ES2334726T3 - Composicion que comprende il-1ra como inhibidor de interleucina 1 e hialuronano como polimero de liberacion controlada. - Google Patents

Composicion que comprende il-1ra como inhibidor de interleucina 1 e hialuronano como polimero de liberacion controlada. Download PDF

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION FARMACEUTICA QUE CONTIENE (A) UNA CANTIDAD EFECTIVA DE POLIMERO DE LIBERACION CONTROLADA Y (B) UNA CANTIDAD EFECTIVA DE UN IL-1RA. DICHA COMPOSICION MUESTRA UN EFECTO TERAPEUTICO SOBRE LA INFLAMACION Y ES UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS MEDIADAS POR IL-1, PARTICULARMENTE ENFERMEDADES DE LAS ARTICULACIONES.

Description

Composición que comprende IL-1ra como inhibidor de interleucina-1 e hialuronano como polímero de liberación controlada.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inflamación. Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición para el propósito de prevenir o tratar enfermedades inflamatorias.
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Antecedentes de la invención
La inflamación es la reacción de defensa del cuerpo a lesiones tales como las causadas por lesión mecánica, infección o estimulación antigénica. Una reacción inflamatoria se puede expresar de forma patológica cuando la inflamación se induce por un estímulo inapropiado tal como un autoantígeno, se expresa de una manera exagerada o persiste bastante después de la eliminación de los agentes lesivos.
Aunque la etiología de la inflamación está mal comprendida, recientemente se ha obtenido considerable información con respecto a los aspectos moleculares de la inflamación. Esta investigación ha conducido a la identificación de ciertas citocinas que se piensa que ocupan un papel destacado en la mediación de inflamación. Las citocinas son proteínas extracelulares que modifican el comportamiento de células, particularmente las células que están en el área inmediata de la síntesis y liberación de citocinas. La interleucina-1 (IL-1) es una de las citocinas inflamatorias más potentes descubiertas hasta ahora y una citocina que se piensa que es un mediador clave en muchas enfermedades y afecciones médicas, denominadas "enfermedades mediadas por interleucina-1". La IL-1, que se fabrica (aunque no exclusivamente) por células del linaje de macrófagos/monocitos, se puede producir en dos formas: IL-1 alfa (IL-1a) e IL-1 beta (IL-1 \beta).
Se considera que una enfermedad o afección médica es una "enfermedad mediada por interleucina-1" si la enfermedad o afección médica espontánea o experimental está asociada con niveles elevados de IL-1 en fluidos corporales o tejidos o si las células o tejidos tomados del cuerpo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En muchos casos, tales enfermedades mediadas por interleucina-1 también se reconocen por las siguientes dos condiciones adicionales: (1) los hallazgos patológicos asociados con la enfermedad o afección médica se pueden imitar experimentalmente en animales por la administración de IL-1; y (2) la patología inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad o afección médica se puede inhibir o suprimir por tratamiento con agentes que inhiben la acción de IL-1. En la mayoría de las enfermedades mediadas por interleucina-1 al menos se cumplen dos de las tres condiciones y en muchas enfermedades mediadas por interleucina-1, se cumplen las tres condiciones. Una lista no exclusiva de enfermedades inflamatorias mediadas por interleucina-1 (IL-1) agudas y crónicas incluye, pero sin limitación, las siguientes: pancreatitis aguda; ALS, enfermedad de Alzheimer; caquexia/anorexia, asma, aterosclerosis, síndrome de fatiga crónica, fiebre, diabetes (por ejemplo, diabetes por insulina); glomerulonefritis; rechazo de injerto frente a hospedador; choque hemorrágico; hiperalgesia, enfermedad inflamatoria del intestino, afecciones inflamatorias de una articulación, incluyendo osteoartritis, artritis psoriásica y artritis reumatoide; lesión isquémica, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesión cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneración); enfermedades pulmonares (por ejemplo, ARDS); mieloma múltiple, esclerosis múltiple; leucemias mielógenas (por ejemplo, AML y CML) y otras; miopatías (por ejemplo, metabolismo de proteína de músculo, especialmente en septicemia); osteoporosis, enfermedad de Parkinson, dolor; parto prematuro; psoriasis, lesión por reperfusión, choque séptico, efectos secundarios de radioterapia, enfermedad de la articulación mandibular temporal, metástasis tumoral; o una afección inflamatoria que se produce por distensión, esguince, lesión de cartílago, traumatismo, cirugía ortopédica, infección u otros procesos patológicos.
Las afecciones inflamatorias de una articulación son enfermedades de articulación crónicas que afectan y discapacitan, hasta grados variables, a millones de personas por todo el mundo. La artritis reumatoide es una enfermedad de las uniones articulares en la que el cartílago y el hueso se erosionan lentamente por un tejido conectivo proliferativo, invasivo denominado pannus, que procede de la membrana sinovial. La enfermedad puede implicar estructuras peri-articulares tales como bolsas, vainas del tendón y tendones así como tejidos extra-articulares tales como el subcutis, sistema cardiovascular, pulmones, bazo, ganglios linfáticos, músculos esqueléticos, sistema nervioso (central y periférico) y ojos (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II: 1828). La osteoartritis es una enfermedad articular común caracterizada por cambios degenerativos en el cartílago articular y proliferación reactiva de hueso y cartílago alrededor de la articulación. La osteoartritis es un proceso activo mediado por células que puede producirse como resultado de la respuesta inapropiada de condrocitos a estímulos catabólicos y anabólicos. Los cambios en algunas moléculas de matriz del cartílago articular tienen lugar de forma descrita en osteoartritis temprana (Thonar et al. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19: 635-657 y Shinmei et al. (1992), Arthritis Rheum., 35: 1304-1308).
Se piensa que la artritis reumatoide se produce como resultado de la presentación de un antígeno pertinente a un hospedador inmunogénicamente susceptible. Los antígenos que potencialmente podrían iniciar una respuesta inmune que produjera artritis reumatoide pueden ser endógenos o exógenos. Los posibles antígenos endógenos incluyen colágeno, mucopolisacáridos y factores reumatoides. Los antígenos exógenos incluyen micoplasmas, micobacterias, espiroquetas y virus. Los productos secundarios de la reacción inmune inflaman la sinovia (es decir, prostaglandinas y radicales de oxígeno) y desencadenan cambios articulares destructivos (es decir, colagenasa).
Existe un amplio espectro de gravedad de enfermedad, pero muchos pacientes desarrollan un ciclo de recidivas y remisiones intermitentes con un patrón global de destrucción y deformidad articular progresiva lentamente. Las manifestaciones clínicas pueden incluir poliartritis simétrica de articulaciones periféricas con dolor, dolor a la exploración, hinchamiento y pérdida de función de articulaciones afectadas; rigidez matutina; y pérdida de cartílago, erosión de materia ósea y subluxación de articulaciones después de inflamación persistente. Las manifestaciones extra-articulares incluyen nódulos reumatoides, vasculitis reumatoide, inflamaciones pleuropulmonares, escleritis, síndrome seco, síndrome de Felty (esplenomegalia y neutropenia), osteoporosis y pérdida de peso (Katz (1985), Am. J. Med., 79: 24 y Krane y Simon (1986), Advances in Rheumatology, Synderman (ed.), 70 (2): 263-284). Las manifestaciones clínicas dan como resultado un alto grado de morbilidad que da como resultado una vida diaria alterada del paciente.
La implicación de interleucina-1 en artritis se ha implicado por dos líneas de pruebas distintas. En primer lugar, se han observado niveles aumentados de interleucina-1 y del ARNm que la codifica en el tejido sinovial y el fluido de articulaciones artríticas. Véase, por ejemplo, Buchan et al., "Third Annual General Meeting of the British Society for Rheumatology", Londres, Inglaterra, noviembre 19-21, 1988, J. Rheumatol., 25(2); Fontana et al. (1982), Rheumatology Int., 2: 49-53; y Duff et al. (1988), Monokines and Other Non-Lymphocytic Cytokines, M. Powanda et al. (eds), págs. 387-392 (Alan R. Liss, Inc.).
En segundo lugar, se ha demostrado en numerosas ocasiones que la administración de interleucina-1 a tejido articular sano da como resultado la erosión de cartílago y hueso. En un experimento, se demostró que las inyecciones intra-articulares de IL-1 en conejos provoca destrucción de cartílago in vivo (Pettipher et al. (1986), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 83, 8749-8753). En otros estudios, se demostró que IL-1 provoca la degradación tanto de cartílago como de hueso en explantes tisulares (Saklatavala et al. (1987), Development of Diseases of Cartilage and Bone Matrix, Sen and Thornhill (eds.), págs. 291-298 (Alan R. Liss, Inc.) y Stashenko et al. (1987), The American Association of Immunologists, 183: 1464-1468). Una teoría aceptada generalmente que se usa para explicar el vínculo causal entre IL-1 y artritis es que la IL-1 estimula diversos tipos celulares, tales como fibroblastos y condrocitos, para producir y secretar compuestos proinflamatorios o degradativos tales como prostaglandina E_{2} y metaloproteinasas.
El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) es una proteína humana que actúa como un inhibidor natural de interleucina-1. El antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra) se ha descrito como un agente potencial para el uso en el tratamiento clínico de enfermedades mediadas por IL-1 (Patente Australiana Nº 649245). Sin embargo, el IL-1ra tiene una semivida relativamente corta. Por lo tanto, sería ventajoso administrar IL-1ra en una formulación de liberación controlada para tratar enfermedades mediadas por IL-1.
El documento WO 96/00081 describe composiciones de liberación controlada que comprenden un antagonista de receptor de interleucina-1 (IL-1ra) para tratar enfermedad inflamatoria del intestino mediada por IL-1, en las que el IL-1ra está encapsulado en alginato.
El documento WO 95/10298 se refiere a un método de anticoncepción que utiliza antagonistas del receptor de IL-1 y describe la formulación del IL-1ra en un inserto de supositorio intravaginal que tiene propiedades de liberación lenta.
Un material útil en formulaciones de liberación controlada es el ácido hialurónico. El ácido hialurónico es un mucopolisacárido de origen natural que consiste en los restos de ácido D-glucorónico y N-acetil-D-glucosamina en una cadena no ramificada. El polímero tiene un peso molecular promedio de (5-6) x 10^{6} y muestra una biocompatibilidad excelente. En el cartílago articular, el ácido hialurónico desempeña un papel importante en la construcción de la matriz de cartílago agregándose con proteoglucano. Además, se ha descrito que en condiciones patológicas tales como artritis reumatoide, osteoartritis y artritis infecciosa, las concentraciones y el peso molecular de ácido hialurónico en la articulación cambian y provocan cambios en la naturaleza del líquido sinovial.
Tanto la reticulación química como la derivatización de ácido hialurónico se han usado para mejorar sus propiedades reológicas o aumentar el tiempo de degradación de ciertos fármacos (Cortivo et al. (1991), Biomaterials, 2: 727-730, Benedetti et al. (1990), J. Controlled Release, 13: 33-41 y Hunt et al. (1990), J. Controlled Release, 12: 159-
169).
Se ha demostrado que la inyección de derivados de ácido hialurónico de alto peso molecular puede restaurar la capa de ácido hialurónico dañada sobre la superficie de cartílago articular y puede ser eficaz para tratar algunos tipos de afecciones articulares en ensayos clínicos y fundamentales. Los ejemplos de publicaciones científicas que describen tal uso de derivados de ácido hialurónico para el tratamiento de afecciones articulares incluyen Nizolek & White (1981), Cornell Vet, 71: 355-375; Namiki et al. (1982), Int. J. Chem. Pharmacol., Therapy and Toxicol., 20: 501-507; Asheim y Lindblad (1976), Acta Vet Scand, 17 (4): 379-394; Svanstrom (1978), Proceedings of the 24th Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, St Louis, Mo., pág. 345-348; Wigren et al. (1975), Upsala J Med Sci Supl, 17: 1-20; y Gingerich et al. (1980), Res Vet Sci, 30: 192-197. El uso de ácido hialurónico en articulaciones humanas se describe por Peyron et al. (1974), Pathologie Biologie, 22(8): 731-736. El uso intra-articular de ácido hialurónico en articulaciones de caballo se ha promovido comercialmente en relación con los productos de Pharmacia Hylartil^{TM} y Hylartin V^{TM} y el producto de Sterivet Synacid^{TM}. Sin embargo, aunque los síntomas tales como dolor y rigidez se convierten en un grave problema en el tratamiento de enfermedades articulares, el ácido hialurónico no mejora directamente tales síntomas.
Adicionalmente, el ácido hialurónico se ha usado para el suministro de fármacos. Larsen y Balazs (1991), Advanced Drung Delivery Reviews, 7: 279-293, describe sistemas de suministro de fármaco que usan hialuronano y sus derivados. Una publicación científica que describe el uso de ácido hialurónico tanto en solitario como con cortisona en diversas articulaciones animales, especialmente caballos, es Rydell et al. (1971), Clinical Orthopedics and Related Research, 80: 25-32. Otra publicación científica describe la preparación de microesferas de ésteres de ácido hialurónico que se usaron para el suministro nasal de insulina (Illum et al. (1994), J. Controlled Release, 29: 133-141). Se prepararon esferas en blanco por una técnica de emulsión/evaporación de disolvente, se expusieron a una solución de insulina durante una hora y después se liofilizaron. Cuando se administraron a ovejas, se observó que la biodisponibilidad media era del 11% en comparación con insulina administrada por la vía subcutánea. Este sistema también se ha usado como un dispositivo de suministro para factor de crecimiento de nervios (Ghezzo et al. (1992), Int. J. Pharm., 87: 21 -29). Sin embargo, se ha descrito que cuando se inyectó en rodillas de perro una concentración fisiológica (3 mg/ml) de ácido hialurónico de alto peso molecular (Mr 6x10^{6}) o bajo peso molecular (Mr 5x10^{5}) mezclado con albúmina radiactiva, el volumen de distribución y la velocidad de aclaramiento de albúmina superaron ligeramente los de rodillas en las que la concentración (0,03 mg/ml) de ácido hialurónico de alto peso molecular o la concentración (0,3 mg/ml) de ácido hialurónico de bajo peso molecular se redujo (Myers y Brandt (1995), J. Rheumatol., 22: 1732-1739). Esta referencia sugiere que una combinación de ácido hialurónico con una proteína, tal como IL-1ra, no sería más eficaz que el ácido hialurónico en solitario en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, particularmente cuando se administra por inyección intra-articular.
Okada y Toguchi (1995), Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12 (1): 1-99, describe que muchos polímeros biodegradables obtenidos a partir de fuentes naturales o mediante síntesis química son útiles como vehículos de fármaco para sistemas de suministro de fármaco. Este documento describe además que se prefieren los polímeros biodegradables sintéticos para el desarrollo de productos comerciales y que los polímeros biodegradables sintéticos generalmente son superiores con respecto a polímeros naturales con respecto a la reproducibilidad del producto.
Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos terapéuticos y composiciones para el tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por IL-1. Estos y otros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción más adelante en este documento.
Sumario de la invención
Esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una combinación de hialuronano o una sal del mismo y un antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra) como un agente para tratar enfermedades inflamatorias mediadas por IL-1. El tipo de tratamiento al que se hace referencia en este documento tiene por objeto mamíferos, incluyendo seres humanos. La presente invención se define por las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
Serán evidentes numerosos aspectos y ventajas de la presente invención después de la revisión de las figuras, en las que:
La Figura 1 muestra los niveles séricos de IL-1ra después de inyección subcutánea de IL-1ra en tampón citrato (CSEP) en solitario o IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP.
La Figura 2 muestra la cantidad de IL-1ra remanente en articulaciones de cobaya después de inyección intra-articular de IL-1ra en CSEP en solitario o IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP.
La Figura 3 muestra la concentración de IL-1ra en líquido sinovial recuperado de conejos después de inyección intra-articular de IL-1ra en CSEP en solitario o IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP.
La Figura 4 muestra la evaluación histológica de la gravedad de la enfermedad en articulaciones de rodilla de ratas inmunizadas con colágeno de tipo II bovino, después de inyección intra-articular de ácido hialurónico en CSEP en solitario o IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP.
La Figura 5 muestra una secuencia de ácido nucleico (SEC ID Nº: 1) que codifica IL-1ra humano recombinante (rhuIL-1ra). También se muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de rhuIL-1ra, siendo el aminoácido inicial M_{n}, donde n es igual a 0 ó 1.
La Figura 6 muestra los efectos de una inyección diaria (QD) de IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP mostrados en comparación con IL-1ra en CSEP o ácido hialurónico en CSEP o CSEP en solitario sobre el diámetro de la articulación del tobillo a lo largo del tiempo en ratas con artritis por colágeno de tipo II establecida.
La Figura 7 muestra los efectos de una inyección diaria (QD) de IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP mostrados en comparación con IL-1ra en CSEP o ácido hialurónico en CSEP o CSEP en solitario sobre los pesos de almohadillas finales ratas con artritis por colágeno de tipo II establecida.
La Figura 8 muestra los efectos de una inyección diaria (QD) de IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP mostrados en comparación con IL-1ra en CSEP o ácido hialurónico en CSEP o CSEP en solitario sobre la inflamación, formación de pannus y lesión de cartílago y hueso en ratas con artritis por colágeno de tipo II establecida.
La Figura 9 muestra los efectos de una inyección diaria (QD), inyección cada dos días (Q2D) o inyección cada tres días (Q3D) de IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP mostrados en comparación con ácido hialurónico en CSEP (QD) o sin tratamiento sobre el diámetro de la articulación del tobillo a lo largo del tiempo en ratas con artritis por colágeno de tipo II establecida.
La Figura 10 muestra los efectos de una inyección diaria (QD), una inyección cada dos días (Q2D) o una inyección cada tres días (Q3D) de IL-1ra mezclado con ácido hialurónico en CSEP mostrados en comparación con ácido hialurónico en CSEP (QD) o sin tratamiento sobre el peso de almohadillas final de ratas con artritis por colágeno de tipo II establecida.
Descripción detallada
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen una mezcla de hialuronano o una sal del mismo y un antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra). En una realización específica, la presente invención se refiere a la administración de una formulación farmacéutica que comprende hialuronano y un antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra), que conduce a una elevación relativamente prolongada de los niveles de IL-1ra.
Los inhibidores de interleucina-1 pueden ser cualquier proteína capaz de evitar específicamente la activación de receptores celulares para IL-1. Las clases de inhibidores de interleucina-1 incluyen: antagonistas del receptor de interleucina-1 tales como IL-1ra, como se describe más adelante; anticuerpos monoclonales anti-receptor de IL-1 (documento EP 623674); proteínas de unión a IL-1 tales como receptores de IL-1 solubles (Patentes de Estados Unidos Nº 5.492.888, 5.488.032, 5.464.937, 5.319.071 y 5.180.812); anticuerpos monoclonales anti-IL-1 (documentos WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, US 4.935.343, EP 364778, EP 267611 y EP 220063); y proteínas accesorias de receptor de IL-1 (documento WO 96/23067).
El IL-1ra preferido (tanto glucosilado como no glucosilado) así como métodos para preparar y usar el mismo se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.075.222 (a la que se hace referencia en este documento como la Patente .222); los documentos WO 91/08285, WO 91/17184, AU 9173636, WO 92/16221 y WO 96/22793.
Específicamente, se describen y revelan tres formas útiles de IL-1ra (IL-1raa, IL-1ra\beta e IL-1rax) y variantes del mismo en la patente .222. El IL-1raa se caracteriza como una molécula de 22-23 kD con SDS-PAGE con un punto isoeléctrico aproximado de 4,8, que eluye de una columna Mono Q FPLC aproximadamente a NaCl 52 mM en tampón Tris, pH 7,6. El IL-1ra\beta se caracteriza como una proteína de 22-23 kD, que eluye de una columna Mono Q a NaCl 48 mM. Tanto IL-1ra\alpha como IL-1ra\beta están glucosilados. El IL-1rax se caracteriza como una proteína de 20 kD, que eluye de una columna Mono Q a NaCl 48 mM y no está glucosilada. Estos tres inhibidores poseen actividades funcionales e inmunológicas similares.
Un método descrito para producir IL-1ra consiste en aislar el IL-1ra de monocitos humanos, donde se producen de forma natural. Un segundo método descrito implica aislar el gen responsable de codificar IL-1ra, clonar el gen en vectores y tipos celulares adecuados, expresar el gen para producir los inhibidores y recoger los inhibidores. El último método, que es ilustrativo de métodos de ADN recombinante en general, es un método preferido. Los métodos de ADN recombinante se prefieren en parte debido a que son capaces de conseguir cantidades comparativamente mayores de proteína a una mayor pureza. Por tanto, la invención también incluye IL-1ra que contiene un grupo metionilo N-terminal como consecuencia de expresión en células procariotas, tales como E. coli.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención también incluye formas modificadas de IL-1ra. Las formas modificadas de IL-1ra como se usan en este documento incluyen polipéptidos variantes en los que los aminoácidos se han (1) delecionado ("variantes de deleción"), (2) insertado ("variantes de adición") o (3) sustituido por ("variantes de sustitución") restos dentro de la secuencia de aminoácidos de IL-1ra.
Para variantes de deleción de IL-1ra, cada polipéptido puede tener típicamente una deleción de secuencia amino que varía de aproximadamente 1 a 30 restos, más típicamente de aproximadamente 1 a 10 restos y mucho más típicamente de aproximadamente de 1 a 5 restos contiguos. Se consideran deleciones intrasecuencia N-terminales, C-terminales e internas. Las deleciones dentro de la secuencia de aminoácidos de IL-1ra se pueden realizar en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia de IL-1. Las deleciones dentro de la secuencia de aminoácidos de IL-1ra se pueden realizar en áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia de IL-1 y modificarán más probablemente de forma significativa la actividad biológica.
Para variantes de adición de IL-1ra, cada polipéptido puede incluir una fusión amino- y/o carboxilo-terminal que varía en longitud de un resto a cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia internas de restos aminoacídicos únicos o múltiples. Las adiciones internas pueden variar típicamente de aproximadamente de 1 a 10 restos aminoacídicos, más típicamente de aproximadamente 1 a 5 restos aminoacídicos y mucho más típicamente de aproximadamente 1 a 3 restos aminoacídicos.
Las variantes de adición de extremo amino incluyen la adición de una metionina (por ejemplo, como un artefacto de la expresión directa de la proteína en cultivo celular recombinante bacteriano) o un resto aminoacídico o secuencia adicional. Un ejemplo adicional de una inserción amino-terminal incluye la fusión de una secuencia señal, así como o con otras secuencias pre-pro, para facilitar la secreción de proteína de células hospedadoras recombinantes. Cada polipéptido puede comprender una secuencia señal seleccionada para ser reconocida y procesarse, es decir, escindirse por una peptidasa señal, por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal de IL-1ra nativa, cada polipéptido puede comprender una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa o líderes de enterotoxina II termoestable. Para células de levadura, cada polipéptido puede tener una secuencia señal seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de secuencias líder de la invertasa de levadura, factor alfa y fosfatasa ácida. Para expresión de células de mamífero, cada polipéptido puede tener la secuencia señal nativa de IL-1 ra, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias señal de mamífero, por ejemplo, secuencias obtenidas de otros miembros de la familia de IL-1.
Las variantes de adición del extremo carboxi incluyen proteínas quiméricas en las que cada una comprende la fusión de IL-1ra con todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana. Se prefieren tales proteínas quiméricas en las que la porción de inmunoglobulina de cada una comprende todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana, tal como IgG, IgA, IgM o IgE (especialmente IgG, por ejemplo, IgG1 o IgG3). Un especialista entenderá que cualquier aminoácido de cualquier porción de inmunoglobulina se puede delecionar o sustituir con uno o más aminoácidos, o uno o más aminoácidos se pueden añadir siempre que el IL-1ra todavía antagonice el receptor de IL-1 y la porción de inmunoglobulina muestre una o más de sus propiedades características.
Para variantes de sustitución de IL-1ra, cada uno de tales polipéptidos puede tener al menos un resto aminoacídico en IL-1ra eliminado e insertado en su lugar un resto diferente. Las variantes de sustitución incluyen variantes alélicas, que están caracterizadas por cambios de secuencia de nucleótidos de origen natural en la población de especie que puede dar como resultado o no un cambio de aminoácidos. El especialista en la técnica puede usar cualquier información con respecto al sitio de unión o activo del polipéptido en la selección de posibles sitios de mutación. Se describen variantes de sustitución ilustrativas en los documentos WO 91/17184, WO 92/16221 y WO 96/09323.
Un método para identificar restos aminoacídicos o regiones para mutagénesis de una proteína se denomina "mutagénesis mediante alanina" (Cunningham y Wells (1989), Science, 244: 1081-1085). En este método, se identifica un resto aminoacídico o grupo de restos diana de una proteína (por ejemplo, restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituye por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para realizar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso circundante en o en el exterior de la célula. Los restos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones después se refinan introduciendo restos adicionales o alternos en los sitios de sustitución. Por tanto, el sitio para introducir una modificación de secuencia de aminoácidos está predeterminado y, para optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar mutagénesis mediante alanina o aleatoria y el polipéptido variante resultante se explora para la combinación óptima de actividad deseada y grado de actividad.
Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución incluyen sitios en los que los aminoácidos encontrados en IL-ra son sustancialmente diferentes en términos de volumen de cadena lateral, carga y/o hidrofobicidad de proteínas similares a IL-1ra, tales como los IL-1ra de otras diversas especies o de otros miembros de la familia de IL-1. Otros sitios de interés incluyen aquellos en los que los restos particulares de IL-1ra son idénticos a los de tales proteínas similares a IL-1ra. Tales posiciones generalmente son importantes para la actividad biológica de una proteína. Inicialmente, estos sitios están modificados por sustitución de un modo relativamente conservativo. Tales sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado "Sustituciones Preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales (Sustituciones Ilustrativas) y/o se pueden realizar otras adiciones/deleciones y se pueden explorar los polipéptidos resultantes.
TABLA 1 Sustituciones de Aminoácidos
1
2
Se espera que las modificaciones conservativas en la secuencia de aminoácidos (y las modificaciones correspondientes en la secuencia de ácido nucleico codificante) de IL-1ra produzcan proteínas que tengan características funcionales y químicas similares. Por el contrario, se pueden conseguir modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de IL-1ra seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura de la cadena principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o de hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la proteína en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de cadena lateral:
1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;
3) ácidos: Asp, Glu;
4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) aromáticos: Trp, Tyr, Phe y
6) restos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro.
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Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de uno de estos grupos por otro. Tales restos sustituidos se pueden introducir en regiones de IL-1ra que son homólogas o no homólogas con otros miembros de la familia de IL-1.
Las mutaciones específicas en la secuencia de IL-1ra pueden implicar sustitución de un aminoácido no nativo en el extremo N, extremo C o en cualquier sitio de la proteína que esté modificado por la adición de un hidrato de carbono ligado a N o ligado a O. Tales modificaciones pueden ser de utilidad particular, tal como en la adición de un aminoácido (por ejemplo, cisteína), que es ventajoso para la unión de un polímero soluble en agua para formar un derivado, como se describe más adelante. Además, la secuencia de IL-1ra se puede modificar para añadir sitios de glucosilación o para delecionar sitios de glucosilación ligada a N o ligada a O. Un sitio de reconocimiento de glucosilación ligada a asparagina comprende una secuencia tripeptídica que se reconoce específicamente por enzimas de glucosilación celulares apropiadas. Estas secuencias tripeptídicas son Asn-Xaa-Thr o Asn-Xaa-Ser, donde Xaa puede ser cualquier aminoácido diferente de Pro.
En una realización específica, las variantes son sustancialmente homólogas al aminoácido de IL-1ra (SEC ID Nº: 2). La expresión "sustancialmente homóloga" como se usa en este documento significa un grado de homología que preferiblemente es superior al 70%, más preferiblemente superior al 80%, aún más preferiblemente superior al 90% o mucho más preferiblemente incluso el 95%. El porcentaje de homología como se describe en este documento se calcula como el porcentaje de restos aminoacídicos encontrados en la menor de las dos secuencias que se alinean con restos aminoacídicos idénticos en la secuencia que se está comparando cuando se pueden introducir cuatro huecos en una longitud de 100 aminoácidos para ayudar a ese alineamiento, como se expone en Dayhoff en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. También se incluyen como sustancialmente homólogas las variantes de IL-1ra que se pueden aislar mediante reactividad cruzada con anticuerpos para la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o cuyos genes se pueden aislar mediante hibridación con el ADN de la SEC ID Nº: 1 o con segmentos del mismo.
La producción de variantes de IL-1ra se describe con más detalle más adelante. Tales variantes se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN que codifica variantes de IL-1ra o mediante síntesis química in vitro de las variantes deseadas de IL-1ra. Se entenderá por los especialistas en la técnica que se podrán realizar muchas combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones, suponiendo que las variantes finales de IL-1ra sean biológicamente activas.
Las técnicas de mutagénesis para la sustitución, inserción o deleción de uno o más restos aminoacídicos seleccionados se conocen bien por el especialista en la técnica (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.518.584).
Existen dos variables principales en la construcción de cada variante de secuencia de aminoácidos, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Al diseñar cada variante, la localización de cada sitio de mutación y la naturaleza de cada mutación dependerán de la característica o las características bioquímicas a modificar. Cada sitio de mutación se puede modificar individualmente o en series, por ejemplo, (1) sustituyendo en primer lugar con elecciones de aminoácidos conservativos y después con selecciones más radicales, dependiendo de los resultados conseguidos, (2) delecionando el resto aminoacídico diana o (3) insertando uno o más restos aminoacídicos adyacentes al sitio localizado.
Los derivados modificados químicamente de IL-1ra y variantes de IL-1ra se pueden preparar por el especialista en la técnica, dadas las descripciones en este documento. Se pueden preparar conjugados usando IL-1ra glucosilado, no glucosilado o desglucosilado y variantes de IL-1ra. Típicamente, se usarán IL-1ra no glucosilado y variantes de IL-1ra. Los restos químicos adecuados para la derivatización de IL-1ra y variantes de IL-1ra incluyen polímeros solubles en agua.
Los polímeros solubles en agua son deseables debido a que la proteína a la que se une cada uno no precipitará en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Preferiblemente, el polímero será farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o composición terapéutica. El especialista en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones tales como si el conjugado de polímero/proteína se usará terapéuticamente y, si lo hace, la dosificación deseada, el tiempo de circulación y resistencia a proteolisis.
Los polímeros solubles en agua adecuados, clínicamente aceptables, incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), propionaldehído de polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poli (\beta-aminoácidos) (homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialqueno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (POG) (por ejemplo, glicerol) y otros polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado o glucosa polioxietilada, ácidos colónicos u otros polímeros de hidratos de carbono, ficol o dextrano y mezclas de los mismos.
Como se usa en este documento, polietilenglicol quiere decir que incluye cualquiera de las formas que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono-(C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua.
Los polímeros solubles en agua pueden tener cada uno cualquier peso molecular y pueden estar ramificados o no ramificados. Los polímeros solubles en agua tienen típicamente cada uno un peso molecular promedio entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado). El peso molecular promedio de cada polímero soluble en agua preferiblemente está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, más preferiblemente entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 25 kDa y mucho más preferiblemente aproximadamente 20 kDa. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular o cuantas más ramificaciones, mayor es la proporción de polímero: proteína. Se pueden usar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de liberación sostenida; los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica; la facilidad del manejo; el grado o la ausencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua sobre una proteína terapéutica).
Los polímeros solubles en agua se deben unir cada uno a la proteína con la consideración de los efectos sobre dominios funcionales o antigénicos de la proteína. En general, la derivatización química se puede realizar en cualquier condición adecuada usada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activado. Los grupos de activación que se pueden usar para unir el polímero a los restos activos incluyen los siguientes: sulfona, malemidia, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo.
Los polímeros solubles en agua están unidos cada uno generalmente a la proteína en los grupos \alpha- o \varepsilon-amino de aminoácidos o un grupo tiol reactivo, pero también se considera que se puede añadir un grupo soluble en agua a cualquier grupo reactivo de la proteína que sea suficientemente reactivo para unirse a un grupo soluble en agua en condiciones de reacción adecuadas. Por tanto, un polímero soluble en agua se puede unir covalentemente a una proteína por un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los restos aminoacídicos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos de lisina y el resto aminoacídico N-terminal. Los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico y el resto aminoacídico C-terminal. Los que tienen un grupo tiol reactivo incluyen restos de cisteína.
Los métodos para preparar proteínas conjugadas con polímeros solubles en agua comprenderán generalmente cada uno las etapas de (a) hacer reaccionar una proteína con un polímero soluble en agua en condiciones por las que la proteína se une a uno o más polímeros solubles en agua y (b) obtener el producto de reacción. Las condiciones de reacción para cada conjugación se pueden seleccionar entre cualquiera de las conocidas en la técnica o las desarrolladas posteriormente, pero se deben seleccionar para evitar o limitar la exposición a condiciones de reacción tales como temperaturas, disolventes y niveles de pH que inactivarían la proteína a modificar. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones se determinarán caso por caso basándose en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de polímero soluble en agua: conjugado de proteína, mayor será el porcentaje de producto conjugado. La proporción óptima (en términos de eficacia de reacción porque no hay proteína o polímero que no haya reaccionado en exceso) se puede determinar por factores tales como el grado deseado de derivatización (por ejemplo, mono-, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, si el polímero está ramificado o no ramificado y las condiciones de reacción usadas. La proporción de polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG) a proteína variará generalmente de 1:1 a 100:1. Se pueden preparar uno o más conjugados purificados a partir de cada mezcla mediante técnicas de purificación convencionales, que incluyen, entre otras, diálisis, precipitación salina, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y electroforesis.
Se puede desear específicamente una proteína modificada químicamente en el extremo N. Se puede seleccionar un polímero soluble en agua por peso molecular, ramificación, etc., la proporción de polímeros solubles en agua a moléculas de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción a realizar y el método de obtener la proteína modificada químicamente en el extremo N seleccionada. El método para obtener la preparación de proteína modificada químicamente en el extremo N (es decir, separar este resto de otros restos monoderivatizados, si fuera necesario) puede ser mediante purificación del material de proteína modificada químicamente en el extremo N de una población de moléculas de proteína modificadas químicamente. La modificación química en el extremo N selectiva se puede conseguir por alquilación reductora que aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al N-terminal) disponibles para la derivatización en una proteína particular. En las condiciones de reacción apropiadas, se consigue una derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un polímero que contiene grupo carbonilo. Por ejemplo, se puede unir selectivamente un polímero soluble en agua al extremo N de la proteína realizando la realización a un pH que permita aprovechar las diferencias de pKa entre el grupo \varepsilon-amino de los restos de lisina y las del grupo \alpha-amino del resto N-terminal de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína y no tiene lugar ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de cadena lateral de lisina. Usando alquilación reductora, el polímero soluble en agua puede ser del tipo que se ha descrito anteriormente y debe tener un único aldehído reactivo para acoplarse a la proteína. Se puede usar propionaldehído de polietilenglicol, que contiene un único aldehído
reactivo.
La presente invención considera específicamente la proteína derivatizada químicamente para que incluya restos de mono- o poli-PEG (por ejemplo, 2-4). La pegilación se puede realizar mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica. Los métodos para preparar un producto de proteína pegilada comprenderán generalmente las etapas de: (a) hacer reaccionar un producto de proteína con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG) en condiciones por las que la proteína se une a uno o más grupos de PEG (b) obtener el producto o los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones se determinarán caso por caso basándose en parámetros conocidos y el resultado deseado.
Existen varios métodos de unión disponibles para los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento EP 0 401 384; véase también Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 24: 1028-1035, Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2): 4-10, (publicado por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, Londres N20 OLD, RU); los documentos EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221, WO 95/34326; y las demás publicaciones mencionadas en este documento que se refieren a la pegilación.
Específicamente, la pegilación se puede realizar mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. Por tanto, los productos de proteína de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas pegiladas en las que el grupo o los grupos de PEG se une o se unen mediante grupos acilo o alquilo. Tales productos pueden estar mono-pegilados o poli-pegilados (por ejemplo, que contienen 2-6 y preferiblemente 2-5 grupos de PEG). Los grupos de PEG se unen generalmente a la proteína en los grupos \alpha- o \varepsilon-amino de aminoácidos, pero también se considera que los grupos de PEG se podrían añadir a cualquier grupo amino unido a la proteína que sea suficientemente reactivo para unirse a un grupo de PEG en condiciones de reacción adecuadas.
La pegilación por acilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado de éster activo de polietilenglicol (PEG) con la proteína. Para las reacciones de acilación, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un único grupo éster reactivo. Se puede usar cualquier molécula de PEG reactiva conocida o descubierta posteriormente para realizar la reacción de pegilación. Un éster de PEG activado preferido es PEG esterificado hasta N-hidroxisuccinimida (NHS). Como se usa en este documento, se considera que "acilación" incluye, sin limitación, los siguientes tipos de enlaces entre la proteína terapéutica y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares (véase Chamow (1994), Bioconjugate Chem., 5 (2): 133-140). Las condiciones de reacción se pueden seleccionar entre cualquiera de las conocidos en la técnica de pegilación o las desarrolladas posteriormente, pero deben evitar condiciones tales como temperatura, disolvente y pH que inactivarían la proteína a modificar.
La pegilación por acilación dará como resultado generalmente una proteína poli-pegilada. Preferiblemente, el enlace de conexión será una amida. También preferiblemente, el producto resultante estará solamente (por ejemplo, > 95%) sustancialmente mono, di- o tri-pegilado. Sin embargo, se pueden formar algunas especies con mayores grados de pegilación en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas usadas. Si se desea, se pueden separar especies pegiladas más purificadas de la mezcla (particularmente, especies no reaccionadas) mediante técnicas de purificación convencionales, que incluyen, entre otras, diálisis, precipitación salina, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y electroforesis.
La pegilación por alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con la proteína en presencia de un agente reductor. Para la reacción de alquilación reductora, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un único grupo aldehído reactivo. Un aldehído de PEG reactivo ilustrativo es propionaldehído de polietilenglicol, que es estable en agua, o derivados de alcoxi o ariloxi mono C1-C10 de los mismos (véase, la Patente de Estados Unidos Nº 5.252.714).
La pegilación por alquilación también puede dar como resultado proteína poli-pegilada. Además, se pueden manipular las condiciones de reacción para favorecer sustancialmente la pegilación solamente en el grupo \alpha-amino del extremo N de la proteína (es decir, una proteína mono-pegilada). En el caso de monopegilación o polipegilación, los grupos de PEG se unen preferiblemente a la proteína mediante un grupo -CH_{2}-NH-. Con referencia particular al grupo -CH_{2}-, este tipo de enlace se denomina en este documento un enlace "alquilo".
La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de producto de mono-polímero/proteína comprenderá generalmente las etapas de: (a) hacer reaccionar una proteína con una molécula de PEG reactiva en condiciones de alquilación reductoras, a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo amino de dicha proteína y (b) obtener el producto o los productos de reacción. La derivatización mediante alquilación reductora para producir un producto monopegilado aprovecha las diferencias de pKa entre los grupos amino de lisina y el grupo \alpha-amino en el extremo N (siendo el pKa el pH al que el 50% de los grupos amino están protonados y el 50%, no).
La reacción se realiza a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los restos de lisina y las del grupo \alpha-amino del resto N-terminal de la proteína. En general, si el pH es menor, se deseará un mayor exceso de polímero a proteína (es decir, cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha-amino N-terminal, más polímero se necesitará para conseguir las condiciones óptimas). Si el pH es mayor, la proporción de polímero: proteína no tiene que ser tan grande (es decir, están disponibles más grupos reactivos, de tal forma que se necesitan menos moléculas de polímero). Para los propósitos de la presente invención, el pH se incluirá generalmente en el intervalo de 3-9, preferiblemente 3-6. Para la alquilación reductora, el agente reductor debe ser estable en solución acuosa y preferiblemente ser capaz de reducir solamente la base de Schiff formada en el proceso inicial de alquilación reductora. Los agentes reductores adecuados se pueden seleccionar entre borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, borano de dimetilamina, borano de trimetilamina y borano de piridina. Un agente reductor particularmente adecuado es cianoborohidruro sódico. Se pueden determinar otros parámetros de reacción, tales como disolvente, tiempos de reacción, temperatura y medios de purificación de productos caso por caso, basándose en la información publicada con respecto a la derivatización de proteínas con polímeros solubles en agua.
Mediante tal derivatización selectiva, la unión de un polímero soluble en agua (que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído) a una proteína está controlada: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína y no tiene lugar ninguna modificación significativa de los demás grupos reactivos, tales como los grupos amino de cadena lateral de lisina. La preparación típicamente será mayor del 90% de conjugado de monopolímero/proteína y más típicamente mayor del 95% de conjugado de monopolímero/proteína, estando el resto de las moléculas observables sin reaccionar (es decir, proteína que carece del resto de polímero).
La pegilación también se puede realizar específicamente mediante polímeros solubles en agua que tienen al menos un grupo hidroxi reactivo (por ejemplo, polietilenglicol) que se puede hacer reaccionar con un reactivo que tenga un grupo carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo para convertir el grupo hidroxilo en un aceptor de Michael reactivo, formando de este modo un "enlazador activado" útil para modificar diversas proteínas para proporcionar conjugados biológicamente activos mejorados. "Carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo" significa un grupo carbonilo, nitrilo o sulfona al que se enlaza un grupo de dos carbonos que tienen un sitio activo para acoplamiento específico de tiol sobre el segundo carbono del grupo carbonilo, nitrilo o sulfona (documento WO 92/16221).
Los enlazadores activados pueden ser monofuncionales, bifuncionales o multifuncionales. Los reactivos útiles que tienen un grupo sulfona reactivo que se pueden usar en los métodos incluyen, sin limitación, clorosulfona, vinilsulfona y divinilsulfona.
En una realización específica, el polímero soluble en agua se activa con un receptor de Michael. El documento WO 95/13312 describe, entre otros, PEG activados por sulfona solubles en agua que son altamente selectivos para el acoplamiento con restos de tiol en lugar de restos amino en moléculas y sobre superficies. Estos derivados de PEG son estables contra hidrólisis durante periodos prolongados en entornos acuosos a pH de aproximadamente 11 o menos y pueden formar enlaces con moléculas para formar conjugados que también son hidrolíticamente estables. El enlace por el que los PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan incluye un resto de sulfona acoplado a un resto de tiol y tiene la estructura PEG-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-S-W, donde W representa la molécula biológicamente activa y en la que el resto de sulfona es vinil sulfona o una etil sulfona activa. Dos derivados homobifuncionales particularmente útiles son PEG-bis-clorosulfona y PEG-bis-vinilsulfona.
La Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 08/473.809, presentada el 7 de junio de 1995, describe métodos para preparar enlazadores activados por sulfona obteniendo un compuesto que tiene un grupo hidroxilo reactivo y convirtiendo el grupo hidroxilo en un aceptor de Michael reactivo para formar un enlazador activado, con el uso de tetrahidrofurano (THF) como el disolvente para la conversión. La Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 08/611.918, presentada el 6 de marzo de 1996, describe un proceso para purificar los enlazadores activados que utiliza cromatografía de interacción hidrófoba para separar los enlazadores basándose en el tamaño y la funcionalidad de grupo terminal.
Polinucleótidos
En este documento se describen además polinucleótidos que codifican IL-1ra y variantes de IL-1ra. Basándose en la presente descripción y usando la tabla de codón universal, el especialista habitual en la técnica puede determinar de forma sencilla todas las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de IL-1ra y variantes de IL-1ra.
Las técnicas de expresión recombinante realizadas de acuerdo con las descripciones indicadas más adelante se pueden seguir para producir estos polinucleótidos y para expresar las proteínas codificadas. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifique IL-1ra o una variante de IL-1ra en un vector apropiado, el especialista en la técnica puede producir de forma sencilla grandes cantidades de la secuencia de nucleótidos deseada. Las secuencias se pueden usar después para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, se puede insertar un polinucleótido que codifica IL-1ra o una variante de IL-1ra en un vector de expresión. Introduciendo el vector de expresión en un hospedador apropiado, la proteína deseada se puede producir en grandes cantidades.
Como se describe adicionalmente en este documento, existen numerosos sistemas de hospedador/vector disponibles para la propagación de secuencias de ácido nucleico deseadas y/o para la producción de las proteínas deseadas. Estos incluyen, pero sin limitación, vectores plasmídicos, víricos e insercionales y hospedadores procariotas y eucariotas. Un especialista en la técnica puede adaptar un sistema de hospedador/vector que es capaz de propagar o expresar ADN heterólogo para producir o expresar las secuencias de la presente invención.
Además, se entenderá por los especialistas en la técnica, que, a la vista de la presente descripción, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias de ácido nucleico degenerado que codifican IL-1ra que tienen las secuencias expuestas en la Figura 5 y las secuencias de ácido nucleico que hibridan (preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas) con complementos de estas secuencias de ácido nucleico [Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a 389]. Son condiciones de hibridación rigurosas ilustrativas la hibridación en SSC 4x a 62-67ºC, seguido de lavado en SSC 0,1 x a 62-67ºC durante aproximadamente una hora. Alternativamente, son condiciones de hibridación rigurosas ilustrativas la hibridación en formamida al 45-55%, SSC 4 x a 40-45ºC. También se incluyen secuencias de ADN que hibridan con el complemento de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEC ID Nº: 1 en condiciones de hibridación relajadas y que codifican las variantes de IL-1ra. Los ejemplos de tales condiciones de hibridación de rigurosidad relajada son SSC 4 x a 45-55ºC o hibridación con formamida al 30-40% a 40-45ºC.
También se proporcionan por la presente invención construcciones de ADN recombinante que implican ADN de vector junto con las secuencias de ADN que codifican las proteínas deseadas. En cada una de tales construcciones de ADN, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada (con o sin péptido señal) está en asociación operativa con una secuencia de control o reguladora de la expresión adecuada capaz de dirigir la replicación y/o expresión de la proteína deseada en un hospedador seleccionado.
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Expresión Recombinante Preparación de Polinucleótidos
Se pueden obtener de forma sencilla secuencias de ácido nucleico que codifiquen IL-1ra o variantes de IL-1 ra de una diversidad de maneras que incluyen, sin limitación, síntesis química, exploración de genotecas de ADNc o genómicas, exploración de bibliotecas de expresión y/o amplificación por PCR de ADNc. Estos métodos y otros que son útiles para aislar tales secuencias de ácido nucleico se exponen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; por Ausubel et al. (1994), eds, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; y por Berger y Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA.
Se puede conseguir la síntesis química de secuencias de ácido nucleico usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como los expuestos por Engels et al. (1989), Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716-734 y Wells et al. (1985), Gene, 34: 315. Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos de fosfotriéster, fosforamidita y H-fosfonato de síntesis de secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden sintetizar grandes secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, las mayores de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, como varios fragmentos. Después, los fragmentos se pueden ligar entre sí para formar secuencias de ácido nucleico que codifiquen una proteína deseada. Un método preferido es síntesis respaldada por polímero usando química de fosforamidita convencional.
Alternativamente, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada explorando una genoteca de ADNc apropiada (es decir, una genoteca preparada a partir de una o más fuentes tisulares que se piensa que expresan la proteína) o una biblioteca genómica (una biblioteca preparada a partir de ADN genómico total). La fuente de la biblioteca de ADNc típicamente es un tejido de cualquier especie que se piensa que expresa una proteína deseada en cantidades razonables. La fuente de la biblioteca genómica puede ser cualquier tejido o tejidos de cualquier mamífero u otra especie que se piensa que aloja un gen que codifica una proteína deseada.
Los medios de hibridación se pueden explorar para la presencia de ADN que codifica una proteína deseada usando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, fragmentos de ADNc o ADN genómico que poseen un nivel aceptable de homología con el ADNc o gen a clonar) que hibridarán selectivamente con ADNc o genes presentes en la biblioteca. Las sondas usadas típicamente para tal exploración codifican una pequeña región de secuencia de ADN de la misma especie o una similar que la especie a partir de la cual se preparó la biblioteca. Alternativamente, las sondas pueden estar degeneradas, como se analiza en este documento.
La hibridación se consigue típicamente hibridando una sonda oligonucleotídica o ADNc a los clones en condiciones de rigurosidad que evitan la unión no específica pero que permiten la unión de los clones que tienen un nivel significativo de homología con la sonda o el cebador. Las condiciones de rigurosidad de hibridación y lavado típicas dependen en parte del tamaño (por ejemplo, número de nucleótidos en longitud) de la sonda de ADNc o de oligonucleótido y si la sonda está degenerada. La probabilidad de identificar un clon también se considera a diseñar el medio de hibridación (por ejemplo, si se está explorando una biblioteca de ADNc o genómica).
Cuando se usa un fragmento de ADN (tal como un ADNc) como una sonda, las condiciones de hibridación típicas incluyen las expuestas en Ausubel et al. (1994), eds., supra. Después de la hibridación, el medio de hibridación se lava con una rigurosidad adecuada dependiendo de varios factores tales como tamaño de sonda, homología esperada de sonda a clon, el medio de hibridación que se está explorando, el número de clones que se está explorando y similares. Los ejemplos de soluciones de lavado rigurosas, que habitualmente son bajas en fuerza iónica y se usan a temperaturas relativamente altas, son los siguientes: uno de tales lavados rigurosos es NaCl 0,015 M, NaCitrato 0,005 M y SDS al 0,1% a 55-65ºC; otro de tales lavados rigurosos es Na_{2}EDTA 1 mM, NaHPO4 40 mM, pH 7,2 y SDS al 1% a aproximadamente 40-50ºC; y otro lavado riguroso es SSC 0,2 X y SDS al 0,1% a aproximadamente 50-65ºC.
También existen protocolos ilustrativos para condiciones de lavado rigurosas en las que se usan sondas oligonucleotídicas para explorar medio de hibridación. Por ejemplo, un primer protocolo usa SSC 6 X con pirofosfato sódico al 0,05 por ciento a una temperatura entre aproximadamente 35ºC y 63ºC, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, se lavan sondas de 14 bases a 35-40ºC, sondas de 17 bases a 45-50ºC, sondas de 20 bases a 52-57ºC y sondas de 23 bases a 57-63ºC. La temperatura se puede aumentar 2-3ºC cuando la unión no específica de fondo aparece alta. Un segundo protocolo usa cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para el lavado. Una de tales soluciones de lavado riguroso es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y SDS al 0,2%.
Otro método adecuado para obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método se prepara ADNc a partir de poli(A) + ARN o ARN total usando la enzima transcriptasa inversa. Después, dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas de ADNc (oligonucleótidos) que codifica la proteína deseada, se añaden al ADNc junto con una polimerasa tal como Taq polimerasa y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.
Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas o cebadores deben ser de longitud adecuada y suficientemente inequívocas a fin de minimizar la cantidad de unión no específica que puede tener lugar durante la exploración o amplificación por PCR. La secuencia real de las sondas o cebadores habitualmente se basa en secuencias o regiones conservadas o altamente homólogas. Opcionalmente, las sondas o los cebadores pueden ser completa o parcialmente degenerados, es decir, pueden contener una mezcla de sondas/cebadores, que codifican todos la misma secuencia de aminoácidos pero usando diferentes codones para realizar esto. Una alternativa para preparar sondas degeneradas es poner una inosina en algunas o todas de esas posiciones de codón que varían por especies. Las sondas o cebadores oligonucleotídicos se pueden preparar mediante métodos de síntesis química para ADN, como se ha descrito anteriormente.
Vectores
Se puede insertar ADN que codifica las proteínas deseadas en vectores para clonación adicional (amplificación del ADN) o para la expresión. Los vectores adecuados están disponibles en el mercado o el vector se puede construir específicamente. La selección o la construcción de un vector apropiado dependerá de (1) si se va a usar para amplificación de ADN o para expresión de ADN, (2) el tamaño del ADN a insertar en el vector y (3) la célula hospedadora deseada a transformar con el vector.
Los vectores implican cada uno una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada unida operativamente a una o más de las siguientes secuencias de control o reguladoras de la expresión capaces de dirigir, controlar o realizar de otro modo la expresión de una proteína deseada por una célula hospedadora seleccionada. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y su compatibilidad con la célula hospedadora deseada. Los componentes de vector incluyen generalmente, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes de selección o marcadores, un promotor, un elemento potenciador, una secuencia de terminación de la transcripción y similares. Estos com-
ponentes se pueden obtener a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar mediante procedimientos conocidos.
Los ejemplos de vectores de clonación procariotas adecuados incluyen bacteriófagos tales como derivados de lambda o plásmidos de E. coli (por ejemplo, pBR322, col E1, pUC, el factor F y derivados de plásmido Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). También se pueden usar para este propósito otros vectores de expresión apropiados, de los que se conocen en la técnica numerosos tipos para las células hospedadoras descritas más adelante.
Secuencia Señal
El ácido nucleico que codifica una secuencia señal se puede insertar 5' de la secuencia que codifica una proteína deseada, por ejemplo, puede ser un componente de un vector o puede ser parte de un ácido nucleico que codifica la proteína deseada. Por ejemplo, se conoce el ácido nucleico que codifica la secuencia señal nativa de IL-1ra (Patente de Estados Unidos Nº 5.075.222).
Origen de Replicación
Los vectores de expresión y clonación generalmente incluyen cada uno una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. En un vector de clonación, esta secuencia típicamente es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador e incluye un origen de replicación o secuencia de replicación autónoma. Tales secuencias se conocen bien. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas y son útiles diversos orígenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen de SV40 se usa con frecuencia solamente debido a que contiene el promotor temprano).
Gen de Selección
Los vectores de expresión y clonación contienen típicamente cada uno un gen de selección. Este gen codifica una proteína "marcadora" necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células hospedadoras transformadas cuando se cultivan en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras que no se transforman con el vector no contendrán el gen de selección y, por lo tanto, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxótrofas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio de cultivo.
Se pueden usar otros genes de selección para amplificar los genes a expresar. La amplificación es el proceso en el que los genes que son más demandados para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores de selección adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. Los transformantes celulares se ponen bajo presión de selección a la que solamente los transformantes están adaptados de forma única para sobrevivir mediante los marcadores presentes en los vectores. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de este modo a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica una proteína deseada. Como resultado, se sintetizan cantidades crecientes de una proteína deseada a partir del ADN amplificado.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedadora apropiada cuando se usa DHFR de tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino deficiente en actividad de DHFR (Urlaub y Chasin (1980), Proc. Natl. Acad., Sci., USA, 77(7): 4216-4220). Después, las células transformadas se exponen a niveles aumentados de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de DHFR y, de forma concomitante, múltiples copias de otro ADN presente en el vector de expresión, tal como el ADN que codifica una proteína deseada.
Promotor
Los vectores de expresión y clonación contendrán cada uno típicamente un promotor que se reconoce por el organismo hospedador y está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada. Un promotor es una secuencia no traducida localizada cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente en el intervalo de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, tal como la que codifica una proteína deseada. Un promotor se puede agrupar convenientemente en una de dos clases, promotores inducibles o promotores constitutivos. Un promotor inducible inicia niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Se conoce bien un gran número de promotores, reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. Un promotor puede estar unido operativamente al ADN que codifica una proteína deseada eliminando el promotor del ADN de fuente por digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora deseada. La secuencia promotora de IL-1ra nativa se puede usar para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN que codifica una proteína deseada. Sin embargo, se prefiere un promotor heterólogo, si permite una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo y si es compatible con el sistema de célula hospedadora que se ha seleccionado para el uso. Por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de promotor nativo de los demás miembros de la familia de IL-1 se puede usar para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN que codifica una proteína deseada.
Los promotores adecuados para el uso con hospedadores procariotas incluyen los sistemas de promotor de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp); un sistema de gen de luminiscencia bacteriana (luxR) y promotores híbridos tales como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo de este modo a un especialista en la técnica ligar los mismos en la secuencia o las secuencias de ADN deseadas usando enlazadores o adaptadores cuando se necesite para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.
También se conocen en la técnica bien secuencias promotoras adecuadas para el uso con hospedadores de levadura. Los promotores adecuados para el uso con células hospedadoras de mamíferos se conocen bien e incluyen los obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de peste aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis B y, más preferiblemente, virus del simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.
Elemento Potenciador
Los vectores de expresión y clonación contendrán cada uno típicamente una secuencia potenciadora para aumentar la transcripción por eucariotas superiores de una secuencia de ADN que codifica una proteína deseada. Los potenciadores son elementos que actúan en cis del ADN, habitualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de orientación y posición. Se han encontrado 5' y 3' de la unidad de transcripción. Los potenciadores de levadura se han usado ventajosamente con promotores de levadura. Se conocen varias secuencias potenciadoras de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Adicionalmente, los potenciadores víricos tales como el potenciador de SV40, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus son elementos potenciadores ilustrativos para la activación de promotores eucariotas. Aunque un potenciador se puede empalmar en un vector en una posición 5' ó 3' de un ADN que codifica una proteína deseada, se localiza típicamente en un sitio 5' del promotor.
Terminación de la Transcripción
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas contendrán cada uno típicamente una secuencia necesaria para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles de forma común de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADN o ADNc eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica una proteína deseada.
Construcción de Vector
La construcción de vectores adecuados, que contienen cada uno uno o más de los componentes que se han enumerado anteriormente (junto con la secuencia codificante que codifica una proteína deseada), se puede conseguir mediante técnicas de ligación convencionales. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, adaptan y religan en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la secuencia correcta, la mezcla de ligación se puede usar para transformar E. coli y se pueden seleccionar los transformantes éxitos mediante técnicas conocidas como se ha descrito anteriormente. Después se preparan cantidades del vector de los transformantes, se analizan por digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian para confirmar la presencia de la construcción deseada.
Un vector que proporciona la expresión transitoria de ADN que codifica una proteína deseada en células de mamífero también se puede usar. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse de forma eficaz en una célula hospedadora, de tal forma que la célula hospedadora acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de la proteína deseada codificada por el vector de expresión. Cada sistema de expresión transitorio, que comprende un vector de expresión adecuado y una célula hospedadora, permite la identificación positiva práctica de proteínas codificadas por ADN clonados así como la exploración rápida de tales proteínas para propiedades biológicas o fisiológicas deseadas, es decir, identificar una variante biológicamente activa de proteína IL-1ra.
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Células Hospedadoras
Por la presente invención también se proporciona cualquiera de una diversidad de células hospedadoras recombinantes, cada una de las cuales contiene una secuencia de ácido nucleico para el uso en la expresión de una proteína deseada. Las células hospedadoras procariotas y eucariotas ilustrativas incluyen células bacterianas, de mamífero, fúngicas, de insecto, de levadura o vegetales.
Las células hospedadoras procariotas incluyen, pero sin limitación, eubacterias tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos (por ejemplo, E. coli (HB101, DH5a, DH10 y MC1061), Bacilli, tales como B. subtilis, Pseudomonas, tales como P. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella typhimurium; o Serratia marcescans. Como una realización específica, una proteína deseada se puede expresar en E. coli.
Además de células hospedadoras procariotas, los microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras pueden ser hospedadores adecuados para la expresión de una proteína deseada. Saccharomyces cerevisiae o levadura común de panadero, es la usada de forma más común entre microorganismos hospedadores eucariotas inferiores, pero varios otros géneros, especies y cepas se conocen bien y están disponibles de forma común.
Una proteína deseada se puede expresar en forma glucosilada mediante una cualquiera de varias células hospedadoras adecuadas obtenidas de organismos multicelulares. Tales células hospedadoras son capaces de actividades complejas de procesamiento y glucosilación. En principio, se puede usar cualquier cultivo celular eucariota superior, si tal cultivo implica células de vertebrados o invertebrados, incluyendo células vegetales y de insecto. Como una realización específica, una proteína deseada se puede expresar en células de baculovirus.
Se pueden usar células de vertebrados, ya que la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) es un procedimiento bien conocido. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación, la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea de riñón embrionaria humana (células 293 o células 293 subclonadas para cultivo en suspensión), células de riñón de cría de hámster y células de ovario de hámster chino. Otras líneas de células de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 obtenidas de ratones Swiss, Balb-c o NIH y líneas celulares de hámster BHK o HaK. Como una realización específica, una proteína deseada se puede expresar en células COS.
Una célula hospedadora se puede transfectar y preferiblemente transformar con un ácido nucleico deseado en condiciones apropiadas que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La selección de células hospedadoras adecuadas y métodos para la transformación, cultivo, amplificación, exploración y producción de producto y purificación se conocen bien en la técnica (Gething y Sambrook (1981), Nature, 293: 620-625 o alternativamente, Kaufman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7): 1750-1759 o la Patente de Estados Unidos Nº 4.419.446). Por ejemplo, para células de mamífero sin paredes celulares, se puede usar el método de precipitación con fosfato cálcico. También se pueden usar técnicas de electroporación, microinyección y otras técnicas conocidas.
También es posible que se pueda producir una proteína deseada mediante recombinación homóloga o con métodos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en células que ya contienen el ADN que codifica la proteína deseada. La recombinación homóloga es una técnica desarrollada de forma original para dirigirse a genes para inducir o corregir mutaciones en genes activos de forma transcripcional (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36: 301). La técnica básica se desarrolló como un método para introducir mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de mamífero (Thomas et al. (1986), Cell, 44: 419-428, Thomas y Capecchi (1987), Cell 51: 503-512 y Doetschman et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583-8587) o para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman et al. (1987), Nature, 330: 576-578). Se describen técnicas ilustrativas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.272.071; los documentos WO 92/01069, WO 93/03183, WO 94/12650 y WO 94/31560.
Mediante recombinación homóloga, la secuencia de ADN a insertar en el genoma se puede dirigir a una región específica del gen de interés uniendo el mismo al ADN de dirección. El ADN de dirección es ADN que es complementario (homólogo) a una región del ADN genómico. Pequeños trozos de ADN de dirección que son complementarios a una región específica del genoma se ponen en contacto con la cadena parental durante el proceso de replicación de ADN. Una propiedad general del ADN que se ha insertado en una célula es hibridar y, por lo tanto, recombinarse con otros trozos de ADN endógeno mediante regiones homólogas compartidas. Si esta cadena complementaria se une a un oligonucleótido que contiene una mutación o una secuencia diferente de ADN, también se incorpora en la cadena recién sintetizada como resultado de la recombinación. Como resultado de la función de corrección de errores, es posible que la nueva secuencia de ADN sirva como el molde. Por tanto, el ADN transferido se incorpora en el genoma.
Si se conoce la secuencia de un gen particular, tal como la secuencia de ácido nucleico de una proteína deseada, se puede sintetizar u obtener de otro modo la secuencia de control de la expresión (un trozo de ADN que es complementario a una región seleccionada del gen), tal como por restricción apropiada del ADN nativo en sitios de reconocimiento específicos que unen la región de interés. Este trozo sirve como una secuencia de dirección después de la inserción en la célula e hibridará con su región homóloga dentro del genoma. Si esta hibridación tiene lugar durante la replicación del ADN, este trozo de ADN y cualquier secuencia adicional unida al mismo, actuará como un fragmento de Okazaki y se pespunteará en la cadena hija recién sintetizada de ADN.
Unidas a estos trozos de ADN de dirección hay regiones de ADN que pueden interaccionar con la expresión de una proteína deseada. Por ejemplo, un elemento promotor/potenciador, un supresor o un elemento modulador de la transcripción exógeno se inserta en el genoma de la célula hospedadora deseada en proximidad y orientación suficiente para influir en la transcripción del ADN que codifica la proteína deseada. El elemento de control no codifica una proteína deseada pero, en su lugar, controla una porción del ADN presente en el genoma de la célula hospedadora. Por tanto, la expresión de una proteína deseada se puede conseguir no mediante transfección de ADN que codifica una proteína deseada, sino mediante el uso de ADN de dirección (que contiene regiones de homología con el gen endógeno de interés), acoplado con segmentos reguladores de ADN que proporcionan a la secuencia génica endógena señales reconocibles para la transcripción de una proteína deseada.
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Cultivo de las Células Hospedadoras
El método para cultivar cada una de la una o más células hospedadoras recombinantes para la producción de una proteína deseada variará dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento de producción óptimo para una situación dada será evidente para los especialistas en la técnica mediante experimentación mínima. Tales células hospedadoras recombinantes se cultivan en un medio adecuado y la proteína expresada después se recupera opcionalmente, se aísla y se purifica del medio de cultivo (o de la célula, si se expresa intracelularmente) mediante un medio apropiado conocido por los especialistas en la técnica.
Específicamente, cada una de las células recombinantes usadas para producir una proteína deseada se puede cultivar en medio adecuado para inducir promotores, seleccionar células hospedadoras recombinantes adecuadas o amplificar el gen que codifica la proteína deseada. El medio se puede complementar cuando sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes habitualmente en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa u otra fuente de energía. También se pueden incluir otros complementos a concentraciones apropiadas, como se entenderá por los especialistas en la técnica. También se conocen bien las condiciones de cultivo adecuadas, tales como temperatura, pH y similares, por los especialistas en la técnica para el uso con las células hospedadoras seleccionadas.
El producto de expresión resultante se puede purificar después hasta prácticamente homogeneidad usando procedimientos conocidos en la técnica. Se describen técnicas de purificación ilustrativas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.075.222 y el documento WO 91/08285. Preferiblemente, el producto de expresión se produce en una forma sustancialmente pura. Con "sustancialmente pura" se quiere decir IL-1ra, en una forma modificada, que tiene una actividad específica comparativamente alta, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 150.000-500.000 unidades de receptor/mg como se define en Hannum et al. (1990), Nature, 343: 336-340 y Eisenberg et al. (1990), Nature, 343: 341-346. Sin embargo, se tiene que reconocer que una variante de IL-1ra puede tener una actividad específica diferente.
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Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas incluirán cada una típicamente generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de un IL-1ra, una variante de IL-1ra o un derivado químico del mismo (denominado en lo sucesivo en este documento de forma conjunta un "producto de IL-1ra") y un material de liberación controlada, óptimamente en un vehículo. El vehículo incluye preferiblemente uno o más materiales de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables mezclados con el producto de IL-1ra y material de liberación controlada.
El polímero de liberación controlada se puede seleccionar de polímeros de erosión a granel (por ejemplo, copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), mezclas de polímero de PLGA, copolímeros de bloque de PEG y ácido láctico y glicólico, poli(cianoacrilatos)); polímeros de erosión de superficie (por ejemplo, poli(anhídridos) y poli(orto ésteres)); ésteres de hidrogel (por ejemplo, polioles pluronic, poli(vinil alcohol), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-éter de alquil vinilo, poli(2-hidroxietil metacrilato) (pHEMA), ácido metacrílico (MAA), mezclas de pHEMA y MAA, celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa), hialuronano, alginato, colágeno, gelatina, albúmina y almidones y dextranos) y sistemas de composición de los mismos; o preparaciones de liposomas o microesferas. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo de las presentes proteínas y derivados. La formulación farmacéutica óptima para una proteína deseada se determinará por un especialista en la técnica dependiendo de la vía de administración y la dosificación deseada. Se describen composiciones farmacéuticas ilustrativas en Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332-351 y Remington Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712. Están disponibles composiciones de liberación controlada específicas de los siguientes proveedores: DepoTech Corp., San Diego, CA (Depofoam^{TM}, un liposoma multivesicular) y Alkermes, Inc., Cambridge, MA (ProLease^{TM}, una microesfera de PLGA).
La composición farmacéutica proporcionada por la presente invención comprende la combinación de hialuronano o una sal del mismo y un antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra). La presente invención proporciona el uso de la composición farmacéutica para tratar un paciente aquejado de una enfermedad articular inflamatoria, esclerosis múltiple, leucemia, lesión isquémica o lesión por reperfusión. En un aspecto de acuerdo con la presente invención, dicha enfermedad articular inflamatoria se selecciona entre artritis reumatoide, osteoartritis y otras afecciones inflamatorias que se producen por distensión, esguince, traumatismo, infección, lesión de cartílago o cirugía ortopédica.
En una realización específica, la presente invención se refiere a sistemas de suministro de fármaco basados en hialuronano en formas reticuladas solubles o no solubles. Como se usa en este documento, se pretende que el hialuronano incluya hialuronano, ácido hialurónico, sales de los mismos (tal como hialuronato sódico), ésteres, éteres, derivados enzimáticos y geles reticulados de ácido hialurónico y derivados químicamente modificados de ácido hialurónico (tal como hilano). El ácido hialurónico no modificado o modificado sirve como un vehículo que proporciona liberación lenta de un fármaco de un sistema.
El hialuronano puede ser de cualquier tipo ya reconocido como útil para tales propósitos. Se puede extraer de diversos materiales no limitantes tales como crestas de gallo o cordones umbilicales o de cultivos bacterianos tales como los de estreptococos hemolíticos de grupo A o C. Se describen formas ilustrativas de hialuronano en Peyron y Balazs (1974), Path. Biol., 22(8): 731-736; Isdale et al. (1991), J. Drug Dev., 4(2): 93-99; Larsen et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27: 1129-1134; Namiki, et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11): 501-507; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Release, 35: 67-72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4: 99-110; Sakakibara et al. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299: 282-292; Meyers y Brandt (1995), 22(9): 1732-1739; Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand, 66(266): 116-120; Cascone et al. (1995), Biomaterials, 16(7): 569-574; Yerashalmi et al. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2): 267-273; Bernatchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5): 677-681; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1): 38-43; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332-351; Patentes de Estados Unidos Nº 4.582.865, 4.605.691, 4.636.524, 4.713.448, 4.716.154, 4.716.224, 4.772.419, 4.851.521, 4.957.774, 4.863.907, 5.128.326, 5.202.431, 5.336.767, 5.356.883; Solicitud de Patente Europea Nº 0 507 604 A2 y 0 718 312 A2 y documento WO 96/05845.
El hialuronano debe ser lo suficientemente puro para evitar provocar una reacción adversa o tóxica en el mamífero que se está tratando. Esto implica que esté libre de pirógenos y tenga un nivel suficientemente bajo de proteínas y/o ácidos nucleicos con los que el hialuronano está asociado de forma natural, de tal forma que no se provoque reacción inmune sustancial. Se describen procedimientos de purificación adecuados en la Patente de Estados Unidos Nº 4.141.973, la Patente de Estados Unidos Nº 5.411.874, la Patente de Estados Unidos Nº 5.442.053, la Patente de Estados Unidos Nº 5.559.104, la Patente de Estados Unidos Nº 5.563.051 y las Solicitudes de Patentes Japonesas Nº 14594/1977, 67100/1979 y 74796/1980.
El hialuronano puede estar en su forma de ácido libre o en una forma de sal farmacológicamente aceptable. Además, como sales se pueden mencionar una sal de metal alcalino tal como sal sódica o potásica y una sal de metal alcalino térreo tal como sal de calcio o magnesio. La fuente preferida de hialuronano es un cultivo de un microorganismo apropiado.
El hialuronano que tiene un peso molecular dentro de un amplio intervalo se puede usar en la presente invención. El peso molecular de hialuronano generalmente está entre 0,1 x 10^{6} y 1 x 10^{7}, preferiblemente entre 0,5 x 10^{6} y 5 x 10^{6}, más preferiblemente entre 1 x 10^{6} y 5 x 10^{6} y mucho más preferiblemente entre 1 x 10^{6} y 4 x 10^{6} (por ejemplo, entre 1 x 10^{6} y 2 x 10^{6}).
El aumento del peso molecular de hialuronano por reticulación se ha conseguido de varias maneras. Sakuria et al. en la Patente de Estados Unidos Nº 4.716.224 describen ácido hialurónico reticulado o sales del mismo preparados por la reticulación de ácido hialurónico o sus sales con un epóxido polifuncional. En la Patente de Estados Unidos Nº 4.863.907, Sakuri et al. describen glucosaminoglicanos o sales de los mismos reticulados preparados reticulando un glucosaminoglicano o una sal del mismo con un compuesto epoxi polifuncional. Huang et al., en la Solicitud de Patente Europea Nº 0 507 604 A2, describen polisacáridos que contienen carboxilo reticulados iónicamente en los que el agente de reticulación es un compuesto que posee un catión trivalente. Malson et al., en la Patente de Estados Unidos Nº 4.716.154 y la Patente de Estados Unidos Nº 4.772.419, describen la reticulación de ácido hialurónico con epóxidos bi- o polifuncionales o sus halohidrinas correspondientes, epihalohidrinas o haluros y divinil sulfona. En la Patente de Estados Unidos Nº 4.957.744, della Valle et al. describen la reticulación de ésteres de ácido hialurónico preparados esterificando los grupos carboxilo de ácido hialurónico con alcoholes polihídricos. Balazs et al., en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.582.865, 4.605.691 y 4.636.524, describen la reticulación de ácidos hialurónicos y sus sales y de otros polisacáridos por reacción con divinil sulfona. En las Patentes de Estados Unidos Nº 5.128.326 y 4.582.865, Balazs et al. describen la reticulación de ácido hialurónico con formaldehído, epóxidos, compuestos poliaziridilo y divinil sulfona. En la Patente de Estados Unidos Nº 4.713.448, Balazs et al. describen la modificación de forma química de ácido hialurónico por reacción con aldehídos tales como formaldehído, glutaraldehído y glioxal y describen la posibilidad de que haya tenido lugar la reticulación. En la Patente de Estados Unidos Nº 5.356.883, Kuo et al. describen la reticulación de ácido hialurónico por reacción con biscarbodiimidas. En el documento EP 0 718 312 A2, Nguyen describe la reticulación de ácido hialurónico o sus sales, y de otros polisacáridos, por reacción con di- o polianhidridos.
La concentración de hialuronano en los productos, basada en los polímeros solubles, puede estar en el intervalo de aproximadamente el 0,05% al 5% en peso y mayor, dependiendo del uso final del producto, preferiblemente entre el 0,1% al 4% en peso, más preferiblemente entre el 1% al 3% en peso. La concentración de inhibidor de IL-1 se puede variar a lo largo de límites muy amplios y preferiblemente se debe seleccionar dependiendo de la solubilidad del inhibidor de IL-1, su actividad farmacológica, el efecto deseable del producto final, etc.
El hialuronano reticulado se disuelve habitualmente en un disolvente (por ejemplo, solución salina fisiológica) hasta una viscosidad suficiente para que pase a través de una aguja de inyección. El material de baja viscosidad facilita en gran medida la inyección permitiendo, por ejemplo, el uso de una solución concentrada de hialuronano acuosa en dosis de tamaño práctico. Por tanto, por ejemplo, una solución acuosa al 1% de hialuronano se puede utilizar de forma sencilla para dosis de inyección de aproximadamente 10 mililitros, que contienen cada una aproximadamente 100 miligramos de ingrediente activo si su viscosidad es menor de aproximadamente 200 c/s a 37ºC (como se determina usando un Viscosímetro Semi-Micro Cannon-Manning de acuerdo con los procedimientos en ASTM D 445 y D 2515).
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El sistema de suministro de fármaco de acuerdo con la presente invención incluye lo siguiente:
1)
soluciones de hialuronano en las que se disuelve o dispersa una sustancia farmacológica;
2)
un gel de hialuronano reticulado que forma una "jaula" macromolecular en la que se dispersa una sustancia farmacológica;
3)
un gel mixto reticulado de hialuronano y al menos un polímero hidrófilo diferente en el que se dispersa una sustancia farmacológica; y
4)
un gel reticulado de hialuronano o gel mixto reticulado de hialuronano y al menos un polímero hidrófilo diferente que contiene una sustancia farmacológica que se une covalentemente a las macromoléculas del ácido hialurónico u el otro polímero.
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Existen varios métodos para combinar un fármaco con el gel y, por consiguiente, varios tipos de productos que se pueden obtener.
Uno de los métodos comprende difundir un fármaco en un gel cuando el gel se pone en una solución del fármaco. El proceso de difusión habitualmente es lento y depende de la concentración de fármaco, temperatura de la solución, tamaño de las partículas del gel, etc. El producto obtenido mediante este método es un gel en el que se dispersa uniformemente una sustancia farmacológica.
Se puede obtener el mismo tipo de producto deshidratando un gel de hialuronano y re-hinchando el mismo en una solución farmacológica. Para deshidratar un gel se puede usar un disolvente orgánico miscible en agua o, alternativamente, el agua de un gel se puede eliminar por secado. Sin embargo, es preferible usar un disolvente debido a que después del secado a una temperatura baja o elevada, el gel no se puede re-hinchar hasta su grado de hinchamiento inicial. Por otro lado, después de deshidratar con un disolvente, el gel se hincha hasta el mismo volumen que tenía antes del tratamiento. Los disolventes preferidos son etanol e isopropanol y cetonas tales como acetona, aunque también se pueden usar otros disolventes.
Se puede usar otro método más para obtener productos de este tipo. Este método comprende permitir que un gel de ácido hialurónico concentrado que se produce por una reacción de reticulación realizada previamente en una solución relativamente concentrada de hialuronano se hinche en una solución de una sustancia farmacológica.
Aunque esos tres métodos dan todos como resultado productos que son esencialmente iguales, cada uno de los métodos tiene ciertas ventajas cuando se compara con cualquiera de los demás métodos para cualquier producto específico y, por tanto, la elección del método se debe realizar considerando parámetros tales como naturaleza del fármaco, la concentración deseada del fármaco en el sistema, la velocidad de suministro, etc.
Para obtener una solución de hialuronano en la que se disuelve o dispersa una sustancia farmacológica, se puede usar cualquier método convencional. El hialuronano de cualquier fuente se puede disolver en agua o en solución salina fisiológica hasta una concentración deseada y después se disuelve o dispersa un fármaco en la solución resultante. Alternativamente, una solución o dispersión de un fármaco se puede mezclar con solución de hialuronano. La concentración de polímero se elige dependiendo del uso final del producto y el peso molecular de hialuronano. La concentración de fármaco se elige dependiendo de la actividad deseada del producto.
Para cargar un gel hinchado reticulado con un fármaco usando el proceso de difusión, el gel se puede poner en una solución de fármaco. El tiempo hasta la finalización de este proceso depende del tamaño de partículas del gel, proporción de hinchamiento del gel, la temperatura del proceso, agitación, concentración del fármaco en la solución, etc. Mediante combinación apropiada de estos parámetros, un gel hinchado se puede cargar con un fármaco en un periodo de tiempo relativamente corto.
Para deshidratar un gel reticulado con un disolvente, es suficiente poner el gel en cualquier forma (es decir, como partículas finas o como una membrana) en un disolvente, preferiblemente un disolvente volátil (por ejemplo, isopropanol) y mantener el mismo en el disolvente durante una cantidad de tiempo suficiente para eliminar el agua del gel. El grado de la eliminación de agua depende del tamaño de las partículas o el grosor de membrana, la proporción de gel/disolvente, etc. El tratamiento con un disolvente se puede repetir varias veces, si se desea. El disolvente del gel se puede eliminar secando con presión normal o en un vacío a temperatura ambiente o elevada. El gel deshidratado de este modo, cuando se pone en una solución de fármaco, se rehincha hasta la proporción de hinchamiento inicial.
Están disponibles composiciones de hialuronano específicas en los siguientes proveedores: (BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (Synvisc^{TM}, una mezcla 90:10 de fluido de hilano y gel de hilano); Fidia S.pA., Abano Terme, Italia (Hyalgan^{TM}, la sal sódica de un ácido hialurónico procedente de cresta de gallo (\sim500.000 a \sim700.000 PM)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Tokio, Japón (Artz^{TM}, una solución al 1% de un ácido hialurónico procedente de cresta de gallo, \sim700.000 PM); Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia (Healon^{TM}, un ácido hialurónico procedente de cresta de gallo, \sim4 x 10^{6} PM); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (SurgicoatT^{TM}, un ácido hialurónico recombinante); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Hyaluronic Acid FCH, un Ácido Hialurónico de alto peso molecular (por ejemplo, \sim1,5-2,2 x 10^{6} PM) preparado de cultivos de Streptococcus zooepidemicus; Hialuronato Sódico MV, \sim1,0-1,6 x 10^{6} PM e Hialuronato Sódico LV, \sim1,5-2,2 x 10^{6} PM); Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Suiza (Ácido Hialurónico, sal sódica (catálogo de compañía de 1997 número 385908) preparado a partir de Streptococcus sp.); Intergen Company, Purchase, NY (un ácido hialurónico procedente de cresta de gallo, >1 x 10^{6} PM); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japón.
El disolvente principal en un vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, preferiblemente entre 6,0 y 7,0, más preferiblemente 6,5 (por ejemplo, tampones tales como citratos, fosfatos y aminoácidos tales como glicina); agentes de volumen para formulación liofilizada (por ejemplo, manitol y glicina); osmolaridad (por ejemplo, manitol y cloruro sódico); tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80, triton y pluronics); viscosidad; transparencia; color, esterilidad; estabilidad (por ejemplo, sacarosa y sorbitol); antioxidantes (por ejemplo, sulfito sódico e hidrógeno sulfito sódico); conservantes (por ejemplo, ácido benzoico y ácido salicílico); olor de la formulación., agentes saporíferos y diluyentes; velocidad de disolución (por ejemplo, solubilizantes o agentes de solubilización tales como alcoholes, polietilenglicoles y cloruro sódico); velocidad de liberación; agentes emulsionantes; agentes de suspensión; disolventes; cargas; vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. La formulación farmacéutica óptima para una proteína deseada se determinará por el especialista en la técnica dependiendo de la vía de administración y dosificación deseada (véase, por ejemplo, Regminton's Pharmaceutical Sciences, 18^{a} Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712). Las formulaciones farmacéuticas específicas son las siguientes: citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato 80 al 0,1% (p/p) en agua; pH 6,5 ("formulación de tampón citrato"); y fosfato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, polisorbato 80 entre el 0,1% (p/p) y el 0,01% (p/p) en agua y, opcionalmente, EDTA 0,5 milimolar, pH 6,5 ("formulación de tampón fosfato").
En una realización preferida de la presente invención, IL-1ra en forma de partículas divididas de forma fina se disuelve o suspende en una solución al 0,1-5% p/v de hialuronano o su sal (por ejemplo, hialuronato sódico) como un polvo seco o en agua o un disolvente acuoso (por ejemplo, soluciones salinas fisiológicas tales como sal sódica soluble en agua, soluciones de glucosa del 3 al 5% y soluciones de xilitol del 3 al 5% y formulaciones de tampón citrato o fosfato). El hialuronano e IL-1ra se pueden mezclar usando medios tales como inyectar solución de IL-1ra de ida y vuelta de una jeringa a una segunda jeringa que contiene el hialuronano o por agitación o por microfluidización. Las mezclas de IL-1ra se pueden almacenar a 0-5ºC sin degradación o agregación de la proteína. La concentración de hialuronano puede variar del 0,1-5% p/v, pero la concentración preferida es el 2%. Asimismo, la concentración final de IL-1ra en la preparación puede ser de 0,1-200 mg/ml, pero la concentración preferida es 100 mg/ml. La solución o suspensión resultante se ajusta preferiblemente de tal forma que el valor de pH sea de 6,0 a 7,5.
Una vez que las composiciones farmacéuticas se han formulado, se puede almacenar cada una en un vial estéril como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales composiciones se pueden almacenar en una forma lista para el uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de la administración. El almacenamiento preferido de tales formulaciones es a temperaturas al menos de tan sólo 4ºC y preferiblemente a -70ºC. También se prefiere que las formulaciones que contienen IL-1ra se almacenen y administren a o prácticamente pH fisiológico. Actualmente se piensa que el almacenamiento y la administración en una formulación a pH alto (es decir, mayor de 8) o a un pH bajo (es decir, menor de 5) es indeseable, prefiriéndose un pH de preferiblemente entre 6,0 y 7,0 y siendo más preferido un pH de 6,5.
En este documento también se describen kits para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tenga una proteína secada como un segundo recipiente que tenga una formulación acuosa. Los kits incluidos en el alcance de esta invención son jeringas pre-cargadas de multi-cámara y únicas; jeringas pre-cargadas ilustrativas (por ejemplo, jeringas de líquido y jeringas con liofilizado tales como Lyo-Ject®, una jeringa con liofilizado pre-cargada de cámara dual) están disponibles en Vetter GmbH Ravensburg, Alemania.
Los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, productos de IL-1ra) se pueden administrar cada uno a un paciente en cantidades terapéuticamente eficaces para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, como se han definido anteriormente, que incluyen afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, artritis psoriásica y artritis reumatoide). El término "paciente" tiene por objeto incluir animales (por ejemplo, gatos, perros y caballos) así como seres humanos.
Además, el inhibidor de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) se puede administrar cada uno mediante administración tópica, entérica o parenteral que incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intraventricular e inyección e infusión intraesternal. Un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente un producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) también se puede administrar mediante administración oral o se puede administrar a través de las membranas mucosas, es decir, por vía intranasal, por vía sublingual, por vía oral o por vía rectal para el suministro sistémico. Se prefiere que los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) se administren mediante inyección intra-articular, subcutánea, intramuscular o intravenosa. A modo de ejemplo pero no de limitación, en una realización específica se pueden administrar inhibidores de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) por vía intra-articular para el tratamiento de artritis reumatoide y osteoartritis. A modo de ejemplo pero no de limitación, en otra realización específica, se pueden administrar inhibidores de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) por vía subcutánea o por vía intramuscular para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, mieloma múltiple o leucemias mielógenas (por ejemplo, AML y CML) y otras. A modo de ejemplo pero no de limitación, en una realización específica adicional más, se pueden administrar inhibidores de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) por vía intravenosa para el tratamiento de lesión cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus o para el tratamiento de enfermedad de injerto contra hospedador; o se puede administrar por vía intraventricular para el tratamiento de lesión cerebral como resultado de traumatismo.
Sin tener en cuenta el modo de administración, el tratamiento de enfermedad mediada por IL-1 requiere una dosis o régimen de dosis total de un inhibidor de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) de cantidades eficaces, es decir, eficaces para prevenir, reducir o aliviar síntomas de la enfermedad, tal como para contrarrestar la destrucción progresiva de cartílago de una articulación como se provoca por la degradación de proteoglucanos que son un componente molecular de cartílago articular. Ya que el hialuronano e IL-1ra son sustancias de origen natural en mamíferos, se piensa que no existe ningún límite superior inherente a la dosis tolerable. Sin embargo, como en todos los tratamientos medicinales, es prudente usar no más de lo que es necesario para conseguir el efecto deseado.
La dosis específica se calcula de acuerdo con el peso corporal o el área superficial aproximada del paciente. Otros factores para determinar la dosificación apropiada pueden incluir la enfermedad o afección que se va a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y la edad, sexo y estado médico del paciente. Se realiza un refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento de forma rutinaria por los especialistas en la técnica, especialmente a la vista de la información de dosificación y los ensayos descritos en este documento. La dosificación también se puede determinar mediante el uso de ensayos conocidos para determinar dosificaciones usadas junto con los datos apropiados de dosis-respuesta.
La frecuencia de dosificación depende de la enfermedad y la afección del paciente, así como los parámetros farmacocinéticos del inhibidor de IL-1 (por ejemplo, preferiblemente producto de IL-1ra, y más preferiblemente IL-1ra) usada en la formulación y en la vía de administración. El inhibidor de IL-1 (por ejemplo, producto de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) se puede administrar una vez o, en casos de trastornos graves y prolongados, se puede administrar diariamente en dosis menos frecuentes o administrar con una dosis de embolada inicial seguido de una dosis continua o suministro sostenido. También se considera que se pueden practicar otros modos de dosificación continua o prácticamente continua. Por ejemplo, la derivatización química puede dar como resultado formas de liberación sostenida que tienen el efecto de una presencia continua en el torrente sanguíneo, en cantidades predecibles basándose en un régimen de dosificación determinado:
Los modos preferidos para usar productos de IL-1ra para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo afecciones inflamatorias de una articulación tales como artritis reumatoide y artritis psoriásica, se exponen en el documento AU 9173636. Estos modos incluyen: (1) una inyección intra-articular única de IL-1ra administrada periódicamente cuando sea necesario para evitar o remediar el empeoramiento de artritis y (2) inyecciones subcutáneas periódicas de producto de IL-1ra. Cuando se administra por vía parenteral, la dosis unitaria puede ser hasta 200 mg, generalmente hasta 150 mg y más generalmente hasta 100 mg. Cuando se administra en una cavidad articular, la composición farmacéutica se administra preferiblemente como una única inyección de una jeringa de 3 a 10 ml que contiene una dosis de hasta 200 mg/ml, generalmente hasta 150 mg y más generalmente hasta 100 mg de producto de IL-1 disuelto en solución salina tamponada con fosfato isotónica. La preparación se administra en una cavidad articular a una frecuencia de una vez cada 7 a 10 días. De tal modo, la administración se realiza de forma continua de 4 a 5 veces mientras que se varía la dosis si fuera necesario.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden un IL-1ra formulado con hialuronano o una sal del mismo se pueden administrar con otros terapéuticos adecuados para la indicación que se está tratando. El IL-1ra y cualquiera de uno o más fármacos anti-inflamatorios adicionales se pueden administrar por separado o en combinación. Se puede encontrar información con respecto a los siguientes compuestos en "The Merck Manula of Diagnosis and Therapy", Decimosexta Edición, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) y en "Pharmaprojects", PJB Publications Ltd.
De acuerdo con la presente invención, el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1 como se ha definido anteriormente, que incluyen inflamación aguda y crónica tal como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, artritis reumatoide), incluye fármacos de primera línea de control de dolor e inflamación, clasificadas como fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE). Los tratamientos secundarios incluyen corticosteroides o fármacos antirreumáticos de actuación lenta (SAARD).
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra y cualquiera de uno o más AINE para el tratamiento de enfermedades medidas por IL-1 como se ha definido anteriormente, que incluyen inflamación aguda y crónica tal como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide); y enfermedad de injerto contra hospedador. Los AINE deben su acción anti-inflamatoria, al menos en parte, a la inhibición de la síntesis de prostaglandinas (Goodman y Gilman en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Macmillan 7^{a} Edición (1985)). Los AINE se pueden caracterizar en nueve grupos: (1) derivados de ácido salicílico; (2) derivados de ácido propiónico; (3) derivados de ácido acético; (4) derivados de ácido fenámico; (5) derivados de ácido carboxílico; (6) derivados de ácido butírico; (7) oxicams; (8) pirazoles y (9) pirazolonas.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra con cualquiera de uno o más derivados de ácido salicílico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Tales derivados de ácido salicílico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acetaminosalol, aloxiprina, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, trisalicilato de magnesio y colina, diflusinal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, fenil salicilato, salacetamida, ácido O-acético de salicilamida, salsalato y sulfasalazina. Los derivados de ácido salicílico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido propiónico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido propiónico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, dexindoprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, furcloprofeno, ibuprofeno, ibuprofeno de aluminio, ibuproxam, indoprofeno, isoprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozina, piketoprofeno, pimeprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, piridoxiprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico y tioxaprofeno. Los derivados de ácido propiónico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido acético, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido acético, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acemetacina, alclofenac, amfenac, bufexamac, cinmetacina, clopirac, delmetacina, diclofenac sódico, etodolac, felbinac, fenclofenac, fenclorac, ácido fenclózico, fentiazac, furofenac, glucametacina, ibufenac, indometacina, isofezolac, isoxepac, lonazolac, ácido metiazínico, oxametacina, oxpinac, pimetacina, proglumetacina, sulindac, talmetacina, tiaramida, tiopinac, tolmetina, zidometacina y zomepirac. Los derivados de ácido acético estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido fenámico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido fenámico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico, meclofenamato sódico, ácido medofenámico, ácido mefanámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico y ufenamato. Los derivados de ácido fenámico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse por este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido carboxílico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido carboxílico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden usar comprenden: clidanac, diflunisal, flufenisal, inoridina, ketorolac y tinoridina. Los derivados de ácido carboxílico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más derivados de ácido butírico, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido butírico, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizona, butibufeno, fenbufeno y xenbucina. Los derivados de ácido butírico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más oxicams, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los oxicams, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicam, enolicam, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam y 4-hidroxil-1,2-benzotiazina, 1,1-dióxido 4-(N-fenil)-carboxamida. Los oxicams estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más pirazoles, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los pirazoles, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden usar comprenden: difenamizol y epirizol. Los pirazoles estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de una o más pirazolonas, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las pirazolonas, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden usar comprenden: apazona, azapropazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propilfenazona, ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona. Las pirazolonas estructuralmente relacionadas que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más de los siguientes AINE: ácido \varepsilon-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, anitrazafeno, antrafenina, bendazac, lisinato de bendazac, benzidamina, beprozina, broperamol, bucoloma, bufezolac, ciproquazona, cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidina, difenpiramida, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizol, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixina, fluprocuazona, fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guaiazoleno, isonixirna, HCl de lefetamina, leflunomida, lofemizol, lotifazol, clonixinato de lisina, meseclazona, nabumetona, nictindol, nimesulida, orgoteína, orpanoxina, oxaceprolm, oxapadol, paranilina, perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxima, piproxeno, pirazolac, pirfenidona, procuazona, proxazol, tielavina B, tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamida y los indicados por el número de código de compañía tal como 980156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ON03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (ácido 4-benzoil-1-indanocarboxílico), TVX2706, U60257, UR2301 y WY41770. Los AINE estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares a los anteriores AINE también tienen por objeto incluirse por este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más corticosteroides, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, como se ha definido anteriormente, incluyendo inflamación aguda y crónica tales como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide); enfermedad de injerto contra hospedador y esclerosis múltiple. Los corticosteroides, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen hidrocortisona y compuestos que se obtienen de hidrocortisona, tales como 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, valerato de betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacona, desonida, desoximerasona, dexametasona, diflorasona, difluocortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetonida de flucinolona, fluocinonida, acetonida de fluorocinolona, fluocortina butilo, fluocortolona, hexanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, succinato de sodio de hidrocortisona 21, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednicolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, succinato sódico de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato sódico de prednisolona, 21-estearoglicolato sódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, 21-dietilaminoacetato de prednilideno, tixocortol, triamcinolona, acetonida de triamcinolona, benetonida de triamcinolona y hexacetonida de triamcinolona. Los corticosteroides estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse por este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más fármacos antirreumáticos de actuación lenta (SAARD) o fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDS), ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, como se ha definido anteriormente, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide); enfermedad de injerto contra hospedador y esclerosis múltiple. Los SAARD o DMARDS, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: alocupreido sódico, auranofina, aurotioglucosa, aurotioglucanida, azatioprina, brequinar sódico, bucilamina, 3-aurotio-2-propanol-1-sulfonato de calcio, clorambucilo, cloroquina, clobuzarita, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosporina, dapsona, 15-desoxispergualina, diacereína, glucosamina, sales de oro (por ejemplo, sal de oro de cicloquina, tiomalato sódico de oro, tiosulfato sódico de oro), hidroxicloroquina, hidroxiurea, kebuzona, levamisol, lobenzarit, melitina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, micofenolato mofetilo, mioral, mostaza de nitrógeno, D-penicilamina, imidazoles de piridinol tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoyetina y vincristina. Los SAARD o DMARDS estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse por este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más inhibidores de COX2, sus ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de inflamación aguda y crónica. Los ejemplos de inhibidores de COX2, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, celecoxib. Los inhibidores de COX2 estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más antimicrobianos, ésteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de inflamación aguda y crónica. Los antimicrobianos, ésteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, ampicilina, amoxicilina, aureomicina, bacitracina, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, cefaclor, cefalexina, cefradina, ciprofloxacina, ácido clavulánico, cloxacilina, dicloxacilano, eritromicina, flucloxacilano, gentamicina, gramicidina, meticilano, neomicina, oxacilano, penicilina y vancomicina. Los antimicrobianos estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también tienen por objeto incluirse en este grupo.
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más inhibidores de TNF para el tratamiento de enfermedad mediadas por IL-1, como se ha definido anteriormente, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide); lesión cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus; y enfermedad de injerto contra hospedador. Tales inhibidores de TNF incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis o liberación extracelular in vivo de TNF. En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con cualquiera de uno o más de los siguientes inhibidores de TNF: proteínas de unión a TNF (receptores de TNF soluble), anticuerpos anti-TNF, factor estimulador de colonias de granulocitos; talidomida, BN50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401; péptido T, MDL 201, 499A; clorhidrato de (1R,3S)-Cis-1-[9-(2,6-diaminopurinil)]-3-hidroxi-4-ciclopenteno; (1R,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)purina]-3-acetoxiciclopentano; clorhidrato de (1R, 3R)-trans-1-[9-adenil)-3-acidociclopentano y (1R,3R)-trans-1-[6-hidroxi-purin-9-il)-3-acidociclopentano.
Las proteínas de unión a TNF se describen en la técnica (documentos EP 308 378, EP 422 339, GB 2 218 101, EP 393 438, WO 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, WO 91/03553, EP 418 014, JP 127.800/1991, EP 433 900, Patente de Estados Unidos Nº 5.136.021, GB 2 246 569, EP 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, WO 93/07863, EP 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417 563, y la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Nº 60/021.443, presentada el 9 de julio de 1996 por Fisher, Edwards y Kieft, titulada en la carta de transmisión de Solicitud Provisional "Proteínas de unión a factor de necrosis tumoral").
Por ejemplo, los documentos EP 393 438 y EP 422 339 describen las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de un "inhibidor de TNF de 30 kDa" (también conocido como el receptor p55) y un "inhibidor de 40 kDa" (también conocido como el receptor p75) así como formas modificadas de las mismas (por ejemplos, fragmentos, derivados funcionales y variantes). Los documentos EP 393 438 y EP 422 339 también describen métodos para aislar los genes responsables de codificar los inhibidores, clonar el gen en vectores y tipos celulares adecuados y expresar el gen para producir los inhibidores. Adicionalmente, también se han descrito formas polivalentes (es decir, moléculas que comprenden más de un resto activo) de los inhibidores de TNF que se han descrito anteriormente. En una realización, la forma polivalente se puede construir, por ejemplo, acoplando químicamente al menos un inhibidor de TNF y otro resto con cualquier enlazador clínicamente aceptable, por ejemplo, polietilenglicol (documentos WO 92/16221 y WO 95/34326), por un enlazador peptídico (Neve et al. (1996), Cytokine, 8(5): 365-370) acoplando químicamente a biotina y después uniendo a avidina (documento WO 91/03553) y, finalmente, construyendo moléculas de anticuerpo quiméricas (Patente de Estados Unidos Nº 5.116.964, documentos WO 89/09622, WO 91/16437 y EP 315062).
Los anticuerpos anti-TNF incluyen el anticuerpo Fab MAK 195F (Holler et al. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147); anticuerpo monoclonal anti-TNF CDP 571 (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34: 334-342); anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral murino BAY X 1351 (Kieft et al. (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9); anticuerpo monoclonal anti-TNF CenTNF cA2 (Elliott et al. (1994), Lancet, 344: 1125-1127 y Elliott et al. (1994), Lancet, 344: 1105-1110).
En una realización específica, la presente invención se refiere al uso de un IL-1ra en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con el antígeno Fas humano recombinante soluble o versiones de recombinantes del mismo para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, como se ha definido anteriormente, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide); y enfermedad de injerto contra hospedador. Se conocen el antígeno Fas humano recombinante soluble y variantes de los mismos tales como una proteína de fusión fas, métodos para aislar los genes responsables de codificar el antígeno Fas humano recombinante soluble, métodos para clonar el gen en vectores y tipos celulares adecuados y métodos para expresar el gen para producir los inhibidores (documento WO 96/20206 y Mountz et al., J. Immunology, 155: 4829-4837).
Es especialmente ventajoso formular composiciones de los compuestos anti-inflamatorios adicionales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. "Forma unitaria de dosificación" como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuestos anti-inflamatorios adicionales calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, agentes de recubrimiento, antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que sean compatibles con el ingrediente activo y con el modo de administración y otros ingredientes de la formulación y que no sean perjudiciales para el receptor. El uso de tales medios y agentes se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^{a} Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712). Un vehículo farmacéuticamente aceptable ilustrativo es solución salina tamponada con fosfato. También se pueden incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones.
Para la administración terapéutica oral, el compuesto anti-inflamatorio adicional se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares o se puede incorporar directamente con el alimento en la dieta. Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante tal como goma tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina; o un agente saporífero tal como menta, aceite de gaulteria o sabor de cereza o naranja. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener además de material del anterior tipo, un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como un recubrimiento o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden estar recubiertos con goma laca, azúcar o ambos. Por supuesto, cualquier material usado para preparar cualquier forma unitaria de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto anti-inflamatorio adicional se puede incorporar en una preparación y formulación de liberación controlada. La cantidad del compuesto anti-inflamatorio original en tal composición terapéuticamente útil es tal que se obtendrá una dosificación adecuada.
Para administración terapéutica parenteral, cada compuesto anti-inflamatorio se puede incorporar con una solución inyectable estéril. La solución inyectable estéril se puede preparar incorporando el compuesto anti-inflamatorio adicional en la cantidad requerida en un vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado, con diversos otros ingredientes enumerados a continuación (requeridos), seguido de esterilización por filtración. En el caso de dispersiones, cada uno se puede preparar incorporando el compuesto anti-inflamatorio adicional en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los que se han enumerado anteriormente. En el caso de soluciones inyectables estériles, cada uno se puede preparar por incorporación de un polvo de al menos un compuesto anti-inflamatorio adicional y, opcionalmente, cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada a esterilidad previamente de los mismos, donde el polvo se prepara mediante cualquier técnica adecuada (por ejemplo, secado por vacío y secado por congelación).
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La dosis específica del compuesto anti-inflamatorio adicional se calcula de acuerdo con el peso corporal o área superficial aproximada del paciente. Otros factores para determinar la dosificación apropiada pueden incluir la enfermedad o afección inflamatoria aguda o crónica a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y la edad, sexo y estado médico del paciente. Se realiza un refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento que implica cada una de las formulaciones que se han mencionado anteriormente de forma rutinaria por el especialista en la técnica. Las dosificaciones también se pueden determinar mediante el uso de ensayos conocidos para determinar dosificaciones usadas junto con datos apropiados de dosis-respuesta.
Por tanto, por ejemplo, pertenece al alcance de la invención que las dosis de los compuestos anti-inflamatorios adicionales seleccionados para tratar una enfermedad inflamatoria aguda o crónica particular se puedan variar para conseguir un efecto terapéutico deseado. Cuando uno de los compuestos anti-inflamatorios adicionales tiene efectos secundarios, se puede administrar a pacientes durante periodos de tratamiento alternos de terapia de combinación. Por ejemplo, el tratamiento crónico con metotrexato se asocia con toxicidad gastrointestinal, hepática, de médula ósea y pulmonar (Sandoval et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34: 49-56).
Los ensayos para controlar la mejora de una enfermedad pueden incluir ensayos específicos dirigidos, por ejemplo, a la determinación de respuesta sistémica a inflamación, que incluye la velocidad de sedimentación de eritrocitos (ESR) y reactantes de fase aguda (APR). Las observaciones se realizan con respecto al hinchamiento, etc. de las partes corporales afectadas. También se observa la mejora en rigidez y agarre (cuando se pueda aplicar) y reducción en el dolor del paciente. Si el estado del paciente es estable, se vuelve a tratar con la misma dosificación semanalmente y se evalúa semanalmente. Suponiendo que el estado del paciente sea estable, se puede continuar el tratamiento. Después de seis meses de tratamiento, se determinan cambios anatómicos del esqueleto por formación de imágenes radiológicas, por ejemplo, mediante radiografía con rayos X.
Al final de cada periodo, el paciente se vuelve a evaluar. La comparación de la evaluación radiológica pre-tratamiento y post-tratamiento, ESR y APR indica la eficacia de los tratamientos. De acuerdo con la eficacia de los tratamientos y el estado del paciente, la dosificación se puede aumentar o mantener constante para la duración del tratamiento.
Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso de IL-1ra opcionalmente con una de las siguientes combinaciones para tratar o prevenir una enfermedad mediada por IL-1, como se ha definido anteriormente, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como afecciones inflamatorias de una articulación (por ejemplo, artritis psoriásica y artritis reumatoide) y los síntomas asociados con las mismas: IL1-ra y metrotexato; IL-1ra y uno cualquiera o más de metotrexato, sulfasazina e hidroxicloroquina; IL-1ra, metotrexato e hidroxicloroquina; IL-1ra metotrexato y sulfasazina; e IL-1ra, metotretaxo y un inhibidor de TNF, preferiblemente TNFbp.
En una realización específica preferida, el uso comprende la administración (por ejemplo, intra-articular, subcutánea o intramuscular) de IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con metotrexato y/o TNFbp para tratar artritis (por ejemplo, osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide) y los síntomas asociados con la misma.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, intravenosa o intraventricular) de IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con activador de plasminógeno tisular y/o TNFbp para tratar lesión cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneración.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) de IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con uno o más de un corticosteroide, ciclosporina, un interferón (por ejemplo, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma o interferón consenso) y/o TNFbp para tratar esclerosis múltiple.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, intravenosa) de un IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con uno o más de metotrexato, un corticosteroide, FK-506, ciclosporina, una proteína fas soluble y/o TNFbp para tratar enfermedad de injerto contra hospedador.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, subcutáneo o intramuscular) de un IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) G-CSF y/o TNFbp para tratar lesión enfermedad inflamatoria del intestino.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) de un IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con un interferón (por ejemplo, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma o interferón consenso) para tratar mieloma múltiple o leucemias mielógenas (por ejemplo, AML y CML) y otras.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, subcutánea, intraventricular o intratecal) de un IL-1ra formulado con hialuronano opcionalmente en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con un AINE (por ejemplo, indometacina) y/o TNFbp para tratar enfermedad de Alzheimer.
En una realización preferida específica, el uso comprende la administración (por ejemplo, inyección local, subcutánea o intramuscular) de un IL-1ra formulado con hialuronano para tratar enfermedad de articulación mandibular temporal.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar más completamente la presente invención.
Ejemplos
Se proporcionan métodos convencionales para muchos de los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, o procedimientos alternativos adecuados, en manuales ampliamente reconocidos de biología molecular tales como, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990). Todos los agentes químicos fueron de calidad analítica o de calidad USP.
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Ejemplo 1
Preparación de Muestra: Un antagonista de receptor de IL-1 recombinante humano (rhuIL-Ira) obtenido de E. coli, preparado generalmente de acuerdo las enseñanzas de la Patente de Estados Unidos Nº 5.975.222, se formuló en citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1% (p/p) en agua, pH 6,5 (CSEP). Después, las jeringas que contenía el IL-1ra formulado se unieron mediante una válvula a una jeringa que contenía uno de los siguientes materiales de liberación controlada: fluido de hilano H-10^{TM} (Biomatrix, Inc., Ridgefield, Inc.), un ácido hialurónico reticulado (Mr \geq 4x10^{6}) como un polvo seco o polvo seco reconstituido en PBS; ácido hialurónico (Mr \geq 570.000) en PBS obtenido de cultivos de Streptococcus zooepidemicus (catálogo Nº H9390, Sigma, Inc., St. Louis, MO) como un polvo seco; polivinilpirrolidona (Mr 1,3x10^{6}) (catálogo Nº 43.719-0, Aldridge Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) como un polvo seco; y carboximetil celulosa (carboximetil celulosa (catálogo Nº 06139, Polysciences, Inc. Warrington, PA) como un polvo seco. Después, el IL-1ra se mezcló con el material de liberación controlada inyectando la solución de rhuIL-Ira en la jeringa que contiene el ácido hialurónico e inyectando los contenidos de ida y vuelta varias veces para garantizar la mezcla.
Por consiguiente, se prepararon las siguientes formulaciones: (1) IL-1ra (100 mg/ml)/hilano H-10^{TM} al 2%; (2) IL-1ra (100 mg/ml)/ácido hialurónico al 1%; (3) IL-1ra (100 mg/ml)/hilano H-10^{TM} al 0,5%; (4) IL-1ra (100 mg/ml)/ácido hialurónico al 2%, (5) IL-1ra (100 mg/ml)/polivinilpirrolidona al 4% y (6) IL-1ra (100 mg/ml)/carboximetil celulosa al 3%.
Las diversas formulaciones se inyectaron por vía subcutánea en ratas Lewis hembra (200-250 g, Charles River, Portage, Ml). En diversos momentos después de la inyección se extrajo sangre por catéteres insertados en las venas yugulares de los animales. La sangre se centrifugó para eliminar células sanguíneas y el plasma remanente se ensayó para IL-1ra usando un kit de ELISA (inmunoensayo de IL-1ra humano Quantikine^{TM}, R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las directrices del fabricante. Los datos se expresan como IL-1ra en plasma (\mug/ml de IL-1ra en plasma) frente al tiempo después de la inyección, como se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 IL-1ra en Plasma (\mug/ml) después de Inyección Subcutánea
3 
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Como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 1, la incorporación de IL-1ra en hialuronano, polivinilpirrolidona y carboximetil celulosa conduce a elevación prolongada de niveles plasmáticos de IL-1ra en comparación con IL-1ra administrado en solitario.
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Ejemplo 2
El IL-1ra en CSEP se radiomarcó con Na[^{125}I] y después se incorporó en fluido de hilano H-10^{TM} (al 2% final), como se ha descrito anteriormente. Se inyectaron IL-1ra radioactivo o mezclas de IL-1ra/hilano H-10^{TM} por vía intra-articular en las rodillas de cobayas (Charles River, Portage, MI). En diversos momentos después de la inyección los animales se eutanasiaron y se retiraron las articulaciones de la rodilla y se contaron en un contador gamma, como se describe en Len et al. (1989), J. Rheumatol., 16: 1295-1303. La cantidad de IL-1ra remanente en las articulaciones en cada punto de tiempo se muestra en la Figura 2. Las semividas intra-articulares de IL-1ra en las tres formulaciones diferentes de hialuronano se calcularon a partir de los gráficos tales como la Figura 2 y se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3 Semivida Articular de Formulaciones de IL-1ra en Cobayas después de Inyección Intra-articular
5
Como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 2, la incorporación de IL-1ra en hialuronano conduce a la retención prolongada de IL-1ra en articulaciones de la rodilla después de administración intra-articular. El grado de retención se puede controlar por la proporción de hialuronano reticulado (gel) a no reticulado (fluido) en la formulación.
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Ejemplo 3
Se inyectó IL-1ra en CSEP o una formulación de IL-1ra (100 mg/mg)/hilano H-10^{TM} al 2%, como se ha descrito anteriormente, por vía intra-articular en las rodillas de conejos (Charles River, Portage, MI). En diversos momentos después de la inyección, los animales se eutanasiaron y las rodillas se lavaron con PBS para recuperar el líquido sinovial. La concentración de IL-1ra (\mug/ml) en el líquido sinovial recuperado se determinó por ELISA (Quantikine^{TM}, inmunoensayo de IL-1ra humano, R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los datos se muestran en la Tabla 4 y la Figura 3.
TABLA 4 Semivida Articular de Formulaciones de IL-1ra en Rodillas de Conejo después de Inyección Intra-articular
6
7 
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Estos datos muestran que la formulación de hialuronano de IL-1ra es capaz de liberación prolongada de IL-1ra intacto en el líquido sinovial después de inyección intra-articular.
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Ejemplo 4
Se inmunizaron ratas Lewis hembra (200-250 g, Charles River, Portage, MI) el día 0 y el día 7 con colágeno de tipo II bovino (Elastin Products, Owensville, MO). Se desarrolló artritis comenzando los 12-13. A las ratas (8 animales/grupo) se inyectó por vía intra-articular fluido de hilano H-10^{TM} en CSEP (50 \mul/rodilla; 1 mg de hialuronano total) o IL-1ra (100 mg/ml)/hilano H-10^{TM} al 2%(50 \mul/rodilla; 5 mg de IL-1ra/1 mg de hialuronano) los días 15 y 18 después de la inmunización inicial. Un grupo de control de artritis no recibió inyección. El día 20, después de la inmunización inicial, las ratas se eutanasiaron y se recogieron las articulaciones de rodilla para evaluación histológica de la gravedad de la enfermedad. Como se muestra en la Tabla 5 y en la Figura 4: (a) tratamiento con IL-1ra suprimió significativamente la lesión de cartílago y hueso y tenía un efecto modesto sobre sinovitis; (b) la lesión articular total se redujo al 70% en comparación con los controles y (c) el tratamiento con solamente hialuronano no tuvo efectos beneficios en comparación con los controles de la enfermedad.
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TABLA 5 Concentración de IL-1ra en Líquido Sinovial después de Inyección Intra-articular
8
Ejemplo 5
A ratas Lewis hembra (200-250 g, Charles River, Portage, MI) se administraron inyecciones intradérmicas de 2 mg/ml de colágeno de tipo II bovino (Elastin Products, Owensville, MO) en adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories, Inc., Ann Arbor, MI) en la base de la cola y sobre el lomo en 3 sitios (250 \mul divididos) el día 0 y el día 7. El día 12 se les administró una inyección intraperitoneal de 3 mg/kg de endotoxina (LPS tipo L-3129, Sigma). La aparición de la artritis tuvo lugar a lo largo de los siguientes 5 días y cuando las ratas desarrollaron la enfermedad se distribuyeron de forma aleatoria a grupos de estudio (6-8/grupo) y se inició el tratamiento. Las ratas se trataron durante 6 días (inyecciones subcutáneas de IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2%, como se ha definido anteriormente, en el dorso del lomo) y después se eutanasiaron el día 7 de la artritis para la evaluación de los pesos de almohadilla y recogido tisular.
Se realizaron mediciones con calibrador de la anchura de la articulación del tobillo antes de la aparición de la artritis, el día de la distribución aleatoria y en cada día posterior del estudio hasta la terminación del estudio sobre la artritis el día 7. Los datos se expresaron después como el área bajo la curva con propósitos de determinar el porcentaje de inhibición de los controles con respecto a la duración de la artritis. Al final, la articulación tibiotarsal se seccionó al nivel del maleolo medial y lateral para la determinación de los pesos de almohadilla finales como otra medida de inflamación. Después se recogieron las articulaciones de tobillo en formalina para evaluación histo-anatomopatológica.
Histo-anatomopatología: se recogieron articulaciones del tobillo en formalina tamponada neutra al 10% durante al menos 24 horas antes de la colocación en un descalcificador I Surgipath (Surgipath, Grayslake, IL) durante aproximadamente 1 semana. Cuando se hubo completado la descalcificación, los dedos se cortaron y la articulación del tobillo se seccionó en el plano longitudinal para dar mitades aproximadamente iguales. Éstas se procesaron para inclusión en parafina, se cortaron y tiñeron con hematoxilina y eosina para la evaluación general de inflamación y lesión ósea y se tiñe-
ron con azul de toluidina para la evaluación específica de cambios de cartílago de acuerdo con los siguientes criterios:
Inflamación
0
= Normal
1
= Infiltración mínima de células inflamatorias en tejido periarticular
2
= Infiltración leve
3
= Infiltración moderada con edema moderado
4
= Infiltración marcada con edema marcado
5
= Infiltración grave con edema grave
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Lesión de Cartílago
0
= Normal
1
= Pérdida mínima a leve de tinción con azul de toluidina sin pérdida obvia de condrocitos o alteración de colágeno.
2
= Pérdida leve de tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos leve focal (superficial) y/o alteración de colágeno
3
= Pérdida moderada de tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos moderada multifocal (zona profunda a central) y/o alteración de colágeno
4
= Pérdida marcada de tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos marcada multifocal (profundidad a zona profunda) y/o alteración de colágeno
5
= Pérdida difusa grave de tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos severa multifocal (profundidad a marca de nivel) y/o alteración de colágeno
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Resorción Ósea
0
= Normal
1
= Áreas pequeñas mínimas de resorción, no fácilmente evidentes con bajos aumentos, osteoclastos poco frecuentes
2
= Leve áreas más numerosas de resorción, no fácilmente evidentes con bajos aumentos, osteoclastos más numerosos
3
= Moderada, tiene resorción obvia de hueso medular trabecular y cortical con defectos de espesor completo en la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión evidente con bajos aumentos, osteoclastos más numerosos
4
= Marcada, tiene defectos de espesor completo en hueso cortical, con frecuencia con alteración del perfil de la superficie cortical remanente, pérdida marcada de medular, numerosos osteoclastos,
5
= Grave, tiene defectos de espesor completo en hueso cortical, con frecuencia con alteración de perfil de la superficie cortical remanente, pérdida marcada de hueso medular de tibia distal, numerosos osteoclastos, resorción también presente en huesos tarsales menores.
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Análisis Estadístico: Datos clínicos para la anchura del tobillo se analizaron determinando el área bajo la curva de dosificación con análisis de varianza posterior. Los pesos de almohadilla (media \pm SE) para cada grupo se analizaron para diferencias usando el Ensayo T de Student.
A diferencia de la ausencia de la eficacia cuando se dieron dosis diarias únicas de 100 mg/kg de IL-1ra en CSEP, la administración de dosis subcutáneas (SQ) diarias únicas (QD) de IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% dio como resultado una inhibición de 62% de la hinchazón de almohadilla a lo largo de tiempo e inhibición del 74% de los pesos de almohadillas finales (Figuras 6 y 7). Estos resultados demuestran claramente los superiores efectos clínicos de la dosificación diaria de IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% frente a IL-1ra en CSEP. Además, el análisis histológico de las secciones de articulación del tobillo puso de manifiesto disminuciones marcadas en la inflamación, formación de pannus y lesión de cartílago y hueso en ratas tratadas con IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% pero no IL-1ra en CSEP (Figura 8).
Después de confirmar que las dosis subcutáneas diarias únicas de IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% eran capaces de modular la progresión de la enfermedad, se realizaron estudios para determinar la duración del efecto. Las ratas tratadas con IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% cada día tenían una inhibición del 53% de la hinchazón de almohadillas a lo largo de tiempo y una inhibición del 78% de los pesos de almohadillas finales (Figuras 9 y 10). Las ratas artríticas tratadas cada dos días con IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% tenían una inhibición del 35% de la hinchazón de almohadillas a lo largo de tiempo y una inhibición del 62% de los pesos de almohadilla finales. Las ratas artríticas tratadas con IL-1ra (100 mg/ml)/fluido de hilano H-10^{TM} al 2% cada tres días tenían una inhibición del 27% (no significativa) de la hinchazón a lo largo de tiempo y una inhibición del 19% de los pesos de las almohadillas. De nuevo, estos resultados demuestran la importancia de mantener niveles sanguíneos mínimos de al menos 200 ng/ml durante el periodo de tiempo en el que IL-1 es operativa en la patogenia en el modelo. El bloqueo del receptor de IL-1 de forma intermitente da como resultado una menor eficacia. Las ratas tratadas cada tres días, se dosificaron el día 1 y el día 4 de artritis. De forma interesante, las mediciones con calibres realizadas 24 h después de la dosificación (día 2 y día 5) indican supresión de progresión de artritis (Figura 9). Sin embargo, las mediciones tomadas 2 ó 3 días después de la dosificación antes de que se les diera a las ratas la siguiente dosis, reflejan progresión de enfermedad, probablemente como resultado de los niveles sanguíneos menos que óptimos durante ese periodo de tiempo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: COLLINS, David S.
\hskip4cmBEVILACQUA, Michael P.
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN Y MÉTODO PARA TRATAR ENFERMEDADES INFLAMATORIAS
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
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(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: AMGEN INC.
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(B)
CALLE: 1840 De Havilland Drive
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(C)
CIUDAD: Thousand Oaks
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
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(E)
PAÍS: EEUU
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 91320-1789
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(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
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(B)
ORDENADOR: PC IBM Compatible
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(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
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(D)
SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión # 1.30
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(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: EEUU todavía no asignada
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-FEB-1997
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(C)
CLASIFICACIÓN:
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(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/011.419
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-FEB-1996
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(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/032.789
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-DIC-1996
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(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
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(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US (Exp de Mand # A-365B-P)
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(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-ENE-1997
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(viii)
INFORMACIÓN DE MANDATARIO/AGENTE:
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(A)
NOMBRE: ZINDRICK, Thomas D.
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(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32.185
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(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: A-365C
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1
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(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
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(A)
LONGITUD: 462 pares de bases
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(B)
TIPO: ácido nucleico
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(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
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(D)
TOPOLOGÍA: lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
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(iv)
CARACTERÍSTICA:
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(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
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(B)
LOCALIZACIÓN: 1..462
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(ix)
CARACTERÍSTICA:
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(A)
NOMBRE/CLAVE: misc_feature
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(B)
LOCALIZACIÓN: 1..3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note = "la metionina inicial es opcional"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
9 
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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 154 aminoácidos
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(B)
TIPO: aminoácidos
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(D)
TOPOLOGÍA: lineal
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
10

Claims (14)

1. Una composición farmacéutica que comprende una combinación de hialuronano o una sal del mismo y un antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra).
\vskip1.000000\baselineskip
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el hialuronano es
(i) ácido hialurónico;
(ii) hialuronato sódico; o
(iii) hilano.
\vskip1.000000\baselineskip
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho IL-1ra está
(i) glucosilado; o
(ii) no glucosilado.
\vskip1.000000\baselineskip
4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho IL-1ra se produce mediante métodos de ADN recombinante.
5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que IL-1ra está fusionado con todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana en el extremo carboxi.
6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el hialuronano está presente en un intervalo de 0,1-5% p/v.
7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la concentración de IL-1ra está presente en un intervalo de 0,1-200 mg/ml.
8. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el hialuronano está presente en el intervalo del 0,1-5% p/v y el IL-1ra está presente en el intervalo de 0,1-200 mg/ml.
9. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además un fármaco anti-inflamatorio.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que dicho fármaco anti-inflamatorio se selecciona entre fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), corticosteroides o fármacos antirreumáticos de actuación lenta (SAARD).
11. Uso de la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente aquejado con una enfermedad articular inflamatoria, esclerosis múltiple, leucemia, lesión isquémica o lesión por reperfusión.
12. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para el uso para tratar un paciente aquejado de una enfermedad articular inflamatoria, esclerosis múltiple, leucemia, lesión isquémica o lesión por reperfusión.
13. El uso de la reivindicación 11 o la composición farmacéutica de la reivindicación 12, en el que dicha enfermedad articular inflamatoria se selecciona entre artritis reumatoide, osteoartritis y otras afecciones inflamatorias que se producen por distensión, esguince, traumatismo, infección, lesión de cartílago o cirugía ortopédica.
14. El uso de la composición farmacéutica de la reivindicación 13, en el que dicha composición farmacéutica se administra por vía intra-articular.
ES97906551T 1996-02-09 1997-02-10 Composicion que comprende il-1ra como inhibidor de interleucina 1 e hialuronano como polimero de liberacion controlada. Expired - Lifetime ES2334726T3 (es)

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