MXPA99005224A - Composicion farmaceutica que comprende una proteina enlazante del tfn para tratar padecimientos mediados por el tnf - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento o prevención de artritis agudo y/o crónica. El método comprende la administración a los pacientes en necesidad de ello, de cantidades terapéuticamente efectivas de una proteína enlazante de TNF y metotrexato (ácido N-(4-((2,4-diamino-6- pteridinil)metilamino)benzoil)-L-glutámico). En una modalidad preferida, la proteína enlazante de TNF es sTNFR-IósTNFR-II. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen una proteína enlazante de TNF y metotrexatoútil en tales métodos.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE COMPRENDE UNA PROTEINA ENLAZANTE DEL TFN PARA TRATAR PADECIMIENTOS MEDIADOS POR EL TNF Campo de la Invención .

La presente invención se refiere al campo de los trastornos mediados por el TNF. Más específicamente, la presente invención se refiere a una terapia combinada para el propósito de prevenir o tratar los trastornos mediados por el TNF.

A tecedentes de la Invención.

La inflamación es la reacción de defensa para lesiones tales como aquellas causadas por daño mecánico, infección o estimulación antigénica. Una reacción inflamatoria puede expresarse patológicamente cuando la inflamación se induce por un estímulo inapropiado tal como un autoant igeno , se expresa de una manera exagerada o persiste aún después de remover los agentes de lesión. Tal reacción inflamatoria puede incluir la producción de ciertas citocinas.

Ref: 030494 Mientras que la etiología de la inflamación es pobremente entendida, información considerable se ha apreciado recientemente respecto a los aspectos moleculares de la inflamación. Esta investigación ha conducido a la identificación de ciertas citocinas que se consideran para figurar prominentemente en la mediación de la inflamación. Las citocinas son proteínas extracelulares que modifican el comportamiento de las células, particularmente aquellas células que están en el área inmediata de la síntesis de la citocina y se liberan. Los factores de tumores de necrosis (TNFs) son una clase de citocinas producidas por numerosos tipo de células, incluyendo monocitos y macrofagos .

Al menos dos TNFs se han descrito previamente, específicamente el TNF alfa (TNF-a) y el TNF beta (TNF-ß o linfotoxina) , y cada uno es activo como una molécula trimérica y se considera que inician señalamientos celulares iniciales por receptores reticulados (Engelmann et al. (1990), J. Bi ol . Ch em . , 265 : 14497-1 50 ) .

Varias líneas de evidencia implican al TNF-a y al TNF-ß como las citocinas más inflamatorias. Se conoce que los TNFs tienen efectos fisiológicos importantes en un número de diferentes células objetivo que se involucran en respuestas inflamatorias para una variedad de estímulos tales como infección y lesión. Las proteínas causan fibroblastos así como células sinoviales para secreción de colagenasa latente y pros taglandina E2 y causan células osteocitas para estimular la resorción del hueso. Estas proteínas incrementan las propiedades adhesivas de la superficie de las células endoteliales para neutrófilos . Estas también causan células endoteliales para una actividad secretante de coagulante y reducen su habilidad para provocar lisis en los coágulos.

Adicionalmente, estos redireccionan la actividad de los adipocitos lejos del almacenamiento de lípidos por expresión de inhibición de la enzima liproteínica de lipasa. Los TNFs también causan hepatocitos para sintetizar una clase de proteínas conocidas como "reactivos de fase aguda", que actúan en el hipotálamo como pirógenos (Selby et al. (1988), Lan ce t , 1 (8583) : 483; Starnes, Jr . Et al. (1988), J. Cl in . In ves t . , 82: 1321; Oliff et al. (1987), Cel l , 5_0: 555; y aage et al. (1987), Lan ce t , 1 (8529) : 355) .

Un trastorno o condición médica se considera que es una "trastorno mediado por el TNF" si el trastorno espontáneo o experimental se asocia con niveles elevados de TNF en los fluidos sanguíneos o en los tejidos adyacentes al foco del trastorno o indicación dentro del cuerpo. Los trastornos mediados por el TNF pueden también reconocerse por las dos siguientes condiciones: (1) los hallazgos patológicos asociados con un trastorno pueden imitarse en animales por la administración del TNF, y (2) la patología inducida en modelos de trastornos en animales experimentales puede inhibirse o abolirse por tratamiento con agentes que inhiben la acción del TNF. Muchos trastornos mediados por el TNF satisfacen dos de estas tres condiciones, y otras pueden satisfacer las tres condiciones completas .

Los trastornos mediados por el TNF tales como artritis reumatoide y artritis psoriática son trastornos crónicos de las uniones que afligen e incapacitan, en una variedad d:e grados, a millones de personas mundialmente . La artritis reumatoide es un trastorno de las uniones articulares en el cual el cartílago y el hueso son lentamente desgastados incesantemente por un tejido conectivo invasor y proliferativo llamado pannus, que se deriva de la membrana sinovial. El trastorno puede involucrar estructuras peri-art iculares tales como bolsas, vainas de tendones y tendones o bien como tejidos extra-articulares tales como el sub-cutis, sistema cardiovascular, pulmones, bazo, nodos linfáticos, músculos esqueléticos, sistema nervioso (central y periférico) y ojos (Silberberg (1985), Anderson 's Pa thol ogy, Kissane (ed.), II : 1828) .

Se cree que la artritis reumatoide resulta de la presentación de un antígeno relevante a un huésped inmunogenéticamente susceptible. Los antígenos que pudieran iniciar potencialmente una respuesta inmune resultando en artritis reumatoide, pueden ser endógenos o exógenos. Los antígenos endógenos posibles incluyen colágeno, mucopolisacáridos y factores reumatoides . Los antígenos exógenos incluyen micoplasmas, micobacterias , espiroquetas y viruses. Los subproductos de la reacción inmune inflaman la sinovia (por ejemplo, prostaglandinas y radicales oxigenó) y activan cambios destructivos de las uniones (por ejemplo, colagenasa) .

Existe un amplio espectro de severidad del trastorno, pero varios pacientes pasan por el transcurso de relapsos y remisiones intermitentes con un patrón global de destrucción y deformidad lentamente progresiva de las uniones,. Las manifestaciones clínicas pueden incluir poliartritis simétrica de las uniones periféricas con dolor, sensibilidad, hinchazón y pérdida de la función de las uniones afectadas; rigidez de la * ? mañana; y pérdida de cartílagos, erosión de materia ósea y subluxación de las uniones después de inflamación persistente. Las manifestaciones extra-articulares incluyen nodulos reumatoides, vasculitis reumatoide, inflamaciones pleuropulmonares , escleritis, síndrome de sicca, síndrome de Felty ( esplenomegalia y neutropenia), osteoporosis y pérdida de peso (Katz (1985), Am . J. Med . , 7_9:24 y Krane y Simón (1986), Advances in Rheuma t ol ogy, Synderman (ed.), 70(2) : 263-284 ) . Las manifestaciones resultan en un elevado grado de morbilidad que resulta en una vida diaria perturbada del paciente.

Adicionalmente, los resultados preclínicos con los diversos modelos animales predictivos de la artritis reumatoide, han sugerido que la inhibibión del TNF-a, puede tener un impacto mayor en el avance y severidad del trastorno (Dayer et al. (1994), European Cytokine Network, 5(6) : 563-571 y Feldmann et al. (1995), Annals of the New York Academy of Sciences , 6_6:272-218) . Más aún, los ensayos clínicos recientes en humanos en artritis reumatoide con inhibidores del TNF han mostrado resultados prometedores (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology , 3 _4J_: 4334-4342; Elliot et al. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 3_9 : 1077 -1081 ; Paleolog et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 3_9 : 1082-1091 y Moreland et al. (1997), New England Journal of Medicine, 337 : 141-47. ) Es un objeto de la presente invención, proporcionar métodos y composiciones terapéuticas para el tratamiento de los trastornos mediados por el TNF. Este y otros objetos de la presente invención serán aparentes de la descripción que sigue .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a terapias para evitar y tratar los trastornos mediados por el TNF en un paciente. La presente invención se refiere específicamente a la terapia de combinación usando una proteína enlazante del TNF para evitar o tratar los trastornos mediados por el TNF, incluyendo trastornos reumáticos, y la inflamación sistémica y pérdida de peso corporal asociada con la misma. El tipo de tratamiento aquí referido se pretende para mamíferos, incluyendo humanos .

Breve Descripción de las Figuras Diversos aspectos y ventajas de la presente invención serán aparentes al revisar las figuras en donde : La Figura 1 describe una secuencia de ácido nucleico (NO. ID SEC:!) codificando Asp1-Thr161, el receptor TNF maduro soluble humano recombinante del tipo I. También detallada está la secuencia de amino ácidos (NO. ID SEC:2) del Asp1-Thr 161 El término amino de la secuencia de amino ácido puede estar metionilado o no metionilado.

La Figura 2 describe una secuencia de ácido nucleico (NO. SEC. ID: 3) codificando el receptor TNF maduro soluble humano recombinante del tipo II. También detallada está la secuencia (NO SEC ID:4) de Leu1-Thr 179 El término amino de la secuencia de amino ácido puede estar metionilado o no metionilado La Figura 3 detalla los efectos de la mancuerna cl05 sTNFR-I y el metotrexato sobre el diámetro de la unión en las ratas artríticas adyuvantes en el Ejemplo 1.

La Figura 4 detalla los efectos de la mancuerna cl05 sTNFR-I solamente, el metotrexato solamente y la combinación de la mancuerna cl05 sTNFR-I con el metotrexato sobre los pesos finales de las patas (índice de artritis), esplenomegal ia (índice de inflamación sistémica) y cambio en el peso corporal en las ratas artríticas adyuvantes en el Ej emplo 1.

La Figura 5 detalla el análisis final (inhibición en la terminación) de los efectos de la mancuerna cl05 sTNFR-I solamente, el metotrexato solamente y la combinación de la mancuerna cl05 sTNFR-I con el metotrexato sobre el diámtero de la unión en las ratas artríticas adyuvantes en el Ejemplo 1.

La Figura 6 detalla los efectos del sTNFR-II/Fc solamente, el metotrexato solamente y la combinación del sTNFR-II/Fc con el metotrexato sobre los pesos finales de las patas (índice de artritis), esplenomegalia (índice de inflamación sistémica) y cambio en el peso corporal en las ratas artríticas adyuvantes en el Ejemplo 2.

La Figura 7 detalla los efectos del sTNFR-II/Fc solamente, el metotrexato solamente y la combinación del sTNFR-II/Fc "con metotrexato en ratas artríticas adyuvantes en' el Ejemplo 2.

La Figura 8 detalla los efectos de la mancuerna cl05 sTNFR-I solamente, la proteína de fusión fas solamente sobre la letalidad de LPS/D- galactosamina en las ratas del Ejemplo 3.

Descripción Detallada de la Invención Los métodos y composiciones de la invención, incluyen la administración a un paciente que padece un trastorno inflamatorio de unión, una cantidad efectiva de una proteína enlazante del TNF en combinación con alguna de una o más medicamentos y terapias antiinflamatorias. El paciente preferido es un humano. Las proteínas de enlace de TNF se describen en el arte (EP 308 378, EP 422 339, GB 2 218 101, EOP 393 438, WO 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, WO 91/03553, EP 418 014, JP 127,800/1991, EP 433 900, patente americana U.S. No. 5,136,021, GB 2 246 569, EP 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, WO 93/07863, EP 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417 563, WO 95/34326, WO 96/2"8546, y la solicitud de PCT No. PCT/US97/12244, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) .

Por ejemplo, las patentes EP 393 438 y EP 422 339, enseñan las secuencias de amino ácidos y ácidos nucleicos de un receptor de TNF soluble tipo I (también conocido como sTNFR-I o el inhibidor TNF 30kDa) y un receptor TNF soluble del tipo II (también conocido como sTNFR-II o inhibidor TNF 40 kDa), denominado colectivamente "sTNFRs" así como formas modificadas de los mismos (por ejemplo, fragmentos, derivados funcionales y variantes) . Las patentes EP 393 438 y EP 422 339, también describen métodos para aislar los genes responsables de la codificación de los inhibidores, clonando los genes en vectores apropiados y tipos de células, y expresando los » ? genes para producir los inhibidores .

Los sTNFR-I y sTNFR-II son miembros de la sobrefamilia de receptores receptor TNF/factor de crecimiento del nervio, el cual incluye el receptor del factor de crecimiento del nervio (NGF) , el antígeno de célula B CD40, 4-1BB, el antígeno de células T de ratas MRC OX40, el antígeno fas, y los antígenos CD27 y CD30 (Smith et al. (1990), Science, 248:1019-1023) . La característica más conservada entre este grupo de receptores de superficie de células es el dominio de enlace de ligando extracelular rico en cisteína, que puede dividirse en cuatro motivos repetitivos de alrededor de cuarenta aminoácidos y los cuales contienen de 4-6 residuos de cisteína 1 en las posiciones que están bien conservadas (Smith et al. (1990), supra) .

Para los propósitos de esta invención, los sTNFRs y las formas modificadas de los mismos, incluyen polipéptidos en los cuales los aminoácidos de sTNFR-I y STNFR-II se han eliminado de ("variantes de eliminación"), insertadas dentro de ("variantes de adición") o substituidas por ("variantes de substitución") se denominan colectivamente "TNFbp(s)". (A menos que se indique de otra manera, la numeración de aminoácidos para las moléculas descritas aquí corresponderán a aquellas presentadas para la forma madura de la molécula (esto es, menos la señal de secuencia), como se detalla por los aminoácidos Asp1-Thr161 del ,NO SEC ID:2, con cualquier MET inicial en cada ' secuencia siendo el número de residuo "0") .

Se apreciará por aquellos habilitados en el arte, que diversas combinaciones de eliminaciones, inserciones y substituciones (individualmente o colectivamente "variante ( s )" ) pueden hacerse dentro de las secuencias de amino ácidos de los sTNFRs, con la condición de que la molécula resultante es biológicamente activa (por ejemplo, posee la capacidad de enlazar TNF) .

Una variante de sTNFR se puede vigilar rápidamente para evaluar sus propiedades físicas. Se apreciará que tal (es) variante (s) demostrarán propiedades inhibidoras del TNF similares, pero no necesariamente todas las mismas propiedades y no necesariamente en el mismo grado que los sTNFR correspondientes no modificados.

Existen dos principales variables en la construcción de la variante (s) de la secuencia de amino ácidos: la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Al diseñar la variante (s), la ubicación de cada sitio de mutación y la naturaleza de cada mutación dependerá de las características bioquímicas a modificarse. Cada sitio de mutación se puede modificar indi idualmente o en serie, por ejemplo, por (1) eliminación del residuo objetivo de amino ácido, (2) insertar uno o más residuos de amino ácido adyacentes al sitio localizado o (3) substitución primero con las elecciones conservadoras de amino ácidos y, dependiendo de los resultados alcanzados, después con más selecciones de radicales .

Las eliminaciones de la secuencia de. amino ácido generalmente están en el intervalo de alrededor de 1 a 30 residuos de amino ácido, preferiblemente desde alrededor de 1 hasta 10 residuos de amino ácido y más preferiblemente desde alrededor de 1 hasta 5 residuos contiguos. Las eliminaciones de intrasecuencias internas, terminal carboxi, terminal amino se contemplan. Se pueden hacer las eliminaciones dentro de las secuencias de amino ácidos de los sTNFRs, por ejemplo, en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia del receptor NGF/TNF. Las eliminaciones dentro de las secuencias de amino ácido de la sTNFRs en áreas de homología substancial con las secuencias de otros miembros de la familia del receptor NGF/TNF, serán más probable que modifiquen significativamente la actividad biológica. Específicamente, la similaridad de la secuencia entre los miembros de familia del receptor NGF/TNF, es particularmente elevada en la región que corresponde a los primeros dos circuitos de disulfuro del dominio 1, la totalidad del dominio 2 y el primer circuito de disulfuro del dominio 3 (Banner et al. (1993), Cell, 73:431-445) . El número de eliminaciones totales y/o eliminaciones consecutivas, será preferiblemente seleccionado de manera de preservar la estructura terciaria en el dominio afectado, por ejemplo, reticulado de cisteína.

La patente EP 393 438, enseña un inhibidor TNF 40 kDA ?51 y un inhibidor TNF 40 kDA ?53, los cuales son versiones truncas de la proteína inhibidora recombinante TNF 40 kDa, en donde 51 ó 53 residuos de amino ácido .respectivamente, se eliminan en la terminación carboxilo de la proteína madura. De conformidad, un técnico hábil apreciaría que el cuarto dominio de cada inhibidor TNF 30 kDa y el inhibidor 40 kDa no es necesario para la inhibición TNF. De hecho, varios grupos han confirmado este entendimiento. Se han generado los derivados de eliminación de dominio de los inhibidores TNF 30 kDa y 40 kDa, y aquellos derivados sin el cuarto dominio, retienen completa la actividad de enlace de TNF mientras que aquellos derivados sin el primero, segundo y tercer dominio respectivamente, no retienen la actividad enlazante de TNF (Corcoran et al. (1994), Eur . J. Bi och em . , 223:831-840; Chih-Hsueh et al. (1995), Th e Journa l of Bi ol ogi ca l Ch emi s try, 270(6) : 2874-2878; y Scallon et al. (1995), Cy t okin e , 7 ( 8 ( : 759-770 ) .

La solicitud PCT No. PCT/US 97 / 12244 enseña formas truncadas del sTNFR-I y del STNFR-II que no contienen el cuarto dominio (residuos de amino ácido Thr127-Asn161 de sTNFR-I y residuos de amino ácido Pro141-Thr179 del sTNFR-II); una porción del tercer dominio (residuos de amino ácido Asn 111 Cys 1-26 del sTNFR-I y residuos de amino ácido Pro 123 Lys140 del sTNFR-II); y opcionalmente, que no contienen una porción del primer dominio (residuos de amino ácido Asp1-Cys19 del sTNFR-I y de los residuos de amino ácido Leu1-Cys32 del sTNFR-II) . Los sTNFRs truncados de la presente invención incluyen las proteínas representadas por la fórmula Rx- ( Cys19-Cys103 ) -R2 y R4- ( Cys32-Cys115 ) -R5. listas proteínas son formas truncadas del sTNFR-I y del sTNFR-II respectivamente.

Por "Ri- (Cys19-cys103) -R2" quiere decir una o más proteínas en donde ( Cys19-Cys103 ) representan los residuos 19 al 103 del sTNFR-I, el esquema de numeración del residuo de aminoácido del cual se proporciona en la Figura 1, para facilitar la comparación; en donde Rx representa u? grupo metionilado o no metionilado del Cys19 o de los residuos de amino ácido de término amino, seleccionados del alguno de Cys18 hasta Asp1, y en donde R2 representa un grupo carboxi de Cys103 o de los residuos de amino ácido carboxi-terminales selccionados de alguno de Phe104 hasta Leu110.

Los sTNFR-I truncados ejemplares de la presente invención, incluyen las siguientes moléculas (denominadas colectivamente 2.6D sTNFR-I) : NH2- (AspXCys105) -COOH (también referida como sTNFR-I 2.6D/C105); NH2- ( Asp^Leu108 ) -COOH (también referida como sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-(Asp1-Asn105)-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/N105); NH2- ( Tyr9-Leu108 ) -COOH (también referido como sTNFR-I 2.3 D/dl8); y NH2-(Ser16 Leu ,i10Uß8) -COOH ( también referido como sTNFR-I 2.3D/dl5) ya sea metionilado o no metionilado, y variantes y derivados de los mismos .

Por "R3- (Cys32-Cys115 quiere decir una o más proteínas en donde ( Cys32-Cys115) representa residuos Cys32 hasta Cys115 del sTNFR-II, el esquema de numeración del residuo de amino ácido del cual se proporciona en la Figura 2 para facilitar la comparación; en donde R3 representa un grupo amina metionilado o no metionilado de Cys32 o del (os) residuo(s) de amino ácido de término amino, seleccionados de alguno de Cys31 hasta Leu1 y en donde R4 representa un grupo carboxi de Cys115 o del (os) residuo(s) de amino ácido carboxi terminal seleccionado de alguno de Ala116 hasta Arg122.

Una adición de secuencia de amino ácido puede incluir inserciones de una . fusión amino- y/o carboxi-terminal en un intervalo de longitud desde un residuo hasta cien o más ' residuos, así como inserciones de int rasecuencias internas de residuos simples o múltiples de amino ácidos. Las adiciones internas pueden estar generalmente en el intervalo desde alrededor de 1 hasta 20 residuos de amino ácido, preferiblemente desde alrededor de 1 hasta 10 residuos de amino ácido, más preferiblemente desde alrededor de 1 hasta 5 residuos de amino ácido, y más preferiblemente desde alrededor de 1 hasta 3 residuos de amino ácido. Las adiciones dentro de las secuencias de amino ácidos de los sTNFRs, se pueden hacer en las regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia del receptor NGF/TNF. Las adiciones dentro de la secuencia de amino ácido de los sTNFRs en áreas de homología substancial con las secuencias de los otros miembros de la familia del receptor NGF/TNF estarán más probables de modificar significativamente la actividad biológica. Las adiciones incluyen preferiblemente secuencias de amino ácidos derivadas de las secuencias de los miembros de la familia de receptores NGF/TNF.

Una adición de término amino se contempla que incluye la adición de una metionina (por ejemplo, como un artefacto de la expresión directa en cultivos de células bacterianas recombinantes) . Un ejemplo adicional de una adición amino-terminal incluye la fusión de una secuencia de señal al término amino de los sTNFRs maduros con objeto de facilitar la secreción de la proteína de las células huésped recombinantes. Dichas secuencias de señal se obtendrán generalmente de esas y serán así homólogos de las especies de células huésped pretendidas. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de origen de los sTNFRs, se puede substituir la secuencia por una secuencia de señal procariótica seleccionada de por ejemplo, el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa o secuencias líder de enterotoxina II estables al calor. Para la expresión en células de levadura, la secuencia de señal se puede seleccionar por ejemplo, desde el grupo de la invertasa de levadura, el factor alfa o las secuencias líder de fosfatasa acida. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias de señal de origen (EP 393 438 y EP 422 339) son satisfactorias, aunque otras secuencias de señal de mamíferos pueden ser apropiadas, por ejemplo, las secuencias derivadas de otros miembros de la familia del receptor NGF/TNF.

Un ejemplo de una adición de término amino- o carboxi-, incluye proteínas quiméricas que comprenden la fusión en terminal amino o terminal carboxi de un TNFbp(s) con todo o parte del dominio constante de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana (individual o colectivamente, ("sTNFR Fe ( s ) " ) . Tales polipéptidos quiméricos se prefieren en donde la porción de inmunoglobulina de cada uno comprende todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana tal como IgG (por ejemplo, IgGl ó IgG3), IgA, IgM ó IgE. Un técnico habilitado apreciará que cualquier amino ácido de la porción inmunoglobulina, se puede eliminar o substituir con uno o más amino ácidos, o uno o más amino ácidos se pueden agregar mientras la porción de proteína enlazante TNF aún se enlace al TNF y la porción de inmunoglobulina muestre una o más de sus propiedades características.

Otro grupo de variante(s) es la(s) variante(s) de subs ti tucióin de amino ácido de la secuencia de amino ácido de los sTNFRa. Estas son variantes en donde al menos un residuo de' amino ácido en un sTNFR se elimina y un residuo diferente se inserta en su lugar. La variante de substitución incluye variantes alélicas que se caracterizan por cambios en la secuencia de nucleótidos que se presentan naturalmente en la población de especies que pueden o no resultar en un cambio de amino ácido. Alguien habilitado en el -arte puede usar cualquier información conocida acerca del enlace o el sitio activo del polipéptido en la selección de los sitios posibles de mutación.

Un método para identificar los residuos de amino ácido o las regiones para la mutagénesis de una proteína, se denomina "mutagénesis de barrido de alanina", como se describe por Cunningham y Wells (1989), Science, 244:1081-1085, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia. En este método, un residuo de amino ácido o grupo de residuos objetivo se identifica (por ejemplo, residuos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se substituyen por un amino ácido neutral o cargado negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina), para afectar la interacción de los amino ácidos con el medio acuoso circundante dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios /residuos que demuestren sensibilidad funcional a las substituciones se refinan después al introducir residuos alternos o adicionales en los sitios de substitución. Así, está predeterminado el sitio para introducir una modificación de secuencia de amino ácido. Para optimizar la funcionalidad de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria o el barrido de alanina se pueden llevar a cabo y la (s) variante (s) se pueden monitorear para la combinación óptima de la actividad deseada y grado de actividad.

Los sitios de mayor interés para la 4 mutagénesis subs ti tucional incluyen sitios en los cuales los residuos particulares de amino ácidos dentro de un sTNFR son substancialmente diferentes de otras especies u otros miembros de la familia de receptores NGF/TNF en términos de. masa lado-cadena, carga y/o hidrofobicidad . Otros sitios de interés incluyen aquellos en los cuales residuos particulares de un sTNFR son idénticos entre otras especies u otros miembros de familia del receptor NGF/TNF, ya que dichas posiciones son generalmente importantes para la actividad biológica de una proteína .

Otros sitios de interés incluyen aquellos en los cuales residuos particulares son similares o idénticos con aquellos de tales proteínas como sTNFR-I y proteínas como sTNFR-II. De conformidad, la siguiente información se ha obtenido en relación al sTNFR-I (Banner et al. (1993), supra, y Fu et al. (1995), Pro tein En gin eering, 8 ( 12 ) : 1233 - 124 1 ) . Lo s re s i duos Tyr- Thr 3'9 His ,55 en el Dominio 1, los residuos Phe 49 , Ser .63 , Asp en el Dominio 2 y los residuos Tyr92 y Ser107 en el Dominio 3, se han identificado como potencialmente importantes para la estabilización de la estructura de los Dominios 1, 2 y 3 respectivamente. Los residuos Pro12 e His55 se han identificado como potencialmente interactuantes con Ser86 Tyr87 sobre la subunidad C de TNF-a. Los residuos Glu45-Phe49 se han identificado como que están en un circuito en el .cual potencialmente interactúan con los residuos Leu 9-Arg32 de la subunidad A del TNF-a. Los residuos Gly38 se han identificado como que interactúan potencialmente con Asn1 -Pro20 sobre la subunidad A del TNF-a. El residuo His58-Leu60 se ha identificado en una conformación extendida de cepas e interacciones de cadena lateral con los residuos Arg31-Ala33 sobre la subunidad A del TNF-a se han identificado potencialmente con el residuo His58 del sTNFR-I, específicamente interactuando con el residuo Arg31. Los residuos Lys6 -Arg66 se han identificado como que están en una conformación extendida de cepas y se han identificado que tienen interacciones de cadena lateral y cadena principal con los residuos Ala145-Glu146 y el residuo Glu46 sobre la subunidad A de TNF-a. El residuo Met69 se ha identificado como que interactúa potencialmente con el residuo Tyr115 sobre la subunidad A de TNF-a. Los residuos His94-Phe101 se han identificado que forman un circuito que interactúa con los residuos Thr72-Leu75 y Asn137 de la subunidad C del TNF-a, con el residuo Trp96 de sTNFR-I específicamente interactuando con los residuos Ser71-Thr72 sobre la subunidad C del TNF-a, Leu100 de sTNFR-I que está en cercana proximidad con el residuo Asn137 sobre la subunidad C de la TNF-a y residuo Gln102 de la sTNFR-I específicamente interactuando con el residuo Pro113 sobre la subunidad A di TNF-a.

Además de las cisteínas que forman los 3 pares de enlaces disulfuro dentro de cada uno de los cuatro dominios de la molécula, existen varios otros residuos conservados que contribuyen a la estabilización del doblez terciario de cada dominio .

Existen dos principales clases dentro de las cuales caen estos residuos estabilizantes. El primer tipo contribuye a la protección (de los átomos de azufre del enlace disulfuro del solvente. Un ejemplo de este residuo en el dominio 3 es el Tyr .92. En el dominio 4, la Phe 133 ayuda a proteger el enlace disulfuro Cys128-Cys139. Todos los cuatro dominios tienen ya sea un Tyr o Phe en estas mismas ubicaciones conservadas estructuralmente. La segunda clase de residuos estabilizantes forman enlaces hidrógeno dentro de sus respectivos dominios. Dentro del dominio 3 Asn123 y Ser107 forman un enlace hidrógeno y Ser107 formaun enlace hidrógeno adicional con el Thr124.

Para el dominio 4 estos residuos incluyen Asn144 Ser 141 Además existen enlaces hidrógeno entre los dominios 3 y 4 que no se ven entre otros dominios. Estos enlaces hidrógeno son (1) oxígeno de cadena principal Asn105 y nitrógeno de cadena lateral Asn137 y (2) oxígeno de cadena lateral Ser107 y nitrógeno de cadena principal Asn 137 Un técnico habilitado apreciará que inicialmente los sitios deben modificarse por substitución de una manera relativamente conservadora. Tales substituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "Substituciones Preferidas". Si tales substituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios substanciales (Substituciones Ejemplares) y/o se pueden hacer otras adiciones/eliminaciones y los productos resultantes se pueden tamizar.

TABLA 1: Substituciones de Amino Ácidos Al hacer tales cambios, el índice hidropático de los amino ácidos se puede considerar. La importancia del índice hidropático de amino ácidos al proporcionar la función biológica intercativa sobre una proteína, se entiende generalmente en el arte (Kyte and Doolittle) (1982), J. Mol . Bi ol . , 157:105-131, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) . Se conoce que ciertos amino ácidos se pueden substituir por otros amino ácidos que tienen un índice o registro hidropático similar y que _ún retienen una actividad biológica similar.

También se entiende en el arte que la substitución de amino ácidos similares se puede hacer efectivamente sobre la- base de afinidad hidrofílica, particularmente en donde la proteína o péptido funcionalmente equivalente creado por lo mismo se pretende para uso en modalidades inmunológicas, como en el caso actual. La patente U.S. 4,554,101, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia, establece que la mayor afinidad hidrofílica promedio local de una proteína, como se gobierna por la afinidad hidrofílica de sus amino ácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, esto es, con una propiedad biológica de la proteína.

La patente americana U.S. 4,554,101, también enseña la identificación y preparación de epítopos a partir de secuencias primarias de amino ácidos sobre la base de su afinidad hidrofílica. A través de los métodos descritos en la patente americana U.S. 4,554,101, un técnico habilitado podría identificar los epítopos por ejemplo, dentro de la secuencia de amino ácido de un sTNFR. Estas regiones también se refieren como "regiones de núcleo epitópico". Diversas publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria, y a la identificación de los epítopos, a partir de análisis de secuencias de amino ácidos (Chou y Fasman (1974), Bi och em i s try, 13 ( 2 ) : 222-245 ; Chou y Fasman (1974), Bi och emis try, 13 ( 2 ) : 221-222 ; Chou y Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Áreas Mol. Biol., 47:45-148; Chou y Fasman (1978 ) , Ann . Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou y Fasman (1979), Biophys. J. , 26:367-384, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Además, los programas de cómputo están actualmente disponibles para apoyar con la predicción de porciones antigénicas y regiones de núcleo epitópico de las proteínas. Ejemplos incluyen aquellos programas basados en el análisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf (1988), Comput. Appl .Biosci. , 4(1) .-181-186 y Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4 ( 1 ) : 187-191 , las descripciones de los cuales se incorporan aquí como referencia) ; el programa PepPlot" (Brutlag et al. (1990), CABS, 6:237-245 y Weinberger et al. (1985), Science, 228:740-742, las descripciones de los cuales se incorporan aquí como referencia) ; y otros programas para la predicción de la estructura terciaria de las proteínas (Fetrow y Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11:479-483, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia ) .

En contraste, las modificaciones substanciales en las características funcionales y/o químicas de los sTNFRs, se pueden llevar a cabo al seleccionar las substituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la columna vertebral del polipéptido en el área de substitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o de hélice, (b) la carga relativa o afinidad hidrofóbica de la proteína en el sitio objetivo o (c) la masa de la cadena lateral. Los residuos que se presentan naturalmente se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de la cadena lateral: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; 2) hidrofílicos neutrales: Cys, Ser, Thr; « ? 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5) aromáticos: Trp, Tyr, Phe; y 6) residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro.

Las substituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de uno de estos grupos por otro. Dichos residuos substituidos se pueden introducir en regiones de los sTNFRs que por ejemplo, .«son homologas con otros miembros de la familia de receptores NGF/TNF o dentro de las regiones no homologas de la proteína .

Una diversidad de substituciones de amino ácidos o eliminaciones se pueden hacer para modificar o agregar sitios de glicosilación ligados en O ó ligados en N, resultando en una proteína con glicosilación alterada. La secuencia se puede alterar para agregar sitios de glicosilación o para eliminar sitios de glicosilación ligados en O ó ligados en N a partir de los sTNFRs. Un sitio de reconocimiento de glicosilación ligada con aspargina, comprende una secuencia de tripéptido que se reconoce específicamente por sus enzimas de glicosilación celulares apropiadas. Estas secuencias de tripéptidos son ya sea Asn-Xaa-Thr ó Asn-Xaa-Ser, en donde Xaa puede ser cualquier amino ácido diferente a Pro. Los residuos de aspargina probados o pronosticados del inhibidor TNF 30kDa, existen en la posición 14, 105 y 111.

Las mutaciones especificas de las secuencias de los sTNFRs, pueden involucrar la substitución de un amino ácido no original en la terminación amino, terminación carboxi o en. cualquier sitio de la proteína que se modifica por la adición de un carbohidrato ligado con N o ligado con O. Tal modificación puede ser de utilidad particular en la adición de un amino ácido (por ejemplo, cisteína), que es ventajosa para la unión de un polímero soluble en agua para formar un derivado. Por ejemplo, la WO 92/16221 describe la preparación de muteínas sTNFR-I, por ejemplo, en donde un residuo de aspargina en la posición 105 de la proteína humana original se cambia a cisteína (cl05 sTNFR-I) .

En una modalidad específica, un polipéptido variante puede preferiblemente estar sustancialmente homólogo al amino ácido del sTNFR a partir del cual se deriva. El término "substancialmente homólogo" como se usa aquí, significa un grado de homología que está en exceso de un 80%, preferiblemente en exceso de 90%, y más preferiblemente en exceso de 95% o más preferiblemente aún 99%. El porcentaje de homología como se describe aquí, se calcula como el porcentaje de residuos de amino ácido encontrados en la más pequeña de las dos secuencias las cuales se alinean con residuos idénticos de amino ácido en la secuencia que se compara cuando cuatro espacios en una longitud de 100 amino ácidos se pueden introducir para ayudar en aquella alineación, como se establece por Dayhoff (1972), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia. También se incluye dentro del término "substancialmente homólogo", están las variante (s) del sTNFRs las cuales se pueden aislar en virtud de su reactividad cruzada con anticuerpos para las secuencias de amino ácidos de SEC ID NO : 2 y SEC ID NO : 4 o cuyos genes se pueden aislar a través de hibridización con el ADN de la SEC ID NO : 1 y SEC ID NO:3 o con los segmentos de los mismos.

Derivados de Polipéptidos.

Los derivados químicamente modificados de los TNFbp(s) en los cuales la próteína se liga a un polímero con objeto de modificar las propiedades de la proteína (referida aquí como "derivados") , se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Tales derivados se pueden preparar por alguien habilitado en el arte dadas las descripciones incluidas. Los conjugados se pueden preparar usando porciones químicas apropiadas y TNFbp(s) glicosilados , no glicosilados o des-glícosilados . Típicamente las proteínas no glicosiladas y los polímeros solubles en agua se usarán .

Los polímeros solubles en agua son deseables debido a que la proteína a la cual se colocan no se precipitan en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico. Preferiblemente el polímero será farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o composición terapéutica. Alguien habilitado en el arte podrá seleccionar el polímero deseado con base en tales consideraciones como si el conjugado polímero/proteína se usará terapéuticamente y si es así, el perfil terapéutico de la proteína (por ejemplo, duración de la liberaci'pon prolongada, resistencia a la proteolisis; efectos si es que hay, sobre las dosis; actividad biológica, facilidad de manejo; grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua sobre proteínas terapéuticas) .

Apropiadamente, los polímeros solubles en agua clínicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol (PEG), polietilen glicol propionaldehido, copolímeros de etilen glicol/ propilen glicol, monometoxi -polietilen glicol, carboximetilcelulosa, dextran, alcohol polivinílico (PVA), polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3 , 6-trioxano , copolímero del anhídrido etilen/maleico , poli (ß-amino ácidos) (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli (n-vinil pirrolidona ) polietilen glicol, homopolímeros del polipropilen glicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de etileno/óxido de polipropileno, polioles polioxietilados (POG) (por ejemplo, glicerol) y otros polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado o glucosa polioxie t Hada , ácidos colónicos u otros polímeros de carbohidratos, Ficoll o dextran y mezclas de los mismos. Como se usan aquí, el polietilen glicol significa que agrupa cualquiera de las formas que se han utilizado para derivar otras proteínas, tales como mono- (C1-C10 ) alcoxi- ariloxi-polietilen glicol. El polietilen glicol., propionaldehido puede tener ventajas en la manufactura debido a su estabilidad en agua .

Los polímeros solubles en agua cada uno puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o sin ramificar. Generalmente, entre mayor es el peso molecular o mayores las ramificaciones, mayor la relación de polímero : proteína . Los polímeros solubles en agua cada uno típicamente tienen un pes'o molecular promedio de entre alrededor de 2kDa hasta alrededor de 100 kDa (el término "alrededor" indica que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido) . El peso molecular promedio de cada polímero soluble en agua preferiblemente está entre 5kDa y alrededor de 40 kDa, más preferiblemente entre alrededor de lOkDa y alrededor de 35kDa y lo más preferiblemente entre alrededor de 15kDa y alrededor de 30 kDa.

Existe una diversidad de métodos de colocación disponibles para aquellos hábiles en el arte, incluyendo reacciones de acilación o reacciones de alquilación (preferiblemente para generar una proteína de terminal amino químicamente modificada) con una molécula reactiva soluble en agua. Ver por ejemplo, EP 0 401 384; Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2) :4-10, publicada por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lañe, Londres N20 OLD, Reino Unido; EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; WO 95/13312; WO 96/11953; WO 96/19459 y WO 96/19459 y las otras publicaciones aquí citadas que se relacionan con la pegilación, las descripciones de las cuales se incroporan aquí como referencia.

Una modalidad específica de la presente invención, es una molécula de aldehido no ramificado de monomet oxi-polietilen glicol que tiene un peso molecular promedio de ya sea alrededor de 20kDa o alrededor de 33 kDa (por ejemplo, entre 30 kDa y 35 kDá) , o un aldehido de butil terciario y polietilen 'glicol que tiene un peso molecular promnedio de alrededor de 33 kDa ( por ejemplo, entre 30 kDa y 35 kDa) conjugado por medio de alquilación reductiva hasta los TNFbp(s) .

La pegilación también puede llevarse a cabo específicamente utilizando polímeros solubles en agua que tienen al menos un grupo hidroxi reactivo (por ejemplo, polietilen glicol) . El polímero soluble en agua puede reaccionar con un grupo activante, formando por lo tanto un "e?lazador activado" útil en la modificación de diversas proteínas. Los enlazadores funcionales pueden ser monofuncionales, bif ncionales o multifuncionales.

Los grupos activantes que se pueden usar para enlazar el polímero soluble en agua a dos o más proteínas incluye los siguientes: sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Los reactivos útiles que tienen un grupo sulfona reactivo que se pueden usar en los métodos incluyen, sin limitación, clorosulfona , vinilsulfona y divinilsulfona . Estos derivados de PEG son estables contra la hidrólisis por periodos prolongados en medios acuosos a pHs de alrededor de 11 o menos, y pueden formar enlaces con moléculas para formar conjugados que son también hidrolíticamente estables. Dos derivados homofuncionales particularmente útiles son el PEG-bis-clorosulfona y el PEG-bis-vinilsul fona (WO 95/13312) .

La WO 97/14003, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia, enseña métodos para elaborar enlaces activados por sulfona mediante la obtención de un compuesto que tiene un grupo hidroxilo reactivo y que convierte el grupo hidroxilo a un aceptador reactivo de Michael para formar un enlace activado, con el uso del tetrahidrofurano (THF) como el solvente para la conversión. La solicitud también enseña un proceso para la purificación de los enalces activados el cual utiliza cromatografía de interacción hidrofóbica para separar los enlaces con base en el tamaño y funcionalidad del grupo terminal.

Formas Polivalentes Las formas polivalentes, 'esto es, moléculas que comprenden más de una 'porción activa, se pueden construir. En una modalidad, la molécula puede poseer sitios múltiples de unión del factor de tumor de necrosis para el ligando TNF. Adicionalmente, la molécula puede poseer al menos un sitios de unión del factor de tumor de necrosis y dependiendo de la característica deseada de la forma polivalente, al menos un sitio de otra molécula (por ejemplo, un TNFbp(s) ) , y un antagonista receptor de interleucina-1 ("IL-lra") como se describe abajo) .

En una modalidad, se puede construir la forma polivalente por ejemplo, mediante el acoplamiento químico de al menos un TNFbp(s) y otra porción con algún enlazador clínicamente aceptado (por ejemplo, un polímero soluble en agua) . En principio, el enlazador no debe impartir nueva inmunogenicidad ni por virtud de los nuevos residuos de amino ácidos, alterar la afinidad hidrofóbica y el balance de cargas de la estructura, lo cual afecta su biodistribución y espaciamiento.

Los polímeros solubles en agua pueden ser, con base en los monómeros aquí enlistados, homopolímeros, copolímeros de bloque o aleatorios, terpolímeros de cadena recta o ramificada, substituidos o no substituidos. El polímero puede ser de cualquier longitud o peso molecular, pero estas características pueden afectar las propiedades biológicas. Los pesos moleculares promedio de polímero particularmente útiles para disminuir las velocidades de espaciamiento en aplicaciones farmacéuticas, están en el rango de 2,000 a 35,000 daltones. Además, la longitud del polímero puede variarse para optimizar o conferir la actividad biológica deseada.

Las porciones activas pueden enlazarse usando técnicas convencionales de acoplamientos (ver la WO 92/16221, WO 95/13312 y WO 95/34326, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Por ejemplo, las patentes WO 92/16221 y WO 95/34326 describen la preparación de diversas moléculas dimerizadas de sTNFR-I, por ejemplo, sTNFR-I cl05 dimerizado.

Alternativamente, una molécula divalente puede consistir de dos repeticiones en tándem de sTNFRs separadas por una región enlazantes de polipéptidos. El diseño de los enlaces de polipéptidos es similar en diseño a la inserción de secuencias de circuito corto entre dominios en el diseño de n o vo de proteínas (Mutter (1988) , TIBS, 13: 260-265 y Regan y DeGrado (1988), Science, 241:976-978, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Varias construcciones de enlazantes diferentes se han ensamblado y muestran ser útiles para formar anticuerpos de cadena simple; los enlaces más funcionales varían en tamaño desde 12 hasta 25 amino ácidos (los amino ácidos tienen grupos laterales no reactivos, por ejemplo, alanina, serina y glicina), los cuales juntos constituyen una secuencia hidrofílica, tienen unos cuantos residuos opuestamente cargados para aumentar la solubilidad y son flexibles (Whitlow y Filpula (1991), Métodos: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105; y Brigido etal . (1993), J. Immunol . , 150:469-479, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Se ha demostrado que un enlazante apropiado para anticuerpos de cadena simple, es efectivo para producir una forma dimérica "del sTNFR-II humano (Nevé et al. (1996), Cytokihe, 8 ( 5 ) : 365-370 , la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia ) .

Adicionalmente, un TNFbp(s) puede estar químicamente acoplado a la biotina, y el conjugado resultante puede entonces permitirse enlazar a la avidina, resultando en moléculas de avidina/biotina/TNFbp (s ) tetravalentes. Un TNFbp(s) también puede estar covalentemente acoplado a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los conjugados resultantes precipitados con anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméricos .

En todavía otra modalidad, las porteínas recombinantes de fusión, pueden producirse en donde cada molécula quimérica recombinante tiene una secuencia TNFbp(s) terminalmente en amino o terminalmente en carboxi fusionada con todo o parte de los dominios constantes, pero al menos un dominio constante, de la cadena ligera o peasada de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, una proteína de fusión quimérica TNFbp ( s ) /IgGl (o IgGl /TNFbp ( s ) ) se puede producir a partir de un gen quimérico que contiene una cadena ligera: una quimera de cadena ligera kappa TNFbp ( s ) /humana (TNFbp ( s ) /Ck) o una cadena ligera kappa humana/quimera TNFbp (s) ( Ck/TNFbp ( s ) ) ; o un gen quimérico que contiene una cadena pesada: una quimera de cadena pesada gama-1 TNFbp ( s ) /humama (TNFbp ( s ) /Cg-1 ) o una cadena pesada humana gama- 1/quimera TNFbp (s) (Cg-1/TNFbp ( s ) ) . Siguiendo la transcripción y traducción de un gene quimérico de cadena pesada, o de un gene que contiene una cadena ligera y un gene quimérico de , cadena pesada, los productos de gene pueden ser ensamblados en una molécula quimérica simple que tiene un TNFbp(s) desplegado en forma bivalente. Los detalles adicionales relacionados con la construcción de dichas moléculas diméricas, se describen en la patente de los Estados Unidos 5,116,964, WO 89/09622, WO 91/16437 y EP 315062, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencias.

En todavía otra modalidad, las proteínas recombinantes de fusión también se pueden producir en donde cada molécula quimérica recombinante tiene al menos un TNFbp (s) como aquí se describe, y al menos una porción de la región 186-401 de osteoprotogerina , como se describe en la Solicitud de Patente Europea No. 96309363.8, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencias. Ya sea los TNFbp(s) o la porción de osteoprotogerina pueden estar en la terminación amino o la terminación carboxi de la molécula quimérica Síntesis de los TNFbp(s) .

La producción de los TNFbp (s) se describe en mayor detalle debajo. Tales proteínas se pueden preparar por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o por síntesis química in vitro.

Polinucleótidos Con base en la presente descripción y usando la .tabla universal de codones, alguien con habilidad ordinaria en el arte puede fácilmente determinar todas las secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de, amino ácido de los TNFbp (s) .

Las técnicas de expresión recombinantes llevadas a cabo de conformidad con las descripciones establecidas abajo, pueden seguirse para producir cada uno de tales polinucleótidos y para expresar las proteínas codificadas. Por ejemplo, al insertar una secuencia de ácido nucleico que codifica un TNFbp (s) dentro de un vector apropiado, alguien con habilidad en el arte puede producir fácilmente grandes cantidades de lka secuencia deseada de nucleótidos. Las secuencias se pueden usar después para generar sondas de detección o primarios de amplificación. Alternativamente, un polinucleótido que codifica un TNFbp (s) se puede insertar dentro de un vector de expresión. Al introducir el vector de expresión dentro de un huésped apropiado, la proteína deseada se puede producir en grandes cantidades.

Como se describe además aquí, existen diversos sistemas vector/huésped disponibles para la propagación de las secuencias deseadas de ácido nucleico y/o la producción de las proteínas deseadas. Estas incluyen pero no se limitan a, plásmidos, vectores insercionales o virales, y huéspedes procarióticos y eucarióticos . Alguien con habilidad en el arte puede adaptar un sistema huésped/vector que sea capaz de propagar o expresar ADN heterólogo para producir o expresar las secuencias de la presente invención.

Además, se apreciará por aquellos hábiles en el arte que, en vista de la presente descripción, las secuencias de ácido nucleico dentro del alcance de la presente invención incluyen los ácidos nucleicos de las Figuras 1 y 3, así como secuencias degeneradas de ácido nucleico de las mismas, secuencias de ácido nucleico que codifican la (s) variante(s) de los sTNFRs, y aquellas secuencias de ácido nucleico que hibridizan a los complementos de los ácidos nucleicos de las Figuras 1 y 3 bajo condiciones de hibridización, o condiciones equivalentes a las mismas, descritas en la sección de tamizado de la colección ed cADN aba j o .

También se proporcionan con la presente invención las construcciones de ADN recombinante que involucran al vector ADN junto con las secuencias de ADN que codifican las proteínas deseadas. En cada una de tales construcciones de ADN, la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada (con o sin péptidos de señal) está en asociación operativa con un control de expresión apropiado o secuencia regulatoria capaz de dirigir la replicación y/o la expresión de la proteina deseada en un huésped seleccionado.

Expresión Recombinante.

Preparación de Polinucleótidos.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un TNFbp (s) se puede obtener fácilmente en una diversidad de formas incluyendo sin limitación, la síntesis química, tamizado de colección genómica o de cADN, tamizado de la colección de expresión y/o amplificación de PCR del cADN. Estos métodos y otros que son útiles para el aislamiento de tales secuencias de ácido nucleico se establecen en Sambrook et ai. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual,. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habror, NY; por Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Prótocols Press; y por Berger y Kimmel (1987), Me'thods inEnzymology : Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, Ca, Las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.

La síntesis química de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada se puede llevar a cabo usando métodos bien conocidos en el arte, tales como aquellos establecidos por Engels et al., (1989), Ange w . Ch em . In t l . Ed . , 28:716-734 y Wells et al. (1985), Gene 34:315, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. Estos métodos incluyen, in ter a l i a , métodos del fos fot riés ter , fos foramidi ta y H-fosfonato de la síntesis de la secuencia de ácido nucleico. Las grandes secuencias de ácido nucleico por ejemplo, aquellas más grandes que alrededor de 100 nucleótidos en longitud, se pueden sintetizar como diversos fragmentos. Los fragmentos se pueden ligar juntos para formar una secuencia apropiada de ácido nucleico. Un método preferido es la spintesis soportada de polímeros usando la química normal de la fosforamidi ta .

Alternativamente, una secuencia apropiada de ácido nucleico, se puede obtener mediante el tamizado de una colección apropiada de cADN (esto es, una colección preparada a partir de una o más fuentes de tejidos que se cree que expresan la proteína) o una colección genómica (una colección preparada a partir del ADN genómico total) . La fuente de la colección del cADN es típicamente una fuente de tejido o célula de alguna especie que se cree expresa una proteína deseada en cantidades razonables. La fuente de la colección genómica puede ser cualquier tejido o tejidos de algún mamífero u otras especies que se cree que alojen un gene que codifique la proteína deseada.

Cada medio de hibridi zación se puede tamizar para la presencia de un ADN que codifica una proteína deseada usando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, fragmentos de cADN o de ADN genómico que poseen un nivel aceptable de homología con el cADN o el gene a ser clonado) que se hibridizarán selectivamente con el cADN(s) o gene (s) presente(s) en la colección. Las sondas típicamente usadas para dichos tamizados codifican una región pequeña de especies iguales o similares que las especies de las cuales la colección es preparada. Alternativamente, las sondas se pueden degenerar como aquí se discute.

La hibridización se lleva a cabo típicamente mediante el ablandamiento de la sonda de oligonucleótido o cADN a los clones, bajo condiciones de astringencia que evitan el enlace no específico pero permiten el enlace de aquellos clones que tienen un nivel significativo de homología con la sonda o primario. Las condiciones típicas de hibridizacipon y astringencia de lavada dependen en parte del tamaño (esto es, el número de nucleótidos en longitud) de la sonda de cADN o oligonucleótido y de si la sonda está degenerada. La probabilidad de identificar un clon también se considera al diseñar el medio de hibridización (por ejemplo, si una colección genómica o cADN está siendo tamizado) .

En donde un fragmento de ADN (tal como el cADN) se usa comouna sonda, las condiciones típicas de hibridización 'incluyen aquellas establecidas en Ausubel et "al. (1994), supra. Después de la hibridi zaci'ón , el medio de hibridización se lava hasta una astringencia apropiada, dependiendo de los diversos factores tales como el tamaño de la sonda, la homología esperada de la sonda al clon, el medio de hibridización que se está tamizando, el número de clones que se está tamizando y similares.

Las condiciones ejemplares de hibridización astringente son la hibridización en 6 x SSC a 62-67 C, seguida por lavado en 0.1 x SSC a 62-67 C durante aproximadamente una hora. Alternativamente, las condiciones de hibridización astringente ejemplares son la hibridización a 45-55% de formamida, 6 x SSC a 40-45 C, seguida por lavado en 0.1 x SSC a 62-67 C durante aproximadamente una hora. También incluidas están las secuencias de ADN las cuales se hibridizan a las secuencias de ácido nucleico establecidas en las Figuras 1 y 3 bajo condiciones relajadas de hibridización y las cuales codifican un TNFbp (s) . Ejemplos de tales condiciones de hibridización de astringencia relajada son 6 x SSC a 45-55 C o hibridización con 30-40% de formamida a 40-45 C, seguida por lavado en 1-2 x SSC a 55 C durante aproximadamente 30 minutos. Ver Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a la 389, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia.

Existen también protocolos ejemplares de condiciones astringentes de lavado en donde las sondas de oligonucleótido se usan para tamizar los medios de hibridización. Por ejemplo, un primer protocolo utiliza 6 x SSC con 0.05 por ciento de pirofosfato de sodio a una temperatura de entre alrededor de 35 C y 63 C, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las sondas de base 14 se lavan a 35-40 C, las sondas de base 17 a 45-50 C, las sondas de base 20 a 52-57 C y las sondas de base 23 a 57-63 C. La temperatura se puede incrementar 2-3 C en donde el enlace no específico de respaldo aparezca alto. Un segundo protocolo utiliza cloruro de tetrametil amonio (TMAC) para lavado. Una de tales soluciones astringentes de lavado es el TMAC 3 M, 50 mM tris-HCl, pH 8.0 y 0.2% SDS.

Otro método para obtener una secuencia apropiada de ácido nucleico que codifica un TNFbp (s) es la reacción de cadena de polimerasa (PCR) . En este método, el cADN se prepara a partir de poli (A) +ARN o ARN total usando la transcriptasa de enzimas inversas. Los dos primarios, típicamente complementarios a las dos regiones separadas de cADN (oligonucleótidos) que codifican la proteína deseada, se agregan después al cADN junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq y la polimerasa amplifica la región de cADN entre los dos primarios.

Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas o primarios, deben ser de longitud adecuada y suficientemente no ambiguas de manera de minimizar la cantidad de enlace no específico que puede ocurrir durante el tamizado o amplificación PCR. La secuencia actual de las sondas o primarios, se basa usualmente en secuencias o regiones altamente homologas o conservadas. Opcionalmente, las sondas oprimarios pueden estar completamente o parcialmente degenerados, esto es, pueden contener una mezcla de sondas /primarios , todos codificando la misma secuencia de amino ácidos pero usando codones diferentes para hacerlo. Una Alternativa para la preparación de sondas degeneradas es colocar una inosina en algunas o en todas las posiciones de codones que varían por especies. Las sondas de oligonucleótidos o primarios, se pueden preparar mediante métodos de síntesis química para el ADN como aquí se describe.

Vectores El ADN que codifica las proteínas deseadas puede estar insertado dentro de vectores para un clonado adicional (amplificación del ADN) o para expresión. Los vectores apropiados están comercialmente disponibles o pueden construirse específicamente. La selección o construcción de un vector apropiado dependerá de (1) si se va a usar para la amplificación del ADN o para la expresión del ADN, ( 2 ) el tamaño del ADN a insertarse dentro del vector y (3) la célula huésped pretendida a transformarse con el vector.

Los vectores cada uno implica típicamente una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada ligada operativamente a uno o más de las siguientes secuencias regulatorias o de control de expresión, capaces de dirigir, controlar o de otra manera efectuar la expresión de una proteína deseada mediante una célula huésped seleccionada. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación del ADN o expresión del ADN) y su compatibilidad con la célula huésped pretendida. Los componentes del vectorgeneralmenteincluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una señal de secuencia, un origen de replicación, uno o más genes marcadores o de selección, un promotor, un elemento enriquecedor , una secuencia de transcripción de terminación y similares. Estos componentes se pueden obtener de fuentes naturales o sintetizarse mediante procedimientos conocidos.

Ejemplos de los vectores apropiados procarióticos clonantes incluyen bacteriófagos tales como los derivados lambda, o plásmidos de la E. Coli (por ejemplo, pBR322, col El, pUC, los derivados del factor F y del plásmido Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Otros vectores de expresión apropiados, de los cuales se conocen numerosos tipos en el arte para las células huésped descritas abajo, se pueden también usar para este propósito.

Secuencia de Señal El ácido nucleico que codifica una señal de secuencia, se puede insertar 5' de la secuencia que codifica una proteína deseada, por ejemplo, puede ser un componente de un vector o puede ser parte de un ácido nucleico que codifica la proteína deseada. Los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de la señal original de los sTNFRs, se conocen (EP 393 438, EP 422 339) y WO 96/28546, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) .

Origen de la Replicación.

Los vectores de expresión y clonación, generalmente incluyen cada uno una secuencia de aácido nucleico que permite , que el vector se replique en una o más , células huésped seleccionadas. En un vector clonante, esta secuencia es típicamente una" que permite que el vector se replique independientemente del ADN de cromosoma huésped e incluye un origen de replicación o una secuencia replicante autónoma. Tales secuencias son bien conocidas. El origen de la replicación a partir del plásmido pBR322, es apropiada para la mayoría de las bacterias Gram negativas, y diversos orígenes (por ejemplo, Virus de Simio 40 (SV40), polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores en las células de mamíferos. Generalmente, el origen de la replicación no se necesita para los vectores de expresión en mamíferos (por ejemplo, el origen SV40 se usa a menudo solamente porque contiene al promotor temprano) .

Gene de Selección.

Los vectores de expresión y clonación contienen cada uno típicamente un gene de selección. Este gene codifica una proteína "marcadora" necesaria para la sobrevivencia o crecimiento de las células huésped trasnfromadas cuando crecen en medios de cultivo selectivos . Las células uésped que no se trasnforman con el vector no contendrán el gene de selección y por lo tanto, no sobrevivirán en los medios de cultivo. Los genes típicos de selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, amplicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) las deficiencias auxotrópicas del complemento; ó (c) proporcionar nutrientes críticos no disponibles de los medios de cultivo.

Otros genes de selección sepueden usar para amplificar los genes a expresarse. La amplificación es el proceso en donde los genes que tienen una mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento, se repiten en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de los marcadores seleccionables apropiados para células de mamíferos incluyen reductasa de dihidrofolato (DHFR) y quinasa de timidina. Los transformantes de célula se colocan bajo presión de selección a la cual solamente los transformantes se adaptan particularmente para sobrevivir en virtud del marcador que está presente en el vector. La presión de selección se impone al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en los medios se cambia sucesivamente, conduciendo por lo tanto a la amplificación de ambos, el gene de selección y el ADN que codifica la proteína deseada. Como resultado, las cantidades en aumento de la proteína deseada se sintetizan a partir del ADN amplificado .

Por ejemplo, las células transformadas con el gene de selección del DHFR se identifican primero al cultivar todos los transformantes en medios de cultivo que contienen metotrexato, un antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped apropiada cuando DHFR de tipo silvestre se usa, es la línea de célula del ovario del hámster chino deficiente en actividad del DHFR (Urlaub y Chasin (1980), Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 77 ( 7 ) : 4216-4220 , la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) . Las células transformadas se exponen entonces a niveles en aumento de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de copias múltiples del gene de DHFR y concomítantemente , copias múltiples de otros ADN presentes en el vector de expresión, tal como el ADN que codifica una proteína deseada.

Promotor .

Los vectores de expresión y clonación cada uno, contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y está ligado probablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína deseada. Un promotor es una secuencia no traducida localizada corriente arriba (5' ) del codon de partida de un gene estructural (generalmente dentro de alrededor de 100 hasta 1000 bp ) que controla la transcricpión y traducción de una secuencia particular de ácido nucleico. Un promotor puede estar convencionalmente agrupado dentro de una de dos calses, promotores inducibles y promotores constitutivos. Un promotor inducible, inicia niveles en aumento de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos . Un promotor puede estar ligado operativamente al ADN que codifica una proteína deseada al eliminar el promotor del ADN de fuente mediante digestión de enzimas de restricción e insertar la secuencia deseada del promotor. Las secuencias originales del promotor de sTNFRs, se pueden usar para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN que codifica una proteína deseada. Un promotor heterólogo se prefiere sin embargo, si permite una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína expresada, en comparación con el promotor original y si es compatible con el sistema de célula huésped que se ha seleccionado para uso. Por ejemplo, cualquiera de las secuencias originales promotoras de otros miembros de la familia de receptores NGF/TNF, se pueden usar para la amplificación directa y/o la expresión del ADN que codifica una proteína deseada.

Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen la beta-lactamasa y sistemas promotores de la lactosa; fosfotasa alcalina; un sistema promotor de triptofano (trp), un sistema de genes de luminiscencia bacteriana (luxR) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos también son apropiados. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo por lo tanto que alguien con habilidad en el arte ligue cada secuencia seleccionada a la secuencia de ADN deseada usando enlaces o adaptadores como se necesiten para suministrar algunos sitios requeridos de restricción.

Las secuencias apropiadas de promotores para su uso con los huéspedes de levadura, son también bien conocidas en el arte. Los promotores apropiados para su uso con cpelulas huésped de mamíferos son bien conocidos e incluyen aquellos obtenidos de los genomas de viruses tales como el virus de polioma, virus de la viruela de aves, adenovirus (tal como el denovirus 2), virus de papiloma de bovino, virus del sarcoma de aves, citomegalovirus y retrovirus, virus de la hepatitis B, más preferiblemente SV 40. Otros promotores de mamíferos apropiados incluyen promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico, y el promotor de actina .

Elemento Enriquecedor.

Los vectores de clonación y expresión contendrán cada uno típicamente una secuencia de enriquecedor para aumentar la transcripción por eucariotas superiores de una secuencia de ADN que codifique una proteína deseada. Los enriquecedores son elementos de acción cis del ADN, usualmente desde alrededor de 10-300 bp en longitud, que actúan sobre el promotor para incrementar su transcripción. Los enriquecedores son relativamente independientes de la orientación y la posición. Se han encontrado 5' y 3' a la unidad de transcripción. Los enriquecedores de levadura se usan ventajosamente con los promotores de levadura. Se conocen diversas secuencias de enriquecedores disponibles de genes de mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . Adicionalmente los enriquecedores virales tales como el enriquecedor SV40, el enriquecedor del promotor temparno del citomegalovirus, el enriquecedor de polioma y los enriquecedores de adenovirus son elementos enriquecedores ejemplares para la activación de los promotores eucarióticos. Mientras que un enriquecedor se puede empalmar con un vector en la posición 5' ó 3' a un ADN que codifica la proteína deseada, se localiza típicamente en el sitio 5' del promotor.

Terminación de la Transcripción.

Los vectores de expresión usados en las células huésped eucarióticas, cada uno contendrá típicamente una secuencia necesaria p^ra la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARN . Tales secuencias estánn comúnmente disponibles desde las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de ADNs y cADNs eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porciónno traducida del mARN que codifica una porteína deseada.

Construcción del Vector.

La construcción de un vector apropiado que contiene uno o más de los compuestos aquí enlistados (junto con la secuencia de codificación deseada) puede llevarse a cabo mediante técnicas normales de ligazón. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN son cleaved, ajustados y vueltos a ligar en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la secuencia correcta, la mezcla de ligazón se puede usar para transformar E. Coli., y los transformantes exitosos se pueden seleccionar mediante técnicas conocidas como aquí se describe. Las cantidades de vector de los transformantes se preparan después, se analizan por digestión de endonucleasas de restricción y/o secuenciadas para confirmar la presencia de la construcción deseada.

Un vector que proporciona la expresión transitoria del ADN que codifica una proteína deseada en células de mamíferos, también se puede usar. En general, la expresión transitoria involucra el uso de un vector de expresión que es capaz de replicar eficientemente en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula diversas copias del vector de expresión y a su vez, sintetiza altos niveles de la proteína deseada codificada por el vector de expresión. Cada sistema transitorio de xpresión, comprende un vector de expresión apropiado y una célula huésped, permite la identificación positiva conveniente de proteínas codificadas por ADNs clonados, así como para el tamizado rápido de tales proteínas para propiedades biológicas y fisiológicas deseadas.

Células Huésped.

Cualquiera de una variedad de células huésped recombinantes, cada una de las cuales contiene una secuencia de ácido nucleico para usarse en la expresión de la proteína deseada, también se proporciona mediante la presente invención. Las células huésped eucarióticas y procarióticas ejemplares incluyen células bacterianas, de mamíferos, de hongos, de insectos, levaduras o de plantas .

Las células huésped procarióticas incluyen pero no se limitan a, eubacterias tales como organismos Gram negativos o Gram positivos (por ejemplo, E. Coli (HB101, DH5a, DH10 y MC1061); Bacilli spp. Tal como B. Subtilis; Pseudomonas spp tales como p. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella spp., tal como s. Typhimurium; o Serratia spp. Tal como S. Marcescans. En una modalidad específica, una proteína deseada se puede expresar en E. Coli.

Además de las células huésped procarióticas, se puede expresar la TNFbp (s) en forma glicosilada mediante alguna de una cantidad de células huésped apropiadas derivadas de organismos multicelulares. Tales células huésped son capaces de actividades de un procesamiento complejo y de glicosilación. En principio, cualquier cultivo de células superiores eucarióticas puede ser usado, ya sea que dicho cultivo involucre células de vertebrados o invertebrados, incluyendo células de insectos y plantas. Microbios eucarióticos tales como hongos cepasos o levaduras pueden ser huéspedes apropiados para la expresión de una proteína deseada. La Sa ccharomyces cerevisia e o levadura común de panadería, es la más comúnmente usadaentre los microorganismos huésped inferiores eucarióticos, pero una diversidad de otros géneros, especies y cepas son bien conocidos y comúnmente disponibles .

Se pueden usar las células de vertebrados ya que la propagación de las células de vertebrados en cultivos (cultivo de tejidos) es un procedimiento bien conocido. Ejemplos de las líneas de células huésped útiles de mamíferos incluyen pero no se limitan a, línea de riñon de simios transformada por la línea de riñon embriónico humano SV40 (COS-7) (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivos de suspensión) , células de riñon de hámster recién nacido y células de ovario de hámster chino. Otras líneas de células de mamíferos apropiadas incluyen pero no se limitan a, HeLa, células de ratón L-929, líneas 3T3 derivadas a partir de ratones suizos, Balb-c ó NIH, y líneas de células de hámster BHK ó HaK. En una modalidad específica, se puede expresar una proteína deseada en células COS o en células de baculovirus .

Una célula huésped puede ser transfectada y preferiblemente transformada con un ácido nucleico deseado bajo condiciones apropiadas que permitan la expresión del ácido nucleico. La selección de células huésped apropiadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, tamizado y producción de producto y purificación son bien conocidos en el arte (Gething y Sambrook (1981), Nature, 293:620-625 o alternativamente, Kaufman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5 ( 7 ) : 1750-1759 , o la patente U.S. No. 4,419,446, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Por ejemplo, para células de mamíferos sin paredes de células, se puede usar el método de precipitación de fosfato de calcio. Se pueden usar también la electroporación, micro-inyección y otras técnicas conocidas.

También es posible que una proteína deseada se pueda producir mediante la recombinación homologa o con métodos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos dentro de células que ya contienen el ADN que codifica una proteína deseada. La recombinación homologa es una técnica originalmente desarrollada para buscar genes objetivo para inducir o corregir mutaciones en los genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati (1989), Prog. In Nucí. Acid Res. and Mol. Biol., 36:301, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) . La técnica básica se desarrolló como un método para introducir mutaciones específicas dentro de regiones específicas del genoma de mamíferos /Thomas et al. (1986), Cell, 44:419-428; Thomas y Capecchi (1987), Cell, 51:503-512 y Doetschman et al. (1988), Proc. Nati. Acad. Sci., 85:8583-8587, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia) o para corregir las mutaciones específicas dentro de los genes defectuosos (Doetschman et al. (1987), Nature, 330:576-578, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) . Las técnicas ejemplares se describen en la patente U.S. No. 5,272,071; WO 92/01069; Wo 93/03183; WO 94/12650 y WO 94/31560, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.

Cultivo de las Células Huésped El método para cultivar cada una o más células huésped recombinantes para la producción, variará dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento óptimo de producción para una situación dada será aparente para aquellos con habilidad en el arte mediante una experimentación mínima. Dichas células huésped recombinantes se cultivan en medios apropiados y la proteína expresada después se recupera, aisla y purifica opcionalmente de los medios de cultivo (o de la célula si se expresa int racelularmente ) mediante medios apropiados conocidos por aquellos hábiles en el arte .

Específicamente, cada una de las células recombinantes usadas para producir una proteína deseada se pueden cultivar en medios de cultivo apropiados para inducir promotores, seleccionando células huésped recombinantes apropiadas o amplificando el gene codificador de la proteína deseada. Los medios de cultivo se pueden suplementar como sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor del crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), soluciones amortiguadoras (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como la gentamicina ) , elementos de rastreo (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa u otra fuente de energía. Se pueden incluir otros suplementos a concentraciones apropiadas, como se apreciará por aquellos hábiles en el arte. Las condiciones apropiadas de cultivo tales como temperatura, pH y similares son también bien conocidas en el arte para su uso con las células huésped seleccionadas.

El producto resultante de la expresión puede después purificarse hasta casi la homogeneidad mediante el uso de procedimientos conocidos en el arte. Las técnicas de purificación ejemplares se enseñan en la patente EP 393 438 y EP 422 339, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.

Composiciones Farmacéuticas La presente invención agrupa composiciones farmacéuticas, cada una conteniendo cantidades terapéutica o profilácticamente efectivas de un TNFbp (s) o un derivado químicamente modificado del mismo (colectivamente, "producto (s) TNFbp") en combinación con un vehículo. El vehículo preferiblemente incluye uno o más materiales de' formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptables en combinación con el (los) Producto(s) TNFbp.

El solvente primario en un vehículo puede ser acuoso o no acuoso en naturaleza. Además, elvehículo puede contener excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH preferiblemente entre 5-6.5, y más preferiblemente entre 5.5-6.0 (por ejemplo, soluciones amortiguadoras tales como citratos o fosfatos, y amino ácidos tales como glicina); viscosidad; claridad; color; esterilidad; estabilidad (por ejemplo, sacarosa o sorbitol) ; * ? olor; velocidad de disolución (por ejemplo, solubilizadores o agentes solubilizantes tales como alcoholes, polietilen glicoles y cloruro de sodio) ; rapidez de liberación; así como agentes de volumen para formulación liofilizada (por ejemplo, manitol y glicina) ; tensoactivos (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80, tritón y plurónicos); antioxidantes (por ejemplo, sulfito de sodio y sulfito ácido de sodio); conservadores (por ejemplo, ácido benzoico y ácido salicílico); agentes saborizantes y diluyentes; agentes emulsificantes; agentes ed suspensión; solventes; rellenos; vehículos de suministro y otros adyuvantes y/o excipientes farmacéuticos. Otras formas de administración efectiva tales coimo formulaciones parenterales de liberación lenta, nebulizaciones inhalantes, formulaciones oralmente activas o supositorios, también son vislumbradas. La composición pueede también involucrarpreparaciones particulares de compuestos poliméricos tales como polímeros de erosión en masa (por ejemplo, ácido poli ( láctic-co-glicólico ) copolímeros (PLGA), mezclas de polímeros PLGA, copolímeros de bloque de PEG, y ácido láctico y glicólico, poli ( cianoacrilatos )) ; polímeros de erosión de superficie (por ejemplo, poli (anhídridos ) y poli (orto esteres)); esteres de hidrogel (por ejemplo, polioles plurónicos, poli (alcohol vinílico), poli ( vinilpirrolidona ) , copolímeros del éter alquil vinil o-anhidrido maleico, celulosa, derivados edl ácido hialurónico, alginato, colágeno, gelatina, albúmina, y almidones y dextranos) y sistemas de composiciones de los mismos; ' o preparaciones de liposomas o microesferas. "Tales composiciones pueden influenciar el estado 'físico, estabilidad, rapidez de la liberación in vi vo, y rapidez del espaciamiento in vi vo de las proteínas y derivados actuales. La formulación farmacéutica óptima para una proteína deseada se determinará por alguien hábil en el arte dependiendo de la ruta de administración y de la dosis deseada. Las composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. 18a (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; Leone-Bay et al. (1995), Journal of Medicine Chemistry, 38:4263-4269; Haas, et al. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1) :93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 y WO 94/21235, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.

Las composiciones específicas de liberación sostenida están disponibles de los siguientes proveedores: Depotech (DepofoamTM, una liposoma muí tivescicular ) y Alkermes (ProLeaseTM, una microesfera de PLGA) . Formas ejemplares de hialuronano se describen en Peyron y Balazs (1974), Path. Biol., 22 ( 8 ) : 731 -736 ; Isdale et al. (1991), J. Drug. Dev., 4(2) :93-99; Larsen et al. i (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129-1134; Namiki, et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20 ( 11 ) : 501-507 ; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Reléase, 35:67-72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4:99- 110; Sakakibara et al. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299:282-292; Meyers y Brandt (1995), 22 ( 9 ) : 1732-1739 ; Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand, 66 ( 266 ) : 116-120 ; Cascone et al. (1995), Biomaterials , 16(7) :569-574; Yerashalmi et al. (1994), archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2) :267-273; Bernatchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials research, 27 ( 5 ) : 677-681 ; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(l) :38-43; Gomobotz y Petít (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; patentes americanas U.S. 4,582,865, 4,605,691, 4,636,524, 4,713,448, 4,716,154, 4,716,224, 4,772,419, 4,851,521, 4,957,774, 4,863,907, 5,128,326, 5,202,431, 5,336,767, 5,356,883; Solicitud de patente europea Nos. 0 507 604 A2 y 0 718 312 A2 ; y WO 96/05845, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. Las composiciones específicas de hialuronano están disponibles de los siguientes proveedores: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (SynviscTM, una mezcla 90:10 de un fluido de hilano y un gel de hilano); Fidia S.p.A., Abano Terme, Italia (Hyalgan™, la sal de sodio de un ácido hialurónico derivado de la cresta del gallo (500,000 hasta 700,000 PM) ) ; Kaken Pharmacuetical Co., Ltd., Tokio, Japón (Artz™, una solución al 1% de un ácido hialurónico derivado de la cresta del gallo 700,000 PM); Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia (Healon™, un ácido hialurónico derivado de la cresta del gallo, 4 x 106 PM) ; Genzyme Corporation, Cambridge, MA ( SurgicoatTM, un ácido hialurónico recombinante); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Acido Hialurónico FCH, un ácido hialurónico de alto peso molecular (por ejemplo, 1.5-2.2 x 106 PM) ácido hialurónico preparado a partir de cultivos de S trep t o co ccus zooepidemi cus ; Hialuronato de sodio MV, 1.0-1-6 x 106 PM y Hialuronato de sodio LV, 1.5-2.2 x 106 PM) ; Calbiochem-Novabiochem AB , Lautel fingen , Suiza (Acido Hialurónico, sal 'de sodio (número de catálogo 1997 de la compañía "385908) preparado a partir de S trep t oco ccus sp . ) ; Intergen Company, Purchase, NY (un ácido hialurónico derivado de la cresta del gallo, >1 x 106 PM) ; Diosynth Inc., Chicago IL; Amerchol Corp., Edison, NJ y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japón.

Una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo liofilizado o deshidratado. Tales composiciones cada una pueden almacenarse ya sea en una forma fácil de usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiera de reconstitución previa a su administración. En una modalidad específica, la presente invención se dirige a estuches para producir una unidad de administración de dosis simple. Los estuches pueden contener un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Los estuches incluidos dentro del alcance de esta invención son jeringas simples y de muí t i-cámaras pre-llenadas; jeringas ejemplares pre-llenadas (por ejemplo, jeringas líquidas, y liojeringas tales como Lyo-JectR, una liojeringa pre-llenada de cámara dual) están disponibles de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.

Usos El(los) producto(s) TNFbp pueden ser útiles como reactivos de investigación y como agentes de diagnóstico y terapéuticos . De esta manera, el (los) producto (s) TNFbp se pueden usar en ensayos de diagnóstico in vitro y/o in vivo, para cuantificar la cantidad de TNFR-I, sTNFR-I, TNFR-II o sTNFR-II original en una muestra de tejido u órgano o para determinar y/o aislar células que expresan TNF (Scallon et al. (1995) , supra) . En ensayos de tejidos u órganos habrá menos radioactividad desde un(os) producto(s 125 I -TNFbp enl a zado a TNF, en comparación con una curva de enla zado 4 estandarizada de un producto 125I-TNFbp, debido a sTNFR-I ó sTNFR-II originales no etiquetados enlazados al TNF. Similarmente, el uso de un producto (s) 125I-TNFbp se puede usar para detectar la presencia de TNF en diversos tipos de células.

Esta invención también contempla el uso del producto (s) TNFbp en la generación de anticuerpos y los anticuerpos resultantes (específicamente incluyendo aquellos que también se enlazan al sTNFR-I o sTNFR-II original) . Los anticuerpos pueden desarrollarse los cuales enlazan a los producto(s) TNFbp. Alguien con habilidad en el arte puede usar procedimientos publicados bien conocidos para obtener anticuerpos monoclonales y policlonales o anticuerpos recombinantes los cuales reconocen específicamente y enlazan a diversas proteínas codificadas por las secuencias de amino ácidos de la presente invención. Tales anticuerpos pueden usarse después para purificar y caracterizar el sTNFR-I original y el sTNFR-II original o para cuantificar el número de TNFR-I ó TNFR-II expresado sobre una superficie de la célula .

La presente invención también se relaciona con los métodos para el tratamiento de ciertos trastornos y condiciones médicas (muchas de las cuales se pueden caracterizar como trastornos inflamatorias) que son medidadas por el TNF, así como las secuelas relacionadas y síntomas asociados con los mismos. Una. lista no exclusiva de trastornos mediados por TNF. incluyen pero no se limitan a los siguientes: " cachexia/anorexia ; cáncer (por ejemplo, leucemias); síndrome de fatiga crónica; depresión;'' diabetes (p.ej, diabetes mellitus y ataque juvenil del Tipo 1); fibromielgia o analgesia; rechazo de injertos contra huésped; hiperalgesi; trastorno inflamatoria del vientre, isquémico, incluyendo isquemia cerebral (daño cerebral como resultado de un trauma, epilepsia, hemorragia o infarto, cada uno de los cuales conduce a neurodegeneración) ; trastornos del pulmón (por ejemplo, síndrome de dolor respiratorio en adultos y fibrosis pulmonar); esclerosis múltiple; trastornos neuroinflamatorias ; trastornos oculares; dolor; pancreatitis; fibrosis pulmonar; daño por reperfusión; trastornos reumáticos (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa , espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriática, artritis enteropática , polimiositis , dermatpmiositis , escleroderma , esclerosis sistémica, vasculitis, vasculitis cerebral, trastorno de Lyme, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), síndrome de Sjógren's, fiebre reumática, policondritis , y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes); choque séptico; efectos laterales de la terapia de radiación; lupus eritematoso sistémico; trastorno de la unión mandibular temporal, tiroiditis, transplante de tejidos o una condición inflamatoria resultante de daño a los cartílagos, tirones o torceduras, traumas, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de trastorno.

El producto (s) TNFbp se puede administrar a un paciente en cantidades terapéuticamente efectivas para la prevención o tratamiento de los trastornos mediados por TNF incluyendo trastornos reumáticos. El término "paciente" se pretende que agrupe a animales (por ejemplo, gatos, perros y caballos) así como humanos.

El(los) producto(s) se pueden administar por vía tópica, administración enteral o parenteral incluyendo sin limitación, infusión, intraarterial, int raarticular , int racapsular , intracardiaca, intradermal, intramuscular, intraorbital , intratecal, intravenosa, intraperitoneal, intraespinal , inyección intraes ternal , intraventricular , subcutánea, subcuticular , subcapsular, subaracnoide y trans traqueal . El (los) producto(s) TNFbp se pueden también administrar vía administración oral o administrarse a través de membranas de moco, esto es, bucalmente, intranasalmente, rectalmente o sublingualmente por entrega sistémica.

Se prefiere que el producto(s) se administre por vía intraarticular , intramuscular, intravenosa o inyección subcutánea. Adicionalmente, el producto (s) TNFbp se puede administrar por infusión continua (por ejemplo, constante o implantada de forma intermitente o dispositivos moduladores de flujo para infusión externa) de manera de proporcionar continuamente el nivel deseado de producto(s) TNFbp en la sangre para la duración de la administración. Esto se puede llevar a cabo por medio de una mini-bomba tal como una mini-bomba osmótica. En estas formas, uno se puede asegurar de que la cantidad del medicamento se mantiene en el nivel deseado y uno puede tomar muestras de sangre y vigilar la cantidad de medicamento en el torrente sanguíneo. Diversas bombas están comercialmente disponibles por ejemplo, de proveedores como MiniMed Inc., Syl ar, CA (por ejemplo, MT507) y Alza Corp., Palo Alto, CA (por ejemplo, bomba osmótica Alzet, modelo 2MLI) .

También se contempla que otras formas de dosificación continua o casi continua se puedan practicar, Por ejemplo la derivación química puede resultar en formas de liberación prolongada de proteína que tiene el efecto de una presencia continua en el torrente sanguíneo, en cantidades predecibles basadas en un régimen de dosis predeterminada .

Los modos de uso del (los) producto (s) TNFbp para el tratamiento de trastornos mediados por TNF, incluyendo trastornos reumáticos (pe.j., osteoartritis, artritis psoriática y artritis reumatoide) , se establecen en la Solicitud de Patente europea 567566, las enseñanzas de la cual se incorporan aquí como referencia. A manera de ejemplo pero no de limitación, en una modalidad específica, el (los) producto(s) TNFbp se pueden administrar intr-articularmente para el tratamiento de la artritis reumatoide y la osteoar ritis. A manera de ejemplo pero no de limitación en otra modalidad específica, el (los) producto(s) TNFbp se pueden administrar subcutáneamente o int ramuscularmente para el tratamiento de la artritis reumatoide, trastorno inflamatoria del vientre, cachexia/anorexia o esclerosis múltiple. A manera de ejemplo pero no de limitación, en todavía una modalidad adicional específica, el (los) producto(s) TNFbp se puede administrar intravenosamente para el tartamiento de daño cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o infarto, o administrarse intraventricularmente para el tratamiento del daño cerebral como resultado de un trauma. Un modo específico para el tratamiento de la artritis incluye: (I) una inyección intraarticular simple de un producto (s) TNFbp dada periódicamente como se necesite para evitar o remediar la explosiónde la artritis y (2) inyecciones subcutáneas periódicas del (los) producto(s) TNFbp. En otra modalidad específica, un producto (s) de TNFbp puede administrarse en el tratamiento del choque séptico. El inicio del tratamiento para el choque séptico debe comenzar tan pronto como sea posible después de la septicemia o cuando la posibilidad de septicemia se diagnostique. Por ejemplo, el tratamiento puede comenzar inmediatamente después de la cirugía o de un accidente o de cualquier otro evento que pueda llevar el riesgo de iniciar un choque séptico. Los modos preferidos para el tratamiento del síndrome de dolor respiratorio en adultos incluye: (1) administraciones simples o múltiples intratraqueales de un producto (s) TNFbp y (2) infusión intravenosa continua o bolo de ' un producto(s) TNFbp.

En otra modalidad, la terapia de células también está contemplada, por ejemplo, implantación de células que producen un producto (s) TNFbp. Esta modalidad de la presente invención puede incluir la implantación en pacientes de células que son capaces de sintetizar y secretar un producto(s) TNFbp. Tales células que producen un producto (s) TNFbp pueden ser células que normalmente no producen un producto (s) TNFbp pero que han sido modificadas para producir un producto (s) TNFbp. Las células también pueden ser células cuya capacidad de producir un producto (s) TNFbp se ha aumentado por la transformación con un polinucleótido apropiado para la expresión y secreción de un producto (s) TNFbp. Con objeto de minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes por la administración de un producto (s) TNFbp de una especi extraña, se prefiere que las células sean de la misma especie que el paciente (por ejemplo, humanos) o que las células estén encapsuladas con material que proporcione una barrera en contra del reconocimiento inmune, o que las células se coloquen en una ubicación anatómica inmunológicamente privilegiada, tal como en los testículos, ojos o el sistema nerviosos central.

Las células animales humanas o no humanas pueden implantarse en pacientes en cubiertas o membranas biocompatibles, poliméricas semipermeables para permitir la liberación de (los) producto (s) TNFbp, pero para evitar la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores det rimentales a partir del tejido circundante. Alternativamente, las células propias del paciente, transformadas ex vivo para producir un producto (s) TNFbp, se pueden implantar directamente en el paciente sin tal encapsulación. La metodología para la encapsulación de la membrana de células vivientes es familiar para aquellos con habilidad ordinaria en el arte, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en pacientes se puede llevar a cabo.

En todavía otra modalidad, la terapia de genes in vivo también se vislumbra, en donde una secuencia de ácido nucleico codificando un producto (s) TNFbp, se introduce directamente en el paciente. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico codificando un producto(s) TNFbp se introduce en las células objetivo por inyección local de una construcción de ácido nucleico, con o sin un vector de entrega apropiado, tal como un vector de virus adenoasociado . Los v.ectores virales alternos incluyen pero no se limitan a retrovirus, adenovirus, virus de herpes simplex y vectores del papilloma virus. La transferencia física se puede alcanzar in vivo mediante inyección local de la construcción desada de ácido nucleico u otro vector de entrega apropiado conteniendo la secuencia de ácido nucleico deseada, transferencia mediada por liposomas, inyección directa (ADN desnudo), transferencia mediada por receptores (complejo ADN-ligando) o bombardeo de micropartículas (pistola de genes) .

Las técnicas ejemplares de terapia de genes y células se describen en la patente U.S. No. 4,892,538; patente U.S. No. 5,011,472; patente U.S. No. 5,106,627; DE 4219626, WO 94/20517 y 96/22793, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia.

Independientemente de la forma de administración, el tratmiento del trastorno mediado por TNF requiere una dosis o un régimen de dosis total de un producto (s) TNFbp efectivo para reducir o mejorar los síntomas del trastorno. Los factores que determinan la dosis apropiada o régimen de dosis total pueden incluir el trastorno o condición a tratarse o prevenirse, la severidad del trastorno, la forma de administración y la edad, sexo y condición médica del paciente.

Un refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento se hace rutinariamente por aquellos hábiles en el arte, especialmente a la luz de la información de dosis y los ensayos aquí incluidos. La frecuencia de dosificado también depende de los parámetros farmacocinéticos del (los) producto ( s ) TNFbp en la formulación utilizada. El producto (s) TNFbp se puede administrar una vez o en casos de trastornos severos y prolongados, administrarse diariamente en dosis menos frecuentes o administrarse con una dosis inicial de bolo seguida de una dosis continua o suministro sostenido. También se contempla que otras formas de dosificación continua o casi continua se puedan practicar. Por ejemplo, la derivación química puede resultar en formas de liberación prolongada que tienen el efecto de una presencia continua en el torrente sanguíneo, en cantidades predecibles basadas en una dosificación determinada o régimen de dosis total. La dosificación o régimen de dosis total puede también determinarse a través del uso de ensayos conocidos para determinar las dosis usadas en conjunto con los datos apropiados de la respuesta de dosis.

Cuando se administra parenteralmente, cada dosis de unidad por ejemplo, puede ser de hasta 10 mg, generalmente hasta 15 mg y más generalmente hasta 20 mg . Cuando se administra en una cavidad articular, la composición farmacéutica se administra preferiblemente como una inyección simple de por ejemplo, una jeringa de 3 a 10 ml que contiene una dosis por ejemplo, de entre alrededor de 5 mg/ml hasta 10 mg/ml de producto (s) TNFbp disuelto en una solución salina amortiguada isotónica de fosfato. La preparación se puede administar dentro de una cavidad articular a una frecuencia de por ejemplo, de una vez cada 7 a 10 días. De manera tal que la administración se lleva a cabo continuamente por ejemplo, 4 a 5 ve ce s mientras se varía la dosis si es necesario.

Como se contempla por la presente invención, un producto (s) puede administrase como un .adjunto a otra terapia y también con otras formulaciones farmacéuticas apropiadas para la indicación que se trata. Un producto (s) TNFbp y una o más terapias adicionales o formulaciones farmacéu icas se 4 pueden administrar separadamente o en combinación.

En una modalidad específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretara tmiento , pos t-tra tamient o o tratamiento concurrente) con uno o más inhibidores TNF adicionales para el tratamiento de trastornos mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica. Los inhibidores TNF incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o la liberación extracelular de TNF, incluyendo los siguientes compuestos.

Los inhibidores adicionales de TNF incluyen anticuerpos anti-TNF (por ejemplo, anticuerpo MAK 195F Fab (Holler et al. (1993), Primer Simposio Internacional de Citocinas en el Transplante de Médula Osea, 147; anticuerpo monoclonal anti-TNF CDP 571 (rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342, la descripción de la cual se incorpora como referencia); anticuerpo monoclonal del factor de necrosis anti-tumor de murina BAY X 1351 (Kieft et al. (1995) . 7°. Congreso Europeo de Microbiología Clínica y Trastornos Infecciosos, 9, la descripción de la cual se incorpora por referencia); anticuerpo monoclonal anti-TNF CenTNF cA2 (Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1105-1110, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia) .

En una modalidad específica, la presente invención se dirige hacia el uso de un producto(s) TNFbp en combinación (pre'tratamiento , posttratamiento o tratamiento * concurrente) con antígeno fas soluble humano o secretado o versiones recombinantes del mismo (WO 96/20206 y Mountz et al., J. Immunology, 155:4829-4837; y EP 510 691, las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia) . La patente WO 96/20206 describe antígeno fas humano secretado (original y recombinante, incluyendo una proteína de fusión Ig), los métodos para ailsar los genes responsable de la codificación del antígeno fas humano recombinante soluble, métodos para clonar el gene en vectores apropiados y tipos de células, y métodos para expresar el gene para producir los inhibidores. La EP 510 691 enseña codificación de ADNs para el antígeno fas humano, incluyendo antígeno fas soluble, vectores que expresan el ADNs y los transformantes transfectados por el vector. Cuando se administra parenteralmente, las dosis de una proteína de fusión de antígeno fas soluble o secretado son cada una generalmente desde alrededor de 1 microgramo/kg hasta alrededor de 100 microgramos/kg .

En una modalidad específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamíento o tratamiento concurrente) con alguna de uno o más inhibidores de interleucina-1 para el tratamiento de trastornos mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como cachexia/anorexia ; síndrome de fatiga crónica, depresión; diabetes (por ejemplo, ataque juvenil Tipo 1 y diabetes mellitus); fibromielgia o analgesia, rechazo de injertos contra huésped; hiperalgesia, trastorno inflamatoria del vientre; daño isquémico, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, daño cerebral como resultado de .trauma, epilepsia, hemorragia o infarto, cada uno de los cuales puede llevar a neurodegeneración); trastornos de los pulmones (por ejemplo, ARDS y fibrosis pulmonar) ; esclerosis múltiple , trastornos oculares; dolor; pancreatitis; daño por reperfusión; (por ejemplo, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa , espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis , dermatomiositis , escleroderma , esclerosis sistémica, vasculitis, vasculitis cerebral, trastorno de Lyme, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), síndrome de Sjógren's, fiebre reumática, policondri tis , y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes); choque séptico; efectos laterales de la terapia de radiación; trastorno temporal de la unión mandibular; metástasis de tumor o una condición inflamatoria resultante de tirones, torceduras , daño de cartílagos, trauma, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de trastornos . Las clases de inhibidores de interleucina-1 incluyen antagonistas receptores de interleucina-1 (culaquier compuesto capaz de evitar específicamente la activación de recpetores celulares al IL-1) tal como IL-lra como se describe abajo; anticuerpos monoclonales del receptor anti-IL-1 (por ejemplo, EP 623674), la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia, las proteínas de enlace IL-1 tales como los recpetores solubles IL-1 (por ejemplo, U.S.P. 5,492,888, U.S.P. 5,488,032, y U.S.P. 5,464,937, U.S.P. 5,319,071 y U.S.P. 5,180,812, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia); anticuerpos . monoclonales anti-IL-1 (por ejemplo, WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S.P. 4,935,343, EP "364778, EP 267611 y EP 220063, las descripciones" de las cuales se incorporan aquí como referendia ) ; las protepinas accesorias del recpetor IL-1 (por ejemplo, WO 96/23067, la descirpción de la cual se incorpora aquí como referencia) y otros compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o liberación extracelular del IL-1.

El antagonista receptor de interleucin-1 (IL- 1ra) es una proteína humana que actúa como un inhibidor natural de la interleucina-1. Los antagonistas receptores preferidos, así como los métodos de elaboración y métodos de uso de los mismos, se describen en las patentes americanas U.S. No. 5,075,22; WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626; WO 94/20517; WO 96/22793 y WO 97/28828, las descripciones de las cuales se incorporan aquí como referencia. Las proteínas incluyen antagonistas receptores IL-1 glicosilados así como no glicosilados .

Específicamente, tres formas preferidas de IL-lra (IL-lraa, IL-iraß y IL-lrax), cada una derivada de la misma secuencia de codificación del ADN, se detallan y describen en la patente U.S. ,075,222. Los métodos de producción de los inhibidores IL-1, particularmente IL-lras, también se describen en la patente 5,075,222. En una modalidad específica, un IL-lra contiene un grupo N-terminal metionilo como consecuencia de la expresión en E . Col i . La presente invención también incluye IL-lras modificados. Los IL-lras modificados incluyen por ejemplo, metínas de tales inhibidores en los cuales un residuo de cisteína se substituye por un amino ácido en uno. o más sitios en la secuencia de un amino ácido de un inhibidor que se presenta naturalmente. Tales muteínas pueden después reaccionar selectivamente en sitios con unidades de polietilen glicol (PEG) 4 .-* funcionalizado u otros poliéteres que contienen sulfhidrilo, para crear especies de PEG IL-lra. La patente WO 92/16221 describe varias especies de IL-lra modificado y métodos para la elaboración de tales inhibidores modificados de PEG.

Una clase adicional de inhibidores de interleucina- 1 incluye a compuestos capaces de evitar específicamente la activación de receptores celulares al IL-1. Tales compuestos incluyen proteínas de enlace IL-1, tales como receptores solubles y anticuerpos monoclonales. Tales compuestos también incluyen anticuerpos monoclonales para los receptores.

Una clase adicional de inhibidores de interleucina-1 incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo y/o la liberación extracelular de IL-1. Dichos compuestos incluyen agentes que afectan la transcripción de genes IL-1 o el procesamiento de preproteínas de IL-1.

El tratamiento actual de las trastornos mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda o crónica tal como trastornos reumáticas, incluyen el uso de medicamentos de primera línea para el control del dolor e inflamación clasificados como no esferoidales, medicamentos anti-inflamatorios (NSAIDs) . Los tratamientos secundarios incluyen corticosteroides, medicamentos antireumáticos de acción lenta (SAARDs) o medicarentos modificadores de la trastorno (DM) . La información referente a los siguientes compuestos se puede encontrar en el Manual Merck de Diagnóstico ' y Terapia, Décima Sexta Edición, Merck Sharp" & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rhaway, NJ (1992) y en Pharmacoproj ects , PJB Publications Ltd.

En una modalidad específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp y alguno de uno o más NSAIDs para el tratamiento de trastornos medidadas por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como trastornos reumpaticas y trastornos de injerto contra huésped. Los NSAIDs poseen su acción antiinflamatoria al menos en parte, para la inhibición de la síntesis de la pros taglandina (Goodman y Gilman en "Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica" MacMillan Edición 7a. (1985) . Los NSAIDs se pueden caracterizar en nueve grupos: (1) derivados del ácido salicílico; (2) derivados del ácido propiónico; (3) derivados del ácido acético; (4) derivados del ácido fenámico; (5) derivados del ácido carboxílico; (6) derivados del ácido butírico; (7) oxi camas; (8) pirazoles y (9) pirazolonas .

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más derivados del ácido salicílico, esteres promedicamento o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos . Tales derivados del ácido salicílico, esteres promedicamento y las sales farmacéuticamente aceptables e los mismos comprenden: acetaminosalol , aloxiprina, aspirina, benorilato, bromosaligenina , acetilsalicilato de calcio, trisalicilato de magnesio colina diflusinal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, .salicilato de imidazol, ace tilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, ace tilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida , ácido O-acético salicilamida , salsalato y sulfasalazina. Los derivados estructuralmente relacionados del ácido salicílico que tienen propiedades similares analgésicas y anti-inflamatorias se pretenden también agrupar en este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso del producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más derivados de ácido propiónico, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados del ácido propiónico, esteres ed promedicamentos y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: alminoprofen, benoxaprofen , ácido buclóxico, carprofen, dexindoprofen, fenoprofen, flunoxaprofen, fluprofeen, flurbiprofen , furcloprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminio, ibuproxam, indoprofen, isoprofen, cetoprofen, loxoprofen, miroprofen, naproxen, oxaprozin, picetoprofen , pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, ácido protizínico, piridoxiprofen , suprofen, ácido tiaprofénico y tioxaprofen. Los derivados estructuralmente relacionados del ácido propiónico que tienen propiedades similares analgésicas y anti-inflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presenteinvención se dirige al uso de producto(s) TNFbp en combinación (pretratamiento, posttratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más derivados del ácido acético, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados del ácido acético, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acematacina, alclofenaco, amfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopiraco, delmatacina, diclofenaco de sodio, etodolaco, felbinaco, fenclofenaco , fencloraco, ácido fenclozico, fentiazaco, furofenaco, glucametacina , ibufenaco, indometacina , isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, ácido metiazínico, oxametacina, oxpinaco, pimetacina, proglumetacina , sulindaco, talmetacina, tiaramida, tiopinaco, tolmetina, zidometacina y zomepiraco. Los derivados estructuralmente relacionados del ácido acético que tienen propiedades analgésicas similares y anti-inflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presenteinvención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más derivados del ácido fenámico, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados del ácido fenámico, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico , meclofenamato de sodio, ácido edofenámico, ácido mefanámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico y ufenamato. Los derivados estructuralmente relacionados del ácido fenámico que tienen propiedades analgésicas similares y anti-inflama torias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más derivados del ácido carboxílico, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos . Los derivados del ácido carboxílico, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden usar comprenden: clidanaco, diflunisal, flufenisal, inoridina, cetorolaco y tinoridina. Los derivados estructuralmente relacionados del ácido carboxílico que tienen propiedades analgésicas similares y anti-inflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más derivados del ácido butírico, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados del ácido butírico, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizon, butibufen, fenbufen y xenbucin. Los derivados estructuralmente relacionados del ácido butírico que tienen propiedades analgésicas similares y antiinflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de .un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento ', pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más oxicamos, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los oxicamos, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicamo, enolica o, isoxicamo, piroxicamo, sudoxicamo, tenoxicamo y 4-hidroxil-1 , 2-benzotiazina 1,1-dióxido 4-(N-fenil)-carboxamida. Los derivados estructuralmente relacionados de los oxicamos que tienen propiedades analgésicas similares y antiinflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más pirazoles, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los pirazoles, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: difenamizol y epirizol. Los derivados estructuralmente relacionados de los pirazoles que tienen propiedades analgésicas similares y antiinflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más pirazolonas, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las pirazolonas, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: apazona, azapropazona , bencipiperilona , feprazona, mofebutazona , morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propilfenazona , ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona . Los derivados estructuralmente relacionados de pirazalonas que tienen propiedades analgésicas similares y antiinflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más de los siguientes NSAIDs: ácido e-acetamidocaproico, S-adesilmetionina , ácido 3-amino-. -hidroxibutírico, amixetrina, anit razafeno, antrafenina, bendazaco, lisinato de bendazaco, bencidamina, beprozina, broperamol, bucoloma, bufezolaco, ciprocuazona , cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidina, difenpiramida , difenpiramida , difisalamina , ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizol, fenflumizol, floctafenina , flumizol, flunixin, fluprocuazona , fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guaiazoleno, isonixirina, clorhidrato de lefetamina, leflunomida, lofemizol, lotifazol, clonixinato de lisina, meseclazona, nabumetona, nictindola, nimesulida, orgoteina, orpanoxina, oxaceprolm, oxapadol, paranilina, perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxime, piproxeno, pirazolaco, pirfenidona, procuazona, proxazol, tielavin B, tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamida y aquellos designados por el número de código de la compañía tal como 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ON03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (ácido 4-benzoíl-l-indancarboxílico) , TVX2706, U60257, UR2301 y WY41770. Los derivados estructuralmente relacionados del NSAIDs que tienen propiedades analgésicas similares y ant i-inflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más corticosteroides, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enferemedades mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica tales como trastornos reumáticas, trastorno de injerto contra huésped y esclerosis múltiple. Los corticosteroides, esteres de promedicamentos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden la hidrocortisona y compuestos derivados de la hidrocortisona tales como 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona , algestona, amcinonida, beclometasona , betametasona, valerato de betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolona , cloprednol, corticos terona , cortisona, cortivazol, deflazacon, desonida, desoximerasona , dexametasona, diflorasona, diflucortolona , difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida , flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetónido de flucinolona, fluocinonida , acetónido de fluorocinolona , butil fluocortina, fluocortolona , hexanoato de fluorocortolona , valerato de diflucortolona , fluorometolona , acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona , flurandenolida, formqcortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfatode hidrocortisona, 21-succinato de sodio de hidrocortisona, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona , metilprednicolona , furoato de mometasona, parametasona , prednicarbato , prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato de sodio de prednisolona, succinato de sodio de prednisolona, 21-m-sulfobenzoa to de sodio de prednisolona, 21-estearoglicolato de sodio de prednisolona, tebutato de prednisolona, 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, 21-dietilaminoacetato de prednilideno , tixocortol, triamcinolona , acetónido de triamcinolona, benetónido de triamcinolona y hexacetónido de triamcinolona. Los derivados estructuralmente relacionados de los corticosteroides que tienen propiedades analgésicas similares y ant i-inflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más de medicamentos antireumáticos de baja acción (SAARDs) o medicamentos antireumáticos modificadores de la trastorno (DMARDS), esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para el tratamiento de trastornos mediados por el TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como trastornos reumáticas, esclerosis múltip_e e injerto contra huésped. Los SAARDs o DMARDS, esteres de promedicamento y sales . farmacéuticamente aceptables de los mismos comprende: alocupreido de sodio, auranofino, ." aurotioglucosa, aurotioglicánido , aza tioprina", brequinar sodio, bucilamina, 3-aurotio-2-propanol- 1-sulfonato de calcio, cloranbucil, cloroquina, clobuzarit, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosporina , dapsona, 15-desoxiespergualina , diacereína, glucosamina, sales de oro (por ejemplo, sal de oro de cicloquina, tiomalato de sodio oro, tiosulfato de sodio oro), hidroxicloroquina , hidfroxiurea , cebuzona, levamisol, lobenzarit, melitin, 6-mercaptopurina , metotrexato, mizoribina, mofetil micofenolato, mioral, mostaza de nitrógeno, D-penicilamina, piridinol imidazoles tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoietina y vincristina. Los SAARDs ó DMARDs es ructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas similares y antiinflamatorias también se pretende que se cubran por este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más inhibidores COX2 , esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de trastornos mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica. Ejemplos de los inhibidores C0X2 , esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen por ejemplo el celecoxib. Los inhibidores de C0X2 estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y antiinflamatorias también se pretenden cubrir en este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-trat amiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más antimicrobianos, esteres de promedicamentos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de trastornos mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica. Ejemplos de los antimicrobianos, incluyen por ejemplo ampicilina, amoxicilina, aureomicina, bacitracina, ceftazimida, ceftriaxona, cefotaxime, cefaclor, cefalexina, cefradina, ciprofloxacino , ácido clavulánico, cloxacilina, dicloxacilina , eri t romicina , flucloxacilano , gentamicina, gramicidina, meticilano, neomicina, oxacilano, penicilina y vancomicina. Los antimicrobianos estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y antiinflamatorias también se pretenden cubrir en este grupo.

En una modalidad más específica, la presente invención se dirige al uso de un producto (s) TNFbp en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con alguno de uno o más de los siguientes compuestos para el tratamiento de enferemdades mediados por el TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica, factor estimulante de la colonia de granulocitos; talidomida; BN 50730; tenidap; E 5531; PCA 4248 tiapafanto, nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401; péptido T; MDL 201, 449A; clorhidrato de ( IR, 3S ) -Cis- 1- ( 9- ( 2 , 6-diaminopurinil ) ) -3 -hidroxi-4 -ciclopent eno ; (lR,3R)-trans-l-(9-(2, 6-di amino) purina)-3-acetoxiciclopentano ; clorhidrato de ( IR, 3R) -trans-1- ( 9-adenil ) -3-azidociclopentano y ( IR, 3R) -t rans-1- ( 6-hidroxi-purin-9-il) -3-azidociclopentano.

Es especialmente ventajoso formular composiciones de los compuestos adicionales antiinflamatorios en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La "forma de dosis unitaria" como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente discretas ajustadas como dosis unitarias para los pacientes que se van a tratar, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuestos antiinflamatorios adicionales calculados para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el protador farmacéutico requerido. Como se usa aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye alguno y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y fungicidas, agentes retrasadores de la absorción e isotónicos y similares que son compatibles con el ingrediente activo y con el modo de administración y otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el recipiente.

Para administración oral terapéutica, el compuesto antiinflamatorio adicional se puede incorporar con excipientes y usados en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares, o se pueden icnorporar directamente con el alimento en la dieta. Las tabletas, pastillas, pildoras, cápsulas y similares, pueden también contener lo siguiente: un aglutinante tal como go ade tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como un almidón de maíz, ácido algínico y similares, un lubricante tal como el estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como la sacarosa, lactosa o sacarina; o un agente saborizante tal como yerbabuena, aceite de gaulteria o saborizantes de cereza o de naranja. Cuando la forma de, dosis unitaria es una cápsula, puede contener además del material del tipo descrito aquí, un portador líquido. Diversos otros materiales pueden estar presentes como un recubrimiento o de otra manera modificar la forma física de la dosis unitaria. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas se pueden recurbri con shellac, azúcar o ambos. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosis unitaria debe estar frarmacéuticamente puro y subs tancialmenteno tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto anti-inflamatorioadicional se puede incorporar dentro de una preparación y formulación de liberación sostenida. La cantidad de compuesto adicional anti-inflamatorio en tal composición terapéuticamente útil es tal que se obtendrá una dosis apropiada.

Para administración terapéutica parenteral, cada compuesto anti-inflamatorio adicional puede incorporarse con una solución inyectable estéril. La solución inyectable estéril se puede preparar al incorporar el compuesto anti-inflamatorio adicional en la cantidad requerida en un portador farmacéuticamente aceptable, con diversos otros ingredientes, seguido de esterilización filtrada. En el caso de las dispersiones, cada una se puede preparar al incorporar el compuesto antiinflamatorio adicional en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos aquí enumerados. En el caso de las soluciones estériles inyectables, cada una se puede preparar al incorporar un polvo d-A compuesto antiinflamatorio adicional y opci.pnalmente , cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución estéril previamente filtrada, en donde el polvo se prepara por cualquier técnica apropiada (por ejemplo, secado al vacío y congelación al vací o ) .

El uso de tales medios y agentes es bien conocido en el arte (ver por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. 18. (1990), Mack Publishing Co . Easton, PA 18042, páginas 1435-1712, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia). Los ingredientes activos complementarios se pueden también incorporara dentro de las composiciones.

La dosis específica del compuesto antiinflamatorio adicional se calcula de conformidad con el peso corporal aproximado o área superficial del paciente. Otros factores que determinan la dosis apropiada pueden incluir la trastorno inflamatoria aguda y crónica o condición a tratarse o evitarse, la sevridad de la enferemedad, la vía de administración y la edad, sexo y condición médica del paciente. Un refinamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento involucrando a cada una de las formulaciones aquí mencionadas se hace rutinariamente por aquellos hábiles en el arte. Las dosis también se pueden determinar a través del uso de ensayos conocidos para determinar las dosis usadas en conjunto con los datos apropiados de respuesta de dosis.

Así por ejemplo, está dentro del alcance de la invención, que las dosis de compuestos antiinflamatorios adicionales seleccionados para el tratamiento de una trastorno inflamatoria crónica o aguda en particular tal como trastornos reumáticas pueden variar para alcanzar el efecto terapéutico deseado. En donde uno de los compuestos anti-inflamatorios adicionales tiene efectos laterales, se puede dar a los pacientes durante periodos alternos de tratamiento de terapia de combinación. Por ejemplo, el tratamiento crónico con metotrexato se asocia con toxicidad gastrointestinal, hepática, de la médula ósea y pulmonar (Sandoval et al. (1995), British Journal of Rheumatology , 34:49-56, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia) .

Las pruebas para vigilar la mejora de una enferemdad pueden incluir pruebas específicas dirigidas por ejemplo, a la determinación de la respuesta sistémica a la inflamacióin, la cual incluye la rapidez de sedimentación de eritrocitos (ESR) y los reactivos de fase aguda (APR) . Observaciones se hacen para la hinchazón, etc. De las partes afectadas del cuerpo. La mejora en rigidez y control (en donde es aplicable), y la reducción en el dolor del pacientetambién se observa. Si la condición del paciente es estable, el paciente se vuelve a tratar con la misma dosis semanalmente y se evalúa semanalmente. Con tal de que la condición del paciente sea estable, el tratamiento puede continuarse. Después de seis meses de tratamiento, los cambios anatómicos del esqueleto se determinan mediante imágenes radiológicas, por ejemplo por radiografía con rayos X .

Al final de cada periodo, el paciente se evalúa nuevamente. La comparación de la evaluación del pre-tratamiento y el pos t-tratamiento radiológico, ESR y APR indica la eficacia de los tratamientos . De conformidad con la eficacia de los tratamientos y la condición del paciente, la dosis se puede incrementar o mantener constante por la duración del tratamiento.

Preferiblemente la presente invención se dirige a un método con opcionalmente, una de las siguientes combinaciones para tratar o prevenir las enferemdades mediados por TNF, incluyendo inflamación aguda y crónica tal como trastornos reumáticas y los síntomas asociados con las mismas. Una combinación es un producto (s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) (sTNFR-I/IgGl O sTNFR-II /IgGl ) de los mismos) con uno o más de metotrexato, leflunomida, un inmunodepresor (pe.j., ciclosporina ) , ciprofloxacino , antígeno fas soluble o secretado y un inhibidor IL-1 (por ejemplo, Il-lra) . Las combinaciones preferidas incluyen el (los) producto(s) TNFbp y elme totrexato o el (los) producto (s) TNFbp y leflunomida. Otra combinación es un producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fe ( s ) ( sTNFR-I /IgGl O sTNFR-I I /IgGl ) de los mismos) con uno o más de metotrexato, leflunomida, sulfasazina e hidroxi cloquina .

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, intraarticular, subcutánea o intramuscular) del producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) ( sTNFR-I / I gGl 0 sTNFR-II/IgGl), opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con metotrexato y/o leflunomida y/o un inhibidor IL-1 (por ejemplo, IL-lra) y/o un antígeno fas soluble o secretado para tratar trastornos reumáticas .

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, intravenosa o intraventricular ) del producto (s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) (sTNFR-I/IgGl O sTNFR- I I / I gGl ) , opcionalmente formulados <con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con un activador de tejido de plasminógeno y/o un inhibidor 11-1 (por ejemplo, IL-lra) para tratar daño cerebral como resultado de traumas, epilepsia, hemorragia o infarto, cada unode los cuales puede conducir a neurodegeneración.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) del producto (s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) (sTNFR-I/IgGl O sTNFR-II /IgGl ) , opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, pos t-tratamiento o tratamiento concurrente) con uno o más de un corticosteroide, ciclosporina , FK-506 o un interferón (por ejemr_o, alfa inferieron, beta inferieron, gama inferieron o inferieron de consenso) y/o un inhibidor IL-1 (por ejemplo, IL-lra opcionalmente formulado con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano) para tratar la esclerosis múltiple.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) del producto (s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) (sTNFR-I/IgGl O sTNFR- I I / I gGl ) , opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con G-CSF y/o un inhibidor IL-1 (por ejemplo, IL-lra) para tratar la trastorno inflamatoria del vientre.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) del producto (s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) (sTNFR-I/IgGl O sTNFR-I I /IgGl ) , opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con leptina, Marinol™ o Megace™ para tratar la cachexia/anorexia .

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) del producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) (sTNFR-I/IgGl O sTNFR- I I / I gGl ) , opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con leptina para tratar la diabetes.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea, int ravent ricular o intratecal) de un producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) ( sTNFR-I /I gGl O sTNFR-II/IgGl), opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano) ) en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con NSAID (por ejemplo, indometacin) y/o un inhibidor IL-1 (por ejemplo, IL-lra) para tratar la trastorno de Alzheimer.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea, int ravent ricular o intratecal) de un producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fe ( s ) ( sTNFR-I / 1 gGl O sTNFR- II/IgGl), opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano) ) en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con un antígeno fas soluble o secretado para tratar el cáncer (por ejemplo, leucemias); diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus Tipo 1 de ataque juvenil); rechazo de injerto contra huésped; hepatitis; daño isquémico/reperfusión, incluyendo isquemia cerebral (daño cerebral como resultado de traumas, epilepsia, hemorragia o infarto, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneración); trastornos neuroinflamatorias ; trastornos reumáticas y transplante de tejidos.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea, intraventricular o intratecal) del producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) ( sTNFR- I / I gGl O sTNFR- II/IgGl), opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) en combinación (pretratamiento, post-tratamiento o tratamiento concurrente) con os teoprotogerina (Solicitud de Patente Europea No. 96309363.8) en el tratamiento de la osteoporosis o la trastorno de Paget.

En una modalidad específica preferida, el método comprende la administración (por ejemplo, subcutánea, int ravent ricular o intratecal) del producto(s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) ( sTNFR-I /I gGl O sTNFR-II/IgGl), opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano) ) en combinación con una terapia de genes (por ejemplo, usando el adenovirus humano) para modular la respuesta inflamatoria a los antígenos del vector (Zhang et al (1997), Arthritis & Rheumatism, 40(9) :S220 (1138)) .

El resultado sorprendente e inesperado aquí descrito es la habilidad del producto (s) TNFbp (por ejemplo, sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR (2.6D sTNFRs tales como 2.6D sTNFR-I) o sTNFR Fc(s) ( sTNFR-I / I gGl O sTNFR-I I / I gGl ) , opcionalmente formulados con un polímero de liberación controlada (por ejemplo, un dextrano o hialuronano)) y metotrexato para actuar haciendo sinergia en el tratamiento de diversos síntomas asociados con las enferemdades mediados con TNF, incluyendo la inflamaciónaguda y crónica tal como las enferemdades reumáticas. "Haciendo sinergia" se usa aquí para referirse a una situación en donde elbeneficio proporcionado por la administración conjunta de inhibidores, es mayor que la suma algebraica de los efectos resultantes de la administración separada de los componentes de la combinación. Como se muestra en los experimentos de abajo, en el modelo de artritis adyuvante, el tratamiento de combinación del producto(s) TNFbp y el metotrexato, es sinergístico con respecto a la inflamación sistémica del tratamiento (esto es, la esplenomegalia ) y la pérdida de peso asociada con la artritis reumatoide. Así, el tratamiento combinado con el producto (s) TNFbp y el metotrexato, tiene la ventaja de alcanzar el mismo resultado con una dosis inferior o una administración menos frecuente de metotrexato, reduciendo por lo tanto cualquier efecto tóxico y potencialmente la ventaja de persistir aún después de que el tratamiento ha terminado.

El metotrexato es un medicamento anti-metabolitos e inmunodepresor. El metotrexato es un agente efectivo anti-inflamatorio con la utilidad en el tratamiento de psoriasis severa e inhabilitante y artritis reumatoide (Hoffmeister (1983), The American Journal of Medicine, 30:69-73 y Jaffe (1988), Arthritis and Rheumatism, 31:299) .

El metotrexato es el ácido N- ( 4 - ( ( 2 , 4 -diamino-6-pteridinil) met ilamino ) benzoil ) -L-glutámico y tiene la fórmula estructural: Las siguientes referencias describen la preparación del metotrexato (Seeger et al. (1949), J. Am. Chem. Soc., 71:1753; el metabolismo del metotrexato (Freeman (1958), J. Pharmacol. Exp. Ther. 122:154 y Henderson et al. (1965), Cáncer Res., 25:1008); la toxicidad del metotrexato Condit et al., (1960), Cáncer, 13:222-249; los modelos faramcocinéticos del metotrexato (Bischoff et al. (1970), J. Pharm, Sci., 59:149); el metabolismo y la farmacocinética del metotrexato (Evans (1980), Appl. Pharmacokinet . , Williams et al. (eds.), pp- 518-548 (Appl. Ther. Inc.); la farmacología clínica del metotrexato (bertino (1981), Cáncer Chemother., 3:359-375 y Jolivet et al. (1983), N. Eng. J. Med., 309:1094-110 ); y la experiencia clínica del metotrexato en la artritis reumatoide (Weiunblatt et al. (1985), N. Eng. J. Med., 312:818-822; Furst (1985), J. Rheumatol., 12(12) :1-14; Williams et al. (1985), Arthritis Rheum., 28:721-730 y Seitz et al. (1995), British Journal of Rheumat ology , 34:602-609) . Adicionalmente, diversas patentes se han emitido describiendo el agente activo de metotrexato y métodos para sintetizar el, metotrexato o intermediarios potenciales en la síntesis del metotrexato: patente americana U.S. Nos. 2, 512, 572, 3, 892, 801, 3,989, 703, 4, 057 ,548, 4, 067, 867, 4, 079, 056, 4, 080, 325, 4, 136, 101, 4,224, 46, , 306, 064, 4, 374, 987, 4, 421, 913 y 4, 767, 859.

El mecanismo de acción del metotrexato está pobremente entendido, sin embargo, diversas actividades de este medicamento se ha demostrado que contribuirán probablemente a su eficacia (Segal et al. (1990), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 20:190-198) . Los siguientes mecanismos de acción del metotrexato se han postulado: inhibición de las trayectorias dependientes del folato y el metabolismo de las proteínas (Morgan et al. (1987), Arthritis and Rheumatism, 30:1348-1356); inhibición de la migración neutrófila en uniones artríticas (van der Kerkhof et al. (1985), British Journal of Dermatology, 113:251-255; Ternowitz et al. (1987) , Journal ofInvestigative Dermatology, 89:192-196 y Sperling (1992), Arthritis and Rheumatism, 35:376-384); actividad inhibitoria IL-6 (Segal (1991), Arthritis and Rheumatism, 34 ( 2 ) : 146-152 ) y el efecto anti-proliferativo local específico sobre las células involucradas en la artritis (Rodenhuis et al. (1987), Arthritis and Rheumatism, 30:369-374) . El metotrexato se han demostrado que bloquea la trayectoria del receptor de interleucina-1 beta/interleucina-1 (Brody et al. (1993), European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 31 ( 10 ) : 667 -674 ) ; sin embargo, aunque el metotrexato puede inhibir los efectos proliferativos del IL-1 y disminuir laproducción de monocitos IL-1 en el corto plazo en ciertos pacientes, este efecto no es sostenido y es improbable de explicar la eficacia a largo plazo del metotrexato (Barrera et al. (1996), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 25 ( 4 ) : 234 -253 ) .

El metotrexato se puede administar oralmente, intraperitonealmente, subcutáneamente o intravenosamente. Se prefiere la administración oral. El siguiente es un ejemplo del procedimiento para la administración combinada de un producto (s) TNFbp y el metotrexato para tratar un paciente humano. El paciente toma una tableta o cápsula de metotrexato tres veces a la semana, a una dosis semanal total de 5 hasta 50 mg/paciente/semana . El paciente tambiénb se le inyecta intravenosamente con producto(s) TNFbp, a una dosis diaria de 50 hasta 150 mg . Se apreciará por aquellos hábiles en el arte que las dosis aquí presentadas son las dosis preferidas. La dosis de partida del compuesto en particular usado, sereduce para un paciente que muestra reacción adversa, o el medicamento usado en combinación con los compuesto (s) se puede cambiar o reducir, por ejemplo, dependiendo de las diferentes formulaciones, rutas, programas de dosis y/o otras variables conocidas por aquellos hábiles en el arte, tal como la tolerancia individual del paciente al medicamento, su eficacia y toxicidad.

Preferiblemente, el paciente se trata con una dosis que comienza semanalmente de metotrexato a entre 5 mg y 7.5 mg (oral o intramuscularment ) y una dosis diaria de producto (s) TNFbp a entre 50 mg y 150 mg intravenosamente. La dosis de metotrexato se incrementa por 5 mg cada 2 a 3 semanas. El nivel máximo de dosis se determina en un punto en el cual el paciente muestra mejoras, lo cual es generalmente preferible menos de alrededor de 25 mg de metotrexato por semana, más preferiblemente entre 5 y 25 mg de metotrexato por semana. Al final del periodo del quinto día el paciente es evaluado. La evaluación incluye examinación física y pruebas detalladas de laboratorio. Las pruebas incluyen la evaluación por toxicidad. La vigilancia adicional en laboratorio en el caso del metotrexato, incluye un conteo completo de células de sangre cada 2 semanas durante los primeros tres meses y posteriormente mensualmente. Las precauciones adicionales preferiblemente incluyen evaluaciones mensuales de los niveles de albúmina de suero, transferasa de amino alanina, bilirrubina, creatinina y nitrógeno y urea en sangre. Se prefiere también un análisis mensual de orina.

Lo anterior es a manera de ejemplo y no excluye el tratamiento de otras enferemdades inflamatorias de las uniones que aparecen a partir de respuestas inmunes anormales o indeseablemente normales. El ejemplo tampoco excluye otros tratamientos para usarse concurrentemente con estos compuestos antiinflamatorios que se conocen por aquellos hábiles en el arte o que pueden llegar por aquellos hábiles en el arte usando los lineamientos establecidos en esta especificación.

Otros compuestos anti-inflamatorios arriba mencionados se pueden usar en conjunto con los tratamientos .

Ej emplos .

Los métodos normales para muchos de los procedimientos descritos en los siuientes ejemplos, o procedimientos apropiados alternos, se proporcionan en manualesampliamente reconocidos de biología molecular tales como por ejemplo, Sambrook et al., - Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience , Nueva York (1990) . Todos los productos químicos fueron grado analítico o grado USP.

Ejemplo 1.

Un modelo animal de artritis reumatoide inducido por un adyuvante," se utilizó para investigar la terapia decbmbinación de una proteína enlazante de TNF y metotrexato en ratas macho de Lewis (3-7/grupo) pesando al menos 200 g.

En el día cero, todas las ratas se inyectaron con 100 µl de Adyuvante Completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St Luis, MO) al cual se le agregó un adyuvante sintético N , -dioctildecildecil -N ' , N-bis (2-hidroxi-etil ) propandiamina, 50 mg/ml. En los días 0-14 el metotrexato en carboximetilcelulosa al 1% (Sigma) se administró oralmente en forma diaria (0.06 mg/kg) a los dos grupos de ratas. En los días 8, 10, 12 y 14, el sTNFR-I cl05 derivado de E. Coli se dimerizó con PEG-20 , 000-bi s -vini 1 -sulfona (mancuerna sTNFR-I cl05; preparada generalmente segpun las enseñanzas de WO 95/34326) formulada en la composición farmacéutica (34 mM de NaCl, 10 mM de fosfato de sodio, 4% de sorbitol (peso/vol) en agua; pH 6.5), se administró por inyección subcutánea (SC) (3 mg/kg) a un grupo de ratas que se trataban con el Adyuvante Completo de Freunds y metotrexato y otro grupo de ratas se trataba con el Adyuvante Completo de Freunds solamente .

Los pesos corporales se tomaron en el día 0 cada tercer día desde el día 9 hasta la terminación en el día 15. Las mediciones de calibrador y el registro clínico se efectuaron el día 9 y cada tercer día hasta la terminación. En este momento, el peso del cuerpo, patas y bazo del animal se determinaron.

Como se observa en las figuras 3 y 4, las ratas se trataron con la mancuerna cl05 sTNFR-I solamente, exhibieron alrededor de 42% de inhibición de la hinchazón de las patas (área debajo de la curva-AUC) , sin un beneficio importante en la esplenomegalia (no mostrado) y alrededor de 13.2% de inhibición en el cambio del peso corporal (no se muestra) . Las ratas tratadas con metotrexato tuvieron 26% de inhibición en la hinchazón de las patas (AUC), ninguna inhibición en el peso del bazo (no se muestra) y 3% de inhibición en el cambio de peso corporal (no semuestra) . La terapia decombinación proporcionó un 75% de inhibición de la hinchazón de la pata (AUC), 48% de inhibición de la esplenomegalia (no se muestra) y 16.2% de inhibición del cambio del peso corporal (no se muestra) .

Como se observa en la Figura 5, el análisis final (inhibición en la terminación) de los pesos de la pata terminal y los pesos de bazo indicaron que la mancuerna cl05 sTNFR-I solamente, resultó en una inhibición del 10.9% de la inflamación de la pata, 30.4% de inhibición de la esplenomegalia y 13.2% de inhibición del cambio de peso corporal (no se muestra) . El tratamiento del metotrexato solamente dio sólo 3.9% de inhibición en la inflamación de la pata, 8.5% de inhibición de la esplenomegalia y 3% de inhibición del cambio del peso corporal (no se muestra) . La combinación de la mancuerna cl05 sTNFR-I y el metotrexato, resultó en un 46.8% de inhibición de la hinchazón de patas, 48% de inhibición de la esplenomegalia y 16.2% de inhibición del cambio del peso del cuerpo ( no se muestra ) .

Ejemplo 2 Un modelo animal de artritis reumatoide inducido por un adyuvante, se utilizó para investigar la terapia decombinación de una proteína enlazante de TNF y metotrexato en ratas macho de Lewis (3-7/grupo) pesando al menos 200 g.

En el día cero, todas las ratas se inyectaron con 100 µl de Adyuvante Completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St Luis, MO) al cual se le agregó un adyuvante sintético N , N-dioct ildecildecil-N ' , N-bis ( 2-hidroxi-etil ) propandiamina, 50 mg/ml. En los días 0-14 el metotrexato en carboximetilcelulosa al 1% (Sigma) se administró oralmente en forma diaria (0.06 mg/kg) a los dos grupos de ratas. En los días 9, 11 y 13, la proteína de fusión derivada del CHO sTNFR-II /hlgGl (sTNFR-II Fe; preparada generalmente según las enseñanzas de la patente EP 418 014) formulada en la composición farmacéutica (34 mM de NaCl, 10 mM de fosfato de sodio, 4% de sorbitol (peso/vol) en agua; pH 6.5), se administró por infusión subcutánea (18 mg/kg) a un grupo de ratas que se trataban con el Adyuvante Completo de Freunds y metotrexato y otro grupo de ratas se trataba con el Adyuvante Completo de Freunds solamente.

Los pesos corporales se tomaron en el día 0 y cada tercer día desde el día 9 hasta la terminación en el día 15. Las mediciones de calibrador y el registro clínico se efectuaron diraiamente desde el día 9 hasta la terminación el día 15. En este momento, el peso del cuerpo, patas y bazo del animal se determinaron.

Como se observa en la figura 6, las ratas se trataron con el sTNFR-II Fe solamente, exhibieron alrededor de 8% de inhibición de la hinchazón de las patas (área debajo de la curva-AUC), sin un beneficio importante en la esplenomegalia (-7%) o cambio en el peso corporal (-5%) . Las ratas tratadas con metotrexato tuvieron 6,6% de inhibición en la hinchazón de las patas (AUC) , 74% de inhibición en el peso del bazo y 64% de inhibición en el cambio de peso corporal. La terapia decombinación proporcionó un 96% de inhibición de la hinchazón de la pata (AUC), 94% de inhibición de la esplenomegalia y 79% de inhibición del cambio del peso corporal .

Como se observa en la Figura 7, el análisis final (inhibición en la terminación) de los pesos de la pata terminal indicaron que el sTNFR-II Fe solamente, resultó en una inhibición del 10% de la inflamación de la pata, el Aratamiento del metotrexato solamente dio 74% de inhibición en la inflamación de la pata, y la combinación del sTNFR-II Fe y el metotrexato, resultó en un 88% de inhibición de la hinchazón de patas .

Ej emplo 3.

.La combinación de los efectos inmunoterapéuticos de la mancuerna cl05 sTNFR-I y la proteína de fusión fas se evaluaron usanddo un modelo de ratón de D-Galactosamina (D-GalNH2) indujo la letalidad. El modelo de la D-galactosamina (D-GalNH2) y el lipopolisacárido (LPS) (Mountz et al., J. Immunology, 155:4829- 4837) . En este modelo, los ratones autoinmunes MRL-lpr/lpr se administran con D-GalNH2 con la endotoxina bacteriana (LPS) , y la letalidad se observa a través de +96 horas después del desafío.

Materiales y Métodos.

Células de ovario de mas-er chino deficiente en reductasa- de dihidrofolato (DHFR) (células CHOd) se trans fect aron con cADN quimérico fas/hlgGl (Mountz et al. ( 1 _"96 ) , "Autoinmunidad debida al Nur-77 defectuoso, ñpoptosis Fas y TNF-Rl" en mecanismo de activación de linfocitos y regulación inmune, Vol. 6, p241-262 (Gupta y Cohén (Eds)), Plenum Press, NY) en pDSRa2, generalmente de conformidad con la descripción de DeClerck, et al. (1991), JCB, 266:3893-3899. El procedimiento de transfección difiere del protocolo establecido en DeClerck, et al. (1991), supra, como sigue: las células se transfectaron con 800,000 células con 10 microgramos y 8 microgramos de esperma de arenque como portador, y las células sedividieron 2 días después de la pos t-transfección .

Siguiendo la expresión de la proteína de fusión fas, se purificó la proteína usando un Flujo Rápido de sefarosa de Proteína G, generalmente según Jungbauer, et al. (1989), J.

Chro . , 476:257-268. La proteína purificada se formuló en solución salina amortiguadora de Fosfato (Gibco BRL, Grand Island, NY) .

Protocolo Después de ayunar durante la noche, ratones hembra de 6-8 semanas de edad MRL-lpr/lpr (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) (5/7/grupo) se canularoncon catéteres yugulares y se dejaron recuperar durante varios días. Se colocaron después en jaulas de infusión y se aclimataron durante una semana antes de iniciar la infusión salina .

En la hora 0, todos los ratones se inyectaron intraperitonealmente con 31 microgramos de D-GalNH2 (Sigma) suspendido en una Solución de Sal Balanceada de Hank (Gibco BRL) (120 microgramos/ml ) ; y lipopoli sacárido (LPS) a partir del serotipode E.coli 0127:B8 (Sigma) en una solución salina, estéril, amortiguada con fosfato y libre de endotoxina (PBS) (6 microgramos /rat ón ) .

En la hora 0, +2 horas pos t-desafio , la proteína de fusión fas formulada en una composición farmacéutica (Solución salina amortiguada de Fosfato (Gibco BRL, Grand Island, NY) , se administró intravenosamente en diluciones en serie de 2 pliegues (dosis de microgramos/kg) a dos grupos de ratones .

En la hora 0, +2 horas pos t-desafí o , la mancuerna cl05 sTNFR-I formulada en una composición farmacéutica (34 mM de NaCl, 10 mM de fosfato de sodio, 4% de sorbitol (peso/vol) en agua; pH 6.5) se administró intravenosamente en diluciones en serie de 2 pliegues (dosis de microgramos/kg) a un grupo de ratones que setrataban con D GalNH2 y proteína de fusión fas y a otro grupo de ratones que se trataba solamente con D-GalNH2.

Se generaron las curvas ED50 son paquetes de cómputo estadísticos para Macintosh (StatviewR, Mountain View, CA) . Se siguió la letalidad a través de +96 horas despuésdel desafío.

Resultados : Como se observa en la Figura 8, los ratones administrados con la mancuerna cl05 sTNFR-I (100 microgramo's/kg; N=6; I.V.) al tiempo de -1 hora antes del desafío se observó que estaban completamente protegidos (100% de supervivencia) contra el desafío LPS en comparación con el control (tratado con solución salina) ratones (N=6) desafiados con LPS/D-GalNH2 (P<0.01) . Los ratones tratados con dosis sub-óptimas de la mancuerna cl05 sTNFR-I ( % 5 microgramos/kg; N=6) se observó que tenían alrededor de 35% de protección a través ed las +96 horas después del desafío. Todos los ratones tratadaos con la proteína de fusión fas (100 microgramos/kg; N=6) murieron después de +24 horas-post desafío. Sin embargo, cuando los ratones (N=6) se trataron intravenosamente con la mancuerna cl05 sTNFR-I (25 microgramos/kg) y la proteína de fusión fas (100 microgramos/kg), se observó un aumento en la supervivencia (70%) a través de +36 horas en comparación con la mancuerna cl05 sTNFR-I tratada (25 microgramos), la proteína de fusión fas (100 microgramos/kg) o los animales de control solos (P<0.05) . estos resultados sugieren que la mancuerna cl05 sTNFR-I y la proteína de fusión fas son sinergís ticas en sus efectos terapéuticos en el modelo LPS/D-GalNH2 de inflamación aguda.

La descripción anterior de la invención es ejemplar para propósitos de ilustración y explicación. Será aparente para aquellos hábiles en el arte, que los cambios y modificaciones son posibles sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones se interpreten como que cubren dichos los cambios y modificaciones.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Amgen Inc. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: TERAPIA DE COMBINACIÓN USANDO UNA PROTEINA PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS MEDIADOS POR TNF. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Amgen Inc. (B) CALLE: 1840 DeHavilland Drive (C) CIUDAD: Thousand Oaks * fi (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: E.U. (F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 (v) FORMA DE LECTURA EN COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA: Patentln Liberación No. 1, Versión o. 1.30 (vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD (A) NUMERO DE SOLICITUD: NO SE CONOCE TODAVÍA (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 8-DIC-1997 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/032,587 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 6-DIC-1996 (vii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/036,355 (C) FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-ENE-1997 ( ii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/039,315 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 7-FEB-1997 (vii) DATOS DE SOLICITUD PREVIA (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 60/052,023 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 9-JUL-1997 (viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE /ABOGADO (A) NOMBRE : Zindrick, Thomas K. (B) NUMERO DE REGÍ STRO : 32 , 185 ' (C) NUMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: A-430D (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD:483 pares base (B) TIPO:ácido nucleico (C) AFINIDAD DE CEPAS: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..483 (x) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 1 GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG 48 Asp S=r Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr He Kis Pro Gln Asr. Asn Ser 1 5 10 15 * ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT 96 He Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr A_n Asp Cys 20 25 30 CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TOC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC 144 Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys 'Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser 35 40 45 TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA 1S2 Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu -Arg K_s Cys Leu Ser Cys Ser Lys 50 55 60 TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG G?G ATC TCT TCT TGC ACÁ GTG G?C 240 Cys Arg Lys Glu Mer Gly Gin Val Glu He Ser Ser Cys Thr Val Asp 55 70 75 80 CGG GAC ACC GTG TCT GGC TGC AGG A?G AAC C?C TAC CGG CAT TAT TGC 288 Arg App Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys ?sn Gln Tv.- Arg His Tyr Trp 85 90 95 AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT GGG 336 Ser Glu A=n Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly 100 105 110 ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC CTG TGC ACC TGC 384 Tur Val Kis Leu Ser Cys Gln Glu Lys Cln Asn Thr Vai Cys Thr Cys 115 120 125 CAT GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC 432 Kis Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn 130 135 140 TGT AAG AAA- AGC CTG GAG TGC ACG AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT GAG 480 Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln He Glu 145 . 150 155 160 AAT 483 Asn (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD:161 amino ácidos (B) TIPO:amino ácido (C) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 2 Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lye Tyx -le His Pro Gln Asn Asn Ser 1 5 10 15 He Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys 20 25 30 Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser 35 40 _ 45 Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys 50 55 60 Cys Arg Lys Glu Mee Gly Gln Val Glu He Ser Ser Cys Thr Val Asp 65 70 75 80 Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg Kis Tyr rp 85 90 95 Ser Glu Asr. Leu Phe Gl„ Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly 100 105 110 Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys 115 120 125 His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn 130 135 140 Cys Lys Lys Ser Leu Giu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln He Glu 145 150 155 160 Asr. (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD:705 pares base (B) TIPO:ácido nucleico (C) AFINIDAD DE CEPAS: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..705 (xii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO TTG CCC GCC CAG GTG GCA TTT ACÁ CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 ACÁ TGC CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC CAG ACÁ GCT CAG ATG TGC TGC Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 25 30 AGC AAG TGC TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC TTC TGT ACC AAG ACC Ser Lys Cys Ser Pro Gly sln His Ala Lys Val Phe Cye Thr Lys Thr 35 40 45 TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACÁ TAC ACC CAG CTC 192 Ser ?_p Thr Val Cys Asp Ser Cyo Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC TCT 240 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 GAC CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC 288 -Asp Gln Val Glu Tiir Gln Ala Cys Thr ?rg Glu Gln Asn Arg He Cys 85 90 95 ACC TGC AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC 336 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 _ 110 CGG CTG TGC GCG CCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC 384 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 AGA CCA GGA ACT GAA ACÁ TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG 432 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC 480 Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp He Cys Arg Pro His 145 150 155 160 CAG ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA 528 Gln He Cys Asn Val Val Ala He Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala 165 170 175 GTC TGC ACG TCC ACG TCC CCC ACC OGG AGT ATG GCC CCA GGG GCA GTA 576 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 CAC TTA CCC CAG CCA GTG TCC ACÁ CGA TCC CAA CAC ACG CAG CCA ACT 624 His Leu Pro Glr. Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 CCA GAA CCC AGC ACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG GGC 672 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 CCC AGC CCC CCA GCT GAA GGG AGC ACT GGC GAC 705 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp 225 230 235 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO : 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD:235 amino ácidos (B) TIPO:amino ácido (C) TOPOLOGIA.lineal (ii)TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 4 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 ~- — 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin Thr Ala Gln Met Cys Cys 2C 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln Kis Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg He* Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp He Cys Arg Pro HiS 15 145 ' 150 155 160 Gln He Cys Asn Val Val Ala He Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 - - 215 220 o n. Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp ^ 225 230 235 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método para llevar a cabo la invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención. 25

Claims (26)

Reivindicaciones

1. Un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio agudo o crónico, caracterizado poqrue comprende la administración a un paciente en necesidad de ello, de cantidades terapéuticamente efectivas de una proteína enlazante de TNF y al menos un medicamento antiinflamatorio adicional, en donde la proteína enlazante del TNF y el medicamento antiinflamatorio adicional se administran separadamente o en combinación.

2. El método de conformidad con la rei indicación 1, caracterizado porque el medicamento antiinflamatorio es el metotrexato (ácido N- (4- ( (2, 4-diamino-6-pteridinil ) metilamino) benzoil ) -L-glutámico) .

3. El método de ce formidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medicamento anti-inflamatorio .. es una proteína de fus ion fas .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína enlazante del TNF es sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR o sTNFR Fe.

5. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, caracterizado porque el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio de una unión.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el trastorno inflamatorio de una unión es la artritis reumatoide .

7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína enlazante de TNF y el metotrexato se administran en un portador farmacéuticamente aceptable.

8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína enlazante de TNF y la proteína de fusión fa s se administran en un portador farmacéuticamente aceptable .

9. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una proteína enlazante del TNF y un medicamento anti-inflamatorio.

10. La composición farmacéutica caracterizada porque el medicamento anti-inflamatorio es metotrexato .

11. La composición farmacéutica caracterizada porque el medicamento anti-inflamatsrio es una proteína de fusión fas.

12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la proteína enlazante TNF es sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR o sTNFR Fe.

13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la proteína enlazante TNF está presente en una cantidad de hasta alrededor de 20 mg .

14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el metotrexato está presente en una cantidad de hasta 25 mg .

15. El uso de un medicamento anti-inflamatorio, diferente a una proteína no enlazante de TNF, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio agudo o crónico, en un mamífero en combinación con la administración de una proteína enlazante del TNF.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde el medicamento anti-inflamatorio es metotrexato.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde el metotrexato en el medicamento es hasta alrededor de 25 mg .

18. El uso de conformidad con las reivindicaciones 15 a la 17, en donde el metotrexato se administra oralmente, intraperitonealmente, subcutáneamente o intravenosamente .

19. El uso de conformidad con las rei indicaciones 15 a la 17, en donde el metotrexato se administra oralmente.

20. El uso de conformidad Con la reivindicación 15, en donde el medicamento anti-inflamatorio es una proteína de fusión fa s .

21. El uso de una proteína enlazante TNF en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio agudo o crónico en un mamífero en combinación con la administración de un medicamento anti-inflamatorio adicional.

22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el medicamento anti-inflamatorio es metotrexato .

23. El uso de conformidad con las rei indicaciones 20 a la 22, en donde el metotrexato se administra oralmente, intraperitonealmente, subcutáneamente o intravenosamente .

24. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el medicamento anti-inflamatorio es una proteína de fusión fa s .

25. El uso de conformidad con las reivindicaciones 21 a la 24, en donde la proteína enlazante TNF es sTNFR-I, sTNFR-II, fragmentos de sTNFR o sTNFR Fe.

26. El uso de conformidad con las reivindicaciones 21 a la 25 en donde la proteína enlazante TNF en el medicamento está presente en una cantidad de hasta alrededor de 200 mg .