DD283835A5 - Verfahren zur herstellung eines interleukin-1 inhibitors (il-1i) mittels rekonbinanter dna-technik - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine rekombinante DNA-Methode zur Herstellung eines Interleukin-1 Inhibitors * wobei eine isolierte DNA-Sequenz, einen physiologisch funktionellen Interleukin-1 Inhibitor (IL-li) codiert. Der gruendlich gereinigte Interleukin-1 Inhibitor * ist gegen Interleukin-1 alpha oder Interleukin-1 beta oder gegen beide Substanzen wirksam.{Interleukin-1 Inhibitor * r DNA-Methode; gegen Interleukin-1 alpha; Interleukin-1 beta wirksam}

Description

Öle vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung

eines Interleukin-1 Inhibitors (IL-Ii) mittels rekoobinantnr

DNA-Technik. Anwendungsgebiete sind die Biotechnologie, die pharmazeutische Industrie und die Medizin. Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Vorliegende Anmeldung ist ein Antrag auf Teilweiterbehandlung der US-Patentanmeldung) Serien-Nr. 238,713 der gleichen Erfinder, eingereicht am 31. August 1968, die eine Teilwaiterbehandlung der US-^Patentanmeldung, Serien-Nr. 199.9.15, angemeldet am 27. Hai 1988, darstellt.

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A. IL-I

Interleukine-1 bilden eines Klasse von Proteinen, die von zahlreichen Zelltypen inkl. Honooyten und einigen Makrophagen produziert werden. Diese Klasse enthält Mindestens zwei als Interleukin-1 alpha und Interleukine beta bekannte 17 - 18 Kilodalton Proteine. Diese Proteine haben bedeutende physiologische Wirkungen auf eine Reihe verschiedener Targetzellen, die an den Entzündungs- und Immunreaktionen beteiligt sind. Die Proteine sind Comitogene mit PhytohSnagglutlnin) für T-Zellen, regen sowohl Fibroblastsn als auch Chondrocyten zur Sekretion von latenter Kollagenase an und erhöhen die OberflSchenadhMsionskrBfte der Endothelzellen für Neutrophile. Außerdem wirken sie auf den Hypothalasmus als Pyrogene, sie stimulieren den Katabolismus des Huskelproteins und regen die Hepatocyten zur Synthetisierung einer als "akute Phasenreektante" hskannte Klasse von Proteinen an. Sosit stellen Interleukins-1 (IL-I) eindeutig einen wichtiger Teil dar Wirkung eines Organismus auf Infektion und Verletzung dar.

B. Pathologische Einflösse von IL-I

Trotz ihrer normalerweise nützlichen Einflüsse sind Umstlnde bekannt geworden, bei denen schädliche Wirkungen von IL-I auftreten. Beispielsweise kann IL-I den Kollagenasespiegel . in einem arthritischen Gelenk erhöhen, und es wurde als ein Mediator sowohl für akute als auch chronische Stadien der Immunopatholcgie bei rheuaatolder Arthritis einbezogen. IL-I kann verantwortlich sein für die Veränderung der Funktion von Endothelzellen, für die Richtung der Chemotaxis und der Migration Jer l.eukocyten und Lyuphocyten in das synoviale Gewebe, wobei die Kapillarproliferation ausgelöst und die makrophage Akkumulation

in der synovialen Auskleidung während der akuiten Fhase dieser Krankheit stimuliert wird. In der Phase der Gewebedestruktion wurde IL-1 als ein Mediator bei der Verursachung von Gewebeschaden durch stimulierende Auslösung von Enzymen aus Fibr ob lasten und Chondrocyten einbezogen.

Außerdem wurde eine übermäßige IL-1 Produktion in der Haut von Patienten mit Psoriasis nachgewiesen, und man kann hohe IL-1 Spiegel in der Synovia von Patienten mit psoriatischer Arthritis feststellen. Durch Zellen in dem entzündeten Synovium bei psoriatischer Arthritis freigesetztes IL-1 kann durch Stimulierung von Enzymfreisetzung aus anderen Zellen eine Gewebedestruktion mittelbar beeinflussen. Die Pathologie der Gelenke des Reiter-Syndroms iat gleich der bei psoriatischer Arthritis und rheumatoider Arthritis festgestellten. IL-1 wurde als ein Mediator der Gewebedestruktion bei diesen drei unterschiedlichen Formen von entzündlicher Arthritis einbezogen. Außerdem kann man IL-1 in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthritis finden. Die Freisetzung von IL-1 durch Chondrocyten wurde in die Destruktion von Ca^tilago articularis bei dieser Krankheit einbezogen.

IL-1 kann auch die Schwere von Autoimmunkrankheiten erhöhen. Beispielsweise wurde eine verringerte IL-1 Produktion aus peripheren Blutzellen bei Personen beschrieben, die an systemischer Lupus erythymatodes litten. Außerdem kann man einige Veränderungen in der B-Lymphocytenfunktion mit den Abnormalitäten bei der IL-1 Produktion oder IL-1 Verfügbarkeit in Verbindung bringen.

Eine übermäßige IL-1 Produktion wurde in den peripheralen Monocyten von Patienten mit Sklerodermie nachgewiesen, und IL-1 wurde als ein mögliohes Agens von Fibrosierung durch Stimulierung der Kollagenproduktion durch Fibroblasten einbezogen. Der Mechanismus von Gewebeschaden bei Dermatomyositis könnte auch duroh Zellen bewirkte Immunität beinhalten, und IL-1 kann deshalb als ein Mediator bei diesem pathophysiologischen Prozeß enthalten sein.

Akute und chronische interstitielle Lungenkrankheit wird durch übermäßige Kollagenproduktion durch Lungenfibroblasten charakterisiert, die durch IL-1 stimuliert werden kann. Jüngste Untersuchungen an tierischen Modellen von pulmonaler Hypertonie weisen darauf hin, daß IL-1' für die Induktion endothelialer Zellveränderung verantwortlich sein kann, die zu einer Verengung der pulmonalen Arterien führt. Diese Verengung ist es, die zu pulmonaler Hypertonie und weiterer Sekün.därschädigung führt. Demzufolge können IL-1 Inhibitoren für die Behandlung dieser Lungenkrankheiten von Nutzen sein.

In jüngsten Untersuchungen wurde beschrieben, daß IL-I zu einer direkten Schädigung der Beta-Zellen in den Langerhanschen Inseln in der Lage ist, die für die Produktion von Insulin verantwortlich sind. Eine Schädigung der Zellen durch IL-1 wird jetzt als Primärereignis in der akuten Phase von juvenilem Diabetes mellitus als hypthetisch angesehen.

Die Infiltration von Monocyten und Makrophagen in die Nieren ist bei vielen Formen von akuter und chronischer Glomerulonephritis vorherrschend. Die Freisetzung von IL-1.

duroh diese Zellen kann zu lokaler Akkumulation anderer entzündlicher Zellen führen, was eventuell zu Entzündungsschäden und fibrotischer Reaktion in den Nieren führt.

Es wurde nachgewiesen, daß die in Geweben oder Flüssigkeiten gefundenen Kristalle bei Gicht oder Pseudogicht Makrophagen direkt zur Freisetzung von IL-1 anregen können« Demzufolge kann IL-1 ein bedeutender Mediator in dem Entzündungszyklus bei diesen Krankheiten sein.

IL-1 kann einen Kalziumverlust aus den Knochen verursachen und für die bei entzündlichen Gelenkerkrankungen festzustellende Osteoporosis verantwortlich sein.

Keratinozyten von Patienten mit Psoriasis setzen große Mengen IL-1 frei. Dieser Mediator kann für die sekundäre Zellproliferation- und akkumulation verantwortlich sein, die in der Haut von Patienten mit dieser Krankheit auftritt,

IL-1 i3t eines der bedeutenden endogenen Pyrogene und kann für die Induktion des bemerkenswerten Fiebergrades verantwortlich sein, wie er bei einigen Infektionserkrankungen, z.B. akuter fieberhafter Erkrankung durch Bakterien oder Viren auftritt.

Sarkoidose wird durch granulomatose Schädigung in vielen verschiedenen Organen im Körper charakterisiert. Es wurde nachgewiesen, daß IL-1 in der Lage ist, eine Granulombildung in vitro hervorzurufen und in diesem Prozeß bei Patienten mit Sarkoidose vorkommen kann.

Eine übermäßige IL-1 Produktion wurde bei peripheren Monocyten sowie bei Morbus Chron als auch bei Oolitis

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ulceroea nachgewiesen. Eine örtlich begrenzte UL-I Freisetzung in Darn Kann ein bedeutender Mediator bei der Stimulierung des Entzündungszyklus bei diesen Krankheiten sein.

Bestinsvte Lymphadenome sind durch Fieber, Osteoporose und sogar sekundire Arthritis charakterisiert. Eine übermlQige IL-I Freisetzung wurde bei einigen Lymphadenomzöllen in vitro nachgewiesen und kann für einige klininche Manifestationen dieser Malignitlten verantwortlich sein. Ebenso kann die IL-I Produktion durch einige Maligne Lymphocyten für Manches Fieber, akute Phasenreaktion oder Kachexie, die bei Leukämie auftritt, verantwortlich sein.

Man niMMt an, daß die IL-I Freisetzung durch Astrocyten Im Gehirn fur die Entstehung der Fibröse verantwortlich ist, die naoh einer Hlrnschldigung durch vaskullre Okklusion entstehen kann.

C. Anwendungen for einen IL-I Inhibitor

In diesen und anderen Fallen, in denen IL-I eine schädigende Wirkung hat, gibt es zweifelsfrei eine klinische Anwendung für einen Inhibitor dor IL-I Wirkung. 0« IL-I ein CoMitogen für T-Zellen ist, steht es im Mittelpunkt für .die Entwicklung von AutoiMmun- und anderen Immunkrankheiten. Daher könnten -systematisch verabreicht - IL-I Inhibitoren nützliche immunoeuppresive Mittel sein. Lokal angewandt, dienen solche IL-I Inhibitoren zur Verhütung von Gewebedestruktion in einem entzündeten Gelenk oder anderen Entzündungsstellen. Tatsächlich kSnnten zur Verhütung von Gewebedestruktion einige IL-I Inhibitoren sogar wirksamer sein, wenn sie in Verbindung mit Kollagenase-Inhibitoren verabreicht würden.

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Eine therapeutische Beeinflussung der Wirkung von IL-1 könnte auf der Ebene von Synthese, Sekretion oder der Bindung der Targetzellen oder Reaktion auf Protein möglioh sein. IL-1 wird du^oh Monocyten/Makrophagen und andere Zellen, durch Reaktion mit Lipopolysaccharide, Koraplementfragmenten und Viren synthetisiert. Jedes Molekül, das die Bindung dieser auslösenden Faktoren an Producer-Zellen blockiert oder das sich mit ihren Einflüssen auf die Phy? .ologie dieser Zellen überlagert, dient als Regulator der Wirkung von IL-1. IL-1 wird nicht durch ein traditionelles Sekretionssystem abgesondert, da mRNAs isoliert worden sind, die mindestens zwei 30 kd Präkursoren von Proteinen codieren, die aber keine hydrophobe Signalsequenz enthalten. Die Freisetzung des aktiven Proteins aus dem inaktiven Präkursor erfordert wahrscheinlich die Proteolyse dieses Präkursors. Ein Inhibitor für die Freisetzung von IL-1 oder mehreren IL-1 aus ihren Präkursoren könnten theoretisch die IL-1 Wirkung regulieren. IL-1 wirkt wahrscheinlich auf Targetzellen über einen klassischen rezeptorvermittelten Weg, obwohl dieser Rezeptor bis jetzt nicht isoliert wurde. Demzufolge könnte es sein, daß ein Molekül, das eine IL-1 Bindung mit seinen Rezeptoren beeinträchtigt oder die Rezeptoren herabreguliert, auch die IL-1 Wirkung regulieren könnte. Obwohl die intrazellulären Vorgänge nach einer Rezeptorbindung von IL-1 noch nicht völlig erkannt sind, ist es außerdem möglich, da3 wirksame Mittel existieren, die die Zellreaktionen auf andere rezeptorvermittelte Vorgänge beeinträchtigen und deshalb die Wirkung von IL-1 verhindern. Aus diesen oben dargelegten Gründen wurden Proteine und k?.eine Moleküle ge-

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sucht, die in der Lage sind, IL-I auf die eine oder andere Art zu nennen.

Ziel der Erfindung

Durch das erfindungegeefiGe Verfahren wird ein pharmakologisch Äußeret wertvoller Interleukin-1 Inhibitor (IL-I) zur Verfügung gestellt.

Darlegung dee Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabezugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, die in der Lage sind, die Wirkung von Interleukin-1 zu hemaen, bereitzustellen.

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überraschenderweise haben die heutigen Erfinder mindestens zwei IL-I Inhibitorproteine mit 11-1 verzögernden Eigenschaften gefunden. Diese Moleküle hat nan in gereinigter For« erhalten, von der jeder Facheann die Aminosäuresequenz bestinnen kann. Außerdem wurde eine Herstellung von Zellen charakterisiert, die diese Proteine produzieren, und es wurde eine nRNA, die zu ihrer Synthese führt, charakterisiert. Letztlich wurde ein Antiserun entwickelt, daß das Screening von cDNA Expressions-Libraries für die Gencodierung für diese Inhibitoren erleichtert. Zusammen ermöglichen diese Reagenzien, daß die cDNAs die zu klonierenden IL-I Inhibitoren codieren. Diese Gene machen wiederun die großtechnische Herstellung von IL-I Inhibitoren möglich, die für die Verwendung in pharmazeutischen Rezepturen genignet sind, die für die Behandlung pathophysiologiacher IL-1-vernittelter Zustünde von Nutzen sind.

Diese Erfindung bezieht sich in allgemeinen auf Verfahren zur Herstellung von IL-I Inhibitoren ("IL-Ii") und speziell einen durch Monocyten erhaltenen Inhibitor. Zusätzlich bezieht eich vorliegende Erfindung auf die Herstellung biologisch aktive, Analoga dieser Inhibitoren.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, gereinigte Formen dieser IL-I Inhibitoren zu erzeugen, die gegenüber IL-IO oder IL-18 oder deren Kombinationen wirksan sind. Ein weiterer Gegenstand der gegenwärtigen Erfindung besteht darin, diese Inhibitoren in gereinigten Formen zu erzeugen, um die Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz zu

ermöglichen. Ein weiterer Gegenstand ist, die Aminosüuresequenzen von bestimmten IL-1 Inhibitoren festzustellen. Außerdem ist die Identifikation von biologisch wirksamen Analoga solcher IL-1 Inhibitoren mit erhöhten oder äquivalenten Eigenschaften auch ein Ziel der Erfindung.

Weiterhin besteht ein Gegenstand dieser Erfindung darin, ein rekombinantes DNA-System für die Produktion von hier beschriebenen IL-1 Inhibitoren zu entwickeln. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildet die Entwicklung gereinigter Formen von IL-1 Inhibitoren, die als pharmazeutische Präparate, die Wirkung gegen IL-1 aufweisen, von Wert sind.

Zusätzliche Ziele und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der vorliegenden Beschreibung erläutert, und teilweise gehen sie eindeutig aus der Beschreibung hervor oder sind aus der praktischen Anwendung der Erfindung zu erkennen. Die Ziele und Vorteile sind mit den in den angefügten Patentansprüchen besonders erläuterten Mitteln und Kombinationen zu realisieren und zu erreichen.

Um die Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung,werden IL-1 Inhibitoren dargelegt, die eine verzögernde Wirkung gegenüber IL-1 aufweisen. Die bevorzugten Inhibitoren wurden in einer gerei igten Form aus einem monocyten-konditionierten Medium mit Monocyten isoliere, die auf·IgG-beschichteten Platten gewachsen sind.

Bevorzugte Inhibitoren der vorliegenden Erfindung sind 1, 2 und 3. Die Inhibitoren 1 und 2 sind Proteine, die auf einer Positionscharakteristik von 22-23 kDa Proteinen

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auf SDS-PAGE verlaufen und die sich bei 52 rnM bzw. 60 mM NaCl aus einer Mono Q FPLC-Säule unter spezifizierten Bedingungen herauslösen. Inhibitor 3 ist ein Protein, das auf einer Positionscharakteristik eines 2OkD Proteins auf SDS-PAGE verläuft und sich bei 48 mM NaCl aus einer Mono Q FPLC-Säule unter spezifischen Bedingungen herauslöst. Zusätzlich werden zur Erreichung der Ziele und gemäß den Absichten der vorliegenden Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen dargelegt, die mindestens einen wirksamen Bestandteil, einen IL-1 Inhibitor gemäß \rorliegender Erfindung oder seine biologisch wirksamen Analoga, wie hier dargelegt, enthalten.

Weiterhin wird zur Erreichung der Ziele und in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung auch ein rekombinanfces DNA-System für die Entwicklung dieser IL-1 Inhibitoren und ihrer Analoga dargelegt. Eine bevorzugte Ausführungsart dieses Systems enthält mindestens ein cDNA-Klon oder sein synthetisches Äquivalent, das mindestens einen IL-1 Inhibitor zusammen mit Krankheitsüberträgern und Zellen codiert und da3 ein Expressionssystem bildet, welches in der Lage ist, die hier dargelegten IL-1 Inhibitoren zu exprimieren. Ebenso v/erden Antisera zur Verwendung bei der Identifizierung dieser cDNA-Klone geschaffen. Expresnionssy! teme für die Produktion dieser IL-1 Inhibitoren unter Verwendung dieser cDNA-Klone, ihrer Analoga oder anderer DNA-Sequenzen zur Kodierung dieser Inhibitoren werden entwickelt.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Die Abbildungen la und Ib zeigen die Proteinprofile der Mono Q Chromatographie der zwei metabolisoh gekennzeichneten Monooyten-UberstBnde. Die Zellen wurden auf mit IgG (la) oder fötalem Kalbeserum (Ib) beschichteten Platten gezüchtet.

Abbildung 2a zeigt silbergefirbte Gele von Fraktionen aus den in Abbildungen la und Ib dargestellten Bereichen.

Abbildung 2b 1st ein Autoradiogramm der in Abbildung 2a gezeigten Gele.

Die Abbildungen 3a, b und c stellen Werte von dem gereinigten IL-Ii des Beispiels 1 dar. Abbildung 3a enth&lt Chromatographie-Werte mit den überlagerten Radioaktivltltsmustern. Abbildung 3b enthält sllbergeffirbte Gele von den Proben der in Abbildung 3a dargestellten Fraktionen. Abbildung 3c enthält Autoracfiogramme der Gele in Abbildung 3b.

Die Abbildung 4a und b zeigen die Ergebnisse von Gelfiltratlona-Chromatogrammen von Mono Q-gereinigtem IL-Il.

Die Abbildung 5a und b zeigen eine Western-Analyse von Mäuse-Antiserum.

Abbildung 6 stellt den Aufbau von Plasmid pSVXVPL2IL-li dar.

Abbildung 7 stellt den Aufbau von Plasmld pMK-SGEtIL-Ii dar. Die Abbildungen 8a-d enthalten Werte von IL-Ii- «

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Die Abbildungen 8a und b zeigen Daten der Chromatographie. Abbildung 8c zeigt ein silbergefBrbtes Gel von Proben der in Abbildung 8b dargestellten Fraktionen. Abbildung 8d ist ein Autoradiogramm.

Die Abbildung 9a und 9b enthalten Werte von IL-Ii-

Abbildung 9a enthBlt Chromatographie-Werte, Abbildung 9b SDS-PAGE-Werte.

Abbildung 10 enthält Werte einer IL-li-oi Peptid-Trennung. Abbildung 11 enthBlt Werte einer IL-Ii-^ Peptid-Trennung.

Abbildung 12a ist eine Fotographie des Gels mit den GT10-ILÜ-2A, aufgeschlossen nit EcoRI nach Elektrophorese genoß Beispiel 6.

Abbildung 1 2b enthält Werte eines Autoradiogranms eines Souther Blot des in Abbildung 12a dargestellten Gels.

Abbildung 13 zeigt einen Teil der DNA Sequenz 4es Protein-Codierungsbereiche von Lambda GT10-IL11-2A und die vorausbestiemte Aminosäuresequenz gemBQ Beispiel 6,

Abbildung 14 stellt die Nukleotidsequenz von GT10-111I-2A dar.

Abbildung 15 stellt ein Petid dar, einschließlich, inter a lia, einer IL-Ii Sequenz und einer sekretorische» Leltseciuenz.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungeart

Nunmehr wird Detail auf die gegenwBrtig bevorzugten Auiifühtungsarten der Erfindung hingewiesen, die zusammen mit

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den nachfrlgenden Beispielen zur Erläuterung der Prinzipien der Erfindung dienen.

A« Inhibitor aua humanen Monocyten

Wie oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf IL-1 Inhibitoren, die in einer gereinigten Form isoliert wurden. Vorzugsweise erhält man die erfindungsgenäßen IL-1 Inhibitoren aus einem konditionieren Medium humaner Monocyten, wobei die Monocyten auf IgG - beschichteten Gefäßen gezüchtet wurden. Außerdem schließt die Erfindung gründlich gereinigte IL-1 Inhibitoren jeden Ursprungs ein, die dem Inhibitor biologisch äquivalent sind, der aus einem humane Monocyten enthaltenden Medium erhalten wurde.

Unter "biologisch äquivalent" - wie in der Spezifikation und den Patentansprüchen durchweg verwendet - verstehen wir Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, eine IL-1-Wirkung in ähnlicher V/eise zu verhindern, jedoch nicht unbedingt im gleichen Grad wie der aus Monocyten isolierte native IL-1 Inhibitor. Unter "wesentlich homolog" - wie durchweg in der sich ergebenden Spezifikation und den. Patentansprüchen verwendet - wird ein Homologiegrad des aus dem monocyten-konditionierten Medium isolierten nativen IL-1 Inhibitor verstanden, der über die durch alle vorher angeführten IL-1-Inhibitor gezeigten hinausgeht. Vorzugsweise liegt der Homologiegrad über 70 %, besser über 80 % und nor '-> besser über 90 %. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Inhibitoren hat bei nativen Inhibitoren eino Homologie von 95 %, Die beschriebene prozentuale Homologie wird als Prozentsatz der in der kleineren der beiden Sequenzen gefundenen

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Äminofläurereate berechnot, die mit den identischen Aminosäureresten in der verglichenen Sequenz abgeglichen sind, wenn vier Zwischenräume in einer Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um damit diese Abgleichung zu unterstützen, wie von Dayhoff, M.D. in Atlas of Protein Sequenze and Structure, Ausgabe 5, Seite 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. dargelegt, und durch Referenz hier besonders einbezogen.

Die bevorzugten IL-1 Inhibitoren der vorliegenden Erfindung wurden aus einem monocyten-konditionierten Medium erhalten und zum ersten Mal in einer gereinigten Form isoliert. Für die Ziele der vorliegenden Anmeldung soll der Begriff "reine Form" oder "gereinigte Form" - wenn er verwendet wird, um auf die hier dargelegten IL-1 Inhibitoren hinzuweisen - eine Herstellung bedeuten, die im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, die keine IL-1 Inhibitorer darstellen. Vorzugsweise besitzen die IL-1 Inhibitoren der vorliegenden Erfindung eine Reinheit von mindestens 90 % und vorzugsweise 95 %*

Mit den Methoden dieses Beispiels wurden drei gereinigte IL-1 Inhibitoren isoliert· Diese schließen Inhibitor 1, Inhibitor 2 und Inhibitor 3 ein. Inh-,oitor 1 verhält sich v/ie ein 22-23 kDa-Molekül auf SDS-PAGE mit einem ungefähren isoelektrischen Punkt von 4,8 und der aus einer Mono Q FPLC-Säule bei etwa 52 mM NaCl in Trispuffer, pH 7,6 herausgelöst wird. Inhibitor 2 ist auch ein 22-23 kDa Protein, pi = 4,8, das sie h aber aus einer Mono Q-Säule bei 60 mM NaCl löst. Inhibitor 3 ist ein 20 kDa Protein und löst aich aus einer Mono Q-Säule bei 48 mM NiCl. Die

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Inhibitoren 1, 2 und 3 3tehen immunologisch und funktionell in Beziehung. Dadurch, daß diese Inhibitoren in gereinigter Form erhalten wurden, wurden die jetzigen Erfinder in die Lage versetzt, ihre Aminosäuresequenzen zu erlangen. Unter Verwendung der gereinigten Inhibitoren, die erstmals hier dargelegt wurden und von solchen Methoden wie sie in und durch die mit dem ABI Protein Sequencer mitgelieferten technischen Handbuch von ABI Protein Sequencer beschrieben sind.

Beispiel 3 enthält V/erte der Aminosäuresequenz, die aus drei IL-1 Inhibitorarten erhalten wurden, nämlich IL-Ii-X, IL-U-oC und IL-U-/?.

Die jetzigen Erfinder haben mindestens einen Antikörper gegen einen IL-1 Inhibitor entdeckt. Weitere polyklonale und monoklonale Antikörper gegen diesen und weitere IL-1 Inhibitoren können durch den Fachleuten bekannte Methodenhergestellt werden. Ein besonderer polyklonaler Antikörper wird in Abbildung 4 beschrieben.

B. Rekotnbinant-Inhibitor 1. Allgemeines

Jetzt wird eine Rekombination-DNA-Methode für die Herstellung eines IL-1 Inhibitors dargelegt. In einer Ausführungsart der Erfindung wirkt die aktive Seite in einer Weise, die biologisch äquivalent zu der des vom Menschen isolierten natürlichen IL-1 Inhibitors ist. Man kann eine natürliche oder synthetische DNA-Sequenz verwenden, um die Produktion von IL-1 Inhibitoren zu steuern. Diese Methode beinhaltet:

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(a) Herstellung einer DNA-Sequenz, die eine Wirtszelle so steuern kann, daß sie ein Protein mit einer IL-1 Inhibitor-Aktivität erzeugt;

(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einem Krankheitsüberträger, der in eine Wirtszelle überführt und repliziert werden kann, wobei dieser Krankheitsüberträger, der funktionelle Elemente enthält, die notwendig sind, um die DNA-Sequenz zu exprimieren.

(c) Transferierung des Krankheitsüberträgers, der die synthetische DNA-Sequenz und funktionsfähige Elemente enthält, in eine Wirtszelle, die den di . DNA-Kodierung enthaltenden ]L-1 Inhibitor exprimiert;

(dT Züchtung der Wirtszellen unter für die Verstärkung des Krankheitsüberträgers geeigneten Bedingungen und Expression des Inhibitors;

(β) "Ernten" des Inhibitors und

(f) Ermöglichung, daß der Inhibitor eine aktive tertiäre Struktur annimmt, wodurch er IL-1-inhibitorische Wirksamkeit besitzt.

2. DNA-Sequenzen

Für die Anwendung bei dieser Methode vorgesehene DNA-Sequenzen werden teile in Beispiel 5 und teils in Beispiel behandelt. Es ist beabsichtigt, daß diese.Sequenzen synthetische und natürliche¹ DNA-Sequenzen einschließen. Die natürlichen Sequenzen enthalten ferner cDNA oder genomische DNA-Segmente.

Beispiel 6 zei gt ein Molekularklon der DNA, der ein Protein codiert, das mit dem in den Beispielen 1-3 isolierten identisch ist. In Beispiel 6 wurde ein Plaque, GT10-ILU-2A, aus einem GT1O Library isoliert» Die Phage innerhalb dieses Plaques wurde vermehrt und die DNA isoliert und mit EcoRI aufgeschlossen. Bin EcoRI-Fragment von 1850 Basenpaaren trägt die Codierungssequenz für den IL-1 Inhibitor. Abbildung 13 zeigt die partielle DNA-Sequenz des EcoRI-Fragmeηtes.

Angesichts der hier enthaltenen Hinweise und der bekannten Verfahren 3ind für einen normalen Fachmann weitere synthetische Polynukleotidsequenzen brauchbar. Als ein Beispiel des derzeitigen Standes der Technik hinsichtlich der Polynukleotidsynthese wird auf Matteuccj^, M.D. und Caruthers, M.H. in J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981) und Beaucage, S.L. und Caruthers, M.H. in Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981) sowie auf die mit einem ABI Oligonukleotid-Synthesizer gelieferten Instruktionen hingewiesen, wobei alle insbesondere durch Referenz hier einbezogen sind.

Diese synthetischen Sequenzen können mit den nachstehend detaillierter beschriebenen natürlichen Sequenzen identisch sein oder können verschiedene Nukleotide enthalten» Bei einer Ausführungsart besteht - wenn die synthetischen Sequenzen Nukleotide enthalten, die sich von den in den natürlichen DNA-Sequenzen festgestellten unterscheiden die Absicht, daß diese Sequenzen noch .ein Polypeptid codieren, das die gleiche Primärstruktur wie das aus Monocyten isolierte IL-Ii hat. In einer anderen Ausführungsart codiert eine verschiedene Nukleotide enthaltende synthetische Sequenz ein Polypeptid, das die gleiche

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biologische Wirksamkeit wie das hier beschriebene IL-1 besitzt.

Außerdem kann die DNA-Sequenz ein Fragment einer natürlichen Sequenz sein, das heißt ein Polynukleotid-Pragment, das in der Natur auftritt und das erstmalig von den jetzigen Erfindern isoliert und gereinigt wurde. In einer Ausführungsart ist die DNA-Sequenz ein aus einem cDNA-Library isoliertes Restriktionsfragmant.

In einer anderen Ausführungsart wird die DNA-Sequenz aus einem humanen genoraischen Library isoliert. Ein Beispiel für ein solches Library, das in dieser Ausführungsart von Nutzen ist, wird von Lawn u.a., in Cell 15:1157-1174 (1878) dargestellt, das hier insbesondere durch Referenz einbezogen ist.

Mit einer bevorzugten Version dieser Ausführungsart wird beabsichtigt, die natürliche DNA-Sequenz durch eine Methode, die aus folgendem besteht, zu erhalten:

(a) Herstellung eines humanen cDNA Library aus Zellen, vorzugswe.se Monocyten, die einen IL-1 Inhibitor in einem Krankheitsüberträger produzieren können;

(b) Prüfen des humanen DNA-Library3 mit mindestens einer Sonde, die in der Lage ist, sich an das IL-1 Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt zu binden;

(c) Identifizierung von mindestens einem Klon, der die Gencodierung für den Inhibitor enthält, durch die Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden.

(d) Isolierung der Gen- oder eines Teils der Gencodierung für den Inhibitor aus dem Klon oder ausgewählten Klonen;

(e) Bindung des Gens oder dessen geeigneten Fragmente an funktionsfähige Elemente, die erforderlich sind, um das Gen zu erhalten und in eine Wirtszelle zu expriraieren.

Die für den vorgenannten Prozeß nützlichen natürlichen DNA-Sequenzen können auch durch eine Methode identifiziert und isoliert v/erden, die folgendes beinhaltet:

(a) Herstellung eines humanen genomischen DNA-Librarys, vorzugsweise vermehrt in einer recArecBC E. coli Wirtszelle;

(b) Prüfen des humanen genomischen DNA Librarys mit mindestens einer Sonde, mit der eine Bindung an das IL-1 Inhibitorgen und dessen Proteinprodukt möglich ist;

(c) Identifizierung von mindestens einem Klon, der die Gencodierung für den Inhibitor enthält, durch die Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden;

(d) Isolierung der Gencodierung für den Inhibitor aus dem (den) identifizierten Klon(nen) und

(e) Bindung des Gens oder dessen geeigneten Fragmente an funktionsfähige Elemente, die erforderlich sind, um das Gen zu erhalten und in eine Wirtszelle zu exprimieren.

Bei der Isolierung einer für die obige Methode geeigneten natürlichen DNA-Sequenz bevorzugt man, die beiden Restriktionsstellen zu identifizieren, die innerhalb und am dichtesten zu den Endteilen des entsprechenden Gens oder von Abschnitten des Gens liegen. Das das entsprechende Gen enthaltende DNA-Segment wird dann aus dem Rückstand des genomischen Materials unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonukleasen entfernt. Nach Exzision werden 3^f und 4' Enden der DNA-Sequenz und alle Exon-Verbindungen wieder hergestellt, um entsprechende DNA-Sequenzen zu erhalten, die die N- und C- Terminalen des IL-1 Inhibitor-Proteins codieren und die DNA-Sequenz mit ihren funktionsfähigen Elementen verschmelzen können.

3. Krankheitsüberträger

(a) Mikroorganismen, insbesondere E« coli Die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Krankheitsüberträger beinhalten alle die, in die eine DNA-Üequenz wie oben dargestellt zusammen mit sämtlichen bevorzugten oder erforderlichen funktionsfähigen Elementen eingeführt werden kann und wobei d' ν Krankheitsüberträger dann nachfolgend in eine Wirtszelle transferiert und in einer solchen Zelle repliziert werden kann. Bevorzugte Krankheitsüberträger sind solche, deren Restriktionsstellen einwandfrei nachgewiesen wurden und die die für die Transkription der DNA-Sequenz bevorzugten und erforderlichen funktionsfähigen Elemente enthalten. Allerdings v/erden bestimmte Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung auch vorgestellt, bei denen gemeinhin unentdeckte Krankheitsüberträger eingesetzt werden, die eine oder mehrere hier beschriebene cDNA Sequenzen enthalten. Insbesondere werden bei allen diesen Krankheits-

Überträgern einige oder sämtliche folgende Charakteristiken bevorzugt: (1) Sie besitzen eine minimale Anzahl von Wirtsorganisraus-Sequenzen; (2) sie werden in dem gewünschten Wirt stabil gehalten und vermehrt; (3) sie können in einer großen Anzahl von Kopien in dem gewünschten Wirt vorhanden sein; (4) sie besitzen einen regulierbaren Promotor, der so angeordnet ist, daß er die Transkription des betreffenden Gels fördert; (5) sie haben mindestens eine Marker DNA-Sequenzcodierung für ein auswahlbares Merkmal, das auf einem Teil des Plasmids getrennt von dem vorhanden ist, bei dem die DNA-Sequenz eingesetzt wird und (6) eine DNA-Sequenz, die in der Lage ist, die Transkription zu beenden.

In verschiedenen bevorzugten Ausführungsarten enthalten diese kionischen Krankheitsüberträger, die die DNA Sequenzen der vorliegenden Erfindung aufweisen und sie exprimieren können, verschiedene fuuKtionsfähige Elemente· Diese "funktionsfähigen Elemente" enthalten - wie hier diskutiert - mindestens einen Promotor, mindestens eine Shine-Dalgarno-Sequenz und Initiator-Kondon und mindestens ein Terminator-Kodon. "Vorzugsweise enthalten diese "funktionsfähigen Elemente¹¹ auch mindestens einen Operator, mindestens eine Leitsequenz für die aus dem Interzellularraum zu exportierenden Proteine, mindestens ein Gen für ein Regulatorprotein und alle anderen DNA-Sequenzen, die für eine entsprechende Transkription und nachfolgende Translation der Krankheitsüberträger-DNA notwendig sind oder bevorzugt werden.

Bestimmte funktionsfähige Elemente können in allen bevorzugten Krankheitsüberträgern der vorliegenden Erfindung vorkommen. Es besteht die Absicht, daß alle zusätzlichen

funktionsfähigen Elemente erforderlichenfalls diesen Krankheitsüberträgern unter Anwendung von den entsprechenden Fachleuten bekannten Methoden unter Beachtung der hler enthaltenen Hinv/eise zugegeben werden können.

In der Praxis ist es möglich, jeden dieser Krankheitsüberträger auf eine Weise aufzubauen, die leichte Isolierung, Anhäufung und Austausch eruöglicht. Das erleichtert die Ansammlung zahlreicher funktionsfähiger Gene aus Kombinationen dieser Elemente und deren Codierungsbereich der DNA-Sequenzen. Weiterhin sind viele dieser Elemente in mehr als einem Wirt verwendbar. Es besteht außerdem dis Absicht, daß die Krankheitsüberträger in bestimmten toerorzugten /usführungsarten DNA-Sequenzen enthalten, die als Regulatoren ("Operatoren") fungieren sowie weitere DNA-Sequenzen, die Regulatorproteine codieren können.

(i) Regulatoren

In einer Ausführungsart dienen diese Regulatoren zur Verhinderung der Expression der DNA-Sequenz bei Vorhandensein bestimmter Milieubedingungen und ermöglichen bei Vorhandensein anderer Milieubedingungen die Transkription und die nachfolgende Expression des.durch die DNA-Sequenz codierten Proteins. Insbesondere wird bevorzugt, daß die Regulierungssegmente so in den Krankheitsüberträger eingeführt werden, daß eine Expression der DNA-Sequenz nicht oder in einem stark reduzierten Umfang auftritt, beispielsweise in Abwesenheit von isopropylthio-beta-D-Galactosid. In dieser Situation können die die DNA-Sequenz enthaltenden UTigewandelten Mikroorganismen zu einer gewünschten Dichte vor der Einleitung der Expression von IL-Ii anwachsen. In dieser Ausführungsart wird die Expression des gewünschten Proteins durch Zugabe einer Substanz zu dem mikrobiel'.en

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.ilieu eingeleitet, die die Expression der DNA-Sequenz hervorrufen kann, nachdem die gewünschte Dichte erreicht worden ist.

(ii) Promotoren

Die Bxpressions-Krankheitsüberträger müssen Promotoren enthalten, die von dem Wirtsorganismus zur Expression seiner eigenen Proteine benutzt werden können. Während das Lactose-Promotorsystem allgemein angewendet wird, sind weitere mikrobielle Promotoren isoliert und charakterisiert worden, die einen Fachmann in die Lage versetzt, sie zur Expression des rekombinanten IL-Ii zu verwenden.

(iii) Transkriptionsterminator

Die hier betrachteten Transkriptionsterminatoren dienen zur Stabilisierung des Krankheitsüberträgers. Insbesondere sind solche Sequenzen, wie sie von Rosenberg, M. und Court, J., in Ann. Rev. Genet, J_3:319-353 (1979) beschrieben und durch Referenz besonders hier einbezogen sind, für die Anwendung bei der vorliegenden Erfindung vorgesehen.

(iv) Nichttranslatierte Sequenz

Es wird darauf hingewiesen, daß bei der bevorzugten Ausführungsart es auch wünschenswert sein kann, die 3' oder 5' Enden des Codierungsbereichs zu rekonstruieren, um die Inkorporation nichttranslierter 3¹ oder 5' Sequenzen in das Gentranskript zu ermöglichen. In diese nichttranslatierten Sequenzen sind solche einbezogen, die die mRNA stabilisieren, wie sie von Schmeis3ner, U., McKenney, K., Rosenberg, M. und Court, D. in J. Mol. Biol. 176:39-53 (1984) identifiziert sind und hier durch Referenz speziell einbezogen wurden.

2 8 3 6

(ν) Riboaotnbindungaat eilen

Die mikrobielle Expression fremder Proteine erfordert bestimmte funktionsfähige Elemente, die-Ribosombindungastellen beinhalten aber nicht auf diese begrenzt sind. Eine Ribosombindungastelle ist eine Sequenz, die eine Ribosom erkennt und in die Initiation der Proteinsynthese ei-nbindet, wie von Gold, L. u.a., Ann. Re".'. Microbio. .25:557-580, oder Marquis, D.M. u.a., Gene ,4J?:175~183 (1986) dargelegt. Beide aind apeziell hier durch Referenz einbezogen. Eine bevorzugte Ribosombinaungsstelle ist: GAGGCGCAAAAACATG).

(vl) Leitsequenz und Translationskuppler Außerdem bevorzugt man, daß eine DNA-Codierung für eine geeignete sekretorische Leit (Signal) Sequenz an dem 5' Ende der DNA-Sequenz vorhanden ist, wie von Watson, M.E., in Nucleic Acids Res. J_2:5145-51t>3 dargelegt und hier speziell durch Referenz einbezogen, wenn das Protein aus dem Zytoplasma abgesondert werden soll. Die DNA für die Leitsequenz muß sich in einer Position befinden, die die Produktion eines Pusionaproteina ermöglicht, in der die Leitaequenz unmittelbar angrenzend oder kovalent mit dem Inhibitor verbunden iat, daa heißt es brauchen keine Transkriptions- oder Translationsterminationssignale zwischen den beiden DNA-Codierungssequenzen vorhanden zu 3ein. Das Vorhandensein der Leitsequenz ist zum Teil aus einem oder mehreren der folgenden Gründe wünschenswert. Erstens kann das Vorhandensein der Leitsequenz dam V/irt das Processing von iL-1i erleichtern. Insbesondere K.ami uie Leitsequenz die Zellteilung des initialen Translationsproduktes durch eine Pührungspeptidase steuern, um die Leitsequenz zu beseitigen und ein Polypeptid mit der

" ²⁵ " 2 8 3 6 3 5

Aminosäuresequenz zu hinterlassen, das eine potentielle Proteinaktivität aufweist. Zweitens kann das Vorhandensein der Leitsequenz die Reinigung von IL-Ιλ t durch Ausschleusen des Proteins aus dem Zellzytoplasma erleichtern. Bei einigen Species von Wirts-Mikroorganismen ermöglicht das Vorhandensein einer entsprechenden Leitsequenz den Transport des kompletten Proteins in der; periplasmatischen Raum wie im Falle einiger E. ooli. Bei bestimmten E. coli, Saccharomyces und Stämmen von Bacillus und Pseudomonas ermöglicht die entsprechende Leitsequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran und in das extrazelluläre Medium, In diesem Poll kann das Protein aus dem extrazellulären Protein gereinigt werden. Drittens kann bei einigen mittels der vorliegenden Erfindung hergestellten Proteinen das Vorhandensein der Lei'tsequenz erforderlich sein, um das komplette Protein in einem Milieu anzuordnen, wo es sich falten kann, um seine aktive Struktur anzunehmen, v/obei die Struktur die entsprechende Proteinaktivität besitzt«

In einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung ist eine zusätzliche DNA-Sequenz unmittelbar vor der DNA~Sequeur angeordnet, die den IL-1 Inhibitor codiert. Die zusätzliche DNA-Sequenz kann als Translationskuppler fungieren, das heißt es ist eine DNA-Sequenz, die eine RNA codiert, die dazu dient, das Ribosom unmittelbar neben oder an der Rioosombindungsstelle der Inhibitor-RNA, mit der sie aneinanderliegt, anzuordnen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsart kann man den Translationskuppler unter Verwendung der DIH-Sequenz

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG und durch Methoden erhalten, die den Fachleuten in bezug auf translational Kupp.'.er bekannt sind.

(vii) Translationaterminator

Die hier betrachteten Translationsterminatoren dienen dazu, um die Translation von mRNA zu stoppen. Sie können entweder natürlich, wie von Kohli, J., Mol. Gen. Genet, 182:430-439 beschrieben oder amthetisch hergestellt sein, wie von Pettersson, R.P., Gene 24_:15-27 (1983) beschrieben, v/obei beide speziell durch Referenz hier einbezogen sind.

(viii) Wählbare Marker

Weiterhin wird bevorzugt, daß der in einem wählbaren Marker enthaltene geklonte Krankheitsüberträger, z.B. ein medikamentenresistenter Marker oder andere Marker, die eine Expression eines auswählbaren Merkmals durch den Wirts-Mikroorganismus hervorrufen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsart ist das Gen für die Ampicillinresistenz in dem Krankheitsüberträger enthalten, v/ährend bei anderen Plasmiden das Gen für eine Tetracyclinresistenz oder das Gen für die Chloramphenicolre^i.stenz vorhanden ist.

Eine solche Medikamentenresistenz oder andere wählbare Marker sollen teilweise die Wahl der Transformanten erleichtern. Außerdem kann das Vorhandensein eines solchen wählbaren Markers in dem geklonten Krankheitsüberträger dazu verwendet werden, um kontaminierende Mikroorganismen an einer Vermehrung in dem Kulturmedium zu hindern. In dieser Ausführungsart würde man eine Reinkultur der transformierten Wirts-Mikroorganismen durch Kultivierung der Mikroorganismen unter Bedingungen erhalten, die für das Überleben det. induzierten Phänotyp benötigen.

Wie hierin dargelegt, werden die funktionsfähigen Elemente routinemäßig durch die entsprechenden Fachleute anhand der bisherigen Literatur und der hier enthaltenen Hinweise ausgewählt. Allgemeine Beispiele für diese funktionsfähigen Elemente werden in B. Levin, Genes, Wiley &Sons., New York (1983) dargelegt, die speziell hier durch Referenz einbezogen sind. Man kann verschiedene Beispiele! geeigneter funktionstüchtiger Elemente bei den oben behandelten Krankheitsüberträgern finden, und man kann sie nach Durchsicht der Veröffentlichungen, in denen die Grundcharakteristiken der vorhin erwähnten Krankheitsüberträger behandelt werden, erläutern.

Nach der Synthese und Isolierung aller notwendigen und gewünschten Komponenten des oben behandelten'Krankheitsüberträgers, wird dieser durch den Fachleuten allgemein bekannte Methoden zusammengesetzt. Man nimmt an, daß die Zusammenstellung solcher Krankheitsüberträger innerhalb der Pflichten und Aufgaben liegt, die von dem Fachpersonal durchgeführt werden, wie das - ohne unangemessene Experimente - möglich ist. Beispielsweise wurden ähnliche DNA Sequenzen in entsprechende Kloning-Krankheitsüberträger ligiert, wie das von Maniatis u.a. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984) dargelegt wird und hier speziell durch Referenz einbezogen ist.

Bei der Konstruktion von er'findungsgemäßen Kloning-Krankheitsüberträgern ist zu beachten, daß Mehrfachkopien der DNA-Sequenz und ihre funktionsfähigen Begleitelemente in jeden Krankheitsüberträger eingeführt werden können. In einer solchen Ausführungsart produziert der Wirtsorganismus größere Mengen pro Krankheitsüberträger des gewünschten IL-1 Inhibitors. Die Anzahl der Mehrfachkopien der DNA-

- 28 -

Sequenz, die in den Krankheitsüberträger eingeführt werden können, wird nur duroh die Fähigkeit des resultJ renden Krankheitsüberträgers infoige seiner Größe begrenzt, der in eine entsprechende Wirtszelle transferiert., repliziert und transkripiert werden soll,

(b) Weitere Mikroorganismen

Pur die Verwendung bei anderen Mikroorganismen außer

E. ooli geeignete Krankheitsüberträger v/erden auch für diese Erfindung betrachtet. Derartige Krankheitsüberträger werden in Tabelle 1 beschrieben. Weiterhin werden bestimmte bevorzugte Krankheitsüberträger nachstehend behandelt«

Tabelle

Wirte Regulierte Indueer Transkriptions-Promotoren terminator

LIRlTA Stabi- Transkrip- Marker lisation tionelle

Startstelle

und Leit-

peptid

RS

Bindungsstelle

E.coli Lac , Tac Lambda pL

Trp⁵

IPTG

erhöhte Temp.

rrmB rrmC

bla'

lambda int ompA 10

Ampicillin'^ Tetracyclin¹⁴'¹⁵

phoS

Chloramphenicol

16

IAAZugabe oder

Tryptophan-Verarmung

Ba- ⁺alpha cillus

Amylase

E.coli rrn

rrn Bt.T

,20

⁺Subtilisin' ⁺P-43¹5

spac-I²⁶ IPTG B.amy neutr. Kan

r

Protease Cam"

B.amy alphaylase^^

,r

B.amy enutr. Protease

B.amy alphaamylase

B.subt. Subtilisin

2T Pseudo- Trp '(S.coli)lAA Zu-

monas gäbe od.

Lac(E.coli) Tryptophanverarmung

Lac(E.coli) IPTG Phospholi- Sulfonamid^ Trp (E.coli) pase C^⁰ ₂₉

Exotoxin A Streptomycin"^

κ» ο»

OO

Fortsetzung:

Hefe GaI 1³¹ Glukose- Cyc 1 Invertase³⁶ Ura 3"

verar- _TT Säure-

mung """ phospha- Leu <r

und t§se ^

Ada I³³ Galaktose Alpha-Faktor Alpha-Faktor His 3

II³⁴ Glukose-r Sac 2 Tap 1.

Pho 5 Verarmung

Phosphatv er ar—

mung

⁺nicht reguliert

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- 31 -

(i) Pseudomonas Krankheitsüberträger Verschiedene Krankheitsüberträger-Plasmide_f die sich in einem breiten Bereich von grammnegativen Bakterien autonom replizieren, werden für den Einsatz als Kloning-Vehikel in Wirten der Gattung Pseudomonas bevorzugt. Bestimmte werden von Tait, R.C, Close, T.J., Lundquist, R.C, Hagiya, M., Rodriquez, R.L. und Kado, CI. in Biotechnology, Mai 1983, Seiten 269-275; Panopulos, N.J. in Genetio Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, Seiten 163-1&5 (1981) und Sakagucki, K. in Current Topic in Microbiology and Immunology 96,:31-45 (1982) beschrieben. Sämtliche sind speziell hier durch Referenz einbezogen.

Bei einem besonders bevorzugten Aufbau würde man das Plasmid RSF1O1O und Derivate hiervon verwenden, wie sie von Bagdasarian, M., Bagdasarian, M.M., Colernan, S. und Timmis, K.N. in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. und Puhler, A. eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), beschrieben werden und die hier speziell durch Referenz einbezogen sind. Die Vorteile von RSF1O1O liegen darin, daß es sich relativ um ein kleines Plasmid mit einer hohen Kopiezahl handelt, das einfach in E. coli und Pseudon'.onas-Spezies transformiert werden kann und hier stabil bleibt. Bei diesem System v/ird die Anwendung des Tac-Expressionssystems, wie für Esoherichia beschrieben, bevorzugt, da es der Anschein hat, daß der E. ooli trp-Promotor einfach du:'oh Pseudomonas-RNA-Polyrnerase erkannt wird, wie von Sakagucki, K. in Current Topics in Microbiology and Ivamunology 96:31-45 (1982) und Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. und Heyneker, M.L. in Biotechnology,

Februar 1984, Seiten 161-165 dargelegt. Beide sind speziell durch Referenz hier einbezogen. Die Transkriptionsaktivität kann weiterhin durch die Notwendigkeit des Austausche des Promotors mit beispielsweise einem E. coli oder P. aerucinasa trp-Promotor maximal erhöht werden. Außerdem wird das lad - E. coli - Gen auch in das Plasmid eingetragen, um eine Regulation zu bewirken.

Die Translation kann mit der Translationsinitiation für alle Pseudomonas-Proteine sowie mit den Initiationsstellen für alle in hohem Umfang exprimierte Proteine des gewählten Typs gekoppelt v/erden, um eine intrazelluläre Expression des Inhibitors hervorzurufen.

In den Fällen, bei denen Restriktions-Negativstämme eines Pseudomonas Species-Wirts nicht verfügbar sind, ist die Transformationswirksamkeit mit aus E. coli isolierten Plasmidkonstrukten gering. Deshalb ist die Passagierung des Pseudomonas-Kloning-Krankheitsüberträgers

ma al·

durch einen r m -Stamm einer anderen Species vor der Transformation des gewünschten Wirtes erwünscht, wie das von Bagdasarian, M. u.a., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Seiten 411-422, Timmi3 und Puhler eds., Elsevier/florth Holland Biomedical Preös (1979) dargelegt und hier speziell durch Referenz einbezogen ist.

(ii) Bacillus-Krankheit süberträger

Weiterhin enthält ein bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus Plat .nid pUB11O alä Kloning-Vehikel. V/ie in einem anderen Wirt-Krankheitsüberträger-

- 33 - 2 β 3 β 3

System ist es möglich, im Bacillus das erfindungsgemä3e IL-Ii entweder als intrazelluläres oder als sekretorisches Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsarten beinhalten beide Systeme» Shuttle-Krankheitsüberträger, die sich in Bacillus und E» coli replizieren, stehen für den Aufbau und die Testung verschiedener Gene zur Verfugung, wie das von Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, .7» und Shivakumar, A. G. in Genetic Engineering, Ausgabe 2, Setlov und Hollander eds., Plenum Press, New York, New York, Seiten 115-131 (1900) beschrieben und speziell durch Referenz hier einbezogen ist. Für die Expression und Sekretion von IL-Ii aus B. subtilis wird die Signalsequenz der alpha-Amylase vorzugsweise mit dem Codierbereich für das Protein gekoppelt. Zur Synthese des intrazellulären Inhibitors wird die transportierbar MA-Sequenz translati:nell mit der Ribosom-Bindungsstelle der alpha-Amylase-Leitsequenz gekoppelt.

Die Transkription dieser Konstrukt° wird vorzugsweise durch den alpha-Amylasepromotor oder dessen Derivat durchgeführt. Dieses Derivat enthält die RNA-Polymerase-Erkennungssecuenz des nativen alpha-Anylasepromotors aber bezieht auch den lac-Operatorbereich ein. Ähnliche Hybridpromotoren, aufgebaut aus der.. Penicillin-Gen-Promotor und dem lac-Operator haben gezeigt, daß sie in Bacillus-Wirten in einer regelbaren Art und Weise wirken, wie von Yansura, D.G. und Henne:: in Genetics and Biotechnolog?; of Bacilli, Ganesan, A.T. und Hoch, J.A.,· eds., Academic Press, Seiten 259-263 (1934) dargelegt und speziell durch Referenz hier einbezogen. Das lacI-Gen de3 E. coli wird auch in das Plasmid einbesogen, um die Regulierung zu bewirken.

- 34 - 2 ft 3 8 3

(iii) Clostridium-Krankheitsüberträger Ein bevorzugter Aufbau für die Expression in Clostridium ist Plasmid pJU12, beschrieber, von Squires, CJI. u.a., in J. Bacteriol. 15J):465-471 (1984) und speziell hier einbezogen, -,ransformiert in C. perfringens mit Hilfe der Methode von Keefner, D.L. u.a. wie in J. Bacteriol. 159,:46O-464 (1984) beschrieben und hier speziell durch Referenz einbezogen. Die Transkription wird durch den Promotor des tetrazyklinresistenten Gens gesteuert. Die Translation ist an die Shine-Dalgarno-Sequenzen des gleichen tet^r-Gens in einer Art und Weise gekoppelt, die streng analog zu den oben dargestellten Verfahren für in anderen Wirten verwendete Krankheitsüberträger geeignet ist.

(iv) Hefe-Krankh eit süberträger

Die Erhaltung fremder in Hefe eingeleiteter DNA kann auf verschiedene V/eise bewirkt werden, wie das von Botstein, D. und Dacis, R.V/., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones and Broach, eds., Seiten 607-636 (1982) beschrieben und hier speziell durch Referenz einbezogen ist. Ein bevorzugtes Expressionssystem zur Anwendung bei Wirtsorganismen der Gattung Saccharomyces beherbergt das IL-Ii - Gen auf dem 2 Mikroplasmid. Die Vorteile des 2-I/iikronkreises beinhalten eine relativ hohe Anzahl Kopien sowie Stabilität bei Einführung in cir°-Stämme. Diese Krankheitsüberträger enthalten ν ,rzugsweise den Replikationsursprun^, und mindestens einen Antibiotik-Resistenz-Marker aus pBR322 und ermöglichen die Replikation und Selektion in E. coli. Außerdem hat das Plasmid vorzugsweise die 2-Mikron-Sequenz und das Hefe LEU2-Gen

-35- 203835

und dient in defekten LEU2 Hefemutanten den gleichen Zwecken. »

Y/enn die Absicht besteht, daß die rekombinanten IL-1 Inhibitoren letztlich in Hefe exprimiert werden, wird vorzugsweise zuerst der Kloning-Krankheitsüberträger in-Esoherichia coli transferiert, wobei sich der Krankheitsüberträger replizieren kann und von dem der Krankheitsüberträger erhalten und nach Verstärkung gereinigt wird. Der Krankheitsüberträger wird dann in die Hefe zur endgültigen Expression des IL-1 Inhibitors transferiert.

(c) Säugetierzellen

Die cDNA für den IL-1 Inhibitor dient als Gen für die Expression des Inhibitors in Säugetierzellen. Es muß eine Sequenz vorhanden sein, die bei Bindung von Ribosomen wirkungsvoll ist, wie das von Kozak in Nucleic Acids Research 15_:8125-8132 (1987) beschrieben und hier speziell durch Referenz einbezogen wird, und es muß eine Codierkapazität für eine Leitsequenz (siehe Abschnitt 3(a)(vi)) haben, um das vollentwickelte Protein in einer verarbeiteten Form aus der Zelle herauszuleiten. Das die vollständige cDNA-Sequenz tragende DNA Restriktionsfragment kann in einen Expresi.ions-Krankheitsüberträger eingeführt werden, der einen Transkriptions-Promotor und transkriptioneile Enhancer besitzt, die von Guarente, L. in Cell 5_2:3O3-3O5 (1988) und Kadonaga, J.T. u.a. in Cell 52:10Y9-1o90 (1987) beschrieben, wobei beide durch Referenz hier einbezogen sind. Der Promotor kann regulierbar sein, wie in dem Plasmid pMSG (Pharmacia Cat. No. 27450601), wenn eine wesentliche Expression des Inhibitors für das Zellwachstum schädlich ist. Der Krank-

heitaüberträger soll ein vollständiges Polyadenylations-Signal haben, wie das von Ausubel, P.M. u.a. in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (19^7) beschrieben und hier speziell durch Referenz; einbezogen wird, so daß die von diesem Krankheitsüberträger transkribierte mRNA richtig entwickelt wird. Letztlich hat der Krankheitsüberträger den Replikationsbeginn und mindestens einen Antibiotik-Resistenz-Marker aus pBR322 und ermöglicht eine Replikation und Selektion in E. ooli.

Um eine stabile Zellinie auszuwählen, die den IL-1 Inhibitor produziert, kann der Expressions-Krankheitsüberträger das Gen für einen auswählbaren Marker tragen, z.B. einen medikamentenresistenten Marker oder ein Komplementärgen für eine fehlende Zellinie,'z.B. ein Dihydrofolat-Reduktase (dhfr)-Gen für die Transformierung einer dhfr" Zellinie, wie das von Ausubel u.a., supra bes hrieben wird. Alternativ kann ein getrenntes, den wählbaren Marker tragendes Plasmid zusammen mit dem Expressions-Krankheitsübertrüger transformiert werden.

4. Wirtszellen/Transformation

Der so erhaltene Krankheitsüberträger wird in eine entsprechende Wirtszelle transformiert. Diese Wirtszellen können Mikroorganismen oder Säugetierzellen sein.

(a) Mikroorganismen

Man nimmt an, daß sämtliche Mikroorganismen gewählt werden können, die die Fähigkeit besitzen, exogene DNA aufzunehmen und solche Gene und funktionsfähige Begleitelemente zu exprimieren. Nach Wahl eines Wirtsorganismus v/ird der Krankheitsüberträger in den Wirtsorganismus

unter Anwendung von den Fachleuten allgemein bekannten Methoden transferiert. Beispiele fu" solche Methoden kann man in Advanced Baoterial Genetics von R.W. Davis u.a., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980) finden, die hier speziell durch Referenz einbezogen sind. In einer Ausführungsart wird bevorzugt, daß die Transformation bei niedriger Temperatur erfolgt, dn eine Temperatu.rregulierung als Mittel zur Regulierung der Gen-Expression durch Anwendung funktionsfähiger Elemente, wie oben dargelegt, vorgesehen ist. In einer anderen Ausführungsart ist - wenn osmolare Regulatoren in den Krankheitsüberträger eingefünrt wurden - die Regulierung der Salzkonzentration während der Transformation erforderlich, um die entsprechende Steuerung der fremden Gene zu gewährleisten.

Es wird bevorzugt, daß der Wirts-Mikroorganismus ein fakultativer Anaerobier oder ein Aerobier ist. Besondere Wirte können für die Verv/endung bei dieser Methode vorzugsweise Hefe und Bakterien beinhalten. Spezifische Hefen enthalten die Gattung Saccharomyces und insbesondere Saccharomyces cerevJ3iae. Spezifische Bakterien enthalten die Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas, besonders Bacillus subtilis und Escherichia coil. Außerdem sind Wirtszellen in Tabelle 1, supra, zusammengestellt.

(b) Säugetierzeileη

Der Krankheitsüberträger kann in Säugetierzellen

in Kultur durch verschiedene Techniken eingeführt werden, z.B. Kalziumphosphat: DNA Ko-Pro?,ipitatoren, Elektroporation oder Protoplastfusion. Die bevorzugte Methode ist Ko-Prezipltation mit Kalziumphosphat, wie das von Ausubel

u.a., supra beschrieben wird.

-38- 263835

Es existieren viele stabile Zelltypen, die transformierbar und in der Lage zur Transkription und Translation der cDNA Sequenz, zum Processing des Präkursors IL-Ii und zur Abgabe des vollständig entwickelten Proteins sind. Allerdings können Zelltypen im Hinblick auf die Glykosylation von ausgeschleusten Proteinen und posttranslationeller Modifikation von Aminosäureresten - sofern vorhanden - veränderlich sein. Somit sind die idealen Zelltypen solche, die einen zum natürlichen Molekül identischen rekombinierten IL-1 Inhibitor produzieren.

5· Kultivierung engineerter Zellen Die Wirtszellen werden unter geeigneten Bedingungen für die Expression des IL-1 Inhibitors kultiviert. Diese Bedingungen sind im allgemeinen für die Wirtszelle spezifisch und werden problemlos von einem Fachmann anhand der veröffentlichten Literatur bestimmt, die sich mit den Wachstumsbedingungen für solche Zellen befaßt sov/ie anhand der hier enthaltenen Hinweise. Beispielsweise enthält das nier durch Referenz einbezogene Bergey's Manual of Determinative bacteriology, 8. Ausgabe, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland Informationen über Bedingungen für die Kultivierung von Bakterien. Ähnliche Informationen zur Kultivierung von Hefe und Säugetierzellen kann man aus Pollack, R., Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) entnehmen, die hier speziell durch Referenz einbezogen sind.

Sämtliche für die Regulierung der Expression der DNA Sequenz notwendigen Bedingungen, die von allen functions-

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fähigen Elementen abhängen, die in den Krankheitsüberträger eingeführt wurden oder vorhanden sind, wirken bei den Transformations™ und Kultivierungsstufen. In einer anderen Ausführungsart sind die Zellen bei Vorhandensein entsprechender Regulierungabedingungen, die die Expression der DNA Sequenz hemmen, zu einer hohen Dichte gewachsen. Wenn die optimale Zelldichte erreicht ist, werden die Milieubedingungen so geändert, daß sie für die Expression der DNA Sequenz geeignet sind. Damit ist beabsichtigt, daß die Produktion des IL-1 Inhibitors in einer Zeitspanne nach dem Wachsen der Wirtszellen bis in die Nähe der optimalen Dichte erfolgt und daß der entstehende Inhibitor zu einer Zeit "geerntet" werden kann, nachdem die für seine Expression erforderlichen Regulationsbedingungen eingeführt wurden.

6. Reinigung

(a) Von Mikroorganismen produziertes IL-Ii In einer bevorzugten Ausführungsart der vorliegenden Erfindung wird der rekombinante IL-1 Inhibitor nach dem "Ernten" und vor der Annahme seiner aktiven Struktur gereinigt. Diese Ausführungsart wird bevorzugt, da die Erfinder der Meinung sind, daß die TErlangung einer hohen Ausbeute eines zurückgefalteten Proteins erleichtert v/ird, wenn das Protein zuerst gereinigt wird. Allerdings wird in einer anderen bevorzugten Ausführungsart ermöglicht, daß sich der IL-1 Inhibitor zurückfalten kann und seine aktive Struktur vor der Reinigung annimmt. In einer weiteren anderen bevorzugten Ausführungsart befindet sich der IL-1 Inhibibor in seinem zurückgefalteten aktiven Stadium nach der Wiedergewinnung aus den kultivierten Medium.

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6 3 8 3

Unter bestimmten Umständen nimmt der IL-1 Inhibitor seine richtige aktive Struktur nach der Expression in dem Wirtsorganismus und Transport des Poteins durch die Zellwan.d oder Membran oder in den periplastnati3Chen Raum an. Das i-ritt generell auf, wenn die DNA-Codierung .für eine entsprechende Leitsequenz mit der DNA-Codierung für das rekombinante Protein verbunden ist, V/enn der IL-1 Inhibitor nicht seine richtige aktive Struktur annimmt, werden alle Disulfid-Bindungen, die sich gebildet haben und/oder alle nichtkovalenten aufgebauten Wechselbeziehungen zuerst durch Denaturierungs- und Reduktionsmittel, z.B. Guanidiniumchlorid und beta-Merkaptoethanol zerstört, ehe der IL-1 Inhibitor seine aktive Struktur nach Verdünnung und Oxydation dieser Mittel .unter kontrollierten Bedingungen annehmen kann.

Pur die Reinigung vor und nach dem Wiederfalten werden einige Kombinationen folgender Schritte vorzugsweise angewandt: Anionaustausch-Chromatographie (MonoQ oder DEAE-Sepharose), Gelfiltrationschromatographie (Superose), chromatofokusierende (MonoP) und hydrophobische Wechselwirkungs-Chromatographie (Octyl oder Phenyl Sepharose). Von besonderem Wert ist die Antikörper-Affinitäts- Chromatographie unter Verwendung der IL-1i-spezifischen monoclonalen Antikörper (beschrieben in Beispiel 3).

(b) Von Säufletierzellen produziertes TL-Ii Von Säugetierzellen produziertes IL-Ii wird aus dem konditionierten Medium durch Schritte, die die Ionen-Austauschchromatographfe und Immunoaffinitäts-Chromatographie unter Verwendung von in Beispiel 3 beschriebenen monoklonalen Antikörpern beinhalten, gereinigt. Für

26383

- 41 -

Fachleute ist das eindeutig, daO in den erfindungsgemlOen Prozessen und Produkten verschiedene Modifikationen und Variationen durchgeführt werden können. Somit 1st beabsichtigt, daO die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen dieser Erfindung einschließt, vorausgesetzt, sie liegen innerhalb des Anwendungsbereichs der angeführten Patentansprüche und deren Äquivalente.

Es ist darauf hinzuweisen, daß die Anwendung der Hinwelse der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder Milieu innerhalb der Fähigkeiten bines jeden Fachmanns unter dem Aspekt der hier enthaltenen Hinwelse liegt. Beispiele der Produkte der vorliegenden Erfindung und repräsentativen Verfahren für deren Isolierung und Herstellung sind im folgenden dargestellt.

AusfOhrunasbeispiele

Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen derzeitig bevorzugte Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung. Die in diesen Beispielen verwendeten Veröffentlichungen sind speziell durch Referenz hier einbezogen.

Beispiel 1 - Herstellung von Protein A. Materialien

Hank'eche Gleichgewichts-Salzlösung (HSSS),und RPMI wurden von Mediatech, Washington, 0. C. bezogen. Lymphoprep kam von Accurate Chemical an Scientific Corp., Westbury, N. Y.. Humane IgG, MTT, Kaninchen Anti-Prostaglandin E« Antiserum, Amoniumkarbonat, Oithiothreitol,

komplette und nichtkomplette Freund'sches Adjuvants, Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin v/urden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri bezogen. C3H/HeJ-Mäuse wurden bezogen von Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, BALB/o-Mäuae und P3 Myelomzellen von DPS. John Kappler und Philippa Marrack am National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (NJC/ IRM), Denver, Colorado.

Rekombinantes humanes IL-1 wurde bezogen von Cistron Biotechnology, Pine Brook, N.J.. Gereinigtes Phytohemagglutinin wurde von Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N.C. geliefert. Humane Vorhautfibroblasten aus Primärkulturen kamen von Dr. Richard Clark von NJC/IRM, Denver, Colorado. Monoklonale Mäuse-Anti-Kaninchen IgG-Antikörper wurden geliefert von AIA Reagents, Aurora, Colorado. Schwache Methionin RPMI wurde unter Verwendung von Select-Amine kit von GIBCO Laboratories, Grand Island, N.Y. hergestellt. (³⁵S)-Methionin, Diphenyloxazol und( ⁴c)-j_Odazidsäure wurden bezogen von DuPont-NZN, Chicago, Illinois. Fötales Kalbsserum wurde gekauft von HyClone Laboratories, Logan, Utah. Mono Q und Superose 12 Säulen wurden geliefert von Pharmacia, Inc. Piscataway, N.J.. C4-Umkehrphasensäulen wurden erhalten von Synchroni, Inc., Lafayette, Indiana. C8-Umkehrphasensäulen wurden erhalten von Applied Biosystems, Inc., Foster City, California. Acetonitril und Polyethylenglykol 8000 wurden von J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J. gekauft. Trifluoressigsäure und Guanindinhydrochlorid wurden beiOgen von Pierce Chemicals, Rockford, Illinois. Endoproteinaso Lys C wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana gekauft.

Bei den für PGE₂ ELISA benötigten Mikrofiltrationsplatten handelt es sich um Nunc-Immuno Plate I von Interrnountain Scientifio Corporation, Boutiful, Utah. Die für Hybridoma-Produktion benötigten Platten stammten von Costar, Cambridge, Massachusetts«

B. Die Erzeugung von Monocyten-IL-I-Inhibitor Humane Leucocyten wurden von normalen Spendern erhalten, resuspendiert in Hank'scher Gleichgewiohtslösung (HBSS) bei 1 Teil Hämatokrit auf 1 Teil HBSS, unterlegt mäht Lymphoprep bei 400 xg, 30' bei Raumtemperatur abgeschleudert. Die mononukleare Fraktion wurde genommen

(charakteristischerv/eise erhielt man 4-5 x 10 Zellen pro Spender), in HBSS ohne Ca oder Mg gewaschen, suspendiert in serumfreier RPMI und auf mit normalen humanen IgG beschichteten Petrischalen aufgetragen, die durch Chromatographie über Sephapex G200 (6 χ Zellen in 10 ml pro 100 mm Schale) LPS-frei gemacht wurden. Sämtliche Reagenzien enthielten weniger als 10 pp/ml LPS. Die Zellen wurden 24-48 h kultiviert, und das sich ergebende konditionierte Medium bildete den unbehandelten IL-1 Inhibitor (IL-Ii) Überstand. Kennzeichnenderweise ergaben die Zellen von einem Spender 700-900 ml unbehandelten IL-ü-Überstand.

C. Proben für den IL-1 Inhibitor Zwei IL-1 Proben wurden routinemäßig verwendet, um das IL-Ii nachzuv/eisen. Thymocyten (1 χ 10 Zellen von 4-6 7/ochen alten C3H/HeJ-Mäusen) reagierten auf

1,0 Einheiten/ml relcombinanten humanes IL-1 plus 1 ug/ml Phytohämaglutinin durch halbmaximale Proliferation, wie durch H-Thymidin-Einbau oder Aufnahme von Tetrazolsalz MTT (Mosmann, T.J. Immunol. Method, 6^:55-61 (1983) nach dreitägiger Stimulation. Unbehandelter IL-Ii Überstand verzögert vollkommen diese proliferative Reaktion bei einer Verdünnung von 1/10. Humane Hautfibroblasten (1 χ 10 Zellen pro Loch in einer 96 Lochplatte) reagierten charakteristisch mit 0,5 Einheiten/ml rekombinantes humanes IL-1 durch Sekretion bei sechs-stündiger Stimulation, etwa 50.000 pg/ml PGE₂, das mittels ELISA bestimmt werden kann. Diese Prüfung ist gegenüber IL-Ii genauso sensitiv wie die Thymocyt-Prüfung.

D. Metabolische Markierung de3 IL-1 Inhibitors Das IL-Ii wurde metabolisch gekennzeichnet durch Kultivierung mononukleärer Leukocyten für 43 Stunden auf IgG-beschichteter. Platten (wie in B beschrieben) in serumfreier RPMI, die nur 0,75 ug/ml kaltes Methionin (15 ug/ml ist normal) enthielt und der 0,5 mCi ^JJS-Methionin (1151 Ci/mmol) pro 10' Zellen zugesetzt wurde. Die Kontrolle der Konnzeichnung wurde identisch durchgeführt mit der Ausnahme ₉ daß die Platten an Stelle von IgG mit fötalem Kalbsserum beschichtet warden. Proben von solchen Kontrollüberständen zeigten, daß sehr wenig IL-Ii ausgeschieden wurde, wenn die Zellen auf mit fötalem Kalbsserum beschichteten Platten kultiviert wurden.

E. Reinigung des IL-1 Inhibitor-Protein Es wurden unbehandelte IL-Ii Überstände 1,0 M in Natriumchlorid hergestellt, auf Eis eine Stunde lang inkubiert und mit 10.000/min 15 Minuten zentrifugiert. Die Über-

- AR -

stände, die die gesamte Inhibitoraktivität aber nur 20 % des ursprünglichen Proteins enthielten, wurden dann extensiv bei 4°C gegen 0,025 M Tris, pH 7,6, dialysiert, das υ,1 % Sucrose (als Α-Puffer) für eine üradient-Fraktionierung von Protein auf einer Mono Q Anionenaustauschsäule enthielt. Wach der Dialyse wurden di-e inhibitorenthaltenden Lösungen erneut 15 Minuten mit 10.000/min zentrifugiert und dann durch 0,22 Nyloni'iltor passiert, nie überstände wurden kennzeichnenderweise mit 10 ml eines analog nergestellten Uoerstandes aus einer metaoοlischen Kennzeichnung icomoiniert und auf Mono Q-Superose (Pnarmacia FPLC)-Säulen mit Bettvolumina von entweder 1,0 ml oder 8,0 ml gegeben, mit einem Α-Puffer gewaschen bis das CD₂₈₀ des abfließenden Stroms zur Grundlinie zurückfloß und sorgfältig mittels Chromatographie unter Verwendung eines linearen Natriunichloridgradienten (0,025 M bis 0,10 M) in Puffer A untersucht. Säulenfraktionen wurden gesammelt und auf Radioaktivität und Bioaktivität untersucht. Proben jeder Fraktion wurden auch bei reduziertem 12,5 % SDS-PAGE durchgeführt, silbern angefärbt, mit Diphenyloxazol permeiert, getrocknet und auf Folie gegeben, um autoradiographische Werte zu erhalten. Abbildung 1a zeigt dan Proteinprofil der Mono Q Chromatographie von 40 ml unbehandeltem IL-Ii Überstand, gemischt mit 3 ml metabolisch markiertem IL-Ii Überstand. Die Werte der in 50 ml jeder Fraktion gefundenen Radioaktivität und der in der PGEp-Produktionsprobe ermittelten· IL-H Bioaktivität sind überlagert. Es werden zwei größere und eine kleinere radioaktive Species gezeigt, die vollstündig mit den drei Peaks der Bioaktivität korrelieren.

Abbildung 1b zeigt die gleiche Chromatographie von 15 ml unbearbeiteten IL-Ii überstand gemischt mit 3 ml Überstand aus Monocyten, die metabolisch auf mit fötalem Kalbsserum (PCS) an Stelle von IgG beschichteten Platten markiert waren. Die Niveaus der drei radioaktiven oben angeführten Species sind bemerkenswert verringert. Abbildung 2a zeigt silbergefärbte Gele aus den Fraktionen aus den in den Abbildungen 1a und 1b dargestellten entsprechenden Bereichen in den Chromatographien. Es ist zu beachten, daß sowohl die Fraktionen der Peak-Radioaktivität als auch der Bioaktivität in Abbildung 1a (Fraktionen 52 und 59) ein größeres Band bei 22 Kd (mit Pfeilen gekennzeichnet) bei SDS-PAGE aufweisen. Die dritte Species (Fraktion 48 in Abbildung 1a) zeigt ein Band bei 20 kD bei SDS'PAGE. Gelfiltrationsuntersuchungen an unbehandelterh IL-Ii haben gezeigt, daß das aktive Molekül eine relative Molekülmasse von 18-25 Kd hat. Abbildung 2b ist ein Autoradiogramm des in Abbildung 2a dargestellten Gels. Man kann ohne weiteres erkennen, daß die Proteinbänder bei 20 und 22 Kd die Species mit größerer Radioaktivität in diesen Fraktionen darstellen.

Faßt man diese Ergebnisse zusammen,, so haben wir nachgewiesen, daß die metabolische Markierung von auf mit IgG-beschichteten Petrischalen aufgetragenen Monocyten zu radioaktiven opecies führt, die nur geringfügig produziert werden, wenn die Zellen auf mit FCS-beschichteten Schalen aufgetragen sind. Diese produzierten radioaktiven Species stimmen co-chromatographisch ausgezeichnet mit verschiedenen Species der IL-Ii Bioaktivität bei MONO Q überein. Gele und die sich ergebenden Autoradiogramme

.„. 28383S

zeigen, daß die drei hauptsächlich induzierten Mo'eküle Proteine mit der vorausbestimmten relativen Molekülmasse für IL-Ii darstellen.

Die IL-Ii Moleküle wurden weiter auf zwei Weisen mit dem Ziel der Sequentierung gereinigt. Als erstes wurde eine C4-Phasenumkehr-Kolonne mit Mono Q Fraktionen mit Peak-Bioaktivität und Radioaktivität beschickt und mit H₂0/0,1 % TFA: Azetonitril/O,1 % TPA Gradient eluiert. Da das IL-Ii Molekül spurengekennzeichnet wurde, hat man die Proben jeder Fraktion direkt hinsichtlich der Radioaktivität registriert und sie ebenso mittels SDS-PAGE und anschließender Autoradiographie analysiert. Abbildung 3a zeigt ein derartiges Chromatogramm mit den überlagerten Radioaktivitätsmustern. Dio silbergefärbten Gele von Proben au3 jeder Fraktion (Abb. 3b) und nachfolgende Autoradiogramme der Gele (Abb. 3c) zeigen, daß man das IL-Ii Molekül in den Fraktionen 32-36 findet. Diese Fraktionen wurden herabgetrocknet und sequentiert. Als Alternative wurden die Peak-Mono Q Fraktionen mittels Speed Vac getrocknet, in 0,4 ml 0,05 M NH.HGOo wieder suspendiert und direkt zweimal auf einer 10 χ 300 mm Superose 12 Gelfiltrationssäule (Pharmacia FPLC) chromatographiert, die mit dem gleichen Puffer wie in den Abbildungen 4a und 4b dargestellt abgeglichen wurde. Die Fraktionen wurden gesammelt und Proben von allen wurden auf Radioaktivität und Bioaktivität getestet sowie durch silbern angefärbte und autoradiographierte SDS-PAGE untersucht. Entsprechende Fraktionen wurden dann auf einem Speed Vac getrocknet und sequentiert.

- 48 -

Beispiel 2

Vorgeschlagene Sequentierung des IL-1 Inhibitors Vor der Sequentierung wurden die Proben in 6 M Guandidin-HCl, pH 8,6, gelöst, 4 Stunden bei 37°G unter Np mit lOOfachem Dithiothreitol Molarüberschuß über Protein reduziert und 1 Stunde mit 400fachem 14C~Jodazetsäure Überschuß alkyliert. In diesem Fall wurden die Reaktionen auf einer C8-Phasenumkehrsäule entsalzt, eluiert und teilgetrocknet. N-Terminalsequenzen wurden mit Hilfe eines Applied Biosystems Protein Sequencers bestimmt. Um interne Sequenzen zu erhalten, wurden Proben, die reduziert und alkyliert sein konnten, mit Cyanbromid oder proteolytischen Enzymen unter Anwendung von den Fachleuten bekannten Methoden aufgeschlossen. Die Reaktionen vmrden getrocknet, in υ,1 % VFA/H₂O gelöst, und die Peptide vmrden mit einer C8-Phasenumkehrsäule getrennt.

Beispiel 3 Reinigung und Sequentierung der IL-1 Inhibitor-Species

A. IL-U-X, IL-1i-a und IL-1i-b Species Die Mono Q Reinigung des IL-Ii trennt die biologische Aktivität in drei Haupt-Species, wie in Abbildung 1a dargestellt und in Abbildung 1 beschrieben, wobei die Peak-Fraktionen für diese Aktivität 48, 52 und 59 betragen .SDS-PAGE bei Proben dieser Fraktionen - wie in Abbildung 2a dargestellt - enthüllen passende Species bei 20 kD, 22 kD bzw. 22 kD. Eine Westernanalyse solcher Gele unter Verwendung von Mäuseanti-

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sei um, wie in nachstehendem Beispiel 4 behandelt, färbt alle drei Species an. Wenn man IL-Ii aus Zellen herstellt, die metybolisch mit 35S-Methionin markiert sind, ist während des Wachstums auf mit IgG-be3chichteten Platten jedes dieser Bänder radioaktiv (wie in Abb. 2b mit dem Autoradiogramm des obenerwähnten Gels dargestellt). Auf Basis der in Beispiel 1 diskutierten Logik, daß nämlich in einem nichtinduzierten Zustand inkubierte parallele Zellen keine IL-Ii Bioaktivität und keine solchen radioaktiven Bänder produzieren, können wir schlußfolgern, daß diese drei Species für die biologische Aktivität verantwortlich sind. V/ir haben diese Species vorläufig IL-Ii-X, IL-1i-a und IL~1i-b benannt.

B. Reinigung und Sequentierung von IL-Ii-X Mono Q Fraktionen, die IL-Ii-X und/oder IL-1i-a enthalten, wurden weiter mittels Phasenumkehr IIPLC-Chromatographie auf einer Synchropak RP-4 (G4) Säule gereinigt, und man erhielt radioaktives Species für die Sequenzanalyse. Zahlreiche Versuche zur direkten Sequentierung von RP-HPLC-gereinigtem IL-1i-a und IL-1i-b schlugen fehl. Das deutet darauf hin, daß sie an ihren N-Termini chemisch blockiert sind. Allerdings ergab eine Herstellung von IL~1i-a (IL-1i-aBsp42) folgende Sequenzt

15 10 15 20

RPSCFKSS K MQAF_ISDVNQ

Nachfolgende Herstellungen von IL-Ii-X, die mittels C4 RP-HPLG gleichermaßen gereinigt wurden, haben die gleiche Soquenz erzeugt:

- 50 -

15 10 15 20

PrepKxF24 MQAF_ID_VN_K_F

und PrepKxF23 RP RK_LKMQAF_I

Diese aind eindeutig ein Teil der in dem ursprünglichen Versuch bei der Sequentierung von IL-1i-a festgestellten Sequenz. Die Erfinder schlußfolgern, daß die dargestellten Sequenzwerte des N-Terminus des 20 kD Species, genannt IL-U-X- ist.

Bei diesen und allen folgenden Sequenzen besagt eine unterstrichene Position entweder eine Unfähigkeit, einen Rest zu identifizieren oder daß Mehrschichti'gkeit im Hinblick auf den identifizierten Rest existiert. Werden zwei oder mehr Reste in eine Position gebracht, besagt das, daß mehr als eine Aminosäure bei dieser Sequentierung3· stufe nachgewiesen wurde und der wahrscheinlich korrektere Rest darüber ist.

C. Herstellung, Reinigung ur.'.d Sequentierung von

Peptiden von IL--1i-a und IL-1i-b

Da IL-1i-a und PV-1i-b offensichtlich an ihrrni N-Termini chemisch blockiert sind, wurden Peptide von jeden durch endoproteinase Digestion erzeugt. Insbesondere v/urden Mono Q Fraktionen, die entweder' IL-1i-a oder IL-1i-b enthielten durch eine 4,6 χ 250 mm C3-RPHPLG-Säule (Zorbax Protein Plus) gegeben, eine akzeptable Alternative zu den C-4-Säulen, die bei allen vorherigen Experimenten verv/endet v/urden. Sehr graduelle Gradienten

-51- 2 8383$

(0,2 % Azetonitril pro Minute bei 0,5 ml/min) lösten die IL-1i-a (Abbidung 8a, b) oder IL-1i-b (Abbildung 9a) aus den hauptsächlich kontaminierten radioaktiven Species, humanes Lysozym. Oie Identitäten der gereinigten Speciea wurden durch das Vorhandensein eines einzelnen radioaktiven 22 kD Proteins auf SDS-PAGS und der anschließenden Autoradiogramme bestätigt (Abbildungen 8c, d und 9b). Die Proteine wurden per Hand in silikoni3ierten Glasrohren gesammelt, und zu jedem wurde 25 ml 0,2 % Tween-20 Lösung zugegeben. Die IL-1ienthaltenden Fraktionen wurden dann auf einen Speed-Vac auf ein Volumen von 50 ml reduziert und durch Zugabe von 1 % NH^HCO., auf 300 ml aufgefüllt. Danach wurde 1 mg Endoproteinase zugegeben. Bei IL-1i-a handelt es sich bei dem verwendeten Enzym um Endoproteinase Lys C (Boehringer-Mannheim) während IL-1i-b mit Endoproteinase Asp N (Boehringer-Mannheim) sequentiert wurde. Die Sequentierung wurde bei 37°C, 16 Stunden, durchgeführt, dann wurde das Volumen des Reaktionsgemischs auf einem Speed Vac auf 50 ml reduziert.

Bei IL-1i-a wurde die Probe direkt, chromatographisch untersucht, während die IL-1i-b-Probe zuerst durch Zugabe von 50 mlvl Dithiothreitol in 2 M Tris, pH 8,0, 5 ml, reduziert v/urde, man ließ 30 Minuten bei 37 C reagieren, und dann wurde durch Zugabe 1,1 ^mol "ΊΗ-Jodaz et säure in 10 ml Ethanol karboxymethyliert (Reaktion 30 min bei 37⁰G im Dunkeln). Die Trennung der Peptide erfolgte auf einer 2,1 χ 250 mm Browalee Aquapore RP-300 (C8)-Säule mit enger Bohrung bei einer Fließgeschwindigkeit

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3 8 3

von 100 ml/min unter Verwendung eines Beckman HPLC, ausgestattet mit mikrogebohrter Hardware und mikrogebohrten kompatiblen Pumpen. Ea wurde ein 200 min 0-100 % linearer Gradient verwendet (HpO/0,1 % TFA zu Acetonitril/ 0,1 % TPA). Die Peptidtrennungen sind in den Abbildungen 10 und 11 dargestellt. Die erhaltene Sequenzinformation ist folgendes

j i 5 VO

IUit.yiC-<a KQAT. I. DVNQK

IS 10 IS 20 _K 'S ρ

» FYlHHUYCPVHiOH

1 S_{1 γ}

RaIy·C«U _ F λ T I R O ti

1 ·

RalyiC'U FYTQCD

i 9 iO _v U _H

CE SlTI

Re Ly IC 37 .QDlT.LQLlAH^QlfiLSEQ

15 IQ U

i S 10 -IS Ϊ0 2 Ii

QKTFt

l 0 V ti 2 I ^f. Π 4 H H U V λ i Y L Q 5 ? N V H I.

1 S 10

"» OiOVNVTKrYFQ

1 S _K 10 IS

1 S

WAJρΗ-2S D V R T K T I R

I₁S 10

S L

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Zwei der Peptidsequenzen stehen offensichtlich zu den früher von IL-11-X erhaltenen in Beziehungen. Eine davon, RaLysC-41 ist eine IL-1i-a Sequenz und die andere, RbAspN~51i> eine IL-1i-b Sequenz, wodurch bewiesen wird, daß die drei IL-1i-b Speciea mindestens in enger Verbindung stehende Proteine, wenn nicht chemisch und/oder physikalisch modifizierte Formen eines einzelnen Original-IL-Ii-Moleküls sind. Kombiniert man die aufgestellten Sequenzen, ergeben sich folgende zusammengesetzte Sequenzen:

I·· toltfiC'fcW ι |. (ULyiC-i)

>'"! ιMmwmi ι

OIGVMVTIfYrqtO

8 ο t τ»ς Q u ι α ν» q τ c u t j u U-MUytC-U····!

ο «ιf α r; uö^i

Diese zusammengesetzten Sequenzen sind anscheinend in keinen anderen bekannten Polypeptiden vorhanden, die in der allerneuesten Protein Identification Resource Database (.PIR 16,0) zusammengestellt sind. Die Erfinder sind der i.ieinung, daß diese Sequenzen oder deren Kleinere Varianten eine Klasse von Molekülen aarstellen, die als

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IL-1 Inhibitoren wirken können.

Beispiel 4

Herstellung von für den IL-1 Inhibitor spezifischeil

Antikörpern

10 Wochen alten BALB/c-Mäusen wurde IL-1isubcutan injiziert, das zum Teil von unbehiandelten Überständen mittels Mono Q Chromatographie gereinigt (40Ofach), gegen PBS dialysiert und mit Complete Freund 'schein Adjuvans emulgiert war. Jede Maus erhielt das aus 5 ml unbehandeltem Überstand gereinigte IL-Ii. Die Mäuse wurden alle 2 Wochen mit einer äquivalenten Menge IL-Ii aufgefrischt, die mit Incomplete Freund'scher Adjuvans emulgiert war. Sieben Tage nach jeder Auffrischung wurden von den Schwänzen Serumproben entnommen. Es wurden Antisera auf Anti-IL-1i-Alctivität mittels Westernanalyse der Transblots des Immunogens auf SDS-PAGE getestet, wie in Abbildung 5a dargestellt. Abbildung 5b zeigt, daß alle Mäuse Anti-IL-1i-Antikörper nach drei Injektionen mit IL-Ii produziert hatten.

Da monoklonale Antikörper von großem Wert bei der Klonierung des IL-1i-Gens au3 einem Expressionslibrary, der Reinigung des rekombinanten IL-Ii"Proteins und für die Untersuchung d&r Biologie des Moleküls aind, haben wir den Prozeß der Hörstellung einer Serie von monoklonalen Antikörpern speziell für IL-Ii in Angriff genommen. Um B-Zellen-Hybridomas zu produzieren, wurden den o.g. Mäusen die gleiche Menge IL-Ii in Saline

- ⁵⁵ - 2 8 3 8 3 S

24 Stunden vor der Entfernung der Milz intravenös injiziert. Aus der Milz wurden Splenicyten herausgeschabt und in kalte Gleichgewichtssalz-Lösung (BSS)

gegeben, zweimal mit BSS gewaschen, mit P3 Myelom-

7 zellen in einem Verhältnis von 2 χ 10 P3 Sollen pro 10 Milz B-Zellen gemischt und abgeschleudert. Die Zellen wurden durch tropfenweise Zugabe von 1 ml warmen, vergastem (5 % CO₂) PEG 6000 (40 % PoIyethylenglykol 6000 zu 60 % minimalen essentiellen Medium) mit dem trockenen Pellet verschmolzen. Die verschmolzenen Zellen v/urden mit BSS gewaschen und in 10 ml reichem Medium (10 % FBS) wieder suspendiert, das 2 χ 10^ Peritonealzellen pro ml enthielt, und das Pellet wurde mit Hilfe einer 10 ml Pipette vorsichtig aufgebrochen. Das Volumen wurde auf 20. ml mit der Zugabe von mehr Peritonealzellen im Medium eingestellt, und die Zellen wurden in 96 Lochplatten mit 0,1 rnl/Loch aufgetragen. Die Platten wurden in einem Gasinkubator gestellt und anschließend auf folgende Art und Weise behandelt:

Tag 1 - Zugabe von 3 x HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) in reichem Medium bis za einer Endkonzentration von 1x.

Tag 5 - Medium wechseln, austauschen mit 200 ul 1 χ HAT in reichem Medium.

Tag 10 - Beginn der Prüfung auf Hybridenv/achstum. Medium wechseln, mit 200 ul 1 χ HAT in reichem Medium austauschen, das 1,5 x 10 Peritonealzellen pro ml enthält.

Wenn Hybridzellen in einem Loch beinahe konfluent sind, werden die Überstände zar Prüfung transferiert, und die Zellen werden vorsichtig mit einer Pipettenspitze zusammengekratzt und zu 1 ml Kulturlöchern, die einmal HAT in reichem Medium plus 3 x 10 Peritonealzellen pro ml enthielten, übertragen.

Die Überetände von den konfluenten Löchern wurden auf Anti-IL-1i-Aktivität unter Verwendung von ELISA geprüft, in der zum Teil gereinigte IL-Ii (Mono Q gereinigtes Material, identisch mit dem, das den Mäusen injiziert wurde) an Mikrotitrierlöcher gebunden ist. Normale Mäuseseren und hyperimniune Antiseren v/erden als negative bzw. positive Kontrollen verwendet. Positive überstände werden erneut mittels ELISA auf Platten getestet, die mit homogen gereinigtem IL-Ii beschichtet sind und mittels Immunoprezipitation von gereinigtem metabolisch markierten IL-Ii. Positive Zellen werden dann durch Grenzlösung kloniert und den mit Pristan behandelten Mäusen injiziert, um Ascites hervorzurufen. Durch Gewebekultur oder massive Erzeugung und Sammlung von ascitischer Flüssigkeit in Mäusen kann man große Mengen von IL-Ii spezifischen Antikörpern produzieren. Mit der Reinigung dieser Antikörper um, deren Anordnung zu unlöslichen Perlen werden Äffinitätsadsorber für die Reinigung des rekombinanten IL-1i-Proteins produziert..

Beispiel

Kloning von IL-Ii cDNA

Es wurde festgestellt, daß auf IgG-beschichteten Petrischalen aufgetragene und 24 Stunden in Anwesenheit von

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(³⁵S)-Methionin kultivierte Monooyten (³⁵S)-IL-Ii produzierten, das durch seine chromatographischen Eigenschaften auf Mono Q identifiziert werden konnte.

Um eine Bestimmung durchzuführen, wenn (innerhalb der 24 Stunden-Periode) IL-1imit einer maximalen Menge produziert wurde, hat man auf Platten aufgetragene Monocyten ("^S)-Methionin (pulsiert) für eine kurze, zweistündige Periode aubgeaetzt, wobei in dieser Zeit ein großer Überschuß an unmarkiertem Methionin zugesetzt und für weitere 2 Stunden inkubiert wurde. Das Medium wurde dann gesammelt und auf das Verhältnis von markiertem IL-Ii analysiert. Dieses Verfahren wurde bei Monocyten bei unterschiedlichen Zeiten nach Belegung der IgG-beschichteten Platten angewandt, und man hat festgestellt, daß die Exposition von Monocyten gegenüber (^3:3 S)-Methionin für 15 Stunden nach dem Auftragen die maximale Menge ( S)-IL-Ii produzierte. Das besagt, daß sich IL-Ii mRNA in Monocyten 15 Stunden nach dem Auftragen auf IgG auf seinem maximalen Niveau befand.

Frische Monocyten wurden dann auf LPS-freiem IgG aufgetragen, das man wie im Beispiel 1B erhielt. Nach dem Inkubieren von RPMI-Medium für 15 Stunden bei 37°C wurden die Zellen mit mit phosphatgepufferter Saline gewaschen, dann mit 4M Guanidinthiozyanat, 25 mM Natriumzitrat, pH 7, 0,5 % Sarkosyl, 0,1M 2-Merkaptoethanol aufgelöst. Die gesamte RMA wurde dann e\ia dieser Lösung mittels der AGPC-Metnode von P. Chomczynski und N.Sacchi, beschrieben in Analytical Biochemistry, Ausgabe 162, Seiten 156-159 (1Sö7), getrennt.

Poly A⁺ RNA v/urde durch Oligo-dl'-Zellulose-Chromatographie mittels der Methode von Aviv, H. und Leder, P., (1972) Proo. Natl. Acad. Sei. (USA) 69_:H08-1412 isoliert, mit Ethanol gefällt und auf eine Konzentration von 0,36 ug/ul gelöst. Es wurde ein Mikrogx*arnm auf Poly A⁺ RNA benötigt, um cDNA nach Gubler, U. und Hoffman, B.J. (1983) Gene 2^:263-169 herzustellen.

Die cDNA wurde in ein Lambda gt11 Expressionslibrary unter Verwendung von Eco Rl Bindegliedern von Boehringer Mannheim, Katalog-Nr. 988448 oder New England Bio Lab Nr. 1070 und den von diesen Herstellern erhaltenen Hinweisen eingebaut.

Das sich ergebende Library, das 10 unabhängige Klone enthält, wurde auf E. coli Y1090 rk~ (Promaga Biotec) mit einem entsprechenden polyklonalen Antikörper für IL-Ii untersucht, wie bereits dargelegt, unter Anwendung der von R.A. Young und R.W. Davis (1983) PNAS 80:1194-1198 beschriebenen SoBening-Bedingungen. Positive Signale werden unter Verwendung eines zweiten mit Biotin behandelten Antikörpers (z.B. Ziegen- Anti-Mäuse IgG, Bethesda Research Labs), gefolgt von einem Strepavidin-Alkalinphosphatase Konjugat (Beches"da Research Labs.) nachgewiesen, wie von Bayer, E.A. und Wilchek, M. (1979) in Methods in Biochemical Analysis und Guesdon J.L. Ternynch, T. und Avramea3, S. (1979) J. Histochem. Cy toc hem. 27:1131-1138 beschrieben sow.ie entsprechend der Hinweise des Herstellers.

Beispiel 6

Herstellung und Sequentierung der Gen-Codierung für IL-11 Gemäß Beschreibung in Beispiel 5 hergestellte cDNA wurde in den Klonierungsvektor Lambda GT1O eingebaut. Diese cDNA wurde zuerst unter Verwendung von EcoRI-Methylase mit S-Adenosylmethionin als Substrat methyliert, EcoRI-Bindung3glieder wurden in eine Ligaturreaktion eingebracht, und überschüssige Bindungsglieder wurden mittels Digestion mit EcoRI-Endonuleaae und Chromatographie auf einer CL6B Spin-Säule entfernt. Es v/urde eine Ligatur-Reaktion durchgeführt, die 0,124 ug verbundener, nach Größe ausgewählter cDNA und 1 ug EcoRI-Cut sowie mit Phosphatase behandeltes Lambda GT10 enthielt, und die Produkte dieser Ligatur-Reaktion wurden unter Verwendung von GIGAPACK GOLD Packungsextrakten (Stratagene) paketiert.

j Dies ergab ein Library von 1 χ 10 Gliedern.

Um dieses GT10 Library zu untersuchen, wurden Oligonucleotide (Antisens)-Sonden auf Basis der in Beispiel 3 dargelegten Protein- und Peptidsequenz synthetisiert. Die Sequenzen dieser Sonden und ihre korrespondierenden Peptidsequenzen sind wie folgt:

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prob* HUiI-] ttJtacotJcohaaJ >

Ly* M*t Gin Al* Ph*

prob* ixuii-4 ttJaajatJaaJotJc^Jct

ty* Ph* Tyr Ph· ein QIu Afp

Prob* IXUiI-S TACCANTe M TTJaA^ATJJAA Met vai Thr ty* Ph· Ty* Pt»

prob* ixuii·« ctJcanttJqtJttJto s'

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32 Die Sonde Nr. ILlil-3 wurde an ihrem 5' Ende p-

5 phosphoryliert und dazu benutzt, um 3 x 10 Plaques des Library zu untersuchen. Die Sonde hybridisierte reproduzierbar drei Plaques, und von diesen wurde ein Plaque dargestellt, um auch Sonde Nr. ILlil-4 zu hybridisieren» Dieses Plaque, GT10-ILli-2A v/urde

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kultiviert, und die DNA wurde unter Verwendung von Lambdasorb (Promega) nach den Hinweisen des Herstellers isoliert. GT10-IL1i-2A wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland unter Neuerwerbung Nr. 40488 hinterlegt. Die DNA wurde mit Ec₁ORI aufgeschlossen, in fünf gleiche Aliquote geteilt und auf ein 1 % Agarosegel elektrophorisiert.

Nach der Elektrophorese wurde dieses Gel mit Ethidiumbromid angefärbt. Eine Potographie dieses Gels wird in Abbildung 12a gezeigt. Die Lane 6, 8, 10, 12 und 14 enthalten die fünf Aliquote aus der EcoRI-Digestion. Lane 5 enthält ein Gemisch eines Wildtyp-Lambda-DNA-Cuts mit Hindlll und 0X174 RF DNA-Cut mit Haelll (New England Biolabs), die als Markierung der durchschnittlichen Molekularmasse von Nutzen sind. Abbildung 12a zeigt, daß GT10-IL1i-2A ein EcjoRI-Prägment enthält, das 1850 Basenpaare in der Länge beträgt.

Um überzeugender zu beweisen, daß dieses I85O ment die Codierungssequenz für den IL1-Inhibitor trägt, wurde ein Southern Blot wie folgt durchgeführt. Die DNA-Fragmente in dem in Abbildung .12a dargestellten Gel wurden auf Nitrozellulose unter Anv/endung von Standard-Methoden geblottet. Die Nitrozellulose wurde dann in fünf Längsstreifen geschnitten, so daß jeder Streifen die DNA aus den Lanen 6, ö, 10, 12 und I4 enthielt. Die Streifen wurden dann einzeln zu jeder der fünf Oligonucleotid-Sonden (oben) hybridisiert, die an dem

32 5' Ende mit ρ Phosphat markiprt waren. Die Oligonucleo tid-Konzentration betrug 1 pmol/ml, und die Hybridi-

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sations-Temperaturen waren wie folgt:

LANE SONDE TEMPERATUR

6 Nr. ILlil-3 35⁰C

8 Nr. ILlil-4 42⁰C

10' Nr. ILlil-5 42⁰C

12 Nr. ILlil-6 40⁰C

14 Nr. ILlil-7 35°C

Nach dem Waschen wurden die Streifen in einer Linie angeordnet und zusammengeheftet, um das ursprüngliche Nitrozelluloseblatt wieder zu bilden. Dieses wurde unter Anwendung eines Intensivierungsscreens. bei -70⁰C und 24 Stunden autoradiographiert. Abbildung 12b ist eine Potographie dieses Autoradiogramms. Sie liefert den Beweis, daß sämtliche Sonden besonders das 1850 bp Fragment hybridisieren, womit bewiesen wird, daß dieses Ji'ragtnent wesentliche Codierungssequenzen für den IL1 Inhibitor trägt.

Zur Bestimmung der DNA-Sequenz wurde GT10-IL1i-2A DNA mit EcoRI aufgeschlossen, auf ein t % Agarosegel elektrophoresiert und das 18^0 bp Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde mit EcoRI aufgeschlossenem ivi13 mp19 ver-Dunden und in E₁ coli-Stamm JM109 transferiert. Die Transformanten wurden untersucht, wobei man solche suchte, deren Beta-Galactosidaseaktivität fehlte. Fünf solcher Transformanten wurden isoliert, die DNA in einzelnen Bündeln hergestellt, und die Sequentierung erfolgt gemäß Songer u.a.. Die DNA-Sequenz von drei Transformanten

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korrespondierte mit dem 3¹ Ende der mRNA, während zwei Transformanten eine Protein-Codierungs-Sequenz aufwiesen. In Abbildung 13 ist die DNA-Sequenz dargestellt, die wir für den Protein-Codierungsbereich der cDNA erhielten.

Abbildung 13 zeigt auch die vorausbestimmte Aminosäure-Sequenz. Die Aminosäure-Sequenz von dem ersten Aminosäure-Alanin zu dem 29. Aminosäure-Prolin und von dem 79. Aminosäure-Isoleuoin zu dem Ende i3t die hypothetische Aminosäure-Sequenz. Die vorausbestimmte Aminosäure-Sequenz von dem 30. Aminosäure-Prolin zu dem 78. Aminosäure-Prolin sind mit der in Beispiel 3 beschriebenen Peptid-Sequenzen übereinstimmend.

Beispiel

Sequentierung von GT10-IL-1J-2A und IL-Ii Ein Teil von GT10-IL1i-2A wurde sequentiert und ist in Abbildung 14 dargestellt. Die DNA codiert ein Protein, das Aminosäure-Sequenzen enthält, die charakteristisch für IL-Ii (Nucleotide 99-557) sind. Allerdings nimmt man an, daß zu diesem Protein mehrere Modifikationen hergestellt v/erden können, ehe das" in das extrazelluläre Milieu abgesondert wird. Diese Modifikationen können oder können nicht für das Protein insofern wesentlich sein, da(3 es eine Aktivität wie IL-Ii hat.

GT10-IL1i-2A codiert mindestens den N-Terminal von 32 Aminosäuren (Nucleotide 3-98) bis zu dem Aminoterminus der Prom IL-Ii, bekannt als X. Wir nehmen an, daß in 32 Aminosäuren eine sekretorische Leitsequenz enthalten

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ist, die bei dem durch Nuceotide 24-26 codierten M beginnt, das soeben entstenende IL-Ii zu dem extrazellulären Milieu leitet, und das dann durch eine Leitpeptidase oder möglicherweise andere Peptidasen entfernt wird. Der Umfang, in dem die Sequenz in Form von 06 - und /3- IL-Ii entfernt wird, ist zur Zeit nicht bekannt, aber man nimmt an, daß der N-Terminus dieser Formen sehr dicht an dem der Form X liegt. Die Entfernung der sekretorischen Leitsequenz ist wahrscheinlich für das Protein notwendig, um eine effektive IL-Ii Aktivität aufweisen zu können.

Die Nucleotide 349-351 von GT1O-IL-1i-2A codieren einen N-Rest, der Teil einer concensus N-Glycosylationsstelle ist. Auf der Grundlage ihrer Suszeptibilität, sich mit N-Glykanase aufzulösen, nimmt man an, daß die Formen öl und/9- IL-Ii glykosyliert sind. Da man nicht annimmt, daß die Form X zur Lösung mit diesem Enzym neigt, glaubt man, daß sie nicht glykosyliert ist, obgleich das eine Möglichkeit bleibt, die leicht durch einen entsprechenden Fachmann der Proteinsequentierung unter Verwendung der hier gegebenen Informationen nachgewiesen v/erden kann. V/ir nehmen an, daß die Glycosylation bei diesem N-Rest für das Protein nicht erforderlich ist, um eine effektive IL-1i-Aktivität aufzuweisen.

Die Nucleotide 89-101 von GT1O-IL-Ii-2A codieren ein P (siehe Abbildung 15), aber es wurde kein P an dieser Position (der N-Terminus) der Form IL-Ii-X nachgewiesen. Es ist möglich, daß dieser Rest in dem vollständig entwickelten Protein modifiziert wurden ist. Man nimmt an, daß die Modifikation dieses Restes für eine effektive

IL-Ii Aktivität nicht von Bedeutung ist.

Die zur Zeit nichtbekannten N-Terminusreste der Formen öl und β sind nicht völlig durch die Edman Degradation nachweisbar und werden wahrscheinlich nach der Entfernung von einigen N-Terminalresten des durch GT10-IL-1i-2A codierten Proteins modifiziert. Man nimmt an, daß diese Modifikation für die effektive IL-U Aktivität nicht von Bedeutung ist«

Beispiel 8

Die Expression von Genen mit IL-1i-Codierung in

tierischen Zellen .

Die Expression tierischer Zellen von IL-Ii erfordert die nachfolgenden Schritte:

a. Konstruktion eines Expressions-Krankheitsüberträgers

b. Wahl einer Wirtszellinie

c. Einführung des Expressions-Krankheitsüberträgers in die Wirtszellen

d. Manipulation der rekombinanten Wirtszellen zur Erhöhung der IL-1i-Niveaus

1. Die für die Anwendung in tierischen Zellen vorgesehenen IL-1i-Expressions-Krankheitsüberträger können aus unterschiedlichen Typen bestehen, inkl. stark konsitutive Kxpressionskonstrukte, induzible Genkonstrukte sov/ie solche, die für die Expresion in besonderen Zelltypen vorgesehen sind» In allen Fällen sind Promotoren und andere Genregulierungabereiche, z.B. Enhancer (induzibel oder nicht) sov/ie Polyadenylations-

- 65a-

26383 5

signale an der entsprechenden Stelle in bezug auf die cDNA Sequenzen in Krankheitsüberträgern auf Basis Plasmid angeordnet. Es folgen zwei Beispiele für solche Konstrukte: (1) Ein Konstrukt unter Verv/endung eines stark konstitutiven Promotorbereichs ist unter Verwendung des Affenvirus 4-0 (SV40)-Gen-Kontrollsignals in einer Anordnung hergestellt, die man in dem Plasmid PSV2CAT findet, wie von Gorman u.a. in Mol. CeI. Biol. 2:1044-1051, 1982, beschrieben und hier speziell durch Referenz einbezogen. Dieses Plasmid ist auf solche Weise zu manipulieren, daß es unter Verv/endung der üblichen molekularbiologischen Techniken die IL-Ii cDNA für die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Codierungssequenzen substituieren kann (Maniatis u.a.,, supra)_t wie in Abbildung ο dargestellt. (2) Ein inducibles Gen-Konstrukt ist unter Verwendung von Plasmid PMK herzustellen, das den Mäuse-Metallothionein (MT-1 )-?romotorbereich enthält.(Brinster u.a., Cell 22.:228-231, 1981). Dieses Plasmid kann als Startmaterial verwendet wei-den und ist, wie in Abbildung 7 dargestellt, zu manipulieren, um ein metallinduzibles Gen-Konstrukt zu erhalten.

2. Eine Anzahl tierischer Zellini-en ist zur Expression von IL-Ii unter Nutzung der oben beschriebenen Krankheitsüberträger zu verwenden, um aktives Protein zu produzieren. Zwei .potentielle Zellinien, die hinsichtlich ihre?.·· Fähigkeit, fremde Gen-Expression zu fördern, bestens charakterisiert worden sind, sind Mäuse Ltk" und chinesische Harnsterovarien (CHO) dhfr~-Zellen, obgleich die Expression von IL-Ii sich nicht auf diese Zellinien beschränkt.

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3. Es ist Krankheitsüberträger-DNA in diese Zellinien unter Verwendung einer Reihe von Gen-Transfer-Techniken einzuführen. Die hier angewendete Methode beinhaltet die Kalziumphosphat-DNA-Präzipitationstechnik, beschrieben von S.L. Graham & A.S. van der Eb (Virology £2:456-467, 1973) bei der der Expreasions-Krankheitsüberträger für IL-Ii zusammen mit einem zweiten Krankheitsüberträger ko-präzipitiert wird, der einen wählbaren Marker codiert. Bei einer Ltk~"-Zelltransfektion ist der wählbare Marker ein Thymidinkinase-Gen, und die Wahl erfolgt wie von Wigler, u.a. (Cell 16:777-785, 1979) beschrieben. Bei CHO dhfr~-Zellen ist der wählbare Marter Dihydrofolatreduktase (DHPR), deren V/ahl wie von Ringold u,a. in J. Mol. Appl. Genet. 1:165-175, 19*31» beschrieben, erfolgt.

4. Zellen, die die IL-Ii Genkonstrukte exprimieren, sind dann unter Bedingungen zu züchten, die die Produktionsniveaus von IL-Ii erhöhen. Zellen, die die Metallothionein-Promotorkonstrukte tragen, können nunmehr in Anv/esenheit von Schvvermetallen, z.B. Kadmium, gezüchtet werden, das zu einer 5-fach erhöhten Ausnutzung des MT-1 Promotors (Mayo u.a., Cell 2^:99-108) führt, was nachfolgend einen vergleichbaren Anstieg der IL-Ii Proteinniveaus ergibt.Zellen, die IL-Ii Expressions-Krenkhei-tsüberträger enthalten (entweder auf Basis SV40 oder MT-I_-^ können zusammen mit einem DHPR Expressions-Krankheitsüberträger durch das Gen-Verstärkun/j-sprotokoll - beschrieben von Ringold u.a. (J. Mol. Appl. Genet. J_: 165-175» 1981) genommen werden, unter Verwendung von Methctrexat, ein kompetitiver Antagonist

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2 6 3 8 3 5

von DHFR. Das fUhrt zu weiteren Kopien der in den Zellen vorhandenen DHFR-Gene und damit zusammenhängend zu vergrößerten Kopien der IL-Ii Gene, die wiederum..· mehr durch Zellen produziertes IL-Ii Protein ergeben können.

Beispiel 9

Reinigung von IL-Ii a us rekotubinauten tierischen Zellen Da man erwartet, daß IL-Ii aus Zellen wie das natürliche Material ausgeschieden v/ird, nimmt man an, daß die oben beschriebenen Methoden zur Reinigung des natürlichen Proteins eine gleiche Reinigung und Charakterisierung des rekombinanten Proteins ermöglichen.

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2638 3 5

Beispi

11

Ein Protein mit der Sequenz:

π τ s χ * (> a & S' κ e s * μ α

UFi.ir

(I P N V N I, E

UO

(80

170

0 V V P Γ R ι*

V/obei Z Cystein, Serin oder Alanin ist, >md

Z ist Arginin oder Prolin ist ebenfalls in die Erfindung einbezogen.

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Beispiel 10 Sequena von IL-Ii

Der Aminoterminalr^st von IL-Ii wurde mehrfach durch direkte Proteinsequentierung als ein Arginin (R) identifiziert. Das Ergebnis einer solchen Sequentierung ist in Beispiel 3 dargestellt. Im Gegensatz dazu ist der durch die Sequenz an cDNA vorausbe3timmte Aminoterminalrest des IL-Ii ein Prolin (P). Dieser Aminoterminalrest korrespondiert mit den Nucleotiden 85-87 in Abbildung 13 und ist in den Abbildungen H und 15 mit einem Kreis versehen. Diese scheinbare Nichtübereinstimmung zwischen der cDNA-Sequenz und der direkten Proteinsequenz kann durch die Annahme gelöst v/erden, daß ein Fehler in der cDNA-Sequenz während der Umkehrtranskriptasekatalysierten Synthese aus ihrer mRNA eingebaut wurde. Das heißt, ein CGA (Arginin)-Kodon, das an der mRNA liegt, wo es für diesen Aminoterminalrest codiert, könnte sich während der Umkehr-Transkriptasereaktion zu einem GCA (Prolin)-Kodon in der cDNA umgewandelt haben. Tiber diese Art des Umicehr-Transkriptaseproblema wurde bereits ir der Literatur berichtet, z.B. von B,D. Clark u.a. in Nucleic Acids Research 14:7897 (1986).

Die jetzigen Erfinder vertreten die Auffassung, aaß die korrekte Aminosäure-Sequenz des Proteins so ist, wie durch die cDNA vorausbestinimt, ausgenommen, daß di'5 Aminoterminal-Aminosäure ein Arginin statt des in den Abbildungen 13-15 dargestellten Prolinrests ist. Die Erfinder glauben, daß sowohl DNA-Sequenzen als auch deren entsprechende Peptidsequenzen in ihren Er-

findungsbereich fallen, obwohl die Amino-Terrninal-Arginin-Sequenz bevorzugt wird.

Claims (23)

1. Ψ1 283

   Patentansprüche

   1. Eine kombinante DNA-Methode zur Herstellung eines Intorleukln-1 Inhibitors (IL-Ii)₁ gekennzeichnet durch

   a) Herstellung einer DNA-Sequenz, die eine Wirtezelle so steuern kenn, dafl sie ein Protein mit einer IL-Ii Inhlbitor-Aktlvitlt produziert ι

   b) Klonieren der ONA-Sequenz in einen Krankheitsüberträger, der in eine Wirtszelle transferiert und repliziert werden kann, wobei ein solcher KrankheitsQbertrlgerfür die Expression der DNA-Sequenz erforderllohe funktionsfähige Elenente enthilt.

   ο) Transferieren des die synthetische DNA-Sequenz und
   funktionsfähige Elemente enthaltenden Krankheitsüberträger in eine Wirtezelle, die die den IL-1-Inhlbitor codierende DNA zur Expression bringen kannt

   d) Kultivierung der Wirtszeilen unter für die Verstärkung des Krankheitsüberträgers und Expression des Inhibitors Beeigneten Bedingungen!

   e) "Ernten" des Inhibitors und

   f) Gewährleistung, daß der Inhibitor eine aktive Tertiärstruktur annimmt, wodurch er IL-I inhlbitierende Aktivität besitzt.
2. 2. Methode nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine oDNA 1st.
3. 3. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine genomische Polynucleotid-Sequinz ist.
4. 4. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus Säugetlerzellen gewonnen wird.
5. 5. Methode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz aus humanen Mouocytzellen gewonnen wird.
6. 6. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen einen Mikroorganismus darstellen.
7. 7. Methode nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus E^ coil 1st.

   β. Methode nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtezellen Siugetierzellen sind.
8. 9. Methode nach Anspruch B, dadurch gekennzeichnet, daß die Slugertierz^llen CHO-Zellen sind.
9. 10. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine cONA-Polynucleotld ist.
10. 11. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz eine genonische Polynucleotid-Sequenz ist.
11. 12. Methode nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß eine isolierte DNA-Sequenz, einen physiologisch ljnktlonellen Interleukin-1 Inhibitor (IL-Ii) codiert, der eine DNA-Sequenz enthält, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz ausreichend duplikativ zu 11-11 hat, um den Besitz von mindestens einer biologischen Eigenschaften von IL-Ii

    zu ersSglichen.
12. 13. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß

    die DNA-Baseneequenz die Nucleinsäuren zwischen Positionen 99 und 557 aus der nachstehenden Squenz enthält.

    23FFO

    90 80 90 lJpO 110 120

    CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCCACCCTCTGGGAOAAAATCCA TLLLFLFHEETICPFSGRKS

    130 140 150 160 170 180

    gcragatgcaagccttcagaatctgggatettaaccagaabaccttctatctgaggaaca skmqafribdvnoktfylrn

    190 200 210 220 230 240

    accaactagttgctgqatacttbcaageaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagatb nolvhgylqgpmvnleekid

    250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGEAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVPIEPHALFLGIHGGKM. CL

    310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNITO

    370 380 390 400 410 420

    tgagcgagaacagaaagcaggacaagcgcttcqccttcatccgctcagacagtggcccca lsenrkqdkrfafirsosgp

    430 440 450 460 470 480

    CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA

    490 500 510 520 530 540

    accagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctact dqpvsltnmpdegvmvtkfy

    550 ^560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E ·

    0'; rep-fr - η /> *- *·-ο ι
13. 14. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das rekobinante DNA-Molekül GTlO-IL-11-2A ist.
14. 15. Methode nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß in gründlich gereinigter Interleukin-1 Inhibitor (IL-Ii) hergestellt wird, der mindestens einen von IL-Ii-X, IL-Ii.-^ und IL-H-ß enthalt.
15. 16. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei IL-Ii um IL-Ii-X handelt.

    % .263835
16. 17. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, defl es sich bei IL-Il um IL-11-οό handelt.

    1Θ. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei IL-Ii im IL-11-0 handelt.
17. 19. Methode nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daO die ONA-Basensequenz die Nucleinsäuren zwischen Position 99 und 557 aus der nachfolgenden Sequunz enthilt.

    ^ ΓΓΡ -fr · η

    Λ 8 3 8 3 5

    70 80 90 ljpO 110 120

    CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGABACBATCTGCCGACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICRFSGRKS

    130 140 150 160 17Ü 180

    gcaaqatgcaaeccttcagaatctgggatettaaccagaabaccttstatstgaooaaca skhqafrimdvnqktfylrn

    190 200 210 220 230 240

    accaactagttgctggatacttscaageaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagats nqlvagylqgpnvnleekio

    250 260 270 280 290 300 TGGiACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGQGAAGATGTGCCTGT VVPIEPHALFLQIHGGKMCL

    310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNITD

    370 380 390 400 410 420

    tgagcgagaacagaaagcaggacaagcgcttcsccttcatccgctcagacagtggcccca lsenrkqokrfafirsosgp

    430 440 450 460 470 480

    CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA

    490 500 510 520 530 540

    accagcccgtcagcctcaccaatatgcctgacgaaggcgtcatggtcaccaaattctact oqpvsltnmpoegvmvtkfy

    550 |560 570 580 590 600 TCCAOGAGOACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATOGCAAGGACTG F Q E D E ·

    j r Γ
18. 20. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daßein gründlich gereinigter Interleukin-1 Inhibitor mit der Sequenz ι

    ,10 .

    MEIXRGLRSHLITLLLPLFH

    30

    SETIXZPSGRKSSKMQAFRE

    50

    WDVNQKTFYLRNNQLVAGYL

    70 BO

    QGPNVNLEEKIOVVPIEPHA

    90

    LFLGIHGGKMXLSXVKSGUE

    110

    TRLQLEAVNITOLSENRKQD

    130

    KRFAFIRSDSGPTT S-F ESAA

    150

    XPGWBLXTAMEADQPVSLTN

    170
    MPDEGVMVTKFYFQEDE

    Wobei X Cystin, Serin oder Alanin 1st ι und

    Z ist Arginin oder Prolin hergestellt wird.
19. 21. Methode nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß ein gründlich gereinigter Interleukin-l Inhibitor (IL-Ii), der mindestens gegen eine aus einer aus Interleukin-l alpha und Interleukin-l beta enthaltendenden Gruppe ausgewählten Substanz wirksam ist.

    28383
20. 22. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß «an daβ IL-Ii aus SBugetierzellen erhält.
21. 23. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das IL-Ii aus Monocyten isoliert wird.
22. 24. Methode .nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, d*ß IL-Ii aus hunanen Monooyten isoliert wird.
23. 25. Verwendung eines erflndungsgenSB hergestellten Interleukin-1 Inhibitors (IL-Ii), dadurch gekennzeichnet, daß er zur Herstellung von Arzneimitteln eingesetzt wird.

    Hierzu 22 Seiten Zeichnungen