KR20150080033A - 골관절염 및 통증의 치료 방법 - Google Patents

골관절염 및 통증의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-IL-1α 및 항-IL-1β 항체 및 가공된 1가 및 다특이적인 IL-1α 및 IL-1β 결합 단백질을 포함하는 IL-1α 및 IL-1β 결합 단백질을 사용하는, 골관절염 및 통증의 치료방법에 관한 것이다.

Description

골관절염 및 통증의 치료 방법{TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS AND PAIN}
관련 출원의 상호참조
본 출원은 2011년 2월 8일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/440,853호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본원에 인용에 의해 포함된다.
발명의 분야
본 발명은, 골관절염 및 통증의 치료, 및 보다 구체적으로 골관절염 및 통증을 치료하기 위한 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 단백질의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
건강한 척추동물(사람 및 다른 포유동물 포함)의 관절 연골, 또는 "유리질 연골(hyaline cartilage)"은, 주로 프로테오글리칸, 제II형 콜라겐, 및 물로 구성된 세포외 매트릭스(ECM) 내의 연골세포의 원주형 성장 패턴(columnar growth pattern)을 특징으로 하는 반투명한, 유백색의 결합 조직이다. 관절 연골은 효과적인 체중-지지 쿠션(weight-bearing cushion)을 제공하여 관절 내의 서로 다른 골들 사이에 접촉을 방지하므로 관절의 정상적인 기능에 중요하다. 관절 연골은 관절 외상에 의한 손상뿐만 아니라, 점진적인 미란(erosion) 과정에도 민감하다. 초기에, 이러한 미란은, 감소된 유리질 연골 영역이 연골하 골에 완전히 침투하지 않는 단순한 무증상 "부분적 두께 결함(partial thickness defect)"일 수 있다. 이러한 부분적 두께 결함은 일반적으로 통증이 없으며 전형적으로 관절경 시험 동안에만 검출된다. 그러나, 미란 과정이 치료되지 않는 경우, 부분적 두께 결함의 기저부는 계속해서 닳을 수 있고, 결함의 직경이 증가할 수 있어, 결함이 궁극적으로 근본적인 골을 침투하는 "완전 두께 결함(full thickness defect)"으로 진행된다. 이러한 완전한 두께 결함은, 관절의 서로 다른 골들의 표면이 접촉하여 침식하기 시작하여 염증, 통증, 및 다른 퇴행성 변화, 즉, 골관절염(OA)의 전형적인 증상을 초래하도록 충분히 커질 수 있다. 따라서, 골관절염은 관절 변형, 불안정성, 손상, 및 통증을 초래하는 퇴행성, 진행성, 및 불구성(crippling) 장애이다. 궁극적으로, 관절 대체 수술(joint replacement surgery)이 개체에게 적어도 부분적으로 소정 수준의 가동성을 회복시키기 위한 유일한 실용적인 수단일 수 있다.
IL-1 상과(superfamily)는 열, 프로스타글란딘 합성(예를 들면, 섬유아세포, 근육 세포 및 내피 세포에서), T-림프구 활성화, 및 인터류킨-2 생산을 포함하는 광범위한 생물학적 및 생리학적 효과를 갖는 염증 과정의 매개인자들로 구성된다. IL-1 상과의 본래의 구성원은 IL-1α, IL-1β, 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra, IL-1RA, IL-1ra, IL-1Rα)이다. IL-1α 및 IL-β는 감염에 대한 면역 방어에 포함된 전-염증성 사이토카인이다. IL-1Rα는 IL-1α 및 IL-1β와 결합하는 수용체에 대해 경쟁하여, 면역 활성화에 있어서 이들의 역할을 차단한다. IL-1 상과의 다른 구성원으로는 IL-18[참조: Dinarello (1994) FASEB J. 8(15):1314-1325; Huising et al. (2004) Dev. Comp. Immunol. 28(5):395-413] 및 IL-1α, IL-1β 또는 IL-1RA와 구조적 상동성을 지닌, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, 및 IL1F10으로 명명된, 6개의 추가의 유전자가 포함된다. 따라서, IL-1α, IL-1β 및 IL-1RA는 각각 IL-1F1, IL-1F2, 및 IL-1F3으로 재명명되어 왔다[참조: Sims et al. (2001) Trends Immunol. 22(10):536-537; Dunn et al. (2001) Trends Immunol. 22(10):533-536]. IL-1 과(family)의 추가의 추정적인 구성원은, 당해 명칭이 HGNC 유전자 과의 명명법 데이터베이스에서 공식적으로 허용되어 있지 않지만, IL-33 또는 IL-1F11이라고 칭하여 기술되어 왔다.
IL-1α 및 IL-1β 둘 다는 대식세포, 단핵구, 및 수지상 세포에 의해 생산된다. 이들은 감염에 대한 신체의 염증 반응의 중요한 부분을 형성한다. 이들 사이토카인은 내피 세포 상에서 부착 인자의 발현을 증가시켜 백혈구를 감염 부위로 이동(transmigration)시킬 수 있도록 하고 시상하부 온도조절 센터를 재설정시켜, 열로서 자체 발현하는 증가된 체온을 초래한다. 따라서, IL-1은 내인성 발열원이라고 칭한다. 증가된 체온은, 신체의 면역계가 감염과 싸우도록 돕는다. 또한, IL-1은 조혈의 조절에 있어서 중요하다. 말초 조직에서 IL-1β 생산은 또한 열과 관련된 통각과민증(통증에 대한 증가된 민감성)과 관련되어 있다[참조: Morgan et al. (2004) Brain Res. 1022(1-2):96-100]. IL-1은 통증과 관련된 사이클로옥시게나제-2 (COX-2)의 발현을 상향조절한다. 대부분의 경우, IL-1α 및 IL-1β는 동일한 세포 수용체에 결합한다. 당해 수용체는 많은 부분에서 특정의 다른 수용체와 공유되어 있는 경로를 통해 세포내 신호를 전송하는, 2개의 관련되어 있지만, 동일하지 않은 소단위로 구성된다. 이들은 선천적 면역 수용체 및 IL-18 수용체의 Toll 계열을 포함한다. IL-1α 및 IL-1β는 또한 열, 느린 파형 수면, 및 호중구증가증의 유도, T- 및 B-림프구 활성화, 섬유아세포 증식, 특정 세포에 대한 세포독성, 콜라게나제의 유도, 간 급성기 단백질의 합성, 및 콜로니 자극 인자 및 콜라겐의 증가된 생산을 포함하는 유사한 생물학적 특성을 지닌다.
IL-1α 및 IL-1β를 암호화하는 cDNA가 분리되어 발현되어 왔으며; 이들 cDNA는 IL-1α[참조: Lomedico et al. (1984) Nature 312:458] 및 IL-1β[참조: Auron et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7909]로 명명된 2개의 상이한 유전자 생성물을 나타낸다. 8개의 인터류킨 1 계열 유전자는 염색체 2 상에 사이토카인 유전자 클러스터(cluster)를 형성한다. IL-1β는 mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 사람 단핵구에 의해 생산된 우세한 형태이다. 사람 IL-1의 2개 형태는 단지 26%의 아미노산 상동성을 공유한다. 이들의 명백한 폴리펩타이드 서열에도 불구하고, IL-1의 2개 형태는, 아미노산 상동성이 IL-1 분자의 별개의 영역에 한정된다는 점에서 구조적 유사성을 갖는다[참조: Auron et al. (1985) J. Mol. Cell Immunol. 2:169].
IL-1α 및 IL-1β는 전구체 펩타이드로서 생산된다. 다시 말해서, 이들은 긴 단백질로서 제조된 후 프로세싱되어 성숙한 단백질이라고 칭하는, 보다 짧은, 활성 분자를 방출한다. IL-1α는 칼파인에 의해 단백질분해적으로 프로세싱되어 여전히 잘 연구되어 있지 않은 메커니즘으로 방출되는 프로단백질(proprotein)로서 생산된다. 예를 들어, 성숙한 IL-1β는 카스파제-1 또는 인터류킨-1 전환 효소(ICE)라고 칭하는, 단백질의 카스파제 계열의 특정 구성원에 의한 절단 후 Pro-IL-1β로부터 방출된다. 사람 IL-1 상과의 각각의 구성원의 성숙한 형태의 3-차원 구조는 배럴-형 단백질(barrel-shaped protein)을 생산하는 12 내지 14개의 β-쇄로 구성된다.
IL-1α는 연골 재흡수를 증가시키는데 있어서의 이의 효과로 인하여 "카타볼린(catabolin)"으로 본래 명명되었지만, 또한 활막 세포내에서의 콜라게나제 및 프로스타글란딘에 대한 이의 자극 효과로 인하여 "단핵구 세포 인자"(MCF)로서, 및 급성기 반응에 대한 자극 효과를 갖는 "백혈구 내인성 인자(LEM)"로서도 명명된다. IL-1α는 단핵구, 대식세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 림프구와 같은 다수의 상이한 세포에 의해 합성되며, 다수의 세포는 IL-1α에 대해 특이적인 수용체를 지니므로, IL-1α는 광범위한 스펙트럼(광범위)의 생물학적 활성을 지닌다. IL-1α는 IL-2 방출, B-세포 성숙 및 증식, 및 섬유아세포 성장 인자 활성을 유도함으로써 흉선 세포 증식을 자극한다. IL-1α 단백질은 내인성 발열원으로 확인되며 활막 세포로부터 프로스타글란딘 및 콜라게나제의 방출을 자극하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, IL-1α는 또한 각종 장애 및 장애의 증상에 대한 트리거(trigger)로서 중심 위치를 점유한다. 이들 장애는 흔히 거의 치료되지 않거나 치료되지 않는 주로 심각한 장애이다. 이들 유전자의 다형성(polymorphism)은 류마티스 관절염 및 알츠하이머병과 관련된 것으로 제안되어 왔다. 일반적으로 IL-1은 관절염, 폐 섬유증, 중추 신경계의 질환, 진성 당뇨병, 및 특정의 심혈관 질환을 포함하는 다수의 사람 질환과 연루되어 왔다. IL-1α의 바람직하지 않은 효과는 예를 들면, 문헌[참조: Oppenheim et al. (1986) Immunol. Today 7:45-56, Durum et al. (1985) Ann. Rev. Immunol. 3:263-287 및 Symons et al. (1989) Lymphokine Res. 8:365-372]에 기술되어 있다.
OA의 발병, 유지, 및 진행은, IL-1이 중심 역할을 하는 기계적 및 생화학적 경로의 복잡한 캐스케이드(cascade)에 의해 매개된다. IL-1α 및 IL-1β는 단핵구, 대식세포, 및 호중구에 의해서뿐만 아니라, 연골세포, 활막 섬유아세포, 및 파골세포와 같은 관절 조직내 세포에 의해서도 생산된다[참조: 예를 들면, Dinarello et al. (2009) Ann. Rev. Immunol. 27: 519-550]. 시험관내에서, IL-1은 연골세포 및 활막세포를 자극하여 OA를 초래하는 연골 파괴에 관여하는 프로테이나제를 생산할 수 있으며[참조: 예를 들면, Dayer et al. (1977) Science 195: 181-183; Dayer et al. (1984) Biochem. Pharmacol. 33: 2893-2899; McGuire-Goldring et al. (1984) Arthritis Rheum. 27: 654-662], 또한 정상의 유리질 연골의 세포외 매트릭스(ECM)의 주요 구성원인, 프로테오글리칸 및 콜라겐 제II 형의 합성을 억제한다[참조: 예를 들면, Goldring et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 16724-16729; Goldring et al. (1988) J. Clin. Investig. 82: 2026-2037]. 전임상 및 임상 연구가 OA의 발병에 있어서 IL-1의 추가의 증거를 제공하여 왔다. 예를 들어, IL-1의 동물 무릎내로의 관절내(ia) 주사는 백혈구 침윤 및 연골 손실을 초래하였다[참조: Pettiphar et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8749-8753]. 대조적으로, IL-1 길항제의 ia 주사는 실험적 OA의 진행에 있어서 유의적인 감소를 초래하였다[참조: 예를 들면, Pelletier et al. (1997) Arthritis Rheum. 40: 1012-1019; Caron et al. (1996) Arthritis Rheum. 39: 1535-1544); Fernandes et al. (1999) Am. J. Pathol. 154: 11590-11690); Zhang et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 341: 202-208]. 또한, IL-1 녹아웃(knockout: KO) 마우스는 이들의 야생형 상대물과 비교하여 외과적으로 유도된 연골 손상에 대해 내성인 것으로 밝혀졌다[참조: Glasson et al. (2009) Osteoarthritis Cartilage, 18: 572-580].
IL-1α 및 IL-1β 둘 다는 사람 OA 환자의 활막, 연골, 및 윤활액 내에서 발현된다[참조: 예를 들면, Farahat et al. (1993) Ann. Rheum. Dis. 52: 870-875]. IL-1 수용체 길항제인, IL-1 길항제, 아나킨라(Anakinra), 및 IL-1 수용체 모노클로날 항체인 AMG-108은 증상 및 연골보호와 관련한 OA 시험에서 일부 효능이 입증되었다[참조: "Results from a Randomized Controlled Trial of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R type I) in Patients With Osteoarthritis of the Knee" Cohen et al., ACR2007]. 이들 제안된 치료요법 둘 다는 명확하고 풍부한 임상 효능을 입증하기 위하여 추가의 연구를 기다리고 있다.
골관절염으로 고생하는 개체를 치료하기 위한 새롭고 효과적인 방법 및 조성물에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 골관절염(OA)을 치료하고 통증을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 개체(사람 또는 다른 포유동물)에게 IL-1α 및 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질을 투여함을 포함한다.
본 발명의 한 양상에서, 개체(사람 또는 다른 포유동물)에서 골관절염을 치료하기 위한 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 단백질을 IL-1β에 결합하는 결합 단백질과 조합하여 투여하거나 (예를 들면, 혼합물로, 연속적인 투여에 의해, 또는 동시 투여에 의해) 개체에게 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시형태에서, 개체에서 골관절염을 치료하는 방법은 개체에게 IL-1α에 결합하는 결합 단백질을 투여함을 포함하며, 여기서, 상기 결합 단백질은 IL-1α에 대한 항체, 예를 들면, IL-1α에 대한 모노클로날 항체이다. 다른 실시형태에서, 개체에서 골관절염을 치료하는 방법은 개체에게 IL-1β에 결합하는 결합 단백질을 투여함을 포함하며, 여기서, 상기 결합 단백질은 IL-1β에 결합하는 항체, 예를 들면, IL-1β에 결합하는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 다른 양상에서, 개체(사람 또는 다른 포유동물)에서 골관절염을 치료하는 방법은 개체에게 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 결합 단백질은 IL-1α에 결합하는 적어도 하나의 결합 부위 및 IL-1β에 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 이원 가변 도메인 면역글로불린 결합 단백질(또한 본원에서 "DVD-IgTM" 또는 "DVD-Ig" 결합 단백질 또는 분자로 언급됨)이다. 보다 바람직하게는, DVD-Ig 결합 단백질은 IL-1α에 결합하는 2개의 결합 부위 및 IL-1β에 결합하는 2개의 결합 부위를 포함한다.
다른 실시형태에서, 개체에서 골관절염을 치료하기 위한 본 발명에 따른 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결합 단백질의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 골관절염을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질 및 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 투여함을 포함한다. 본 발명에서 유용한 이러한 결정화된 결합 단백질은 결정화된 항체 IL-1α, IL-1β에 대한 결정화된 항체, 및 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 DVD-Ig 결합 단백질을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
개체에서 골관절염을 치료하기 위한 본 발명의 방법에서 유용한 조성물은, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 방출하기 위한 조성물을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명에 따른 골관절염을 치료하기 위한 방법에서 유용한 조성물은:
(a) IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질; 및 임의로 성분을 포함하는 제형; 및
(b) 적어도 하나의 중합체성 담체를 포함한다.
한 실시형태에서, 상기 기술한 조성물은 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질 및 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질 둘 다의 조합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질은 결정화된 항체, 예를 들면, IL-1α에 결합하는 결정화된 모노클로날 항체이며, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질은 결정화된 항체, 예를 들면, IL-1β에 결합하는 모노클로날 항체이다.
한 실시형태에서, 위에서 기술한 조성물은 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결정화된 결합 단백질은 IL-1α 및 IL-1β-Ig 둘 다에 결합하는 결정화된 이원 가변 도메인(DVD-Ig) 결합 단백질이다.
다른 실시형태에서, 개체에서 골관절염을 치료하기 위한 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질 둘 다의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하고; 여기서, 상기 적어도 하나의 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(오가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화된 폴리사카라이드, 이들의 블렌드(blend) 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체이다.
한 실시형태에서, 상기한 조성물 중에 임의의 성분(ingredient)이 존재하는 경우, 이 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 상기한 골관절염을 치료하는 방법은 개체에게 제2 제제를 투여함을 추가로 포함하며, 여기서 제2 제제는 상기 방법 또는 당해 방법에 사용된 조성물에 추가의 바람직한 특성을 제공한다. 이러한 제2 제제는 부데노사이드, 표피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF의, LT의, IL-2의, IL-6의, IL-7의, IL-8의, IL-12의, IL-13의, IL-15의, IL-16의, IL-18의, IL-23의, EMAP-II의, GM-CSF의, FGF의 및 PDGF의 항체, CD2의, CD3의, CD4의, CD8의, CD-19의, CD25의, CD28의, CD30의, CD40의, CD45의, CD69의, CD90의 또는 이들의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제(complement inhibitor), 아드레날린 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염성 사이토카인, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 및 TGFβ로 이루어진 그룹 중 하나 이상의 분자일 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 기술된 골관절염을 치료하는 방법은, 본원에 기술된 하나 이상의 결합 단백질 또는 본원에 기술된 조성물을, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 낭내, 연골내, 강내(intracavitary), 복내(intracelial), 소뇌내, 대뇌실내(intracerebroventricular), 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 협측(buccal), 설하, 비강내 및 경피로부터 선택된 하나 이상의 방식으로 투여함을 포함한다.
본 발명의 한 양상에서, 개체(사람 또는 기타 포유동물)에서 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결합 단백질을 IL-1β에 결합하는 결합 단백질과 함께 투여하거나(예를 들면, 혼합물로, 연속적 투여에 의해 또는 동시 투여에 의해) 또는 개체에게 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법 및 조성물은 암, 신경병성 통증, 근육 통증, 관절 통증, 골절 통증, 상처 통증, 수술에 의한 통증, 두통, 편두통, 및 이질통증(이질통증성 통증), 통각과민증, 및 이질통증과 통각과민증의 조합과 같은 통증 병태를 포함하는, 임의의 유형의 통증을 갖는 개체에서 통증을 치료하는데 사용할 수 있다.
한 실시형태에서, 개체에서 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결합 단백질을 투여함을 포함하며, 여기서, 상기 결합 단백질은 IL-1α에 대한 항체, 예를 들면, IL-1α에 대한 모노클로날 항체이다. 다른 실시형태에서, 개체에서 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1β에 결합하는 결합 단백질을 투여함을 포함하며, 여기서, 상기 결합 단백질은 IL-1β에 결합하는 항체, 예를 들면, IL-1β에 결합하는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 다른 양상에서, 개체에서 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 결합 단백질은 IL-1α에 결합하는 적어도 하나의 결합 부위 및 IL-1β에 결합하는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 이원 가변 도메인 면역글로불린 결합 단백질(본원에서 "DVD-IgTM" 또는 "DVD-Ig" 결합 단백질 또는 분자로서도 언급됨)이다. 바람직하게는, DVD-Ig 결합 단백질은 IL-1α에 결합하는 2개의 결합 부위 및 IL-1β에 결합하는 2개의 결합 부위를 포함한다.
다른 실시형태에서, 개체에서 통증을 치료하기 위한 본 발명에 따른 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결합 단백질의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 한 실시형태에서, 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질 및 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 투여함을 포함한다. 본 발명에서 유용한 이러한 결정화된 결합 단백질로는 IL-1α에 대한 결정화된 항체, IL-1β에 대한 결정화된 항체, 및 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 DVD-Ig 결합 단백질이 포함되지만, 이들에 제한되지 않는다.
개체에서 통증을 치료하기 위한 본 발명의 방법에 유용한 조성물은 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 방출하기 위한 조성물을 포함한다.
한 실시형태에서, 본 발명에 따른 통증을 치료하기 위한 방법에 유용한 조성물은,
(a) 제형(여기서, 상기 제형은, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질 둘 다의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질; 및 임의로 하나의 성분을 포함한다); 및
(b) 적어도 하나의 중합체성 담체를 포함한다.
한 실시형태에서, 상기한 조성물은, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질 둘 다의 조합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질은, 결정화된 항체, 예를 들면, IL-1α에 결합하는 결정화된 모노클로날 항체이고, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질은, 결정화된 항체, 예를 들면, IL-1β에 결합하는 모노클로날 항체이다.
한 실시형태에서, 상기한 조성물은 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결정화된 결합 단백질은 IL-1α 및 IL-1β-Ig 둘 다에 결합하는 결정화된 이원 가변 도메인(DVD-Ig) 결합 단백질이다.
다른 실시형태에서, 개체에서 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질, IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질과 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질 둘 다의 조합물, 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 결정화된 결합 단백질을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화된 폴리사카라이드, 이들의 블렌드 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체이다.
한 실시형태에서, 임의의 성분이 상기한 조성물 중에 존재하는 경우, 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 상기한 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 제2 제제를 투여함을 추가로 포함하며, 여기서, 제2 제제는 상기 방법 또는 당해 방법에 사용된 조성물에 추가의 바람직한 특성을 제공한다. 이러한 제2 제제는 부데노사이드, 표피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF의, LT의, IL-2의, IL-6의, IL-7의, IL-8의, IL-12의, IL-13의, IL-15의, IL-16의, IL-18의, IL-23의, EMAP-II의, GM-CSF의, FGF의 및 PDGF의 항체, CD2의, CD3의, CD4의, CD8의, CD-19의, CD25의, CD28의, CD30의, CD40의, CD45의, CD69의, CD90의 또는 이들의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염성 사이토카인, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 및 TGFβ로 이루어진 그룹 중 하나 이상의 분자일 수 있다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에 기술된 바와 같이 통증을 치료하는 방법은, 개체에게 본원에 기술된 하나 이상의 결합 단백질 또는 본원에 기술된 조성물을 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 대뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 협측, 설하, 비강내 및 경피로부터 선택된 하나 이상의 방식으로 투여함을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-1 발현과 관련된 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체에서 통증을 치료하는 방법을 제공한다. 개체에서 이러한 IL-1 발현은 개체의 혈장 및/또는 국부 조직에서 증가된 IL-1 수준을 초래할 수 있다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여, 골관절염, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염(Lyme arthritis), 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 피부염, 피부 경화증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키 질환(Kawasaki's disease), 그레이브 질환(Grave's disease), 신 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근 경색, 애디슨 질환(Addison's disease), 산발성 다분비선 결핍증 제I형, 다분비선 결핍증 제II형[슈미트 증후군(Schmidt's syndrome)], 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응음성 관절병증, 관절병증, 라이터 질환(Reiter's disease), 건선성 관절병증, 궤양성 대장염 관절병증, 장병성 활막염, 클라미디아-관련 관절병증, 여시니아-관련 관절병증, 살모넬라-관련 관절병증, 척추관절병증, 죽상 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리 질환(Royal Free disease), 만성 피부점막 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 증후군, 후천성 면역결핍증 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증-후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련 폐 질환, 쇼그렌 질환(Sjoegren's disease) 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 확산 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 기관지 폐색증, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 제1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드(lupoid) 간염), 제2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 가시세포증을 갖는 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화 담관염, 제1형 건선, 제2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 중성구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿 패스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절성 다발동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 발열, 류마티스성 척추염, 스틸 질환, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 질환/동맥염, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 간경변, 알코올-유도된 간 손상, 담즙울혈, 특이체질성 간 질환, 약물-유도된 간염, 비-알코올성 지방간, 알레르기, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 장애(예를 들면, 우울증 및 정신 분열증), Th2 유형 및 Th1 유형 매개된 질환, 급성 및 만성 통증(다양한 형태의 통증), 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 무베타지방단백혈증, 말단 청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 프로세스, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암종, 이소성 심방 박동, 후천성 면역 결핍증(AIDS) 치매 합병증, 알코올-유도된 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식편 거부, 알파-1-안티트립신 결핍증, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 퇴화, 항-CD3 치료요법, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화, 동정맥루, 운동실조, 심방 세동(지속 또는 발작), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 각 차단(bundle branch block), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 화상, 심장 부정맥, 심장 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 우회 염증 반응(cardiopulmonary bypass inflammation response), 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다소성 심방 빈맥, 화학치료요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병리, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐심증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환(Creutzfeldt-Jakob disease), 배양 음성 패혈증(culture negative sepsis), 낭포성 섬유증, 사이토카인 치료요법 관련 장애, 권투선수 치매, 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부학적 병태, 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환, 확산성 루이체 질환(diffuse Lewy body disease), 확장된 울혈성 심근증, 기저핵의 장애, 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 약물-유도된 운동 장애, 약물 민감성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염(Epstein-Barr virus infection), 피부 홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 태아의 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조(Friedreich's ataxia), 기능성 말초 동맥 장애, 진균 패혈증, 가스 괴저(gas gangrene), 위궤양, 사구체 신염, 임의의 장기 또는 조직의 이식편 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발상 세포 백혈병, 할러포르덴-스파츠 질환(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액 투석, 용혈성 요독 증후군/혈전용해성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, A형 간염, 히스속 부정맥(His bundle arrhythmias), HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 운동과다성 운동 장애, 과민 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족성 운동 장애, 시상 하부-뇌하수체-부신 축 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스 관절염, 소아 척추 근육 위축증, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계의 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌수막염, 수막염 구균혈증, 대사성 편두통 두통, 특발성 편두통 두통, 미토콘드리아 멀티시스템 장애, 혼합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다중 시스템 변성 (멘첼, 데제린-토마스, 쉬-드라거, 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium intracellulare), 마이코박테리움 투베르큘로시스(mycobacterium tuberculosis), 골수이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈성 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신장염, 신장증, 신경 퇴행성 질환, 신경성 근육 위축증, 호중구 감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 분지의 폐색, 폐색성 동맥 장애, OKT3® 치료요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관절제술 반전 과정, 장기비대증(organomegaly), 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 악성 종양의 부종양 증후군/고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증성 질환, 다년성 비염, 심장주위 질환, 말초 죽상 동맥경화성 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포 자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 감마글로불린병증, 및 피부 변화 증후군), 관류 후 증후군, 펌프 후 증후군, MI-후 심장절개 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압증, 방사선 치료요법, 레이노이드 현상, 레이노이드 질환, 레프섬 질환(Refsum's disease), 정규 협소 QRS 빈맥, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근증, 육종, 노인성 무도병, 루이체 유형의 노인성 치매, 혈청반응음성 관절병증, 쇼크, 겸상 세포 빈혈, 피부 동종이식편 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특정 부정맥, 척추성 운동실조, 척수 소뇌 변성, 스트렙토코커스 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성(subacute) 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계의 매독, 전신성 아나필락시스(systemic anaphylaxis), 전신성 염증 반응 증후군, 전신성 개시 소아 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관확장증, 폐색성 혈전혈관염, 혈소판 감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민 반응, IV형 과민성, 불안정 협심증, 요독증, 요로성 패혈증, 두드러기, 판막성 심장 질환, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염, 바이러스-관련 혈구탐식성 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke- Korsakoff syndrome), 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식편 거부, 급성 관상동맥 증후군, 급성 특발성 다발성 신경염, 급성 염증성 탈수초성 다발성 근신경병증, 급성 허혈, 성인 스틸 질환(adult Still's disease), 원형탈모증, 아나필락시스, 항-인지질 항체 증후군, 재생 불량성 빈혈, 동맥경화, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 청력 손실, 자가면역 림프구증식 증후군(ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 조기 난소 부전, 안검염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 파국적 항인지질 증후군, 셀리악 질환, 경부 척추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증에 대한 위험을 갖는 임상적으로 독립된 증후군(CIS), 유년기 개시형 정신 장애, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨성 망막병증, 추간판 탈출증(disk herniation), 추간판 이탈(disk prolapse), 약물-유도된 면역 용혈성 빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 상공막염, 다형 홍반, 주요 다형 홍반, 임신성 유천포창, 길랑-바레 증후군(GBS), 건초열, 휴즈 증후군(Hughes syndrome), 특발성 파킨슨 질환, 특발성 간질성 폐렴, IgE-매개된 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염(inclusion body myositis), 감염성 안 염증성 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환(Kussmaul disease) 또는 쿠스마울-마이어 질환(Kussmaul-Meier disease), 란드리 마비(Landry's paralysis), 랑게르한스 세포 조직구증, 망상 피반, 황반 변성, 현미경적 다발혈관염, 베체트병(Morbus Bechterew), 운동 신경 장애, 점막 유천포창, 다발성 장기 부전, 중증 근무력증, 골수이형성 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A형 비-B형 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절(pauciarticular) JRA, 말초 동맥 폐색 질환(PAOD), 말초 혈관 질환(PVD), 말초 동맥 질환(PAD), 정맥염, 결절성 다발동맥염(또는 결절성 동맥주위염), 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다관절 JRA, 다내분비 결핍 증후군, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 펌프-후 증후군, 원발성 파킨슨 질환, 전립선암 및 직장암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 전립선염, 순수 적혈구 무형성증, 1차 부신 기능부전, 재발성 시신경 척수염, 재협착증, 류마티스 심장 질환, SAPHO(활막염, 여드름, 농포증, 골형성과다증 및 골염), 2차 아밀로이드증, 쇼크 폐(shock lung), 공막염, 좌골 신경통, 2차 부신 기능부전, 실리콘 관련 결합 조직 질환, 스네돈-윌킨슨 피부병(Sneddon-Wilkinson dermatosis), 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 전신성 염증 반응 증후군, 일시적 동맥염(temporal arteritis), 톡소플라스믹 망막염(toxoplasmic retinitis), 독성 표피 괴사 용해, 횡단성 척수염, TRAPS(종양 괴사 인자 수용체 타입 1 (TNFR)-관련 주기적 증후군), 제1형 알레르기 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 일반적인 간질성 폐렴(UIP), 혈관염, 춘계 각결막염, 바이러스성 망막염, 보그트-고야나기-하라다 증후군(VKH syndrome), 습윤 황반 변성, 및 상처 치유를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체에서 통증을 치료한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 본원의 특허청구범위의 청구항 16에 따른 개체에서 통증을 치료하고, 여기서, 개체는 원발성 암, 전이성 암, 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담도암, 소장암, 결장암, 요로암, 신장암, 방광암, 요로상피암, 여성 생식기암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모암, 임신성 영양아세포 질환, 남성 생식기암, 전립선암, 정낭암, 고환암, 생식 세포 종양, 내분비선암, 갑상선암, 부신암, 뇌하수체암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 골암, 연조직암, 카포시 육종, 뇌의 종양, 신경암, 안암, 수막암, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경아세포종, 신경초종(Schwannoma), 수막종, 조혈 악성 종양으로부터 생성되는 고형 종양, 백혈병, 호지킨 림프종, 및 비-호지킨 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환을 앓고 있다.
도 1a는 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig) 작제물의 도식적 표현이며, 2명의 모 항체로부터 DVD-Ig 분자를 생성하기 위한 전략을 나타낸다.
도 1b는 DVD1-Ig, DVD2-Ig, 및 2개의 키메라, 단일특이적, 모노클로날 항체 2D13.E3(항-IL-1α) 및 13F5.G5(항-IL-1β)에 대한 유전적 작제물의 도식적 표현을 나타낸다. "VHβ" 및 "VLβ"는 각각 IL-β에 결합하는 13F5.G5 항체의 항원 결합 부위의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 나타낸다. "VHα" 및 "VLα"는 각각 IL-1α에 결합하는 3D12.E3 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 나타낸다. "L"은 리더 서열(leader sequence)을 나타낸다. DVD2-Ig에 대한 유전적 작제물의 다이아그램에서, "VHβ"와 "VHα" 사이 및 "VLβ"와 "VLα" 사이의 수평 표시는 링커 서열(linker sequence)의 존재를 나타낸다.
도 2는 골관절염의 관절 불안정 모델(JIM)에서 마우스의 관절 연골의 조직학적 점수매김(histology scroring)의 막대 그래프를 나타낸다. 막대 그래프의 각각의 세트는 4개의 처리 그룹: 인산염 완충된 염수(PBS) 비히클 단독("PBS"), 항-IL-1α 모노클로날 항체("항-IL-1α mAb"), 항-IL-1β 모노클로날 항체("항-IL-1β mAb"), 및 항-IL-1α와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합("항-IL-1α mAb + 항-IL-1β mAb")으로 처리한 그룹에서 마우스의 무릎내 관절 연골에 대한 점수매김을 제공한다. 각각의 세트 내에서 개개의 막대 그래프는 3개의 별도의 구역에 대한 총 조직학 점수 및 점수들을 나타내며, 여기서, 각각의 구역은 내측 정강 연골의 영역의 1/3을 차지한다(구역 1: 내부 구역, 구역 2: 중간 구역, 및 구역 3: 외부 구역). 좌측으로부터 우측으로: 내측 정강 구역 1, 2, 및 3에 대한 총 점수의 막대 그래프; 내측 정강 구역 1에 대한 점수의 막대 그래프; 내측 정강 구역 2에 대한 점수의 막대 그래프; 및 내측 정강 구역 3에 대한 점수의 막대 그래프. 실시예 3.3.1을 참조한다.
도 3은 골관절염의 관절 불안정 모델(JIM)에서 마우스의 관절 연골의 조직학적 점수매김의 막대 그래프를 나타낸다. 막대 그래프의 각각의 세트는 4개의 처리 그룹: PBS 비히클 단독("비히클"), 항-IL-1α 모노클로날 항체와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합[("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)"], 6mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질["IL-1α/β DVD-Ig (6mg/kg)"], 및 12mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질["IL-1α/β DVD-Ig (12mg/kg)"]로 처리한 그룹에서 마우스의 무릎내 관절 연골에 대한 점수매김을 제공한다. 각각의 세트 내에서 개개의 막대 그래프는 3개의 별도의 구역에 대한 총 조직학 점수 및 점수들을 나타내며, 여기서, 각각의 구역은 내측 정강 연골의 영역의 1/3을 차지한다(구역 1: 내부 구역, 구역 2: 중간 구역, 및 구역 3: 외부 구역). 좌측으로부터 우측으로: 내측 정강 구역 1, 2, 및 3에 대한 총 점수의 막대 그래프; 내측 정강 구역 1에 대한 점수의 막대 그래프; 내측 정강 구역 2에 대한 점수의 막대 그래프; 및 내측 정강 구역 3에 대한 점수의 막대 그래프. 실시예 3.3.2를 참조한다.
도 4는 골관절염의 관절 불안정 모델(JIM)에서 마우스의 관절 연골의 조직학적 점수매김의 막대 그래프를 나타낸다. 막대 그래프의 각각의 세트는 4개의 처리 그룹: PBS 비히클 단독("비히클"), 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)의 조합["항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)"], 항-IL-1β 모노클로날 항체(12mg/kg)["항-IL-1β mAb(12mg/kg)"], 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)["항-IL-1β mAb(6mg/kg)"], 및 항-IL-1β 모노클로날 항체(3mg/kg)["항-IL-1β mAb(3mg/kg)"]로 처리된 그룹에서 마우스의 무릎내 관절 연골에 대한 점수매김을 제공한다. 각각의 세트 내에서 개개의 막대 그래프는 3개의 별도의 구역에 대한 총 조직학 점수 및 점수들을 나타내며, 여기서, 각각의 구역은 내측 정강 연골의 부위의 1/3을 차지한다(구역 1: 내부 구역, 구역 2: 중간 구역, 및 구역 3: 외부 구역). 좌측으로부터 우측으로: 내측 정강 구역 1, 2, 및 3에 대한 총 점수의 막대 그래프; 내측 정강 구역 1에 대한 점수의 막대 그래프; 내측 정강 구역 2에 대한 점수의 막대 그래프; 및 내측 정강 구역 3에 대한 점수의 막대 그래프. 실시예 3.3.3을 참조한다.
도 5는 PBS 비히클 단독("비히클"), 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)의 조합["항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)"], 6mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질["IL-1α/β DVD(6mg/kg)"], 및 12mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질["IL-1α/β DVD(12mg/kg)"]로 처리한 경우에 골관절염의 관절 불안정 모델에 있어서 동물에 자이모산(zymosan)-유도된 IL-6 생산(pg/ml)의 수준을 나타낸다. 실시예 3.3.4를 참조한다.
도 6은 PBS 비히클("비히클"), 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)의 조합["항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)"], 및 6mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질["IL-1α/β DVD(6mg/kg)"]로 처리한 골관절염의 내측 반월상연골 탈안정화(DMM) 모델에 있어서 동물내 연골 퇴행(degeneration)에 대한 총 합 점수를 나타낸다. 실시예 3.3.5를 참조한다.
도 7은 골관절염의 내측 반월상연골 탈안정화(DMM) 모델에 있어서 동물에서의 연골 퇴행에 대한 각종 처리의 8주 연구 결과를 나타낸다. 각각의 막대 그래프는 PBS 비히클 단독("비히클"), 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)("항-IL-1α mAb 6　mg/kg"), 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)("항-IL-1β 6　mg/kg"), 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)의 조합["항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)"], 1.5mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질("IL-1α/β DVD 1.5mg/kg"), 3mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질("IL-1α/β DVD 3mg/kg"), 또는 6mg/kg으로의 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질("IL-1α/β DVD 6mg/kg")로 처리한 동물에서 연골 퇴행에 대한 평균 합 점수를 나타낸다. 실시예 3.3.6을 참조한다.
도 8은 골관절염의 내측 반월상연골의 탈안정화(DMM) 모델에 있어서 동물을 비히클 단독("비히클"), 독시사이클린(30mg/kg)["독시사이클린(30mg/kg)"], 또는 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)의 조합("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)")으로 처리한 4주 연구의 결과를 나타낸다. 실시예 3.3.7을 참조한다.
도 9는 7, 14, 21, 28, 및 35일째 DMM 수술한 마우스의 발에서 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. DMM 발("DMM")의 발 움추림 역치는 반대측(비-수술) 발("반대측") 및 허위 수술("허위")로부터의 발과 비교하여 유의적으로 감소하였다. DMM 발은 7일 정도로 일찍 이질통증이 있었고 이러한 통증 거동은 35일째까지 나타났다. 실시예 4를 참조한다.
도 10은 비히클 단독("PBS 대조군"), IgG 이소형 대조군(확립된 질환 및 통증에 대한 양성 대조군 "IgG 대조군"), 또는 항-IL-1α와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합["항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)"]으로 처리하고 5주(35일) 후 반대측(비-수술) 발("반대측") 및 허위 수술("허위")로부터의 발과 비교한 DMM 마우스에서의 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. 실시예 4를 참조한다.
도 11은 35일 동안 IgG 이소형 대조군(확립된 질환 및 통증에 대한 양성 대조군)으로 미리 처리한 후 항-IL-1α 또는 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합을 투약하고 24시간 후의 36일째에 ("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β(6mg/kg)(투약 24 시간 후)")에 발 움추림 역치에 대해 시험한 DMM 마우스에서의 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. 비교를 위해, 5주(35일) 후, 반대측(비-수술) 발("반대측"), 허위 수술 발("허위"), 비히클 단독("PBS 대조군"), IgG 이소형("IgG 대조군"), 및 항-IL-1α과 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)")으로 처리한 수술한 발에 대해 35일째의 발 움추림 역치 값을 제공하였다. 당해 데이터는, IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 중화가, 확립된 통증을 지닌 마우스에서 이질통증을 유의적으로 역전시켰음을 나타낸다. 실시예 4를 참조한다.
도 12는 4주 동안 주당 2회로 PBS 비히클 단독("비히클"), 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)("항-IL-1α mAb(6mg/kg)"), 항-IL-1β 모노클로날 항체 (6mg/kg)("항-IL-1β mAb(6mg/kg)"), 또는 항-IL-1α 모노클로날 항체(6mg/kg)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(6mg/kg)의 조합("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)")으로 복강내(ip) 투여한 DMM 마우스에서의 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. 동물을 28일째에 이질통증에 대해 시험하였다. "반대측" 막대 그래프는 대표적인 비-수술(반대측) 사지의 발 움추림 역치를 제공한다. 비히클로 처리한 그룹에서 동물의 동측(수술) 사지는 반대측(비-수술) 사지와 비교하여 또는 허위 수술("허위")을 거친 동물과 비교하여 이질통증(고통스러움)이 있었다.
도 13은 4주 동안 4일마다 1mg/kg("항-IL-1α mAb(1mg/kg) + 항-IL-1β mAb(1mg/kg)")으로, 3mg/kg("항-IL-1α mAb(3mg/kg) + 항-IL-1β mAb(3mg/kg)")으로, 또는 6mg/kg("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)")으로 둘 다 복강내(ip) 투여한, PBS 비히클 단독("비히클") 또는 항-IL-1α 모노클로날 항체와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합으로 처리한 DMM 마우스에서의 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. 동물을 28일째에 시험하였다. PBS 비히클 단독으로 처리한 그룹에서 동물의 동측(수술) 사지는 반대측(비-수술) 사지("반대측")와 비교하여 또는 허위 수술("허위")을 거친 동물과 비교하여 이질통증(고통스러움)이 있었다. 당해 결과는, 항-IL-1α 모노클로날 항체와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합을 사용한 처리가 DMM 마우스에서 용량 관련된 방식으로 이질통증 발달을 방지함을 입증한다. 실시예 6을 참조한다.
도 14는, 확립된 골관절염 및 기계적 이질통증을 지닌 DMM 마우스를 27일째에 항-IL-1α 모노클로날 항체와 항-IL-1β 모노클로날 항체으로 조합으로 처리하고, 둘 다 28일째에 이질통증에 대해 시험하기 24시간 전에 1mg/kg("항-IL-1α mAb(1mg/kg) + 항-IL-1β mAb(1mg/kg)"), 3mg/kg("항-IL-1α mAb(3mg/kg) + 항-IL-1β mAb(3mg/kg)"), 또는 6mg/kg("항-IL-1α mAb(6mg/kg) + 항-IL-1β mAb(6mg/kg)")으로 복강내(ip) 투여한 경우의 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. 비히클("비히클")로 처리한 그룹에서 동물의 동측(수술) 사지는 반대측(비-수술) 사지("반대측")와 비교하여 또는 허위 수술("허위")을 거친 동물과 비교하여 이질통증(고통스러움)이 있었다. 당해 결과는, 항-IL-1α 모노클로날 항체와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합을 사용한 처리가, 확립된 질환을 가진 DMM 마우스에서 확립된 이질통증을 용량 관련된 방식으로 역전시킴을 나타낸다. 실시예 7을 참조한다.
도 15는 마우스 카라기난-유도된 염증성 통증(통각과민증) 모델에서 동물에서의 발 움추림 잠복기(초, "s")의 막대 그래프를 나타낸다. 족부내에 카라기난을 주사한 후 30시간째에, 마우스를 항-IL-1α 모노클로날 항체 단독(900㎍)("항-IL-1α mAb"), 항-IL-1β 모노클로날 항체 단독(900㎍)("항-IL-1β mAb"), 항-IL-1α 모노클로날 항체 (900㎍)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(900㎍)의 조합("항-IL-1α mAb + 항-IL-1β mAb"), PBS 비히클("PBS"), 또는 IgG 이소형 대조군("IgG")으로 처리하였다. 다른 그룹에는 카라기난의 족부내 투여 후 47 및 95시간째에 단일 용량(30mg/kg)의 디클로페낙(비-스테로이드성 소염 진통 대조군)을 투여하였다. 카라기난의 족부내 투여 후 48시간(도 15a) 및 96시간(도 15b)째에 복사열 자극을 이용한 열 통각과민증 시험을 수행하였다. 채워진 막대는 대조군 발(카라기난 비 투여)에 대한 발 움추림 잠복기를 나타낸다. 채워지지 않은 막대는 카라기난이 투여된 발에 대한 발 움추림 잠복기를 나타낸다. 실시예 8을 참조한다.
도 16은 마우스에서 마우스 카라기난-유도된 염증성 통증(통각과민증) 모델에서 동물의 발 움추림 잠복기(초, "s")의 막대 그래프를 나타낸다. 족부내에 카라기난을 주사한 후 30시간째에, 마우스에게 비히클("PBS"), IgG 이소형 대조군("IgG"), 또는 항-IL-1α 모노클로날 항체와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합의 3회 용량 중 1회로 처리하였고, 여기서, 각각의 모노클로날 항체는 100㎍["항-IL-1α mAb(100㎍) + 항-IL-1β mAb(100㎍)"], 300㎍["항-IL-1α mAb(300㎍) + 항-IL-1β mAb(300㎍)"], 또는 900㎍["항-IL-1α mAb(900㎍) + 항-IL-1β mAb(900㎍)"]으로 투여되었다. 다른 그룹에는 카라기난의 족부내 투여 후 47 및 95 시간째에 단일 용량(30mg/kg)의 디클로페낙(비-스테로이드성 소염 진통 양성 대조군)을 투여하였다. 카라기난의 족부내 투여 후 48시간(도 16a) 및 96시간(도 16b)째에 복사열 자극을 사용한 열 통각과민증 시험을 수행하였다. 채워진 막대는 대조군 발(카라기난 비 투여)에 대한 발 움추림 잠복기를 나타낸다. 채워지지 않은 막대는 카라기난 투여된 발에 대한 발 움추림 잠복기를 나타낸다. 실시예 9를 참조한다.
도 17은 마우스에서 CFA("완전 프로인트 보조제(Complete Freund's Adjuvant) 염증성 통증 모델에서 항-IL-1α와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합 치료요법의 시험 결과를 나타낸다. 족부내 CFA 주사 후 30시간째에, 마우스에게 항-IL-1α 모노클로날 항체(900㎍)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(900㎍)의 조합, PBS 비히클("PBS"), 또는 IgG 이소형 대조군("IgG")으로 처리하였다. 다른 그룹에는 CFA의 족부내 투여 후 47시간째에 단일 용량(30mg/kg)의 디클로페낙(비-스테로이드성, 소염성 진통 양성 대조군)을 투여하였다. CFA 투여 후 48시간째에 폰 프라이 모노필라멘트(von Frey monofilament)를 사용하여 동물의 기계적 이질통증 시험을 수행하였다. 도 17a는 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. 채워진 막대는 반대측(CFA 비투여) 대조군 발에 대한 발 움추림 역치를 나타낸다. 채워지지 않은 막대는 처리 그룹의 동물에서 CFA 투여된 발에 대한 발 움추림 역치를 나타낸다. 도 17b는 처리 그룹의 동물에 대한 효능의 크기(% MPE)에 대한 막대 그래프를 나타낸다. 실시예 10을 참조한다.
도 18은 신경병성 통증의 L5/L6 척추 신경 라이게이션(SNL) 마우스 모델의 동물에서의 발 움추림 역치(그람, "g")의 막대 그래프를 나타낸다. SNL 수술 후 6일째에 동물을 항-IL-1α 모노클로날 항체(900㎍)와 항-IL-1β 모노클로날 항체(900㎍)의 조합("항-IL-1α mAb + 항-IL-1β mAb"), PBS 비히클("PBS"), 또는 IgG 이소형 대조군("IgG")으로 처리하였다. SNL 수술 후 24 시간(도 18a) 및 72 시간(도 18b)째에 폰 프라이 모노필라멘트를 사용한 동물의 기계적 이질통증 시험을 수행하였다. 양성 대조군으로서 시험하기 1시간 전에 다른 그룹을 가바펜틴(100mg/kg, "Gabapentin")으로 처리하였다. 실시예 11을 참조한다.
도 19는 도 18에 대해 기술된 바와 같이 24 및 72시간째에 동물 처리 그룹에 대한 효능의 크기(% MPE)에 대한 막대 그래프를 나타낸다. "비히클"은 PBS 비히클로 처리한 SNL 동물을 나타낸다. "IgG"는 IgG 이소형 대조군으로 처리한 SNL 동물을 나타낸다. "IL-1αβ"는 항-IL-1α 모노클로날 항체(900㎍)와 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합으로 처리한 동물을 나타낸다. 실시예 11을 참조한다.
본 발명은, 인터류킨-1(IL-1)의 기능을 차단하는 것이 개체(사람 또는 기타 포유동물)에서 골관절염(OA)을 치료하기에 효과적인 수단일 수 있다는 발견에 기반한다. 본 발명에 따라서, OA를 치료하기 위한 IL-1 기능의 차단은 개체에게 IL-1α 및 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 단백질을 투여함으로써 달성할 수 있다. 이러한 "이원-특이적"인 치료요법은 OA 환자에게 IL-1α에 결합하는 결합 단백질(예를 들면, 항체) 및 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(예를 들면, 항체)을 투여함으로써 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 다가의 및 다중특이적인 결합 단백질을 투여함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 유용한 이러한 다가의 및 다중특이적인 결합 단백질은 이원 가변성 도메인 면역글로불린 결합 단백질(본원에서 "DVD-IgTM" 또는 "DVD-Ig" 결합 단백질 또는 분자로서도 언급됨)을 포함한다. 예를 들면, 문헌[PCT 공보 제WO 2007/024715호 및 Wu et al. (2007) Nature Biotech. 25(11): 1290-1297]을 참조한다. IL-1α 및 IL-1β 결합 단백질의 특정 조합 또는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 특이적인 DVD-Ig 분자가 OA의 관절 불안정성 모델(JIM), 또는 OA의 내측 반월상연골 탈안정화(DMM) 모델과 같은 OA의 동물 모델을 사용하여 평가할 수 있다. 문헌[Glasson et al. (2007) Osteoarthrit. Cart. 15(9):1061-9]을 참조한다.
본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당해 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 그러나, 용어들의 의미 및 범위는, 어떠한 잠재적 모호성의 경우에, 명백해질 것이며, 본원에 제공된 정의는 어떠한 사전적 또는 고유의 정의보다 앞선다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 경우, 단순 용어는 복수를 포함할 수 있으며, 복수 용어는 단수를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는", 및 "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 형태들의 사용은 제한되지 않는다. 또한, "요소(element)" 또는 "구성원(component)"과 같은 용어는 달리 구체적으로 기술하지 않는 한 하나 이상의 소단위를 포함하는 하나의 단위 및 요소 및 구성원을 포함하는 요소 및 구성원 둘 다를 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질 및 핵산 화학, 및 핵산 하이브리드화와 함께, 및 이의 기술에서 사용된 명명법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용된 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당해 분야에 잘 공지된 통상의 방법에 따라서 및 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전체에서 인용되고 논의된 각종의 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 당해 분야에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기술된 바와 같이 제조업자의 지침에 따라 수행한다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약제 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 과정 및 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술을 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료에 사용한다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 선택된 용어가 하기에 정의된다.
용어 "폴리펩타이드"는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 의미한다. 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 용어 폴리펩타이드와 상호교환적으로 사용되며 또한 아미노산의 중합체 쇄를 말한다. 용어 "폴리펩타이드"는 단백질 서열의 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 폴리펩타이드 유사체(analog)를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"는 이의 천연 상태에서 이를 동반한 천연적으로 관련된 구성원들과 관련되어 있지 않은 이의 기원 또는 유도체의 공급원에 의해, 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나 천연에서 발생하지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 이로부터 천연적으로 기원하는 세포와는 상이한 세포계에서 합성되거나 화학적으로 합성되는 폴리펩타이드가 이의 천연적으로 관련된 구성원들로부터 "분리"될 것이다. 또한, 단백질은 당해 분야에 잘 공지되어 있는 단백질 정제 기술을 사용하여, 분리에 의해 천연적으로 관련된 구성원을 실질적으로 함유하지 않도록 할 수 있다.
용어 "회수"는 분리, 예를 들면, 당해 분야에 잘 공지되어 있는 단백질 정제 기술을 사용하여 천연적으로 관련된 구성원을 실질적으로 함유하지 않는 폴리펩타이드와 같은 화학 종(chemical species)이 되도록 하는 공정을 의미한다.
용어 "사람 IL-1α"(본원에서 "hIL-1α" 또는 "IL-1α"로서도 약기함)는 각종 면역 반응, 염증 과정, 및 조혈에 관여하는 다면발현성 사이토카인을 포함한다. 예를 들면, IL-1α는 활성화된 대식세포에 의해 생산된 사람 사이토카인을 포함하며; 이는 IL-2 방출, B-세포 성숙 및 증식, 및 섬유아세포 성장 인자 활성을 유도함으로써 흉선 증식을 자극한다. 용어 "사람 IL-1α"는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있는 재조합 사람 IL-1α ("rh IL-1α")를 포함하도록 의도된다.
용어 "사람 IL-1β"(본원에서 "hIL-1β", 또는 "IL-1β"로서도 약기함)는 각종 면역 반응, 염증 과정, 및 조혈에 관여하는 다면발현성 사이토카인을 포함한다. 용어 사람 "IL-1β"는 표준 재조합 발현 방법에 의해 제조될 수 있는 재조합 사람 IL-1β("rh IL-1β")를 포함한다.
사람 IL-1α 및 IL-1β의 아미노산 서열은 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pat00001
용어 "생물학적 활성"은 사이토카인의 모든 고유의 생물학적 특성을 말한다. IL-1α 및 IL-1β의 생물학적 특성은 IL-1 수용체에 대한 결합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"생물학적 활성"은 IL-1α의 모든 고유의 생물학적 특성을 말한다. IL-1α의 생물학적 특성은 IL-1α 수용체에 대한 결합; IL-2 방출, B-세포 성숙 및 증식, 및 섬유아세포 성장 인자 활성을 유도함에 의한 흉선 세포 증식의 자극을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
항체, 단백질, 또는 펩타이드와 제2의 화학 종의 상호작용을 참조하여, 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은, 당해 상호작용이 화학 종에서 특정 구조(예를 들면, 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존함을 의미하고, 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특이적인 단백질 구조를 인식하여 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응물 중에서 에피토프 A(또는 유리되거나, 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "항체"는 면역글로불린(Ig) 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 보유하는, 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄, 또는 임의의 기능성 단편, 이의 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자를 말한다. 이러한 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체성 항체 양식은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이의 비제한적 실시형태는 하기에 논의된다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약기함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약기함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 골격 영역(FR)이라고 명명된, 보다 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 명명된 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들면, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 소부류로 이루어질 수 있다.
용어 항체의 "항원-결합부"는 항원(예를 들면, hIL-1α)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 또한, 이러한 항체 실시형태는 2개 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는, 이특이적, 이중 특이적 또는 다중-특이적인 양식을 가질 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함된 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인, Fab 단편; (ii) 힌지 영역(hinge region)에서 이황화물 브릿지(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일의 가변성 도메인을 포함하는, dAb 단편[참조: Ward et al. (1989) Nature 341:544-546, PCT 공보 제WO 90/05144호]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자[단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 참조: 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 하는 합성 링커(linker)에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체(scFv)는 또한 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디(diabody)와 같은 다른 형태의 단일쇄 항체도 포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인이 단일의 폴리펩타이드 쇄 상에서 발현되지만, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이룸으로써 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원 결합 부위를 생성하도록 하기에 너무 짧은 링커를 사용한다[참조: 예를 들면, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123]. 이러한 항체 결합부는 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Kontermann and Duebel eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001) (ISBN 3-540-41354-5)].
용어 "항체 작제물"은 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 연결된 본 발명의 하나 이상의 항원 결합부를 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 하나 이상의 항원 결합부를 연결하기 위해 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123]. 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 말한다. 사람 IgG 중쇄(감마) 및 경쇄(카파 및 람다) 불변 도메인 아미노산 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
Figure pat00002
또한 추가로, 항체 또는 이의 항원-결합부는 항체, 또는 이의 항원 결합부와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유결합성 또는 비공유결합성 회합에 의해 형성된 보다 큰 면역부착 분자(immunoadhesion molecule)의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체성(tetrameric) scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙트아비딘 코어 영역의 사용[참조: Kipriyanov, S. et al. (1995) Human Antibod. Hybridomas 6:93-101], 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용[참조: Kipriyanov, S. et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058]을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체의 항원 결합부는 각각 전체 항체의 파파인 또는 펩신 소화와 같은 통상의 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 이의 항원 결합부, 및 면역부착 분자는 본원에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
"분리된 항체"는, 항원 특이성이 상이한 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는 항체(예를 들면, hIL-1α에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hIL-1α 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 함유하지 않는다)를 말한다. 그러나, hIL-1α에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터의 IL-1α 분자와 같은, 다른 항원에 대해 교차-반응성을 지닐 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 사람 항체는 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3에서 사람 생식계열 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "사람 항체"는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열이 사람 골격 서열 상에 절편이식된 항체를 포함하지 않는다.
용어 "재조합 사람 항체"는 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기, IIC 단락에서 추가로 기술됨), 재조합체, 조합 사람 항체 라이브러리로부터 분리된 항체[참조: Hoogenboom, H. (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70; Azzazy and Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo and Larrick (2000) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21: 371-378], 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식되는 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체[참조: 예를 들면, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann and Green (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13: 593-597; Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364-370)] 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 분리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 분리된 모든 사람 항체를 포함한다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 사람 Ig 서열에 대해 유전자 이식된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 행하므로 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이와 관련되지만, 생체내에서 사람 항체 생식계열 레퍼토리(repertoire) 내에 천연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예를 들면, 사람 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 말한다.
용어 "CDR-절편이식된 항체"는, 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 영역의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예를 들면 사람 CDR(예를 들면, CDR3) 중 하나 이상이 예를 들면, 사람 IL-1α에 대한 뮤린 모노클로날 항체로부터 수득된 바와 같은 뮤린 CDR 서열로 대체된 사람 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 말한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 3개의 CDR이 존재하고, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지정된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원 결합 부위의 단일 가변 영역(즉, VH 또는 VL) 내에 발생하는 3개의 CDR의 그룹을 말한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 차등적으로 정의되어 왔다. 카밧(Kabat)에 의해 기술된 시스템[참조: Kabat et al. (1987, 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland)]은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명료한 잔기 번호매김 시스템(residue numbering system)을 제공할 뿐만 아니라 또한 3개의 CDR을 정의하는 정밀한 잔기의 경계도 제공한다. 이들 CDR은 카밧 CDR로 언급될 수 있다. 쵸티아(Chothia) 및 공동연구자[참조: Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 및 Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883]는, 카밧 CDR내 특정의 소-부위가 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고, 거의 동일한 펩타이드 골격 구조를 채택함을 발견하였다. 이들 소-부분은 L1, L2, 및 L3 또는 H1, H2, 및 H3으로 지정되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지정한다. 이들 영역은 카밧 CDR과 오버랩(overlap)되는 경계를 갖는 쵸티아 CDR로 언급될 수 있다. 카밧 CDR과 오버랩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌[참조: Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139 및 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-745]에 기술되어 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 비록 이들이 특정 잔기 또는 잔기의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의적으로 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 관점에서 축소되거나 확장될 수 있다고 해도, 카밧 CDR과 오버랩될 것이다. 본원에 사용된 방법은, 비록 특정 실시형태가 카밧 또는 쵸티아 정의된 CDR을 사용한다고 해도, 이들 시스템 중 어느 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다.
용어 "카밧 번호매김", "카밧 정의" 및 "카밧 표지화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 항체, 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호매김 시스템을 말한다[참조: Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 및 Kabat, E. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역(hypervariable region)은 CDR1에 대해 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3에 대해 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역의 경우, 초가변영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3에 대해 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
지난 20년에 걸쳐 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 아미노산 서열의 집중적인 공공의 데이터베이스의 성장 및 분석은 가변 영역 서열 내의 골격 영역(FR)과 CDR 서열 사이의 대표적인 경계의 이해를 가져왔으며 당해 분야의 숙련가가 카밧 번호매김, 쵸티아 번호매김, 또는 다른 시스템에 따라 CDR을 정확하게 측정할 수 있도록 하였다. 예를 들면, 문헌[Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," In Kontermann and Duebel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), chapter 31, pages 432-433]을 참조한다. 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역의 아미노산 서열내 카밧 CDR의 아미노산 서열을 측정하는 유용한 방법은 하기에 제공된다:
CDR-L1 아미노산 서열을 확인하기 위해서:
VL 영역의 아미노 말단으로부터 대략 24개 아미노산 잔기에서 출발한다;
CDR-L1 서열 이후의 잔기는 항상 시스테인(C)이다;
CDR-L1 서열 이전의 잔기는 항상 트립토판(W) 잔기이고, 전형적으로 Trp-Tyr-Gln(W-Y-Q)이지만, 또한 Trp-Leu-Gln(W-L-Q), Trp-Phe-Gln(W-F-Q), 및 Trp-Tyr-Leu(W-Y-L)이다;
길이는 전형적으로 10 내지 17개 아미노산 잔기이다.
CDR-L2 아미노산 서열을 확인하기 위해서:
CDR-L1의 말단 이후의 16개 아미노산으로 항상 시작한다;
CDR-L2 서열 이전의 잔기는 일반적으로 Ile-Tyr(I-Y)이지만, 또한 Val-Tyr(V-Y), Ile-Lys(I-K), 및 Ile-Phe(I-F)이다;
길이는 항상 7개 아미노산 잔기이다.
CDR-L3 아미노산 서열을 확인하기 위해서:
CDR-L2의 말단 이후의 33개 아미노산으로 항상 시작한다;
CDR-L3 아미노산 서열 이전의 잔기는 항상 시스테인(C)이다;
CDR-L3 서열 이후의 잔기는 항상 Phe-Gly-X-Gly(F-G-X-G)(서열번호 7)이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다;
길이는 전형적으로 7 내지 11개 아미노산 잔기이다.
CDR-H1 아미노산 서열을 확인하기 위해서:
VH 영역의 아미노 말단으로부터 대략 31개 아미노산 잔기 및 시스테인 (C) 이후의 항상 9개 잔기로 출발한다;
CDR-H1 서열 앞의 잔기는 항상 Cys-X-X-X-X-X-X-X-X(서열번호 151)이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다;
CDR-H1 서열 이후의 잔기는 항상 Trp(W)이고, 전형적으로 Trp-Val(W-V)이지만, 또한 Trp-Ile(W-I), 및 Trp-Ala(W-A)이다;
길이는 전형적으로 5 내지 7개 아미노산 잔기이다.
CDR-H2 아미노산 서열을 확인하기 위해서:
CDR-H1의 말단 이후의 15개 아미노산 잔기로 항상 출발한다;
CDR-H2 서열 앞의 잔기는 전형적으로 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(L-E-W-I-G)(서열번호 8)이지만, 다른 변형도 있다;
CDR-H2 서열 뒤의 잔기는 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala(K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A)이다;
길이는 전형적으로 16 내지 19개 아미노산 잔기이다.
CDR-H3 아미노산 서열을 확인하기 위해서:
CDR-H2의 말단 이후의 33개 아미노산 잔기로 항상 및 시스테인(C) 이후의 3개 아미노산 잔기로 항상 출발한다;
CDR-H3 서열 앞의 잔기는 항상 Cys-X-X(C-X-X)이고, 여기서 X는 임의의 아미노산, 전형적으로 Cys-Ala-Arg(C-A-R)이다;
CDR-H3 서열 뒤의 잔기는 항상 Trp-Gly-X-Gly(W-G-X-G)(서열번호 9)이고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다;
길이는 전형적으로 3 내지 25개 아미노산 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "수용체" 및 "수용체 항체"는 골격 영역 중 하나 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 항체 또는 핵산 서열을 말한다. 일부 실시형태에서, 용어 "수용체"는 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 말한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 "수용체"는 골격 영역 및 불변 영역(들) 중 하나 이상을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 말한다. 특정 실시형태에서, 용어 "수용체"는 골격 영역 중 하나 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 말한다. 당해 실시형태에 따라서, 수용체는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에서 발생하지 않는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 10개 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 수용체 골격 영역 및/또는 수용체 불변 영역(들)은 예를 들면, 생식계열 항체 유전자, 성숙한 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들면, 당해 분야에 잘 공지되어 있는 항체, 개발 중인 항체, 또는 시판되는 항체)로부터 유도되거나 수득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정규(canonical)" 잔기는 문헌[참조: Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 및 Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817]에 정의된 바와 같이 특정 정규 CDR 구조를 정의하는 CDR 또는 골격 내의 잔기를 말한다. 쵸티아 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요 부분은 아미노산 서열의 수준에서의 큰 다양성에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 백본 입체구조를 갖는다. 각각의 정규 구조는 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 인접한 분절에 대한 펩타이드 백본 비틀림 각(backbone torsion angle)의 세트를 주로 규정한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "공여체" 및 "공여체 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 말한다. 한 실시형태에서, 공여체 항체는, 골격 영역이 수득되거나 유도되는 항체와는 상이한 종 유래의 항체이다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여체 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-사람 항체를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "골격" 또는 "골격 서열"은 가변 영역에서 CDR을 뺀 나머지 서열을 말한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템으로 측정될 수 있기 때문에, 골격 서열의 의미는 상응하게 상이한 해석에 적용된다. 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3, 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 골격 영역을 각각의 쇄 상의 4개의 소-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누며, 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, 그리고 CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정 소-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로 규정하지 않으면서, 다른 사람들에 의해 언급된 것으로서, 골격 영역은 단일의, 천연적으로 발생하는 면역글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합된 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, FR은 4개의 소-영역 중 하나를 나타내고, FR은 골격 영역을 구성하는 4개의 소-영역 중 2개 이상을 나타낸다.
사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 표 3 및 표 4에 기술된 서열로부터 선택된다.
[표 3]
Figure pat00003
[표 4]
Figure pat00004
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생식계열 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위한 유전적 재배열 및 돌연변이를 초래하는 성숙화 공정을 겪지 않은 비-림프구 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 말한다[참조: 예를 들면, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30]. 본 발명의 각종 실시형태에 의해 제공된 이점들 중 하나는, 생식계열 항체 유전자가 성숙한 항체 유전자 보다 종 내에서 개체의 특징적인 필수 아미노산 서열 구조를 더 보존하는 경향이 있고, 따라서 상기 종에서 치료학적으로 사용되는 경우 외부 종 유래인 것으로 인식되는 경향이 적다는 인식에서 기인한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "주요(key)" 잔기는 항체, 특히 사람화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 더 많은 영향을 미치는 가변 영역 내의 특정 잔기를 말한다. 주요 잔기는 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다: CDR에 인접한 잔기, 강력한 글리코실화 부위(N- 또는 O-글리코실화 부위일 수 있다), 드믄 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 정규 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 베르니어 구역(Vernier zone) 내의 잔기, 및 가변 중쇄 CDR1의 쵸티아 정의와 제1 중쇄 골격의 카밧 정의 사이에 오버랩된 영역 내의 잔기.
용어 "사람화된 항체"는 비-사람 종(예를 들면, 마우스)으로부터 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 여기서 VH 및/또는 VL 서열 중 적어도 일부가 보다 "사람-유사하게" 변경되는, 즉, 사람 생식계열 가변 서열과 보다 유사한 항체를 말한다. 사람화된 항체의 한 유형은 CDR-절편이식된 항체이고, 여기서, 비-사람 CDR 서열은 사람 VH 및 VL 서열내로 도입되어 상응하는 비-사람 골격(FR) 서열을 대체한다. 예를 들면, "사람화된 항체"는 목적한 항원에 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 골격(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 변이체, 유도체, 유사체, 또는 이의 단편이다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR과 관련하여 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 말한다. 사람화된 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 중 모두를 실질적으로 포함하고, 여기서, CDR 영역 중 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린(즉, 공여체 항체)의 모두 또는 실질적으로 모두에 상응하며 골격 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린 컨센서스 서열(consensus sequence)의 모두 또는 실질적으로 모두이다. 한 실시형태에서, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 사람 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄뿐만 아니라 중쇄의 적어도 가변 도메인 둘 다를 함유한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 경쇄만을 함유한다. 일부 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 중쇄만을 함유한다. 구체적인 실시형태에서, 사람화된 항체는 단지 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 함유한다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 이소형도 포함하는 면역글로불린의 임의의 부류로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 하나 이상의 부류 또는 이소형으로부터의 서열을 포함할 수 있으며, 특정 불변 도메인은 당해 분야에 잘 공지되어 있는 기술을 사용하여 바람직한 효과기 기능을 최적화하기 위해 선택할 수 있다.
사람화된 항체의 골격 및 CDR 영역은 모 서열에 정확하게 상응할 필요가 없고, 예를 들면, 공여체 항체 CDR 또는 컨센서스 골격은 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이됨으로써 이러한 부위에서 CDR 또는 골격 잔기는 공여체 항체 또는 컨센서스 골격에 상응하지 않게 될 수 있다. 그러나, 한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 일반적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 적어도 95%가 모 FR 및 CDR 서열의 것들에 상응할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 골격"은 컨센서스 면역글로불린 서열내 골격 영역을 말한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련된 면역글로불린 서열의 계열내에 가장 흔히 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)으로부터 형성된 서열을 말한다[참조: 예를 들면, Winnaker (1987) From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany)]. 따라서, "컨센서스 면역글로불린 서열"은 "컨센서스 가변 도메인" 및/또는 "컨센서스 불변 도메인"을 포함할 수 있다. "컨센서스 가변 도메인"은 최종적으로 하나 이상의 "컨센서스 골격 영역" 및/또는 하나 이상의 "컨센서스 CDR"을 포함할 수 있다. 면역글로불린 계열에서, 컨센서스 서열내 각각의 위치는 당해 계열의 이러한 위치에서 가장 흔히 발생하는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산이 동등하게 흔히 발생하는 경우, 이들 중 어느 하나는 컨센서스 서열 내에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "베르니어" 구역은 문헌[참조: Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499]에 기술된 바와 같이 CDR 구조를 조절할 수 있고 피트(fit)를 항원에 미세-조절할 수 있는 골격 잔기의 소세트를 말한다. 베르니어 구역 잔기는 CDR 아래에 놓인 층을 형성하고, CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "다가 결합 단백질"은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 다가 결합 단백질은 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 가공되며, 일반적으로 천연적으로 발생하는 항체가 아니다. 용어 "다특이적인 결합 단백질"은 2개 이상의 관련되거나 관련되지 않은 표적을 결합시킬 수 있는 결합 단백질을 말한다. 이중 가변성 도메인(DVD) 결합 단백질은, 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하며 4가 또는 다가 결합 단백질인 결합 단백질이다. 이러한 DVD 결합 단백질은 단일특이적, 즉, 하나의 항원에 결합할 수 있거나, 다특이적, 즉, 2개 이상의 항원에 결합할 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD-IgTM 분자로서 언급된다. DVD-IgTM 분자의 각각의 1/2은 중쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원 결합 부위당 항원 결합에 관여하는 총 6개의 CDR를 지닌 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. DVD 결합 단백질 및 DVD 결합 단백질을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,612,181호에 기술되어 있다.
본 발명의 한 양상은 사람 IL-1α에 결합할 수 있는 결합 단백질을 포함하는 DVD 결합 단백질에 관한 것이다. 다른 양상에서, DVD 결합 단백질은 IL-1α 및 제2 표적에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, DVD 결합 단백질은 IL-1α 및 IL-1β에 결합할 수 있다.
용어 "중화하는"은, 결합 단백질이 사이토카인에 특이적으로 결합하는 경우 사이토카인의 생물학적 활성의 중화를 말한다. 한 실시형태에서, 중화 결합 단백질은 중화 항체이며, hIL-1α에 대한 이의 결합은 hIL-1α의 생물학적 활성의 억제를 초래한다. 한 실시형태에서, 중화 결합 단백질은 hIL-1α에 결합하여 hIL-1α의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100%까지 감소시킨다. 중화 결합 단백질에 의한 hIL-1α의 생물학적 활성의 억제는 당해 분야에 잘 공지된 hIL-1α 생물학적 활성의 하나 이상의 지시인자를 측정함으로써 평가할 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 펩타이드 결정인자를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화를 포함하며, 특정 실시형태에서, 특이적인 3차원 구조 특성, 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합된 항원의 영역이다. 따라서, 에피토프는 특이적인 결합 파트너의 상보성 부위에 결합하는 것으로 알려진 항원(또는 이의 단편)의 영역의 아미노산 잔기로 이루어진다. 항원성 단편은 하나 이상의 에피토프를 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 이의 표적 항원을 인식하는 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어진다. 항체가 교차-경쟁(하나는 다른 하나의 결합 또는 조절 효과를 방지한다)하는 경우, 항체는 "동일한 에피토프에 결합"하는 것으로 일컬어진다. 또한, 에피토프의 구조적 정의(오버랩핑, 유사한, 동일한)은 유익하지만, 기능적 정의는 흔히, 이들이 구조적(결합) 및 기능적(조절, 경쟁) 매개변수를 포함하므로 더 관련이 있다.
용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BIACORETM 시스템(제조원: 스웨덴 업살라 및 미국 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재하는 Biacore International AB, a GE Healthcare company)을 사용하여 바이오센서 매트릭스내에서 단백질 농도에 있어서의 변경을 검출함으로써 실시간 생물특이적인 상호작용의 분석을 허용하는 광학적 현상을 말한다. 추가의 기술에 대해서는, 문헌[참조: Jonsson, U. et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U. et al. (1991) BioTechniques 11: 620-627; Johnsson, B. et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 Johnsson, B. et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]을 참조한다.
용어 "Kon"은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 예를 들면, 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 결합 단백질(예를 들면, 항체)의 회합을 위한 온 속도 상수(on rate constant)를 말한다. 또한, "Kon"은 또한 본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "결합 속도 상수", 또는 "ka"로 공지되어 있다. 이의 표적 항원에 대한 항체의 결합 속도 또는 항체와 항원 사이의 복합체 형성 속도를 나타내는 당해 값은 또한 하기 식으로 나타낸다:
항체("Ab") + 항원("Ag")→Ab-Ag.
용어 "Koff"는 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 예를 들면, 항체/항원 복합체로부터의 결합 단백질(예를 들면, 항체)의 해리를 위한 오프 속도 상수(off rate constant)를 말한다. 또한, "Koff"는 또한 본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같은 용어 "해리 속도 상수" 또는 "kd"로 공지되어 있다. 당해 값은 하기 식으로 나타낸 바와 같은, 시간에 걸쳐 이의 표적 항원으로부터의 항체의 해리 속도 또는 Ab-Ag 복합체의 유리 항체 및 항원으로의 분리의 해리 속도를 나타낸다:
Ab + Ag←Ab-Ag.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "평형 해리 상수" 또는 "KD"는 평형시 적정 측정으로 수득되거나 해리 속도 상수(koff)를 결합 속도 상수(kon)로 나누어 수득된 값을 말한다. 결합 속도 상수, 해리 속도 상수, 및 평형 해리 상수는 항원에 대한 항체의 결합 친화성을 나타내기 위해 사용된다. 결합 및 해리 속도 상수를 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 형광성-기반 기술의 사용은 평형시 생리학적 완충액 중에서 샘플을 실험하기 위한 고 민감도 및 능력을 제공한다. BIACORETM(생물분자 상호작용 분석) 검정과 같은 다른 실험적 접근법 및 장치를 사용할 수 있다(예를 들면, 스웨덴 업살라 소재의 Biacore International AB, GE Healthcare company로부터 이용가능한 장치). 또한, 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments)(미국 아이다호주 보이시 소재)로부터 이용가능한 KinExA®[역학적 배제 검정(Kinetic Exclusion Assay)] 검정을 사용할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 확인을 제공하는 표지가 도입된 단백질을 말한다. 한 양상에서, 표지는 검출가능한 마커(marker), 예를 들면, 표시된 아비딘(예를 들면, 광학적 또는 비색계 방법에 의해 검출할 수 있는 형광성 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 잔기의 폴리펩타이드에 대한 부착 또는 방사표지된 아미노산의 도입이다. 폴리펩타이드용 표지의 예는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 방사선동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들면, 3H,, 14C,, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm); 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 및 란타나이드 인), 효소 표지(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼린 포스파타제); 화학발광성 마커; 비오티닐 그룹; 2차 리포터(reporter)에 의해 인식된 소정 폴리펩타이드 에피토프(epitope)(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequences), 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 및 에피토프 태그); 및 가돌리늄 킬레이트와 같은 자기성 제제(magnetic agent).
용어 "항체 접합체"는 치료제 또는 세포독성제와 같이, 제2 화학적 모이어티에 화학적으로 연결된, 항체와 같은 결합 단백질을 말한다. 용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 한 양상에서, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
용어 "결정" 및 "결정화된"은 결정의 형태로 존재하는, 항체 또는 이의 항원 결합부를 말한다. 결정은 물질의 고체 상태의 한 형태이며, 이는 무정형 고체 상태 또는 액체 결정성 상태와 같은 다른 형태와 구별된다. 결정은 원자, 이온, 분자(예를 들면, 항체와 같은 단백질), 또는 분자 조립체(예를 들면, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고, 반복적인, 3차원적 어레이로 구성된다. 이들 3-차원 어레이는 당해 분야에 잘 이해되어 있는 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정내에서 반복되는 기본 단위, 또는 빌딩 블록(building block)은 비대칭 단위로 일컬어진다. 제공된, 잘-정의된 결정학적 대칭에 따른 배열내 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀(unit cell)"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적인 번역에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다. 문헌[참조: Giege and Ducruix(1999) Chapter 1, In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins , a Practical Approach , 2 nd ed ., (Ducruix and Giege, eds.)(Oxford University Press, New York, 1999) pp. 1-16]을 참조한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드의 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 또는 뉴클레오타이드의 어느 한 유형의 변형된 형태를 의미한다. 당해 용어는 DNA 또는 RNA의 단일가닥 및 이중가닥 형태를 포함하지만, 한 실시형태에서 이중가닥 DNA이다.
용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연에서 이것이 회합되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 회합되지 않는 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, 게놈성, cDNA, 또는 합성 기원, 또는 이들의 조합)을 의미하며, 이와 함께 이는 천연에서 작동적으로 연결되거나 이와 함께 이는 보다 큰 서열의 부분으로서 천연에서 발생한다.
용어 "벡터"는, 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는 내부에 추가의 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환형 이중가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터이고, 여기서, 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는, 이들이 도입되는 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제 기원을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)를, 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합시킬 수 있으며, 이에 의해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 또한, 특정 벡터는, 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서, "재조합 발현 벡터"(또는 단순히, "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용하기 위한 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태로 존재한다. 플라스미드는 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들면, 복제 결핍성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은, 발현 벡터의 이러한 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "작동적으로 연결된"은, 이들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 구성원들을 위치배열함을 말한다. 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 제어 서열은, 암호화 서열의 발현이 제어 서열과 혼화성(compatible)인 조건하에서 달성되는 방식으로 라이게이션된다. "작동적으로 연결된" 서열은 목적한 핵산에 인접한 발현 제어 서열, 트랜스 방식(in trans)으로 작용하는, 즉, 목적한 핵산 이외의 상이한 핵산 분자 상에 위치하지만 그럼에도 불구하고 목적한 핵산에 걸쳐 제어를 발휘하는 발현 제어 서열, 및 목적한 핵산과 같이, 그러나 이와 떨어진, 동일한 핵산 분자 상에 위치한 발현 제어 서열을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "발현 제어 서열"은, 이들이 라이게이션된 암호화 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미치기 위해 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 말한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질성 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열[예를 들면, 코작 컨센서스 서열(Kozak consensus sequence)]; 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 경우에 따라 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 이러한 제어 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하고; 원핵 세포에서, 이러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵세포에서, 일반적으로 이러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은, 이의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 구성원들을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 이의 존재가 유리한 추가의 구성원, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
"형질전환"은, 이에 의해 외인성 DNA가 숙주 세포내로 도입되는 임의의 과정을 말한다. 형질전환은 외부 핵산 서열을 예를 들면, 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 삽입시키기 위한 당해 분야에 잘 공지된 각종 방법을 사용하여 천연 또는 인공 조건 하에서 발생할 수 있다. 당해 방법은 형질전환된 숙주 세포를 기준으로 선택되며 바이러스 감염, 전기천공, 지질감염, 및 입자 충격(particle bombardment)을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 "형질전환된" 세포는, 삽입된 DNA가 자가 복제하는 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 또한 제한된 기간 동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포)는, 외인성 DNA가 도입된 세포를 말하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 특정한 대상체 세포뿐 아니라, 이러한 세포의 후대세포를 말하는 것으로 의도된다. 특정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후대 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 후대세포는 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 한 양상에서, 숙주 세포는 삶의 임의의 시기로부터 선택된 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 진핵 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 다른 양상에서, 숙주 세포는 원핵 세포주 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli); 포유동물 세포주 CHO, HEK 293, 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
표준 기술을 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들면, 전기천공 및 지질감염)에 사용할 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 또는 당해 분야에서 일반적으로 달성된 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 선행 기술 및 과정은 당해 분야에 잘 공지된 통상의 방법에 따라 및 본 명세서 전체에 인용되고 논의된 각종의 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2d ed . (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]을 참조한다.
용어 "유전자이식 유기체"는 이식유전자를 함유하는 세포를 갖는 유기체를 말하며, 여기서, 유기체(또는 유기체의 다른 선조) 내에 도입된 이식유전자는 유기체내에서 천연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "이식유전자"는, 이로부터 유전자이식 유기체가, 유전자이식 유기체의 하나 이상의 세포 유형 또는 조직내에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 지시하도록 발달하는 세포의 게놈내로 안정하게 및 작동적으로 통합되는 DNA 작제물이다.
용어 "조절하다(regulate)" 및 "조정하다(modulate)"는 상호교환적으로 사용되며 목적한 분자의 활성(예를 들면, hIL-1α의 생물학적 활성)의 변화 또는 변경을 말한다. 조정은 목적한 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 분자의 예시적인 활성 및 기능은 결합 특성, 효소 활성, 세포 수용체 활성화, 및 신호 형질도입을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
상응하게, 용어 "조정인자"는 목적 분자의 활성 또는 기능(예를 들면, hIL-1α의 생물학적 활성)을 변화시키거나 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들면, 조정인자는 조정인자의 부재하에 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기에 있어서 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조정인자는 분자의 적어도 하나의 활성 또는 기능의 크기를 감소시키는, 억제제이다. 예시적인 억제제는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디(peptibody), 탄수화물 또는 유기 소분자(small organic molecule)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 펩티바디는 예를 들면, PCT 공보 제WO　01/83525호에 기술되어 있다.
용어 "효능제"는 목적한 분자와 접촉시, 효능제의 부재시에 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기에 있어서 증가를 유발하는 조정인자를 말한다. 목적한 특정 효능제는 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 또는 임의의 다른 분자를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
용어 "길항제" 또는 "억제제"는 목적한 분자와 접촉시, 길항제의 부재시에 관찰된 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 기능의 크기에 있어서 감소를 유발하는 조정인자를 말한다. 길항제는 IL-1α 및/또는 IL-1β의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단하거나 조정하는 것을 포함한다. IL-1α의 길항제 및 억제제는 IL-1α에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 또는 임의의 다른 분자를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. IL-1β의 길항제 및 억제제는 IL-1β에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 또는 임의의 다른 분자를 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 기간을 감소시키거나 완화시키거나, 장애의 진행을 방지하거나, 장애의 퇴행을 유발하거나, 장애과 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 발달, 발병 또는 진행을 방지하거나, 장애를 검출하거나, 다른 치료요법(예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)을 향상시키거나 개선시키는 치료요법의 양을 말한다.
용어 "샘플"은 광범위한 의미로 사용된다. "생물학적 샘플"은 살아있는 것 또는 이전에 살아있었던 것으로부터의 물질의 임의의 양을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 살아있는 것은 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 물질은 혈액, 혈청, 뇨, 활액, 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
"친화성 성숙된" 항체는 이러한 변경(들)을 지니지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화성에 있어서의 개선을 초래하는 하나 이상의 CDR 또는 이의 골격에 있어서의 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰(nanomolar) 또는 심지어 피코몰(picomolar) 친화성을 가질 것이다. 친화성 성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 과정으로 생산된다. 문헌[참조: Marks et al. (1992) BioTechnology 10: 779-783]은 VH 및 VL 도메인 셔플링(domain shuffling)에 의한 친화성 성숙을 기술하고 있다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위적 돌연변이유발은 문헌[참조: Barbas et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169: 147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-3319; 및 Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889-896]에 기술되어 있다.
통증에 대한 초기 유발이 사라진 후 개체에서 지속되는 통증은 더 이상 증상이 아니지만 자체로 인식된 질환이다. 본원에 사용된 용어 "이질통증"은, 개체가 피부의 브러싱(brushing)과 같은, 전형적으로 기계적 특성의 정상적인 무해한 자극에 대해 고통스러운 반응을 경험하는 상태를 말한다. 이질통증성 통증은 침해수용기를 포함하지 않으므로 "비-침해수용기성" 통증으로서도 언급될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "통각과민증"은, 개체가 유해한 자극, 특히 고통스러운 기계적, 열적, 또는 화학적 자극과 같은, 침해수용기를 활성화하는 자극으로부터 초래되는 통증에 대해 증가된 민감성을 갖는 상태를 말한다. 침해수용기를 활성화하는 자극은 통증을 유발한다. 통각과민증은, 개체가 일반적으로 무해한 자극에 대해 증가된 통증 반응을 가지는 상태이다. 개체는 이질통증, 통각과민증, 또는 이질통증과 통각과민증의 조합으로 고생할 수 있다.
I. IL -1α 및 IL -1β에 결합하는 DVD - Ig TM 결합 단백질의 생성
하나 이상의 표적 항원(또는 에피토프)에 결합할 수 있는 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IgTM) 결합 단백질의 설계 및 생산은 기술되어 있다(참조: 예를 들면, PCT 공보 제WO 2007/024715호). 골관절염을 치료하기 위해 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 DVD-Ig 결합 단백질은 IL-1α 및 IL-1β에 결합한다. 한 실시형태에서, DVD-IgTM 결합 단백질은 적어도 2개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이며, 단, 이는 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다)를 포함하고; 여기서, 제2 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이며, 단, 이는 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않으며; n은 0 또는 1이다)을 포함한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 DVD-IgTM 결합 단백질은 2개의 항원 결합 부위를 갖는다.
다른 실시형태에서, DVD-IgTM 결합 단백질은 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하며, 여기서 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄의 각각은 각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이며, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이며, 단, 이는 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역이다)을 포함하고; 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄의 각각은 각각 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n(여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이며, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이며, 단, 이는 CH1이 아니고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않고, n은 0 또는 1이다)을 포함한다. 이러한 DVD-IgTM 결합 단백질은 4개의 항원 결합 부위를 갖는다.
예로서, 개체에서 골관절염을 치료하기 위해 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 유용한 DVD-Ig 결합 단백질은 2개(제1 및 제2 폴리펩타이드)의 VD1 가변 도메인의 회합에 의해 형성된 IL-1β에 대한 결합 부위 및 2개(제1 및 제2 폴리펩타이드)의 VD2 가변 도메인의 회합에 의해 형성된 IL-1α에 대한 결합 부위를 갖도록 가공될 수 있다. 대안적인 정렬에서, 개체에서 골관절염을 치료하기 위해 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 유용한 DVD-Ig 결합 단백질은 2개(제1 및 제2 폴리펩타이드)의 VD1 가변 도메인의 회합에 의해 형성된 IL-1α에 대한 결합 부위 및 2개(제1 및 제2 폴리펩타이드)의 VD2 가변 도메인의 회합에 의해 형성된 IL-1β에 대한 결합 부위를 가질 수 있다.
A. 모 모노클로날 항체의 생성
DVD 결합 단백질의 가변 도메인은 목적한 항원에 결합할 수 있는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함하는, 모 항체로부터 수득될 수 있다. 이들 항체는 천연적으로 발생할 수 있거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합의 사용을 포함하는 당해 분야에 공지된 광범위하게 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual , 2 nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., 1981), pages 563-581 (상기 문헌은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다)]에 교시된 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "모노클로날 항체"("mAb"로 약기함)는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는, 임의의 진핵세포, 원핵세포, 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 기원된 항체를 말하며, 이것을 생산하는 방법이 아니다. 하이브리도마는 표준 방법을 사용하여 견고한 하이브리도마 성장, 고 항체 생산 및 바람직한 항체 특성을 포함하는 바람직한 특성에 대해 선택하고, 클로닝하며 추가로 스크리닝된다. 하이브리도마는 동계 동물(syngeneic animal), 면역계가 결여된 동물, 예를 들면, 누드 마우스(nude mouse)내에서 생체내로, 또는 시험관내 세포 배양물 내에서 배양하여 증대시킬 수 있다. 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하며 증대시키는 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 바람직한 실시형태에서, 하이브리도마는 마우스 하이브리도마이다. 다른 실시형태에서, 하이브리도마는 래트, 양, 돼지, 염소, 소, 또는 말과 같은 비-사람, 비-마우스 종에서 생산된다. 다른 실시형태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마이며, 여기서, 사람 비-분비성 흑색종은 IL-1α 또는 IL-1β와 같은, 특이적인 바람직한 항원에 결합할 수 있는 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된다.
재조합 모노클로날 항체는 또한 미국 특허 제5,627,052호, PCT 공보 제WO 92/02551호 및 문헌[참조: Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]에 기술된 바와 같이, 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)과 같이 당해 분야에서 언급된 과정을 사용하여 단일의, 분리된 림프구로부터 생성된다. 당해 방법에서, 목적한 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들면, 면역화된 동물로부터 유도된 림프구가 확인되어 있으며, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA는 역 전사효소-PCR에 의해 세포로부터 구조된 후 이들 가변 영역은 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포내에서 적절한 면역글로불린 불변 영역(예를 들면, 사람 불변 영역)과 관련하여 발현될 수 있다. 이어서, 생체내 선택된 림프구로부터 유도된, 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포는 예를 들면, 형질감염된 세포를 패닝(panning)시켜 목적한 항원에 대해 항체를 발현하는 세포를 분리함으로써, 시험관내에서 추가로 분석 및 선택할 수 있다. 또한, 증폭된 면역글로불린 서열은 PCT 공보 제WO 97/29131호 및 PCT 공보 제WO 00/56772호에 기술된 것과 같은 시험관내 친화성 성숙 방법과 같이, 시험관내에서 추가로 조작할 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 사람 면역글로불린 유전자좌(locus) 중 일부 또는 전부를 포함하는 비-사람 동물을 목적한 항원으로 면역화시킴으로써 생산한다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은 XENOMOUSE 유전자이식 마우스이며, 이는 사람 면역글로불린 유전자좌의 거대 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결핍된 조작된 마우스 스트레인이다. 예를 들면, 문헌[Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21 및 US 특허 제5,916,771호; 제5,939,598호; 제5,985,615호; 제5,998,209호; 제6,075,181호; 제6,091,001호; 제6,114,598호; 및 제6,130,364호]을 참조한다. 또한 PCT 공보 제WO 91/10741호; 제WO 94/02602호; 제WO 96/34096호; 제WO 96/33735호; 제WO 98/16654호; 제WO 98/24893호; 제WO 98/50433호; 제WO 99/45031호; 제WO 99/53049호; 제WO 00/09560호; 및 제WO 00/037504호를 참조한다. XENOMOUSE 유전자이식 마우스는 완전한 사람 항체의 성인-유사 사람 레퍼토리를 생산하고, 항원-특이적인 사람 모노클로날 항체를 생성한다. XENOMOUSE 유전자이식 마우스는 사람 중쇄 유전자좌 및 x 경쇄 유전자좌의 메가염기 크기의, 생식계열 입체구조 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 대략 80%를 함유한다. 문헌[Mendez et al. (1997) Nature Genet. 15:146-156 및 Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188: 483-495]을 참조한다.
또한, 시험관내 방법을 사용하여 모 항체를 제조할 수 있으며, 여기서, 항체 라이브러리는 바람직한 결합 특이성을 갖는 항체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 재조합 항체 라이브러리의 이러한 스크리닝 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공보 제WO 92/18619호; 제WO 91/17271호; 제WO 92/20791호; 제WO 92/15679호; 제WO 93/01288호; 제WO 92/01047호; 제WO 92/09690호; 제WO 97/29131호; 및 Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acid Res. 19: 4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982, 및 US 특허 공보 제2003/0186374호]에 기술된 방법을 포함한다.
또한, 본 발명에서 유용한 모 항체는 당해 분야에 공지된 각종의 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 수반하는 파아지 입자의 표면에 나타난다. 특히, 이러한 파아지를 이용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 나타낼 수 있다. 목적한 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 항원, 예를 들면, 고체 표면 또는 비드(bead)에 결합하거나 포획된 항원 또는 표지된 항원을 사용하여 선택하거나 확인할 수 있다. 이들 방법에 사용된 파아지는 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 이황화물 안정화된 Fv 항체 도메인을 지닌 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 전형적으로 필라멘트성 파아지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 문헌[참조: Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al. (1997) Gene 187: 9-18; Burton et al. (1994) Adv. Immunol. 57:191-280; PCT 출원 제PCT/GB91/01134호; PCT 공보 제WO 90/02809호; 제WO 91/10737호; 제WO 92/01047호; 제WO 92/18619호; 제WO 93/11236호; 제WO 95/15982호; 및 제WO 95/20401호; 및 US 특허 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호 및 제5,969,108호]에 기술된 것을 포함한다.
상기 문헌들에 기술된 바와 같이, 파아지 선택 후, 파아지로부터의 항체 암호화 영역을 분리하여 사람 항체 또는 임의의 다른 바람직한 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하는데 사용하고, 예를 들면, 하기 상세히 기술된 바와 같이, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 세균을 포함하는 임의의 바람직한 숙주내에서도 발현시킬 수 있다. 예를 들면, Fab, Fab', 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하기 위한 기술은 또한 문헌[PCT 공보 제WO 92/22324호; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6): 864-869; 및 Sawai et al. (1995) AJRI 34: 26-34; 및 Better et al. (1988) Science, 240: 1041-1043]에 기술된 것과 같은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 사용할 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예는 문헌[미국 특허 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999; 및 Skerra et al. (1988) Science 240: 1038-1041]에 기술된 것을 포함한다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 대안으로, 거대한 조합 라이브러리를 스크리닝하기 위해 당해 분야에 공지된 다른 방법을 모 항체의 확인에 적용시킬 수 있다. 대안적인 발현 시스템의 한 유형은, 재조합 항체 라이브러리가 문헌[참조: Szostak 및 Roberts 등의 PCT 공보 제WO 98/31700호, 및 Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 94: 12297-12302]에 기술된 바와 같은 RNA-단백질 융합체로서 발현되는 것이다. 당해 시스템에서, 공유결합성 융합은 mRNA와 이것이 이들의 3' 말단에서 푸로마이신, 펩티딜 수용체 항생제를 수반하는 합성 mRNA의 시험관내 번역에 의해 암호화하는 펩타이드 또는 단백질 사이에서 생성된다. 따라서, 특이적인 mRNA는, 이원 특이성 항원에 대한 항체 또는 이의 부분의 결합과 같은, 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면, 항체, 또는 이의 부분의 특성을 기반으로 한 mRNA(예를 들면, 조합 라이브러리)의 복합체 혼합물로부터 농축시킬 수 있다. 이러한 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수된 항체, 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 서열은 위에서 기술한 바와 같은 재조합 수단(예를 들면, 포유동물 숙주 세포내에서)에 의해 발현될 수 있으며, 또한 mRNA-펩타이드 융합체의 추가 라운드의 스크리닝에 의한 추가의 친화성 성숙에 적용시킬 수 있으며, 여기서 돌연변이는 본래 선택된 서열(들)내로, 또는 위에서 기술한 바와 같이, 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙을 위한 다른 방법에 의해 도입시킬 수 있다.
다른 접근법에서 모 항체는 또한 당해 분야에 공지된 효모 디스플레이 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전적 방법을 사용하여 항체 도메인을 효모 세포 벽에 묶어 이들을 효모 표면에 나타낸다. 특히, 이러한 효모를 이용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들면, 사람 또는 뮤린)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 나타낼 수 있다. 모 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 미국 특허 제6,699,658호에 기술된 것들을 포함한다.
상기 기술된 항체는 추가로 변형시켜 CDR-절편이식되고 사람화된 모 항체를 생성할 수 있다. CDR-절편이식된 모 항체는 사람 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하고, 여기서, VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상은 목적한 항원에 결합할 수 있는 뮤린 항체의 CDR 서열로 대체된다. 임의의 사람 항체로부터의 골격 서열도 CDR-절편이식을 위한 주형(template)으로서 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 골격 상에의 직쇄 교체는 종종 항원에 대한 결합 친화성의 일부 손실을 초래한다. 보다 상동성인 사람 항체는 본래의 뮤린 항체에 대한 것이며 뮤린 CDR을 사람 골격과 결합시킬 가능성은 친화성을 감소시킬 수 있는 CDR내 왜곡(distortion)을 도입시킬 가능성이 마찬가지로 더 적다. 따라서, CDR과 떨어진 뮤린 가변 골격을 대체시키기 위해 선택된 사람 가변 골격이 뮤린 항체 가변 영역 골격과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. CDR과 떨어진 사람 및 뮤린 가변 영역은 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것이 보다 바람직하다. CDR과 떨어진 사람 및 뮤린 가변 영역이 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것이 훨씬 더 바람직하다. CDR과 떨어진 사람 및 뮤린 가변 영역이 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것이 가장 바람직하다. 이러한 항체를 생산하는 방법은 당해 분야(참조: EP 제239,400호; PCT 공보 제WO 91/09967호; 미국 특허 5,225,539호; 제5,530,101호; 및 제5,585,089호)에, 베니어링(veneering) 또는 재표면화(resurfacing)는 문헌[참조: EP 제592,106호; EP 제519,596호; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Engineering 7(6): 805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973]에, 및 쇄 셔플링(chain shuffling)은 문헌(참조: 미국 특허 제5,565,352호)에 공지되어 있다.
사람화된 항체는 비-사람 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자로부터의 골격 영역을 갖는 바람직한 항원에 결합하는 비-사람 종 항체로부터의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은 예를 들면, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin- ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이러한 임포트(import) 서열을 사용하여 당해 분야에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나 결합 친화성, 온-속도(on-rate), 오프-속도(off-rate), 결합가, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나 변형시킬 수 있다.
사람 골격 영역내 골격 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환시켜 항원 결합을 변경시키거나, 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이들 골격 치환은 당해 분야에 잘 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 특정 위치에서 일반적이지 않은 골격 잔기를 확인하기 위한 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 골격 잔기를 확인하기 위한 CDR 및 골격 잔기의 상호작용의 모델화에 의해 확인한다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,585,089호; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323]을 참조한다. 3차원 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하며 당해 분야의 숙련가에게 친숙하다. 선택된 후보물 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체구조적 구조를 설명하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 점검은 후보물 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 유사한 역할의 분석, 즉, 이의 항원에 결합하기 위한 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기를, 컨센서스 및 임포트 서열로부터 선택하고 결합시켜 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화성과 같은 바람직한 특성이 달성되도록 할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다. 항체는 문헌[참조: Jones et al. (1986) Nature 321:522; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534; Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973; PCT 공보 제WO　91/09967호; 제WO　90/14443호; 제WO　90/14424호; 제WO　90/14430호; 제WO　99/06834(PCT/US98/16280)호; 제WO　97/20032(PCT/US96/18978)호; 제WO　92/11272(PCT/US91/09630)호; 제WO　92/03461(PCT/US91/05939)호; 제WO　94/18219(PCT/US94/01234)호; 제WO　92/01047(PCT/GB91/01134); 및 WO　93/06213(PCT/GB92/01755)호; EP　제0　592　106호; EP　제0　519　596호; EP　제0　239　400호; 미국 특허 제5,565,332호; 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 및 제4,816,567호]에 기술된 것들과 같은, 그러나 이들에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 사람화할 수 있다.
모 모노클로날 항체는 IL-1α 또는 IL-1β에 결합할 수 있는 각종 모노클로날 항체로부터 선택될 수 있다.
모 모노클로날 항체는 또한 임상 시험, 또는 임상 용도를 위한 개발시 사용하기 위해 승인된 각종의 치료학적 항체로부터 선택될 수 있다.
B. DVD - Ig 분자의 작제
2개의 상이한 모 모노클로날 항체로부터의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 직접적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의한 짧은 링커를 통해 나란히(in tandem) 연결된 후 경쇄 불변 도메인이 연결되도록 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig) 분자를 설계한다. 유사하게, 중쇄는 나란히 연결된 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH)에 이어서 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역을 포함한다. 문헌[PCT 공보 제WO 2007/024715호]를 참조한다.
가변 도메인은 위에서 기술한 방법들 중 어느 하나에 의해 생성된 모 항체로부터의 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 가변 도메인은 뮤린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다. 보다 바람직하게 가변 도메인은 CDR 절편이식되거나 사람화된 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인이다. 가장 바람직하게는 가변 도메인은 사람 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다.
한 실시형태에서, 제1 및 제2 가변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 직접 연결된다. 다른 실시형태에서, 가변 도메인은 링커 서열을 통해 연결된다. 바람직하게는 2개의 가변 도메인이 연결된다. 3개 이상의 가변 도메인은 또한 직접 또는 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 가변 도메인은 동일한 항원에 결합할 수 있거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 본 발명의 DVD-Ig 분자는 하나의 면역글로불린 가변 도메인 및 수용체의 리간드 결합 도메인, 효소의 활성 도메인과 같은 비-면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있다. DVD-Ig 분자는 또한 2개 이상의 비-Ig 도메인을 포함할 수 있다.
링커 서열은 단일의 아미노산 또는 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 DVD-Ig 결합 단백질을 설계하고 생산하는데 사용될 수 있는 링커 서열의 예는 AKTTPKLEEGEFSEAR(서열번호 59); AKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 60); AKTTPKLGG(서열번호 61); SAKTTPKLGG(서열번호 62); SAKTTP(서열번호 63); RADAAP(서열번호 64); RADAAPTVS(서열번호 65); RADAAAAGGPGS(서열번호 66); RADAAAA(G4S)4(서열번호 67); SAKTTPKLEEGEFSEARV(서열번호 68); ADAAP(서열번호 69); ADAAPTVSIFPP(서열번호 70); TVAAP(서열번호 71); TVAAPSVFIFPP(서열번호 72); QPKAAP(서열번호 73); QPKAAPSVTLFPP(서열번호 74); AKTTPP(서열번호 75); AKTTPPSVTPLAP(서열번호 76); AKTTAP(서열번호 77); AKTTAPSVYPLAP(서열번호 78); ASTKGP(서열번호 79); ASTKGPSVFPLAP(서열번호 80); GGSGGGGSG(서열번호 81); GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 82); GENKVEYAPALMALS(서열번호 83); GPAKELTPLKEAKVS(서열번호 84); GHEAAAVMQVQYPAS(서열번호 85); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(서열번호 86); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(서열번호 87)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 링커 서열의 선택은 몇몇의 Fab 분자의 결정 구조 분석에 기초한다. 가변 도메인과 Fab 내의 CH1/CL 불변 도메인 또는 항체 분자 구조 사이의 천연의 굴곡성 연결이 존재한다. 이러한 천연 연결은 V 도메인의 C-말단으로부터의 4 내지 6개 잔기 및 CL/CH1 도메인의 N-말단으로부터의 4 내지 6개 잔기에 의해 분포된, 대략 10 내지 12개 아미노산 잔기를 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명에 유용한 DVD-Ig 분자는 각각 DVD-Ig 분자의 경쇄 및 중쇄에서 링커로서 CL 또는 CH1의 N-말단 5 내지 6개 아미노산 잔기 또는 11 내지 12개 아미노산 잔기를 사용하여 생성된다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기, 특히 처음 5 내지 6개 아미노산 잔기는 강력한 2차 구조없이 루프 입체구조를 채택하므로, 2개의 가변 도메인 사이에서 굴곡성 링커로서 작용할 수 있다. CL 또는 CH1 도메인의 N-말단 잔기는, 이들이 면역글로불린 서열의 일부이므로 가변 도메인의 천연적 연장이며, 따라서 링커 및 연결부로부터 잠재적으로 발생하는 임의의 면역원성도 큰 정도로 최소화한다.
다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 모든 잔기는 아니지만 CL/CH1 도메인 중 임의의 길이의 임의의 서열; 예를 들면, CL/CH1 도메인의 처음 5 내지 12개 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며; 경쇄 링커는 Cκ 또는 Cλ일 수 있으며; 중쇄 링커는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를 포함하는, 임의의 이소형의 CH1으로부터 유도될 수 있다. 링커 서열은 또한 Ig-유사 단백질(예를 들면, TCR, FcR, KIR); G/S계 서열(예를 들면, G4S(서열번호 88) 반복체); 힌지 영역-유도된 서열; 및 다른 단백질로부터의 다른 천연 서열과 같은 다른 단백질로부터 유도될 수 있다.
한 실시형태에서, 불변 도메인은 재조합 DNA 기술을 사용하여 2개의 연결된 가변 도메인에 연결된다. 바람직하게는, 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 서열을 중쇄 불변 도메인에 연결시키고 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 서열을 경쇄 불변 도메인에 연결시킨다. 바람직하게는, DVD-Ig 결합 단백질이 사람에게 사용되어야 하는 경우, 불변 도메인은 각각 사람 중쇄 불변 도메인 및 사람 경쇄 고정 도메인이다. 바람직하게는, DVD-Ig 중쇄는 Fc 영역에 추가로 연결된다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역, 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 가장 바람직하게는, Fc 영역은 사람 Fc 영역이다. 바람직한 실시형태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD로부터의 Fc 영역을 포함한다.
한 실시형태에서, 2개의 중쇄 DVD-Ig 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD-Ig 폴리펩타이드를 합하여 DVD-Ig 분자를 형성시킨다. 특이적인 표적을 결합시킬 수 있는 특이적인 DVD-Ig 분자의 예 및 이의 제조 방법의 상세한 설명은 기술되어 있다. 예를 들면, PCT 공보 제WO 2007/024715호를 참조한다.
C. DVD - Ig 결합 단백질의 생산
IL-1α 및 IL-1β에 결합하고 골관절염을 치료하기 위한 본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 DVD-Ig 단백질은 당해 분야에 공지된 다수의 기술 중 어느 하나에 의해서 생산될 수 있다. 예를 들면, PCT 공보 제2007/024715호를 참조한다. 예를 들면, DVD-Ig 중쇄 및 DVD-Ig 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)가 표준 기술에 의해 숙주 세포내로 형질감염되는, 숙주 세포로부터의 발현. 용어 "형질감염"의 각종 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포내로 도입시키기 위해 일반적으로 사용된 광범위한 각종 기술, 예를 들면, 전기천공(electroporation), 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 비록 원핵 또는 진핵 숙주 세포내에서 DVD-Ig 결합 단백질을 발현시키는 것이 가능하다고 해도, 진핵 세포내에서의 DVD-Ig 단백질의 발현이 바람직하며, 포유동물 숙주 세포내에서의 발현이 가장 바람직하고, 이는, 이러한 진핵 세포(및 특히 포유동물 세포)가 원핵 세포보다도 더 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 DVD-Ig 단백질을 조립하여 분비하는 경향이 있기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키는데 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220에 기술되고, 예를 들면, R.J. Kaufman 및 P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621에 기술된 바와 같이 DHFR 선택성 마커와 함께 사용된 dhfr- CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2 세포를 포함한다. DVD-Ig 단백질을 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포내로 도입시키는 경우, DVD-Ig 단백질은 숙주 세포내에서 DVD-Ig 단백질의 발현을 허용하거나, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지내로 DVD-Ig 단백질의 분비를 허용하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. DVD-Ig 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
본 발명에 유용한 DVD-Ig 단백질의 재조합체 발현을 위한 바람직한 시스템에서, DVD-Ig 중쇄 및 DVD-Ig 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘-매개된 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포내로 도입된다. 재조합 발현 벡터내에서, DVD-Ig 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서(enhancer)/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 연결되어 고수준의 유전자 전사를 구동한다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 수반하며, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염시킨 CHO 세포의 선택을 허용한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포는 DVD-Ig 중쇄 및 경쇄의 발현을 허용하도록 배양되며 완전한 DVD-Ig 단백질이 배양 배지로부터 회수된다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키며, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하여 배양 배지로부터 DVD-Ig 단백질을 회수한다. 또한 추가로 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 적합한 배양 배지 중에서 본 발명의 DVD-Ig 단백질이 합성될 때까지 배양함으로써 본 발명의 DVD-Ig 단백질을 합성하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 배양 배지로부터 DVD-Ig 단백질을 분리함을 추가로 포함할 수 있다.
DVD-Ig 결합 단백질의 중요한 특징은, 이것이 통상의 항체와 유사한 방식으로 생산되고 정제될 수 있다는 것이다. DVD-Ig 결합 단백질의 생산은 임의의 종류의 불변 영역의 임의의 서열 변형 또는 화학적 변형없이, 바람직한 이원-특이적인 활성을 지닌 균질한, 단일의 주요 생성물을 생성한다. "이-특이적", "다중-특이적", 및 "다중-특이적 다가의" 전장 결합 단백질을 생성하기 위한 다른 앞서 기술된 방법은 단일의 주요 생성물을 초래하지 않지만 대신 조립된 비활성의, 단일-특이적인, 다-특이적인, 다가의, 전장 결합 단백질의 혼합물, 및 상이한 결합 부위의 조합을 지닌 다가의 전장 결합 단백질의 혼합물의 세포내 또는 분비된 생산을 초래한다. 예로서, 밀러(Miller) 및 프레스타(Presta)가 기술한 설계를 기초로 하여(참조: PCT 공보 제WO2001/077342호), 중쇄 및 경쇄의 16개의 가능한 조합이 존재한다. 결과적으로, 단백질의 6.25%만이 바람직한 활성 형태로 존재하는 경향이 있다. 대규모 제조시 전형적으로 사용된, 표준 크로마토그래피 기술을 사용한 단백질의 비활성 및 부분적으로 활성인 형태로부터 단백질의 완전한 활성형의 분리는 여전히 입증되어 있지 않다.
놀랍게도, "이원-특이적인 다가의 전장 결합 단백질"인, DVD-Ig 결합 단백질의 설계는 바람직한 "이원-특이적인 다가의 전장 결합 단백질", 즉, 기능적 DVD-Ig 결합 단백질로 주로 조립하는 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 생성한다. PCT 공보 제WO 2007/024715호를 참조한다.
II . 결정성 및 유도체화된 결합 단백질
본 발명은 결합 단백질이 결정인 골관절염 치료용 방법 및 조성물을 포함한다. 한 실시형태에서, 결정화된 결합 단백질은 결합 단백질의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 크다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 보유한다.
본 발명에 유용한 결정화된 결합 단백질은 당해 분야에 공지되어 있으며, 본원에 참조로 인용된 PCT 공보 제WO 02072636호에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 글리코실화된 결합 단백질을 사용하며, 여기서 결합 단백질 또는 이의 항원-결합부는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함한다. 초기의 생체내 단백질 생산은 번역 후 변형으로 알려진 추가의 프로세싱을 겪을 수 있다. 특히, 글리코실화로 공지된 공정인, 당(글리코실) 잔기가 효소적으로 첨가될 수 있다. 공유결합적으로 연결된 올리고사카라이드 측쇄를 지닌 수득되는 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로서 공지되어 있다. 항체는 Fc 도메인, 및 또한 가변 도메인내에 하나 이상의 탄수화물 잔기를 지닌 당단백질이다. Fc 도메인내 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 효과기 기능에 있어서 중요한 효과와, 항체의 항원 결합 또는 반감기에 있어 최소의 효과를 갖는다[참조: Jefferis (2005) Biotechnol. Prog., 21: 11-16]. 대조적으로, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 있어 효과를 가질 수 있다. 가변 도메인내 글리코실화는 입체 장애에 기인한, 항체 결합 친화성에 있어 음성적 효과를 가질 수 있거나[참조:Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 1361-1367], 항원에 대해 증가된 친화성을 초래할 수 있다[참조: Wallick et al. (1998) Exp. Med. 168:1099-1109; Wright et al. (1991) EMBO J.10:2717-2723].
결합 단백질의 O- 또는 N-연결된 글리코실화 부위가 돌연변이된 글리코실화 부위 돌연변이체를 생성하는 것이 가능하다. 당해 분야의 숙련가는 표준 기술을 사용하여 이러한 돌연변이체를 생성할 수 있다. 생물학적 활성을 보유하지만 결합 활성이 증가되거나 감소된 글리코실화 부위 돌연변이체를 또한 골관절염을 치료하기 위해 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 결합 단백질 또는 이의 항원-결합부의 글리코실화는 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 아글리코실화된(aglycosylated) 항체를 제조할 수 있다(즉, 항체는 글리코실화를 결여한다). 글리코실화는 예를 들면, 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 항체 서열내 글리코실화의 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 가변 영역 글리코실화 부위의 제거를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환을 이룸으로써 이러한 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다 이러한 시도는 PCT 공보 제WO 2003/016466호 및 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 추가로 상세히 기술되어 있다.
추가로 또는 대안으로, 감소된 양의 푸코실 잔기를 가진 하이포푸코실화된 항체 또는 증가된 이등분되는 GlcNAc 구조를 갖는 항체와 같은 글리코실화의 변경된 유형을 갖는 본 발명에 유용한 변형된 결합 단백질을 제조할 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 양식은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되어 왔다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들면, 변경된 글리코실화 기관(machinery)을 가진 숙주 세포내에서 결합 단백질을 발현시킴으로써 달성할 수 있다. 변경된 글리코실화 기관을 갖는 세포는 당해 분야에 기술되어 있으며 본 발명의 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-181, 및 유럽 특허 제EP 1,176,195호; 및 PCT 공보 제WO 03/035835호 및 제WO 99/5434280호]을 참조한다.
단백질 글리코실화는 목적한 단백질의 아미노산 서열, 및 또한 단백질이 발현되는 숙주 세포에 의존한다. 상이한 유기체는 상이한 글리코실화 효소(예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산할 수 있으며 이용가능한 상이한 기질(뉴클레오타이드 당)을 갖는다. 이러한 인자로 인하여, 단백질 글리코실화 양식, 및 글리코실 잔기의 조성물은, 특정한 단백질이 발현되는 숙주 시스템에 따라 상이할 수 있다. 본 발명에 유용한 결합 단백질의 글리코실 잔기는 글루코스, 갈락토스, 만노즈, 푸코즈, n-아세틸글루코사민 및 시알산을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 글리코실화 패턴이 사람 패턴이 되도록 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실 잔기를 포함한다.
상이한 단백질 글리코실화는 상이한 단백질 특성을 생성할 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주내에서 생산되고, 효모 내인성 경로를 이용하여 글리코실화된 치료학적 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포내에서 발현된 동일한 단백질의 것과 비교하여 감소될 수 있다. 이러한 당단백질은 또한 사람에서 면역원성일 수 있으며 투여 후 생체내에서 감소된 반감기를 나타낸다. 사람 및 다른 동물에서 특이적인 수용체는 특이적인 글리코실 잔기를 인식할 수 있으며 혈류로부터 단백질의 신속한 청소(clearance)를 촉진한다. 다른 부작용은 단백질 폴딩에 있어서의 변화, 용해도, 프로테아제에 대한 민감성, 트래피킹(trafficking), 수송, 구획화(compartmentalization), 분비, 다른 단백질 또는 인자에 의한 인식, 항원성, 또는 알레르기원성을 포함할 수 있다. 따라서, 전문의는 특이적인 조성 및 글리코실화 양식, 예를 들면, 글리코실화 조성물 및 사람 세포 또는 의도된 대상 동물의 종-특이적인 세포내에서 생산된 것과 동일하거나 적어도 유사한 양식을 지닌 치료학적 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포의 것과는 상이한 글리코실화된 단백질의 발현은 숙주 세포를 유전적으로 변형시켜 이종 글리코실화 효소를 발현하도록 함으로써 달성할 수 있다. 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 전문의는 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 이의 항원-결합부를 생성할 수 있다. 예를 들면, 효모 균주를 유전적으로 변형시켜 비-천연적으로 존재하는 글리코실화 효소를 발현하도록 함으로써 이러한 효모 균주에서 생산된 글리코실화된 단백질(당단백질)이 동물 세포, 특히 사람 세포의 것과 동일한 단백질 글리코실화를 나타내도록 하여 왔다(참조: 미국 특허 공보 제2004/0018590호 및 제2002/0137134호 및 PCT 공보 제WO 2005/100584호).
또한, 목적 단백질이 유전적으로 가공되어 각종 글리코실화 효소를 발현하도록 함으로써 라이브러리의 구성원 숙주 세포가 변이체 글리코실화 양식을 갖는 목적한 단백질을 생산하도록 한 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 발현시킬 수 있음을 당해 분야의 숙련가는 인지할 것이다. 이후에, 전문의는 특정한 신규 글리코실화 양식을 갖는 목적한 단백질을 선택하여 분리할 수 있다. 바람직하게는, 특별히 선택된 신규한 글리코실화 양식을 갖는 단백질은 개선되거나 변경된 생물학적 특성을 나타낸다.
IV . 약제학적 조성물
본 발명의 방법은 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질을 포함하는, 개체에서 골관절염 또는 통증을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 사용한다. 이러한 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및/또는 부형제, 또는 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질의 활성 이외에 바람직한 치료학적, 약제학적 또는 약리학적 이점을 조성물에 제공하는 임의의 다른 화합물(들)을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명에 따라 개체에서 골관절염 또는 통증을 치료하는데 유용한 조성물은 IL-1α에 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항-IL-1α 항체, 및 IL-1β에 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, 항-IL-1β 항체, 또는 IL-1α 및/또는 IL-1β 둘 다에 결합하는 결합 단백질, 예를 들면, IL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질을 포함한다.
본 발명의 방법에 유용한 결합 단백질은 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물내로 도입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 혼화성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 피복물(coating), 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 광범위하게 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충된 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등, 및 또한 이의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 다가알코올(예를 들면, 만니톨 또는 소르비톨), 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 미량의 보조물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 항체 또는 항체 부위의 반감기 또는 효능을 향상시킨다.
각종 전달 시스템이 공지되어 있으며 본 발명에 유용한 하나 이상의 결합 단백질 또는 개체에서 골관절염 또는 통증을 방지하거나, 유지하거나, 치료하거나, 완화시키는데 유용한 예방제 또는 다른 치료제의 조합물, 예를 들면, 리포좀내 봉입(encapsulation), 미세입자, 미세캅셀, 결합 단백질 또는 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 및 수용체-매개된 세포내이입[참조: 예를 들면, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem., 262: 4429-4432], 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부로서 핵산의 작제물로 투여하는데 사용될 수 있다. 개체에게 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질을 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들면, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여, 및 점막 투여(예를 들면, 비강내 및 경구 경로)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 폐 투여를 예를 들면, 흡입기 또는 분무기, 및 분무화제를 사용한 제형을 사용하여 이용할 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,019,968호; 제5,985,320호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 및 제5,290,540호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호). 한 실시형태에서, 본 발명에 유용한 결합 단백질은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(제조원: 미국 매사츄세츠주 캠브릿지 소재의 Alkermes, Inc.)를 사용하여 투여한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 결합 단백질은 근육내, 정맥내, 종양내, 경구, 비강내, 폐, 또는 피하 투여한다. 결합 단백질은 임의의 편리한 경로, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 내피 또는 점액피부 라이닝(mucocutaneous lining) (예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장내 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 결합 단백질을 치료가 요구되는 부위에 국소적으로, 예를 들면, 관절 부위내로 적접 결합 단백질을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들면 및 이에 한정되지 않고, 국소 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 이식의 수단에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 이식은 시알라스틱 막(sialastic membrane), 중합체, 섬유상 매트릭스(예를 들면, Tissuel®), 또는 콜라겐 매트릭스와 같은 막 및 매트릭스를 포함하는, 다공성 또는 비-다공성 물질이다. 한 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질의 유효량은 영향받은 관절에 국소 투여함으로써, 통증을 포함하는, 골관절염에서 또한 발생하는 바와 같은 연골 퇴행의 추가의 진행을 치료하고/하거나, 유지하고/하거나, 완화하고/하거나 예방한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질의 유효량은 결합 단백질(들) 이외의 하나 이상의 다른 치료제(예를 들면, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)의 유효량과 함께 영향받은 관절에 국소 투여됨으로써, 통증을 포함하는, 골관절염 또는 하나 이상의 이의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나, 유지하고/하거나 완화시킨다.
다른 실시형태에서, IL-1α 및 IL-1β 결합 단백질은 제어 방출 또는 지속된 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시형태에서, 펌프를 사용하여 조절되거나 지속된 방출을 달성할 수 있다[참조: Langer (1990) Science 249:1527-1533; Sefton (1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng., 14: 201-240; Buchwald et al. (1980) Surgery, 88: 507-516; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med., 321: 574-579]. 다른 실시형태에서, 중합체 물질을 사용하여 본 발명에 유용한 결합 단백질의 제어된 또는 지속된 방출을 달성할 수 있다[참조: 예를 들면, Medical Applications of Controlled Release, (Langer and Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984); Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, (Smolen and Ball, eds.) (Wiley, New York, 1984); Langer and Peppas (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys., C23: 61-126; see also Levy et al. (1985) Science 228:190-192; During et al. (1989) Ann. Neurol., 25: 351-356; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105-112); 미국 특허 제5,679,377호; 제5,916,597호; 제5,912,015호; 제5,989,463호; 및 제5,128,326호; 및 PCT 공보 제WO　99/15154호 및 제WO　99/20253호]. 지속된 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 폴리언하이드라이드(다무수물), 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시형태에서, 지속된 방출 제형에 사용된 중합체는 불활성이고, 여과할 수 있는 불순물을 함유하지 않으며, 저장시 안정하고, 멸균성이며, 생분해가능하다. 또 다른 실시형태에서, 조절되거나 지속된 방출 시스템은 예방학적 또는 치료학적 표적에 근접하게 위치할 수 있으므로, 전신 투여량의 분획만을 필요로 한다[참조: 예를 들면, Goodson, J.M., Chapter　6, In Medical Applications of Controlled Release , Vol .　 II , Applications and Evaluation, (Langer and Wise, eds.)(CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984), pp.　115-138].
제어 방출 시스템은 문헌[참조: Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990)]에서 검토시에 논의되어 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술도 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지속된 방출 제형을 생산하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,526,938호; PCT 공보 제WO 91/05548호 및 제WO　96/20698호; Ning et al. (1996) Radiother. Oncol., 39: 179-189; Song et al. (1996) PDA J. Pharm. Sci. Technol., 50: 372-377; Cleek et al. (1997) Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854; 및 Lam et al. (1997) Proceed. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 24: 759-760]을 참조한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명에 유용한 조성물이 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 단백질을 암호화하는 핵산인 경우, 핵산은 생체내에서 투여되어, 이를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고 이를 투여함으로써 이의 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진함으로써 이것이 예를 들면, 레트로바이러스 벡터의 사용에 의해(참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,980,286호), 또는 직접 주사에 의해, 또는 미세입자 충격[예를 들면, 유전자 총(gene gun); 제조원: Biolistic, DuPont]의 사용에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제를 사용한 피복의 사용에 의해, 또는 이를 핵내로 도입되는 것으로 알려진 호메오박스-유사 펩타이드(homeobox-like peptide)에 연결하여 투여함에 의해[참조: 예를 들면, Joliot et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868] 세포내로 되도록 한다. 달리는, 핵산을 세포내적으로 도입하고 동종 재조합에 의해 발현용 숙주 세포 DNA내에 도입시킬 수 있다.
골관절염 또는 통증을 치료하기 위해 본 발명에서 유용한 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 혼용성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비강내(예를 들면, 흡입), 경피(예를 들면, 국소), 경점막, 및 직장 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 조성물은 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비강내, 또는 국소 투여하기 위해 채택된 약제학적 조성물로서 통상의 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중 용액이다. 경우에 따라, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 리그노캄네와 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다.
골관절염 또는 통증을 치료하기 위해 본 발명에 유용한 조성물이 국소 투여되는 경우, 조성물은 연고제, 크림제, 경피 패취제, 로션제, 겔제, 샴푸제, 스프레이제, 에어로졸제, 액제, 유제의 형태, 또는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 다른 형태로 제형화될 수 있다[참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms , 19 th ed ., (Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1995]. 분무가능하지 않은 국소 용량형의 경우, 국소 적용과 혼용성인 하나 이상의 부형제 또는 담체를 포함하고 물보다 바람직하게는 더 큰 동적 점도(dynamic viscosity)를 갖는 점성 내지 반-고체 또는 고체 형태가 전형적으로 사용된다. 다른 적합한 제형은 현탁제, 산제, 도찰제(liniment), 연고제(salves) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시형태에서, 이러한 제형은 멸균되거나 예를 들면, 삼투압과 같은 각종 특성에 영향을 미치기 위해 보조제(예를 들면, 방부제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)과 혼합된다. 다른 적합한 국소 용량형은 분무가능한 에어로졸 제제를 포함하며, 여기서 활성 성분은 예를 들면, 고체 또는 액체 불활성 담체와 함께 가압된 휘발물질(예를 들면, FREON®과 같은 가스성 추진제)과의 혼합물 또는 스퀴즈 병(squeeze bottle) 중에 패키징된다. 습윤제 또는 보습제를 또한 경우에 따라 약제학적 조성물 및 용량형에 가할 수 있다. 이러한 추가의 성분의 예는 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
골관절염 또는 통증을 치료하기 위한 본 발명의 방법이 조성물의 비강내 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 에어로졸 형태, 분무제, 연무제, 또는 점적제의 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 결합 단백질은 적합한 추진제(예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스)의 사용으로, 가압된 팩 또는 분무기로부터의 에어로졸 분무 표시방식의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 측정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캅셀제 및 카트릿지(예를 들면, 젤라틴으로 구성됨)는 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기재의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
골관절염 또는 통증을 치료하기 위한 본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 정제, 캅셀제, 카쉐제, 젤캅제(gelcap), 액제, 현탁제 등의 형태로 경구 제형화될 수 있다. 정제 또는 캅셀제는 결합제(예를 들면, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들면, 락토스, 미세결정성 셀룰로스, 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들면, 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제(예를 들면, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 정제는 당해 분야에 잘 공지된 방법으로 피복시킬 수 있다. 경구 투여용 액체 제제는 액제, 시럽제 또는 현탁제의 형태를 취할 수 있으나, 이에 한정되지 않거나, 이들은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과 구성하기 위한 무수 생성물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁화제(예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들면, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올, 또는 분획화된 야채 오일); 및 방부제(예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제와 함께 통상적인 수단으로 제조할 수 있다. 당해 제제는 또한 경우에 따라 완충제 염, 풍미제, 착색제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 골관절염 또는 통증을 치료하기 위해 본 발명에서 유용한 결합 단백질(들)의 서방출, 제어 방출, 또는 지속된 방출을 위해 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명에 따라 골관절염을 치료하는 방법 또는 통증을 치료하는 방법은 에어로졸화제와 함께 제형화된 조성물의, 예를 들면, 흡입제 또는 분무제의 사용에 의한 폐 투여를 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제6,019,968호; 제5,985,320호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 및 제5,290,540호; 및 PCT 공보 제WO　92/19244호; 제WO　97/32572호; 제WO　97/44013호; 제WO　98/31346호; 및 제WO　99/66903호]을 참조한다. 특정 실시형태에서, IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질 또는 골관절염 치료용 조합 치료요법은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(제조원: 미국 매사츄세츠주 캠브릿지 소재의 Alkermes, Inc.)을 사용하여 투여된다.
본 발명의 방법은 주사(예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입)에 의한 비경구 투여용으로 제형화된 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질을 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 방부제가 들어있는 단위 용량형(예를 들면, 앰플제 또는 다중-투여량 용기) 중에 제공할 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중에 현탁제, 액제, 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 달리는, 결합 단백질은 사용 전에 적합한 비히클(예를 들면, 멸균 발열물질을 함유하지 않는 물)과 함께 구성하기 위한 산제 형태일 수 있다.
본 발명의 방법은 데포트 제제(depot preparation)로서 제형화된 조성물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들면, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 조성물은 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일 중 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체(예를 들면, 난용성 염으로서)로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 기원한 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 기원한 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분은 별도로 또는 예를 들면 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 샤쉐와 같은 밀폐하여 밀봉시킨 용기 중에 무수 동결건조된 분말 또는 물을 함유하지 않는 농출물로서, 단위 용량형으로 함께 혼합된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분산시킬 수 있다. 투여 방식이 주사인 경우, 주사용 멸균 수 또는 염수의 앰플은, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명은 또한 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질 또는, 제제의 양을 나타내는 앰플 또는 사쉐와 같은 밀폐하여 밀봉시킨 용기 중에 패키징된 이러한 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 한 실시형태에서, IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질 또는 이러한 결합 단백질(들)을 포함하는 약제학적 조성물은 밀폐하여 밀봉시킨 용기 중에 무수 멸균시킨 동결건조된 분말 또는 물을 함유하지 않는 농출물로서 제공되며 관절염 또는 통증을 치료하기 위해 대상체에게 투여하기 위한 적절한 농축물로 재구성(예를 들면, 물 또는 염수를 사용하여)시킬 수 있다. 한 실시형태에서, IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질 또는 이러한 결합 단백질(들)을 포함하는 약제학적 조성물은 적어도 약 5mg, 적어도 약 10mg, 적어도 약 15mg, 적어도 약 25mg, 적어도 약 35mg, 적어도 약 45mg, 적어도 약 50mg, 적어도 약 75mg, 또는 적어도 약 100mg의 단위 용량으로 밀폐하여 밀봉시킨 용기 중에 무수 멸균시킨 동결건조된 분말로서 공급된다. 이러한 동결건조된 결합 단백질(들) 또는 이러한 결합 단백질(들)을 포함하는 약제학적 조성물은 이의 본래의 용기 중에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 사이에서 보관할 수 있으며 결합 단백질(들) 또는 이러한 결합 단백질(들)을 포함하는 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주내, 5일내, 72시간내, 48시간내, 24시간내, 12시간내, 6시간내, 5시간내, 3시간내, 또는 1시간내에 투여될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질 또는 이러한 결합 단백질(들)을 포함하는 약제학적 조성물은 제제의 양 및 농도를 나타내는 밀폐하여 밀봉시킨 용기 중에 액체 형태로 제공된다. 한 실시형태에서, 투여된 조성물의 액체 형태는 밀폐하여 밀봉시킨 용기 중에 적어도 약 0.25mg/ml, 적어도 약 0.5mg/ml, 적어도 약 1mg/ml, 적어도 약 2.5mg/ml, 적어도 약 5mg/ml, 적어도 약 8mg/ml, 적어도 약 10mg/ml, 적어도 약 15mg/kg, 적어도 약 25mg/ml, 적어도 약 50mg/ml, 적어도 약 75mg/ml 또는 적어도 약 100mg/ml으로 공급된다. 액체 형태는 이의 본래의 용기 중에 약 2℃ 내지 약 8℃ 사이에서 보관될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물에 유용한 결합 단백질은 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물내로 도입될 수 있다. 한 양상에서, 결합 단백질은 약 0.1mg/ml 내지 약 250mg/ml의 항체를 함유하는 주사가능한 액제로서 제조될 것이다. 주사가능한 액제는 플린트(flint) 또는 호박색 바이알, 앰플, 또는 예비-충전된 주사기 중에 액체 또는 동결건조된 용량형으로 구성될 수 있다. 완충액은 L-히스티딘(약 1 mM 내지 약 50 mM), 임의로 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 pH 5.0 내지 약 7.0(최적으로 약 pH 6.0)일 수 있다. 다른 적합한 완충액은 석신산나트륨, 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 염화나트륨을 사용하여 용액의 독성을 약 0 내지 약 300 mM(최적으로 액체 용량형의 경우 약 150 mM)의 농도에서 조절할 수 있다. 동결보호제가 동결건조된 용량형을 위해, 원칙적으로 약 0% 내지 약 10% 슈크로스(최적으로 약 0.5% 내지 약 1.0%)로 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제는 트레할로스 및 락토스를 포함한다. 증량제(bulking agent)는 동결건조된 용량 형에 대해, 원칙적으로 약 1% 내지 약 10%의 만니톨(최적으로 약 2% 내지 약 4%)로 포함될 수 있다. 안정화제는 액체 및 동결건조된 용량형 둘 다에서, 원칙적으로 약 1 mM 내지 약 50 mM의 L-메티오닌(최적으로 약 5 mM 내지 약 10 mM)으로 사용될 수 있다. 다른 적합한 증량제는 글리신, 아르기닌을 포함하며, 약 0% 내지 약 0.05%의 폴리소르베이트-80(최적으로 약 0.005% 내지 약 0.01%)로서 포함될 수 있다. 추가의 표면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 표면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라 골관절염 또는 통증을 치료하는데 유용한 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은 예를 들면, 액체 용액(예를 들면, 주사가능하고 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀제 및 좌제와 같은 액체, 반-고체 및 고체 용량형을 포함한다. 특정한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 적용에 의존한다. 대표적인 조성물은 항체를 사용한 사람의 수동적 면역화에 사용된 것들과 유사한 조성물과 같은, 주사가능하거나 주입가능한 용액의 형태이다. 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 한 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건하에서 멸균되고 안정해야한 한다. 조성물은 액제, 미세유제, 분산제, 리포좀제, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 액제는 활성 화합물(즉, 항체, 또는 이의 항원 결합 부위)를 위에서 나열한 하나의 성분 또는 성분들의 조합이 들어있는 필요량의 적절한 용매 중에 도입시킨 후, 멸균 여과하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 위에서 나열한 것들과는 다른 요구되는 성분들을 함유하는 멸균 비히클내로 도입시켜 제조한다. 멸균 주사가능한 액제의 제조를 위한 멸균되고, 동결건조된 산제의 경우에, 예시적인 제조 방법은 활성 성분 및 앞서의 이의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 분무-건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복물을 사용함에 의해, 분산제의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 표면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물 중에, 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 골관절염 또는 통증을 치료하는데 유용한 결합 단백질은, 비록 예시적인 투여 경로/방식이 피하 주사, 정맥내 주사, 또는 주입이라고 해도, 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 투여될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 바람직한 결과에 따라 변할 것이다. 특정 실시형태에서, 결합 단백질(들)은 이식체, 경피 패취, 및 미세봉입된 전달 시스템을 포함하는, 제어 방출 제형과 같은, 속방출에 대해 결합 단백질(들)을 보호할 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 생분해가능한, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 많은 방법이 당해 분야의 숙련가들에게 특허되거나 일반적으로 알려져 있다[참조: 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)].
특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 결합 단백질(들)은 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화가능한 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 결합 단백질(들)(및 경우에 따라, 다른 성분)이 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캅셀 중에 밀폐되거나, 정제로 압착되거나, 대상체의 식이내로 직접 도입될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 화합물은 부형제와 함께 도입될 수 있으며 소화가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캅셀제, 엘릭서르제, 현탁제, 시럽제, 와이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 비경구 투여 이외의 투여로 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 피복하거나, 화합물을 이러한 물질과 함께 공-투여하는 것이 필수적일 수 있다.
보충의 활성 화합물을 또한 조성물내로 도입시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 결합 단백질(예를 들면, 항체), 또는 이의 항원 결합 부위는 골관절염 또는 통증을 치료하는데 유용한 하나 이상의 추가의 치료제와 함께 공제형화되고/되거나 동시투여된다. 예를 들면, hIL-1α 및/또는 hIL-1β에 결합하는 결합 단백질, 또는 이의 항원 결합 부위(들)은 다른 표적(예를 들면, 다른 사이토카인에 결합하는 항체 또는 세포 표면 분자에 결합하는 항체)에 결합하는 하나 이상의 추가의 항체와 함께 공제형화되고/되거나 동시투여될 수 있다. 또한, 하나 이상의 결합 단백질을 하나 이상의 다른 치료제와 함께 사용할 수 있다. 이러한 조합 치료요법은 투여된 치료제의 보다 낮은 용량을 유리하게 이용할 수 있으므로, 각종 단독치료요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
특정 실시형태에서, IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 단백질(들), 또는 이의 결합 부위는 당해 분야에 공지된 반감기를 연장시키는 비히클에 연결된다. 이러한 비히클은 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜, 및 덱스트란을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 비히클은 예를 들면, 미국 특허 제6,660,843호에 기술되어 있다.
특정 실시형태에서, 결합 단백질의 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 유전자 치료요법에 의해 골관절염을 치료하거나, 예방하거나, 유지하거나 완화시키기 위해 투여된다. 유전자 치료요법은 발현되거나 발현가능한 핵산을 대상체에에 투여함으로써 수행된 치료요법을 말한다. 본 발명의 당해 실시형태에서, 핵산은 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(들)에 대한 이들의 암호화된 결합 폴리펩타이드(들)을 생산하며 골관절염 또는 통증과 관련하여 예방학적 또는 치료학적 효과를 중재한다.
당해 분야에서 이용가능한 유전자 치료요법을 위한 임의의 방법도 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 유전자 치료요법의 방법의 일반적인 고찰에 대해서는, 문헌[참조: Goldspiel et al. (1993) Clin. Pharm. 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan (1993) Science 260: 926-932; Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 및 Robinson, C. (1993) Trends Biotechnol. 11(5):155]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법은 문헌[참조: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley &　Sons, New York, 1993); 및 Kriegler, Gene Transfer 및 Expression , A Laboratory Manual, (Stockton Press, New York, 1990)]에 기술되어 있다. 유전자 치료요법의 각종 방법에 대한 상세한 설명은 미국 특허원 공보 제2005/0042664호에 기재되어 있다.
IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(들)은 단독으로 또는 골관절염 또는 통증의 치료에 유용한 하나 이상의 추가의 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 추가의 제제는 골관절염의 하나 이상의 증상을 치료하거나 통증과 관련된 IL-1 이외의 표적에 영향을 미치는데 유용한 것으로서 당해 분야에 인식된 치료제일 수 있다. 추가의 제제는 또한 치료학적 조성물에 유리한 기여를 제공하는 제제, 예를 들면, 개체에게 투여될 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
본 발명내에 포함될 조합물은 이들의 의도된 목적에 유용한 조합물임이 추가로 이해될 수 있다. 하기 설정된 제제는 나열할 목적이며 이에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 일부분인 조합물은, IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(들) 및 바람직한 특성을 제공하는 적어도 하나의 추가의 제제일 수 있다. 조합물이, 형성된 조성물이 이의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 존재하는 경우, 조합물은 또한 하나 이상의 추가의 제제, 예를 들면, 2개 또는 3개의 추가의 제제를 포함할 수 있다. 골관절염 또는 통증을 치료하기 위한 바람직한 조합물은 이소프로펜과 같은 약물을 포함하는, "NSAIDS"로 또한 언급된 비-스테로이드성 소염 약물(들)을 포함한다. 다른 바람직한 조합물은 프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드를 포함하는 소염제이며; 스테로이드의 잘 공지된 부작용은, 환자를 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(들)과 함께 치료하는 경우 요구되는 스테로이드 투여량을 테이퍼링(tapering)함으로써 감소시키거나 심지어 제거할 수 있다. 골관절염 또는 통증으로 고생하는 개체를 치료하는데 사용하기 위한 치료제의 비-제한적 예는 하나 이상의 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않을 수 있다: 부데노시드, 상피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리사이클레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF의, LT의, IL-2의, IL-6의, IL-7의, IL-8의, IL-12의, IL-13의, IL-15의, IL-16의, IL-18의, IL-23의, EMAP-II의, GM-CSF의, FGF의 및 PDGF의 항체, CD2의, CD3의, CD4의, CD8의, CD-19의, CD25의, CD28의, CD30의, CD40의, CD45의, CD69의, CD90의 또는 이들의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루모마이드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아덴소신 효능제, 항혈전제, 상보체 억제제, 아드레날린제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티로프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염성 사이토카인, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 및 TGFβ.
본 발명의 약제학적 조성물은 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"의 IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 하나 이상의 결합 단백질(들)을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 바람직한 치료학적 결과를 달성하는데 필수적인 용량 및 기간 동안 효과적인 양을 말한다. 결합 단백질의 치료학적 유효량은 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있으며, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 바람직한 반응을 유발하기 위한 결합 단백질의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료학적 유효량은 또한, 결합 단백질(들), 또는 이의 일부(들)의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 더 크게 되는 양이다. "예방학적 유효량"은 골관절염에서 영향받은 관절내 관절 연골의 추가의 변성 또는 손실을 방지하는 것과 같은 바람직한 예방학적 효과를 달성하거나 통증의 발병 또는 심화를 방지하는 것과 같은, 바람직한 예방학적 결과를 달성하는데 필수적인 용량으로 및 기간 동안 효과적인 양을 말한다. 전형적으로, 예방학적 투여량은 질환의 조기 단계 이전 또는 조기 단계에 대상체에서 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
한 실시형태에서, 개체가 IL-1 축적과 관련된 질환 또는 장애로 고생하는, 통증에 대해 개체를 치료하는 방법. 개체에서 이러한 IL-1 축적은 감소된 IL-1 발현 또는 IL-1의 감소된 대사작용의 결과일 수 있다. IL-1의 축적은 개체의 혈액(혈장, 혈청 포함) 또는 국소 조직에서 발생할 수 있다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 개체가 IL-1 축적과 관련된 질환 또는 장애로 고생하는, 통증에 대해 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시형태에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법은 골관절염, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염(Lyme arthritis), 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 피부염, 피부 경화증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키 질환(Kawasaki's disease), 그레이브스 질환(Grave's disease), 신 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근 경색, 애디슨 질환(Addision's disease), 산발성 다분비선 결핍증 제I형, 다분비선 결핍증 제II형(슈미트 증후군(Schmidt's syndrome)), 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응음성 관절병증, 관절병증, 라이터 질환(Reiter's disease), 건선성 관절병증, 궤양성 대장염 관절병증, 장병성 활막염, 클라미디아-관련 관절병증, 여시니아-관련 관절병증, 살모넬라-관련 관절병증, 척추관절병증, 죽상 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리 질환(Royal free disease), 만성 피부점막 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 증후군, 후천성 면역결핍증 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증 (공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증-후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련된 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부 근염/다발성 근염 관련된 폐 질환, 쇼그렌 질환(Sjoegren's disease) 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 확산 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 기관지 폐색증, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 제1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드(lupoid) 간염), 제2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 가시세포증을 갖는 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화 담관염, 제1형 건선, 제2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 중성구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿 패스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절성 다발동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 발열, 류마티스성 척추염, 스틸 질환, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 질환/동맥염, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 간경변, 알코올-유도된 간 손상, 담즙울혈, 특이체질성 간 질환, 약물-유도된 간염, 비-알코올성 지방간, 알레르기, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 장애(예를 들면, 우울증 및 정신 분열증), Th2 유형 및 Th1 유형 매개된 질환, 급성 및 만성 통증(다양한 형태의 통증), 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 무베타지방단백혈증, 말단 청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 프로세스, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암종, 이소성 심방 박동, 후천성 면역 결핍증(AIDS) 치매 합병증, 알코올-유도된 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식편 거부, 알파-1-안티트립신 결핍증, 근위축성 측색 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 퇴화, 항-CD3 치료요법, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화, 동정맥루, 운동실조, 심방 세동(지속 또는 발작), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 각 차단(bundle branch block), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 화상, 심장 부정맥, 심장 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 우회 염증 반응(cardiopulmonary bypass inflammation response), 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다발성 심방 빈맥, 화학치료요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병리, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐심증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환(Creutzfeldt-Jakob disease), 배양 음성 패혈증(culture negative sepsis), 낭포성 섬유증, 사이토카인 치료요법 관련 장애, 권투선수 치매, 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부학적 병태, 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환, 확산성 루이체 질환(diffuse Lewy body disease), 확장된 울혈성 심근증, 기저핵의 장애, 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 약물-유도된 운동 장애, 약물 민감성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염(Epstein-Barr virus infection), 피부 홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 태아의 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조(Friedreich's ataxia), 기능성 말초 동맥 장애, 진균 패혈증, 가스 괴저(gas gangrene), 위궤양, 사구체 신염, 임의의 장기 또는 조직의 이식편 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발상 세포 백혈병, 할러포르덴-스파츠 질환(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액 투석, 용혈성 요독 증후군/혈전성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, A형 간염, 히스속 부정맥(His bundle arrhythmias), HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 운동과다성 운동 장애, 과민 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족성 운동 장애, 시상 하부-뇌하수체-부신 축 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스 관절염, 소아 척추 근육 위축증, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계의 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌수막염, 수막염 구균혈증, 대사성 편두통 두통, 특발성 편두통 두통, 미토콘드리아 멀티시스템 장애, 혼합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다중 시스템 변성 (멘첼, 데제린-토마스, 쉬-드라거, 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium intracellulare), 마이코박테리움 투베르큘로시스(mycobacterium tuberculosis), 골수이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈성 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신장염, 신장증, 신경 퇴행성 질환, 신경성 근육 위축증, 호중구 감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 분지의 폐색, 폐색성 동맥 장애, OKT3® 치료요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관절제술 반전 과정, 장기비대증(organomegaly), 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 악성 종양의 부종양 증후군/고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증성 질환, 다년성 비염, 심장주위 질환, 말초 죽상 동맥경화성 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포 자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 감마글로불린병증, 및 피부 변화 증후군), 관류 후 증후군, 펌프 후 증후군, MI-후 심장절개 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압증, 방사선 치료요법, 레이노이드 현상, 레이노이드 질환, 레프섬 질환(Refsum's disease), 정규 협소 QRS 빈맥, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근증, 육종, 노인성 무도병, 루이체 유형의 노인성 치매, 혈청반응음성 관절병증, 쇼크, 겸상 세포 빈혈, 피부 동종이식편 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특정 부정맥, 척추성 운동실조, 척수 소뇌 변성, 스트렙토코커스 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성(sbuacute) 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계의 매독, 전신성 아나필락시스(systemic anaphylaxis), 전신성 염증 반응 증후군, 전신성 개시 소아 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관확장증, 폐색성 혈전혈관염, 혈소판 감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민 반응, IV형 과민성, 불안정 협심증, 요독증, 요로성 패혈증, 두드러기, 판막성 심장 질환, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염, 바이러스-관련 혈구탐식성 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke- Korsakoff syndrome), 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식편 거부, 급성 관상동맥 증후군, 급성 특발성 다발성 신경염, 급성 염증성 탈수초성 다발성 근신경병증, 급성 허혈, 성인 스틸 질환(adult Still's disease), 원형탈모증, 아나필락시스, 항-인지질 항체 증후군, 재생 불량성 빈혈, 동맥경화, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 청력 손실, 자가면역 림프구증식 증후군(ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 조기 난소 부전, 안검염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 파국적 항인지질 증후군, 셀리악 질환, 경부 척추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증에 대한 위험을 갖는 임상적으로 독립된 증후군(CIS), 유년기 개시형 정신 장애, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨성 망막병증, 추간판 탈출증, 추간판 이탈, 약물-유도된 면역 용혈성 빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 상공막염, 다형 홍반, 주요 다형 홍반, 임신성 유천포창, 길랑-바레 증후군(GBS), 건초열, 휴즈 증후군(Hughes syndrome), 특발성 파킨슨 질환, 특발성 간질성 폐렴, IgE-매개된 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염(inclusion body myositis), 감염성 안 염증성 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환(Kussmaul disease) 또는 쿠스마울-마이어 질환(Kussmaul-Meier disease), 란드리 마비(Landry's paralysis), 랑게르한스 세포 조직구증, 망상 피반, 황반 변성, 현미경적 다발혈관염, 베체트병(Morbus Bechterev), 운동 신경 장애, 점막 유천포창, 다발성 장기 부전, 중증 근무력증, 골수이형성 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A형 비-B형 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절(pauciarticular) JRA, 말초 동맥 폐색 질환(PAOD), 말초 혈관 질환(PVD), 말초 동맥 질환(PAD), 결절성 다발동맥염 (또는 결절성 동맥주위염), 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다관절 JRA, 다내분비 결핍 증후군, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 펌프-후 증후군, 원발성 파킨슨 질환, 전립선 및 직장 암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 전립선염, 순수 적혈구 무형성증, 1차 부신 기능부전, 재발성 시신경 척수염, 재협착증, 류마티스 심장 질환, SAPHO(활막염, 여드름, 농포증, 골형성과다증 및 골염), 2차 아밀로이드증, 쇼크 폐(shock lung), 공막염, 좌골 신경통, 2차 부신 기능부전, 실리콘 관련 결합 조직 질환, 스네돈-윌킨슨 피부병(Sneddon-Wilkinson dermatosis), 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 전신성 염증 반응 증후군, 측두 동맥염, 톡소플라스믹 망막염(toxoplasmic retinitis), 독성 표피 괴사, 횡단성 척수염, TRAPS(종양 괴사 인자 수용체 타입 1 (TNFR)-관련 주기적 증후군), 1형 알레르기 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 일반적인 간질성 폐렴(UIP), 혈관염, 춘계 각결막염, 바이러스성 망막염, 보그트-고야나기-하라다 증후군(VKH syndrome), 습윤 황반 변성, 및 상처 치유를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애로 고생하는 개체에서 통증을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담도암, 소장암, 요로암(신장암, 방광암 및 요로상피암 포함), 여성 생식기암(자궁경부암, 자궁암, 난소암 및 융모암 및 임신성 영양아세포 질환 포함), 남성 생식기암(전립선암, 정낭암, 고환암 및 생식 세포 종양 포함), 내분비선암(갑상선암, 부신암, 및 뇌하수체암 포함), 및 피부암, 및 혈관종, 흑색종, 육종(골암, 연조직암 및 카포시 육종으로부터 유발된 것 포함), 뇌의 종양, 신경암, 안암, 수막암(성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경아세포종, 신경초종 및 수막종 포함), 조혈 악성 종양으로부터 생성되는 고형 종양, 예를 들면, 백혈병, 및 림프종(호지킨 림프종, 및 비-호지킨 림프종 둘 다)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환으로 고생하는 개체에서 통증을 치료하는데 사용될 수 있다.
용량 요법을 조절하여 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여하거나 수개의 분할된 투여량을 오랜 시간에 걸쳐 투여하거나 투여량을 치료학적 상황의 긴급 사태에 의해 지시되는 바에 따라 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 단위 용량형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 용량 단위 형태는 치료할 포유동물 대상체에 대한 단일 용량들로서 적합한 물리적으로 별개의 단위들을 말하며; 각각의 단위는 요구된 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료학적 효과를 생산하도록 계산된 활성 화합물의 예정된 양을 함유한다. 본 발명의 용량 단위 형태를 위한 시방서(specification)는 (a) IL-1α 및/또는 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(들)의 독특한 특징들 및 달성될 특별한 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 치료를 위한 이러한 단백질(들)의 컴파운딩(compounding)을 위한 기술 분야에서의 고유한 제한사항들에 의해 지시되고 이들에 직접 의존한다.
골관절염 또는 통증의 치료시 유용한 결합 단백질의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비-제한적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 10mg/kg이다. 용량 값은 완화될 상태의 유형 및 중증도에 의해 변할 수 있음을 주목하여야 한다. 임의의 특별한 대상체에 대해서도, 특정 용량 요법은 개체의 요구도 및 조성물의 투여를 감독하거나 이를 투여하는 사람의 전문적인 판단에 따라 오랜 시간에 걸쳐 조절되어야 하고, 본원에 나탸닌 용량 범위는 단지 예시이며 특허청구된 조성물의 영역 또는 실시를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 또한 이해하여야 한다.
본원에 기술된 본 발명의 방법 및 조성물의 다른 적합한 변형 및 채택도 명백하며 본 발명의 영역 또는 본원에 기재된 실시형태에서 벗어나지 않고 적합한 등가물을 사용하여 달성할 수 있음이 당해 분야의 숙련가에게 매우 명백할 것이다. 이제 본 발명을 상세히 기술하며, 이는 예시의 목적으로만 포함되며 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는, 후속되는 실시예를 참조로 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1. 이원 가변 도메인 면역글로불린( DVD - Ig ) 단백질의 생성
이원 가변 도메인 면역글로불린 (DVD-Ig) 분자는, 2개의 상이한 모 mAb로부터의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)이 재조합 DNA 기술에 의해 직접 나란히 또는 짧은 링커를 통해 연결된 후, 경쇄 불변 도메인이 연결되도록 설계된다. 유사하게, 중쇄는 직접 나란히 또는 짧은 링커를 통해 연결된 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH)에 이어, 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역을 포함한다. 도 1a를 참조한다. 모 항-IL-1α 모노클로날 항체 및 모 항-IL-1β 모노클로날 항체로부터 생산된 것으로서, IL-1α 및 IL-1β에 결합하는 DVD-Ig 결합 단백질의 예를 포함하는, 모 모노클로날 항체로부터의 DVD-Ig 결합 단백질의 설계 및 생산은 기술되어 있다. 본원에 참조로 인용된 문헌[PCT 공보 제WO 2007/024715 A2호 및 Wu et al., Nature Biotechnol., 25(11): 1290-1297 (2007)]을 참조한다. IL-1α 및 IL-1β에 대한 선택된 모노클로날 항체 및 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 DVD-Ig 분자의 생산을 위한 모 모노클로날 항체로서의 이의 용도의 설명은 본원에 제공된다. DVD-Ig 분자는 류마티스 관절염 및 골관절염에 대한 공지된 동물 모델을 사용하여 가능한 치료학적 활성에 대해 특성확인되었다.
실시예 1.1. IL -1α 및 IL -1β에 대한 뮤린 모노클로날 항체의 생성
IL-1α 및 IL-1β에 대한 모노클로날 항체(mAb)를 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 다음과 같이 생성하였다.
실시예 1.1.A 마우스의 면역화
정제된 재조합 사람 IL-1α 및 뮤린 IL-1β(제조원: R&D Systems)을 역가 검정(titer assay) 및 스크리닝 ELISA에서 피복 항원으로서 뿐만 아니라 면역원으로서도 사용하였다. 면역화 용량은 주요 및 부스트(boost) 면역화 둘 다에 대해 모든 항원의 경우 5.0 내지 20.0㎍/마우스/주사의 범위이었다. ImmunEasy 보조제는 Qiagen(참조: 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)으로부터 구입하였으며 10.0㎍의 항원당 20 ml의 ImmunEasy 보조제의 보조제/항원 비로 사용하였다. 면역화시킬 동물의 각각의 그룹은 요이치로 이와쿠라(Yoichiro Iwakura) 박사(일본 도쿄도 미나토쿠 소재의 도쿄대)로부터 입수한 5마리의 IL-1αβ KO 마우스를 포함하였다. 마우스를 하기 기술된 투여량 스케쥴에 따라 면역화시켰다. MRC-5 세포는 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)에서 구입하였으며 IL-1 생검정에 사용하였다. 사람 IL-8 ELISA 키트(kit) 및 대조군 마우스 항-hIL-1α 및 항-hIL-1β 항체(MAB200 및 MAB201)는 R&D Systems(미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)에서 구입하였다.
요약하면, 보조제-항원 혼합물은 우선 보조제를 바이알 중에서 볼텍스(vortex)를 사용하여 온화하게 혼합함으로써 제조하였다. 목적한 양의 보조제를 바이알로부터 제거하여 오토클레이빙된(autoclaved) 1.5mL의 미세원심분리 튜브 중에 두었다. 항원을 PBS 또는 염수 중에서 0.5 내지 1.0mg/ml 범위의 농도로 제조하였다. 계산된 양의 항원을 이후에 보조제가 들어있는 미세원심분리 튜브에 가하고 당해 용액을 온화하게 상하로 5회 피펫팅(pipetting)하여 혼합하였다. 보조제-항원 혼합물을 실온에서 15분 동안 항온처리한 후 상하로 5회 온화하게 피펫팅함으로써 다시 혼합하였다. 보조제-항원 용액을 동물 주사를 위해 적절한 주사기 내에 넣었다. 총 5 내지 20㎍의 항원을 50 내지 100μl의 용적으로 주사하였다. 각각의 동물을 면역화한 후, 역가에 따라 2 내지 3회 부스팅(boosting)하였다. 우수한 역가를 가진 동물에게 주입 및 하이브리도마 생성 전에 최종의 정맥내 부스트를 제공하였다.
실시예 1.1.B. 하이브리도마의 스크리닝
위에서 기술된 바와 같이 생성된, 하이브리도마를 스크리닝하고 ELISA를 사용하여 항체 역가를 측정하였다. 단백질 항원을 표준 ELISA 과정을 사용하여 특이적인 항체 검출용 ELISA 플레이트 위에 직접 피복하였다. 요약하면, ELISA 플레이트를 100 μl의 rhIL-1α 또는 rhIL-1β(PBS중 1.0 μg/ml)으로 밤새 4℃에서 피복시켰다. 플레이트를 250 μl PBS/0.5% 트윈(Tween)20으로 3회 세척하고 200 μl의 차단 완충액(0.5%Tween20이 들어있는 PBS중 2% BSA)으로 차단시켰다. 희석된 혈청 또는 하이브리도마 상층액(100 μl)을 각각의 웰에 가하고, 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 플레이트를 PBS/0.5%Tween20으로 3회 세척하였다. HRP-염소 항-뮤린 IgG를 검출을 위해 사용하고, 결합 OD를 450 nm에서 관찰하였다. ELISA에서 고 특이적인 결합 활성을 나타낸 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 아클로닝(subcloning)하고 정제하며, 항체의 친화성[비아코어(Biacore)] 및 효력(MRC-5 생검정)을 다음과 같이 특성확인하였다.
실시예 1.1.C. IL -1α 및 IL -1β에 대한 뮤린 모노클로날 항체의 특성확인
다음 검정을 사용하여 실시예 1.1.B.에 기술된 하이브리도마에 의해 생산된 항체를 특성확인하였다.
실시예 1.1.C.1. 표면 플라스몬 공명
염소 항-마우스 IgG 및 rmIL-1을 통해 바이오센서 매트릭스(biosensor matrix) 위에 포획된 항체(마우스 항-재조합 mIL-1 항체) 사이의 실시간 결합 상호작용을 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 비아코어 시스템(BIAcore system)(제조원: 스웨덴 업살라 소재의 Biacore AB)을 사용하여 제조업자의 지시 및 표준 과정에 따라 측정하였다. 요약하면, rmIL-1을 HBS 러닝 완충액(running buffer)(제조원: Biacore AB) 중에 희석시키고 50 μl의 분취량(aliquot)을 면역화된 단백질 매트릭스를 통해 5 ml/분의 유동속도(flow rate)으로 주사하였다. 사용된 rhIL-1의 농도는 62.5, 125, 187.5, 250, 375, 500, 750, 1000, 1500, 및 2000 nM이었다. 해리 상수(오프-속도), 결합 상수(온-속도). 비아코어 역학적 평가 소프트웨어(BIAcore kinetic evaluation software)(버젼 3.1)을 사용하였다.
실시예 1.1.C.2. 항- IL -1 생검정
MRC-5 세포주는 사람 IL-1α 및 IL-1β에 투여량-의존적 방식으로 반응하여 IL-8을 생산하는 사람 폐 섬유아세포 세포주이다[참조: Dinarello, Muegge, and Durum (2000) Curr. Protocols Immunol. 6:1]. MRC-5 세포를 10% FBS 완전 MEM 중에서 배양하고 37℃에서 5% CO2 항온처리기 중에서 성장시켰다. 재조합 사람 IL-1α 또는 IL-1β에 대한 모노클로날 항체(mAb)의 중화 효능을 측정하기 위해, mAb(50μl)의 상이한 농도(0-10μg/ml)를 96-웰 플레이트에 가하고 50 μl의 rhIL-1α 또는 rhIL-1β(10-50 pg/ml)을 1시간 동안 37℃에서 예비-항온처리하였다. 상층액을 수거하고, 희석시키고, IL-8 농도를 표준 IL-8 ELISA 키트(제조원: R&D Systems)를 사용하여 ELISA로 측정하였다. 항체 효력은 MRC-5 세포에 의한 IL-8 생산을 억제하는 이의 능력으로 측정하였다.
비아코어 및 MRC-5 생검정을 기초로 하여, 고 친화성 및 효력을 가진 다수의 뮤린 항-hIL-1α 및 항-hIL-1β 항체를 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 확인하였다:
Figure pat00005
실시예 1.1.D. IL -1α 및 IL -1β에 대한 뮤린 모노클로날 항체( mAb )의 클로닝 및 서열분석
표 1(상기)에 기술된 모든 항-IL-1α/β mAb 및 추가의 항체의 가변 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 유전자의 클로닝 및 서열 분석을 트리졸 시약(제조원: Invitrogen)을 사용하여 제조업자의 지시에 따라 각각의 하이브리도마 세포주로부터 총 RNA의 분리 및 정제 후 수행하였다. VH 및 VL 유전자 둘 다의 증폭은 마우스 Ig-프라이머 세트(제조원: 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Novagen)로부터의 IgGVH 및 IgκL 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조업자가 제안한 바와 같은 1개-튜브 RT-PCR 키트(제조원: Qiagen)로 수행하였다. 생산적 증폭으로부터 수득되는 DNA 단편을 제조업자의 지시에 따라 PCR-TOPO 벡터(제조원: Invitrogen)내로 클로닝하였다. 이후에, 다수의 VH 및 VL 클론을 ABI 3000 서열분석기(제조원: 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 사용하여 디데옥시 쇄 종결 방법(dideoxy chain termination method)으로 서열분석하였다. 모든 mAb VL 및 VH 유전자의 서열을 하기 표 2에 나타낸다.
Figure pat00006
Figure pat00007
실시예 1.2. 뮤린 -사람 키메라 항체의 생성 및 특성확인
상기 기술된 모든 mAb를 키메라 항체(사람 불변 영역을 지님)로 전환시키고 발현, 정제 및 특성확인하여 활성을 확인하였다. 항체를 또한 후속적인 DVD-Ig 결합 단백질 분석을 위한 대조군으로 사용하였다. 3D12.E3을 키메라 형태로 전환시키기 위해, 3D12.E3-VL을 프라이머 P1 및 P2를 사용하여 PCR 증폭시키는 한편; 사람 Cκ 유전자(내부에서 생성된 pBOS 벡터내, 제조원: 미국 매사츄세츠주 워체스터 소재의 Abbott Bioresearch Center)를 프라이머 P3 및 P4를 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응물 둘 다를 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 프라이머 P1 및 P4를 사용하는 후속적인 오버랩핑 PCR 반응에 대한 오버랩핑 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 생성물, 키메라 경쇄 3D12.E3-VL-hCκ를 제조업자의 지시에 따라 TOPO 클로닝에 의해 pEF6 TOPO 포유동물 발현 벡터(제조원: Invitrogen)내로 아클로닝하였다. 표 3은 당해 과정에서 사용된 PCR 프라이머 각각의 서열을 나타낸다.
Figure pat00008
3D12.E3 중쇄를 키메라 형태로 전환시키기 위해, 3D12.E3-VH를 프라이머 P5 및 P6을 사용하여 PCR 증폭시키는 한편; 사람 Cγ1 유전자(ABC에서 내부에서 생성된 pBOS 벡터)를 프라이머 P7 및 P8을 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 둘 다를 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행하였다. 2개의 PCR 생성물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 프라이머 P5 및 P8을 사용하는 후속적인 오버랩핑 PCR 반응을 위한 오버랩핑 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 생성물인, 키메라 경쇄3D12.E3-VH-hCγ1을 pcDNA3.1 TOPO 포유동물 발현 벡터(제조원: Invitrogen)내로 제조업자의 지시에 따라서 아클로닝시켰다. 표 4는 당해 과정에 사용된 PCR 프라이머 각각의 서열을 나타낸다.
Figure pat00009
유사하게, 키메라 13F5.G5-VH-Cγ1을 프라이머 P21/P22(VH의 경우) 및 P7/P8(hCγ1의 경우)을 사용하여 생성시키고 pcDNA3.1 TOPO 벡터내로 클로닝하고, 키메라 13F5.G5-VL-Cκ를 프라이머 P23/P24(VL의 경우) 및 P3/P4(hCκ의 경우)를 사용하여 생성시키고 pEF6 TOPO 벡터내로 클로닝하였다. 표 5는 당해 과정에 사용된 PCR 프라이머 각각의 서열을 나타낸다.
Figure pat00010
키메라 항체를 발현시키기 위해, 13F5.G5-VL-Cκ 및 13F5.G5-VH-Cγ1을 COS 세포 중에서 리포펙타민(제조원: Invitrogen)을 사용하여 72시간 동안 공-발현시키고, 배지를 수집하여 IgG를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 유사하게, 13F5.G5-VL-Cκ 및 13F5.G5-VH-Cγ1을 COS내에서 리포펙타민(제조원: Invitrogen)을 사용하여 72시간 동안 공-발현시키고, 배지를 수집하여 IgG를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 키메라 Ab 둘 다를 비아코어 및 MRC-5 생검정으로 특성확인하여 활성을 확인하였다. 당해 결과는, 이들 키메라 Ab가 본래의 뮤린 mAb의 것과 유사한 친화성 및 효력을 나타내었음을 나타내었다.
실시예 1.3. IL -1α/β 이원 가변 도메인 면역글로불린( DVD - Ig ) 분자의 작제 , 발현 및 정제
hIL-1α 및 hIL-1β에 결합할 수 있는 DVD-Ig 결합 단백질을 생성하는데 사용된 작제물은 도 1b에 도시되어 있다. 요약하면, 2개의 고 친화성 뮤린 항체, 항-hIL-1α(클론 3D12.E3) 및 항-hIL-1β(클론 13F5.G5)를 포함하는 모 mAb를, Balb/c 마우스를 재조합 IL-1α 단백질(rhIL-1α) 및 재조합 IL-1β 단백질(rhIL-1β)을 각각 사용하여 면역화시켜 수득하였다. 이들 2개의 하이브리도마 클론의 VL/VH 유전자를 RT-PCR에 의해 마우스 Ig 프라이머 키트(제조원: 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Novagen)을 사용하여 분리시켰다. VL/VH 유전자를 우선 키메라 항체(사람 불변 영역을 지님)로 전환시켜 활성 및 효력을 확인하였다. DVD1-Ig 결합 단백질을 생성하기 위해, 13F5.G5의 VH 및 VL을 3D12.E3의 VH 및 VL 각각의 N-말단에 직접 융합시켰다(도 1b에 나타낸 바와 같음). DVD2-Ig 결합 단백질을 유사하게 작제하였으나, 단, 이는 경쇄(링커 서열은 ADAAP이다)와 중쇄(링커 서열은 AKTTPP이다) 내 2개의 가변 도메인 사이에 링커를 지녔다. 이들 서열은 뮤린 Cκ 및 CH1 서열의 N-말단으로부터 선택하였다. 뮤린 Cκ 및 CH1의 N-말단으로부터 선택된 이들 링커 서열은 가변 도메인의 천연 연장부이며 몇개의 Fab 결정 구조의 분석을 기준으로 한 유의적인 2차 구조가 없는 굴곡성 구조를 나타낸다. PCR 클로닝의 상세한 과정은 하기 기술되어 있다.
실시예 1.3.A. hIL -1α/β DVD1 - Ig 결합 단백질의 분자 클로닝
13F5.G5-VH를 프라이머 P21 및 P25를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 3D12.E3-VH-hCγ1을 프라이머 P14 및 P8을 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 둘 다를 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행하였다. 2개의 PCR 생성물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 프라이머 P21 및 P8을 사용하는 후속적인 오버랩핑 PCR 반응을 위한 오버랩핑 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 생성물인, DVD1-Ig 중쇄 hIL-1α/βDVD1-VH-hCγ1을 pcDNA3.1 TOPO 포유동물 발현 벡터(제조원: Invitrogen)내로 제조업자의 지시에 따라서 아클로닝하였다. 표 6은 당해 과정에 사용된 PCR 프라이머의 서열을 나타낸다.
Figure pat00011
hIL-1α/βDVD1-Ig 경쇄를 생성시키기 위해, 13F5.G5-VL을 프라이머 P23 및 P26을 사용하여 PCR 증폭시키는 한편; 3D12.E3-VL-hCκ를 프라이머 P16 및 P4를 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 둘 다는 표준 PCR 기술 및 과정에 따라서 수행하였다. 2개의 PCR 생성물 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 프라이머 P23 및 P4를 사용하는 후속적인 오버랩핑 PCR 반응에 대한 오버랩핑 주형으로서 함께 사용하였다. 최종 PCR 생성물, hIL-1α/β DVD1-Ig 경쇄 hIL-1α/β DVD1-VL-hCκ를 pEF6 TOPO 포유동물 발현 벡터(제조원: Invitrogen)내로 제조업자의 지시에 따라 아클로닝하였다. 표 7은 당해 과정에 사용된 PCR 프라이머 각각의 서열을 나타낸다.
Figure pat00012
실시예 1.3.B. hIL -1α/β DVD2 - Ig 의 분자 클로닝
13F5.G5-VH를 프라이머 P21 및 P17을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 3D12.E3-VH-hCγ1을 프라이머 P18 및 P8을 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 둘 다는 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행하였다. 2개의 PCR 생성물을 겔-여과하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 프라이머 P21 및 P8을 사용하여 후속적인 오버랩핑 PCR 반응용 오버랩핑 주형으로 함께 사용하였다. 최종 PCR 생성물, DVD2-Ig 중쇄 hIL-1α/βDVD2-VH-hCγ1을 pcDNA3.1 TOPO 포유동물 발현 벡터(제조원: Invitrogen)내로 제조업자의 지시에 따라 아클로닝시켰다. 표 8은 당해 과정에서 사용된 PCR 프라이머 각각의 서열을 나타낸다.
Figure pat00013
hIL-1α/βDVD2-Ig 경쇄를 생성시키기 위해, 13F5.G5-VL을 프라이머 P23 및 P19를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 3D12.E3-VL-hCκ를 프라이머 P20 및 P4를 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응 둘 다를 표준 PCR 기술 및 과정에 따라 수행하였다. 2개의 PCR 생성물을 겔-정제하고, 표준 PCR 조건을 사용하여 프라이머 P23 및 P4를 사용하는 후속적인 오버랩핑 PCR 반응용 오버랩핑 주형으로 함께 사용하였다. 최종 PCR 생성물, hIL-1α/βDVD2-Ig 경쇄 hIL-1α/βDVD2-VL-hCκ를 pEF6 TOPO 포유동물 발현 벡터(제조원: Invitrogen)내로 제조업자의 지시에 따라 아클로닝하였다. 표 9는 당해 과정에서 사용된 PCR 프라이머 각각의 서열을 나타낸다.
Figure pat00014
hIL-1α/βDVD1-Ig 및 hIL-1α/βDVD2-Ig의 최종 서열은 표 10에 기술되어 있다.
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
실시예 1.3.C. hIL -1α/β DVD1 - Ig 결합 단백질의 발현 및 정제
각각의 작제물의 중쇄 및 경쇄를 pcDNA3.1 TOPO 및 pEF6 TOPO 벡터 각각내로 아크로닝하고, 서열분석하여 정확성을 보증하였다. 각각의 작제물의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 플라스미드를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 및 293펙틴(fectin) 시약 각각을 COS 세포 및 또한 사람 배아 신장 293 세포[출처: 미국 버지니아주 마나사스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)]내에서 일시적으로 발현시켰다. 세포 배양 배지를 일시적인 형질감염 후 72시간째에 수거하고 항체를 제조업자의 지시에 따라 단백질 A 크로마토그래피(제조원: 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce)를 사용하여 정제하였다. 항체를 SDS-PAGE로 분석하고 A280 및 BCA(제조원: 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce)로 정량화하였다. 표 11은, hIL-1α/βDVD1-Ig 및 hIL-1α/βDVD2-Ig의 발현 수준이 키메라 항체의 것과 비교가능함을 나타내며, DVD-Ig 결합 단백질이 포유동물 세포내에서 효율적으로 발현할 수 있음을 나타낸다.
Figure pat00018
실시예 1.4. hIL -1α/β DVD - Ig 결합 단백질의 질량 분광법 및 SEC 분석
DVD-Ig 결합 단백질의 경쇄 및 중쇄의 분자량(MW)을 측정하기 위해, 10 μL의 DVD-Ig 분자(0.8㎍/μL)를 1.0 M DTT 용액(5 μL)으로 환원시켰다. PLRP-S, 8μ, 4000A, 및 1 x 150 mm 단백질 컬럼(제조원: 미국 매사츄세츠주 아우번 소재의 Michrom BioResource)을 사용하여 DVD-Ig 분자의 중쇄 및 경쇄를 분리하였다. 아질런트(Agilent) HP1100 모세관(Capillary) HPLC(제조원: 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Agilent Technologies Inc.)를 질량 분광계 QSTAR(제조원: 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)와 함께 사용하였다. 밸코 밸브(valco valve)를 10분으로 설정하여 탈염 샘플에 대해 폐기물로부터 MS로 유동을 변환시켰다. 완충액 A는 0.02% TFA, 0.08% FA, 0.1% ACN 및 99.8% HPLC-H2O이었다. 완충액 B는 0.02% TFA, 0.08% FA, 0.1% HPLC-H2O, 및 99.8% ACN을 함유하였다. HPLC 유동 속도는 50 μL/분이었고 샘플 주사 용적은 8.0 mL이었다. 컬럼 오븐의 온도를 60℃로 설정하고, 분리 구배는 5% B로 5분; 5% B 내지 65% B로 35분; 65% B 내지 95% B로 다른 5분, 및 95% B 내지 5% B로 5분 동안이었다. TOFMS 스캔은 800 내지 2500 amu이었고, 주기는 3600이었다. 전장 DVD-Ig 결합 단백질의 MW를 측정하기 위해, 단백질 마이크로트랩 카트릿지(Protein MicroTrap cartridge)(제조원: 미국 매사츄세츠주 아우번 소재의 Michrom BioResource)를 샘플을 탈염시키기 위해 사용하였다. HPLC 구배는 5% B로 5분; 5% B 내지 95% B로 1분; 및 95% B 내지 5% B로 다른 4분이었다. QSTAR TOFMS 스캔은 2000 내지 3500 amu이었고, 주기는 899이었다. 모든 MS 미가공 데이터(raw data)를 애널리스트(Analyst) QS 소프트웨어(제조원: Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다. DVD-Ig 결합 단백질의 SEC 분석을 위해, PBS 중에서 정제된 DVD-Ig 결합 단백질 및 키메라 Ab를 수페로즈(Superose) 6 10/300 G2, 300 x 10 mm 컬럼(제조원: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Amersham Bioscience)에 적용하였다. HPLC 장치인, Model 10A(제조원: 미국 매릴랜드주 콜롬비아 소재의 Shimadzu)를 SEC를 위해 사용하였다. 모든 단백질을 280 nm 및 214 nm에서 UV 검출을 사용하여 측정하였다. 용출물은 0.5 mL/분의 유동 속도에서 등용매(isocratic)이었다. 안정성 연구를 위해, PBS중 0.2 내지 0.4mg/ml의 농도 범위의 샘플은 -80℃ 내지 25℃ 사이의 3회 동결-해동 주기를 겪거나, 4℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 및 8주 동안 항온처리한 후, SEC 분석하였다.
DVD-Ig 결합 단백질 및 키메라 항체를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 정제 수율(3 내지 5mg/L)은 각각의 단백질에 대해 발현 배지의 hIgG 정량화와 일치하였다. 정제된 DVD-Ig 결합 단백질 및 키메라 항체의 조성 및 순도를 환원된 및 비-환원된 조건 둘 다에서 SDS-PAGE로 분석하였다. 비-환원된 조건에서, 4개의 단백질 각각은 단일 밴드(single band)로서 이주하였다. DVD-Ig 단백질은 예측한 바와 같이, 키메라 항체보다 더 큰 분자량을 나타내었다. 비-환원 조건에서, 4개의 단백질 각각은 2개 밴드, 즉 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 수득하였다. 다시, DVD-Ig 결합 단백질의 경쇄 및 중쇄는 키메라 항체의 것보다 크기가 더 컸다. SDS-PAGE는, 각각의 DVD-Ig 결합 단백질이 단일 종으로서 발현되며, 중쇄 및 경쇄는 효율적으로 쌍을 이루어 IgG-유사 분자를 형성한다. 중쇄 및 경쇄, 및 또한 2개의 DVD-Ig 분자의 전장 단백질의 크기는 아미노산 서열을 기준으로 한 이들의 계산된 분자량과 일치한다(참조: 표 11).
DVD-Ig 결합 단백질의 정확한 분자량을 측정하기 위하여, 질량 분광법을 사용하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 경쇄, 중쇄, 및 전장 단백질을 포함하는 각각의 DVD-Ig 결합 단백질의 실험적으로 측정된 분자량은 예측된 값과 우수하게 일치한다. 용액 중에서 DVD-Ig 결합 단백질의 물리적 특성을 추가로 연구하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 각각의 단백질을 분석하였다. 키메라 Abs 및 DVD2-Ig 결합 단백질 둘 다는 단량체성 단백질로서 물리적 균질성을 입증하는, 단일 피크를 나타내었다. 3D12.E3 키메라 Ab는 13F5.G5 키메라 Ab보다 더 작은 물리적 크기를 나타내었으며, 이는 3D12.E3 키메라 Ab가 보다 더 압축된 구상 형을 채택하였음을 나타낸다. DVD1-Ig 결합 단백질은 우측에 주요 피크 및 쇼율더 피크(shoulder peak)를 나타내었으며, 이는 DVD1-Ig 결합 단백질의 부분이 현재의 완충액 조건에서 응집된 형태로 가능하게 존재함을 제안한다.
실시예 1.5: hIL -1α/β DVD - Ig 결합 단백질의 시험관내 안정성의 분석
DVD-Ig의 물리적 안정성을 다음과 같이 시험하였다. PBS 중에서 0.2 내지 0.4mg/ml의 농도 범위의 정제된 항체는 -80℃ 내지 25℃ 사이의 3회 동결-해동 주기를 겪거나, 4℃, 25℃, 또는 40℃에서 4주 및 8주 동안 항온처리한 후, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 사용하여 분석하였다(참조: 표 12).
Figure pat00019
키메라 항체 둘 다는 정규의 IgG 분자의 경우 일반적인, 작은 정도의 응집 및 단편화를 나타내었다. DVD1-Ig 결합 단백질은 정제 후 SEC에 있어서 일부 응집을 나타내었다. 안정성 분석에서, DVD1-Ig 결합 단백질은 또한 상이한 조건하에서 PBS중 응집을 나타내었지만; DVD1-Ig 결합 단백질의 응집된 형태의 퍼센트는 장기간의 저장 또는 보다 높은 온도 동안 증가하지 않았다. DVD1-Ig 결합 단백질의 단편화된 형태의 퍼센트는 키메라 3D12.E3 Ab의 것과 유사한, 일반적인 범위이었다. 대조적으로, DVD2-Ig 결합 단백질은 예외적인 안정성을 나타내었다. 응집 또는 단편화는 시험한 모든 조건에서 DVD2-Ig 결합 단백질에 대해 검출되지 않았으며, DVD2-Ig 결합 단백질 중 100%가 완전한 단량체성 분자로서 유지되었다.
실시예 1.6. hIL -1α/β DVD - Ig 결합 단백질의 항원 결합 친화성의 측정
rhIL1-α 및 rhIL1-β에 결합하는 DVD-Ig 분자의 역학을 비아코어(Biacore) 3000 장치(제조원: 스웨덴 업살라 소재의 Biacore AB)로 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% 표면활성제 P20)을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명-계 측정 장치로 측정하였다. 모든 화학물질은 업자(스웨덴 업살라 소재의 Biacore AB)로부터 입수하거나, 달리는 본원에 기술된 바와 같은 상이한 공급원으로부터 입수하였다. 대략적으로, 10 mM의 아세트산나트륨(pH 4.5) 중에 희석된 5000 RU의 염소 항-사람 IgG Fcγ 단편 특이적인 폴리클로날 항체(미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce Biotechnology Inc.)를 직접 CM5 조사 등급의 바이오센서 칩(biosensor chip)을 가로질러 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 제조업자의 지시 및 과정에 따라 25mg/ml에서 직접 고정화하였다. 바이오센서 표면의 반응하지 않은 잔기를 에탄올아민으로 차단시켰다. 유동셀(flowcell) 2 및 4에서 변형된 카복시메틸 덱스트란 표면을 반응 표면으로 사용하였다. 유동 셀 1 및 3에서 염소 항-사람 IgG의 부재하에 변형되지않은 카복시메틸 덱스트란을 참조 표면으로 사용하였다. 역학적 분석을 위해, 1:1의 랭뮤어 결합 모델(Langmuir binding model)로부터 기원한 속도 방정식을 모든 10개의 주사의 결합 및 해리 상에 대해 (구형 피트 분석(global fit analysis)을 사용하여) 바이오평가(Bioevaluation) 4.0.1 소프트웨어를 사용하여 동시에 핏팅(fitting)하였다. 정제된 DVD-Ig 샘플을 HEPES-완충된 염수 중에 염소 항-사람 IgG Fc 특이적인 반응 표면을 가로질러 포획하기 위해 희석시키고 반응 매트릭스에 걸쳐 5 ml/분의 유동 속도로 주사하였다. 결합 및 해리 속도 상수, kon (M-1s-1) 및 koff (s-1)를 25 ml/분의 연속 유동 속도하에 측정하였다. 속도 상수는 1.25 내지 1000 nM 범위의 10개의 상이한 항원 농도에서 역학적 결합 측정으로 유도시켰다. DVD-Ig 분자와 rhIL1α/β 사이의 반응의 평형 해리 속도(M)를 이후에 다음 식에 의해 역학적 속도 상수로부터 계산하였다: KD = koff/kon. rhIL1α/β 샘플의 분취량을 또한 블랭크 참조(blank reference) 및 반응 CM 표면에 동시 주사하여 임의의 비특이적인 결합 배경을 기록하고 감하여 굴절률 변화 및 주사 노이즈(injection noise)의 대부분을 제거하였다. 표면을 5ml/분의 유동 속도에서 10 mM 글리신(pH 1.5)의 2회 연속적인 25ml 주사로 재생시켰다. 항-Fc 항체 고정된 표면을 완전히 재생시키고 12회 주기에 걸쳐 이들의 완전한 포획능을 보유시켰다. 포획된 DVD-Ig-rhIL1α/β 복합체의 명백한 입체화학을 다음 식을 사용하여 포화된 결합 조건(정상-상태 평형)하에 계산하였다:
Figure pat00020
비아코어 분석은, 키메라 항체가 본래의 하이브리도마 모노클로날 항체와 유사한 결합 역학 및 친화성을 지님을 나타내며, 이는, 정확한 VL/VH 서열이 분리되었음을 나타낸다(표 13). hIL-1α에 대한 2개의 DVD-Ig 결합 단백질의 전체 결합 매개변수는 유사하였으며, DVD-Ig 결합 단백질의 친화성은 키메라 3D12.E3 항체의 것보다 단지 2 내지 3배 미만이었다. hIL-1β에 대한 DVD2-Ig 결합 단백질의 결합 친화성은 키메라 항체 13F5.G5보다 약간 더 낮았지만, DVD1-Ig 결합 단백질보다는 3배 더 높았다. hIL-1에 대한 키메라 항체의 친화성과 비교하여 hIL-1에 대한 2개의 DVD-Ig 결합 단백질의 친화성은 IL-1에 대한 입체화학의 평가에 의해 나타낸 바와 같이 유사하였다. 2가의 단일특이적, 키메라 항체 둘 다는 비아코어에서 IL-1α 및 IL-1β에 각각 1.6 및 1.7의 입체화학으로 결합하였다. 이는, 항체가 1.5 내지 2.0의 범위인 입체화학을 생성하는 비아코어 센스 칩상에서 밀집하여 고정되는 경우 분자간 방해로 인하여 IgG에 대해 일반적이다. hIL-1α 및 hIL-1β에 대한 DVD-Ig 결합 단백질 둘 다의 화학량론은 2개의 키메라 항체의 것과 유사하였으며, 이는, DVD-Ig 결합 단백질 둘 다가 각각의 항원에 대해 2가 결합능을 지녔음을 나타낸다.
Figure pat00021
또한, DVD-Ig 결합 단백질의 4가의 이중-특이적인 항원 결합을 또한 비아코어로 분석하였다(표 14). 우선, DVD-Ig 결합 단백질을 비아코어 센서 칩 상에서 염소 항-사람 Fc 항체를 통해 포획하고, 제1 항원을 주사하고 결합 신호를 관찰하였다. DVD-Ig 결합 단백질이 제1 항원에 의해 포화되면, 이후에, 제2 항원을 주사하고 제2 신호를 관찰하였다. 이는 DVD2-Ig 결합 단백질에 대해 IL-1β을 처음 주사한 후 IL-1α를 주사하거나 IL-1α를 처음 주사한 후 IL-1β를 주사하여 수행하였다. 하나의 서열에서, 이중-결합 활성을 검출하였다. 유사한 결과가 DVD1-Ig 결합 단백질에 대해 수득되었다. 따라서, 각각의 DVD-Ig 결합 단백질은 이중-특이적인 4가 분자로서 항원 둘 다에 동시에 결합할 수 있었다. 표 14에 나타낸 바와 같이, hIL-1α 또는 hIL-1β이든, 제1 항원에 대한 DVD-Ig 결합 단백질 둘 다의 화학양론은 일-특이적인 2가 결합의 것과 유사한 1.5보다 컸다. 제2 항원을 주사 시, DVD-Ig 결합 단백질은 이미 제1 항원에 의해 점유되었지만, 제2 항원(즉, hIL-1α 또는 hIL-1β)에 대한 DVD-Igs 결합 단백질 둘 다의 화학량론은 1.0과 1.3 사이이었다. 따라서, DVD-Ig 결합 단백질은 2개의 IL-1α 및 2개의 IL-β 분자에 결합할 수 있었다. DVD-Ig 결합 단백질을 우선 비아코어 센서 칩에서 염소 항-사람 Fc 항체를 통해 포획하였고, 제1 항원을 주사하고 결합 신호를 관찰한 후 제2 항원을 주사하였다.
Figure pat00022
실시예 1.7. DVD - Ig 분자의 기능적 동일성의 측정
DVD2-Ig 결합 단백질은 표적-특이적인 친화성 크로마토그래피대신 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제되므로, 임의의 잠재적인 미스폴딩(misfolding)되고/되거나 미스매치된 VL/VH 도메인도, 존재하는 경우, 2개의 상이한 항원에 대한 결합 연구에 의해 평가할 수 있다. 이러한 결합 분석은 크기 배제 액체 크로마토그래피(SEC)로 수행하였다. DVD2-Ig 결합 단백질은 단독으로 또는 IL-1α, IL-1β, 또는 등몰 비의 IL-1α 및 IL-1β 둘 다와 함께 37℃에서 120분의 항온처리 기간 후, 컬럼에 적용하였다. 각각의 항원을 또한 대조군으로서 단독으로 수행하였다. SEC 결과는, DVD2-Ig 결합 단백질이 용액 중에서 IL-1α 및 IL-1β에 결합할 수 있었음을 나타내었으며, 이러한 결합은 SEC 신호로의 이동을 초래하였으며 이는, DVD2-Ig 결합 단백질이 임의의 항원과 복합되었을 때 이의 역학적 크기에 있어서의 증가를 나타낸다. DVD2-Ig 결합 단백질 신호의 이동은 100%였으며, 부분적이지는 않지만, 이는, 모든 DVD2-Ig 분자가 항원에 결합할 수 있음을 제안한다. IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 존재하에서, DVD2-Ig 결합 단백질 신호의 추가로 및 완전한 이동이 존재하였으며, 이는, 모든 DVD2-Ig 분자가 단일형태 양식으로 항원 둘 다에 결합할 수 있었음을 나타낸다. 당해 실험은, DVD-Ig 결합 단백질이 기능적으로 동종인 단백질로서 발현되었음을 입증하였다. 이는, DVD-Ig 결합 단백질이 모든 앞서 기술된 이중-특이적인, 다중-특이적인, 및 다가의 면역글로불린-유사 및 면역글로불린-기원한 분자와는 상이한, 동종의 단일, 기능성 종으로 생산될 수 있음을 입증하므로 유의적인 결과를 가진다.
실시예 1.8. DVD - Ig 결합 단백질의 생물학적 활성의 측정
DVD-Ig의 생물학적 활성을 MRC-5 생검정을 사용하여 측정하였다. MRC-5 세포주는 사람 IL-1α 및 IL-1β에 대해 투여량 의존적 방식으로 반응하여 IL-8을 생산하는 사람 폐 섬유아세포 세포주이다. MRC-5 세포를 ATCC로부터 입수하여 10% FBS 완전 MEM 중에서 37℃로 5% CO2 항온처리기 중에서 배양하였다. 사람 IL-1α 또는 IL-1β에 대한 DVD-Ig의 중화 활성을 측정하기 위하여, MEM/10%FBS 중 50 μl의 항체(1 x 10-7 내지 1 x 10-12 M)을 96 웰 플레이트에 가하고 50 μl의 hIL-1α 또는 hIL-1β(200 pg/ml)과 함께 1시간 동안 37℃, 5% CO2에서 예비-항온처리하였다. 이후에, MRC-5 세포를 1 x 105/ml의 농도에서 모든 웰에 가하고, 플레이트를 37℃에서 5% CO2 항온처리기 중에서 밤새 항온처리하였다. 상층액을 수거하고 사람 IL-8 생산을 표준 ELISA(제조원: 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재의 R&D Systems)로 측정하였다. DVD-Ig 결합 단백질의 중화 활성을 IL-8 생산을 억제하는 이의 능력으로 측정하였다.
표 13에 나타낸 바와 같이, DVD-Ig 결합 단백질 둘 다는 hIL-1α 및 hIL-1β를 중화시킬 수 있었다. hIL-1α에 대한 결합 친화성과 일치하여, hIL-1α에 대한 DVD1-Ig 결합 단백질 및 DVD2-Ig 결합 단백질의 중화 활성은 또한 키메라 항체의 것과 유사, 즉 3배 미만이었다(참조: 표 13). hIL-1β에 대한 이의 결합 친화성과 일치하여, hIL-1β에 대한 DVD2-Ig 결합 단백질의 중화 활성은 키메라 Ab 13F5.G5의 것보다 약간 적었지만, DVD1-Ig 결합 단백질의 것보다는 3배 더 높았다. 전체적으로 본래의 모노클로날 항체와 비교하여 DVD-Ig 분자의 생물학적 활성에 있어 유의적인 감소는 없었다.
DVD-Ig 결합 단백질이 IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 존재하에서 IL-8 생산을 억제할 수 있는지를 측정하기 위하여, 등량의 hIL-1α 및 hIL-1β를 MRC-5 검정의 동일한 배양 시스템에 가하였다. DVD1-Ig 결합 단백질 및 DVD2-Ig 결합 단백질 둘 다는 IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 존재하에서 MRC-5 세포에 의한 IL-8 합성을, 단지 하나의 사이토카인이 존재한 경우의 단일-검정의 것과 유사한 활성으로 억제할 수 있었다(표 13). IL-1α 및 IL-1β 둘 다가 존재하는 당해 검정에서, DVD2-Ig 결합 단백질(1.2 nM)의 이중-억제 활성은 DVD1-Ig 결합 단백질(2.2 nM)의 것보다 더 높았다.
실시예 2. DVD - Ig 결합 단백질에서 링커 크기 및 가변 도메인 배향의 분석
표 15에 나타난 바와 같이, 상이한 모 mAb 쌍을 갖는 추가의 DVD-Ig 분자를 작제하였다. mAb의 각각의 쌍에 대해 4개의 상이한 DVD-Ig 작제물을 생성시켰다: 짧은 링커를 지닌 2개 및 긴 링커를 지닌 2개, 각각은 2개의 상이한 도메인 배향: a-b-C(알파-베타-불변 도메인) 및 b-a-C(베타-알파-불변 도메인). 링커 서열은 다음과 같이, 사람 Cκ 또는 CH1 도메인의 N-말단 서열로부터 기원하였다: 짧은 링커: 경쇄: TVAAP(서열번호 71); 중쇄: ASTKGP(서열번호 79); 및 긴 링커: 경쇄: TVAAPSVFIFPP(서열번호 72); 중쇄: ASTKGPSVFPLAP(서열번호 80).
모든 중쇄 및 경쇄 작제물을 pBOS 발현 벡터내로 아클로닝하고, COS 세포 또는 프리스타일(freestyle) 293 세포에서 발현시켰다.
새로운 DVD-Ig 클론을 작제하기 위해, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 2개의 mAb의 가변 도메인을 우선 hIL-1α/βDVD1-Ig 및 hIL-1α/βDVD2-Ig에 대해 기술된 바와 같이 오버랩핑 PCR을 사용하여 나란히 결합시켰다. 이후에, 결합된 단편(piece)들을 pBOS 벡터내에서 동종 재조합을 사용하여 아클로닝시켰다. 요약하면, 벡터를 제한 분해(2㎍의 pBOS-hCk 벡터를 FspAI 및 BsiWI를 사용하여 O+ 완충액 중에서 분해하고, 및 2㎍의 pBOS-hCγ z,non 벡터를 FspAI 및 SaII를 사용하여 O+ 완충액 중에서 분해하였다). 분해된 샘플을 1% 아가로즈 겔 위에서 수행하고 골격 단편을 50 μl의 물 중에서 정제하였다. 동종 재조합 및 형질전환을 위해, DH5α 적격 세포를 빙상에서 해동시키고, 20 내지 50 ng의 결합된 PCR 생성물 및 20 내지 50 ng의 선형화된 벡터(매 50 μl의 DH5α 세포내에서)와 혼합하였다. 혼합물을 온화하게 혼합하고 빙상에서 45분 동안 항온처리한 후, 42℃에서 1분 동안 열 쇼크(heat shock)에 의해 처리하였다. 이후에, 100 μl의 SOC 배지를 가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 형질전환 배양물을 암피실린을 함유하는 LB/아가 플레이트(LB/agar plate)에 접종하고 37℃에서 18 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 세균 클론을 분리하고, 이로부터 DNA를 정제하여 서열분석에 적용하였다. 최종의 서열-입증된 클론을 앞서 기술한 바와 같이 항체 발현 및 정제를 위해 COS 또는 293 세포내에서 공-형질감염(동일한 항체 쌍의 매치하는 HV 및 LC)시켰다.
정제된 DVD-Ig 단백질의 특성을 표 16에 요약한다. 표 16의 좌측 부분은 새로운 hIL-1α/β DVD-Ig 분자의 작제룰 위해 사용된 2개 쌍의 mAb의 특이성, 결합 친화성, 및 중화 효력을 나타낸다. 항체 18F4.2C8 및 1B12.4H4(참조: 실시예 1.1.D)를 사용하여 hIL-1α/β DVD3a-Ig, hIL-1α/β DVD4a-Ig, hIL-1α/β DVD3b-Ig, 및 hIL-1α/β DVD4b-Ig를 작제하였다. hIL-1α/βDVD3a-Ig 및 hIL-1α/βDVD4a-Ig는 각각 짧은 및 긴 링커를 지닌, a-b-C 배향이었다. hIL-1α/βDVD3b-Ig 및 hIL-1α/βDVD4b-Ig는 각각 짧은 및 긴 링커를 지닌 b-a-C 배향이었다. 항체 6H3.1A4 및 6B12.4F6을 사용하여 hIL-1α/βDVD5a-Ig, hIL-1α/βDVD6a-Ig, hIL-1α/β DVD5b-Ig, 및 hIL-1α/β DVD6b-Ig를 작제하였다. hIL-1α/β DVD5a-Ig 및 hIL-1α/βDVD6a-Ig는 각각 짧은 및 긴 링커를 가진 a-b-C 배향이었다. hIL-1α/β DVD5b-Ig 및 hIL-1α/βDVD6b-Ig는 각각 짧은 및 긴 링커를 가진 b-a-C 배향이었다. 이들 추가의 hIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 분자 클로닝은, 오버랩핑 PCR 과정을 사용하는, hIL-1α/β DVD1-Ig에 대해 앞에서 기술된 과정을 사용하여 수행하였다(참조: 실시예 1.3). 이들 추가의 hIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 아미노산 서열은 표 15에 기재되어 있다.
Figure pat00023
Figure pat00024
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Figure pat00034
신규 DVD-Ig 작제물의 특징을 표 16에 요약한다. 친화성(Kd) 및 생물학적 활성(IC50)을 비아코어 및 MRC-5 생검정 각각으로 측정하였다. 모든 신규 DVD-Ig 단백질의 SDS-PAGE 분석은 정규의 항체 및 DVD1/2-Ig와 유사하게, 환원된 및 비-환원된 조건 둘 다에서 정상의 이주 양식(normal migration pattern)을 나타내었다.
Figure pat00035
신규한 DVD-Ig 분자의 기능적 특성확인은, 임의의 배향이든, 긴 링커를 지닌 DVD-Ig 분자는 항원 둘 다의 결합 및 중화 측면에서 짧은 링커를 가진 것보다 더 우수하게 수행하였음을 나타내었다. 긴 링커를 가진 DVD-Ig 분자와 관련하여, b-a-C 배향을 가진 것은 항원 둘 다에 대해 우수한 결합 및 이들 둘 다의 중화를 나타내었지만, a-b-C 배향을 가진 DVD-Ig 분자는 IL-1α에 대해 우수한 결합 및 이의 중화를 나타내었고 IL-1β에 대해 감소된 결합 및 이의 중화를 나타내었다(예를 들면, DVD4b 대 DVD4a). DVD-Ig 분자, DVD4b는 아(sub)-nM로 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 결합하여 이들을 중화시켰으며 모 mAb의 결합 및 중화 특성을 완전히 보유하였다.
실시예 3. mIL -1α/β DVD - Ig 분자의 생성
약력학, 생체내 효능, 조직 침투, 및 DVD-Ig 분자의 면역원성에 관한 주요 쟁점을 연구하기 위하여, 마우스-항-마우스 IL-1α/β DVD-Ig 분자를 하기 기술한 바와 같이 작제하였다.
실시예 3.1. mIL -1α/β DVD - Ig 분자의 작제
마우스 항-마우스 IL-1α/β DVD-Ig 분자를 IL-1α/β 이중 KO 마우스로부터 생성된 2개의 마우스 항-마우스 IL-1α/β 모노클로날 항체(9H10 및 10G11)를 사용하여 작제하였다. 마우스 항-마우스 IL-1α, 및 마우스 항-마우스 IL-1β, 모노클로날 항체(mAb)를, IL-1α/β 이중 KO 마우스를 마우스 IL-1α, 또는 마우스 IL-1β로 각각 면역화시켜 생성시켰다. 하나의 마우스 항-마우스 IL-1α(클론 9H10) 및 하나의 마우스 항-마우스 IL-1β mAb(클론 10G11)을 선택하여 mIL-1α/β DVD-Ig 분자를 생성하는데 사용하였다. 각종 링커 크기 및 상이한 도메인 배향을 시험하였다. 최종의 기능적 mIL-1α/β DVD-Ig 분자를 V(항-mIL-1β)-링커-V(항-mIL-1α)-뮤린 불변 영역(Cγ2a 및 Cκ)의 배향으로 작제하였다. 클로닝, 발현, 및 정제 과정은 hIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 것과 유사하였다. mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 클로닝을 유사한 오버랩핑 PCR 및 동종 재조합을 사용하여 hIL-1α/β DVD3-Ig에 대해 기술한 바와 같이 수행하였다. mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 서열을 하기 표 17에서 나타낸다.
Figure pat00036
Figure pat00037
뮤린 mIL-1α/b DVD-Ig 결합 단백질은 뮤린 IL-1α(mIL-1α) 및 뮤린 IL-1β (mIL-1β) 둘 다에 대해 친화성/시험관내 효력을 보유하였다. 표 18은 mAbs 9H10(항-mIL-1α), 10G11(항-mIL-1β), 및 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 특성확인을 나타낸다.
Figure pat00038
실시예 3.2. 류마티스 관절염 모델에서 mIL -1α/β DVD - Ig 결합 단백질의 생체내 활성
항-IL-1α, 항-IL-1β, 결합된 항-IL-1α/항-IL-1β, 및 뮤린 IL-1α/β DVD4-Ig의 치료학적 효과를 당해 분야에 잘 공지된 콜라겐-유도된 관절염 마우스 모델에서 평가하였다. 요약하면, 수컷 DBA-1 마우스를 꼬리의 기저에서 CFA중 소 제II형 콜라겐으로 면역화시켰다. 마우스를 21일째에 자이모산으로 복강내(i.p) 부스팅하였다. 24 내지 27일째에 질환이 발병한 후, 마우스를 선택하여 각각 10마리의 마우스의 별도의 그룹으로 나누었다. 대조군 그룹, 및 항-사이토카인 그룹의 평균 관절염 점수는 치료 개시에서 비교가능하였다. IL-1을 중화시키기 위해, 마우스에게 매 격일로 1 내지 3mg/kg의 항-IL-1α mAb, 항-IL-1β mAb, 항-IL-1α와 항-IL-1β mAb의 조합물, 또는 뮤린 IL-1α/β DVD4-Ig를 복강내 주사하였다. 마우스를 말초 관절내 관절염의 가시적 출현에 대해 주당 3회 조심스럽게 시험하고, 질별 활성에 대해 점수를 매겼다.
치료학적 방식으로 IL-1의 차단은 관절염의 중증도를 효과적으로 감소시켰으며, 항-IL-1β는 항-IL-1α(10% 감소)보다 더 큰 효능(대조군 그룹과 비교하여 평균 관절염 점수에 있어서 24% 감소)을 나타내었다. 추가의 효과가 항-IL-1α와 항-IL-1β 사이에서 관찰되었으며, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb 둘 다로 처리한 마우스에서 평균 관절염 점수에 있어 40% 감소되었다. 놀랍게도, 동일한 투여량 수준에서, mDVD-Ig 결합 단백질의 치료는 평균 관절염 점수에 있어 47% 감소를 나타내었으며, 이는, mDVD-Ig 결합 단백질의 생체내 치료학적 효능을 입증한다. 유사한 효능이 또한 당해 동물 모델에서 관절 팽윤의 측정시 관찰되었다.
실시예 3.3. 골관절염 모델에서 뮤린 IL -1α/β DVD - Ig 결합 단백질의 생체내 활성
상기 연구는, IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 항-마우스 IL-1α 및 IL-1β 항체 및 또한 뮤린 항-마우스 IL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질의 조합물을 사용한 차단이 류마티스 관절염에 대한 마우스 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델에서 당일 항체 단독보다 유의적으로 보다 효율적이었음을 나타내었다[참조: 또한 Wu et al., Nature Biotech., 25(11): 12901297 (2007)]. 골관절염(OA)에서 항-IL-1 치료요법의 효능을 또한 OA의 2개의 동물 모델, 즉, 마우스에서 관절 불안정성 모델("JIM") 및 내측 반월상연골 탈안정화("DMM") 모델을 사용하여 연구하였다.
실시예 3.3.1. 마우스에서 골관절염의 관절 불안정성 모델( JIM )에서 마우스 항- 뮤린 IL -1α 및 항- 뮤린 IL -1β 모노클로날 항체의 생체내 활성
실시예 3.3.1.A. 연구 설계
마우스에서 골관절염의 관절 불안정 모델(JIM)에 있어서 mIL-1α/β DVD-Ig 분자의 생체내 활성의 연구 설계를 표 19에 나타낸다. 모든 그룹은, 약 30 그람(BW = 30 g)으로 칭량되는 25마리의 마우스(n = 25)를 포함하였다. 연구를 21일 후에 종결하였다. 우리(cage) 당 5마리씩 가둔 2개월 반 연령의 수컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mouse)(25마리/그룹/시점)를 이소플루란 마취로 마취시켰다. 전방 십자인대(ACL) 외상을 OA 병변을 유도시키기 위한 시도로 0일째에 우측 및 좌측 무릎에 투여하였다. IL-1 억제성 항체 IL-1α (9H10) 및 IL-1β (10G11)를 단독으로 및 함께 사용한 복강내(ip) 치료를 ACL 외상일에 개시하여 20일 동안 매 4일마다(q4d) 지속하였다. 비-처리 대조군에 대한 비히클은 PBS이었다. 우측 및 좌측 무릎을 21일째에 수거하고, 조직병리학적 변경을 기록하고 특성확인하였다. 데이터를 성공적인 불안정성 유도를 나타내는 증식성 반응을 갖는 관절 만을 사용하여 분석하였다. 증식성 반응/불안정성을 0 내지 3으로 기록하고, 단지 불안정한 관절(1, 2, 또는 3의 점수)를 최종 분석에서 사용하였다. 내부 및 측부 대퇴부 및 정강 연골 퇴화를 0 내지 5의 규모로 연골 퇴화의 중증도에 대해 기록하였다. 마지막 항체 투여후 4일째에, 혈액을 각각의 그룹으로부터의 모든 동물로부터 혈청 수거를 위해 수거하였다. 체중을 매주마다 기록하였다. 마지막 날에, 동물(그룹 1, 2, 3, 4에서 10마리 동물)에게 자이모산 A를 투여하고 혈액을 IL-6(IL-1/TNF 의존성)의 혈청 분석을 위해 4시간 후에(종결시) 수거하였다. 동물을 21일째에 사멸시키고 우측 및 좌측 무릎 관절을 포르말린내로 수집하였다.
Figure pat00039
실시예 3.3.1.B. 조직 제조 및 분석
조직 제조: 석회질제거 고정액(Surgipath Decalifier, 제조원: 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 Surgipath Medical Ind., Inc.)에서 2 내지 3일 후에, 무릎 관절 둘 다에서 관련없는 조직을 잘라내고, 정면 평면(frontal plane)에 봉매(embedding)시키고 단면화하였다. 하나의 단편을 각각의 동물(2개 관절/블록)로부터 정면 평면의 대략 중간 지점에서 취하였다. 모든 단면은 8μm 이었으며 톨루이딘 블루(Toluidine blue)로 염색하였다. 슬라이드를 그룹 지정을 연구하기 위해 맹검처리된(blinded) 면허가 있는 수의과 병리학자가 시험하였다. 통계적 분석을 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 수행하였고, 95% 신뢰 수준을 사용하여 모든 처리 그룹을 대조군 그룹과 비교하는 2-테일드 t-시험(2-tailed t-test)을 포함하였다.
관절의 조직병리학적 점수매김: 내부 및 측면 대퇴부 및 정강 연골 퇴화를 다음 시스템을 사용하여 연골 퇴화의 중증도에 대해 기록하였다: 섬유성연축(fibrillation)과 함께 연골세포 및 프로테오글리칸 손실의 깊이/정도:
1 = 깊이없는(피상적) 손상, 구역 표면(zone surface)의 50% 이상에 걸쳐 콜라겐의 접선 층(tangential layer)의 부재 또는 구역내 중심 또는 확산 분포에 있어서 프로테오글리칸 및/또는 연골세포의 10% 이하의 손실
2 = 매트릭스 손실이 구역의 50% 이상 부위의 상부 1/4 또는 구역내 중심 또는 확산 분포에 있어서 프로테오글리칸 및/또는 연골세포의 25%까지의 손실로 연장됨
3 = 매트릭스 손실이 구역의 50% 이상에 걸쳐 연골 두께의 1/2을 통해 또는 구역내 중심 또는 확산 분포에 있어서 프로테오글리칸 및/또는 연골세포의 50% 까지의 손실로 연장됨.
4 = 매트릭스 손실이 구역의 50% 이상에 걸쳐 연골 두께의 3/4을 통해 또는 구역내 중심 또는 확산 분포에 있어서 프로테오글리칸 및/또는 연골세포의 75% 까지의 손실로 연장됨.
5 = 매트릭스 손실이 구역의 50% 이상에 걸쳐 전체 연골 두께를 통해 또는 구역내 중심 또는 확산 분포에 있어서 프로테오글리칸 및/또는 연골세포의 100%까지의 손실로 연장됨.
점수는 병변의 지역(내부, 중간 및 외부) 분포에 대한 기여와 함께 지정하였고, 각각 3번째에 대한 점수(0 내지 5)를 관절의 각각의 부위에 대해 합한 후 전체 관절에 대해 합하였다.
골증식체(평가하에서 정강 또는 대퇴부 표면상에서 최대)를 디지탈 소프트웨어(digital software)(NIS-Elements version 3.0)를 사용하여 측정하였다.
골증식체 평가 = 크기에 따라 소, 중간 또는 대에 대해 1, 2, 또는 3.
소 골증식체 = 1 (150 μm 이하)
중간 골증식체 = 2 (151 내지 300 μm)
대 골증식체 = 3 (>301 μm)
윤활액 반응을 염증 유형과 관련하여 기술하고 특성확인하였으며 존재할 경우 정도는 점수에 포함시키지 않았다.
각각의 동물에 대한 각종 매개변수 각각에 대한 평균 ± SE를 측정하고 합하여 총 관절 점수에 도달하였다.
불안정성 유도의 조직학적 증거를 가진 관절을 내부 윤활막 및 측면 인대에서 증식성 변화의 존재로 확인하였다. 또한, 불안정성 점수를 다음 기준에 따라 각각의 관절에 대해 기록하였다.
0 = 불안정성 없음
1 = 약한 불안정성(인대 및 경계 구역에서 최소 내지 약한 증식성 변화)
2 = 중간의 불안정성(인대 및 경계 구역에서 중간의 증식성 변화)
3 = 심각한 불안정성(인대 및 경계 구역에서 심각한 증식성 변화).
결과: 점수가 1, 2, 또는 3(또는 2, 3)인 불안정한 관절만을 최종 데이터 분석에 사용하였다. 데이터는 영향받은 동물을 기준으로하기 보다는 정체 영향받은 관절을 기준으로 궁극적으로 분석하였다. 당해 연구의 결과는, 항-IL-1α 또는 IL-1β 모노클로날 항체로 처리한 동물의 관절이 비히클-처리한 대조군 관절에서 관찰된 것과 유사한 연골 퇴화를 나타내었음을 나타내었다. 그러나, 마우스 항-마우스 IL-1αmAb(9H10) 및 마우스 항-마우스 IL-1βmAb(10G11) 둘 다를 사용한 조합 치료요법은 내부 정강 연골 퇴화 점수를 유의적으로 감소시켰다. 도 2는 각종 처리 그룹에서 동물의 관절내 연골 퇴화 점수의 막대 그래프를 나타낸다.
실시예 3.3.2. 마우스에서 골관절염의 관절 불안정성 모델( JIM )에서 mIL -1α/β DVD - Ig 결합 단백질의 생체내 활성
상기 실시예 3.3.1에 기술된 바와 같은 골관절염에 대한 관절 불안정성 모델을 또한 사용하여 마우스 항-mIL-1α 모노클로날 항체 (9H10) 및 마우스 항-mIL-1β 모노클로날 항체 (10G11)의 조합에 의해 제공된 바와 같은 항-IL-1 치료요법의 효능을 2개의 모노클로날 항체로부터 생성된 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질에 의해 제공된 것과 비교하였다.
실시예 3.3.2.A. 연구 설계
당해 연구의 설계는 실시예 3.3.1에서 상기 기술된 것과 유사하였다. 우리 당 5마리씩 가둔 2개월 반 연령의, 수컷 스위스 웹스터 마우스(25마리/그룹/시점)를 이소플루란 마취로 마취시키고 우측 및 좌측 무릎 부위를 클립(clip)시키고 0일째에 십자 인대에 대한 관절내 외상을 제조하였다. 투여(0일째 개시, ip)를 21일째에 종결된 동물(그룹 2의 경우)을 사용하여 매 4일마다 1회 수행하였다. 투여(0일째 개시, ip)는 21일째에 종결된 동물(그룹 1, 3 및 4의 경우)을 사용하여 주당 3회 수행하였다. 마지막 항체 투여 후 4일째에, 각각의 동물로부터의 모든 동물을 혈청 수거를 위해 채혈하였다. 체중을 매주 기록하였다. 최종 일에, 동물(그룹 1, 2, 3, 4에서 10마리 동물)에게 자이모산 A를 투여하고 4시간 후(종결시) IL-6(IL-1/TNF 의존성)의 혈청 분석을 위해 채혈하였다. 동물을 21일째에 안락사시키고 우측 및 좌측 무릎 관절을 포르말린내로 수집하였다. 하기 연구 설계 표를 참조한다.
Figure pat00040
실시예 3.3.2.B. 조직 제조 및 분석
각종 처리 그룹에서 동물의 관절로부터의 관절 연골의 조직 제조 및 조직학적 점수매김을 실시예 3.3.1에서 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과: 당해 결과는, mILα/β 10G11-9H10 DVD-Ig 결합 단백질을 사용한 마우스의 처리가 모 mAb 9H10 및 10G11의 조합물과 비교가능한 효능으로 골관절염(P < 0.05 대 비히클)의 진행을 유의적으로 억제하였음을 나타내었다. 도 3은 각종 처리 그룹에서 동물의 관절내 연골 퇴화 점수의 막대 그래프를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 6 또는 12mg/kg의 DVD-Ig 결합 단백질을 사용한 처리의 결과는 골관절염성 병변을 예방하는 측면에서 이들의 효능에 있어 유사하였다(3mg/kg의 DVD-Ig 결합 단백질을 사용한 처리는 연골 퇴행에 영향을 미치지 않았으며 결과는 비히클 처리된 관절과 유사하였다. 참조: 하기 실시예 3.3.3). 당해 연구의 결과는, 항-IL-1α 및 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합물 또는 IL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질을 사용한 처리가 골관절염의 마우스 모델에서 조직병리학적 매개변수에 있어서의 유의적인 유리한 효과를 가졌음을 나타내었다.
실시예 3.3.3. 항- IL -1β 모노클로날 항체 및 다른 결합 단백질을 사용한 처리와 비교하기 위한 골관절염의 관절 불안정성 모델에 있어서 후속 연구
후속 연구는, 다른 처리와 비교하여 항-IL-1β 모노클로날 항체 만으로 처리한 동물에서 내부 정강 연골 퇴행에 있어서의 임의의 유의적인 효과가 존재하는지의 여부를 보다 근접하게 측정하기 위해 골관절염의 관절 불안정성 모델을 사용하여 수행하였다. 항-IL-1β 모노클로날 항체를 사용한 처리의 효과는 연구 21일째에 평가하였다.
실시예 3.3.3.A. 연구 설계
당해 연구의 설계는 실시예 3.3.1에 상기 기술된 것과 유사하였다.
Figure pat00041
실시예 3.3.3.B. 조직 제조 및 분석 Tissue Preparation 및 Analysis
각종 처리 그룹에서 동물의 관절로부터의 관절 연골의 조직 제조 및 조직학적 점수매김은 실시예 3.3.1에서 상기 기술된 바와 같이 수행하였다.
결과: 도 4에 나타낸 바와 같이, 결과는 앞서의 연구들의 결과를 입증하였으며, 즉, 유사한 양성 처리 효과가 항-IL-1α 및 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합을 사용하여 주목되었으며, 항-IL-1β 모노클로날 항체 단독으로의 처리는 시험한 어떠한 투여량에서도 연골 퇴화를 방지하는데 효과적이지 않았다.
실시예 3.3.4. 관절 불안정성 모델 연구에서 자이모산 -유도된 인터류킨 -6 (IL-6) 생산
항-IL-1α 및 항-IL-1β 모노클로날 항체 및 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질이 기능적이고 생체내에서 IL-1α 및 IL-1β를 중화시킬 수 있는지를 측정하기 위한 약력학적 판독으로서, 인터류킨 6(IL-6)의 자이모산-유도된(IL-1α 및 IL-1β 의존성) 생산을 OA의 관절 불안정성 모델 연구에서 측정하였다.
요약하면, 모델에서 21일째에, 자이모산을 PBS 비히클 중에 현탁시키고 30분 동안 비등하는 물 중에 둔 후, 사용 전에 냉각되도록 하였다 이후에, 마우스에게 0.5ml의 PBS 중 현탁액(주사 전에 잘 혼합함)으로서 50mg/kg의 자이모산을 ip 주사하였다. 이후에, 마우스를 자이모산 주사 후 4시간 동안 방혈시켰다. 혈청을 IL-6 측정을 위해 수집하였다.
결과: 도 5에 나타낸 바와 같이, 항-IL-1α 모노클로날 항체 (6mg/kg) 및 항-IL-1β 모노클로날 항체 (6mg/kg)의 조합 및 또한 mIL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질 (6mg/kg 또는 12mg/kg에서)은 비히클-처리된 대조군 동물과 비교하여 자이모산-유도된 IL-6 생산을 유의적으로 중화시켰다. 따라서, 항체는 생체내에서 기능적 활성을 나타내었다.
실시예 3.3.5. SV129 마우스에서 내측 반월상연골 탈안정화(DMM)에 의해 유도된 골관절염에 있어서의 사이토카인 억제성 항체 처리의 효과
대안적인 동물 모델을 사용하여 골관절염에서 연골 퇴화의 느린 진행에 있어서 항-IL-1α 및 항-IL-1β 활성의 효과를 연구하였다. 골관절염에 대한 내측 반월상연골 탈안정화(DMM) 모델의 마우스는 JIM 과정(상기 참조)보다 침습성 및 염증이 거의 없었으며 내측 경골 고평부 및 내측 대퇴골과의 중심 체중 지지 영역(weight-bearing region)에서 주로 병변을 초래한다. DMM 후 병변의 중증도 및 위치는 JIM과 비교하는 경우 보다 더 일치하였다.
실시예 3.3.5.A. 연구 설계
우리당 5마리씩 가둔 대략 30 그람의 수컷 SV129 마우스를 0일째에 케타민/크실라진 콕테일(cocktail)로 마취시키고, 복강내(ip) 투여한 후, 내측 측부 인대를 무딘 박리(blunt dissection)로 노출시키고, 가로절단하여 대퇴부를 향해 반월판을 반영시켰다. 관절 공간을 8-0 비크릴 봉합선으로 닫았다. 피부를 상처 접착제(wound glue)로 닫았다. 허위 수술(sham surgery)을 위해, 수직 피부 절개를 무릎의 내측 양상에 걸쳐 수행하고 관절낭을 개방하였다. 관절낭을 8-0 비크릴 봉합선으로 닫고 피부를 상처 접착제로 닫았다. 이후에, 동물의 그룹에 하기 연구 계획 표에 따라 항체 또는 비히클의 복강내(ip) 주사로 처리하였다. 2개의 성별-매치되고, 연령-매치되며, 스트레인-매치된 나이브 마우스(naive mouse)를 또한 연구에 포함시켰다. 동물을 처리 8주 후 마취시키고, 무릎 관절을 10% 중성 완충된 포르말린으로 수거하였다.
Figure pat00042
실시예 3.3.5.B. 조직의 시험
포르말린-고정된 샘플을 석회질을 제거하고, 표본(specimen)을 정면 평면에서 각각 15단계 절개로 절개하였다. 각각의 단면은, 두께가 대략 6μm이었고, 단계 절개는 70μm로 분리하였다. 모든 슬라이드를 톨루이딘 블루[티. 블루(T. Blue)]로 염색하였다. 슬라이드를 챔버스 방법(Chambers method([참조: Chambers et al. (2001)]에 따라 연골 퇴행(하기 참조)에 대해 면허가 있는 수의과 병리학자가 평가하였다. 4개의 연골 표면, 내측 대퇴골과(MFC), 내측 경골 고평부(MTP), 측면 대퇴골과(LFC), 및 측면 경골 고평부(LTP)를 하기 표의 규모에 따라 0 내지 6으로 점수를 매겼다.
Figure pat00043
통계적 분석을 만-휘트니(Mann-Whitney) U 시험을 사용하여 그래프파드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software) 버젼 4.03으로 수행하였다.
실시예 3.3.5.C. 결과
도 6에 나타낸 바와 같이, 항-마우스 IL-1α 모노클로날 항체 (9H10, 6mg/kg) 및 항-마우스 IL-1β 모노클로날 항체 (10G11, 6mg/kg) 둘 다 또는 IL-1α/βDVD-Ig 결합 단백질 (6mg/kg) 둘 다를 사용한 조합 치료요법은 골관절염의 마우스 DMM 모델에서 연골 퇴화를 유의적으로 감소시켰다.
실시예 3.3.6. 골관절염에 대한 내측 반월상연골 탈안정화(DMM)에 있어서 마우스에서 항- IL -1α 및 항- IL -1β 활성의 적정(8주 연구)
8주 연구를 골관절염의 DMM 모델에서 항-mIL-1α 모노클로날 항체(9H10 mAb) 및 항-mIL-1β 모노클로날 항체(10G11 mAb) 단독 또는 조합의, 및 mIL-1α/β10G11-9H10 DVD-Ig 결합 단백질의 각종 투여량에 대한 반응시 연골 퇴화에 있어서의 효과에 대해 수행하였다.
실시예 3.3.6.A. 연구 설계
체중이 대략 30그람인, 우리당 5마리씩 가둔 수컷 SV129 마우스를 0일째에 케타민/크실라진 콕테일로 마취시키고, 복강내(ip) 투여한 후, 내측 측부 인대를 무딘 박리로 노출시키고, 가로절단하여 대퇴부를 향한 반월판을 반영시켰다. 관절 공간을 8-0 비크릴 봉합선으로 닫았다. 피부를 상처 접착제로 닫았다. 허위 수술을 위해, 수직 피부 절개를 무릎의 내측 양상에 걸쳐 수행하고 관절낭을 개방하였다. 관절낭을 8-0 비크릴 봉합으로 닫고, 피부를 상처 접착제로 닫았다. 이후에 동물의 그룹에 하기 연구 계획 표에 따라 항-mIL-1α 모노클로날 항체, 항-mIL-1β(단독 또는 조합), mIL-1α/βDVD-Ig 결합 단백질, 또는 비히클을 복강내(ip) 주사로 처리하였다. 동물을 처리 8주 후 마취시키고, 무릎 관절을 10% 중성 완충된 포르말린으로 수거하였다.
Figure pat00044
상기 표의 컬럼 3에서 괄호 안의 수(동물의 수)는 데이터 세트에 포함된 동물의 실제 수이다. 예외의 간단한 설명은 다음과 같다;
그룹 B: 9마리의 동물이 그룹 B에 포함되었다. 1마리의 동물이 데이터 세트로부터 제외시켰는데, 그 이유는, 조직학적 실험에서 내측 반월이 완벽한 것으로 나타났고 골관절염성 변화가 거의 없었기 때문이었다.
그룹 C: 단지 5마리의 동물만이 그룹 C에 포함되었다. 5마리의 동물이 데이터 세트로부터 제외되었는데, 그 이유는, 조직학적 실험에서 내측 반월이 대부분 완벽한 것으로 나타났고 골관절염성 변화가 거의 없기 때문이었다.
그룹 D: 단지 8마리의 동물만이 그룹 D에 포함되었다. 1마리의 동물에 대한 슬라이드는 존재하지 않았다. 다른 동물은 데이터 세트로부터 제외시켰는데, 그 이유는, 조직학적 실험에서 내측 반월이 대부분 완벽한 것으로 나타났고 골관절염성 변화가 거의 없었기 때문이다.
그룹 E: 단지 8마리의 동물만이 그룹 E에 포함되었다. 2마리 동물은 열외 동물로 고려되었기 때문에 제외되었다.
그룹 F: 단지 9마리의 동물만이 그룹 F에 포함되었다. 1마리 동물이 데이터 세트로부터 제외되었는데, 그 이유는, 조직학적 실험에서 내측 반월이 완벽한 것으로 여겨지고 필수적으로 골관절염성 변화가 없었기 때문이다.
실시예 3.3.6.B. 조직 제조 및 실험
조직을 실시예 3.3.5에서 상기 기술한 바와 같이 제조하고 점수를 매겼다.
실시예 3.3.6.C. 결과
결과는 도 7에 나타낸다. 골관절염(상기)에 대한 관절 불안정성 모델(JIM)에서 수득된 결과와 유사하게, 항-IL-1α 모노클로날 항체(9H10) 또는 항-IL-1β 모노클로날 항체(10G11) 단독을 사용한 처리는 비히클 대조군 관절에서 관측된 것과 통계적으로 유의적이지 않은 연골 퇴화에 있어서의 감소를 초래하였다. 그러나, 모노클로날 항체 둘 다 또는 IL-1α/βDVD-Ig 결합 단백질(1.5mg/kg에서 IL-1α/βDVD의 경우 제외)을 사용한 조합 치료요법은 평균 합계 챔버 점수(mean sum Chambers score)(전체 연골 퇴행을 나타냄) 및 평균 최대 챔버 점수(관절내 대부분 영향받은 부위)를 유의적으로 감소시켰다. 통계적으로 유의적인 투여량 효과는 mIL-1α/βDVD-Ig 처리 그룹에서 평균 합계 챔버 점수에 대해 관측되었다. 따라서, 당해 연구에서, 항-mIL-1α 모노클로날 항체 및 항-mIL-1β모노클로날 항체(각각 6mg/kg) 둘 다 및 mIL-1α/βDVD-Ig 결합 단백질(3 및 6mg/kg)을 사용한 8주 처리는 골관절염의 DMM 모델에서 유도된 연골 퇴화의 진행을 완화시켰다.
실시예 3.3.7. 골관절염의 내측 반월상연골 탈안정화 ( DMM ) 모델에 있어서 동물에서 연골 퇴행에 대한 항- IL -1α 및 항- IL -1β 활성의 및 소 분자 처리의 효과
독시사이클린은 골관절염의 DMM 모델(참조: Effects of Disease-modifying Osteoarthritis Drugs in an in - vivo Animal Model 1Silva et al., Univ. Mass. Med. School, Worcester, MA, USA, Trans ORS 2009-need full citation) 및 또한 사람 임상 시험[참조: Brandt et al. (2005) Arthrit. Rheum. 52(7):2015-2025]에서 연골 퇴행을 예방하는 것으로 알려져 있다. 당해 연구에서, DMM 모델에서 동물을 독시사이클린으로 처리하는 효과를 항-IL-1α 및 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합을 사용하여 동물을 처리한 효과와 비교하였다.
실시예 3.3.7.A. 연구 설계
체중이 대략 30 그람인 수컷 SV129 마우스는 무딘 박리에 의해 노출된 내측 측부 인대를 가졌으며, 가로절단하여 대퇴부를 향한 반월판을 반영시켰다. 관절 공간을 8-0 비크릴 봉합선으로 닫았다. 피부를 상처 접착제로 닫았다. 허위 수술을 위해, 수직 피부 절개를 무릎의 내측 양상에 걸쳐 수행하고 관절낭을 개방하였다. 관절낭을 8-0 비크릴 봉합선으로 닫고, 피부를 상처 접착제로 닫았다. 이후에, 동물의 그룹에 하기 연구 계획 표에 따라 비히클 또는 처리의 os(경구)로 또는 복강내(ip) 주사로 처리하였다. 3개의 성별-매치되고, 연령-매치되며, 스트레인-매치된 나이브 마우스를 또한 연구에 포함시켰다. 동물을 처리 4주 후 마취시키고, 무릎 관절을 10% 중성 완충된 포르말린으로 수거하였다.
Figure pat00045
실시예 3.3.7.B. 조직 제조 및 실험
조직을 실시예 3.3.5에서 상기 기술한 바와 같이 제조하고 점수를 매겼다.
실시예 3.3.7.C. 결과
당해 결과는 도 8에 나타낸다. 연구의 조건하에서, 180㎍/마우스 각각으로 투여한, 항-IL-1α 및 항-IL-1β모노클로날 항체의 조합을 사용한 4주 치료는, 수컷 SV129 마우스에서 내측 반월상연골 탈안정화에 의해 유도된 골관절염 변화의 유의적인 완화를 초래하였다. 평균 합계 챔버 점수 및 평균 최대 챔버 점수가 유의적으로 감소되었으며, 평균 총 합계된 챔버 점수는 비히클 대조군 그룹에 대해 비교시 이러한 조합 치료에 의해 주목할만큼 감소되었다. 30mg/kg에서의 독시사이클린 처리는 또한 유사한 처리 효과를 초래하였지만, 항체 조합 치료요법이 보다 더 효과적이었다.
실시예 4. 항- IL -1α/β 치료요법의 통증 효능
DMM 마우스는 또한 마우스에서 측정가능한 통증을 생성한다. 최근에, 말파이트(Malfait) 등의 문헌[참조: Malfait et al. (2010) Osteoarthritis Cartilage, 18: 572-580]은 DMM 처리 후 그러나 허위 수술을 하지 않은 뒷발에서 발 움추림 역치(통증의 기계적인 이질통증 지표)에서 큰 감소를 나타내었다. 항-IL-1α/β 치료요법의 효능을 DMM 동물 모델에서 연구하였다. 당해 일련의 연구에서 나타낸 바와 같이, DMM 수술로 처리한 마우스는 수술 후 7일째 정도 일찍 이질통증성이었으며 35일째까지 발 움추림 역치에 있어서 감소를 나타내었다.
통증을 완화시키기 위한 항-IL-1 치료요법의 잠재력을 기계적 이질통증의 측면에서 OA의 DMM 마우스 모델에서 시험하였다. IL-1α 및 IL-1β mAb의 조합의 투여는 수술 당일에 개시하여 5주 동안 주당 2회 반복하였다. 동물을 PBS 비히클 단독으로, IgG 이소형 대조군으로, 또는 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb의 조합(각각의 mAb에 대해 6mg/kg의 투여량으로)으로 처리하였다. 동물을 발 움추림 역치에 대해 매주 시험하였다. 반대측(비-수술) 사지와 비교하거나 허위 수술을 수행한 동물과 비교하여 PBS 또는 IgG 이소형 대조군을 사용하여 처리한 그룹의 동측(수술) 사지는 이질통증성(고통스러운)이었다. 도 9를 참조한다. 대조적으로, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb의 조합으로 처리한 그룹은 5주(35일)째에 PBS 비히클 또는 IgG 이소형 처리된 그룹과 비교하여 이질통증(통증)의 발달에 있어 감소를 나타내는 유의적으로 보다 더 높은 발 움추림 역치를 입증하였다. 통증에 있어서 이러한 감소는 처리 후 1주째 정도로 조기에 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
확립된 통증에서 IL-1 치료요법의 효과를 평가하기 위하여, OA 및 기계적인 이질통증이 확립된 IgG 대조군내 동물을 35일째에 항-IL-1α 및 항-IL-1β모노클로날 항체의 조합으로 처리하고 발 움추림 역치를 24시간 후(36일째) 시험하였다. 데이터는, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb를 사용한 조합 치료요법이 질환이 확립된 동물에서 이질통증을 역전시켰음(OA 통증을 감소시켰음)을 입증하였다. 이들 데이터는, 항-IL-1 치료요법이 잠재적인 질환 개질 효과와는 독립적인 진통 효과를 제공함을 나타낸다. 도 11을 참조한다.
실시예 5. 항- IL -1α/β 조합 치료요법의 통증 효능의 추가의 연구
기계적 이질통증의 측면에서 OA의 DMM 마우스 모델에 있어 통증을 완화시키기 위한 항-IL-1 치료요법의 잠재력(상기 참조)을 추가로 평가하였다. IL-1α 및 IL-1β mAb의 조합의 투여는 수술 당일 개시하였으며 4주 동안 주당 2회 반복하였다. DMM 동물을 PBS 비히클 단독으로, 항-IL-1α mAb(6mg/kg)로, 항-IL-1β mAb(6mg/kg)로, 또는 항-IL-1α mAb(6mg/kg) 및 항-IL-1β mAb(6mg/kg)의 조합으로 4주 동안 주당 2회 복강내(ip) 투여하여 처리하였다. 동물을 28일째에 이질통증에 대해 시험하였다. 비히클로 처리한 그룹의 동측(수술) 사지는 반대측 측면(비-수술) 사지와 비교하거나 허위 수술한 동물과 비교하여 이질통증성(고통스러운)이었다. 도 12를 참조한다. 유사하게, 항-IL-1α 또는 항-IL-1β mAb 단독으로 처리한 그룹은 이질통증성(고통스러운)이었다. 대조적으로, 항-IL-1α 및 항-IL-1βmAb의 조합으로 처리한 그룹은 유의적으로 보다 높은 통증 제거 역치를 입증하였으며, 이는 비히클 처리된 그룹과 비교하여 이질통증(통증)의 발달에 있어서의 감소를 나타낸다(도 12).
실시예 6. 항- IL -1α/β 조합 치료요법의 투여량 의존적 통증 효능
항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb의 조합의 투여를 수술이 동물에게 수행된 날에 DMM 마우스 모델에서 개시하고 4주 동안 주당 2회 반복하였다. 동물에서 PBS 비히클 단독으로 또는 항-IL-1α mAb 및 항-IL-1β mAb의 조합으로 처리하였으며, 둘 다 4주 동안 매 4일마다 1mg/kg, 3mg/kg, 또는 6mg/kg에서 복강내(ip) 투여하였다. 동물을 28일째에 발 움추림 역치에 대해 시험하였다. 비히클로 처리한 그룹의 동측(수술) 사지는 반대측(비-수술) 사지와 비교하거나 허위 수술한 동물과 비교하여 이질통증(통증)을 나타내는 발 움추림 역치에 있어서 유의적인 감소를 나타내었다(도 13). 대조적으로, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb의 조합으로 처리한 그룹은 비히클 처리된 그룹과 비교하여 이질통증(통증)의 발달에 있어서 감소를 나타내는 발 움추림 역치에서 투여량-의존적인 증가를 입증하였다(도 13).
실시예 7. 확립된 통증에 있어서 항- IL -1α/β 조합 치료요법
확립된 통증에서 항-IL-1α/β 조합 치료요법의 효과를 평가하기 위하여, OA 및 기계적 이질통증이 확립된 DMM 마우스 모델에서 동물을 27일째에 항-IL-1α mAb 및 항-IL-1β mAb의 조합으로, 둘 다 1　mg/kg, 3mg/kg, 또는 6mg/kg에서 28일째에 이질통증에 대해 시험하기 24시간 전에 복강내(ip) 투여하여 처리하였다. 결과는 도 14에 나타낸다. 데이터는, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb를 사용한 조합 치료요법이 투여량-관련된 방식으로 확립된 질환을 지닌 동물에서 기계적 이질통증(감소된 OA 통증)을 역전시켰음을 입증하였다(도 14).
실시예 8. 항- IL -1α/β 조합 치료요법의 통각과민증억제 효과( anti -hyperalgesic effect)
IL-1α 및 IL-1β의 중화가 염증성 통증 상태에서 통각억제 효과를 생성하는지를 평가하기 위해, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb를 통각성 통증의 마우스 카라기난 발 모델에서 확립된 통증을 역전시키는 능력에 대해 평가하였다.
항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb의 효능은, 마우스 카라기난 모델에서 단독 또는 조합하여 투여시 평가하였다(도 15). 족부내 카라기난 주사 후 30시간째에: 900㎍의 항-IL-1α mAb, 항-IL-1β mAb, 또는 이들의 조합을 마우스의 상이한 그룹에서 투여하였다. 열 통각과민증 시험을 카라기난 투여 후 48 및 96 시간째에 수행하였다. 앞서의 연구에서 알 수 있는 바와 같이, 900㎍의 투여량 조합은 열 통각과민증을 유의적으로 약화시켰다(48시간째에 PBS 그룹에서 4.98 ± 0.34s와 비교하여 카라기난 발 8.11 ± 0.62s, p<0.01, 도 15a; 96시간째에 PBS 그룹에서 4.45 ± 0.55s와 비교하여 카라기난 발 7.62 ± 0.45s, p<0.01, 도 15b). 900㎍의 조합 그룹에서 통각억제 효과는 48시간째에 53 ±7%이었고, 96시간째에 82 ± 11%이었다. 디클로페낙(비-스테로이드성, 소염 진통제) 양성 대조군은 다시 열 통각과민증의 유의적인 약화를 나타내었다(시점 둘 다에서 p<0.01). 대조적으로, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb를 단독으로 투여하는 경우 시점 둘 다에서 유의적인 통각억제 효과는 관찰되지 않았으며, 이는, IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 동시 중화가 마우스 카라기난 염증성 통증 모델에서 통각억제 효능에 요구됨을 나타낸다.
실시예 9. 항- IL -1α/β 조합 치료요법의 투여량-의존성 통각과민증 억제 효과
도 16에 나타낸 바와 같이, 마우스(암컷 BALB/c)에서 족부내 카라기난 주사는 복사열 자극에 대한 발 움추림 잠복기에 있어서의 감소로 입증되는 바와 같이 장기간 지속되는 열 통각과민증을 생성한다(카라기난 주사 후 48 및 96시간째에 수행된 시험; 둘 다의 시점에서 대조군 손상되지 않은 발 대 PBS 비히클 그룹에서 카라기난 발에 대한 p<0.01). 상이한 그룹의 동물을 비히클 또는 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb(100, 300, 또는 900㎍/각 mAb의 마우스)로 카라기난 주사 후 30시간째에 처리하였다. 투여량-관련된 효과가 관찰되었으며, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb의 900㎍ 투여량의 조합이 열 통각과민증을 유의적으로 약화시켰다(48시간째에 900㎍ 그룹에서 7.88 ± 0.93s와 비교하여 PBS에서 카라기난 발 3.23 ± 0.34s, p<0.01, 도 16a; 96시간째에 900㎍ 그룹에서 7.62 ± 0.45s와 비교하여 PBS에서 카라기난 발 4.45 ± 0.55s, p<0.01, 도 16b). 900㎍ 처리 그룹에서 통각억제 효과는 48시간째에 70 ±9%이었고, 96시간째에 62 ±4%이었다. 디클로페낙(30mg/kg), 비-스테로이드성, 소염 진통제를 연구에서 양성 대조군으로 포함시켰으며, 이는 손상된 발의 평균 발 움추림 잠복기를 48시간째에 7.01 ±0.58s 및 96시간째에 7.48 ±0.34s로 증가시켰다(둘 다의 시점에서 p<0.01). IgG 대조군 및 저 투여량 100㎍의 mAb 그룹은 어느 시점에서도 열 통각과민증을 약화시키지 않았다. mAb 및 디클로페낙은 대조군의 손상되지 않은 발에서 발 움추림 잠복기를 유의적으로 변화시키지 않았다.
실시예 10. CFA 통증 모델에서 항- IL -1α/β 조합 치료요법의 효능
CFA[완전 프로인트 보조제(Complete Freund's Adjuvant)] 염증성 통증 모델을 사용하여, 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb 조합이 기계적 종점에 대해 효능을 생산할 수 있는지를 시험하였다. 따라서, 기계적 이질통증을 CFA로 족부내에 동물(암컷 BALB/c 마우스)에 주사한 후 48시간째에 당해 동물에서 폰 프라이 모노필라멘트(von Frey monofilament)를 사용하여 평가하였다. 도 17a에서 알 수 있는 바와 같이, 족부내 CFA는 PBS 비히클 단독으로 처리한 CFA 주사된 발에서 감소된 발 움추림 역치에 의해 입증된 바와 같이 큰 기계적 이질통증을 생성하였다(반대측 손상되지 않은 발에서 0.052 ±0.028g 대 0.860 ±0.090g, p<0.01). 별개의 동물 그룹을 IgG 이소형 대조군 또는 항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb(900mg/각각의 mAb의 마우스)를 CFA 주사 후 30시간째에 처리하였다. mAb 처리된 그룹은 기계적 이질통증의 유의적인 약화를 나타내었다(0.419 ±0.101 g, PBS 비히클에 대해 p<0.01, 도 17a). 효능의 크기(MPE %)는 65.51 ±12.35%이었다(도 17b). 소염성, 진통 양성 대조군 디클로페낙(30mg/kg, 1 시간 전처리) 또한 64.51 ±10.20%의 MPE%로 발 움추림 역치(0.359 ±0.088 g, PBS 비히클에 대해 p<0.01)를 증가시켜 기계적 이질통증을 약화시켰다.
실시예 11. 신경병성 통증에 있어서 항- IL -1α/β 조합 치료요법의 효능
항-IL-1α 및 항-IL-1β mAb 조합 치료요법이 신경병성 통증 상태에서 효능을 생산할 수 있는지를 마우스(수컷 CD1)에서 L5/L6 척수 라이게이션(SNL) 모델에서 실험하였다. 시험은 SNL 수술 후 6일째에 동물을 mAb 조합(900㎍/각각의 mAb의 마우스)으로 처리한 후 24 및 72시간째에 수행하였다. 기계적 이질통증이 폰 프라이 모노필라멘트 자극에 대한 감소된 발 움추림 역치(24시간 째에 대조측 발의 경우 0.073 ±0.032g 대 0.735 ±0.109g, 도 18a; 72시간째에 대조측 발에 대해 0.128 ±0.048g 대 0.732 ±0.132g, 도 18b; 둘 다의 시점에서 p<0.01)에 의해 입증된 바와 같이 SNL 수술 후에만 PBS 비히클로 처리한 마우스에서 관찰되었다. mAb 처리된 그룹은 둘 다의 시점에서 기계적 이질통증의 유의적인 약화를 나타내었다(0.477 ±0.131 g, 24시간째에 PBS 비히클에 대해 p<0.01, 도 18a; 0.527 ±0.111 g, 72시간째에 PBS 비히클에 대해 p<0.01, 도 18b). 효능의 크기(MPE %)는 24시간째에 72.20 ±14.39%이었고 72시간째에 80.62 ±12.33%이었다(도 19). 양성 대조군 가바펜틴(100mg/kg, 1시간 전처리)은 발 움추림 역치를 유의적으로 증가시킴으로써 기계적 이질통증을 약화시키는 데 있어 완전히 유효하였다(24시간째에 0.858 ±0.077g 및 72시간째에 1.138 ±0.096g, 둘 다의 시점에서 PBS 비히클에 대해 p<0.01). 대조적으로, IgG 대조군은 둘 다의 시점에서 기계적 이질통증에 있어 임의의 효과도 생성하지 않았다.
통증 치료 연구의 결론
본원에 기술된 통증 연구의 결과는, 본 발명에 따른 항-IL-1α/β 조합 치료요법이 임의의 형태의 통증에 대한 치료로서 효과적이며 골관절염과 관련된 통증에 대해서만 효과적이지 않음을 나타낸다. 이러한 항-IL-1α/β 조합 치료요법을 사용하여 통증 상태 이질통증, 통각과민증, 및 이질통증과 통각과민증의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 통증 병태로 고생하는 개체에서 통증을 치료하는데 사용할 수 있다. 항-IL-1α/β 조합 치료요법은 개체에게, 항-IL-1α 및 항-IL-1β 모노클로날 항체의 조합과 같은 IL-1α 및 IL-1β 결합 단백질의 조합(예를 들면, 혼합물, 동시 투여, 또는 연속 투여)을 투여함으로써, 또는 개체에게, IL-α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 이특이적 항체 또는 IL-1α/β DVD-Ig 결합 단백질과 같은 IL-α 및 IL-1β 둘 다에 결합하는 단백질을 투여함으로써 개체에게 제공할 수 있다.
참조 문헌의 도입
본원 전체에서 인용될 수 있는 모든 인용된 참조문헌(문헌 참조, 특허, 특허원, 및 웹사이트)의 내용은, 이에 인용된 참조문헌에서와 같이, 이들의 전체내용이 참조로 표현하여 본원에 도입된다. 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야에 익히 공지된, 약제 과학, 면역학, 분자생물학, 및 세포 생물학의 통상의 기술을 사용할 것이다.
등가물
본 발명은 이의 취지 또는 필수적인 특징에서 벗어나지 않고 다른 구체적인 형태를 구현할 수 있다. 따라서, 앞서의 실시형태들은 본원에 기술된 발명을 제한하는 것이라기 보다는 나열하는 모든 양상으로 고려되어야 한다. 따라서, 본 발명의 영역은 앞서의 설명보다는 첨부된 특허청구범위에 의해 나타나며, 특허청구범위의 등가물의 의미 및 범위내에 있는 모든 변화는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. <120> TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS AND PAIN <130> ABT-122.1 PCT (10918WOO1) <150> US 61/440,853 <151> 2011-02-08 <160> 151 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu Asn Gln 20 25 30 Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu Gly Cys Met 35 40 45 Asp Gln Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser Lys Thr Ser Lys 50 55 60 Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala Thr Asn Gly Lys Val 65 70 75 80 Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gln Ser Ile Thr Asp Asp Asp 85 90 95 Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg 100 105 110 Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser Asn Val Lys Tyr Asn Phe Met Arg 115 120 125 Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gln Ser Ile 130 135 140 Ile Arg Ala Asn Asp Gln Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu 145 150 155 160 Asp Glu Ala Val 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Val Ser Val Thr Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Gln Ser Pro Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 165 170 175 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Val Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 195 200 205 Gln Gln Tyr Thr Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Ile Lys Arg 225 <210> 135 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha/beta DVD-Ig tandem heavy chain variable domains <400> 135 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Leu Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Thr Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 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Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly 210 215 220 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 138 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha/beta DVD-Ig tandem light chain variable domains <400> 138 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 115 120 125 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 130 135 140 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 145 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Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 115 120 125 Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala 130 135 140 Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 165 170 175 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 180 185 190 Val Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 195 200 205 Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 210 215 220 Lys Arg Arg 225 <210> 141 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha/beta DVD-Ig tandem heavy chain variable domains <400> 141 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Thr Gly Thr 1 5 10 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Arg Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 225 230 235 240 Leu Thr Val Ser Ser 245 <210> 142 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1alpha/beta DVD-Ig tandem light chain variable domains <400> 142 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala 115 120 125 Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala 130 135 140 Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser 145 150 155 160 Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 165 170 175 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 180 185 190 Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 195 200 205 Trp Asn Ser Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met 210 215 220 Lys Arg Arg 225 <210> 143 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mIL-1alpha/beta DVD-Ig tandem heavy chain variable domains <400> 143 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr 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Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 145 150 155 160 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 165 170 175 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 180 185 190 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 195 200 205 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 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Ser Gly Ile Leu His Asn Tyr 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ser Ala Lys Ile Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 149 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable domain of 9H10 <400> 149 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn His Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 150 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 150 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 35 40 45 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 65 70 75 80 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 85 90 95 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(9) <223> Xaa can be any amino acid <400> 151 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (27)

  1. IL-1α에 결합하는 결합 단백질 및 IL-1β에 결합하는 결합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 골관절염을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1α 항체인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1β 항체인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1α 항체이고, 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1β 항체인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질 및 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 내에 제형화되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질 및 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이 결정화된 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질 및 상기 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질이, 성분(ingredient) 및 중합체성 담체를 포함하는 조성물 내에 제형화되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중합체성 담체가, 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리[(오가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 하이알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화된 폴리사카라이드, 이들의 블렌드(blend) 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택되는 중합체인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 성분이, 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 개체에게, 바람직한 특성을 제공하는 제2 제제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제2 제제가, 부데노사이드, 표피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF의, LT의, IL-2의, IL-6의, IL-7의, IL-8의, IL-12의, IL-13의, IL-15의, IL-16의, IL-18의, IL-23의, EMAP-II의, GM-CSF의, FGF의 및 PDGF의 항체, CD2의, CD3의, CD4의, CD8의, CD-19의, CD25의, CD28의, CD30의, CD40의, CD45의, CD69의, CD90의 또는 이들의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제(complement inhibitor), 아드레날린 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염성 사이토카인, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 및 TGFβ로 이루어진 그룹 중 하나 이상의 화합물인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에게 투여하는 단계가, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내(intraabdominal), 낭내(intracapsular), 연골내, 강내(intracavitary), 복내(intracelial), 소뇌내, 대뇌실내(intracerebroventricular), 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내(intraperitoneal), 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 협측(buccal), 설하, 비강내 및 경피로부터 선택된 하나 이상의 방식에 의한 것인, 방법.
  13. 개체에게,
    IL-1α에 결합하는 결합 단백질 및 IL-1β에 결합하는 결합 단백질(여기서, 상기 결합 단백질은 상기 개체에게 혼합물로, 동시에 또는 연속적으로 투여된다)을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 통증을 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 개체가, 이질통증, 통각과민증, 및 이질통증과 통각과민증의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 통증 병태를 앓고 있는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1α 항체인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1β 항체인, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1α 항체이고, 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이 항-IL-1β 항체인, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질 및 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 내에 제형화되는, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결합 단백질 및 상기 IL-1β에 결합하는 결합 단백질이 결정화된 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 IL-1α에 결합하는 결정화된 결합 단백질 및 상기 IL-1β에 결합하는 결정화된 결합 단백질이,
    임의로, 성분; 및
    중합체성 담체를 포함하는 조성물 내에 제형화되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 중합체성 담체가, 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(무수물), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논); 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화된 폴리사카라이드, 이들의 블렌드 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 성분이, 존재하는 경우, 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제13항에 있어서, 상기 개체에게, 바람직한 특성을 제공하는 제2 제제를 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제2 제제가, 부데노사이드, 표피 성장 인자, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진, 아미노살리실레이트, 6-머캅토퓨린, 아자티오프린, 메트로니다졸, 리폭시게나제 억제제, 메살라민, 올살라진, 발살라지드, 항산화제, 트롬복산 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-1β 모노클로날 항체, 항-IL-6 모노클로날 항체, 성장 인자, 엘라스타제 억제제, 피리디닐-이미다졸 화합물, TNF의, LT의, IL-2의, IL-6의, IL-7의, IL-8의, IL-12의, IL-13의, IL-15의, IL-16의, IL-18의, IL-23의, EMAP-II의, GM-CSF의, FGF의 및 PDGF의 항체, CD2의, CD3의, CD4의, CD8의, CD-19의, CD25의, CD28의, CD30의, CD40의, CD45의, CD69의, CD90의 또는 이들의 리간드의 항체, 메토트렉세이트, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 레플루노미드, NSAID, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 프레드니솔론, 포스포디에스테라제 억제제, 아데노신 작용제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린 제제, IRAK, NIK, IKK, p38, MAP 키나제 억제제, IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체, 가용성 p55 TNF 수용체, 가용성 p75 TNF 수용체, sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R, 소염성 사이토카인, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, 및 TGFβ로 이루어진 그룹 중 하나 이상의 화합물인, 방법.
  25. 제13항에 있어서, 상기 개체가, 골관절염, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절병증, 전신 홍반성 낭창, 크론 질환(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기 질환, 건선, 피부염, 피부 경화증, 이식편 대 숙주 질환, 기관 이식 거부, 기관 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 죽상 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키 질환(Kawasaki's disease), 그레이브스 질환(Grave's disease), 신 증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schoenlein purpurea), 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충 질환, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도병, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근 경색, 애디슨 질환(Addision's disease), 산발성 다분비선 결핍증 제I형, 다분비선 결핍증 제II형(슈미트 증후군(Schmidt's syndrome)), 성인 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청반응음성 관절병증, 관절병증, 라이터 질환(Reiter's disease), 건선성 관절병증, 궤양성 대장염 관절병증, 장병성 활막염, 클라미디아-관련 관절병증, 여시니아-관련 관절병증, 살모넬라-관련 관절병증, 척추관절병증, 죽상 질환/동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선형 IgA 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 쿰스(Coombs) 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 소아 악성 빈혈, 근육통성 뇌염/로얄 프리 질환(Royal free disease), 만성 피부점막 칸디다증, 거대 세포 동맥염, 원발성 경화 간염, 잠복성 자가면역 간염, 후천성 면역결핍 증후군, 후천성 면역결핍증 관련 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증 (공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장성 심근증, 여성 불임, 난소 부전, 조기 난소 부전, 섬유성 폐 질환, 잠복성 섬유화 폐포염, 염증-후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련 간질성 폐 질환, 혼합 결합 조직 질환 관련 폐 질환, 전신성 경화증 관련 간질성 폐 질환, 류마티스 관절염 관련된 간질성 폐 질환, 전신 홍반성 낭창 관련 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련된 폐 질환, 쇼그렌 질환(Sjoegren's disease) 관련 폐 질환, 강직성 척추염 관련 폐 질환, 혈관염 확산성 폐 질환, 혈철증 관련 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 기관지 폐색증, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역 간염, 제1형 자가면역 간염(전형적 자가면역 또는 루포이드(lupoid) 간염), 제2형 자가면역 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 가시세포증을 갖는 B형 인슐린 저항성, 부갑상선 기능 저하증, 기관 이식과 관련된 급성 면역 질환, 기관 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절염, 원발성 경화 담관염, 제1형 건선, 제2형 건선, 특발성 백혈구감소증, 자가면역 중성구감소증, 신장 질환 NOS, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 낭창, 남성 불임 특발성 또는 NOS, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿 패스튜어 증후군(Goodpasture's syndrome), 결절성 다발동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 발열, 류마티스성 척추염, 스틸 질환, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 타카야스 질환/동맥염, 자가면역 혈소판 감소증, 특발성 혈소판 감소증, 자가면역 갑상선 질환, 갑상선 기능 항진증, 갑상선종 자가면역 갑상선 기능 저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역성 갑상선 기능 저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알코올성 간경변, 알코올-유도된 간 손상, 담즙울혈, 특이체질성 간 질환, 약물-유도된 간염, 비-알코올성 지방간, 알레르기, 그룹 B 스트렙토코커스(GBS) 감염, 정신 장애(예를 들면, 우울증 및 정신분열증), Th2 유형 및 Th1 유형 매개된 질환, 급성 및 만성 통증(다양한 형태의 통증), 폐암, 유방암, 위암, 방광암, 결장암, 췌장암, 난소암, 전립선암 및 직장암과 같은 암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 무베타지방단백혈증, 말단 청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 프로세스, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 선암종, 이소성 심방박동, 후천성 면역 결핍증(AIDS) 치매 합병증, 알코올-유도된 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식편 거부, 알파-1-안티트립신 결핍증, 근위축성 측색 경화증, 빈혈, 협심증, 전각 세포 퇴화, 항-CD3 치료요법, 항 인지질 증후군, 항-수용체 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화, 동정맥루, 운동실조, 심방 세동(지속 또는 발작), 심방 조동, 방실 차단, B 세포 림프종, 골 이식 거부, 골수 이식(BMT) 거부, 각 차단(bundle branch block), 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma), 화상, 심장 부정맥, 심장 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심폐 우회 염증 반응(cardiopulmonary bypass inflammation response), 연골 이식 거부, 소뇌 피질 변성, 소뇌 장애, 혼란 또는 다발성 심방 빈맥, 화학치료요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알코올 중독, 만성 염증성 병리, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐심증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥 질환(Creutzfeldt-Jakob disease), 배양 음성 패혈증(culture negative sepsis), 낭포성 섬유증, 사이토카인 치료요법 관련 장애, 권투선수 치매, 탈수초성 질환, 뎅기 출혈열, 피부염, 피부학적 병태, 당뇨병, 당뇨병성 동맥경화 질환, 확산성 루이체 질환(diffuse Lewy body disease), 확장된 울혈성 심근증, 기저핵의 장애, 중년의 다운 증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 약물-유도된 운동 장애, 약물 민감성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병, 후두개염, 엡스타인-바 바이러스 감염(Epstein-Barr virus infection), 피부 홍통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 혈구탐식성 림프조직구증, 태아의 흉선 이식 거부, 프리드라이히 운동실조(Friedreich's ataxia), 기능성 말초 동맥 장애, 진균 패혈증, 가스 괴저(gas gangrene), 위궤양, 사구체 신염, 임의의 장기 또는 조직의 이식편 거부, 그람 음성 패혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발상 세포 백혈병, 할러포르덴-스파츠 질환(Hallervorden-Spatz disease), 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장 이식 거부, 혈색소증, 혈액 투석, 용혈성 요독 증후군/혈전성 혈소판 감소성 자반증, 출혈, A형 간염, 히스속 부정맥(His bundle arrhythmias), HIV 감염/HIV 신경병증, 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 운동과다성 운동 장애, 과민 반응, 과민성 폐렴, 고혈압, 운동부족성 운동 장애, 시상 하부-뇌하수체-부신 축 평가, 특발성 애디슨 질환, 특발성 폐 섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 유아 척추 근육 위축증, 대동맥 염증, 인플루엔자 A, 이온화 방사선 노출, 홍채모양체염/포도막염/시신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 뇌졸중, 소아 류마티스 관절염, 소아 척추 근육 위축증, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장 이식 거부, 레지오넬라, 리슈마니아증, 나병, 피질척수계의 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 뇌수막염, 수막염 구균혈증, 대사성 편두통 두통, 특발성 편두통 두통, 미토콘드리아 멀티시스템 장애, 혼합 결합 조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다중 시스템 변성(멘첼, 데제린-토마스, 쉬-드라거, 및 마차도-조셉), 중증 근무력증, 세포내 마이코박테리움 아비움(mycobacterium avium intracellulare), 마이코박테리움 투베르큘로시스(mycobacterium tuberculosis), 골수이형성 증후군, 심근 경색, 심근 허혈성 장애, 비인두 암종, 신생아 만성 폐 질환, 신장염, 신증, 신경 퇴행성 질환, 신경성 근육 위축증, 호중구 감소성 발열, 비-호지킨 림프종, 복부 대동맥 및 이의 분지의 폐색, 폐색성 동맥 장애, OKT3® 치료요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관절제술 반전 과정, 장기비대증(organomegaly), 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 악성 종양의 부종양 증후군/고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반 염증성 질환, 다년성 비염, 심장주위 질환, 말초 죽상 동맥경화성 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성 빈혈, 폐포 자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발성 신경병증, 장기비대증, 내분비병증, 모노클로날 감마글로불린병증, 및 피부 변화 증후군), 관류 후 증후군, 펌프 후 증후군, MI-후 심장절개 증후군, 자간전증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압증, 방사선 치료요법, 레이노이드 현상, 레이노이드 질환, 레프섬 질환(Refsum's disease), 정규 협소 QRS 빈맥, 신혈관성 고혈압, 재관류 손상, 제한성 심근증, 육종, 노인성 무도병, 루이체 유형의 노인성 치매, 혈청반응음성 관절병증, 쇼크, 겸상 세포 빈혈, 피부 동종이식편 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특정 부정맥, 척추성 운동실조, 척수 소뇌 변성, 스트렙토코커스 근염, 소뇌의 구조적 병변, 아급성(sbuacute) 경화성 범뇌염, 실신, 심혈관계의 매독, 전신성 아나필락시스(systemic anaphylaxis), 전신성 염증 반응 증후군, 전신성 개시 소아 류마티스 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관확장증, 폐색성 혈전혈관염, 혈소판 감소증, 독성, 이식, 외상/출혈, III형 과민 반응, IV형 과민성, 불안정 협심증, 요독증, 요로성 패혈증, 두드러기, 판막성 심장 질환, 정맥류, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균성 수막염, 바이러스-관련 혈구탐식성 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke- Korsakoff syndrome), 윌슨 질환, 임의의 기관 또는 조직의 이종이식편 거부, 급성 관상동맥 증후군, 급성 특발성 다발성 신경염, 급성 염증성 탈수초성 다발성 근신경병증, 급성 허혈, 성인 스틸 질환(adult Still's disease), 원형탈모증, 아나필락시스, 항-인지질 항체 증후군, 재생 불량성 빈혈, 동맥경화, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 스트렙토코커스 감염과 관련된 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 청력 손실, 자가면역 림프구증식 증후군(ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 조기 난소 부전, 안검염, 기관지 확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 파국적 항인지질 증후군, 셀리악 질환, 경부 척추증, 만성 허혈, 반흔성 유천포창, 다발성 경화증에 대한 위험을 갖는 임상적으로 독립된 증후군(CIS), 유년기 개시형 정신 장애, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 누낭염, 피부근염, 당뇨성 망막병증, 추간판 탈출증(disk herniation), 추간판 이탈(disk prolapse), 약물-유도된 면역 용혈성 빈혈, 심내막염, 자궁내막증, 내안구염, 상공막염, 다형 홍반, 주요 다형 홍반, 임신성 유천포창, 길랑-바레 증후군(GBS), 건초열, 휴즈 증후군(Hughes syndrome), 특발성 파킨슨 질환, 특발성 간질성 폐렴, IgE-매개된 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염(inclusion body myositis), 감염성 안 염증성 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장 질환, 염증성 신장 질환, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건성 각결막염, 쿠스마울 질환(Kussmaul disease) 또는 쿠스마울-마이어 질환(Kussmaul-Meier disease), 란드리 마비(Landry's paralysis), 랑게르한스 세포 조직구증, 망상 피반, 황반 변성, 현미경적 다발혈관염, 베체트병(Morbus Bechterev), 운동 신경 장애, 점막 유천포창, 다발성 장기 부전, 중증 근무력증, 골수이형성 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병증, 비-A형 비-B형 간염, 시신경염, 골용해, 난소암, 소수관절(pauciarticular) JRA, 말초 동맥 폐색 질환(PAOD), 말초 혈관 질환(PVD), 말초 동맥 질환(PAD), 결절성 다발동맥염 (또는 결절성 동맥주위염), 다발 연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다관절 JRA, 다내분비 결핍 증후군, 다발성 근염, 류마티스성 다발성 근육통(PMR), 펌프-후 증후군, 원발성 파킨슨 질환, 전립선 및 직장 암 및 조혈 악성 종양(백혈병 및 림프종), 전립선염, 순수 적혈구 무형성증, 1차 부신 기능부전, 재발성 시신경 척수염, 재협착증, 류마티스 심장 질환, SAPHO(활막염, 여드름, 농포증, 골형성과다증 및 골염), 2차 아밀로이드증, 쇼크 폐(shock lung), 공막염, 좌골 신경통, 2차 부신 기능부전, 실리콘 관련 결합 조직 질환, 스네돈-윌킨슨 피부병(Sneddon-Wilkinson dermatosis), 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 전신성 염증 반응 증후군, 측두 동맥염, 톡소플라스믹 망막염(toxoplasmic retinitis), 독성 표피 괴사, 횡단성 척수염, TRAPS(종양 괴사 인자 수용체 타입 1 (TNFR)-관련 주기적 증후군), 제1형 알레르기 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 일반적인 간질성 폐렴(UIP), 혈관염, 춘계 각결막염, 바이러스성 망막염, 보그트-고야나기-하라다 증후군(VKH syndrome), 습윤 황반 변성, 및 상처 치유를 포함하는 그룹으로부터 선택된 질환 또는 장애를 앓고 있는, 개체에서 통증을 치료하는 방법.
  26. 제13항에 있어서, 상기 개체가, 원발성 암, 전이성 암, 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담도암, 소장암, 결장암, 요로암, 신장암, 방광암, 요로상피암, 여성 생식기암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모암, 임신성 영양아세포 질환, 남성 생식기암, 전립선암, 정낭암, 고환암, 생식 세포 종양, 내분비선암, 갑상선암, 부신암, 뇌하수체암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 골암, 연조직암, 카포시 육종, 뇌의 종양, 신경암, 안암, 수막암, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경아세포종, 신경초종(Schwannoma), 수막종, 조혈 악성 종양으로부터 생성되는 고형 종양, 백혈병, 호지킨 림프종, 및 비-호지킨 림프종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환을 앓고 있는, 개체에서 통증을 치료하는 방법.
  27. 제13항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에게 투여하는 단계가, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 대뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내 및 경피로부터 선택된 하나 이상의 방식에 의한 것인, 방법.
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