ES2615357T3 - Terapia de combinación usando un inhibidor de IL-1 para tratar enfermedades mediadas por IL-1 - Google Patents

Abstract

Uso de cantidades terapéuticamente eficaces de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y un fármaco antiinflamatorio adicional para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda o crónica, donde dicho anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y al menos un compuesto antiinflamatorio adicional se preparan para la administración separada o combinada, donde el compuesto antiinflamatorio es metotrexato (ácido N-[4-[(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino]benzoil]-L-glutámico).

Description

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DESCRIPCION

Terapia de combinacion usando un inhibidor de IL-1 para tratar enfermedades mediadas por IL-1 Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de las enfermedades mediadas por IL-1. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a una terapia de combinacion para el fin de prevenir o tratar enfermedades mediadas por IL-1.

Antecedentes de la invencion

La inflamacion es la reaccion de defensa del cuerpo a los danos causados por ejemplo por una lesion mecanica, infeccion o estimulacion antigenica. Una reaccion inflamatoria puede expresarse patologicamente cuando la inflamacion se induce por un estfmulo inapropiado, como por ejemplo un autoantigeno, se expresa de manera exagerada o persiste bastante despues de la retirada de los agentes culpables. Dicha reaccion de inflamacion pueden incluir la produccion de determinadas citocinas.

A pesar de que la etiologfa de la inflamacion se entiende poco, recientemente se ha adquirido una considerable informacion en lo que se refiere a los aspectos moleculares de la inflamacion. Esta investigacion ha llevado a la identificacion de determinadas citocinas que, segun se cree, participan prominentemente en la mediacion de la inflamacion. Las citocinas son protemas extracelulares que modifican el comportamiento de las celulas, en particular las celulas que estan en la zona inmediata de la smtesis y liberacion de citocina. Una de las citocinas inflamatorias mas potentes ya descubierta y una citocina que segun se piensa es una mediadora clave en muchas enfermedades y estados patologicos medicos es la interleucuina-1 (IL-1). IL-1, que es fabricada (aunque no exclusivamente) por las celulas del linaje macrofago/monocito, se puede producir en dos formas: IL-1 alfa (IL-1a) e IL-1 beta (IL-1 p).

Una enfermedad o afeccion medicas se considera como una “enfermedad mediada por interleucina-1” cuando dicha enfermedad o afeccion medica, ya sea espontaneo o experimental, esta asociado a niveles elevados de IL-1 en los fluidos o tejidos de organismo, o cuando las celulas o tejidos extrafdos desde el organismo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En muchos casos, se reconocen las enfermedades mediadas por interleucina-1 tambien porque se dan las siguientes dos condiciones adicionales: (1) los descubrimientos patologicos asociados a la enfermedad o la afeccion medica pueden imitarse experimentalmente en animales a traves de la administracion de IL-1; y (2) la patologfa inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad o la afeccion medica puede inhibirse o eliminarse a traves del tratamiento con agentes que inhiben la accion de IL-1. En la mayona de las enfermedades mediadas por interleucina-1 coinciden al menos dos de las tres condiciones, y en muchas de las enfermedades mediadas por interleucina 1 se observan las tres condiciones.

Las enfermedades mediadas por IL-1 tales como artritis reumatoide y artritis psoriasica, son enfermedades de las articulaciones cronicas que afligen o imposibilitan, en diversos grados, a millones de personas en todo el mundo. La artritis reumatoide es una enfermedad de las uniones articulares donde se van erosionando lentamente el cartflago y el hueso a traves de un tejido conectivo invasivo proliferativo denominado pannus, que deriva de la membrana sinovial. La enfermedad puede implicar estructuras peri-articulares como bursas, envolturas de tendon y tendones, asf como tejidos extra-articulares tales como subcutis, sistema cardiovascular, pulmones, bazo, nodulos linfaticos, musculos esqueleticos, sistema nervioso (central y periferico) y ojos (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II: 1828).

Se cree que la artritis reumatoide es el resultado de la presentacion de un antfgeno relevante a un hospedador susceptible inmunogeneticamente. Los antfgenos que podnan iniciar potencialmente una respuesta inmune desembocando en artritis reumatoide podnan ser endogenos o exogenos. Entre los posibles antfgenos endogenos se incluyen colageno, mucopolisacaridos y factores reumatoides. Entre los antfgenos exogenos se incluyen micoplasmas, micobacterias, espiroquetas y virus. Los productos secundarios de la reaccion inmune inflaman la sinovia (es decir, las prostaglandinas y los restos de oxfgeno) e impulsan cambios en las articulaciones destructivos (es decir, colagenasa).

Existe un amplio espectro de gravedad de la enfermedad, aunque muchos pacientes experimentan un ciclo de recafdas y remisiones intermitentes con un patron general de lenta y progresiva destruccion y deformidad de las articulaciones. Entre las manifestaciones clmicas se pueden incluir poliartritis simetrica de las articulaciones perifericas, con dolor, irritabilidad, inflamacion y perdida de la funcion de las articulaciones afectadas; rigidez matutina; y perdida de cartflago, erosion de la materia osea y subluxacion de las articulaciones tras una inflamacion persistente. Entre las manifestaciones extra-articulares se incluyen nodulos reumatoides, vasculitis reumatoide, inflamaciones pleuro-pulmonares, escleritis, smdrome sicca, smdrome de Felty (esplenomegalia y neutropenia), osteoporosis y perdida de peso (Katz (1985), Am. J. Med. 79: 24 y Krane and Simon (1986), Advances in Rheumatology, Synderman (ed.), 70(2): 263-284). Las manifestaciones clmicas tienen como resultado un alto grado de morbidez que tiene como resultado una vida cotidiana molesta para el paciente.

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Una teoiia aceptada generalmente a la que se recurre para explicar la relacion causal entre IL-1 y la artritis es que la IL-1 estimula varios tipos de celulas, como fibroblastos y condrocitos, para producir y secretar compuestos proinflamatorios o degradativos, como prostaglandina E2 y metaloproteinasas. Se ha relacionado la participacion de la interleucina-1 en la artritis a traves de dos lmeas de evidencia distintas.

En primer lugar, se ha observado un mayor nivel de interleucina-1 y del ARNm que lo codifica, en el tejido y el lfquido sinovial de las articulaciones artnticas. Vease por ejemplo, Buchan y cols., “Thrid Annual General Meeting of the British Society for Rheumatology” Londres, Inglaterra, noviembre 19-21, 1988, J. Rheumatol., 25(2); Fontana y cols. (1982), Rheumatology Int.: 2: 49-53; y Duff y cols. (1988); Monokines and Other Non-Lymphocytic Cytokines, M. Powanda y cols., (eds), pp. 387-392 (Alan R. Liss, Inc.).

En segundo lugar, se ha demostrado en numerosas ocasiones que la administracion de interleucina-1- al tejido de la articulacion sano tiene como resultado la erosion del cartflago y el hueso. En un experimento, se demostro que las inyecciones intra-articulares de IL-1 a conejos causaban la destruccion del cartflago in vivo (Pettipher y cols., (1986), Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 83: 8749-8753). En otros estudios, se ha demostrado que IL-1 causa la degradacion tanto del cartflago como del hueso en explantes de tejido (Saklatavala y cols., (1987), Development of Diseases of Cartilage and Bone Matrix, Sen and Thornhill (eds.), pp. 291-298 (Alan R. Liss, Inc.) and Stashenko y cols. (1987), The American Association of Immunologists, 183: 1464-1468). Por otra parte, se han obtenido unos resultados prometedores con unas recientes pruebas clmicas preliminares con seres humanos en artritis reumatoide con un inhibidor de IL-1 (Bresnihan, y cols., (1996), Arthritis and Rheumatism, 39(9): S73: And Watt y cols., (1996), Arthritis and Rheumatism, 39(9): S123).

El documento AU 649 245 desvela un metodo para tratar una enfermedad mediada por interleucina-1 que comprende administrar a un paciente en necesidad de la misma una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de interleucina 1. En una realizacion preferida se desvela una combinacion de IL-1ra e indometacina.

Un objeto de la presente invencion consiste en proporcionar metodos y composiciones terapeuticas para el tratamiento de afecciones inflamatorias de una articulacion. Tanto este como otros objetos de la presente invencion seran evidentes a partir de la descripcion en lo sucesivo en el presente documento.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a una terapia de combinacion para prevenir y tratar las enfermedades mediadas por IL-1 en un paciente. La presente invencion se refiere espedficamente a

1. Uso de cantidades terapeuticamente eficaces de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y un farmaco antiinflamatorio adicional para la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria aguda o cronica, donde dicho anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y al menos un compuesto antiinflamatorio adicional se preparan por separado o en administracion combinada, donde el compuesto anti-inflamatorio es metotrexato (acido N-r4-r(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino1benzoil1-L-glutamico).

2. El uso de 1, donde dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria de una articulacion, preferentemente, dicha enfermedad inflamatoria de una articulacion es artritis reumatoide.

3. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y al menos un compuesto antiinflamatorio adicional, donde el al menos un compuesto antiinflamatorio adicional es metotrexato (acido N-f4- r(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino1benzoil1-L-glutamico).

4. La composicion farmaceutica de 3, donde dicho metotrexato esta presente en una cantidad de hasta aproximadamente 25 mg.

5. Uso de un compuesto antiinflamatorio, distinto de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1, en la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad cronica o aguda en un mamifero en combinacion con la administracion de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1, donde el compuesto antiinflamatorio es metotrexato.

6. El uso de 5 donde la cantidad de metotrexato en el medicamento es hasta aproximadamente 25 mg.

7. Uso de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1, en la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria cronica o aguda en un mamifero en combinacion con la administracion de un compuesto antiinflamatorio adicional, donde el compuesto antiinflamatorio es metotrexato.

8. El uso de acuerdo con 6 o 7, donde el anticuerpo monoclonal anti-IL-1 en el medicamento esta presente en una cantidad de hasta aproximadamente 200 mg.

9. El uso de acuerdo con uno cualquiera de 5 a 8, donde dicho metotrexato se prepara para la administracion oral.

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Breve descripcion de las Figuras

Numerosos aspectos y ventajas de la presente invencion se pondran de manifiesto al repasar las Figuras, donde:

La Figura 1 representa una secuencia de acido nucleico (SEQ ID NO:1) que codifica Arg1-Glu153, IL-1ra humana recombinante madura (rhuIL-1ra). Tambien se representa la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:2) de rhulL- 1ra, siendo el aminoacido inicial Mn donde n se iguala a 0 o 1.

La Figura 2 representa los efectos de rhuIL-1ra solo, metotrexato solo y la combinacion de rhuIL-1ra y metotrexato en el diametro de la articulacion en ratas artnticas adyuvantes en el Ejemplo 1.

La Figura 3 representa los efectos de rhuIL-1ra solo, metotrexato solo y la combinacion de rhuIL-1ra y metotrexato en los pesos finales de la pata (mdice de artritis), la esplenomegalia (mdice de inflamacion sistemica) y el cambio de peso corporal en ratas artnticas adyuvantes en el Ejemplo 1.

La Figura 4 representa el analisis final (inhibicion en la terminacion) de los efectos de rhuIL-1ra solo, metotrexato solo o de la combinacion con rhuIL-1ra y metotrexato en el diametro de la articulacion en las ratas artnticas adyuvantes del Ejemplo 2.

La Figura 5 representa los efectos de rhuIL-1ra solo, metotrexato solo y la combinacion de rhuIL-1ra y metotrexato en los pesos finales de la pata (mdice de artritis), la esplenomegalia (mdice de inflamacion sistemica) y el cambio de peso corporal en ratas artnticas adyuvantes en el Ejemplo 2.

La Figura 6 representa los efectos en la gravedad clmica de rhulL-1ra o r-metIFN-con1 en un modelo de EAE en el Ejemplo 4.

La Figura 7 representa los efectos en la gravedad clmica de la terapia de combinacion de rhulL-1ra y r-metlFN- con1 en un modelo de EAE en el Ejemplo 4.

La Figura 8 representa los efectos en la ganancia de peso de la terapia de combinacion de rhulL-1ra y r-metlFN- con1 en un modelo de EAE en el Ejemplo 4.

Descripcion detallada de la invencion

En las presentes realizaciones, el animal sujeto preferible es el ser humano.

Los inhibidores de interleucina pueden ser de cualquier protema capaz de prevenir espedficamente la activacion de receptores celulares para IL-1. Las clases de inhibidores de interleucina 1 incluyen: antagonistas del receptor de interleucina 1 tales como IL-1ra, como se describe a continuacion; anticuerpos monoclonales del receptor anti-IL-1 (por ejemplo, documento EP 623674); protemas de union a IL-1 tales como receptores de IL-1 solubles (por ejemplo, los documentos U.S.P. 5.492.888; U.S.P. 5.488.032, y U.S.P. 5.464.937; U.S.P. 5.319.071; y U.S.P. 5.180.812; anticuerpos monoclonales anti-IL-1 (por ejemplo los documentos WO 9501997, WO 9402627, Wo 9006371, U.S.P. 4.935.343, EP 364.778; EP 276.611 y Ep 220.063); protemas accesorias del receptor de IL-1 (por ejemplo, el documento WO 96/23067)) y otros compuestos y protemas que bloquean la smtesis in vivo o la liberacion extracelular de IL-1.

El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) es una protema humana que actua como inhibidor natural de la interleucina-1 y que es un miembro de la familia IL-1 que incluye IL-1a e lL-1 p. Los antagonistas del receptor preferidos, asf como los metodos para su fabricacion y uso de los mismos, se describen en la patente de EE.UU. n.° 5.075.222; el documento WO 91/08285; el documento WO 91/17184; el documento AU 9173636; el documento WO 92/16221; el documento WO 93/21946; el documento WO 94/06457; el documento WO 94/21275; el documento FR 2706772; el documento WO 94/21235; el documento DE 4219626; el documento WO 94/20517; el documento WO 96/22973 y el documento WO 97/28828. Las protemas incluyen antagonistas del receptor IL-1 tanto glucosilados como no glucosilados.

Espedficamente, tres formas utiles de IL-1ra y variantes de las mismas se desvelan y se describen en la patente 5.075.222. La primera de ellas, IL-1raa, se caracteriza como una molecula de 22-23 kD en SDS-PAGE con un punto isoelectrico aproximado de 4,8, por elucion desde una columna Mono Q FPLC a aproximadamente 52 mM de NaCl en tampon tris, pH 7,6. La segunda, IL-1rap, se caracteriza como una protema de 22-23 kD, por elucion desde una columna Q a 48 mM de NaCl. Tanto IL-1raa como IL-1rap estan glucosiladas. La tercera, IL-1rax se caracteriza como una protema de 20 kD, por elucion desde una columna Mono Q a 48 mM de NaCl y no esta glucosilada. La patente 5.075.222 describe tambien metodos para el aislamiento de genes responsables de la codificacion de los inhibidores, la clonacion del gen en vectores y tipos de celulas adecuados y la expresion del gen para producir los inhibidores.

IL-1ra y las formas modificadas de IL-1ra donde los aminoacidos de IL-1ra han sido (1) suprimidos (“variantes de delecion”), (2) insertados (“variantes de adicion”) o (3) sustituidos (“variantes de sustitucion”) se denominan de forma colectiva “protema o protemas IL-1ra”. [A no ser que se indique de otro modo, la numeracion de aminoacidos para las moleculas que se describen en el presente documento debera corresponder a la presentada para la forma madura de la molecula (es decir menos la secuencia de senal), tal como se describe con los aminoacidos Arg1- Glu152 de la SEQ ID NO:2, siendo MET inicial en cada una de dichas secuencias el resto numero “0”].

Se apreciara por aquellos expertos en la materia que pueden realizarse muchas combinaciones de deleciones,

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inserciones y sustituciones (individualmente o colectivamente “variante o variantes”) dentro de las secuencias de aminoacido de IL-1ra, con la condicion de que la molecula resultante sea biologicamente activa (por ejemplo, que posea la capacidad de inhibir IL-1).

Una variante o variantes de IL-ra puede detectarse rapidamente para evaluar sus propiedades ffsicas. Se apreciara que tales variante o variantes demostraran propiedades de inhibicion de IL-1 similares, pero no necesariamente todas las mismas propiedades y no necesariamente en el mismo grado que IL-1ra.

Existen dos variables principales en la construccion de la variante o variantes de secuencia de aminoacido: la localizacion del sitio de mutacion y la naturaleza de la mutacion. Al designar una variante o variantes, la localizacion de cada sitio de mutacion y la naturaleza de cada mutacion dependeran de la caractenstica o caractensticas bioqmmicas a modificarse. Cada sitio de mutacion puede modificarse individualmente o en serie, por ejemplo, (1) suprimiendo el resto de aminoacido diana, (2) insertando uno o mas restos de aminoacido adyacentes al sitio localizado o (3) sustituyendo primero con elecciones de aminoacidos conservativos y, dependiendo de los resultados conseguidos, despues con seleccionas mas restos.

Las deleciones de la secuencia de aminoacido oscilan generalmente de aproximadamente 1 a 30 restos de aminoacido, preferentemente de aproximadamente 1 a 20 restos de aminoacido, mas preferentemente de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoacido, lo mas preferentemente de aproximadamente 1 a 5 restos contiguos. Se contemplan las deleciones dentro de la secuencia amino terminal, carboxi-terminales e internas. Se pueden realizar supresiones dentro de la secuencia de aminoacido IL-1ra, por ejemplo, en regiones de baja homologfa con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1. Las supresiones dentro de la secuencia de aminoacido IL-1ra en areas de homologfa sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1 tendran mas probabilidades de modificar significativamente la actividad biologica.

Una adicion de secuencia de aminoacido puede incluir inserciones de fusion amino- y/o carboxi-terminal comprendidas en longitud de un resto y cien o mas restos, asf como inserciones dentro de la secuencia internas de un solo resto o varios restos de aminoacido. Las adiciones internas pueden oscilar generalmente entre aproximadamente 1 y 20 restos de aminoacido, preferentemente entre aproximadamente 1 y 10 restos de aminoacido, mas preferentemente entre aproximadamente 1 y 5 restos de aminoacido, siendo sobre todo preferible entre aproximadamente 1 y 3 restos de aminoacido. Las adiciones dentro de la secuencia de aminoacido de IL-1ra se pueden realizar en regiones de baja homologfa con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1. Las adiciones dentro de la secuencia de aminoacido de IL-1ra en areas de homologfa sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1 tendran mayor probabilidad de modificar significativamente la actividad biologica. Las adiciones incluyen preferentemente secuencias de aminoacido derivadas de las secuencias de los miembros de la familia IL-1.

Se contempla que la adicion del termino amino incluya la adicion de una metionina (por ejemplo, como elemento de la expresion directa en un cultivo de celulas recombinantes bacterianas). Otro ejemplo mas de una adicion amino- terminal incluye la fusion de una secuencia de senales con el termino amino de Il-1ra con el fin de facilitar la secrecion de protemas desde celulas hospedadoras recombinantes. Dichas secuencias de senal se obtendran generalmente a partir especies de celulas hospedadoras buscadas y por lo tanto seran homologas a ellas. Para celulas hospedadoras procariotas que no reconocen la secuencia de senal nativa de IL-1ra, se puede sustituir la secuencia de senal por una secuencia de senal procariota, como por ejemplo, a partir del grupo de secuencias lfder de fosfatasa alcalina, penicilinasa o enterotoxina II termoestable. Para la expresion en celulas de levadura, cada polipeptido puede tener una secuencia de senal seleccionada por ejemplo del grupo de secuencias lfder de invertasa de levadura, factor alfa o fosfatasa acida. En la expresion de celulas de mamffero, la secuencia de senal nativa de IL-1ra (documento U.S. 5.075.222) es satisfactoria, si bien pueden ser adecuadas otras secuencias de senal de mamffero, como por ejemplo secuencias derivadas de otros miembros de la familia IL-1.

Un ejemplo de la adicion en el termino amino- o carboxi incluye protemas quimericas que comprenden la fusion amino-terminal o carboxi-terminal de una protema o protemas IL-1ra con parte o todo el dominio constante de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana (individualmente o colectivamente, (“IL-1ra Fac”). Son preferibles dichos polipeptidos quimericos, comprendiendo la porcion de inmunoglobulina de cada uno todos los dominios excepto el primer dominio de la region constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana, como IgG (por ejemplo, IgG1 o IgG3), IgA, IgM o IgE. Las personas especializadas en este campo podran apreciar que se puede suprimir o sustituir cualquier aminoacido de la porcion inmunoglobulina con uno o mas aminoacidos, se pueden anadir uno o mas aminoacidos, siempre y cuando la porcion de la protema o protemas IL-Ira siga inhibiendo la IL-1 y la porcion inmunoglobulina presente una o mas de sus propiedades caractensticas.

Otro grupo de variante o variantes es el de la variante o variantes de sustitucion de aminoacido de la secuencia de aminoacidos de IL-1ra. Se trata de variantes donde se elimina al menos un resto de aminoacido en IL-1ra y se inserta un resto diferente en su lugar. Entre las variantes de sustitucion se incluyen variantes alelicas, que se caracterizan por cambios en la secuencia de nucleotido naturales en la poblacion de especie que pueden tener o no como resultado un cambio de aminoacido. Un experto en la materia puede usar cualquier informacion conocida sobre la union o sitio activo del polipeptido para la seleccion de los posibles sitios de mutacion. En los documentos

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WO 91/17184, WO 92/16221 y WO 96/09323 se instruye sobre ejemplos de variante o variantes de sustitucion.

Uno de los metodos para identificar restos o regiones de aminoacido para mutagenesis de una protema se denomina “mutagenesis de exploracion de alanina”, como describe Cunningham y Wells (1989), Science, 244: 10811085. En este metodo, se identifica un resto de aminoacido o un grupo de restos diana de una protema (por ejemplo, restos cargados como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoacido neutro o de carga negativa (siendo sobre todo preferible alanina o polialanina) para afectar a la interaccion de los aminoacidos con el entorno acuoso circundante dentro o fuera de la celula. A continuacion, se refinan los dominios/restos que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones por introduccion de restos adicionales o alternativos en los sitios de sustitucion. Segun esto, se determina previamente el sitio para introducir una modificacion de la secuencia de aminoacido. Para optimizar el comportamiento de una mutacion en un sitio determinado, se puede llevar a cabo la exploracion de alanina o la mutagenesis aleatoria y se puede realizar la deteccion selectiva de la variable o varia para obtener la combinacion optima segun la actividad y el grado de actividad deseados. Se ha trazado el mapa de los sitios de union del receptor en IL-1ra por mutagenesis dirigida a sitio extensiva (Evans y cols., (1994), The Journal of Biological Chemistry, 270(19):11477-11483.

Los sitios de mayor interes para la mutagenesis de sustitucion incluyen sitios donde ciertos aminoacidos en particular, que se encuentran dentro de IL-ra, son sustancialmente diferentes de otras diversas especies u otros miembros de la familia IL-1 en lo que se refiere al volumen de cadenas laterales, la carga y/o la hidrofobicidad. Otros sitios de interes incluyen aquellos donde ciertos restos en particular de IL-1ra son identicos entre otras especies u otros miembros de la familia IL-1, dado que dichas posiciones son importantes generalmente para la actividad biologica de una protema. Las personas especializadas en este campo podran apreciar que inicialmente, estos sitios deberan modificarse por sustitucion de una manera relativamente conservativa.

Tales sustituciones conservativas se muestran en la tabla 1, bajo el encabezamiento “Sustituciones preferibles”. Cuando dichas sustituciones tienen como resultado un cambio en la actividad biologica, mas cambios sustanciales cambios se pueden introducir (ejemplos de sustituciones) y/o se pueden realizar otras adiciones/supresiones y realizar la deteccion selectiva de los polipeptidos resultantes.

TABLA 1: Sustituciones de aminoacido

Resto original

Sustituciones preferidas Sustituciones ejemplares

Ala (A)

Val Val; Leu; Ile

Arg (R)

Lys Lys; Gln; Asn

Asn(N)

Gln Gln; His; Lys; Arg

Asp(D)

Glu Glu

Cys(C)

Ser Ser

Gln (Q)

Asn Asn

Glu (E)

Asp Asp

Gly (G)

Pro Pro

His (H)

Arg Asn; Gln; Lys; Arg

Ile (I)

Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucina

Leu (L)

Ile norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe

Lys (K)

Arg Arg; Gln; Asn

Met (M)

Leu Leu; Phe; Ile

Phe (F)

Leu Leu; Val; Ile; Ala

Pro (P)

Gly Gly

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr Tyr

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Resto original Sustituciones preferidas Sustituciones ejemplares

Tyr (Y)

Phe Trp; Phe; Thr; Ser

Val (V)

Leu Ile; Leu; Met;

Phe; Ala;

norleucina

Al realizar dichos cambios, puede considerarse el mdice hidropatico de los aminoacidos. La importancia del mdice hidropatico de los aminoacidos a la hora de conferir una funcion biologica interactiva a la protema se entiende generalmente dentro de la especialidad (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157:105-131). Se sabe que determinados aminoacidos pueden estar sustituidos por otros aminoacidos que tienen una puntuacion o mdice hidropatico similar y siguen reteniendo una actividad biologica similar.

Tambien se entiende en la tecnica que la sustitucion de aminoacidos similares puede realizarse eficazmente en funcion de la hidrofobicidad, en particular, cuando se pretende utilizar la protema o peptido de funcionalidad equivalente creada de este modo en modos de realizacion inmunologicos, como es el presente caso. En la patente de EE.UU. 4.554.101, se senala que la mayor hidrofobicidad media local de una protema, segun se rige por la hidrofobicidad de sus aminoacidos adyacentes se corresponde con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir con una propiedad biologica de la protema.

La patente EE.UU. 4.554.101 tambien ensena sobre la identificacion y preparacion de epttopos a partir de secuencias de aminoacido primarias en funcion de la hidrofobicidad. A traves de los metodos descritos en la patente EE.UU. 4.554.101, un experto en la materia podra identificar epftopos, como por ejemplo, dentro de la secuencia de aminoacido de IL-1ra. Dichas regiones se denominan tambien “regiones de nucleo epitopico”. Se han dedicado numerosas publicaciones cientfficas a la prediccion de una estructura secundaria y a la identificacion de epftopos, a partir de analisis de secuencias de aminoacido (Chou y Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 222-245; Chou y Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Chou y Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 211222, Chou y Fasman (1978, Ann Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou y Fasman (1979), Biophys. J., 26:367-384. Por otra parte, actualmente se dispone de programas informaticos para ayudar a predecir las porciones antigenicas y las regiones de nucleo epitopico de protemas. Entre los ejemplos se incluyen los programas basados en el analisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 y Wolf y cols., (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191, el programa PepPlot® (Brutlag y cols. (1990), CABS, 6:237-245 y Weinberger y cols. (1985), Science, 228: 740-742, y otros programas para prediccion de estructura terciaria de protema (Fetrow and Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11: 479-483).

En contraste, pueden realizarse sustanciales modificaciones en las caractensticas funcionales y/o qmmicas de IL- 1ra seleccionando las sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena principal de polipeptido en el area de la sustitucion, por ejemplo, como una conformacion en lamina o helicoidal, (b) la carga relativa o hidrofobicidad de la protema en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos en funcion de las propiedades de la cadena lateral comunes:

1) hidrofobo: norleucina, Met, Ala, Val, Leu; Ile;

2) hidrofilo neutro: Cys, Ser, Thr;

3) acido: Asp; Glu

4) basico: Asn, Gln; His, Lys, Arg;

5) aromatico: Trp, Tyr, Phe; y

6) restos que influyen en la orientacion de cadena: Gly, Pro.

Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de uno de estos grupos por otro. Tales restos sustituidos pueden introducirse en regiones de IL-1ra que son por ejemplo homologas a las de otros miembros de la familia IL-1 o en regiones no homologas de la protema.

Puede realizarse una diversidad de sustituciones o supresiones de aminoacido para modificar o anadir sitios de glucosilacion unidos en N- o unidos en O-, con el resultado de una protema con la glucosilacion alterada. Puede modificarse la secuencia para anadir sitios de glucosilacion o suprimir sitios de glucosilacion unidos en N- o unidos en O- desde IL-1ra. Un sitio de reconocimiento de glucosilacion unido a asparagina comprende una secuencia de tripeptido que es reconocida espedficamente por enzimas de glucosilacion celulares apropiadas. Dichas secuencias de tripoeptido son o bien Asn-Xaa-Thr o bien Asn-Xaa-Ser, pudiendo ser Xaa cualquier aminoacido distinto a Pro.

Las mutaciones espedficas de la secuencia de IL-1ra pueden implicar sustitucion de un aminoacido no nativo en el termino amino, el termino carboxi o cualquier otro sitio de la protema que esta modificado por la adicion de un carbohidrato unido en N- o unido en O-. Dichas modificaciones pueden resultar de particular utilidad en la adicion de un aminoacido (por ejemplo, cistema), lo que es ventajoso para la union de un polfmero hidrosoluble para formar un derivado. Por ejemplo, el documento WO 92/16221 describe la preparacion de IL-1ra mutemas, por ejemplo, donde

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se cambian los restos nativos por cistema.

Un polipeptido variante preferentemente sera sustancialmente homologo al aminoacido de IL-1ra (SEQ ID NO:2). La frase “susancialmente homologo” como se utiliza en el presente documento se refiere a un grado de homologfa que excede un 80 %, preferentemente que excede un 90 %, mas preferentemente que excede un 95 %, lo mas preferentemente incluso un 99 %. El porcentaje de homologfa como se describe en el presente documento se calcula como el porcentaje de restos aminoacido que se encuentran en la mas pequena de las dos secuencias que se alinean con restos de aminoacido identicos en la secuencia que se esta comparando cuando se pueden introducir dos espacios en una longitud de 100 aminoacidos para ayudar a dicho alineamiento, tal como describe Dayhoff en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. Tambien se incluyen dentro del termino “sustancialmente homologo” variante(s)de IL-1ra que se pueden aislar en virtud de la reactividad cruzada con anticuerpos para la secuencia de aminoacidos de la sEq ID NO:2 o cuyos genes se pueden aislar a traves de hibridacion con el ADN de la SEQ ID NO:1 o con segmentos de la misma.

Derivados de polipeptido

Se describen los derivados qmmicamente modificados de la protema o protemas IL-1ra donde la protema esta unida a un polfmero con el fin de modificar las propiedades de la protema (denominados en el presente documento “derivados”). Dichos derivados pueden ser preparados por las personas especializadas en este campo en funcion de la descripcion aqm expuesta. Se pueden preparar conjugados utilizando protema o protemas IL-1ra glucosiladas, no glucosiladas o desglucosiladas y fracciones qmmicas adecuadas. Tfpicamente, se utilizaran protemas no glucosiladas y polfmeros hidrosolubles.

Los polfmeros hidrosolubles son deseables ya que la protema a la que se une cada uno de ellos no precipitara en un entorno acuoso, como es el entorno fisiologico. Preferentemente, el polfmero sera farmaceuticamente aceptable para la preparacion de un producto o composicion terapeutico. Las personas especializadas en este campo podran seleccionar el polfmero deseado en funcion de consideraciones de si el conjugado polfmero /protema se utilizara terapeuticamente y, si es asf, el perfil terapeutico de la protema (por ejemplo, la duracion de la liberacion sostenida; la resistencia a la proteolisis; los efectos, si los hay en la dosis; la actividad biologica; la facilidad de manejo; el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polfmero hidrosoluble en una protema terapeutica).

Los polfmeros hidrosolubles clmicamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), propionaldehfdo de polietilenglicol, copolfmeros de etilen glicol/propilen glicol, monometoxi-polietilenglicol, carboximetil celulosa, dextrano, polialcohol vimlico (PVA), polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolimero de etileno/antndrido maleico, poli(p-aminoacidos (ya sean homopolfmeros o copolfmeros aleatorios), poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolfmeros de polipropilen glicol (PPG) y otros oxidos de polialquileno, copolfmeros de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polialcoholes polioxietilados (POG) (por ejemplo, glicerol) y otros polialcoholes polioxietilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada, acidos colonicos u otros polfmeros de hidrato de carbono, Ficoll o dextrano y mezclas de ellos. Como se usa en el presente documento, se pretende que polietilenglicol abarque cualquier forma que se haya utilizado para derivar otras protemas, como mono-(C1-C10) alcoxi o ariloxi-polietilenglicol. El propionaldehfdo de polietilenglicol puede presentar ventajas en la fabricacion gracias a su estabilidad en agua.

Los polfmeros hidrosolubles pueden ser cada uno de cualquier peso molecular y pueden estar ramificados o sin ramificar. Generalmente, cuanto mayor es el peso molecular o cuantas mas ramificaciones tiene, mayor es la relacion polfmero:protema. Los polfmeros hidrosolubles tienen tfpicamente un peso molecular medio comprendido entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el termino “aproximadamente” que, en las preparaciones de un polfmero hidrosoluble, algunas moleculas pesaran mas y algunas menos que el peso molecular senalado). El peso molecular medio de cada uno de los polfmeros hidrosolubles esta comprendido preferentemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 40 kDa, mas preferentemente entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 35 kDa siendo sobre todo preferible entre aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 30 kDa.

Existe una serie de metodos de fijacion disponibles para los expertos en la materia, incluyendo reacciones de acilacion o reacciones de alquilacion (preferentemente para generar una protema qmmicamente modificada amino- terminal) con una molecula hidrosoluble reactiva. Vease por ejemplo, el documento EP 0.401.384; Malik y cols. (1992), Exp. Hematol., 20: 1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2): 4-10, publicado por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, RU; el documento EP 0.154.316; el documento EP 0.401.384; el documento WO 92/16221; el documento WO 95/34326; el documento WO 95/13312; el documento WO 96/11953; el documento WO 96/19459 y el documento WO 96/19459; y las otras publicaciones citadas en el presente documento que se refieren a la pegilacion.

Una variante espedfica es una molecula de aldehfdo de monometoxi-polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de bien aproximadamente 20 kDa o bien aproximadamente 33 kDa (por ejemplo, entre 30 kDa y 35 kDa), o un aldehfdo de terc-butil polietilenglicol que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 33 kDa (por ejemplo entre 30 kDa y 35 kDa) conjugado a traves de la alquilacion reductora con la protema o protemas IL-1ra.

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La pegilacion tambien puede llevarse a cabo espedficamente utilizando poUmeros hidrosolubles que tienen al menos un grupo hidroxi reactivo (por ejemplo, polietilenglicol). Puede hacerse reaccionar el poUmero hidrosoluble con un grupo activador, formando asf un “ligando activado” util en la modificacion de diversas protemas. Los ligandos activados pueden ser monofuncionales, bifuncionales o multifuncionales.

Entre los grupos activadores que pueden utilizarse para unir el polfmero hidrosoluble con dos o mas protemas se incluyen los siguientes: sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Entre los reactivos utiles que tienen un grupo sulfona reactivo que pueden utilizarse en los metodos se incluyen, sin limitacion, clorosulfona, vinilsulfona y divinilsulfona. Estos derivados PEG son estables frente a la hidrolisis durante extensos penodos de tiempo en entornos acuosos, a pH de aproximadamente 11 o menos, y pueden formar uniones con moleculas para formar conjugados que tambien son hidroltticamente estables. Dos derivados homobifuncionales particularmente utiles son PEG-bis-clorosulfona y PEG-bis-vinilsulfona (documento WO 95/13312).

Formas polivalentes

Pueden construirse formas polivalentes, es decir, moleculas que comprenden mas de un resto activo. En una realizacion, la molecula puede poseer multiples sitios antagonistas de receptor de interleucina-1.

Adicionalmente, la molecula puede poseer al menos un sitio antagonista de receptor de interleucina-1 y, dependiendo de las caractensticas deseadas de la forma polivalente, al menos un sitio de otra molecula (por ejemplo, una protema o protemas IL-1ra, y un producto TNFbp, como se describe a continuacion).

La forma polivalente puede construirse, por ejemplo, por acoplamiento qmmico en al menos una protema o protemas IL-1ra y otra fraccion con cualquier ligando clmicamente aceptado (por ejemplo, un polfmero hidrosoluble). En principio, el ligando no debe impartir una nueva inmunogenicidad ni tampoco, en virtud de los nuevos restos de aminoacido, alterar la hidrofobicidad ni cargar el resto de la estructura que afecte a su distribucion y eliminacion.

Los polfmeros hidrosolubles pueden ser, en funcion de los monomeros enumerados en el presente documento, homopolfmeros, copolfmeros aleatorios o de bloque, terc-polfmeros de cadena lineal o ramificada, sustituidos o sin sustituir. El polfmero puede ser de cualquier longitud o peso molecular, si bien estas caractensticas pueden afectar a las propiedades biologicas. Los pesos moleculares medios de polfmero particularmente utiles para disminuir los indices de eliminacion en aplicaciones farmaceuticas se encuentran en el intervalo de 2.000 a 35.000 daltons. Por otra parte, la longitud del polfmero puede variar para optimizar o conferir la actividad biologica deseada.

Los restos activos pueden unirse utilizando tecnicas de acoplamiento convencionales (veanse los documentos WO 92/16221, WO 95/13312 y WO 95/34326). Por ejemplo, en los documentos WO 92/16221 y WO 95/34326 se describe la preparacion de diversas moleculas IL-1ra dimerizadas.

Alternativamente, una molecula bivalente puede consistir en dos repeticiones en tandem de protema o protemas IL- 1ra separadas por una region de ligando de polipeptido. El diseno de los ligandos de polipeptido es similar al diseno a la insercion de secuencias de bucle cortas entre dominios en el diseno de novo de protemas (Mutter (1988), TIBS, 13: 260-265 y Regan and Degrado (1988), Science, 241: 976-978. Se han ensamblado varios constructos de ligando diferentes y se ha demostrado que son utiles para formar anticuerpos de cadena simple; los ligandos mas funcionales vanan en tamano entre 12 y 25 aminoacidos (aminoacidos que tienen grupos laterales no reactivos, por ejemplo, alanina, serina y glicina) que constituyen juntos una secuencia hidrofila, tienen restos de carga opuesta para potenciar la solubilidad y son flexibles (Whitlow y Filpula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2: 97-105; y Brigido y cols., (1993), J. Immunol. , 150: 469-479.

Adicionalmente, la protema o protemas IL-1ra pueden acoplarse qmmicamente a biotina y, a continuacion, puede dejarse unir el conjugado resultante a avidina, con el resultado de una molecula de protema o protemas avidina/biotina/IL-1ra tetravalente. La protema o protemas IL-1ra pueden acoplarse covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y hacerse precipitar el conjugado resultante con anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decamericos.

Tambien pueden producirse las protemas de fusion recombinantes donde cada molecula quimerica recombinante tiene una secuencia de protema o protemas IL-1ra fusionada amino-terminalmente o carboxi-terminalmente con todos o parte de los dominios constantes, pero a al menos un dominio constante, de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se puede producir una protema de fusion quimerica de protema o protemas IL-1ra/IgG1 (o protema o protemas IgGl/IL-1ra) a partir de un gen qmmerico con contenido en cadena ligera: una quimera de protema o protemas IL-1ra/kappa humana de cadena ligera (protema o protemas IL-1ra/Ck) o quimera de cadena ligera de kappa humana /protema o protemas IL-1ra (Ck/protema o protemas IL-1ra); o gen qmmerico con contenido en cadena pesada: una quimera de protema o protemas IL-1ra/cadena pesada de gamma-1 humana (protema o protemas IL-1ra /Cg-1) o quimera de gamma-1 humana de cadena pesada /protema IL-1ra) (Cg- 1/protema o protemas IL-1ra). Tras la transcripcion y traduccion de un gen quimerico de cadena pesada, o de un gen con contenido en cadena ligera y un gen qmmerico de cadena pesada, se pueden ensamblar los productos geneticos en una sola molecula qmmerica que tiene una protema o protemas IL-1ra desplegada bivalentemente.

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Otros detalles que se refieren a la construccion de dichas moleculas qmmericas se describen en la patente de EE.UU. n.° 5.116.964; el documentoWO 89/09622, el documento WO 91/16437 y el documento EP 315062.

Tambien pueden producirse protemas de fusion recombinantes teniendo cada molecula quimerica recombinante al menos una protema o protemas IL-1ra, tal como se ha descrito en el presente documento, y al menos una porcion de la region 186-401 de osteoprotogerina, tal como se describe en la solicitud de patente europea N.° 96309363.8. Bien la protema o protemas IL-1ra o bien la porcion de osteoprotogerina pueden estar en el termino amino o en el termino carboxi de la molecula quimerica.

Smtesis de protema o protemas IL-1ra

A continuacion se describe con mayor detalle la produccion de la protema o protemas IL-1ra. Tales protemas pueden prepararse, por ejemplo, a traves de tecnicas recombinantes o a traves de una protema de smtesis qmmica in vitro.

Polinucleotidos

Basandose en la presente descripcion y utilizando la tabla de codones universales, un experto en la materia podra determinar facilmente todas las secuencias de acido nucleico que codifican la secuencia de aminoacido de la protema o protemas IL-1ra.

Pueden seguirse las tecnicas de expresion recombinantes llevadas a cabo de acuerdo con las descripciones que se exponen a continuacion para producir cada uno de tales polinucleotidos y para expresar la protema codificada. Por ejemplo, insertando una secuencia de acido nucleico que codifica una protema o protemas IL-1ra en un vector apropiado, un experto en la materia podra producir facilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleotido deseada. Las secuencias se pueden utilizar despues para generar sondas de deteccion o cebadores de amplificacion. Alternativamente, puede insertarse un polinucleotido que codifica una protema o protemas IL-1ra en un vector de expresion. Al introducir el vector de expresion en un hospedador apropiado, se puede producir la protema deseada en grandes cantidades.

Como se describe ademas en el presente documento, hay disponibles numerosos sistemas hospedador/vector para la propagacion de las secuencias de acido nucleico deseadas y/o la produccion de las protemas deseadas. Entre ellos se incluyen, pero no se limitan a, plasmido, vectores vmicos e insercionales y hospedadores procariotas y eucariotas. Un experto en la materia podra adaptar un sistema hospedador/vector con el que se pueda propagar o expresar ADN heterologo para producir o expresar las secuencias de la presente invencion.

Adicionalmente, se apreciara por aquellos expertos en la materia que, a la vista de la presente descripcion, las secuencias de acido nucleico dentro del alcance de la presente invencion incluyen la secuencia de acido nucleico de la Figura 1, asf como las secuencias de acido nucleico degeneradas de la misma, secuencias de acido nucleico que codifican variante o variantes de IL-1ra y secuencias de acido nucleico que se hibridan (en las condiciones de hibridacion que se describen mas adelante en la seccion de exploracion de biblioteca de ADNc, o condiciones equivalentes o condiciones mas rigurosas) con complementos de la secuencia de acido nucleico de la Figura 1.

Tambien se proporciona por la presente invencion construcciones de ADN recombinante que implican un vector de ADN junto con las secuencias de ADN que codifican las protemas deseadas. En cada construccion de ADN tal, la secuencia de acido nucleico que codifica una protema deseada (con o sin peptidos senal) esta en asociacion funcional con una secuencia de control de expresion o reguladora capaz de dirigir la replicacion y/o la expresion de la protema deseada en un hospedador seleccionado.

Expresion recombinante

Preparacion de polinucleotidos

Puede obtenerse facilmente una secuencia de acido nucleico que codifica una protema o protemas IL-1ra de varias maneras entre las que se incluyen, sin limitacion, smtesis qmmica, deteccion selectiva de biblioteca de ADNc o genomica, deteccion selectiva de biblioteca de expresion y/o amplificacion por PCR de ADNc. Estos metodos y otros, que son utiles para aislar dichas secuencias de acido nucleico, se describen en Sambrook y cols. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; de Ausubel y cols. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; y por Berger y Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic Press, Inc. San Diego Ca.

La smtesis qmmica de una secuencia de acido nucleico que codifica una protema deseada puede llevarse a cabo utilizando metodos muy conocidos en la especialidad, tales como los que describe Engels y cols. (1989), Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-734 y Wells y cols. (1985), Gene, 34: 315. Estos metodos incluyen, entre otros, los metodos de smtesis de secuencia de acido nucleico de fosfotriester, fosforoamidita, y H-fosfonato. Se pueden sintetizar secuencias de acido nucleico grandes, como por ejemplo, las que son mas grandes de aproximadamente 100

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nucleotidos de longitud, como varios fragmentos. A continuacion, se pueden ligar los fragmentos entre sf para formar una secuencia de acido nucleico adecuada. Un metodo preferible es la smtesis soportada por poKmero aplicando la qmmica de fosforamidita normal.

Alternativamente, se puede obtener una secuencia de acido nucleico adecuada por deteccion selectiva de una biblioteca de ADNc apropiada (es decir, una biblioteca preparada a partir de una o mas fuentes de tejido que presuntamente expresa la protema) o una biblioteca genomica (una biblioteca preparada a partir de un ADN genomico total). La fuente de la biblioteca de ADNc es tipicamente una fuente de tejido o celular de cualquier especie que exprese presuntamente una protema deseada en cantidades razonables. La fuente de la biblioteca genomica puede consistir en cualquier tejido o tejidos de un mairnfero u otra especie que se crea que hospeda un gen que codifica la protema deseada.

Se puede realizar la deteccion selectiva de los medios de hibridacion para determinar la presencia de un ADN que codifica una protema deseada utilizando una o mas sondas de acido nucleico (oligonucleotidos, fragmentos de ADN genomico o ADNc que poseen un nivel aceptable de homologfa con el ADNc o gen que se va a clonar) que se hibriden selectivamente con el o los ADNc o gen o genes presentes en la biblioteca. Las sondas utilizadas tfpicamente para dicha deteccion selectiva codifican una region reducida de la secuencia de ADN desde la misma especie o especie similar a la especie desde la que se prepara la biblioteca. Alternativamente, las sondas se pueden degenerar, tal como se explica en el presente documento.

Tfpicamente se lleva a cabo la hibridacion por apareamiento de una sonda de oligonucleotido o ADNc con los clones en condiciones de severidad para prevenir una union no espedfica a la vez que se permite la union de los clones que tienen un nivel significativo de homologfa con la sonda o cebador. Las condiciones de rigor de lavado e hibridacion tfpicas dependen en parte del tamano (es decir el numero de nucleotidos en longitud) del ADNc o la sonda de oligonucleotido o de si se genera o no la sonda. La probabilidad de identificacion de un clon tambien se considera a la hora de disenar el medio de hibridacion (por ejemplo, si se esta detectando selectivamente una biblioteca genomica o de ADNc o no).

Cuando se utiliza un fragmento de ADN (como por ejemplo un ADNc) como sonda, entre las condiciones de hibridacion tfpicas se incluyen aquellas que se exponen en Ausubel y cols. (1994), anteriormente. Tras la hibridacion, se lava el medio de hibridacion en condiciones de severidad adecuadas, dependiendo de varios factores como el tamano de la sonda, la homologfa de la sonda con el clon esperada, el medio de hibridacion que se este detectando selectivamente, el numero de clones que se esten detectando selectivamente y similares.

Como ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas puede mencionarse una hibridacion en 6 x SSC a 62-67 °C, seguido del lavado en 0,1 x SSC a 62-67 °C durante aproximadamente una hora. Alternativamente, otro ejemplo de condiciones de hibridacion severas puede consistir en una hibridacion a 45-55 % de formamida, 6 x SSC a 40-45 °C, seguido del lavado en 0,1 x SSC a 62-67 °C durante aproximadamente una hora. Asimismo, se incluyen secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de acido nucleico que se indican en la Figura 1 en condiciones de hibridacion relajadas y que codifican una protema o protemas IL-1ra. Como ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas relajadas se puede mencionar 6 x SSC a 45-55 °C o la hibridacion con 30-40 % de formamida a 40-45 °C, seguido del lavado en 1-2 x SSC a 55 °C durante aproximadamente 30 minutos. Ver Maniatis y cols. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, paginas 387 a 389.

Existen tambien protocolos ejemplares para las condiciones de lavado rigurosas, segun los cuales se utilizan sondas de oligonucleotido para detectar selectivamente los medios de hibridacion. Por ejemplo, en un primer protocolo se utilizan 6 x SSC con 0,05 por ciento de pirofosfato sodico a una temperatura comprendida entre aproximadamente 35 °C y 63 °C, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, se lavan 14 sondas de base a 35-40 °C, 17 sondas de base a 45-50 °C, 20 sondas de base a 52-57 °C, y 23 sondas de base a 57-63 °C. Se puede aumentar la temperatura 2-3 °C cuando la union no espedfica de fondo resulta alta. En un segundo protocolo se utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para el lavado. Una solucion de lavado severa consiste en TMAC 3M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y 0,2% SDS.

Otro metodo para obtener una secuencia de acido nucleico adecuada que codifica una protema o protemas IL-1ra es la reaccion en cadena de polimerasa (PCR). En este metodo, se prepara ADNc a partir de poli(A)+ARN o ARN total utilizando la transcriptasa inversa de enzima. A continuacion, se anaden dos cebadores, tfpicamente complementarios de las dos regiones de ADN por separado (oligonucleotidos) que codifican la protema desdada, al ADNc junto con una polimerasa, como por ejemplo polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la region de ADNc entre los dos cebadores.

Las secuencias de oligonucleotido seleccionadas como sondas o cebadores deberan ser de la longitud adecuada y suficientemente no ambigua como para reducir al mmimo la cantidad de union no espedfica que pueda darse durante la deteccion selectiva o la amplificacion por PCR. La secuencia real de las sondas o cebadores se basa normalmente en las secuencias o regiones altamente homologas o conservadas. Opcionalmente, se pueden degenerar total o parcialmente las sondas o cebadores, es decir, pueden contener una mezcla de sondas/cebadores, que codifican todos ellos la misma secuencia de aminoacido, pero que utilizan diferentes

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codones para hacerlo. Una alternativa a la preparacion de sondas degeneradas consiste en colocar una inosina en alguna o en todas las posiciones de codon que vanan segun la especie. Las sondas o cebadores de oligonucleotido se pueden preparar a traves de metodos de smtesis qmmica para ADN tal como se describe en el presente documento.

Vectores

Se puede insertar ADN que codifica las protemas deseadas en vectores para posterior clonacion (amplificacion de ADN) o para expresion. Los vectores adecuados estan disponibles en el comercio o se pueden construir de manera espedfica. La seleccion o construccion de un vector apropiado dependera de (1) si se va a utilizar o no para amplificacion de ADN o para expresion de ADN, (2) el tamano del ADN que se va a insertar en el vector y (3) la celula hospedadora destinada a transformarse con el vector.

Los vectores implican tipicamente cada uno de ellos una secuencia de acido nucleico que codifica una protema deseada unida operativamente a una o mas de las siguientes secuencias reguladoras o de control de la expresion capaces de dirigir, controlar o afectar de otro modo a la expresion de una protema deseada a traves de una celula hospedadora seleccionada. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su funcion (amplificacion de ADN o expresion de ADN) y su compatibilidad con la celula hospedadora pretendida. Los componentes de vector incluyen generalmente, sin limitarse solo a ellos, uno o mas de los siguientes: una secuencia de senal, un origen de replicacion, uno o mas genes marcadores o de seleccion, un promotor, un elemento potenciador, una secuencia de terminacion de transcripcion y similares. Estos componentes pueden obtenerse a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar a traves de procedimientos conocidos.

Los ejemplos de vectores de clonacion procariotas adecuados incluyen bacteriofagos tales como derivados lambda, o plasmidos de Escherichia coli (por ejemplo, derivados de plasmido pBR322, col E1, pUC, el factor F y Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Se pueden utilizar tambien para este fin otros vectores de expresion apropiados de los que se conocen numerosos tipos dentro de la especialidad para las celulas hospedadoras que se describen a continuacion.

Secuencia senal

Se puede insertar el acido nucleico que codifica una secuencia senal en 5' de la secuencia que codifica una protema deseada, por ejemplo, puede ser un componente de un vector o puede formar parte de un acido nucleico que codifica la protema deseada. El acido nucleico que codifica la secuencia senal nativa de IL-1ra se conoce (patente de EE.UU. N.° 5.075.222).

Origen de replicacion

Los vectores de expresion y clonacion incluyen generalmente cada uno de ellos una secuencia de acido nucleico que permite la replicacion del vector en una o mas celulas hospedadoras seleccionadas. En un vector de clonacion, esta secuencia es tfpicamente aquella que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomico hospedador e incluye un origen de replicacion o una secuencia de replicacion autonomicamente. Dichas secuencias son muy conocidas. El origen de replicacion del plasmido pBR322 es adecuado para la mayona de las bacterias Gram-negativas, y son utiles diversos ongenes (por ejemplo, virus de simio 40 (SV40), polioma, adenovirus, VSV o BPV) para los vectores de clonacion en celulas de mamffero. Generalmente, el origen de replicacion no es necesario para los vectores de expresion de mairnfero (por ejemplo, el origen SV40 se utiliza frecuentemente solamente porque contiene el promotor temprano).

Gen de seleccion

Los vectores de expresion y clonacion contienen cada uno de ellos tfpicamente un gen de seleccion. Dicho gen codifica una protema “marcadora” necesaria para la supervivencia o crecimiento de las celulas hospedadoras transformadas cuando crecen en un medio de cultivo selectivo. Las celulas hospedadoras que no se transforman con el vector no contendran el gen de seleccion y por lo tanto, no sobreviviran en los medios de cultivo. Los genes de seleccion tfpicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexano o tetraciclina; (b) complementan las deficiencias auxotroficas o (c) suministran nutrientes cnticos no disponibles desde los medios de cultivo.

Se pueden utilizar otros genes de seleccion para amplificar los genes que se van a expresar. La amplificacion es el proceso donde los genes que son mas demandados para la produccion de una protema cntica para el crecimiento se reiteran en tandem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de celulas recombinantes. Entre los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mamffero se incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina quinasa. Los transformantes celulares quedan bajo la presion de seleccion de manera que solamente los transformantes se adaptan de manera unica para sobrevivir en virtud del marcador que esta presente en los vectores. La presion de seleccion se impone al cultivar las celulas transformadas en condiciones donde la concentracion del agente de seleccion en el medio logra cambiarse, lo que lleva a la amplificacion tanto del gen de

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seleccion como el ADN que codifica la protema deseada. Como resultado, se sintetizan mayores cantidades de la protema deseada desde el ADN amplificado.

Por ejemplo, las celulas transformadas con el gen de seleccion DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un antagonista competitivo de DHFR. Una celula hospedadora apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo silvestre es la lmea de celulas de ovario de hamster chino deficientes en actividad DHFR (Urlaub y Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77(7): 4216-4220. A continuacion, se exponen las celulas transformadas a mayores niveles de metotrexato. Esto lleva a la smtesis de multiples copias del gen DHFR y, de manera concomitante, a multiples copias de otro ADN presente en el vector de expresion, como el ADN que codifica una protema deseada.

Promotor

Los vectores de expresion y clonacion contendran tipicamente cada uno de ellos un promotor que se reconoce por el organismo hospedador y que esta unido operativamente a una secuencia de acido nucleico que codifica la protema deseada. Un promotor es una secuencia sin traducir localizada aguas arriba (5') del codon de partida de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripcion y la traduccion de una secuencia de acido nucleico en particular. Un promotor puede agruparse convencionalmente en una de las dos clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Un promotor inducible inicia mayores niveles de transcripcion desde ADN bajo su control como respuesta a ciertos cambios en las condiciones de cultivo, como por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Se conoce un gran numero de promotores, reconocidos a traves de una serie de celulas hospedadoras potenciales. Se puede unir operativamente un promotor a ADN que codifica una protema deseada separando el promotor del ADN fuente por digestion con enzima de restriccion e insertando la secuencia de promotor deseada. La secuencia de promotor IL-1ra nativa puede utilizarse para la amplificacion y/o la expresion directa del ADN que codifica una protema deseada. Es preferible un promotor heterologo, sin embargo, si permite una mayor transcripcion y mayores rendimientos de la protema expresada en comparacion con el promotor nativo y si es compatible con el sistema de celula hospedadora que ha sido seleccionado para su uso. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de las secuencias de promotor nativas de otros miembros de la familia IL-1 para la amplificacion directa y/o expresion del ADN que codifica una protema deseada.

Entre los promotores adecuados para su uso con hospedadores procariotas se incluyen sistemas de promotor de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptofano (trp); un sistema de gen de luminiscencia bacteriano (luxR) y promotores hubridos, como por ejemplo promotor tac. Tambien son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleotido se han publicado, lo que permite a las personas especializadas en este campo ligarlos con las secuencias de ADN deseadas empleando ligandos o adaptadores segun sea necesario para suministrar los sitios de restriccion necesarios.

Las secuencias de promotor adecuadas para su uso con hospedadores de levadura tambien se conocen dentro de la especialidad. Los promotores adecuados para su uso con celulas hospedadoras de mamffero se conocen y entre ellos se incluyen los obtenidos a partir de genomas de virus como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, mas preferentemente, SV40. Otros promotores de mamffero adecuados incluyen promotores de marnffero heterologos, por ejemplo, promotores de impacto por calor y promotor de actina.

Elemento potenciador

Los vectores de expresion y clonacion contendran tfpicamente cada uno de ellos una secuencia potenciadora para aumentar la transcripcion por eucariotas superiores de una secuencia de ADN que codifica una protema deseada. Los potenciadores son elementos de actuacion en cis de ADN, normalmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actuan en el promotor aumentando su transcripcion. Los potenciadores son relativamente independientes en orientacion y posicion. Se han encontrado en 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripcion. Ventajosamente, se utilizan potenciadores de levadura con promotores de levadura. Se conocen varias secuencias de potenciador disponibles a partir de genes de mairnfero (por ejemplo, globina, elastasa, albumina, alfa-feto- protema e insulina). Adicionalmente, otros ejemplos de elementos potenciadores para la activacion de promotores eucariotas son potenciadores virales como el potenciador SV40, el potenciador de promotor de citomegalovirus temprano, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus. Si bien se puede dividir un potenciador en un vector en la posicion 5' o 3' para un ADN que codifica una protema deseada, tfpicamente esta localizado en un sitio 5' desde el promotor.

Terminacion de la transcripcion

Los vectores de expresion usados en celulas hospedadoras eucariotas contendran cada uno de ellos tfpicamente una secuencia necesaria para la terminacion de la transcripcion y para la estabilizacion de ARNm. Tales secuencias estan disponibles comunmente desde las regiones sin traducir 5' y ocasionalmente 3' de los ADN o los ADNc eucariotas. Dichas regiones contienen segmentos de nucleotido transcritos como fragmentos poliadenilados en la

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porcion sin traducir del ARNm que codifica una protema deseada.

Construccion del vector

La construccion de un vector adecuado que contiene uno o mas de los componentes que se han enumerado (junto con la secuencia de codificacion deseada) puede llevarse a cabo a traves de tecnicas de ligacion normales. Se segmentan plasmidos aislados o fragmentos de ADN, se adaptan y se religan en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la secuencia correcta, se puede utilizar la mezcla de ligacion para transformar E. coli, y se pueden seleccionar los transformantes con exito a traves de tecnicas conocidas, tal como se ha descrito. A continuacion, se preparan cantidades del vector desde los transformantes, se analizan por digestion con endonucleasa de restriccion y/o se secuencian para confirmar la presencia del constructo deseado.

Se puede utilizar tambien un vector que proporciona la expresion transitoria del ADN que codifica una protema deseada en celulas de mairnfero. En general, la expresion transitoria implica el uso de un vector de expresion que es capaz de replicarse eficientemente en una celula hospedadora, de manera que la celula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresion y, a su vez, sintetiza altos niveles de la protema deseada codificada por el vector de expresion. Cada uno de los sistemas de expresion transitorios, que comprende un vector de expresion adecuado y una celula hospedadora, permite la identificacion positiva conveniente de las protemas que codifican los ADN clonados, asf como la rapida deteccion selectiva de dichas protemas para las propiedades biologicas o fisiologicas deseadas.

Celulas hospedadoras

En la presente invencion tambien se proporciona cualquiera de una diversidad de celulas hospedadoras recombinantes, que contiene cada una de ellas una secuencia de acido nucleico para su uso en la expresion de una protema deseada. Las celulas hospedadoras procariotas y eucariotas ejemplares incluyen celulas de bacterias, de marnfferos, de hongos, de insectos, de levaduras o de vegetales.

Las celulas hospedadoras procariotas incluyen, pero no se limitan a, eubacterias tales como organismos Gram- negativos o Gram-positivos (por ejemplo, E. coli (HB101, DH5a, DH10, y MC1061); Bacilli spp. tales como B. subtilis; Pseudomonas spp. tales como P. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella spp. tales como S. typhimurium; o Serratia spp. tales como S. marcescans. En una realizacion espedfico, la protema deseada puede expresarse en E. coli.

Ademas de las celulas hospedadoras procariotas, la protema o protemas IL-1ra pueden expresarse en la forma glucosilada a traves de cualquiera entre una serie de celulas hospedadoras adecuadas derivadas de organismos multicelulares. Tales celulas hospedadoras son capaces de un procesado complejo y actividades de glucosilacion. En principio, podna utilizarse cualquier cultivo de celulas eucariotas superiores, pudiendo implicar dicho cultivo tanto celulas de vertebrado como de invertebrado, incluyendo celulas vegetales y de insecto. Pueden ser hospedadores adecuados para la expresion de una protema deseada microbios eucariotas como hongos filamentosos o levaduras. Saccaromyces cerevisiae, o levadura de panadero comun, es la que se utiliza mas comunmente dentro de los microorganismos hospedadores eucariotas inferiores, si bien se conoce una serie de otros generos, especies y cepas diversos y se dispone de ellos comunmente.

Pueden usarse celulas de vertebrado, ya que la propagacion de las celulas de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) es un procedimiento muy conocido. Los ejemplos de lmeas celulares hospedadoras de marnffero utiles incluyen, pero no se limitan a, lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7), lmea de rinon embrionico humano (celulas 293 o celulas 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspension), celulas de rinon de hamster bebe y celulas de ovario de hamster chino. Otras lmeas de celula de mamffero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, HeLa, celulas L-929 de raton, lmeas 3T3 derivadas de ratones suizos, Balb-c o NIH, y lmeas de celulas de hamster BHK o HaK. En un modo de realizacion espedfico, se puede expresar una protema deseada en celulas COS o en celulas de baculovirus.

Puede transfectarse una celula hospedadora y transformar preferentemente con un acido nucleico deseado en condiciones apropiadas que permitan la expresion del acido nucleico. La seleccion de las celulas hospedadoras adecuadas y los metodos de transformacion, cultivo, amplificacion, deteccion selectiva y produccion y purificacion de producto son muy conocidas dentro de la especialidad (Gething y Sambrook (1981), Nature, 293: 620-625 o alternativamente, Kaufman y cols. (1985), Mol. Cell. Biol. 5(7): 1750-1759 o la patente de EE.UU. N.° 4.419.446. Por ejemplo, puede utilizarse la precipitacion con fosfato de calcio para celulas de mamffero sin paredes celulares. Tambien pueden usarse tecnicas como electroporacion, micro-inyeccion y otras tecnicas conocidas.

Tambien es posible que la protema deseada se obtenga por recombinacion homologa o a traves de metodos de produccion recombinantes utilizando elementos de control introducidos en las celulas que ya contienen ADN que codifica la protema deseada. La recombinacion homologa es una tecnica desarrollada originalmente para genes diana para inducir o corregir mutaciones en genes activos transcripcionalmente (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36: 301). La tecnica basica fue desarrollada como un metodo para introducir mutaciones

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espedficas en regiones espedficas del genoma de mairnfero (Thomas y cols., (1986), Cell, 44:419-428; Thomas y Capecchi (1987), Cell 51: 503-512 y Doetschman y cols. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8583-8587) o para corregir mutaciones espedficas dentro de genes defectuosos (Doetschman y cols. (1987), Nature, 330: 576-578). En la patente de EE.UU. N.° 5.272.071; el documento WO 92/01069; el documento Wo 93/03183; el documento WO 94/12650 y el documento WO 94/31560 se describen tecnicas ejemplares.

Cultivo de celulas hospedadoras

El metodo para cultivar cada una de las una o mas celulas hospedadoras recombinantes para la produccion variara dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento de produccion optimo para una situacion dada sera evidente para aquellos expertos en la materia a traves de una experimentacion minima. Tales celulas hospedadoras recombinantes se cultivan en un medio adecuado y a continuacion, opcionalmente, se recupera, afsla y purifica la protema expresada desde el medio de cultivo (o desde la celula, si se expresa intracelularmente) a traves de medios adecuados conocidos por los expertos en la materia.

Espedficamente, puede cultivarse cada una de las celulas recombinantes utilizadas para producir una protema deseada en un medio adecuado para inducir promotores, seleccionar celulas hospedadoras recombinantes adecuadas o amplificar el gen que codifica la protema deseada. El medio puede estar suplementado segun sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidermico), sales (como cloruro sodico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleosidos (como adenosina y timidina), antibioticos (como gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorganicos normalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa y otras fuentes de energfa. Se pueden incluir tambien otros suplementos en condiciones adecuadas, tal como podran apreciar los expertos en la materia. Asimismo, los expertos en la materia conoceran las condiciones de cultivo adecuadas, tales como la temperatura, el pH y similares, para su uso con las celulas hospedadoras seleccionadas.

El producto de expresion resultante puede purificarse despues proximo a la homogeneidad aplicando procedimientos conocidos en la tecnica. En la patente de EE.UU. N.° 5.075.222 y el documento WO 91/08285 se ensenan tecnicas de purificacion ejemplares. Preferentemente, se obtiene el producto de expresion en una forma sustancialmente pura. “Sustancialmente pura” significa que IL-1ra, en una forma sin modificar, tiene una actividad espedfica comparativamente alta, preferentemente en el intervalo de aproximadamente 150.000 - 500.000 unidades de receptor/mg como se define en Hannum y cols. (1990), Nature, 343: 341-340 y Eisenberg y cols. (1990), Nature, 343: 341-346, ambas de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia

Composiciones farmaceuticas

Se describen preparaciones farmaceuticas que contienen cada una de ellas cantidades efectivas terapeutica o profilacticamente de una protema o protemas IL-1ra o un derivado qmmico de las mismas (denominado de forma colectiva “producto o productos de protema IL-1ra”) en combinacion con un vehmulo. Entre los vedculos se incluyen preferentemente uno o mas materiales de formulacion farmaceutica o fisiologicamente aceptables en combinacion con el producto o productos de protema IL-1ra.

El disolvente primario en el vedculo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Ademas, el vedculo puede contener excipientes farmaceuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, preferentemente entre 6,0 y 7,0, mas preferentemente 6,5 (por ejemplo, tampones como citratos o fosfatos y aminoacidos como glicina); viscosidad; transparencia; color; esterilidad; estabilidad (por ejemplo, sacarosa y sorbitol); olor; velocidad de disolucion (por ejemplo, solubilizantes o agentes de solubilizacion como alcoholes; polietilenglicoles y cloruro sodico), velocidad de liberacion; asf como agentes de volumen para formulaciones liofilizadas (por ejemplo, manitol y glicina), agentes tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80, triton y pluronics); antioxidantes (por ejemplo, sulfito sodico e hidrogeno sulfito sodico); conservantes (por ejemplo, acido benzoico y acido salidlico); agentes aromatizantes y de dilucion; agentes emulsionantes; agentes de suspension; disolventes; cargas; vedculos de administracion y otros adyuvantes y/o excipientes farmaceuticos. Se preven tambien otras formas de administracion eficaces, como por ejemplo formulaciones parenterales de liberacion lenta, nebulizadores de inhalacion, formulaciones oralmente activas, o supositorios. La composicion tambien puede implicar preparaciones en partmulas de compuestos polimericos como polfmeros de erosion en volumen (por ejemplo, copolfmeros de poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), mezclas de polfmero PLGA, copolfmeros de bloque de PEG, y acido lactico y glicolico, poli(cianoacrilatos)); polfmeros de erosion superficial (por ejemplo, poli(anddridos) y poli(orto esteres)); esteres de hidrogel (por ejemplo, polialcoholes pluronicos, poli(alcohol vimlico), poli(vinil pirrolidona), copolfmeros de anddrido maleico-eter alquil vimlico, celulosa, derivados de acido hialuronico, alginato, colageno, gelatina, albumina y almidones y dextranos) y sistemas de composicion de los mismos; o preparaciones de liposomas o macroesferas. Tales composiciones pueden influir en el estado ffsico, la estabilidad, la velocidad de liberacion in vivo y la velocidad de eliminacion in vivo de las protemas y derivados de la presente invencion. La formulacion farmaceutica optima para la protema deseada se determinara por los expertos en la materia dependiendo de la ruta de administracion y la dosis deseada. En Remiginton's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, paginas 1435-1712; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem. 6: 332-351; documento WO 94/06457; Leone-Bay y cols. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38: 4263-4269; Haas, y cols. (1995), Clinical Immunology

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and Immunopathology, 76(1): 93; documento WO 94/21275; documento FR 2706772; documento WO 94/21235 y documento Wo 97/28828 se describen ejemplos de composiciones farmaceuticas.

Las composiciones de liberacion sostenida espedficas estan disponibles de los siguientes proveedores: Depotech (Depofoam™, un liposoma multivesicular) y Alkermes (ProLease™, una microesfera PLGA). En Peyron y Balazs (1974), Path. Biol. , 22(8): 731-736; Isdale y cols. (1991), J. Drug. Dev., 4(2): 93-99; Larsen y cols. (1993), Journal of Biomedical Materials Research 27: 1129-1134; Namiki, y cols. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11): 501-507; Meyer y cols. (1995), Journal o Controlled Release, 35: 67-72; Kikuchi y cols. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4:99-110; Sakakibara y cols. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299 :282-292; Meyers and Brandt (1995), 22(9): 1732-1739; Laurent y cols., (1995), Acta Orthop Scand, 66(266): 116-120; Cascone y cols.(1995), Biomaterials, 16(7): 569-574; Yerashalmi y cols. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2):: 267-273; Bernatchez y cols., (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5): 677-681; Tan y cols. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1): 38-43; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332-351; las patentes de EE.UU. N.° 4.582.865; 4.605.691; 4.636.524; 4.713.448; 4.716.154; 4.716.224; 4.772.419; 4.851.521; 4.957:774; 4.863:907; 5.128:326; 5.202.431; 5.336.767; 5.356.883; las solicitudes de patente europeas N.° 0.507.604 A2 y 0.718.312 A2; y el documento WO 96/05845 se describen formas de hialuronano ejemplares. Las composiciones de hialuronano espedficas estan disponibles de los siguientes proveedores: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (Synvisc™, una mezcla 90:10 de un fluido hialino y un gel hialino); Fidia S.p.A.; Abano Terme, Italia (Hyalgan™, la sal sodica de un acido hialuronico derivado de cresta de gallo(~500.000 a ~700.000 MW)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Tokio, Japon (Artz™, una solucion al 1 % de un acido hialuronico derivado de cresta de gallo, ~ 700.000 MW); Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia (Healon™ un acido hialuronico derivado de cresta de gallo, ~4 x 106 MW); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoat, un acido hialuronico recombinante); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, Nh (Acido hailuronico FCH, un alto peso molecular (por ejemplo, ~1,5-2,2x106 MW) acido hialuronico preparado a partir de cultivos de Streptococcus zooepidemicus; Hialuronato sodico MW, ~1,0-1,6 x106 PM y hialuronato sodico LV, ~1,5-2,2 x 106 MW); Calbiochem- Novabiochem AB, Lautelfingen, Suiza (acido hialuronico, sal sodica (numero de catalogo de la empresa 1997, 385908) preparado partir de Streptococcus sp.); Intergen Company, Purchase, NY (un acido hialuronico derivado de cresta de gallo, >1 x 106 MW); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp. Edison, NJ and Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Tokio, Japon.

Otra formulacion farmaceutica espedfica es citrato sodico 10 milimolar, cloruro sodico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1 % (p/p) en agua, pH 6,5 (“formulacion de tampon citrato”). Otra formulacion espedfica es fosfato sodico 10 milimolar, cloruro sodico 140 milimolar, entre 0,1 % (p/p) y polisorbato al 0,01 % (p/p) en agua y opcionalmente, EDTA 0,5 milimolar, pH 6,5 (“formulacion de tampon fosfato”). Otra formulacion espedfica mas consiste en fluido hialino H-10™, un acido hialuronico reticulado (Biomatrix, Inc., Ridgefield, Inc.) para conseguir 100 mg/ml de IL-1ra y acido hialuronico al 2% (Mr> 4 x 106).

Una vez formulada la composicion farmaceutica, puede almacenarse en viales esterilizados en forma de solucion, suspension, gel, emulsion, solido o en un polvo liofilizado o deshidratado. Tales composiciones pueden almacenarse bien en una forma lista para su uso o bien en una forma que requiera la reconstitucion antes de su administracion (por ejemplo, liofilizada).

La presente invencion puede emplear kits para producir una unidad de administracion de una sola dosis. Los kits pueden contener cada uno de ellos tanto un primer recipiente que tiene una protema deshidratada como un segundo recipiente que tiene una formulacion acuosa. Los kits incluidos dentro del alcance de la presente invencion son jeringuillas de una sola camara o de varias camaras previamente cargadas; las jeringuillas precargadas ejemplares (por ejemplo, jeringuillas lfquidas y lio-jeringuillas como Lyo-Ject®, una liojeringuilla precargada de camara dual) estan disponibles de Vetter GmbH, Ravensburgo, Alemania.

Usos

El producto o productos de protema IL-1ra pueden ser utiles como reactivos de investigacion y agentes terapeuticos y de diagnostico. De esta manera, el producto o productos de protema IL-1ra pueden usarse en ensayos diagnosticos in vitro y/o in vivo para cuantificar la cantidad de IL-1 en una muestra de tejido o de organo para determinar y/o aislar celulas que expresen IL-1. En ensayos de tejidos u organos habra menos radiactividad a partir de un producto o productos de protema IL-1ra-125I que se unan a IL-1, en comparacion con una curva de union patron de un producto o productos de protema IL-1ra-125I, debido a la union de IL-1ra nativa sin marcar a IL-1. Similarmente, el uso de un producto o productos de protema IL-1ra-125I puede usarse para detectar la presencia de IL-1 en diversos tipos celulares.

Se describe el uso de producto o productos de protema IL-1ra en la generacion de anticuerpos y los anticuerpos resultantes (incluyendo espedficamente aquellos que tambien se unen a IL-1ra nativa). Pueden desarrollarse anticuerpos que se unen a producto o productos de protema IL-1ra. Un experto en la materia puede usar procedimientos publicados bien conocidos para obtener anticuerpos monoclonales, policlonales o anticuerpos recombinantes, que reconocen y se unen espedficamente a las diversas protemas codificadas por las secuencias de aminoacidos de la presente invencion. Tales anticuerpos pueden usarse despues para purificar y caracterizar la

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IL-1ra nativa.

La presente invencion tambien se refiere a usos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de ciertas enfermedades y afecciones medicas (muchas de los cuales pueden caracterizarse como enfermedades inflamatorias) que estan mediadas por IL-1, as^ como a las secuelas y smtomas relacionados asociados a las mismas. Una lista no exhaustiva de las enfermedades mediadas por interleucina-1 (IL-1) agudas o cronicas incluye pero no se limita a las siguientes: ALS, enfermedad de Alzheimer, asma, aterosclerosis, caquexia/anorexia; smdrome de fatiga cronica, depresion, diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo I de inicio en la juventud y diabetes melitus); fiebre, fibromialgia o analgesia; glomerulonefritis; rechazo de injerto frente a hospedador; choque hemorragico; hiperalgesia, enfermedad intestinal inflamatoria; lesion isquemica, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesion cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, que pueden conducir a neurodegeneracion); enfermedades del pulmon (por ejemplo, ARDS y fibrosis pulmonar); mieloma multiple; esclerosis multiple; leucemia mielogena (por ejemplo, AML y CML) y otras leucemias; miopatfas (por ejemplo, metabolismo de protema muscular, esp., en sepsis), enfermedades oculares, osteoporosis; enfermedad de Parkinson; dolor, pancreatitis, parto prematuro; psoriasis; lesion por reperfusion; enfermedades reumaticas (por ejemplo, artritis reumatoide; osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis enteropatica, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistemica, vasculitis, vasculitis cerebral, enfermedad de Lime, artritis inducida por estafilococos (“septica”), Smdrome de Sjogren, fiebre reumatica, policondritis y polimialgia reumatica y artritis de celula gigante); shock septico; efectos colaterales de terapia de radiacion; enfermedad de articulacion mandibular temporal; metastasis de tumor; o estado inflamatorio como resultado de una torcedura, tension, dano de cartflago, trauma, cirugfa ortopedica, infeccion y otros procesos de la enfermedad.

Los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-1ra e IL-1ra) pueden administrarse a un paciente en cantidades terapeuticamente eficaces para prevenir o tratar enfermedades mediadas por IL-1 incluyendo enfermedades reumaticas. Se pretende que el termino “paciente” incluya animales (por ejemplo, gatos, perros y caballos) asf como seres humanos.

Ademas, los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-1ra e IL-1ra) pueden administrarse por via topica, enterica o parenteral incluyendo sin limitarse solo a ellas, por infusion, intraarterial, intraarticular, intracapsular, intracardiaca, intradermica, intramuscular, intraorbital, intratecal, intravenosa, intraperitoneal, intraespinal, inyeccion intrasternal, intraventricular, subcutanea, subcuticular, subcapsular, subaraquinoide y transtraqueal. Los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-1ra e IL-1ra) pueden administrarse tambien por administracion oral o se pueden administrar a traves de membranas mucosas es decir, por via bucal, intranasal, rectal o sublingual para administracion sistemica.

Es preferible que los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) se administren por via intraarticular, subcutanea, intramuscular o inyeccion intravenosa. Adicionalmente, los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-an IL-1ra e IL-1ra) pueden administrase por infusion continua (por ejemplo, dispositivos de modulacion de flujo por infusion externa o implantados de forma constante o intermitente) de manera que proporcionen continuamente el nivel deseado de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en la sangre durante el tiempo que dure la administracion. Esto se puede llevar a cabo por medio de una mini-bomba, como por ejemplo una mini-bomba osmotica. De esta forma, es posible asegurar que se mantiene la cantidad de los farmacos en el nivel deseado y es posible tomar muestras de sangre y llevar un control de la cantidad de farmaco en la corriente sangumea. En el comercio se dispone de varias bombas, como por ejemplo de proveedores como MiniMed Inc., Sylmar, CA (por ejemplo, MT507) y Alza Corp., Palo Alto CA (por ejemplo, bomba osmotica Alzet, modelo 2ML1).

Tambien se contempla la puesta en practica de otros modos de dosificacion continua o proxima a la continua. Por ejemplo, la formacion de derivados qmmicos puede tener como resultado formas de liberacion sostenida de la protema que tienen el efecto de mantener una presencia continua en la corriente sangumea, en cantidades predecibles en funcion de un regimen de dosis determinado.

Los modos de utilizacion de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra eIL- 1ra) para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo enfermedades reumaticas (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriasica y artritis reumatoide) se exponen en la solicitud de patente australiana Au 9173636, las ensenanzas de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. A modo de ejemplo, pero sin limitacion, en una realizacion espedfica se pueden administrar los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) intra-articularmente para el tratamiento de artritis reumatoide y osteoartritis. A modo de ejemplo pero sin limitacion, en otra realizacion espedfica, se pueden administrar los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) subcutaneamente o intramuscularmente para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, esclerosis multiple, mieloma multiple o leucemias mielogenosa (por ejemplo, AML y CML) y otras leucemias. A modo de ejemplo, pero sin limitacion, en otra realizacion espedfica mas pueden administrarse los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) por via intravenosa para el tratamiento de lesion cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, o para el tratamiento de

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enfermedad de hospedador frente a injerto; o se pueden administrar por v^a interventricular para el tratamiento de lesion cerebral como resultado de traumatismo.

En otra realizacion, tambien se contempla la terapia celular, por ejemplo, la implantacion de celulas que producen un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an lL-1ra e IL-1ra). Esta realizacion de la presente invencion puede incluir implantar en pacientes celulas que son capaces de sintetizar y secretar un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra). Tales celulas que producen un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) pueden ser celulas que normalmente no producen un inhibidor de IL-1 pero que se han modificado para producir un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra). Las celulas tambien pueden ser celulas cuya capacidad para producir un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) se ha aumentado por transformacion con un polinucleotido adecuado para la expresion y la secrecion de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra). Para minimizar una reaccion inmunologica posible en pacientes administrando un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) de una especie extrana, se prefiere que las celulas sean de la misma especie que el paciente (por ejemplo, humana) o que las celulas se encapsulen con un material que proporcione una barrera contra el reconocimiento inmune, o que las celulas se coloquen en una localizacion inmunologicamente privilegiada, tal como en el testmulo, en el ojo o en el sistema nervioso central.

Las celulas humanas o animales distintas de humanas pueden implantarse en pacientes en envueltas o membranas polimericas semipermeables biocompatibles para permitir la liberacion de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra), pero para prevenir la destruccion de las celulas por el sistema inmune del paciente o por otros factores en detrimento desde el tejido circundante. Alternativamente, las propias celulas del paciente, transformadas ex vivo para producir un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra), pueden implantarse directamente en el paciente sin tal encapsulacion. La metodologfa para la encapsulacion de membrana de celulas vivas es familiar para aquellos expertos en la materia, y la preparacion de celulas encapsuladas y su implantacion en pacientes pueden lograrse.

Incluso en otra realizacion, tambien se contempla la terapia genica in vivo, en la que una secuencia de acido nucleico que codifica un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) se introduce directamente en un paciente. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico que codifica un inhibidor de IL- 1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) se introduce en celulas diana a traves de la inyeccion local de una construccion de acido nucleico, con o sin un vector de transporte apropiado, tal como un vector vmco adenoasociado. Los vectores vmcos alternativos incluyen pero no se limitan a vectores de retrovirus, adenovirus, virus del herpes simplex y virus del papiloma. La transferencia ffsica puede lograrse in vivo por inyeccion local de la construccion deseada de acido nucleico u otro vector de transporte apropiado que contenga la secuencia de acido nucleico deseada, transferencia mediada por liposomas, inyeccion directa (ADN desnudo), transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN) o bombardeo de micropartmulas (pistola genica).

Las tecnicas de terapia celular y genica ejemplares se desvelan en la Patente de EE.UU. N.° 4.892.538; la Patente de EE.UU. N.° 5.011.472; la Patente de EE.UU. N.° 5.106.627; el documento DE 4219626, el documento WO 94/20517 y el documento 96/22793.

Independientemente de la manera de administracion, el tratamiento de una enfermedad mediada por IL-1 requiere una dosis o un regimen de dosis total de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) eficaz para reducir o aliviar los smtomas de la enfermedad. Los factores que determinan la dosificacion apropiada o el regimen de dosis total pueden incluir la enfermedad o afeccion que se vaya a tratar o prevenir, la severidad de la enfermedad y la ruta de administracion, asf como la edad, el sexo y el estado medico del paciente.

El experto en la materia podra afinar mejor los calculos necesarios para determinar la dosificacion apropiada para el tratamiento de manera rutinaria, especialmente a la luz de la informacion sobre la dosificacion y los ensayos que se describen en el presente documento. La frecuencia de la dosificacion dependera de los parametros farmacocineticos del producto o productos del inhibidor IL-1 (por ejemplo, un IL-an IL-1ra) en la formulacion utilizada. Los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) puede administrarse de una vez, o en los casos de trastornos graves o prolongados, se puede administrar de forma diaria en dosis menos frecuentes o se puede administrar con una dosis de bolo inicial seguido de una dosis continua o una administracion sostenida. Tambien se contempla la puesta en practica de otros modos de dosificacion continua o proxima a la continua. Por ejemplo, la formacion de un derivado qrnmico puede tener como resultado una forma de liberacion sostenida que tiene el efecto de mantener una presencia continua en la corriente sangumea, en cantidades predecibles en funcion de una dosis o un regimen de dosis total determinado. La dosis o regimen de dosis total se podra determinar tambien a traves del uso de ensayos conocidos para determinar las dosis utilizadas en combinacion con los datos de respuesta a dosis apropiados.

Cuando se administra por via parenteral, cada dosis unitaria, por ejemplo, puede consistir en hasta 200 mg, generalmente hasta 150 mg y mas generalmente hasta 100 mg. Cuando se administra en una cavidad articular, la

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composicion farmaceutica se administra preferentemente en una sola inyeccion desde una jeringuilla de 3 a 10 ml que contiene una dosis, por ejemplo, de hasta 200 mg/ml, generalmente de hasta 150 mg y mas generalmente de hasta 100 mg de producto IL-1 disuelto en solucion salina isotonica tamponada con fosfato. La preparacion se puede administrar en una cavidad articular a una frecuencia por ejemplo de una vez cada 7 a 10 dfas. Segun dicho modo, se lleva a cabo la administracion de modo continuo, por ejemplo de 4 a 5 veces, al mismo tiempo que se vana la dosis, si es necesario.

Como se contempla por la presente invencion, puede administrarse un producto inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) como adjunto de otra terapia y tambien con otras formulaciones farmaceuticas adecuadas para la indicacion que se este tratando. Puede administrarse un producto inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) y cualquiera de una o mas terapias adicionales o puede administrarse formulaciones farmaceuticas separadamente o en combinacion.

En una realizacion espedfica, la presente invencion se dirige al uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento y tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas inhibidores de TNF para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL- 1, incluyendo inflamacion aguda y cronica como caquexia/anorexia; smdrome de fatiga cronica; depresion, diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo I de inicio en la juventud y diabetes melitus); fibromialgia o analgesia; rechazo de hospedador frente a injerto; hiperalgesia, enfermedad intestinal inflamatoria; lesion isquemica, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesion cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o accidente crebrovascular, que pueden conducir a neurodegeneracion); enfermedades del pulmon (por ejemplo, ARDS y fibrosis pulmonar); esclerosis multiple; enfermedades oculares; dolor, pancreatitis; lesion por reperfusion; enfermedades reumaticas (por ejemplo, artritis reumatoide; osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis enteropatica, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistemica, vasculitis, vasculitis cerebral, enfermedad de Lime, artritis inducida por estafilococos (“septica”), smdrome de Sjogren, fiebre reumatica, policondritis y polimialgia reumatica y artritis de celula gigante); shock septico; efectos colaterales de terapia de radiacion; enfermedad de articulacion mandibular temporal; metastasis de tumor; o estado inflamatorio como resultado de una torcedura, tension, dano de cartflago, trauma, cirugfa ortopedica, infeccion y otros procesos de enfermedad. Tales inhibidores de TNF incluyen compuestos y protemas que bloquean la smtesis in vivo o la liberacion extracelular del TNF. En una realizacion espedfica, la presente invencion se dirige al uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas de los siguientes inhibidores de TNF: protemas de union a TNF (receptor TNF soluble tipo I y receptor TNF soluble tipo II ("sTNFR"), como se define en el presente documento), anticuerpos anti-TNF, factor estimulante de colonias de granulocitos; talidomida; BN 50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401; peptido T; MDL 201,449A; clorhidrato de (1R,3S)-Cis-1-[9-(2,6-diaminopurinil)]-3- hidroxi-4-ciclopenteno; (1R,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)purina]-3-acetoxiciclopentano; clorhidrato de (1R,3R)-trans-1- [9-adenil)-3-azidociclopentano y (1R,3R)-trans-1-[6-hidroxi-purin-9-il)-3-azidociclopentano.

Las protemas de union a TNF se desvelan en la tecnica (documentos EP 308 378, EP 422 339, GB 2 218 101, EP 393 438, WO 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, WO 91/03553, EP 418 014, JP 127.800/1991, EP 433 900, Patente de EE.UU. N.° 5.136.021, GB 2 246 569, EP 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, WO 93/07863, EP 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417 563, Solicitud PCT Internacional N.° PCT/US97/12244).

Por ejemplo, los documentos EP 393 438 y EP 422 339 ensenan las secuencias de aminoacidos y de acidos nucleicos de un sTNFR-I (denominado en la solicitud “inhibidor de TNF de 30 kDa”) y un sTNFR-II (denominado en la solicitud “inhibidor de TNF de 40 kDa”) asf como formas modificadas de los mismos (por ejemplo, fragmentos, derivados funcionales y variantes). El documento EP 393 438 y el documento EP 422 339 tambien desvelan metodos para aislar los genes responsables de codificar los inhibidores, clonar el gen en vectores adecuados y tipos celulares y expresar el gen para producir los inhibidores. Adicionalmente, se han desvelado tambien formas polivalentes (es decir, moleculas que comprenden mas de un resto activo) de sTNFR-I y sTNFR-II. En una realizacion, la forma polivalente puede construirse, por ejemplo, por acoplamiento qrnmico de al menos un inhibidor de TNF y otro resto qrnmico con cualquier conector clmicamente aceptable, por ejemplo polietilenglicol (documento WO 92/16221 y documento WO 95/34326), mediante un conector peptfdico (Neve et al. (1996), Cytokine, 8(5):365- 370), acoplando qmmicamente a biotina y despues uniendo a avidina (documento WO 91/03553) y finalmente, construyendo moleculas de anticuerpo quimerico (Patente de EE.UU. 5.116.964, documento WO 89/09622, documento WO 91/16437 y documento EP 315062).

Los anticuerpos anti-TNF incluyen anticuerpo MAK 195F Fab (Holler y col. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147); anticuerpo monoclonal CDP 571 anti-TNF (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342); anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral murino BAY X 1351 (Kieft y coll.(1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9); anticuerpo monoclonal anti-TNF CenTNF cA2 (Elliott y col. (1994), Lancet, 344:1125-1127 y Elliott y col. (1994), Lancet, 344:1105-1110).

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Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con el antigeno fas humano secretado o soluble o versiones recombinantes del mismo (documento WO 96/20206 y Mountz et al., J. Immunology, 155:48294837; y el documento EP 510 691). El documento WO 96/20206 desvela el antigeno fas humano secretado (nativo y recombinante, incluyendo una protema de fusion Ig), metodos para aislar los genes responsables de codificar el antigeno fas humano recombinante soluble, metodos para clonar el gen en vectores y tipos celulares adecuados y metodos para expresar el gen para producir los inhibidores. El documento EP 510 69l ensena ADN que codifican para el antigeno fas humano, incluyendo el antigeno fas soluble, vectores que expresan dichos ADN y transformantes transfectados con el vector. Cuando se administran parenteralmente, las dosis de una protema de fusion de antigeno fas soluble o secretado son cada una generalmente de aproximadamente 1 microgramo/kg a aproximadamente 100 microgramos/kg.

El tratamiento de la presente invencion de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamacion cronica y aguda tales como enfermedades reumaticas incluye el uso de farmacos de primera lmea para controlar el dolor y la inflamacion clasificados como farmacos anti-inflamatorios no esteroides (AINE). Los tratamientos secundarios incluyen corticosteroides, farmacos antireumaticos de lenta actuacion (SAARD) y farmacos de modificacion de la enfermedad (DM). La informacion referente a estos compuestos se puede encontrar en el Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16a edicion, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) y en Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.

La presente invencion se dirige al uso de un inhibidor de IL-1 y un anticuerpo monoclonal anti-IL-1) y metotrexato para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1 como se define en las reivindicaciones 1, 5 y 7- Los AINE deben su accion antiinflamatoria, al menos en parte, a la inhibicion de la smtesis de prostaglandina ((Goodman y Gilman en "The Pharmacological Basis of Therapeutics," MacMillan 7th Edition (1985)). Los AINE pueden caracterizarse en nueve grupos: (1) derivados del acido salidlico; (2) derivados del acido propionico; (3) derivados del acido acetico; (4) derivados del acido fenamico; (5) derivados del acido carboxflico; (6) derivados del acido butmco; (7) oxicams; (8) pirazoles y (9) pirazolonas.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas derivados de acido salidlico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Tales derivados de acido salidlico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: acetaminosalol, aloxiprina, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato calcico, difusinal trisalicilato magnesico colina, etersalato, fendosal, acido gentfsico, glicolsalicilato, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, acido O-acetico de salicilamida, salsalato y sulfasalazina. Los derivados de acido salidlico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas derivados de acido propionico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido propionico, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: alminoprofeno, benoxaprofeno, acido bucloxico, carprofeno, dexindoprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, furcloprofeno, ibuprofeno, ibuprofeno de aluminio, ibuproxam, indoprofeno, isoprofeno, cetoprofeno, loxoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, picetoprofeno, pimeprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, acido protizfnico, piridoxiprofeno, suprofeno, acido tiaprofenico y tioxaprofeno. Los derivados de acido propionico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas derivados de acido acetico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido acetico, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: acemetacina, alclofenac, amfenac, bufexamac, cinmetacina, clopirac, delmetacina, diclofenac sodico, etodolac, felbinac, fenclofenac, fenclorac, acido fenclozico, fentiazac, furofenac, glucametacina, ibufenac, indometacina, isofezolac, isoxepac, lonazolac, acido metiadnico, oxametacina, oxpinac, pimetacina, proglumetacina, sulindac, talmetacina, tiaramida, tiopinac, tolmetina, zidometacina y zomepirac. Los derivados de acido acetico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas derivados de acido fenamico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido fenamico, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: acido enfenamico, etofenamato, acido flufenamico, isonixina, acido meclofenamico, meclofenamato sodico, acido

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medofenamico, acido mefanamico, acido niflumico, talniflumato, terofenamato, acido tolfenamico y ufenamato. Los derivados de acido fenamico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas derivados de acido carboxflico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido carboxflico, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: clidanac, diflunisal, flufenisal, inoridina, cetorolac y tinoridina Los derivados de acido carboxflico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas derivados de acido butmico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido butmico, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizona, butibufeno, fenbufeno y xenbucina. Los derivados de acido butmco estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas oxicamos, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los oxicamos, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicam, enolicam, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam y 4-hidroxil-1,2-benzotiazina 1,1 -dioxido de 4-(N-fenil)-carboxamida. Los oxicamos estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas pirazoles, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los pirazoles, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: difeminazol y epirizol. Los pirazoles estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de una o mas pirazolonas, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de las mismas. Las pirazolonas, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de las mismas comprenden: apazona, azapropazona, bezpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenylbutazona, pipebuzona, propilfenazona, ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona. Las pirazolonas estructuralmente relacionadas que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de los siguientes AINE: acido £-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, acido 3-amino-4-hidroxibutmco, amixetrina, anitrazafeno, antrafenina, bendazac, lisinato de bendazac, benzidamina, beprozina, broperamol, bucoloma, bufezolac,

ciproquazona, cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidina, difenpiramida, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizol, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixina, fluproquazona, fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guaiazolena, isonixirna, lefetamina HCl, leflunomida, lofemizol, lotifazol, clonixinato de lisina,

meseclazona, nabumetona, nictindola, nimesulida, orgoteina, orpanoxina, oxaceprolm, oxapadol, paranilina,

perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxime, piproxeno, pirazolac, pirfenidona, proquazona, proxazol, tielavina B,

tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamida y aquellos designados por el numero de codigo de comparua tales como 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (acido 4-benzoil-1-indancarboxflico), TVX2706, U60257, UR2301 y WY41770. Los AINE estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas corticosteroides, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamacion aguda y cronica tales como enfermedades reumatica,s enfermedad de injerto frente a hospedador y esclerosis multiple. Los corticosteroides, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos incluyen hidrocortisona y compuestos que derivan de hidrocortisona, tales como 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona,

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betametasona, valerato de betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacon, desonida, desoximerasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, flumetasona pivalato, flunisolida, acetonida flucinolona, fluocinonida, fluorocinolona acetonida, butilo de fluocortina, fluocortolona, hexanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednidane, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, succinato de hidrocortisona 21-sodica, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednicolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato de prednisolona sodica, succinato de prednisolona sodica, 21-m-sulfobenzoato de prednisolona sodica, 21-estearoglicolato de prednisolona sodica, tebutato de prednisolona, 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, 21- dietilaminoacetato de prednilideno, tixocortol, triamcinolona, triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida y triamcinolona hexacetonida. Los corticosteroides estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas farmacos antirreumaticos de actuacion lenta (SAARD) o farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (DMARD), esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamacion aguda y cronica tales como enfermedades reumaticas enfermedad de injerto frente a hospedador y esclerosis multiple. Los SAARD o DMARD, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden alocupreido sodico, auranofina, aurotioglucosa, aurotioglucanido, azatioprina, brequinar sodico, bucilamina, 3-aurotio-2-propanol-1-sulfonato calcico, clorambucilo, cloroquina, clobuzarit, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosporina, dapsona, 15-desoxiespergualina, diacereina, glucosamina, sales de oro (por ejemplo sal de oro de cicloquina, tiomalato de oro sodico, tiosulfato de oro sodico), hidroxicloroquina, hidroxiurea, cebuzona, levamisol, lobenzarit, melitina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, mofetilo de micofenolato, mioral, mostaza de nitrogeno, D-penicilamina, imidazoles de piridinol tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoyetina y vincristina. Los SAARD o DMARD estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas inhibidores de COX2, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamacion cronica y aguda. Los ejemplos de inhibidores de COX2, los esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, celecoxib. Los inhibidores de COX2 estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Se describe el uso de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema IL-an IL-1ra e IL-1ra) en combinacion (tratamiento previo, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o mas antimicrobianos, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamacion aguda y cronica. Los antimicrobianos incluyen, por ejemplo, ampicilina, amoxicilina, aureomicina, bacitracina, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, cefaclor, cefalexina, cefradina, ciprofloxacina, acido clavulanico, cloxacillina, dicloxacillano, eritromicina, flucloxacillano, gentamicina, gramicidina, meticillano, neomicina, oxacillano, penicillina y vancomicina. Los antimicrobianos estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares tambien se destinan a abarcarse por este grupo.

Es especialmente ventajoso formular composiciones de los compuestos antiinflamatorios adicionales en formas de dosificacion unitarias para la facilidad de administracion y la uniformidad de la dosificacion. “Forma de dosificacion unitaria” como se usa en el presente documento se refiere a unidades ffsicamente discretas ajustadas como dosificaciones unitarias para los pacientes a tratarse, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuestos antiinflamatorios adicionales calculados para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion al vehmulo farmaceutico requerido. Como se usa en el presente documento, “vehmulo farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimiento, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retraso de la absorcion y similares que son compatibles con el ingrediente activo y con el modo de administracion y otros ingredientes de la formulacion y no deletereos para el receptor.

Para la administracion terapeutica oral, el compuesto antiinflamatorio adicional puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares, o puede incorporarse directamente con el alimento en la dieta. Los comprimidos, trociscos, pfldoras, capsulas y similares pueden contener tambien lo siguiente: un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicalcico, un agente disgregante tal como almidon de mafz, acido algmico y similares; un agente lubricante tal como estearato magnesico; un agente

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edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, aceite de verde de invierno o sabor a cereza o a naranja. Cuando la forma de dosificacion unitaria es una capsula, puede contener, ademas del material del tipo descrito en el presente documento, un vehmulo Kquido. Diversos materiales distintos pueden estar presentes como un recubrimiento o de otra manera modificar la forma ffsica de la unidad de dosificacion. Por ejemplo, los comprimidos, pfldoras o capsulas pueden recubrirse con shellac, azucar o ambos. Por supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosificacion unitaria debe ser farmaceuticamente puro y sustancialmente no toxico en las cantidades empleadas. Ademas, el compuesto antiinflamatorio adicional puede incorporarse en una preparacion y formulacion de liberacion sostenida. La cantidad del compuesto antiinflamatorio adicional en tal composicion terapeuticamente util es tal que se obtendra una dosificacion adecuada.

Para la administracion terapeutica parenteral, cada compuesto antiinflamatorio adicional puede incorporarse con una solucion inyectable esteril. La solucion inyectable esteril puede prepararse incorporando el compuesto antiinflamatorio adicional en la cantidad requerida en un vehmulo farmaceuticamente aceptable apropiado, con diversos ingredientes distintos, seguido de esterilizacion filtrada. En el caso de dispersiones, cada una debe prepararse incorporando el compuesto antiinflamatorio adicional en un vehmulo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los ingredientes distintos requeridos de aquellos enumerados en el presente documento. En el caso de soluciones inyectables esteriles, cada una puede prepararse incorporando un polvo del compuesto antiinflamatorio adicional y, opcionalmente, cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente filtrada esteril del mismo, donde el polvo se prepara mediante cualquier tecnica apropiada (por ejemplo secado al vado y secado por congelacion).

El uso de tales medios y agentes se conoce bien en la tecnica (vease por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, paginas 1435-1712). Los ingredientes suplementarios activos tambien pueden incorporarse en las composiciones.

La dosis espedfica del compuesto antiinflamatorio adicional se calcula de acuerdo con el peso aproximado del cuerpo o el area superficial del paciente. Otros factores para determinar la dosificacion apropiada pueden incluir la enfermedad o afeccion inflamatoria aguda o cronica a tratarse o prevenirse, la gravedad de la enfermedad, la ruta de administracion y la edad, el sexo y la condicion medica del paciente. El refinamiento adicional de los calculos necesarios para determinar la dosificacion apropiada para el tratamiento que implica cada una de las formulaciones mencionadas en el presente documento se realiza rutinariamente por aquellos expertos en la materia. Las dosificaciones tambien pueden determinarse a traves del uso de ensayos conocidos para determinar dosificaciones usadas junto con datos de respuesta a dosis apropiados.

De esta manera, por ejemplo, esta dentro del alcance de la presente invencion que las dosis de los compuestos antiinflamatorios adicionales seleccionadas para tratar una enfermedad inflamatoria aguda o cronica particular tales como enfermedades reumaticas puedan variarse para lograr un efecto terapeutico deseado. Donde uno de los compuestos antiinflamatorios adicionales tiene efectos secundarios, pueden darse a pacientes durante periodos de tratamiento alternos de terapia de combinacion. Por ejemplo, el tratamiento cronico de metotrexato se asocia a toxicidad gastrointestinal, hepatica, de la medula osea y pulmonar (Sandoval et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:49-56).

Los ensayos para monitorizar la mejora de una enfermedad pueden incluir ensayos espedficos dirigidos, por ejemplo, a la determinacion de la respuesta sistemica a la inflamacion, que incluyen la velocidad de sedimentacion de eritrocitos (ESR) y los reactivos de fase aguda (APR). Se realizan observaciones del hinchamiento, etc. de las partes corporales afligidas. La mejora de la rigidez y estar apretado (donde sea aplicable) y la reduccion del dolor del paciente tambien se observan. Si la condicion del paciente es estable, el paciente se re-trata con la misma dosificacion semanalmente y se evalua semanalmente. Con la condicion de que la condicion del paciente sea estable, el tratamiento puede continuarse. Despues de seis meses de tratamiento, se determinan los cambios anatomicos del esqueleto por formacion de imagenes radiologicas, por ejemplo por radiograffa de rayos X.

Al final de cada periodo, el paciente se evalua de nuevo. La comparacion de las evaluaciones radiologicas de pre- tratamiento y post-tratamiento, ESR y APR indican la eficiencia de los tratamientos. De acuerdo con la eficiencia de los tratamientos y la condicion del paciente, la dosificacion puede aumentarse o mantenerse constante durante la duracion del tratamiento.

Se describe un metodo con, opcionalmente, una de las siguientes combinaciones para tratar o prevenir enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamacion aguda y cronica tales como enfermedades reumaticas y los smtomas asociados a las mismas. Una combinacion es un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o un hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) con uno o mas de metotrexato, leflunomida, un inmunosupresor (por ejemplo, ciclosporina), ciprofloxacina, antfgeno fas secretado o soluble y un inhibidor de TNF (por ejemplo, sTNFR). Las combinaciones preferidas incluyen el producto o productos de protema IL-1ra y metotrexato, o el producto o productos de protema IL-1ra y leflunomida. Otra combinacion preferida de dicho producto o productos de protema IL-1ra con uno o mas de

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metotrexato, leflunomida, sulfasazina e hidroxiclorocina.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, por via intraarticular, subcutanea o intramuscular) de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc) formulado opcionalmente con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), formulacion de tampon citrato o formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento, tratamiento concurrente) con metotrexato para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1 incluyendo inflamacion cronica y aguda como caquexia/anorexia; smdrome de fatiga cronica; depresion, diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo I de inicio en la juventud y diabetes melitus); fibromialgia o analgesia; rechazo de hospedador frente a injerto; hiperalgesia, enfermedad intestinal inflamatoria; lesion isquemica, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesion cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o accidente crebrovascular, que pueden conducir a neurodegeneracion); enfermedades del pulmon (por ejemplo, ARDS y fibrosis pulmonar); esclerosis multiple; enfermedades oculares, dolor, pancreatitis; lesion por reperfusion; enfermedades reumaticas (por ejemplo, artritis reumatoide; osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, smdrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriasica, artritis enteropatica, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistemica, vasculitis, vasculitis cerebral, enfermedad de Lime, artritis inducida por estafilococos (“septica”), Smdrome de Sjogren, fiebre reumatica, policondritis y polimialgia reumatica y artritis de celula gigante); shock septico; efectos colaterales de terapia de radiacion; enfermedad de articulacion mandibular temporal; metastasis de tumor; o estado inflamatorio como resultado de una torcedura, tension, dano de cartflago, traumatismo, cirugfa ortopedica, infeccion y otros procesos de la enfermedad.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, intraarticular, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con metotrexato y/o leflunomida y/o sTNFR para tratar artritis (por ejemplo osteoartritis, artritis psoriasica y/o artritis reumatoide) y los smtomas asociados con ellos.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, intraarticular, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con activador de plasminogeno tisular y/o sTNFR para tratar la lesion cerebral como resultado de un traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, cada uno de los cuales puede dar lugar a neurodegeneracion.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con uno o mas de un corticosteroide, ciclosporina o un interferon (por ejemplo interferon alfa, interferon beta, interferon gamma e interferon consenso) y/o un inhibidor de TNF (por ejemplo, sTNFR) para tratar esclerosis multiple.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, intravenosa) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con uno o mas de metotrexato, leflunomida, un corticosteroide, FK506, ciclosporina, una protema fas soluble y/o sTNFR para tratar el rechazo de injerto frente a hospedador.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un

polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la

formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con G-CSF y/o sTNFR para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un

polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la

formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con un interferon (por ejemplo interferon alfa, interferon beta, interferon gamma e interferon consenso) para tratar mieloma multiple o mielogeno (por ejemplo, AML y CML) y otras leucemias.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, subcutanea o intraventricular o intratecal) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polfmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combinacion (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento

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concurrente) con un AINE (por ejemplo, indometacina) y/o sTNFR para tratar la enfermedad de Alzheimer.

El metodo puede comprender la administration (por ejemplo, inyeccion local, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un poKmero de liberation controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulation de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato), opcionalmente con tratamientos convencionales, para tratar la enfermedad de la articulation mandibular temporal.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, inyeccion local, subcutanea o intramuscular) de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un poKmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combination (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con osteoprotogerina (Solicitud de Patente Europea N.° 96309363,8) en el tratamiento de osteoporosis o enfermedad de Paget.

El metodo puede comprender la administracion (por ejemplo, inyeccion local, subcutanea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un poKmero de liberacion controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano), la formulacion de tampon citrato o la formulacion de tampon fosfato) en combinacion con terapia genica (por ejemplo, usando el adenovirus humano) para modular la respuesta inflamatoria a los antfgenos de vector (Zhang y col. (1997), Arthritis & Rheumatism, 40(9):S220 (1138)).

El resultado sorprendente e inesperado que se ha expuesto en el presente documento es la capacidad de IL-1ra y metotrexato para actuar sinergicamente en el tratamiento de diversos smtomas asociados a enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo estados inflamatorios agudos y cronicos. “Sinergicamente” se usa en el presente documento para referirse a una situation donde el beneficio transmitido por la administracion conjunta de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, un producto o productos de protema de IL-1ra e IL-1ra) y uno o mas compuestos antiinflamatorios adicionales es superior a la suma algebraica de los efectos que resultan de la administracion por separado de los componentes de la combinacion. Tal como se demuestra en el experimento que se expone mas adelante, en un modelo de artritis adyuvante, la combinacion de tratamiento de rhuIL-1ra y metotrexato es sinergica en lo que se refiere al tratamiento de inflamacion sistemica (por ejemplo, esplenomegalia) y la perdida de peso asociada con artritis reumatoide. Por lo tanto, el tratamiento de rhuIl-1ra y metotrexato combinado tiene la ventaja de conseguir el mismo resultado con una dosis mas baja o una administracion menos frecuente de metotrexato, reduciendo asi el efecto toxico y, potencialmente, con la ventaja de una actividad persistente incluso despues de que haya terminado el tratamiento.

El metotrexato es un anti-metabolito y un farmaco inmunosupresor. El metotrexato es un agente anti-inflamatorio eficaz que tiene utilidad en el tratamiento de psoriasis discapacitante y grave y artritis reumatoide (Hoffmeister (1983), The Americal Journal of Medicine, 30: 69-73 y Jaffe (1988), Arthritis and Rheumatism, 31: 299). El metotrexato es acido N-[4-[(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino]benzofl]-L-glutamico y tiene la formula estructural:

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En los documentos de referencia que se citan a continuation se describe la preparation de metotrexato (Seeger y cols. (1949), J. Am. Chem. Soc., 71: 1753; el metabolismo de metotrexato (Freeman (1958), J. Pharmacol. Exp. Ther. 122: 154 y Henderson y cols., (1965), Cancer Res. 25: 1008); la toxicidad de metotrexato (Condit y cols., (1960), Cancer, 13: 222-249; los modelos farmacocineticos de metotrexato (Bischoff y cols., (1970), J. Pharm. Sci. 59: 149); el metabolismo y farmacocinetica de metotrexato (Evans (1980), Appl. Pharmacokinet. Williams y cols. [eds], pp. 518-548 (Appl. Ther. Inc.); la farmacologia clmica de metotrexato (Bertino (1981), Cancer Chemother., 3: 359-375 y Jolivet y cols. (1983), N. Engl. J. Med. 309: 1094-1104); y la experiencia clmica de metotrexato en artritis reumatoide (Weinblatt y cols. (1985), N. Eng. J. Med., 312: 818-822; Furst (1985), J. Rheumatol., 12(12): 1-14; Williams y cols. (1985), Arthritis Rheum., 28: 721-730 y Seitz y cols. (1995), British Journal of Rheumatology, 34 602609). Adicionalmente, se han publicado numerosas patentes donde se describe el agente activo metotrexato y metodos para la smtesis de metotrexato o productos intermedios potenciales en la smtesis de metotrexato: patentes de EE.UU. N° 2.512.572; 3.892.801; 3.989.703; 4.057.549; 4.067.867; 4.079.056; 4.080.325; 4.136.101; 4.224.446; 4.306.064; 4.374.987; 4.421.913 y 4.767.859.

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El mecanismo de accion de metotrexato apenas se comprende, aunque se han demostrado varias de las actividades de este farmaco que, probablemente, contribuyan a su eficiencia (Segal y cols., (1990), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 20 190-198). Se han postulado los siguiente mecanismos de accion para metotrexato: inhibicion de las rutas dependientes de foliato y metabolismo de protema (Morgan y cols., (1987); Arthritis and Rheumatism, 30: 1348-1356); inhibicion de desplazamiento de neutrofilos en articulaciones artnticas (Van de Kerkhof y cols., (1985), British Journal of Dermatology, 113: 251-255; Ternowitz y cols., (1987), Journal of Investigative Dermatology, 89: 192-196 and Sperling (1992), Arthritis and Rheumatism, 35: 376-384); actividad inhibidora de IL-6 (Segal (1991), Arthritis and Rheumatism, 34(2): 146-152) y el efecto anti-proliferativo espedfico local en celulas implicadas en artritis (Rodenhuis y cols. (1987), Arthritis and Rheumatism, 30: 369-374). Se ha demostrado que metotrexato bloquea la ruta de interleucina-1 beta/receptor de interleucina (Brody y cols., (1993), European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 31(10): 667-674); no obstante, aunque metotrexato pueda inhibir los efectos proliferativos de IL-1 y disminuir la produccion de IL-1 de monocito a corto plazo en determinados pacientes, su efecto no es sostenido y no es probable que explique la eficacia a largo plazo de metotrexato (Barrera y cols., (1996), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 25(4): 234-253).

El metotrexato puede administrarse por via oral, intraperitoneal, subcutanea o intravenosa. Es preferible la administracion oral. Lo siguiente es un ejemplo sobre el procedimiento para la administracion combinada de un producto o productos de protema IL-1ra (por ejemplo, IL-1ra) y tratamiento con metotrexato para tratar a un paciente humano. El paciente ingiere un comprimido o capsula de metotrexato tres veces a la semana, una dosis semanal total de 5 a 50 mg/paciente/semana. Asimismo, se inyecta al paciente por via intravenosa un producto o productos de protema IL-1ra (por ejemplo, IL-1ra) a una dosis diaria de 50 a 150 mg. Los expertos en la materia apreciaran que las dosis aqu presentadas son dosis preferibles. La dosis de partida del compuesto que se utilice en particular se reduce cuando el paciente presente una reaccion adversa, o se puede cambiar o reducir el farmaco utilizado en combinacion con el compuesto o compuestos, por ejemplo, dependiendo de las diferentes formulaciones, rutas, planes de dosis y/u otras variables conocidas entre las personas especializadas en este campo, como puedan ser la tolerancia al farmaco por parte del paciente, su eficacia y su toxicidad.

Preferentemente, se trata al paciente con una dosis de partida semanal de metotrexato comprendida entre 5 mg y 7,5 mg (oral o intramuscularmente) y una dosis diaria de producto o productos de protema IL-1ra (por ejemplo, IL- 1ra) a una dosis comprendida entre 50 mg y 150 mg (por via intravenosa). Se aumenta la dosis de metotrexato en 5 mg cada 2 a 3 semanas. Se determina el nivel de dosis maxima a un punto donde el paciente presente una mejora, que preferentemente consiste generalmente en menos de aproximadamente 25 mg de metotrexato por semana, mas preferentemente entre 5 y 25 mg de metotrexato por semana. A continuacion, se puede evaluar al paciente con un examen ffsico y un extenso analisis de laboratorio. El analisis incluye la evaluacion para determinar la toxicidad. Otro control de laboratorio adicional en el caso de metotrexato incluye tambien preferentemente un recuento de celulas de la sangre completo cada 2 semanas durante los primeros 3 meses y mensualmente despues. Entre las precauciones adicionales se incluyen preferentemente valoraciones mensuales de los niveles en suero de albumina, alanina amino transferasa, bilirrubina, creatinina y nitrogeno en la urea de la sangre. Tambien es preferible un analisis de orina mensual.

Ejemplos

Los metodos convencionales para muchos de los procedimientos que se describen en los siguientes ejemplos, o procedimientos alternativos, se encuentran en manuales muy conocidos sobre biologfa molecular como por ejemplo Sambrook y cols., Molecular Cloning, segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y Ausabel y cols., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, Nueva York (1990). Todas las sustancias qmmicas fueron de calidad analftica o calidad USP.

Ejemplo 1

Se utilizo un modelo animal de artritis reumatoide inducido por un adyuvante para investigar la terapia de combinacion de un inhibidor de IL-1 y metotrexato. Se canularon ratas Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5 por grupo) que pesaban al menos 200 g con cateteres yugulares y se les dejo que se recuperaran durante varios dfas. A continuacion, se las coloco en jaulas para infusion y se las aclimato durante una semana antes de iniciar las inyecciones adyuvantes.

El dfa 0, se inyectaron a todas las ratas tratadas 100 pl de adyuvante Completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a la que se anadio adyuvante sintetico, N,N-dioctildecildecil-N'-, N-bis(2-hidroxi-etil)-propanodiamina, 75 mg/ml. En los dfas 0-14 se comenzo el tratamiento con metotrexato en carboximetil celulosa al 1 % (Sigma) y se administro oralmente (0,06 mg/kg). El dfa 8, se administro el tratamiento con antagonista de receptor de IL-1 recombinante humano derivado de E. coli (preparado generalmente de acuerdo con las directrices de la patente de EE.UU. N.° 5.075.222, rhuIL-1ra) formulado en una composicion farmaceutica (citrato sodico 10 milimolar, cloruro sodico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1 % (p/p) en agua, pH 6,5) por infusion IV continua (5 mg/kg/hora) a cada uno de los grupos de ratas que se estaba tratando tanto con adyuvante completo de Freunds como metotrexato y a otro grupo de ratas que se estaba tratando solamente con adyuvante completo de Freunds.

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Se tomaron los pesos corporales el dfa 0 y cada dfa a partir del 8 dfa hasta la terminacion el d^a 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuacion cmica el dfa 8 y cada d^a hasta la terminacion. En este momento, se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

Tal como se puede observar en las Figuras 2 y 3, las ratas tratadas con rhuIL-1ra en solitario presentaron un 57 % de inhibicion de la artritis (inflamacion de la pata), no presentaron ningun beneficio significativo en esplenomegalia y presentaron un 25 % de inhibicion del cambio de peso corporal. Las ratas tratadas con metotrexato teman un 55 % de inhibicion de inflamacion de la pata, y no presentaron inhibicion del peso del bazo y un 23 % de inhibicion del cambio de peso corporal. La terapia de combinacion presento un 100 % de inhibicion de la inflamacion de la pata, un 49 % de inhibicion de la esplenomegalia y 106 % de inhibicion del cambio de peso corporal.

Ejemplo 2

Se canularon ratas de Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5-7/grupo) que pesaban al menos 200 g con cateteres yugulares y se les dejo que se recuperaran durante varios dfas. A continuacion, se les coloco en jaulas para infusion y se les aclimato durante al menos una semana antes de iniciar las inyecciones de adyuvante.

El dfa 0, se les inyectaron a las ratas 100 pl de adyuvante completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se anadio adyuvante sintetico, N,N-dioctildecildecil-N', N-bis(2-hidroxi-etil)-propanodiamina, 75 mg/ml. En los dfas 0-14, se comenzo el tratamiento con metotrexato en carboximetil celulosa al 1 % (Sigma) y se administro por via oral (0,06 mg/kg). El dfa 8, se administro el tratamiento con rhuIL-1ra formulado en una composicion farmaceutica (citrato sodico 10 milimolar, cloruro sodico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1 % (p/p) en agua, pH 6,5) por infusion IV continua (5 mg/kg/hora). Se tomaron los pesos corporales el dfa 0 y cada dfa desde el dfa 8 hasta la terminacion el dfa 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuacion clmica el dfa 8 y cada dfa hasta el dfa de la terminacion. En este tiempo, se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

Tal como se puede observar en las Figuras 4 y 5, las ratas tratadas con rhu IL-1ra en solitario presentaron un 22 % de inhibicion de la inflamacion de la pata, un 24 % de inhibicion de la esplenomegalia y ninguna inhibicion del cambio de peso corporal. Las ratas tratadas con metotrexato presentaron un 57 % de inhibicion en la inflamacion de la pata, un 22 % de inhibicion de la esplenomegalia y un 59 % de inhibicion del cambio de peso corporal. La combinacion de rhuIL-1ra y metotrexato tuvo como resultado un 90 % de inhibicion de la inflamacion de la pata, un 77 % de inhibicion de esplenomegalia y un 65 % de inhibicion del cambio de peso corporal asociado con artritis/inflamacion sistemica.

Ejemplo 3

Se canulo a las ratas Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5-7/grupo) que pesaban al menos 250-300 g en el subcutis de la parte dorsal y se les dejo que se recuperaran durante varios dfas. A continuacion, se las coloco en jaulas para infusion y se les aclimato durante al menos 4 dfas antes de iniciar las inyecciones adyuvantes.

El dfa 0, se les inyectaron 100 pl de adyuvante completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se anadio adyuvante sintetico N,N-dioctildecildecil-N', N-bis(2-hidroxi-etil)-propanodiamina, 75 mg/ml. En los dfas 0-14 se inicio el tratamiento con metotrexato en carboximetil celulosa al 1% (Sigma) y se administro por via oral (0,048, 0,06 o 0,075 mg/kg). El dfa 8, se comenzo el tratamiento con rhuIL-1ra formulado en una composicion farmaceutica (citrato sodico 10 milimolar, cloruro sodico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1 % (p/p) en agua, pH 6,5) por infusion subcutanea continua (5 mg/ml/hora; 0,1 ml/hora). Se tomaron los pesos corporales el dfa 0 y cada dfa a partir del dfa 8 hasta la terminacion el dfa 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuacion clmica el dfa 8 y cada dfa hasta la terminacion. En este tiempo se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

La infusion subcutanea continua de rhuIL-1ra a una velocidad de 5 mg/ml/hora, dfas 8-15 en ratas artnticas adyuvantes tuvo como resultado un 6 % de inhibicion del peso de la pata final. El tratamiento de ratas artnticas adyuvantes con una dosis oral diaria de metotrexato (0,075, 0,060 o 0,048 mg/kg) en los dfas 0-14, tuvo como resultado 47, 27 o 0 % (respectivamente) de inhibicion del peso de la pata final. El tratamiento concurrente de rhulL- 1ra y metotrexato a las mismas dosis aumento la inhibicion a un peso de la pata final de 84, 44 o 21 %. Por lo tanto, se observaron ventajas clmicas estadfsticamente significativas cuando las dosis de metotrexato fueron 0,075 o 0,06 mg/kg. En el caso de una terapia de combinacion, la inhibicion de la inflamacion de la pata fue significativamente mayor que la que se dio con rhuIL-1ra o metotrexato en solitario cuando la dosis de metotrexato fue 0,075 mg/kg. El analisis de la inflamacion de la pata segun las medidas con calibrador secuenciales de las articulaciones del tobillo revelaron una inhibicion de la artritis cuando se analizaron los datos del area bajo la curva. Las ratas tratadas con rhuIL-1ra en solitario presentaron un 6 % de inhibicion de la inflamacion, mientras que aquellas a las que se administro 0,075 mg/kg de metotrexato presentaron un 45 % de disminucion del diametro de la articulacion del tobillo a lo largo del tiempo. Como contraste, las ratas a las que se les administro una terapia de combinacion presentaron un 78 % de inhibicion de la artritis. Estadfsticamente, se observo un beneficio de combinacion estadfsticamente significativo en el area bajo la curva del diametro del tobillo en las ratas a las que se les administro 0,048 pero no

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La evaluacion histologica de las articulaciones del tobillo de las ratas tratadas con rhuIL-1ra demostro un 8 % de inhibicion de la inflamacion y un 53 % de inhibicion de la resorcion osea. El tratamiento con metotrexato tuvo como resultado una inhibicion significativa de respuesta a dosis de estos parametros a 0,075 (44 % de inhibicion de la inflamacion y 58 % de inhibicion de la resorcion osea) o 0,06 (26 % de inhibicion de la inflamacion y 55 % de inhibicion de la resorcion osea) pero no 0,048 mg/kg (8 % de inhibicion de la inflamacion y 11 % de inhibicion de la resorcion osea). El beneficio de la combinacion fue sobre todo espectacular en las ratas a las que se les administro 0,075 mg/kg de dosis de metotrexato en combinacion con rhuIL-1ra. En estas ratas, se inhibio la inflamacion en un 85 % y disminuyo la resorcion osea en un 97 %. Estas diferencias aumentaron significativamente con respecto a las observadas en cada uno de los tratamientos en solitario para ambos parametros. Se observaron tambien beneficios de la combinacion similares a 0,06 mg/kg de dosis de metotrexato en combinacion con rhuIL-1ra (44 % de inhibicion de la inflamacion y 84 % de inhibicion de la resorcion osea) y con 0,048 mg/kg de dosis de metotrexato en combinacion con rhuIL-1ra (23 % de inhibicion de la inflamacion y 68 % de inhibicion de la resorcion osea).

Ejemplo 4

Se canularon ratas Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5-7 /grupo) que pesaban al menos 250-300 g en el subcutis de la parte dorsal y se les dejo que se recuperaran durante varios dfas. A continuacion, se las coloco en jaulas para infusion y se las aclimato durante al menos 4 dfas antes de iniciar las inyecciones adyuvantes.

El dfa 0, se inyectaron a las ratas 100 pl de adyuvante completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se anadio un adyuvante sintetico, N,N-dioctildecildecil-N',N-bis(2-hidroxi-etil) propanadiamina, 75 mg/ml. En los dfas 0-14, se comenzo el tratamiento de metotrexato en carboximetil celulosa al 1 % (Sigma) y se administro por via oral (0,048, 0,06 o 0,075 mg/kg). El dfa 8, se inicio el tratamiento con rhuIL-1ra formulado en una composicion farmaceutica (citrato sodico 10 milimolar, cloruro sodico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1 % (p/p) en agua, pH 6,5) por infusion IV continua (5 mg/kg/hora). Se tomaron los pesos del cuerpo el dfa 0 y cada dfa desde el dfa 8 hasta la terminacion el dfa 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuacion clrnica el dfa 8 y cada dfa despues hasta la terminacion. En este tiempo se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

La infusion subcutanea continua de rhuIL-1ra a una velocidad de 5 mg/kg/hora, dfas 8-15 en ratas artnticas adyuvantes tuvo como resultado un 6% de inhibicion del peso de la pata final. El tratamiento de ratas artnticas adyuvantes con dosis orales diarias de metotrexato (0,075, 0,060 o 0,048 mg/kg) los dfas 0-14, tuvo como resultado un 47, 27 o 0 % (respectivamente) de inhibicion del peso de la pata final. El tratamiento concurrente con rhuIL-1ra y metotrexato a estas mismas dosis aumento la inhibicion del peso de la pata final a 84, 44 o 21 %. Por lo tanto, se observo un beneficio clmico estadfsticamente significativo cuando las dosis de metotrexato fueron 0,075 o 0,06 mg/kg. En el caso de una terapia de combinacion, la inhibicion de la inflamacion de la pata fue significativamente mayor que la que se produjo con rhuIL-1ra o con metotrexato en solitario cuando la dosis de metotrexato fue 0,075 mg/kg. El analisis de la inflamacion de la pata segun las medidas con calibrador secuenciales de las articulaciones del tobillo revelaron una inhibicion de la artritis cuando se analizaron los datos como el area bajo la curva. Las ratas tratadas con rhuIL-1ra en solitario presentaron un 6% de inhibicion de la inflamacion, mientras que las ratas a las que se administro 0,075 mg/kg de metotrexato presentaron un 45% de disminucion del diametro de la articulacion del tobillo a lo largo del tiempo. En contraste, las ratas a las que se les administro una terapia de combinacion presentaron un 78 % de inhibicion de la artritis. Se observo un beneficio de la combinacion estadfsticamente significativo en el area bajo la curva de inhibicion del diametro del tobillo en las ratas a las que se les habfa administrado 0,048, pero no 0,06 mg/kg, de metotrexato.

La evaluacion histologica de las articulaciones del tobillo a partir de las ratas tratadas con rhuIL-1ra demostro un 8 % de la inhibicion y un 53 % de la inhibicion de la resorcion osea. El tratamiento con metotrexato tuvo como resultado una significativa inhibicion como respuesta a dosis de estos parametros a 0,075 (44 % de inhibicion de la inflamacion y 58 % de inhibicion de la resorcion osea) o 0,06 (26 % de inhibicion de la inflamacion y 55 % de inhibicion de la resorcion osea) pero no 0,048 mg/kg (8 % de inhibicion de la inflamacion y 11 % de la inhibicion de la resorcion osea). El beneficio de la combinacion fue sobre todo sorprendente en las ratas a las que se les administro 0,075 mg/kg de dosis de metotrexato en combinacion con rhuIL-1ra. En estas ratas, se inhibio la inflamacion en un 85% y la resorcion osea disminuyo en un 97 %. Estas diferencias aumentaron significativamente con respecto a las observadas con cada uno de los tratamientos por separado para ambos parametros. Se observo un beneficio de la combinacion similar a una dosis de 0,06 mg/kg de metotrexato en combinacion con rhuIL-1ra (44 % de inhibicion de la inflamacion y 84 % de inhibicion de la resorcion osea) y con 0,048 mg/kg de dosis de metotrexato en combinacion con rhuIl-1ra (23 % de inhibicion de la inflamacion y 68 % de inhibicion de la resorcion osea).

Ejemplo 4

Materiales: interferon consenso (r-metlFN-con-i) se genera un interferon sintetico sustancialmente de acuerdo con las ensenanzas de la Patente de Estados Unidos 4.695.623.

Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso de cantidades terapeuticamente eficaces de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y un farmaco antiinflamatorio adicional para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda o cronica, donde dicho anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y al menos un compuesto antiinflamatorio adicional se preparan para la administracion separada o combinada, donde el compuesto antiinflamatorio es metotrexato (acido N-[4-[(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino]benzoil]-L-glutamico).
2. 2. El uso de la reivindicacion 1, donde dicha enfermedad antiinflamatoria es una enfermedad inflamatoria de una articulacion, preferentemente, dicha enfermedad inflamatoria de una articulacion es artritis reumatoide.
3. 3. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 y al menos un compuesto antiinflamatorio adicional, donde el al menos un compuesto antiinflamatorio adicional es metotrexato (acido N-[4- [(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino]benzoil]-L-glutamico).
4. 4. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 3, donde dicho metotrexato esta presente en una cantidad de hasta aproximadamente 25 mg.
5. 5. Uso de un compuesto antiinflamatorio, distinto de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1, en la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad aguda o cronica en un mairnfero en combinacion con la administracion de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1, donde el compuesto antiinflamatorio es metotrexato.
6. 6. El uso de 5 donde la cantidad de metotrexato en el medicamento es hasta aproximadamente 25 mg.
7. 7. Uso de un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 en la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria aguda o cronica en un mamffero en combinacion con la administracion de un compuesto antiinflamatorio adicional, donde el compuesto antiinflamatorio es metotrexato.
8. 8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, donde el anticuerpo monoclonal anti-IL-1 en el medicamento esta presente en una cantidad de hasta aproximadamente 200 mg.
9. 9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde dicho metotrexato se prepara para la administracion oral.