ES2694252T3 - Métodos para reducir la agregación de IL-1ra - Google Patents

Métodos para reducir la agregación de IL-1ra Download PDF

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Abstract

Un método para reducir la agregación de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra), o reducir la tasa de agregación de un IL-1ra, en una composición acuosa, en el que el método comprende reducir la agregación o reducir la tasa de agregación de IL-1 ra en la composición acuosa mediante la incubación de la composición acuosa que comprende IL-1ra con al menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación o reducir la tasa de agregación de IL-1 ra en la composición acuosa, en el que al menos una de las al menos una molécula accesoria es eficaz para reducir la agregación entre 20 °C y 45 °C y se selecciona de un azúcar en una concentración del 1 al 3 por ciento y un anión de carga múltiple.

Description

DESCRIPCION
Metodos para reducir la agregacion de IL-1ra 5 CAMPO
La presente invencion se refiere a metodos para reducir la agregacion de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra). La divulgacion tambien proporciona metodos para mejorar las formulaciones de farmacos que comprenden reducir la agregacion de IL-1 ra. La divulgacion tambien son metodos para tratar enfermedades que 10 utilizan IL-1ra cuya agregacion se ha reducido. Finalmente, la presente divulgacion se refiere a composiciones y kits que comprenden un IL-1 ra cuya agregacion se ha reducido.
ANTECEDENTES
15 La interleucina-1 alfa (IL-1 a), la interleucina-1 beta (IL-1 p) y el antagonista del receptor de la interleucina-1 (IL-1ra) se unen cada uno al receptor de IL-1 tipo 1 (IL-1RI), que se encuentra en la superficie de ciertos tipos de celulas. IL- 1a e IL-1 p tienen efectos fisiologicos sobre varias celulas diana diferentes, incluidas ciertas celulas que participan en las respuestas inflamatorias e inmunitarias. IL-1 ra, en contraste, se une a IL-1RI, pero no provoca respuestas biologicas aguas abajo comparables. Mas bien, IL-1ra inhibe competitivamente la union de IL-1 a e IL-1 p a IL-1RI. 20 Anakinra, una version producida por E. coli de IL-1ra, se comercializa para el tratamiento de la artritis reumatoide.
Chang B.S. et al., ("Physical factors affecting the storage stability of freeze-dried interleukin-1 receptor antagonist: Glass transition and protein conformation", Archives of Biochemistry and Biophysics, Nueva York, US. Vol. 331, N.° 2, 1996, pags. 249-258, ISSN: 0003-9861) y Chang B.S. et al., (Development of a stable freeze-dried formulation of 25 recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, Pharmaceutical Research, Nueva York, US, Vol. 13, N.° 2, 1996, pags. 243-249, ISSN: 0724-8741) divulgan metodos para estabilizar formulaciones secadas por congelacion, liofilizadas de IL-1ra.
Chang B.S. et al., (Development of a stable freeze-dried formulation of recombinant human interleukin-1 receptor 30 antagonist, Pharmaceutical Research, Nueva York, US,Vol. 13, N.° 2, 1996, pags. 243-249)
RESUMEN
El alcance de la invencion se define por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripcion a los metodos de 35 tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmaceuticas y medicamentos de la presente invencion para su uso en un metodo para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. La presente invencion se refiere a un metodo para reducir la agregacion de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1 ra), o reducir la tasa de agregacion de un IL-1ra en una composicion acuosa incubando la composicion acuosa que comprende IL- 1ra con al menos una molecula accesoria a una concentracion suficiente para reducir la agregacion o reducir la tasa 40 de agregacion de la IL-1 ra en la composicion acuosa, en el que al menos una de la al menos una molecula accesoria es eficaz en la reduccion de la agregacion entre 20 °C y 45 °C y se selecciona de un azucar en una concentracion del 1 al 3 por ciento y un anion de carga multiple.
Tambien se divulga un metodo para preparar una formulacion de farmaco antagonista del receptor de interleucina-1 45 (IL-1 ra). El metodo comprende incubar la IL-1 ra de agregacion con al menos una molecula accesoria. En ciertos casos, la agregacion se reduce.
Se divulga un metodo para tratar a un paciente. Se divulga un metodo para tratar a un paciente que tiene artritis. Se divulga un metodo para tratar a un paciente que tiene artritis reumatoide. Se divulga un metodo para tratar a un 50 paciente que tiene osteoartritis. Se divulga un metodo para tratar a un paciente que tiene al menos una de enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, glomerulonefritis o leucemia. Se divulga un metodo para tratar a un paciente que tiene un efecto adverso de IL-1. El metodo para tratar a un paciente comprende administrar al paciente una composicion que comprende (i) una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista del receptor de interleucina- 1 (IL-1ra) y (ii) al menos una molecula accesoria.
55
En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria esta en una concentracion que reduce la agregacion de un IL-1ra de agregacion. En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria esta en una concentracion que reduce la tasa de agregacion de un IL-1ra de agregacion. En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria se selecciona de un azucar y un anion de carga multiple. En ciertas formas de
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realizacion, al menos una molecula accesoria es un anion de carga multiple. En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria es pirofosfato 1 a 20 mM. En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria es citrato 1 a 20 mM. En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria es al menos un azucar. En ciertas formas de realizacion, al menos uno de dichos azucares es glicerol, sorbitol o sacarosa. El azucar se encuentra en una concentracion del 1 al 3 por ciento.
En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria se selecciona de una molecula accesoria reactiva a la lisina y una molecula accesoria reactiva a la arginina. En ciertas formas de realizacion, al menos una molecula accesoria se selecciona de acido 6-(W-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)hexanoico (NBD-X), metil acetil fosfato (MAP), y anhfdrido citraconico.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el perfil de agregacion de protefnas de tipo salvaje IL-1 ra en el tiempo en PSE (fosfato 10 mM, pH 6,5, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM) o CSE (citrato 10 mM, pH 6,5, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM) analizado en el Ejemplo 2.
La Figura 2 muestra la cromatograffa lfquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) de la protefna de tipo salvaje IL-1 ra derivatizada con NBD-X analizada en el Ejemplo 3. El panel superior muestra la absorbancia de IL-1ra marcada con NBD-X en 215 nm. El panel inferior muestra la emision fluorescente a 535 nm despues de la excitacion a 480 nm.
La Figura 3 muestra las tasas de agregacion para la protefna de tipo salvaje IL-1 ra en presencia de concentraciones crecientes de fosfato, pirofosfato y aniones de citrato analizadas en el Ejemplo 4.
La Figura 4 muestra las tasas de agregacion para la protefna de tipo salvaje IL-1 ra en presencia de concentraciones crecientes de glicerol, sorbitol o sacarosa analizadas en el Ejemplo 5.
La Figura 5 muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) del precursor humano IL-1ra, que incluye una secuencia lfder secretora.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoacidos de IL-1 ra humano que carece de la secuencia lfder secretora (SEQ ID NO: 3). El punto (•) indica la lisina en la posicion 93. El signo mas (+) indica la arginina en la posicion 97. Tambien se indican las ubicaciones del triptofano-16 (A) y la tirosina-34 (o).
La Figura 7 muestra una estructura cristalina de rayos X ejemplar de IL-1ra.
La Figura 8 muestra una porcion de la interfaz entre las dos subunidades del dfmero de IL-1 ra asimetrico en la estructura cristalina de rayos X descrita para la Figura 1.
La Figura 9 muestra el despliegue en equilibrio inducido por urea de IL-1ra detectado por el dicrofsmo circular analizado en el Ejemplo 6.
La Figura 10 muestra el despliegue en equilibrio inducido por urea de IL-1ra detectado por fluorescencia intrfnseca analizado en el Ejemplo 6.
La Figura 11 muestra el despliegue inducido por clorhidrato de guanidinio de IL-1 ra por el dicrofsmo circular analizado en el Ejemplo 6.
La Figura 12 muestra el despliegue de IL-1 ra inducido por clorhidrato de guanidinio por fluorescencia intrfnseca analizado en el Ejemplo 6.
La Figura 13 muestra la HPLC de fase inversa de IL-1ra marcada por afinidad con metil acetil fosfato (MAP) en presencia de citrato 10 mM, pH 6,5, analizada en el Ejemplo 7.
La Figura 14 muestra la HPLC de fase inversa de IL-1ra marcada por afinidad con metil acetil fosfato (MAP) en presencia de fosfato 10 mM, pH 6,5, analizada en el Ejemplo 7.
La Figura 15 muestra la superposicion de los perfiles de HPLC de fase inversa de IL-1 ra marcada por afinidad con metil acetil fosfato durante 4,5 horas (270 minutos) en presencia de citrato 10 mM, pH 6,5, fosfato 10 mM, pH 6,5, o pirofosfato 10 mM, pH 6,4, analizada en el Ejemplo 7. Cuatro picos debilmente resueltos estan marcados como 1, 2, 3 y 4.
La Figura 16 muestra la tasa de derivacion de IL-1 ra con metil acetil fosfato en presencia de citrato 10 mM, pH 6,5, analizada en el Ejemplo 7. La Figura 16A muestra una reproduccion de los cromatogramas de la Figura 13. La Figura 16B muestra los resultados de la deconvolucion de cada cromatograma de la Figura 16A. La Figura 16C muestra una grafica de la integracion de cada uno de los picos en deconvolucion de la Figura 16B frente al tiempo.
La Figura 17 muestra una comparacion de las tasas de derivacion de IL-1 ra con MAP en presencia de varios tampones a diversos pH, analizada en el Ejemplo 7.
La Figura 18 muestra la superposicion de los perfiles de HPLC de fase inversa de IL-1 ra marcada por afinidad con metil acetil fosfato durante 5,5 horas en presencia de citrato 10 mM o fosfato 10 mM a diversos niveles de pH, analizada en el Ejemplo 7.
La Figura 19 muestra el perfil de agregacion de protefna de tipo salvaje IL-1ra en el tiempo en diversas
concentraciones de fosfato en un tampon con NaCI 100 mM, pH 6,5, analizado en el Ejemplo 8.
La Figura 20 muestra la union de citrato a IL-1 ra en funcion del aumento de la concentracion de citrato, como se analiza en el Ejemplo 9.
La Figura 21 muestra la competicion por la union de citrato a IL-1ra al aumentar las concentraciones de 5 pirofosfato o fosfato, como se analiza en el Ejemplo 10.
La Figura 22 muestra una grafica del KdLapp para la union de citrato a IL-1ra en funcion de la concentracion de pirofosfato en la solucion, como se analiza en el Ejemplo 10. La Kdx para la union de pirofosfato al sitio de union a aniones de IL-1 ra se calculo para ser 2,994 mM.
La Figura 23 muestra la secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO: 4) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID 10 NO: 5) de un IL-1ra ejemplar.
La Figura 24 muestra la secuencia de aminoacidos de un IL-1ra ejemplar, denominado icIL-1ra (SEQ ID NO: 6). SEQ ID NO: 6 tiene la misma secuencia que SEQ ID NO: 3, pero con 7 aminoacidos adicionales en el extremo N-terminal.
15 DESCRIPCION DETALLADA DE CIERTAS FORMAS DE REALIZACION EJEMPLARES
En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural, a menos que se indique especfficamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique otra cosa. Ademas, el uso del termino "que incluye", asf como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Ademas, terminos tales como "elemento" o 20 "componente" incluyen tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden mas de una subunidad a menos que se indique especfficamente otra cosa.
En diversas formas de realizacion, se pueden usar tecnicas estandar para ADN recombinante, sfntesis de oligonucleotidos, cultivo de tejidos, transformacion y transfeccion. En diversas formas de realizacion, las reacciones 25 enzimaticas y las tecnicas de purificacion pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza comunmente en la tecnica o como se describe en el presente documento. En diversas formas de realizacion, las tecnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas especfficas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva y/o que se conocen por un 30 experto en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). A menos que se proporcionen definiciones especfficas, las nomenclaturas utilizadas en relacion con los procedimientos de laboratorio y tecnicas de, qufmica analftica, qufmica organica sintetica y qufmica medicinal y farmaceutica que se describe en el presente documento es la bien conocida y usada en la tecnica. En diversas formas de realizacion, las tecnicas estandar pueden usarse 35 para sfntesis qufmicas, analisis qufmicos, preparacion farmaceutica, formulacion y administracion, y tratamiento de pacientes. En ciertas formas de realizacion, cuando un aminoacido se "reemplaza" con otro aminoacido, ese reemplazo se puede hacer de forma recombinante, por ejemplo, mutando el codon en el polinucleotido que codifica el aminoacido con respecto al codon que codifica otro aminoacido. En ciertas formas de realizacion, la mutacion del codon se puede hacer por cualquier metodo conocido en la tecnica.
40
Definiciones
Segun se utiliza de acuerdo con la presente divulgacion, se entendera que los siguientes terminos, a menos que se indique otra cosa, tienen los siguientes significados:
45
El termino "polinucleotido aislado" significara un polinucleotido de origen genomico, ADNc o de origen sintetico, o alguna combinacion de los mismos, que (1) no esta asociado con al menos una porcion de un polinucleotido en el que se encuentra en la naturaleza, o (2) esta unido a un polinucleotido al que no esta unido en la naturaleza, o (3) no aparece en la naturaleza.
50
El termino "unido operativamente" se refiere a componentes que estan en una relacion que les permite funcionar de la manera prevista. Por ejemplo, una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia de codificacion se liga de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con el funcionamiento de las secuencias de control.
55
El termino "secuencia de control" se refiere a secuencias polinucleotfdicas que pueden efectuar la expresion y el procesamiento de secuencias codificantes a las que estan ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo huesped. De acuerdo con ciertas formas de realizacion, las secuencias de control para procariotas pueden incluir promotores, sitios de union ribosomicos y secuencias de terminacion de la
transcripcion. De acuerdo con ciertas formas de realizacion, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores y secuencia de terminacion de la transcripcion. En ciertas formas de realizacion, las "secuencias de control" pueden incluir secuencias lfder y/o secuencias asociadas de fusion.
5 El termino "polinucleotido" significa una forma polimerica de nucleotidos que tiene ribonucleotidos y/o desoxirribonucleotidos de origen natural y/o modificados que estan unidos entre si por uniones de origen natural y/o no naturales. En ciertas formas de realizacion, un polinucleotido tiene una longitud de al menos 10 bases. El termino incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN/ARN e hfbridos de ADN/ARN, o formas modificadas de los mismos.
10
El termino "oligonucleotido" incluye polfmeros que tienen ribonucleotidos y/o desoxirribonucleotidos de origen natural y/o modificados, que estan unidos entre si por uniones de origen natural y/o no naturales. Los oligonucleotidos son un subconjunto de polinucleotidos y generalmente comprenden aproximadamente 200 bases o menos. En ciertas formas de realizacion, los oligonucleotidos tienen una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 15 bases. En ciertas formas de realizacion, los oligonucleotidos tienen una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 a 40. Los oligonucleotidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Los oligonucleotidos pueden ser oligonucleotidos sentido o antisentido.
El termino "nucleotidos de origen natural" incluye desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos. El termino "nucleotidos 20 modificados" incluye nucleotidos con grupos de azucar modificados o sustituidos y/o grupos de bases de nucleotidos modificados o sustituidos, y similares. Los terminos "union oligonucleotfdica" y "union polinucleotida" incluyen enlaces tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato y similares. Vease, por ejemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer 25 Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pags. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Pat. de Estados Unidos N.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). En ciertas formas de realizacion, un oligonucleotido o polinucleotido puede incluir una etiqueta.
30 El termino "de origen natural", aplicado a un objeto, se refiere a un objeto que se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptfdica o polinucleotfdica que esta presente en un organismo (incluidos los virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada por el hombre en el laboratorio o esta presente de forma natural.
35 El termino "protefna aislada" significa una protefna elaborada por medios sinteticos o una protefna codificada por ADN genomico, ADNc, ARN u otro polinucleotido, que (1) esta libre de al menos algunas protefnas con las que normalmente se encontrarfa; o (2) esta esencialmente libre de otras protefnas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie; o (3) se expresa por una celula de una especie diferente; o (4) no aparece en la naturaleza. En la notacion de polipeptido utilizada en el presente documento, la direccion a la izquierda es la direccion del terminal 40 amino y la direccion a la derecha es la direccion del terminal carboxilo, de acuerdo con el uso y la convencion estandar, a menos que se indique de otro modo.
De manera similar, a menos que se indique especfficamente otra cosa, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleotidos monocatenarias es el extremo 5'; la direccion de la izquierda de las secuencias de polinucleotidos 45 bicatenarias se conoce como la direccion 5'. La direccion de la adicion de 5' a 3' a las transcripciones de ARN nacientes se denomina direccion de transcripcion; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que estan 5' con respecto al extremo 5' de la transcripcion de ARN se denominan "secuencias aguas arriba" y estan "aguas arriba de la region codificante"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que estan 3' con respecto al extremo 3' de la transcripcion de ARN se denominan "secuencias aguas abajo" y estan "aguas abajo de la region codificante".
50
Como se usa en el presente documento, los terminos "etiqueta" o "marcado" se refieren a la presencia de un resto detectable. Un resto detectable puede incorporarse durante la sfntesis de un polinucleotido o polipeptido o puede unirse, covalentemente o no covalentemente, despues de la sfntesis. El marcado puede ser, por ejemplo, la incorporacion de un aminoacido radiomarcado, la union de restos de biotina que pueden detectarse con avidina 55 marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un resto fluorescente o actividad enzimatica que puede detectarse mediante metodos opticos o colorimetricos). En ciertas formas de realizacion, la etiqueta o el resto detectable pueden ser terapeuticos. En la tecnica se conocen diversos metodos para marcar polipeptidos y/o polinucleotidos. Los ejemplos de etiquetas para polipeptidos y/o polinucleotidos incluyen, pero sin limitacion: radioisotopos o radionuclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), etiquetas fluorescentes (por
ejemplo, FITC, rodamina, fosforos de lantanidos), marcadores enzimaticos (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos de biotinilo, epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremalleras de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metales, etiquetas de 5 epftopo). En ciertas formas de realizacion, las etiquetas estan unidas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial de impedimento esterico.
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoacidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Vease Immunology--A Synthesis (2a Edicion, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, 10 Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisomeros (por ejemplo, D-aminoacidos) de los veinte aminoacidos convencionales, los aminoacidos no naturales, tales como los aminoacidos a, a-disustituidos, los aminoacidos N- alquilos, acido lactico y otros aminoacidos no convencionales tambien pueden ser componentes adecuados para polipeptidos de la presente invencion. Los aminoacidos no convencionales ejemplares no limitativos incluyen 4- hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetilisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- 15 formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoacidos e iminoacidos similares.
Un experto en la tecnica sera capaz de identificar variantes adecuadas de un polipeptido con tecnicas bien conocidas. En ciertas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede identificar regiones adecuadas de un polipeptido que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiendose a regiones que no se consideran importantes 20 para la actividad. En ciertas formas de realizacion, se pueden identificar residuos y porciones de un polipeptido que se conservan entre polipeptidos similares. En ciertas formas de realizacion, incluso las areas que pueden ser importantes para la actividad biologica o para la estructura pueden ser susceptibles de sustituciones de aminoacidos conservativas sin destruir la actividad biologica o sin afectar adversamente a la estructura del polipeptido.
25 Adicionalmente, en ciertas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede revisar estudios de la funcion estructural e identificar residuos en polipeptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. En vista de tal comparacion, se puede predecir la importancia de los residuos de aminoacidos en una protefna que corresponden a residuos de aminoacidos que son importantes para la actividad o la estructura en protefnas similares. En ciertas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede optar por sustituciones de aminoacidos 30 qufmicamente similares para dichos residuos de aminoacidos importantes predichos.
En ciertas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoacidos en relacion con estructuras conocidas en polipeptidos similares. Ademas, en ciertas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede generar variantes de ensayo que contengan una sola sustitucion de 35 aminoacido en cada residuo de aminoacido deseado. En ciertas formas de realizacion, las variantes se pueden cribar usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la tecnica. Tales variantes podrfan usarse para recopilar informacion sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, en ciertas formas de realizacion, si uno descubriera que un cambio en un residuo de aminoacido en particular resultara en una actividad destruida, reducida de forma no deseable, o inadecuada, se pueden evitar las variantes con tal cambio. En otras palabras, basandose en la 40 informacion obtenida a partir de dichos experimentos de rutina, un experto en la tecnica puede determinar facilmente los aminoacidos donde se deben evitar sustituciones adicionales en solitario o junto con otras mutaciones.
En ciertas formas de realizacion, se realizan deleciones, inserciones y/o sustituciones (denominadas individualmente o colectivamente como "variante(s)") dentro de la secuencia de aminoacidos de una protefna de tipo salvaje IL-1 ra. 45 Como se usa en el presente documento, "protefna de tipo salvaje IL-1ra" se refiere a una protefna que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3, que tiene opcionalmente un residuo de metionina adicional en su extremo N, de modo que la secuencia N-terminal es MRPSGR.... La protefna terapeutica que tiene el nombre generico "anakinra" esta dentro de esta definicion de protefna de tipo salvaje IL-1 ra. Anakinra tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5, que es identica a la SEQ ID NO: 3, pero con una metionina N-terminal. En ciertas formas de 50 realizacion, las alteraciones de la protefna de tipo salvaje IL-1 ra, tales como la modificacion qufmica o enzimatica, se realizan despues de la traduccion o sfntesis de la protefna. Dichas protefnas IL-1 ra alteradas se denominan individualmente o colectivamente como "derivado(s)". El termino IL-1 ra incluye protefnas de tipo salvaje IL-1 ra, asf como variantes y derivados de IL-1 ra de origen natural y no natural que tienen actividad antagonista para el receptor de IL-1 ra.
55
En ciertas formas de realizacion, un "aminoacido que no tiene una carga positiva" se selecciona de alanina, cistefna, acido aspartico, acido glutamico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptofano y tirosina. Los aminoacidos que no tienen una carga positiva tambien incluyen, pero sin limitacion, aminoacidos no convencionales que no tienen una carga positiva. Un experto en la
tecnica puede determinar si una variante de aminoacido particular tiene o no una carga positiva cuando se incorpora en un polipeptido.
En ciertas formas de realizacion, un "aminoacido que no tiene una carga" se selecciona de alanina, cistefna, 5 fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptofano y tirosina. Los aminoacidos que no tienen una carga tambien incluyen, pero sin limitacion, aminoacidos no convencionales que no tienen una carga. Un experto en la tecnica puede determinar si una variante de aminoacido no convencional particular tiene o no una carga cuando se incorpora en un polipeptido.
10 En ciertas formas de realizacion, un "aminoacido polar que no tiene una carga" se selecciona entre cistefna, glicina, glutamina, asparagina, serina, treonina y tirosina. Los aminoacidos polares que no tienen una carga tambien incluyen, pero sin limitacion, aminoacidos no convencionales que son polares pero que no tienen una carga. Un experto en la tecnica puede determinar si una variante de aminoacido no convencional particular es polar y si tiene una carga cuando se incorpora en un polipeptido.
15
En ciertas formas de realizacion, un "aminoacido no aromatico" se selecciona de alanina, arginina, cistefna, acido aspartico, acido glutamico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, y valina. Los aminoacidos no aromaticos tambien incluyen, pero sin limitacion, aminoacidos no convencionales que no son aromaticos. Un experto en la tecnica puede determinar si una variante de aminoacido no 20 convencional particular es aromatica cuando se incorpora en un polipeptido.
El termino "interaccion cation-pi" se refiere a una interaccion no covalente entre un aminoacido cationico y un aminoacido aromatico. En ciertas formas de realizacion, el aminoacido cationico puede ser lisina. En ciertas formas de realizacion, el aminoacido cationico puede ser arginina. En ciertas formas de realizacion, el aminoacido aromatico 25 puede ser fenilalanina. En ciertas formas de realizacion, el aminoacido aromatico puede ser tirosina. En ciertas formas de realizacion, el aminoacido aromatico puede ser triptofano. La interaccion cation-pi puede estar dentro de un unico polipeptido (es decir, intramolecular) o la interaccion cation-pi puede estar entre dos o mas polipeptidos (es decir, intermolecular).
30 En ciertas formas de realizacion, ciertos residuos de aminoacidos de IL-1ra estan implicados en una interaccion cation-pi. La Figura 1 muestra una estructura cristalina de rayos X de IL-1ra. La estructura cristalina se preparo usando un archivo 1ILR.pdb y Vector NTI 3D Molecular Viewer (InforMax). IL-1 ra cristalizo como un dfmero asimetrico. Vease, por ejemplo, Vigers et al., J. Biol. Chem., 269: 12874-12879 (1994). La Figura 2 muestra una porcion de la estructura cristalina de la Figura 1. En esa estructura cristalina, la lisina-93 en una subunidad IL-1 ra 35 parece estar implicada en una interaccion cation-pi con triptofano-16 en la otra subunidad IL-1ra. De forma similar, la arginina-97 en una subunidad IL-1ra parece estar involucrada en una interaccion cation-pi con la tirosina-34 en la otra subunidad IL-1ra.
El termino "fragmento de polipeptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que tiene 40 una eliminacion amino-terminal y/o carboxi-terminal. En ciertas formas de realizacion, los fragmentos tienen una longitud de al menos 5 a 201 aminoacidos. Se apreciara que, en ciertas formas de realizacion, los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 170, 175, 176, 177, 180, 185, 190, o 200 aminoacidos de longitud.
45 El termino "muestra biologica", como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitacion, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o anteriormente un ser vivo. Dichos seres vivos incluyen, pero sin limitacion, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Dichas sustancias incluyen, pero sin limitacion, sangre, suero, orina, celulas, organos, tejidos, huesos, medula osea, ganglios linfaticos y piel.
50 Como se usa en el presente documento, "sustancialmente pura" significa que una especie macromolecular objeto es la especie macromolecular predominante presente (es decir, en una base molar es mas abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composicion). En ciertas formas de realizacion, una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que la especie macromolecular objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en peso) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas formas 55 de realizacion, en una composicion sustancialmente pura, la especie macromolecular objeto comprendera mas de aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 99 % en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion. En ciertas formas de realizacion, la especie macromolecular objeto se purifica esencialmente a homogeneidad (es decir, las especies contaminantes no pueden detectarse en la composicion por metodos de deteccion convencionales). En ciertas formas de realizacion, la composicion consiste esencialmente en una sola
especie macromolecular.
El termino paciente incluye sujetos humanos y animales.
5 El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) es una protefna humana que actua como un inhibidor de la actividad de interleucina-1 y es un miembro de la familia IL-1, que tambien incluye IL-1 a e IL-1p. Una lista no exclusiva, no limitativa, no exhaustiva de antagonistas del receptor de IL-1 incluye Kineret® (anakinra) (por ejemplo, una protefna que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5), protefna de tipo salvaje IL-1 ra (incluyendo, pero sin limitacion, una protefna que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, o una protefna que tiene la secuencia de 10 SEQ ID NO: 5), IL-1ra intracelular (icIL-1ra) (incluyendo, pero sin limitacion, una protefna que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6), IL-1ra p (vease, por ejemplo, la Publicacion PCT N.° WO 99/36541), variantes de IL-1 ra, y derivados de IL-1ra. Ciertos antagonistas del receptor de IL-1 ra, incluyendo IL-1 ra y variantes y derivados del mismo, asf como los metodos de fabricacion y uso de los mismos, se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.075.222; Patente de Estados Unidos N.° 6.599.873 B1; Patente de Estados Unidos N.° 5.863.769; Patente de 15 Estados Unidos N.° 5.858.355; Patente de Estados Unidos N.° 5.739.282; Patente de Estados Unidos N.° 5.922.573; Patente de Estados Unidos N.° 6.054.559; los documentos WO 91/08285; WO 91/17184; WO 91/17249; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/22793; WO 96/12022; WO 97/28828; WO 99/36541; WO 99/51744. Un antagonista del receptor de IL-1 puede estar glicosilado o no glicosilado.
20
Los ejemplos de IL-1 ra incluyen, pero sin limitacion, un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 2 y fragmentos, variantes y derivados de tal polipeptido que tienen una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1; un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 3 y fragmentos, variantes y derivados de tal polipeptido que tienen una actividad 25 antagonista para el receptor de interleucina-1; un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 5 y fragmentos, variantes y derivados de tal polipeptido que tienen una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1; y un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos como se expone en la SEQ ID NO: 6 y fragmentos, variantes y derivados de tal polipeptido que tienen una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1.
30
En ciertas formas de realizacion, el termino IL-1 ra incluye, pero sin limitacion, variantes de IL-1 ra que tienen actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. En ciertas formas de realizacion, las variantes de IL-1 ra son de origen natural. En ciertas formas de realizacion, las variantes de IL-1 ra se construyen artificialmente. Las variantes ejemplares de IL-1 ra incluyen, pero sin limitacion, secuencias de aminoacidos que tienen una o mas 35 sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoacidos en comparacion con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. En ciertas formas de realizacion, las variantes de IL-1 ra comprenden una secuencia de aminoacidos que es identica en un 95 % a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, las variantes de IL-1ra comprenden una secuencia de aminoacidos que es identica en un 90 % a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, las variantes de IL-1ra comprenden 40 una secuencia de aminoacidos que es identica en un 85 % a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, las variantes de IL-1ra comprenden una secuencia de aminoacidos que es identica en un 75 % a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3.
En ciertas formas de realizacion, el termino IL-1ra incluye, pero sin limitacion, fragmentos de IL-1 ra que tienen 45 actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. En ciertas formas de realizacion, los fragmentos de IL-1 ra son de origen natural. En ciertas formas de realizacion, los fragmentos de IL-1ra se construyen artificialmente. Los fragmentos de IL-1 ra ejemplares incluyen, pero sin limitacion, fragmentos de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SeQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. Los fragmentos de IL-1 ra son un subconjunto de variantes de IL-1 ra.
50
En ciertas formas de realizacion, el termino IL-1 ra incluye, pero sin limitacion, derivados de IL-1 ra que tienen actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. En ciertas formas de realizacion, los derivados de IL-1 ra son de origen natural. En ciertas formas de realizacion, los derivados de IL-1 ra se construyen artificialmente. Los derivados de IL-1 ra ejemplares incluyen, pero sin limitacion, formas modificadas qufmica o enzimaticamente de la 55 secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. Los derivados ejemplares de IL-1ra tambien incluyen, pero sin limitacion, formas modificadas qufmica o enzimaticamente de variantes de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6.
En ciertas formas de realizacion, el termino IL-1 ra incluye, pero sin limitacion, un IL-1 ra que tiene una secuencia
lider secretora. En ciertas formas de realizacion, IL-1 ra que tiene una secuencia lider secretora se denomina "IL-1ra precursor". Una secuencia de aminoacidos de IL-1 ra precursor ejemplar se expone en la SEQ ID NO: 2. El termino "IL-1ra precursor" incluye fragmentos, variantes y derivados de SEQ ID NO: 2 que son capaces de secretarse y procesarse en una forma que tiene actividad antagonista para el receptor de interleucina-1.
5
El termino IL-1 ra incluye tanto IL-1 ra de agregacion como IL-1 ra que tiene una agregacion reducida. Las protefnas IL-1 ra de agregacion tienen una lisina en la posicion 93 y una arginina en la posicion 97, pero no todas las protefnas IL-1ra con una lisina en la posicion 93 y una arginina en la posicion 97 son IL-1ra de agregacion. "IL-1 ra de agregacion" incluye protefnas de variantes y derivados de IL-1 ra de tipo que se agregan a 39 °C de acuerdo con el 10 siguiente ensayo. Una solucion de 100 mg/ml de IL-1 ra objeto se incuba a 39 °C en fosfato 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM, pH 6,5 (PSE). Como referencia, una solucion de 100 mg/ml de una protefna de tipo salvaje IL-1 ra que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5, se incuba en PSE a 39 °C. La densidad optica de cada solucion se mide a 405 nm, despues de 2 horas de incubacion a 39 °C. Si la IL-1 ra objeto tiene una densidad optica despues de 2 horas de incubacion que es al menos el 60 % de la densidad optica de la protefna de tipo salvaje IL-1 ra despues de 2 15 horas de incubacion, entonces la IL-1 ra objeto es una IL-1 ra de agregacion.
"IL-1ra que tiene agregacion reducida" incluye protefnas de variantes y derivados de IL-1 ra que tienen una densidad optica que es inferior al 60 % de la densidad optica de la protefna de tipo salvaje IL-1 ra en el ensayo descrito anteriormente.
20
En ciertas formas de realizacion, el termino "una IL-1 ra que tiene actividad antagonista para el receptor de interleucina-1" se refiere a una protefna de tipo salvaje, de variante o derivado de IL-1 ra que es al menos un 50 % tan activa como una protefna de tipo salvaje IL-1 ra que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, en el ensayo de formacion del complejo de senalizacion de IL-1 ra descrito en el Ejemplo 3. "Al menos el 50 % tan activo" 25 se determina comparando la Ce50 de la IL-1 ra objeto con la CE50 de protefna de tipo salvaje IL-1 ra.
El termino "Arginina-97" se refiere al residuo de aminoacidos en la posicion 97 en la SEQ ID NO: 3 o la posicion de aminoacidos en una IL-1 ra que corresponde al residuo de aminoacidos en la posicion 97 en la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoacido que corresponde a la arginina-97 de la SEQ ID NO: 3 es la arginina en la posicion 98 de la 30 SEQ ID NO: 5. Esa arginina todavfa se conoce como arginina-97 de IL-1ra. En ciertas formas de realizacion, la arginina-97 se denomina "R97", en la que R es el codigo de una sola letra para la arginina y 97 se refiere a su posicion en la SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, si R97 se reemplaza con otro amino acido, la mutacion puede denominarse R97X, en la que X es el codigo de una sola letra para el aminoacido de reemplazo. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, si r97 se reemplaza por alanina, la mutacion se puede denominar R97A.
35
El termino "Lisina-93" se refiere al residuo de aminoacidos en la posicion 93 en la SEQ ID NO: 3 o la posicion de aminoacidos en una IL-1 ra que corresponde al residuo de aminoacidos en la posicion 93 en la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoacido que corresponde a la lisina-93 de la SEQ ID NO: 3 es la lisina en la posicion 94 de la SEQ ID NO: 5. Esa lisina todavfa se conoce como lisina-93 de IL-1 ra. En ciertas formas de realizacion, la lisina-93 se 40 denomina "K93", en la que K es el codigo de una sola letra para la lisina y 93 se refiere a su posicion en la SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, si K93 se reemplaza con otro amino acido, la mutacion puede denominarse K93X, en la que X es el codigo de una sola letra para el aminoacido de reemplazo. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, si K93 se reemplaza por alanina, la mutacion se puede denominar K93A.
45 El termino "Triptofano-16" se refiere al residuo de aminoacidos en la posicion 16 en la SEQ ID NO: 3 o la posicion de aminoacidos en una IL-1 ra que corresponde al residuo de aminoacidos en la posicion 16 en la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoacido que corresponde al triptofano-16 de la SEQ ID NO: 3 es el triptofano en la posicion 17 de la SEQ ID NO: 5. Ese triptofano todavfa se conoce como triptofano-16 de IL-1ra. En ciertas formas de realizacion, el triptofano-16 se denomina "W16", en la que W es el codigo de una sola letra para el triptofano y 16 se refiere a su 50 posicion en la SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, si W16 se reemplaza con otro amino acido, la mutacion puede denominarse W16X, en la que X es el codigo de una sola letra para el aminoacido de reemplazo. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, si W16 se reemplaza por alanina, la mutacion se puede denominar W16A.
El termino "Tirosina-34" se refiere al residuo de aminoacidos en la posicion 34 en la SEQ ID NO: 3 o la posicion de 55 aminoacidos en una IL-1 ra que corresponde al residuo de aminoacidos en la posicion 34 en la SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoacido que corresponde a la tirosina-34 de la SEQ ID NO: 3 es la tirosina en la posicion 35 de la SEQ ID NO: 5. Esa tirosina todavfa se conoce como tirosina-35 de IL-1ra. En ciertas formas de realizacion, la tirosina-34 se denomina "Y34", en la que Y es el codigo de una sola letra para la tirosina y 34 se refiere a su posicion en la SEQ ID NO: 3. En ciertas formas de realizacion, si Y34 se reemplaza con otro amino acido, la mutacion puede
denominarse Y34X, en la que X es el codigo de una sola letra para el aminoacido de reemplazo. Por lo tanto, como ejemplo no limitativo, si Y34 se reemplaza por alanina, la mutacion se puede denominar Y34A.
En ciertas formas de realizacion, la "agregacion reducida" se define como (1) agregacion de un polipeptido en la 5 condicion A que se reduce en relacion con la agregacion del polipeptido en la condicion B; y/o (2) agregacion de una variante polipeptfdica en la condicion A que se reduce en relacion con la agregacion del polipeptido de tipo salvaje en la misma condicion A; y/o (3) agregacion de una variante polipeptfdica en la condicion A que se reduce en relacion con la agregacion de una variante polipeptfdica diferente en la misma condicion A. Como ejemplo no limitativo, la agregacion relativa se puede determinar para el caso (1) como se indica a continuacion. La densidad 10 optica a 405 nm de un polipeptido en la condicion A se mide en diversos tiempos. La densidad optica a 405 nm del polipeptido en la condicion B se mide entonces en los mismos diversos tiempos. La curva de agregacion para el polipeptido objeto en cada condicion se traza con densidad optica en el eje y, y el tiempo en el eje x. Si el polipeptido en la condicion A tiene una densidad optica mas baja en el tiempo t que el polipeptido en la condicion B en el mismo tiempo t, entonces se dice que el polipeptido en la condicion A tiene una agregacion reducida con respecto al 15 polipeptido en la condicion B.
Los ejemplos de diferentes condiciones incluyen, pero sin limitacion, diferencias en la composicion del tampon, diferencias en la temperatura, diferencias en la concentracion de polipeptidos, la presencia y ausencia de moleculas accesorias, diferencias en la concentracion de moleculas accesorias, etc.
20
El termino "molecula accesoria" se refiere a una molecula que reduce la agregacion de uno o mas polipeptidos. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de uno o mas polipeptidos no especfficamente. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion al interactuar con uno o mas aminoacidos del polipeptido. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria interactua 25 covalentemente con uno o mas aminoacidos del polipeptido y se denomina "molecula accesoria covalente". En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria interactua de manera no covalente con uno o mas aminoacidos del polipeptido y se denomina "molecula accesoria no covalente".
En ciertas formas de realizacion, la reduccion en la agregacion de un polipeptido esta relacionada con la 30 concentracion de la molecula accesoria. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede eliminar sustancialmente la agregacion de un polipeptido. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 10 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 20 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 30 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula 35 accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 40 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 50 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 60 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 70 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 75 %. En ciertas 40 formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 80 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 85 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 90 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la agregacion de un polipeptido en al menos un 95 %.
45
En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido. En ciertas formas de realizacion, la reduccion en la tasa de agregacion de un polipeptido depende de la concentracion de la molecula accesoria. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria elimina sustancialmente la agregacion de un polipeptido. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un 50 polipeptido en al menos un 10 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 20 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 30 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 40 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 50 %. En ciertas formas de 55 realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 60 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 70 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 75 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 80 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de
agregacion de un polipeptido en al menos un 85 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 90 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reduce la tasa de agregacion de un polipeptido en al menos un 95 %.
5 En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria interactua covalentemente o no covalentemente con un polipeptido en uno o mas residuos de aminoacidos. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria interactua con uno o mas residuos de aminoacidos especfficos. En ciertas formas de realizacion, una molecula
accesoria no reduce sustancialmente la actividad del polipeptido. En ciertas formas de realizacion, una molecula
accesoria no reduce la actividad del polipeptido en mas del 10 %. En ciertas formas de realizacion, las moleculas
10 accesorias no reducen la actividad del polipeptido en mas del 20 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria no reduce la actividad del polipeptido en mas del 30 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula
accesoria no reduce la actividad del polipeptido en mas del 50 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula
accesoria no reduce la actividad del polipeptido en mas del 75 %.
15 En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria elimina una carga presente en un residuo de aminoacidos. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria elimina una carga modificando covalentemente el residuo de aminoacidos. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria elimina una carga al interactuar de manera no covalente con el residuo de aminoacidos, "enmascarando" de este modo la carga.
20 Las moleculas accesorias covalentes ejemplares incluyen, pero sin limitacion, acido 6- (N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3- diazol-4-il)amino)hexanoico (NBD-X), metil acetil fosfato (MAP) y anhfdrido citraconico.
Las moleculas accesorias no covalentes ejemplares incluyen, pero sin limitacion, azucares, aniones de carga unica y aniones de carga multiple. Los azucares ejemplares que pueden ser moleculas accesorias incluyen, pero sin 25 limitacion, glicerol, sacarosa, manitol y sorbitol. Los ejemplos de aniones de carga unica que pueden ser moleculas accesorias incluyen, pero sin limitacion, fosfato y cloruro. Los aniones ejemplares de carga multiple que pueden ser moleculas accesorias incluyen, pero sin limitacion, pirofosfato y citrato.
El termino "molecula accesoria reactiva a la arginina" se refiere a una molecula accesoria que interactua 30 especfficamente con los residuos de arginina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la arginina interactua unicamente con arginina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la arginina interactua con la arginina ademas de otros aminoacidos. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la arginina interactua covalentemente con arginina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la arginina interactua no covalentemente con arginina. En ciertas formas de 35 realizacion, una molecula accesoria reactiva a la arginina no reduce sustancialmente la actividad del polipeptido que contiene la arginina.
El termino "molecula accesoria reactiva a la lisina" se refiere a una molecula accesoria que interactua especfficamente con los residuos de lisina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la 40 lisina interactua unicamente con lisina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la lisina interactua con lisina ademas de otros aminoacidos. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la lisina interactua covalentemente con la lisina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la lisina interactua no covalentemente con la lisina. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria reactiva a la lisina no reduce sustancialmente la actividad del polipeptido que contiene la lisina.
45
El termino "aniones de carga multiple" se refiere a moleculas que comprenden mas de una carga negativa a pH 6,5 y 25 °C. En ciertas formas de realizacion, los aniones de carga multiple tienen en promedio mas de una, pero menos de dos, cargas negativas a pH 6,5 y 25 °C. En ciertas formas de realizacion, los aniones de carga multiple tienen en promedio dos o mas cargas negativas a pH 6,5 y 25 °C. En ciertas formas de realizacion, los aniones de carga 50 multiple tienen en promedio entre dos y cuatro cargas negativas a pH 6,5 y 25 °C. En diversas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede determinar si un anion particular es un anion de carga multiple a pH 6,5 y 25°C, por ejemplo, a partir de los valores de pKa publicados para el anion. El termino "anion de carga unica" se refiere a un anion que tiene en promedio una carga negativa, o menos de una, a pH 6,5 y 25 °C. En diversas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede determinar si un anion particular es un anion de carga unica a pH 6,5 y 55 25°C, por ejemplo, a partir de los valores de pKa publicados para el anion.
El termino "azucar" se refiere a un carbohidrato. Los azucares ejemplares incluyen, pero sin limitacion, monosacaridos, disacaridos y trisacaridos. Los azucares ejemplares no limitantes incluyen, pero sin limitacion, glicerol, sacarosa, manitol y sorbitol.
Se considera que una enfermedad o afeccion medica es una "enfermedad mediada por interleucina-1" si la enfermedad o afeccion medica espontanea o experimental esta asociada con niveles elevados de IL-1 en fluidos corporales o tejido y/o si las celulas o tejidos tomados del cuerpo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En 5 ciertas formas de realizacion, dichas enfermedades mediadas por interleucina-1 tambien son reconocidas por una o mas de las siguientes dos condiciones: (1) los hallazgos patologicos asociados con la enfermedad o afeccion medica pueden imitarse experimentalmente en animales mediante la administracion de IL-1 o la regulacion positiva de expresion de IL-1; y/o (2) una patologfa inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad o afeccion condicion medica puede inhibirse o eliminarse mediante el tratamiento con agentes que inhiben la accion de la IL-1. 10 En ciertas formas de realizacion, una o mas de las condiciones anteriores se cumplen en una enfermedad mediada por IL-1. En ciertas formas de realizacion, todas las condiciones se cumplen en una enfermedad mediada por IL-1.
Las enfermedades mediadas por interleucina-1 aguda y cronica (IL-1) incluyen, pero sin limitacion, pancreatitis aguda; esclerosis lateral amiotrofica (ELA o enfermedad de Lou Gehrig); enfermedad de Alzheimer; 15 caquexia/anorexia, incluyendo, pero sin limitacion, caquexia inducida por el SIDA; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis; vasculitis autoinmune; sfndrome de fatiga cronica; enfermedades asociadas a Clostridium, incluyendo, pero sin limitacion, diarrea asociada a Clostridium; afecciones e indicaciones coronarias, incluyendo, pero sin limitacion, insuficiencia cardfaca congestiva, reestenosis coronaria, infarto de miocardio, disfuncion miocardica (por ejemplo, relacionada con sepsis) e injerto de derivacion de arteria coronaria; cancer, 20 incluyendo, pero sin limitacion, leucemias, incluyendo, pero sin limitacion, leucemia de mieloma multiple y mielogena (por ejemplo, AML y CML) y metastasis tumoral; diabetes (incluyendo, pero sin limitacion, diabetes dependiente de insulina); endometriosis; fiebre; fibromialgia; glomerulonefritis; enfermedad de injerto contra huesped y/o rechazo de trasplante; choque hemohorragico; hiperalgesia; enfermedad inflamatoria intestinal; afecciones inflamatorias de una articulacion, incluyendo, pero sin limitacion, osteoartritis, artritis psoriasica y artritis reumatoide; enfermedad 25 inflamatoria del ojo, incluyendo, pero sin limitacion, las asociadas con, por ejemplo, trasplante de cornea; isquemia, incluyendo, pero sin limitacion, isquemia cerebral (incluyendo, pero sin limitacion, lesion cerebral como resultado de, por ejemplo, traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, cada uno de los cuales puede provocar neurodegeneracion); enfermedad de Kawasaki; deterioro del aprendizaje; enfermedades pulmonares (incluyendo, pero sin limitacion, sfndrome de dificultad respiratoria aguda, o ARDS); esclerosis multiple; miopatfas (por ejemplo, el 30 metabolismo de las protefnas musculares, incluyendo, pero sin limitacion, metabolismo de las protefnas musculares en la sepsis); neurotoxicidad (incluyendo, pero sin limitacion, tal afeccion inducida por el VIH); osteoporosis; dolor, incluyendo, pero sin limitacion, dolor relacionado con el cancer; enfermedad de Parkinson; enfermedad periodontal; parto prematuro; psoriasis; lesion por reperfusion; choque septico; efectos secundarios de la radioterapia; enfermedad de la articulacion mandibular temporal; alteracion del sueno; uveitis; y afecciones inflamatorias resultado 35 de, por ejemplo, tension, esguince, dano del cartflago, traumatismo, cirugfa ortopedica, infeccion u otros procesos de enfermedades.
Descripcion detallada de ciertas formas de realizacion ejemplares
40 Se proporcionan metodos para reducir la agregacion de una IL-1ra de agregacion. En ciertas formas de realizacion, la IL-1 ra de agregacion, cuya agregacion debe reducirse, comprende la secuencia de aminoacidos en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6. En ciertas formas de realizacion, la IL-1ra de agregacion cuya agregacion debe reducirse, comprende un fragmento, variante o derivado de un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 6, donde ese 45 fragmento, variante o derivado tiene una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1.
La agregacion de IL-1 ra puede ser resultado de una o mas interacciones cation-pi entre los residuos de superficie de dos polipeptidos de IL-1 ra. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 2, la lisina-93 de un polipeptido IL-1 puede formar una interaccion cation-pi con el triptofano-16 de un segundo polipeptido IL-1. De manera similar, la 50 arginina-97 de un polipeptido puede formar una interaccion cation-pi con la tirosina-34 de un segundo polipeptido. Esas interacciones pueden hacer que dos polipeptidos IL-1ra se unan entre si. Ademas, debido a que la union es asimetrica, lo que significa que la union no se produce entre la misma cara en ambos polipeptidos, cada polipeptido puede ser capaz de unirse a dos polipeptidos IL-1 ra simultaneamente. De hecho, si son posibles contactos de union asimetricos adicionales entre los polipeptidos IL-1 ra, un polipeptido IL-1 ra puede ser capaz de unirse a mas de dos 55 polipeptidos IL-1 ra simultaneamente. Si cada polipeptido IL-1 ra es capaz de unirse al menos a otros dos polipeptidos IL-1 ra, por ejemplo, a traves de la interaccion cation-pi asimetrica que se muestra en la Figura 8, entonces esas interacciones pueden conducir a la agregacion de IL-1 ra en solucion.
En ciertas formas de realizacion, la agregacion de una IL-1 ra de agregacion puede reducirse reduciendo la carga
positiva en la lisina-93, en la arginina-97, o tanto en la lisina-93 como en la arginina-97. En ciertas formas de realizacion, si la carga positiva en una o ambas de esas posiciones se reduce lo suficiente, la interaccion cation-pi puede no formarse, o puede debilitarse de modo que ya no sea lo suficientemente estable como para causar la agregacion de IL-1ra. En ciertas formas de realizacion, la agregacion de una IL-1 ra de agregacion puede reducirse 5 por otros mecanismos. El metodo no esta limitado por el mecanismo de la reduccion en la agregacion. Cualquiera de los metodos descritos para reducir la agregacion puede producirse por el mecanismo propuesto ejemplar analizado anteriormente o por cualquier otro mecanismo que logre el resultado descrito. Las moleculas que son capaces de reducir la agregacion de una IL-1 ra de agregacion se denominan colectivamente "moleculas accesorias", independientemente de su mecanismo de reduccion de la agregacion y de si actuan de forma covalente o no 10 covalente.
En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede reducir la agregacion de una IL-1 ra de agregacion al reducir la carga positiva en una o ambas de lisina-93 o arginina-97. En diversas formas de realizacion, una molecula accesoria puede reducir la carga positiva en la lisina-93, en la arginina-97 o tanto en la lisina-93 como la 15 arginina-97 de forma covalente o no covalente. Una molecula accesoria postulada para reducir la carga positiva en uno o ambos de estos aminoacidos tambien puede reducir la agregacion a traves de otros mecanismos, o puede actuar por otros mecanismos en su totalidad.
En ciertas formas de realizacion, la incubacion de una IL-1 ra de agregacion con moleculas anionicas de carga unica 20 o anionicas de carga multiple puede reducir la agregacion de IL-1ra. En ciertas formas de realizacion, la incubacion de una IL-1 ra que tiene una agregacion reducida con moleculas anionicas de carga unica o anionicas de carga multiple puede reducir aun mas la agregacion de IL-1 ra. En ciertas formas de realizacion, esa reduccion en la agregacion puede ser resultado de la molecula anionica de carga unica o anionica de carga multiple que interactua con la carga positiva en la lisina-93, en la arginina-97, o tanto en lisina-93 como arginina-97. Como se analiza en el 25 trabajo descrito en el Ejemplo 2 y se muestra en la Figura 1, la incubacion de una IL-1 ra de agregacion en CSE, que contiene citrato 10 mM, redujo la agregacion (medida por la densidad optica a 405 nm) con el tiempo mas que la incubacion de IL-1 ra de agregacion en PSE, que contiene fosfato 10 mM. En ese experimento, la agregacion en CSE alcanzo una DO405 de aproximadamente 0,55, mientras que la agregacion en PSE alcanzo una DO405 de aproximadamente 1,2. Por lo tanto, la incubacion en CSE redujo la agregacion en mas del 50 % en relacion con la 30 agregacion en PSE en ese experimento.
De manera similar, en el trabajo descrito en el Ejemplo 2, la tasa de agregacion de IL-1ra de agregacion en CSE fue mas baja que la tasa de agregacion de IL-1ra de agregacion en PSE. La tasa de agregacion en PSE en la Figura 1 esta representada por la pendiente de la lfnea marcada como Kagg. Se puede trazar una lfnea similar para CSE en la 35 Figura 1, y esa lfnea tendra una pendiente mas baja, lo que indica una disminucion de la tasa de agregacion en CSE en relacion con PSE.
En ciertas formas de realizacion, el citrato puede ser mas eficaz para reducir la agregacion porque tiene una carga negativa mayor que el fosfato a un pH de 6,5. En ciertas formas de realizacion, ciertas cantidades de carga negativa 40 pueden ser mas eficaces que otras para reducir la agregacion. Ademas, en ciertas formas de realizacion, ciertas configuraciones de carga negativa, por ejemplo, la distancia entre las cargas negativas en una molecula accesoria y como estan "fijadas" esas cargas negativas en el espacio, tambien pueden afectar a la eficacia de las moleculas accesorias. Por lo tanto, en ciertas formas de realizacion, la eficacia de diversas moleculas accesorias puede verse afectada por la cantidad de carga negativa, pero la cantidad de carga negativa puede no ser siempre determinativa. 45 En ciertas formas de realizacion, un anion de carga multiple puede ser mas eficaz para reducir la agregacion que un anion de carga unica. En diversas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede seleccionar moleculas accesorias y determinar cual es apropiada para la aplicacion especffica contemplada. Por ejemplo, ciertas moleculas accesorias pueden ser mas o menos eficaces a ciertas temperaturas. En diversas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede seleccionar una molecula accesoria que sea eficaz a la temperatura particular a la que se 50 incubara o se almacenara la IL-1ra de agregacion. De acuerdo con la invencion, se selecciona una molecula accesoria que sea eficaz en la reduccion de la agregacion entre aproximadamente 20 °C y 45 °C. En ciertas formas de realizacion, se selecciona una molecula accesoria que sea eficaz en la reduccion de la agregacion entre aproximadamente 25 °C y 45 °C. En ciertas formas de realizacion, se selecciona una molecula accesoria que sea eficaz en la reduccion de la agregacion entre aproximadamente 30 °C y 45 °C. En ciertas formas de realizacion, se 55 selecciona una molecula accesoria que sea eficaz en la reduccion de la agregacion entre aproximadamente 35 °C y 45 °C.
En ciertas formas de realizacion, la alteracion de la concentracion de una molecula accesoria puede afectar a la reduccion en la agregacion o la reduccion en la tasa de agregacion de una IL-1ra de agregacion. El trabajo analizado
en el Ejemplo 4 y mostrado en la Figura 3 considero la tasa de agregacion de una IL-1ra de agregacion incubada en diversas concentraciones de fosfato, citrato o pirofosfato. En ese experimento, el citrato y el pirofosfato mostraron una correlacion similar entre una reduccion en la tasa de agregacion y la concentracion de la molecula accesoria. Tanto el citrato como el pirofosfato mostraron una reduccion de casi el 90 % en la tasa de agregacion en una 5 molecula accesoria 10 mM. Esa reduccion aumento tanto para el citrato como para el pirofosfato a 20 mM, y luego se estabilizo hasta mas de 100 mM. En contraste, el fosfato mostro solo una reduccion de aproximadamente el 20 % en la tasa de agregacion a 10 mM, y la reduccion no se estabilizo hasta aproximadamente 80 mM. Los resultados del experimento analizado en el Ejemplo 4 sugieren que el pirofosfato y el citrato son sustancialmente igualmente eficaces para reducir la tasa de agregacion de una IL-1 ra de agregacion a 29 °C. Tanto el citrato como el pirofosfato 10 tienen una mayor carga negativa que el fosfato a pH 6,5, lo que sugiere que, en ciertas formas de realizacion, la cantidad de carga negativa puede afectar a la eficiencia de ciertas moleculas accesorias.
En ciertas formas de realizacion, un azucar puede ser una molecula accesoria. Los azucares ejemplares que pueden ser moleculas accesorias incluyen, pero sin limitacion, sacarosa, glicerol, manitol y sorbitol. El Ejemplo 5 describe un 15 experimento ejemplar en el que las concentraciones crecientes de sacarosa, glicerol o sorbitol redujeron la tasa de agregacion de una IL-1ra de agregacion (vease la Figura 4). Al 3 %, cada uno de los tres azucares redujo la tasa de agregacion a menos de 5 unidades de agregacion (a.u.; 1 a.u. es igual a un aumento de 1 mili-unidad de densidad optica a 405 nm por minuto usando un volumen de 200 pl y un Espectrofotometro de lectura de placas SpectroMax™), en comparacion con una tasa de agregacion de mas de 20 a.u. en azucar al 0 %.
20
En diversas formas de realizacion, un experto en la tecnica puede determinar la concentracion apropiada de una molecula accesoria no covalente para una aplicacion particular usando, por ejemplo, los metodos del Ejemplo 4 o del Ejemplo 5. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente a una concentracion de 1 a 100 mM. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente en una concentracion de
25 1 a 50 mM. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente en una concentracion de
1 a 20 mM. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente en una concentracion de
10 mM.
En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente en una concentracion de entre el 0 y 30 el 10 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente en una concentracion de entre el 0 y el 5 %. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede estar presente en una concentracion del 1 %, 2 % o el 3 %.
En ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra es inferior a 10 mM. En 35 ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra es inferior a 7 mM. En ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra es inferior a 5 mM. En ciertas
formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1ra es inferior a 4 mM. En ciertas
formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1ra es inferior a 3 mM. En ciertas
formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra esta entre 0,1 mM y 5 mM. En
40 ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1ra esta entre 1 mM y 5 mM. En ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra esta entre 0,1 mM y 4 mM. En ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra esta entre 1 mM y 4 mM. En ciertas formas de realizacion, la Kd de una molecula accesoria no covalente para IL-1 ra esta entre 2 mM y 4 mM.
45 En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede reducir la agregacion modificando covalentemente una IL-1ra de agregacion. En ciertas formas de realizacion, una molecula accesoria puede reducir adicionalmente la agregacion modificando covalentemente una IL-1 ra que tiene una agregacion reducida. En ciertas formas de realizacion, la modificacion covalente elimina una carga positiva en la lisina-93, en la arginina-97, o tanto en la lisina- 93 como en la arginina-97. En ciertas formas de realizacion, una molecula covalente accesoria puede reducir la 50 agregacion mediante otro mecanismo, por ejemplo, inhibiendo estericamente la formacion de una o mas interacciones cation-pi u otras interacciones entre los polipeptidos IL-1 ra de agregacion.
Las moleculas accesorias ejemplares no limitativas que pueden modificar covalentemente una IL-1 ra incluyen, pero sin limitacion, NBD-X, MAP y anhfdrido citraconico. En ciertas formas de realizacion, NBD-X forma un derivado con 55 aminas primarias. En el trabajo analizado en el Ejemplo 3 y mostrado en la Figura 2, la incubacion de la protefna de tipo salvaje IL-1ra con NBD-X, SE dio lugar a la derivacion del grupo amino terminal del polipeptido y de la lisina-93. En ciertas formas de realizacion, la derivacion con NBD-X puede eliminar la carga positiva en la lisina-93 y puede dar como resultado una agregacion reducida de IL-1ra derivatizada. En ciertas formas de realizacion, MAP acetila residuos de lisina y los grupos amino N-terminales de polipeptidos. En el trabajo analizado en el Ejemplo 7 y
mostrado en las Figuras 13-15, la incubacion de IL-1 ra con MAP en varios tiempos de incubacion, dio como resultado la derivacion del grupo amino N-terminal de IL-1 ra; la derivacion del grupo amino N-terminal y lisina-6 de IL-1ra; la derivacion del grupo amino N-terminal, lisina-6 y lisina-93 de IL-1ra; o la derivacion del grupo amino N- terminal, lisina-6, lisina-93 y lisina-96 de IL-1ra. En ciertas formas de realizacion, la derivacion con MAP puede 5 eliminar la carga positiva en la lisina-93 y puede dar como resultado una agregacion reducida de IL-1 ra derivatizada.
En ciertas formas de realizacion, otras moleculas reactivas a amina pueden reducir la agregacion de una IL-1 ra de agregacion al eliminar una o mas cargas positivas o mediante otro mecanismo. En ciertas formas de realizacion, IL- 1ra que se ha derivado con una molecula accesoria covalente es al menos un 90 % tan activa como una protefna de 10 tipo salvaje IL-1 ra que no se ha derivado de manera similar. En ciertas formas de realizacion, IL-1 ra que se ha derivado con una molecula accesoria covalente es al menos un 80 % tan activa como una protefna de tipo salvaje IL-1 ra que no se ha derivado de manera similar. En ciertas formas de realizacion, IL-1ra que se ha derivado con una molecula accesoria covalente es al menos un 75 % tan activa como una protefna de tipo salvaje IL-1ra que no se ha derivado de manera similar. En ciertas formas de realizacion, IL-1 ra que se ha derivado con una molecula accesoria 15 covalente es al menos un 50 % tan activa como una protefna de tipo salvaje IL-1ra que no se ha derivado de manera similar.
A continuacion, se describen los kits que comprenden IL-1 ra y al menos una molecula accesoria. Los kits pueden incluir opcionalmente instrucciones para combinar la IL-1 ra y la al menos una molecula accesoria, si los 20 componentes se proporcionan por separado. Los kits pueden incluir instrucciones para usar la IL-1 ra y la al menos una molecula accesoria. Los kits pueden comprender al menos una molecula accesoria covalente y/o al menos una molecula accesoria no covalente. Cuando el kit comprende al menos una molecula accesoria covalente, el kit puede comprender ademas instrucciones para eliminar cualquier molecula accesoria sin reaccionar restante de la IL-1 ra derivatizada despues de la incubacion de IL-1 ra con la molecula accesoria covalente. Los kits pueden contener IL- 25 1ra que ya se ha derivado con al menos una molecula accesoria covalente. De manera similar, en ciertas formas de realizacion, un kit puede contener una IL-1ra que ya esta en una composicion con al menos una molecula accesoria no covalente.
Como se describe a continuacion, se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad 30 terapeuticamente eficaz de IL-1ra junto con un diluyente, vehfculo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
Los materiales de formulacion aceptables pueden ser no toxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.
35
Una composicion farmaceutica puede comprender materiales de formulacion para modificar, mantener y/o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolucion o liberacion, adsorcion y/o penetracion de la composicion. Los materiales de formulacion ejemplares incluyen, pero sin limitacion, aminoacidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina); 40 antimicrobianos; antioxidantes (tales como acido ascorbico, sulfito de sodio e hidrogeno-sulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos y otros acidos organicos); agentes de carga (tales como manitol y glicina); agentes quelantes (tal como acido etilendiamino tetraacetico (EDTA)); agentes complejantes (tales como cafefna, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina e hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacaridos; disacaridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, manosa y dextrinas); protefnas (tales como albumina serica, 45 gelatina e inmunoglobulinas); agentes colorantes, saporfferos y diluyentes; agentes emulsionantes; polfmeros hidrofilos (tales como polivinilpirrolidona); polipeptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tal como el sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, acido benzoico, acido salicflico, timerosal, alcohol fenetflico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, acido sorbico y peroxido de hidrogeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol); alcoholes de azucar (tales como manitol y sorbitol); agentes de 50 suspension; tensioactivos o agentes humectantes (tales como pluronics, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa y sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, tales como cloruro de sodio y potasio, manitol, sorbitol); vehfculos de administracion; diluyentes; excipientes y adyuvantes farmaceuticos. (Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edicion, 55 A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990).
Una IL-1 ra y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales pueden estar unidos a un vehfculo que prolonga la semivida. Los vehfculos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, el dominio Fc, polietilenglicol y dextrano. Se describen ciertos vehfculos ejemplares, por ejemplo, en la Solicitud de Estados Unidos N.° de Serie 09/428.082 y la
Solicitud PCT N.° WO 99/25044 publicada.
Un experto en la tecnica determinara una composicion farmaceutica optima dependiendo, por ejemplo, de la via de administracion prevista, el formato de administracion y la dosificacion deseada. Vease, por ejemplo, Remington's 5 Pharmaceutical Sciences, anteriormente. En ciertas formas de realizacion, dichas composiciones pueden influir en el estado ffsico, la estabilidad, la velocidad de liberacion in vivo y la velocidad de depuracion in vivo de la IL-1ra.
El vehfculo o portador primario en una composicion farmaceutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en ciertas formas de realizacion, un vehfculo o portador adecuado puede ser agua para inyeccion, solucion 10 salina fisiologica o lfquido cefalorraqufdeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administracion parenteral. La solucion salina tamponada neutra o la solucion salina mezclada con albumina serica son vehfculos ejemplares adicionales. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender tampon Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampon de acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir ademas sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. Una composicion que comprende una IL-1ra, con o 15 sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, puede prepararse para el almacenamiento mezclando la composicion seleccionada con el grado de pureza deseado con agentes de formulacion opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una solucion acuosa. Ademas, una composicion que comprende una IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, puede formularse como un liofilizado usando excipientes 20 apropiados, tal como sacarosa.
Las composiciones farmaceuticas pueden seleccionarse para administracion parenteral. Las composiciones pueden seleccionarse para inhalacion o para administracion a traves del tracto digestivo, tal como por via oral. La preparacion de tales composiciones farmaceuticamente aceptables esta dentro de los conocimientos de la tecnica.
25
Cuando se contempla la administracion parenteral, una composicion terapeutica puede estar en forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirogenos, que comprende la IL-1ra deseada, con o sin al menos una molecula accesoria y/o una o mas agentes terapeuticos adicionales, en un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Un vehfculo para inyeccion parenteral puede ser agua destilada esteril en la que la IL-1 ra, con o sin al 30 menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, se formula como una solucion isotonica esteril, debidamente conservada. La preparacion puede involucrar la formulacion de la molecula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partfculas bioerosionables, compuestos polimericos (tales como acido polilactico o acido poliglicolico), perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberacion controlada o sostenida del producto que luego puede ser administrado a traves de un deposito de inyeccion. Tambien se puede 35 usar acido hialuronico, y puede tener el efecto de promover una duracion sostenida en la circulacion. Se pueden usar dispositivos de administracion de farmacos implantables para introducir la molecula deseada.
Una composicion farmaceutica puede formularse para inhalacion. Una IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, puede formularse como un polvo seco para inhalacion. 40 Una solucion de inhalacion que comprende una IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, puede formularse con un propulsor para la administracion de aerosol. Las soluciones pueden nebulizarse. La administracion pulmonar se describe adicionalmente en la solicitud PCT n.° PCT/US94/001875, que describe la administracion pulmonar de protefnas modificadas qufmicamente.
45 Ademas, se contempla que las formulaciones pueden administrarse por via oral. Una IL-1 ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, que se administra de esta manera puede formularse con o sin los vehfculos utilizados habitualmente en la composicion de formas de dosificacion solidas, tales como comprimidos y capsulas. Puede disenarse una capsula para liberar la porcion activa de la formulacion en el punto del tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradacion 50 presistemica. Se puede incluir al menos un agente adicional para facilitar la absorcion e la IL-1ra y/o cualquier molecula accesoria y/o cualquier agente terapeutico adicional. Tambien se pueden emplear diluyentes, saporfferos, ceras de bajo punto de fusion, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspension, agentes desintegrantes de comprimidos y aglutinantes.
55 Una composicion farmaceutica puede implicar una cantidad eficaz de IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, en una mezcla con excipientes no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. Al disolver los comprimidos en agua esteril u otro vehfculo apropiado, las soluciones se pueden preparar en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitacion, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa o fosfato
de calcio; o agentes de union, tales como almidon, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico o talco.
Las composiciones farmaceuticas adicionales seran evidentes para los expertos en la tecnica, incluidas las 5 formulaciones que implican IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, en formulaciones de administracion sostenida o controlada. En ciertas formas de realizacion, las tecnicas para formular una diversidad de otros productos de administracion sostenida o controlada, tales como vehfculos de liposomas, micropartfculas bioerosionables o perlas porosas e depositos de inyeccion, tambien se conocen por los expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Solicitud PCT N.° PCT/US93/00829, que describe la 10 liberacion controlada de micropartfculas polimericas porosas para la administracion de composiciones farmaceuticas. Las preparaciones de liberacion sostenida pueden incluir matrices de polfmeros semipermeables en forma de artfculos conformados, por ejemplo, pelfculas, o microcapsulas. Las matrices de liberacion sostenida pueden incluir poliesteres, hidrogeles, polilactidas (veanse, por ejemplo, los documentos U.S. 3.773.919 y EP 058,481), copolfmeros de acido L-glutamico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli(2- 15 hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., anteriormente) o acido poli-D(-)-3-hidroxibutfrico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberacion sostenida pueden incluir liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de varios metodos conocidos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); los documentos EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.
20
La composicion farmaceutica que se usa para la administracion in vivo es tfpicamente esteril. Esto se puede lograr mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles. Cuando la composicion esta liofilizada, la esterilizacion usando este metodo puede realizarse antes o despues de la liofilizacion y reconstitucion. La composicion para administracion parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una solucion. Las 25 composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso esteril, por ejemplo, una bolsa de solucion intravenosa o vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica.
Una vez formulada la composicion farmaceutica, se puede almacenar en viales esteriles en forma de una solucion, 30 suspension, gel, emulsion, solido o como polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que se reconstituye antes de la administracion.
Se pueden proporcionar kits para producir una unidad de administracion de dosis unica. Los kits pueden contener 35 cada uno un primer recipiente que tiene una protefna seca y un segundo recipiente que tiene una formulacion acuosa. Se pueden incluir kits que contengan jeringas precargadas de una sola camara y varias camaras (por ejemplo, jeringas de lfquido y liojeringas).
La cantidad eficaz de una composicion farmaceutica que comprende una IL-1ra, con o sin al menos una molecula 40 accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, para ser empleados terapeuticamente dependera, por ejemplo, del contexto terapeutico y los objetivos. Un experto en la tecnica apreciara que los niveles de dosificacion apropiados para el tratamiento, de acuerdo con ciertas formas de realizacion, variaran de este modo dependiendo, en parte, de la molecula suministrada, la indicacion para la cual se utiliza la IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, la via de administracion y el tamano (peso corporal, 45 superficie corporal o tamano del organo) y/o condicion (la edad y la salud general) del paciente. En ciertas formas de realizacion, el medico puede valorar la dosis y modificar la via de administracion para obtener el efecto terapeutico optimo. Una dosificacion tfpica puede variar de aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. La dosificacion puede variar de 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o de 1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 pg/kg hasta aproximadamente 50 100 mg/kg.
La frecuencia de dosificacion puede tener en cuenta los parametros farmacocineticos de IL-1ra y/o cualquier molecula accesoria y/o cualquier agente terapeutico adicional en la formulacion utilizada. Un medico puede administrar la composicion hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. Por lo tanto, la composicion 55 puede administrarse como una dosis unica, o como dos o mas dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de la molecula deseada) con el tiempo, o como una infusion continua a traves de un dispositivo de implantacion o cateter. El refinamiento adicional de la dosis apropiada se realiza de forma rutinaria por los expertos en la tecnica y esta dentro del ambito de las tareas que habitualmente realizan. Pueden determinarse dosificaciones apropiadas mediante el uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.
La ruta de administracion de la composicion farmaceutica es segun los metodos conocidos, por ejemplo, por via oral, mediante inyeccion por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; por sistemas de liberacion sostenida o por 5 dispositivos de implantacion. Las composiciones pueden administrarse mediante inyeccion en bolo o de forma continua mediante infusion, o mediante un dispositivo de implantacion.
La composicion puede administrarse localmente a traves de la implantacion de una membrana, una esponja u otro material apropiado sobre el cual se ha absorbido o encapsulado la molecula deseada. Cuando se usa un dispositivo 10 de implantacion, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u organo adecuado, y la administracion de la molecula deseada puede realizarse mediante difusion, bolo de liberacion programada o administracion continua.
Puede ser deseable usar una composicion farmaceutica que comprenda una IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, de manera ex vivo. En tales casos, las celulas, 15 tejidos y/u organos que se han extrafdo del paciente se exponen a una composicion farmaceutica que comprende una IL-1ra, con o sin al menos una molecula accesoria y/o uno o mas agentes terapeuticos adicionales, despues de lo cual las celulas, tejidos y/u organos se implantan de nuevo en el paciente.
En ciertos casos, una IL-1 ra que tiene una agregacion reducida y/o cualquier molecula accesoria y/o cualquier 20 agente terapeutico adicional puede administrarse mediante la implantacion de ciertas celulas que han sido modificadas geneticamente, utilizando metodos conocidos en la tecnica, para expresar y segregar los polipeptidos. Dichas celulas pueden ser celulas animales o humanas, y pueden ser autologas, heterologas o xenogenicas. Las celulas pueden ser inmortalizadas. Para disminuir la posibilidad de una respuesta inmunologica, las celulas pueden encapsularse para evitar la infiltracion de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulacion son, por lo 25 general, cerramientos o membranas polimericas semipermeables y biocompatibles que permiten la liberacion del producto o productos de protefnas, pero evitan la destruccion de las celulas por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.
Ejemplos
30
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan con fines ilustrativos.
Ejemplo 1
35
Produccion de protefna de tipo salvaje IL-1ra
El antagonista del receptor de interleucina-1 recombinante humano (IL-1ra) que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5, puede prepararse en las instalaciones de fabricacion de Amgen de acuerdo con el metodo analizado en la Patente 40 europea N.° EP 0 502 956 B1, en la que la etapa de recuperacion celular es opcional. Como alternativa, la anakinra, que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, puede obtenerse en Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. La IL-1ra humana purificada que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5 se uso en los ejemplos descritos en el presente documento.
45 Ejemplo 2
Agregacion de IL-1 ra
La agregacion de IL-1 ra en tampon fosfato y tampon citrato a 39 °C se determino de la siguiente manera. Diez ml de 50 una solucion madre de IL-1 (200-220 mg/ml de protefna en citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM, pH 6,5 (CSE)) se dializaron durante una noche a 4 °C frente a 2 x 2 l de fosfato 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0,5 mM, pH 6,5 (PSE) o 2 x 2 l de CSE. La solucion dializada se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm y la concentracion de protefna IL-1 ra se ajusto a 140 mg/ml diluyendo con el tampon apropiado.
55 La agregacion de IL-1ra en cada tampon se midio utilizando una placa de vidrio de 96 pocillos (Zissner) y un espectrofotometro de lectura de placas de temperatura controlada, SpectraMax Plus (Molecular Devices). El tamano de la muestra por pocillo fue de 180 pl. Las placas se incubaron en el espectrofotometro a 39 °C y la densidad optica se midio a 405 nm cada 1 minuto. La Figura 1 muestra la densidad optica a 405 nm representada en funcion del tiempo para este experimento. La tasa de agregacion se determino como la pendiente de la region lineal inicial de la
curva de saturacion utilizando el programa SoftMax Pro (Molecular Devices). La tasa de agregacion de IL-1 ra incubada en CSE se reduce en relacion con la tasa de agregacion de IL-1 ra incubada en PSE. Ademas, la extension de la agregacion de IL-1ra incubada en CSE se reduce con relacion a la extension de la agregacion de IL- 1 ra incubada en PSE.
5
Ejemplo 3
Marcado con NBD-X de IL-1 ra
10 Los grupos amino expuestos en la superficie se identificaron marcando IL-1 ra con NBD-X, SE (6-(N-(7-nitrobenz-2- oxa-1,3-diazol-4-il)amino)hexanoato de succinimidilo, Molecular Probes). NBD-X se convierte en fluorescente tras la derivacion con grupos amino. Se diluyeron veinte pl de IL-1 ra 0,2 mM en PSE con 480 pl de PSE. Se anadieron ocho pl de 50 pg/pl de NBD-X, solucion de SE en dimetilformamida a la solucion de IL-1 ra en aumentos de 2 pl a temperatura ambiente. La reaccion se incubo durante una hora a temperatura ambiente, luego se detuvo mediante la 15 adicion de 50 pl de una solucion 1,5 M de hidroxilamina, pH 8,5. La mezcla de reaccion se paso a traves de una columna de filtracion de gel desalinizante que se preequilibro con PSE. El pico de protefna se recogio y se analizo adicionalmente por RP-HPLC y LC-MS/MS de la siguiente manera.
La HPLC de fase inversa se realizo utilizando una columna Phenomenex Jupiter™ 5p C4 (300 A, 250 x 4,6 mm) y un 20 sistema HP1100 HPLC equipado con detectores de absorbancia y fluorescencia en lfnea. La absorbancia se midio a 215 nm para detectar la presencia del polipeptido. La emision fluorescente se midio a 535 nm despues de la excitacion a 480 nm para detectar la presencia de NBD-X derivada de amina. La elucion se realizo con un gradiente lineal del 30-45 % de metanol en acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1 % y agua (v/v/v). La Figura 2 muestra la absorbancia de IL-1ra marcada con NBD-X a 215 nm y la emision fluorescente de IL-1ra marcada con NBD-X a 535 25 nm despues de la excitacion a 480 nm para este experimento. La identidad de los picos fluorescentes se determino como se indica a continuacion.
Se identificaron dos picos de fluorescencia principales, un pico de elucion temprana a los 16,75 minutos y un pico de elucion posterior a los 17,5 minutos. Vease la Figura 2, panel inferior. Los picos se recogieron manualmente y se 30 digirieron con endoproteinasa Lys-C de la siguiente manera. Cada pico se recogio de cinco formas de realizacion de HPLC separadas. Todas las fracciones que contenfan principalmente el pico de 16,75 se agruparon juntas. Todas las fracciones que contenfan principalmente el pico de 17,5 minutos se agruparon juntas. Las dos muestras reunidas se secaron luego con centrifugacion utilizando un concentrador SpeedVac. Cada una de las muestras reunidas se disolvio luego en 490 pl de tampon de digestion, que contenfa Tris 10 mM, clorhidrato de guanidinio 0,8 M, pH 8,0. 35 Despues, se anadieron 10 pl de una solucion de proteinasa Lys-C, preparada disolviendo 5 pg de proteinasa Lys-C (grado de secuenciacion, Roche Diagnostics) en 50 pl de tampon de digestion, a cada muestra agrupada. Las muestras se digirieron durante una noche a 37 °C. Despues de la digestion, los peptidos generados se sometieron a LC-MS/MS utilizando un Finnegan LCQ Deca equipado con una HPLC Beckman System Gold de acuerdo con el protocolo del fabricante estandar.
40
Para el pico de elucion temprana (16,75 min), la digestion produjo un peptido unico de masa 1107,8 m/z, correspondiente a un peptido amino-terminal de IL-1 ra con una masa anadida de 276 amu, lo que sugiere la presencia de un derivado de NBD. El analisis de MS/MS del peptido produjo fragmentos consistentes con la secuencia de aminoacidos MRPSGRK mas una masa extra de 276 amu en el residuo de metionina, lo que sugiere 45 que la metionina amino-terminal de IL-1 ra se derivatizo con NBD-X.
La digestion del pico de elucion posterior (17,5 min) produjo un peptido unico de masa de 1145,9 m/z, que sugirio un peptido IL-1 ra correspondiente a los residuos 72-96 que comprenden un derivado de NBD. El analisis de MS/MS del peptido produjo fragmentos consistentes con la secuencia de aminoacidos correspondiente a los residuos 72-96 con 50 una lisina derivatizada con NBD en la posicion 93.
De acuerdo con los resultados anteriores, la lisina en la posicion 93 de IL-1ra es capaz de derivatizar con NBD-X en las condiciones utilizadas en este experimento. Estos resultados tambien sugieren que la lisina en la posicion 93 esta expuesta y es un residuo accesible al disolvente en la protefna IL-1 ra intacta.
55
Ejemplo 4
Tasa de agregacion de IL-1ra en presencia de fosfato, citrato o pirofosfato
La tasa de agregacion de IL-1 ra se determino en varias composiciones de tampon diferentes. Diez ml de una solucion madre de IL-1 (220 mg/ml en CSE) se dializaron contra 2 x 4 l de NaCl 140 mM usando un tubo de dialisis Pierce Snakeskin (3,5 kDa de corte) a 4 °C. Las alfcuotas de la solucion de IL-1 ra dializada se llevaron a diversas concentraciones de citrato, fosfato o pirofosfato mediante la adicion de citrato 0,45 M, fosfato 0,5 M o soluciones 5 madre de pirofosfato 0,45 M (todas con pH 6,5) y un volumen apropiado de NaCl 140 mM para dar como resultado una concentracion final de IL-1 ra en cada muestra de 140 mg/ml. La concentracion final de citrato, fosfato o pirofosfato en cada muestra vario de 1 a 125 mM.
La agregacion de IL-1ra en cada muestra se controlo durante 4 horas a 29 °C midiendo la dispersion de la luz a 405 10 nm a intervalos de un minuto como se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior. La tasa de agregacion se determino como la pendiente de la region lineal de la curva de saturacion calculada utilizando el programa SoftMax Pro (Molecular Devices). La Figura 3 muestra que en este experimento, la tasa de agregacion de IL-1 ra disminuyo con concentraciones crecientes de citrato, fosfato o pirofosfato. Particularmente, la tasa de agregacion de IL-1ra en tampon citrato o pirofosfato disminuyo mas rapidamente que la tasa de agregacion en tampon fosfato.
15
Las pKa estimadas de los tres hidrogenos ionizables sobre fosfato son 2,148, 7,198 y 12,35 a pH 6,5 y 39 °C. Las pKa estimadas de los tres hidrogenos ionizables en citrato son 3,128, 4,761 y 6,396 a pH 6,5 y 39 °C. Las pKa estimadas de los cuatro hidrogenos ionizables en pirofosfato son 0,83, 2,26, 6,72 y 9,46 a pH 6,5 y 39 °C. Vease, por ejemplo, Goldberg et al., Thermodynamic quantities for the ionization reactions of buffers. J. Phys. Chem. Ref. 20 Data, 31(2):231-370 (2002). Por consiguiente, se preve que el fosfato tendra predominantemente una carga negativa a pH 6,5 y 39 °C, mientras que se preve que el citrato tendra tres cargas negativas a pH 6,5 y 39 °C, y se preve que el pirofosfato tendra entre dos y tres cargas negativas a pH 6,5 y 39 °C, segun lo estimado de acuerdo con las pKa indicadas en la bibliograffa analizadas anteriormente.
25 Por lo tanto, estos resultados sugieren que los aniones de carga multiple pueden reducir la tasa de agregacion de IL- 1 ra mas eficazmente que los aniones de carga unica a un pH particular. De acuerdo con esa conclusion, se encontro que el NaCl, que es un anion de carga unica, tiene un perfil de tasa de agregacion similar al del fosfato (datos no mostrados).
30 Ejemplo 5
Tasa de agregacion de IL-1 ra en presencia de sacarosa, glicerol o sorbitol
La tasa de agregacion de IL-1 ra se determino en presencia de varios azucares diferentes. Se dializaron diez ml de 35 una solucion madre de IL-1 (220 mg/ml en CSE) frente a 2 x 4 l de NaCl 140 mM usando un tubo de dialisis Pierce Snakeskin (3,5 kDa de corte) a 4 °C. Las alfcuotas de la solucion de IL-1 ra dializada se llevaron a varias concentraciones porcentuales de sacarosa, glicerol o sorbitol mediante la adicion del 25 % de sacarosa, 25 % de glicerol o 25 % de soluciones madre de sorbitol y un volumen apropiado de NaCl 140 mM para dar como resultado una concentracion final de IL-1 ra en cada muestra de 140 mg/ml. La concentracion final de sacarosa, glicerol o 40 sorbitol en cada muestra fue del 0 %, 1 %, 2 % o 3 %. La tasa de agregacion se determino midiendo la densidad optica de cada solucion de IL-1 ra a 39 °C utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 2. La Figura 4 muestra que en este experimento, las concentraciones crecientes de azucar dieron como resultado tasas de agregacion decrecientes de IL-1 ra. En azucar al 0 %, la tasa de agregacion de IL-1 ra en este experimento fue de aproximadamente 22 unidades de agregacion (a.u., medidas como el aumento de la densidad mili-optica a 405 nm 45 por minuto). Al 3 % de sacarosa, glicerol o sorbitol, la tasa de agregacion de IL-1 ra se redujo a entre 0 y 5 a.u.
Ejemplo 6
Despliegue inducido por urea y clorhidrato de guanidinio de IL-1 ra 50
El despliegue en equilibrio de IL-1 inducido por urea se realizo de la siguiente manera. Para estudios de dicrofsmo circular de UV lejano, se envolvieron en papel de aluminio 1-1,5 ml de muestras de 0,86 mg/ml de IL-1 ra y diversas concentraciones de urea (entre aproximadamente 0 y 10 M) para protegerlas de la luz y se incubaron durante una noche (>12 horas) a temperatura ambiente. El dicrofsmo circular a 230 nm se determino para cada muestra a 23 °C. 55 La Figura 9 muestra la senal de dicrofsmo circular a 230 nm para IL-1ra incubada en diversas concentraciones de urea para este experimento. Los datos se representaron graficamente y la curva de despliegue se ajusto a un modelo de 3 estados, estado nativo <-> estado intermedio <-> estado desplegado. En este modelo, m1, que es la pendiente de la primera transicion, y Cm1, que es el punto medio de la primera transicion, estaban restringidos. Estos parametros estaban restringidos porque los CD UV lejanos no pueden distinguir entre los estados nativos e
intermedios. Los valores restringidos para ml y Cmi se obtuvieron promediando los valores de varias mediciones de fluorescencia, que fueron capaces de distinguir el estado nativo del estado intermedio. Como se muestra en la Figura 9, IL-1ra experimento una transicion de despliegue global entre aproximadamente 4 y 6 M de urea en este experimento.
5
Para los estudios de fluorescencia, se envolvieron en papel de aluminio 1-1,5 ml de muestras de 0,086 mg/ml de IL- 1ra y diversas concentraciones de urea (entre aproximadamente 0 y 10 M) para protegerlas de la luz y se incubaron durante una noche (>12 horas) a temperatura ambiente. La Figura 10 muestra la fluorescencia intrfnseca a 353 nm de IL-1 ra incubada en diversas concentraciones de urea. Los datos se representaron graficamente y la curva de 10 despliegue se ajusto al modelo de 3 estados analizado anteriormente. No se aplicaron restricciones en este experimento. Como se muestra en la Figura 10, el experimento de fluorescencia sugiere la presencia de una transicion de despliegue entre 0 y aproximadamente 1,5 M de urea. Dado que esa transicion no se observa en el experimento de CD UV lejano, puede reflejar la acumulacion de un estado intermedio con una estructura secundaria de tipo nativo. Ese estado intermedio puede implicar mas cambios locales en la estructura, por ejemplo, 15 desestabilizacion de los bucles de superficie, mientras que el nucleo hidrofobo de IL-1 ra puede permanecer sustancialmente imperturbable.
El despliegue inducido por el clorhidrato de guanidinio en equilibrio (GuHCI) se realizo de la siguiente manera. Para estudios de dicrofsmo circular de UV lejano, se envolvieron en papel de aluminio 1-1,5 ml de muestras de 0,86 20 mg/ml de IL-1 ra y diversas concentraciones de GuHCl (entre aproximadamente 0 y 5 M) para protegerlas de la luz y se incubaron durante una noche (>12 horas) a temperatura ambiente. El dicrofsmo circular a 230 nm se determino para cada muestra a 23 °C. La Figura 11 muestra la senal de dicrofsmo circular a 230 nm para IL-1ra incubada en diversas concentraciones de GuHCl. Los datos se representaron graficamente y la curva de despliegue se ajusto al modelo de 3 estados, estado nativo <-> estado intermedio <-> estado desplegado. En este modelo, m1, Cm1, "ns", 25 que es la pendiente del valor inicial del estado nativo, e "is", que es la pendiente del valor inicial del estado intermedio, estaban restringidos. Los valores restringidos de m1 y Cm1 para el despliegue inducido por GuHCI se determinaron sustancialmente como se ha descrito anteriormente para el despliegue inducido por urea. "Ns" e "is" estaban restringidos a ser mayores de cero. Estos parametros estaban restringidos porque los CD UV lejanos no pueden distinguir entre los estados nativos e intermedios. Como se muestra en la Figura 11, IL-1ra experimento una 30 transicion de despliegue global entre aproximadamente 1 y 2 M de GuHCl en este experimento.
Para los estudios de fluorescencia, se envolvieron en papel de aluminio 1-1,5 ml de muestras de 0,086 mg/ml de IL- 1ra y diversas concentraciones de GuHCl (entre aproximadamente 0 y 5 M) para protegerlas de la luz y se incubaron durante una noche (>12 horas) a temperatura ambiente. La Figura 12 muestra la fluorescencia intrfnseca a 353 nm 35 de IL-1 ra incubada en diversas concentraciones de urea. Los datos se representaron graficamente y la curva de despliegue se ajusto al modelo de 3 estados analizado anteriormente. No se aplicaron restricciones en este experimento. La Figura 12 muestra la fluorescencia intrfnseca a 353 nm de IL-1 ra incubada en diversas concentraciones de GuHCl. Los datos se representaron graficamente y la curva de despliegue se ajusto al modelo de 3 estados analizado anteriormente. No se aplicaron restricciones en este experimento. Como se muestra en la 40 Figura 12, los datos de fluorescencia sugieren la presencia de una transicion de despliegue entre aproximadamente 0 y 0,6 M de GuHCl. Dado que esa transicion no se observa en el experimento de CD UV lejano, puede reflejar la acumulacion de un estado intermedio con una estructura secundaria de tipo nativo. Ese estado intermedio puede implicar mas cambios locales en la estructura y/o implicar la desestabilizacion de los bucles de superficie, mientras que el nucleo hidrofobo de IL-1ra puede permanecer sustancialmente imperturbable.
45
La diferencia entre los datos de fluorescencia para el despliegue inducido por urea y el despliegue inducido por GuHCI puede ser resultado de los efectos diferenciales de los dos desnaturalizantes sobre la fluorescencia intrfnseca de IL-1ra.
50 Ademas, la diferencia entre los datos de CD y los datos de fluorescencia para cada desnaturalizante puede deberse a la capacidad de la fluorescencia intrfnseca del triptofano para detectar cambios locales en la estructura terciaria de la protefna, mientras que la CD detecta cambios en la estructura secundaria de la protefna.
Ejemplo 7
55
Derivacion de IL-1ra con metil acetil fosfato (MAP)
En ciertas formas de realizacion, el acetil fosfato de metilo (MAP) acetila residuos de lisina y las aminas N-terminales de polipeptidos. MAP se preparo como se describe en Kluger et al. (1980) J. Org. Chem., 45: 2723. La identidad del
producto se confirmo mediante RMN y espectrometrfa de masas.
La IL-1 ra se derivo con MAP en presencia de citrato o fosfato como se indica a continuacion. Para la derivacion en presencia de citrato, se anadieron 20 pl de MAP (solucion madre 10 mM en agua) y 20 pl de IL-1 ra (solucion madre 5 10 mM en CSE) a 160 pl de citrato 10 mM, pH 6,5 en un vial de HPLC. La reaccion se incubo a 37 °C y se tomaron alfcuotas de 25 pl utilizando un automuestreador de HPLC en 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos. Cada alfcuota se analizo mediante HPLC de fase inversa utilizando una HPLC Agilent 110 equipada con una columna de HPLC de fase inversa Jupiter 5u C4 300A (4,6 x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA), un detector UV en lfnea y una bandeja de muestras de 100 pocillos de temperatura controlada fijada a 37 °C. El caudal se ajusto a 1 ml/min y la columna se
10 mantuvo a una temperatura de 50 °C. La columna se equilibro previamente durante 15 min (caudal de 1 ml/min) con 65 % de tampon A (acido trifluoroacetico al 0,1 % (TFA) en agua) y 35 % de tampon B (acetonitrilo al 90 %, TFA al 0,1 % en agua). Despues de la carga, los analitos se eluyeron utilizando un gradiente de aumento del 35 % al 50 % de tampon B (acetonitrilo al 90 %, TFA al 0,1 % en agua) durante 25 minutos.
15 Para la derivacion en presencia de fosfato, se anadieron 20 pl de MAP (solucion madre 10 mM en agua) y 20 pl de IL-1 ra (solucion madre 10 mM en CSE) a 160 pl de fosfato 10 mM, pH 6,5 en un vial de HPLC. La reaccion se incubo a 37 °C y se tomaron alfcuotas de 25 pl utilizando un automuestreador de HPLC en 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos. Cada alfcuota se analizo mediante HPLC de fase inversa como se ha descrito anteriormente para la derivacion en presencia de citrato.
20
Los resultados de la derivacion en presencia de citrato se muestran en la Figura 13. Los resultados de la derivacion en presencia de fosfato se muestran en la Figura 14. Ambos perfiles de HPLC revelan cuatro picos de IL-1ra nuevos, de resolucion debil, resultado de la derivacion con MAP en este experimento.
25 La IL-1 ra tambien se derivo con MAP en presencia de pirofosfato 10 mM, pH 6,4. Se anadieron veinte pl de MAP (solucion madre 10 mM en agua) y 20 pl de IL-1 ra (solucion madre 10 mM en CSE) a 160 pl de pirofosfato 10 mM, pH 6,4 en un vial de HPLC. La reaccion se incubo a 37 °C y se tomaron alfcuotas de 25 pl utilizando un automuestreador de HPLC en 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos. Cada alfcuota se analizo mediante HPLC de fase inversa como se ha descrito anteriormente para la derivacion en presencia de citrato. La Figura 15 muestra una
30 superposicion de los resultados de la HPLC de fase inversa de la derivacion de IL-1ra con MAP durante 4,5 horas (270 minutos) en presencia de citrato, en presencia de fosfato y en presencia de pirofosfato. Se identificaron cuatro picos resueltos debilmente en este experimento y se indican en la Figura 15.
Cada uno de los picos a partir del punto de tiempo de 270 minutos para la derivacion en presencia de citrato, que se
35 muestra en la Figura 15, se analizo adicionalmente para determinar la identidad de cada uno, como se indica a continuacion. Los cuatro picos principales se recogieron de la forma de realizacion de HPLC analizada anteriormente. Las muestras se concentraron en un SpeedVac a un volumen final de 5-10 pl. Despues, se anadieron noventa pl de tampon de digestion (tris 50 mM, guanidinio 0,8 M-HCl, pH 8,0) a cada muestra, seguidos de 10 pl de endoproteinasa lys-C (1 pg en 10 pl de tampon de digestion). Las muestras se incubaron a 37 °C durante 16 horas.
40 Los peptidos resultantes se analizaron por LC-MS/MS utilizando una HPLC Agilent 110 equipada con una deteccion de Ms en lfnea con una trampa de iones Finnegan. La columna de HPLC utilizada fue una columna de HPLC de fase inversa Jupiter 5u C18 100A (2 x 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA). El caudal se ajusto a 0,2 ml por minuto y la columna se mantuvo a una temperatura de 50 °C. La columna se equilibro previamente durante 22 minutos con un 98 % de tampon A ((TFA al 0,1 % en agua) y un 2 % de tampon B (acetonitrilo al 90 %, TFA al 0,1 % en agua).
45 Despues de la carga, los analitos se eluyeron de la columna de HPLC usando un gradiente de aumento del 2 % al 45 % de tampon B durante 50 minutos. El diez por ciento del eluyente de la columna de HPLC se sometio a un analisis por MS. La presencia de un grupo acetilo adicional en un peptido dio como resultado un aumento de 42 m/z en el perfil de MS en relacion con el peptido no modificado. La identidad de los peptidos detectados y los residuos de aminoacidos especfficos que se modificaron se verifico mediante MS/MS.
50
El polipeptido IL-1 ra del pico 1 parecfa derivarse solo en su amina N-terminal. El polipeptido IL-1 ra del pico 2 parecio derivarse en su amina N-terminal y en la lisina-6. El polipeptido IL-1ra del pico 3 parecio derivarse en su amina N-terminal, en la lisina-6 y en la lisina-93. Finalmente, el polipeptido IL-1 ra del pico 4 parecio derivatizarse en su amina N-terminal, en la lisina-6, en la lisina-93 y en la lisina-96.
55
El nivel de derivacion en todas las posiciones, excepto la amina N-terminal, parece ser mayor en presencia de fosfato que en presencia de citrato o pirofosfato. Estos resultados sugieren que el citrato y/o el pirofosfato pueden proteger los grupos de lisina cargados positivamente en IL-1 ra de la derivacion con MAP mejor que el fosfato. Estos resultados pueden sugerir que el citrato y/o el pirofosfato tienen una afinidad mas fuerte por los residuos de lisina
cargados positivamente que el fosfato.
La velocidad de derivacion de IL-1 ra con MAP se determino utilizando los datos mostrados en la Figura 13 (y reproducidos en la Figura 16A) para la derivacion de IL-1 ra en presencia de citrato. En particular, cada 5 cromatograma de la Figura 16A se sometio a deconvolucion utilizando PeakFit™ (Systat Software Inc.). Despues, se integro el area debajo de cada uno de los picos en deconvolucion (picos 1-4) en cada punto de tiempo (0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos). En la Figura 16B se muestra un perfil en deconvolucion ejemplar para un punto de tiempo. Los picos 1-4 en deconvolucion estan marcados en la Figura 16B y el area integrada bajo de cada uno se muestra a continuacion. El pico 1 tenia un area integrada de 160,28590. El pico 2 tenia un area integrada de 10 190,41964. El pico 3 tenia un area integrada de 181,76548. El pico 4 tenia un area integrada de 178,18844. El area integrada del pico 4 en deconvolucion en los puntos de tiempo 0, 45, 90, 135, 180 minutos se represento entonces en funcion del tiempo de incubacion de la reaccion que produjo ese pico. Ese grafico se muestra en la Figura 16C. La lfnea resultante tiene una pendiente de 68,931 hora-1.
15 La velocidad de derivacion de IL-1 ra con MAP se calculo entonces para diversos experimentos en presencia de diversos tampones y a diversos pH, de acuerdo con los metodos descritos anteriormente. Las distintas tasas se representaron entonces en un grafico de barras, que se muestra en la Figura 17. Especfficamente, la velocidad de derivacion de IL-1 ra con MAP se determino en presencia de fosfato 10 mM, pH 6,3; citrato 10 mM, pH 6,3; pirofosfato 10 mM, pH 6,3; fosfato 10 mM, pH 6,5; fosfato 20 mM, pH 6,5; citrato 10 mM, pH 6,5; citrato 20 mM, pH 20 6,5; pirofosfato 10 mM, pH 6,5; pirofosfato 20 mM, pH 6,5; fosfato 10 mM, pH 6,7; citrato 10 mM, pH 6,7; y pirofosfato 10 mM, pH 6,7.
En cada pH, la tasa de derivacion de IL-1 ra con MAP fue mas lenta en tampon citrato o pirofosfato que en tampon fosfato. Vease la Figura 17. Ademas, la velocidad de derivacion en presencia de citrato o pirofosfato 20 mM fue mas 25 lenta que la velocidad de derivacion en presencia de citrato o pirofosfato 10 mM. Estos resultados sugieren que el citrato y/o el pirofosfato pueden proteger los residuos de lisina de IL-1ra de la derivacion con MAP de manera mas eficaz que el fosfato. Por lo tanto, la velocidad de derivacion de IL-1 ra con MAP es mas lenta en presencia de tampon citrato o pirofosfato que en presencia de tampon fosfato.
30 Finalmente, la IL-1ra tambien se derivo con MAP en presencia de citrato 10 mM a pH 6,3, pH 6,5 o pH 6,7; o en presencia de fosfato 10 mM, pH 6,3, pH 6,5 o pH 6,7, durante 5,5 horas, de acuerdo con los metodos descritos anteriormente. La Figura 18 muestra una superposicion de los resultados de la HPLC de fase inversa de la derivacion de IL-1 ra con MAP durante 5,5 horas en presencia de cada uno de esos tampones. Esa figura muestra que la IL-1ra se deriva en mayor medida en presencia de fosfato que en presencia de citrato en todos los niveles de 35 pH analizados. Esos resultados sugieren que el citrato puede proteger los residuos de lisina de IL-1ra de la derivacion con MAP de manera mas eficaz que el fosfato.
Los datos mostrados en la Figura 18 tambien sugieren que la IL-1 ra se deriva en mayor medida a medida que aumenta el pH.
40
Ejemplo 8
Agregacion de IL-1 ra en presencia de diversas concentraciones de fosfato
45 Se dializaron diez ml de IL-1ra (220 mg/ml en CSE) a 4 °C durante 48 horas frente a un total de 8 l (2 l con tres cambios de tampon de 2 l cada uno) de fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5. La concentracion de IL-1 ra se ajusto a 167 mg/ml con fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5. Se preparo una solucion madre de fosfato 1 M disolviendo una cantidad apropiada de fosfato de sodio en el fosfato 10 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM. Se hicieron soluciones madre de trabajo veinte mM, 60 mM, 110 mM, 210 mM, 310 mM, 410 mM, 510 mM, 610 mM, 710 mM, 810 mM, 910 mM, y 1 50 M de fosfato, pH 6,5 a partir de la solucion madre 1 M por dilucion con fosfato 10 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM.
La agregacion de IL-1ra en diversas concentraciones de fosfato se midio utilizando una placa de vidrio de 96 pocillos (Zissner) y un espectrofotometro de lectura de placas de temperatura controlada, SpectraMax Plus (Molecular Devices). Se anadieron ciento ochenta microlitros de la solucion madre de 167 mg/ml de IL-1ra a cada pocillo. 55 Despues, se anadieron veinte pl de una solucion madre de trabajo de fosfato a cada pocillo (una solucion madre de trabajo por pocillo). La concentracion final de fosfato en los pocillos fue 0 mM, 2 mM, 6 mM, 11 mM, 21 mM, 31 mM, 41 mM, 51 mM, 61 mM, 71 mM, 81 mM, 91 mM, 100 mM. La placa se incubo en el espectrofotometro a 39 °C y la densidad optica se midio a 405 nm cada 1 minuto. La Figura 19 muestra la densidad optica a 405 nm representada en funcion del tiempo para cada concentracion de fosfato para este experimento. Los datos en la Figura 19 sugieren
que la extension de la agregacion de IL-1ra disminuye con el aumento de la concentracion de fosfato.
Ejemplo 9
5 Medicion de la union de citrato a IL-1 ra
El numero de sitios de union a ion de citrato y la Kd de union de citrato a IL-1 ra se determinaron como se indica a continuacion. Se prepararon soluciones de 1 ml de IL-1 ra 1 mM en tampones que tenfan diversas concentraciones de citrato, pH 6,5 diluyendo la solucion madre de IL-1 ra (220 mg/ml en CSE) en tampones apropiados. 10 Especfficamente, se prepararon 1 ml de soluciones 1 mM de IL-1 ra en cada uno de citrato 5 mM, 10 mM y 20 mM, pH 6,5. Cada solucion tambien contenfa NaCl 70 mM. Se pusieron 400 microlitros de cada solucion en una columna de centrifugacion Microsep™-10 (Pall Corporation; una solucion por columna). Las columnas se centrifugaron a 18 °C durante 35 minutos a 4000 xg. Despues de la centrifugacion, la IL-1 ra permanece en el retenido, unido a parte del citrato, mientras que parte del tampon que contiene citrato no unido pasa a traves del filtro como filtrado. 15 Despues de la centrifugacion, aproximadamente la mitad de la solucion habfa pasado a traves del filtro como filtrado.
La cantidad de citrato en cada retenido y filtrado se determino de la siguiente manera. Se cargaron veinte pl de filtrado o retenido en una columna de HPLc de fase inversa (columna Supelcosil™ LC-18, 15 cm x 4,6 mm, Sigma- Aldrich, cat. n.° 58985). El caudal fue de 1 ml por minuto con acido fosforico 0,1 M como tampon de realizacion 20 (elucion isocratica). La elucion se realizo a temperatura ambiente. La cantidad de acido cftrico eluido de la columna se midio a 215 nm. La concentracion de citrato en la muestra que se ensaya (el retenido o el filtrado) se calculo entonces a partir de esa medicion (el sistema se calibro con estandares de solucion de citrato 0-10 mM, pH 6,5).
La Figura 20 muestra un grafico de la concentracion de citrato unido a IL-1 ra (determinada como la concentracion 25 de citrato en el retenido menos la concentracion de citrato en el filtrado) frente a la concentracion de citrato total en la solucion. La concentracion maxima de citrato unido, Bmax, se extrapola a partir de esos datos para que sea 1,8218 mM. Los datos de la Figura 20 se usaron para crear un grafico de Scatchard para determinar la Kd para la union de citrato a IL-1ra. La Kd se calculo como 3,846 mM para este experimento (datos no mostrados). Ademas, el numero de sitios de union para citrato en IL-1 ra se determino a partir de la interseccion x en el grafico de Scatchard. El 30 numero de sitios de union fue de 0,94 para este experimento (datos no mostrados). Estos datos sugieren que hay un sitio de union de citrato en IL-1 ra.
Ejemplo 10
35 Competicion por el sitio de union al anion ra IL-1
La competicion por el sitio de union de citrato en IL-1ra por pirofosfato se determino como se indica a continuacion. Cuatrocientos microlitros de una solucion que contenfa IL-1ra 1 mM, citrato 10 mM, pH 6,5, NaCl 70 mM y una concentracion de ensayo de pirofosfato se pusieron en una columna de centrifugacion Microsep™-10 (Pall 40 Corporation) y se centrifugaron a 18°C durante 35 minutos a 4000 xg. Las concentraciones de pirofosfato ensayadas fueron 0 mM, 5 mM, 10 mM y 20 mM. Despues de la centrifugacion, aproximadamente la mitad de la solucion paso a traves del filtro como filtrado, mientras que la solucion restante permanecio por encima del filtro como retenido. La IL-1 ra permanece en el retenido, unido a parte del citrato y/o pirofosfato, mientras que parte del tampon que contiene citrato no unido y pirofosfato pasara a traves del filtro como filtrado. La concentracion de citrato 45 tanto en el retenido como en el filtrado se determino como se ha analizado anteriormente en el Ejemplo 9. La competicion por el sitio de union de citrato en IL-1 ra por fosfato se determino como se ha descrito anteriormente para el pirofosfato.
La Figura 21 muestra un grafico de la concentracion de citrato unido por IL-1 ra frente a la relacion de la 50 concentracion total de anion de competicion (pirofosfato o fosfato) con respecto a la concentracion total de citrato en la solucion. Los datos sugieren que el pirofosfato es mas eficaz en la competicion con el citrato por el sitio de union de citrato en IL-1ra que el fosfato. Debido a que tanto el pirofosfato como el fosfato parecen ser capaces de competir por el sitio de union a IL-1ra (es decir, el sitio no es especffico para citrato), se hace referencia a la union de citrato en el sitio de IL-1 ra como el sitio de union de aniones.
A partir de los datos mostrados en la Figura 21, la Kd para la union de pirofosfato al sitio de union de anion en IL-1 ra se determino usando los siguientes calculos. Vease, por ejemplo, Stinson y Holbrook, Biochem. J. (1973) 131: 719728. La competicion entre la union de citrato y pirofosfato se puede expresar como dos equilibrios separados:

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    10
    15
    20
    25
    1. Un metodo para reducir la agregacion de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra), o
    reducir la tasa de agregacion de un IL-1ra, en una composicion acuosa, en el que el metodo comprende reducir la agregacion o reducir la tasa de agregacion de IL-1 ra en la composicion acuosa mediante la incubacion de la composicion acuosa que comprende IL-1 ra con al menos una molecula accesoria a una concentracion suficiente para reducir la agregacion o reducir la tasa de agregacion de IL-1 ra en la composicion acuosa, en el que al menos una de las al menos una molecula accesoria es eficaz para reducir la agregacion entre 20 °C y 45 °C y se selecciona de un azucar en una concentracion del 1 al 3 por ciento y un anion de carga multiple.
  2. 2.
    El
    multiple.
  3. 3.
    El
  4. 4.
    El
  5. 5.
    El
  6. 6.
    El
  7. 7.
    Un
    El metodo de la reivindicacion 2, en el que dicho anion de carga multiple es pirofosfato 1 a 20 mM.
    El metodo de la reivindicacion 2, en el que dicho anion de carga multiple es citrato 1 a 20 mM.
    El metodo de la reivindicacion 1, en el que al menos una molecula accesoria es un azucar.
    El metodo de la reivindicacion 5, en el que dicho azucar es glicerol, sorbitol o sacarosa.
    comprende reducir la agregacion de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra), o reducir la tasa de agregacion de un IL-1ra, en una composicion acuosa incubando la composicion acuosa que comprende la IL-1ra con al menos una molecula accesoria a una concentracion suficiente para reducir la agregacion o reducir la tasa de agregacion de la IL-1ra en la composicion acuosa, en el que al menos una de la al menos una molecula accesoria es eficaz en la reduccion de la agregacion entre 20 °C y 45 °C y se selecciona de un azucar en una concentracion del 1 al 3 por ciento y un anion de carga multiple, en el que la agregacion se reduce.
    30 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que al menos una molecula accesoria es un anion de carga
    multiple.
  8. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicho anion de carga multiple es pirofosfato 1 a 20 mM.
    35 10. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicho anion de carga multiple es citrato 1 a 20 mM.
  9. 11. El metodo de la reivindicacion 7, en el que al menos una molecula accesoria es un azucar.
  10. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que dicho azucar es glicerol, sorbitol o sacarosa.
    40
    Agregaci6n de IL-1 ra a 39°C (405 nm)
    imagen1
    Tiempo (s)
    Figura 2
    RP HPLC de IL-lra, marcada con NBD-X a pH 6,5
    imagen2
    CO
    4^
    tfft
    12
    5/16/03
    [lL-1ra]'«140mg/ml
    imagen3
    ■ mM Fosfato sodico vs Pendiente P
    . mM Pirofosfato sodico vs Pendiente PP Rep 1
    ■ mM Citrato sodico vs Pendiente C
    ■mM Pirofosfato sodico vs Pendiente PP Rep 2
    imagen4
    -r~
    20
    40
    - i—
    60
    mM
    100
    —I—
    120
    140
    imagen5
    FIG. 5
    . 10 20 + 30 40 50 50
    GAATTCCGGGCTGCAGTCACAG?lATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCXCCTAXTCA
    HEICRGL RSHLI
    70 50 90 lAo 110 120 CTCTCCTCCTCTrCXTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCfiACCCTCTGGGAGAAAATCXIA TT.LLFLFHS ET I C(R)PSGRKS
    130 240 150 160 170 ISO
    GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA S K M Q A f R I WOVKQltTFYL RH
    ■
    190 200 210 220 230 240
    accaactagttgctggatacttgcaaggaccaaatgtcaatttagaagaaaagatagatg
    Q l V JL G T L
    Q Q P H V H L BEK X D
    250 260
    270 260 290 300
    TGGTACCeATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCXnxrr
    imagen6
    . 310 320 330 340 350 360. CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRIiQLEAVKITD
    370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGMiAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTCGCCCCA LSEtiRKQDKRFAFIRSDSGP
    430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCC6GTTGGTTGCTCTGCACAGC(3ATGGAAGCT6 TTSPESAACPGWF&CTAHEA
    490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGtCACCAAATTCTACT DQPVSLTNHPDEGVKVTKFr
    550 *560 570 500 590 600
    TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG
    F Q E D B *
    FIG. 6
    ($)PSGRKSSKKQAFR X A O
    WDVHQXTFYLRMNQLV AGYl
    qgphvwleekidvvpiepha
    ' LFLGIHGGKMCLSCVKSGDE
    0
    T R L QLBAVK I TDLSENRKQD
    +
    XRFAFIASD5GPTTSF8SAA
    CPGWFXiCTAHEADQPVSLTH
    mpdegvmvtkfyfqbde
    imagen7
    Cadena 1
    imagen8
    16
    Lys-93
    Cadena 2
    Ajuste de curva basado en modelo de 3 estados: N <-> | <-> JJ (Restriccidn de ml y Cmi)
    imagen9
    Fluorescencia a 353 nm
    Ajuste de curva basado en modelo de 3 estados: N <-> I <-> U
    imagen10
    ro
    Ajuste de curva basado en modelo de 3 estados: N <-> I <-> U (Restrictiones: ml, Cm1, ns>0, ls>0)
    imagen11
    Ajuste de curva basado en modelo de 3 estados: N <-> I U'
    -P^
    CO
    imagen12
    ■daoi a aio-aia.<tBiKiro,ica (iHPCBAAireiupnMoaujiBinBATAW022aca«Gi-oiai.D}
    0AD1 A. Bls«S16,<) RtMBO.IO) (U.VCBAfttrai50PF\M00UJIEflU>ATAmnaEra31-CB31.B) 0AD1 A B)g-Z1«.4 R« *880,100 {VWJCBAADQiroPAUJOOUJSeBUATA»«I2aCrOO(-CEJ01.r) 0AO1 A 8lg*21«.4R«WKMC0<MAPCBARD«1S0PnU0aUI8eHICATAtM0228C8Wl-O«1.0) dam a ai«-2iBa4 niKmo.icn(hLAPCBAn[»3is3PFvuoomeeRiBATA»4Q2aacffaa«-Daoi.D) OAD1 A *lg«2Aa.4 n«>^EE.1t3Q (MAPCBAAb\21S0PFMQCUJtE3nSATAO<(mACStt01-0e31 JO) DAD1A 9lg-210.4R«KXO.tOO (WAPCBAflOiaiOOPfWQCmJBBfPXiATAWOEflCSWWJTOI
    imagen13
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    4^
    cn
    DAD1 A, Slo*218.<»KlMBO.100 (M.VCBARraiaOPrtMaO\UlEmaATMMS2DTB'C01'aiai.D) DA01 A. aiB-I15AF«*‘3M.1QQ(M«,CBAflD'aiMPPWQOWJlEmOATA»«22#TBt01-OZl1JJ BAM A. aig>21S/4 BlrKWl.lOO (kfcVCaAROiaiflOPFMjaOUJIEFnDATAKMQMTriOOI-OJOl J) DAD1 A, 8lj-21fl.< RtMflO.ICU 0*VCBA»D\2 lOOPnMCIGWJSEmDATAlMEBfl T0ia01-C4D».D) DAM A. 8I8-213.A fl«M0O,1DO (H;VCBAA5tt18aPF\*aO\USEm5ATAW3IIBTEY]C1-M01.D) DAM A, Il5«2ia.AR«MSa,1DO CWAPCSAatratEEPFAMOCWEEIWiATA'OMraU'aM-CaM.D) DAM A. E 10*210,4 R|K360,100(MAPCBAADMI60PFVUQCNiSEFADATAO4Q32STBV3D1-OTDI.D)
    1000
    imagen15
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    1
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    imagen21
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    imagen22
    Area integrada 1.160,28590
  11. 2. 190,41964
  12. 3. 181,76548
  13. 4. 178,18844
    Pendiente= 68,931
    imagen23
    ro
    o
    u ^ tn 01 o o o o
    Fosfato 10 mM
    Citrato 10 mM
    Pirofosfato 10 mM
    10mM
    20mM
    10mM
    20m M
    10mM
    20m M
    Fosfato 10 mM
    Citrato 10 mM
    Pirofosfato 10 mM
    8U03-U U-S0
    ssteezsoB
    Figura 17
    imagen24
    imagen25
    11000
    r
    [Citrato unidoj, mM
    Union de citrato a IL-1 ra, un sitio de saturation
    imagen26
    imagen27
    0,0
    imagen28
    0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
    ____________[ani6n]/[Citrato]_______________________
    [Pirofosfato] Xtotal
    [Citrato] total Ltotal [Citrato-IL-1 ra] PL [IL-1ra]total Ptotal [IL-1ra]libre Plibre [Citrato] libre Llibre Delta [Citrato-IL-1 ra] segun j aumenta [pirofosfato] DeltaPL
    0,000
    10,000 1,129 1,750 0,621 8,871
    0,000
    5,000
    10,000 0,837 1,750 0,913 9,163 0,292
    10,000
    10,000
    0,703 1,790 1,087 9,297 0,423
    20,000
    10,000 0,433 1,790 1,357 9,567 0,696
    imagen29
    Union competitiva con pirofosfato
    cn
    oo
    imagen30
    Pendiente/interseccion = 1/K\
    KdY para pirofosfato^ 2,994 mM
    A
    1 cat
    4 atgcgaccgtccggccgtaagagctccaaaatgcaggctttccgt 1MRP SGRKS S KMQ AFR
    4 9 atctgggacgttaaccagaaaaccttctacctgcgcaacaaceag 16 I WDVNQKT P YLRNNQ
    94 ctggttgctggctacctgcagggtccgaacgttaacctggaagaa 31LVAGYLQ G PNVNLEE
    13 9 aaaatcgacgttgtaccgatcgaaccgcacgctctgttcctgggt 46KIDVVP I E P HALFLG
    184 atccacggtggtaaaatgtgcctgagctgcgtgaaatctggtgac 61IHGGKMCL S CVKSGD
    22 9 gaaactcgtctgcagctggaagcagttaacatcactgacctgagc 76 B-T R-L Q L -E- A V N- I T D L- S
    274 gaaaaccgcaaacaggacaaacgtttcgcattcatccgctctgac 91E.NRKQDKRFAF 1RSD
    319 agcggcccgaccaccagcttcgaatctgctgcttgcccgggttgg 106 SGPTTSF E SAACPGW
    3 64 ttcctgtgcactgctatggaagctgaccagccggtaagcctgacc 121 FLCTAMEADQPVSLT
    409 aac^tgccggacgaaggcgtgatggtaaccaaattctacttccag 136 NMPDEGVMVTKFYFQ
    454 gaagacgaataatgggaagctt 465 SEQ ID NO: 4 151 E D E * SEQ ID NO: 5
    1 MALETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLE 50
    • • • • •
    51 EKIDWPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRK 100
    • • • • •
    101 QDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMV 150
    151 TKFYFQEDE 159 SEQ ID NO: 6
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