DE69031997T2

DE69031997T2 - TNF(Tumor Necrosis Factor)-Inhibitor und Verfahren zur Herstellung

Info

Publication number: DE69031997T2
Application number: DE69031997T
Authority: DE
Inventors: Michael T. Boulder Colorado 80302 Brewer; Karin K. Boulder Colorado 80301 Hale; Michael W. Terre Haute Indiana 47803 King; Tadahiko Louisville Colorado 80027 Kohno; Charles Boulder Colorado 80304 Squires; Robert C. Boulder Colorado 80303 Thompson; Rebecca W. Boulder Colorado 80303 Vanderslice; James Boulder Colorado 80303 Vannice
Original assignee: Amgen Boulder Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1989-07-18
Filing date: 1990-07-17
Publication date: 1998-05-14
Anticipated expiration: 2010-07-18
Also published as: NZ234499A; IL131281A0; EP0422339A1; GR3026416T3; EP0790306A2; HK1014539A1; NO306728B3; AU647397B2; IL95031A0; JPH03163099A; IE990595A1; DK0422339T3; CA2021369A1; PT94754B; ATE162801T1; DE69031997D1; PL286089A1; US6541620B1; FI903591A0; AU5897690A

Description

Hintergrund der Erfindung

Tumomekrosefaktoren sind eine von zahlreichen Zelltypen, einschließlich Monozyten und Makrophagen, hergestellte Klasse von Proteinen. Mindestens zwei TNFs sind bereits beschrieben worden, spezifisch TNF Alpha und TNF Beta (Lymphotoxin). Diese bekannten TNFs haben wichtige physiologische Effekte auf eine Anzahl von verschiedenen Zielzellen, die an der Entzündungsantwort beteiligt sind. Diese Proteine veranlassen sowohl Fibroblasten als auch Synovialzellen Collagenase und Prostaglandin E2, latent abzusondem und veranlassen osteoblastische Zeilen Knochenresorption auszuführen. Diese Proteine steigern die adhäsiven Oberflächeneigenschaften von Endothelialzellen zu Neutrophilzellen. Sie können ebenfalls Endothelialzellen veranlassen eine Aktivität abzusondern, die Gerinnung bewirkt und deren Fähigkeit reduzieren Blutpfropfen zu lysieren. Zusätzlich dirigieren sie durch Inhibieren der Expression des Enzyms Lipoproteinlipase die Fettzellenaktivität von der Lagemng von Lipiden weg. TNFs veranlassen Hepatozyten eine Klasse von Proteinen, bekannt als "akute- Phase-Reaktanten" (acute phase reactants), zu synthetisieren und sie wirken als Pyrogene auf den Hypothalamus. Durch diese Aktivitäten wurde festgestellt, daß TNFs eine wichtige Rolle in der Antwort eines Organismuses auf Streß, auf Infektion und auf Verletzung darstellen. Siehe z.B. Veröffentlichungen von P.J. Selby et al. in Lancet, 27. Febr. 19885. 483; H.F. Stames, Jr. et al. in J. Clin. Invest. 82:1321(1988); A. Oliff et al. in Cell 50:555(1987); und A. Waage et al. in Lancet, 14. Febr. 1987, S. 355.
Trotz der üblicherweise nützlichen Effekte sind jedoch Umstände aufgetreten, in denen die Wirkungen von TNFs schädlich sind. Zum Beispiel löst TNF Alpha, wenn in Tiere injiziert, Symptome für septischen Schock aus; es wurde beobachtet, daß endogene TNF- Konzentrationen nach Injektionen von Bakterien oder Bakterienzellwänden ansteigen. TNFs verursachen ebenso Darmnekrosis und akute Lungenverletzungen und sie stimulieren den Katabolismus von Muskelproteinen. Zusätzlich kann die Fähigkeit der TNFs die Konzentration an Collagenase in einem arthritischen Gelenk zu erhöhen und die Chemotaxis und Wanderung von Leukozyten und Lymphozyten zu dirigieren ebenso für die Knorpeldegeneration und die Proliferation des Synovialgewebes bei dieser Krankheit verantwortlich sein. Daher können TNFs sowohl als Vermittler der akuten als auch der chronischen Stadien der Immunpathologie bei rheumatischer Arthritis dienen. TNFs können ebenfalls für einige Leiden im Zusammenhang mit Blutgerinnseln durch Ändern der Endothelialzeilfunktion verantwortlich sein. Außerdem wurde übermäßige TNF- Produktion bei Patienten mit AIDS nachgewiesen und diese kann verantwortlich sein für einige bei dieser Krankheit und Leukämien beobachten Fieber, Akutphaseantwort und Kachexie.
Unter diesen und anderen Umständen, in denen TNF einen schädlichen Effekt hat, gibt es ganz offensichtlich eine klinische Anwendung für einen Inhibitor der TNF-Wirkung. Systemisch zugeführt würden TNF-Inhibitoren nützliche Therapeutika gegen septischen Schock und Kachexie sein. Lokal angewendet würden solche TNF-Inhibitoren zum Verhindern von Gewebezerstörung in entzündeten Gliedern und anderen entzündeten Stellen dienen. In der Tat könnten solche TNF-Inhibitoren noch effektiver sein, wenn sie zusammen mit Interleukin-I(IL-1)-Inhibitoren verabreicht würden.
Eine Möglichkeit für einen therapeutischen Eingriff gegen die Wirkung von TNF befindet sich auf der Ebene der Zielzellantwort auf das Protein. TNF scheint über einen klassischen, Rezeptor-vermittelten Weg auf Zellen zu wirken. Daher würde jedes Molekül, das die Fähigkeit von TNF an seine Rezeptoren zu binden negativ beeinflußt, die TNF- Wirkung regulieren, entweder durch Blockieren des Rezeptors oder durch Blockieren des TNFs. Aus diesen Gründen wurden Proteine und kleine Moleküle, die in der Lage sind TNF auf diese Weise zu inhibieren, gesucht.
In EP-A-308378 ist ein TNF-inhibitorisches Protein offenbart, das aus menschlichem Urin stammt und sich verhält als hätte es auf einer Ultrogel ACA 44 Gelfiltrationssäule ein apparentes Molekulargewicht von 40 bis 80 kDa. Das Protein hat ein Molekulargewicht von 26 bis 28 kDa wenn es auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert wird. Es wurde gezeigt, daß der N-Terminus des Proteins die folgende Aminosäuresequenz hat: Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-X-Asn-Ser.
Ein Protein, das die N-terminale Aminosäuresequenz Asp-Ser-Val-Cys-Pro hat, wurde ebenfalls in Engelmann et al., J. Biol. Chem. 264,1989, Seiten 11974-11980 offenbart.
Es wurde gezeigt, daß das Protein ein TNF-Inhibitor ist, mit einem apparenten Molekulargewicht von 27.000 kDa auf einem SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen. Das Protein beeinträchtigte die Bindung von TNF Alpha und TNF Beta. Es wurde spezifische Bindung des Proteins an TNF Alpha und in einem geringeren Ausmaß an TNF Beta beobachtet.
Sekinger et al., J. Biol. Chem. 264, Seiten 11966-11973, offenbart einen TNF Alpha- Inhibitor, der mit einem apparenten Molekulargewicht von 43.000 kDa unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen wandert. Es wird keine Aminosäuresequenz zur Verfügung gestellt. Weiterhin offenbart DE-A-3910323 einen TNF Alpha-Inhibitor, der ein Molekulargewicht von 40 bis 60 kDa hat, wenn durch Molekularsiebchromatographie bestimmt, und 33 kDa, wenn durch SDS-PAGE bestimmt. Die N-terminale Aminosäurequenz wurde als Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Cys-Asn- Ser-Ile bestimmt.
In einer weiteren Publikation offenbart Engelmann et al. (J. Biol. Chem. 265,1990, Seiten 1531-1536) zwei TNF-Inhibitoren, die beide ein Molekulargewicht von ungefähr 30.000 kDa haben. Die N-terminale Sequenz dieser Proteine wurde als (I) Asp-Ser-Val- Cys-Pro und (ii) Val-Ala-Phe-Thr-Pro bestimmt, wobei Sequenz (i) unverändert ist und Sequenz (ii) in unterschiedlichem Maße verkürzt ist, so daß Proteine mit den N- terminalen Sequenzen Thr-Pro und Phe-Thr-Pro resultieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung gereinigte Formen eines TNF-Inhibitors, die gegen TNF Alpha aktiv sind, zur Verfügung zu stellen, und die Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz zu ermöglichen. Eine zusätzliche Aufgabe ist es, weitere TNF- inhibitorische Moleküle zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe ist es, Aminosäuresequenzen von bestimmten TNF-Inhibitoren zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung eine zelluläre Quelle der mRNAs, die für TNF-Inhibitoren codieren und eine cDNA Genbank, die eine cDNA für die Inhibitoren enthält, zur Verfügung zu stellen. Weiterhin ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, einen genomischen Klon der DNA, die für die TNF-Inhibitoren codiert und die codierenden Sequenzen dieser DNA zur Verfügung zu stellen.
Das Identifizieren von biologisch aktiven Analogen solcher TNF-Inhibitoren mit verstärkten oder gleichwertigen Eigenschaften ist ebenfalls eine der Aufgaben der Erfindung.
Zusätzlich ist es eine Aufgabe dieser Erfindung ein rekombinantes DNA-System zum Herstellen des hier beschriebenen TNF-Inhibitors zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung schließt das zur Verfügungstellen von gereinigten Formen des TNF-Inhibitors ein, welche einen großen Wert als pharmazeutische Zubereitungen, die Aktivität gegen TNF aufweisen, hätte. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung schließt das zur Verfügungstellen gereinigter Kombinationen von TNF-Inhibitoren und IL-1-Inhibitoren dar, die einen großen Wert als pharmazeutische Zubereitungen, die Aktivität sowohl gegen IL-1 als auch TNF aufweisen, haben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben mindestens zwei TNF-Inhibitorproteine mit TNF-inhibitorischen Eigenschaften isoliert. Ein 30 kDa Protein und ein 40 kDa Protein wurden in ihrer gereinigten Form erhalten. Die Amionsäuresequenz des 30 kDa TNF- Inhibitorproteins wurde ermittelt. Die Aminosäuresequenzdaten des 40 kDa TNF- Inhibitorproteins sind ebenfalls ermittelt worden. Der 40 kDa TNF-Inhibitor ist ein neues, bisher nicht beschriebenes Protein.
Ein menschlicher genomischer DNA Klon, der das Gen des 30 kDa Proteins enthält, wurde ermittelt. Eine zelluläre Quelle dieses Proteins wurde identifiziert und ein cDNA Klon wurde erhalten und die Nucleinsäuresequenz des Gens für dieses Protein wurde bestimmt. Zusätzlich wurde der Genklon in einen Vektor überführt, für den gezeigt wurde, daß er das Protein in einer Wirtszelle exprimiert. Es wurde ebenfalls ein Verfahren zum Reinigen des Proteins in einer aktiven Form entwickelt.
Es wurde eine zelluläre Quelle identifiziert, die das 40 kDa Protein herstellt, ein cDNA Klon wurde erhalten und die Nucleinsäuresequenz des Gens für das 40 kDa Protein wurde bestimmt. Die vollständigen cDNA Klone, die für den 30 kDa TNF-Inhibitorvorläufer und den 40 kDa TNF-Inhibitorvorläufer codieren, wurden in Säugerzellen exprimiert, um eine Erhöhung an TNF-Bindungsstellen auf der Zelloberfläche zu erzielen.
Ein Gen, das für die reife Form des 30 kDa Proteins codiert, wurde in E. coli exprimiert. Drei gesonderte Gene, die für Teile oder das gesamte reife 40 kDa Protein codieren, wurden ebenfalls in E. coli exprimiert. Die drei exprimierten 40 kDa Inhibitorproteine- reifer 40 kDa TNF-Inhibitor, 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53- weisen jeweils TNF-inhibitorische Aktivität auf. Reifer 40 kDa TNF-Inhibitor, wie aus von menschlichen U937 Zellen konditioniertem Medium isoliert und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 werden gemeinsam als 40 kDa TNF-Inhibitor bezeichnet.
Der 30 kDa TNF-Inhibitor hat TNF Alpha-inhibitorische Aktivität gezeigt. Der 40 kDa TNF-Inhibitor hat inhibitorische Wirkung gegen TNF Alpha und TNF Beta gezeigt.
Durch rekombinate DNA-Technolgie wird es nun möglich sein, die Herstellung dieser TNF-Inhibitoren im großen Maßstab durchzuführen. Diese Inhibitoren sollten, zum Gebrauch in pharmazeutischen Formulierungen geeignet sein und zur Behandlung von pathophysiologischen Zuständen nützlich sein, die durch TNF vermittelt werden.

Kurze Beschreibungen der Zeichnunhen

Abb. 1 zeigt einen Cytotoxizitäts-Test für TNF in der Abwesenheit (-.-.) und in der Gegenwart (-x-x-) des TNF-Inhibitors (30 kDa). Verschiedene Konzentrationen von TNF wurden mit und ohne TNF-Inhibitor (30 kDa) inkubiert und der Cytotoxizitäts-Test, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt.
Abb. 2 zeigt einen nativen Gel-Shift-Test in dem "a" TNF alleine bezeichnet, und "b" TNF + TNF-Inhibitor (30 kDa) bezeichnet.
Abb. 3 zeigt Con A-Peroxidasefärbung des TNF-Inhibitors (30 kDa). Ungefähr 200 ng jedes Proteins wurden in einer 14% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter übertragen. Glycoproteine wurden unter Verwendung von Con A-Peroxidasefärbung identifiziert. In dieser Abbildung bezeichnet "a" einen Molekulargewichtsstandard, "b" bezeichnet Ovalbumin, "c" bezeichnet Rinderserumalbumin und "d" bezeichnet den TNF-Inhibitor (30 kDa).
Abb. 4 zeigt die chemische Deglycosylierung des TNF-Inhibitors (30 kDa). Ungefähr 200 ng des TNF-Inhibitors (30 kDa) wurden chemisch deglycosyliert (Spur C), wie in Beispiel 1 beschrieben.
Abb. 5 zeigt N-Glycanasebehandlung des TNF-Inhibitors (30 kDa). Gereinigter TNF-Inhibitor (30 kDa) wurde durch Bolton-Hunter-Reagenz jodiert und denaturierter, jodierter TNF-Inhibitor (30 kDa) wurde für 6 Stunden bei 37ºC mit N-Glycanase behandelt. In dieser Abbildung bezeichnet "a" nativen TNF-Inhibitor (20 kDa) und "b" bezeichnet deglycosylierten Inhibitor (30 kDa).
Abb. 6A zeigt ein OD&sub2;&sub8;&sub0; Profil einer DEAE Sepharose CL-6B Chromatographie von 20 l Urin.
Abb. 6B zeigt eine Autoradiographie des entsprechenden nativen Gel-Shift-Tests, welches ein Maximum an TNF-Inhibitor (30 kDa) in Fraktion 57-63 zeigt, das bei ungefähr 80 mM NACl liegt.
Abb. 7 zeigt ein OD&sub2;&sub8;&sub0; Profil der Elution mit 0,05 M Na Phosphat pH 2,5 der TNF- Affinitätssäule.
Abb. 8A und 8C zeigen die chromatographischen Profile (OD&sub2;&sub1;&sub5; und OD&sub2;&sub8;&sub0;) der RPB Reinigung des TNF-Inhibitors (30 kDa) mit dem L929 Biotest der Fraktionen der RP8 Säule, die ein Maximum des TNF-Inhibitors (30 kDa) bei Fraktionen 28-31 zeigen, welches bei ungefähr 18% Acetonitril liegt und in Fraktionen 35 und 36, welches bei ungefähr 21 % Acetonitril liegt.
Abb. 8B zeigt eine silbergefarbte 5 %-iges SDS-PAGE der vereinigten RPB Fraktionen, welche eine einzige Bande bei 30 kDa zeigen.
Abb. 9A zeigt eine Peptidreinigung des Lys-C Verdaus des TNF-Inhibitors (30 kDa).
Abb. 9B zeigt eine Peptidreinigung von verdauten alkylierten (*) Lys-C Verdauen des TNF-Inhibitors (30 kDa).
Abb. 10 zeigt eine Peptidreinigung von zwei verdauten alkylierten (*) Asp-N Verdauen des TNF-Inhibitors (30 kDa).
Abb. 11A und 11B zeigen Peptidreinigungen eines Endopeptidase V8 Verdaus von reduziertem carboxymethyliertem TNF-Inhibitor (30 kDa).
Abb. 12 zeigt Aminosäuresequenzen, die im TNF-Inhibitor (30 kDa) vorhanden sind. Freizeichen in der Sequenz zeigen, daß der Rest nicht eindeutig durch Proteinsequenzieren identifiziert wurde. C* zeigt die Identifizierung von Carboxymethylcystein durch die Gegenwart von ³H in dem Rest.
Abb. 13 zeigt die DNA Sequenz eines genomischen Klons, der zumindest einen Teil eines TNF-Inhibitors (30 kDa) codiert.
Abb. 14 zeigt mindestens 70% der reifen Aminosäuresequenz eines bevorzugten TNF-Inhibitors.
Abb. 15 zeigt den Nachweis von TNF-Inhibitor in Überstand von U937 Zellen durch Gel-Shift-Tests.
Abb. 16 zeigt den Nachweis von TNF-Inhibitor in HPLC Fraktionen eines U937 Überstandes.
Abb. 17 zeigt den Northern blot, der zu Beispiel 4 gehört.
Abb. 18 zeigt das Binden des deglycosylierten TNF-Inhibitors (30 kDa) an TNF. Glycosylierter und deglycosylierter TNF-Inhibitor wurden mit TNF-Affigel inkubiert und nicht gebundenes Material und Eluat des Gels wurden mit SDS-PAGE analysiert. In dieser Abbildung bezeichnet (11) das nicht gebundene Material von TNF-INH, reduziert und oxidiert, (21) bezeichnet das Durchflußmaterial von deglycosyliertem TNF-INH, reduziert und oxidiert, (51) bezeichnet das durchgeflossene Material von nativem TNF-INH, (12) bezeichnet das Eluat von TNF-INH, reduziert und oxidiert, (22) bezeichnet das Eluat von deglycosyliertem TNF-INH, reduziert und oxidiert und (52) bezeichnet das Eluat von nativem TNF-INH.
Abb. 19 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 30 kDa TNF-Inhibitors.
Abb. 20 beschreibt die cDNA Sequenz, die die in Abb. 19 gezeigte Aminosäuresequenz codiert.
Abb. 21 zeigt die gesamte cDNA Sequenz des Vorläufers für den 30 kDa TNF- Inhibitor.
Abb. 22 zeigt die DNA Sequenz nahe des Starts des TNF-Inhibitor (30 kDa) Gens im Plasmid pTNFIX-1.
Abb. 23 zeigt das Plasmid pCMVXV Beta TNFBP Stop A.
Abb. 24 zeigt das Plasmid pSVXVTNFBP Stop A.
Abb. 25 zeigt ein chromatographisches Profil bei OD&sub2;&sub1;&sub5; der RPB Säule des 30 kDa TNF-Inhibitors von E. coli. Die Ergebnisse des L929 Biotests sind ebenfalls gezeigt (-x-x).
Abb. 26 zeigt eine silbergefärbte 14%-ige SDS-PAGE der RPB Fraktionen in Abb. 25.
Abb. 27 zeigt ein chromatographisches Profil bei OD&sub2;&sub1;&sub5; der RPB Reinigung des TNF-Inhibitors aus U937 Zellen. Die Ergebnisse des L929 Biotests sind ebenfalls als Säulengraph dargestellt. Zwei ausgeprägte TNF-Inhibitormaxima sind dargestellt.
Abb. 28 zeigt eine silbergefärbte 14%-ige SDS-PAGE der RPB Fraktionen. Fraktion Nummer 30 enthält den 30 kDa TNF-Inhibitor und Fraktion Nummer 35 enthält den 40 kDa TNF-Inhibitor.
Abb. 29 zeigt ein chromatographisches Profil bei OD&sub2;&sub1;&sub5; der Reinigung des aus Urin stammenden 40 kDa TNF-Inhibitors. Die zweiten Maxima an TNF-Inhibitor von mehreren RPB Chromographien wurden vereinigt und erneut auf einer RPB Säule analysiert. TNF-inhibitorische Aktivität ist als Säulengraph dargestellt. Der Unterschied zwischen dem OD&sub2;&sub1;&sub5; Maximum und dem Aktivitätsmaximum spiegelt das Leervolumen zwischen dem Detektor und dem Fraktionssammler wieder.
Abb. 30 zeigt eine silbergefärbte 14%-ige SDS-PAGE der RPB Fraktionen von Urin. Fraktion Nummer 32 enthält den 40 kDa TNF-Inhibitor.
Abb. 31 zeigt die aminoterminalen Sequenzen der aus U937 erhaltenen Inhibitoren (30 kDa und 40 kDa) und des aus Urin stammenden 40 kDa TNF- Inhibitors.
Abb. 32 zeigt eine Peptidreinigung von durch Endopeptidase V8 verdautem 40 kDa TNF-Inhibitor.
Abb. 33 zeigt eine Peptidreinigung von durch Endopeptidase Arg-C verdautem 40 kDa TNF-Inhibitor.
Abb. 34 zeigt eine Peptidreinigung von durch Trypsin verdautem Arg-C16 Peptid.
Abb. 35 zeigt eine Peptidreinigung von durch Chymotrypsin verdautem Arg-C10 Peptid.
Abb. 36 zeigt eine Primärstruktur des 40 kDa TNF-Inhibitors.
Abb. 37 zeigt einen Teil der 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA Sequenz zusammen mit dem vorausgesagten Aminosäuretranslationsprodukt.
Abb. 38 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des 40 kDa TNF-Inhibitors.
Abb. 39 zeigt die gesamte cDNA Sequenz des Vorläufers des 40 kDa TNF- Inhibitors, zusammen mit dem daraus abgeleiteten Translationsprodukt. Abb. 40 zeigt einen Cytotoxizitäts-Test für TNF Beta (Lymphotoxin) in der Gegenwart (o-o) des 40 kDa TNF-Inhibitors, in der Gegenwart ( - ) des 30 kDa TNF-Inhibitors und ohne jeglichen Inhibitor (x-x).
Abb. 41 zeigt die Expression der 30 kDa TNF-Inhibitor cDNA Sequenz, wie in Abb. 21 in COS7 Zellen gezeigt. COS Zellen wurden mit Plasmiden unter Verwendung des Lipofectinverfahrens nach Feigner etal. (Proc. Natl. Aca. Sci. (USA) 84, 7413-1987) transfiziert. 3,4 x 10&sup5; Zellen wurden mit den angegebenen Mengen an [¹²&sup5;I] TNF Alpha bei einer spezifischen Aktivität von 5,6 x 10&sup4; cpm/ng inkubiert und die an die Zellen gebundene Menge bestimmt. Qffene Symbole bezeichnen die gesamten cpm, die nach einer vierstündigen Inkubation bei 4ºC mit den Zellen assoziiert sind. Geschlossene Symbole repräsentieren gebundenes [¹²&sup5;I] TNF Alpha in der Gegenwart eines 180-fachen Überschusses an kaltem, nicht markiertem TNF-Alpha.
Abb. 42 zeigt die Expression der 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA Sequenz, gezeigt in Abb. 39, in COS7 Zellen. Testbedingungen sind in Abb. 41 beschrieben. Die dunklen Symbole repräsentieren das gebundene [¹²&sup5;I] TNF Alpha in der Gegenwart eines 180-fachen Überschusses von kaltem, nicht markiertem TNF-Alpha.
Abb. 43 zeigt den Cytotoxizitäts-Test einer HPLC RPC-8 Fraktion der menschlichen Monozyten, die mit PMA und PHA für 24 Stunden behandelt wurden.
Abb. 44 zeigt das RPC-8 chromatographische Muster des 40 kDa TNF-Inhibitors Δ51 (A), SDS-Polyacrylamidgelanalyse der Fraktionen (B) und den Cytotoxizitäts-Test von L929 Zellen (C).
Abb. 45 zeigt das RPC-8 chromtographische Muster des 40 kDa TNF-Inhibitors Δ53 (A); SDS-Polyacrylamidgelanalyse der Fraktionen (B) und den Cytotoxizitäts-Test von L929 Zellen (C).

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die derzeitig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden nun detailliert erwähnt, was zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dient, die Grundlagen der Erfindung zu erklären.

1. Aus Urin isolierter Inhibitor

Wie oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf TNF-Inhibitoren, die in gereinigter Form isoliert worden sind. In einer Ausführungsform dieser Erfindung stammt der 40 kDa TNF-Inhibitor vorzugsweise aus Urin. Zusätzlich umfaßt die Erfindung im großen Maß gereinigte TNF-Inhibitoren jeden Ursprungs, die biologisch äquivalent zu dem aus Urin isolierten Inhibitor sind. In dieser Beschreibung sollte jeder Bezug auf einen TNF-Inhibitor, oder einfach einen Inhibitor, als auf jeden der hier identifizierten und beschriebenen Inhibitoren bezogen, ausgelegt werden.
Mit "biologisch äquivalent", wie in der gesamten Beschreibung und Ansprüchen benutzt, meinen wir Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, TNF- Wirkung in ähnlicher Weise, aber nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß wie der native aus Urin isolierte TNF-Inhibitor zu verhindern. Mit "im wesentlichen homolog" wie in der gesamten folgenden Beschreibung und Ansprüchen benutzt, ist ein Grad an Homologie zu dem nativen, aus Urin isolierten TNF-Inhibitor größer als der von irgendeinem vorher beschriebenen TNF-Inhibitor gezeigte Homologiegrad gemeint. Vorzugsweise liegt der Grad an Homologie über 70%, besonders bevorzugt bei über 80% und noch mehr bevorzugt bei über 90%, 95% oder 99%. Eine besonders bevorzugte Gruppe an TNF-Inhibitoren ist mehr als 95% homolog zu dem nativen Inhibitor. Der Prozentsatz an hier beschriebener Homologie ist errechnet als der Prozentsatz an Aminosäureresten, der in der kleineren der beiden Sequenzen gefunden wurde, die mit identischen Aminosäureresten in der zu vergleichenden Sequenz übereinstimmt, wenn vier Lücken auf eine Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um das Übereinstimmen zu erleichtern, wie dargelegt von Dayhoff in Atlas of Protein Seauence and Structure Bd. 5, Seite 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., hiermit ausdrücklich durch Verweis mit einbegriffen. Ebenso als im wesentlichen homolog mit eingeschlossen sind solche TNF-Inhibitoren, die aufgrund von Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen den beschriebenen Inhibitor isoliert werden können oder dessen Gene durch Hybridisieren mit dem Gen oder mit Segmenten des beschriebenen Inhibitors isoliert werden können.
Der bevorzugte 40 kDa TNF-Inhibitor der vorliegenden Erfindung, stammt aus Urin und wurde zum erstenmal in gereinigter Form isoliert.
Zum Zweck der vorliegenden Erfindung soll, wenn "reine Form" oder "gereinigte Form" benutzt wird, um sich auf den hier offenbarten TNF-Inhibitor zu beziehen, eine Zubereitung gemeint sein, die im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, die keine TNF- Inhibitorproteine sind. Vorzugsweise ist der TNF-Inhibitor der vorliegenden Erfindung mindestens 50% rein, besonders bevorzugt 75% rein und besonders bevorzugt 80%, 95% oder 99% rein. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die TNF- Inhibitorproteinzubereitung ausreichend rein, um einem Durchschnittsfachmann zu ermöglichen ihre Aminosäuresequenz ohne weitere Reinigungsschritte zu ermitteln. Mindestens zwei TNF-Inhibitoren wurden durch die in den Beispielen beschriebenen Verfahren isoliert. Die zwei Inhibitoren sind ungefähr 30 kDa und ungefähr 40 kDa in SDS-PAGE. Der 30 kDa Inhibitor eluiert von einer DEAE CL6B Säule bei ungefähr 80 millimolar NaCl in Trispuffer, pH 7,5. Die Aminosäuresequenz des 30 kDa Inhibitors ist in Abb. 19 beschieben und die Aminosäuresequenz des 40 kDa Inhibitors ist in Abb. 38 beschrieben. Es wurde gezeigt, daß der 30 kDa TNF-Inhibitor die Aktivität von TNF Alpha inhibiert und einen geringen Effekt auf die Aktivität von TNF Beta hat. Es wurde gezeigt, daß der 40 kDa TNF-Inhibitor einen wesentlichen inhibierenden Effekt auf sowohl TNF Alpha als auch auf TNF Beta (Lymphotoxin) hat.

2. Aus U937 konditioniertem Medium isolierter Inhibitor

In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der 40 kDa TNF- Inhibitor aus von menschlichen U397 Zellen konditioniertem Medium isoliert. Das aus U937 konditioniertem Medium gewonnene 40 kDa Protein ist im wesentlichen homolog zu dem aus Urin isolierten 40 kDa TNF-Inhibitor und ist biologisch äquivalent zu besagtem Protein.

3. Struktur des 30 kDa TNF-Inhibitors

Der aus Urin isolierbare 30 kDa TNF-Inhibitor ist ein Glycoprotein, das mindestens eine Kohlenhydrateinheit enthält. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der natürliche 30 kDa TNF-Inhibitor deglycosyliert. Der degiycosylierte TNF-Inhibitor, der seine Fähigkeit an TNF zu binden beibehält, liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Vollständig und teilweise deglycosylierter 30 kDa TNF-Inhibitor ist in dieser Erfindung mit umfaßt. Der aus Urin isolierte deglycosylierte 30 kDa TNF-Inhibitor ist ein Protein von ungefähr 18 kDa.
Die identifizierte Gensequenz, die das 30 kDa Protein codiert, enthält kein Terminationscodon wie von der Aminosäuresequenz des 18 kDa Proteins vermutet werden könnte. Die Erfinder vermuten ohne sich jedoch darauf beschränken zu wollen, daß die in vivo hergestellten Proteine zusätzliche Aminosäuresequenzen enthalten. Gemäß dieser Theorie ist das codierte Protein ein TNF-Rezeptormoiekül. Das von der cDNA codierte Inhibitorprotein hat eine hydrophobe Sequenz, die mit der die Zellmembran durchspannenden Region kompatibel wäre und einen TNF-bindenden Teil, der sich extrazellulär von der Zellmembran erstrecken würde. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese und wie in Beispiel 19 beschrieben, wurde die cDNA in Cos Zellen exprimiert und führt zu einem Anstieg in der Zahl der TNF-Bindungsstellen auf der Zelle. Die TNF-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind daher die Rezeptorfragmente oder Teile des Rezeptormoleküls. Solche Bindungsfragmente wurden für andere bindendelinhibitorische Moleküle (z.B., IL-2 Inhibitor) identifiziert und werden als lösliche Rezeptoren bezeichnet.
Diese Theorie ist im Einklang mit dem Fehlen eines Terminationscodons in der Nucleotidsequenz, die dem Terminus des Proteins entsprechend würde, wie von der bekannten Sequenz des isolierten TNF-Inhibitorfaktors vermutet. Es ist ebenfalls im Einklag mit der Tatsache, daß die Nucleotidsequenz über die Stelle hinaus, an der das Terminationscodon liegen sollte, eine Anzahl von hydrophoben Aminosäuren codiert.
Die vorliegende Erfindung umfaßt daher nicht nur den identifizierten und beschriebenen Teil der TNF-Inhibitoren, sondern alle Proteine, die einen Teil der Aminosäuresequenz, die von der hier identifizierten und beschriebenen cDNA codiert werden, enthalten.

4. Struktur des 40 kDa TNF-Inhibitors

Der aus von menschlichen U937 Zellen konditioniertem Medium isolierte und in Urin identifizierte 40 kDa TNF-Inhibitor ist ein Glycoprotein, das mindestens eine Kohlhydrateinheit enthält. In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist der natürliche 40 kDa TNF-Inhibitor deglycosyliert. Der deglycosylierte 40 kDa TNF-Inhibitor, der seine Fähigkeit an TNF Alpha und TNF Beta (Lymphotoxin) zu binden beibehält, liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Vollständig und teilweise deglycosylierter 40 kDa TNF- Inhibitor ist in dieser Erfindung mit umfaßt. Die Erfinder vermuten, daß der 40 kDa TNF- Inhibitor ebenfalls ein löslicher Rezeptor sein kann. Die identifizierte Gensequenz, die das 40 kDa Protein codiert, enthält kein Terminationseodon wie von der Aminosäuresequenz des deglycosylierten 40 kDa TNF-Inhibitors vermutet werden könnte. Wie in Beispiel 20 beschrieben, wurde die cDNA in Cos Zellen exprimiert und führt zu einem Anstieg in der Anzahl von TNF-Bindungsstellen auf der Zelle.
Die vorliegende Erfindung umfaßt das Gen, das für das reife, aus dem durch menschliche U939 Zelle konditioniertem Medium gewonnene und in Urin identifizierte 40 kDa Protein codiert und größere und kleinere Teile eines solchen Gens in dem Maß, daß die TNF-inhibitorische Aktivität des codierten Proteins nicht betroffen ist. Wie durch Hinweis auf Abb. 38 festgestellt werden kann, hat der reife 40 kDa TNF-Inhibitor eine prolinreiche Region nahe dem vermuteten C-Terminus des Proteins. 40 kDa TNF-Inhibitoren, bei denen die gesamte Region oder Teile der prolinreichen Region nicht im Protein eingeschlossen sind, sind als TNF-Inhibitoren aktiv und liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Zwei solcher verkürzter Proteine sind in Beispielen 17 und 22 unten aufgeführt und werden als 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 bezeichnet. Alle Teile dieser Anmeldung, die sich allgemein auf 40 kDa TNF-Inhibitoren beziehen, sollen das reife, aus von menschlichen U397 Zellen kondentionierte Medium gewonnene und in Urin identifizierte 40 kDa Protein und auch den 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und den 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 umschließen
Es wird allgemein angenommen, daß mindestens ein TNF-Rezeptor in der Lage ist, sowohl TNF Alpha als auch TNF Beta zu binden, während einige TNF-Rezeptoren in der Lage sind nur TNF Alpha zu binden. Dies ist in Übereinstimmung mit den Beobachtungen, daß es zwei TNF-Inhibitoren gibt, die beide vermutlich aktive Fragmente der TNF- Rezeptorregion sind und einer nur gegen TNF Alpha aktiv ist und der andere gegen beide TNF Alpha und TNF Beta aktiv ist.

5. Rekombinater Inhibitor

(a) albemein

Eine rekombinante DNA Methode zum Herstellen eines TNF-Inhibitors ist nun veröffentlicht. In einer Ausführungsform der Erfindung wirkt die aktive Region in einer Weise, die biologisch äquivalent ist zu der des aus Urin isolierten TNF-Inhibitors. Eine natürliche oder synthetische DNA Sequenz kann benutzt werden um das Herstellen eines solchen TNF-Inhibitors zu steuern. Diese Methode umfaßt:
(a) das Herstellen einer DNA Sequenz, die in der Lage ist, die Wirtszelle so zu steuern, daß sie ein Protein mit TNF-inhibitorischen Aktivitäten oder einen Vorläufer derselben herstellt;
(b) das Klonieren der DNA Sequenz in einen Vektor, der in der Lage ist, in eine Zelle übertragen und repliziert werden zu können, wobei dieser Vektor funktionelle Elemente enthält, die zur Expression der DNA Sequenz oder Vorläufer derselben benötigt werden;
(c) das Übertragen des Vektors, der die synthetische DNA Sequenz und funktionelle Elemente enthält, in eine Wirtszelle, die in der Lage ist die DNA, die für den TNF- Inhibitor oder einen Vorläufer desselben codiert, zu exprimieren;
(d) das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen für die Amplifikation des Vektors und Expression des Inhibitors oder eines Vorläufers desselben;
(e) das Ernten des Inhibitors oder eines Vorläufers desselben; und
(f) dem Inhibitor erlauben eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wobei es TNF- inhibitorische Aktivität besitzt oder in ein Protein mit TNF-inhibitorischer Aktivität prozessiert werden kann.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der TNF-Inhibitor in Form eines Vorläuferproteins von der Wirtszelle hergestellt. Das Vorläuferprotein wird in ein oder mehreren Schritten zu einem Protein prozessiert und durch dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren ermöglicht, sich richtig zu einem aktiven TNF-Inhibitor zu falten.

(b) DNA Sequenzen

DNA Sequenzen, die beabsichtigt sind in diesem Verfahren eingesetzt zu werden, sind teilweise in Beispielen 6, 14A und 17 diskutiert. Es ist beabsichtigt, daß diese Sequenzen synthetische und natürliche DNA Sequenzen und Kombinationen davon einschließen. Die natürlichen Sequenzen schließen weiterhin cDNA oder genomische DNA Segemente ein.
Die Mittel zur synthetischen Herstellung von Polynudeotidsequenzen, die mit den von cDNA oder genomischen Polynudeotidsequenzen codierten Proteinen identisch sind, sind dem Fachmann allgemein bekannt, besonders im Licht der hier enthaltenen Lehren. Als ein Beispiel für den jetzigen Stand der Technik bezogen auf Polynucleotidsynthese sei verwiesen auf Matteucci, M.D. und Caruthers, M.H., in J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981) und Beaucage, S.L. und Caruthers, M.H. in Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981) und auf die Anweisungen, die mit einem ABI Oligonucleotid Synthetisierer mitgeliefert werden, wobei alle diese Referenzen hier ausdrücklich durch Verweis mit einbegriffen sind.
Diese synthetischen Sequenzen können mit der unten genauer beschriebenen Sequenz identisch sein oder sie können andere Nucleotide enthalten. In einer Ausführungsform wird beabsichtigt, falls die synthetischen Sequenzen Nucleotide enthalten, die von den in den natürlichen Sequenzen dieser Erfindung gefundenen Nucleotiden abweichen, daß diese abweichenden Sequenzen immer noch ein Polypeptid codieren, das die gleiche Primärstruktur wie der aus Urin isolierte TNF-Inhibitor hat. In einer alternativen Ausführungsform codiert die synthetische Sequenz, die abweichende Nucleotide enthält, ein Polypeptid, das die gleiche biologische Aktivität wie der hier beschriebene TNF- Inhibitor hat.
Zusätzlich kann die DNA Sequenz ein Fragment einer natürlichen Sequenz z.B. ein Fragment eines Polynucleotids sein, das in der Natur vorkommt und das zum erstenmal von den hier vorhandenen Erfindern isoliert und gereinigt wurde. In einer Ausführungsform ist die DNA Sequenz ein Restriktionsfragment, das aus einer cDNA Genbank isoliert wurde.
In einer alternativen Ausführungsform wird die DNA Sequenz aus einer menschlichen genomischen Genbank isoliert. Ein Beispiel für eine in dieser Ausführungsform nützlichen Genbank ist von Wyman et al. beschrieben, (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 2880-2884.
In einer bevorzugten Form dieser Ausführungsform wird beabsichtigt, daß die natürliche DNA Sequenz erhalten wird durch ein Verfahren, das umfaßt:
(a) das Herstellen einer menschlichen cDNA Genbank aus Zellen, vorzugsweise U937 Zellen, die in der Lage sind, einen TNF-Inhibitor in einem Vektor und in einer Zelle herzustellen, die fähig ist, sämtliche Teile der cDNA zu amplifizieren und zu exprimieren;
(b) das Inkubieren der menschlichen DNA Genbank mit mindestens einer Sonde, die in der Lage ist an das TNF-Inhibitorgen oder dessen Proteinprodukt zu binden;
(c) das Identifizieren von mindestens einem Klon, der das für den Inhibitor codierende Gen enthält, durch die Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde des Gens oder seines Proteinproduktes zu binden;
(d) das Isolieren des für den Inhibitor codierenden Gens oder eines Teils dieses Gens von dem oder den ausgewählten Klonen; und
(e) Verbinden des Gens oder geeigneter Teile davon zu funktionellen Elementen, die notwendig sind, das Gen in der Wirtszelle zu erhalten und zu exprimieren.
Die für das hier beschriebene Verfahren nützlichen natürlichen DNA Sequenzen können ebenfalls durch ein Verfahren identifiziert und isoliert werden, das umfaßt:
(a) Herstellen einer menschlichen genomischen Genbank, vorzugsweise in einem recBC, sbc Wirt, vorzugsweise CES 200 propagiert;
(b) Inkubieren der menschlichen genomischen Genbank mit mindestens einer Sonde, die in der Lage ist, ein TNF-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt zu binden;
(c) das Identifizieren von mindestens einem Klon, der das für den Inhibitor codierende Gen enthält, durch die Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde des Gens oder seines Proteinproduktes zu binden;
(d) das Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert aus dem oder den identifizierten Klonen; und
(e) Verbinden des Gens, oder geeigneter Fragmente davon, zu funktionellen Elementen, um das Gen in einer Wirtszelle zu erhalten und zu exprimieren.
Ein drittes mögliches Verfahren zum Identifizieren und Isolieren natürlicher DNA Sequenzen, die in dem vorliegenden Verfahren nützlich sind, schließt folgende Schritte ein:
(a) das Herstellen vom mRNA aus Zellen, die den TNF-Inhibitor herstellt;
(b) das Synthetisieren von cDNA (einzel- oder doppelsträngig) von dieser mRNA;
(c) das Amplifizieren der TNF-Inhibitorspezifischen DNA Sequenzen, die in dieser Mischung von cDNA Sequenzen vorliegen, unter Verwendung des Polymerasekettenreaktionsverfahrens (PCR) mit Primem wie sie in Tabelle 5 gezeigt sind;
(d) das Identifizieren der PCR Produkte durch Southern Blot Analyse, die Sequenzen enthalten, die in den anderen Oligonucleotidsonden, gezeigt in Tabelle 5, enthalten sind;
(e) das Subklonieren der so identifizierten DNA Fragmente in M13 Vektoren, die direktes Sequenzieren der DNA Sequenzen erlauben;
(f) das Benutzen dieser Sequenzen, um einen cDNA Klon aus der cDNA Genbank zu isolieren; und
(g) das Verbinden des Gens, oder geeigneter Fragmente davon, zu funktionellen Elementen, die notwendig sind, um das Gen in der Wirtszelle zu erhalten und zu exprimieren.
Bei der Isolierung einer DNA Sequenz, die zur Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens geeignet ist, wird es bevorzugt, die beiden Restriktionsschnittstellen zu identifizieren, die in und so nah wie möglich an den Endbereichen des geeigneten Gens oder Teilen dieses Gens liegen, welches das native Protein oder Fragmente davon codiert. Das DNA Segment, daß das geeignete Gen oder Teile des Gens enthält, wird unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonucleasen vom Rest des genomischen Materials entfernt. Nach dem Ausschneiden werden die 3' und 5' Enden der DNA Sequenz und jegliche Intron-Exon Grenzen wieder hergestellt, um geeignete DNA Sequenzen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, für den N- und C-Terminus und die Gesamtheit des TNF-Inhibitorproteins zu codieren und die weiterhin in der Lage sind, die DNA Sequenz an ihre funktionellen Elemente zu fusionieren.
Wie unten in Beispiel 17 beschrieben, kann die DNA Sequenz, die zur Expression des 40 kDa TNF-Inhibitors eingesetzt wird, durch Entfernen von entweder 153 oder 159 Basenpaaren des Gens, das den reifen 40 kDa TNF-Inhibitor, welcher aus von menschlichen U937 Zellen konditioniertem Medium gewonnen und in Urin identifiziert wurde, modifiziert werden. Das Δ53 Gen wurde hergestellt, um die Prolinregion vom C- Terminus des vollständigen Gens zu entfernen und das Δ51 Gen wurde hergestellt, um sich dem C-Terminus des Gens, das für den 30 kDa TNF-Inhibitor codiert zu nähern.
Eine DNA Sequenz, die nach diesen Verfahren aus einer cDNA Genbank isoliert wurde und die mindestens einen Teil des 30 kDa TNF-Inhibitors, wie hier beschrieben codiert, wurde bei der American Type Culter Collection Rockville, M.D., unter der Hinterlegungsnummer 40645 hinterlegt.
Eine DNA Sequenz, die nach diesen Verfahren aus einer menschlichen genomischen DNA Genbank isoliert wurde und die mindstens einen Teil des hier beschriebenen 30 kDa TNF-Inhibitors codiert, wurde bei der American Type Culture Collection Rockville, M.D., unter der Hinterlegungsnummer 40620 hinterlegt.
Eine DNA Sequenz, die nach diesen Methoden aus einer cDNA Genbank isoliert wurde und die mindestens einen Teil des hier beschriebenen 40 kDa TNF-Inhibitors codiert, wurde bei der American Type Cultural Collection, Rockville, M.D., unter der Hinterlegungsnummer 68204 hinterlegt.

6. Vektoren

(b) Mikroorganismen. Im besonderen E. coli

Die zur Benutzung in der vorliegenden Erfindung beabsichtigten Vektoren schließen jegliche Vektoren ein, in die eine DNA Sequenz, wie oben beschrieben, eingefügt werden kann, zusammen mit jedem bevorzugten oder benötigten funktionellen Element und dieser Vektor anschließend in eine Wirtszelle gebracht werden und in solch einer Zelle dupliziert werden kann. Bevorzugte Vektoren sind solche deren Restriktionsschnittstellen genau beschrieben sind und die die funktionellen Elemente, die bevorzugt oder zur Transkription der DNA Sequenz benötigt sind, enthalten. Jedoch sind auch bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßt, die zur Zeit nicht entdeckte Vektoren einsetzen, die ein oder mehrere der hier beschriebenen cDNA Sequenzen enthalten würden. Im besonderen ist bevorzugt, daß alle dieser Vektoren einige oder alle der folgenden Charakteristika aufweisen: (1) eine minimale Anzahl an Sequenzen des Wirtorganismus zu besitzen; (2) stabil im gewünschten Wirt enthalten zu sein und in diesem zu propagieren; (3) in der Lage zu sein, in einer hohen Kopiezahl im gewünschten Wirt vorhanden zu sein; (4) einen regulierbaren Promotor zu besitzen, um die Transkription des Gens von Interesse zu fördern; (5) mindestens eine Marker DNA Sequenz zu haben, die für ein selektierbares Merkmal codiert, das in einem Teil des Plasmids getrennt von dem Teil in den die DNA Sequenz eingefügt wird, liegt; und (6) eine DNA Sequenz, die in der Lage ist Transkription zu beenden.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen enthalten diese Klonierungsvektoren, welche DNA Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten und in der Lage sind sie zu exprimieren, verschiedene funktionelle Elemente. Diese, wie hier besprochenen "funktionellen Elemente", schließen mindestens einen Promotor ein, mindestens eine Shine-Dalgamo-Sequenz und Initiationscodon und mindestens ein Stopcodon. Bevorzugter Weise schließen diese "funktionellen Elemente" ebenfalls mindestens einen Operator ein, mindestens eine Leadersequenz für Proteine, die aus dem Intrazellularraum exportiert werden sollen, mindestens ein Gen für ein Regulatorprotein und jegliche andere DNA Sequenzen, die notwendig oder bevorzugt sind, um geeignete Transkrition und nachfolgende Translation der Vektor-DNA zu ermöglichen.
Bestimmte dieser funktionellen Elemente können in jedem der bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Es ist beabsichtigt, daß jedes zusätzliche funktionelle Element, das benötigt werden kann, zu diesen Vektoren zugefügt werden kann unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, besonders im Licht der hier dargelegten Lehren.
In der Praxis ist es möglich, jeden dieser Vektoren so zu konstruieren, daß es ihnen erlaubt ist, in einfacher Weise isoliert, zusammengesetzt und ausgetauscht zu werden. Dies erleichtert das Zusammensetzen von zahlreichen funktionellen Genen aus kombinationen dieser Elemente und der codierenden Region von DNA Sequenzen. Weiterhin werden viele dieser Elemente in mehr als einem Wirt anwendbar sein. Es ist zusätzlich beabsichtigt, daß die Vektoren in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen DNA Sequenzen enthalten werden, die in der Lage sind als Regulatoren ("Operatoren") zu funktionieren und andere DNA Sequenzen, die in der Lage sind für Regulatorproteine zu codieren.

(1) Regulatoren

In einer Ausführungsform werden diese Regulatoren dazu dienen, die Expression der DNA Sequenz in Gegenwart bestimmter Umweltbedingungen zu verhindern und in der Gegenwart von anderen Umweltbedingungen die Transkription und anschließende Expression des von der DNA Sequenz codierten Proteins zu erlauben. Im besonderen ist es bevorzugt, daß regulatorische Segemente in den Vektor eingefügt werden, so daß die Expression der DNA Sequenz nicht auftritt oder in einem stark verringertem Maße auftritt, in der Abwesenheit von z.B. Isopropylthio-beta-D-Galactosid. In dieser Lage kann der transformierte Mikroorganismus, der die DNA Sequenz enthalt, vor der Initiation der Expression des TNF-Inhibitors bis zu einer gewünschten Dichte herangewachsen werden. In dieser Ausführungsform wird die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe einer Substanz zu der mikrobiellen Umgebung induziert, die in der Lage ist, Expression der DNA Sequenz zu verursachen, nachdem die gewünschte Dichte erreicht worden ist.

(ii) Promotoren

Die Expressionsvektoren müssen Promotoren enthalten, die vom Wirtsorganismus zum Exprimieren ihrer eigenen Proteine benutzt werden können. Wahrend das Lactosepromotorsystem allgemein benutzt wird, wurden andere mikrobielle Promotoren isoliert und charakterisiert, die einen Fachmann in die Lage versetzen, sie zur Expression des rekombinaten TNF-Inhibitors zu benutzen.

(iii) Transkriptionsterminator

Die hier beabsichtigten Transkriptionsterminatoren dienen zum Stabilisieren des Vektors. Im besonderen solche Sequenzen, wie beschrieben von Rosenberg M. und Court, D., in Ann. Rev. Genet. 13:319-353 (1979), die speziell durch Verweis hiermit einbegriffen sind, sind zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung beabsichtigt.

(iv) nichttranslatierte Sequenz

Es wird angemerkt, daß es in einer bevorzugten Ausführungsform ebenfalls wünschenswert sein kann, daß 3' oder 5' Ende der codierenden Region umzugestalten, um Eingliederung von 3' oder 5' nicht translatierten Sequenzen in das Gentranskript zu erlauben. Einbegriffen in diese nichttranslatierten Sequenzen sind solche, die mRNA stabilisieren wie von Schmeissner U., Mc Kenney, K., Rosenberg, M und Court, D. in J. Mol. Biol. 176:39-53 (1984), identifiziert, hiermit ausdrücklich durch Verweis mit eingeschlossen.

(v) Ribosomen Bindungssteilen

Die mikrobielle Expression von fremden Proteinen benötigt bestimmte funktionelle Elemente, die Ribosomenbindungsstellen einschließen, aber nicht auf diese limitiert sind. Eine Ribosomenbindungsstelle ist eine Sequenz, die ein Ribosom erkennt und an die es während des Beginns der Proteinsynthese bindet, wie dargelegt in Gold L. et al., Ann. Rev. Microbio. 35:557-580; oder Marquis, D. M. et al., Gene 42:175-183 (1986), welche beide ausdrücklich durch Verweis hiermit einbegriffen sind. Eine bevorzugte Ribosomenbindungsstelle ist GAGGCGCAAAM(ATG).

(vi) Leadersequenz und Translationskoppler

Zusätzlich ist es bevorzugt, daß eine DNA Sequenz, die für eine geeignete sekretorische Leader (Signal) Sequenz codiert, am 5' Ende der DNA Sequenz liegt, wie dargestellt von Watson, M.E. in Nucleic Acids Res. 12:5145-5163, hiermit ausdrücklich durch Verweis eingeschlossen, falls das Protein aus dem Zytoplasma ausgeschieden werden soll. Die DNA für die Leadersequenz muß in einer Position liegen, die das Herstellen eines Fusionsproteins erlaubt, in dem die Leadersequenz direkt anschließend an und kovalent verbunden mit dem Inhibitor ist, z.B., es dürfen keine Transkriptions- oder Translationsstopsignale zwischen den zwei codierenden Sequenzen liegen. Die Anwesenheit einer Leadersequenz ist teilweise aus einem oder mehreren der folgenden Gründe erwünscht. Erstens kann das Vorhandensein einer Leadersequenz das Prozessieren des TNF-Inhibitors im Wirt erleichtern. Im Besonderen kann die Leadersequenz das Schneiden des ursprünglichen Translationsproduktes durch eine Leaderpeptidase steuern, um die Leadersequenz zu entfernen und ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mögliche Proteinaktivität besitzt, zurückläßt Zweitens kann die Gegenwart der Leadersequenz die Reinigung des TNF-Inhibitors erleichtern, indem sie das Protein aus dem Zellzytoplasma heraussteuert. In einigen Stämmen von Wirtsmikroorganismen wird die Gegenwart einer geeigneten Leadersequenz den Transport des vollständigen Proteins in den periplasmatischen Raum erlauben, wie dies der Fall bei einigen E. coli ist. Im Fall von Keratin E.coli. Saccharomyces und Stämmen von Bacillus und Pseudomonas wird die geeignete Leadersequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran und in das extrazelluläre Medium erlauben. In diese Situation kann das Protein von Extrazellulärproteinen gereinigt werden. Drittens, im Falle einiger in der vorliegenden Erfindung hergestellter Proteine kann das Vorhandensein einer Leadersequenz nötig sein, um das vollständige Protein in einer Umgebung zu lokalisieren, wo es sich falten kann, um seine aktive Struktur einzunehmen, welche die geeignete Proteinaktivität besitzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine zusätzliche DNA Sequenz direkt anschließend an die DNA Sequenz, die für den TNF-Inhibitor codiert, lokalisiert. Die zusätzliche DNA Sequenz ist in der Lage als Translationskoppler zu fungieren, d.h., es ist eine DNA Sequenz, die eine RNA codiert, welche dazu dient, Ribosomen unmittelbar benachbart zu der Ribosomenbindungsstelle der Inhibitor RNA, an die sie angrenzt, zu positionieren. In einer Ausführunsform der vorliegenden Erfindung kann der Translationskoppler von der DNA Sequenz TAACGAGGCGCAAMMTGAAMAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG stammen und von Verfahren, die gegenwärtig dem Fachmann bekannt sind, die sich auf Translationskoppler beziehen.

(vii) Translationsterminator

Die hiermit beabsichtigten Translationsterminatoren dienen zum Beenden der Translation von mRNA. Sie können entweder natürlich wie beschrieben von Kohli J., Mol. Gen. Genet 182:430-439 sein oder synthetisiert sein, wie von Pettersson R.F. Gene 24:15-27 (1983) beschrieben, wobei weitere Referenzen hiermit ausdrücklich durch Verweis eingeschlossen sind.

(viii) Selektierbare Marker

Zusätzlich ist bevorzugt, daß der Klonierungsvektor einen selektierbaren Marker enthält, wie einen Drogenresistenzmarker oder andere Marker, die die Expression eines selektierbaren Merkmals durch den Wirtsorganismus veranlassen. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Gen für Ampicillinresistenz in den Vektor eingeschlossen, während in anderen Plasmiden des Gen für Tetracyclinresistenz oder das Gen für Chloramphenicolresistenz eingeschlossen ist.
Solch eine Drogenresistenz oder ein anderer selektierbarer Marker sollen teilweise die Selektion von Transformanden erleichtern. Zusätzlich kann die Gegenwart eines solchen selektierbaren Markers in dem Klonierungsvektor von Nutzen sein, indem kontaminierende Mikroorganismen davon abgehalten werden, sich im Kulturmedium zu vermehren. In dieser Ausführungsform könnte eine reine Kultur der transformierten Wirtsmikroorganismen erhalten werden durch Kultivieren der Mikroorganismen unter Bedingungen, die den induzierten Phenotyp zum Überleben benötigen.
Die funktionellen Elemente, die hier erwähnt sind, werden standardmäßig vom Fachmann gewählt, im Licht der früheren Veröffendlichungen und der hier enthaltenen Lehren. Allgemeine Beispiele für diese funktionellen Elemente sind dargelegt in B. Lewin Genes, Wiley & Sons, New York (1983), hiermit ausdrücklich durch Verweis mit eingeschlossen. Verschiedene Beispiele geeigneter funktioneller Elemente können in den oben besprochenen Vektoren gefunden werden und können durch Übersicht über die Publikationen, die die grundlegenden Eigenschaften der vorher genannten Vektoren erörtern, erklärt werden.
Nach Synthese und Isolierung aller notwendigen und erwünschten Teilstücke des oben besprochenen Vektors wird der Vektor durch dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren zusammengesetzt. Es wird angenommen, daß das Zusammensetzen solcher Vektoren zu den Pflichten und Aufgaben, die von einem durchschnittlichen Fachmann wahrgenommen werden, gehört und als solches in der Lage ist, ohne übermäßiges Experimentieren ausgeführt zu werden. Zum Beispiel wurden ähnliche DNA Sequenzen in geeignete Klonierungsvektoren legiert, wie dargelegt von Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984), hiermit ausdrücklich durch Verweis mit einbezogen.
Es sollte zusätzlich angemerkt werden, daß beim Konstruieren der Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung vielfache Kopien der DNA Sequenz und seiner begleitenden funktionellen Elemente in jeden Vektor inseriert werden können. In solch einer Ausführungsform würde der Wirtsorganismus größere Mengen des gewünschten TNF- Inhibitors pro Vektor herstellen. Die Anzahl der vielfachen Kopien einer DNA Sequenz, die in den Vektor inseriert werden kann, ist lediglich eingeschränkt durch die Fähigkeit des resultierenden Vektors, bedingt durch seine Größe, in eine geeignete Wirtszelle überführt, repliziert und und transkribiert zu werden.

(b) Weitere Mikroorganismen

Vektoren, die zum Gebrauch in Mikrooranismen außer E. coli, geeignet sind, sind in dieser Erfindung ebenfalls beabsichtigt. Solche Vektoren sind in Tabelle 1 beschrieben. Zusätzlich werden bestimmte bevorzugte Vektoren im folgenden erläutert. Tabelle 1
1. Backman, K., Ptashne, M. und Gilbert, W. Proc. NaU. Acad. Sd. USA 73 4174-4178 (1976).
2. de Boer, H.A., Comstock, L.J., und Vasser, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).
3. Shimatake, H. und Rosenbert, M. Nature 292 128-132 (1981).
4. Derom, C., Gheysen, D. und Fiers, W. Gene 17, 45-54 (1982).
5. Hallewell, R.A. und Emtage, S. Gene 9, 27-47 (1980).
6.Brosius, J., Dull, T.J., Sleeter, D.D. und Noller, H.F. J. Mol. Biol. 148 107-127 (1981).
7. Normanly, J., Ogden, R.C., Horvath, S.J. und Abelson, J. Nature 321, 213-219 (1986).
8. Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, A. und Cohen, S.N Cell 46, 245-251 (1986).
9. Schmeissner, U., Mc Kenney, K., Rosenberg M. und Court, D. J. Mol. Biol. 176, 39-53 (1984).
10. Mott, J.E., Galloway, J.L. und Platt, T. EMBO J. 4, 1887-1891 (1985).
11. Koshland, D. und Botstein, D. Cell 20, 749-760 (1980).
12. Movva, N.R., Kakamura, K. und Inouye, M. J. Mol. Biol. 143, 317-328 (1980).
13. Surin, B.P., Jans, D.A., Fimmel, A.L., Shaw, D.C., Cox, G.B. und Rosenberg, H. J. Bacteriol. 157, 772-778 (1984).
14. Sutcliffe, J. G. Proc. NaU. Acad. Sci. USA 75, 3737-3741 (1978).
15. Peden, K.W.C. Gene 22, 277-280 (1983).
16. Alton, N.K. und Vapnek, D. Nature 282, 864-869 (1979).
17. Yang, M., Galizzi, A., und Henner, D. Nuc. Acids Res. 11(2), 237-248 (1983).
18. Wong, S.-L., Price C.W., Goldfarb, D.S., und Doi, R.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).
19. Wang, P.-Z. und Doi, R.H. J. Biol. Chem 251, 8619-8625 (1984).
20. Lin, C.-K., Quinn, L.A., Rodriguez, R.L. J. Cell. Biochem. Suppl. (9B), S. 198 (1985).
21. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., und Filpula, D. J. Bact. 159(3), 811-819 (1984).
22. Plava, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., und Kaariamen, L. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 5582-5586 (1982).
23. Wong. S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., und Dol, R.H. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).
24. Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., Young, F.E. Gene 29, 21-46 (1984). 25. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J., und Fiiuia, D.J. Bact. 159(3), 811-819(1984).
26. Yansura, D.G. und Henner, D. J. PNAS 81 439-443 (1984).
27. Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. und Heyneker, H.L. Biotechnology, 161-165 (1984).
28. Lory, S., und Tai, P.C. Gene 22 95-101 (1983).
29. Liu, P.V. J. Infect. Dis. 130 (suppl) 594-599 (1974).
30. Wood, D.G., Hollinger, M.F., und Tindol, M.B. J. Bact. 145, 1448-1451 (1981).
31. St. John, T.P. und Davis, R.W. J. Mol. Biol. 152, 285-315 (1981).
32. Hopper, J.E., und Rowe, L.B. J. Biol. Chem. 253, 7566-7569 (1978).
33. Denis, C.L., Ferguson, J. und Young, E.T. J. Biol. Chem. 258, 1165-1171 (1983).
34. Lutsdorf, L. und Megnet, R. Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944 (1968).
35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, H. und Hinnen, A. EMBO J. 6, 675-680 (1982).
36. Watson, M.E. Nucleicacid Research 12, 5145-5164 (1984).
37. Gerband, C. und Guerineau, M. Curr. Genet 1, 219-228 (1980).
38 Hinnen, A., Hicks, J.B. und Fink, G.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).
39. Jabbar, M.A., Sivasubramanian, N. und Nayak, D.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 2019-2023 (1985).

(i) Pseudomonasvektoren

Einige Vektorplasmide, die autonom in einem weiten Bereich von Gram negativen Bakterien replizieren, sind zum Gebrauch als Klonierungsvehikel in Wirten des Genus Pseudomonas bevorzugt. Einige derselben sind beschrieben von Tait R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M., Rodriguez, R.L. und Kado, C.I. in Biotechnology, Mai 1983, Seiten 269-275,; Panopoulos, N.J. in Genetic Engineering in the Plant Sciences. Praeger Publishers, New York, New York, Seiten 163-185 (1981); und Sakagucki, K. in Current Topics in Microbiology und Immunology 96:31-45 (1982), wobei jede dieser Referenzen ausdrücklich durch Verweis hierin mit einbegriffen ist.
Eine besonders bevorzugte Konstruktion würde das Plasmid RSF1010 und Derivate davon einsetzen, wie beschrieben durch Bagdasarian M.M., Coleman, S. und Timmis, K.N. in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. und Puhler, A. eds., Elsevierlnorth Holland Biomedical Press (1979), hierin ausdrücklich durch Verweis mit einbegriffen. Die Vorteile von RSF1010 sind, daß es ein relativ kleines Plasmid mit großer Kopiezahl ist, welches ohne weiteres in sowohl E. coli als auch Pseudomonas Arten transformiert und stabil erhalten werden kann. In diesem System würde es bevorzugt werden, das Tac Expressionssystem wie für Escherichia beschrieben zu benutzen, da es scheint, daß der E.coli trp Promotor ohne weiteres von Pseudomonas RNA Polymerase erkannt werden kann, wie dargelegt von Sakagucki, K. in Current Topics in Microbiology and Immunology 96:31-45(45 (1982) und Gray G.L., McKeown, K.A., Jones A.J.S., Seeburg, P.H., und Heyneker, H.L. in Biotechnology, Feb. 1984, Seiten 161-165, welche beide ausdrücklich durch ihren Verweis hier mit einbegriffen sind. Transkriptionsaktivität kann weiterhin durch den Austausch des Promotors mit z.B. einem E.coli oder P. aeruginosa trp Promotor maximiert werden. Zusätzlich würde ebenfalls das lacl Gen von E. coli in dem Plasmid enthalten sein, um Regulierung zu beeinflussen.
Translationen kann an Translationsinitiation für jedes der Pseudomonas Proteine gekoppelt werden, ebenso wie an Initiationsstellen für jedes der in hohem Maß exprimierten Proteine der Klasse, die ausgesucht wurde, um intrazelluläre Expression des Inhibitors zu veranlassen.
In den Fällen, in denen Restriktions-Minus-Stämme einer Pseudomonas Wirtsart nicht erhältlich sind, ist die Transformationseffizienz mit aus E. coli isolierten Plasmidkonstrukten gering. Daher ist erwünscht, die Pseudomonas Klonierungsvektoren über einen r- m+ Stamm einer anderen Art zu transformieren, bevor der gewünschte Wirt tranformiert wird, wie dargelegt in Bagdasarian M. et. al., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Seiten 411422, Timmes und Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), hierin ausdrücklich durch Verweis mit eingeschlossen.

(ii) Bacillusvektoren

Weiterhin schließt ein bevorzugtes Expressionssystem in Wirten des Genus Bacillus die Benutzung des Plasmid pUB110 als Klonierungsvehikel ein. Wie in anderen Wirtsvektorsystemen ist es in Bacillus möglich&sub5; den TNF-Inhibitor der vorliegenden Erfindung entweder als intrazelluläres oder als abgesondertes Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsformen umschließen beide Systeme. Shuttel-Vektoren, die sich sowohl in Bacillus als auch E. coli replizieren, sind zum Konstruieren und Testen verschiedener Gene erhältlich, wie beschrieben von Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., und Shivakumar, A.G. in Genetic Engineering. Bd. 2. Setlow und Hollander, Plenum Press, New York, New York, Seiten 115-131 (1980) hier ausdrücklich durch Verweis mit eingeschlossen. Zur Expression und Sekretion des TNF-Inhibitor aus B. subtilis, wird vorzugsweise die Signalsequenz von Alpha-Amylase an die codierende Region des Proteins gekoppelt. Zur Synthese von intrazellulärem Inhibitor wird die bewegliche DNA Sequenz durch Translation an die Ribosomenbindungsstelle der Alpha-Amylase- Leadersequenz gekoppelt.
Die Transkription jeder dieser Konstrukte wird vorzugsweise durch den Alpha-Amylase- Promotor oder ein Derivat davon gesteuert. Dieses Derivat enthält die RNA Polymeraseerkennungssequenz des nativen Alpha-Amylase-Promotors aber schließt ebenfalls die lac Operatorregion mit ein. Es wurde gezeigt, daß ähnliche Hybridpromotoren, die aus dem Penicillasegenpromotor und dem lac Operator konstruiert sind, in regulierbarer Weise in Bacillus Wirten, funktionieren, wie dargestellt von Yansura, D.G. und Henner in Genetics und Biotechnology of Bacilii, Ganesan, A.T. und Hoch, J.A., eds., Academic Press, Seiten 249-263 (1984), ausdrücklich durch Verweis hier miteingeschlossen. Das lacl Gen von E. coli würde ebenfalls in das Plasmid eingeschlossen werden um die Regulation zu beeinflussen.

(iii) Clostridiumvektoren

Eine bevorzugte Konstruktion zur Expression in Clostridium ist das Plasmid pJU12, beschrieben von Squires, C.H. et al., in J. Bacteriol. 159:465-471(1984) und ausdrücklich durch Verweis hier miteingeschlossen, welches in C. perfringens durch das Verfahren von Heefner, D.L. et al. wie beschrieben in J. Bacteriol. 159:460-464 (1984) transformiert wird, hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen. Transkription wird von dem Promotor des Tetracylinrestistenzgens gesteuert. Die Transiation ist mit Shine- Dalgamo Sequenzen desselben Tet Gens in einer Weise verbunden, die exakt analog zu dem wie oben für geeignete Vektoren zum Gebrauch in anderen Wirten dargelegt ist.

(iv) Hefevektoren

Das Erhalten fremder in Hefe eingeführter DNA, kann auf verschiedenen Wegen beeinflußt werden, wie beschrieben von Botstein, D. und Davis, R.W., in The Molecular Biologv of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laoratory, Strathern, Jones und Broach, eds, Seiten 607-636 (1982), hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen. Ein bevorzugtes Expressionssystem zum Gebrauch mit Wirtsorganismen des Genus Saccharomyces beherbergt das TNF-Inhibitorgen auf dem 2 Mikron-Plasmid. Die Vorteile des 2 Mikronkreises schließen eine relativ hohe Kopiezahl und Stabilität beim Einführen in cir, Stamme ein. Diese Vektoren beinhalten vorzugsweise den Replikationsursprung und mindestens einen Antibiotikumresistenzmarker aus pBR322, um Replikation und Selektion in E. coli zu gestatten. Zusätzlich wird das Plasmid vorzugsweise die 2 Mikron-Sequenz und das Hefe LEU2 Gen tragen, um den gleichen Zweck in LEU2 defekten Hefemuntanten zu erfüllen.
Falls es beabsichtigt wird, daß die rekombinanten TNF-Inhibitoren letzten Endes in Hefe exprimiert werden, wird es bevorzugt, daß der Klonierungsvektor zuerst in Escherichia coli transferiert wird, wo dem Vektor erlaubt würde sich zu replizieren und aus dem der Vektor erhalten und nach Amplifikation gereinigt würde. Der Vektor würde dann in Hefe überführt, um schließlich den TNF-Inhibitor zu exprimieren.

(c) Säugerzellen

Die cDNA des TNF-Inhibitors wird als Gen zur Expression des Inhibitors in Säugerzellen dienen. Sie sollte eine Sequenz haben, die wirksam Ribosomen bindet, wie die von Kozak beschriebene in Nucleic Acids Research 15:8125-81232 (1987), hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen und sollte die Fähigkeit haben für eine Leadersequenz zu codieren (siehe Sektion 3(a) (vi)), um das reife Protein in einer prozessierten Form aus der Zelle zu lenken. Das DNA Restriktionsfragment, das die vollständige cDNA Sequenz trägt, kann in einen Expressionsvektor eingefügt werden, der einen Transkriptionspromotor und einen Transkriptionsenhancer wie von Guarente, L. in Cell 52:303-305 (1988) und Kadonaga J.T. et al., in Cell 51:1079-1090 (1987) beschrieben hat, welche beide ausdrücklich durch Verweis hierin miteingeschlossen sind. Der Promotor kann wie in dem Plasmid pMSG (Pharmacia Katalognummer 27450601) regulierbar sein, falls die konstitutive Expression des Inhibitors für das Zellwachstum schädlich ist. Der Vektor sollte ein vollständiges Polyadenylierungssignal enthalten, wie von Ausubei F.M. et al. in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987) beschrieben, hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen, so daß die von diesem Vektor transkribierte mRNA passend prozessiert wird. Schließlich soll der Vektor den Replikationsursprung und mindestens einen Resistenzmarker für ein Antibiotikum aus PBR322 haben um Replikation und Selektion in E. coli zu erlauben.
Um eine stabile Zellinie, die den TNF-Inhibitor herstellt, zu selektionieren, kann der Expressionsvektor des Gens für einen selektierbaren Marker, wie einen Drogenresistenzmarker tragen, oder ein komplementierendes Gen für eine Zellinie, der dieses Gen fehlt, wie ein Dihydrofolatreductasegen (dhfr) zum Transformieren einer dhfr Zellinie, wie von Ausubel et al., supra beschrieben. Alternativ kann ein separates Plasmid, das einen selektierbaren Marker trägt, mit dem Expressionsvektor cotransformiert werden.

7. Wirtszellen/Transformation

Der so erhaltene Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle übertragen. Diese Wirtszellen können Mikroorganismen oder Säugerzellen sein.

(c) Mikroorganismen

Es wird davon ausgegangen, daß jeder Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat exogene DNA aufzunehmen und diese Gene und begleitende funktionelle Elemente zu exprimieren, ausgewählt werden kann. Nachdem ein Wirtsorganismus ausgewählt worden ist, wird der Vektor mit dem Fachmann allgemein bekannten Methoden in den Wirtsorganismus überführt. Beispiele für diese Verfahren können in Advanced Bacterial Genetics von R.W. Davis et al Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980) gefunden werden, hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen. In einer Ausführungsform wird bevorzugt, daß die Transformation bei geringer Temperatur stattfindet, da Regulieren der Temperatur als ein Mittel beabsichtigt ist, die Genexpression durch den Gebrauch von funktionellen Elementen wie oben dargelegt zu regulieren. In einer anderen Ausführungsform würde Regulierung der Salzkonzentration während der Transformation benötigt werden, um geeignete Kontrolle über die fremden Gene zu garantieren, falls osmolare Regulatoren in den Vektor eingefügt worden wären.
Es ist bevorzugt, daß der Wirtsmikroorganismus fakultativ anaerob oder aerob ist. Besondere Wirte, die zum Gebrauch in diesem Verfahren bevorzugt sein können, schließen Hefen und Bakterien ein. Spezifische Hefen schließen Hefen des Genus Saccharomyces und besonderes Saccharomyces cerevisiae ein. Spezifische Bakterien schließen Bakterien der Genera Bacillus, Escherichia und Pseudomonas, besonders Bacillus subtilis und Escherichia coli ein. Zusätzliche Wirtszellen sind in Tabelle 1, supra aufgezählt.

(d) Säugerzellen

Der Vektor kann durch verschiedene Verfahren in Säugerzellen in Kultur eingeführt werden, wie Calciumphosphat, DNA Copräzipitation, Electroporation oder Protoplastenfusion. Das bevorzugte Verfahren ist Copräzipitation mit Calciumphosphat wie von Ausubel et al. supra beschrieben.
Es existieren viele stabile Zelltypen, die transformierbar und in der Lage sind, die cDNA Sequenz zu transkribieren und zu translatieren, den TNF-Inhibitorvorläufer zu prozessieren und das reife Protein abzusondern. Die Zelltypen können jedoch variieren im Hinblick auf die Glycosylierung des abgesonderten Proteins und post-translationale Modifikation der Aminosäurereste. Die am besten geeigneten Zelltypen sind daher solche, die einen rekombinaten TNF-Inhibitor hersteilen, der identisch mit dem natürlichen Protein ist.

8. Kultivieren von veränderten Zeilen

Die Wirtszellen werden unter zur Expression des TNF-Inhibitor geeigneten Bedingungen kultiviert. Diese Bedingungen sind im allgemeinen spezifisch für die Wirtszelle und werden im voraus von einem durchschnittlichen Fachmann im Lichte der veröffentlichen Literatur bezüglich Wachstumsbedingungen für solche Zellen und der hier enthaltenen Lehren bestimmt. Zum Beispiel enthält Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., William & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen, Informationen über Bedingungen zum Kultivieren von Bakterien. Ähnliche Information zum Kultivieren von Hefe und Säugerzellen können aus Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) erhalten werden, hierin ausdrücklich durch Verweis miteingeschlossen.
Abhängig von sämtlichen funktionellen Elementen, die in den Vektor eingefügt wurden oder in ihm vorhanden sind, würden jegliche Bedingungen, die zum Regulieren der Expression der DNA Sequenz notwendig sind, während der Schritte der Transformation und des Kultivierens wirksam sein. In einer Ausführungsform werden die Zellen zu einer hohen Dichte in der Gegenwart geeigneter regulatorischer Bedingungen herangezogen, welche die Expression der DNA Sequenz inhibieren. Wenn optimale Zelldichte annähernd erreicht ist, werden die Umgebungsbedingungen zu Gunsten der Bedingungen, die zur Expression der DNA Sequenz geeignet sind, geändert. Es wird daher beabsichtigt, daß die Herstellung des TNF-Inhibitors in einer Zeitspanne nach dem Wachstum der Wirtszellen zur annähernd optimaler Dichte erfolgt, und daß der resultierende Inhibitor einige Zeit nachdem die regulatorischen Bedingungen, die für seine Expression notwendig sind, induziert wurden, geerntet wird.

9. Reinigung

(a) In Mikroorganismen produzierter TNF-Inhibitor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekombinate TNF-Inhibitor nach dem Ernten gereinigt, bevor eine aktive Struktur des Inhibitors vermutet wird. Diese Ausführungsform wird bevorzugt, da die Erfinder glauben, daß das Wiedergewinnen einer großen Menge an erneut gefaltenem Protein durch vorheriges Reinigen des Proteins vereinfacht wird. Es wird jedoch in einer zweiten Ausführungsform bevorzugt, daß dem TNF-Inhibitor erlaubt wird sich erneut zu falten und seine aktive Struktur einzunehmen, bevor er gereinigt wird. In noch einer weiteren bevorzugten zweiten Ausführungsform liegt der TNF-Inhibitor nach Wiedergewinnen aus dem Kulturmedium in seiner erneut gefaltenen aktiven Form vor.
Unter bestimmten Umständen wird der TNF-Inhibitor seine ihm eigene aktive Struktur nach Expression im Wirtsmikroorganismus und Proteintransport durch die Zellwand oder Zellmembran in den periplasmatischen Raum einnehmen. Dies wird im allgemeinen der Fall sein, wenn die für eine geeignete Leadersequenz codierende DNA an die DNA, die für das rekombinante Protein codiert, gebunden wurde. Falls der TNF-Inhibitor seine ihm eigene aktive Struktur nicht einnimmt, müssen sämtliche Disulfidbrücken, die sich ausgebildet haben, unwoder jegliche nichtkovalente Interaktionen, die aufgetreten sind, zuerst durch denaturierende und reduzierende Agentien unterbrochen werden, z.B. Guanidiniumchlorid und β-Mercaptoethanol, bevor dem TNF-Inhibitor erlaubt wird, seine aktive Struktur, nach Verdünnung und Oxidation dieser Agentien unter kontrollierten Bedingungen, einzunehmen.
Zum Reinigen vor und nach der erneuten Faltung werden bevorzugt einige Kombinationen der folgenden Schritte eingesetzt: Anionenaustauschchromatographie (MonoQ oder DEAE-Sepharose), Gelfiltrationschromatographie (Superose), Chromatofocusing (MonoP) und Chromatographie aufgrund hydrophober Wechselwirkungen (Octyl- oder Phenylsepharose). Von besonderem Wert ist die Affinitätschromatographie unter Verwendung von TNF (beschrieben in Beispiel 1).

(b) In Säuerzellen hergestellter TNF-Inhibitor.

Der in Säugerzellen hergestellte TNF-Inhibitor wird mit Hilfe von Schritten, die Ionenaustauschchromotographie und Affinitätschromatographie einschließen unter Verwendung von TNF, wie in Beispiel 1 beschrieben, aus konditioniertem Medium gereinigt. Es wird für den Fachmann offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Variationen der Verfahren und Produkte der vorliegenden Erfindung gemacht werden können. So ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung Modifikationen und Variationen dieser Erfindung zur Verfügung stellt, vorausgesetzt, daß sie im Rahmen der angefügten Ansprüche und deren Äquivalente liegen. Wie vorher angedeutet, sind die TNF-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung zum Gebrauch als therapeutische Agenzien beabsichtigt und sollen daher in pharmazeutisch verträglichen Trägern formuliert werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die TNF-Inhibitoren chemisch modifiziert sein, um die pharmakinetischen Eigenschaften der Moleküle zu verbessern. Ein Beispiel würde das Koppeln der TNF-Inhibitoren an ein polymeres Material mit hohem Molekulargewicht wie Polyethylenglycol sein. Zusätzlich können Interleukin-1 Inhibitoren in Verbindung mit den TNF-Inhibitoren verabreicht werden. Diese therapeutische Kombination wird besonders nützlich für die Behandlung von Entzündungs- und degenerativen Krankheiten sein.
Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene, zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der hier beanspruchten Erfindung. Alle Druckschriften und Referenzen, die in den folgenden Beispielen zitiert werden, sind ausdrücklich durch Verweis hierin miteingeschlossen.

BEISPIEL 1. Proteinherstellung

A. Material

Das Gen für TNF Alpha (TNFα) wurde von British Biotechnology, Limited, Oxford, England erworben. DEAE-Sepharose CL-6B Trägersubstanz und Mono-Q HR5/5, HR10/10 FPLC Säulen wurden von Pharmacia, Inc., Piscataway, New Jersey erworben. Affigel-15 Trägermaterial und der Biorad Proteintestkit wurden von Biorad, Richmond, California erworben, Tween 20, Ammoniumbicarbonat, Natriumphosphat, PMSF, Natriumbicarbonat, Dithiothreitol, Kristaliviolett und Actinomycin D wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri erworben. Endoproteinase Lys-C, Endoproteinase Asp-N und TRIS wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana erworben. Hexafluoroaceton wurde von ICN Biomedicals, Costa Mesa, California erworben. Cyanogenbromid, Trifluoressigsäure und Guanidinhydrochlorid wurden von Pierce Chemicals, Rockford, Illionis erworben. Acetonitril und HPLC Wasser wurden von der J.T. Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey erworben. Harnstoff wurde von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland erworben. [³H]-Jodessigsäure wurde von New England Nuclear, Boston, Massachusetts erworben. [¹²&sup5;1]-TNFα wurde von Amersham, Arlington Heights, Illionis erworben. Rekombinantes menschliches TNFα wurde von Amgen, Thousand Oaks, Califomia erworben. C8-reverse Phase- Säulen (25 cm x 4,6 mm) wurden von Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana erworben. Eine C8-Microbor reverse Phase-Säule (7 Mikron, 22 cm x 2,1 mm) wurde von Applied Biosystems, Foster City, California erworben. Microtiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden von VWR Scientific, Batavia, Illinois erworben. McCoys 5A Medium und fötales Kälberserum wurde von Gibco, Grand Island, New York erworben. RPM-1 1640 Medium und L-Glutamin wurde von Mediatech, Herndon, Virginia erworben. Trypsin wurde von K.C. Biologicals, St. Lenexa, Kansas erworben. ME180, U937 und L929 Zellinien wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland erhalten.

B. Test für den TNF-Inhibitor

Zwei Arten von Tests wurden eingesetzt, um den TNF-Inhibitor zu identifizieren. Einer dieser Test ist ein Cytotoxizitäts-Test. Der andere ist ein Gelshifttest.

1. Cytotoxizitäts-Test

Der Cytotoxizitäts-Test wurde mit Actinomycin D behandelten ME180 Zellen und L929 Zellen wie beschrieben von Ostrove und Gifford (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 354- 358 (1979)) und Aggarwal und Essalu (J. Biol. Chem. 262,10000-10007 (1987)) beschrieben. L929 Zellen (CCLI: American Type Culture Collection) wurden in McCoy's 5A Medium mit 10% fötalem Kälberserum gehalten. Konfluente Kulturen wurden kurz mit 0,25% Trypsin in einer physiologischen Lösung, die 5mM EDTA enthält, behandelt und mit frischem Medium resuspendiert. Annähernd 2 x 10&sup4; trypsinisierte Zellen wurden pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen (Corning) ausgesäht und für 24 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde Actinomycin D zugesetzt zu einer Endkonzentration von 0,25 µg pro ml. Nach zwei Stunden wuden Proben, die TNF und TNF-Inhibitor enthielten, den Vertiefungen zugesetzt und die Inkubation über Nacht bei gleicher Temperatur fortgesetzt. Nach Betrachten unter dem Mikroskop wurde das Medium abgegossen und die Vertiefungen mit PBS ausgespült. Die Vertiefungen wurden dann mit einer Lösung aus 0,1% Kristallviolett, 10% Formaldehyd und 10mM Kaliumphosphat, pH 6,0 für 5 Minuten aufgefüllt, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Der Farbstoff wurde mit 0,1 M Natriumcitrat in 50% Ethanol, pH 4,2, extrahiert. Die Absorbtion des Farbstoffs in lebende Zellen wurde bei 570 nm unter Zuhilfenahme des kinetischen Mikroplattenlesegerätes, (Molecular Devices Corp. CA) bestimmt. Ein Beispiel für diesen Test ist in Abb. 1 gezeigt. In Gegenwart des TNF-Inhibitors ist der zytotoxische Effekt von TNF verringert.

2. Gelschifttest

Der Gelshifttest erfordert den Gebrauch eines nativen Polyacrylamidgelelektrophoresesystems. Diese native 4% Gelelektrophorese wurde gemäß Hedrick und Smith (Arch. Biochem. and Biophysics 126, 155-164 (1968) durchgeführt. Nach C8 Chromatographie wurde das jodierte TNF (Amersham) mit dem TNF-Inhibitor aus Beispiel 1.C. gemischt und für 30 Minuten bis 2 Stunden inkubiert. Neben dem jodierten TNF allein wurde diese Mischung auf ein 4% natives Gel geladen und elektrophoretisch aufgetrennt. Nachdem das Gel mit 10% Essigsäure fixiert und gewaschen worden war, wurde ein Film darübergelegt, um eine Radioautography zu erstellen. Wie in Abb. 2 gezeigt, wandert der Komplex von TNF und TNF-Inhibitor anders als TNF allein. Dieser Gelshifttest wurde benutzt, um zu bestimmen, welche Fraktionen TNF-Inhibitor in den Eluaten der DEAE- CL6B Säulenchromatotraphie enthalten.

C. Reinigung des 30 kDa TNF-Inhibitor

Zwanzig Liter Urins von einem Patienten, bei dem eine renale Dysfunktion diagnostiziert worden war, wurden mit einer Amicon YM5 Membran auf 200 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde dann bei 4ºC gegen 0,025 M Tris-HCl, pH 7,5, dialysiert und anschließend für 30 Minuten in einem JA14 Rotor bei 10.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf eine 40 x 4,5 cm DEAE-Sepharose CL-6B Säule geladen, die mit 0,025 M Tris- HCl, pH 7,5, equilibriert worden war, und ausgiebig mit Equilibrierungspuffer gespült, bis die OD&sub2;&sub8;&sub0; der Ausflußfraktionen auf den Grundwert zurückgekehrt war. Die Chromatographie wurde unter Gebrauch eines linearen Gradienten von 0-0,05 M Natriumchlorid in 0,025 M Tris-HCl, pH 7,5 durchgeführt und durch OD&sub2;&sub8;&sub0; gemessen. Die Säulenfraktionen wurden gesammelt und unter Verwendung des nativen Geltests auf TNF- Inhibitoraktivität getestet. Der eluierte TNF-Inhibitor eluiert in einem ziemlich scharfen Maximum bei 80 mM NaCl.
Abb. 6A zeigt das OD&sub2;&sub8;&sub0; Profil der DEAE Sepharose CL-6B Chromatographie von 20 I Urin. Abb. 6B zeigt das mit dem nativen Geltest korrespondierende Audioradiogramm, welches ein Maximum des TNF-Inhibitor in Fraktionen 57-63 anzeigt, welches bei ungefahr 80 mM NACl liegt.
Der TNF-Inhibitor wurde weiter unter Verwendung einer TNF-Affinitätssäule gereinigt. Rekombinates TNF wurde in BL21/DE3 exprimiert und machte ungefahr 10-20% des gesamten Zellproteins aus. Das Zellsediment wurde bei 20.000 psi mit einer French- Presse behandelt und das lösliche Material bei 4ºC gegen 0,025 M Tris-HCl, pH 8,0 dialysiert. Das dialysierte Lysat wurde durch einen 0,2 µm Filter flltriert und auf eine Mono- Q FPLC Säule geladen, die mit 0,025 M Tris-HCl, pH 8,0, equilibriert war. Es wurde ein linearer Gradient von 0 bis 0,5 M NaCl in 0,025 M Tris-HCl, pH 8,0, benutzt und mit OD&sub2;&sub8;&sub0; gemessen. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und durch SDS-PAGE auf ihre Reinheit hin analysiert. Der daraus folgende TNFα Pool war gemessen in Coomassie gefarbter SDS-PAGE, ungefähr 90% rein, und war gemäß einem Bradford Proteintest der Lysozym als Standard verwendete und einem ME180 Biotest der TNFα von Amgen als Standard verwendete (Bradford, M. Annal. Biochem. 72, 248-254 (1976)) voll aktiv.
TNFα wurde in einem Amicon Centriprep-10 Filter auf ungefähr 25 mglml konzentriert, gegen 100 mM NaHCO&sub3;, pH 8,5 dialysiert, und an Affigel-15 Trägermaterial mit 25 mg TNF/ml Trägermaterial gekoppelt. Eine Kopplungseffizienz von mehr als 80% ergab ein Trägermaterial mit großer Kapzität, das weiter benutzt wurde, um den TNF-Inhibitor zu reinigen.
Zu den vereinigten Fraktionen der DEAE CL-6B Säule wurde PMSF mit einer Endkonzentration von 1-4 mM zugesetzt und auf eine 4 x 1 cm TNF-Affinitätsäule geladen, die bei 4ºC mit 0,025 M Tris-HCl, pH 7,5 mit einer Flußrate von 0,1 ml/Min. equilibriert war. Die Säule wurde dann mit 0,025 M Tris-HCl, pH 7,5, gespült bis der OD&sub2;&sub8;&sub0; Wert der Ausflußfraktionen auf den Grundwert zurückgekehrt ist. Daraufhin wurde die Säule mit 0,05 M NaPhos, pH 2,5, eluiert und die OD&sub2;&sub8;&sub0; gemessen. Abb. 7 zeigt das OD&sub2;&sub8;&sub0; Profil der 0,05 M NaPhos, pH 2,5 Elutionen von der TNF-Affinitätssäule.
Der TNF-Inhibitor wurde durch Reverse Phase HPCL auf einer Syncropak RP-8 (C8) Säule bis zur Homogenität gereinigt. Die Fraktionen des OD&sub2;&sub8;&sub0; Maximums der TNF Affinitätssäule wurden vereinigt und sofort auf eine mit 0,1% TFA/H&sub2;O equilibrierte RP-8 Säule geladen, und ein linearer 1%/Min. Gradient von 0,1% TFA/Acetonitril wurde von 0- 50% gefahren und durch OD&sub2;&sub1;&sub5; und OD&sub2;&sub8;&sub0; gemessen. Die Fraktionen wurden gesammelt und auf ihre Bioaktivität unter Verwendung von L929 Zellen und dem nativen Geltest, wie in Beispiel 1.B. beschrieben, getestet. Beide der Tests zeigten Bioaktivität in Fraktionen 28-32, was mit dem Maximum gemessen bei dem OD&sub2;&sub1;&sub5; und OD&sub2;&sub8;&sub0; das bei 18% Acetonitril eluiert, korrespondiert.
Abb. 8A und 8B zeigen das chromatographische Profil der vereinigten TNF-Affinitätssäulenfraktionen auf einer Syncropak RP-8 Säule mit der entsprechenden Bioaktivität aus dem L929 Cytotoxizitäts-Test. Abb. 8B zeigt eine silbergefärbte 15% reduzierte SDS-PAGE der vereinigten Fraktionen der RP-8 Säule, welche eine einzige Bande bei 30 kDa zeigt.

D. Charkterisierung der Proteinkomponente des 30 kDa TNF-Inhibitors

Der 30 kDa TNF-Inhibitor ist ein Glycoprotein wie unter Verwendung von Concanavalin A-Peroxidase festgestellt wurde, nachdem das Protein auf Nitrocellulosefilter übertragen worden war. Dieses Verfahren ist eine Modifikation von Wood und Sarinana (Analytical Biochem. 69, 320-322 (1975)), die Glycoproteine direkt in Acrylamidgelen identifizieren. Die Anfärbung des Gylcoproteins durch Peroxidase wurde unter Vewendung von Peroxidase konjugiertem Con A oder nichtkonjugiertem Con A durchgeführt. Wenn nichtkonjugiertes Con A benutzt wurde, wurde der Nitrozellulosefilter für eine Stunde in einer Lösung, die Con A (0,5 mg/ml Miles Laboratory) in Phosphatpuffer, pH 7,2, (PBS) enthält inkubiert und dann 3 x 5 Min. in PBS gewaschen. Der gewaschene Filter wurde in Meerrettichperoxidase (0,1 mg/ml, Sigma Chemical) für eine Stunde inkubiert. Nachdem der Filter 3 x 15 Min. in PBS gewaschen wurde, wurde er in eine Lösung eingetaucht, die 3 mglml 4-Chloro-1-naphtol (Sigma Chemical) und 12,5 µl/ml an Hydrogenperoxid enthält, bis die Farbe sich entwickelt hatte.
Glycoprotein wurde als violette Farbe gesehen. Sobald der Filter entwickelt worden war, wurde ein Photo gemacht, wie in Abb. 3 gezeigt.
Chemische Deglycosylierung des TNF-Inhibitors wurde nach der Methode von Edge, Faltynek, Hof, Reichert und Weber (Analytical Biochem. 118, 131-137 (1981)) durchgeführt. Eine Mischung aus 0,25 ml Anisol (Eastman Kodak) und 0,5 ml Trifluormethansulfonsäure (Eastman Kodak) wurde auf 4ºC abgekühlt und dann 1-200 ng trockenen TNF- Inhibitors in 3 µl dieser Mischung gelöst. Das Reaktionsgefäß wurde mit Stickstoff gespült und dann 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das deglycosylierte Protein wurde in einer SDS-PAGE (Abbildung 4) analysiert. Das Molekulargewicht des chemisch behandelten TNF-Inhibitors ist ungefähr 18.000 Dalton. Eine Bande von 14.000 Dalton war ebenfalls zu sehen, aber dies kann ein proteolytisches Fragment des deglykosylierten TNF-Inhibitors sein.
Die enzymatische Deglykosylierung wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (Genzyme Corp.) unter Verwendung von N-Glycanase durchgeführt, außer daß der TNF-Inhibitor für 5 bis 6 Std. anstatt über Nacht mit N-Glycanase inkubiert wurde. Es wird gezeigt, daß das Molekulargewicht der deglykosylierten Form des denaturierten TNF-Inhibitors bei ungefähr 20.000 Dalton liegt (Abb. 5). Wenn der Inhibitor vor der Deglykosylierung nicht denaturiert wird, ist das Molekulargewicht des deglykosylierten Proteins ungefähr 26.000 Dalton.

E. Deglycosylierter 30kDa TNF-Inhibitor bindet an TNF

Radioaktiv markierter TNF-Inhibitor (30 kDa) wurde mit TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) behandelt, um Kohlenhydrate zu entfernen und die TFMSA wurde durch HPLC vom Protein getrennt. Die Proteinfraktion wurde mit TNF-Affigel für 1 Std. bei 4ºC gemischt, und das gesamte nicht gebundene Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Das TNF-Affigel wurde gründlich mit 50 mM NaPO&sub4;, pH 2,5, gewaschen. Die Radioaktivität wurde in jeder Fraktion gezählt und ebenso durch SDS-PAGE analysiert. Nichtspezifisches Binden des TNF-Inhibitors wurde unter Verwendung von Anhydrochymotrypsin-Affigel gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß deglycosylierter TNF-Inhibitor (30 kDa) an TNF bindet. Tabelle 2
In einem anderen Experiment wurde radioaktiv markierter TNF-Inhibitor (30 kDa) reduziert und dann mit N-Glycanase deglycosyliert. Nach Deglycosylierung wurde das Material mit 13 mM oxidiertem Glutathion (GSSG) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und 5-fach mit 50 mM Tris verdünnt. Dann wurde Cystein zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt. Das Material wurde bei 4ºC für 16 Std. inkubiert und dann mit einem TNF-Affigel für 1 Std. bei 4ºC gemischt. Nicht gebundenes Material wurde entfernt, und das Gel wurde gründlich mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,53 gewaschen. Das gebundene Material wurde mit 50 mM NaPO&sub4;, pH 2,5, eluiert. Die Radioaktivität wurde in jeder Fraktion gemessen und eine SDS-PAGE von jeder Fraktion durchgeführt. Wie aus Tabelle 3 und Abb. 18 zu sehen, bindet der deglycosylierte und reoxidierte TNF-Inhibitor ebenfalls an TNF. Tabelle 3

Beispiel 2. Sequenzieren des 30 kDa TNF-Inhibitors

N-terminale Sequenzen wurden unter Verwendung des Applied Biosystems Protein Sequencers, Modelle 470 und 477, bestimmt. Vor dem Sequenzieren wurden die von einer Vielzahl von proteolytischen Enzymen hergestellten Peptide auf einer Applied Biosystems C8-Microbore HPLC-Säule (22 cm x 2,1 mm) gereinigt.

A. Aminoterminales Sequenzieren

Ungefähr 250 pMol von reverse-Phase-(RP-8)-gereinigtem TNF-Inhibitor wurden direkt auf einen Polybrenfilter geladen und automatischem Edman-Abbau unterworfen. Die resultierende Sequenzinformation ergab die ersten 30 Aminosäuren des Moleküls.

B. Endoproteinase Lys-C Verdau von nativem Protein

Ungefähr 250 pMol (5 µg) von reverse-Phase-gereinigtem TNF-Inhibitor wurden mit einem µg Endoproteinase Lys-C verdaut. Der 12-Stunden-Verdau bei 25ºC wurde in der Gegenwart von 1 M Harnstoff, 0,01% Tween 20 und 150 mM NH&sub2;HCO&sub3;, pH 8,0, durchgeführt. Vor der Peptidreinigung wurde der Verdau durch Inkubation für 1 Stunde reduziert, gefolgt von Zugabe von 50-fachem molarem Überschuß von Dithiothreitol, oder reduziert und alkyliert durch eine weitere einstündige Inkubation bei 37ºC unter Verwendung eines zweifachen molaren Überschusses von [³H]-Iodessigsäure über Dithiothreitol. Abbildung 9A zeigt das reverse-Phase-HPLC-Muster dieses Verdaus. Abbildung 98 zeigt das reverse-Phase-HPLC-Muster dieses Verdaus, gefolgt von Alkylierung.

C. Endoproteinase Asp-N Verdau von nativem Protein

Ungefähr 250 pMol (5 µg) des reverse-Phase-gereinigten TNF-Inhibitors wurden mit 0,5 - 2,5 µg Endoproteinase Asp-N verdaut. Der 12 - 18 Stunden-Verdau wurde bei 37ºC in der Gegenwart von 1 M Guanidin-HCl, 0,01 % Tween 20 und 150 mM Naphos, pH 8,0, durchgeführt.
Vor der Peptidreinigung wurde der Verdau reduziert und alkyliert, wie in Beispiel 2.B. Abbildung 10 zeigt das reverse-Phase-HPLC-Muster zweier solcher Verdaue.

D. Reduktion/Carboxymethylierung von Protein

Der reverse-Phase-HPLC-gereinigte TNF-Inhibitor wurde reduziert und mit [³H]- Iodessigsäure, wie von Glaser et al. in Chemical Modiflcations of Proteins, S.103 - 104 (1975) beschrieben carboxymethyliert, außer daß zwei aufeinanderfolgende Reduktionszyklen gefolgt von Alkylierung benutzt wurden. Das Protein wurde erneut vor dem proteolytischen Verdau durch reverse-Phase-HPLC gereinigt.

E. Endoproteinase V8 Verdau von Reduktion/Carboxymethtlierung von Protein

Ein analytischer Verdau wurde durchgeführt, indem 55 pMol (ungefähr 1 µg) des reduzierten carboxymethylierten TNF-Inhibitors in 150 mM NaHCO&sub3;, pH 8,0, gelöst wurden und mit 0,2 µg V8-Protease für 18 Std. bei 25ºC verdaut wurden. Reverse-Phase-HPLC (Abbildung 11A) zeigte drei sequenzierbare Peptide und zeigte, daß ein Verdau in größerem Maßstab angebracht war. Ungefähr 220 pMol (4,5 µg) an reduziertem carboxymethyliertem TNF-Inhibitor wurden mit 1 µg V8-Protease für 5 Std. bei 25ºC verdaut, dann zusätzliche 0,5 µg V8-Protease zugesetzt und die Verdaue für 16 Std. fortgesetzt. Abb. 11B zeigt die reverse-Phase-HPLC des V8-Verdaus in großem Maßstab.

F. Vollständige Primärstruktur des 30 kDa TNF-Inhibitors basierend auf Pedtidsequenzen und cDNA-Sequenz

Verschiedene Peptidfragmente wurden gemäß der in Beispiel 4 erhaltenen cDNA- Sequenz linear angeordnet. Dies wird in Abb. 19 gezeigt. Reste, die nicht durch Proteinsequenzieren identifiziert wurden, sind die Reste mit den Nummern 14, 42, 43, 44, 96, 97,105,107,108 und 110 bis 119. Die Sequenz Gin-Ile-Glu-Asn ist offensichtlich der Carboxyterminus des 30 kDa TNF-Inhibitors.

Beispiel 3. Der 30 kDa TNF-Inhibitor wird durch U937-Zeilen hergestellt, die mit PMA und PHA stimuliert wurden.

Die Monocyten-ähnliche Zellinie U937 wurde bei 37ºC in RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, bis zu einer Zelldichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml herangezogen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation entfernt und in fünf verschiedenen 100 cm²-Petrischalen resuspendiert, bei 2 x 10&sup6; Zellen/ml in RPMI ohne Serum, das 10 ng/ml PMA (Phorbol 12 - Myristat 13 - Acetat) und 5 µg/ml PHA-P (Phytohämagglutinin- P) enthielt. Das konditionierte Medium einer Platte wurde nach nur 10 Min. Inkubation geerntet und als Nullzeitkontrolle benutzt. Das Medium der restlichen Platten wurde nacheinander bei 24 Std., 48 Std., 72 Std. und 96 Std. nach dem Ausplattieren entfernt. Das in diesen Proben enthaltene Protein wurde auf jeweils ungefähr 400 µl durch Centriprep-10 (Amicon Corp.)-Behandlung konzentriert. Jede 400 µl-Probe wurde dann mit einem gleichen Volumen an Affigel-15 (Biorad Corp.)-Herstellung gemischt, die ungefahr 10 mg/ml an gereinigtem menschlichem rekombinatem TNFα enthielt, das in unserem Labor hergestellt worden war. Für dieses TNFα war gezeigt worden, daß es bioaktiv ist durch seine Toxizität gegenüber Murein-L929-Zellen, bevor es an Affigel-15-Gelmaterial gebunden war.
Das konditionierte Medium wurde chargenweise bei Raumtemperatur mit dem TNFα- Affinitäts-Gelmaterial für 2 Std. inkubiert. Die nicht gebundene Fraktion wurde nach Zentrifugation des Gelmaterials entfernt, und das Gelmaterial anschließend mit 1 ml (500 µl, 2x) PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5), welches 0,1% Gelatine enthielt, gewaschen. Gebundenes Material wurde mit einer 25 mM-Lösung an monobasischem Natriumphosphat, pH 2,5 (400 µl, 2x) eluiert. Jeweils 40 µl der nicht gebundenen, gewaschenen und eluierten Fraktionen wurden getrocknet, in 10 µl von 25 mM Tris pH 7,5, resuspendiert, mit 2 µl (100 pCi) an ¹²&sup5;I-TNFα (400-800 Ci/mMol, Amersham) gemischt und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischungen wurden dann mit 5 µl von 40% Sucrose und 1 ml an 0,1 % Bromphenolblau gemischt und auf ein 4%iges natives Acrylamidgel, wie in Beispiel 1.B. beschrieben, geladen. Das konditionierte Medium aller Proben außer der Nullkontrolle enthielt TNF-Bindungsaktivität in diesem Test wie in Abb. 15 gezeigt.
Die restlichen 300 µl einer jeden Probe (erste niedrig-pH-Elution) wurden auf eine C8 HPLC-Säule geladen und mit einem linearen Gradienten von Acetonitril für 60 min (1%/min, 1 ml/min Flußrate, 1 ml Fraktionen wurden gesammelt) eluiert. Jede Fraktion wurde getrocknet und in 50 µl PBS + 0,1 % Gelatine resuspendiert. 10 µl jeder dieser Proben wurde mit ¹²&sup5;I-TNFα wie oben gemischt und durch ein natives Polyacrylamidgel analysiert. TNFα-Bindungsaktivitäten wurden in Fraktionen detektiert, die 33% und 36% Acetonitril, wie in Abb. 16 gezeigt, entsprechen.

Beispiel 4. Analyse von Messenger-RNA von PMA/PHA-behandelten U937-Zeilen

U937-Zellen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben bis zu einer Dichte von 1 x 10&sup6; Zellen/ml herangezogen und dann in serumfreiem Medium bei 2 x 10&sup8; Zellen/ml mit oder ohne PMA (10 ng/ml) und PHA (5 µl/ml) resuspendiert. Proben wurden nach 1 Std. + /-PMA/PHA und 17 Std. lediglich + PMA/PHA abgenommen. Gesamt-RNA wurde aus den Zellen nach dem Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren von Chomczynski und Sacci (Analytical Biochemistry 162:156 - 1591(1987)) hergestellt. Poly-A&spplus;- RNA wurde durch Anlagern an Oligo-dT-Cellulose (Bethesda Research Labs) hergestellt. Acht Mikrogramm jeder Poly-A&spplus;-RNA wurden dann auf ein 6,6% Formaldehyd, 1,2% Agarose-Gel geladen. Die im Gel befindliche RNA wurde dann auf eine Zetaprobe-Membran (BioRad) geblottet. Die Membran wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, behandelt, um eine menschliche genomische DNA-Genbank mit Oligonukleotidsonden zu screenen. 1 x 10&sup6; cpm/ml einer markierten, einzelsträngigen DNA-Sonde (Polynucleotidkinase) wurde zugesetzt. Die Sequenz dieser Sonde ist:
5'TTGTGGCACTTGGTACAGCAAAT3'
und sie stimmt überein mit den Basen 410-433 der in Abb. 13 gezeigten Sequenz. Nach Über-Nacht-Hybridisierung bei 65ºC wurde die Membran einmal bei Raumtemperatur in 6 x SSC, 0,1% SDS und einmal bei 65ºC in derselben Lösung gewaschen und dann mit einem Röntgenfilm für 72 Std. exponiert. Das in Abb. 17 gezeigte Autoradiogramm zeigt, daß PMA/PHA-Behandlung von U937-Zellen in serumfreiem Medium für 1 Std. deuuich die Expression des 30 kDa TNFα-Inhibitor-Messenger-RNA stimuliert und daß bei 17 Std. Behandlung diese Messenger-RNA in den Zellen so gut wie abwesend ist. Die Molekulargröße der 30 kDa-TNFα-Inhibitor-Messenger-RNA ist ungefahr 2,4 Kilobasen, basierend auf diesem Experiment.

Beispiel 5. Herstellen einer menschlichen genomischen DNA-Genbank für den 30 kDa-TNF-Inhibitor

Menschliche genomische DNA wurde mit Sau3Al partiell verdaut und nach Größe selektioniert. DNA mit einer durchschnittlichen Größe von 15 kB wurde in die BamHI-Stelle des Bakteriophagen Lambda Charon 30 ligiert (Rimm, D.L., Horness, D., Kucera, J. und Blattner, F.R. Gene 12:301-309 (1980)). Die Phagen wurden in E. coli CES 200 propagiert und amplifiziert.

A. Sonden

Die vier degenerierten Oligonukleotid-Hybridisierungssonden, die in Tabelle 4 aufgezählt sind, wurden auf einem Applied Biosystems DNA Synthesizer synthetisiert. Jede Sondenmischung bestand aus allen möglichen DNA-Sequenzen, die für die gegebene Peptidsequenz codieren. Tabelle 4
Oligonudeotide wurden mit [gamma -³²P]-ATP (Amersham Inc., Arlington Heights, IL) und T4-Polynudeotidkinase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) gemäß den Instruktionen des Herstellers markiert, so daß sie eine spezifische Aktivität von 6-9 x 10&sup6; c.p.m./picomol hatten.

B. Methoden:

8,4 x 10&sup5; Lambdaphagen, die menschliche genomische DNA enthielten, wurden plattiert und in Duplikaten auf Nitrocellulosefilter transferiert. Diese Filter wurden mit 1 pMol/ml TNFBP-P2'-Sonde für 16 Std. in einer Lösung hybridisiert, die 1,0 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat, 2 x Denhardt-Lösung (Denhardt, D.T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 23: 641-646 (1966)), 0,1% SDS, 0,05% Natriumpyrophosphat und 150 µg/ml Hefe-tRNA bei einer Temperatur von 52ºC hybridisiert. Diese Temperatur ist 2ºC unter dem errechneten Tm für die meisten AT-reichen Mitglieder des Oligonucleotidpools. (Suggs, S.V. in Developmental Biology Using Purified Genes, (Brown, D.D., und Fox, C.F., Hrsg.) Academic Press, New York, S.683-693 (1981)). Nach dem Hybridisieren wurden die Filter für 45 min bei geeigneter Temperatur und dreimaligem Austauschen von 1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat und 0,5% SDS gewaschen. Ein stringenter Waschschritt von 8 min wurde bei der errechneten Tm (d.h., 2ºC über der Hybridisierungstemperatur) der meisten AT-reichen Mitglieder des Pools durchgeführt. Die Filter wurden dann getrocknet und für 40 Std. mit einem lntensivierungsschirm bei -70ºC autoradiographiert.
11 positive hybridisierende Plaques wurden detektiert, und diese wurden isoliert und amplifiziert. Die Fähigkeit dieser Klone, mit TNFBP-P20, TNFBP-P3' und TNFBP-P4 zu hybridisieren, wurde unter Verwendung ähnlicher Methoden getestet. Ein Klon (TNFBP- 8) hybridisierte mit allen vier Oligonucleotiden. Dieser Klon wurde plaquegereinigt und amplifiziert. Unter Verwendung von Lambda-Sorb (Promega Corporation, Madison, Wi) wurde DNA dieses Klons gereinigt, gemäß einem vom Hersteller beschriebenen Verfahren.
1 Mikrogramm dieser DNA wurde dann mit Sau3AI verdaut und die Fragmente in den BamHI-verdauten M13-Sequenzierungsvektor mp 18 (Yanish-Perron, C., Viera, J. und Messing, J. Gene 33:103-119 (1985)) subkloniert. M13-Klone wurden dann in Duplikaten auf Nitrocellulosefilter übertragen und mit den Oligonucleotidsonden in Tabelle 4 unter Verwendung von vorher beschriebenen Bedingungen hybridisiert. Positive Subklone wurden gereinigt und sequenziert (Sanger, F. und Coulson, A.R.J. Mol. Biol. 94:441-448 (1975)) unter Verwendung einer modifizierten T4-DNA-Polymerase (Sequenase, US Biochemical Corp., Cleveland, OH) wie vom Hersteller beschrieben und unter Verwendung der degenerierten Sonden als Primer, um den erhaltenen Klon oder die erhaltene Sequenz unter Verwendung dieser Sonden zu identifizieren. Unter den erhaltenen Sequenzen sind solche der Subklone TNFBP-M13-Sau3A-P2'-2- und TNFBP-M13-Sau3A-P4 Primer P3, P3', P2', P2 und P4. Die Sequenzdaten sind in Abb. 13 dargestellt. Die Sequenz enthält DNA, die für mindestens 48 Aminosäuren von 30 kDa TNF-Inhibitorpeptiden codiert, die sich von denen, die von der Sonde spezifiziert werden, unterscheiden und bestätigt daher, daß der Klon TNFBP8 für einen TNF- Inhibitor codiert. Die Sequenz zeigt ebenfalls, daß das Gen für den TNF-Inhibitor mindestens ein Intron (GTAGGGGCAA ... CCCCATTCACAG) einschließt. Schließlich zeigt diese Sequenz, daß der 30 kDa TNF-Inhibitor als ein Vorläuferprotein synthetisiert wird und daß eine proteolytische Spaltung an der Arg-Asp-Sequenz benötigt wird, um das reife, aktive Protein zu erzeugen.

Beispiel 6. Herstellung und Screening einer cDNA-Genbank von mRNA aus U937 Zellen, die mit PMA/PHA stimuliert waren.

Das in Beispiel 4 beschriebene Experiment zeigt, daß U937-Zellen, die mit PMA/PHA für 1 Std. behandelt werden, einen Pool an Messenger-RNA enthalten sollten, der für den TNF-Inhibitor (30 kDa) angereichert ist. Dementsprechend wurde eine cDNA-Genbank aus Polya&spplus;-RNA, die aus mit PMA/PHA behandelten U937-Zellen erhalten worden war, hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Doppelsträngige, geradendige cDNA wurde aus ungefähr 5 µg PolyA+-RNA erhalten, im wesentlichen wie von Gubler, U. und Hoffman, B.J., (1983 Gene, 25:263) beschrieben, unter Verwendung von chargengeprüften Reagenzien (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Verfahren. Ungefähr 1 µg doppelsträngiger erhaltener cDNA wurde mit dem Enzym EcoRI-Methylase behandelt, und EcoRI-Linker mit der Sequenz d(pCCGGMTTCCGG) (New England Biolabs, Beverly, MA) wurden via T4-DNA-Ligase angefügt, gefolgt von einem Verdau von Endonuclease EcoRI. Diese DNA wurde dann in einen Lambda- Bakteriophagen-Klonierungsvektor gt10 (Young, R.A. und Davis, R.W. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:1194-1198), der mit EcoRI verdaut worden war ligiert, und das Produkt in infektiöse Lambda-Bakteriophagenpartikel unter Verwendung des Lambda- DNA-Verpackungsextrakts (Gigapack II Gold) erhalten von Stratagene (La Jolla, CA) gemäß ihrem Protokoll, verpackt. Dieses Lambda-Lysat (cDNA-Genbank) wurde dann benutzt, um den E. coli-Stamm C600 hflA zu infizieren, und es wurde gezeigt, daß die Genbank ungefähr 2,5 x 10&sup6; rekombinante Mitglieder enthält.
Ungefähr 4 x 10&sup5; Mitglieder dieser Genbank wurden auf den E. coli-Stamm C600 hflA (5 x 10&sup4; p.f.u./Platte;p.f.u.=Phagen-formende Einheiten (phage forming units)) ausplattiert. Zweifaches Abheben von Nitrocellulosefiltern wurde durchgeführt, und die Filter wie in Beispiel 5 zum Screenen der menschlichen genomischen Genbank beschrieben behandelt. Die DNA auf den Filtern wurde dann mit derselben ³²P-markierten Sonde wie in Beispiel 4 beschrieben hybridisiert, außer daß die Inkubationstemperatur 42ºC war. Von 4 x 10&sup5; ausplattierten rekombinanten Phagen hybridisierten 3 Duplikatplaques mit dieser Sonde. Diese wurden weiter reisoliert und wie oben hybridisiert und mit einer zusätzlichen synthetischen Sonde mit der Sequenz: 5'CCCCGGGCCTGGACAGTCAUGTA 3' hybridisiert.
Diese Sonde entspricht mit den Basen 671-694 des menschlichen genomischen TNF- Inhibitor-Klons, der in Abb. 13 gezeigt ist, überein. Beide Sonden hybridisieren mit allen drei Plaques, die mit dem ersten identifiziert wurden.
Nach Plaquereinigung wurde DNA aus diesen drei Klonen hergestellt und in die EcoRI- Stelle des M13-Vektors MP18 und MP19 subkloniert, wie in Beispiel 5 beschrieben. Jede dieser cDNAs besteht aus zwei EcorI-Fragmenten, eins von ungefähr 800 Bp, welches allen drei Klonen gemeinsam ist, und ein anderes 1300 Bp, 1100 Bp oder 1000 Bp-Fragment, abhängig von dem Klon. Die wahrscheinliche Herkunft des einzelnen Ecor 1-Fragments in jedem Klon ist unvollständige Elongation durch das Enzym reverse Transkriptase während der ersten Strangsynthese der cDNA. Daher repräsentieren diese EcorI-Fragmente wahrscheinlich das 5'-Ende der TNF-Inhibitor-mRNA und das 800 Bp-Fragment des 3'-Endes. Dies wird durch die für diese Fragmente wie im folgenden beschrieben erhaltene DNA-Sequenz bestätigt.
Aus den EcoRI-Subklonen der oben beschriebenen cDNA wurde die gesamte Sequenz der 2100 Bp cDNA erhalten. Das Didioxynucleotid-Kettenterminationsverfahren wurde zum Sequenzieren benutzt (Sanger, F. und Coulsen, A.R. (1975) J. Mol. Biol. 94:441- 448). Die modifizierte T7-DNA-Polymerase, Sequenase (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) wurde als Elongationsenzym wie vom Hersteller beschrieben benutzt. Sequenzierungsprimer waren synthetische Oligonukleotide, die nach der menschlichen genomischen Sequenz des TNF-Inhibitors, wie in Abb. 13 gezeigt, hergestellt wurden, oder Sequenzen, die unter Verwendung dieser Primer erhalten wurden. Abb. 20 zeigt die translatierte Sequenz, die von einem der cDNA-Klone abstammt. Diese Sequenz stimmt mit der überein, die aus Proteinsequenzdaten erhalten wurde, wie in Abb. 19 beschrieben. Die gesamte Sequenz der menschlichen 30 kDa TNF-Inhibitor-cDNA aus Klon Lambdagt10-7ctnfbp ist in Abb. 21 gezeigt.

Beispiel 7. Expression der 30 kDa TNF-Inhibitor cDNA in Escherichia coli

Der Teil des TNF-Inhibitor (30 kDa) cDNA-Gens, das für die lösliche TNFα- Bindungsaktivität codiert, wurde zur Expression in E. coli hergestellt, wie im folgenden beschrieben.
Da die Protein-codierende Sequenz, die den C-terminalen Teil des aus Urin stammenden TNF-Inhibitors (Sequenz QIEN, Base 771, Abb. 20) definiert, nicht von einem Terminationscodon in der cDNA-Sequenz gefolgt wird, wurde ein solches durch Oligonucleotid-gerichtete in vitro-Mutagenese (Biorad, Richmond, CA) eingeführt. Ein M13MP19-Klon des 1300 Bp EcoRI-Fragments des Klons Lambda-gt107ctnfbp wurde hybridisiert mit dem synthetischen Oligonudeotid:
5' CTACCCCAGAUGAGMTTMGCTTMGGGCACTGAGGAC 3'.
Nach Synthese des zweiten Strangs und Transfektion in einen geeigneten Wirt wurden Klone von Mutanten durch Hybridisation mit dem oben beschriebenen mutagenen Oligonukleotid identifiziert. Die molekulare Identität der so identifizierten Klone wurde durch DNA-Sequenzieren bestätigt, wie in Beispiel 5 beschrieben. Als nächstes wurde ein 468 Bp Fragment, definiert durch Sty1 (Position 303) und HindIII, den C-Terminus des Proteins definierend, von der Rf-Form als mutagenisierter Klon entfernt und in ein E. coli Expressionsplasmid, das den tacl-Promotor (DeBoer, H.A., et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25) enthält, eingefügt. Diese Konstruktion wurde durch den Gebrauch der synthetischen doppelsträngigen Adaptersequenz vervollständigt:
5' GATCCGATCTTGGAGGATGATTAAATGGACAGCGTTTGCCCC 3' GCTAGMCCTCCTACTMUTACCTGTCGCMACGGGGGTTC
Dieser Adapter verbindet durch Transiation das TNF-Inhibitorgen (verkürzte Form wie oben beschrieben) mit den ersten 12 Codons des Bakteriophagen-T7-Gens 10. Die DNA-Sequenz dieses Konstrukts ist von dem Punkt der Transiationsinitiation an Gen 10 bis zur Adaptersequenz in Abb. 22 gezeigt. Ein Methionincodon (ATG) wird notwendigerweise zu der TNF-Inhibitor-Gensequenz zur Expression in E. coli hinzugefügt. Das Plasmid wird pTNFiX-1 genannt.
Das vorhergesagte Molekulargewicht dieses Proteins ist ungefähr 17.600 kDa, ein Molekulargewicht, welches sehr nahe an dem des deglycosylierten nativen TNF-Inhibitors (30 kDa) ist.

Beispiel 8: Reinigung des aktiven TNF-Inhibitors (30 kDa) aus Escherichia coli

Zellen aus einem Liter E. coli-Kultur (pTNFIX-1JM1071on-)&sub1;,die unter induzierenden Bedingungen für 2 Std. herangezogen worden waren&sub3; wurden in 10 ml an 50 mM Tris- HCl, pH 7,5, welches 2 mM EDTA (TE-Puffer) enthielt, resuspendiert und mit einer French-Presse bei 20.000 psi bei 4ºC behandelt. Das Material wurde für 10 min bei 20.000 g zentrifugiert. Das resultierende Sediment wurde einmal in TE-Puffer gewaschen. Das gewaschene Sediment wurde in 2 ml an 6 M Guanidin-HCl resuspendiert und bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden 80 µl an 500 mM DTT zugesetzt und die Mischung wurde für weitere 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Material, das nach dieser Behandlung unlöslich blieb, wurde durch Zentrifugation bei 20.000 g für 15 min entfernt. 120 µl an 500 mM oxidiertem Glutathion wurden dem Überstand zugesetzt und die Mischung für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Material wurde dann in 20 ml von 0,6% Tri-base-Lösung (Tri base solutiuon) verdünnt, und 220 µl an 500 mM Cyst ein wurden zugesetzt. Die Inkubation wurde für weitere 16 Std. bei 4ºC fortgesetzt. Nach 16 Std. Inkubation wurde unlöslicher Rückstand beobachtet. Dieses unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 20.000 g für 20 min entfernt. Der resultierende Überstand wurde gegen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, für 16 Std. bei 4ºC dialysiert, dann bei 20.000 g für 10 min zentrifugiert, PMSF diesem Überstand zu einer Endkonzentration von 4 mM zugesetzt, und das Material wurde auf eine TNF-Affinitätssäule (0,7 x 2 cm) bei einer Flußrate von 0,1 mul/min geladen. Die Säule wurde gründlich mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, und gebundene Proteine wurden mit 50 mM NaPO&sub4;-HCl, pH 2,5, eluiert. Das pH 2,5 Eluat wurde auf eine RP8-Säule geladen, die vorher mit 0,1 % TFA/H&sub2;O equilibriert worden war. Der TNF- Inhibitor wurde mit einem linearen Gradienten von 0,1 % TFA/Acetonitril bei 1%/min eluiert (Abb. 25). Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert (Abb. 26), und ein Cytotoxizitätstest wurde durchgeführt (Abb. 25), um den TNF-Inhibitor zu lokalisieren. Der in E. coli hergestellte TNF-Inhibitor (30 kDa) wandert bei ungefähr 20 kDa, da er nicht glycosyliert ist. Fraktionen Nr.30 bis 35 enthalten TNF-Inhibitor. Die aminoterminale Sequenz dieses Materials zeigt, daß der in E. coli hergestellte TNF-Inhibitor die folgende Sequenz hat:
Met-Asp-Ser-Val-()-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Asn-Asn-Ser--
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden ungefähr 40 µg des TNF-Inhibitors (30 kDa) aus einem Liter der Kultur erhalten. Der Ertrag war ungefähr 2 bis 3%. Der Ertrag kann auf bis über 50% gesteigert werden, indem der TNF-Inhibitor vor dem Wiederfalten gereinigt wird.

Beispiel 9. Expression von Genen. die den 30 kDa TNF-Inhibitor in tierischen Zellen codieren

Expression des TNF-Inhibitors in tierischen Zellen setzt folgende Schritte voraus:
a. Konstruktion eines Expressionsvektors.
b. Auswahl von Wirtszellinien.
c. Einführen des Expressionsvektors in Wirtszellen.
d. Manipulation der rekombinanten Wirtszellen, um die Expressionsmengen an TNF-BP zu erhöhen.
1. TNF-Inhibitorexpressionsvektoren, die zum Gebrauch in tierischen Zellen bestimmt sind, können verschiedenen Typs sein, einschließlich starker konstitutiver Expressionskonstrukte, induzierbarer Genkonstrukte und solche, die zur Expression in bestimmten Zelltypen bestimmt sind. In allen Fällen sind Promotoren und andere Gen-regulierende Regionen wie Enhancer (induzierbar oder nicht) und Polyadenylierungssignale an die geeignete Stelle in bezug auf die cDNA-Sequenzen in den Plasmid-basierenden Vektoren positioniert. Zwei Beispiele solcher Konstrukte folgen.
Ein Konstrukt, das eine starke konstitutive Promotorregion benutzt, kann unter Verwendung der Cytomegalovirus (CMV)-immediate-early-Genkontrollsignale hergestellt werden. Dieses Plasmid kann unter Benutzung von molekularbiologischen Standardverfahren (Maniatis, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) konstruiert werden und in dem Plasmid, welches in Fig. 23 (pCMVXV beta TNFBPstopA) gezeigt ist, resultieren. Der SV40-Replikationsstart ist in diesem Plasmid mit eingeschlossen, um seinen Gebrauch in COS-Zellen für transiente Expressionstests zu vereinfachen. Dieses bestimmte Konstrukt enthalt den CMV-immediate-early- Promotor und -Enhancer, wie beschrieben von Boshart, et al., (Cell 41:521-530,1985), gefolgt von dem Kaninchen-B-Globin zweiten Intron (siehe van Ooyen et al., Science 206:337-344,1979), welches durch BamHI und EcoRI-Restriktionsschnittstellen flankiert ist. Dieses Intron ist mit eingeschlossen, da gezeigt wurde, daß Expressionswerte ansteigen, wenn Introns in die transkribierten Regionen einiger Expressionsvektoren (Buckman und Berg, Mol. Cell. Biol. 8:4395-4405, 1988) eingeschlossen werden. Das Polyadenylierungssignal wird von Simian Virus 40 (SV40)-Sequenzen (Kartenkoordinaten 2589-2452; siehe Reddy, et al., Science 200:494-502,1978) zur Verfügung gestellt. Die 30 kDa TNF-Inhibitor-cDNA-Sequenzen wurden wie folgt modifiziert: Die ausgedehnte Region, die 3' des C-Terminus des gereinigten TNF-Inhibitors aus menschlichem Urin liegt, ist deletiert worden, und ein Stopcodon wurde in die Position direkt hinter dem C-terminalen Asparagin eingesetzt. Die nicht modifizierten 30 kDa TNF-Inhibitor-cDNA-Sequenzen in einem analogen Vektor wurden in COS-Zellen inseriert, und es wurde gezeigt, daß sie die TNF-Bindungsaktivitat in solchen Zellen erhöhen.
Das zweite Konstrukt (siehe Abb. 24) (pSVXVTNFBP Stop A) benutzt die starke konstitutive Promotorregion des SV40 Early Gens in einer Anordnung wie in Plasmid pSV2CAT (Gorman, et al., Mol. Celi. Biol. 2:1044-1051,1982) gefunden. Dieses Plasmid sollte in einer Weise manipuliet sein, so daß die TNF-Inhibitor-cDNA gegen die Chloramphenicolacetyltransferase-codierenden Sequenzen unter Verwendung von Standard-molekularbiologischen Standardverfahren ersetzt wird. Wiederum ist die TNF- Inhibitor-cDNA wie oben beschrieben für das CMV-Promotorkonstrukt modifiziert worden. Die SV40-early-Promotor-Region umfaßt Sequenzen von der HindIII-Stelle bis zu der BamHI-Stelle (Kartenkoordinaten 5090-188; siehe Reddy et aß., Science 200:494- 502,1978) und das SV40-Polyadenylierungssignal ist wie oben beschrieben für das CMV-Konstrukt.
2. Zwei tierische Zellinien sind benutzt worden, um den TNF-Inhibitor unter Verwendung der oben beschriebenen Vektoren zu exprimieren, um aktives Protein herzustellen. Zellinien, die charakterisiert wurden die Fahigkeit zu haben, die Expression dieses Fremdgens zu unterstützen, schließen Affennierenzellen, COS-7, und Chinese hamster ovary (CHO)-Dihydrofolatreductase-deflziente (dhfr&supmin;)-Zellen ein.
3. Um eine fortlaufende, CHO-abstammende Zellinie zu etablieren, die den 30 kDa- TNF-Inhibitor in das Zellkulturmedium absondert, wurde ein TNF-Inhibitor-Expressionsplasmid in diese dhfr&supmin;-Zellen zusammen mit einem Plasmid, das die Synthese von Dihydrofolatreductase steuert, unter Verwendung des Calciumphosphat-DNA-Präzipitationsverfahrens beschrieben von Graham und van der Eb (Virologv 52:456-467, 1973) eingeführt. Die Zellen, die DNA aufgenommen haben und DHFR exprimieren, wurden selektioniert wie beschrieben von Ringold et al., (J. Mol. Appl. Genet. 1:165-175,1981).
4. Zellen, die die TNF-Inhibitor-Genkonstrukte exprimieren, können manipuliert werden, um die Mengen der Herstellung an TNF-Inhibitor zu steigern. Zellen, die TNF-Inhibitor- Expressionsvektoren zusammen mit einem dhfr-Expressionsvektor enthalten, sollten dem Genamplifikationsprotokoll beschrieben von Ringold, et aß., (J. Mol. Appl. Genet. 1:165-175, 1981) unterzogen werden, unter Verwendung von Methotrexat, einem kompetitiven Antagonisten von dhfr. Genamplifikation führt zu mehr Kopien der dhfr- und TNF-Inhibitor-Gene, die in der Zelle vorhanden sind, und zusammen die Mengen an TNF-Inhibitor-mRNA steigern, welche wiederum dazu führt, daß mehr TNF- Inhibitorprotein von den Zellen hergestellt wird.

Beispiel 10. Isolieren von zwei Typen von TNF-inhlbitoren aus U937konditioniertem Medium und die Existenz eines zweiten TNF-Inhibitors in menschlichem Urin.

Die menschlichen U937-Zellen wurden bis zu einer Dichte von 1 x 10&sup5; Zellen/ml in 150 m²-Flaschen unter Verwendung von RPMI1640-Medium, das 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 Einheiten/ml Streptomycin und 10% fötales Kälberserum enthielt, herangewachsen. Nach drei Tagen Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 g für 7 min geerntet. Die Zellen wurden zu einer Dichte von 2 x 10&sup6;/ml in RPMI1640-Medium ohne Serum resuspendiert. Die Zeilen wurden in Gegenwart von 5 µg/ml PHA-P (Phytohämagglutinin) und 10 ng/ml PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat) für 24 Std. herangewachsen.
Das 24-Std.-Medium (4425 ml) wurde durch Zentrifugation gesammelt und durch einen Amicon YM5-Filter auf ungefähr 100 ml konzentriert. Das Material wurde über ein TNF- Affinitätsgel (0,7 x 2 cm) bei einer Flußrate von 0,1 ml/min geleitet und das Gel wurde gründlich mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,53 gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit 50 mM NaPO&sub4;-HCl, pH 2,5, eluiert, und der TNF-Inhibitor von den anderen kontaminierenden Proteinen durch HPLC-RPC8 getrennt. Wie in Abb. 27 gezeigt, werden zwei TNF-Inhibitor-Maxima beobachtet. SDS-PAGE-Analyse der RPC8-Fraktion zeigt, daß die Molekulargewichte der zwei Maxima ungefähr mit 30 kDa und 40 kDa Proteinen korrespondierenden (Abb. 28). Das 30 kDa-Protein (TNF-1NH1) wurde aminoterminaler Sequenzanalyse unterzogen, und es wurde festgestellt, daß es dieselbe Sequenz wie der aus Urin stammende 30 kDa-TNF-Inhibitor, der oben beschrieben ist, besitzt. Die Proteinsequenz des 40 kDa-Proteins zeigt jedoch, daß es nicht dasselbe wie das 30 kDa-Protein ist (siehe Beispiel 11). Weitere Reinigung des zweiten TNF-Inhibitor- Maximums in dem menschlichen Urin, welches um Fraktion 35 in Abb. 8 zu sehen ist, zeigt, daß es ebenfalls das 40 kDa-TNF-Inhibitorprotein ist (Abb. 29 und 30).
Der 40 kDa-TNF-Inhibitor ist ebenfalls ein Glycoprotein. Dies wurde unter Verwendung von Concanavalin-A-Peroxidase detektiert, nachdem das Protein auf einen Nitrocellulosefilter übertragen worden war, wie in Beispiel 1.D. beschrieben. In SDS-PAGE wurde gezeigt, daß das Molekulargewicht von N-Glycanase-behandeltem 40 kDa-TNF-Inhibitor ungefähr 30 kDa ist (siehe in Beispiel 1.D. beschriebenes Verfahren).
Dem in Beispiel I.E. oben dargelegten Verfahren folgend kann bestimmt werden, daß der deglycosylierte 40 kDa-TNF-Inhibitor ebenfalls TNF-alpha bindet. Zusätzlich kann ebenfalls gezeigt werden, daß das deglycosylierte 40 kDa-Protein TNF-beta (Lymphotoxin) binden kann.

Beispiel 11. Proteinsequenzierung von aus U937-Zellen stammendem 30 kDa-TNF- Inhibitor. 40 kDa-TNF-Inhibitor und aus Urin stammendem 40 kDa-TNF-Inhibitor.

Die aminoterminale Sequenz der Proteine wurde unter Verwendung des Applied Biosystem Protein Sequencers, Modell 470, bestimmt. Sowohl native wie auch reduziertecarboxymethylierte Proteine wurden sequenziert. Ungefähr 200 pMol der reverse-Phase (RP-8) gereinigten TNF-Inhibitoren wurden auf einen Polybren-Filter aufgetragen und automatischem Edman-Abbau unterzogen. Die resultierende Sequenz ist in Abb. 31 gezeigt. Es kann gesehen werden, daß das aus U937 stammende 30 kDa-Protein das gleiche wie das in Urin gebildete und identifizierte ist. Das 40 kDa-TNF-Inhibitorprotein ist nicht das gleiche wie das 30 kDa-TNF-Inhibitorprotein. Das aus Urin stammende 40 kDa-TNF-Inhibitorprotein enthält die zwei aminoterminalen Reste nicht; ansonsten stimmt es mit dem aus U937 stammenden 40 kDa-Protein überein.

Beispiel 12. Primirstruktur des 40 kDa-TNF-Inhibitors.

Ungefähr 40 µg des reduzierten und carboxymethylierten TNF-Inhibitors (40 kDa) wurde mit Endoprotease V8 wie oben beschrieben verdaut, und die resultierenden Peptide auf einer RPC18-Säule aufgetrennt (Abb. 33). Die gereinigten Peptide wurden unter Verwendung des Applied Biosystem Protein Sequencers, Modell 470, sequenziert. Ungefähr 90 µg des reduzierten und carboxymethylierten TNF-Inhibitors wurden mit 5 µg an Endopeptidase Arg-C in 0,2 M Ammoniumbicarbonat bei 37ºC behandelt. Nach 24 Std. des Verdaus wurde das Arg-C-verdaute Material auf eine HPLC-RP8-Säule geladen, um die Peptide aufzutrennen (Abb. 32). Gereinigte Peptide wurden wie vorher beschrieben sequenziert. Einige der Peptide wurden weiter mit TPCK-Trypsin oder Chymotrypsin verdaut. Ungefähr 500 pMol des arg-C16-Peptids wurden mit 3 µg TPCK- Trypsin (Boehringer Mannheim) in 0,2 M Ammoniumbicarbonat für 7 Std. bei 37ºC behandelt, und die Peptide unter Verwendung von RP8 aufgetrennt (Abb. 34). Ungefähr 200 pMol des Peptids arg-C10 wurden mit einem µg an Chymotrypsin (Boehringer Mannheim) bei 37ºC für 3,5 Std. verdaut, und die resultierenden Peptide auf einer RPC18 aufgetrennt (Abb. 35).
Eine partielle Struktur des TNF-Inhibitors (40 kDa) wurde durch lineares Anordnen verschiedener überlappender Peptide bestimmt (Abb. 36). Die gesamte Primärstruktur des 40 kDa-TNF-Inhibitors ist in Fig. 38 gezeigt. Reste, die nicht durch Proteinsequenzieren identifiziert worden waren, wurden nach Durchsicht der Sequenz des cDNA-Klons, der den 40 kDa-TNF-Inhibitor codiert, hergeleitet, und wird in Beispiel 14A diskutiert und in Abb. 39 beschrieben.

Beispiel 13. Identifikation von cDNA-Klonen TOR den 40 kDa-TNFα-Inhibitor.

Die in Beispiel 9 dargestellte Information zeigt, daß U937-Zellen, die mit PMA und PHA behandelt wurden, einen TNFα-Inhibitor mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40 kDa herstellen. Dieses Protein wurde gereinigt, und seine Aminosäuresequenz wurde im wesenuichen bestimmt wie in Beispiel 12 beschrieben. Tabelle 5 zeigt die Sequenzen von mehreren Peptiden, die von diesem Protein abstammen und gibt die Sequenzen von gemischten Sequenzoligonucleotidsonden an, die benutzt wurden, um Gene, die für den hier beschriebenen 40 kDa-TNF-Inhibitor codieren, zu isolieren.
Die Gen-codierenden Sequenzen, die den 40 kDa-Inhibitor umfassen, können aus einer menschlichen genomischen Genbank, in Beispiel 5 beschrieben, isoliert werden, oder es kann eine cDNA-Genbank aus mRNA erhalten von U937-Zelien, die mit PMA und PHA für ungefähr 9 Std. behandelt wurden, konstruiert werden (siehe Beispiel 14). Jede Genbank sollte ungefähr 1,0 x 10&sup6; Rekombinante enthalten. Tabelle 5

Beispiel 14. Isolierung von 40 kDa-TNF-Inhibitor-cDNA-Sequenzen aus PMA/PHA- induzierten U937-Zellen.

U937 mRNA wurde aus Zellen isoliert, die für 9 Std. mit PMA/PHA induziert worden waren. Sie wurde dann auf einer oligo-dT-Säule selektiert, und die so isolierte polyadenylierte mRNA wurde benutzt, um dscdna unter Verwendung von reverser Transkriptase, gefolgt von E. coli-Polymerase hR Nase H herzustellen. Die dscdna wurde einer Polymerase-Kettenreaktion unterzogen, unter Verwendung der degenerierten Sonden (40KD-P1' und 40KD-P7) gezeigt in Tabelle 5, als Primer. Die DNA-Produkte aus dieser Reaktion wurden in einem Southern Blot mit der Sonde 40 KD-P6' (siehe Tabelle 5) hybridisiert, wobei eine einzelne Bande, die diese Sequenz enthielt, identifiziert wurde.
Diese Bande wurde auf einem Agarosegel isoliert und in M13-Phagen-DNA (Stamm mpl 8) kloniert. Nach Transformation in den E. coli-Stamm JM109 und dem Ausplattieren auf Medium, das X-Gal und IPTG enthielt, wurden klare Plaques identifiziert, welche das korrekte cDNA-Insert enthielten. Die Sequenz der DNA in diesem Klon ist in Abb. 37 zusammen mit dem vorhergesagten Translationsprodukt aus dieser Sequenz gezeigt. Diese Aminosäuresequenz stimmt überein mit der in Abb. 36 gezeigten Peptidsequenz (Reste 12 - 104) und Abb. 38.

Beispiel 14A. Isolierung eines 40 kDa-TNF-Inhibitor-cDNA-Klons aus PMA/PHA- Induzierten U937-Zellen.

mRNA wurde aus menschlichen U937-Zellen isoliert (Chirgwin, J.M. etal., Biochemistry 18, 5294-5299), die für 9 Std. PHA und PMA ausgesetzt waren. mRNA wurde aus dieser RNA gereinigt unter Verwendung von oligo-dT-Cellulose (Aviv, H. und Leder, P., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69,1408-1412). 5 µg dieser mRNA wurden benutzt, um 3 µg geradendiger, doppelsträngiger cDNA (Gubler, U. und Hoffman, B.J., 1983, Gene 25, 263-269) zu synthetisieren. Nach Zusetzen von EcoRI-Linkern wurde die cDNA durch Sephacryl S-400 (Pharmacia)-Spinsäulenchromatographie gereinigt und Ethanol-prazipitiert. 100 ng dieser cDNA wurden in 1 µg an EcoRI-verdautem und mit alkalischer Phosphatase behandeltem Lambda gt-10 kloniert und in vitro unter Verwendung des Gigapack gold (Stratagene) verpackt. Die verpackte cDNA erzeugte 2,5 x 10&sup6; Rekombinante, wenn sie auf E. coli C600 hfl ausplattiert wurde. 1,2 x 10&sup6; Mitglieder dieser Genbank wurden in Duplikaten mit der ³²P-markierten Sonde 40KD-P6+7 (5' GGG CGT ATG TGC TGT CCT CAC AGG 3') wie beschrieben (Benton, W.D. und Davis, R.W., 1977, Science 196,180-182) gescreent. Zwölf positive Hybridisierungsklone wurden isoliert und erneut mit den Sonden 40KD-P6' und 40KD-P7 (siehe Tabelle 5 in Beispiel 13) gescreent. Vier dieser Klone hybridisierten mit allen drei Sonden. Einer dieser klone, C40DK#6, wurde mit EcoRI verdaut und ein 2,2 kB-lnsert wurde isoliert und in beiden Orientierungen in den Bakteriophagen M13-Vektor, mp 19 (Yarrish-Perron C., et al 1985, Gene 33, 103-119) subkloniert. Die Sequenz beider Stränge wurde bestimmt unter Verwendung des Kettenterminationsverfahrens (Sanger, F. und Coulson, A.R., 1975, J. Mol. Biol. 94, 442-448) mit Taq DNA-Polymerase (U.S. Biochemical). Diese Sequenz ist in Abb. 39 zusammen mit ihrem abgeleiteten Translationsprodukt gezeigt. Die Sequenz enthält ein einziges offenes Leseraster, das sich von dem ATG-Triplet der Base 93 bis weit über die C-terminale Sequenz des 40 kDa-Proteins zum GAC-Triplet bei Base 863 erstreckt.

Beispiel 15. Der 40 kDa-TNF-Inhibitor inhibiert sowohl TNF beta als auch TNF alpha.

Der 30 kDa TNF-Inhibitor und der 40 kDa TNF-Inhibitor wurden beide untersucht um zu bestimmen, ob sie ebenfalls in der Lage sind die Aktivität von TNF beta (Lymphotoxin) zu inhibieren. Verschiedene Konzentrationen an TNF-beta (erworben von Endogen) wurden mit jedem der Inhibitoren für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Mischungen wurden via dem L929-Zelltestsystem analysiert, wie in Beispiel 1.B.1. für TNF alpha beschrieben. Diese Experimente zeigten, daß der 30 kDa TNF- Inhibitor einen geringen inhibitorischen Effekt auf TNF beta ausübt. Der 40 kDa TNF- Inhibitor zeigte jedoch deutliche TNF beta Inhibition. Die Ergebnisse dieser Experimente können in Abb. 40 betrachtet werden.

Beispiel 16. Herstellen einer menschlichen genomlschen DNA-Genbank für den 40 kDa-Inhibitor.

Eine geeignete menschliche genomische DNA-Genbank für den 40 kDa-TNF-Inhibitor kann wie in Beispiel 5 für den 30 kDa-TNF-Inhibitor beschrieben hergestellt werden.

Beispiel 17. Herstellen von Genen zur Expresslon der 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA in Escherichia coli.

Teile des TNF-Inhibitor (40 kDa) cDNA-Gens, das für lösliche TNF-bindenden Aktivitäten (Abb. 39) codiert, sind zur Expression in E. coli wie unten beschrieben hergestellt worden.
Da es schwierig war, die C-terminale Sequenz des reifen 40 kDa TNF-Inhibitors, der aus Urin oder U937-Zellen stammt, definitiv zu bestimmen, konstruierten wir 3 Derivate seiner cDNA-codierenden Sequenz, basierend auf der Sequenzanalyse des cDNA-Klons. Das erste erstreckt sich bis zur vermuteten Transmembransequenz dieses Proteins, Basenpaar 863 (Abb. 39) und endet mit der Peptidsequenz... Gly Ser Thr Gly Asp. Die nächsten beiden sind 51 (Δ51) und 53 (Δ53) Aminosäuren kürzer als dieser Klon und enden jeweils mit Basenpaar 710 ... Ser Pro Thr, und Basenpaar 704 ... Ser Thr Ser.
Jeder dieser drei C-Termini wurde durch in vitro-Mutagenese ("Mutagene", Biorad, Richmond, CA) von M13-Klonen der cDNA des 40 kDa TNFα-Inhibitors hergestellt. Der längste Klon wurde zuerst hergestellt unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonudeotide:
1. 5' CAC TGG CGA CTA AGC UC GCT CTT C 3'
2. 5' GCG GCG CAC GCC GGA TCC GAT CU GGA GGA TGA UA MT GTT GCC CGC CCA G 3'
Oligonudeotid 1 inseriert ein Translationsterminationscodon nach Aminosäure 235, Asp, und stellt eine HindIII Restriktionsendonucleaseerkennungsstelle an diesem Punkt her. Oligonucleotid 2 paßt die N-terminale Sequenz des reifen Proteins, Leu Pro Ala ... Bp 159 (Abb. 39) zur Expression in E. coli an, durch
1) Inserieren eines Met, ATG-Codons in Aminosäureposition 1, und
2) Inserieren einer translationellen Kopplungssequenz und 5' BamHI- Restriktionsendonukleaseerkennungsstelle. Das mutagenisierte Fragment wurde durch BamHi/Hind"-Verdau der Rf-DNA des mutanten M13-Klons entfernt und in ein E. coli Expressionsplasmid eingeführt, wie in Beispiel 7 beschrieben. Klone, die dieses Genkonstrukt enthalten, werden TNF.40 genannt.
Die beiden verkürzten Klone wurden wie oben beschrieben unter Verwendung des mutagenisierten M13-Derivats des oben isolierten 40 kDa TNFα-Inhibitorklons konstruiert und der folgenden Oligonudeotide:
5' GTCCCCCACCTMGCTTCGGAGTATGG 3' Δ51
5' GTCCACGTCCTMGCUCCCACCCGGA 3' Δ53
Diese zwei Oligonudeotide führen jeweils Translationsterminationscodons in Bp 710 und 704 ein (Abb. 39). Klone, die diese Genkonstruktionen enthalten,,werden jeweils TNF:40 51 und TNF: 40 53 genannt.

Beispiel 18. Expression von Genen, die den 40 kDa TNF-Inhibitor in tierischen Zellen codieren.

Expression des 40 kDa TNF-Inhibitorklons in tierischen Zellen kann, wie in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt werden. Die ausgedehnte Region, die 3' des C-Terminus des 40 kDa TNF-Inhibitors gelegen ist, kann deletiert werden und ein Stopcodon in diese Position eingebaut werden, direkt nach der C-terminalen Asparaginsäure.

Beispiel 19. Expression der vollständigen cDNA, die den 30 kDa-TNF-Inhibitor Codiert, in Säugerzellen steigert TNF-Rezeptorsteilen.

Es wurde ein Expressionsvektor hergestellt, der die gesamte 30 kDa TNF-Inhibitor cDNA (2,1 kb), gezeigt in Abb. 21, genannt P30KXVA, beinhaltet, und er war in jeder Weise mit dem in Abb. 23 gezeigten Vektor identisch (d.h., die TNF-BP-Sequenzen, die in dieser Abbildung gezeigt werden, wurden durch die 2,1 kB cDNA unter Verwendung der einzigen EcorI-Stelle in dem Plasmid ersetzt). Siehe Beispiel 9 für eine vollständigere Beschreibung des Expressionsvektors. Dieses Plasmid wurde in COS7-Zellen eingefügt unter Verwendung des Lipofectinverfahrens, beschrieben von Feigner etal. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)). Transfizierte Zellen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, (¹²&sup5;I]TNFα zu binden. Abb. 41 zeigt die Ergebnisse dieses Bindungstests von Zellen, die mit einer negativen Kontrolle oder dem Expressionsvektor P30KXVA transfiziert worden waren. Die Anzahl an Bindungsstellen in Plasmid-transfizierten Zellen ist wesentlich höher als die Anzahl in den Kontrollzeilen. Der vollständige cDNA-Klon (d.h., das offene Leseraster, das ein wesentlich größeres Protein als den 30 kDa aus Urin stammenden Inhibitor codiert), stellt tatsächlich einen cDNA-Klon eines TNF-Rezeptors dar.

Beispiel 20. Expression von cDNA. die den 40 kDa TNF-Inhibitor in Säugerzellen codiert, steigert die TNF-Rezeptorstellen.

Unter Verwendung eines 2,4 kB cDNA-Fragments, welches aus dem Lambdaphagen Seite 20, wie in Beispiel 14A beschrieben, isoliert worden war, wurde ein Expressionsvektor hergestellt. Dieses Plasmid war identisch mit dem in Beispiel 9 (Abb. 23) beschriebenen, außer daß die 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA Sequenzen gegen die 30 kDa TNF-Inhibitor cDNA Sequenzen in diesem Plasmid ausgetauscht worden waren. Plasmide mit dem 2,4 kB EcoRI cDNA-Fragment in beiden Orientierungen wurde isoliert, genannt p40KXVA (Sense-Orientierung) und P40KXVB (Antisense-Orientierung). Diese Plasmide enthalten den SV40-Replikationsstart, den Cytomegalovirus "Immediate Early Promoter" und Enhancer, das Kaninchen-B-Globin zweite Intron, die 40 kDa TNF- Inhibitor cDNA und das SV50 Early Polyadenylierungs-Signal (für eine vollständigere Beschreibung dieses Vektors siehe Beispiel 9) in einem auf PBR322-basierenden Plasmid. Diese Plasmide wurden in COS7-Zellen transfiziert, die dann auf TNF-Bindung getestet wurden (siehe Abb. 42). Zellen, die mit P40KXVA transfiziert worden waren, zeigten eine größere Anzahl an TNF-Bindungsstellen auf der Zelloberfläche als sowohl nicht transfizierte COS7-Zellen oder COS7-Zellen, die mit P40KXVB transfiziert worden waren, was darauf hinweist, daß diese cDNA einen TNF-Rezeptor codiert. Andere Säugerzellen wie CHO-Zellen könnten entwickelt werden, welche diesen Rezeptor überproduzieren oder welche den 40 kDa TNF-Inhibitor auf in Beispiel 9 beschriebenen Wegen in das Gewebekulturmedium absondern.

Beispiel 21. Inhibitor, isoliert aus menschlichen Monocyten.

Menschliche Monocyten wurden aus 550 ml Blut gewonnen, wie beschrieben von (Hannum, C.H. et al., Nature 343, 336-340,1990). Die frischen Monocyten (2 x 10&sup7; Zellen) wurden in 500 ml serumfreiem RPMI1640-Medium ausgesät und mit 10 ng/ml PMA und 5 µg/ml PHA-P für 24, 48 und 72 Std. bei 37ºC behandelt. Nach der Inkubation wurden die Medien durch Zentrifugation gesammelt und auf 50 ml konzentriert. Die konzentrierten Medien wurden jeweils einzeln nacheinander auf eine TNF-Affinitatssäule (2 ml Säulenvolumen) geladen und mit Saure wie in Beispiel 1 eluiert. Das eluierte Material wurde weiter unter Verwendung einer HPLC RPC-8-Saule unter denselben wie in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen gereinigt und jede Fraktion in einem L929- Cytotoxizitätstest getestet. Abb. 43 zeigt die beiden Maxima der TNF-Inhibitor Aktivität. Diese beiden Maxima korrespondieren mit den 30 kDa und 40 kDa TNF-Inhibitoren überein, die ebenfalls in dem Kulturmedium von U937-Zellen, die mit PMA und PHA behandelt wurden und in Urin identifiziert wurden, überein.

Beispiel 22. Expression und Reinigung von kurzeren Formen des 40 kDa TNF- Inhibitors (Δ51 und Δ53) aus E. coil.

300 ml Zellen von E. coli-Kulturen (40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53) wurden getrennt, unter induzierenden Bedingungen für 2 Std. herangewachsen, in 10 ml an 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, das 2 mM EDTA (TE-Puffer) enthielt, resuspendiert und mit einer French-Presse bei 20.000 G für 10 min behandelt. Die resultierenden Sedimente wurden einmal mit TE-Puffer gewaschen. Das gewaschene Sediment wurde in 2 ml an 6 M Guanidin-HCl/100 mM Tris-HCl, pH 8,514 mM PMSF resuspendiert und für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation wurden 500 mM DU zu einer Endkonzentration von 4 mM zugesetzt, und die Mischung bei Raumtemperatur für eine weitere Stunde inkubiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 20.000 G für 15 min entfernt. 500 mM oxidiertes Glutathion wurden dem Überstand zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 20 mM, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Das Material wurde dann in 20 ml an 0,6% Tris-Basenlösung mit 5 mM Cystein verdünnt. PMSF wurde zu einer Endkonzentration von 2 mM zugesetzt. Nach 16 Std. Inkubation bei 4ºC wurde dieses Material gegen 300 Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, für 3 Std. bei 4ºC dialysiert und dann bei 20.000 g für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine TNF-Affinitatssäule (0,7 x 2 cm, 13 mg rhTNF/ml Affigel-10) mit einer Flußrate von 0,09 ml/min geladen. Diese Saule wurde gründlich mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;- HCl, pH 2,5, eluiert. Die sauren Eluate wurden auf eine RPB-Säule (2 x 200 mm, spelco) geladen und die TNF-Inhibitoren mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1% TFA bei einer Flußrate von 1 ml pro Gradient pro Minute eluiert (Abb. 44A und 45A). Die Fraktionen wurden durch einen L929-Cytotoxizitätstest untersucht, um die TNF- Inhibitoren zu lokalisieren. Das Hauptmaximum eines jeden RP8-Proflls enthält die TNF- inhibierende Aktivität (Abb. 44B und 45B). Die in E. coli hergestellten TNF-Inhibitoren (40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51) wandern bis zur erwarteten Position in einer SDS-PAGE (Abb. 448 und 458). Die aminoterminale Sequenz dieser Proben zeigt, daß die in E. coli hergestellten TNF-Inhibitoren folgende Sequenz haben: Met-Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden ungefähr 150 µg jedes 40 kDa TNF- Inhibitors (Δ51 und Δ53) aus 30 ml der Kultur erhalten. Der Ertrag war einige Prozent, jedoch kann der Ertrag durch Verbesserung jedes Reinigungsschrittes auf über 30% gesteigert werden.
Beide dieser 40 kDa TNF-Inhibitoren (Δ51 und Δ53) inhibieren nicht nur TNFα sondern auch TNFβ.

Beispiel 23. Expression und Reinigung eines Vollängen-40 kDa TNF-Inhibitors.

Ein aktiver 40 kDa TNF-Inhibitor wurde aus einem E. coli-Stamm gereinigt, der Plasmide trägt, welche ein Gen für den reifen 40 kDa Vollängen-TNF-Inhibitor tragen (wie in Beispiel 12). Das zum Isolieren eines aktiven Inhibitors benutzte Verfahren war das gleiche wie das in Beispiel 22. Dieser aktive Inhibitor inhibiert jeweils TNFα und TNFβ, und die aminoterminale Sequenz ist die gleiche wie in Beispiel 22 gezeigt.

Beispiel 24. Aminosärezusammensetzung des 40 kDa TNF-Inhibitors.

In U937 hergestellter reifer 40 kDa TNF-Inhibitor wurde durch das PTC- Aminosäureanalysesystem auf seine gesamte Aminosäurezusammensetzung analysiert. Die Daten über die tatsächliche und vorhergesagte Zusammensetzung des reifen 40 kDa-Vollängen-TNF-Inhibitors wie in Abb. 38 gezeigt ist in Tabelle 6 gezeigt.

Beispiel 25. Herstellen von chemisch modifizierten TNF-Inhibitoren.

Um die Halbwertszeit von TNF-Inhibitoren im Plasma zu steigern, können TNF- Inhibitoren, die mit Polyethylenglycol (PEG) chemisch modifiziert sind, hergestellt werden. Die Modifikation kann durch kreuzweises Vernetzen von PEG an einen Cysteinrest der TNF-Inhibitormoleküle durchgeführt werden. Da alle der Cysteinreste in den TNF- Inhibitoren Disulfidbrücken bilden, können mutante TNF-Inhibitoren konstruiert werden, die zusätzliche Cysteinreste am Aminoterminus, an Glycosylierungsstellen und dem Carboxyterminus eines jeden Inhibitors enthalten. Die Mutagenese kann durch PCR unter Verwendung von Oligonudeotiden, die die gewünschte Mutation enthalten, durchgeführt werden. Im Falle des 30 kDa-TNF-Inhibitors wurde ein zusätzlicher Cysteinrest in Position 1,14 oder 105 eingefügt. Diese mutanten Proteine wurden in E. coli unter Verwendung des gleichen Systems wie in Beispiel 7, 22 und 23 beschrieben, exprimiert und wieder zum aktiven TNF-Inhibitor gefaltet. Die mutanten Proteine sind so aktiv wie die nicht mutanten Proteine. Pegylierung dieser Proteine wird durchgeführt, und ihre Aktivität bestimmt. Die 40 kDa-Mutanten werden wie oben beschrieben konstruiert und Pegylierung wird durchgeführt, um aktive Proteine zu erhalten und um die Stabilität des TNFInhibitors zu steigern. Tabelle 6
ND: nicht bestimmt
Es versteht sich, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein bestimmtes Expressionssystem in dem Rahmen der Fähigkeiten eines gewöhnlichen Fachmanns im Licht der hier enthaltenen Lehre liegt. Es wird daher für den gewöhnlichen Fachmann offensichtlich sein, daß verschiedene Modifikationen und Variationen an den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können. Es ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung diese Modifikationen und Variationen abdeckt, vorausgesetzt, daß sie im Rahmen der folgenden Ansprüche und ihrer Äquivalente liegen.

Claims

1. Tumor Nekrose-Faktor (TNF)-Inhibitor, umfassend die in Abbildung 19 dargestellte Aminosäuresequenz, wobei der Inhibitor in einer Wirtszelle hergestellt wird, die keine Glykosylierung durchführen kann oder die eine nicht-menschliche Zelle ist, welche Glykosylierung durchführen kann.

2. Tumor Nekrose-Faktor (TNF)-Inhibitor, der nicht glykosyliert ist und ein Molekulargewicht von circa 18 kDa hat.

3. TNF-Inhibitor nach Anspruch 23 wobei der TNF-Inhibitor durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wird.

4. TNF-Inhibitor, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Abbildung 38 von Aminosäure 1 bis 235 (40 kDa-Inhibitor), von Aminosäure 1 bis 182 wie dargestellt in Abbildung 38 (40 kDa-Inhibitor Δ53) oder von Aminosäure 1 bis 184 wie dargestellt in Abbildung 38 (40 kDa-Inhibitor Δ51).

5. TNF-Inhibitor nach Anspruch 4, wobei der TNF-Inhibitor in einer Wirtszelle hergestellt wird, die keine Glykosylierung durchführen kann oder die eine nichtmenschliche Zelle ist, welche Glyksoylierung durchführen kann.

6. TNF-Inhibitor, umfassend die Aminosäuresequenz wie dargestellt in Abbildungen 19 oder 38, mit der Ausnahme, daß die Aminosäure am N-Terminus, am C- Terminus oder an einer Glykosylierungsstelle durch einen Cysteinrest ersetzt ist.

7. TNF-Inhibitor nach Anspruch 6, wobei der TNF-Inhibitor eine die in Abbildung 19 dargestellte Aminosäuresequenz hat und das nicht natürlich vorkommende Cystein in Position Nr. 1,14 oder 105 liegt.

8. TNF-Inhibitor nach einem der Anspruche 1 bis 3 und 6, wobei der TNF-Inhibitor an ein polymeres Material mit hohem Molekulargewicht gebunden ist.

9. TNF-Inhibitor nach Anspruch 8, wobei das polymere Material mit hohem Molekulargewicht Polyethylenglykol ist.

10. Pharmazeutische Zubereitung, umfassend den TNF-Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

11. Verfahren zum Herstellen eines TNF-Inhibitors, umfassend:

(a) Kultivieren einer Wirtszelle unter zur Expression des TNF-Inhibitors geeigneten Bedingungen, wobei die Wirtszelle eine Nukleinsäure enthält, die eine Sequenz umfaßt, die aus der aus:

(i) der in Abbildung 13 dargestellten DNA-Sequenz oder einem kodierenden Teil davon;

(ii) der in Abbildung 20 dargestellten DNA-Sequenz oder einem kodierenden Teil davon;

(iii) der in Abbildung 21 dargestellten DNA-Sequenz oder einem kodierenden Teil davon;

(iv) der in Abbildung 37 dargestellten DNA-Sequenz oder einem kodierender Teil davon;

(v) der in Abbildung 39 dargestellten DNA-Sequenz oder einem kodierenden Teil davon;

(vi) einer Sequenz, die in den kodierenden Bereichen von (i), (ii), (iii), (iv) und (v) oder Teilen davon degeneriert ist; und

(vii) einer Sequenz, die an eine Nukleinsäure-Sequenz hybridisiert, die komplementär zu (i), (ii), (iii), (iv), (v) oder (vi) ist; bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

(b) Ernten des Inhibitors.

12. Verfahren nach Anspruch 11, umfassend vor Schritt (a) weiterhin die Schritte:

I) Herstellen einer Nukleinsäure, die eine Sequenz umfaßt, die aus der aus:

(vii) einer Sequenz, die an eine Nukleinsäure-Sequenz hybridisiert, die komplementär zu (i), (ii), (iii), (iv), (v) oder (vi) ist;

bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

II) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine vollständige Zelle übertragen und repliziert werden kann, wobei dieser Vektor funktionelle Elemente enthält, die zur Expression der DNA-Sequenz benötigt werden;

III) Übertragen des Vektors, der die synthetische DNA-Sequenz und funktionelle Elemente enthält, in einen Wirt, der die DNA, die für den TNF-Inhibitor kodiert, exprimieren kann.

13. Verfahren nach Anspruch 11, weiter umfassend einen Schritt (c), in dem dem Inhibitor gestattet wird, eine aktive Tertiarstruktur anzunehmen, wodurch er TNF-inhibitorische Aktivität besitzt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der TNF-Inhibitor eine Aminosäuresequenz umfaßt, die dargestellt ist in:

(i) Abbildung 19;

(ii) Abbildung 38;

(iii) Aminosäuren 1 bis 184, wie in Abbildung 38 (40kDA-Inhibitor Δ51) dargestellt; oder

(iv) Aminosäuren 1 bis 182, wie in Abbildung 38 (40kDA-Inhibitor Δ53) dargestellt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der TNF-Inhibitor einen nicht natürlich vorkommenden Cysteinrest am C-Teminus, am N-Terminus, oder an einer Glykosylierungsstelle des Inhibitors enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der TNF-Inhibitor die in Abbildung 19 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt und das nicht natürlich vorkommende Cystein am N-Terminus, C-Terminus oder den Aminosäurepositionen 1,14 oder 105 ist.

17. Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die aus der aus:

(i) der in Abbildung 13 dargestellten DNA-Sequenz

(ii) der in Abbildung 20 dargestellten DNA-Sequenz

(iii) der in Abbildung 21 dargestellten DNA-Sequenz

(iv) der in Abbildung 37 dargestellten DNA-Sequenz

(v) der in Abbildung 39 dargestellten DNA-Sequenz

(vi) einem Fragment von (i), (ii), (iii), (iv) oder (v), das für ein Polypeptid mit TNF- inhibitorischer Aktivität kodiert

(vii) einer Sequenz, die im Vergleich zu den Sequenzen von (i), (ii), (iii), (iv), (v) oder (vi) degeneriert ist, die für ein Polypeptid mit TNF-inhibitorischer Aktivität kodiert

(viii) einer Sequenz, die zu (i), (ii), (iii), (iv), (v) (vi) oder (vii) komplementär ist (ix) einer Sequenz, die mit (viii) hybridisiert und die für ein Polypeptid mit TNF- inhibitorischer Wirkung kodiert bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

18. TNF-Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung beim Behandeln einer TNF-vermiffelten Krankheit.

19. TNF-Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung in Kombination mit einem IL-1-Inhibitor beim Behandeln einer TNF-vermittelten Krankheit.

20. Verwendung des TNF-Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Herstellen eines Medikamentes zum Behandeln oder Vorbeugen von TNF-vermittelten Krankheiten.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Medikament weiterhin einen IL-1-Inhibitor umfaßt.

22. Vektor: umfassend eine Nukleinsäure-Sequenz wie in Anspruch 17 definiert.

23. Wirtszelle, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleinsäure-Sequenz wie in Anspruch 17 definiert.

24. Wirtszelle nach Anspruch 23, die eine prokaryotische Zelle ist.

25. Wirtszelle nach Anspruch 24, die ein E. coli ist.

26. Wirtszelle nach Anspruch 23, die eine eukaryotische Zelle ist.

27. Wirtszelle nach Anspruch 26, wobei die eukaryotische Zelle eine Säugerzelle ist.

28. Wirtszelle nach Anspruch 27, wobei die Wirtszelle eine Chinese hamster ovary- Zelle ist.