MXPA06010352A - Metodos para reducir la agregacion del antagonista del receptor de interleucina 1 - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para reducir la agregación de una IL-1ra de agregación que comprenden incuban IL-1ra con al menos una molécula accesoria. También se proporcionan equipos que comprenden IL-1ra y por lo menos una molécula accesoria. Se proporcionan también composiciones farmacéuticas que comprenden IL-1ra y por lo menos una molécula accesoria.

Description

MÉTODOS PARA REDUCIR LA AGREGACIÓN DEL ANTAGONISTA DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA 1 Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para reducir la agregación de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL—Ira) de agregación. La presente invención se refiere también a métodos para mejorar formulaciones de fármaco que comprenden reducir la agregación de IL-lra. La presente invención se refiere también a métodos para tratar enfermedades usando IL-lra cuya agregación ha- sido reducida. Finalmente, la presente invención se refiere a composiciones y equipos que comprenden una IL-lra cuya, agregación ha . sido reducida . Antecedentes de la invención La interleucina-1 alfa (IL-la) , interleucina-1 beta (IL-lß) y el antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) se unen cada uno al receptor de IL-1 tipo 1 (IL-1RI) , el cual se encuentra sobre la superficie de ciertos tipos de células . IL-l y IL-lß tienen efectos fisiológicos en un número de células objetivo diferentes, incluyendo ciertas células que están implicadas en las respuestas inflamatoria e inmunitaria. IL-lra, en contraste, se une a IL-lRI, pero no desarrolla respuestas biológicas descendentes comparables . Más bien, IL-lra inhibe competitivamente la unión de IL-la y IL-lß EEF.: 175514 a IL-1RI. La anan inra, una versión producida por E. coli de IL-lra, se comercializa para el tratamiento de artritis reumatoide. Breve descripción de la invención En ciertas modalidades, se proporciona un método para reducir la agregación de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación. En ciertas modalidades, el método comprende incubar IL-lra con al menos una molécula accesoria. En ciertas modalidades, se proporciona un método para preparar una formulación de fármaco con antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) . En ciertas modalidades, el método comprende incubar la IL-lra de agregación con por lo menos una molécula accesoria. En ciertas- modalidades, se reduce la agregación. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un paciente. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un paciente que tenga artritis. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un paciente que tenga artritis reumatoide. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un paciente que tenga osteoartritis . En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un paciente que tenga al menos una de enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, glomerulonefritis o leucemia. En ciertas modalidades, se proporciona un método para tratar un paciente que tenga un efecto adverso de IL-1. En ciertas modalidades, se proporciona un método de tratamiento de un paciente . que comprende administrar al paciente una composición que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y (ii) por lo menos una molécula accesoria. En ciertas modalidades, se proporcionan equipos. En ciertas modalidades, un equipo comprende un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y al menos una molécula accesoria. En ciertas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y al menos una molécula accesoria. En ciertas modalidades, por lo menos una molécula accesoria está presente a una concentración que reduce la agregación de una IL-lra de agregación. En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria está presente a una concentración que reduce la velocidad de agregación de una IL-lra de agregación. En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas. En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas . En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria es pirofosfato 1 a 20 mM. En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria es citrato 1 a 20 mM. En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria es por lo menos un azúcar. En ciertas modalidades, al menos uno de los azúcares es glicerol, sorbitol o sucrosa. En ciertas modalidades, al menos uno de los azúcares está presente a una concentración de 1 a 3 por ciento . En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina. En ciertas modalidades, al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (JV- (7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-il) amino) hexanoico (NBD-X) , fosfato de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico. Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra el perfil de agregación de proteína IL-lra tipo silvestre con el tiempo ya sea en PSE (fosfato 10 mM, pH 6.5, NaCl 140 mM, EDTA 0.5 mM) o CSE (citrato 10 mM, pH 6.5, NaCl 140 mM, EDTA 0.5 mM) descrito en el Eje plo 2. La figura 2 muestra la cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) de proteína IL-lra tipo silvestre derivada con NBD-X descrita en el Ejemplo 3. El panel superior muestra la absorbancia de IL-lra marcada con NBD-X a 215 nm. El panel inferior muestra la emisión fluorescente a 535 nm luego de la excitación a 480 nm. La figura 3 muestra las velocidades de agregación para proteína IL-lra tipo silvestre - en presencia de concentraciones cada vez más altas de aniones de fosfato, pirofosfato y citrato descritas en el Ejemplo 4. La figura 4 muestra las velocidades de agregación para proteína IL-lra tipo silvestre en presencia de concentraciones cada vez más altas de glicerol, sorbitol o sucrosa descritas en el Ejemplo 5. La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ . ID 110:1) y secuencia de aminoácidos " (SEQ ID NO: 2) de IL-lra humana precursora, la cual incluye una secuencia líder secretora. La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de L-lra humana que carece de la secuencia líder secretora (SEQ ID NO: 3) . El punto (•) indica la usina en la posición 93. El signo de más (+) indica la arginina en la posición 97. también se indican las ubicaciones de triptófano-16 (?) y tirosina-34 (O) . La figura 7 muestra una estructura de cristal por rayos X de IL-lra ejemplar. La figura 8 muestra una porción de la interfaz entre las dos subunidades del dí ero de IL-lra asimétrico en la estructura de cristal por rayos X descrita para la figura 1.

La figura 9 muestra el desdoblamiento de equilibrio inducido por urea de IL-lra detectado por dicroísmo circular descrito en el Ejemplo 6. La figura 10 muestra el desdoblamiento de equilibrio inducido por urea de IL-lra detectado por fluorescencia intrínseca descrita en el Ejemplo 6. La figura 11 muestra el desdoblamiento de equilibrio inducido por clorhidrato de guanidinio de IL-Ira mediante dicroísmo circular descrito en el Ejemplo 6. La figura 12 muestra el desdoblamiento de IL-lra de equilibrio inducido por clorhidrato de guanidinio mediante fluorescencia intrínseca descrita en el Ejemplo 6. La figura 13 muestra la HPLC de fase inversa de la afinidad de IL-Ira marcada con fosfato de metilacetilo (MAP) en presencia de citrato 10 mM, pH 6.5, descrito en el Ejemplo 7. La figura 14 muestra la HPLC de fase inversa de la afinidad de IL-lra marcada con fosfato de metilacetilo (MAP) en presencia de fosfato 10 mM, pH 6.5, descrito en el Ejemplo 7. La figura 15 muestra la disposición de los perfiles de HPLC de fase inversa de afinidad de IL-lra marcada con fosfato de metilacetilo durante 4.5 horas (270 minutos) en presencia de citrato 10 mM, pH 6.5, fosfato 10 mM, pH 6.5 o pirofosfato 10 mM, pH 6.4, descrito en el Ejemplo 7. Cuatro picos resueltos semanalmente son marcados como 1, 2, 3 y 4. Las figuras 16A-16C muestran la velocidad de derivación de IL-lra con fosfato de metilacetilo en presencia de citrato 10 mM, pH 6.5, descrito en el Ejemplo 7. La figura 16A muestra una reproducción de los cromatogramas de la Figura 13. La figura 16B muestra los resultados de descifrar _ cada cromatograma de la Figura 16A. La figura 16C muestra una gráfica de la integración - de cada uno de los picos descifrados de la Figura 16B contra- " el tiempo. La figura 17 muestra una comparación de las velocidades de derivación de IL-lra con MAP en presencia de varios reguladores de pH a varios pH, descrita en el Ejemplo 7. La figura 18 muestra la disposición de los perfiles de HPLC de fase inversa de IL-lra marcada por afinidad con fosfato de metilacetilo durante 5.5 horas en presencia de citrato 10 mM o fosfato 10 mM a varios niveles de pH, descrito en el Ejemplo 7. La figura 19 muestra el perfil de agregación de proteína IL-lra tipo silvestre con el tiempo a varias concentraciones de fosfato en un regulador de pH con NaCl 100 mM, pH 6.5, descrito en el Ejemplo 8. La figura 20 muestra la unión de citrato a L-lra como una función de incrementar la concentración de citrato, como se describe en el Ejemplo 9. La figura 21 muestra la competencia de la unión de citrato a IL-lra al incrementar las concentraciones de pirofosfato o fosfato, como se describe en el Ejemplo 10. La figura 22 muestra una gráfica de la KaLapp para la unión de citrato a IL-lra como una función de la concentración de pirofosfato en la solución, como se describe en el Ejemplo . La Kdx para la unión de pirofosfato al sitio de unión a aniones de IL-lra se calculó como de 2.994 mM. La figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:- 4) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de una IL-lra ejemplar. La figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de una IL-lra ejemplar, referida como icIL-lra (SEQ ID NO: 6) . SEQ ID NO: 6 tiene la misma secuencia que SEQ ID NO: 3, pero con 7 aminoácidos adicionales en el extremo N. Descripción detallada de la invención Los encabezados de sección usados en la presente tienen propósitos organizacionales únicamente y no deben considerarse como limitantes de la materia descrita en la presente. Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente a manera de referencia en la presente para cualquier propósito. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluyendo" e "incluido" no es limitativo. Asimismo, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario. En varias modalidades, pueden usarse técnicas estándares para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, cultivo de tejidos, transformación y transfección. En varias modalidades, reacciones enzimáticas y -técnicas de purificación pueden llevarse a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comunmente en la técnica o como se describe en la presente. En varias modalidades, las técnicas y procedimientos pueden llevarse a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica y como los descritos en varias referencias generales y más específicas que se citan y describen a lo largo de la presente descripción y/o que se conocen por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) . A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas usadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquellos conocidos y usados comúnmente en la técnica. En varias modalidades, se pueden usar técnicas estándares para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, suministro y tratamiento de pacientes. En ciertas modalidades, cuando un aminoácido es "reemplazado" con otro aminoácido ese- reemplazo se puede hacer en forma recombinante, por ejemplo, al mutar el codón en el polinucleótido que codifique para el aminoácido por el codón que codifique para otro aminoácido. En ciertas modalidades, la mutación del codón puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica. Definiciones Según se utilizan de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se deberá entender que tienen los siguientes significados : El término "polinucleótido aislado" deberá significar un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético, o alguna combinación del mismo, que (1) no esté asociado con al menos una porción de un polinucleótido en el cual se encuentre en la naturaleza, o (2) esté enlazado a un polinucleótido al cual no esté enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurra en la naturaleza. El término "enlazado operablemente" se refiere a componentes que están en una relación que les permite funcionar de su manera deseada. Por ejemplo, una secuencia de control "enlazada operablemente" a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logre bajo condiciones compatibles con la operación de las secuencias de control. El término "secuencia de control" se refiere a secuencias ' de polinucleótidos que pueden llevar a cabo la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales estén ligadas . La naturaleza de estas secuencias de control puede diferir dependiendo del organismo huésped. De acuerdo con ciertas modalidades, las secuencias de control de procariontes pueden incluir promotores, sitios de unión ribosómicos y secuencias de terminación de transcripción. De acuerdo con ciertas modalidades, las secuencias de control para eucariontes pueden incluir promotores y secuencias de terminación de transcripción. En ciertas modalidades, las "secuencias de control" pueden incluir secuencias líder y/o secuencias de socios de fusión. El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos que tiene ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos que ocurren naturalmente y/o modificados los cuales están enlazados juntos por enlaces que ocurren naturalmente y/o que no ocurren naturalmente. En ciertas modalidades, un polinucleótido tiene al menos 10 bases de longitud. El término incluye formas de una y doble hebras de ADN/ARN, y un híbrido ADN/ARN, o formas modificadas de los mismos . El término "oligonucleótido" incluye polímeros que tienen ribonucleótidos y/o desoxirribonúcleótidos que ocurren naturalmente y/o modificados, los cuales están enlazados juntos por enlaces que ocurren naturalmente y/o que no ocurren naturalmente. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos y comprenden generalmente alrededor de 200 bases o menos. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos tienen una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 bases. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos tienen una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 a 40 bases. Los oligonucleótidos pueden ser de una sola hebra o de doble hebra. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos de sentido o antisentido. El término "nucleótidos que ocurren naturalmente" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados" incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y/o grupos base de nucleótidos modificados o sustituidos y similares . Los términos "enlace de oligonucleótidos" y "enlace de polinucleótidos" incluyen enlaces tales como fósforotioato, fósforoditioato, fósforoselenoato, fósforodiselenoato, fósforoanilotioato, fósforoaniladato, fósforoamidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al . , Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al . , J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al . , Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al . , Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al . , Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87- 108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al . , patente de E.U.A. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Revie s 90:543 (1990). En ciertas modalidades, un oligonucleótido o polinucleótido puede incluir un marcador. El término "que ocurre naturalmente" aplicado a un objeto se refiere a un objeto que puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que esté presente en un organismo (incluyendo virus) que pueda ser aislada de una fuente en la naturaleza y la cual no haya sido modificada por el hombre en el laboratorio o que de otra manera ocurra naturalmente. El término "proteína aislada" significa una proteína hecha mediante medios sintéticos o una proteína codificada por ADN genómico, ADNc, ARN u otro polinucleótido, el cual (1) esté libre de al menos algunas proteínas con las cuales se uniría normalmente; o (2) esté esencialmente libre de otras proteínas provenientes de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie; o (3) sea expresado por una célula proveniente de una especie diferente; o (4) no ocurra en la naturaleza. En la anotación de polipéptido usada en la presente, la dirección a la izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección a la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con uso y convención' estándares, a menos que se indique específicamente lo contrario. En forma similar, a menos que se indique específicamente lo contrario, el extremo izquierdo de secuencias de polinucleótidos de una sola hebra es el extremo- 5'; la dirección izquierda de secuencias de • polinucleótidos de doble hebra es referida como la dirección 5 ' . La dirección de adición 5 ' a 3 ' a transcriptos de ARN nacientes es referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que están 5' al extremo 5' del transcripto de ARN son referidas como las "secuencias hacia el extremo 5'" y están hacia el "extremo 5' de la región de codificación"; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que estén 3 ' al extremo 3 ' del transcripto de ARN son referidas como "secuencias hacia el extremo 3'" y están "hacia el extremo 3' de la región de codificación" . Según se usa en la presente, los términos "marcador" o "marcado" se refieren a la presencia de una porción detectable. Una porción detectable puede incorporarse durante la síntesis de un polinucleótido o polipéptido o puede ser unida, ya sea de manera covalente o no covalente, después de la síntesis. La marcación puede ser, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido marcado radioactivamente, la fijación de porciones de biotina que pueden detectarse con avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contenga una porción fluorescente o actividad enzimática que pueda detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos" . En ciertas modalidades, la etiqueta o porción detectable puede ser terapéutico . Se conocen en la técnica varios métodos para marcar polipéptidos y/o polinucleótidos. Ejemplos de marcadores para polipéptidos y/o polinucleótidos incluyen, pero no están limitados a: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, ? In, 125I, 131I) , marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanuro) , marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes de polipéptidos predeterminados conocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcadores de epítopes) . En ciertas modalidades, los marcadores son unidos por brazos separadores de varias longitudes para reducir el potencial de impedimento estérico. Según se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional .

Véase Immunology—A Synthesis (2a Edición, E. S. Golub y D. R.

Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales, tales como aminoácidos a-,a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los aminoácidos no convencionales y ejemplares no limitativos incluyen 4-hidroxiprolina, ?- carboxiglutamatq.,. e-N, N, N;-trimetil-lisina, e-N-acetil- lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina y otros aminoácidos e imino ácidos similares . Una persona capacitada será capaz de identificar variantes adecuadas de un polipéptido con técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, alguien capacitado en la técnica puede identificar regiones adecuadas de un polipéptido que pudieran ser cambiadas sin destruir la actividad al seleccionar regiones que no se consideren importantes para la actividad. En ciertas modalidades, se pueden identificar residuos y porciones de un polipéptido que estén conservadas entre polipéptidos similares. En ciertas modalidades, incluso áreas que pudieran ser importantes para actividad biológica o para estructura podrían ser susceptibles a sustituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del polipéptido. Además, en ciertas modalidades, alguien capacitado en la técnica puede revisar estudios de función de estructura e identificar residuos en polipéptidos similares que sean importantes para actividad o estructura. En vista de esta comparación, alguien puede predecir la importancia de residuos de aminoácido en una próteína que correspondan a residuos de aminoácido que sean importantes para actividad o estructura en proteínas similares. En ciertas modalidades, alguien capacitado en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para estos residuos de aminoácido importantes predichos . En ciertas modalidades, alguien capacitado en la técnica puede analizar la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con estructuras conocidas en polipéptidos similares. Además, en ciertas modalidades, una persona capacitada en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una sola sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. En ciertas modalidades, las variantes pueden ser después tamizadas usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Estas variantes pueden usarse para recabar información a cerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, en ciertas modalidades, si alguien descubriera que un cambio en un residuo de aminoácido particular diera como resultado actividad destruida, reducida indeseablemente o inadecuada, las variantes con este cambio pueden evitarse. En otras palabras, con base en la información recabada de estos experimentos de rutina, alguien capacitado en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que deban evitarse sustituciones adicionales ya sea solas o en combinación con otras mutaciones . En ciertas modalidades, supresiones, inserciones y/o sustituciones (individual o colectivamente referidas como "variantes") se hacen dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-lra tipo silvestre. Según se usa en la presente, "proteína IL-lra tipo silvestre" se refiere a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que tiene opcionalmente un residuo de metionina adicional en su término N, de tal manera que la secuencia N-terminal es MRPSGR.... La proteína terapéutica que tiene el nombre genérico "anakinra" está dentro de esta definición de proteína IL-lra tipo silvestre. La anakinra tiene la secuencia de SEQ ID NO: , la cual es idéntica a SEQ ID NO: 3, pero con una metionina N-terminal. En ciertas modalidades, las alteraciones a la proteína IL-lra tipo silvestre, tales como modificación química o enzimática, se hacen después de la traducción o síntesis de la proteína. Estas proteínas IL-lra alteradas son individual o colectivamente referidas como "derivados" . El término IL-lra abarca proteínas IL-lra tipo silvestre, así como variantes de IL-Ira que ocurren naturalmente y que no ocurren naturalmente y derivados que tienen actividad antagonista para el receptor de IL-lra. En ciertas modalidades, un "aminoácido que no tiene una carga positiva" se selecciona de alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos que no tienen una carga positiva también incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos no convencionales que no tienen una carga positiva. Alguien capacitado en la técnica puede determinar si una variante de aminoácidos particular tiene o no una carga positiva cuando se incorpora en un polipéptido. En ciertas modalidades, un "aminoácido que no tiene una carga" se selecciona de alanina, cisteína, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina, valina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos que no tienen una carga también incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos no convencionales que no tienen una carga. Alguien capacitado en la técnica puede determinar si una variante de aminoácidos no convencional particular tiene o no una carga positiva cuando se incorpora en un polipéptido . En ciertas modalidades, un "aminoácido polar que no tiene una carga" se selecciona de cisteína, glicina, glutamina, asparagina, serina, treonina, y tirosina. Los aminoácidos polares que no tienen una carga también incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos no convencionales que son polares pero que no tienen una carga. Alguien capacitado en la técnica puede determinar si una variante de aminoácido no convencional particular es o no polar y si tiene una carga cuando se incorpora en un polipéptido . En ciertas modalidades, un "aminoácido no aromático" se selecciona de alanina, arginina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina," histidina, isoleucina, leucina, Usina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina y valina. Los aminoácidos no aromáticos también incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos no convencionales que no son aromáticos. Alguien capacitado en la técnica puede determinar si una variante de aminoácidos no convencional particular es o no aromática cuando se incorpora en un polipéptido . El término "interacción catión-pi" se refiere a una interacción no covalente entre un aminoácido catiónico y un aminoácido aromático. En ciertas modalidades, el aminoácido catiónico puede ser Usina. En ciertas modalidades, el aminoácido catiónico puede ser arginina. En ciertas modalidades, el aminoácido aromático puede ser fenilalanina. En ciertas modalidades, el aminoácido aromático puede ser tirosina. En ciertas modalidades, el aminoácido aromático puede ser triptófano. La interacción catión-pi puede ser dentro de un solo polipéptido (es decir, intramolecular) o la interacción catión-pi puede ser entre dos o más polipéptidos (es decir, intermolecular) . En algunas modalidades, ciertos residuos de aminoácido de IL-lra están implicados en una interacción catión-pi. La figura 1 muestra una estructura- de cristal por rayos X de IL-lra. La estructura de cristal se preparó usando un archivo lILR.pdb y Vector NTI 3D Molecular Viewer (InforMax) . IL-lra se cristalizó como un dímero asimétrico. Véase por ejemplo," Vigers et al . , J. Biol . Chem. , 269:12874-12879 (1994) . La figura 2 muestra una porción de la estructura de cristal de la figura 1. En esa estructura de cristal, la lisina- 3 en una subunidad de IL-lra aparece como implicada en una interacción catión-pi con triptófano-16 en la otra subunidad de IL-lra. En forma similar, la arginina-97 en una subunidad de IL-lra parece estar implicada en una interacción catión-pi con la tirosina-34 en la otra subunidad de IL-lra. El término "fragmento de polipéptido" según se usa en la presente se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino- erminal y/o carboxi-terminal . En ciertas modalidades, los fragmentos tienen una longitud de aproximadamente 5 a 201 aminoácidos. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos tienen al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 110, 125, 150, 170, 175, 176, 177, 180, 185, 190 ó 200 aminoácidos de largo. El término "muestra biológica" , según se usa en la presente, incluye, pero no está limitado a, cualquier cantidad de una sustancia de un organismo vivo o de un organismo anteriormente vivo. Estos organismos vivos incluyen, pero no están limitados -a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Las sustancias incluyen, pero no están limitadas a, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, medula ósea, nodulos linfáticos y piel. Según se usa en la presente, "sustancialmente puro" significa que una especie macromolecular objetivo es la especie macromolecular predominante presente (es decir, sobre una base molecular es más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composición) . En ciertas modalidades, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie macromolecular objetivo comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (sobre una base de peso) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas modalidades, en una composición sustancialmente pura, las especies macromoleculares objetivo comprenderán más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99% en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En ciertas modalidades, las especies macromoleculares objetivo se purifican esencialmente hasta la homogeneidad (es decir, las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición por medios de métodos de detección convencionales) . En ciertas modalidades, la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular. El término paciente y incluye sujetos humanos y animales . Un -antagonista del receptor de interleucina-1 (IL- Ira) es una proteína humana que actúa como un inhibidor de la activid d de interleucina-1 y es un miembro de la familia de IL-1, la cual incluye también IL-la y IL-lß. Una_,lista no exclusiva, no limitativa y rio exhaustiva de antagonistas del receptor de IL-1 incluye Kineret® (anakinra) (por ejemplo, una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5), proteína IL-lra tipo silvestre (incluyendo, pero no limitada a, una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 o una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5), IL-lra intracelular (icIL-lra) (incluyendo, pero no limitada a, una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6), IL-Iß (véase, por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 99/36541), variantes de IL-lra y derivados de IL-lra. Ciertos antagonistas del receptor de IL-lra, incluyendo IL-lra y variantes y derivados de la misma, así como métodos para hacerlos y usarlos, se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,075,222; patente de E.U.A. No. 6,599,873 Bl; patente de E.U.A. No. 5,863,769; patente de E.U.A. No. 5,856,355; patente de E.U.A. No. 5, 739,282; patente de E.U.A. No. 5,922,573; patente de E.U.A. No. 6,054,559; WO 91/08285; WO 91/17184; WO 91/17249; AU 9173636; WO 91/16221; WO 93/21945; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; WO 96/12022; WO 97/28828; WO 99/36541; WO 99/51744. Un antagonista del receptor de IL-1 puede ser glicosilado o no glicosilado. Las IL-lras ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 2 y fragmentos, variantes y derivados de este polipéptido que tengan una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1; un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 3 y fragmentos, variantes y derivados de este polipéptido que tengan una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1; un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 5 y fragmentos, variantes y derivados de este polipéptido que tengan una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1 y un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 6 y fragmentos, variantes y derivados de este polipéptido que tengan una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. En ciertas modalidades, el término IL-lra incluye, pero no está limitado a, variantes de IL-lra que tengan actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. En ciertas modalidades, las variantes de IL-lra ocurren naturalmente. En ciertas modalidades, las variantes de IL-lra 5 se construyen artificialmente. Las variantes de IL-lra ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, secuencias de aminoácidos que tienen una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 o SEQ-~±B: NO: 6. En ciertas 10. modalidades, las variantes de IL-lra comprenden una secuencia de aminoácidos que es 95% idéntica-; a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas modalidades, las variantes de IL-lra comprenden una secuencia de aminoácidos que es 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 5 NO: 3. En ciertas modalidades, las variantes de IL-lra comprenden una secuencia de aminoácidos que es 85% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 3. En ciertas modalidades, las variantes de IL-lra comprenden una secuencia de aminoácidos que es 75% idéntica a la secuencia de 0 aminoácidos de SEQ ID NO: 3. En ciertas modalidades, el término IL-lra incluye, pero no está limitado a, fragmentos de IL-lra que tienen actividad antagonista para el receptor interleucina-1. En ciertas modalidades, los fragmentos de IL-lra ocurren 5 naturalmente. En ciertas modalidades, los fragmentos de IL-lra se construyen artificialmente. Los fragmentos de IL-lra ejemplares incluyen, pero no están limitados a, fragmentos de la secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Los fragmentos de IL-lra son un súbconjunto de variantes de IL-lra. En ciertas modalidades, el término IL-lra incluye, pero no está limitado a, derivados de IL-lra que tienen actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. En ciertas modalidades, los derivados de IL-lra ocurren naturalmente. En ciertas modalidades, los derivados de IL-lra se construyen artificialmente. Los derivados de IL-lra ejemplares incluyen, pero no están limitados a, formas química o enzimáticamente modificadas de la secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 o SEQ ID NO: 6. Los derivados de IL-lra ejemplares incluyen, pero no están limitados a, formas química o enzimáticamente modificadas de variantes de la secuencia ilustrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 O SEQ ID NO: 6. En ciertas modalidades, el término IL-lra incluye., pero no está limitado a, una IL-lra que tiene una secuencia líder secretora. En ciertas modalidades, la IL-lra que tiene una secuencia líder secretora es referida como "IL-lra precursora" . Una secuencia de aminoácidos de IL-lra precursora ejemplar se describe en SEQ ID NO: 2. El término "IL-lra precursora" incluye fragmentos, variantes y derivados de SEQ ID NO: 2 que sean capaces de ser secretados y procesados en una forma que tenga actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. El término IL-Ira incluye tanto IL-lra de agregación como IL-lra que tiene agregación reducida. Las proteínas IL- Ira de agregación tienen una lisina en la posición 93 y una arginina en la posición 97, pero no todas las proteínas IL-lra con una lisina en la posición 93 y una arginina en la posición 97 son IL-Iras de agregación. La "IL-lra de agregación" incluye proteínas IL-lra tipo silvestre, variantes y derivados que se agreguen a 39°C de acuerdo con el siguiente ensayo. Una solución de 100 mg/ml de la IL-lra objetivo se incuba - a 39°C en fosfato 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0.5 mM, pH 6.5 (PSE) . Como una referencia, una solución de 100 mg/ml de una proteína IL-Ira tipo silvestre que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5, se incuba en PSE a 39°C. La densidad óptica de cada solución se mide a 405 nm después de dos horas de incubación a 39°C. Si la IL-lra objetivo tiene una densidad óptica después de dos horas de incubación que es al menos 60% la densidad óptica de la proteína IL-lra tipo silvestre después de dos horas de incubación, entonces la IL-lra objetivo es una IL-lra de agregación. La "IL-lra que tiene agregación reducida" incluye proteínas variantes y derivadas de IL-lra que tienen una densidad óptica que es menor que 60% de la densidad óptica de la proteína IL-lra tipo silvestre en el ensayo descrito arriba. En ciertas modalidades, el término "IL-lra que tiene una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1" se refiere a una proteína variante o derivada de IL-lra tipo silvestre que es al menos 50% tan activa como una proteína IL- Ira tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, en el ensayo de formación de complejos de señalización de IL-lra descrito en el Ejemplo 3. "Al menos 50% tan activa" se determina al comparar la EC50 de la IL-lra objetivo con la ECS0 "de la proteína IL-lra tipo silvestre. El término "Arginina-97" se refiere al residuo de aminoácido en la posición 97 en SEQ ID NO: 3 o la posición de aminoácido en una IL-lra que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 97 en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoácido que corresponde a arginina-97 de SEQ ID NO: 3 es la arginina en la posición 98 de SEQ ID NO: 5. Esa arginina aún es referida como arginina-97 de IL-lra. En ciertas modalidades, la arginina-97 es referida como "R97", en donde la R es el código de una sola letra para arginina y 97 se refiere a su posición en SEQ ID NO:3. En ciertas modalidades, si se reemplaza R97 con otro aminoácido, la mutación puede referirse como R97X, en donde X es el código de una sola letra para el aminoácido de reemplazo. Así, como un ejemplo no limitativo, si R97 se reemplaza por alanina, la mutación puede ser referida como R97A. El término "Lisina-93" se refiere al residuo de aminoácido en la posición 93 en SEQ ID NO: 3 o a la posición de aminoácido en una IL-lra que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 93 en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoácido que corresponde a lisina-93 de SEQ ID NO: 3 es la lisina en la posición 94 de SEQ ID NO: 5. Esa lisina aún es referida como lisina-93 de IL-lra. En ciertas modalidades, la lisina-93 es referida como "K93", en donde la es el código de una sola letra para lisina y 93 se refiere a su posición en SEQ ID NO:3. En ciertas modalidades, si se reemplaza K93 con otro aminoácido, la mutación puede referirse como K93X,- en donde X es el código de una sola letra para el-^ aminoácido de reemplazo. Así, como un ejemplo no limitativo, si K93 se reemplaza por alanina, la mutación puede ser referida como K93A. El término "triptófano-16" se refiere al residuo de aminoácido en la posición 16 en SEQ ID NO: 3 o a la posición de aminoácido en una IL-lra que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 16 en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoácido que corresponde a triptófano-16 de SEQ ID NO: 3 es el triptófano en la posición 17 de SEQ ID NO: 5. Ese triptófano aún es referido como triptófano-16 de IL-lra. En ciertas modalidades, triptófano-16 es referido como "W16", en donde la W es el código de una sola letra para triptófano y 16 se refiere a su posición en SEQ ID NO:3. En ciertas modalidades, si se reemplaza W16 con otro aminoácido, la mutación puede referirse como W16X, en donde X es el código de una sola letra para el aminoácido de reemplazo. Así, como un ejemplo no limitativo, si W16 se reemplaza por alanina, la mutación puede ser referida como W16A. El término "tirosina-34" se refiere al residuo de aminoácido en la posición 34 en SEQ ID NO: 3 o a la posición de aminoácido en una IL-lra que corresponde al residuo de aminoácido en la posición 34 en SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, el aminoácido que corresponde a tirosina-34 de SEQ ID "NO: 3 es la tirosina en la -posición 35 de SEQ ID NO: 5. Esa tirosina aún es referida como tirosina-34 de IL-lra. En ciertas modalidades, la tirosina-34 es referida como "Y34", en donde la Y es el código de una sola letra para tirosina y 34 se refiere a su posición en SEQ ID N0:3. En ciertas modalidades, si se reemplaza Y34 con otro aminoácido, la mutación puede referirse como Y34X, en donde X es el código de una sola letra para el aminoácido de reemplazo. Así, como un ejemplo no limitativo, si Y34 se reemplaza por alanina, la mutación puede ser referida como Y34A. En ciertas modalidades, "agregación reducida" se define como (1) la agregación de un polipéptido bajo una condición A que se reduce en relación con la agregación del polipéptido bajo una condición B y/o (2) la agregación de una variante de polipéptido bajo una condición A que se reduce en relación a la agregación del polipéptido tipo silvestre bajo la misma condición A y/o (3) la agregación de una variante de polipéptido bajo la condición A que se reduce en relación a la agregación de una variante de polipéptido diferente bajo la misma condición A. Como un ejemplo no limitativo, la agregación relativa puede determinarse para el caso (1) como sigue. La densidad óptica a 405 nm de un polipéptido bajo la condición A se mide en varios tiempos . La densidad óptica a 405 nm del polipéptido bajo la condición B se mide después en los mismos varios tiempos . La curva de agregación para el polipéptido objetivo bajo cada condición es graficada con la densidad óptica en el eje y y tiempo en el eje x. Si el polipéptido bajo la condición A tiene _una densidad óptica más baja en el tiempo t que el polipéptido bajo la condición B en el mismo tiempo t, entonces se dice que el polipéptido bajo la condición A tiene agregación reducida en relación con el polipéptido bajo la condición B. Ejemplos de condiciones diferentes incluyen, pero no están limitados a, diferencias en la composición del regulador de pH, diferencias en temperatura, diferencias en la concentración de polipéptidos , la presencia y ausencia de moléculas accesorias, diferencias en la concentración de moléculas accesorias, etc. El término "molécula accesoria" se refiere a una molécula que reduce la agregación de uno o más polipéptidos . En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de uno o más polipéptidos no específicamente. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación al interactuar con uno o más aminoácidos del polipéptido. En ciertas modalidades, una molécula accesoria interactúa covalentemente con uno o más aminoácidos del polipéptido y es referida como una "molécula accesoria covalente". En ciertas modalidades, una molécula accesoria no interactúa covalentemente con uno o más aminoácidos del polipéptido y es referida como una "molécula accesoria no covalente" . En ciertas modalidades, la reducción en agregación de un polipéptido está relacionada con la concentración de la molécula accesoria. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede eliminar sustancialmente la agregación de un polipéptido. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 10%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 20%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 30%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 40%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 50%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 60%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 70%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 75%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 80%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 85%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación- de un polipéptido en al menos 90%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la agregación de un polipéptido en al menos 95%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido. En ciertas modalidades, la reducción en la velocidad de agregación de un polipéptido depende de la concentración de la molécula accesoria. En ciertas modalidades, una molécula accesoria sustancialmente elimina la agregación de un polipéptido. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 10%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 20%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 30%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 40%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 50%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 60%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 70%. En" ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 75%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 80%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 85%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 90%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reduce la velocidad de agregación de un polipéptido en al menos 95%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria interactúa covalentemente o no covalentemente con un polipéptido en uno o más residuos de aminoácido. En ciertas modalidades, una molécula accesoria interactúa con uno o más residuos de aminoácido específicos. En ciertas modalidades, una molécula accesoria no reduce sustancialmente la actividad del polipéptido. En ciertas modalidades, una molécula accesoria no reduce la actividad del polipéptido en más de 10%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria no reduce la actividad del polipéptido en más de 20%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria no reduce la actividad del polipéptido en más de 30%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria no reduce la actividad del polipéptido en más de 50%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria no reduce la actividad del polipéptido en más de 75%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria remueve una carga presente en un residuo de aminoácido. En ciertas modalidades, una molécula accesoria remueve una carga al modificar covalentemente el residuo de aminoácido. En ciertas' modalidades, una molécula accesoria remueve una carga al interactuar no covalentemente con el residuo de aminoácido, de esta manera "enmascarando" la carga. Las moléculas accesorias covalentes ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-il) amino)hexanoico (NBD-X), fosfato de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico. Las moléculas accesorias no covalentes ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, azúcares, aniones de una sola carga y aniones de varias cargas. Los azúcares ejemplares que pueden ser moléculas accesorias incluyen, pero no están limitados a, glicerol, sucrosa, manitol y sorbitol. Los aniones de una sola carga ejemplares que pueden ser moléculas accesorias incluyen, pero no están limitados a, fosfato y cloruro. Los aniones de varias cargas ejemplares que pueden ser moléculas accesorias incluyen, pero no están limitados a, pirofosfato y citrato. El término "molécula accesoria reactiva con arginina" se refiere a una molécula accesoria que interactúa específicamente con residuos de arginina. " Én ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con arginina interactúa únicamente con arginina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con árginina interactúa con arginina además de otros aminoácidos. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con arginina interactúa covalentemente con arginina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con arginina interactúa no covalentemente con arginina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con arginina no reduce sustancialmente la actividad del polipéptido que contiene la arginina. El término "molécula accesoria reactiva con lisina" se refiere a una molécula accesoria que interactúa específicamente con residuos de lisina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con lisina interactúa únicamente con lisina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con lisina interactúa con lisina además de otros aminoácidos. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con lisina interactúa covalentemente con lisina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con lisina interactúa no covalentemente con lisina. En ciertas modalidades, una molécula accesoria reactiva con lisina no reduce sustancialmente la actividad del polipéptido que contiene la lisina. El término "aniones de varias cargas" se refiere a moléculas que comprenden más de una carga negativa a pH 6.5 y 25°C. En "ciertas modalidades, los aniones de varias cargas tienen en- promedio más de una, pero menos de dos, cargas negativas a pH 6.5 y 25°C. En ciertas modalidades, los aniones de varias cargas tienen en promedio dos o más cargas negativas a pH 6.5 y 25°C. En ciertas modalidades, los aniones de varias cargas tienen en promedio entre dos y cuatro cargas negativas a pH 6.5 y 25°C. En varias modalidades, alguien capacitado en la técnica puede determinar si un anión particular es un anión de varias cargas a pH 6.5 y 25°C, por ejemplo, a partir de los valores pKa publicados para el anión. El término "anión de una sola carga" se refiere a un anión que tiene en promedio una, o menos de una, carga negativa a pH 6.5 y 25°C. En varias modalidades, alguien capacitado en la técnica puede determinar si un anión particular es un anión de una sola carga a pH 6.5 y 25°C, por ejemplo, a partir de los valores pKa publicados para el anión. • El término "azúcar" se refiere a un carbohidrato.

Los azúcares ejemplares incluyen, pero no están limitados a, monosacáridos, disacáridos y trisacáridos . Los azúcares ejemplares no limitativos incluyen, pero no están limitados a, glicerol, sucrosa, manitol y sorbitol. Se considera que una enfermedad o condición médica es una "enfermedad mediada por interleucina-1" si la enfermedad o condición médica espontánea o experimental está asociada con niveles elevados de L-1 en fluidos corporales o tejido y/o si células o tejido tomados del cuerpo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En ciertas modalidades, estas enfermedades mediadas .por interleucina-1 también son reconocidas por una o más de las siguientes dos condiciones : (1) los descubrimientos patológicos asociados con la enfermedad o condición médica pueden ser imitados experimentalmente en animales mediante la administración de IL-1 o la sobre-regulación de la expresión de IL-1 y/o (2) una patología inducida por modelos animales experimentales de la enfermedad o condición médica puede ser inhibida o detenida mediante tratamiento con agentes que inhiban la acción de IL-1. En ciertas modalidades, una o más de las condiciones anteriores se satisfacen en una enfermedad mediada por IL-1. En ciertas modalidades, todas las condiciones se satisfacen en una enfermedad mediada por IL-1.

- Las enfermedades mediadas por interleucina-1 (IL-1) agudas y crónicas incluyen, pero no están limitadas a, pancreatitis aguda; esclerosis lateral amiotrófica (ALS, o enfermedad de Lou Gehrig) ; enfermedad de Alzheimer; caquexia/anorexia, incluyendo, pero no limitada a, caquexia inducida por SIDA; asma y otras enfermedades pulmonares; ateroesclerosis; vasculitis autoinmune; síndrome de fatiga crónica; enfermedades asociadas con Clostridium, incluyendo, pero no limitadas a, diarrea asociada con Clostridium; condiciones e indicaciones coronarias, incluyendo, pero no limitadas a, insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunción de miocardio (por ejemplo, relacionada con sepsis) e injerto de derivación de arterias coronarias; cáncer, incluyendo, pero no limitado a, leucemias, incluyendo, pero no limitadas a, leucemia de mieloma múltiple y mielógena (por ejemplo, AML y CML) , y metástasis tumoral; diabetes (incluyendo, pero no limitada a, diabetes dependiente de insulina); endometriosis; fiebre; fibromialgia; glomerulonefritis; enfermedad de injerto contra huésped y/o rechazo de trasplantes; choque hemorrágico; hiperalgesia; enfermedad inflamatoria del intestino; condiciones inflamatorias de una articulación, incluyendo, pero no limitadas a, osteoartritis, artritis psoriásica y artritis reumatoide; enfermedad inflamatoria ocular; incluyendo, pero no limitada a, aquellas asociadas con, por ejemplo, transplante de córnea; isquemia; incluyendo, pero no limitada a, isquemia cerebral (incluyendo, pero no limitada a, lesión cerebral como resultado de, por ejemplo, trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía, cada una de las cuales puede llevar a neurodegeneración) ; enfermedad de Kawasaki; deterioro de aprendizaje; enfermedades pulmonares (incluyendo, pero no limitadas a, síndrome de insuficiencia respiratoria aguda o ARDS) ;'_ esclerosis múltiple; miopatías (por ejemplo, metabolismo de proteína muscular, incluyendo, pero no limitado a, metabolismo de proteína muscular en sepsis); neurotoxicidad (incluyendo, pero no limitada a, condiciones inducidas por VIH) ; osteoporosis; dolor, incluyendo, pero no limitado a, dolor relacionado con cáncer; mal de Parkinson; enfermedad periodontal; parto prematuro; psoriasis; lesión de reperfusión; choque séptico; efectos secundarios de terapia con radiación; enfermedad de las articulaciones mandibulares temporales; alteraciones del sueño; uveítis; y condiciones inflamatorias que resulten, por ejemplo, de tensión, esguince, daño a cartílagos, trauma, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de enfermedad. Se proporcionan métodos para reducir la agregación de una IL-lra de agregación. En ciertas modalidades, la IL-lra de agregación cuya agregación va a reducirse comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO : 6. En ciertas modalidades, la IL- Ira de agregación cuya agregación va a reducirse comprende un fragmento, variante o derivado de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o 'SEQ ID NO : 6, en donde ese fragmento, variante o derivado tiene una actividad antagonista para el receptor de interleucina-1. La agregación de IL-lra puede ser el resultado de una o más ..interacciones catión-pi entre residuos de superficie de dos polipéptidos IL-lra. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 2, la lisina-93 de un polipéptido IL-1 puede formar una interacción catión-pi con el triptófano 16 de un segundo polipéptido IL-1. En forma similar, la arginina 97 de un polipéptido puede formar una interacción catión-pi con la tirosina 34 de un segundo polipéptido. Esas interacciones pueden causar que dos polipéptidos IL-lra se unan uno al otro. Más aún, debido a que esa unión es asimétrica, significando que la unión ocurre entre la misma superficie sobre ambos polipéptidos, cada polipéptido puede ser capaz de unirse a dos polipéptidos IL-lra simultáneamente. De hecho, si son posibles contactos de unión asimétrica adicionales entre polipéptidos IL-lra, un polipéptido IL-lra puede ser capaz de unirse a más de dos polipéptidos IL-lra simultáneamente. Si cada polipéptido IL-lra es capaz de unirse a por lo menos otros dos polipéptidos IL-Ira, por ejemplo, a través de la interacción catión-pi asimétrica mostrada en la figura 8, entonces esas interacciones pueden llevar a la agregación de IL-lra " en solución. En ciertas modalidades, la agregación de una IL-lra de agregación puede reducirse al reducir la carga positiva en lisina 93, en arginina 97 o tanto en lisina 93 como en arginina 97. En ciertas modalidades, si la carga positiva en una o ambas de esas posiciones se reduce lo suficiente, la interacción catión-pi puede no formarse, o puede ser debilitada de tal manera que ya no sea lo suficientemente estable co o para causar la agregación de IL-lra. En ciertas modalidades, la agregación de una IL-lra de agregación puede reducirse mediante otros mecanismos . El método no está limitado por el mecanismo de la reducción en agregación. Cualquiera de los métodos descritos para reducir la agregación puede ocurrir por el mecanismo propuesto ejemplar descrito arriba o mediante cualquier otro mecanismo que logre el resultado descrito. Las moléculas que son capaces de reducir la agregación de una IL-lra de agregación son referidas colectivamente como "moléculas accesorias" no obstante su mecanismo para reducir la agregación y no obstante de si actúan covalente o no covalentemente. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede reducir la agregación de una IL-lra de agregación al reducir la carga positiva en uno o ambos de lisina 93 o arginina 97. En varias modalidades, una molécula accesoria puede reducir la carga positiva en lisina 93, arginina 97 o tanto en lisina 93 como en arginina 97 covalente o no covalentemente. Una molécula accesoria que se postula reduce la carga positiva en uno o ambos de esos aminoácidos también puede reducir la agregación a través de otros mecanismos, o puede actuar mediante otros mecanismos completamente. En ciertas modalidades, la incubación de una IL-lra de agregación con moléculas aniónicas de una sola carga o moléculas 'aniónicas de varias cargas puede reducir la agregación de L-lra. En ciertas modalidades, la incubación de una IL-lra que tiene agregación reducida con moléculas aniónicas de una sola - carga o moléculas aniónicas de varias- cargas puede reducir más la agregación de IL-lra. En ciertas modalidades, esa reducción en la agregación puede ser el resultado de que la molécula aniónica de carga individual o la molécula aniónica de varias cargas interactúe con la carga positiva en lisina 93, arginina 97 o tanto en lisina 93 como en arginina 97. Como se describe en el trabajo mostrado en el ejemplo 2 e ilustrado en la figura 1, la incubación de una IL-Ira de agregación en CSE, el cual contiene citrato 10 M, redujo la agregación (medida por la densidad óptica a 405 nm) con el tiempo, más que incubar la IL-lra de agregación en PSE, el cual contiene fosfato 10 mM. En ese experimento, la agregación en CSE alcanzó una OD405 de aproximadamente 0.55, mientras que la agregación en PSE alcanzó una ODos de aproximadamente 1.2. Así, la incubación en CSE redujo la agregación en más del 50% en relación a la agregación en PSE en ese experimento . De manera similar, en el trabajo descrito en el ejemplo 2, la velocidad de agregación de IL-lra de agregación en CSE fue más baja que la velocidad de agregación de IL-lra de agregación en PSE. La velocidad de agregación en PSE en la figura 1 se representa por la pendiente de la línea marcada como Kagg. Una línea similar puede dibujarse para CSE en la figura 1, y esa línea tendría una pendiente más somera, indicando una velocidad de agregación reducida en CSE en relación a PSE. En ciertas modalidades, el citrato puede ser más efectivo para reducir agregación toda vez que tiene una mayor carga negativa que el fosfato a pH 6.5. En ciertas modalidades, ciertas cantidades de carga negativa pueden ser más efectivas que otras para reducir la agregación. Además, en ciertas modalidades, ciertas configuraciones de carga negativa, por ejemplo, la distancia entre cargas negativas en una molécula accesoria y qué tan "fijas" estén en el espacio esas cargas negativas, también puede afectar la efectividad de moléculas accesorias. Así, en ciertas modalidades, la efectividad de varias moléculas accesorias puede ser afectada por la cantidad de carga negativa, pero la cantidad de carga negativa no siempre puede ser determinante. En ciertas modalidades, un anión de varias cargas puede ser más efectivo para reducir la agregación que un anión de una sola carga. En varias modalidades, alguien capacitado en la técnica puede seleccionar moléculas accesorias y determinar cuál es adecuada para la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, ciertas moléculas accesorias pueden ser más o menos efectivas a ciertas temperaturas. En varias modalidades, alguien capacitado en la técnica puede seleccionar una molécula accesoria que sea efectiva a la temperatura particular a la cual la IL-Ira de agregación será incubada o almacenada. En ciertas modalidades, se selecciona una molécula accesoria que es efectiva para reducir la agregación entre aproximadamente °C y -45°C. En ciertas modalidades, se selecciona una molécula accesoria que es efectiva para reducir la agregación entre aproximadamente 25°C y 45°C. En ciertas modalidades, se selecciona una molécula accesoria que es efectiva para reducir agregación entre aproximadamente 30°C y 45°C. En ciertas modalidades, se selecciona una molécula accesoria que es efectiva para reducir agregación entre aproximadamente 35°C y 45°C. En ciertas modalidades, alterar la concentración de una molécula accesoria puede afectar la reducción en agregación o la reducción en la velocidad de agregación de una IL-lra de agregación. El trabajo descrito en el ejemplo 4 y mostrado en la figura 3 consideró la velocidad de agregación de una IL-lra de agregación incubada a varias concentraciones de fosfato, citrato o pirofosfato. En ese experimento, citrato y pirofosfato mostraron una correlación similar entre una reducción en la velocidad de agregación y la concentración de la molécula accesoria. Tanto el citrato como el pirofosfato mostraron una reducción de casi 90% en la velocidad de agregación a 10 mM de molécula accesoria. Esa reducción se incrementó tanto para citrato como para pirofosfato a 20 mM, y luego se niveló hasta más de 100 mM. En contraste, el fosfato mostró sólo alrededor de una reducción del 20% en la velocidad de agregación a 10 mM, y la reducción no se niveló hasta aproximadamente 80 mM. Los resultados del experimento descrito en el ejemplo 4 sugieren que el pirofosfato y el citrato son sustancialmente igualmente efectivos para reducir la velocidad de agregación de una IL-Ira de agregación a 29°C. Tanto el citrato como el pirofosfato tienen una carga negativa más grande que el fosfato a pH 6.5, sugiriendo que, en ciertas modalidades, la cantidad de carga negativa puede afectar la eficiencia de ciertas moléculas accesorias . En ciertas modalidades, un azúcar puede ser una molécula accesoria. Los azúcares ejemplares que pueden ser moléculas accesorias incluyen, pero no están limitados a, sucrosa, glicerol, manitol y sorbitol. El ejemplo 5 describe un experimento ejemplar en el cual concentraciones cada vez más altas de sucrosa, glicerol o sorbitol redujeron la velocidad de agregación de una IL-Ira de agregación (véase Figura 4) . A 3%, cada uno de los tres azúcares redujo la velocidad de agregación a menos de 5 unidades de agregación (a.u.; 1 a.u. es igual a un incremento de una unidad de densidad milióptica a 405 nm por minuto usando un volumen de 200 µl y un espectrofotómetro de lectura de placa SpectroMax™) , en comparación con una velocidad de agregación de más de 20 a.u. a 0% de azúcar. En varias modalidades, alguien capacitado en la técnica puede determinar la concentración adecuada de molécula accesoria no covalente para una aplicación particular usando, por ejemplo, los métodos del ejemplo 4 o ejemplo 5. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de 1 a 100 mM. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de 1 a 50 mM. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de 1 a 20 mM. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de 10 mM. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de entre 0 y 10%. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de entre 0 y 5% . En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede estar presente a una concentración de 1%, 2% o 3%.

En ciertas modalidades, la Ka de una molécula accesoria no covalente para IL-lra es menor que 10 mM. En ciertas modalidades, la Kd de una molécula accesoria no covalente para IL-lra es menor que 7 mM. En ciertas modalidades, la Kd de una molécula accesoria no covalente para IL-lra es menor que 5 mM. En ciertas modalidades, la Ka de una molécula accesoria no covalente para IL-lra es menor que 4 mM. En ciertas modalidades, la Ka de una molécula accesoria no covalente para IL-lra es menor que 3 mM. En ciertas modalidades, la a de una molécula accesoria no covalente para IL-lra está entre 0.1 mM y 5 mM. En ciertas modalidades, la a de una molécula accesoria no covalente para IL-lra está entre 1 mM y 5 mM. En ciertas modalidades, la Kd de una molécula accesoria no covalente para IL-lra está entre 0.1 mM y 4 mM. En ciertas modalidades, la Kd de una molécula accesoria no covalente para IL-lra está entre 1 mM y 4 mM. En ciertas modalidades, la Ka de una molécula accesoria no covalente para IL-lra está entre 2 mM y 4 mM. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede reducir la agregación al modificar covalentemente una IL-lra de agregación. En ciertas modalidades, una molécula accesoria puede reducir más la agregación al modificar covalentemente una IL-lra que tenga agregación reducida. En ciertas modalidades, la modificación covalente remueve una carga positiva en lisina 93, en arginina 97, o tanto en lisina 93 como en arginina 97. En ciertas modalidades, una molécula accesoria covalente puede reducir la agregación por otro mecanismo, por ejemplo, al inhibir estancamente la formación de una o más interacciones catión-pi u otras interacciones entre polipéptidos IL-lra de agregación. Las moléculas accesorias ejemplares no limitativas que pueden modificar covalentemente una IL-Ira incluyen, pero no están limitadas a, NBD-X, MAP y anhídrido citracónico. En ciertas modalidades, NBD-X forma un derivado con aminas primarias. En el trabajo descrito en el ejemplo 3 y mostrado en la figura 2 , en la incubación de proteína IL-lra tipo silvestre con NBD-X, SE dio como resultado la derivación del grupo amina amino-terminal del polipéptido y de lisina 93. En ciertas modalidades, la derivación con NBD-X puede remover la carga positiva en lisina 93 y puede dar como resultado la agregación reducida de IL-lra derivada. En ciertas modalidades, MAP acetila los residuos de lisina y los grupos amino N-terminales de polipéptidos. En el trabajo descrito en el ejemplo 7 y mostrado en las figuras 13-15, la incubación de IL-lra con MAP en varios tiempos de incubación dio cómo resultado la derivación del grupo amino N-terminal de IL-lra; la derivación del grupo amino N-terminal de IL-lra y lisina 6 de IL-lra; la derivación del grupo amino N-terminal, lisina 6, y lisina 93 de IL-lra; o la derivación del grupo amino N-terminal, lisina 6, lisina 93 y lisina 96 de IL-lra. En ciertas modalidades, la derivación con MAP puede remover la carga positiva en lisina 93 y puede dar como resultado la agregación reducida de IL-lra derivada. En ciertas modalidades, otras moléculas reactivas con amina pueden reducir la agregación de una IL-lra de agregación al remover una o más cargas positivas o a través de otro mecanismo. En ciertas" modalidades, IL-lra que ha sido derivada con una molécula accesoria covalente "es al menos 90% tan activa como la proteína IL-lra tipo silvestre que no ha sido derivada similarmente. En ciertas modalidades, la" IL-lra que ha sido derivada con moléculas accesorias""covalentes es al menos 80% tan activa como la proteína IL-lra tipo silvestre que no ha sido derivada similarmente. En ciertas modalidades, -la IL-lra que ha sido derivada con moléculas accesorias covalentes es al menos 75% tan activa como la proteína IL-lra tipo silvestre que no ha sido derivada similarmente. En ciertas modalidades, la IL-lra que ha sido derivada con moléculas accesorias covalentes es al menos 50% tan activa como la proteína IL-lra tipo silvestre que no ha sido derivada similarmente. En ciertas modalidades, se proporcionan equipos que comprenden IL-lra y por lo menos una molécula accesoria. Los equipos pueden incluir opcionalmente instrucciones para combinar la L-lra y la por lo menos una molécula accesoria, si los componentes se proporcionan por separado. En ciertas modalidades, los equipos incluyen instrucciones para usar la IL-lra y la por lo menos una molécula accesoria. En ciertas modalidades, los equipos pueden comprender al menos una molécula accesoria covalente y/o por lo menos una molécula accesoria no covalente. Cuando el equipo comprende al menos una molécula accesoria covalente, el equipo puede comprender además instrucciones para remover cualquier molécula accesoria no reaccionada restante de la IL-lra derivada luego de la incubación de IL-lra con la molécula accesoria covalente. En ciertas modalidades, los equipos que contienen IL-lra que ya ha sido derivada con al menos una molécula accesoria covalente. De manera similar, en ciertas modalidades, un equipo puede contener una IL-lra que ya esté en una composición con por lo menos una molécula accesoria no covalente. En ciertas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-lra junto con un diluyente, vehículo, solubilizador, emulsionante, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, los materiales de formulación aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas . En ciertas modalidades, una composición farmacéutica pude comprender materiales de formulación para modificar, mantener y/o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción y/o penetración de la composición. Los materiales de formulación ejemplares incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio y sulfito ácido de sodio) ; reguladores de pH (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos y otros ácidos orgánicos) ; agentes de volumen (tales como manitol y glicina) ; agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) ; agentes acomplejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina e hidroxipropil-beta-ciclodextrina) ; rellenos; monosacáridos ; disacáridos y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa y dextrinas) ; proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina e inmunoglobulinas) ; agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tales como polivinilpirrolidona) ; polipéptido de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tales como sodio); conservadores (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno) ; solventes (tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol) ; alcoholes de azúcar (tales como manitol y sorbitol) ; agentes de suspensión; agentes tensioactivos o agentes humectantes (tales como plurónicos, PEG, esteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal) ; agentes de incremento de estabilidad (tales como sucrosa y sorbitol); agentes de incremento de tonicidad (tales como haluros de metal alcalino, tales como cloruro de sodio y potasio, manitol, sorbitol) ; vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y adyuvantes farmacéuticos. (Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18va edición, A.R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company (1-990) . En ciertas modalidades, una IL-lra y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales son unidos a un vehículo de extensión de vida media. Los vehículo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, el dominio Fe, polietilenglicol y dextrano . Se describen ciertos vehículos ejemplares, por ejemplo, en la solicitud de E.U.A No. de serie 09/428,082 y en la Solicitud de PCT publicada No. WO 99/25044. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en la técnica dependiendo, por ejemplo, de la ruta de administración deseada, formato de suministro y dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente. En ciertas modalidades, estas composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de eliminación in vivo de la IL-lra. En ciertas modalidades, el vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser ya sea de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. En ciertas modalidades, solución salina neutra de pH regulado o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden regulador de pH Tris con un pH de aproximadamente 7.0-8.5, o regulador de pH de acetato con un pH de alrededor de 4.0-5.5, los cuales pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado para los mismos. En ciertas modalidades, una composición que comprende una IL-lra, con o sin por lo menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, puede prepararse para su almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tenga el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en ciertas modalidades, una composición que comprenda una IL-lra, con o sin por lo menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, se puede formular como un liofilizado usando excipientes adecuados tales como sucrosa. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden seleccionarse para suministro parenteral. En ciertas modalidades, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para suministro a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la capacidad de la técnica. En ' ciertas modalidades, cuando se contempla la administración parenteral, una composición terapéutica puede estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable y libre de pirógenos que comprenda la IL-lra deseada, con o sin por lo menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, un vehículo para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual la IL-lra, con o sin por lo menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, se formula como una solución estéril, isotónica y adecuadamente conservada. En ciertas modalidades, la preparación puede incluir la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio- erosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o prolongada del producto que después puede ser suministrado mediante una inyección de depósito. En ciertas modalidades, también se puede usar ácido hialurónico, y puede tener el efecto de promover la duración prolongada en la circulación. En ciertas modalidades, dispositivos de suministro de fármaco implantables pueden usarse para introducir la molécula deseada. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. En ciertas modalidades, una IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, puede formularse como un polvo seco para inhalación. En ciertas modalidades, una solución de inhalación que comprenda una IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, puede formularse con un propelente para el suministro en aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones pueden ser nebulizadas. La administración pulmonar se describe más en la solicitud de PCT No. PCT/US 94/001875, la cual describe el suministro pulmonar de proteínas modificadas químicamente. En ciertas modalidades, se contempla que las formulaciones pueden administrarse oralmente. En ciertas modalidades, una IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, que se administra de esta manera puede formularse con o sin los vehículos usados comúnmente en la mezcla de formas de dosis sólidas tales como tabletas y cápsulas . En ciertas modalidades, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximice y la degradación presistémica "se minimice. En ciertas modalidades, al menos un agente adicional puede incluirse para facilitar la \ absorción de la IL-lra y/o cualquier molécula accesoria y/o cualquier agente terapéutico adicional . En ciertas modalidades, pueden emplearse también diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de desintegración de tableta y aglutinantes . En ciertas modalidades, una composición farmacéutica puede incluir una cantidad efectiva de IL-Ira, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, en una mezcla con excipientes no tóxicos que sean adecuados para la fabricación de tabletas . En ciertas modalidades, al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo adecuado, pueden prepararse soluciones en forma de dosis única. En ciertas modalidades, los excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que incluyan IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria '- y/o uno o más agentes _ terapéuticos adicionales, en formulaciones de suministro prolongado o controlado. En ciertas modalidades, las técnicas para formular una variedad de otros productos de suministro controlado o prolongado, tales como vehículos de lipqsornas, micropartículas bio-erosionables o esferas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Véase por ejemplo, la solicitud de PCT No. PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, las preparaciones de liberación prolongada pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación prolongada pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilacturos (véase por ejemplo, US 3,773,919 y EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato (Sidman et al . , Biopolymers, 22:547-556 (1983)), metacrilato de poli (2-hidroxietilo) (Langer et al . , J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al . , citado anteriormente) o ácido poli-D(-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988). En ciertas modalidades, las composiciones de liberación prolongada pueden incluir liposomas, los cuales pueden prepararse mediante cualquier de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al . , Proc. Nati. Acad. Sci . E. U. A., 82:3688-3692 (1985) ,: EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949. La composición farmacéutica que se usará para administración in vivo típicamente es estéril. En ciertas modalidades, esto se puede lograr mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. En ciertas modalidades, cuando la composición es liofilizada, la esterilización usando este método puede llevarse a cabo ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. En ciertas modalidades, la composición para administración parenteral puede ser almacenada en forma liofilizada o en una solución. En ciertas modalidades, las composiciones parenterales . generalmente se ponen en un recipiente que tiene una entrada de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco para solución intravenosa que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

En ciertas modalidades, después de que la composición farmacéutica ha sido formulada, se puede almacenar en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado. En ciertas modalidades, estas formulaciones pueden almacenarse ya sea en forma lista de usar . o en una forma (por ejemplo, liofilizada)_ que sea reconstituida antes de su administración. En ciertas modalidades, se proporcionan equipos para producir una unidad de administración de dosis única. En ciertas modalidades, los equipos pueden contener cada uno tanto un primer contenedor que tenga una proteína seca como un segundo contenedor que tenga una formulación acuosa. En ciertas modalidades, se incluyen los equipos que contienen jeringas prellenadas de una sola y de varias cámaras (por ejemplo, jeringas para líquidos y lisojeringas) . En ciertas modalidades, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, que se empleará terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Alguien capacitado en la técnica apreciará que los niveles de dosificación adecuados para tratamiento, de acuerdo con ciertas modalidades, variarán entonces dependiendo, en parte, de la molécula suministrada, de la indicación para la cual la IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, se esté usando, la ruta de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de órganos) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el médico puede calcular la dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. En ciertas modalidades, una dosis típica puede variar de alrededor de 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. En ciertas modalidades, la dosis puede variar de 0.1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 µg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 µg/kga hasta aproximadamente 100 mg/kg. En ciertas modalidades, la frecuencia de dosificación tomará en cuenta los parámetros farraacocinéticos de la L-Ira y/o cualquier molécula accesoria y/o cualquier agente terapéutico adicional en la formulación usada. En ciertas modalidades, un clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. En ciertas modalidades, la composición puede administrarse por lo tanto como una sola dosis, como dos o más dosis (las cuales pueden no contener la misma cantidad de la molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o catéter. Una refinación adicional de la dosificación adecuada se hace de rutina por aquello expertos en la técnica y está dentro del ámbito de tareas llevadas a cabo rutinariamente por ellos . En ciertas modalidades, las dosificaciones adecuadas pueden lograrse a través del uso de datos de respuesta a dosis adecuados. En ciertas modalidades, la ruta de administración de la " composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección mediante rutas - intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberación prolongada o mediante dispositivos de implantación. En ciertas modalidades, las- composiciones pueden administrarse mediante inyección de bolo o continuamente por infusión, o mediante un dispositivo de implantación. En ciertas modalidades, la composición puede administrarse localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material adecuado sobre el cual la molécula deseada haya sido absorbida o encapsulada. En ciertas modalidades, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en cualquier tejido u órgano adecuado, y el suministro de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación sincronizada o administración continua. En ciertas modalidades, podría ser deseable usar una composición farmacéutica que comprenda una IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, de una manera ex vivo . En tales casos, células, tejidos y/u órganos que hayan sido retirados del paciente son expuestos a una composición farmacéutica que comprende una IL-lra, con o sin al menos una molécula accesoria y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, después de los cual las células, tejidos y/u órganos se implantan de regreso al paciente. En ciertas modalidades, una IL-lra que tiene agregación reducida y/o cualquier molécula accesoria y/o cualquier agente terapéutico adicional pueden suministrarse al implantar ciertas células que hayan sido genéticamente manipuladas, usando métodos-"-conocidos en la técnica, para expresar y secretar los polipéptidos. En ciertas modalidades, estas células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o genogeneicas . En ciertas modalidades, las células pueden ser inmortalizadas. En ciertas modalidades, para reducir la probabilidad de una respuesta inmunológica, las células pueden ser encapsuladas para evitar la infiltración de tejidos circundantes. En ciertas modalidades, los materiales de encapsulación son típicamente cubiertas o membranas poliméricas biocompatibles y semipermeables que permiten la liberación de los productos de proteina pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmunológico del paciente o por otros factores dañinos provenientes de tejidos circundantes . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplos Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos llevados a cabo y los resultados logrados, se proporcionan por propósitos ilustrativos únicamente y no se deben considerar como limitativos de la presente invención. Ejemplo 1 Producción de una proteína IL-lra tipo silvestre Antagonista del receptor de interleucina-1 recombinante humana (IL-lra) que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 5, puede prepararse en las instalaciones de fabricación de Amgen de acuerdo con el método descrito en la patente europea No . EP 0 502 956 Bl, en el cual es opcional la etapa de recuperación de células. Como alternativa, anakinra, la cual tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 se puede obtener de Amgen Inc. , Thousand Oaks, CA. IL-lra humana purificada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 se usó en los ejemplos descritos en la presente. Ejemplo 2 Agregación de IL-lra La agregación de IL-lra en regulador de pH de fosfato y regulador de pH de citrato a 39°C ser determinó como sigue. Diez mililitros de una solución de abastecimiento de IL-lra (200-220 mg/ml de proteína en citrato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0.5 mM, pH 6.5 (CSE)) se dializaron durante la noche a 4°C ya sea contra 2 x 2L de fosfato 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 0.5 mM, pH 6.5 (PSE) o 2 x 2L de CSE. La solución dializada se filtró a través de un filtro de 0.2 µm y la concentración de proteína IL-lra se ajustó a 140 mg/ml al diluir con el regulador de pH adecuado. La agregación de IL-Ira en cada regulador de pH se midió usando una placa de vidrio de 96 pocilios (Zissner) y un espectrofotómetro de lectura de placa controlado en temperatura, SpectraMax Plus (Molecular Devices) . El tamaño de la muestra por pocilio fue de 180 µl/µl. Las placas fueron incubadas en el espectrofotómetro a 39°C y la densidad óptica se midió 405 nm cada 1 minuto. La figura 1 muestra la densidad óptica a 405 nm graficada como una función de tiempo para este experimento. La velocidad de agregación se determinó como la pendiente de la región lineal inicial de la curva de saturación usando el programa SoftMax Pro (Molecular Devices) . La velocidad de agregación de IL-Ira incubada en CSE se reduce en relación a la velocidad de agregación de IL-lra incubada en PSE. Además, el grado de agregación de IL-lra incubada en CSE se reduce en relación al grado de agregación de IL-lra incubada en PSE. Ejemplo 3 Marcación de IL-lra con NBD-X Grupos amino expuestos en superficie se identificaron mediante marcación de IL-lra con NBD-X, SE (6-(N-7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol~4il) amino) hexanoato de succinimidilo, Molecular Probes) . NBD-X se vuelve fluorescente después de la derivación con grupos amino. Veinte µl/µl de IL- lra 0.2 mM en PSE se diluyeron con 480 µlµl de PSE. Ocho µl de 50 µg/µlµl de NBD-X, solución de SE en dimetilformamida se añadieron a la solución de IL-lra a incrementos de 2 µlµl a temperatura ambiente. La reacción se incubó durante una hora a temperatura ambiente, luego se detuvo mediante la adición de 50 µlµl de una solución de hidroxilamina 1.5 M, pH 8.5. La mezcla de reacción se pasó a través de una columna de filtración con gel de desalificación que había sido pre- equilibrada con PSE. El pico de proteínas se recogió y se analizó más mediante RP-HPLC y LC-MS/MS como sigue. Se llevó a cabo la HPLC de fase inversa usando una columna Phenomex Júpiter™ 5µ C4 (300 Á, 250x4.6 mm) y un sistema para HPLC HP1100 equipado con detectores de absorbancia y fluorescencia en línea. La absorbancia se midió a 2115 nm para detectar la presencia del polipéptido. La emisión fluorescente se midió a 535 nm después de la excitación a 480 nm para detectar la presencia del NBD-X derivado con amina. La elución se llevó a cabo con una gradiente lineal 30-45% de metanol en ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) y agua (v/v/v) . La figura 2 muestra la absorbancia de IL-lra marcada con NBD-X a 215 nm y la emisión fluorescente de IL-lra marcada con NBD-X a 535 nm después de la excitación a 480 nm para este experimento. La identidad de los picos de fluorescencia se determinó como sigue. Dos picos de fluorescencia principales fueron identificados, un pico de elución temprana a 16.75 minutos y un pico de elución tardía a 17.5 minutos. Véase figura 2, panel inferior. Los picos se recolectaron manualmente y se digirieron con Lys-C endoproteínasa como sigue. Cada pico fue recolectado a partir de cinco corridas de HPLC separadas .

Todas las fracciones que contenían principalmente el pico de 16.75 se agruparon juntas. Todas las fracciones que contenían principalmente el pico de 17.5 se agruparon juntas. Las dos muestras _ agrupadas se secaron después con centrifugación usando un concentrador SpeedVac . Cada una de las muestras agrupadas se disolvió después en 490 µlµl de regulador de pH de digestión, que contenía Tris 10 mM, clorhidrato de guanidinio 0.8 M, pH 8.0. Diez microlitros de una solución de Lys-C proteinasa, preparada al disolver 5 µg de Lys-C proteinasa (grado secuenciación, Roche Diagnostics) en 50 µl de regulador de pH de digestión, se añadieron después a cada muestra agrupada. Las muestras fueron digeridas durante la noche a 37°C. Después de la digestión, los péptidos generados se sometieron a LC-MS/MS usando un aparato Finnegan LCQ Deca equipado con una HPLC Beckman System Gold de acuerdo con el protocolo del fabricante estándar. Para el pico de elución temprana (16.75 min) la digestión produjo un péptido de masa único 1107.8 m/z, que correspondía a un péptido amino-terminal de IL-lra con una masa añadida de 276 amu, lo cual sugiere la presencia de un derivado de NBD. El análisis MS/MS del péptido produjo fragmentos consistentes con la secuencia de aminoácidos MRPSGRK más una masa extra de 276 amu en el residuo de metionina, sugiriendo que la metionina amino-terminal de IL- lra" era derivada con NBD-X. La digestión del pico de elución tardía (17.5 min) - la digestión produjo un péptido de masa único 1145.9 m/z, lo cual sugirió un péptido de IL-lra que correspondía a los residuos 72-96 que comprendía un derivado de NBD. El análisis MS/MS del péptido produjo fragmentos consistentes con la secuencia de aminoácidos que correspondía a los residuos 72-96 con una lisina derivada por NBD en la posición 93. De acuerdo con los resultados anteriores, la lisina en la posición 93 de IL-lra es capaz de la derivación con NBD- X bajo las condiciones usadas en este experimento. Estos resultados sugieren también que la lisina en la posición 93 es expuesta y es un residuo accesible por solventes en la proteína IL-lra intacta. Ejemplo 4 Velocidad de agregación de IL-lra en presencia de fosfato, citrato o pirofosfato La velocidad de agregación de IL-Ira se determinó en varias composiciones reguladoras de pH diferentes . Diez mililitros .de una solución de abastecimiento de IL-Ira (220 mg/ml en CSE) se dializaron contra 2 x 4L de NaCl 140 mM usando tubos de diálisis Pierce Snakeskin (límite de 3.5 kDa) a 4°C. Alícuotas de la solución de IL-lra dializada se llevaron a varias concentraciones de citrato, fosfato o pirofosfato mediante la adición de soluciones de abastecimiento de citrato 0.45 M, fosfato 0.5 M o pirofosfato 0.45 M (todas a pH 6.5) y un volumen adecuado de NaCl 140 mM para dar como resultado la concentración final de IL-lra en cada muestra de 140 mg/ml. La concentración final de citrato, fosfato o pirofosfato en cada muestra varió de 1 a 125 mM. La agregación de IL-lra en cada muestra se monitoreó durante 4 horas a 29°C al medir la dispersión de luz a 405 nm a intervalos de un minuto como se describe en el ejemplo 2 arriba. La velocidad de agregación se determinó como la pendiente de la región lineal de la curva de saturación calculada usando el programa SoftMax Pro (Molecular Devices) .

La figura 3 muestra que en este experimento, la velocidad de agregación de IL-lra se redujo con concentraciones cada vez más altas de citrato, fosfato o pirofosfato. Notablemente, la velocidad de agregación de IL-lra en regulador de pH de citrato o pirofosfato se redujo más rápidamente que la velocidad de agregación en regulador de pH de fosfato. Los valores pKa calculados de los hidrógenos ionizables en fosfato son 2.148, 7.198 y 12.35 a pH 6.5 y 39°C. Los valores pKa calculados de los tres hidrógenos ionizables en citrato son 3.128, 4.761 y 6.396 a pH 6.5 y 39°C. Los valores pKa calculados de los cuatro hidrógenos ionizables en pirofosfato son 0.83, 2.26, 6.72 y 9.16 a pH 6.5 y 39°C. Véase, por ejemplo, Goldberg et al . , Thermodynamic quantities for the ionization reactions of b_uffers . J. Phys .

Chem. Ref. Data, 31(2): 231-370 (2002). En consecuencia, se predice que el - fosfato tiene predominantemente una carga negativa a pH 6.5 y 39°C, mientras que se predice que el citrato tiene tres cargas negativas a pH 6.5 y 39°C y se predice que el pirofosfato tiene entre dos y tres cargas negativas a pH 6.5 y 39°C, como se calcula de acuerdo con los valores pKa reportados en la literatura y descritos arriba. Así, estos resultados sugieren que los aniones de varias cargas pueden reducir la velocidad de agregación de IL-Ira en forma más efectiva que los aniones de una sola carga a un pH particular. Concordando con esa conclusión, se encontró que NaCl, el cual es un anión de una sola carga, tenía un perfil de velocidad de agregación similar al del fosfato (datos no mostrados) . Ejemplo 5 Velocidad de agregación de IL-Ira en presencia de sucrosa, glicerol o sorbitol Se determinó la velocidad de agregación de IL-lra en presencia de varios azúcares diferentes . Diez mililitros de una solución de abastecimiento de IL~lra (220 mg/ml en CSE) se dializaron contra 2 x 4L de NaCl 140 mM usando tubos de diálisis Pierce Snakeskin (límite de 3.5 kDa) a 4°C. Alícuotas de la solución de IL-lra dializada se llevaron a varias concentraciones porcentuales de sucrosa, glicerol o sorbitol mediante la adición de soluciones de abastecimiento de sucrosa al 25%, glicerol al 25% o sorbitol al 25% y un volumen adecuado de NaCl 140 mM para dar como resultado una concentración final de IL-lra en cada muestra de 140 mg/ml. La concentración final de sucrosa, glicerol o sorbitol- - en cada muestra fue de 0%, 1%, 2% o 3%. La velocidad de agregación se determinó al medir la densidad óptica de cada solución de IL-lra a 39°C usando el método descrito en el ejemplo 2. La figura 4 muestra que en este experimento, las concentraciones cada vez más altas de azúcar dieron como resultado velocidades de agregación de IL-lra cada vez más altas. A 0% de azúcar, la velocidad de agregación de IL-lra en este experimento fue de aproximadamente 22 unidades de agregación (a.u., medida como el incremento en densidad milióptica a 405 nm por minuto) . A 3% de sucrosa, glicerol o sorbitol, la velocidad de agregación de IL-lra se redujo a entre 0 y 5 a.u. Ejemplo 6 Desdoblamiento de IL-lra inducido por clorhidrato de guanidinio y urea El desdoblamiento de IL-lra inducido por urea en equilibrio se llevó a cabo como sigue. Para estudios de dicroísmo circular UV lejanos, muestras de 1-1.5 mi de 0.86 mg/ml de IL-lra y varias concentraciones de urea (entre aproximadamente 0 y 10M) se envolvieron en papel aluminio para protegerlas de la luz y se incubaron durante la noche (> 12 horas) a temperatura ambiente. El dicroísmo circular a 230 nm se determinó después para cada muestra a 23°C. La figura 9 muestra la señal de dicroísmo circular a 23-0 nm -para IL-lra incubada en varias concentraciones de urea para este experimento. Los datos se graficaron y la curva de desdoblamiento se ajustó a un modelo de tres estados, estado nativo <-> estado intermedio <-> estado desdoblado. En este modelo, mi, la cual es la pendiente de la primera transición, y Cmi, la cual es el punto medio de la primera transición fueron restringidos. Esos parámetros fueron restringidos debido a que la CD UV lejana no puede distinguir entre los estados nativo y el intermedio. Los valores restringidos para mi y Cmi se obtuvieron al promediar los valores de varias mediciones de fluorescencia, las cuales fueron capaces de distinguir el estado nativo a partir del estado intermedio. Como se muestra en la figura 9, IL-lra sufrió una transición de desdoblamiento global entre urea aproximadamente 4 y 6 M en este experimento. Para los estudios de fluorescencia, muestras de 1-1.5 mi de 0.086 mg/ml de IL-lra y varias concentraciones de urea (entre aproximadamente 0 y 10M) se envolvieron en papel aluminio para protegerlas de la luz y se incubaron durante la noche (> 12 horas) a temperatura ambiente. La figura 10 muestra la fluorescencia intrínseca a 353 nm de IL-lra incubado en varias concentraciones de urea. Los datos se graficaron y la curva de desdoblamiento se ajustó al modelo de tres estados descrito arriba. No se aplicaron restricciones en este experimento. Como se muestra en la figura 10, el experimento de fluorescencia sugiere la presencia de una transición de desdoblamiento entre 0 y aproximadamente 1.5 M de urea. Ya queresa transición no s observa en el experimento CD UV lejano,' . puede reflejar la acumulación de un estado intermedio con una estructura secundaria tipo nativa. Ese estado intermedio puede incluir más cambios locales a la estructura, por ejemplo, desestabilización de circuitos de superficie, mientras que el núcleo hidrofóbico de IL-lra puede permanecer sustancialmente sin cambios . Se llevó a cabo como sigue el desdoblamiento inducido por clorhidrato de guanidinio en equilibrio (GuHCl) . Para estudios de dicroísmo circular UV lejanos, muestras de 1-1.5 mi de 0.86 mg/ml de IL-lra y varias concentraciones de GuHCl (entre aproximadamente 0 y 5M) se envolvieron en papel aluminio para protegerlas de la luz y se incubaron durante la noche (> 12 horas) a temperatura ambiente. El dicroísmo circular a 230 nm se determinó después para cada muestra a 23°C. La figura 11 muestra la señal de dicroísmo circular a 230 nm para IL-lra incubada en varias concentraciones de GuHCl. Los datos se graficaron y la curva de desdoblamiento se ajustó al modelo de tres estados, estado nativo <-> estado intermedio <-> estado desdoblado. En este modelo, mi, Cmi "ns", lo cual es la. pendiente de la línea de base del estado nativo, y "is", la cual es la pendiente de la línea de base del estado intermedio fueron restringidas . Los valores restringidos de mi y Cmi para el desdoblamiento inducido por GuHCl se determinaron sustancialmente como se "describió arriba para el desdoblamiento inducido -por urea. "Ns" y "is"- fueron restringidos para ser mayor que cero. Esos parámetros fueron restringidos debido a que la CD UV lejana no puede distinguir entre los estados nativo y el intermedio. Como se muestra en la figura 11, IL-lra sufrió una transición de desdoblamiento global entre aproximadamente GuHCl 1 y 2 M en este experimento . Para estudios de fluorescencia, muestras de 1-1.5 mi de 0.086 mg/ml de IL-lra y varias concentraciones de GuHCl (entre alrededor de 0 y 5M) se envolvieron en papel aluminio para protegerlas de la luz y se incubaron durante la noche (> 12 horas) a temperatura ambiente. La figura 12 muestra la fluorescencia intrínseca a 353 nm de IL-lra incubada a varias concentraciones de urea. Los datos se graficaron y la curva de desdoblamiento se ajustó al modelo de tres estados descrito arriba. No se aplicaron restricciones en este experimento. La figura 12 muestra la fluorescencia intrínseca a 353 nm de IL- lra incubada a varias concentraciones de GuHCl . Los datos se graficaron y la curva de desdoblamiento se ajustó al modelo de tres estados descrito arriba. No se aplicaron restricciones en este experimento. Como se muestra en la figura 12, los datos de fluorescencia sugieren la presencia de una transición de desdoblamiento entre 0 y aproximadamente 0.6 M de GuHCl . Ya que esa transición no se observa en el experimento CD UV lejano, puede reflejar la acumulación de un estado intermedio con una estructura secundaria tipo nativa. Ese estado intermedio puede incluir más cambios locales ra la estructura y/o incluir la desestabilización de circuitos de superficie, mientras que el núcleo hidrofóbico de IL-lra puede permanecer sustancialmente sin alteraciones. La diferencia entre los datos de fluorescencia para el desdoblamiento inducido por urea y el desdoblamiento inducido por GuHCl pueden ser el resultado de efectos diferenciales de los dos desnaturalizadores en la fluorescencia intrínseca de IL-lra. Más aún, la diferencia entre los datos de CD y los datos de fluorescencia para cada desnaturalizador puede deberse a la capacidad de la fluorescencia intrínseca del triptófano para detectar cambios locales en la estructura terciaria de la proteína, mientras que la CD detecta cambios en la estructura secundaria de la proteína. Ejemplo 7 Derivación de IL-lra con fosfato de metilacetilo (MAP) En ciertas modalidades, el fosfato de metilacetilo (MAP) acetila residuos de lisina y las aminas N-terminales de polipéptidos. El MAP se preparó como se describe en Kruger et al . , .(1980) J. Org. Chem. , 45: 2723. La identidad del producto se confirmo mediante RNM y espectrometría de masas . IL-lra se derivó con MAP en presencia de citrato o fosfato como sigue. Para la derivación en presencia de citrato, 20 µl de MAP (solución de abastecimiento 10 mM en agua) y 20 µl de IL-lra (solución de abastecimiento 10 mM en CSE) se añadieron a.160 µl de citrato 10 mM, pH 6.5 en un frasco para HPLC. La reacción se incubó a 37°C y se tomaron alícuotas de 25 µl usando un automuestreador de HPLC a 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos. Cada alícuota fue analizada mediante HPLC de fase inversa usando una HPLC Agilent 110 equipado con una columna para HPLC de fase inversa Júpiter 5u C4 300A (4.6 x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA) , un detector UV en línea y un equipo de bandeja de muestras de 100 pocilios controlado en temperatura puesto a 37°C. La velocidad de flujo se ajustó a 1 mi/min y la columna se mantuvo a una temperatura de 50°C. La columna fue pre-equilibrada durante 15 minutos (velocidad de flujo lml/min) con 65% de regulador de pH A (ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA) en agua) y 35% de regulador de pH B (acetonitrilo al 90%, TFA al 0.1% en agua). Después de la carga, los analitos fueron eluídos usando una gradiente que iba de 35% a 50% de regulador de pH B (acetonitrilo al 90%, TFA al 0.1% en agua) durante 25 minutos. Para la derivación en presencia de fosfato, 20 µl de MAP (solución de abastecimiento 10 mM en agua) y 20 µl de IL- Ira (solución de abastecimiento 10 mM en CSE) se añadieron a .160 µl de fosfato 10 mM, pH 6.5 en un frasco para HPLC. La reacción se incubó a 37°C y se tomaron alícuotas de 25 µl usando un auto muestreador de HPLC a 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos. Cada alícuota fue analizada mediante ?PLC de fase inversa como se describió arriba para la derivación en presencia de citrato. Los resultados de la derivación en presencia de citrato se muestran en la figura 13. Los resultados de la derivación en presencia de fosfato se muestran en la figura 14. Ambos perfiles de HPLC revelan cuatro picos de IL-lra nuevos y débilmente resueltos que resultan de la derivación con MAP en este experimento. IL-lra también se derivó con MAP en presencia de 10 mM de pirofosfato, pH 6.4. Veinte microlitros de MAP (solución de abastecimiento 10 mM en agua) y 20 µl de IL-lra (solución de abastecimiento 10 mM en CSE) se añadieron a 160 µl de pirofosfato 10 mM, pH 6.4 en un frasco para HPLC. La reacción se incubó a 37°C y se tomaron alícuotas de 25 µl usando un automuestreador para HPLC a 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos. Cada alícuota fue analizada mediante HPLC de fase inversa como se describió arriba para la derivación en presencia de citrato. La figura 15 muestra una disposición de los resultados de la HPLC de fase inversa de la derivación de IL-lra con MAP durante 4.5 horas (270 minutos) en presencia de citrato, en presencia de fosfato y en presencia de pirofosfato. Cuatro picos débilmente resueltos se identificaron en este experimento y están indicados en la figura 15. - : Cada uno de los picos del punto de tiempo de 270 minutos para la derivación en presencia de citrato, mostrados en la-, figura 15, se analizó más para determinar así la identidad de cada uno, como sigue. Los cuatro picos principales se recabaron de la corrida de HPLC descrita arriba. Las muestras se concentraron en un SpeedVAc hasta un volumen final de 5-10 µl . Noventa microlitrós de regulador de pH de digestión (Tris 50 mM, clorhidrato de guanidinio 0.8 M, pH 8.0) se añadieron después a cada muestra, seguidos por 10 µl de endoproteinasa lys-C (1 µg en 10 µl de regulador de pH de digestión) . Las muestras se incubaron a 37°C durante 16 horas. Los péptidos resultantes se analizaron mediante LC- MS/MS usando una HPLC Agilent 100 equipada con una detección MS en línea y una trampa de iones Finnegan. La columna de HPLC usada fue una columna para HPLC de fase inversa Júpiter 5u C18 100A (2 x 150 mm, Phenomex, Torrance, CA) . La velocidad de flujo se ajustó a 0.2 mi por minuto y la columna se mantuvo a una temperatura de 50°C. la columna fue pre-equilibrada durante 22 minutos con 98% de regulador de pH A (TFA al 0.1% en agua) y 2% de regulador de pH B (acetonitrilo al 90%, TFA al 0.1% en agua). Después de la carga, los analitos fueron eluídos de la columna de HPLC usando una gradiente que iba de 2% a 45% de regulador de pH B durante 50 minutos. Diez por ciento del eluyente que provenía de la columna de HPLC se sometieron a análisis MS . La presencia de un grupo acetilo adicional en un péptido dio como resultado un incremento de 42 m/z en el perfil de MS en relación al péptido no modificado .

La identidad de los péptidos detectados y los residuos de aminoácidos específicos que se modificaron se verificó mediante MS/MS. El polipéptido IL-lra del pico 1 pareció ser derivado en su amina N-terminal únicamente. El polipéptido IL-lra del pico 2 pareció ser derivado en su amina N-terminal y en lisina 6. El polipéptido IL-lra del pico 3 pareció ser derivado en su amina N-terminal, en lisina 6 y en lisina 93. Finalmente, el polipéptido IL-lra del pico 4 pareció ser derivado en su amina N-terminal, en lisina 6, en lisina 93 y en lisina 96. El nivel de derivación en todas las posiciones excepto para la amina N-terminal pareció ser mayor en presencia de fosfato que en presencia de citrato o pirofosfato. Estos resultados sugieren que el citrato y/o pirofosfato pueden proteger los grupos lisina cargados positivamente en IL-lra contra la derivación con MAP mejor que fosfato. Estos resultados pueden sugerir que el citrato y/o pirofosfato tiene una afinidad más fuerte que el fosfato por los residuos de lisina cargados positivamente. La velocidad de derivación de IL-lra con MAP se determinó usando los datos mostrados en la figura 13 (y reproducidos en la figura 16A) para la derivación de IL-lra en presencia de citrato. En particular, cada cromatograma de la figura 16A fue " descifrado usando PeakFit™ (Systat Software Inc.). El área bajo cada uno de los picos descifrados (picos 1-4) en cada punto de tiempo (0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos) fue entonces integrada. Un perfil descifrado ejemplar para un punto de tiempo se muestra en la figura 16B. Los picos descifrados 1-4 son marcados en la figura IB y el área integrada bajo cada uno se muestra abajo. El pico 1 tuvo un área integrada de 160.28590. El pico 2 tuvo un área integrada de 190.41964. El pico 3 tuvo un área integrada de 181.76548. El pico 4 tuvo un área integrada de 178.18844. El área integrada del pico descifrado 4 en los puntos de tiempo 0, 45, 90, 135, 180, 225 y 270 minutos se gráfico entonces contra el tiempo de incubación de la reacción que produjo ese pico. Esa gráfica se muestra en la figura 16C. La línea resultante tiene una pendiente de 68.931 horas-1. La velocidad de derivación de IL-lra con MAP se calculó después para varios experimentos en presencia de varios reguladores de pH y a varios pHs, de acuerdo con los métodos descritos arriba. Las diferentes velocidades se graficaron después sobre una gráfica de barras mostrada en la figura 17. Específicamente, la velocidad de derivación de IL- 1ra con MAP se determinó en presencia de fosfato 10 mM, pH 6.3; citrato 10 mM, pH 6.3; pirofosfato 10 mM, pH 6.3; fosfato 10 mM, pH 6.5; fosfato 20 mM, pH 6.5; citrato 10 mM, pH 6.5; citrato 20 mM," pH 6.5; pirofosfato 10 mM, pH 6.5; pirofosfato ~ 20 mM, pH 6,5; fosfato 10 mM, pH 6.7; citrato 10 mM, pH 6.7 y pirofosfato 10 mM, pH 6.7. A cada pH, la velocidad de derivación de IL-lra con MAP fue más lenta en regulador de pH de citrato o pirofosfato que en regulador de pH de fosfato. Véase figura 17. Además, la velocidad de derivación en presencia de citrato o pirofosfato20 mM fue más lenta que la velocidad de derivación en presencia de citrato o pirofosfato 10 mM. Estos resultados sugieren que el citrato y/o pirofosfato pueden proteger a los residuos de lisina de IL-lra contra la derivación con MAP de manera más efectiva que el fosfato. Así, la velocidad de derivación de IL-lra con MAP es más lenta en presencia de regulador de pH de citrato o regulador de pH de pirofosfato que en presencia de regulador de pH de fosfato. Finalmente, IL-lra también se derivó con MAP en presencia de citrato 10 M a pH 6.3, pH 6.5 o pH 6.7; o en presencia de fosfato 10 mM a pH 6.3, pH 6.5 o pH 6.7 durante 5.5 horas, de acuerdo con los métodos descritos arriba. La figura 18 muestra una disposición de los resultados de HPLC de fase inversa de la derivación de IL-lra con MAP durante 5.5 horas en presencia de cada uno de esos reguladores de pH. Esa figura muestra que IL-lra" se deriva a un mayor grado en presencia de fosfato que presencia de citrato a todos los niveles de pH probados . Estos resultados sugieren que el citrato puede proteger los residuos de lisina de IL-lra contra la derivación con MAP de manera más efectiva que el fosfato. Los datos mostrados en la figura 18 también sugieren que IL-lra es derivada a un mayor grado al incrementarse el pH. Ejemplo 8 Agregación de IL-Ira en presencia de varias concentraciones de fosfato Diez mililitros de solución de abastecimiento de IL-lra (220 mg/ml se dializaron a 4°C durante 48 horas contra un total de 8L (2L con tres cambios de regulador de pH de 2L cada uno) de fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, pH 6.5. La concentración de IL-lra se ajustó a 167 mg/ml con fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, pH 6.5. Se preparó una solución de abastecimiento de fosfato 1 M al disolver una cantidad adecuada de fosfato de sodio en el fosfato 10 mM, pH 6.5, NaCl 100 mM. Soluciones de abastecimiento de trabajo de 20 mM, 60 mM, 110 mM, 210 mM, 310 mM, 410 mM, 510 mM, 610 mM, 710 mM, 810 mM, 910 mM y 1 mM de fosfato, pH 6.5 se hicieron a partir de las solución de abastecimiento 1 M al diluir con fosfato 10 mM, pH 6.5 y NaCl 100 M. La agregación de ?L-lra en varias concentraciones de fosfato se midió usando una placa de vidrio- de 96 pocilios ~_' (Zissner) y un espectrofotómetro de lectura de placa controlado en -temperatura, SpectraMax Plus (Molecular Devices) . 118 microlitros de la solución^de abastecimiento de 167 mg/ml de IL-lra se añadieron a cada pocilio. Veinte microlitros de una solución de abastecimiento de trabajo de fosfato se añadieron después a cada pocilio (una solución de abastecimiento de trabajo por pocilio) . La concentración final de fosfato en los pocilios fue de 0 mM, 2 mM, 6 mM, 11 mM, 21 mM, 31 mM, 41 mM, 51 mM, 61 mM, 71 mM, 81 mM, 91 mM, 100 mM. La placa se incubó" en el espectrofotómetro a 39°C y la densidad óptica se midió a 405 nm cada un minuto. La figura 19 muestra la densidad óptica a 405 nm graficada como una función de tiempo para cada concentración de fosfato para este experimento . Los datos en la figura 19 sugieren que el grado de agregación de IL-lra se reduce con una concentración de fosfato cada vez más alta.

Ejemplo 9 Medición de la unión de citrato a IL-lra El número de sitios de unión de iones de citrato y la K de la unión de citrato a IL-lra se determinaron como sigue. Soluciones de 1 mi de IL-lra 1 mM se prepararon en reguladores de pH que tenían varias concentraciones de citrato, pH 6.5 al diluir solución de abastecimiento de IL-lra (220 mg/ml en CSE) en los reguladores de pH adecuados. En forma específica, 1 mi de soluciones 1 mM de IL- Ira en cada uno de citrato 5 mM, 10 mM y 20 mM, pH 6.5 se prepararon. Cada solución contenía también NaCl -70 mM.

Cuatrocientos microlitros de cada solución se colocaron en una columna centrífuga Microsep™-10 (Pall Corporation) ; una solución por columna) . Las columnas fueron centrifugadas a 18°C durante 35 minutos a 4000 xg. Después del centrifugado, la IL-lra permanece en el retenido, unida a un poco del citrato, mientras que una parte del regulador de pH que contiene citrato no ligado pasa a través del filtro como filtrado. Después del centrifugado, aproximadamente la mitad de la solución había pasado a través del filtro como filtrado. La cantidad de citrato en cada uno del retenido y filtrado se determinó como sigue. Veinte micrlitros de filtrado o retenido se cargaron sobre una columna HPLC de fase inversa (Supelcosil™ LC 18, 15 cm x 4.6 mm, Sigma-Aldrich no. de cat. 58985). La velocidad de flujo fue de 1 mi por minuto con ácido fosfórico 0.1 M como regulador de pH de activación (elución isocrática) . La elución se llevó a cabo a temperatura ambiente. La cantidad de ácido cítrico eluída de la columna se midió a 215 nm. La concentración de citrato en la muestra ensayada (el retenido o filtrado) se calculó después a partir de esa medición (el sistema fue calibrado con estándares de solución de citrato 0-10 mM, pH 6.5). La figura 20 muestra una "gráfica de la concentración de citrato unido a IL-lra (determinada como la concentración de citrato en el retenido menos la concentración de citrato en el filtrado) contra la concentración -de citrato total en la solución. La concentración máxima de citrato unido, Bma , se extrapoló de aquellos datos para ser 1.8218 mM. Los datos de la figura 20 se usaron para crear una gráfica de Scatchard para determinar así la Kd para unión de citrato a IL-lra. La Kd se calculó como 3.846 mM para este experimento (datos no mostrados) . Además, el número de sitios de unión para citrato en IL-lra se determinó a partir de la intercepción x en la gráfica de Scatchard. El número de sitios de unión fue de 0.94 para este experimento (datos no mostrados) . Estos datos sugieren que hay un sitio de unión de citrato en IL-lra. Ejemplo 10 Competencia por el sitio de unión de aniones de IL-Ira La competencia por el sitio de unión a citrato en IL-lra por pirofosfato se determinó como sigue. Cuatrocientos microlitros de un solución que contenía IL-lra lm, citrato 10 mM, pH 6.5, NaCl 70 mM y una concentración de prueba de pirofosfato se colocaron en columnas centrífugas Microsep™-10 (Pall Corporation) y se centrifugaron a 18°C durante 35 minutos a 4000 xg. Las concentraciones de pirofosfato probadas fueron O mM, 5 mM, 10 mM y 20 mM. Después del centrifugado, aproximadamente la mitad de la solución había pasado a través del filtro como filtrado, mientras que la solución restante permaneció sobre el filtro como retenido . La IL-lra permanece en el retenido, unida a una parte del citrato y/o pirofosfato, mientras que una ..parte del regulador de pH que contiene citrato no unido y pirofosfato pasará a través del filtro como filtrado. La concentración de citrato tanto en el retenido como en el filtrado se determinó como se describió arriba en el ejemplo 9. La competencia por el sitio de unión de citrato en IL-Ira por fosfato se determinó como se describió arriba para pirofosfato. La figura 21 muestra una gráfica de la concentración de citrato unido por IL-lra contra la relación de la concentración total de el anión de competencia (pirofosfato o fosfato) a la concentración total de citrato en la solución. Los datos sugieren que el pirofosfato es más efectivo para competir con citrato por el sitio de unión a citrato en IL-lra que el fosfato. Debido a que tanto el pirofosfato como el fosfato parecen ser capaces de competir por el sitio de unión a IL-lra (es decir, el sitio no es específico para citrato) , los presentes inventores- hacen referencia a la unión de citrato en el sitio IL-lra como el sitio de unión aniónico. A partir de los datos mostrados en la figura 21, la Ka para la unión de pirofosfato al sitio de unión aniónico en IL-Ira se determinó usando los siguientes cálculos. Véase, por ejemplo, Stinson and Holbrook, Biochem. J. (1973) 131: 719- 728. La competencia entre la unión de citrato y pirofosfato puede expresarse como dos equilibrios separados : K< P + L PL K' X P +X PX en donde P = proteína, la cual es IL-lra en este caso; L = ligando, el cual es citrato en este caso y X = anión competente, el cual es pirofosfato en este caso. KaL es la Ka para la unión de ligando a proteína y es igual a la concentración de P (proteína libre) por la concentración de L (ligando libre) , dividida entre la concentración de PL (proteína unida a ligando) . Kdx es la Kd para la unión aniónica competitiva a proteína y es igual a la concentración de P (proteína libre) por la concentración de X (anión competente libre) , dividida entre la concentración de PX (proteína unida a anión competente) .

La Ka aparente u observada de citrato (KdLapp) se puede expresar como sigue: (Lfree).(Pfree) + (PX)] KdLapp = (PL) en donde Lfree es una concentración de ligando libre (citrato) , Pfree es la concentración de proteína libre (IL-lra) , PX es la concentración de proteína unida a anión competitivo (pirofosfato) , y PL es la concentración de proteína unida a ligando. Al reemplazar el término (PX) con (Xfree) (Pfree) /Kdx, que se deriva de la ecuación de equilibrio mostrada arriba, la expresión para KdLapp se puede reducir a: K<*Lapp = KdL[1 + (Xfree/Kdx)].

Así, si KdLapp se gráfica contra Xfree/ la intercepción y será igual a KdL y la pendiente será igual a KdL/Kdx. Haciendo una redisposición, Kdx será igual a la intercepción y dividida entre la pendiente. La KdLapp para unión a citrato se calcula a cada concentración de anión competente como la concentración de proteína libre (IL-lra) por la concentración de ligando libre (citrato) , dividida entre la concentración de ligando unido (citrato unido a IL-Ira) . La concentración de proteína libre se calcula como siendo la concentración total de proteína en la muestra menos la concentración de proteína unida (la cual es igual a la concentración de ligando unido) . Xfree o la concentración de anión competente libre, es igual a la concentración total de anión competente menos el cambio en la concentración de ligando unido (citrato unido a IL-lra) al ser incrementada la concentración total de anión competente (es decir, al ser reemplazado el citrato en los sitios de unión al anión IL-lra por el anión competente) . En otras palabras, Xfree = Xtotai - ? Xound como Xotai se incrementa. La figura 22 muestra una gráfica de KdLapp para citrato contra la cantidad de pirofosfato libre, calculada usando los datos de la--- -figura 20 y los cálculos" descritos arriba. La Kdx para pirofosfato se calculó como 2.994 mM para este experimento. Como se indicó arriba, la intercepción y debe ser igual a KdL, la cual es la Kd de citrato. En este experimento, la KdL fue de 3.894 mM, lo cual concuerda con la determinación experimental anterior de la Kd para unión de citrato a IL-lra, 3.846 mM, descrito en el ejemplo 9. Una gráfica similar (datos no mostrados) se creó para los datos de fosfato mostrados en la figura 21. En este experimento, la Kdx para fosfato se calculó como de 12.641 mM. La KdL para citrato, determinada a partir de la intercepción y de la gráfica para este experimento (datos no mostrados) , fue de 4.996 mM. Estos datos sugieren que el citrato y pirofosfato tienen as más bajas para el sitio de unión aniónico de IL-Ira. Además, el pirofosfato puede tener una Kd ligeramente más baja que el citrato para un sitio de unión aniónico. Las Kds más bajas observadas en este experimento se correlacionan con la mayor capacidad de pirofosfato y citrato para reducir la agregación de IL-lra, como se muestra en los ejemplos 2 y 4. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (54)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para reducir la agregación de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación que comprende incubar IL-lra con al menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación de la IL-lra, caracterizado porque al menos una de la por lo menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas . 2. El método de conformidad con "la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el anión de varias cargas es pirofosfato 1 a 20 mM.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el anión de varias cargas es citrato 1 a 20 mM.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un azúcar.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el azúcar es glicerol, sorbitol o sucrosa.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el azúcar está a una concentración de 1 a 3 por ciento .
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-il) amino)hexanoico (NBD-X), fosfato de metilacetilo- (MAP) y anhídrido citracónico.
10. 10. Un método para preparar una formulación de fármaco con antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-Ira) que comprende incubar una IL-lra de agregación con por lo menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación de la IL-lra o reducir la velocidad de agregación de la IL-lra, en donde al menos una de la por lo menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas, caracterizado porque se reduce la agregació .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas .
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anión de varias cargas es pirofosfato 1 a 20 mM.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anión de varias cargas es citrato 1 a 20 mM.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un azúcar.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque -el azúcar es glicerol, sorbitol o sucrosa.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el azúcar está a una concentración de 1 a 3 por ciento.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-il) amino)hexanoico (NBD-X), fosfato de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico.
19. 19. Un método para tratar un paciente, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y (ii) por lo menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación de la IL- Ira o reducir la velocidad de agregación de la IL-lra, en donde al menos una de la por lo menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anión de varias cargas es pirofosfato 1 a 20 mM.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anión de varias cargas es citrato 1 a 20 mM.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un azúcar.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el azúcar es glicerol, sorbitol o sucrosa.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el azúcar está a una concentración de 1 a 3 por ciento.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-l, 3~diazol-4-il) amino) hexanoico (NBD-X), fosfato de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico.
28. 28. Un método para tratar un paciente que tenga artritis reumatoide, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y (ii) por lo menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación de la IL-lra o reducir la velocidad de agregación de la IL-lra, en donde al menos una de la por lo menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas .
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas .
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anión de varias cargas es pirofosfato 1 a 20 mM.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el anión de varias cargas es citrato 1 a 20 mM.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un azúcar. _ ... "
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el azúcar es glicerol, sorbitol o sucrosa .
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el azúcar está a una concentración de 1 a 3 por ciento.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-il) amino) exanoico (NBD-X), fosfato de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico.
37. 37. Un método para tratar un paciente que tenga osteoartritis, caracterizado porque comprende administrar al paciente una composición que comprende (i) una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y (ii) por lo menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación de la IL-lra o reducir la velocidad de agregación de la IL-lra, en donde al menos una de la por lo menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas r
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas .
39. 39. El método de conformidad con- la reivindicación 38, caracterizado porque el anión de varias cargas es pirofosfato 1 a 20 mM.
40. 40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el anión de varias cargas es citrato 1 a 20 mM.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque al menos una molécula accesoria es un azúcar .
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el azúcar es glicerol, sorbitol o sucrosa.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el azúcar está a una concentración de 1 a 3 por ciento.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina.
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2"-oxa-l, 3-diazol-4- il) amino)hexanoico (NBD-X), fosfato - de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico.
46. 46. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-lra) de agregación y por lo menos una molécula accesoria a una concentración suficiente para reducir la agregación de la IL-lra o reducir la velocidad de agregación de la IL-lra, en donde al menos una de la por lo menos una molécula accesoria se selecciona de un azúcar y un anión de varias cargas, y en donde se reduce la agregación.
47. 47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque al menos una molécula accesoria es un anión de varias cargas .
48. 48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el anión de varias cargas es pirofosfato 1 a 20 mM.
49. 49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque el anión de varias cargas es citrato 1 a 20 M.
50. 50. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque al menos una molécula accesoria es un azúcar.
51. 51. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque el azúcar _ es glicerol, sorbitol o sucrosa.
52. 52. La composición farmacéutica de conformidad con" la reivindicación 50, caracterizada porque el azúcar está a una concentración de 1 a 3 por ciento .
53. 53. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque al menos una molécula accesoria se selecciona de una molécula accesoria reactiva con lisina y una molécula accesoria reactiva con arginina .
54. 54. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque al menos una molécula accesoria se selecciona de ácido 6- (N- (7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-il)amino)hexanoico (NBD-X), fosfato de metilacetilo (MAP) y anhídrido citracónico.