DE3687948T2 - Verfahren und nukleinsaeure zur herstellung von lecithin: cholestrinacyltransferase. - Google Patents

Verfahren und nukleinsaeure zur herstellung von lecithin: cholestrinacyltransferase.

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DE3687948T2 DE8686308624T DE3687948T DE3687948T2 DE 3687948 T2 DE3687948 T2 DE 3687948T2 DE 8686308624 T DE8686308624 T DE 8686308624T DE 3687948 T DE3687948 T DE 3687948T DE 3687948 T2 DE3687948 T2 DE 3687948T2
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Description

    Hintergrund
  • Die Erfindung betrifft die Herstellung von Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Expression von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in einer rekombinanten Wirtszellkultur.
  • Cholesterin peripheren Ursprungs wird durch das Plasma zum Katabolismus in die Leber transportiert. Man nimmt an, daß die Reaktionssequenz, die an diesem Stoffwechselweg beteiligt ist (reverser Cholesterintransport), wichtig für die Homeostase des peripheren Cholesterins (I) ist. Eine Schlüsselkomponente beim Transport und Metabolismus von Cholesterin im Plasma ist dessen Veresterung durch die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase. Dieses Enzym, ein Glycoprotein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von etwa 63000 (2,3) wird aus der Leber in das Plasma-Kompartiment (4,5) sezerniert. Unter physiologischen Bedingungen katalysiert die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase den Transfer von Acylgruppen von der sn2-Position des Lecithins an die 3-OH-Gruppe des freien Cholesterins. Apolipoprotein A-I (apoA-I), das Hauptprotein der Lipoproteine mit hoher Dichte des Plasmas (HDL) ist ein starker Aktivator der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität (6). Die Umwandlung von diffundierbarem Cholesterin in dessen unlösliche Esterform im Plasma ist wichtig, um einen Konzentrationsgradienten zwischen Zellmembranen und Plasma aufrechtzuerhalten. Wenn die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität in vitro oder in vivo inhibiert wird oder einen genetischen Defekt besitzt, wird Cholesterin nicht länger in das Plasma transportiert und häuft sich in den Geweben an (7-9). Während das Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Protein in verschiedenen Laboratorien bis zur Homogenität gereinigt worden ist, ist wenig über dessen Struktur und Wirkmechanismus bekannt. Ferner ist die Reinigung aus natürlichen Quellen teuer, und es besteht das Risiko, daß das Endprodukt durch hinzukommende Viren und dergleichen kontaminiert ist. Zusätzlich wird die Aktivität der natürlichen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, d. h. der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase mit einer identischen Aminosäuresequenz wie die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, die in einer gegebenen Tierart vorhanden ist (oder dessen natürlich vorkommende Allele), nicht leicht modifiziert. Folglich ist es hier eine Aufgabe, ein Verfahren zur ökonomischen Herstellung von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, die von infektiöser Kontamination frei ist, bereitzustellen, das ausreichend flexibel ist, die Herstellung von Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase-Aminosäuresequenzvarianten mit Eigenschaften, die sich von denen der natürlichen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase unterscheiden, zu ermöglichen.
    • Zusammenfassung
  • Die obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem man (a) einen Vektor, der eine für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codierende Nukleinsäure enthält, konstruiert; (b) eine Wirtszellkultur mit dem Vektor von Stufe a) transformiert; (c) den Transformanten von Stufe b) züchtet, um Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in der Kultur anzuhäufen; und (d) die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase aus der Kultur gewinnt.
  • Die Erfinder haben cDNA-Clone mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in voller Länge konstruiert und sequenziert, die vollständige translatierte Aminosäuresequenz des reifen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Proteins und dessen Leader-Prepeptid bereitgestellt und Verfahren zu dessen Expression in einer rekombinanten Zellkultur bereitgestellt. Überraschenderweise wurde dieses Enzym trotz der kritischen Rolle, die Cholesterin und andere Lipide bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Zellmembran spielen, in der rekombinanten Zellkultur in einer enzymatisch aktiven Form ohne offensichtliche Toxizität für die Wirtszelle exprimiert.
  • Es werden Verfahren zur Herstellung von Aminosäuresequenzvarianten der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase bereitgestellt, die verbesserte Eigenschaften, wie erhöhte oxidative Stabilität, verringerte Empfindlichkeit gegenüber proteolytischer Hydrolyse in der Zellkultur oder bei der Therapie in vivo und Modifikation der Bindungseigenschaften des Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase-Apolipoproteins und -Cofaktors zeigen.
  • Die hier identifizierte DNA, die mit der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase in Zusammenhang steht, wird in Hybridisierungs-Assays zur Identifizierung des Restriktionsenzym-Polymorphismus bei Herzerkrankung verwendet.
  • Solche Assays sind nützlich zum Screening auf pränatalen angeborenen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Mangel und die Prädisposition für Herzerkrankungen bei Erwachsenen.
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird in therapeutisch wirksamen Dosen Patienten mit Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Mangel, d. h. solchen mit angeborenen Mängeln, Nierenerkrankung im Endstadium oder Hepatitis, in physiologisch annehmbaren Trägern verabreicht. Die Plasma- Cholesterin-Spiegel werden durch die durch Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase vermittelte Mobilisierung von Plasma-Cholesterin in Lipoproteine mit hoher Dichte und deren Entfernung aus dem Blutstrom erniedrigt. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ist vermutlich auch nützlich, die Mobilisierung von Cholesterin aus atherosclerotischen Plaques zu unterstützen, ebenso wie bei der Mobilisierung von Cholesterin aus anderen Geweben.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 zeigt die menschliche Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-mRNA, die Positionen der genomischen und cDNA-Clone und die Restriktionsenzym-Schnittstellen. Menschliche Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-RNA, wie von den cDNA-Clonen abgeleitet, ist unter einem Größenmaßstab in Nukleotiden angegeben. Die Transkriptionsrichtung verläuft von links nach rechts. Die Besonderheiten der mRNA sind: 5'-untranslatierte Region (abgeschätzte Größe, als gepunktete Linie gezeigt), codierende Region für das Leader-Peptid (schraffierte Box), reife Codierungs-Region (offene Box) und 3'-untranslatierte Region, die in einer Polyadenylierungsstelle endet (Linie mit Balken). Alle Schnittstellen für die Restriktionsenzyme S (SstI), T (TagI), K (KpnI), Sc (ScaI) und P (PstI) sind gezeigt. Unter dieser Linie zeigen fünf horizontale Balken den Umfang der cDNA-Clone, die in den Beispielen weiter beschrieben sind. Beide Stränge der Clone pL4 und 12 wurden vollständig sequenziert, während der Umfang der Clone pL2, 10 und 19 nur C-Reaktionen unterworfen wurde. Schraffierte Balken an der Grundlinie zeigen Regionen genomischer Clone, die sequenziert wurden, um die terminalen Regionen der Gene zu erhellen.
  • Fig. 2a zeigt die Aminosäure-Nukleotidsequenz für eine cDNA, die natürliche menschliche Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA codiert. Die Nukleotide (links jeder Reihe) sind vom 5'-Ende des cDNA-Clons pL12 numeriert. Die vollständige vorhergesagte Aminosäuresequenz der Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase ist über der DNA-Sequenz gezeigt. Negative Aminosäurezahlen (über den Resten) beziehen sich auf das angenommene Leader- Prepeptid, wohingegen positive Zahlen sich auf das reife Protein beziehen. Die vier vorhergesagten N-verknüpften Glycosylierungsstellen sind überstrichen, und die Spanne von sechs Resten (umgeben von hydrophilen Regionen), die mit der Bindungsstelle an der Grenzfläche der Schweinepankreas-Lipase identisch ist, ist mit einer Box umgeben. Doppelte Unterstreichungen zeigen das konservierte Hexanukleotid für das Polyadenylierungssignal. Poly(A)- Schwänze verschiedener Länge treten an der gleichen Stelle in vier cDNA- Clonen auf. Die Einfachunterstreichungen zeigen die Aminosäuresequenzen, die durch N-terminales Sequenzieren ebenso wie durch Peptidanalyse nach tryptischer Hydrolyse erhalten worden sind.
  • Fig. 2b zeigt die genomische Sequenz, die von Clonen des Bakteriophagen Lambda erhalten wurde und die an den 5'- bzw. 3'-Enden der cDNA überlappen. 5-flankierende Nukleotide sind willkürlich vom 5'-Ende der verfügbaren Sequenz numeriert. Die aminoterminale Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase-Proteinsequenz ist wie in Fig. 2a numeriert. Stoppcodons in allen drei Leserastern sind unterstrichen. Das erste Stoppcodon im Leseraster stromaufwärts ist das TGA der Nukleotide 121-124. Die 3'-flankierenden Nukleotide und die Carboxylterminalen Peptide sind wie in Fig. 2a numeriert. Das Hexanukleotid für das Polyadenylierungssignal ist zweifach unterstrichen, und die Stelle der Anheftung des Poly(A)-Schwanzes ist einfach unterstrichen.
  • Fig. 3 zeigt den Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Expressionsvektor pSVLCAT.1. E bezeichnet den frühen SV40-Promotor. Die Transkriptionsrichtungen sind durch Pfeile gekennzeichnet.
    • Ausführliche Beschreibung
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ist für die Zwecke der Erfindung als ein Protein mit der in Fig. 2a angegebenen Aminosäuresequenz und deren Aminosäuresequenzvarianten einschließlich natürlich vorkommender Allele und Varianten mit vorbestimmten Deletionen, Insertionen oder Substitutionen eines oder mehrerer Reste, die entweder enzymatisch aktiv bezüglich der Veresterung von Cholesterin sind oder die enzymatisch inaktiv sind, aber immunologisch eine Kreuzreaktion mit einem Antikörper, der enzymatisch aktive Lecithin-Cholesterin-Acyltranferase binden kann, zeigen, definiert.
  • Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Varianten, die eine immunologische Kreuzreaktion zeigen können, können kompetitiv die Bindung einer enzymatisch aktiven Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase mit polyClonalen Antiseren gegen die enzymatisch aktive Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase inhibieren. Solche Antiseren werden auf übliche Weise hergestellt, indem man Ziegen, Vögeln, Kaninchen oder anderen Arten s.c. Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase in voll ständigem Freund'schem Adjuvans injiziert und anschließend intraperitoneale oder s.c.-Boosterinjektionen in unvollständigem Freund'schem Adjuvans verabreicht.
  • Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Varianten, die nicht enzymatisch aktiv sind, aber die eine Kreuzreaktion mit Antiseren gegen enzymatisch aktive Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase zeigen können, sind (a) als ein Reagens im diagnostischen Assay auf Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder als Antikörper gegen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase; (b) bei Insolubilisierung gemäß bekannten Verfahren als Mittel zur Reinigung von Anti-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Antikörpern aus Antiseren oder zur Bindung von Proteinen aus Plasma; und (c) als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern gegen enzymatisch aktive Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nützlich.
  • Die Aminosäuresequenz von Fig. 2a ist die einer Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase. Wenn Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, beispielsweise in Prokaryonten, die mit DNA codierend für Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase transformiert sind, die die reife Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase aus dem Säuger-Präprotein nicht verarbeiten und sezernieren, transformiert worden sind, synthetisiert wird, ist es bevorzugt, Wirtszellen zu transformieren, die ein solches Processing vornehmen können, um reife Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase im Kulturmedium oder dem Periplasma der Wirtszellen zu erhalten. Typischerweise können höhere eukaryotische Wirtszellen, wie Säugerzellen, Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase weiterverarbeiten und reife Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach Transformation mit DNA codierend für Prä-Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase sezernieren.
  • Alternativ wird sezernierte reife Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase durch Ligierung von 5'-DNA, die reife Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase codiert, an das 3'-Ende von DNA, die eine Signalsequenz, die dem Wirt homolog ist, codiert, erhalten, und diese Konstruktion wird zur Transformation von Wirtszellen verwendet. Der Ausdruck "homolog" bedeutet, daß die in Frage kommende Sequenz die eine Proteins oder Polypeptids, das normalerweise innerhalb der Wirtszelle vorkommt, ist. In diesem Fall wird die Wirtszelle das exprimierte Fusionsprotein durch proteolytische Spaltung der Peptidbindung zwischen der Signalsequenz und dem Phe&sub1; der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase verarbeiten und danach die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in das Periplasma der Wirtszelle oder in das Medium, je nach der in Frage kommenden Wirtszelle, sezernieren. Beispielsweise wird bei der Konstruktion eines prokaryotischen Expressionsvektors der sekretorische Leader der menschlichen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase durch Leader der bakteriellen alkalischen Phosphatase oder des hitzestabilen Enterotoxins II ersetzt, und bei Hefe wird der Leader der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase durch Leader der Hefe-Invertase, des alpha-Faktors oder der sauren Phosphatase ersetzt. Jedoch wird der sekretorische Leader der menschlichen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase von höheren heterologen eukaryotischen Zellen erkannt. Gram-negative Organismen, die mit einem homologen Signal-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase- Fusionspeptid transformiert sind, sezernieren reife Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase in das Periplasma der Zelle, wohingegen Hefe oder Bacillus sp. reife Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in Kulturmedium sezernieren.
  • Aminosäuresequenzvarianten sind Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Species, in denen mindestens ein Aminosäurerest deletiert, insertiert oder durch einen anderen Rest substituiert ist. Solche Varianten werden hergestellt, um die Eigenschaften des Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Enzyms zu modifizieren, um seine therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen und um dessen Herstellung in einer rekombinanten Zellkultur zu erleichtern. Typische Varianten werden hergestellt, die beispielsweise gegenüber proteolytischer Hydrolyse, die in einigen rekombinanten Zellkulturen oder im Kreislauf der Patienten, denen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase verabreicht wird, vorkommen kann, beständig sind, indem die Proteolysestellen nicht länger empfindlich gegenüber proteolytischem Angriff gemacht werden. Dies wird geeigneterweise durch Deletieren oder Substituieren von Argininyl- oder Lysinyl-Resten durch andere Reste oder durch Insertieren von Prolylresten nach solchen Argininyl- oder Lysinyl-Resten erreicht.
  • Andere Varianten sind beständig gegenüber Glycosylierung (durch Deletion oder Substitution von Asparaginylresten in Asn-X-Thr-Glycosylierungsstellen oder werden an neuen vorbestimmten Stellen glycosyliert (durch Insertionen oder Substitutionen), um eine Asn-X-Thr-Stelle zu schaffen. Es werden auch Varianten erzeugt, die die katalytische Aktivität des Enzyms variieren, z. B. die dessen Substratspezifität verbreitern oder dessen Turnoverzahl erhöhen, was mit einer Deletion oxidativ labiler Reste im Enzym verbunden ist, und die in ihrer Fähigkeit an Apolipoprotein D und andere Proteine einschließlich Zelloberflächenrezeptoren, mit denen die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wechselwirken könnte, zu binden, variieren.
  • Aminosäuresequenz-Varianten von Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder reifer Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase fallen in mehrere Klassen: Deletionen, Insertionen oder Substitutionen. Insertionen umfassen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen ebenso wie Insertionen einzelner Reste oder Polypeptide in die Sequenz. Fusionen umfassen Hybride aus reifer Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase mit Polypeptiden, die mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase homolog sind, einschließlich im Falle von menschlicher Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase sekretorischer Leader aus anderen sezernierten menschlichen Proteinen und Polypeptiden, die mit der Wirtszelle homolog sind, beispielsweise sekretorischer Leader von Wirtszellproteinen und Polypeptide, die sowohl zu der Wirtszelle als auch zu den Arten, von der sich die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ableitete, heterolog sind. Bevorzugte Fusionen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind aminoterminale Fusionen mit entweder prokaryotischen Peptiden oder Signalpeptiden aus Signalsequenzen von prokaryotischen Hefe-, Virus- oder Wirtszellen. Es ist nicht wesentlich, daß die Signalsequenz irgendeine reife Restsequenz aus dem Protein, dessen Sekretion sie üblicherweise bewirkt, aber dies ist bevorzugt, um die Sekretion eines Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase-Fusionproteins zu vermeiden.
  • Andere Insertionen werden in die reife codierende Sequenz der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase eingeführt. Dies sind jedoch üblicherweise kleinere Insertionen als die amino- oder carboxylterminalen Fusionen und zwar in der Größenordnung von 1 bis 4 Resten. Im allgemeinen sollten sie in Paaren eingeführt werden, um die Einführung von Störungen in das Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Molekül zu minimieren. Ein repräsentatives Beispiel ist [Arg&sub3;&sub6; → Arg&sub3;&sub6;&sub2;ProGln&sub3;&sub6;&sub3;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, eine Variante, die wegen ihrer Resistenz gegenüber tryptischer Hydrolyse an dem Arg&sub3;&sub6;&sub2;-Rest ausgewählt wurde. Eine weitere Insertionsvariante ist [Pro&sub1;&sub7;&sub4;Val&sub1;&sub7;&sub5;→Pro&sub1;&sub7;&sub4;Val ValVal&sub1;&sub7;&sub5;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase. Außer anders angegeben, sind die spezifischen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Variationen, die hier beschrieben sind, Variationen in der reifen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Sequenz; sie sind keine Varianten der Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase.
  • Deletionen sind durch die Entfernung einer oder mehrere Aminosäurereste von der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Sequenz gekennzeichnet. Sie werden bevorzugt in Paaren aus den gleichen Gründen wie bei den Insertionen eingeführt. Beispielsweise wird Gly&sub1;&sub7;&sub2;Lys&sub1;&sub7;&sub3;deletiert, um eine Stelle für die Trypsinhydrolyse zu zerstören. Andere Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Deletionsvarianten sind [Glu&sub4;&sub1;&sub1;Pro&sub4;&sub1;&sub2;→Δ]Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase und [Asn&sub2;&sub7;&sub2;Tyr&sub2;&sub7;&sub3;→Δ]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase. Typischerweise werden nicht mehr als etwa 2 bis 6 beste an jeder Stelle in dem Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Molekül deletiert, obwohl eine Deletion der Reste -23 bis -1 einschließlich unternommen wird, um Met-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, eine Variante, die für die intrazelluläre direkte Expression einer Met-reife-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase angenommen wird, zu erhalten.
  • Substitutionsvarianten sind durch die Entfernung eines Zielrests und dessen Ersatz durch eine andere Aminosäure gekennzeichnet. Verglichen mit Deletions- oder Insertionsvarianten können größere Anzahlen von Substitutionen gemacht werden, insbesondere wenn Reste mit ähnlichem sterischem Umfang oder Ladung oder Hydrophobizität gegen den Zielrest substituiert werden. Im allgemeinen gestatten Substitutionen die Feinmodifikation in der Aktivität und den Eigenschaften der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase und zwar mehr, als üblicherweise mit Deletionen oder Insertionen möglich ist. Beispiele für Substitutionen umfassen:
  • [Phe&sub1;&sub7;&sub6;→Tyr&sub1;&sub7;&sub6;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Val&sub1;&sub7;&sub5;→Thr&sub1;&sub7;&sub5;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Lys&sub1;&sub7;&sub3;→Glu&sub1;&sub7;&sub3;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Lys&sub1;&sub7;&sub3;→His&sub1;&sub7;&sub3;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Cys&sub3;&sub5;&sub6;→Ser&sub3;&sub5;&sub6;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Lys&sub1;&sub5;→Asn&sub1;&sub5;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Arg&sub1;&sub5;&sub8;→Trp&sub1;&sub5;&sub8;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Arg&sub2;&sub5;&sub6;→Trp&sub2;&sub5;&sub6;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Arg&sub3;&sub2;&sub3;→His &sub3;&sub2;&sub3;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Arg&sub2;&sub5;&sub6;→Trp&sub2;&sub5;&sub6;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Arg&sub1;&sub4;&sub7;→Trp&sub1;&sub4;&sub7;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Arg&sub1;&sub4;&sub0;→Asn&sub1;&sub4;&sub0;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Lys&sub1;&sub0;&sub5;→His&sub1;&sub0;&sub5;]Lecithin -Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Lys&sub1;&sub1;&sub6;→His&sub1;&sub1;&sub6;]Lesithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Lys&sub1;&sub0;&sub1;→Gln&sub1;&sub0;&sub1;; Lys&sub1;&sub1;&sub6;→Asn&sub1;&sub1;&sub6;; Arg&sub1;&sub4;&sub0;→Asn&sub1;&sub4;&sub0;; Arg&sub1;&sub4;&sub7;→His&sub1;&sub4;&sub7;; Arg&sub1;&sub5;&sub8;→Asn&sub1;&sub5;&sub8;]; Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
  • [Ser&sub1;&sub8;&sub1;→Thr&sub1;&sub8;&sub1;] und
  • [His&sub1;&sub8;&sub0;→Asn&sub1;&sub8;&sub0;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase.
  • Kombinationen von Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen der Aminosäurereste fallen auch unter den Bereich der vorliegenden Erfindung. Beispiele dafür sind [Thr&sub2;&sub2;→Δ; Phe&sub6;&sub7;→Thr&sub6;&sub7;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder [Leu&sub1;&sub8;&sub3;→Val&sub1;&sub8;&sub3;; Leu&sub1;&sub8;&sub5;His&sub1;&sub8;&sub6;→Leu&sub1;&sub8;&sub5;ValValHis&sub1;&sub8;&sub6;]Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase.
  • Aminosäuresequenz-Varianten werden am besten hergestellt, indem man eine Zielstelle, bevorzugt innerhalb etwa der Reste 114-256 und/oder 362-416 einschließlich, auswählt und die Varianten in die Stelle durch Sättigungsmutagenese einführt.
  • Während die Variationsstelle vorbestimmt ist, ist es überflüssig, daß die Variation per se vorbestimmt wird. Um beispielsweise die Durchführung einer Variation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, wird eine Zufallsmutagenese am Zielcodon oder der Zielregion durchgeführt, und die exprimierten Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Varianten werden auf optimale Kombination der gewünschten Aktivität abgesucht. Techniken zur Erzeugung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA mit einer bekannten Sequenz sind gut bekannt, z. B. die M13-Primer-Mutagenese.
  • DNA, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codiert, wird durch chemische Synthese durch Absuchen von reversen Transkripten von mRNA aus Leber oder durch Absuchen von genomischen Banken aus einer beliebigen Zelle erhalten. Angesichts der Länge der DNA, die die Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase codiert, ist es effizienter, eine cDNA-Bank abzusuchen, als die DNA zu synthetisieren. Jedoch ist die Synthese eines Teils des Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Gens vorteilhaft zur Einführung einziger Restriktionsschnittstellen zum Zeitpunkt der Herstellung der DNA, wodurch die Verwendung des Gens in Vektoren, die Restriktionsschnittstellen, die sonst in der nativen Sequenz nicht vorkommen, enthalten, erleichtert wird, und Schritte unternommen werden können, um die Translationseffizienz durch Eliminieren von Stamm- und Schleifenstrukturen zu erhöhen, ohne weiter die DNA für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, beispielsweise durch Mutagenese oder dergleichen, modifizieren zu müssen. Die cDNA, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codiert, ist frei von Introns und flankierender DNA, die andere Proteine codiert und die der Quelle der Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase-DNA homolog ist.
  • Eine cDNA-Bank aus menschlicher Leber wurde auf DNA, die menschliche Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Sequenzen codiert, unter Verwendung von markierten Oligonukleotiden, deren Sequenzen auf der Teilaminosäuresequenz, die aus der Analyse gereinigter menschlicher Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase bestimmt worden war, beruhten, abgesucht. Die DNA, die prä-LCAT oder reife LCAT codiert, und durch Absuchen identifiziert wurde, kann dann (Fig. 2a) mutiert werden, um die vorstehend beschriebenen Aminosäurevarianten der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase zu codieren. Beispielsweise wird die Prä-Sequenz deletiert und ein Startcodon unmittelbar 5' der DNA, die die reife Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codiert, insertiert, so daß die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Kette direkt in der rekombinanten Kultur exprimiert wird.
  • Covalente Markierung dieser DNA wird mit einer detektierbaren Substanz, wie einer fluoreszierenden Gruppe, einem radioaktiven Atom oder einer chemilumineszenten Gruppe nach an sich bekannten Verfahren erreicht. Die markierte DNA wird dann in üblichen Hybridisierungsassays verwendet. Solche Assays werden zur Identifizierung von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Vektoren und Transformanten, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, oder zur in-vitro-Diagnose, wie der Detektion von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-mRNA oder fehlerhafter genomischer DNA in Geweben verwendet.
  • Eine besonders wertvolle Verwendung der mit Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase assoziierten DNA ist die Erleichterung der Identifizierung von Restriktionsenzym-Polymorphismen bei Herzerkrankungen.
  • Allgemeine Verfahren sind bekannt, um Restriktionsenzym-Polymorphismen, die mit Erbkrankheiten, wie Sichelzellanämie (32,33) verbunden sind, zu bestimmen. Mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase assoziierte DNA wird in solchen Verfahren wie folgt verwendet. Genomische DNA oder cDNA wird auf bekannte Weise aus einer Population von Menschen, von denen einige physiologische Anzeichen einer Herzerkrankung oder Atherosklerose zeigen und andere nicht, hergestellt. Bevorzugt werden die Populationen aus der gleichen Familie ausgewählt. Diese DNA wird dann vollständig mit einem ausgewählten Restriktionsenzym abgebaut, und die Fragmente werden durch Elektrophorese getrennt. Die DNA wird dann auf Nitrocellulosefilter überführt und mit einem mit Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase assoziierten DNA-Fragment hybridisiert. Dieses Verfahren ist im allgemeinen als Southern-Hybridisierung bekannt (siehe nachstehend). Personen mit einer erblichen Prädisposition für Atherosklerose zeigen ein unterschiedliches Bandenmuster bei der Southern-Analyse als andere Personen, d. h. sie zeigen einen Restriktionsabbau-Polymorphismus. Beispielsweise ist die Detektion der genetischen Abnormalität, die für Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase Mangel verantwortlich ist, jetzt eine direkte Anwendung des Restriktionsenzym-Polymorphismus, da die vollständige codierende Sequenz der Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase und ihrer flankierenden genomischen Region hier beschrieben wurden.
  • Das Restriktionsenzym, das am zuverlässigsten mit dem Zustand der Atherosklerose in Zusammenhang steht, kann durch das oben beschriebenen Routinescreening identifiziert werden. Geeignete Kandidaten werden aus bekannten Restriktions-endonukleasen (34) ausgewählt.
  • Die Testproben sind bevorzugt Banken lymphozytischer genomischer DNA in dem Lamba-Phagen, obwohl cDNA-Banken aus Leber auch nützlich sind. Die Sonden, die zu ihrer Analyse verwendet werden, umfassen cDNA der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in voller Länge, genomische DNA-Introns der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, nichttranslatierte 5,- und 3'- flankierende Regionen von bis zu 5000 bp und Fragmente davon. Die Größe der Oligonukleotidsonde hängt vom Ziel der Southern-Hybridisierung ab. Wenn die Southern-Hybridisierung das Vorliegen eines Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Allels bestimmen soll, ist die Sonde ausreichend klein, um die Detektion unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen, z. B. niedriger Salzkonzentration und/oder hoher Temperatur, zu gestatten. Beispielsweise ist die Bestimmung einer einzelnen Nukleotidmutation mit der Verwendung einer kleinen Sonde im allgemeinen von etwa 10 bis 20 Basen und hochstringenten Bedingungen verbunden. Andererseits werden wesentliche Deletionen im dem Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Gen durch Sonden entsprechender Deletion detektiert. Die Abwesenheit von Hybridisierung zeigt das Vorliegen des unerwünschten Allels. Während die Sonde keinem speziellen Teil der genomischen DNA, cDNA oder flankierenden Regionen der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase entsprechen muß, ist im allgemeinen jedoch eine DNA bevorzugt, die etwa 30 bis 50 Basenpaaren der DNA codierend für die Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase entspricht oder komplementär dazu ist.
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird in Wirtszellen synthetisiert, die mit Vektoren, die DNA codierend für Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, Met-reife-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Varianten enthalten, transformiert worden sind. Die Vektoren werden verwendet, um die DNA, die die Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase codiert, zu amplifizieren, entweder um Mengen an DNA zum weiteren Verarbeiten (Clonieren von Vektoren) herzustellen oder zur Expression der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (Expressionsvektoren). Ein Expressionsvektor ist ein replizierbares DNA- Konstrukt, in dem eine DNA-Sequenz codierend für eine Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase funktionell an geeignete Kontrollsequenzen, die die Expression der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in einem geeigneten Wirt bewirken können, gebunden ist. Clonierungsvektoren brauchen keine Kontrollsequenzen zur Expression zu enthalten. Solche Kontrollsequenzen umfassen einen Transkriptionspromotor, eine fakultative Operatorsequenz zur Kontrolle der Transkription, eine Sequenz, die geeignete mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen (zur prokaryotischen Expression) codiert, und Sequenzen, die die Beendigung der Transkription und Translation kontrollieren. Expressions- und Clonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, um die stabile Expression der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase zu erleichtern oder zu amplifizieren und/oder um die Transformanten zu identifizieren. Jedoch kann das Selektionsgen zur Aufrechterhaltung der Expression der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase von einem separaten Vektor in Cotransformationssystemen unter Verwendung eukaryotischer Wirtszellen geliefert werden.
  • Die Vektoren umfassen Plasmide, Viren (einschließlich Phagen) und intergrierbare DNA-Fragmente, d. h. Fragmente, die durch Rekombination in das Wirtsgenom integrierbar sind. Die hier zur Verwendung der Expression der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in eukaryotischen Zellen beschriebenen Vektoren enthalten Plasmidsequenzen zur Clonierung in Mikroorganismen, bei denen das Plasmid sich autonom aus dem Wirtsgenom repliziert, aber die DNA sich vermutlich in das Genom der eukaryotischen Wirtszelle nach Transformation integriert. Auf ähnliche Weise sind Bacillusvektoren, die genomisch durch homologe Rekombination in Bacillus integrieren, ebenfalls nützlich. Jedoch sind alle anderen Formen von Vektoren, die eine äquivalente Funktion erfüllen und die einem Fachmann bekannt sind oder bekannt werden, hier geeignet.
  • Geeignete Vektoren enthalten im allgemeinen Replicon- (Replikationsorigins zur Verwendung in nichtintegrativen Vektoren) und Kontrollsequenzen, die sich von Arten, die mit dem beabsichtigten Expressionswirt kompatibel sind, ableiten. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Vektoren, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-DNA enthalten, transformiert oder transfiziert worden sind. Transformierte Wirtszellen enthalten Clonierte DNA, und bei Transformation mit einem Expressionsvektor exprimieren sie auch die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder deren Derivate. Die exprimierte Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird intracellulär abgelagert oder entweder in den periplasmischen Raum oder den Kulturüberstand, je nach der gewählten Wirtszelle und dem Vorliegen von geeigneten Processing-Signalen in dem exprimierten Protein, d. h. homolgen oder heterologen Signalsequenzen, sezerniert.
  • Die DNA-Regionen sind funktionell verbunden, wenn sie in funktioneller Beziehung zueinander stehen. Beispielsweise ist die DNA für eine Prä-Sequenz oder einen sekretorischen Leader funktionell an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Prä-Protein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt. Ein Promoter ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert, oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn sie so angeordnet ist, daß sie die Translation gestattet. Im allgemeinen bedeutet funktionell verbunden, daß die DNA-Sequenzen, die miteinander verknüpft sind, fortlaufend sind, und im Falle von sekretorischen Leadern fortlaufend und im Leseraster sind.
  • Geeignete Wirtszellen sind Prokaryonten, Hefen oder höhere eukaryotische Zellen. Prokaryonten umfassen Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bazillen. Höhere eukaryotische Zellen umfassen beispielsweise etablierte Zellinien von Säugern, wie nachstehend beschrieben. Eine bevorzugte Wirtszelle ist E. coli 294 (ATCC 31,446), obwohl andere Prokaryonten, wie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), E. coli W3110 (ATCC 27,325), Pseudomonasarten oder Serratia Marcesans geeignet sind.
  • Expressionsvektoren für Wirtszellen umfassen üblicherweise einen Replikationsursprung (wenn extrachromosomale Amplifikation gewünscht ist; bei der Clonierung innerhalb der Zelle ist der Ursprung ein bakterieller Ursprung), einen Promoter stromabwärts der codierenden Sequenzen für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase zusammen mit einer Ribosomen-Bindungsstelle (die Ribosomen-Bindungssequenz oder Shine-Dalgarno-Sequenz wird nur bei prokaryotischer Expression benötigt), eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz. Wie erwähnt, ist einem Fachmann klar, daß bestimmte dieser Sequenzen nicht für die Expression in bestimmten Wirten benötigt werden. Ein Expressionsvektor zur Verwendung mit Mikroorganismen braucht nur einen Replikationsursprung, der von dem beabsichtigten Wirt erkannt wird, einen Promoter, der in dem Wirt funktioniert, und ein Gen zur phänotypischen Selektion, beispielsweise ein Gen, das für Proteine codiert, die Antibiotikaresistenz verleihen oder Auxotrophie liefern, zu enthalten. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird typischerweise in E. coli unter Verwendung von pBR322, ein Plasmid, abgeleitet von einer E.-coli-Art, (Bolivar, et al., 1977 "Gene" 2: 95) cloniert. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und ergibt somit ein leichtes Mittel zur Identifizierung transformierter Zellen.
  • Expressionsvektoren sollten im Gegensatz zu Clonierungsvektoren einen Promoter oder eine andere Sequenz zur Erhöhung der Transkription, die von dem Wirtsorganismus erkannt wird, enthalten. Dies ist im allgemeinen ein Promoter, der dem beabsichtigten Wirt homolog ist. Im Falle von Vektoren für höhere Eukaryonten erhöhen Enhancer-Sequenzen häufig die Transkription von den Promotoren. Die am häufigsten bei rekombinanten DNA-Konstruktionen verwendeten Promotoren umfassen die β-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., 1978, "Nature", 275: 615 und Goeddel et al., 1979, "Nature", 281: 544), ein Tryptophan- (trp) Promotersystem (Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057 und die EPA-Anmeldung, Publikationsnummer 36,776) und den tac-Promoter (H. de Boer et al., 1983, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 80: 21- 25). Während diese Promotoren die am häufigsten verwendeten sind, sind auch andere mikrobielle Promotoren geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht, wodurch ein Fachmann sie funktionell mit der DNA, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codiert, in Plasmidvektoren (Siebenlist et al., 1980, "Cell" 20: 269) unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, die irgendwelche benötigten Restriktionsschnittstellen liefern, ligieren kann. Promotoren zur Verwendung in prokaryotischen Expressionssystemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.) Sequenz, die funktionell an die DNA für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase gebunden ist, d. h. die S.D.-Sequenz ist so angebracht, daß sie die Translation erleichtert. Im allgemeinen bedeutet dies, daß der Promotor und die S.D.-Sequenzen, die sich stromabwärts des zweiten Codons eines bakteriellen Strukturgens befinden, durch die Sequenzen der Prä-Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, die 5' zur reifen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase lokalisiert ist, substituiert werden. Das Startcodon kann durch Insertionsmutagenese oder durch das bakterielle Gen geliefert werden.
  • Zusätzlich zur Prokaryonten werden eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefekulturen, mit Vektoren, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codieren, transformiert. Saccharomyces cerevisiae oder übliche Bäckerhefe werden am meisten unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen verwendet. Jedoch ist eine Anzahl von anderen Stämmen im allgemeinen verfügbar und nützlich. Hefevektoren enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung aus dem 2-Micron-Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, eine DNA, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder ihr Derivat codiert, Sequenzen zur Polyadenylierung und zur Beendigung der Transkription und ein Selektionsgen. Ein geeignetes Plasmid für die Expression der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in Hefe ist YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, "Nature", 282: 39; Kingsman et al., 1979, "Gene", 7: 141; Tschemper et al., 1980, "Gene" 10, 157). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm der Hefe, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, enthält, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, "Genetics", 85: 12). Das Vorliegen der trp1-Läsion in dem Genom der Wirtszellhefe liefert dann eine wirksame Umgebung zur Detektion der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Auf ähnliche Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20,622 oder 38,626) durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen tragen, komplementiert.
  • Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, "J. Biol. Chem.", 255: 2073) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, "J. Adv. Enzyme Reg.", 1: 149; und Holland et al., 1978, "Biochemistry", 17: 4900), wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosophat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression sind weiter in R. Hitzeman et al., EP-A-73,657 beschrieben.
  • Andere Hefepromotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer Transkription, die durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, haben, sind Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme im Zusammenhang mit dem Stickstoffmetabolismus und die zuvor erwähnten Metallothionein und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, ebenso wie Enzyme, die für die Verwertung von Maltose und Galactose nützlich sind. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen auch in den Expressionsvektor 3' der codierenden Sequenzen für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ligiert, um die Beendigung und die Polyadenylierung der mRNA zu gewährleisten.
  • Zellkulturen, die sich von vielzelligen Organismen ableiten, sind hier bevorzugte Wirtszellen. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur verwendbar, sei es von Säugervertebraten- oder Invertebratenkulturen. Die Vermehrung der Vertebraten-Zellen in Kultur per se wurde in den vergangenen Jahren zu einem Routineverfahren [Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973)]. Beispiele für nützliche Säugerwirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Ovarzelllinien des chinesischen Hamsters (CHO) und W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien.
  • Die Kontrollsequenzen der Transkription und Translation der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in Expressionsvektoren für Vertebraten- Zellen werden bevorzugt aus viralen Quellen geliefert. Beispielsweise leiten sich üblicherweise verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2 und am bevorzugtesten dem Simian Virus 40 (SV40) ab. Die frühen und späten Promotoren von SV40 sind besonders nützlich, weil sie leicht aus dem Virus als Fragment, das auch den viralen SV40-Ursprung zur Replikation enthält, erhalten werden (Fiers et al., 1978, "Nature", 273: 113). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können auch verwendet werden, vorausgesetzt, daß die ungefähr 250 bp lange Sequenz, ausgehend von der Hind III-Schnittstelle gegen die Bgl I-Schnittstelle, die am viralen Replikationsursprung lokalisiert ist, eingeschlossen ist. Ferner ist es auch möglich, den genomischen Promotor der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, die Kontroll- und/oder Signalsequenzen, die normalerweise mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase assoziiert sind, zu verwenden, vorausgesetzt daß solche Sequenzen mit der Wirtszelle kompatibel sind und von ihr erkannt werden.
  • Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors, so daß er einen exogenen Ursprung einschließt, erhalten werden, wie von dem SV40 oder anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) erhalten wird, oder kann von dem chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle integriert wird, ist das zuletzt Genannte oft ausreichend.
  • Eher als die Verwendung von Vektoren, die virale Replikationsorigins enthalten, werden Säugerzellen mit DNA, die eine selektierbaren Marker codiert und DNA, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase oder ihr Derivat codiert, cotransformiert. Ein Beispiel für einen geeigneten selektierbaren Marker ist die Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder die Thymidinkinase. Solche Marker sind Proteine, im allgemeinen Enzyme, die die Identifizierung der transformierten Zellen, d. h. Zellen, die kompetent gemacht wurden, Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-DNA aufzunehmen und die Amplifikation der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-DNA ermöglichen. Im allgemeinen erfolgt die Identifizierung durch das Überleben der Transformanten im Kulturmedium, das für die nichttransformierten Zellen toxisch ist, oder von dem die Zellen einen kritischen Nährstoff ohne vorherige Aufnahme des Markerproteins nicht aufnehmen können.
  • Die Amplifizierung wird durch Züchten der identifizierten Transformanten in Zyklen von stets zunehmendem Selektionsdruck (im allgemeinen Erhöhung der Konzentration der toxischen Komponente) durchgeführt.
  • Bei der Selektion einer bevorzugten Säugerwirtszelle zur Transfektion mittels Vektoren, die DNA-Sequenzen, die sowohl für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase als auch die DHFR codieren, umfassen, ist es geeignet, den Wirt je nach der Art des verwendeten DHFR-Proteins zu selektieren. Wenn Wildtyp-DHFR-Protein verwendet wird, ist es bevorzugt, eine Wirtszelle zu selektieren, die bezüglich DHFR defizient ist, was somit die Verwendung der codierenden Sequenz für DHFR als Marker für die erfolgreiche Transfektion in einem Selektivmedium, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt, gestattet. Eine geeignete Wirtszelle in diesem Fall ist eine bezüglich der DHFR-Aktivität defiziente Zelllinie des chinesischen Hamsters (CHO), die wie von Urlaub und Chasin, 1980, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 77, 4216 beschrieben, hergestellt und vermehrt wurde.
  • Wenn andererseits DNA, die für DHFR-Protein mit niedriger Bindungsaffinität für Methotrexat (MTX) codiert, als Kontrollsequenz verwendet wird, ist es nicht notwendig, DHFR-resistente Zellen zu verwenden. Weil die mutierte DHFR resistent gegenüber MTX ist, können MTX-haltige Medien als Mittel zur Selektion verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Wirtszellen selbst MTX-sensitiv sind. Die meisten eukaryotischen Zellen, die MTX absorbieren können, scheinen Methotrexat-sensitiv zu sein. Eine solche nützliche Zellinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
  • Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in einer rekombinanten Vertebraten-Zellkultur geeignet sind, sind in M-J. Gethin et al., "Nature", 293: 620-625 (1981), N. Mantei et al., "Nature" 281: 40-46; und A. Levinson et al., EP-A 117,060 und EP-A-117,058 beschrieben.
  • Die Expression der menschlichen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in einem nichtmenschlichen rekombinanten Wirt oder in eukaryotischen Mikroorganismen führt zu einer menschlichen Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase als ein Verfahrensprodukt der rekombinanten Zellkultur, das nicht mit seiner nativen Glycosylierung assoziiert ist. Die prokaryotische Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ist vollständig unglycosyliert.
  • Die mit Vektoren, wie vorstehend beschrieben, transformierten Wirtszellen werden in Nährmedien gezüchtet, bis sich die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in der Kultur anreichert. Es kann vorteilhaft sein, die Wirtszellen in einem Medium, das Cholesterin oder andere Lipide enthält, zu züchten. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase enthält wie andere katalytische Faktoren, die mit Lipiden wechselwirken (23-27), eine Lipidbindungsstelle "an der Grenzfläche" und verschiedene andere Domänen, die ausgedehnte lineare Sequenzen aus hydrophoben Aminosäuren enthalten. Wirtszellen, die an den Cholesterin- und/oder Lipidstoffwechsel akklimatisiert oder angepaßt sind, z. B. prokaryotische oder eukaryotische Mikroorganismen, die auf Cholesterin oder Lipiden wachsen können, können besser an die Expression und/oder Sekretion von lipophilen Enzymen einschließlich der Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase angepaßt sein. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird intrazellulär lokalisiert sein, wenn sie direkt exprimiert wird, d. h. ohne einen sekretorischen Leader und man testet so Einschlußkörperpräparate oder lösliche Extrakte lysierter Zellen auf Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität. Kulturmedien oder periplasmatische Flüssigkeiten werden in an sich bekannter Weise gewonnen, wenn die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase sezerniert wird. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Assays sind gut bekannt, vergleiche das nachstehende Beispiel 5. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird aus den gewonnenen Extrakten oder Medien nach an sich bekannten Verfahren zur Reinigung von Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase aus Serum oder Plasma (siehe das nachstehende Beispiel 1) gereinigt.
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird in Form von pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Salzen, wie Säureadditionssalzen oder Metall komplexen, z. B. mit Zink, Eisen oder dergleichen (die als Salze für die Zwecke dieser Anmeldung gelten), verabreicht. Beispiele für solche Säureadditionssalze sind Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat und dergleichen. Die intravenöse Verabreichung in isotoner Salzlösung, Phosphatpufferlösungen oder dergleichen ist geeignet.
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase sollte unter der Leitung eines praktischen Arztes verabreicht werden, und pharmazeutische Präparate enthalten üblicherweise eine wirksame Menge des Enzyms zusammen mit einem üblichen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die Dosierung variiert je nach dem speziellen Zweck, für den die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase verabreicht wird, üblicherweise in Dosierungsmengen, die ausreichend sind, den Plasmaspiegel an Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase des Patienten auf mindestens 25% der Aktivität der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in normalem vereinigtem Plasma zu bringen. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase kann zusammen mit Apoproteinen, wie den Apolipoproteinen A-I oder D verabreicht werden.
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wird zweckmäßigerweise aus einem implantierbaren oder auf der Haut haftenden Artikel mit verzögerter Freisetzung verabreicht. Beispiele für geeignete Systeme für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase umfassen Copolymere der L-Glutaminsäure und des gamma-Ethyl-L-glutamats (U. Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22(1): 547-556), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (R. Langer et al., 1981, "J. Biomed. Mater Res." 15: 167-277 und R. Langer, 1982, "Chem. Tech." 12: 98-1-5), Ethlyvinylacetat (R. Langer et al., Id.) oder Poly-D-(-)-³hydroxybuttersäure (EP-A 133,988). Solche Artikel werden subkutan implantiert oder in Kontakt mit der Haut oder den Schleimhautmembranen angebracht.
  • Mit der Ausnahme der nachstehend beschriebenen cDNA-Clone (die als "p" trotz der Tatsache, daß sie Clone des Phagen X sind, bezeichnet werden) werden die Plasmide durch ein vorausgehendes kleines p und/oder anschließende Großbuchstaben oder Ziffern bezeichnet. Die Ausgangsplasmide hier sind im Handel erhältlich und sind öffentlich unbeschränkt verfügbar oder können aus solchen verfügbaren Plasmiden nach veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind andere äquivalente Plasmide auf dem Fachgebiet bekannt und sind für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich.
  • "Abbau" der DNA bedeutet die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen der DNA wirkt. Solche Enzyme werden Restriktionsenzyme genannt, und die Stellen, auf die jedes spezifiziert ist, werden Restriktionsschnittstelle genannt. Die verschiedenen hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und andere Erfordernisse wurden, wie von den Enzymherstellern angegeben, verwendet. Die Restriktionsenzyme werden üblicherweise mit Abkürzungen aus einem Großbuchstaben, an den sich andere Buchstaben für den Mikroorganismus, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde, und dann eine Ziffer, die das spezielle Enzym bezeichnet, anschließend bezeichnet. Im allgemeinen wird etwa 1 ug des Plasmids des DNA-Fragments mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme sind von dem Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC werden üblicherweise verwendet, aber viele variieren gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die abgebaute Nukleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. An den Abbau mit einem Restriktionsenzym schließt sich selten die Hydrolyse der 5'-terminalen Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase an, um zu verhindern, daß sich die zwei durch ein Restriktionsenzym geschnittenen Enden eines DNA-Fragments kreisförmig verbinden oder eine geschlossene Schleife bilden, die die Insertion eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsschnittstelle behindern würde. Außer anders angegeben schließt sich an den Abbau der Plasmide keine 5'-terminale Dephosphorylierung an.
  • Verfahren und Reagentien zur Dephosphorylierung sind gebräuchlich (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, Seiten 133-134).
  • Die "Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Abbau mit Restriktionsenzymen bedeutet Abtrennung der Abbauprodukte auf Polyacrylamid- oder Agarosegel mittels Elektrophorese, Identifizierung des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegen die der Marker-DNA-Fragmente mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des Gelteils, der das gewünschte Fragment enthält, und Abtrennung des Gels von der DNA. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Vergleiche beispielsweise R. Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 9: 6013-6114, und D. Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8: 4057).
  • "Southern-Analyse" ist ein Verfahren, nach dem das Vorliegen von DNA-Sequenzen in einem Abbaugemisch oder einer DNA-haltigen Zusammensetzung mittels Hybridisierung an ein bekanntes markiertes Oligonukleotid oder DNA- Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke hier soll, außer anders angegeben, Southern-Analyse die Abtrennung der Abbauprodukte auf einem 1%igen Agarosegel, Denaturierung und Transfer auf Nitrocellulose nach dem Verfahren von E. Southern, 1975, "J. Mol. Biol." 98: 503-517 und Hybridisierung, wie von T. Maniatis et al., 1978, "Cell" 15: 687-701 beschrieben, bedeuten. "Northern-Analyse" ist ein Hybridisierungsverfahren für mRNA, welches mittels Elektrophorese der RNA in Agarosegelen, die ein Denaturierungsmittel, wie 6% Formaldehyd enthalten, durchgeführt wird, und woran sich der Transfer auf Nitrocellulose und die Hybridisierung, ebenfalls wie in Maniatis et al. beschrieben, anschließen.
  • "Transformation" bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, so daß die DNA replizierbar ist, entweder als chromosomales Element oder als Integration in ein Chromosom. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von E. coli ist das CaCl&sub2;-Verfahren nach Mandel et al., 1970, "J. Mol. Biol." 53: 154.
  • "Ligierung" bezieht sich auf das Verfahren von Phosphodiesterbindungen zwischen doppelsträngigen Nukleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., Id., Seite 146). Außer anders vorgesehen, kann die Ligasierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA- Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug ungefähr äquimolarer Mengen der zu ligiereden DNA-Fragmente durchgeführt werden.
  • "Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet die Isolierung von Plasmid-DNA aus einer mikrobiellen Kultur. Außer anders angegeben, kann das alkalische-/SDS-Verfahren nach Maniatis et al., Id. S. 90, verwendet werden.
  • "Oligonukleotide" sind kurze, einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynukleotide, die chemisch nach bekannten Verfahren synthetisiert werden und dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt werden.
  • Auf alle Literaturzitate wird hier expressis verbis Bezug genommen.
    • Beispiel 1 Reinigung und Sequenzanalyse von menschlicher Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase
  • Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wurde aus normalem menschlichem Plasma (500 ml) nach einer Modifikation der früher beschriebenen Verfahren (10) gereinigt. Die Fraktion zu 1,21-1,25 g/ml wurde nach präparativer Zentrifugation von Plasma in einer NaBr-Lösung (1,24 g/ml) isoliert. Dies wurde durch eine Säule (2,5·20 cm) aus Phenylagarose (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die mit 3M NaCl, 1mM EDTA, pH 7,4 equilibriert worden war, geleitet. Nach Waschen mit 500 ml 3M NaCl-10mM Tris- HCl, pH 7,4 wurde der Phenylagaroseträger weiter mit 0,15M NaCl-Tris-Puffer gewaschen, bis die OD&sub2;&sub8;&sub0; des Eluats < 0,05 betrug. Das verbleibende adsorbierte Protein wurde mit destilliertem Wasser eluiert und auf eine Säule aus DEAE-Cellulose (DE-52, Whatman), die mit 10mM Tris-HCl, pH 7,4 equilibriert worden war, geleitet. Die Säule wurde mit einem NaCl-Gradienten (0- 0,3M NaCl in 10mM Tris-HCl, pH 7,4) eluiert. Die Fraktion, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase enthielt, wurde auf eine Hydroxylapatitsäule (1,5·4 cm) (Biorad, Hydroxylapatit HT), die mit destilliertem Wasser equilibriert worden war, gegeben und mit einem Gradienten von 0-5mM Natriumphosphat, pH 6,8 in 0,15M NaCl eluiert. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-haltige Fraktion wurde gewonnen. Jedes beliebige verbleibende Apolipoprotein D (apo D) wurde, sofern notwendig, entfernt, indem man diese Säulenfraktionen durch eine Immunaffinitätssäule, die einen spezifischen polyclonalen Antikörper gegen apo D in covalenter Bindung an Agarose mittels des cNBr-Verfahrens enthielt, leitete. Das Endprodukt wurde auf seine Reinheit mittels der Gradientengelelektrophorese, bestimmt durch Silberfärbung, beurteilt.
  • Die Aminosäureanalyse wurde auf einem Beckmann-6300-Aminosäureanalysator mit der Ninhydrinreaktion durchgeführt. Die Peptide wurden 24 Stunden in konstant siedender HCl bei 110ºC hydrolysiert. Die NH&sub2;-terminale Sequenzanalyse wurde an nativer Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase an einem Prototyp Gas-/Flüssigphasensequinator mit Trimethylamin, Phenylisothiocyanat und Trifluoressigsäure (TFA) als Reagentien durchgeführt. Die extrahierten Anilinothiazolinon-Aminosäurederivate wurden automatisch in Phenylthiohydantoin-Aminosäuren mit 25%iger wäßriger TFA umgewandelt und auf einer Beckmann-Ultrasphere-Octylsäule getrennt. Die tryptischen Peptide wurden sowohl mittels des Gas-/Flüssigphasensequinators oder einem modifizierten Beckmann-Modell 890B-Sequinator sequenziert. Der tryptische Abbau der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wurde in 0,1M Tris pH 8,0 mit 0,01% Tween 20 bei 37ºC 18 Stunden lang mit einem Enzym-/Substratverhältnis von 1:20 durchgeführt. Das Abbaugemisch wurde auf einer Synchrom RP-4-Säule (4,6 mm·10 cm) chromatographiert. Die Elutionslösungsmittel waren 0,1%ige TFA in Wasser (Lösungsmittel 1) und 1-Propanol, das 0,07%ige TFA (Lösungsmittel 2) enthielt. Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten von 1% Lösungsmittel 1 auf 50% Lösungsmittel 2 bei 25ºC mit einer Flußrate von 1,0 ml/min. unter Verwendung eines Spectra Physics SP8000 HPLC eluiert. Der Efluent wurde auf die Absorption bei 214 und 280 nm nach einem Waters Associates Modell 440-Absorptionsdetektor überwacht.
    • Beispiel 2 Clonierung der cDNA
  • Die allgemeine Strategie zur Isolierung der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase-cDNA in voller Länge begann mit der Bestimmung der limitierten Aminosäuresequenz menschlicher Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, die in Beispiel 1 vorgenommen wurde (vergleiche Fig. 2a). Insbesondere wurden 4 nützliche Abschnitte der Peptidsequenz vom aminoterminalen Ende des intakten Proteins (wie aus menschlichem Plasma isoliert) und von drei inneren Peptidfragmenten, die aus dem Abbau der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase mit Trypsin stammten, erhalten. Bestimmte dieser Peptidsequenzen wurden verwendet, um eine einzelne Oligonukleotidsonde, die eine mögliche Codonauswahl für die geeignete Sequenz darstellte, entwickeln und zu synthetisieren. Unter Verwendung dieser DNA-Sonden wurden offensichtlich cDNA-Clone der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in voller Länge aus einer cDNA-Bank der Leber eines erwachsenen Menschen erhalten ("volle Länge" ist hier so definiert, daß der vollständige codierende Teil für das Protein der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-mRNA wiedergegeben wird). Da cDNA- Clone nicht die vollständigen 5'- und 3'-Enden der mRNAs enthalten können, verfolgten die Erfinder die cDNA-Clonierung unter Isolierung und DNA-Sequenzanalyse genomischer Clone, die die Enden der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase-cDNA-Clone überlappten. Dies ermöglichte die Bestätigung der Interpretation der Erfinder der Lecithin-Cholesterin-AcyltransferasemRNA bezüglich Größe und Sequenz.
  • Doppelsträngige cDNA wurde aus RNA der Leber eines erwachsenen Menschen unter Verwendung der reversen Transkriptase auf bekannte Weise hergestellt und nach S1-Behandlung wurde sie an synthetische Oligonukleotide, die Restriktionsschnittstellen für SalI, SstI, XhoI, und ein EcoRI- überhängendes Ende, wie zuvor beschrieben (11), enthielten, ligiert. Diese DNA wurde in die EcoRI-Schnittstelle von &lambda;gt10 (11,12) insertiert.
  • Die Nukleotidsonden wurden auf der Basis mehrerer der in Beispiel 1 bestimmten Aminosäuresequenzen hergestellt und mit radioaktivem Phosphor am Ende markiert. Diese Arbeit ist in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt Tabelle 1 Peptidsequenz und Oligonukleotidsonden
  • Aminoterminales Ende von LCAT - LCAT.1
  • Die Peptidsequenzanalyse (obere Zeile) führt zur Synthese der einzigartigen langen Oligonukleotidsonden wie gezeigt. (Die tatsächlichen Sonden waren das reverse Komplement dieser Sequenzen, so daß sie zur Hybridisierung an RNA ebenso wie an DNA verwendet werden konnten.) Die entsprechenden Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA-Sequenzen sind in der letzten Zeile gezeigt. In zwei Fällen unterschied sich eine von der cDNA codierte Aminosäure von der Vorhersage von der Peptidsequenzierung (wie in Klammern angegeben).
  • Eine &lambda;-Phagen-Bank (1,5·10&sup6; PFU) mit cDNA (> 500bp) wurde in gt10 wie beschrieben (12,29) hergestellt.
  • Etwa 2 Millionen Phagen aus der cDNA-Bank der Leber eines erwachsenen Menschen mit dem oligo(dT)-Primer in &lambda;gt10 wurden auf vierzig 15-cm- Petriplatten gezüchtet, von denen dreifache Nitrocellulosefilter abgenommen wurden. Die Filter wurden mit unterschiedlichen mit ³²P-endmarkierten Oligonukleotidsonden in 0,75M NaCl, 75mM Trinatriumcitrat, 50mM Natriumphosphat (pH 6,8), fünfmal Denhardts-Lösung, 20% Formamid, 10% Dextransulfat und 20 ug/ml gekochter, mit Ultraschall beschallter Lachssamen- DNA bei 42ºC über Nacht hybridisiert und 2 Stunden in 0,15M NaCl, 15mM Trinatriumcitrat, 0,1% NaDodSO&sub4; bei 43ºC gewaschen. Neunzehn sehr stark hybridisierende doppelt positive Clone wurden auf den Filtern, die mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-4-Sonde hybridisiert und auf Filtern, die sowohl mit den Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-3- und den Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-5-Sonden hybridisierten, beobachtet. Southern Blots in den gleichen Hybridisierungslösungen zeigten etwa 10 getrennte Banden und Northern Blots zeigten eine hybridisierende RNA, die kleiner als 18S war. Nach erneutem Absuchen mit getrennten Sonden rehybridisierten 15 der 19 ausgewählten Plague-Regionen mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-4, 12 auch mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-3 und 4 mit der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-1, wobei die Sonde auf der aminoterminalen Proteinsequenz basierte. Die vier Phagen, die mit der aminoterminalen Sonde hybridisierten, waren die besten Kandidaten für cDNA-Clone in voller Länge und wurden anschließend gereinigt und mittels DNA-Sequenzierung analysiert (zusammen mit einem fünften cDNA-Clon, der anschließend durch erneutes Absuchen der Banken mit DNA-Fragmenten aus dem ursprünglichen Clon gewonnen wurde). Die Fragmente wurden in M13-Phagenvektoren zur DNA-Sequenzierung nach dem Didesoxyketten-Beendigungsverfahren (13) subcloniert. Alle in diesem Bericht dargestellten Sequenzen stammten aus der unabhängigen Analyse der beiden DNA-Stränge. Eine menschliche Genombank in &lambda;Charon 30 (14) wurde mit Restriktionsfragmenten der cDNA-Clone nach Standardverfahren abgesucht.
    • Beispiel 3 DNA-Sequenz der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA
  • Das Ausmaß der fünf Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA- Clone, die sequenziert wurden und die abgeleitete Struktur der Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase-mRNA sind in Fig. 1 gezeigt. Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz und die translatierte Sequenz der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase-cDNA. Die DNA-Sequenzen aller fünf Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase-cDNA-Clone waren ähnlich und unterschieden sich nur im Ausmaß der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-mRNA, die wiedergegeben wurde und in der Länge der Poly(A)-Schwänze. Die zwei längsten Clone pL4 und pL12 wurden vollständig sequenziert, während die C-Reaktionen nur für pL2, 10 und 19 durchgeführt wurden. Die Clone pL2, 4, 10 und 19 enthielten Poly(A)- Schwänze unterschiedlicher Längen (50-90b) an der gleichen Stelle, während pL12 sich nicht bis zurück zu dem Poly(A)-Schwanz erstreckte. Die Clone pL4 und pL12 hatten die weiteste Ausdehnung an dem 5'-Ende. Sie enthielten beide ein Initiatormethionincodon und Codons für eine offensichtliche hydrophobe Leadersequenz, die de aminoterminalen Sequenzen der reifen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase vorausging; die Clone enthielten nur kurze Regionen der 5'-nichttranslatierten Sequenz. Die DNA-Sequenz der unabhängigen Clone pL4 und pL12 waren über etwa 1400 Basenpaare, denen sie entsprachen, identisch und dienten zur Bestätigung der Richtigkeit der Clonierungs- und Sequenzierverfahren. Das 5'-Ende der cDNA enthält ein Startmethionincodon, an das sich ein kontinuierliches offenes Leseraster anschließt, das ein 440-Aminosäure-langes Polypeptid codiert. Die ersten 24 Reste enthalten ein Core hydrophober Aminosäuren und stellen wahrscheinlich ein aminoterminales Sekretionssignalpeptid dar. Daran anschließend folgt die Sequenz (beginnend mit Phe-Trp-Leu) des aminoterminalen Endes des Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Proteins, wie es aus Plasma gereinigt wurde. Das reife Protein enthält 416 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 47090. Man weiß, daß die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ein Glycoprotein ist, das auf einem SDS-Polyacrylamidgel bei Mr 63000 wandert. Frühere Autoren vermuteten einen Kohlenhydratgehalt von 25% und ein abgeleitetes Polypeptidgewicht von etwa 45000 (2). Aus der translatierten DNA-Sequenz lassen sich vier mögliche N-gebundene Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser; Asn-X-Thr) ableiten. Die Glycosylierung an einer dieser Stellen (Rest 272) wurde im Verlauf der Peptidsequenzierung detektiert. Andere mögliche Glycosylierungsstellen bleiben unbestätigt.
  • Das Methionincodon an den Nukleotiden 12-14 (Fig. 2a) initiiert vermutlich die Translation des Präproteins. Auf dieses ATG folgt G und vorhergeht G an den minus-3-Nukleotiden in vernünftiger Übereinstimmung mit Konsensussequenzen nahe dem Translationsstart eukaryotischer mRNA (30).
  • Keiner der von den Erfindern charakterisierten cDNA-Clone enthielt die vollständige 5'-untranslatierte Region der Botschaft. Northern-Blot-Hybridisierung einer Poly(A)&spplus;-RNA aus menschlicher Leber, die mit dem Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase-cDNA-Clon-12 abgesucht worden war, zeigte eine einzige hybridisierende Bande aus 1550±50 Basen. Dies bedeutet; daß Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-mRNA etwa 100 Basen der 5'-nichttranslatierten Sequenz enthält. Die Analyse der Genom-Clone unterstützt diese Vermutung und wird nachstehend beschrieben.
  • Das 3'-Ende der cDNA-Clon-Sequenzen zeigt eine unüblich kurze 3'- nichttranslatierte Region aus 23 Nukleotiden. In der Tat ist das übliche Polyadenylierungssignal AATAAA, das den eukaryotischen Poly(A)-Stellen um 20 bis 30 Nukleotide (19) vorausgeht, teilweise in dem Codon für das Carboxyl-terminale Glutamin (GAA) und in dem Translationsstoppcodon TAA enthalten. Die vier unabhängigen Poly(A)-haltigen Clone wurden von den Erfindern analysiert und enthielten alle Poly(A)-Schwänze an der gleichen Stelle. Northern-Blot-Analyse zeigte kein reichliches Vorliegen von längeren RNA-Species, was nahelegt, daß die vorgeschlagene Lokalisierung die Hauptstelle der Polyadenylierung ist.
    • Beispiel 4 DNA-Sequenz der genomischen Clone der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase
  • Infolge der unvollständigen 5'-Enden und der unüblichen Besonderheiten der 3'-Enden der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA- Clone isolierten und analysierten die Erfinder die entsprechenden Regionen der genomischen DNA. Eine Bank aus einem Sau3A-Teilabbau der menschlichen genomischen DNA in dem Phagen &lambda;Charon 30 (14) wurde mit 3'- und 5'-terminalen SstI-Fragmenten, die aus pL12 gelchromatographisch isoliert worden waren, abgesucht. Fünf hybridisierende Clone wurden gewonnen und alle schienen die vollständige cDNA für die codierende Sequenz, wie durch Restriktionskartierung und Hybridisierungsversuche bestimmt wurde, zu enthalten. Phagen DNA aus einem dieser genomischen Clone, &lambda;L1, wurde mit mehreren Restriktionsenzymen, die 5 oder weniger Basen erkannten, geschnitten, nach Southern geblottet und mit den terminalen Sonden hybridisiert. Beide Sonden hybridisierten mit AluI-Fragmenten mit einer Länge von etwa 400 bp. Mit AluI abgebauter &lambda;L1-DNA in diesem Größenbereich wurde über ein Gel isoliert und in den Bakteriophagen M13 cloniert. Plaques, die mit terminalen SstI- Sonden hybridisierten, wurden isoliert und der Didesoxysequenzierung unterworfen, was zur Sequenz von genomischen Fragmenten, die an den 5,- und 3'- Enden der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA überlappten (Fig. 2b), führte.
  • Die genomische Sequenz erstreckt sich 267 bp 5' des Methionincodons, das vermutlich die Transkription des Präproteins initiiert. Keine ATG-Triplets finden sich in dieser Region, während Stoppcodons in allen drei Leserastern vorkommen. Die genomische 3'-Sequenz erstreckt sich 154 bp über das Stoppcodon hinaus und entspricht der Sequenz der kurzen 3'- nichttranslatierten Region und der Polyadenylierungsstelle, die sich von den cDNA-Clonen ableiten lassen. Keine anderen AATAAA-Sequenzen oder erkannte Varianten dieses Polyadenylierungssignals kommen in dieser Genomregion vor, die sich 134 bp über die Poly(A)-Stelle in den cDNA-Clonen erstreckt.
    • Beispiel 5 =Expression des clonierten Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Gens in COS- 7-Zellen
  • Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA in voller Länge wurde aus den Clonen pL4 und pL12 gewonnen und in ein Expressionsplasmid, das den SV40-Replikationsorigin und einen frühen Promotor enthielt, insertiert, um die Expression der die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codierenden Sequenzen zu bewirken. Der cDNA-Clon pL12 wurde mit EcoRI plus PstI abgebaut und ein etwa 1000 bp langes Fragment, das den 5'-Teil der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-cDNA enthielt, wurde gelchromatographisch isoliert. Auf ähnliche Weise wurde ein etwa 500 bp langes EcoRI/PstI-Fragment von pL4 isoliert, das den 3'-Teil der cDNA enthielt. Diese zwei Fragmente wurden in die EcoRI-Stelle von pUC8 (New England Bio Labs) ligiert, wodurch die vollständige codierende Region für die Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase an ihrer internen PstI-Schnittstelle fusioniert wurde. Dieses intermediäre rekombinante Plasmid wurde mit EcoRI abgebaut, und ein etwa 1500 bp langes Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase cDNA-Fragment wurde isoliert.
  • Das Plasmid pgDtruncDHFR (16) enthält einen SV40-Replikationsorigin und einen frühen Promotor, der die Synthese des Herpes-simplex- Virus-gD-Proteins aus cDNA für das gD-Protein dirigiert. Das Startplasmid enthält auch einen zweiten SV40-Promotor, der die Expression eines DHFR- Gens bewirkt, ebenso wie pML- (35) Sequenzen zur Replikation und zur Arzneimittelselektion in E. coli. Daher dient er als Shuttlevektor, der in E. coli- ebenso wie in Säugergewebszellkulturen wachsen kann. pgDtruncDHFR wurde mit EcoRI abgebaut, und das Vektorfragment wurde isoliert. Das Vektorfragment wurde dann an das allein isolierte 1500 bp lange Fragment ligiert, und das Ligierungsgemisch wurde verwendet, um E. coli-294-Zellen (ATCC 31,446) zu transformieren.
  • Ampicillin-resistente Plasmide wurde selektioniert und auf das Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Gen abgesucht. Eine positiv hybridisierende Kolonie wurde gewonnen und als pSVLCAT.1 bezeichnet. Dieses Plasmid ist in Fig. 3 gezeigt. COS7-Zellen (Affenniere) in einer Dichte von 1,5· 10&sup6; Zellen pro 60 mm Platte wurden in serumfreiem Igelminimalmedium gespült, mit dem Plasmid pSVLCAT (4 ug/ml) und DEAE (200 ug/ml) (17) in dem gleichen Medium 5 Stunden bei 37ºC und 7% CO&sub2; transfiziert, in serumfreiem Wachstumsmedium gespült und in 2,5 ml serumfreiem Wachstumsmedium 60 Stunden lang gezüchtet. (Serumfreies Wachstumsmedium ist ein F-12-Medium das mit 5 mg/ml Insulin und 10 mg/ml Transferring supplementiert ist). Die Überstände wurden entfernt und sofort untersucht. Die Wirksamkeit der Transfektion unter diesen Bedingungen betrug 20%, wobei die Cotransformation mit einem Plasmid, das das Herpes-gD-Oberflächenprotein enthielt, und ein Immunfluoreszenzassay auf gD-Protein verwendet wurden. Kontrollkulturen der COS-7-Zellen wurden der gleichen Transfektion und dem gleichen Wachstumsprotokoll unterworfen, jedoch mit der Ausnahme, daß die pSVLCAT.1-DNA nicht aufgenommen wurde. Kein Versuch wurde zu dieser Zeit unternommen, die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Expression durch Methotrexat-Selektion zu amplifizieren oder zu selektionieren, obwohl dies für maximale Gehalte an Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Expression bevorzugt ist.
  • Die Kulturüberstände wurden auf die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Aktivität, wie zuvor beschrieben (10), untersucht. Kurz, Bläschen mit einer einzelnen Wand wurden mittels einer French-Presse aus einer Suspension aus Eilecithin, frisch nachgereinigten 1,2-³H-Cholesterin (New England Nuclear) und freiem Cholesterin (Gew.-Verhältnis 8:1) in destilliertem Wasser hergestellt. Die spezifische Aktivität des Cholesterins betrug 1,2·10&sup5; dpm/ug. Die Bläschen (100 ug Cholesterin/ml) wurden mit apo A-I (100 ug/ml) 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die aktivierten Bläschen wurden mit einem gleichen Volumen aus 10%igem (Gew./Vol.) umkristallisiertem Humanalbumin in 0,15M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 7,4 vermischt. Anteile des Kulturmediums wurden in einem Gesamtassayvolumen von 0,4 ml zugesetzt, und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an Methanol gestoppt, und dann wurden markierte Cholesterylester mit Chloroform extrahiert. Die Anteile der Chloroformphase wurden auf Silikagelschichten, die in Hexan- Diethylether-Essigsäure 83/16/1 (Vol./Vol./Vol.) entwickelt wurden, fraktioniert. Die Radioaktivität der Cholesterylester wurde mittels Flüssigscintillationsspektrometrie bestimmt. Die Aktivität ist als Picomolcholesterinester synthetisiert pro ml Kulturmedium pro Stunde ausgedrückt.
  • In drei getrennten Versuchen betrug die Aktivität der Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase in dem Medium der transfizierten Zellen durchschnittlich 4±1,9 pmol ml&supmin;¹h&supmin;¹(drei Transfektionen: 6,5, 1,9 und 3,6 pmol ml&supmin;¹h&supmin;¹, die Zelldichte war etwas niedrig in dem zweiten Versuch), während die Aktivität des Mediums der Kontrollzellen, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet worden waren, 0,5±0,4 pmol ml&supmin;¹h&supmin;¹ betrug. Es war keine detektierbare Aktivität in dem Medium, wenn 1,5 mM DTNB, ein bekannter Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Inhibitor (31) in das Assaymedium aufgenommen wurde oder wenn apo A-I nicht vorhanden war. Diese Daten zeigen, daß das Auftreten der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase im Kulturmedium nach Transfektion mit dem Plasmid pSVLCAT.1 induziert wurde und daß diese Aktivität die Eigenschaften des Plasmaenzyms, ausgedrückt als dessen Cofaktorabhängigkeit, und Inhibierung durch Sulfhydrylreagentien besitzt. Dies bestätigt, daß die clonierte cDNA die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase, die in heterologen Zellen als von rekombinanter DNA abgeleitetes Produkt exprimiert wird, codiert.
    • Literaturverzeichnis
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Claims (38)

1. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase mit der Aminosäuresequenz der reifen Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach Fig. 2a, worin eine Aminosäure inseriert, deletiert oder substituiert worden ist.
2. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase-Präsequenz N-terminal an Phe&sub1; inseriert ist und die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase zellfrei ist.
3. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Arginin- oder Lysinrest deletiert worden ist oder durch einen anderen Rest außer Lysin oder Arginin substituiert worden ist.
4. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Prolinrest benachbart zu und stromabwärts eines Arginin- oder Lysinrests inseriert worden ist.
5. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Cysteinrest deletiert worden ist oder durch einen anderen Rest substituiert worden ist.
6. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der substituierte Rest Trp, His oder Gln ist.
7. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Glycosilierungsstelle inaktiviert ist.
8. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Substitution, Insertion oder Deletion zwischen etwa den Resten 114 und 256 einschließlich lokaiisiert ist.
9. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substitution, Insertion oder Deletion zwischen etwa den Resten 362 und 416 einschließlich lokalisiert ist.
10. Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie
[Gly&sub1;&sub7;&sub2;Lys&sub1;&sub7;&sub3;&rarr;&Delta;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Phe&sub1;&sub7;&sub6;&rarr;Tyr&sub1;&sub7;&sub6;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Val&sub1;&sub7;&sub5;&rarr;Thr&sub1;&sub7;&sub5;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Lys&sub1;&sub7;&sub3;&rarr;Glu&sub1;&sub7;&sub3;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Lys&sub1;&sub7;&sub3;&rarr;His&sub1;&sub7;&sub3;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Cys&sub3;&sub5;&sub6;&rarr;Ser&sub3;&sub5;&sub6;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Glu&sub4;&sub1;&sub1;Pro&sub4;&sub1;&sub2;&rarr;&Delta;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Asn&sub2;&sub7;&sub2;Tyr&sub2;&sub7;&sub3;&rarr;&Delta;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Lys&sub1;&sub5;&rarr;Asn&sub1;&sub5;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub1;&sub5;&sub8;&rarr;Trp&sub1;&sub5;&sub8;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub2;&sub5;&sub6;&rarr;Trp&sub2;&sub5;&sub6;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub3;&sub6;&sub2;&rarr;Arg&sub3;&sub6;&sub2;ProGln&sub3;&sub6;&sub3;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub3;&sub2;&sub3;&rarr;His&sub3;&sub2;&sub3;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub2;&sub5;&sub6;&rarr;Trp&sub2;&sub5;&sub6;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub1;&sub4;&sub7;&rarr;Trp&sub1;&sub4;&sub6;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Arg&sub1;&sub4;&sub0;&rarr;Asn&sub1;&sub4;&sub0;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Lys&sub1;&sub0;&sub5;&rarr;His&sub1;&sub0;&sub5;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Lys&sub1;&sub1;&sub6;&rarr;His&sub1;&sub1;&sub6;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Lys&sub1;&sub0;&sub1;&rarr;Gln&sub1;&sub0;&sub1;; Lys&sub1;&sub1;&sub6;&rarr;Asn&sub1;&sub1;&sub6;; Arg&sub1;&sub4;&sub0;&rarr;Asn&sub1;&sub4;&sub0;; Arg&sub1;&sub4;&sub7;&rarr; His&sub1;&sub4;&sub7;; Arg&sub1;&sub5;&sub8;&rarr;Asn&sub1;&sub5;&sub8;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Pro&sub1;&sub7;&sub4;Val&sub1;&sub7;&sub5;&rarr;Pro&sub1;&sub7;&sub4;ValValVal&sub1;&sub7;&sub5;] Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase;
[Ser&sub1;&sub8;&sub1;&rarr;Thr&sub1;&sub8;&sub1;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[His&sub1;&sub8;&sub0;&rarr;Asn&sub1;&sub8;&sub0;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase;
[Thr&sub2;&sub2;&rarr;&Delta;; Phe&sub6;&sub7;&rarr;Thr&sub6;&sub7;] Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase und
[Leu)&sub1;&sub8;&sub3;&rarr;Val&sub1;&sub8;&sub3;, Leu&sub1;&sub8;&sub5;His&sub1;&sub8;&sub6;&rarr;Leu&sub1;&sub8;&sub5;ValValHis&sub1;&sub8;&sub6;] Lecithin- Cholesterin-Acyltransferase ist.
11. DNA-Zusammensetzung umfassend eine Nucleinsäure, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase nach einem der Ansprüche 1 bis 10 codiert.
12. DNA-Zusammensetzung umfassend eine Nucleinsäure, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codiert, die mit der DNA-Sequenz in Fig. 2a, die von Nucleinsäuren, die irgendein anderes Tierprotein codieren, frei ist, hybridisiert und als letzter Ursprung der Lecithin-Cholesterin Acyltransferase codierenden Nucleinsäure dient.
13. DNA nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase, die von einem Intron frei ist, codiert.
14. DNA nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase codiert, die von 5' oder 3' flankierenden Regionen, die andere Tierproteine codieren, frei ist und als letzter Ursprung der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codierenden DNA dient.
15. Replizierbarer Vektor umfassend die DNA nach den Ansprüchen 11 bis 14.
16. Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin einen Promotor zur Kontrolle der Transkription der Nucleinsäure, die die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codiert, umfaßt.
17. Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein viraler Promotor ist.
18. Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin einen Transkriptionsverstärker umfaßt.
19. Im wesentlichen reine Nucleinsäure, die mit der Nucleinsäure nach einem der vorausgehenden Ansprüche hybridisieren kann.
20. Wirtszelle transformiert mit einem replizierbaren Vektor nach einem der Ansprüche 15 bis 18.
21. Wirtszelle nach Anspruch 20, welche Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase exprimiert.
22. Wirtszelle nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase aus der Wirtszelle sezerniert wird.
23. Wirtszelle nach einem Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Prokaryont oder ein höherer Eukaryont ist.
24. Zellkultur enthaltend nichthomologe Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert oder durch eine DNA nach Anspruch 11 oder 12 exprimiert.
25. Zellkultur nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase intrazellulär ist.
26. Verfahren zur Herstellung eines Transformanten, der Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase erzeugen kann, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) einen Vektor umfassend eine Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase codierende Nucleinsäure nach Anspruch 11 oder 12 konstruiert und
b) eine Wirtszelle mit dem Vektor transformiert.
27. Verfahren zur Herstellung einer Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase, dadurch gekennzeichnet daß man
c) Wirtszellen nach einem der Ansprüche 20 bis 23 züchtet, um Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase in der Kultur anzureichern, und
d) die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase aus der Kultur gewinnt.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Cos7-Nierenzelle des Affen ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein phenotypisches Selektionsgen enthält.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle ein prokaryontischer oder eukaryontischer Mikroorganismus ist, der wegen seiner Fähigkeit, Cholesterin als Kohlenstoffquelle zu verwerten, selektiert worden ist.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle in einem cholesterinhaltigen Medium gezüchtet wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase codierende Nucleinsäure 5' im geeigneten Leseraster an die Nucleinsäure, die eine von der Wirtszelle erkannte Sekretionssignalsequenz codiert, ligasiert wird.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Sekretionssignalsequenz viralen Ursprungs ist oder der Wirtszelle homolog ist.
34. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Testprobe der DNA mit einem Restriktionsenzym unter Bildung einer Population von DNA-Fragmenten abbaut, die Fragmente trennt und bestimmt, welche Fragmente an eine mit einer Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase assoziierten Nucleinsäuresonde, die sich von einer DNA, die in natürlichem Zustand mit einer die Nucleinsäuresequenz codierenden mRNA ableitet, binden können, wobei die mRNA mit einer DNA, die der DNA-Sequenz von Fig. 2a komplementär ist, hybridisiert.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuresonde ein Teil des Strukturgens für die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase ist oder innerhalb der etwa 5000 bp langen flankierenden Region des Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Gens liegt.
36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine Länge von etwa 10 bis 50 Nucleotiden besitzt.
37. Markiertes Fragment der mit der Lecithin-Cholesterin- Acyltransferase assoziierten Nucleinsäure, die sich von einem vorbestimmten Teil einer Sonde wie in Anspruch 34 definiert oder einer DNA wie in Anspruch 11 oder 12 definiert ableitet.
38. Markiertes Fragment nach Anspruch 37 mit mindestens 10 Nucleotiden, wobei das Fragment der Sequenz der Fig. 2a oder 2b komplementär ist.
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