contato na concentração de cerca de 0,5 a cerca de 200 ng/ml (por exemplo, cerca de 10 ng/ml). Em certas modalidades, o FGF-2 é FGF- 2 humano recombinante (rhFGF-2). Em certas modalidades, a concentração do rhFGF-2 no começo do contato é cerca de 0,5 a cerca de 200 ng/ml (por exemplo, cerca de 10 ng/ml).

[0137] Em certas modalidades, o fator de crescimento é um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Em certas modalidades, o VEGF é VEGF humano. Em certas modalidades, a concentração do VEGF no começo do contato é cerca de 4 a cerca de 800 ng/mL. Em certas modalidades, a concentração do VEGF no começo do contato é cerca de 80 ng/ml. Em certas modalidades, o VEGF é suplementado antes do contato na concentração de cerca de 4 a cerca de 800 ng/mL (por exemplo, cerca de 80 ng/mL). Em certas modalidades, o VEGF é VEGF humano recombinante (rhVEGF). Em certas modalidades, a concentração do rhVEGF no começo do contato é cerca de 4 a cerca de 800 ng/mL (por exemplo, cerca de 80 ng/mL).

[0138] Em certas modalidades, a suspensão com sangue total ou sangue total diluído ou o sangue total não diluído compreende ainda ácido acetilsalicílico. Em certas modalidades, a concentração de ácido acetilsalicílico no começo do contato é entre 0,2 μg/mL e 200 μg/mL; ou 0,5 μg/mL e 100 μg/mL; ou 0,1 μg/mL e 50 μg/mL; ou 1 μg/mL e 25 μg/mL; ou 1 μg/mL e 10 μg/mL; ou 2 μg/mL e 10 μg/mL; ou 3 μg/mL e 8 μg/mL; ou 4 μg/mL e 6 μg/mL. Em certas modalidades, a concentração de ácido acetilsalicílico no começo do contato é cerca de 0,5 μg/mL; ou cerca de 1 μg/mL; ou cerca de 2 μg/mL; ou cerca de 3 μg/mL; ou cerca de 4 μg/mL; ou cerca de 5 μg/mL; ou cerca de 6 μg/mL; ou cerca de 7 μg/mL; ou cerca de 8 μg/mL; ou cerca de 8 μg/mL; ou cerca de 8 μg/mL; ou cerca de 9 μg/mL; ou cerca de 10 μg/mL; ou cerca de 25 μg/mL ou cerca de 50 μg/mL; ou cerca de 100 μg/mL; ou cerca de 200 μg/mL. Em certas modalidades, a concentração de ácido acetilsalicílico no começo do contato é cerca de 5 μg/mL. Em certas modalidades, o VEGF é suplementado antes do contato em uma concentração entre 4 ng/mL e 800 ng/mL; ou entre 10 ng/mL e 400 ng/mL; ou entre 20 ng/mL e 200 ng/mL; ou entre 40 ng/mL e 200 ng/mL; ou entre 60 ng/mL e 100 ng/mL; ou entre 70 ng/mL e 90 ng/mL.

[0139] Em certas modalidades, a concentração de albumina sérica humana (HSA) no começo do contato é entre 50 mg/mL e 150 mg/mL; ou entre 50 mg/mL e 125 mg/mL; ou entre 50 mg/mL e 100 mg/mL; ou entre 60 mg/mL e 90 mg/mL; ou entre 60 mg/mL e 80 mg/mL; ou entre 65 mg/mL e 75 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de albumina sérica humana no começo do contato é cerca de 55 a cerca de 105 mg/m, que é a quantidade quando o sangue total é diluído em uma solução em 2 vezes. Em certas modalidades, a concentração de albumina sérica humana no começo do contato é cerca de 45 a cerca de 69 mg/mL. Em certas modalidades, a concentração de HSA em uma solução é cerca de 70 mg/ml e a concentração de HSA em sangue humano é cerca de 45 mg/mL e o sangue total é diluído na solução, o HSA na suspensão compreendendo sangue total é 55 a 60 mg/mL (isto é, diluição de 2 vezes de sangue total na solução). Em certas modalidades, a concentração de albumina sérica humana depois que o sangue total é diluído em uma solução compreendendo HSA diluído 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes ou 20 vezes.

[0140] Em certas modalidades, a suspensão com sangue total ou sangue total diluído ou o sangue total não diluído compreende um ou mais nutrientes e/ou fatores de crescimento, por exemplo, em concentrações fisiológicas, para suportar sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação de células. Em certas modalidades, os nutrientes são selecionados a partir do grupo consistindo em monossacarídeos (por exemplo, D-glicose), aminoácidos (aminoácidos naturais), vitaminas, íona inorgânicos, oligoelementos, sais e quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o aminoácido incluído como um nutriente pode ser um ou mais de: L-ArgininaHCl, L-Cistina2HCl, L-CistinaHCl H2O, L-HistidinaHCl H2O, L-Isoleucina, L-Leucina, L-LisinaHCl, L-Metio- nina, L-Fenilalanina, L-Treonina, L-Triptofano, L-Tirosina2H2O, L-Va- lina, L-Alanina, L-Asparagina, Ácido L-aspártico, Ácido L-glutâmico, Gli- cina, L-Prolina, L-Serina e/ou L-Hidroxiprolina. Em certas modalidades, a vitamina incluída como um nutriente pode ser um ou mais de: K-Ca- Pantotenato, Cloreto de colina, Ácido fólico, i-Inositol, Niacinamida, HCl de Piridoxal, HCl de Piridoxina, Riboflavina, HCl de Tiamina, Biotina, Vitamina B12, Ácido paraminobenzóico, Niacina, Ácido ascórbico, fosfato de a-Tocoferol, Calciferol, Menadiona, Vitamina A. Em certas modalidades, o íon inorgânico é incluído na forma de um sal inorgânico incluindo mas não limitado a CaCl2, KCl, MgSO4, NaCl, NaHCO3, NaHPO4, KNO3, NaSeO3, Ca(NO3)2, CuSO4, NaHPO4, MgCl2, Fe(NO3)3, CuSO4, FeSO4 e/ou KH2PO4.

[0141] Em algumas modalidades, a suspensão com sangue total ou sangue total diluído ou o sangue total não diluído compreende cerca de 0,7 % a cerca de 1,5 % de sal. Em algumas modalidades, a solução fisiológica compreende cerca de 0,7 %, cerca de 0,8 %, cerca de 0,9 % ou cerca de 1,0 % de sal.

[0142] Em certas modalidades, a suspensão compreende um sis tema tampão independente de CO2. Em algumas modalidades, o sistema tampão independente de CO2 compreende um sistema tampão de fosfato. Em algumas modalidades, o sistema tampão independente de CO2 compreende um tampão de fosfato e bicarbonato de sódio. Em certas modalidades, a suspensão compreende ainda um ou mais de: D- Glicose, Vermelho de fenol, HEPES, Piruvato de sódio, Glutationa (reduzido), Hipoxantina.Na, Timidina, Ácido lipoico, 2HCl de Putrescina, Bacto-peptona, Timina, Sulfato de adenina, Adenosina-5-trifosfato, Colesterol, 2-desóxi-D-ribose, Adenosina-5-fosfato, HCl de Guanina, Ribose, Acetato de sódio, Tween 80, Uracila e/ou Xantina Na.

[0143] Em certas modalidades, um fator não celular da suspensão de sangue total promove a celularização da estrutura tubular acelular, por exemplo, promovendo-se a sobrevivência, proliferação e/ou diferenciação celulares. Em certas modalidades, o fator não celular é um componente não celular presente no sangue total. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um fator gerado a partir do sangue total (por exemplo, a partir das células no sangue total) durante o contato. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove a compatibilidade do hospedeiro, a celularização ou a integração do vaso após o enxerto. Exemplos não limitantes de fatores não celulares da presente invenção são fornecidos na tabela seguinte:

[0144] Qualquer um dos agentes divulgados acima, por exemplo,agentes antitrombóticos, nutrientes, diluente e sistema tampão independente de CO2, pode ser introduzido ao diluente (por exemplo, a solução fisiológica) e ser misturado na suspensão após a diluição do sangue total. Alternativa ou adicionalmente, o mesmo pode ser introduzido diretamente ao sangue total antes da diluição e/ou ser introduzido à suspensão depois da diluição do sangue total.

[0145] Em certas modalidades, a concentração de um nutriente na suspensão é monitorada e ajustada contínua ou regularmente. Em certas modalidades, o nutriente é selecionado a partir do grupo consistindo em um monossacarídeo (por exemplo, D-glicose), um aminoácido (por exemplo, um aminoácido natural), uma vitamina, um íon inorgânico, um oligoelemento e um sal. Em uma modalidade específica, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada durante o contato e D-glicose é adicionada à suspensão para manter a concentração de D-glicose em torno de 3 a cerca de 11 mmol/L.

[0146] Em certas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada medindo-se a concentração de D-glicose em uma amostra coletada da suspensão. Em certas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é medida regularmente, tal como duas vezes a cada dia, uma vez a cada dia ou uma vez a cada dois dias. Em certas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada medindo-se a concentração de D-glicose usando um sensor que está em contato com a suspensão. Em certas modalidades, o sensor está continuamente em contato com a suspensão durante o contato. Em certas modalidades, D-glicose é adicionada quando a concentração medida de D-glicose na suspensão está abaixo de 4 mmol/L. Em certas modalidades, D-glicose é adicionada para atingir uma concentração final de cerca de 7 mmol/L; cerca de 8 mmol/L; cerca de 9 mmol/l; ou cerca de 10 mmol/L de D-glicose na suspensão. Em algumas modalidades, os níveis de glicose são ajustados por adição de uma solução de estoque de D-glicose 1,1 M. Em certas modalidades, a adição de uma solução de estoque a 0,91 μL (em 1,1M) por mL de solução sanguínea leva a um aumento de 1 mmol/L no nível de glicose. O monitoramento contínuo por um sensor, opcionalmente em combinação com a adição automática de D-glicose na suspensão, permite a manutenção da concentração de D-glicose em uma faixa mais estreita. Consequentemente, em certas modalidades, a concentração de D-glicose é mantida em torno de 5 a cerca de 8 mmol/L.

Fatores sanguíneos não celulares

[0147] Em algumas modalidades, a amostra de sangue total com preende um ou mais fatores não celulares, em que um ou mais fatores não celulares do sangue total preenchem a estrutura e em que um ou mais fatores não celulares promovem a celularização da estrutura tubular acelular e a compatibilidade do hospedeiro do vaso após o enxerto. Como usado aqui, o termo “fator não celular” se refere a um componente na suspensão de sangue total que não compreende uma célula euca- riótica completa. Um fator não celular pode ser qualquer tipo de molécula, incluindo mas não limitada a proteína, ácido nucleico, sacarídeo, lipídeo, molécula pequena, íon metálico ou um conjugado ou combinação dos mesmos.

[0148] Por exemplo, o fator não celular pode ser fatores de crescimento. Em algumas modalidades, o fator de crescimento é selecionado a partir do grupo consistindo em: fator estimulante de colônia de granu- lócito e macrófago (GM-CSF), interleucina (IL)-3, IL-4, neutrofina (NT)- 6, pleiotrofina (HB-GAM), midkina (MK), proteína-10 induzível por interferon (IP-10), fator plaquetário (PF)-4, proteína-1 quimiotática monocí- tica (MCP-1), RANTES (CCL-5, ligante 5 de quimiocina (motivo C-C)), IL-8, IGFs, fator de crescimento de fibroblasto (FGF)-l, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, fator de crescimento transformante (TGF)-β, VEGF, fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-1 e quaisquer combinações dos mesmos.

[0149] Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um fragmento celular (por exemplo, trombócito, fração celular). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é uma proteína (por exemplo, citocina, quimiocina, fator de crescimento, anticorpo, fragmento de anticorpo, proteína do sistema de complemento ou enzima). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um ácido nucleico (por exemplo, DNA circulante, RNA circulante ou miRNA circulante). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um sacarídeo (por exemplo, monossacarídeo ou dissacarídeo). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um lipídeo (por exemplo, ácido graxo, tri- glicerídeo ou colesterol). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é uma molécula pequena. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é íon metálico.

[0150] Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é uma forma modificada ou um metabólito de qualquer uma das moléculas acima. Por exemplo, em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um segmento de uma proteína (por exemplo, um peptídeo ou polipeptídeo). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um ácido nucleico com uma ou mais modificações (por exemplo, meti- lação, encapuzamento 5’). Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um ácido aldônico ou alditol de um sacarídeo. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um esterol. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular é um conjugado de qualquer uma das moléculas divulgadas aqui, em que as moléculas são conjugadas covalente ou não covalentemente.

[0151] Em certas modalidades, a concentração do fator de crescimento é igual ao nível fisiológico médio da população do fator de crescimento. Em certas modalidades, a concentração do fator de crescimento é mais do que o nível fisiológico médio da população do fator de crescimento. Em certas modalidades, o fator de crescimento é suplementado como uma molécula isolada, purificada e/ou sintética.

[0152] O fator sanguíneo não celular pode contribuir para o recon-dicionamento/recelularização da estrutura tubular acelular em vários modos in vitro ou depois da implantação. Por exemplo, em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove a fixação ou a aderência de células à estrutura. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove a proliferação de células progenitoras. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove a diferenciação de células progenitoras em células que podem preencher a estrutura. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular inibe a apoptose e/ou a necrose das células e/ou células progenitoras. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove a remoção ou o mascara- mento de proteína(s) alogênica(s) presentes na estrutura. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove o depósito de pro- teína(s) autóloga(s) na estrutura. Em certas modalidades, o fator sanguíneo não celular promove o condicionamento da estrutura para suprimir a rejeição do hospedeiro.

Contato da estrutura tubular acelular com o sangue total do paciente

[0153] A presente divulgação fornece um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado, o método compreendendo contatar a superfície (por exemplo, superfície interna) de uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpressa) com uma suspensão compreendendo sangue total por mais do que 48 horas, permitindo desse modo que as células presentes no sangue preencham a estrutura. Em algumas modalidades, a superfície da estrutura tubular acelular é a superfície interna da estrutura tubular acelular.

[0154] Como usado aqui, o termo “contato”, contatando” ou contatado” significa incubação estática, perfusão, introdução, injeção ou cultura. A perfusão pode ser perfusão pulsada, perfusão de intervalo, direção alternada e nenhuma perfusão. Em algumas modalidades, a estrutura tubular acelular é continuamente perfundido com a suspensão ou sangue total.

[0155] Em certas modalidades, o contato é por mais do que 2 dias.Como usado aqui, o termo “mais do que 2 dias” se refere a uma duração que é mais longa do que 48 horas e mais longa do que cerca de 48 horas. Os termos “dia” e “dias” se referem a ciclo(s) de 24 horas. Em certas modalidades, o contato é por pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou pelo menos 7 dias. Em certas modalidades, o contato é por até 9, até 10, até 11, até 12, até 13, até 14 dias, até 21 dias ou até 31 dias. Em certas modalidades, o contato é por até 1 mês. Em algumas modalidades, o contato é por cerca de 1 a 31 dias, por 2 a 21 dias, por 2 a 14 dias, por 2 a 9 dias, por 2 a 7 dias, por 2 a 5 dias, por 5 a 7 dias ou por 7 a 9 dias. Em certas modalidades, o contato é por cerca de 7 a cerca de 9 dias. Em algumas modalidades, o contato da superfície da estrutura tubular acelular é por 2 a 21 dias, por 3 a 21 dias, por 4 a 21 dias, por 5 a 21 dias, por 6 a 21 dias ou por 7 a 21 dias. Em certas modalidades, o contato é por cerca de 2 dias, por cerca de 3 dias, por cerca de 4 dias, por cerca de 5 dias, por cerca de 6 dias for cerca de 7 dias, por cerca de 8 dias, por cerca de 9 dias, por cerca de 10 dias, por cerca de 11 dias, por cerca de 12 dias, por cerca de 13 dias, por cerca de 14 dias, por cerca de 15 dias, por cerca de 16 dias, por cerca de 17 dias, por cerca de 18 dias, por cerca de 19 dias, por cerca de 20 dias ou por cerca de 21 dias.

[0156] A estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpresso) pode ser contatado com amostra de sangue total não diluída ou a suspensão contendo sangue total diluído em qualquer maneira conhecida na técnica. Por exemplo, em certas modalidades, a estrutura é solta e colocada em suspensão na suspensão, opcionalmente em que a suspensão é agitada (por exemplo, girada) para misturar novamente os componentes regularmente ou continuamente. A rotação da estrutura tubular durante a perfusão pode ser contínua/intermitente, alternada ou de intervalo.

[0157] Em certas modalidades, a superfície interna da estrutura é contatada com a suspensão. Em certas modalidades, a estrutura é per- fundida com a suspensão. Em certas modalidades, a estrutura é perfun- dida com uma recirculação fechada da suspensão. Em certas modalidades, o contato contínuo é perfusão conduzida usando um biorreator.Em certas modalidades, a superfície externa da estrutura é também contatada com a suspensão. Em outras modalidades, a superfície externa da estrutura não é contatada com a suspensão. Em certas modalidades, o contato é conduzido in vitro.

[0158] A perfusão pode ser conduzida em qualquer modo. Por exemplo, em certas modalidades, a estrutura é perfundida com a suspensão continuamente. Em certas modalidades, a estrutura é perfun- dida com a suspensão intermitentemente (por exemplo, perfusão por 1 minuto em um intervalo de 4 minutos). Em certas modalidades, a perfu- são é conduzida em uma única direção. Em certas modalidades, a única direção é a direção do fluxo anterógrado, por exemplo, a direção permitida pela(s) estrutura(s) de válvula na estrutura. Em certas modalidades, a perfusão é conduzida em direções alternadas (por exemplo, mudando a direção a cada 5 minutos). A velocidade da perfusão pode ser determinada pelo técnico no assunto à luz de vários fatores, tal como o diâmetro da estrutura tubular, a resistência mecânica da estrutura, o tempo consumido para que as células sedimentem e a viscosidade da suspensão. Em certas modalidades, a estrutura é perfundida em uma velocidade de cerca de 0,1 a cerca de 50 mL por minuto. Em certas modalidades, a estrutura é perfundida em uma velocidade de cerca de 2 ml por minuto. Dependendo da orientação da estrutura, a rotação durante a perfusão (incluindo os intervalos) pode ser vantajosa tal que a superfície interna da estrutura seja preenchida uniformemente. Em certas modalidades, a estrutura é girada continuamente. Em certas modalidades, a estrutura é girada intermitentemente (por exemplo, em 30° a cada 5 minutos). A direção da rotação pode ser constante ou alternada. A vantagem da rotação pode não ser substancialmente onde a estrutura é fixada verticalmente. Consequentemente, em certas modalidades, a estrutura não é girada.

[0159] Em modalidade específicas, a estrutura (por exemplo, o lú-men da estrutura) é continuamente perfundida com a suspensão. Em certas modalidades, a estrutura é perfundida em uma velocidade de cerca de 0,1 a cerca de 50 mL por minuto (por exemplo, cerca de 2 mL por minuto). Em certas modalidades, a estrutura é perfundido com uma recirculação fechada da suspensão. Em certas modalidades, o contato contínuo é perfusão conduzida usando um biorreator.

Monitoramento das Condições Ambientais Durante o Contato

[0160] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado, o método compreendendo contatar a superfície de uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpressa) com uma suspensão compreendendo sangue total, em que uma pluralidade parâmetros ambientais (por exemplo, temperatura, pH, teor de oxigênio e/ou teor de CO2) são monitorados e ajustados contínua ou regularmente.

[0161] Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 8°C a cerca de 40°C. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 20°C a cerca de 25°C. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 37°C. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C ou cerca de 25°C.

[0162] Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de pH 7,2 a cerca do pH 7,5. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno do pH 7,4.

[0163] Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 30 mmHg a cerca de 100 mmHg de pressão parcial de oxigênio. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 30 mmHg a cerca de 40 mmHg de pressão parcial de oxigênio. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 80 mmHg a 100 mmHg de pressão parcial de oxigênio. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 160 mmHg de pressão parcial de oxigênio.

[0164] Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 38 mmHg a cerca de 76 mmHg de pressão parcial de dióxido de carbono. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 38 mmHg de pressão parcial de dióxido de carbono. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 76 mmHg de pressão parcial de dióxido de carbono. Em certas modalidades, o contato é conduzido em torno de 40 mmHg a cerca de 50 mmHg de pressão parcial de dióxido de carbono.

[0165] Em certas modalidades, os parâmetros ambientais (por exemplo, temperatura, pH, teor de oxigênio e/ou teor de CO2) são monitorados e ajustados contínua ou regularmente durante o contato.

[0166] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um mé todo de preparar um vaso sanguíneo personalizado, o método compreendendo contatar a superfície de uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpressa) com uma suspensão compreendendo sangue total, em que a concentração de um nutriente na suspensão é monitorada e ajustada contínua ou regularmente.

[0167] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado, o método compreendendo contatar a superfície de uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpressa) com uma suspensão compreendendo sangue total, em que a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada durante o contato e D-glicose é adicionada à suspensão para manter a concentração de D-glicose em torno de 3 a cerca de 11 mmol/L.

[0168] Em algumas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada medindo-se a concentração de D-glicose em uma amostra coletada da suspensão. Em algumas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é medida uma vez a cada dia. Em algumas modalidades, a concentração de D-glicose na suspensão é monitorada medindo-se a concentração de D-glicose usando um sensor que está em contato com a suspensão. Em algumas modalidades, o sensor está continuamente em contato com a suspensão durante o contato.

[0169] Em algumas modalidades, D-glicose é adicionada quando a concentração medida de D-glicose na suspensão está abaixo de 4 mmol/L. Em algumas modalidades, D-glicose é adicionada para atingir uma concentração final de 10 mmol/L de D-glicose na suspensão.

Preparação de Andaime Tubular Acelular com um Componente Enriquecido ou Selecionado de Sangue total

[0170] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado em que um ou mais componentes do sangue total são enriquecidos e selecionados e depois adicionados à superfície de uma estrutura tubular acelular para contatar com a superfície interna da estrutura. Por exemplo, um componente selecionado a partir de trombócitos, células nucleadas, proteínas, fatores de crescimento, fatores de sinalização, imunoglobulinas e quaisquer combinações dos mesmos, pode ser adicionado à superfície interna de uma estrutura tubular acelular. O componente pode ser enriquecido ou selecionado por, por exemplo, centrifugação, centrifugação de gradiente, separação por adesão seletiva, filtração ou separação (por exemplo, FACS, MACS).

[0171] Os termos “enriquecido e selecionado” se referem a uma substância e/ou entidade que foi separada de pelo menos um dos com-ponentes com os quais ela foi misturada quando inicialmente produzida (se na natureza ou em um cenário experimental). Em certas modalidades, uma substância e/ou entidade isolada é separada de pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % livre dos componentes com os quais ela foi misturada quando inicialmente produzida. Em certas modalidades, uma substância e/ou entidade enriquecida e selecionada é purificada. Em certas modalidades, uma substância e/ou entidade enriquecida, selecionada e/ou purificada é substancialmente livre de outros componentes. Como usado aqui, o cálculo da porcentagem de separação ou pureza não inclui excipientes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.).

Vasos sanguíneos personalizados

[0172] O método divulgado aqui permite que células e/ou células progenitoras preencham a superfície (por exemplo, superfície interna) da estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo desce- lularizado ou uma estrutura tubular bioimpressa), gerando desse modo o vaso sanguíneo personalizado. Em certas modalidades, as células compreendem células endoteliais. Em certas modalidades, as células compreendem células musculares lisas. Em certas modalidades, as células progenitoras compreendem células progenitoras endoteliais. Em certas modalidades, as células progenitoras compreendem células progenitoras musculares lisas. O técnico no assunto entenderia que as células e/ou células progenitoras poderiam preencher a estrutura em um ou mais modos. O preenchimento da estrutura pode ocorrer in vitro antes da implantação ou in vivo depois da implantação. Em certas modalidades, as células se fixam à estrutura. Em certas modalidades, as células progenitoras proliferam e/ou diferenciam para gerar células da pro- gênie e as células da progênie se fixam à estrutura.

[0173] Em certas modalidades, o contato resulta em proliferação e/ou diferenciação das células progenitoras a células endoteliais. Em certas modalidades, as células endoteliais expressam VE-caderina, AcLDL, vWF e/ou CD31. A estrutura recondicionada/recelularizada pode ser caracterizado quanto à presença de células endoteliais e musculares lisas. Técnicas de imuno-histoquímica e imonofluorescência bem conhecidas comumente ao técnico são utilizadas para detectar a presença ou ausência de células endoteliais e musculares lisas. Para visualizar a presença de células endoteliais, anticorpos para CD31 (1:200) (Abcam, Germany) e vWF (1:100) (Santa Cruz, Germany) podem ser usados para coloração dos estruturas recondicionados/recelu- larizados. Para visualizar as células musculares lisas, o anticorpo contra actina do músculo liso (1:50) (Abcam, Germany) pode ser usado para colorir as válvulas recondicionadas/recelularizadas. A presença de células positivas destes marcadores nos estruturas recelularizadas é de-tectada por imuno-histoquímica ou imonofluorescência. Células musculares lisas também podem ser identificadas pela morfologia de células musculares em forma de eixo que revestem as estruturas recondiciona- das/recelularizadas.

[0174] Os vasos sanguíneos personalizados preparados pelo método divulgado aqui são úteis para a implantação em um indivíduo (por exemplo, ser humano). Em certas modalidades, o vaso sanguíneo per-sonalizado é útil como uma veia. Em certas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de avaliar a função da válvula venosa (por exemplo, usando um teste de competência de válvula in vitro) do vaso sanguíneo personalizado. Testes de competência de válvula in vitro exemplares são fornecidos na Publicação de Patente dos EUA No 2017/0071738. Em certas modalidades, a função da válvula venosa é testada antes do recondicionamento/recelularização. Em certas modalidades, a função da válvula venosa é testada depois do recondiciona- mento/recelularização. Em certas modalidades, a função da válvula venosa é testada tanto antes quanto depois do recondicionamento/recelu- larização.

[0175] Um vaso sanguíneo personalizado funcional não tem nenhum vazamento. Consequentemente, em certas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de avaliar o vazamento. Vários métodos são conhecidos na técnica para testar o vazamento. Por exemplo, em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado é fluxado com uma solução (por exemplo, uma solução fisiologicamente tamponada tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS)), preferivelmente em uma taxa estacionária e a superfície do vaso sanguíneo personalizado é observada quanto ao acúmulo de solução resultante de uma fenda ou furo. Em certas modalidades, o vazamento é testado antes do recondicionamento/recelularização. Em certas modalidades, o vazamento é testado depois do recondicionamento/recelularização. Em certas modalidades, o vazamento é testado tanto antes quanto depois do recondicionamento/recelularização.

[0176] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um vaso sanguíneo personalizado preparado por qualquer um dos métodos divulgados aqui. Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado compreende uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado, opcionalmente tratado com MMP ou uma estrutura tubular bioimpressa) incluindo fatores não celulares tais como os componentes de ECM/composição de um vaso sanguíneo mamífero ou uma parte funcional do mesmo, celularizado com células humanas (por exemplo, células endoteliais e/ou células musculares lisas).

[0177] O vaso sanguíneo personalizado da presente divulgação compreende ainda células tais como, mas não limitada a, células-tronco ou progenitoras derivadas de sangue total tais como células-tronco en- doteliais, células progenitoras endoteliais, células progenitoras musculares lisas, populações celulares do sangue total, sangue periférico e quaisquer populações celulares que podem ser isoladas do sangue to tal. As células progenitoras são definidas como células que são compro-metidas a diferenciar em um tipo de células. Por exemplo, células progenitoras endoteliais significam células que são programadas para diferenciar em células endoteliais; células progenitoras musculares lisas significam células que são programadas para diferenciar em células musculares lisas. Células progenitoras em sangue total ou sangue periférico incluem a população de células não comprometidas e/ou comprometidas, tais como células pluripotentes ou células totipotentes.

[0178] Em certas modalidades, a superfície de o vaso sanguíneo personalizado é substancialmente coberta por células. Em certas modalidades, a superfície interna do vaso sanguíneo personalizado é substancialmente coberta por células endoteliais. Em certas modalidades, as células endoteliais expressam VE-caderina, AcLDL, vWF e/ou CD31.

[0179] O técnico no assunto avaliaria que as células e/ou células progenitoras no sangue não precisam preencher a superfície interna da estrutura à medida em que a estrutura recondicionada/recelularizada é indistinguível de vasos sanguíneos nativos. Como divulgado aqui, a re- celularização pode ocorrer in vitro bem como in vivo após a implantação e uma estrutura parcialmente recelularizada in vitro pode ser recelulari- zada ainda in vivo para recapturar a morfologia e/ou função de vasos sanguíneos nativos. Não obstante, células endoteliais em uma densidade mais baixa do que em vasos sanguíneos nativos também podem cobrir substancialmente a superfície interna da estrutura adotando-se uma morfologia mais difundida, fixando desse modo a uma área de superfície maior por célula.

[0180] Os vasos sanguíneos personalizados preparados pelo método divulgado aqui são úteis para implantação em um indivíduo (por exemplo, ser humano). Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado é útil como uma veia.

[0181] Em certas modalidades, a estrutura tubular acelular é derivada de uma veia (por exemplo, preparado descelularizando-se uma veia nativa). Em certas modalidades, a veia está em uma extremidade inferior. O sistema venoso das extremidades inferiores inclui as veias profundas, que se encontram debaixo da fáscia muscular e drenam os músculos da extremidade inferior; as veias superficiais, que estão acima da fáscia profunda e drenam a microcirculação cutânea; e as veias per- furantes que penetram a fáscia muscular e conectam as veias superficiais e profundas. Veias de comunicação conectam as veias dentro do mesmo compartimento.

[0182] Em certas modalidades, a veia é uma veia profunda. Veias profundas úteis para os presentes métodos incluem mas não são limitadas à veia femoral superficial, que conecta a veia poplítica à veia femoral comum e veias profundas do panturrilha (por exemplo, veias tibi- ais anteriores, tibiais posteriores e peroneais). Em certas modalidades, a veia é uma veia superficial. Veias profundas úteis para os presentes métodos incluem mas não são limitados à veia safena magna, as veias safenas magnas acessórias anteriores e posteriores, veia safena parva (SSV) e veia intersafena (também conhecida como veia Giacomini).

[0183] A maioria das veias têm válvulas venosas para garantir o fluxo unidirecional do sangue. Por exemplo, as veias superficiais, profundas e mais perfurantes em uma extremidade inferior contêm válvulas bicúspides. Consequentemente, em certas modalidades, a estrutura tubular acelular compreende uma estrutura de válvula e a estrutura de válvula é recondicionada/recelularizada para fornecer uma válvula venosa funcional no vaso sanguíneo personalizado. A estrutura de válvula pode ser derivada de uma válvula venosa nativa ou da síntese e/ou montagem da estrutura. Métodos de avaliar a função de uma válvula venosa são conhecidos na técnica, incluindo mas não limitados a um teste de competência de válvula in vitro. Em certas modalidades, o método compreende ainda avaliar a função da válvula venosa (por exemplo, usando um teste de competência de válvula in vitro) da estrutura tubular acelular.

[0184] Em certas modalidades, a estrutura de válvula na estrutura tubular acelular é recondicionada/recelularizada durante o recondicio- namento/recelularização do restante da superfície interna da estrutura, isto é, nenhuma etapa adicional é tomada para especificamente recon- dicionar/recelularizar a estrutura de válvula. Em certas modalidades, as válvulas recondicionadas/recelularizadas são CD31-positivas. As válvulas recondicionadas/recelularizadas também podem ser positivas para actina do músculo liso, positivas para vWF e/ou ser caracterizadas pela presença de células musculares lisas em forma de eixo.

[0185] Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado tinha uma ou mais características de um vaso sanguíneo nativo. Em certas modalidades, a veia personalizada preparada por um método divulgado aqui compreende válvulas recondicionadas/recelularizadas que têm propriedades mecânicas de força no primeiro pico acima de 0,8 N. Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado preparado por um método divulgado aqui não demonstra nenhum vazamento quando testado.

Métodos de Tratamento ou Uso

[0186] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui para o uso em terapia. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece o vaso sanguíneo personalizado para o uso em transplante em um indivíduo. Em certas modalidades, a presente divulgação fornece o vaso sanguíneo personalizado para o uso no tratamento de uma doença ou transtorno do vaso sanguíneo de um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0187] Os termos “tratar”, “tratando” ou “tratamento” e outros equi valentes gramaticais como usado nesta divulgação, incluem aliviar, diminuir, melhorar ou prevenir uma doença, condição ou sintomas, prevenir sintomas adicionais, melhorar ou prevenir as causas metabólicas subjacentes dos sintomas, inibir a doença ou condição, por exemplo, parar o desenvolvimento da doença ou condição, aliviar a doença ou condição, causar a regressão da doença ou condição, aliviar uma condição causada pelo doença ou condição ou parar os sintomas da doença ou condição e são intencionados a incluir profilaxia. Os termos incluem ainda obter um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico significa a erradicação ou a melhora do transtorno subjacente sendo tratado. Também, um benefício terapêutico é obtido com a erradicação ou a melhora de um ou mais dos sintomas fisiológicos associados com o transtorno subjacente tal que uma melhoria seja observada no paciente, não obstante de que o paciente ainda possa ser afligido com o transtorno subjacente.

[0188] Os métodos divulgados aqui são particularmente adequados para gerar vasos sanguíneos modificados semelhantes a autólogo. Eles podem ter as vantagens de: (1) serem não imunogênicos e portanto tendo risco mínimo de rejeição do enxerto ou resposta imune adversa; (2) obviarem a necessidade de imunossupressão e portanto menos risco para o paciente depois da cirurgia e por toda sua vida; (3) não terem nenhuma restrição de comprimento; (4) serem mais prontamente disponíveis, quando comparados às veias de doadores compatíveis ou veias autólogas; (5) serem compostos de componentes naturais (isto é, ECM, células endoteliais e células musculares lisas) e portanto tendo qualidades superiores a maioria das veias sintéticas e artificiais, incluindo preservando fatores de crescimento angiogênicos residuais e integridade biomecânica; 6) requerem a produção invasiva da veia em comparação à veia autóloga de colheita para transplante; (7) permitem o procedimento rápido e minimamente invasivo ao indivíduo pelo uso de sangue total; (8) tornam celularizados e biologicamente integrados no corpo do indivíduo e suas funções (reparo, crescimento, defesa imuno- lógica).

[0189] Consequentemente, em um aspecto, a presente divulgação fornece um método de cirurgia compreendendo implantar o vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui em um indivíduo (por exemplo, humano) em necessidade do mesmo. Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece o vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui para o uso em implantação em um indivíduo (por exemplo, ser humano) em necessidade do mesmo. Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um vaso sanguíneo personalizado preparado por qualquer um dos métodos divulgados aqui, em que o vaso sanguíneo personalizado foi implantado em um indivíduo (por exemplo, ser humano) por cirurgia.

[0190] Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado é autólogo. Como usado aqui, o termo “autólogo” significa que o sangue usado no método de preparar um vaso sanguíneo personalizado é do indivíduo que recebe a implantação ou cirurgia. Em certas modalidades, em que o vaso sanguíneo personalizado é produzido descelularizando- se um vaso sanguíneo nativo, o doador do vaso sanguíneo nativo não é o mesmo indivíduo como o receptor do vaso sanguíneo personalizado. Em certas modalidades, em que o vaso sanguíneo personalizado é produzido descelularizando-se um vaso sanguíneo nativo, o vaso sanguíneo nativo é obtido a partir de uma espécie animal adequada (por exemplo, porco, ovelha, vaca).

[0191] Os métodos de cirurgia divulgados aqui são úteis para tartar várias doenças ou transtornos vasculares. Consequentemente, em certas modalidades, o indivíduo tem uma doença ou transtorno vasculares, por exemplo, uma doença ou transtorno venosos. Em certas modalidades, a doença ou transtorno venosos são selecionados a partir do grupo consistindo em trombose venosa profunda (DVT), insuficiência venosa crônica (CVI) (também conhecida como síndrome pós-flebítica), varizes, ulceração venosa (por exemplo, ulceração venosa da perna) e câncer de perna recorrente (por exemplo, causado por refluxo venoso profundo e/ou hipertensão venosa). Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado é implantado, transplantado ou enxertado para substituir um segmento de vaso sanguíneo nativo afligido com qualquer uma das doenças ou transtornos vasculares. Em certas modalidades, o vaso sanguíneo personalizado é uma veia e compreende pelo menos uma válvula venosa.

[0192] Em certas modalidades, o método de cirurgia trata, melhora e/ou alivia um ou mais sintomas incluindo dor prolongada, peso ou cãibra nas pernas, coceira e formigamento, dor que piora ao ficar de pé, dor que melhora quando as pernas são levantadas, inchaço das pernas, vermelhidão das pernas e tornozelos, mudanças da cor da pele em torno dos tornozelos, varizes na superfície (superficial), espessamento e endurecimento da pele nas pernas e tornozelos (lipodermatoescle- rose), úlceras nas pernas e tornozelos e feridas que são lentas para curar nas pernas ou tornozelos.

[0193] Em certas modalidades, o método de cirurgia divulgado aqui trata e/ou melhora CVI. CVI define aquelas manifestações de doença venosa resultante de hipertensão venosa ambulatorial, definida como uma falha para reduzir a pressão venosa com exercício. Sob circunstâncias normais, as válvulas venosas e as bombas musculares da extremidade inferior limitam o acúmulo de sangue nas veias de extremidade inferior. A falha das bombas musculares de extremidade inferior devido à obstrução de fluxo, fraqueza músculo-fascial, perda de movimento das articulações ou falha valvular é associada com insuficiência venosa periférica.

[0194] Em certas modalidades, o método de cirurgia divulgado aqui trata e/ou melhora a ulceração venosa. Ulcerações venosas são feridas devido ao funcionamento impróprio das válvulas venosas, usualmente das pernas (isto é, ulceração venosa da perna). Úlceras venosas surgem quando válvulas têm função reduzida e o refluxo do sangue causa fusão do sangue nas veias e aumentou a pressão nas veias e capilares. Isto leva a outras complicações relacionadas, tais como edema, inflamação, endurecimento do tecido, subnutrição da pele e eczema venoso. Úlceras venosas são grandes, rasas, descoloridas devido ao vazamento de pigmento contendo ferro em eritrócitos no tecido e podem ter descarga. As úlceras são o mais frequentemente adequadas em torno dos maléolos medianos ou posteriores.

[0195] Em certas modalidades, o método de cirurgia divulgado aqui restaura a pressão venosa normal da extremidade inferior. Por exemplo, com a andamento, a pressão venosa da extremidade inferior é reduzida de aproximadamente 100 mm Hg (dependendo da altura) até a média de 18 mm Hg a cerca de 25 mm Hg dentro de 7 a 12 etapas. Mudanças de pressão similares são observadas com flexão plantar do tornozelo ou elevação do calcanhar em pé, transferindo o peso para o antepé (a manobra na ponta do pé). A pressão venosa ambulatorial (AVP) pode ser determinada usando uma agulha de calibre 21 para medir a resposta a 10 movimentos na ponta do pé, usualmente em uma taxa de 1 por segundo, em veia dorsal do pé. Ao retomar uma posição em pé declarada, a pressão hidrostática é restaurada depois de uma média de 31 segundos. A incidência da ulceração tem uma relação linear a aumentos em AVP acima de 30 mm Hg. Uma AVP aumentada também é associada com um tempo de preenchimento venoso de 90 % de menos do que 20 segundos. Ao contrário da AVP, mudanças de volume podem ser medidas não invasivamente usando pletismografia. O refluxo rápido (isto é, preenchimento venoso de mais do que 7 ml/s) e disfunção da bomba de panturrilha são associados com uma alta incidência de ulceração. As válvulas recondicionadas/recelularizadas em veias, após o enxerto, restauram a AVP normal, refluxo rápido normal e/ou disfunção de bomba de panturrilha normal. Preferivelmente, uma válvula venosa no vaso sanguíneo personalizado, após o enxerto, restaura a tolerância normal da pressão de refluxo de cerca de 100 mm Hg e reduz a uma média de cerca de 18 mm Hg a cerca de 25 mm Hg durante o andamento de 7 a 12 etapas.

[0196] Em certas modalidades, o método de cirurgia divulgado aqui trata e/ou melhora os sintomas de válvulas incompetentes na coxa. Em certas modalidades, o tratamento e/ou a melhora dos sintomas são obtidos restaurando-se a relação de trabalho normal entre bombas musculares e as válvulas venosas. As bombas musculares do membro inferior incluem aquelas do pé, panturrilha e coxa. Entre estas, a bomba de panturrilha é a mais importante visto que é a mais eficiente, tem a maior capacitância e gera as pressões mais altas (200 mm de mercúrio durante a contração muscular). O membro normal tem um volume de panturrilha variando de 1500 a 3000 cc, um volume venoso de 100 a 150 cc e ejeta mais de 40 % a 60 % do volume venoso com uma única contração.

[0197] Durante a contração, os músculos gastrocnêmios e sóleos conduzem o sangue nas veias poplíticas e femorais de grande capacidade. As válvulas recondicionadas/recelularizadas da presente divulgação impedem o fluxo retrógrado (refluxo) durante o relaxamento subsequente, gerando pressão negativa e retirando o sangue da superfície ao sistema profundo através de veias perfurantes competentes. As válvulas recondicionadas/recelularizadas incrementalmente reduzem a pressão venosa até que a afluência arterial se iguala ao escoamento venoso. A presente divulgação fornece que quando o exercício cessa em um indivíduo, as veias com válvulas recondicionadas/recelularizadas preenchem lentamente o leito capilar, causando um retorno lento à pressão venosa em repouso.

[0198] Embora o músculo circunde as veias da coxa, a contribuição da contração muscular da coxa para o retorno venoso é mínima comparada com a bomba muscular da panturrilha. A ação do bombeamento devido à compressão do plexo venoso plantar durante a deambulação prepara a bomba da panturrilha. Várias bombas da perna trabalham juntas com função de válvula competente para retornar o sangue venoso da extremidade distal para proximal. Os vasos sanguíneos personalizados da presente divulgação são para o uso em restaurar as bombas funcionais da perna para retornar o sangue venoso da extremidade distal à proximal.

Biorreatores

[0199] Em um outro aspecto, a presente divulgação fornece um biorreator para preparar um vaso sanguíneo personalizado, o biorreator compreendendo uma bomba (por exemplo uma bomba peristáltica, uma bomba de gravidade, uma bomba de êmbolo ou outra bomba adequada), um recipiente, um primeiro conector e um segundo conector, em que o primeiro e o segundo conectores são direta ou indiretamente conectados ao recipiente, em que cada conector é conectado a uma extremidade de uma estrutura tubular para preparar um vaso sanguíneo personalizado preparado por qualquer um dos métodos de preparar um vaso sanguíneo personalizado divulgados aqui, em que quando o primeiro e o segundo conectores são conectados às duas extremidades de uma estrutura tubular, a bomba medeia a circulação de uma suspensão, sangue total ou solução em um circuito fechado. Em muitas modalidades, é vantajoso que uma bomba (por exemplo uma bomba peristál- tica, uma bomba de gravidade, uma bomba de êmbolo ou outra bomba adequada) usada aqui seja suficientemente suave de modo a minimizer o dano a células sanguíneas.

[0200] Em certas modalidades, o biorreator compreende ainda uma estrutura tubular (por exemplo, uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpresso)). Em certas modalidades, o biorreator compreende ainda uma suspensão ou sangue total como divulgado aqui para preparar um vaso sanguíneo personalizado.

[0201] Em certas modalidades, pelo menos duas partes do biorrea- tor são fornecidas separadamente, com uma instrução para conectá-las na ordem prescrita. Consequentemente, em um aspecto, a presente divulgação fornece um kit para montar um biorreator para preparar um vaso sanguíneo personalizado, o biorreator compreendendo uma bomba peristáltica, um recipiente, um primeiro conector e um segundo conector, em que o primeiro e o segundo conectores podem ser direta ou indiretamente conectados ao recipiente, em que cada conector pode ser conectado a uma extremidade de uma estrutura tubular para preparar um vaso sanguíneo personalizado preparado por qualquer um dos métodos de preparar um vaso sanguíneo personalizado divulgados aqui, em que quando o primeiro e o segundo conectores são conectados às duas extremidades de uma estrutura tubular, a bomba peristáltica medeia a circulação de uma suspensão, sangue total ou solução em um circuito fechado. Em certas modalidades, o kit compreende ainda uma estrutura tubular (por exemplo, uma estrutura tubular acelular (por exemplo, um vaso sanguíneo descelularizado ou uma estrutura tubular bioimpresso)).

[0202] Em certas modalidades, o primeiro e o segundo conectores são conectores de Luer. Em certas modalidades, o primeiro recipiente é diretamente conectado ao recipiente por um tubo e/ou o segundo recipiente é diretamente conectado ao recipiente por um tubo.

[0203] Em certas modalidades, o biorreator compreende uma porta de amostragem. Em certas modalidades, a porta de amostragem é uma parte do recipiente. Em certas modalidades, a porta de amostragem permite a retirada de uma amostra da suspensão, sangue total ou solução do circuito fechado. Em certas modalidades, a porta de amostragem compreende um sensor para medir a temperatura, pH e/ou a concentração de oxigênio, CO2 ou nutriente (por exemplo, D-glicose) na suspensão, sangue total ou solução.

[0204] Em certas modalidades, a porta de amostragem é também útil como uma porta de injeção. Em certas modalidades, o biorreator compreende ainda uma porta de injeção. Em certas modalidades, a porta de injeção é ou pode ser conectada a um reservatório de oxigênio, CO2 ou nutriente (por exemplo, D-glicose).

[0205] Em certas modalidades, a superfície externa da estrutura tubular é contatada com a suspensão, sangue total ou solução no recipiente. Este biorreator permite o recondicionamento/recelularização da superfície interna e da superfície externa da estrutura tubular ao mesmo tempo.

[0206] Em certas modalidades, o biorreator compreende ainda uma câmara circundando a estrutura tubular, permitindo desse modo o contato da superfície externa da estrutura tubular com um líquido na câmara. A câmara também pode ser esterilizada, mantendo a estrutura tubular em uma condição asséptica.

[0207] O técnico no assunto entenderia que o mesmo biorreator pode ser usado para descelularizar um vaso sanguíneo nativo ou para condicionar uma estrutura tubular. A suspensão, sangue total ou solução apropriados podem ser selecionados pelo técnico no assunto correspondendo ao uso.

[0208] Várias bombas podem ser usadas, que não rompem os com ponentes celulares e acelulares na solução sanguínea mesmo durante períodos prolongados de perfusão. Estas podem ser bombas peristálti- cas, bombas de gravidade, bombas de êmbolo ou similares. A inclusão das portas de amostra na configuração do biorreator permite a amostragem estéril do meio de perfusão bem como a injeção estéril de componentes adicionais sem abrir o circuito fechado e em alguns casos sem parar ainda a perfusão. Em uma versão melhorada da configuração do biorreator, sensores com uma variedade de parâmetros relevantes tais como glicose, pH, teor de oxigênio, teor de CO2, metabólitos e assim por diante podem ser acoplados em linha na tubulação de perfusão. Isto permite o monitoramento contínuo do processo de personalização durante RC ou durante DC, monitoramento do progresso e sucesso do rompimento celular e de DNA e remoção.

[0209] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um biorre- ator para preparar um vaso sanguíneo personalizado, o biorreator com-preendendo uma bomba peristáltica, um recipiente compreendendo uma porta de amostragem, um primeiro conector e um segundo conector, em que o primeiro e o segundo conectores são direta ou indiretamente conectados ao recipiente, em que cada conector é conectado a uma extremidade de uma estrutura tubular para preparar um vaso sanguíneo personalizado preparado pelos métodos divulgados aqui, em que quando o primeiro e o segundo conectores são conectados às duas extremidades de uma estrutura tubular, a bomba peristáltica medeia a circulação de uma suspensão ou solução em um circuito fechado.

[0210] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo conectores são conectores de Luer. Em algumas modalidades, a porta de amostragem é uma porta de injeção. Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda uma porta de injeção. Em algumas modalidades, a porta de injeção é conectada a um reservatório de D-glicose. Em algumas modalidades, o primeiro recipiente é diretamente conectado ao recipiente por um tubo e/ou o segundo recipiente é diretamente conectado ao recipiente por um tubo. Em algumas modalidades, o biorreator compreende uma ou mais portas de amostra. Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda um ou mais sensores para medir o nível de glicose. Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda um módulo de ajuste de pH. Em algumas modalidades, o biorreator compreende ainda um módulo de ajuste de CO2.

[0211] Outro aspecto da presente divulgação se refere a um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado, o método compreendendo contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com um componente contido no sangue total, que é enriquecido ou selecionado antes do uso em contatar a superfície.

[0212] Em algumas modalidades, o componente é selecionado a partir de trombócitos, células nucleadas, proteínas, fatores de crescimento, fatores de sinalização, imunoglobulinas e quaisquer combinações dos mesmos.

[0213] Em algumas modalidades, o componente é enriquecido por centrifugação, centrifugação de gradiente, separação por adesão seletiva, filtração ou separação. Muitos métodos para enriquecer ou separar os componentes são bem conhecidos na técnica. Algum exemplo de métodos para separação inclui separação celular ativada por fluorescência (FACS), separação celular magneticamente ativada (MACS). Definições

[0214] Deve ser entendido que métodos não são limitados às mo dalidades particulares descritas e como tal modem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas e não é intencionada a ser limitante. O escopo da presente tecnologia será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0215] Como usado aqui, certos termos podem ter os significados definidos a seguir. Como usado no relatório descritivo e reivindicações, a forma no singular “um”, “uma” e “o”, “a” incluem referências no singular e plural a menos que o contexto claramente dite de outro modo. Por exemplo, o termo “uma célula” inclui uma única célula bem como uma pluralidade de células, incluindo misturas das mesmas.

[0216] Como usado aqui, o termo “compreendendo” é intencionado a significar que as composições e métodos incluem os elementos relatados, mas não excluindo os outros. “Consistindo essencialmente em” quando usado para definir as composições e métodos, deve significar excluindo outros elementos de qualquer significância essencial à composição ou método. “Consistindo em” deve significar excluindo mais do que os oligoelementos de outros ingredientes para as composições reivindicadas e etapas de método substanciais. As modalidades definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do escopo desta divulgação. Consequentemente, é intencionado que os métodos e as composições podem incluir etapas e componentes adicionais (compreendendo) ou alternativamente incluindo etapas e composições de nenhuma significância (consistindo essencialmente em) ou alternativamente, intencionando apenas as etapas ou composições do método estabelecidas (consistindo em).

[0217] O termo “cerca de” se refere a qualquer alteração mínima em um valor absoluto estabelecido (por exemplo, a concentração ou quantidade de um agente) que não muda mudança a eficácia, atividade, ação, resultados estabelecidos, etc. Em modalidades, o termo “cerca de” pode incluir ±10 % de um valor numérico ou ponto de dados específico. O termo “cerca de” inclui o valor estabelecido (por exemplo, “cerca de 1 %” inclui 1 % bem como alterações mínimas do mesmo).

[0218] Faixas podem ser expressadas nesta divulgação como de “cerca de” um primeiro valor particular e/ou a “cerca de” um segundo valor particular. Quando uma tal faixa é expressada, um outro aspecto incluindo do primeiro valor particular e/ou ao segundo valor particular é também considerado. Similarmente, quando valores são expressados como aproximações, pelo uso de “cerca de”, é entendido que o valor particular formas um outro aspecto. É entendido ainda que os pontos finais de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto final quanto independentemente do outro ponto final. Também é entendido que existem vários valores divulgados nesta divulgação e que cada valor é também divulgado como “cerca” daquele valor particular além do valor propriamente dito. Também é entendido que por todo o pedido, os dados são fornecidos em vários formatos diferentes e que estes dados representam pontos finais e pontos de partida e faixas para qualquer combinação dos pontos de dados. Por exemplo, se um ponto de dados particular “10” e um ponto de dados particular “15” são divulgados, é entendido que mais do que, mais do que ou igual a, menos do que, menos do que ou igual a e igual a 10 e 15 são considerados divulgados bem como entre 10 e 15. Também é entendido que cada unidade entre duas unidades particulares são também divulgadas. Por exemplo, se 10 e 15 são divulgadas, então 11, 12, 13 e 14 são também divulgadas.

[0219] Como usado aqui, o termo “compreendendo” é intencionado a significar que as composições e métodos incluem os elementos relatados, mas não excluindo outros. “Consistindo essencialmente em” quando usado para definir composições e métodos, deve significar excluindo outros elementos de qualquer significância essencial para a composição ou método. “Consistindo em” deve significar excluindo mais do que os oligoelementos de outros ingredientes para as composições reivindicadas e etapas do método substanciais. As modalidades definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do escopo desta divulgação. Consequentemente, é intencionado que os métodos e composições podem incluir etapas adicionais e componentes (compreendendo) ou alternativamente incluindo etapas e composições de nenhuma significância (consistindo essencialmente em) ou alternativamente, intencionando apenas as etapas ou composições do método estabelecidas (consistindo em).

EXEMPLOS Exemplo 1: Veia modificada de tecido personalizada (P-TEV)

[0220] Enxertos de P-TEV de porcinos foram preparados e testados in vivo para mostrar sua segurança e praticabilidade. Especificamente, a veia cava do porco foi escolhida como um sistema modelo substituto para imitar o tamanho e a espessura da parede do vaso de uma veia femoral humana.

Preparação de P-TEV

[0221] A veia cava foi recuperada de cadáveres de porco e foi des- celularizada para remover as células e DNA de doador. Brevemente, os segmentos da veia foram perfundidos sequencialmente com Solução de DC 1, Solução de DC 2 e Solução de DC 3, com uma etapa de lavagem usando água estéril entre as diferentes Soluções de DC. Neste exemplo, 24 horas de Triton X, 8h de TNBP e 16h de DNase foram usados. Os segmentos da veia foram depois completamente lavados com Solução de Base de DC e PBS por 1 hora e uma lavagem final de 48 horas. Em seguida, os segmentos da veia foram esterilizados em Solução de Esterilização e foram completamente lavados em PBS (lavagens de esterilização de 1 hora e lavagem final de 48 horas). Cada segmento de veia DC estéril depois foi transferido para um recipiente com um rótulo permanentemente fixo e congelado a -80 °C em PBS. As composições das soluções usadas na descelularização e esterilização foram fornecidas na Tabela 1. Tabela 1: Soluções para descelularização e esterilização

[0222] A acelularidade dos estruturas de vaia descelularizada foi ve rificada por histologia com coloração com Hematoxilina e Eosina (H&E) e coloração com 4‘,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Especificamente, os pontos azuis na coloração com H&E, representando os núcleos, foram observados nas veias não processadas mas não nas amostras desce- lularizadas. Similarmente, a fluorescência de DAPI, indicando DNA, foi detectável nas veias não processadas mas não nas amostras descelu- larizadas. O teor de DNA dos segmentos de veia descelularizada também foi avaliado usando um fluorômetro Qubit™. O teor médio do DNA de filamento duplo (dsDNA) das amostras antes da descelularização foi 152 ng por mg de tecido, com um erro padrão da média (SEM) de 32 ng/mg. Depois da descelularização, as amostras continham 0,5 ng de dsDNA por mg de tecido, com um SEM de 0,04 ng/mg, que foi cerca de 0,3 ± 0,03 % do material não processado. Portanto, a descelularização tornou os estruturas venosos substancialmente isentos de DNA.

[0223] Para recondicionar/recelularizar os estruturas venosos, amostras de sangue total periférico (PWB) foram tomadas de porcos receptores por punção venosa de rotina em estéril tubos de vidro vacu- tainer BD de 10 mL contendo 17 IU/mL de heparina sódica. O PWB foi misturado com um solução de perfusão de órgão ex vivo (solução STEEN™) em uma razão a 1:1 e suplementado com 10 ng/mL de FGF- 2 humano recombinante (rhFGF-2), 80 ng/mL de VEGF humano recom- binante (rhVEGF) e 5 μg/mL de ácido acetilsalicílico, gerando desse modo uma suspensão de sangue autóloga. O recondicionamento/rece- lularização foi realizado em um biorreator fechado. Depois da pré-lavagem com PBS e pré-tratamento com heparina, os estruturas venosas foram continuamente perfundidos com a suspensão de sangue em re- circulação fechada por 7 dias. Durante a perfusão, o nível de glicose na suspensão de sangue foi mantido entre 3 e 11 mmol/L. Sob estas condições, os componentes celulares e outros componentes da suspensão de sangue autóloga preencheram novamente os estruturas venosas. Cirurgia

[0224] As P-TEVs recondicionadas/recelularizadas foram implantadas nos porcos receptores por cirurgia. Especificamente, uma incisão foi feita através da linea alba. Uma técnica convencional para localizar a veia cava foi usada para os primeiros dois porcos: os intestinos foram mantidos à parte com gaze umedecida em solução salina e ganchos cirúrgicos e a parte da veia cava entre vena renalis e a bifurcação para a vena femoralis foi dissecada livre do tecido adjacente. Devido à formação de adesão intestinal em um destes dois animais, uma técnica retroperitoneal, melhorada foi usada para localizar a veia cava nos outros seis porcos (quatro implantados com P-TEV, dois submetidos à cirurgia de forma simulada): o peritônio e a parede abdominal foram separados descendo até a veia cava no lado direito, desse modo deixando os intestinos intactos. Para o transplante de porcos com P-TEV, a veia cava foi cortada e uma P-TEV de aproximadamente 4 cm foi ligada com anastomoses de extremidade a extremidade. Nos portos operados de forma simulada, a tensão da veia não permitiu cortar e suturar em dois locais como com os transplantes de P-TEV. De fato, a veia cava foi cortada e suturada com uma anastomose.

[0225] Durante a cirurgia, os porcos foram sedados com tiletamina, zolazepam e medetomidina e depois intubados para anestesia com iso- flurano. Buprenorfina foi fornecido durante a cirurgia para alívio da dor pós-cirúrgica. Para prevenir a coagulação e a trombose, todos os porcos foram tratados peroralmente com 160 mg de ácido acetilsalicílico uma vez ao dia por uma semana antes da cirurgia e com 2 mg/kg de rivaroxaban duas vezes por dia a partir de um dia pré-cirurgia antes da eutanásia. Adicionalmente, heparina 10.000 IU foi administrada intravenosamente durante a cirurgia.

Condições dos porcos depois da cirurgia

[0226] Dois porcos desenvolveram adesão intestinal depois da cirurgia e tiveram que ser eutanasiados antes do ponto final planejado devido aos sintomas de obstrução total do intestino. Um foi um porco com P-TEV em que a veia cava foi localizada com a técnica convencional. Ele teve que ser eutanasiado 16 dias antes da cirurgia e os intestinos mostraram adesões massivas na dissecação. O outro foi um porco simulado eutanasiado 7 dias após a cirurgia. O peritônio deste porco rompeu durante a cirurgia e os intestinos tiveram que ser manejados com gaze umedecida e ganchos como com a técnica convencional.

[0227] Nenhuma adesão intestinal foi observada durante as dissecações dos outros seus porcos. Entre estes seis animais, um porco simulado e três porcos com P-TEV foram eutanasiados no ponto final planejado de 4 a 5 semanas após a cirurgia. Dois porcos com P-TEV tiveram que ser eutanasiados mais cedo devido a complicações não relacionadas ao transplante de veia cava. Um foi eutanasiado 3 dias antes da cirurgia, porque as suturas da parede abdominal se rompem. O outro foi eutanasiado 17 dias antes da cirurgia por causa de uma fratura no joelho na perna frontal esquerda.

Caracterização das P-TEV transplantadas

[0228] Angiografia foi realizada sob anestesia antes da euthanasia do porco simulado e três porcos com P-TEV que ficaram vivos 4 a 5 semanas após a cirurgia. Fluido de contraste foi injetado em uma veia femoral e a veia cava foi monitorada viva usando um raio X de arco C.Como mostrado nas FIGs. 1A a 1B, a P-TEV (FIG. 1B) e a veia operada forma simulada (FIG. 1A) foram ambas abertas com fluxo de sangue livre.

[0229] A seguir da eutanásia de cada porco, a veia cava foi examinada. As duas veias operadas de forma simulada e seis P-TEVs foram todas abertas com fluxo de sangue livre sem sinal de coagulação ou trombose. Nenhum coágulo de sangue ou trombose foi observado em examinação macroscópica.

[0230] As veias foram depois seccionadas e preparadas para coloração com H&E e cloração com DAPI. Como mostrado nas FIGs. 2A a 2B, no porco com P-TEV (FIG. 2B) eutanasiado 3 dias antes da cirurgia, as células foram observadas no enxerto de P-TEV por coloração com H&E e DAPI. A amostra de 3 dias foi analisada como descrito. As amostras depois de RC foram rotineiramente analisadas igualmente (estas representaram no último estágio de amostras de não P-TEV implantadas). O enxerto de P-TEV foi bem celularizado no porco eutanasiado 17 dias após a cirurgia. Quatro a cinco semanas depois da cirurgia, o número de células na P-TEV (FIG. 2B) pareceu ser igual ao tecido nativo (FIG. 2A). Importantemente, hiperplasia da íntima, uma complicação de potencial maior neste estudo, não foi observada na P-TEV implantada.

[0231] As amostras venosas foram também caracterizadas por imuno-histoquímica. No porco eutanasiado duas semanas antes da cirurgia, as partes proximais, centrais e distais da P-TEV tiveram um número substancial de células e células CD31-positivas podem ser identificadas (FIGs. 3A a 3D). A FIG. 3A mostra a veia cava nativa proximal às anastomoses. As FIGs. 3B a 3D mostram as partes proximais (FIG. 3B), centrais (FIG. 3C) e distais (FIG. 3D) da P-TEV. Pontas de setas indicam células CD31-positivas.

[0232] Em um porco eutanasiado 4 a 5 semanas antes da cirurgia, as partes proximais, centrais e distais da P-TEV tiveram uma densidade celular similar como a veia cava nativa e o lúmen de P-TEV foi coberto com uma camada de endotélio CD31-positiva (FIGs. 4A a 4D). As FIGs. 4A a 4D são uma série de histogramas imunológicos que mostram a cloração com DAPI e imunocloração com CD31 da veia cava quatro semanas após a cirurgia. A FIG. 4A mostra a veia cava nativa proximal às anastomoses. As FIGs. 4B a 4D mostram as partes proximais (FIG. 4B), centrais (FIG. 4C) e distais (FIG. 4D) da P-TEV. Pontas de setas indicam células CD31-positivas.

[0233] A morfologia de células semelhantes ao endotélio que revestem a superfície luminal foi virtualmente indistinguível daquela da veia cava nativa (FIGs. 5A a 5B). As FIGs. 5A a 5B é uma série de imagens em ampliação de 40x que mostram coloração com H&E da veia cava nativa (FIG. 5A) e transplante de P-TEV (FIG. 5B) quatro semanas após a cirurgia. Setas indicam células endoteliais no tecido nativo e células com morfologia semelhante à célula endotelial plaqueada no transplante de P-TEV.

[0234] Em suma, este estudo in vivo sugeriu que as P-TEV foram seguras e factíveis para o transplante venoso.

Exemplo 2: Preparação da solução de perfusão fisiológica:

[0235] 900 ml de Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dul- becco (DPBS) com cálcio e magnésio foi continuamente agitado em 60 rpm em RT. 74 g de Albumina sérica humana foram adicionados lentamente dispondo-se em camadas o pó na superfície do líquido (para evitar a aglomeração) e agitados até que completamente dissolvidos. Formação de espuma foi evitada reduzindo-se temporariamente a rpm. Subsequentemente 6,7 g de dextrano-40 foram adicionados à solução e agitados até que completamente dissolvidos. O pH foi titulado até 7,4 usando NaOH e o volume final foi ajustado para 1000 ml usando DPBS com cálcio e magnésio. A solução de perfusão fisiológica é depois fil- trada estéril usando um filtro estéril de ligação a proteína baixo, aliquo- tada em alíquotas de 25 ml em tubos de 50 ml estéreis e armazenada a 2 a 8°C por até 12 meses.

Exemplo 3: Preparação de uma solução de perfusão fisiológica alternativa (não requerendo HSA caro):

[0236] 25 ml de plasma sanguíneo estéril do paciente foram colocados em um tubo de 50 ml estéril. 1,5 ml de uma slução de estoque de Dextrano-40 filtrada estéril a 100 g/L foram depois adicionados ao plasma e a solução foi agitada cuidadosamente até que completamente misturada. A solução de perfusão fisiológica estéril foi armazenada a 2 a 8°C por até 7 dias.

Exemplo 4: Variações adicionais de solução de perfusão fisiológica preparada:

[0237] DPBS com cálcio e magnésio contendo 70 g/L de HSA, 5 g/L de Dextrano-40 e 11 mmol/L de Glicose.

[0238] DPBS com cálcio e magnésio contendo 40 g/L de HSA e 10 g/L de Dextrano-40.

[0239] Plasma sanguíneo humano contendo 30 g/L de HSA e 5 g/L de Dextrano-40 adicionais.

[0240] Plasma sanguíneo humano contendo 5 g/L de Dextrano-40 adicional e 11 mmol/L de Glicose no total.

[0241] DPBS com cálcio e magnésio contendo 70 g/L de HSA, 5 g/L de Dextrano-60 e 11 mmol/L de Glicose.Exemplo 5: Composições de soluções de perfusão fisiológica co-mercialmente disponíveis:

Exemplo 6: Preparação de um Vaso Sanguíneo Personalizado a partir de uma estrutura Tubular Acelular Preparada por Bioimpres- são

[0242] O Exemplo 1 descreve um método de preparar um vaso sanguíneo personalizado usando uma estrutura tubular descelularizada. Al-ternativamente, um vaso sanguíneo personalizado é preparado a partir de uma estrutura acelular tubular bioimpressa. Brevemente, a estrutura de vaso sanguíneo bioimpressa é preparada em um polímero (natural ou sintético), que é uma forma de gel, forma de esponja, forma de espuma, forma de emplastro ou uma forma semilíquida/fluida. Neste método, uma estrutura polimérica é perfundida com sangue total ou sangue total diluído em uma solução, por exemplo, uma suspensão, que inclui sangue total, para a preparação de um vaso sanguíneo personalizado.

Exemplo 7: Implantação do Vaso Sanguíneo Personalizado

[0243] Um indivíduo em necessidade de um vaso sanguíneo trans plantado é selecionado e um vaso sanguíneo personalizado preparado pelo método fornecido no exemplo 1 ou 2 da presente divulgação é im- plantado/transplantado no indivíduo. A prognose do indivíduo e a recuperação pós-transplante são monitoradas.

[0244] Um vaso sanguíneo personalizado divulgado aqui é usado para o tratamento de várias doenças e transtornos do vaso sanguíneo, tais como trombose venosa profunda (DVT), insuficiência venosa crônica (CVI), varizes, ulceração venosa (por exemplo, ulceração venosa da perna) e câncer de perna recorrente (por exemplo, causado por refluxo venoso profundo e/ou hipertensão venosa).

[0245] Especificamente, um indivíduo tendo uma doença ou transtorno do vaso sanguíneo é selecionado. O vaso sanguíneo personalizado é introduzido ao indivíduo por cirurgia: um segmento de vaso sanguíneo nativo afligido com a doença ou transtorno é removido; o vaso sanguíneo personalizado ou um segmento funcional do mesmo é anas- tomosado ao vaso sanguíneo nativo, substituindo o segmento do vaso sanguíneo nativo que é removido. O vaso sanguíneo híbrido gerado a partir da cirurgia é funcionalmente similar ou equivalente como um vaso sanguíneo nativo e melhora os sintomas incluindo dor prolongada, peso ou cãibra nas pernas, coceira e formigamento, dor que piora ao ficar de pé, dor que melhora quando as pernas são levantadas, inchaço das pernas, vermelhidão das pernas e tornozelos, mudanças da cor da pele em torno dos tornozelos, varizes na superfície (superficial), espessamento e endurecimento da pele nas pernas e tornozelos (lipodermatoescle- rose), úlceras nas pernas e tornozelos e ferida que é lenta para curar nas pernas ou tornozelos.

Exemplo 8

[0246] O processo de recelularização/recondicionamento de uma estrutura tubular acelular para preparar um vaso sanguíneo personalizado envolveu uma pequena amostra de sangue total do paciente.Neste exemplo, o processo de recelularização/recondicionamento envolvendo componentes celulares bem como não celulares (por exemplo, trombócitos, células nucleadas, proteínas, fatores de crescimento, fatores de sinalização, imunoglobulinas) do sangue total são selecionados ou enriquecidos para o uso no processo. Em um exemplo, componentes celulares bem como não celulares do sangue total são combinados com sangue total. Alternativamente, os componentes celulares bem como não celulares do sangue total são usados ao invés do sangue total no processo de recelularização/recondicionamento. O último processo é experimentado por razões relacionadas ao processo e/ou para otimizar a personalização de um vaso sanguíneo. O enriquecimento ou a seleção são realizados usando, por exemplo, centrifugação, centrifugação de gradiente, adesão seletiva, cromatografia, filtração ou separação (FACS, MACS).

Outras modalidades

[0247] Deve ser entendido que embora a divulgação tenha sido descrita em combinação com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente é intencionada para ilustrar e não limitar o escopo da divulgação, que é definida pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações seguintes. Quaisquer definições fornecidas aqui são incluídas para o propósito de entendimento do presente assunto e para construir as reivindicações de patente anexas. As abreviações usadas aqui têm seu significado convencional dentro das técnicas químicas e biológicas.

Claims (24)

1. Método para preparar um vaso sanguíneo personalizado, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma superfície de uma estrutura tubular acelular com uma amostra de sangue total não diluída de um indivíduo em necessidade do vaso sanguíneo personalizado, em que o contato é realizado de 3 a 21 dias.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma população de células na amostra de sangue total preenche a estrutura tubular acelular.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue total compreende um ou mais fatores não celulares, em que um ou mais fatores não celulares do sangue total preenchem a estrutura e em que os fatores não celulares promovem a celularização da estrutura tubular acelular e compatibilidade com o hospedeiro do vaso após o enxerto.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue total compreende ainda um fator antitrombótico.

5. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fator antitrombótico compreende um agente anticoa- gulante.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente anticoagulante compreende heparina ou um dextrano.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a heparina está presente na amostra de sangue total não diluída em uma concentração de cerca de 0,5 IU/mL a cerca de 150 IU/mL no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a heparina está presente na amostra de sangue total não diluída em uma concentração de cerca de 6,7 IU/mL no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dextrano é dextrano-40.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dextrano está presente na amostra de sangue total não diluída em uma concentração de cerca de 1 g/L a cerca de 55 g/L no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

11. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente antitrombótico compreende ácido ascórbico.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ácido ascórbico está presente na amostra de sangue total não diluída em uma concentração de cerca de 0,2 μg/mL a cerca de 200 μg/mL no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ácido ascórbico está presente na amostra de sangue total não diluída em uma concentração de cerca de 5 μg/mL no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

14. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o fator antitrombótico compreende ácido acetilsalicílico.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido acetilsalicílico está presente na amostra de sangue total não diluída em uma concentração de cerca de 0,2 μg/mL a cerca de 200 μg/mL no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido acetilsalicílico está presente na amostra de sangue total não diluída a uma concentração de cerca de 5 μg/mL no início do contato com a superfície da estrutura tubular acelular.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue total compreende ainda igual ou mais do que o nível fisiológico médio da população de um fator de crescimento selecionado a partir do grupo que consiste em: fator estimulador de colônia de macrófagos de granulócitos (GM-CSF), interleucina (IL)- 3, IL-4, neutrófina (NT)-6, pleiotrofina (HB-GAM), midkine (MK), proteína induzível por interferon-10 (IP- 10), fator plaquetário (PF)-4, proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1), RANTES (CCL-5, quimiocina (motivo C-C) ligante 5), IL-8, IGFs, fator de crescimento de fibroblastos (FGF)- l, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, fator de crescimento transformador (TGF)-β, VEGF, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-A, PDGF-B, HB-EGF, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF)-1 e qualquer combinação dos mesmos.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o fator de crescimento é um fator de crescimento de fibroblastos (FGF)-2.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é por um período de 4 a 21 dias.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é por um período de 5 a 21 dias.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é por um período de 6 a 21 dias.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é por um período de 7 a 21 dias.

23. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é por um período de 7 a 9 dias.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o contato é por um período de 3 a 14 dias.