JP2016106086A - 変形性関節症及び疼痛の治療 - Google Patents
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Abstract
【課題】変形性関節症に罹患した個体を治療するための新規で有効な方法及び組成物の提供。【解決手段】IL−1αと結合する結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結合性蛋白質、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む、方法。IL−1α及びIL−1βと結合する結合する蛋白質が、夫々の抗IL−1α抗体及び抗IL−1β抗体であるか、両方に結合する二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)結合蛋白質である、方法。【選択図】図3
Description
本発明は変形性関節症及び疼痛の治療に関し、より具体的には変形性関節症及び疼痛の治療用としての、IL−1α及び/又はIL−1βと結合する蛋白質の使用に関する。
健康な脊椎動物(ヒト及び他の哺乳動物を含む)の関節軟骨ないし「硝子軟骨」は主にプロテオグリカンとII型コラーゲンと水から構成される細胞外マトリックス(ECM)の中に円柱状増殖パターンの軟骨細胞を含むことを特徴とする半透明な乳白色の結合組織である。関節軟骨は関節内の相対向する骨の接触を防ぐための有効な荷重支持クッションを提供するため、関節の正常な機能に不可欠である。関節軟骨は関節外傷による損傷のみならず、緩やかな侵食プロセスも受ける。初期には、このような侵食はすり減った硝子軟骨の領域が軟骨下骨部に完全に到達していない無症候の「部分的厚み欠損」に止まる場合もある。このような部分的厚み欠損は通常では無痛であり、一般に関節鏡検査中にしか検出されない。しかし、侵食プロセスを治療せずにいると、部分的厚み欠損の基部が摩耗し続け、欠損の直径が増大し、欠損が最終的に「完全な厚み欠損」まで進行し、下部の骨に達する場合がある。このような完全な厚み欠損が拡大し、関節の相対向する骨の表面が接触して相互に侵食し始めると、炎症、疼痛及び他の変性変化、即ち変形性関節症(OA)の古典的症状に繋がる場合がある。従って、変形性関節症は関節変形、不安定性、損傷及び疼痛をもたらす進行性の身体障害性変性疾患である。最終的に、ある程度の可動性を少なくとも部分的に個体に回復するための実際的な手段は関節置換術しかないと思われる。
IL−1スーパーファミリーは発熱、(例えば線維芽細胞、筋肉細胞及び内皮細胞における)プロスタグランジン合成、Tリンパ球活性化及びインターロイキン2産生を含む多様な生物学的及び生理的作用をもつ炎症プロセスのメディエーターから構成される。IL−1スーパーファミリーの当初のメンバーはIL−1α、IL−1β及びIL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra,IL−1RA,IL−1ra,IL−1Rα)である。IL−1α及びIL−βは感染に対する免疫防御に関与する炎症誘発性サイトカインである。IL−1Rαは受容体結合に関してIL−1α及びIL−1βと競合し、免疫活性化におけるそれらの役割を妨害する。IL−1スーパーファミリーの他のメンバーとしては、IL−18(Dinarello(1994)FASEB J.8(15):1314−3225;Huising et al.(2004)Dev.Comp.Immunol.28(5):395−413参照)や、IL−1α、IL−1β又はIL−1RAに対して構造相同性をもつ他の6種類の遺伝子(IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9及びIL1F10と呼ばれる)が挙げられる。これに伴い、IL−1α、IL−1β及びIL−1RAは夫々IL−1F1、IL−1F2及びIL−1F3と改名されるようになった(Sims et al.(2001)Trends Immunol.22(10):536−537;Dunn et al.(2001)Trends Immunol.22(10):533−536参照)。IL−33又はIL−1F11と呼ばれるIL−1ファミリーの別の推定メンバーも記載されているが、この名称はHGNC遺伝子ファミリー名称データベースで公式に採用されていない。
IL−1α及びIL−1βはいずれもマクロファージ、単球及び樹状細胞により産生される。これらは感染に対する生体の炎症応答の重要な部分を形成する。これらのサイトカインは内皮細胞上の接着因子の発現を亢進し、白血球を感染部位に移動させ、視床下部体温調節中枢をリセットさせ、発熱として発現される体温上昇をもたらす。従って、IL−1は内因性発熱物質と呼ばれる。体温上昇は生体の免疫系が感染と戦うのに役立つ。IL−1は造血の調節にも重要である。末梢組織におけるIL−1β産生も発熱を伴う痛覚過敏(疼痛感受性亢進)に関係があるとされている(Morgan et al.(2004)Brain Res.1022(1−2):96−100)。IL−1は疼痛に関連するシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)の発現をアップレギュレートする。大半の場合、IL−1α及びIL−1βは同一の細胞受容体と結合する。この受容体は所定の他の受容体とほぼ共通の経路を介して細胞内シグナルを伝達する同一ではないが、近縁の2つのサブユニットから構成される。これらはTollファミリーの先天性免疫受容体とIL−18受容体である。IL−1α及びIL−1βは更に同様の生物学的性質をもち、発熱、徐波睡眠及び好中球増加症の誘導、Tリンパ球及びBリンパ球活性化、線維芽細胞増殖、所定細胞に対する細胞傷害性、コラゲナーゼの誘導、肝臓における急性期蛋白質の合成、並びにコロニー刺激因子及びコラーゲンの産生亢進が挙げられる。
IL−1αとIL−1βをコードするcDNAは単離・発現されており、これらのcDNAはIL−1α(Lomedico et al.(1984)Nature 312:458)及びIL−1β(Auron et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7909)と呼ばれる2種類の異なる遺伝子産物に相当する。8種類のインターロイキン1ファミリー遺伝子が染色体2上にサイトカイン遺伝子クラスターを形成する。IL−1βはmRNAレベル及び蛋白質レベルの両者でヒト単球により産生される主要な形態である。これらの2種類のヒトIL−1はアミノ酸相同度が26%に過ぎない。これらの2種類のIL−1はポリペプチド配列が異なるが、構造類似性があり(Auron et al.(1985)J.Mol.Cell Immunol.2:169)、アミノ酸相同性はIL−1分子の不連続領域に限定される。
IL−1α及びIL−1βは前駆体ペプチドとして産生される。換言するならば、これらは長い蛋白質として産生された後、プロセシングされ、成熟蛋白質と呼ばれる短い活性分子を放出する。IL−1αはプロ蛋白質として産生され、カルパインにより蛋白質分解プロセシングされ、未だ十分に研究されていないメカニズムで放出される。例えば成熟型IL−1βはカスパーゼ1又はインターロイキン1変換酵素(ICE)と呼ばれるカスパーゼファミリー蛋白質の所定のメンバーによる開裂後にPro−IL−1βから放出される。ヒトIL−1スーパーファミリーの各メンバーの成熟形態の三次元構造は樽型蛋白質を産生する12〜14本のβ鎖から構成される。
IL−1αは軟骨吸収の亢進に効果があることから当初は「カタボリン」と呼ばれたが、滑膜細胞でコラゲナーゼとプロスタグランジンに刺激作用を与えることから「単核球細胞因子」(MCF)とも呼ばれ、急性期反応に刺激作用を与える「白血球内因性因子」(LEM)とも呼ばれる。IL−1αは単球、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞及びリンパ球等の多数の異なる細胞により合成され、多くの細胞はIL−1αに特異的な受容体をもつため、IL−1αは広範な生物学的活性をもつ。IL−1αはIL−2放出、B細胞成熟及び増殖、並びに線維芽細胞増殖因子活性を誘導することにより胸腺細胞増殖を刺激する。IL−1α蛋白質は内因性発熱物質とみなされ、滑膜細胞からのプロスタグランジンとコラゲナーゼの放出を刺激すると報告されている。従って、IL−1αは更に各種障害及び障害の症状の誘因として中心的な位置を占める。これらの障害は治療法が殆ど又は全く存在しない重度の障害が大半である。これらの遺伝子の多型は関節リウマチとアルツハイマー病に関係があることが示唆されている。IL−1全般は関節炎、肺線維症、中枢神経系疾患、糖尿病及び所定の心血管疾患を含む多数のヒト疾患に関係があるとされている。IL−1αの望ましくない作用については、例えばOppenheim et al.(1986)Immunol.Today 7:45−56、Durum et al.(1985)Ann.Rev.Immunol.3:263−287及びSynnons et al.(1989)Lymphokine Res.8:365−372に記載されている。
OAの発症、持続及び進行はIL−1が中枢的な役割を果たす機械的及び生化学的経路の複雑なカスケードにより媒介される。IL−1αとIL−1βは単球、マクロファージ及び好中球のみならず、軟骨細胞、滑膜線維芽細胞及び破骨細胞等の関節組織の細胞によっても産生される(例えばDinarello et al.(2009)Ann.Rev.Immunol.27:519−550参照)。インビトロにおいて、IL−1は軟骨細胞と滑膜細胞を刺激し、OAに繋がる軟骨破壊に関与するプロテイナーゼを産生させる(例えばDayer et al.(1977)Science 195:181−183;Dayer et al.(1984)Biochem.Pharmacol.33:2893−2899;McGuire−Goldring et al.(1984)Arthritis Rheum.27:654−662参照)と共に、正常な硝子軟骨の細胞外マトリックス(ECM)の主成分であるプロテオグリカンとII型コラーゲンの合成を阻害することができる(例えばGoldring et al.(1987)J.Biol.Chem.262:16724−16729;Goldring et al.(1988)J.Clin.Investig.82:2026−2037参照)。前臨床試験と臨床試験の結果、IL−1がOAの病因に関与していることも分かっている。例えば、IL−1を動物の膝に関節内(ia)注射すると、白血球浸潤と軟骨減少を生じた(Pettiphar et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8749−8753)。他方、IL−1アンタゴニストをia注射すると、実験的OAの進行が有意に抑制された(例えばPelletier et al.(1997)Arthritis Rheum.40:1012−1019;Caron et al.(1996)Arthritis Rheum.39:1535−1544;Fernandes et al.(1999)Am.J.Pathol.154:11590−11690;Zhang et al.(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.341:202−208参照)。更に、IL−1ノックアウト(KO)マウスはその野生型対照に比較した場合に外科的に誘発した軟骨損傷に対して耐性であることが判明した(Glasson et al.(2009)Osteoarthritis Cartilage,18:572−580)。
IL−1αとIL−1βはいずれもヒトOA患者の滑膜、軟骨及び滑液で発現される(例えばFarahat et al.(1993)Ann.Rheum.Dis.52:870−875参照)。IL−1アンタゴニストとしてIL−1受容体アンタゴニストであるアナキンラと、IL−1受容体モノクローナル抗体であるAMG−108はOA試験において症状と軟骨保護に関して多少の効果を示した(“Results from a Randomized Controlled Trial of AMG 108(a fully human monoclonal antibody to IL−1R type I)in Patients With Osteoarthritis of the Knee”Cohen et al.,ACR2007)。提案されたこれらの治療薬はいずれも明白で確実な効果を立証するべく今後の研究が待たれている。
変形性関節症に罹患した個体を治療するための新規で有効な方法及び組成物が依然として必要とされている。
Dinarello(1994)FASEB J.8(15):1314−3225
Huising et al.(2004)Dev.Comp.Immunol.28(5):395−413
Sims et al.(2001)Trends Immunol.22(10):536−537
Dunn et al.(2001)Trends Immunol.22(10):533−536
Morgan et al.(2004)Brain Res.1022(1−2):96−100
Lomedico et al.(1984)Nature 312:458
Auron et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7909
Auron et al.(1985)J.Mol.Cell Immunol.2:169
Oppenheim et al.(1986)Immunol.Today 7:45−56
Durum et al.(1985)Ann.Rev.Immunol.3:263−287
Synnons et al.(1989)Lymphokine Res.8:365−372
Dinarello et al.(2009)Ann.Rev.Immunol.27:519−550
Dayer et al.(1977)Science 195:181−183
Dayer et al.(1984)Biochem.Pharmacol.33:2893−2899
McGuire−Goldring et al.(1984)Arthritis Rheum.27:654−662
Goldring et al.(1987)J.Biol.Chem.262:16724−16729
Goldring et al.(1988)J.Clin.Investig.82:2026−2037
Pettiphar et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8749−8753
Pelletier et al.(1997)Arthritis Rheum.40:1012−1019
Caron et al.(1996)Arthritis Rheum.39:1535−1544
Fernandes et al.(1999)Am.J.Pathol.154:11590−11690
Zhang et al.(2006)Biochem.Biophys.Res.Commun.341:202−208
Glasson et al.(2009)Osteoarthritis Cartilage,18:572−580
Farahat et al.(1993)Ann.Rheum.Dis.52:870−875
Cohen et al.,"Results from a Randomized Controlled Trial of AMG 108(a fully human monoclonal antibody to IL−1R type I)in Patients With Osteoarthritis of the Knee"ACR2007
本発明は変形性関節症(OA)と疼痛の治療方法を提供する。このような方法はIL−1α及びIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質を個体(ヒト又は他の哺乳動物)に投与する段階を含む。
本発明の1側面において、個体(ヒト又は他の哺乳動物)における変形性関節症の治療方法は、IL−1αと結合する結合性蛋白質をIL−1βと結合する結合性蛋白質と共に(例えば混合物、順次投与、又は同時投与により)前記個体に投与する段階、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。
1態様において、個体における変形性関節症の治療方法はIL−1αと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はIL−1αに対する抗体、例えばIL−1αに対するモノクローナル抗体である。別の態様において、個体における変形性関節症の治療方法はIL−1βと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はIL−1βと結合する抗体、例えばIL−1βと結合するモノクローナル抗体である。
本発明の別の側面において、個体(ヒト又は他の哺乳動物)における変形性関節症の治療方法は、IL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。好ましくは、前記結合性蛋白質はIL−1αと結合する少なくとも1個の結合部位と、IL−1βと結合する少なくとも1個の結合部位を含む二重可変ドメイン免疫グロブリン結合性蛋白質(本願では「DVD−Ig(登録商標)」ないし「DVD−Ig」結合性蛋白質又は分子と言う場合もある)である。より好ましくは、前記DVD−Ig結合性蛋白質はIL−1αと結合する2個の結合部位と、IL−1βと結合する2個の結合部位を含む。
別の態様において、本発明による個体における変形性関節症の治療方法は、IL−1αと結合する結合性蛋白質、IL−1βと結合する結合性蛋白質、IL−1αと結合する結合性蛋白質とIL−1βと結合する結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質と、医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物を前記個体に投与する段階を含む。
本発明の1態様において、変形性関節症の治療方法は、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を個体に投与する段階を含む。本発明で有用なこのような結晶化結合性蛋白質としては、限定されないが、IL−1αに対する結晶化抗体、IL−1βに対する結晶化抗体、並びにIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化DVD−Ig結合性蛋白質が挙げられる。
本発明の個体における変形性関節症の治療方法で有用な組成物としては、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質の放出用組成物が挙げられる。
1態様において、本発明による変形性関節症の治療方法で有用な組成物は、
(a)IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質と、場合により成分を含有する製剤と;
(b)少なくとも1種のポリマー担体
を含有する。
(a)IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質と、場合により成分を含有する製剤と;
(b)少なくとも1種のポリマー担体
を含有する。
1態様において、上記組成物はIL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せを含有する。別の態様において、IL−1αと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばIL−1αと結合する結晶化モノクローナル抗体であり、IL−1βと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばIL−1βと結合するモノクローナル抗体である。
1態様において、上記組成物はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する。別の態様において、前記結晶化結合性蛋白質はIL−1α及びIL−1β−Igの両方と結合する結晶化二重可変ドメイン(DVD−Ig)結合性蛋白質である。
別の態様において、個体における変形性関節症の治療方法は、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する組成物を前記個体に投与する段階を含み、前記少なくとも1種のポリマー担体はポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(酸無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸コポリマーないしPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ[(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の1種以上から選択されるポリマーである。
1態様において、上記組成物中に前記非必須成分が存在する場合、前記成分はアルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される。
1態様において、上記変形性関節症の治療方法は第2の作用剤を前記個体に投与する段階を更に含み、前記第2の作用剤は前記方法又は前記方法で使用される組成物に別の望ましい特性を提供する。このような第2の作用剤はブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、IL−1受容体アンタゴニスト、抗IL−1βモノクローナル抗体、抗IL−6モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物;TNF、LT、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−18、IL−23、EMAP−II、GM−CSF、FGF及びPDGFの抗体;CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90又はそのリガンドの抗体;メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬;IRAK、NIK、IKK、p38、MAPキナーゼ阻害剤;IL−1β変換酵素阻害剤、TNFα変換酵素阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性p55TNF受容体、可溶性p75TNF受容体;sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R;抗炎症性サイトカイン、IL−4、IL−10、IL−11、IL−13及びTGFβから構成される群の1種以上の分子とすることができる。
本発明の別の側面において、本願に記載する変形性関節症の治療方法は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱腔内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内及び経皮から選択される少なくとも1種の方法により、本願に記載する1種以上の結合性蛋白質又は本願に記載する組成物を個体に投与する段階を含む。
本発明の1側面において、個体(ヒト又は他の哺乳動物)における疼痛の治療方法は、IL−1αと結合する結合性蛋白質をIL−1βと結合する結合性蛋白質と共に(例えば混合物、順次投与、又は同時投与により)前記個体に投与する段階、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。
本発明の方法及び組成物は任意形態の疼痛をもつ個体における疼痛を治療するために使用することができ、癌性疼痛、神経障害性疼痛、筋肉痛、関節痛、骨折痛、創傷痛、術後疼痛、頭痛、偏頭痛、並びにアロディニア(異痛症)、痛覚過敏及びアロディニアと痛覚過敏の併発等の疼痛状態が挙げられる。
1態様において、個体における疼痛の治療方法はIL−1αと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はIL−1αに対する抗体、例えばIL−1αに対するモノクローナル抗体である。別の態様において、個体における疼痛の治療方法はIL−1βと結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含み、前記結合性蛋白質はIL−1βと結合する抗体、例えばIL−1βと結合するモノクローナル抗体である。
本発明の別の側面において、個体における疼痛の治療方法は、IL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。好ましくは、前記結合性蛋白質はIL−1αと結合する少なくとも1個の結合部位と、IL−1βと結合する少なくとも1個の結合部位を含む二重可変ドメイン免疫グロブリン結合性蛋白質(本願では「DVD−Ig(登録商標)」ないし「DVD−Ig」結合性蛋白質又は分子と言う場合もある)である。好ましくは、前記DVD−Ig結合性蛋白質はIL−1αと結合する2個の結合部位と、IL−1βと結合する2個の結合部位を含む。
別の態様において、本発明による個体における疼痛の治療方法は、IL−1αと結合する結合性蛋白質、IL−1βと結合する結合性蛋白質、IL−1αと結合する結合性蛋白質とIL−1βと結合する結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質と、医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物を前記個体に投与する段階を含む。
本発明の1態様において、疼痛の治療方法は、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を前記個体に投与する段階を含む。本発明で有用なこのような結晶化結合性蛋白質としては、限定されないが、IL−1αに対する結晶化抗体、IL−1βに対する結晶化抗体、並びにIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化DVD−Ig結合性蛋白質が挙げられる。
本発明の個体における疼痛の治療方法で有用な組成物としては、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質の放出用組成物が挙げられる。
1態様において、本発明による疼痛の治療方法で有用な組成物は、
(a)IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質と、場合により成分を含有する製剤と;
(b)少なくとも1種のポリマー担体
を含有する。
(a)IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質と、場合により成分を含有する製剤と;
(b)少なくとも1種のポリマー担体
を含有する。
1態様において、上記組成物はIL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質とIL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せを含有する。別の態様において、IL−1αと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばIL−1αと結合する結晶化モノクローナル抗体であり、IL−1βと結合する前記結晶化結合性蛋白質は結晶化抗体、例えばIL−1βと結合するモノクローナル抗体である。
1態様において、上記組成物はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する。別の態様において、前記結晶化結合性蛋白質はIL−1α及びIL−1β−Igの両方と結合する結晶化二重可変ドメイン(DVD−Ig)結合性蛋白質である。
別の態様において、個体における疼痛の治療方法は、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質、IL−1αと結合する結晶化結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結晶化結合性蛋白質の両方の組合せ、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する結晶化結合性蛋白質を含有する組成物を前記個体に投与する段階を含み、前記少なくとも1種のポリマー担体はポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(酸無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸コポリマーないしPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ[(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の1種以上から選択されるポリマーである。
1態様において、上記組成物中に前記非必須成分が存在する場合、前記成分はアルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される。
1態様において、上記疼痛の治療方法は第2の作用剤を前記個体に投与する段階を更に含み、前記第2の作用剤は前記方法又は前記方法で使用される組成物に別の望ましい特性を提供する。このような第2の作用剤はブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、IL−1受容体アンタゴニスト、抗IL−1βモノクローナル抗体、抗IL−6モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物;TNF、LT、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−18、IL−23、EMAP−II、GM−CSF、FGF及びPDGFの抗体;CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90又はそのリガンドの抗体;メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬;IRAK、NIK、IKK、p38、MAPキナーゼ阻害剤;IL−1β変換酵素阻害剤、TNFα変換酵素阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性p55TNF受容体、可溶性p75TNF受容体;sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R;抗炎症性サイトカイン;IL−4、IL−10、IL−11、IL−13及びTGFβから構成される群の1種以上の分子とすることができる。
本発明の別の側面において、本願に記載する疼痛の治療方法は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱腔内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内及び経皮から選択される少なくとも1種の方法により、本願に記載する1種以上の結合性蛋白質又は本願に記載する組成物を個体に投与する段階を含む。
別の態様において、本発明はIL−1発現に伴う疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛の治療方法を提供する。前記個体におけるこのようなIL−1発現は前記個体の血漿及び/又は局所組織におけるIL−1濃度上昇をもたらす可能性がある。
1態様において、本願に記載する方法及び組成物は変形性関節症、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェグナー肉芽腫症、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性I型多腺性内分泌不全症、II型多腺性内分泌不全症(シュミット症候群)、成人(急性)呼吸窮迫症候群、脱毛症、先天性脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸病性滑膜炎、クラミジア関連関節症、エルシニア関連関節症、サルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患/動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎/ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、B型肝炎、C型肝炎、分類不能型免疫不全症(分類不能型低ガンマグロブリン血症)、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣不全、早発卵巣不全、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎/多発性筋炎関連肺疾患、ショーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風性関節炎、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎(古典的自己免疫性肝炎ないしルポイド肝炎)、2型自己免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自己免疫介在性低血糖症、黒色表皮腫を伴うB型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、1型乾癬、2型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患NOS、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、特発性ないしNOS男性不妊症、精子自己免疫、多発性硬化症(全サブタイプ)、交感性眼炎、結合組織病続発性肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、ショーグレン症候群、高安病/動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝傷害、胆汁鬱滞症、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アレルギー、B群連鎖球菌(GBS)感染症、精神障害(例えば鬱病及び統合失調症)、Th2型及びTh1型細胞介在性疾患、急性及び慢性疼痛(各種疼痛)、癌(例えば肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌)及び血液悪性疾患(白血病及びリンパ腫)、無βリポ蛋白血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫又は感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性又は慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、エイズ痴呆合併症、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶反応、α1アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗CD3抗体療法、抗リン脂質抗体症候群、抗受容体過敏反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調症、心房細動(持続性又は発作性)、心房粗動、房室ブロック、B細胞リンパ腫、骨移植拒絶反応、骨髄移植(BMT)拒絶反応、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶反応、小脳皮質変性、小脳障害、無秩序型ないし多源性心房頻拍、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性アルコール依存症、慢性炎症性疾患、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、拳闘家痴呆、脱髄疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚疾患、糖尿病、糖尿病性動脈硬化症、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、基底核障害、中高年ダウン症候群、CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発される薬物誘発性運動障害、薬物過敏症、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン・バールウイルス感染症、肢端紅痛症、錐体外路及び小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶反応、フリードリヒ運動失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意臓器又は組織の移植片拒絶反応、グラム陰性菌敗血症、グラム陽性菌敗血症、細胞内生物による肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハレルフォルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶反応、ヘモクロマトーシス、血液透析、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、出血、A型肝炎、ヒス束不整脈、HIV感染症/HIV神経障害、ホジキン病、運動過多性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部−下垂体−副腎軸評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体介在性細胞傷害、無力症、小児脊髄性筋萎縮症、大動脈炎症、A型インフルエンザ、電離放射線被爆、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎/視神経炎、虚血再潅流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶反応、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系傷害、脂肪性浮腫、肝移植拒絶反応、リンパ水腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性偏頭痛、特発性偏頭痛、ミトコンドリア多系統疾患、混合性結合組織病、モノクローナル免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症(Menzel,Dejerine−Thomas,Shy−Drager及びMachado−Joseph)、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ菌感染症、ヒト型結核菌感染症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋委縮症、好中球減少時の発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈とその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、OKT3(登録商標)療法、精巣炎/副睾丸炎、精巣炎/精管切除再吻合術、臓器腫大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶反応、膵臓癌、腫瘍随伴症候群/悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶反応、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、POEMS症候群(多発ニューロパシー、臓器腫大、内分泌障害、モノクローナル免疫グロブリン血症及び皮膚変化症候群)、潅流後症候群、ポストポンプ症候群、MI心膜切開後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象、レイノー病、レフサム病、規則的で狭いQRS幅の頻拍、腎血管性高血圧症、再潅流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老人性舞踏病、レビー小体型老人性痴呆症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶反応、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶反応、充実性腫瘍、特異的不整脈、脊髄性運動失調症、脊髄小脳変性症、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造傷害、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型発症若年性関節リウマチ、T細胞性ないしFAB ALL、毛細血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、中毒症、移植、外傷/出血、III型過敏反応、IV型過敏反応、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染症、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、成人スティル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸症、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群(ALPS)、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早発卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心臓血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群(CIS)、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病網膜症、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群(GBS)、花粉症、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、IgE介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、IPF/UIP、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性症、顕微鏡的多発血管炎、ベヒテレフ病、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非A非B肝炎、視神経炎、骨溶解症、卵巣癌、少関節型JRA、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患(PAD)、静脈炎、結節性多発動脈炎(ないし結節性動脈周囲炎)、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型JRA、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症(PMR)、ポストポンプ症候群、原発性パーキンソン病、前立腺癌及び直腸癌及び血液悪性疾患(白血病及びリンパ腫)、前立腺炎、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心臓病、SAPHO(滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎)、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、シリコン関連結合組織病、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、TRAPS(腫瘍壊死因子1型受容体(TNFR)関連周期性症候群)、1型アレルギー反応、II型糖尿病、蕁麻疹、通常型間質性肺炎(UIP)、血管炎、春季カタル、ウイ
ルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群(VKH症候群)、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛を治療するために使用される。
ルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群(VKH症候群)、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛を治療するために使用される。
1態様において、本願に記載する方法及び組成物は原発性癌、転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、結腸癌、尿管癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖管癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患、男性生殖管癌、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、胚細胞腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、骨癌、軟部組織癌、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、血液悪性疾患に起因する充実性腫瘍、白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から構成される群から選択される疾患に罹患している個体における疼痛を治療するために使用される。
本発明はインターロイキン−1(IL−1)の機能の阻害が個体(ヒト又は他の哺乳動物)における変形性関節症(OA)を治療するために有効な手段となり得るという発見に基づく。本発明によると、OAを治療するためのIL−1機能の阻害はIL−1α及びIL−1βと結合する1種以上の蛋白質を個体に投与することにより実現することができる。このような「二重特異性」療法はIL−1αと結合する結合性蛋白質(例えば抗体)と、IL−1βと結合する結合性蛋白質(例えば抗体)をOA患者に投与することにより、又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する多価及び多重特異性結合性蛋白質を投与することにより実現することができる。本発明で有用なこのような多価多重特異性結合性蛋白質としては、二重可変ドメイン免疫グロブリン結合性蛋白質(本願では「DVD−Ig(登録商標)」ないし「DVD−Ig」結合性蛋白質又は分子と言う場合もある)が挙げられる。例えばPCT公開第WO2007/024715号及びWu et al.(2007)Nature Biotech.25(11):1290−1297参照。IL−1α及びIL−1β結合性蛋白質の特定の組合せ又はIL−1α及びIL−1βの両方と結合する特異的DVD−Ig分子がOAの治療に有用であるか否かはOAの関節不安定性モデル(JIM)やOAの内側半月板不安定化(DMM)モデル等のOAの動物モデルを使用して評価することができる(Glasson et al.(2007)Osteoarthrit.Cart.15(9):1061−9)。
本願で特に定義しない限り、本発明に関連して使用する科学技術用語は当業者に広く理解されている意味である。用語の意味と範囲は明瞭となるはずであるが、潜在的に曖昧な場合には、辞書又は外部の定義よりも本願に記載する定義を優先する。更に、文脈からそうでないと判断される場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。本願では、特に指定しない限り、「又は」なる用語は「及び/又は」を意味する。更に、「含む」なる用語と他の語形(例えば「含んでいる」や「含まれる」)の使用は非限定的である。また、特に指定しない限り、「要素」又は「成分」等の用語は1単位からなる要素及び成分と、2以上のサブユニットからなる要素及び成分の両者を包含する。
一般に、本願に記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、蛋白質及び核酸化学並びに核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用する術語とその技術は当分野で周知であり、広く使用されている。特に指定しない限り、本発明の方法及び技術は当分野で周知の慣用方法に従い、本明細書の随所に引用及び説明する各種一般資料及び特定資料に記載されているように一般に実施される。酵素反応及び精製技術は製造業者の指示に従うか、当分野で広く実施されている方法に従うか、又は本願の記載に従って実施される。本願に記載する分析化学、有機合成化学、及び医薬化学に関連して使用する術語とその実験手順及び技術は当分野で周知であり、広く使用されている。化学合成、化学分析、医薬製造、製剤化及び送達並びに患者の治療には標準技術を使用する。
本発明を理解し易くするために、選択用語を以下に定義する。
「ポリペプチド」なる用語はアミノ酸の任意ポリマー鎖を意味する。「ペプチド」及び「蛋白質」なる用語はポリペプチドなる用語と同義に使用し、同様にアミノ酸のポリマー鎖を意味する。「ポリペプチド」なる用語は天然又は人工蛋白質、蛋白質フラグメント及び蛋白質配列のポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。
「単離蛋白質」又は「単離ポリペプチド」なる用語はその起源又は由来源によりその天然状態でこれに付随する天然会合成分と会合していない蛋白質又はポリペプチド、同一種に由来する他の蛋白質を実質的に含まない蛋白質又はポリペプチド、別の種に由来する細胞により発現される蛋白質又はポリペプチド、あるいは自然界に存在しない蛋白質又はポリペプチドを意味する。従って、化学的に合成されるポリペプチド又はその天然由来源である細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドはその天然会合成分から「単離」される。当分野で周知の蛋白質精製技術を使用して、単離により蛋白質を天然会合成分から実質的に分離することもできる。
「回収」なる用語は例えば当分野で周知の蛋白質精製技術を使用して、単離によりポリペプチド等の化学種を天然会合成分から実質的に分離する方法を意味する。
「ヒトIL−1α」(本願では「hIL−1α」又は「IL−1α」と略称する場合もある)なる用語は各種免疫応答、炎症プロセス及び造血に関与する多面的サイトカインを包含する。例えば、IL−1αは活性化マクロファージにより産生されるヒトサイトカインを含み、IL−2放出、B細胞成熟及び増殖、並びに線維芽細胞増殖因子活性を誘発することにより胸腺細胞を刺激する。「ヒトIL−1α」なる用語は標準組換え発現法により作製することができる組換えヒトIL−1α(「rhIL−1α))を包含するものとする。
「ヒトIL−1β」(本願では「hIL−1β」又は「IL−1β」と略称する場合もある)なる用語は各種免疫応答、炎症プロセス及び造血に関与する多面的サイトカインを包含する。ヒト「IL−1β」なる用語は標準組換え発現法により作製することができる組換えヒトIL−1β(「rhIL−1β」)を包含する。
ヒトIL−1α及びIL−1βのアミノ酸配列を表1に示す。
「生物学的活性」なる用語はサイトカインの固有の全生物学的性質を意味する。IL−1α及びIL−1βの生物学的性質としては限定されないが、IL−1受容体との結合が挙げられる。
「生物学的活性」とはIL−1αの固有の全生物学的性質を意味する。IL−1αの生物学的性質としては限定されないが、IL−1受容体との結合と、IL−2放出、B細胞成熟及び増殖、並びに線維芽細胞増殖因子活性を誘発することによる胸腺細胞の刺激が挙げられる。
抗体、蛋白質又はペプチドと第2の化学種の相互作用に関する「特異的結合」又は「特異的に結合する」なる用語は相互作用が化学種上の特定構造(例えば抗原決定基又はエピトープ)の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は蛋白質一般ではなく特定蛋白質構造を認識してこれと結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識した「A」と抗体を含有する反応混合物中にエピトープA(即ち遊離した未標識のA)を含む分子が存在するならば、標識したAの抗体結合量は減少する。
「抗体」なる用語は2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖の4本のポリペプチド鎖から構成される任意の免疫グロブリン(Ig)分子、又はIg分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的フラグメント、突然変異体、変異体もしくは誘導体を広義に意味する。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体フォーマットは当分野で公知であり、その非限定的な態様について以下に記載する。
全長抗体において、各重鎖は重鎖可変領域(本願ではHCVR又はVHと略称する)と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3の3個のドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域(本願ではLCVR又はVLと略称する)と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は1個のドメインCLから構成される。VH及びVL領域は更に相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域とその間に配置されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存度の高い領域に区分することができる。各VH及びVLはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置された3個のCDRと4個のFRから構成される。免疫グロブリン分子は任意型(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスとすることができる。
抗体の「抗原結合部分」なる用語は抗原(例えばhIL−1α)と特異的に結合する能力を保持する抗体の1個以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は全長抗体のフラグメントにより実施可能である。このような抗体の態様は2種以上の異なる抗原と特異的に結合する複特異性、二重特異性又は多重特異性フォーマットでもよい。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例としては、(i)VL、VH、CL及びCH1領域から構成される1価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された2個のFabフラグメントからなる2価フラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VH領域とCH1領域から構成されるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVL領域とVH領域から構成されるFvフラグメント;(v)単一可変領域から構成されるdAbフラグメント(Ward et al.,(1989)Nature 341:544−546,PCT公開第WO90/05144号);並びに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。更に、FvフラグメントのVL及びVHの2領域は別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して合成リンカーにより結合し、VL領域とVH領域が対合して1価分子を形成する単一蛋白鎖として作製することができる(1本鎖Fv(scFv)と言う;例えばBird et al.(1988)Science 242:423−426;及びHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883参照)。このような1本鎖抗体(scFv)も抗体の「抗原結合部分」なる用語に含むものとする。ダイアボディ等の他の形態の1本鎖抗体も含む。ダイアボディはVH領域とVL領域が1本のポリペプチド鎖上で発現される2価の複特異性抗体であるが、非常に短いリンカーを使用するため、同一鎖上の2領域間で対合することができず、これらの領域は別の鎖の相補性領域と対合し、2個の抗原結合部位を形成する(例えばHolliger,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448;Poljak,et al.(1994)Structure 2:1121−1123参照)。このような抗体結合部分は当分野で公知である(Kontermann and Dubel eds.,Antibody Engineering(Springer−Verlag.New York,2001)(ISBN 3−540−41354−5))。
「抗体コンストラクト」なる用語はリンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常領域に連結された1個以上の本発明の抗原結合部分を含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドはペプチド結合により結合した2個以上のアミノ酸残基を含み、1個以上の抗原結合部分と結合するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当分野で周知である(例えばHolliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448;Poljak et al.(1994)Structure 2:1121−1123参照)。免疫グロブリン定常領域とは重鎖又は軽鎖定常領域を意味する。ヒトIgG重鎖(γ)及び軽鎖(κ及びδ)定常領域アミノ酸配列は当分野で公知であり、表2に示す。
更に、抗体又はその抗原結合部分は抗体又はその抗原結合部分と1種以上の他の蛋白質又はペプチドの共有的又は非共有的結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部でもよい。このような免疫接着分子の例としてはストレプトアビジンコア領域を使用して形成される四量体scFv分子(Kipriyanov,S.et al.(1995)Human Antibod.Hybridomas 6:93−101)や、システイン残基、マーカーペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグを使用して形成される2価ビオチン化scFv分子(Kipriyanov,S.et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047−1058)が挙げられる。Fab及びF(ab’)2フラグメント等の抗体の抗原結合部分は夫々全長抗体のパパイン又はペプシン消化等の慣用技術を使用して全長抗体から作製することができる。更に、抗体、その抗原結合部分及び免疫接着分子は本願に記載するような標準組換えDNA技術を使用して取得することができる。
「単離抗体」とは異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する(例えばhIL−1αと特異的に結合する単離抗体はhIL−1α以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、hIL−1αと特異的に結合する単離抗体は他の抗原(例えば他の種に由来するIL−1α分子)と交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び/又は薬品を実質的に含まない場合がある。
「ヒト抗体」なる用語はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ抗体を包含する。本発明のヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えばランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によりインビトロで導入される突然変異又は体細胞突然変異によりインビボで導入される突然変異)を例えばCDR、特にCDR3に含んでいてもよい。他方、「ヒト抗体」なる用語は別の哺乳動物種(例えばマウス)の生殖細胞系列に由来するCDR配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を包含しない。
「組換えヒト抗体」なる用語は組換え手段により作製、発現、創製又は単離された全ヒト抗体を包含し、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体(下記セクションII Cに詳述)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体(Hoogenboom,H.(1997)Trends Biotechnol.15:62−70;Azzazy and Highsmith(2002)Clin.Biochem.35:425−445;Gavilondo and Larrick(2000)BioTechniques 29:128−145;Hoogenboom and Chames(2000)Immunol.Today 21:371−378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子にトランスジェニックな動物(例えばマウス)から単離された抗体(例えばTaylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287−6295;Kellermann and Green(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13:593−597;Little et al.(2000)Immunol.Today 21:364−370参照)、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライシングする他の任意手段により作製、発現、創製又は単離された抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域をもつ。しかし、所定態様において、このような組換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(又は、ヒトIg配列にトランスジェニックな動物を使用する場合には、インビボ体細胞突然変異誘発)を受け、従って、組換え抗体のVH領域とVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VH及びVL配列に由来し、これらの配列に近縁の配列であるが、天然ではヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にインビボで存在しない場合もある配列である。
「キメラ抗体」なる用語はある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列と、別の種に由来する定常領域配列を含む抗体(例えばマウス重鎖及び軽鎖可変領域をヒト定常領域に連結した抗体)を意味する。
「CDR移植抗体」なる用語はある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域を含むが、VH及び/又はVL領域のCDR領域の1個以上の配列を別の種のCDR配列で置換えた抗体(例えばヒトCDRの1個以上(例えばCDR3)を例えばヒトIL−1αに対するマウスモノクローナル抗体から得られるようなマウスCDR配列で置換えたヒト重鎖及び軽鎖可変領域をもつ抗体)を意味する。
本願で使用する「CDR」なる用語は抗体可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖及び軽鎖可変領域の各々に3個のCDRが存在し、可変領域の各々でCDR1、CDR2及びCDR3と呼ばれる。本願で使用する「CDRセット」なる用語は抗原結合部位の単一可変領域(即ちVH又はVL)に存在する3個1組のCDRを意味する。これらのCDRの厳密な境界は種々のシステムにより種々に定義されている。Kabatにより記載されているシステム(Kabat et al.(1987,1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland))は抗体の任意可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを規定するのみならず、3個のCDRを定義する厳密な残基境界を規定する。これらのCDRをKabat CDRと言う場合がある。Chothiaら(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901−917及びChothia et al.(1989)Nature 342:877−883)はKabat CDR内の所定のサブ部分がアミノ酸配列レベルでは多様性に富んでいるにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとることを見いだした。これらのサブ部分はL1、L2及びL3又はH1、H2及びH3と呼ばれ、ここで「L」及び「H」は夫々軽鎖領域と重鎖領域を表す。これらの領域をChothia CDRと呼ぶ場合があり、その境界はKabat CDRとオーバーラップする。Kabat CDRとオーバーラップするCDRを定義する他の境界はPadlan et al.(1995)FASEB J.9:133−139及びMacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732−745に記載されている。上記システムの1種に厳密には従わないとしても、Kabat CDRとオーバーラップする更に他のCDR境界定義もあり、特定残基もしくは残基群又はCDR全体が抗原結合に有意に影響を与えないという予想又は実験結果に基づいて短くしたものや長くしたものがある。本願で使用する方法はこれらのシステムのいずれに従って定義されたCDRも使用することができるが、所定態様はKabat又はChothiaの定義によるCDRを使用する。
「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」及び「Kabatラベリング」なる用語を本願では同義に使用する。これらの用語は抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりも可変度の高い(即ち超可変性)アミノ酸残基のナンバリングシステムを意味する(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382−391及びKabat,E.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242)。重鎖可変領域では、超可変領域はCDR1のアミノ酸31〜35位、CDR2のアミノ酸50〜65位、及びCDR3のアミノ酸95〜102位に位置する。軽鎖可変領域では、超可変領域はCDR1のアミノ酸24〜34位、CDR2のアミノ酸50〜56位、及びCDR3のアミノ酸89〜97位に位置する。
過去20年間にわたる重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列の広範な公共データベースの発展と分析の結果、可変領域配列内のフレームワーク領域(FR)配列とCDR配列の典型的境界が解明され、当業者はKabatナンバリング、Chothiaナンバリング又は他のシステムに従ってCDRを正確に決定できるようになった。例えばMartin,“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,”In Kontermann and Dubel,eds.,Antibody Engineering(Springer−Verlag,Berlin,2001),chapter 31,pp.432−433参照。重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列内のKabat CDRのアミノ酸配列の有用な決定方法を以下に記載する。
CDR−L1アミノ酸配列を同定するためには、
VL領域のアミノ末端から約24番目のアミノ酸残基から出発する;
CDR−L1配列の前の残基は常にシステイン(C)である;
CDR−L1配列の後の残基は常にトリプトファン(W)残基であり、典型的にはTrp−Tyr−Gln(W−Y−Q)であるが、Trp−Leu−Gln(W−L−Q)、Trp−Phe−Gln(W−F−Q)及びTrp−Tyr−Leu(W−Y−L)でもよい;
長さは典型的には10〜17アミノ酸残基である。
VL領域のアミノ末端から約24番目のアミノ酸残基から出発する;
CDR−L1配列の前の残基は常にシステイン(C)である;
CDR−L1配列の後の残基は常にトリプトファン(W)残基であり、典型的にはTrp−Tyr−Gln(W−Y−Q)であるが、Trp−Leu−Gln(W−L−Q)、Trp−Phe−Gln(W−F−Q)及びTrp−Tyr−Leu(W−Y−L)でもよい;
長さは典型的には10〜17アミノ酸残基である。
CDR−L2アミノ酸配列を同定するためには、
常にCDR−L1の末端から16番目の残基から出発する;
CDR−L2配列の前の残基は一般にIle−Tyr(I−Y)であるが、Val−Tyr(V−Y)、Ile−Lys(I−K)及びIle−Phe(I−F)でもよい;
長さは常に7アミノ酸残基である。
常にCDR−L1の末端から16番目の残基から出発する;
CDR−L2配列の前の残基は一般にIle−Tyr(I−Y)であるが、Val−Tyr(V−Y)、Ile−Lys(I−K)及びIle−Phe(I−F)でもよい;
長さは常に7アミノ酸残基である。
CDR−L3アミノ酸配列を同定するためには、
常にCDR−L2の末端から33番目のアミノ酸から出発する;
CDR−L3アミノ酸配列の前の残基は常にシステイン(C)である;
CDR−L3配列の後の残基は常にPhe−Gly−X−Gly(F−G−X−G)(配列番号7)であり、ここでXは任意アミノ酸である;
長さは典型的には7〜11アミノ酸残基である。
常にCDR−L2の末端から33番目のアミノ酸から出発する;
CDR−L3アミノ酸配列の前の残基は常にシステイン(C)である;
CDR−L3配列の後の残基は常にPhe−Gly−X−Gly(F−G−X−G)(配列番号7)であり、ここでXは任意アミノ酸である;
長さは典型的には7〜11アミノ酸残基である。
CDR−H1アミノ酸配列を同定するためには、
VH領域のアミノ末端から約31番目のアミノ酸残基で常にシステイン(C)から9番目の残基から出発する;
CDR−H1配列の前の残基は常にCys−X−X−X−X−X−X−X−X(配列番号151)であり、ここでXは任意アミノ酸である;
CDR−H1配列の後の残基は常にTrp(W)であり、典型的にはTrp−Val(W−V)であるが、Trp−Ile(W−I)及びTrp−Ala(W−A)でもよい;
長さは典型的には5〜7アミノ酸残基である。
VH領域のアミノ末端から約31番目のアミノ酸残基で常にシステイン(C)から9番目の残基から出発する;
CDR−H1配列の前の残基は常にCys−X−X−X−X−X−X−X−X(配列番号151)であり、ここでXは任意アミノ酸である;
CDR−H1配列の後の残基は常にTrp(W)であり、典型的にはTrp−Val(W−V)であるが、Trp−Ile(W−I)及びTrp−Ala(W−A)でもよい;
長さは典型的には5〜7アミノ酸残基である。
CDR−H2アミノ酸配列を同定するためには、
常にCDR−H1の末端から15番目のアミノ酸残基から出発する;
CDR−H2配列の前の残基は典型的にはLeu−Glu−Trp−Ile−Gly(L−E−W−I−G)(配列番号8)であるが、他の変形でもよい;
CDR−H2配列の後の残基はLys/Arg−Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala−Thr/Ser/Ile/Ala(K/R−L/I/V/F/T/A−T/S/I/A)である;
長さは典型的には16〜19アミノ酸残基である。
常にCDR−H1の末端から15番目のアミノ酸残基から出発する;
CDR−H2配列の前の残基は典型的にはLeu−Glu−Trp−Ile−Gly(L−E−W−I−G)(配列番号8)であるが、他の変形でもよい;
CDR−H2配列の後の残基はLys/Arg−Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala−Thr/Ser/Ile/Ala(K/R−L/I/V/F/T/A−T/S/I/A)である;
長さは典型的には16〜19アミノ酸残基である。
CDR−H3アミノ酸配列を同定するためには、
常にCDR−H2の末端から33番目のアミノ酸残基で常にシステイン(C)から3番目の残基から出発する;
CDR−H3配列の前の残基は常にCys−X−X(C−X−X)(ここでXは任意アミノ酸である)であり、典型的にはCys−Ala−Arg(C−A−R)である;
CDR−H3配列の後の残基は常にTrp−Gly−X−Gly(W−G−X−G)(配列番号9)であり、ここでXは任意アミノ酸である;
長さは典型的には3〜25アミノ酸残基である。
常にCDR−H2の末端から33番目のアミノ酸残基で常にシステイン(C)から3番目の残基から出発する;
CDR−H3配列の前の残基は常にCys−X−X(C−X−X)(ここでXは任意アミノ酸である)であり、典型的にはCys−Ala−Arg(C−A−R)である;
CDR−H3配列の後の残基は常にTrp−Gly−X−Gly(W−G−X−G)(配列番号9)であり、ここでXは任意アミノ酸である;
長さは典型的には3〜25アミノ酸残基である。
本願で使用する「アクセプター」及び「アクセプター抗体」なる用語はフレームワーク領域の1個以上のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は100%を提供又はコードする抗体又は核酸配列を意味する。所定態様において、「アクセプター」なる用語は定常領域を提供又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を意味する。更に別の態様において、「アクセプター」なる用語はフレームワーク領域と定常領域の1個以上を提供又はコードする抗体アミノ酸又は核酸配列を意味する。特定態様において、「アクセプター」なる用語はフレームワーク領域の1個以上のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は100%を提供又はコードするヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を意味する。この態様によると、アクセプターはヒト抗体の1以上の特定位置に存在しないアミノ酸残基を少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、又は少なくとも10個含むことができる。アクセプターフレームワーク領域及び/又はアクセプター定常領域は例えば生殖細胞系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体(例えば当分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販抗体)から入手又は取得することができる。
本願で使用する「カノニカル」残基なる用語はChothia et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901−917及びChothia et al.(1992)J.Mol.Biol.227:799−817により定義されているように特定カノニカルCDR構造を規定するCDR又はフレームワークにおける残基を意味する。Chothiaらによると、多くの抗体のCDRの必須部分はアミノ酸配列レベルでは多様性に富んでいるにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとる。各カノニカル構造はループを形成するアミノ酸残基の連続セグメントについて主に1組のペプチド主鎖ねじれ角を指定する。
本願で使用する「ドナー」及び「ドナー抗体」なる用語は1個以上のCDRを提供する抗体を意味する。1態様において、ドナー抗体はフレームワーク領域の取得源又は入手源である抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体に関連して「ドナー抗体」なる用語は1個以上のCDRを提供する非ヒト抗体を意味する。
本願で使用する「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」なる用語は可変領域からCDRを除いた残りの配列を意味する。CDR配列の厳密な定義は種々のシステムにより決定することができるので、フレームワーク配列の意味は相応に種々に解釈される。6個のCDR(軽鎖のCDR−L1、L2及びL3と重鎖のCDR−H1、H2及びH3)は軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を更に各鎖で4個のサブ領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)に分割し、CDR1はFR1とFR2の間、CDR2はFR2とFR3の間、CDR3はFR3とFR4の間に位置する。個々のサブ領域をFR1、FR2、FR3又はFR4と特定せずに、単にフレームワーク領域と言う場合もあるが、その場合には、1本の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内のFR全体を意味する。本願で使用するFRとは4個のサブ領域の1個を意味し、FRsとはフレームワーク領域を構成する4個のサブ領域の2個以上を意味する。
ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当分野で公知である。本発明の1態様において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は表3及び表4に記載する配列から選択される。
本願で使用する「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子フラグメント」なる用語は特定の免疫グロブリンの発現のために遺伝子再構成と突然変異を誘導する成熟プロセスを受けていない非リンパ細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を意味する(例えばShapiro et al.(2002)Crit.Rev.Immunol.22(3):183−200;Marchalonis et al.(2001)Adv.Exp.Med.Biol.484:13−30参照)。本発明の各種態様により提供される利点の1つは生殖細胞系列抗体遺伝子が成熟抗体遺伝子よりも種における個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存する傾向が強く、従ってこの種で治療に使用した場合に外来源に由来するとみなしにくいという認識に基づく。
本願で使用する「キー」残基なる用語は抗体、特にヒト化抗体の結合特異性及び/又は親和性に強く影響する可変領域内の所定の残基を意味する。キー残基としては限定されないが、CDRに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位(N−グリコシル化部位でもO−グリコシル化部位でもよい)、希少残基、抗原と相互作用することが可能な残基、CDRと相互作用することが可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間のコンタクト残基、バーニアゾーン内の残基、及びChothiaの定義による重鎖可変領域CDR1とKabatの定義による最初の重鎖フレームワークの間でオーバーラップする領域における残基の1種以上が挙げられる。
「ヒト化抗体」なる用語は非ヒト種(例えばマウス)に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/又はVL配列の少なくとも一部が「ヒト類似性」を増すように、即ちヒト生殖細胞系列可変配列との類似性を増すように改変された抗体を意味する。ヒト化抗体の1例は対応する非ヒトフレームワーク(FR)配列に置換えるように非ヒトCDR配列をヒトVH及びVL配列に導入したCDR移植抗体である。例えば、「ヒト化抗体」は目的抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列をもつフレームワーク(FR)領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域(CDR)を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログもしくはフラグメントである。CDRに関連して本願で使用する「実質的に」なる用語は非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%一致するアミノ酸配列をもつCDRを意味する。ヒト化抗体はCDR領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン(即ちドナー抗体)のCDR領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である少なくとも1個、典型的には2個の可変領域(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)の実質的に全部を含む。1態様において、ヒト化抗体は更に免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定態様において、ヒト化抗体は軽鎖と重鎖の少なくとも可変領域を含む。抗体は更に重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域を含むことができる。所定態様において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。所定態様において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定態様において、ヒト化抗体は軽鎖のヒト化可変領域及び/又はヒト化重鎖のみを含む。
ヒト化抗体はIgM、IgG、IgD、IgA及びIgEを含む任意クラスの免疫グロブリンと、限定されないが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む任意アイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は2種以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当分野で周知の技術を使用して所望エフェクター機能を最適化するように特定定常領域を選択することができる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域とCDR領域は親配列に厳密に対応する必要はなく、例えばその部位のCDR又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しないように少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失によりドナー抗体CDR又はコンセンサスフレームワークを突然変異誘発してもよい。しかし、1態様において、このような突然変異は広範にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、及び少なくとも95%が親FR及びCDR配列に対応する。本願で使用する「コンセンサスフレームワーク」なる用語はコンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を意味する。本願で使用する「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は近縁免疫グロブリン配列のファミリーに最高頻度で存在するアミノ酸(又はヌクレオチド)から形成される配列を意味する(例えばWinnaker(1987)From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany参照)。従って、「コンセンサス免疫グロブリン配列」は「コンセンサス可変領域」及び/又は「コンセンサス定常領域」を含むことができる。更に、「コンセンサス可変領域」は1個以上の「コンセンサスフレームワーク領域」及び/又は1個以上の「コンセンサスCDR」を含むことができる。免疫グロブリンファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置はこのファミリーでこの位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占有される。2種類のアミノ酸が同等の高頻度で存在する場合には、どちらをコンセンサス配列に加えてもよい。
本願で使用する「バーニア」ゾーンなる用語はFoote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487−499に記載されているようにCDR構造を調整することができ、抗原に合わせて微調整することができるフレームワーク残基のサブセットを意味する。バーニアゾーン残基はCDRの基層を形成し、CDRの構造と抗体の親和性に影響を与える可能性がある。
「多価結合性蛋白質」なる用語は本明細書では2個以上の抗原結合部位を含む結合性蛋白質の意味で使用する。多価結合性蛋白質は3個以上の抗原結合部位をもつように構築され、一般に天然抗体以外のものである。「多重特異性結合性蛋白質」なる用語は2種以上の近縁又は非近縁ターゲットと結合することが可能な結合性蛋白質を意味する。複可変領域(DVD)結合性蛋白質は2個以上の抗原結合部位を含む結合性蛋白質であり、4価以上の多価結合性蛋白質である。このようなDVD結合性蛋白質は単一特異性、即ち1種類の抗原と結合可能でもよいし、多重特異性、即ち2種類以上の抗原と結合可能でもよい。2本の重鎖DVDポリペプチドと2本の軽鎖DVDポリペプチドを含むDVD結合性蛋白質をDVD−Ig(登録商標)分子と言う。DVD−Ig分子の各半分は重鎖DVD−Igポリペプチドと、軽鎖DVDポリペプチドと、2個の抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、抗原結合部位当たり合計6個のCDRが抗原結合に関与する。DVD結合性蛋白質とDVD結合性蛋白質の作製方法は本願に援用する米国特許第7,612,181号に開示されている。
本発明の1側面はヒトIL−1αと結合することが可能な結合性蛋白質を含むDVD結合性蛋白質に関する。別の側面において、DVD結合性蛋白質はIL−1αと第2のターゲットとに結合することが可能である。1態様において、DVD結合性蛋白質はIL−1αとIL−1βとに結合することが可能である。
「中和」なる用語は結合性蛋白質がサイトカインと特異的に結合する場合のサイトカインの生物学的活性の中和を意味する。1態様において、中和結合性蛋白質はhIL−1αと結合することによりhIL−1αの生物学的活性を阻害する中和抗体である。1態様において、中和結合性蛋白質はhIL−1αと結合し、hIL−1αの生物学的活性を少なくとも約20%、少なくとも約40%、少なくとも約60%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、又は少なくとも約100%低下させる。中和結合性蛋白質によるhIL−1αの生物学的活性の阻害は当分野で周知のhIL−1α生物学的活性の1種以上の指標を測定することにより判定することができる。
「エピトープ」なる用語は免疫グロブリン又はT細胞受容体と特異的に結合することが可能な任意ポリペプチド決定基を包含する。所定態様において、エピトープ決定基はアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の化学的に活性な表面分子群を含み、所定態様では、特定の三次元構造特徴及び/又は特定の電荷特徴をもつ場合がある。エピトープは抗体と結合する抗原の1領域である。従って、エピトープは特異的結合パートナー上の相補的部位と結合することが分かっている抗原(又はそのフラグメント)の1領域のアミノ酸残基から構成される。抗原フラグメントは2個以上のエピトープを含むことができる。所定態様において、抗体は蛋白質及び/又は巨大分子の複雑な混合物中でそのターゲット抗原を認識するときに抗原と特異的に結合すると言う。抗体が交差競合する(一方が他方の結合又は変調作用を妨害する)場合に抗体は「同一エピトープと結合する」と言う。更に、エピトープの構造定義(オーバーラップ、類似、一致)も有益であるが、機能定義のほうが構造(結合)パラメータと機能(変調、競合)パラメータを含むため、適切であることが多い。
「表面プラズモン共鳴」なる用語は例えばBIACORE(登録商標)システム(GE Healthcareの子会社であるBiacore International AB,Uppsala,Sweden及びPiscataway,New Jersey)を使用してバイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を意味する。更に詳細については、Jonsson,U.et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19−26;Jonsson,U.et al.(1991)BioTtechniques 11:620−627;Johnsson,B.et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125−131;及びJohnsson,B.et al.(1991)Anal.Biochem.198:268−277参照。
「Kon」なる用語は当分野で公知の通り、結合性蛋白質(例えば抗体)が抗原と会合して例えば抗体/抗原複合体を形成する会合速度定数を意味する。「Kon」は「会合速度定数」又は「ka」の用語でも呼ばれ、本願では同義に使用する。抗体とその標的抗原の結合速度ないし抗体と抗原の間の複合体形成速度を表すこの数値は式:
抗体(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab−Ag
でも示される。
抗体(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab−Ag
でも示される。
「Koff」なる用語は当分野で公知の通り、結合性蛋白質(例えば抗体)が例えば抗体/抗原複合体から解離する解離速度定数を意味する。「Koff」は「解離速度定数」又は「kd」の用語でも呼ばれ、本願では同義に使用する。この数値は下式:
Ab+Ag←Ab−Ag
により示されるように、抗体がその標的抗原から解離する速度ないしAb−Ag複合体が経時的に遊離抗体及び抗原に分離する速度を表す。
Ab+Ag←Ab−Ag
により示されるように、抗体がその標的抗原から解離する速度ないしAb−Ag複合体が経時的に遊離抗体及び抗原に分離する速度を表す。
「平衡解離定数」又は「KD」なる用語は本願では同義に使用し、平衡状態における滴定測定で得られる数値又は解離速度定数(koff)を会合速度定数(kon)で割ることにより得られる数値を意味する。会合速度定数、解離速度定数及び平衡解離定数は抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。会合速度定数と解離速度定数の測定方法は当分野で周知である。蛍光技術を使用すると、高感度が得られ、平衡状態の生理的緩衝液中のサンプルを試験することができる。BIACORE(登録商標)(生体分子相互作用分析)アッセイ等の他の実験アプローチ及び機器(例えばGE Healthcareの子会社であるBiacore International AB,Uppsala,Swedenから市販されている機器)も使用できる。更に、Sapidyne Instruments(Boise,Idaho)から市販されているKinExA(登録商標)(結合平衡除外法)も使用することができる。
本願で使用する「標識結合性蛋白質」なる用語は結合性蛋白質を識別できるようにラベルを付加した蛋白質を意味する。1側面において、ラベルは検出可能なマーカーであり、例えば放射性標識アミノ酸を付加する方法や、標識アビジン(例えば蛍光マーカー又は光学的方法もしくは比色法により検出可能な酵素活性を付加したストレプトアビジン)により検出可能なビオチニル部分をポリペプチドに結合する方法が挙げられる。ポリペプチドのラベルの例としては限定されないが、放射性同位体ないし放射性核種(例えば3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho、及び153Sm)、蛍光ラベル(例えばFITC、ローダミン及びランタニド蛍光体)、酵素ラベル(例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定ポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン及びエピトープタグ)及び磁性物質(例えばガドリニウムキレート)が挙げられる。
「抗体コンジュゲート」なる用語は第2の化学部分(例えば治療剤や細胞傷害性物質)と化学的に結合した結合性蛋白質(例えば抗体)を意味する。「作用剤」なる用語は本願では化合物、化合物の混合物、生体巨大分子又は生体物質から作製された抽出物の意味で使用する。1側面において、治療剤又は細胞傷害性物質としては限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそのアナログ又はホモログが挙げられる。
「結晶」及び「結晶化」なる用語は結晶形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を意味する。結晶は物質の固体状態の1形態であり、非晶質固体状態や液体結晶状態等の他の形態から区別される。結晶は原子、イオン、分子(例えば抗体等の蛋白質)、又は分子集合体(例えば抗原/抗体複合体)の規則的な繰り返し三次元配列から構成される。これらの三次元配列は当分野で周知の特定の数学的関係に従って配置されている。結晶中で繰り返している基本単位ないし構成単位を非対称単位と言う。所定の明確な結晶対称性に一致する配置で非対称単位が繰り返すことにより、結晶の「単位格子」を構成する。単位格子が全3方向に規則的並進により繰り返すことにより、結晶を構成する。Giege and Ducruix(1999)Chapter 1,In Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach,2nd ed.,(Ducruix and Giege,eds.)(Oxford University Press,New York,1999)pp.1−16参照。
「ポリヌクレオチド」なる用語はリボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか又はこれらのいずれかの型のヌクレオチドの修飾物である2個以上のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。この用語は1本鎖形態と2本鎖形態のDNA又はRNAを含むが、1態様では2本鎖DNAである。
「単離ポリヌクレオチド」なる用語は自然界で会合しているポリヌクレオチド、自然界で機能的に連結しているポリヌクレオチド、又はより長い配列の一部として自然界に存在するポリヌクレオチドの全部又は一部と会合していない(例えばゲノム、cDNAもしくは合成由来又はその組合せの)ポリヌクレオチドを意味する。
「ベクター」なる用語はこれに連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。ベクターの1例は別のDNAセグメントをライゲーションすることができる環状2本鎖DNAループを意味する「プラスミド」である。ベクターの別の例は別のDNAセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができるウイルスベクターである。所定のベクターはこれらのベクターを導入する宿主細胞で自律複製することができる(例えば細菌複製起点をもつ細菌ベクターやエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)も宿主細胞に導入後に宿主細胞のゲノムに組込むことができ、宿主ゲノムと共に複製される。更に、所定のベクターはこれらのベクターを機能的に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターを本願では「組換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と言う。一般に、組換えDNA技術で有用な発現ベクターはプラスミド形態であることが多い。プラスミドは最も広く使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」を同義に使用する場合がある。しかし、本発明はウイルスベクター(例えば複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)等の同等機能をもつこのような他の形態の発現ベクターも包含するものとする。
「機能的に連結」なる用語は成分をその目的通りに機能できるように配置することを意味する。コーディング配列と「機能的に連結」された制御配列は制御配列に適合可能な条件下でコーディング配列の発現が実現されるようにライゲーションされている。「機能的に連結」された配列としては、目的遺伝子に隣接する発現制御配列、イントランスで作用する発現制御配列、即ち目的核酸とは異なる核酸分子に配置されているが、目的核酸を制御する発現制御配列、及び目的核酸と同一の核酸分子上ではあるが、目的核酸から距離を隔てて配置された発現制御配列が挙げられる。本願で使用する「発現制御配列」なる用語はこの配列がライゲーションされたコーディング配列の発現とプロセシングを行うために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列及びエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル(例えばスプライシングシグナルやポリアデニル化シグナル);細胞質mRNAを安定化させる配列;翻訳効率を強化する配列(即ちコザックコンセンサス配列);蛋白質安定性を強化する配列;更には所望により、蛋白質分泌を強化する配列が挙げられる。このような制御配列の種類は宿主生物により異なり、原核生物では、このような制御配列としては一般にプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が挙げられ、真核生物では、一般にこのような制御配列としてはプロモーターと転写終結配列が挙げられる。「制御配列」なる用語はその存在が発現とプロセシングに必須である成分を包含するものとし、更に存在していると有利である別の成分(例えばリーダー配列や融合パートナー配列)も包含することができる。
「形質転換」とは外来DNAが宿主細胞に導入される任意プロセスを意味する。形質転換は外来核酸配列を例えば原核又は真核宿主細胞に挿入するために当分野で周知の各種方法を使用して天然又は人工条件下に実施することができる。方法は形質転換する宿主細胞に基づいて選択され、限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子撃ち込みが挙げられる。このような「形質転換」細胞としては、挿入されたDNAが自律複製プラスミド又は宿主染色体の一部として複製できる安定型形質転換細胞が挙げられる。更に、挿入されたDNA又はRNAを限定期間だけ一過的に発現する細胞も挙げられる。
本願で使用する「組換え宿主細胞」(又は単に「宿主細胞」)なる用語は外来DNAが導入された細胞を意味する。このような用語は特定対象細胞のみならず、このような細胞の子孫も意味する。後続世代には突然変異又は環境影響により所定の変異が生じる場合があるので、このような子孫は実際には親細胞と同一でない場合もあるが、本願で使用する「宿主細胞」なる用語の範囲に含まれる。1側面において、宿主細胞としては生物界の任意のものから選択される原核細胞と真核細胞が挙げられる。真核細胞としては原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞及び動物細胞が挙げられる。別の態様において、宿主細胞としては限定されないが、原核細胞株である大腸菌;哺乳動物細胞株であるCHO、HEK293及びCOS;昆虫細胞株であるSf9;並びに真菌細胞であるSaccharomyces cerevisiaeが挙げられる。
組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換(例えばエレクトロポレーション及びリポフェクション)には標準技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は製造業者の指示に従うか、当分野で広く実施されている方法に従うか、又は本願の記載に従って実施することができる。上記技術及び手順は当分野で周知の慣用方法に従い、本明細書の随所に引用及び説明する各種一般資料及び特定資料に記載されているように一般に実施することができる。例えばSambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York 1989)参照。
「トランスジェニック生物」なる用語は細胞にトランスジーンを導入した生物を意味し、生物(又は生物の祖先)に導入されたトランスジーンはこの生物で天然には発現されないポリペプチドを発現する。「トランスジーン」はトランスジェニック生物の発生源である細胞のゲノムに安定的且つ機能的に組込まれ、トランスジェニック生物の1種以上の細胞種又は組織においてコードされる遺伝子産物の発現を誘導するDNAコンストラクトである。
「調節」及び「変調」なる用語は同義に使用し、目的分子の活性(例えばhIL−1αの生物学的活性)の変更又は改変を意味する。変調は目的分子の所定活性又は機能の強さの増減とすることができる。分子の典型的な活性及び機能としては限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が挙げられる。
これに対応して、「モジュレーター」なる用語は目的分子の活性又は機能(例えばhIL−1αの生物学的活性)を変更又は改変することが可能な化合物である。例えば、モジュレーターはモジュレーターの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子の所定活性又は機能の強さを増減させることができる。所定態様において、モジュレーターは分子の少なくとも1種の活性又は機能の強さを低下させる阻害剤である。典型的な阻害剤としては限定されないが、蛋白質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、糖質又は有機低分子が挙げられる。ペプチボディは例えばPCT公開第WO01/83525号に記載されている。
「アゴニスト」なる用語は目的分子と接触した場合に、アゴニストの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子の所定活性又は機能の強さを増加させるモジュレーターを意味する。特定の有用なアゴニストとしては限定されないが、ポリペプチド、核酸、糖質、又はIL−1α及び/もしくはIL−1βと結合する他の任意分子が挙げられる。
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」なる用語は目的分子と接触した場合に、アンタゴニストの不在下で観察される活性又は機能の強さに比較して分子の所定活性又は機能の強さを低下させるモジュレーターを意味する。アンタゴニストとしては、IL−1α及び/又はIL−1βの生物学的活性又は免疫活性を阻害又は変調させるものが挙げられる。IL−1αのアンタゴニスト及び阻害剤としては限定されないが、ポリペプチド、核酸、糖質、又はIL−1αと結合する他の任意分子が挙げられる。IL−1βのアンタゴニスト及び阻害剤としては限定されないが、ポリペプチド、核酸、糖質、又はIL−1βと結合する他の任意分子が挙げられる。
「有効量」なる用語は障害又はその1種以上の症状の重篤度及び/又は持続期間を低減又は改善するため、障害の進行を予防するため、障害の軽減を誘導するため、障害に伴う1種以上の症状の再発、発現、発症又は進行を予防するため、障害を検出するため、あるいは別の療法(例えば予防剤又は治療剤)の予防又は治療効果を強化又は改善するために十分な療法の量を意味する。
「サンプル」なる用語はその最も広義な意味で使用する。「生体サンプル」としては限定されないが、生体又はかつての生体に由来する任意量の物質が挙げられる。このような生体としては限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ及び他の動物が挙げられる。このような物質としては限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節及び脾臓が挙げられる。
「親和性成熟」抗体とは1個以上のCDR又はそのフレームワークの1カ所以上の改変の結果、このような改変をもたない親抗体に比較して抗体の抗原親和性が改善された抗体である。好ましい親和性成熟抗体は標的抗原に対する親和性値がナノモル又はピコモルとなる。親和性成熟抗体は当分野で公知の方法により生産される。Marks et al.(1992),Bio/Technology 10:779−783はVH及びVL領域シャフリングによる親和性成熟について記載している。CDR及び/又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発はBarbas et al.(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809−3813;Scier et al.(1995)Gene 169:147−155;Yelton et al.(1995)J.Immunol.155:1994−2004;Jackson et al.(1995)J.Immunol.154(7):3310−3319;及びHawkins et al.1992)J.Mol Biol.226:889−896に記載されている。
疼痛の初期原因が消滅した後も個体に持続する疼痛はもはや症状ではなく、それ自体が認定された疾患となる。本願で使用する「アロディニア」なる用語は個体が皮膚のブラシ擦過等の典型的には機械的な種類の一般に無害な刺激に対する疼痛反応を生じる状態を意味する。アロディニア疼痛は侵害受容器を介さないので、「非侵害受容性」疼痛と言う場合もある。本願で使用する「痛覚過敏」なる用語は有害な刺激、特に疼痛性の機械的、熱的又は化学的刺激等の侵害受容器を活性化させる刺激に起因する疼痛に対して個体の感受性が亢進している状態を意味する。侵害受容器を活性化させる刺激は疼痛の原因となる。痛覚過敏は通常では有害な刺激に対して個体の疼痛反応が亢進している状態である。個体はアロディニア、痛覚過敏、又はアロディニアと痛覚過敏の併発を生じる場合がある。
I.IL−1α及びIL−1βと結合するDVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質の作製
1以上の標的抗原(又はエピトープ)と結合することが可能な二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig(登録商標))結合性蛋白質の設計と作製については記載されている(例えば公開第WO2007/024715号参照)。本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物で有用なDVD−Ig結合性蛋白質はIL−1α及びIL−1βと結合する。1態様において、DVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質は少なくとも2本のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、前記式中、VD1は第1の重鎖可変領域であり、VD2は第2の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域であり、X1はリンカーであり、但し、CH1以外のものであり、X2はFc領域であり;第2のポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、前記式中、VD1は第1の軽鎖可変領域であり、VD2は第2の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域であり、X1はリンカーであり、但しCH1以外のものであり、X2はFc領域を含まず;nは0又は1である。第1及び第2のポリペプチド鎖から構成されるDVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質は2個の抗原結合部位をもつ。
1以上の標的抗原(又はエピトープ)と結合することが可能な二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig(登録商標))結合性蛋白質の設計と作製については記載されている(例えば公開第WO2007/024715号参照)。本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物で有用なDVD−Ig結合性蛋白質はIL−1α及びIL−1βと結合する。1態様において、DVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質は少なくとも2本のポリペプチド鎖を含み、第1のポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、前記式中、VD1は第1の重鎖可変領域であり、VD2は第2の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域であり、X1はリンカーであり、但し、CH1以外のものであり、X2はFc領域であり;第2のポリペプチド鎖はVD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、前記式中、VD1は第1の軽鎖可変領域であり、VD2は第2の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域であり、X1はリンカーであり、但しCH1以外のものであり、X2はFc領域を含まず;nは0又は1である。第1及び第2のポリペプチド鎖から構成されるDVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質は2個の抗原結合部位をもつ。
別の態様において、DVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質は4本のポリペプチド鎖を含み、第1の2本の各ポリペプチド鎖は夫々VD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、前記式中、VD1は第1の重鎖可変領域であり、VD2は第2の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域であり、X1はリンカーであり、但しCH1以外のものであり、X2はFc領域であり;第2の2本の各ポリペプチド鎖は夫々VD1−(X1)n−VD2−C−(X2)nを含み、前記式中、VD1は第1の軽鎖可変領域であり、VD2は第2の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域であり、X1はリンカーであり、但しCH1以外のものであり、X2はFc領域を含まず;nは0又は1である。このようなDVD−Ig(登録商標)結合性蛋白質は4個の抗原結合部位をもつ。
例えば、個体における変形性関節症を治療するための本願に記載する方法及び組成物で有用なDVD−Ig結合性蛋白質は前記2本のポリペプチド(第1及び第2のポリペプチド)のVD1可変領域の会合により形成されるIL−1βの結合部位と、前記2本のポリペプチド(第1及び第2のポリペプチド)のVD2可変領域の会合により形成されるIL−1αの結合部位をもつように構築することができる。代替構成において、個体における変形性関節症を治療するための本願に記載する方法及び組成物で有用なDVD−Ig結合性蛋白質は前記2本のポリペプチド(第1及び第2のポリペプチド)のVD1可変領域の会合により形成されるIL−1αの結合部位と、前記2本のポリペプチド(第1及び第2のポリペプチド)のVD2可変領域の会合により形成されるIL−1βの結合部位をもつものでもよい。
A.親モノクローナル抗体の作製
DVD結合性蛋白質の可変領域は目的抗原と結合することが可能なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む親抗体から得ることができる。これらの抗体は天然に存在するものでもよいし、組換え技術により作製したものでもよい。
DVD結合性蛋白質の可変領域は目的抗原と結合することが可能なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む親抗体から得ることができる。これらの抗体は天然に存在するものでもよいし、組換え技術により作製したものでもよい。
モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術又はその組合せの使用を含む当分野で公知の多様な技術を使用して作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は例えばHarlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,2nd ed.,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988);Hammerling,et al.,Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas(Elsevier,N.Y.,1981),pages 563−581(前記文献はその内容全体を本願に援用する)に教示されている当分野で公知の技術等のハイブリドーマ技術を使用して産生させることができる。本願で使用する「モノクローナル抗体」(略称「mAb」)なる用語はハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」なる用語は任意の真核、原核又はファージクローン等の単一クローンに由来する抗体を意味し、その産生方法に限定されない。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、標準方法を使用して活発なハイブリドーマ増殖、高い抗体産生及び望ましい抗体特性を含む望ましい特性について更にスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、同系動物、免疫系を欠損する動物(例えばヌードマウス)でインビボ増殖させるか、あるいは細胞培養でインビトロ増殖させる。ハイブリドーマの選択、クローニング及び増殖方法は当業者に周知である。好ましい態様において、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の態様において、ハイブリドーマは非ヒト非マウス種(例えばラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマ)で産生される。別の態様において、ハイブリドーマはIL−1αやIL−1β等の特定の望ましい抗原と結合することが可能な抗体を発現するヒト細胞にヒト非分泌型骨髄腫細胞を融合したヒトハイブリドーマである。
米国特許第5,627,052号、PCT公開第WO92/02551号及びBabcook et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843−7848に記載されているように、選択的リンパ球抗体法(SLAM)と当分野で呼ばれる方法を使用して単一の単離リンパ球から組換えモノクローナル抗体を作製してもよい。この方法では、目的抗体を分泌する単一細胞(例えば免疫した動物に由来するリンパ球)を同定し、重鎖及び軽鎖可変領域cDNAを逆転写酵素−PCRにより細胞からレスキューした後、これらの可変領域をCOS又はCHO細胞等の哺乳動物宿主細胞で適切な免疫グロブリン定常領域(例えばヒト定常領域)のコンテキストにおいて発現させることができる。インビボ選択したリンパ球に由来する増幅後の免疫グロブリン配列をトランスフェクトした宿主細胞をその後、例えばトランスフェクトした細胞をパンニングして目的抗原に対する抗体を発現する細胞を単離することにより、更にインビトロ解析及び選択することができる。増幅後の免疫グロブリン配列をPCT公開第WO97/29131号及びPCT公開第WO00/56772号に記載されている方法等のインビトロ親和性成熟法等により更にインビトロ操作することができる。
ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全部を含む非ヒト動物に目的抗原を免疫することによりモノクローナル抗体を産生させてもよい。1態様において、非ヒト動物はヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きなフラグメントを含み且つマウス抗体産生を欠損する遺伝子組換えマウス系列であるXENOMOUSEトランスジェニックマウスである。例えば、Green et al.(1994)Nature Genet.7:13 21並びに米国特許第5,916,771号;5,939,598号;5,985,615号;5,998,209号;6,075,181号;6,091,001号;6,114,598号及び6,130,364号参照。更にPCT公開第WO91/10741号;WO94/02602号;WO96/34096号;WO96/33735号;WO98/16654号;WO98/24893号;WO98/50433号;WO99/45031号;WO99/53049号;WO00/09560号;及びWO00/37504号も参照。XENOMOUSEトランスジェニックマウスは全長ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトヒトモノクローナル抗体を産生する。XENOMOUSEトランスジェニックマウスはヒト重鎖遺伝子座とχ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列構成YACフラグメントの導入によりヒト抗体レパートリーの約80%を含む。Mendez et al.(1997)Nature Genet.15:146−156及びGreen and Jakobovits(1998)J.Exp.Med.188:483−495参照。
抗体ライブラリーをスクリーニングして所望の結合特異性をもつ抗体を同定するインビトロ法を使用して親抗体を作製することもできる。組換え抗体ライブラリーのこのようなスクリーニング方法は当分野で周知であり、例えば米国特許第5,223,409号;PCT公開第WO92/18619号、WO91/17271号、WO92/20791号、WO92/15679号、WO93/01288号、WO92/01047号、WO92/09690号、WO97/29131号;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1369−1372;Hay et al.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3:81−85;Huse et al.(1989)Science 246:1275−1281;McCafferty et al.(1990)Nature 348:552−554;Griffiths et al.(1993)EMBO J.12:725−734;Hawkins et al.(1992)J.Mol.Biol.226:889−896;Clackson et al.(1991)Nature 352:624−628;Gram et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3576−3580;Garrard et al.(1991)Bio/Technology 9:1373−1377;Hoogenboom et al.(1991)Nucl.Acids Res.19:4133−4137;Barbas et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978−7982及び米国特許公開第2003/0186374号に記載されている方法が挙げられる。
本発明で有用な親抗体は当分野で公知の各種ファージブィスプレイ法を使用して作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子表面にこれらの抗体ドメインを提示させる。特に、このようなファージを利用してレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えばヒト又はマウス)から発現される抗原結合ドメインを提示させることができる。抗原(例えば標識抗原又は固体表面もしくはビーズに固定化もしくは捕捉した抗原)を使用して、目的抗原と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを選択又は同定することができる。これらの方法で使用されるファージは典型的にはファージ遺伝子III又は遺伝子VIII蛋白質と組換え融合したFab、Fv又はジスルフィド安定化Fv抗体ドメインをもつファージから発現されるfd及びM13結合ドメインを含む線維状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Brinkmann et al.(1995)J.Immunol.Methods 182:41−50;Ames et al.(1995)J.Immunol.Methods 184:177−186;Kettleborough et al.(1994)Eur.J.Immunol.24:952−958;Persic et al.(1997)Gene 187 9−18;Burton et al.(1994)Adv.Immunol.57:191−280;PCT出願第PCT/GB91/01134号;PCT公開第WO90/02809号;WO91/10737号;WO92/01047号;WO92/18619号;WO93/11236号;WO95/15982号;及びWO95/20401号;並びに米国特許第5,698,426号;5,223,409号;5,403,484号;5,580,717号;5,427,908号;5,821,047号;5,571,698号;5,427,908号;5,516,637号;5,780,225号;5,658,727号;5,733,743号及び5,969,108号に開示されている方法が挙げられる。
上記文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージに由来する抗体コーディグ領域を単離し、これを使用してヒト抗体又は他の任意の所望抗原結合フラグメントを含む全長抗体を作製し、例えば本願に詳述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌等の任意の所望宿主で発現させることができる。例えば、PCT公開第WO92/22324号;Mullinax et al.(1992)BioTechniques 12(6):864−869;Sawai et al.(1995)Am.J.Reprod.Immunol.34:26−34;及びBetter et al.(1988)Science 240:1041−1043に開示されている方法等の当分野で公知の方法を使用してFab、Fab’及びF(ab’)2フラグメントを組換え作製するための技術を利用することもできる。1本鎖Fv及び抗体を作製するために使用することができる技術の例としては、米国特許第4,946,778号及び5,258,498号;Huston et al.(1991)Methods Enzymol.203:46−88;Shu et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:7995−7999;並びにSkerra et al.(1988)Science 240:1038−1041に記載されている技術が挙げられる。
ファージディスプレイ法により組換え抗体ライブラリーをスクリーニングする代わりに、大規模コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当分野で公知の他の方法を親抗体の同定に適用することもできる。代替発現システムの1例はSzostak and RobertsのPCT公開第WO98/31700号及びRoberts,R.W.and Szostak,J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297−12302に記載されているように、組換え抗体ライブラリーをRNA−蛋白質融合体として発現させるシステムである。このシステムでは、ペプチドアクセプター抗生物質であるピューロマイシンをその3’末端に付加した合成mRNAのインビトロ翻訳により、mRNAとこのmRNAによりコードされるペプチド又は蛋白質の共有結合的融合体を作製する。従って、コードされるペプチド又は蛋白質(例えば抗体又はその部分)の特性(例えば二重特異性抗原と抗体又はその部分の結合)に基づいてmRNAの複雑な混合物(例えばコンビナトリアルライブラリー)から特定のmRNAを集積させることができる。このようなライブラリーのスクリーニングから回収された抗体又はその部分をコードする核酸配列を上記のような組換え手段により(例えば哺乳動物宿主細胞で)発現させることができ、更に、当初に選択した配列に突然変異を導入したmRNA−ペプチド融合体のスクリーニングラウンドの追加又は上記のような組換え抗体の他のインビトロ親和性成熟法により更に親和性成熟させることができる。
別のアプローチでは、当分野で公知の酵母ディスプレイ法を使用して親抗体を作製することもできる。酵母ディスプレイ法では、遺伝子法を使用して抗体ドメインを酵母細胞壁に結合した後に酵母表面に提示させる。特に、このような酵母はレパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えばヒト又はマウス)から発現される抗原結合ドメインを提示させるために利用することができる。親抗体を作製するために使用することができる酵母ディスプレイ法の例としては、米国特許第6,699,658号に開示されている方法が挙げられる。
上記抗体を更に改変し、CDR移植ヒト化親抗体を作製することもできる。CDR移植抗体はヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み、VH及び/又はVLのCDR領域の1個以上が目的抗原と結合することが可能なマウス抗体のCDR配列で置換されている。任意ヒト抗体に由来するフレームワーク配列をCDR移植の鋳型として使用することができる。しかし、このようなフレームワークに直接鎖置換すると、抗原に対する結合親和性が多少低下することが多い。元のマウス抗体に対するヒト抗体の相同性が高いほど、マウスCDRとヒトフレームワークの結合によりCDRに歪みが導入されて親和性が低下する可能性は低くなる。従って、CDR以外のマウス可変領域フレームワークに置換するために選択されるヒト可変領域フレームワークはマウス抗体可変領域フレームワークに対して少なくとも約65%の配列一致度をもつことが好ましい。CDR以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも約70%の配列一致度をもつことがより好ましい。CDR以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも約75%の配列一致度をもつことが更に好ましい。CDR以外のヒト及びマウス可変領域は少なくとも約80%の配列一致度をもつことが最も好ましい。このような抗体の作製方法は当分野で公知であり(EP239,400号;PCT公開第WO91/09967号;米国特許第5,225,539号;5,530,101号;及び5,585,089号参照)、更にベニアリング又はリサーフェシング(EP592,106号及びEP519,596号;Padlan(1991)Mol.Immunol.28(4/5):489−498;Studnicka et al.(1994)Protein Eng.7(6):805−814;Roguska et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969−973)やチェーンシャフリング(米国特許第5,565,352号)も記載されている。
ヒト化抗体は目的抗原と結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子であり、非ヒト種に由来する1個以上の相補性決定領域(CDR)とヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域をもつ。公知ヒトIg配列は例えばwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez−/query.fcgi;www.atcc.org/phage/hdb.html;www.sciquest.com/;www.abcam.com/;www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html;www.mgen.uni−heidelberg.de/SD/IT/IT.html;www.whfreeman.com/immunology/CH−05/kuby05.htm;www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/;www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m−ikeimages.html;www.antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno−logy.html.www.immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.−html;www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/;www.pebio.com/pa/340913/340913.html−;www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;www.m.ehime−u.acjp/.about.yasuhito−/Elisa.html;www.biodesign.com/table.asp;www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin−ks.html;www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html;www.isac−net.org/sites_geo.html;aximtl.imt.uni−marburg.de/.about.rek/AEP−Start.html;baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html;www.recab.uni−hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;www.mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/pu−blic/INTRO.html;www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/;www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html;antibody.bath.ac.uk/;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem−inar/Slide01.html;www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/;www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h−umanisation/TAHHP.html;www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo−ut.fmolina/Web−pages/Pept/spottech.html;www.jerini.de/fr roducts.htm;www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.Health(1983)に開示されており、各々その開示内容全体を本願に援用する。当分野で公知の通り、このようなインポート配列を使用して免疫原性を低下させたり、結合、親和性、会合速度、解離速度、アビディティ、特異性、半減期、又は任意の他の適切な特性を低下、増加又は改変することができる。
抗原結合を改変、好ましくは改善するためには、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体に由来する対応する残基で置換すればよい。これらのフレームワーク置換は当分野で周知の方法により同定され、例えばCDR残基とフレームワーク残基の相互作用のモデル化により抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較により特定位置の異常なフレームワーク残基を同定する。例えば米国特許第5,585,089号;Riechmann et al.(1988)Nature 332:323参照。三次元免疫グロブリンモデルは広く入手可能であり、当業者に周知である。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元配座構造を図解表示するコンピュータープログラムも入手可能である。これらの表示を精査すると、候補免疫グロブリン配列の機能に残基が果たす可能性のある役割を分析することができ、即ち候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を与える残基を分析することができる。こうして、標的抗原に対する親和性の増加等の所望の抗体特性が得られるようにコンセンサス配列とインポート配列からFR残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基は抗原結合への影響に直接且つ最も実質的に関与している。当分野で公知の各種技術を使用して抗体をヒト化することができ、限定されないが、Jones et al.(1986)Nature 321:522;Verhoeyen et al.(1988)Science 239:1534;Sims et al.(1993)J.Immunol.151:2296;Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901;Carter et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285;Presta et al.(1993)J.Immunol.151:2623;Padlan(1991)Mol.Immunol.28(4/5):489−498;Studnicka et al.(1994)Protein Engineering 7(6):805−814;Roguska,et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969−973;PCT公開第WO91/09967号、WO90/14443号、WO90/14424号、WO90/14430号、WO99/06834号(PCT/US98/16280)、WO97/20032号(PCT/US96/18978)、WO92/11272号(PCT/US91/09630)、WO92/03461号(PCT/US91/05939)、WO94/18219号(PCT/US94/01234)、WO92/01047号(PCT/GB91/01134)及びWO93/06213号(PCT/GB92/01755);EP0592106号、EP0519596号、EP0239400号;米国特許第5,565,332号;5,723,323号;5,976,862号;5,824,514号;5,817,483号;5,814,476号;5,763,192号;5,723,323号;5,766,886号;5,714,352号;6,204,023号;6,180,370号;5,693,762号;5,530,101号;5,585,089号;5,225,539号;及び4,816,567号に記載されている技術が挙げられる。
親モノクローナル抗体はIL−1α又はIL−1βと結合することが可能な各種モノクローナル抗体から選択することができる。
親モノクローナル抗体は臨床試験又は臨床用開発での使用に認可されている各種治療用抗体から選択することもできる。
B.DVD−Ig分子の構築
二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子は2種類の異なる親モノクローナル抗体に由来する2個の異なる軽鎖可変領域(VL)を組換えDNA技術により直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結した後、軽鎖定常領域を連結するように設計される。同様に、重鎖はタンデムに連結された2個の異なる重鎖可変領域(VH)と、それに続く定常領域CH1とFc領域を含む。PCT公開第WO2007/024715号参照。
二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子は2種類の異なる親モノクローナル抗体に由来する2個の異なる軽鎖可変領域(VL)を組換えDNA技術により直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結した後、軽鎖定常領域を連結するように設計される。同様に、重鎖はタンデムに連結された2個の異なる重鎖可変領域(VH)と、それに続く定常領域CH1とFc領域を含む。PCT公開第WO2007/024715号参照。
可変領域は上記方法の任意1種により作製した親抗体から組換えDNA技術を使用して取得することができる。好ましい1態様において、可変領域はマウス重鎖又は軽鎖可変領域である。より好ましくは、可変領域はCDR移植又はヒト化重鎖又は軽鎖可変領域である。最も好ましくは、可変領域はヒト重鎖又は軽鎖可変領域である。
1態様では、組換えDNA技術を使用して第1の可変領域と第2の可変領域を相互に直接連結する。別の態様では、リンカー配列を介して前記可変領域を連結する。2個の可変領域を連結することが好ましい。3個以上の変領域を直接又はリンカー配列を介して連結してもよい。可変領域は同一抗原と結合するものでもよいし、異なる抗原と結合するものでもよい。本発明のDVD−Ig分子は1個の免疫グロブリン可変領域と1個の非免疫グロブリン可変領域(例えば受容体のリガンド結合領域、酵素の活性領域)を含むものでもよい。DVD−Ig分子は2個以上の非Ig領域を含むものでもよい。
リンカー配列は単一アミノ酸でもよいし、ポリペプチド配列でもよい。本願に記載する方法及び組成物で有用なDVD−Ig結合性蛋白質を設計及び作製するのに使用することができるリンカー配列の例としては、限定されないが、AKTTPKLEEGEFSEAR(配列番号59);AKTTPKLEEGEFSEARV(配列番号60);AKTTPKLGG(配列番号61);SAKTTPKLGG(配列番号62);SAKTTP(配列番号63);RADAAP(配列番号64);RADAAPTVS(配列番号65);RADAAAAGGPGS(配列番号66);RADAAAA(G4S)4(配列番号67);SAKTTPKLEEGEFSEARV(配列番号68);ADAAP(配列番号69);ADAAPTVSIFPP(配列番号70);TVAAP(配列番号71);TVAAPSVFIFPP(配列番号72);QPKAAP(配列番号73);QPKAAPSVTLFPP(配列番号74);AKTTPP(配列番号75);AKTTPPSVTPLAP(配列番号76);AKTTAP(配列番号77);AKTTAPSVYPLAP(配列番号78);ASTKGP(配列番号79);ASTKGPSVFPLAP(配列番号80);GGSGGGGSG(配列番号81); GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号82);GENKVEYAPALMALS(配列番号83);GPAKELTPLKEAKVS(配列番号84);GHEAAAVMQVQYPAS(配列番号85);TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(配列番号86);及びASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(配列番号87)が挙げられる。リンカー配列の選択は数個のFab分子の結晶構造に基づいて行われる。Fab又は抗体分子構造では可変領域とCH1/CL 定常領域の天然のフレキシブルな連結が存在する。この天然の連結はV領域のC末端からの4〜6残基とCL/CH1領域のN末端からの4〜6残基を含む約10〜12アミノ酸残基を含む。1態様において、本発明で有用なDVD−Ig分子はDVD−Ig分子の夫々軽鎖及び重鎖のリンカーとしてCL又はCH1のN末端5〜6アミノ酸残基又は11〜12アミノ酸残基を使用して作製される。CL又はCH1領域のN末端残基、特に最初の5〜6アミノ酸残基は強い二次構造をもたないループ配置をとるため、2個の可変領域間のフレキシブルなリンカーとして機能することができる。CL又はCH1領域のN末端残基は免疫グロブリン配列の一部であるので可変領域の天然の延長であり、従って、リンカーと結合部に起因する可能性のある免疫原性を最小限にすることができる。
他のリンカー配列としては、CL/CH1領域の全残基ではない任意長さのCL/CH1領域の任意配列が挙げられ、例えばCL/CH1領域の最初の5〜12アミノ酸残基が挙げられ、軽鎖リンカーはCκ又はCλに由来することができ、重鎖リンカーはCγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε及びCμを含む任意アイソタイプのCH1に由来することができる。リンカー配列はIg様蛋白質(例えばTCR、FcR、KIR)、G/S由来配列(例えばG4S(配列番号88)反復配列)、ヒンジ領域由来配列、及び他の蛋白質に由来する他の天然配列等の他の蛋白質に由来するものでもよい。
1態様では、組換えDNA技術を使用して2個の連結された可変領域に定常領域を連結する。連結された重鎖可変領域を含む配列を重鎖定常領域と連結し、軽鎖可変領域を含む配列を軽鎖定常領域と連結することが好ましい。DVD−Ig結合性蛋白質をヒトで使用する場合には、好ましくは、前記定常領域は夫々ヒト重鎖定常領域及び軽鎖定常領域である。DVD−Ig重鎖を更にFc領域と連結することが好ましい。Fc領域は天然配列Fc領域でもよいし、変異体Fc領域でもよい。最も好ましくは、前記Fc領域はヒトFc領域である。好ましい態様において、Fc領域はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE又はIgDに由来するFc領域を含む。
1態様では、2本の重鎖DVD−Igポリペプチドと2本の軽鎖DVD−Igポリペプチドを結合し、DVD−Ig分子を形成する。特定標的と結合することが可能な特定のDVD−Ig分子の例と、その作製方法の詳細については従来記載されている。例えばPCT公開第WO2007/024715号参照。
C.DVD−Ig結合性蛋白質の作製
IL−1α及びIL−1βと結合し、本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物で有用なDVD−Ig蛋白質は当分野で公知の多数の技術の任意のものにより作製することができる。例えばPCT公開第2007/024715号参照。例えば、DVD−Ig重鎖とDVD−Ig軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトして宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種語形は原核又は真核宿主細胞に外来DNAを導入するために広く使用されている多様な技術(例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、DEAE−デキストラントランスフェクション等)を包含するものとする。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でもDVD−Ig結合性蛋白質を発現させることは可能であるが、真核細胞(特に哺乳動物細胞)のほうが原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性なDVD−Ig蛋白質を組立・分泌し易いので、真核細胞でDVD−Ig蛋白質を発現させることが好ましく、哺乳動物宿主細胞で発現させることが最も好ましい。
IL−1α及びIL−1βと結合し、本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物で有用なDVD−Ig蛋白質は当分野で公知の多数の技術の任意のものにより作製することができる。例えばPCT公開第2007/024715号参照。例えば、DVD−Ig重鎖とDVD−Ig軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトして宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種語形は原核又は真核宿主細胞に外来DNAを導入するために広く使用されている多様な技術(例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、DEAE−デキストラントランスフェクション等)を包含するものとする。原核宿主細胞でも真核宿主細胞でもDVD−Ig結合性蛋白質を発現させることは可能であるが、真核細胞(特に哺乳動物細胞)のほうが原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性なDVD−Ig蛋白質を組立・分泌し易いので、真核細胞でDVD−Ig蛋白質を発現させることが好ましく、哺乳動物宿主細胞で発現させることが最も好ましい。
本発明の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えばR.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601−621に記載されているようなDHFR選択マーカーと併用されるUrlaub and Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220に記載のdhfr−CHO細胞を含む)、NS0骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞が挙げられる。DVD−Ig蛋白質をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞でDVD−Ig蛋白質を発現させるために十分な時間、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地中にDVD−Ig蛋白質を分泌させるために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することによりDVD−Ig蛋白質を産生させる。標準蛋白質精製法を使用して培養培地からDVD−Ig蛋白質を回収することができる。
本発明で有用なDVD−Ig蛋白質の好ましい組換え発現システムでは、DVD−Ig重鎖とDVD−Ig軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウムトランスフェクション法によりdhfr−CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、DVD−Ig重鎖及び軽鎖遺伝子は遺伝子の高レベル転写を誘導するように各々CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節エレメントと機能的に連結されている。組換え発現ベクターは更に、メトトレキサート選択/増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたCHO細胞の選択を可能にするDHFR遺伝子を保持する。選択された形質転換宿主細胞を培養し、DVD−Ig重鎖及び軽鎖を発現させ、無傷のDVD−Ig蛋白質を培養培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地からDVD−Ig蛋白質を回収する。更に、本発明は本発明のDVD−Ig蛋白質が合成されるまで適切な培養培地で本発明の宿主細胞を培養することにより本発明のDVD−Ig蛋白質を合成する方法を提供する。本方法は更に培養培地からDVD−Ig蛋白質を単離する段階を含むことができる。
DVD−Ig結合性蛋白質の1つの重要な特徴は従来の抗体と同様に産生・精製できる点である。DVD−Ig結合性蛋白質の産生の結果、定常領域の配列改変又は任意種類の化学的改変を伴わずに、所望の二重特異性活性をもつ均質で単一の主要産物が得られる。「二重特異性」、「多重特異性」及び「多重特異性多価」全長結合性蛋白質の作製方法として従来記載されている他の方法では単一の主要産物が得られず、不活性な単一特異性、多重特異性の寄せ集めの多価全長結合性蛋白質と、種々の結合部位の組合せを含む多価全長結合性蛋白質の混合物が細胞内又は分泌により産生される。1例として、Miller and Presta(PCT公開第WO2001/077342号)に記載されているデザインによると、重鎖と軽鎖の16通りの異なる組合せが存在する。従って、望ましい活性形態となる可能性があるのは6.25%の蛋白質に過ぎない。大規模製造で一般に使用される標準クロマトグラフィー技術を使用して蛋白質の不活性形態及び部分的に活性な形態から蛋白質の完全に活性な形態を分離する方法も立証されていない。
驚くべきことに、「二重特異性多価全長結合性蛋白質」であるDVD−Ig結合性蛋白質のデザインによると、二重可変領域軽鎖と二重可変領域重鎖が結合され、主に望ましい「二重特異性多価全長結合性蛋白質」、即ち機能的なDVD−Ig結合性蛋白質が得られる。PCT公開第WO2007/024715号参照。
II.結晶性誘導体化結合性蛋白質
本発明は結合性蛋白質が結晶である変形性関節症の治療方法及び組成物を包含する。1態様において、結晶化結合性蛋白質は可溶性の前記結合性蛋白質よりもインビボ半減期が長い。別の態様において、前記結合性蛋白質は結晶化後に生物学的活性を維持する。
本発明は結合性蛋白質が結晶である変形性関節症の治療方法及び組成物を包含する。1態様において、結晶化結合性蛋白質は可溶性の前記結合性蛋白質よりもインビボ半減期が長い。別の態様において、前記結合性蛋白質は結晶化後に生物学的活性を維持する。
本発明で有用な結晶化結合性蛋白質は本願に援用するPCT公開第WO02072636号に開示されているような当分野で公知の方法により作製することができる。
本発明の別の態様は結合性蛋白質又はその抗原結合部分が1個以上の糖質残基を含むグリコシル化結合性蛋白質を利用する。初期インビボ蛋白質産生は更に翻訳後修飾と呼ばれるプロセシングを受ける場合がある。特に、糖(グリコシル)残基が酵素により付加される場合があり、このプロセスをグリコシル化と言う。その結果として得られる蛋白質は共有結合したオリゴ糖側鎖をもち、グリコシル化蛋白質又は糖蛋白質と呼ばれる。抗体はFc領域と可変領域に1以上の糖質残基を含む糖蛋白質である。Fc領域の糖質残基はFc領域のエフェクター機能に重要な影響を与え、抗体の抗原結合又は半減期に与える影響は最小限である(Jefferis(2005)Biotechnol.Prog.,21:11−16)。他方、可変領域のグリコシル化は抗体の抗原結合活性に影響を与える可能性がある。可変領域のグリコシル化は恐らく立体障害により、抗体結合親和性に負の影響を与える可能性(Co et al.(1993)Mol.Immunol.30:1361−1367)や、抗原に対する親和性の増加を生じる可能性(Wallick et al.(1998)Exp.Med.168:1099−1109;Wright et al.(1991)EMBO J.10:2717−2723)がある。
結合性蛋白質のO又はN結合型グリコシル化部位が突然変異されているグリコシル化部位突然変異体を作製することも可能である。当業者は標準技術を使用してこのような突然変異体を作製することができる。本願に記載する変形性関節症の治療方法及び組成物では生物学的活性を維持しながら結合活性が増加又は低下したグリコシル化部位突然変異体を使用してもよい。
本発明の方法及び組成物で有用な結合性蛋白質又はその抗原結合部分のグリコシル化を改変してもよい。例えば非グリコシル化抗体を作製することができる(即ち、抗体はグリコシル化を欠損している)。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増すようにグリコシル化を改変することができる。このような糖鎖改変は例えば抗体配列内の1カ所以上のグリコシル化部位を改変することにより行うことができる。例えば、1カ所以上のアミノ酸置換の結果、1カ所以上の可変領域グリコシル化部位を除去することにより、この部位のグリコシル化を欠損させることができる。このような非グリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増すことができる。このようなアプローチはPCT公開第WO2003/016466号並びに米国特許第5,714,350号及び6,350,861号に更に詳細に記載されている。
上記に加え、又は上記の代わりに、フコシル残基数の少ない低フコシル化抗体や、バイセクトGlcNAc構造の多い抗体等のグリコシル化型を改変させた本発明で有用な改変型結合性蛋白質を作製することもできる。このような改変グリコシル化パターンは抗体のADCC能を亢進することが分かっている。このような糖鎖改変は例えばグリコシル化機序を改変させた宿主細胞で前記結合性蛋白質を発現させることにより実施することができる。グリコシル化機序を改変させた細胞は文献に記載されており、グリコシル化を改変させた抗体を産生させるために本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用することができる。例えば,Shields et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733−26740;Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176−181、ヨーロッパ特許第EP1,176,195号;並びにPCT公開第WO03/035835号及びWO99/5434280号参照。
蛋白質グリコシル化は目的蛋白質のアミノ酸配列と、蛋白質が発現される宿主細胞に依存する。生物によって異なるグリコシル化酵素(例えばグリコシルトランスフェラーゼやグリコシダーゼ)が産生され、利用可能な基質(ヌクレオチド糖)も異なる場合がある。このような因子により、蛋白質グリコシル化パターンとグリコシル残基の組成は特定蛋白質が発現される宿主系により異なる場合がある。本発明で有用な結合性蛋白質のグリコシル残基としては限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、n−アセチルグルコサミン及びシアル酸が挙げられる。好ましくは、グリコシル化結合性蛋白質はグリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含む。
蛋白質グリコシル化の相違の結果、蛋白質特性が相違することは当業者に知られている。例えば、酵母等の微生物宿主で産生され、酵母内在経路を利用してグリコシル化された治療用蛋白質の効力はCHO細胞株等の哺乳動物細胞で発現される同一蛋白質の効力に比較して低いと思われる。このような糖蛋白質はヒトでも免疫原性の可能性があり、投与後のインビボ半減期が短いと思われる。ヒト及び他の動物における特定受容体は特定グリコシル残基を認識し、血流からの蛋白質の迅速なクリアランスを促進する場合がある。他の有害な作用としては、蛋白質フォールディング、溶解度、プロテアーゼ感受性、トラフィキング、輸送、区画化、分泌、他の蛋白質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルゲン性の変化が挙げられる。従って、医師は特定のグリコシル化組成及びパターン(例えばヒト細胞又は所期対象動物の種特異的細胞で産生されるものと同一又は少なくとも同様のグリコシル化組成及びパターン)をもつ治療用蛋白質を選択すると思われる。
異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより、宿主細胞と異なるグリコシル化蛋白質を発現させることができる。当分野で公知の技術を使用して医師はヒト蛋白質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を作製することができる。例えば、酵母株で産生されるグリコシル化蛋白質(糖蛋白質)が動物細胞、特にヒト細胞と同一の蛋白質グリコシル化を示すように、酵母株が非天然グリコシル化酵素を発現するように遺伝子改変されている(米国特許公開第2004/0018590号及び2002/0137134号並びにPCT公開第WO2005/100584号)。
更に、当業者に自明の通り、ライブラリーのメンバー宿主細胞が変異グリコシル化パターンをもつ目的蛋白質を産生するように、各種グリコシル化酵素を発現するように遺伝子改変した宿主細胞ライブラリーを使用して目的蛋白質を発現させることもできる。その後、医師は特定の新規グリコシル化パターンをもつ目的蛋白質を選択・単離することができる。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンをもつ蛋白質は改善又は改変された生物学的性質を示す。
IV.医薬組成物
本発明の方法は個体における変形性関節症又は疼痛の治療用医薬組成物として、IL−1α及び/又はIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質を含有する組成物を利用する。このような組成物は更に、医薬的に許容可能な担体、希釈剤及び/又は賦形剤、あるいは1種以上の結合性蛋白質のIL−1α及び/又はIL−1β結合活性以外の望ましい治療的、医薬的又は薬理的利点を組成物に提供する他の任意化合物を含有することができる。1態様において、本発明による個体における変形性関節症又は疼痛の治療に有用な組成物はIL−1αと結合する結合性蛋白質(例えば抗IL−1α抗体)と、IL−1βと結合する結合性蛋白質(例えば抗IL−1β抗体)又はIL−1α及び/又はIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質(例えばIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質)を含有する。
本発明の方法は個体における変形性関節症又は疼痛の治療用医薬組成物として、IL−1α及び/又はIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質を含有する組成物を利用する。このような組成物は更に、医薬的に許容可能な担体、希釈剤及び/又は賦形剤、あるいは1種以上の結合性蛋白質のIL−1α及び/又はIL−1β結合活性以外の望ましい治療的、医薬的又は薬理的利点を組成物に提供する他の任意化合物を含有することができる。1態様において、本発明による個体における変形性関節症又は疼痛の治療に有用な組成物はIL−1αと結合する結合性蛋白質(例えば抗IL−1α抗体)と、IL−1βと結合する結合性蛋白質(例えば抗IL−1β抗体)又はIL−1α及び/又はIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質(例えばIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質)を含有する。
本発明の方法で有用な結合性蛋白質は対象に投与するのに適した医薬組成物に配合することができる。典型的には、医薬組成物はIL−1α及び/又はIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質と、医薬的に許容可能な担体を含有する。本願で使用する「医薬的に許容可能な担体」とは生理的に適合可能な全溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を広く包含する。医薬的に許容可能な担体の例としては水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の1種以上とその組み合わせが挙げられる。多くの場合には、例えば糖類、多価アルコール(例えばマンニトール、ソルビトール)、又は塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に加えることが好ましい。医薬的に許容可能な担体は更に抗体又は抗体部分の保存期間又は効力を増す微量の助剤(例えば湿潤剤、乳化剤、防腐剤又は緩衝剤)を含有していてもよい。
各種送達システムが公知であり、本発明で有用な1種以上の結合性蛋白質あるいは1種以上の結合性蛋白質と個体における変形性関節症又は疼痛を予防、管理、治療又は改善するために有用な予防剤又は他の治療剤の併用剤を投与するために使用することができ、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル封入、結合性蛋白質又はフラグメントを発現することが可能な組換え細胞、受容体介在型エンドサイトーシス(例えばWu and Wu(1987)J.Biol.Chem.262:4429−4432参照)、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等が挙げられる。IL−1α及び/又はIL−1βと結合する結合性蛋白質を個体に投与する方法としては限定されないが、非経口投与(例えば皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内及び皮下)、硬膜外投与、腫瘍内投与及び粘膜投与(例えば鼻腔内及び経口経路)が挙げられる。更に、例えばインヘラー又はネブライザーの使用やエアゾール化剤の配合により、肺投与を利用することもできる。例えば米国特許第6,019,968号;5,985,320号;5,985,309号;5,934,272号;5,874,064号;5,855,913号;及び5,290,540号;並びにPCT公開第WO92/19244号;WO97/32572号;WO97/44013号;WO98/31346号;及びWO99/66903号参照。1態様では、Alkermes AIR(登録商標)薬物肺送達技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Mass.)を使用して本発明で有用な結合性蛋白質を投与する。1特定態様では、本発明で有用な結合性蛋白質を筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口、鼻腔内、肺又は皮下投与する。結合性蛋白質は任意の適切な経路、例えば輸液又はボーラス注射、上皮又は皮膚粘膜内壁(例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等)吸収により投与してもよく、他の生物学的活性剤と共に投与してもよい。投与は全身でも局所でもよい。
特定態様では、処置を必要とする領域に結合性蛋白質を局所投与すること、例えば関節領域に直接投与することが望ましい場合がある。これは限定されないが、例えば局所輸液、注射又はインプラントにより実施することができ、インプラントは多孔性材料でも無孔性材料でもよく、例えばシラスチック膜、ポリマー、繊維性マトリックス(例えばTissuel(登録商標))又はコラーゲンマトリックス等の膜及びマトリックスが挙げられる。1態様では、疼痛を含む変形性関節症で発生するような軟骨変性を治療、管理、改善及び/又は進行予防するために有効な量の1種以上の結合性蛋白質を患部関節に局所投与する。別の態様では、変形性関節症又はその1種以上の症状(疼痛を含む)を予防、治療、管理及び/又は改善するために有効な量の1種以上の結合性蛋白質を前記結合性蛋白質以外の有効量の1種以上の療法(例えば1種以上の予防剤又は治療剤)と患部に局所併用投与する。
別の態様では、IL−1α及びIL−1β結合性蛋白質を制御放出又は持続放出システムで送達することができる。1態様では、制御又は持続放出を実現するためにポンプを使用してもよい(Langer(1990)Science 249:1527−1533;Sefton(1987)CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.,14:201−240;Buchwald et al.(1980)Surgery,88:507−516;Saudek et al.(1989)N.Engl.J.Med.,321:574−579参照)。別の態様では、本発明で有用な結合性蛋白質の制御又は持続放出を実現するためにポリマー材料を使用することができる(例えばMedical Applications of Controlled Release,(Langer and Wise,eds.)(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1984);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,(Smolen and Ball,eds.)(Wiley,New York,1984);Langer and Peppas(1983)J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.Phys.C23:61−126参照;更にLevy et al.(1985)Science 228:190−192;During et al.(1989)Ann.Neurol.25:351−356;Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71:105−112;米国特許第5,679,377号;5,916,597号;5,912,015号;5,989,463号;及び5,128,326号;並びにPCT公開第WO99/15154号及びWO99/20253号も参照)。持続放出製剤で使用されるポリマーの例としては限定されないが、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、エチレン・酢酸ビニルコポリマー、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ酸無水物、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ラクチド・グリコリドコポリマー(PLGA)及びポリオルトエステルが挙げられる。1態様において、持続放出製剤で使用されるポリマーは不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存安定性であり、無菌であり、生分解性である。更に別の態様では、制御又は持続放出システムを予防又は治療ターゲットに近接して配置し、全身投与量のごく一部で済ますことができる(例えば、Goodson,J.M.,Chapter 6,In Medical Applications of Controlled Release,Vol.II,Applications and Evaluation,(Langer and Wise,eds.)(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1984),pp.115−138参照)。
制御放出システムはLanger,Science,249:1527−1533(1990)に記載されている。1種以上の本発明の治療剤を含有する持続放出製剤を製造するためには、当業者に公知の任意技術を使用することができる。例えば米国特許第4,526,938号;PCT公開第WO91/05548号及びWO96/20698号;Ning et al.(1996)Radiother.Oncol.,39:179−189;Song et al.(1996)PDA J.Pharm.Sci.Technol.,50:372−377;Cleek et al.(1997)Proceed.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853−854;並びにLam et al.(1997)Proceed.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.,24:759−760参照。
本発明で有用な組成物がIL−1α及び/又はL−1βと結合する蛋白質をコードする核酸である特定態様では、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、例えばレトロウイルスベクターの使用(例えば米国特許第4,980,286号参照)、又は直接注射、又は微粒子撃ち込みの使用(例えば遺伝子銃;Biolistic,Dupont)、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤のコーティングにより細胞内に取込むように投与するか、あるいは核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチド(例えばJoliot et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864−1868参照)に結合して投与することにより、そのコードされる予防剤又は治療剤の発現を促進するように核酸をインビボ投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えにより発現させるために宿主細胞DNA内に組込むこともできる。
本発明で有用な変形性関節症又は疼痛の治療用医薬組成物はその所期投与経路に適合可能に製剤化される。投与経路の例としては限定されないが、非経口(例えば静脈内、皮内、皮下)、経口、鼻腔内(例えば吸入)、経皮(例えば局所)、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。特定態様において、組成物はヒトに静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内又は局所投与するのに適した医薬組成物として常法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液に溶解した溶液である。必要に応じて、溶解補助剤や、注射部位の痛みを緩和するための局所麻酔剤(例えばリドカイン)を組成物に更に添加してもよい。
本発明で有用な変形性関節症又は疼痛の治療用組成物を局所投与する場合には、組成物は軟膏剤、クリーム、経皮パッチ、ローション、ジェル、シャンプー、スプレー、エアゾール、溶液剤、乳剤又は当業者に周知の他の剤形に製剤化することができる。例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,19th ed.,(Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,1995)参照。非スプレー型の局所剤形には、局所塗布に適合可能な担体又は1種以上の賦形剤を含有しており、好ましくは水よりも動粘度の高い粘性〜半固体又は固体剤形が典型的に利用される。他の適切な製剤としては限定されないが、懸濁剤、散剤、リニメント剤、膏剤等が挙げられる。1態様では、このような製剤を滅菌するか又は各種性質(例えば浸透圧)に作用するための助剤(例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤又は塩)と混合する。他の適切な局所剤形としては、活性成分を例えば固体又は液体不活性担体と共に加圧揮発性物質(例えばFREON(登録商標)等のガス噴射剤)との混合物又はスクイーズボトルにパッケージングしたスプレー式エアゾール製剤が挙げられる。所望により、モイスチャライザーやヒューメクタントも医薬組成物及び製剤に添加してもよい。このような補助成分の例は当分野で周知である。
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合には、組成物はエアゾール形態、スプレー、ミスト又は滴剤として製剤化することができる。特に、本発明に従って使用する結合性蛋白質は適切な噴射剤(例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス)を利用して加圧パック又はネブライザーからエアゾールスプレー製剤として簡便に送達することができる。加圧エアゾールの場合には、一定量を送達するためのバルブを配置することにより用量単位を配量することができる。化合物と適切な粉末基剤(例えばラクトースや澱粉)の粉末混合物を充填したインヘラー又はインサフレーター用の(例えばゼラチンから構成される)カプセル及びカートリッジとして製剤化することもできる。
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療方法が経口投与を含む場合には、錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ゲルカップ剤、溶液剤、懸濁剤等の剤形に組成物を経口製剤化することができる。錠剤又はカプセル剤は結合剤(例えばプレゲル化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース)、増量剤(例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム)、滑沢剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ)、崩壊剤(ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム)、又は湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)等の医薬的に許容可能な賦形剤と共に慣用手段により製造することができる。錠剤は当分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。経口投与用液体製剤は限定されないが、溶液剤、シロップ剤又は懸濁剤の形態をとることができ、あるいは使用前に水又は他の適切な溶媒で再構成する乾燥製剤の形態でもよい。このような液体製剤は懸濁化剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂肪)、乳化剤(例えばレシチン又はアラビアガム)、非水性溶媒(例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分留植物油)、及び防腐剤(例えばp−ヒドロキシ安息香酸メチル、p−ヒドロキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸)等の医薬的に許容可能な添加剤と共に慣用手段により製造することができる。製剤には更に緩衝塩類、着香剤、着色剤及び甘味剤を適宜添加してもよい。経口投与用製剤は変形性関節症又は疼痛の治療用として本発明で有用な結合性蛋白質の遅延放出、制御放出又は持続放出に適するように製剤化すると適切な場合がある。
本発明の変形性関節症の治療方法又は疼痛の治療方法は例えばインヘラー又はネブライザー、エアゾール化剤を配合した組成物の使用による肺投与を含むことができる。例えば米国特許第6,019,968号;5,985,320号;5,985,309号;5,934,272号;5,874,064号;5,855,913号;及び5,290,540号;並びにPCT公開第WO92/19244号、WO97/32572号、WO97/44013号、WO98/31346号及びWO99/66903号参照。特定態様では、Alkermes AIR(登録商標)薬物肺送達技術(Alkermes,Inc.,Cambridge,Massachusetts)を使用して変形性関節症の治療用のIL−1α及び/又はIL−1βと結合する結合性蛋白質又は併用治療剤を投与する。
本発明の方法は(例えばボーラス注射又は連続輸液による)注射による非経口投与用に製剤化されたIL−1α及び/又はIL−1βと結合する結合性蛋白質を含有する組成物の投与を含むことができる。注射用製剤は防腐剤を添加した単位用量形態(例えばアンプル又はマルチドーズ容器)でもよい。組成物は油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液又は乳剤等の形態でもよく、懸濁化剤、安定剤及び/又は分散剤等の助剤を添加してもよい。あるいは、結合性蛋白質は使用前に適切な溶媒(例えば滅菌パイロジェンフリー水)で再構成する粉末状でもよい。
本発明の方法は更にデポー製剤として製剤化された組成物の投与も含むことができる。このような長時間作用型製剤は(例えば皮下又は筋肉内)移植又は筋肉内注射により投与することができる。従って、例えば、組成物は(例えば許容可能な油中の乳剤としての)適切なポリマーもしくは疎水性材料又はイオン交換樹脂を使用して製剤化してもよいし、難溶性誘導体として(例えば難溶性塩として)製剤化してもよい。
本発明の方法は中性又は塩形態として製剤化された組成物の投与を含む。医薬的に許容可能な塩としては塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸等から誘導される塩等のアニオンと共に形成される塩と、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導される塩等のカチオンと共に形成される塩が挙げられる。
一般に、組成物の成分は単位用量形態(例えば活性剤の量を指示するアンプルやサシェット等の密封容器に収容した乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物)で別々又は混合物として提供される。投与方法が輸液の場合には、滅菌医薬グレードの水又は生理食塩水を充填した輸液ボトルにより組成物を分配することができる。投与方法が注射の場合には、成分を投与前に混合できるように注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明は更に薬剤の量を指示するアンプルやサシェット等の密封容器にパッケージングされたIL−1α及び/もしくはIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物も提供する。1態様では、IL−1α及び/もしくはIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物を密封容器に収容した乾燥滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として提供し、関節炎又は疼痛を治療するために対象に投与するのに適した濃度まで(例えば水又は生理食塩水で)再構成することができる。1態様では、IL−1α及び/もしくはIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物を少なくとも約5mg、少なくとも約10mg、少なくとも約15mg、少なくとも約25mg、少なくとも約35mg、少なくとも約45mg、少なくとも約50mg、少なくとも約75mg、又は少なくとも約100mgの単位用量で密封容器に収容した乾燥滅菌凍結乾燥粉末として提供する。凍結乾燥結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物はその当初の容器に約2℃〜約8℃で保存すべきであり、結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物は再構成後1週間以内、5日以内、72時間以内、48時間以内、24時間以内、12時間以内、6時間以内、5時間以内、3時間以内、又は1時間以内に投与すべきである。代替態様では、薬剤の量と濃度を指示する密封容器にIL−1α及び/もしくはIL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質又はこのような結合性蛋白質を含有する医薬組成物を液体形態で提供する。1態様では、投与する液体形態の組成物を密封容器に少なくとも約0.25mg/ml、少なくとも約0.5mg/ml、少なくとも約1mg/ml、少なくとも約2.5mg/ml、少なくとも約5mg/ml、少なくとも約8mg/ml、少なくとも約10mg/ml、少なくとも約15mg/kg、少なくとも約25mg/ml、少なくとも約50mg/ml、少なくとも約75mg/ml又は少なくとも約100mg/mlで提供する。液体形態はその当初の容器に約2℃〜約8℃で保存すべきである。
本願に記載する方法及び組成物で有用な結合性蛋白質は非経口投与に適した医薬組成物に配合することができる。1側面では、抗体約0.1mg/ml〜約250mg/mlを含有する注射溶液として結合性蛋白質を製造する。注射溶液はフリント又はアンバーバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジに収容した液体又は凍結乾燥剤形から構成することができる。緩衝液はL−ヒスチジン(約1mM〜約50mM)とすることができ、最適値約5mM〜約10mM,pH5.0〜7.0(最適値約pH6.0)とすることができる。他の適切な緩衝液としては限定されないが、琥珀酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが挙げられる。約0〜約300mM(液体剤形では最適値約150mM)の濃度の溶液の毒性を調節するためには塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥剤形には凍害保護剤として主に約0%〜約10%スクロース(最適値約0.5%〜約1.0%)を添加することができる。他の適切な凍害保護剤としてはトレハロースとラクトースが挙げられる。凍結乾燥剤形にはバルク剤として主に約1〜約10%マンニトール(最適値約2%〜約4%)を添加することができる。液体及び凍結乾燥剤形の両者で安定剤として主に約1mM〜約50mM L−メチオニン(最適値約mM5〜約10mM)を使用することができる。他の適切なバルク剤としてはグリシン、アルギニンが挙げられ、約0%〜約0.05%ポリソルベート80(最適値約0.005%〜約0.01%)として添加することができる。その他の界面活性剤としては限定されないが、ポリソルベート20及びBRIJ界面活性剤が挙げられる。
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療に有用な組成物は各種形態を取ることができる。これらの形態としては、例えば液体、半固体及び固体剤形が挙げられ、例えば溶液剤(例えば注射溶液及び輸液溶液)、分散液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム剤及び座剤が挙げられる。特定剤形は所期投与方法及び治療用途により異なる。典型的な組成物は抗体をヒトに受動免疫するために使用されている組成物と同様の組成物等の注射溶液又は輸液溶液の形態である。投与方法は非経口投与(例えば静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内)である。1態様では、静脈内輸液又は注射により抗体を投与する。別の態様では、筋肉内又は皮下注射により抗体を投与する。
治療用組成物は典型的には製造及び保存条件下で無菌安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高薬剤濃度に適した他の注文構造として製剤化することができる。滅菌注射溶液は必要量の活性化合物(即ち抗体又はその抗原結合部分)を必要に応じて上記成分の1種又はその組み合わせと共に適切な溶媒に加えた後に濾過滅菌することにより製造することができる。一般に、分散液は塩基性分散媒と上記から選択される必要な他の成分を含有する滅菌媒体に活性化合物を配合することにより製造される。滅菌注射溶液の調製用滅菌凍結乾燥粉末の場合には、典型的な製造方法は真空乾燥と噴霧乾燥であり、活性成分に乾燥前の滅菌濾過溶液からの任意の他の所望成分を加えた粉末を得る。例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持及び界面活性剤の使用により、溶液の適正な流動性を維持することができる。吸収を遅らせる物質(例えばモノステアリン酸塩やゼラチン)を組成物に加えることにより、注射用組成物の長期吸収を実現できる。
本発明の変形性関節症又は疼痛の治療に有用な結合性蛋白質は当分野で公知の各種方法により投与することができるが、典型的な投与経路/方法は皮下注射、静脈内注射又は輸液である。当業者に自明の通り、投与経路及び/又は方法は所望結果により異なる。所定態様では、結合性蛋白質の迅速な放出を防止する担体を結合性蛋白質に配合することができ、例えばインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル送達システム等の制御放出製剤が挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の多数の製造方法が特許登録されており、あるいは一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,(Marcel Dekker,Inc.,New York,1978)参照。
所定態様では、本発明で有用な結合性蛋白質を例えば不活性希釈剤又は同化性可食性担体と共に経口投与することができる。前記結合性蛋白質(及び所望により他の成分)をハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよいし、対象の食事に直接添加してもよい。経口治療投与には、化合物に賦形剤を添加し、内服錠、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハース剤等の形態で使用してもよい。本発明の化合物を非経口投与以外の方法で投与するためには、その不活性化を防止するための材料を化合物にコーティングしたり、化合物と併用投与することが必要な場合がある。
補助活性化合物も組成物に添加することができる。所定態様では、変形性関節症又は疼痛の治療に有用な1種以上の別の治療剤と本発明で有用な結合性蛋白質(例えば抗体)又はその抗原結合部分を合剤化及び/又は併用投与する。例えば、hIL−1α及び/もしくはhIL−1βと結合する結合性蛋白質又はその抗原結合部分を他のターゲットと結合する1種以上の別の抗体(例えば他のサイトカインと結合する抗体又は細胞表面分子と結合する抗体)と合剤化及び/又は併用投与してもよい。更に、1種以上の結合性蛋白質を1種以上の他の治療剤と併用してもよい。このような併用療法は治療剤の投与用量を減らし、各種単独療法に伴う可能性のある毒性や合併症を避けることができるという利点がある。
所定態様では、IL−1α及び/もしくはL−1βと結合する蛋白質又はその結合部分を当分野で公知の半減期延長用ビヒクルと連結する。このようなビヒクルとしては、限定されないが、Fc領域、ポリエチレングリコール及びデキストランが挙げられる。このようなビヒクルは例えば米国特許第6,660,843号に記載されている。
特定態様では、遺伝子治療により変形性関節症を治療、予防、管理又は改善するために、結合性蛋白質の1種以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する。遺伝子治療とは、発現された核酸又は発現可能な核酸を対象に投与することにより実施される治療を意味する。本発明のこの態様において、核酸はこれらの核酸によりコードされ、IL−1α及び/又はL−1βと結合して変形性関節症又は疼痛に関する予防効果又は治療効果をもたらす結合性蛋白質の結合性ポリペプチドを産生する。
本発明によると、当分野で入手可能な任意の遺伝子治療法を使用することができる。遺伝子治療法の一般論については、Goldspiel et al.(1993)Clin.Pharm.12:488−505;Wu and Wu(1991)Biotherapy 3:87−95;Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596;Mulligan(1993)Science 260:926−932;Morgan and Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.62:191−217;及びRobinson,C.(1993)Trends Biotechnol.11(5):155参照。組換えDNA技術分野で広く知られており、使用することができる方法はAusubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,New York,1993);及びKriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,(Stockton Press,New York,1990)に記載されている。各種遺伝子治療法の詳細な記載は米国特許出願公開第2005/0042664号に開示されている。
IL−1α及び/又はL−1βと結合する結合性蛋白質は単独で使用することもできるし、変形性関節症又は疼痛の治療に有用な1種以上の別の作用剤と併用することもできる。例えば、別の作用剤は変形性関節症の1種以上の症状を治療するため、又は疼痛に関連するIL−1以外のターゲットに作用するために有用であるとして当分野で認められている治療剤とすることができる。別の作用剤は治療用組成物に有益な属性を付与する作用剤でもよく、例えば個体に投与する組成物の粘性に作用する作用剤が挙げられる。
更に当然のことながら、本発明に含まれる併用剤はその所期目的に有用な併用剤である。以下に挙げる作用剤は例証を目的とし、限定的なものではない。本発明に含まれる併用剤はIL−1α及び/又はL−1βと結合する結合性蛋白質と、望ましい特性を提供する少なくとも1種の別の作用剤とすることができる。形成される組成物がその所期機能を発揮できるような併用剤であるならば、併用剤は2種以上の別の作用剤、例えば2種又は3種の別の作用剤を含有することもできる。変形性関節症又は疼痛を治療するのに好ましい併用剤は、非ステロイド性抗炎症薬(「NSAID」とも言う)を含有しており、イブプロフェン等の薬剤が挙げられる。他の好ましい併用剤はプレドニゾロン等のコルチコステロイドを含有する抗炎症剤であり、患者にIL−1α及び/又はL−1βと結合する結合性蛋白質と併用投与する際に必要なステロイド用量を徐々に減らすことによりステロイドの周知の副作用を減らすか又はなくすことができる。変形性関節症又は疼痛に罹患している個体の治療用治療剤の非限定的な例としては、限定されないが、ブデソニド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、IL−1受容体アンタゴニスト、抗IL−1βモノクローナル抗体、抗IL−6モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物;TNF、LT、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−18、IL−23、EMAP−II、GM−CSF、FGF又はPDGFの抗体;CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90又はそのリガンドの抗体;メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬;IRAK、NIK、IKK、p38、MAPキナーゼ阻害剤;IL−1β変換酵素阻害剤、TNFα変換酵素阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性p55TNF受容体、可溶性p75TNF受容体;sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R;抗炎症性サイトカイン、IL−4、IL−10、IL−11、IL−13及びTGFβの1種以上が挙げられる。
本発明の医薬組成物は「治療有効量」又は「予防有効量」のIL−1α及び/又はL−1βと結合する1種以上の結合性蛋白質を含有することができる。「治療有効量」とは、必要な用量と期間で所望治療結果を達成するために有効な量を意味する。前記結合性蛋白質の治療有効量は当業者が決定することができ、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重や、前記結合性蛋白質が個体に所望の反応を誘発する能力等の因子により変動し得る。治療有効量は前記結合性蛋白質又はその部分の治療上有益な作用が毒性又は有害作用を上回る量でもある。「予防有効量」とは、必要な用量と期間で所望予防結果を達成するために有効な量を意味し、変形性関節症の患部関節における関節軟骨の後続変性もしくは減少の予防、又は疼痛の発症もしくは激化の予防が挙げられる。一般に、予防用量は初期疾患ステージ又はそれ以前の対象で使用するので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。
1態様では、個体の疼痛の治療方法が提供され、前記個体はIL−1蓄積に伴う疾患ないし障害に罹患している。個体におけるこのようなIL−1蓄積はIL−1の発現低下又はIL−1の代謝低下の結果であり得る。IL−1の蓄積は個体の血液(血漿、血清を含む)又は局所組織中で生じ得る。
1態様において、本発明は個体の疼痛の治療方法を提供し、前記個体はIL−1蓄積に伴う疾患ないし障害に罹患している。
1態様において、本願に記載する組成物及び方法は変形性関節症、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェグナー肉芽腫症、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性I型多腺性内分泌不全症、II型多腺性内分泌不全症(シュミット症候群)、成人(急性)呼吸窮迫症候群、脱毛症、先天性脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸病性滑膜炎、クラミジア関連関節症、エルシニア関連関節症、サルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患/動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎/ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、B型肝炎、C型肝炎、分類不能型免疫不全症(分類不能型低ガンマグロブリン血症)、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣不全、早発卵巣不全、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎/多発性筋炎関連肺疾患、ショーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風性関節炎、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎(古典的自己免疫性肝炎ないしルポイド肝炎)、2型自己免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自己免疫介在性低血糖症、黒色表皮腫を伴うB型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、1型乾癬、2型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患NOS、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、特発性ないしNOS男性不妊症、精子自己免疫、多発性硬化症(全サブタイプ)、交感性眼炎、結合組織病続発性肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、ショーグレン症候群、高安病/動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝傷害、胆汁鬱滞症、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アレルギー、B群連鎖球菌(GBS)感染症、精神障害(例えば鬱病及び統合失調症)、Th2型及びTh1型細胞介在性疾患、急性及び慢性疼痛(各種疼痛)、癌(例えば肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌)及び血液悪性疾患(白血病及びリンパ腫)、無βリポ蛋白血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫又は感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性又は慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、エイズ痴呆合併症、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶反応、α1アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗CD3抗体療法、抗リン脂質抗体症候群、抗受容体過敏反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調症、心房細動(持続性又は発作性)、心房粗動、房室ブロック、B細胞リンパ腫、骨移植拒絶反応、骨髄移植(BMT)拒絶反応、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶反応、小脳皮質変性、小脳障害、無秩序型ないし多源性心房頻拍、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性アルコール依存症、慢性炎症性疾患、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、拳闘家痴呆、脱髄疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚疾患、糖尿病、糖尿病性動脈硬化症、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、基底核障害、中高年ダウン症候群、CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発される薬物誘発性運動障害、薬物過敏症、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン・バールウイルス感染症、肢端紅痛症、錐体外路及び小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶反応、フリードリヒ運動失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意臓器又は組織の移植片拒絶反応、グラム陰性菌敗血症、グラム陽性菌敗血症、細胞内生物による肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハレルフォルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶反応、ヘモクロマトーシス、血液透析、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、出血、A型肝炎、ヒス束不整脈、HIV感染症/HIV神経障害、ホジキン病、運動過多性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部−下垂体−副腎軸評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体介在性細胞傷害、無力症、小児脊髄性筋萎縮症、大動脈炎症、A型インフルエンザ、電離放射線被爆、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎/視神経炎、虚血再潅流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶反応、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系傷害、脂肪性浮腫、肝移植拒絶反応、リンパ水腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性偏頭痛、特発性偏頭痛、ミトコンドリア多系統疾患、混合性結合組織病、モノクローナル免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症(Menzel,Dejerine−Thomas,Shy−Drager及びMachado−Joseph)、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ菌感染症、ヒト型結核菌感染症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋委縮症、好中球減少時の発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈とその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、OKT3(登録商標)療法、精巣炎/副睾丸炎、精巣炎/精管切除再吻合術、臓器腫大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶反応、膵臓癌、腫瘍随伴症候群/悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶反応、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、POEMS症候群(多発ニューロパシー、臓器腫大、内分泌障害、モノクローナル免疫グロブリン血症及び皮膚変化症候群)、潅流後症候群、ポストポンプ症候群、MI心膜切開後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象、レイノー病、レフサム病、規則的で狭いQRS幅の頻拍、腎血管性高血圧症、再潅流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老人性舞踏病、レビー小体型老人性痴呆症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶反応、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶反応、充実性腫瘍、特異的不整脈、脊髄性運動失調症、脊髄小脳変性症、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造傷害、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型発症若年性関節リウマチ、T細胞性ないしFAB ALL、毛細血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、中毒症、移植、外傷/出血、III型過敏反応、IV型過敏反応、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染症、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、成人スティル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸症、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群(ALPS)、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早発卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心臓血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群(CIS)、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病網膜症、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群(GBS)、花粉症、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、IgE介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、IPF/UIP、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性症、顕微鏡的多発血管炎、ベヒテレフ病、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非A非B肝炎、視神経炎、骨溶解症、卵巣癌、少関節型JRA、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患(PAD)、静脈炎、結節性多発動脈炎(ないし結節性動脈周囲炎)、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型JRA、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症(PMR)、ポストポンプ症候群、原発性パーキンソン病、前立腺癌及び直腸癌及び血液悪性疾患(白血病及びリンパ腫)、前立腺炎、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心臓病、SAPHO(滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎)、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、シリコン関連結合組織病、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、TRAPS(腫瘍壊死因子1型受容体(TNFR)関連周期性症候群)、1型アレルギー反応、II型糖尿病、蕁麻疹、通常型間質性肺炎(UIP)、血管炎、春季カタル、ウイ
ルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群(VKH症候群)、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛を治療するために使用することができる。
ルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田症候群(VKH症候群)、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している個体における疼痛を治療するために使用することができる。
本願に記載する方法及び組成物は原発性及び転移性癌から構成される群から選択される疾患に罹患している個体における疼痛を治療するために使用することができ、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢及び胆管癌、小腸癌、尿管癌(腎臓癌、膀胱癌及び尿路上皮癌を含む)、女性生殖管癌(子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌及び妊娠性絨毛性疾患を含む)、男性生殖管癌(前立腺癌、精嚢癌、精巣癌及び胚細胞腫瘍を含む)、内分泌腺癌(甲状腺癌、副腎癌及び下垂体癌を含む)、及び皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫(骨癌、軟部組織癌及びカポジ肉腫に起因するものを含む)、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌(星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫及び髄膜腫を含む)、白血病等の血液悪性疾患に起因する充実性腫瘍、並びにリンパ腫(ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)が挙げられる。
最適所望応答(例えば治療又は予防応答)が得られるように投与レジメンを調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけて数回に分けて投与してもよいし、治療状況の緊急性に応じて用量を相対的に増減してもよい。投与し易さと用量の均等性の点から非経口組成物を用量単位形態に製剤化すると特に有利である。本願で使用する用量単位形態とは、治療する哺乳動物対象に単位用量として投与するのに適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を必要な医薬担体と共に含有する。本発明の用量単位形態の仕様は(a)IL−1α及び/又はL−1βと結合する結合性蛋白質の固有特性及び達成すべき特定治療又は予防効果と、(b)個体の治療用としてこのような蛋白質を配合する技術に内在する問題により決定され、これらに直接依存する。
変形性関節症又は疼痛の治療に有用な結合性蛋白質の治療有効量又は予防有効量の非限定的な範囲の1例は0.1〜20mg/kg、より好ましくは1〜10mg/kgである。当然のことながら、用量値は緩和しようとする病態の種類と重篤度により変動し得る。任意特定対象の特定投与レジメンは個体の必要と組成物の投与者又は投与監理者の専門的判断に従って経時的に調整すべきであり、本願に記載する用量範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載する組成物の範囲又は実施を制限するものではない。
当業者に容易に理解される通り、本願に記載する本発明の方法及び組成物の他の適切な変形及び応用も自明であり、本発明の範囲又は本願に開示する態様から外れない限り、適切な等価物を使用して実施することができる。以上、本発明を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより更に明瞭に理解されよう。なお、以下の実施例は単に例証を目的とし、本発明を限定するものではない。
実施例1.二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)蛋白質の作製
2種類の異なる親mAbに由来する2個の異なる軽鎖可変領域(VL)を組換えDNA技術により直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結した後、軽鎖定常領域を連結するように二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子を設計する。同様に、重鎖は直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結された2個の異なる重鎖可変領域(VH)と、それに続く定常領域CH1とFc領域を含む。図1A参照。親モノクローナル抗体からのDVD−Ig結合性蛋白質の設計と作製は従来記載されており、IL−1α及びIL−1βと結合するDVD−Ig結合性蛋白質の例として、親抗IL−1αモノクローナル抗体と親抗IL−1βモノクローナル抗体から作製されるものも記載されている。本願に援用するPCT公開第WO2007/024715 A2号及びWu et al.,Nature Biotechnol.,25(11):1290−1297(2007)参照。本願では、選択された抗IL−1α及びIL−1βモノクローナル抗体と、IL−1α及びIL−1βの両方と結合するDVD−Ig分子の作製用の親モノクローナル抗体としてのその使用について記載する。関節リウマチと変形性関節症の公知動物モデルを使用してDVD−Ig分子を可能な治療活性について特性決定した。
2種類の異なる親mAbに由来する2個の異なる軽鎖可変領域(VL)を組換えDNA技術により直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結した後、軽鎖定常領域を連結するように二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子を設計する。同様に、重鎖は直接又は短いリンカーを介してタンデムに連結された2個の異なる重鎖可変領域(VH)と、それに続く定常領域CH1とFc領域を含む。図1A参照。親モノクローナル抗体からのDVD−Ig結合性蛋白質の設計と作製は従来記載されており、IL−1α及びIL−1βと結合するDVD−Ig結合性蛋白質の例として、親抗IL−1αモノクローナル抗体と親抗IL−1βモノクローナル抗体から作製されるものも記載されている。本願に援用するPCT公開第WO2007/024715 A2号及びWu et al.,Nature Biotechnol.,25(11):1290−1297(2007)参照。本願では、選択された抗IL−1α及びIL−1βモノクローナル抗体と、IL−1α及びIL−1βの両方と結合するDVD−Ig分子の作製用の親モノクローナル抗体としてのその使用について記載する。関節リウマチと変形性関節症の公知動物モデルを使用してDVD−Ig分子を可能な治療活性について特性決定した。
実施例1.1.IL−1α及びIL−1βに対するマウスモノクローナル抗体の作製
標準ハイブリドーマ技術を使用してIL−1α及びIL−1βに対するモノクローナル抗体(mAb)を以下のように作製した。
標準ハイブリドーマ技術を使用してIL−1α及びIL−1βに対するモノクローナル抗体(mAb)を以下のように作製した。
実施例1.1.A.マウスの免疫
精製組換えヒトIL−1α及びマウスIL−1β(R&D Systems)を力価アッセイ及びスクリーニングELISAで免疫原及びコーティング抗原として使用した。免疫量は一次免疫とブースター免疫のいずれも全抗原で1匹注射1回当たり5.0〜20.0μgとした。ImmunEasyアジュバントをQiagen(Waltham,MA)から購入し、抗原10.0μg当たりImmunEasyアジュバント20mlのアジュバント/抗原比で使用した。各群の被免疫動物は岩倉洋一郎博士(東京都港区、東京大学)から入手したIL−1αβ KOマウス5匹とした。下記投与スケジュールに従ってマウスに免疫した。MRC−5細胞をATCC(Manassas,VA)から購入し、IL−1バイオアッセイに使用した。ヒトIL−8 ELISAキットと対照マウス抗hIL−1α及び抗hIL−1β抗体(MAB200及びMAB201)はR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入した。
精製組換えヒトIL−1α及びマウスIL−1β(R&D Systems)を力価アッセイ及びスクリーニングELISAで免疫原及びコーティング抗原として使用した。免疫量は一次免疫とブースター免疫のいずれも全抗原で1匹注射1回当たり5.0〜20.0μgとした。ImmunEasyアジュバントをQiagen(Waltham,MA)から購入し、抗原10.0μg当たりImmunEasyアジュバント20mlのアジュバント/抗原比で使用した。各群の被免疫動物は岩倉洋一郎博士(東京都港区、東京大学)から入手したIL−1αβ KOマウス5匹とした。下記投与スケジュールに従ってマウスに免疫した。MRC−5細胞をATCC(Manassas,VA)から購入し、IL−1バイオアッセイに使用した。ヒトIL−8 ELISAキットと対照マウス抗hIL−1α及び抗hIL−1β抗体(MAB200及びMAB201)はR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入した。
要約すると、先ずボルテックスを使用してバイアル中でアジュバントを静かに混合することによりアジュバント−抗原混合物を調製した。所望量のアジュバントをバイアルから取出し、オートクレーブ滅菌済み1.5mLマイクロ遠心管に入れた。抗原をPBS又は生理食塩水で0.5〜1.0mg/mlの濃度に調製した。次にアジュバントを入れたマイクロ遠心管に計算量の抗原を加え、得られた溶液を上下に5回静かにピペッティングすることにより混合した。アジュバント−抗原混合物を室温で15分間インキュベート後、上下に5回静かにピペッティングすることにより再び混合した。アジュバント−抗原溶液を動物注射用の適切なシリンジに吸引した。合計5〜20μgの抗原を50〜100μlの容量で注射した。各動物に免疫後、力価に応じて2〜3回ブースター免疫した。力価が良好な動物にはハイブリドーマの融合と作製前に最終静脈内ブースター注射した。
実施例1.1.B.ハイブリドーマのスクリーニング
上記のように作製したハイブリドーマをスクリーニングし、ELISAを使用して抗体力価を測定した。標準ELISA法を使用して特異抗体を検出するために蛋白質抗原をELISAプレートに直接コーティングした。要約すると、ELISAプレートに100μlのrhIL−1α又はrhIL−1β(PBS中1.0μg/ml)を4℃にて一晩コーティングした。プレートを250μlのPBS/0.5%Tween20で3回洗浄し、ブロッキングバッファー(0.5%Tween20を添加したPBS中2%BSA)200μlでブロッキングした。希釈した血清又はハイブリドーマ上清(100μl)を各ウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。次にプレートをPBS/0.5%Tween20で3回洗浄した。HRP−ヤギ抗マウスIgGを検出に使用し、結合ODを450nmで観測した。ELISAで高い特異的結合活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンをサブクローニングし、精製し、前記抗体の親和性(Biacore)と力価(MRC−5バイオアッセイ)を以下のように特性決定した。
上記のように作製したハイブリドーマをスクリーニングし、ELISAを使用して抗体力価を測定した。標準ELISA法を使用して特異抗体を検出するために蛋白質抗原をELISAプレートに直接コーティングした。要約すると、ELISAプレートに100μlのrhIL−1α又はrhIL−1β(PBS中1.0μg/ml)を4℃にて一晩コーティングした。プレートを250μlのPBS/0.5%Tween20で3回洗浄し、ブロッキングバッファー(0.5%Tween20を添加したPBS中2%BSA)200μlでブロッキングした。希釈した血清又はハイブリドーマ上清(100μl)を各ウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。次にプレートをPBS/0.5%Tween20で3回洗浄した。HRP−ヤギ抗マウスIgGを検出に使用し、結合ODを450nmで観測した。ELISAで高い特異的結合活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンをサブクローニングし、精製し、前記抗体の親和性(Biacore)と力価(MRC−5バイオアッセイ)を以下のように特性決定した。
実施例1.1.C.IL−1α及びIL−1βに対するマウスモノクローナル抗体の特性決定
実施例1.1.Bに記載したハイブリドーマにより産生された抗体を特性決定するために以下のアッセイを使用した。
実施例1.1.Bに記載したハイブリドーマにより産生された抗体を特性決定するために以下のアッセイを使用した。
実施例1.1.C.1.表面プラズモン共鳴法
製造業者の指示と標準手順に従ってBIAcoreシステム(Biacore AB,Uppsala,Sweden)を使用して表面プラズモン共鳴法(SPR)によりヤギ抗マウスIgGを介してバイオセンサーマトリックスに捕捉された抗体(マウス抗組換えmIL−1抗体)とrmIL−1の間のリアルタイム結合相互作用を測定した。要約すると、rmIL−1をHBSランニングバッファー(Biacore AB)で希釈し、50μlアリコートを固定化蛋白質マトリックスに流速5ml/分で注入した。利用したrhIL−1の濃度は、62.5nM、125nM、187.5nM、250nM、375nM、500nM、750nM、1000nM、1500nM及び2000nMとした。解離定数(解離速度)、会合定数(会合速度)を求めるために、BIAcore動態評価ソフトウェア(バージョン3.1)を使用した。
製造業者の指示と標準手順に従ってBIAcoreシステム(Biacore AB,Uppsala,Sweden)を使用して表面プラズモン共鳴法(SPR)によりヤギ抗マウスIgGを介してバイオセンサーマトリックスに捕捉された抗体(マウス抗組換えmIL−1抗体)とrmIL−1の間のリアルタイム結合相互作用を測定した。要約すると、rmIL−1をHBSランニングバッファー(Biacore AB)で希釈し、50μlアリコートを固定化蛋白質マトリックスに流速5ml/分で注入した。利用したrhIL−1の濃度は、62.5nM、125nM、187.5nM、250nM、375nM、500nM、750nM、1000nM、1500nM及び2000nMとした。解離定数(解離速度)、会合定数(会合速度)を求めるために、BIAcore動態評価ソフトウェア(バージョン3.1)を使用した。
実施例1.1.C.2.抗IL−1バイオアッセイ
MRC−5細胞株はヒトIL−1α及びIL−1βに応答して用量依存的にIL−8を産生するヒト肺線維芽細胞細胞株である(Dinarello,Muegge,and Durum(2000)Curr.Protocols Immunol.6:1参照)。MRC−5細胞を10%FBS完全MEMで培養し、5%CO2インキュベーターで37℃にて増殖させた。組換えヒトIL−1α又はIL−1βに対するモノクローナル抗体(mAb)の中和力価を求めるために、種々の濃度(0〜10μg/ml)のmAb(50μl)を96ウェルプレートに加え、rhIL−1α又はrhIL−1β(10〜50pg/ml)50μlと共に1時間37℃にてプレインキュベートした。上清を採取し、希釈し、標準IL−8 ELISAキット(R&D Systems)を使用してELISAによりIL−8濃度を測定した。MRC−5細胞によるIL−8産生を阻害するその能力により抗体力価を求めた。
MRC−5細胞株はヒトIL−1α及びIL−1βに応答して用量依存的にIL−8を産生するヒト肺線維芽細胞細胞株である(Dinarello,Muegge,and Durum(2000)Curr.Protocols Immunol.6:1参照)。MRC−5細胞を10%FBS完全MEMで培養し、5%CO2インキュベーターで37℃にて増殖させた。組換えヒトIL−1α又はIL−1βに対するモノクローナル抗体(mAb)の中和力価を求めるために、種々の濃度(0〜10μg/ml)のmAb(50μl)を96ウェルプレートに加え、rhIL−1α又はrhIL−1β(10〜50pg/ml)50μlと共に1時間37℃にてプレインキュベートした。上清を採取し、希釈し、標準IL−8 ELISAキット(R&D Systems)を使用してELISAによりIL−8濃度を測定した。MRC−5細胞によるIL−8産生を阻害するその能力により抗体力価を求めた。
Biacore及びMRC−5バイオアッセイに基づき、下表1に示すように、親和性と力価の高い多数のマウス抗hIL−1α及び抗hIL−1β抗体を同定した。
実施例1.1.D.IL−1α及びIL−1βに対するマウスモノクローナル抗体(mAb)のクローニングと配列決定
製造業者の指示に従ってTrizol試薬(Invitrogen)を使用して各ハイブリドーマ細胞株から全RNAの単離・精製後に表1(上記)に記載した全抗IL−1α/β mAbと他の抗体の可変領域重鎖(VH)及び軽鎖(VL)遺伝子のクローニングと配列決定を行った。製造業者に提案されているようにMouse Ig−Primer Set(Novagen,Madison,WI)からのIgGVH及びIgκVLオリゴヌクレオチドとOne−tube RT−PCRキット(Qiagen)を使用してVH及びVL両者の遺伝子の増幅を行った。効率的増幅により得られたDNAフラグメントを製造業者の指示に従ってpCR−TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングした。次にABI 3000シーケンサー(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用してジデオキシチェーンターミネーション法により複数のVH及びVLクローンを配列決定した。全mAb VL及びVH遺伝子の配列を表2に示す。
製造業者の指示に従ってTrizol試薬(Invitrogen)を使用して各ハイブリドーマ細胞株から全RNAの単離・精製後に表1(上記)に記載した全抗IL−1α/β mAbと他の抗体の可変領域重鎖(VH)及び軽鎖(VL)遺伝子のクローニングと配列決定を行った。製造業者に提案されているようにMouse Ig−Primer Set(Novagen,Madison,WI)からのIgGVH及びIgκVLオリゴヌクレオチドとOne−tube RT−PCRキット(Qiagen)を使用してVH及びVL両者の遺伝子の増幅を行った。効率的増幅により得られたDNAフラグメントを製造業者の指示に従ってpCR−TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングした。次にABI 3000シーケンサー(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用してジデオキシチェーンターミネーション法により複数のVH及びVLクローンを配列決定した。全mAb VL及びVH遺伝子の配列を表2に示す。
実施例1.2.マウス−ヒトキメラ抗体の作製と特性決定
上記全mAbを(ヒト定常領域をもつ)キメラ抗体に変換し、発現させ、精製し、特性決定し、活性を確認した。その後のDVD−Ig結合性蛋白質分析用対照にもこれらの抗体を使用した。3D12.E3をキメラ形に変換するために、プライマーP1及びP2を使用して3D12.E3−VLをPCR増幅し、プライマーP3及びP4を使用してヒトCκ遺伝子(Abbott Bioresearch Center,Worcester,MAで社内作製したpBOSベクターに担持したもの)を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP1及びP4を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるキメラ軽鎖3D12.E3−VL−hCκを製造業者の指示に従ってTOPOクローニングによりpEF6 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表3はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
上記全mAbを(ヒト定常領域をもつ)キメラ抗体に変換し、発現させ、精製し、特性決定し、活性を確認した。その後のDVD−Ig結合性蛋白質分析用対照にもこれらの抗体を使用した。3D12.E3をキメラ形に変換するために、プライマーP1及びP2を使用して3D12.E3−VLをPCR増幅し、プライマーP3及びP4を使用してヒトCκ遺伝子(Abbott Bioresearch Center,Worcester,MAで社内作製したpBOSベクターに担持したもの)を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP1及びP4を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるキメラ軽鎖3D12.E3−VL−hCκを製造業者の指示に従ってTOPOクローニングによりpEF6 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表3はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
3D12.E3 重鎖をキメラ形に変換するために、プライマーP5及びP6を使用して3D12.E3−VHをPCR増幅し、プライマーP7及びP8を使用してヒトCγ1遺伝子(ABCで社内作製したpBOSベクターに担持したもの)を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP5及びP8を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるキメラ軽鎖3D12.E3−VH−hCγ1を製造業者の指示に従ってpcDNA3.1 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表4はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
同様に、プライマーP21/P22(VH)及びP7/P8(hCγ1)を使用してキメラ13F5.G5−VH−Cγ1を作製し、pcDNA3.1 TOPOベクターにクローニングし、プライマーP23/P24(VL)及びP3/P4(hCκ)を使用してキメラ13F5.G5−VL−Cκを作製し、pEF6 TOPOベクターにクローニングした。表5はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
キメラ抗体を発現させるために、Lipofectamin(Invitrogen)を使用して13F5.G5−VL−Cκと13F5.G5−VH−Cγ1をCOS細胞で72時間同時発現させ、培地を採取し、プロテインAクロマトグラフィーによりIgGを精製した。同様に、Lipofectamin(Invitrogen)を使用して13F5.G5−VL−Cκと13F5.G5−VH−Cγ1をCOS細胞で72時間同時発現させ、培地を採取し、プロテインAクロマトグラフィーによりIgGを精製した。両方の精製キメラAbをBiacoreとMRC−5バイオアッセイにより特性決定し、活性を確認した。その結果、これらのキメラAbは元のマウスmAbと同等の親和性と力価を示すことが判明した。
実施例1.3.IL−1α/β二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)分子の構築、発現及び精製
hIL−1α及びhIL−1βと結合することが可能なDVD−Ig結合性蛋白質を作製するために使用したコンストラクトを図1Bに示す。要約すると、Balb/cマウスに夫々組換えIL−1α蛋白質(rhIL−1α)と組換えIL−1β蛋白質(rhIL−1β)と免疫することにより、抗hIL−1α(クローン3D12.E3)と抗hIL−1β(クローン13F5.G5)の2種類の高親和性マウス抗体を含む親mAbを取得した。マウスIg Primer Kit(Novagen,Madison,WI)を使用してこれらの2種類のハイブリドーマクローンのVL/VH遺伝子をRT−PCRにより単離した。先ずVL/VH遺伝子を(ヒト定常領域をもつ)キメラ抗体に変換し、活性と力価を確認した。DVD1−Ig結合性蛋白質を作製するために、(図1Bに示すように)13F5.G5のVHとVLを夫々3D12.E3のVHとVLのN末端に直接融合した。軽鎖(リンカー配列はADAAP)と重鎖(リンカー配列はAKTTPP)の両者で2個の可変領域間にリンカーを配置した以外は同様にDVD2−Ig結合性蛋白質を構築した。これらの配列はマウスCk及びCH1配列のN末端から選択した。マウスCk及びCH1のN末端から選択したこれらのリンカー配列は可変領域の天然の延長であり、数個のFab結晶構造の分析によると、顕著な二次構造を含まないフレキシブルな配置を示す。PCRクローニングの詳細な手順を以下に記載する。
hIL−1α及びhIL−1βと結合することが可能なDVD−Ig結合性蛋白質を作製するために使用したコンストラクトを図1Bに示す。要約すると、Balb/cマウスに夫々組換えIL−1α蛋白質(rhIL−1α)と組換えIL−1β蛋白質(rhIL−1β)と免疫することにより、抗hIL−1α(クローン3D12.E3)と抗hIL−1β(クローン13F5.G5)の2種類の高親和性マウス抗体を含む親mAbを取得した。マウスIg Primer Kit(Novagen,Madison,WI)を使用してこれらの2種類のハイブリドーマクローンのVL/VH遺伝子をRT−PCRにより単離した。先ずVL/VH遺伝子を(ヒト定常領域をもつ)キメラ抗体に変換し、活性と力価を確認した。DVD1−Ig結合性蛋白質を作製するために、(図1Bに示すように)13F5.G5のVHとVLを夫々3D12.E3のVHとVLのN末端に直接融合した。軽鎖(リンカー配列はADAAP)と重鎖(リンカー配列はAKTTPP)の両者で2個の可変領域間にリンカーを配置した以外は同様にDVD2−Ig結合性蛋白質を構築した。これらの配列はマウスCk及びCH1配列のN末端から選択した。マウスCk及びCH1のN末端から選択したこれらのリンカー配列は可変領域の天然の延長であり、数個のFab結晶構造の分析によると、顕著な二次構造を含まないフレキシブルな配置を示す。PCRクローニングの詳細な手順を以下に記載する。
実施例1.3.A.hIL−1α/β DVD1−Ig結合性蛋白質の分子クローニング
プライマーP21及びP25を使用して13F5.G5−VHをPCR増幅した。プライマーP14及びP8を使用して3D12.E3−VH−hCγ1を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP21及びP8を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるDVD1−Ig重鎖hIL−1α/βDVD1−VH−hCγ1を製造業者の指示に従ってpcDNA3.1 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表6はこの手順で使用したPCRプライマーの配列を示す。
プライマーP21及びP25を使用して13F5.G5−VHをPCR増幅した。プライマーP14及びP8を使用して3D12.E3−VH−hCγ1を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP21及びP8を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるDVD1−Ig重鎖hIL−1α/βDVD1−VH−hCγ1を製造業者の指示に従ってpcDNA3.1 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表6はこの手順で使用したPCRプライマーの配列を示す。
hIL−1α/βDVD1−Ig軽鎖を作製するために、プライマーP23及びP26を使用して13F5.G5−VLをPCR増幅し、プライマーP16及びP4を使用して3D12.E3−VL−hCκを増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP23及びP4を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるhIL−1α/β DVD1−Ig軽鎖hIL−1α/βDVD1−VL−hCκを製造業者の指示に従ってpEF6 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表7はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
実施例1.3.B.hIL−1α/β DVD2−Igの分子クローニング
プライマーP21及びP17を使用して13F5.G5−VHをPCR増幅した。プライマーP18及びP8を使用して3D12.E3−VH−hCγ1を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP21及びP8を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるDVD2−Ig重鎖hIL−1α/βDVD2−VH−hCγ1を製造業者の指示に従ってpcDNA3.1 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表8はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
プライマーP21及びP17を使用して13F5.G5−VHをPCR増幅した。プライマーP18及びP8を使用して3D12.E3−VH−hCγ1を増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP21及びP8を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるDVD2−Ig重鎖hIL−1α/βDVD2−VH−hCγ1を製造業者の指示に従ってpcDNA3.1 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表8はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
hIL−1α/βDVD2−Ig軽鎖を作製するために、プライマーP23及びP19を使用して13F5.G5−VLをPCR増幅した。プライマーP20及びP4を使用して3D12.E3−VL−hCκを増幅した。どちらのPCR反応も標準PCR技術及び手順に従って実施した。2種類のPCR産物をゲル精製し、標準PCR条件下でプライマーP23及びP4を使用する後続オーバッラップPCR反応のオーバッラップ鋳型として一緒に使用した。最終PCR産物であるhIL−1α/βDVD2−Ig軽鎖hIL−1α/βDVD2−VL−hCκを製造業者の指示に従ってpEF6 TOPO哺乳動物発現ベクター(Invitrogen)にサブクローニングした。表9はこの手順で使用した各PCRプライマーの配列を示す。
hIL−1α/βDVD1−Ig及びhIL−1α/βDVD2−Igの最終配列を表10に記載する。
実施例1.3.C.hIL−1α/βDVD1−Ig結合性蛋白質の発現と精製
各コンストラクトの重鎖と軽鎖を夫々pcDNA3.1 TOPO及びpEF6 TOPOベクター(Invitrogen Inc.)にサブクローニングし、配列決定し、間違いないことを確認した。夫々Lipofectamine 2000及び293fectin試薬を使用して各コンストラクトの重鎖と軽鎖をコードするプラスミドをCOS細胞とヒト胚性腎293細胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)で一過性発現させた。一過性トランスフェクションから72時間後に細胞培養培地を採取し、製造業者の指示に従ってプロテインAクロマトグラフィー(Pierce,Rockford,IL)を使用して抗体を精製した。抗体をSDS−PAGEにより分析し、A280及びBCA(Pierce,Rockford,IL)により定量した。表11から明らかなように、hIL−1α/βDVD1−IgとhIL−1α/βDVD2−Igの発現レベルはキメラ抗体の発現レベルと同等であり、DVD−Ig結合性蛋白質を哺乳動物細胞で効率的に発現させることができると判断される。
各コンストラクトの重鎖と軽鎖を夫々pcDNA3.1 TOPO及びpEF6 TOPOベクター(Invitrogen Inc.)にサブクローニングし、配列決定し、間違いないことを確認した。夫々Lipofectamine 2000及び293fectin試薬を使用して各コンストラクトの重鎖と軽鎖をコードするプラスミドをCOS細胞とヒト胚性腎293細胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)で一過性発現させた。一過性トランスフェクションから72時間後に細胞培養培地を採取し、製造業者の指示に従ってプロテインAクロマトグラフィー(Pierce,Rockford,IL)を使用して抗体を精製した。抗体をSDS−PAGEにより分析し、A280及びBCA(Pierce,Rockford,IL)により定量した。表11から明らかなように、hIL−1α/βDVD1−IgとhIL−1α/βDVD2−Igの発現レベルはキメラ抗体の発現レベルと同等であり、DVD−Ig結合性蛋白質を哺乳動物細胞で効率的に発現させることができると判断される。
実施例1.4.hIL−1α/βDVD−Ig結合性蛋白質の質量分析とSEC分析
DVD−Ig結合性蛋白質の軽鎖と重鎖の分子量(MW)を測定するために、DVD−Ig分子(0.8μg/μL)10μLを1.0M DTT溶液(5μL)で希釈した。PLRP−S,8μ,4000A及び1×150mmの蛋白質カラム(Michrom BioResource,Auburn,MA)を使用し、DVD−Ig分子の重鎖と軽鎖を分離した。Agilent HP1100 Capillary HPLC(Agilent Technologies Inc.,Pala Alto,CA)を質量分析計QSTAR(Applied Biosystems,Foster City,CA)と共に使用した。valcoバルブを10分に設定し、サンプル脱塩のために流れを廃液からMSに切替えた。バッファーAは0.02%TFA、0.08%FA、0.1%ACN及び99.8%HPLC−H2Oとした。バッファーBは0.02%TFA、0.08%FA、0.1%HPLC−H2O及び99.8%ACNとした。HPLC流速は50μL/分とし、サンプル注入量は8.0mLとした。カラムオーブンの温度は60℃に設定し、分離勾配は5%Bで5分間、5%B→65%Bで35分間、65%B→95%Bで更に5分間、95%B→5%Bで5分間とした。TOFMSスキャンは800〜2500amuとし、サイクルは3600とした。全長DVD−Ig結合性蛋白質のMWを求めるために、Protein MicroTrapカートリッジ(Michrom BioResource,Auburn,MA)をサンプルの脱塩に使用した。HPLC勾配は5%Bで5分間、5%B→95%Bで1分間、95%B→5%Bで更に4分間とした。QSTAR TOFMSスキャンは2000〜3500amuとし、サイクルは899とした。Analyst QSソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して全MS生データを分析した。DVD−Ig結合性蛋白質のSEC分析には、精製DVD−Ig結合性蛋白質とキメラAbのPBS溶液をSuperose 6 10/300 G2,300×10mmカラム(Amersham Bioscience,Piscataway,NJ)にアプライした。HPLC機器としてModel 10A(Shimadzu,Columbia,MD)をSECに使用した。280nmと214nmにおけるUV検出を使用して全蛋白質を測定した。溶出は流速0.5mL/分でアイソクラチックとした。安定性試験では、PBS中0.2〜0.4mg/mlの濃度範囲のサンプルを−80℃〜25℃で3サイクルの凍結−解凍サイクルに供し、あるいは4℃、25℃又は40℃で4週間及び8週間インキュベートした後にSEC分析に供した。
DVD−Ig結合性蛋白質の軽鎖と重鎖の分子量(MW)を測定するために、DVD−Ig分子(0.8μg/μL)10μLを1.0M DTT溶液(5μL)で希釈した。PLRP−S,8μ,4000A及び1×150mmの蛋白質カラム(Michrom BioResource,Auburn,MA)を使用し、DVD−Ig分子の重鎖と軽鎖を分離した。Agilent HP1100 Capillary HPLC(Agilent Technologies Inc.,Pala Alto,CA)を質量分析計QSTAR(Applied Biosystems,Foster City,CA)と共に使用した。valcoバルブを10分に設定し、サンプル脱塩のために流れを廃液からMSに切替えた。バッファーAは0.02%TFA、0.08%FA、0.1%ACN及び99.8%HPLC−H2Oとした。バッファーBは0.02%TFA、0.08%FA、0.1%HPLC−H2O及び99.8%ACNとした。HPLC流速は50μL/分とし、サンプル注入量は8.0mLとした。カラムオーブンの温度は60℃に設定し、分離勾配は5%Bで5分間、5%B→65%Bで35分間、65%B→95%Bで更に5分間、95%B→5%Bで5分間とした。TOFMSスキャンは800〜2500amuとし、サイクルは3600とした。全長DVD−Ig結合性蛋白質のMWを求めるために、Protein MicroTrapカートリッジ(Michrom BioResource,Auburn,MA)をサンプルの脱塩に使用した。HPLC勾配は5%Bで5分間、5%B→95%Bで1分間、95%B→5%Bで更に4分間とした。QSTAR TOFMSスキャンは2000〜3500amuとし、サイクルは899とした。Analyst QSソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して全MS生データを分析した。DVD−Ig結合性蛋白質のSEC分析には、精製DVD−Ig結合性蛋白質とキメラAbのPBS溶液をSuperose 6 10/300 G2,300×10mmカラム(Amersham Bioscience,Piscataway,NJ)にアプライした。HPLC機器としてModel 10A(Shimadzu,Columbia,MD)をSECに使用した。280nmと214nmにおけるUV検出を使用して全蛋白質を測定した。溶出は流速0.5mL/分でアイソクラチックとした。安定性試験では、PBS中0.2〜0.4mg/mlの濃度範囲のサンプルを−80℃〜25℃で3サイクルの凍結−解凍サイクルに供し、あるいは4℃、25℃又は40℃で4週間及び8週間インキュベートした後にSEC分析に供した。
DVD−Ig結合性蛋白質とキメラ抗体をプロテインAクロマトグラフィーにより精製した。精製収率(3〜5mg/L)は各蛋白質の発現培地のhIgG定量に一致した。精製DVD−Ig結合性蛋白質とキメラ抗体の組成と純度を還元条件下と非還元条件下でSDS−PAGEにより分析した。非還元条件下で4種類の蛋白質は各々単一のバンドとして泳動した。DVD−Ig蛋白質は予想通り、キメラ抗体よりも大きな分子量を示した。非還元条件下で4種類の蛋白質は各々重鎖1本と軽鎖1本の2個のバンドを生じた。この場合も、DVD−Ig結合性蛋白質の重鎖と軽鎖はキメラ抗体よりもサイズが大きかった。SDS−PAGEは各DVD−Ig結合性蛋白質が単一種として発現され、重鎖と軽鎖が効率的に対合してIgG様分子を形成することを示した。2種類のDVD−Ig分子の重鎖及び軽鎖及び全長蛋白質のサイズはアミノ酸配列に基づくその分子量計算値と一致する(表11参照)。
DVD−Ig結合性蛋白質の厳密な分子量を求めるために、質量分析法を利用した。表1に示すように、軽鎖、重鎖及び全長蛋白質を含む各DVD−Ig結合性蛋白質の実験的に求めた分子量は推定値とよく一致する。溶液中のDVD−Ig結合性蛋白質の物理的性質を更に検討するために、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して各蛋白質を分析した。キメラAbとDVD2−Ig結合性蛋白質はいずれも単一ピークを示し、モノマー蛋白質として物理的に均質であることが実証された。3D12.E3キメラAbは物理的サイズが13F5.G5キメラAbよりも小さく、3D12.E3キメラAbはよりコンパクトな球形であることが分かった。DVD1−Ig結合性蛋白質は右側に主ピークと肩ピークを示したことから、DVD1−Ig結合性蛋白質の一部は恐らく現在の緩衝液条件下で凝集形であると予想される。
実施例1.5:hIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質のインビトロ安定性の分析
DVD−Igの物理的安定性を以下のように試験した。PBS中0.2〜0.4mg/mlの濃度範囲の精製抗体を−80℃〜25℃で3サイクルの凍結−解凍サイクルに供し、あるいは4℃、25℃又は40℃で4週間及び8週間インキュベートした後にサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析法を使用して分析した(表12参照)。
DVD−Igの物理的安定性を以下のように試験した。PBS中0.2〜0.4mg/mlの濃度範囲の精製抗体を−80℃〜25℃で3サイクルの凍結−解凍サイクルに供し、あるいは4℃、25℃又は40℃で4週間及び8週間インキュベートした後にサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析法を使用して分析した(表12参照)。
どちらのキメラ抗体も通常のIgG分子に一般的な低度の凝集と断片化を示した。DVD1−Ig結合性蛋白質は精製後にSECで多少の凝集を示した。安定性分析でも、DVD1−Ig結合性蛋白質は各種条件下でPBS中で凝集を示したが、DVD1−Ig結合性蛋白質の凝集形態の百分率は長期保存中又は高温で増加しなかった。DVD1−Ig結合性蛋白質の断片化形態の百分率はキメラ3D12.E3 Abと同等の正常な範囲内であった。他方、DVD2−Ig結合性蛋白質は非常に高い安定性を示した。試験した全条件下でDVD2−Ig結合性蛋白質には凝集も断片化も検出されず、DVD2−Ig結合性蛋白質の100%が無傷のモノマー分子として維持された。
実施例1.6.hIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質の抗原結合親和性の測定
25℃のHBS−EP(10mM HEPES,pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA及び0.005%界面活性剤P20)を使用してBiacore 3000機器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)で表面プラズモン共鳴測定によりDVD−Ig分子のrhIL1−α及びrhIL1−βとの結合動態を測定した。全薬品はBiacore AB(Uppsala,Sweden)又は本願に記載する他の業者から入手した。ヤギ抗ヒトIgG Fcγフラグメントに特異的なポリクローナル抗体(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL)約5000RUを10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で希釈し、製造業者の指示と手順に従って標準アミンカップリングキットを25mg/mlで使用してCM5研究グレードバイオセンサーチップに直接固定化した。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロックした。フローセル2及び4内の修飾カルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用した。フローセル1及び3内のヤギ抗ヒトIgGを固定化していない未修飾カルボキシメチルデキストランを参照表面として使用した。動態分析のために、1:1ラングミュア結合モデルから導出した速度方程式をBioevaluation 4.0.1ソフトウェアを使用して(グローバルフィット分析を使用して)全10回の注入の会合相と解離相に同時にフィットさせた。ヤギ抗ヒトIgG Fc特異反応表面に捕捉するために精製DVD−IgサンプルをHEPES緩衝生理食塩水で希釈し、流速5ml/分で反応マトリックスに注入した。25ml/分の連続流速下で会合速度定数と解離速度定数であるkon(M−1s−1)とkoff(s−1)を求めた。1.25〜1000nMの10種類の異なる抗原濃度で動態結合測定を行うことにより速度定数を求めた。次に次式:KD=koff/konにより動態速度定数からDVD−Ig分子とrhIL1α/βの反応の平衡解離定数(M)を計算した。rhIL1α/βサンプルのアリコートも同時にブランク参照表面と反応CM表面に注入し、非特異的結合バックグラウンドがある場合にはこれを記録して差し引き、屈折率変化と注入ノイズの大部分を排除した。次に10mMグリシン(pH1.5)25mlを流速5ml/分で2回注入して表面を再生させた。抗Fc抗体を固定化した表面は完全に再生され、12サイクルにわたってその完全捕捉能を維持した。下式:
25℃のHBS−EP(10mM HEPES,pH7.4,150mM NaCl,3mM EDTA及び0.005%界面活性剤P20)を使用してBiacore 3000機器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)で表面プラズモン共鳴測定によりDVD−Ig分子のrhIL1−α及びrhIL1−βとの結合動態を測定した。全薬品はBiacore AB(Uppsala,Sweden)又は本願に記載する他の業者から入手した。ヤギ抗ヒトIgG Fcγフラグメントに特異的なポリクローナル抗体(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL)約5000RUを10mM酢酸ナトリウム(pH4.5)で希釈し、製造業者の指示と手順に従って標準アミンカップリングキットを25mg/mlで使用してCM5研究グレードバイオセンサーチップに直接固定化した。バイオセンサー表面上の未反応部分をエタノールアミンでブロックした。フローセル2及び4内の修飾カルボキシメチルデキストラン表面を反応表面として使用した。フローセル1及び3内のヤギ抗ヒトIgGを固定化していない未修飾カルボキシメチルデキストランを参照表面として使用した。動態分析のために、1:1ラングミュア結合モデルから導出した速度方程式をBioevaluation 4.0.1ソフトウェアを使用して(グローバルフィット分析を使用して)全10回の注入の会合相と解離相に同時にフィットさせた。ヤギ抗ヒトIgG Fc特異反応表面に捕捉するために精製DVD−IgサンプルをHEPES緩衝生理食塩水で希釈し、流速5ml/分で反応マトリックスに注入した。25ml/分の連続流速下で会合速度定数と解離速度定数であるkon(M−1s−1)とkoff(s−1)を求めた。1.25〜1000nMの10種類の異なる抗原濃度で動態結合測定を行うことにより速度定数を求めた。次に次式:KD=koff/konにより動態速度定数からDVD−Ig分子とrhIL1α/βの反応の平衡解離定数(M)を計算した。rhIL1α/βサンプルのアリコートも同時にブランク参照表面と反応CM表面に注入し、非特異的結合バックグラウンドがある場合にはこれを記録して差し引き、屈折率変化と注入ノイズの大部分を排除した。次に10mMグリシン(pH1.5)25mlを流速5ml/分で2回注入して表面を再生させた。抗Fc抗体を固定化した表面は完全に再生され、12サイクルにわたってその完全捕捉能を維持した。下式:
Biacore分析の結果、キメラ抗体は結合動態とIL−1に対する親和性が元のハイブリドーマモノクローナル抗体と同等であり、正しいVL/VH配列が単離されたと判断された(表13)。2種類のDVD−Ig結合性蛋白質のhIL−1αに対する総結合パラメーターは同等であり、DVD−Ig結合性蛋白質の親和性はキメラ3D12.E3抗体の親和性の僅か2〜3分の1であった。DVD2−Ig結合性蛋白質のhIL−1βに対する結合親和性はキメラ抗体13F5.G5よりもやや低いが、DVD1−Ig結合性蛋白質の3倍であった。2種類のDVD−Ig結合性蛋白質のhIL−1に対する親和性をキメラ抗体のhIL−1に対する親和性と比較すると、IL−1に対する化学量論比の評価により示されるように同等であった。どちらのキメラ抗体も2価単一特異性であり、夫々化学量論比1.6及び1.7でBiacore上のIL−1α及びIL−1βと結合した。これは抗体をBiacoreセンサーチップに稠密に固定化して化学量論比を1.5〜2.0とする場合に分子間干渉によりIgGに共通である。hIL−1α及びhIL−1βに対する2種類のDVD−Ig結合性蛋白質の化学量論比は2種類のキメラ抗体と同等であり、どちらのDVD−Ig結合性蛋白質も各抗原に対して2価結合能をもつことが分かった。
更に、DVD−Ig結合性蛋白質の4価二重特異性抗原結合についてもBiacoreにより分析した(表14)。先ずヤギ抗ヒトFc抗体を介してDVD−Ig結合性蛋白質をBiacoreセンサーチップに捕捉し、第1の抗原を注入し、結合シグナルを観測した。DVD−Ig結合性蛋白質は第1の抗原により飽和されたので、次に第2の抗原を注入し、第2のシグナルを観測した。これはDVD2−Ig結合性蛋白質では、先ずIL−1βを注入した後にIL−1αを注入するか、又はIL−1αを注入した後にIL−1βを注入することにより実施した。どちらの配列にも二重結合活性が検出された。DVD1−Ig結合性蛋白質でも同様の結果が得られた。即ち、各DVD−Ig結合性蛋白質は二重特異性4価分子として両方の抗原に同時に結合することができた。表14に示すように、第1の抗原に対する両方のDVD−Ig結合性蛋白質hIL−1α又はhIL−1βの化学量論比は単一特異性2価結合と同様に1.5よりも大きかった。DVD−Ig結合性蛋白質が既に第1の抗原により占有されている間に第2の抗原を注入すると、第2の抗原に対する両方のDVD−Ig結合性蛋白質(即ちhIL−1α又はhIL−1β)の化学量論比は1.0〜1.3であった。従って、DVD−Ig結合性蛋白質は2個のIL−1α分子と2個のIL−β分子とに結合することができた。先ずヤギ抗ヒトFc抗体を介してDVD−Ig結合性蛋白質をBiacoreセンサーチップ上に捕捉し、第1の抗原を注入し、結合シグナルを観測した後、第2の抗原を注入した。
実施例1.7.DVD−Ig分子の機能的均質性の判定
DVD2−Ig結合性蛋白質は標的特異的親和性クロマトグラフィーではなくプロテインAクロマトグラフィーにより精製したので、ミスフォールディング及び/又はミスマッチのあるVL/VH領域が存在する可能性があるが、その場合には、これらの2種類の抗原に対する結合試験により判定することができる。このような結合アッセイをサイズ排除液体クロマトグラフィー(SEC)により実施した。DVD2−Ig結合性蛋白質をそのまま、又はIL−1α、IL−1βもしくは等モル比のIL−1αとIL−1βの存在下で37℃にて120分間インキュベーション後にカラムにアプライした。各抗原も対照として単独で泳動させた。SEC結果によると、DVD2−Ig結合性蛋白質は溶液中のIL−1α及びIL−1βと結合することができ、このような結合の結果、どちらの抗原との複合体として存在する場合にもDVD2−Ig結合性蛋白質の動的サイズの増加を示すSECシグナルにシフトした。DVD2−Ig結合性蛋白質シグナルのシフトは一部ではなく、100%であり、全DVD2−Ig分子が抗原と結合できたと予想された。IL−1α及びIL−1βのどちらの存在下でも、DVD2−Ig結合性蛋白質シグナルが更に完全にシフトし、全DVD2−Ig分子が同様に両方の抗原と結合できたと判断された。この実験の結果、DVD−Ig結合性蛋白質は機能的に均質な蛋白質として発現されることが立証された。従来記載されている全ての二重特異性、多重特異性及び多価免疫グロブリン様及び免疫グロブリン由来分子とは異なる均質な単一機能種としてDVD−Ig結合性蛋白質を作製できることが分かったので、これは有意義である。
DVD2−Ig結合性蛋白質は標的特異的親和性クロマトグラフィーではなくプロテインAクロマトグラフィーにより精製したので、ミスフォールディング及び/又はミスマッチのあるVL/VH領域が存在する可能性があるが、その場合には、これらの2種類の抗原に対する結合試験により判定することができる。このような結合アッセイをサイズ排除液体クロマトグラフィー(SEC)により実施した。DVD2−Ig結合性蛋白質をそのまま、又はIL−1α、IL−1βもしくは等モル比のIL−1αとIL−1βの存在下で37℃にて120分間インキュベーション後にカラムにアプライした。各抗原も対照として単独で泳動させた。SEC結果によると、DVD2−Ig結合性蛋白質は溶液中のIL−1α及びIL−1βと結合することができ、このような結合の結果、どちらの抗原との複合体として存在する場合にもDVD2−Ig結合性蛋白質の動的サイズの増加を示すSECシグナルにシフトした。DVD2−Ig結合性蛋白質シグナルのシフトは一部ではなく、100%であり、全DVD2−Ig分子が抗原と結合できたと予想された。IL−1α及びIL−1βのどちらの存在下でも、DVD2−Ig結合性蛋白質シグナルが更に完全にシフトし、全DVD2−Ig分子が同様に両方の抗原と結合できたと判断された。この実験の結果、DVD−Ig結合性蛋白質は機能的に均質な蛋白質として発現されることが立証された。従来記載されている全ての二重特異性、多重特異性及び多価免疫グロブリン様及び免疫グロブリン由来分子とは異なる均質な単一機能種としてDVD−Ig結合性蛋白質を作製できることが分かったので、これは有意義である。
実施例1.8.DVD−Ig結合性蛋白質の生物学的活性の測定
MRC−5バイオアッセイを使用してDVD−Igの生物学的活性を測定した。MRC−5細胞株はヒトIL−1α及びIL−1βに応答して用量依存的にIL−8を産生するヒト胚線維芽細胞細胞株である。MRC−5細胞をATCCから入手し、5%CO2インキュベーターで10%FBS完全MEM中で37℃にて培養した。ヒトIL−1α又はIL−1βに対するDVD−Igの中和活性を測定するために、抗体(1×10−7〜1×10−12M)50μlをMEM/10%FBS溶液として96ウェルプレートに加え、hIL−1又はhIL−1β(200pg/ml)50μlと共に1時間37℃、5%CO2にてプレインキュベートした。次にMRC−5細胞を濃度1×105/ml(100μl)で全ウェルに加え、プレートを5%CO2インキュベーターで37℃にて一晩インキュベートした。上清を採取し、ヒトIL−8産生を標準ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)により測定した。IL−8産生を阻害するその能力によりDVD−Ig結合性蛋白質の中和活性を求めた。
MRC−5バイオアッセイを使用してDVD−Igの生物学的活性を測定した。MRC−5細胞株はヒトIL−1α及びIL−1βに応答して用量依存的にIL−8を産生するヒト胚線維芽細胞細胞株である。MRC−5細胞をATCCから入手し、5%CO2インキュベーターで10%FBS完全MEM中で37℃にて培養した。ヒトIL−1α又はIL−1βに対するDVD−Igの中和活性を測定するために、抗体(1×10−7〜1×10−12M)50μlをMEM/10%FBS溶液として96ウェルプレートに加え、hIL−1又はhIL−1β(200pg/ml)50μlと共に1時間37℃、5%CO2にてプレインキュベートした。次にMRC−5細胞を濃度1×105/ml(100μl)で全ウェルに加え、プレートを5%CO2インキュベーターで37℃にて一晩インキュベートした。上清を採取し、ヒトIL−8産生を標準ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)により測定した。IL−8産生を阻害するその能力によりDVD−Ig結合性蛋白質の中和活性を求めた。
表13に示すように、どちらのDVD−Ig結合性蛋白質もhIL−1αとhIL−1βを中和させることができた。hIL−1αに対する結合親和性と一致し、hIL−1αに対するDVD1−Ig結合性蛋白質及びDVD2−Ig結合性蛋白質の中和活性も同等であり、即ちキメラ抗体の3分の1であった(表13参照)。hIL−1βに対するその結合親和性と一致し、hIL−1βに対するDVD2−Ig結合性蛋白質の中和活性はキメラAb 13F5.G5よりもやや低いが、DVD1−Ig結合性蛋白質の3倍であった。全体としては、元のモノクローナル抗体と比較してDVD−Ig分子の生物学的活性の有意低下はなかった。
DVD−Ig結合性蛋白質がIL−1αとIL−1βの共存下でIL−8産生を阻害することができたか否かを判定するために、等量のhIL−1αとhIL−1βをMRC−5アッセイの同一培養システムに加えた。DVD1−Ig結合性蛋白質とDVD2−Ig結合性蛋白質のどちらもIL−1αとIL−1βの共存下でMRC−5細胞によるIL−8合成を阻害することができ、活性は一方のサイトカインのみを介在させたモノアッセイの活性と同等であった(表13)。IL−1αとIL−1βを共存させたこのアッセイでは、DVD2−Ig結合性蛋白質の二重阻害活性(1.2nM)はDVD1−Ig結合性蛋白質の活性(2.2nM)よりも高かった。
実施例2.DVD−Ig結合性蛋白質におけるリンカーサイズと可変領域の向きの分析
表15に示すような種々の親mAb対を使用して他のDVD−Ig分子を構築した。mAb対毎に4種類の異なるDVD−Igコンストラクトを作製し、2種類には短いリンカーを使用し、2種類には長いリンカーを使用し、各々a−b−C(α−β−定常領域)及びb−a−C(β−α−定常領域)の2種類の領域の向きとした。リンカー配列はヒトCk又はCH1領域のN末端配列に由来するものとし、短いリンカーは軽鎖TVAAP(配列番号71)、重鎖ASTKGP(配列番号79)とし、長いリンカーは軽鎖TVAAPSVFIFPP(配列番号72)、重鎖ASTKGPSVFPLAP(配列番号80)とした。
表15に示すような種々の親mAb対を使用して他のDVD−Ig分子を構築した。mAb対毎に4種類の異なるDVD−Igコンストラクトを作製し、2種類には短いリンカーを使用し、2種類には長いリンカーを使用し、各々a−b−C(α−β−定常領域)及びb−a−C(β−α−定常領域)の2種類の領域の向きとした。リンカー配列はヒトCk又はCH1領域のN末端配列に由来するものとし、短いリンカーは軽鎖TVAAP(配列番号71)、重鎖ASTKGP(配列番号79)とし、長いリンカーは軽鎖TVAAPSVFIFPP(配列番号72)、重鎖ASTKGPSVFPLAP(配列番号80)とした。
全重鎖及び軽鎖コンストラクトをpBOS発現ベクターにサブクローニングし、COS細胞又はfreestyle 293細胞で発現させた。
新規DVD−Igクローンを構築するために、hIL−1α/βDVD1−Ig及びhIL−1α/βDVD2−Igについて記載したようにオーバーラップPCRを使用して先ず2種類のmAbの軽鎖及び重鎖可変領域をタンデムに連結した。次に連結した部分を相同組換えによりpBOSベクターにサブクローニングした。要約すると、ベクターを制限消化により直鎖化した(pBOS−hCkベクター2μgをO+バッファー中でFspAIとBsiWIで消化し、pBOS−hCγz,non aベクター2μgをO+バッファー中でFspAIとSaIIで消化した)。消化したサンプルを1%アガロースゲル上で泳動させ、主鎖フラグメントを水50μl中で精製した。相同組換えと形質転換のために、DH5αコンピテント細胞を氷上で解凍し、連結したPCR産物20〜50ng及び直鎖化ベクター20〜50ngと混合した(DH5α細胞50μl当たり)。混合物を静かに混合し、氷上で45分間インキュベート後、42℃で1分間ヒートショックを与えた。次に、SOC培地100μlを加え、37℃で1時間インキュベートした。アンピシリンを添加したLB/寒天プレートに形質転換培養物を接種し、37℃で18〜20時間インキュベートした。細菌クローンを単離し、このクローンからDNAを精製し、シーケンシング解析した。配列を確認した最終クローンを従来記載されているように、抗体発現・精製用COS又は293細胞にコトランスフェクトした(同一抗体対のHVとLCをマッチさせた)。
精製DVD−Ig蛋白質の特性を表16に示す。表16の左側は新規hIL−1α/β DVD−Ig分子の作製に使用した2対のmAbの特異性、結合親和性及び中和力価を示す。抗体18F4.2C8及び1B12.4H4(実施例1.1.D参照)を使用してhIL−1α/β DVD3a−Ig、hIL−1α/β DVD4a−Ig、hIL−1α/β DVD3b−Ig及びhIL−1α/β DVD4b−Igを作製した。hIL−1α/βDVD3a−IgとhIL−1α/βDVD4a−Igは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してa−b−Cの向きとした。hIL−1α/βDVD3b−IgとhIL−1α/βDVD4b−Igは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してb−a−Cの向きとした。抗体6H3.1A4及び6B12.4F6を使用し、hIL−1α/βDVD5a−Ig、hIL−1α/βDVD6a−Ig、hIL−1α/β DVD5b−Ig及びhIL−1α/β DVD6b−Igを作製した。hIL−1α/β DVD5a−IgとhIL−1α/βDVD6a−Igは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してa−b−Cの向きとした。hIL−1α/β DVD5b−IgとhIL−1α/βDVD6b−Igは夫々短いリンカーと長いリンカーを介してb−a−Cの向きとした。hIL−1α/β DVD1−Igについて上述した手順(実施例1.3参照)を使用し、オーバーラップPCR法を使用してこれらの他のhIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質の分子クローニングを実施した。これらの他のhIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質のアミノ酸配列を表15に開示する。
新規DVD−Igコンストラクトの特性を表16にまとめる。親和性(Kd)と生物学的活性(IC50)は夫々BiacoreとMRC−5バイオアッセイにより測定した。全新規DVD−Ig蛋白質のSDS−PAGE分析は還元条件下と非還元条件下のどちらでも通常の抗体及びDVD1/2−Igと同様の正常な泳動パターンを示した。
新規DVD−Ig分子の機能的特性決定の結果、どちらの向きでも長いリンカーを使用したDVD−Ig分子は短いリンカーを使用したものよりも両者抗原との結合及び中和に関して良好に機能することが判明した。長いリンカーを使用したDVD−Ig分子については、b−a−Cの向きのものは両者抗原との良好な結合と中和を示したが、a−b−Cの向きのDVD−Ig分子はIL−1αとの結合及び中和は良好であったが、IL−1βとの結合及び中和は低下した(例えばDVD4bとDVD4aを比較)。DVD−Ig分子のうち、DVD4bはnM未満のレベルでIL−1α及びIL−1βの両者と結合して中和し、親mAbの結合及び中和特性を完全に維持した。
実施例3.mIL−1α/β DVD−Ig分子の作製
DVD−Ig分子の薬物動態、インビボ効力、組織浸透性及び免疫原性に関する主要な問題を検討するために、マウス抗マウスIL−1α/β DVD−Ig分子を以下のように構築した。
DVD−Ig分子の薬物動態、インビボ効力、組織浸透性及び免疫原性に関する主要な問題を検討するために、マウス抗マウスIL−1α/β DVD−Ig分子を以下のように構築した。
実施例3.1.mIL−1α/β DVD−Ig分子の構築
IL−1αβ二重KOマウスから作製した2種類のマウス抗マウスIL−1α/βモノクローナル抗体(9H10及び10G11)を使用してマウス抗マウスIL−1α/β DVD−Ig分子を構築した。IL−1α/β二重KOマウスに夫々マウスIL−1α又はマウスIL−1βを免疫することによりマウス抗マウスIL−1α及びマウス抗マウスIL−1βモノクローナル抗体(mAb)を作製した。マウス抗マウスIL−1α mAb1株(クローン9H10)とマウス抗マウスIL−1β mAb1株(クローン10G11)を選択及び使用してmIL−1α/β DVD−Ig分子を作製した。種々のリンカーサイズと種々の領域の向きを試験した。最終的な機能的mIL−1α/β DVD−Ig分子はV(抗mIL−1β)−リンカー−V(抗mIL−1α)−マウス定常領域(Cγ2a及びCκ)の向きで構築した。クローニング、発現及び精製手順はhIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質と同様とした。mIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質のクローニングはhIL−1α/β DVD3−Igについて記載したように同様のオーバーラップPCRと相同組換えを使用して実施した。mIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質の配列を下表17に示す。
IL−1αβ二重KOマウスから作製した2種類のマウス抗マウスIL−1α/βモノクローナル抗体(9H10及び10G11)を使用してマウス抗マウスIL−1α/β DVD−Ig分子を構築した。IL−1α/β二重KOマウスに夫々マウスIL−1α又はマウスIL−1βを免疫することによりマウス抗マウスIL−1α及びマウス抗マウスIL−1βモノクローナル抗体(mAb)を作製した。マウス抗マウスIL−1α mAb1株(クローン9H10)とマウス抗マウスIL−1β mAb1株(クローン10G11)を選択及び使用してmIL−1α/β DVD−Ig分子を作製した。種々のリンカーサイズと種々の領域の向きを試験した。最終的な機能的mIL−1α/β DVD−Ig分子はV(抗mIL−1β)−リンカー−V(抗mIL−1α)−マウス定常領域(Cγ2a及びCκ)の向きで構築した。クローニング、発現及び精製手順はhIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質と同様とした。mIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質のクローニングはhIL−1α/β DVD3−Igについて記載したように同様のオーバーラップPCRと相同組換えを使用して実施した。mIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質の配列を下表17に示す。
マウスmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質はマウスIL−1α(mIL−1α)及びマウスIL−1β(mIL−1β)の両方に対する親和性/インビトロ力価を維持した。表18はmAb9H10(抗mIL−1α)、10G11(抗mIL−1β)及びmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質の特性を示す。
実施例3.2.関節リウマチモデルにおけるmIL−1α/βDVD−Ig結合性蛋白質のインビボ活性
当分野で周知のコラーゲン誘発性関節炎マウスモデルで抗IL−1α、抗IL−1β、抗IL−1α/抗IL−1β併用、及びマウスIL−1α/β DVD4−Igの治療効果を評価した。要約すると、雄性DBA−1マウスの尾基部にウシII型コラーゲンのCFA溶液を投与して免疫した。21日目にマウスにザイモサンを腹腔内(i.p)ブースター免疫した。24〜27日目に疾患発症後にマウスを選択し、10匹ずつの群に分けた。対照群と抗サイトカイン群の平均関節炎スコアは治療開始時と同等であった。IL−1を中和させるために、1〜3mg/kgの抗IL−1α mAb、抗IL−1β mAb、抗IL−1αと抗IL−1β mAbの併用、又はマウスIL−1α/β DVD4−Igを1日おきにマウスに腹腔内注射した。末梢関節における関節炎の目視外観についてマウスを週3回慎重に試験し、疾患活性のスコアを求めた。
当分野で周知のコラーゲン誘発性関節炎マウスモデルで抗IL−1α、抗IL−1β、抗IL−1α/抗IL−1β併用、及びマウスIL−1α/β DVD4−Igの治療効果を評価した。要約すると、雄性DBA−1マウスの尾基部にウシII型コラーゲンのCFA溶液を投与して免疫した。21日目にマウスにザイモサンを腹腔内(i.p)ブースター免疫した。24〜27日目に疾患発症後にマウスを選択し、10匹ずつの群に分けた。対照群と抗サイトカイン群の平均関節炎スコアは治療開始時と同等であった。IL−1を中和させるために、1〜3mg/kgの抗IL−1α mAb、抗IL−1β mAb、抗IL−1αと抗IL−1β mAbの併用、又はマウスIL−1α/β DVD4−Igを1日おきにマウスに腹腔内注射した。末梢関節における関節炎の目視外観についてマウスを週3回慎重に試験し、疾患活性のスコアを求めた。
治療モードでIL−1を遮断すると、関節炎重篤度が有効に低下し、抗IL−1β(対照群に比較して平均関節炎スコアの24%低下)は抗IL−1α(10%低下)よりも高い効力を示す。抗IL−1αと抗IL−1βの間には相加効果が認められ、抗IL−1α mAbと抗IL−1β mAbを併用投与したマウスにおける平均関節炎スコアは40%低下した。驚くべきことに、同一用量レベルでmDVD−Ig結合性蛋白質を投与すると、平均関節炎スコアは47%低下を示し、mDVD−Ig結合性蛋白質のインビボ治療効果が立証された。この動物モデルでは関節腫脹の測定でも同様の効力が認められた。
実施例3.3.変形性関節症モデルにおけるマウスIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質のインビボ活性
上記試験の結果、抗マウスIL−1α及びIL−1β抗体の併用とマウス抗マウスIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質でIL−1αとIL−1βを同時に遮断すると、関節リウマチのマウスコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいてどちらか一方の抗体単独よりも有意に効果的であることが分かった(Wu et al.,Nature Biotech.,25(11):12901297(2007)も参照)。OAの2種類の動物モデル、即ちマウスの関節不安定性モデル(「JIM」)と内側半月板不安定化モデル(「DMM」)で変形性関節症(OA)における抗IL−1療法の効力を試験した。
上記試験の結果、抗マウスIL−1α及びIL−1β抗体の併用とマウス抗マウスIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質でIL−1αとIL−1βを同時に遮断すると、関節リウマチのマウスコラーゲン誘発性関節炎(CIA)モデルにおいてどちらか一方の抗体単独よりも有意に効果的であることが分かった(Wu et al.,Nature Biotech.,25(11):12901297(2007)も参照)。OAの2種類の動物モデル、即ちマウスの関節不安定性モデル(「JIM」)と内側半月板不安定化モデル(「DMM」)で変形性関節症(OA)における抗IL−1療法の効力を試験した。
実施例3.3.1.マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル(JIM)におけるマウス抗マウスIL−1α及び抗マウスIL−1βモノクローナル抗体のインビボ活性
実施例3.3.1.A.試験デザイン
マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル(JIM)におけるmIL−1α/β DVD−Ig分子のインビボ活性の試験デザインを表19に示す。全群は体重30グラム(BW=30g)のマウス25匹(n=25)とした。21日後に試験を終了した。2.5カ月齢雄性Swiss Websterマウス(25匹/群/時点)を5匹ずつケージに入れ、イソフルランで麻酔した。OA病変を誘発させようとして0日目に左右膝に前十字靱帯(ACL)外傷を形成した。IL−1阻害抗体IL−1α(9H10)及びIL−1β(10G11)の単独又は併用腹腔内(ip)投与をACL外傷日に開始し、4日おき(q4d)に20日間続けた。非投与対照のビヒクルはPBSとした。左右膝を21日目に採取し、組織病理学的変化を採点し、特性決定した。不安定性誘発の成功を示す増殖応答のあった関節のみを使用してデータを分析した。増殖応答/不安定性を0〜3で採点し、不安定な関節(スコア1、2又は3)のみを最終分析に使用した。内側及び外側大腿骨及び脛骨軟骨変性を軟骨変性の重篤度について0〜5のスケールで採点した。最後の抗体投与から4日後に、血清採取用に各群の全動物から採血した。体重を毎週記録した。最終日に動物(群1、2、3、4で10匹ずつ)にザイモサンAを投与し、4時間後(終了時)にIL−6(IL−1/TNF依存)の血清分析用に採血した。21日目に動物を屠殺し、左右膝関節を採取し、ホルマリンに浸漬した。
実施例3.3.1.A.試験デザイン
マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル(JIM)におけるmIL−1α/β DVD−Ig分子のインビボ活性の試験デザインを表19に示す。全群は体重30グラム(BW=30g)のマウス25匹(n=25)とした。21日後に試験を終了した。2.5カ月齢雄性Swiss Websterマウス(25匹/群/時点)を5匹ずつケージに入れ、イソフルランで麻酔した。OA病変を誘発させようとして0日目に左右膝に前十字靱帯(ACL)外傷を形成した。IL−1阻害抗体IL−1α(9H10)及びIL−1β(10G11)の単独又は併用腹腔内(ip)投与をACL外傷日に開始し、4日おき(q4d)に20日間続けた。非投与対照のビヒクルはPBSとした。左右膝を21日目に採取し、組織病理学的変化を採点し、特性決定した。不安定性誘発の成功を示す増殖応答のあった関節のみを使用してデータを分析した。増殖応答/不安定性を0〜3で採点し、不安定な関節(スコア1、2又は3)のみを最終分析に使用した。内側及び外側大腿骨及び脛骨軟骨変性を軟骨変性の重篤度について0〜5のスケールで採点した。最後の抗体投与から4日後に、血清採取用に各群の全動物から採血した。体重を毎週記録した。最終日に動物(群1、2、3、4で10匹ずつ)にザイモサンAを投与し、4時間後(終了時)にIL−6(IL−1/TNF依存)の血清分析用に採血した。21日目に動物を屠殺し、左右膝関節を採取し、ホルマリンに浸漬した。
実施例3.3.1.B.組織標本作製及び分析
組織標本作製:脱灰固定液(Surgipath Decalifier,Surgipath Medical Ind.,Inc.,Richmond VA)に2〜3日間浸漬後に、両膝関節から外膜組織を切除し、包埋し、前額面で薄切した。前額面のほぼ中間点で1匹毎に切片1枚を採取した(1ブロック当たり2関節)。全切片は8μmとし、トルイジンブルー染色した。有資格獣医病理学者が盲検下でスライドを試験して群指定を試験し、以下の方法に従って採点した。Microsoft Excelを使用して統計分析を行い、95%の信頼レベルを使用して全投与群を対照群と比較する両側t検定を行った。
組織標本作製:脱灰固定液(Surgipath Decalifier,Surgipath Medical Ind.,Inc.,Richmond VA)に2〜3日間浸漬後に、両膝関節から外膜組織を切除し、包埋し、前額面で薄切した。前額面のほぼ中間点で1匹毎に切片1枚を採取した(1ブロック当たり2関節)。全切片は8μmとし、トルイジンブルー染色した。有資格獣医病理学者が盲検下でスライドを試験して群指定を試験し、以下の方法に従って採点した。Microsoft Excelを使用して統計分析を行い、95%の信頼レベルを使用して全投与群を対照群と比較する両側t検定を行った。
関節の組織病理学的スコアリング:フィブリル化を伴う軟骨細胞及びプロテオグリカン損失の深度/程度に関する以下のシステムを使用して軟骨変性の重篤度について内側及び外側大腿骨及び脛骨の軟骨変性を採点した:
1=表層損傷、ゾーン表面の50%以上に及ぶ接線方向の層のコラーゲン不在あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の10%までの減少
2=ゾーンの50%以上の面積の上部1/4までに及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の25%までの減少
3=ゾーンの50%以上で軟骨厚みの1/2に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の50%までの減少
4=ゾーンの50%以上で軟骨厚みの3/4に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の75%までの減少
5=ゾーンの50%以上で軟骨厚み全体に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の100%までの減少。
1=表層損傷、ゾーン表面の50%以上に及ぶ接線方向の層のコラーゲン不在あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の10%までの減少
2=ゾーンの50%以上の面積の上部1/4までに及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の25%までの減少
3=ゾーンの50%以上で軟骨厚みの1/2に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の50%までの減少
4=ゾーンの50%以上で軟骨厚みの3/4に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の75%までの減少
5=ゾーンの50%以上で軟骨厚み全体に及ぶマトリックス損失あるいは巣状又はびまん性ゾーン分布におけるプロテオグリカン及び/又は軟骨細胞の100%までの減少。
病変のゾーン(内側、中央及び外側)分布に注意してスコアを割り当て、3分の1ずつのスコア(0〜5)を関節の領域毎に合計した後、関節全体について総計した。
デジタルソフトウェア(NIS−Elements version 3.0)を使用して骨棘(評価対象の脛骨又は大腿骨表面で最大のもの)を測定した。
骨棘評価=サイズに応じて小、中又は大を1、2又は3とする。
小骨棘=1(150μmまで)
中骨棘=2(151〜300μm)
大骨棘=3(>301μm)。
骨棘評価=サイズに応じて小、中又は大を1、2又は3とする。
小骨棘=1(150μmまで)
中骨棘=2(151〜300μm)
大骨棘=3(>301μm)。
スコアに含まれない滑膜反応が存在する場合には、炎症の型と程度について記載及び記述した。
1匹毎の各種パラメーターの各々について平均±SEを求め、合計し、合計関節スコアを求めた。
内側滑膜及び側副靱帯における増殖変化の存在により不安定性誘導の組織学的徴候のある関節を同定した。更に、以下の基準に従って各関節の不安定性スコアを記録した。
0=不安定性なし
1=軽度の不安定性(靱帯及び周辺ゾーンにおける最低限〜軽度の増殖変化)
2=中度の不安定性(靱帯及び周辺ゾーンにおける中度の増殖変化)
3=重度の不安定性(靱帯及び周辺ゾーンにおける重度の増殖変化)。
0=不安定性なし
1=軽度の不安定性(靱帯及び周辺ゾーンにおける最低限〜軽度の増殖変化)
2=中度の不安定性(靱帯及び周辺ゾーンにおける中度の増殖変化)
3=重度の不安定性(靱帯及び周辺ゾーンにおける重度の増殖変化)。
結果:最終データ分析にはスコアが1、2又は3(又は2、3)の不安定な関節のみを使用した。最終的に罹患動物基準ではなく合計罹患関節基準でデータを解析した。本試験の結果、抗IL−1α又はIL−1βモノクローナル抗体を投与した動物の関節はビヒクルを投与した対照関節で認められた軟骨変性と同様の軟骨変性を示した。他方、マウス抗マウスIL−1α mAb(9H10)とマウス抗マウスIL−1β mAb(10G11)による併用療法では、内側脛骨軟骨変性スコアは有意に低下した。図2は各種投与群における動物の関節の軟骨変性スコアの棒グラフを示す。
実施例3.3.2.マウスの変形性関節症の関節不安定性モデル(JIM)におけるmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質のインビボ活性
上記実施例3.3.1に記載したような変形性関節症の関節不安定性モデルを使用し、更にマウス抗mIL−1αモノクローナル抗体(9H10)とマウス抗mIL−1βモノクローナル抗体(10G11)の併用により得られる抗IL−1療法の効力をこれらの2種類のモノクローナル抗体から作製したmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質により得られる効力と比較した。
上記実施例3.3.1に記載したような変形性関節症の関節不安定性モデルを使用し、更にマウス抗mIL−1αモノクローナル抗体(9H10)とマウス抗mIL−1βモノクローナル抗体(10G11)の併用により得られる抗IL−1療法の効力をこれらの2種類のモノクローナル抗体から作製したmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質により得られる効力と比較した。
実施例3.3.2.A.試験デザイン
本試験のデザインは上記実施例3.3.1に記載したデザインと同様とした。2.5カ月齢雄性Swiss Websterマウス(25匹/群/時点)を5匹ずつケージに入れ、0日目にイソフルランで麻酔し、左右膝領域をクリップで留め、十字靱帯の関節内外傷を形成した。投与(0日に開始、ip)を4日に1回(Q4D)行い、21日目に終了した(群2)。投与(0日に開始、ip)を週3回行い、21日目に終了した(群1、3及び4)。最後の抗体投与から4日後に、血清採取用に各群の全動物から採血した。体重を毎週記録した。最終日に動物(群1、2、3、4で10匹ずつ)にザイモサンAを投与し、4時間後(終了時)にIL−6(IL−1/TNF依存)の血清分析用に採血した。21日目に動物を安楽死させ、左右膝関節を採取し、ホルマリンに浸漬した。下記試験デザイン表参照。
本試験のデザインは上記実施例3.3.1に記載したデザインと同様とした。2.5カ月齢雄性Swiss Websterマウス(25匹/群/時点)を5匹ずつケージに入れ、0日目にイソフルランで麻酔し、左右膝領域をクリップで留め、十字靱帯の関節内外傷を形成した。投与(0日に開始、ip)を4日に1回(Q4D)行い、21日目に終了した(群2)。投与(0日に開始、ip)を週3回行い、21日目に終了した(群1、3及び4)。最後の抗体投与から4日後に、血清採取用に各群の全動物から採血した。体重を毎週記録した。最終日に動物(群1、2、3、4で10匹ずつ)にザイモサンAを投与し、4時間後(終了時)にIL−6(IL−1/TNF依存)の血清分析用に採血した。21日目に動物を安楽死させ、左右膝関節を採取し、ホルマリンに浸漬した。下記試験デザイン表参照。
実施例3.3.2.B.組織標本作製及び分析
上記実施例3.3.1に記載したように各種投与群の動物の関節に由来する関節軟骨の組織標本作製と組織学的スコアリングを実施した。
上記実施例3.3.1に記載したように各種投与群の動物の関節に由来する関節軟骨の組織標本作製と組織学的スコアリングを実施した。
結果:その結果、mIL−1α/β 10G11−9H10 DVD−Ig結合性蛋白質をマウスに投与すると、変形性関節症の進行が有意に抑制され(ビヒクルに対してP<0.05)、親mAb 9H10及び10G11の併用と同等の効力であることが分かった。図3は各種投与群の動物の関節における軟骨変性スコアの棒グラフを示す。図3に示すように、DVD−Ig結合性蛋白質6又は12mg/kgを投与した結果は変形性関節症病変の予防に関して同等の効力であった(DVD−Ig結合性蛋白質3mg/kgを使用した治療は軟骨変性に効果がなく、結果はビヒクルを投与した関節と同等であった。下記実施例3.3.3参照。)。この試験の結果、抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を併用投与又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質を投与すると、変形性関節症のマウスモデルにおける組織病理学的パラメーターに有意に有益な効果があることが判明した。
実施例3.3.3.抗IL−1βモノクローナル抗体と他の結合性蛋白質の投与を比較するための変形性関節症の関節不安定性モデルにおける追跡試験
変形性関節症の関節不安定性モデルを使用して追跡試験を実施し、他の投与に比較して抗IL−1βモノクローナル抗体を単独投与した動物における内側脛骨軟骨変性スコアに有意効果があるか否かをより綿密に検討した。抗IL−1βモノクローナル抗体投与の効果を21日試験で評価した。
変形性関節症の関節不安定性モデルを使用して追跡試験を実施し、他の投与に比較して抗IL−1βモノクローナル抗体を単独投与した動物における内側脛骨軟骨変性スコアに有意効果があるか否かをより綿密に検討した。抗IL−1βモノクローナル抗体投与の効果を21日試験で評価した。
実施例3.3.3.A.試験デザイン
本試験のデザインは上記実施例3.3.1に記載したデザインと同様とした。
本試験のデザインは上記実施例3.3.1に記載したデザインと同様とした。
実施例3.3.3.B.組織標本作製及び分析
上記実施例3.3.1に記載したように各種投与群の動物の関節に由来する関節軟骨の組織標本作製と組織学的スコアリングを実施した。
上記実施例3.3.1に記載したように各種投与群の動物の関節に由来する関節軟骨の組織標本作製と組織学的スコアリングを実施した。
結果:図4に示すように、先の試験の結果が追認され、抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を併用すると、同等の明白な治療効果が認められ、抗IL−1βモノクローナル抗体を単独投与した場合には試験したどの用量でも軟骨劣化の予防に有効ではなかった。
実施例3.3.4.関節不安定性モデル試験におけるザイモサン誘発性インターロイキン−6(IL−6)産生
抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体とmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質が機能的であり、IL−1αとIL−1βをインビボ中和できたか否かを判定するための薬力学的指標として、インターロイキン6(IL−6)のザイモサン誘発性(IL−1α及びIL−1β依存的)産生をOAの関節不安定性モデル試験で測定した。
抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体とmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質が機能的であり、IL−1αとIL−1βをインビボ中和できたか否かを判定するための薬力学的指標として、インターロイキン6(IL−6)のザイモサン誘発性(IL−1α及びIL−1β依存的)産生をOAの関節不安定性モデル試験で測定した。
要約すると、前記モデルで21日目にザイモサンをPBSビヒクルに懸濁し、沸騰水に30分間入れた後、使用時まで冷却した。次に50mg/kgザイモサンをPBS0.5mlに懸濁した懸濁液をマウスにip注射(よく混合してから注射)した。その後、ザイモサン注射から4時間後にマウスから採血した。IL−6測定用に血清を採取した。
結果:図5に示すように、抗IL−1αモノクローナル抗体(6mg/kg)と抗IL−1βモノクローナル抗体(6mg/kg)モノクローナル抗体の併用とmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(6mg/kg又は12mg/kg)はビヒクル投与対照動物と比較してザイモサン誘発性IL−6産生を有意に中和した。従って、これらの抗体はインビボで機能的活性を示した。
実施例3.3.5.SV129マウスの内側半月板不安定化(DMM)モデルにより誘発した変形性関節症に及ぼすサイトカイン阻害抗体投与の効果
変形性関節症における軟骨変性の進行抑制に及ぼす抗IL−1α及び抗IL−1β活性の効果を試験するために代替動物モデルも利用した。変形性関節症のマウス内側半月板不安定化(DMM)モデルはJIM法(上記参照)よりも浸潤性と炎症性が低く、主に内側脛骨上面と大腿骨内側顆の中心荷重領域に病変を生じる。DMM後の病変の重篤度と位置はJIMと比較するとより一貫している。
変形性関節症における軟骨変性の進行抑制に及ぼす抗IL−1α及び抗IL−1β活性の効果を試験するために代替動物モデルも利用した。変形性関節症のマウス内側半月板不安定化(DMM)モデルはJIM法(上記参照)よりも浸潤性と炎症性が低く、主に内側脛骨上面と大腿骨内側顆の中心荷重領域に病変を生じる。DMM後の病変の重篤度と位置はJIMと比較するとより一貫している。
実施例3.3.5.A.試験デザイン
体重約30グラムの雄性SV129マウスを5匹ずつケージに入れ、0日目にケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内(ip)投与して麻酔した後、鈍的剥離により内側側副靱帯を露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを8−0 vicryl縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を8−0 vicryl縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表に従って動物群に抗体又はビヒクルを腹腔内(ip)注射により投与した。雌雄別と年齢と系統を一致させたナイーブマウス2匹も試験に加えた。8週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
体重約30グラムの雄性SV129マウスを5匹ずつケージに入れ、0日目にケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内(ip)投与して麻酔した後、鈍的剥離により内側側副靱帯を露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを8−0 vicryl縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を8−0 vicryl縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表に従って動物群に抗体又はビヒクルを腹腔内(ip)注射により投与した。雌雄別と年齢と系統を一致させたナイーブマウス2匹も試験に加えた。8週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
実施例3.3.5.B.組織の試験
ホルマリンに固定したサンプルを脱灰し、標本を前額面で各々15枚の段階的切片に薄切した。各切片は厚さ6μmとし、段階的切片の間隔は70μmとした。全スライドをトルイジンブルー(T.Blue)染色した。有資格獣医病理学者がスライドをチェンバーズ法(Chambers et al.(2001)Arthritis Rheum 44:1455−65)に従って軟骨変性(下記参照)について評価した。大腿骨内側顆(MFC)、内側脛骨上面(MTP)、大腿骨外側顆(LFC)及び外側脛骨上面(LTP)の4部分の各軟骨表面を下表の尺度に従って0〜6に採点した。
ホルマリンに固定したサンプルを脱灰し、標本を前額面で各々15枚の段階的切片に薄切した。各切片は厚さ6μmとし、段階的切片の間隔は70μmとした。全スライドをトルイジンブルー(T.Blue)染色した。有資格獣医病理学者がスライドをチェンバーズ法(Chambers et al.(2001)Arthritis Rheum 44:1455−65)に従って軟骨変性(下記参照)について評価した。大腿骨内側顆(MFC)、内側脛骨上面(MTP)、大腿骨外側顆(LFC)及び外側脛骨上面(LTP)の4部分の各軟骨表面を下表の尺度に従って0〜6に採点した。
GraphPad Prismソフトウェアバージョン4.03を使用してマン・ホイットニーのU検定により統計分析を行った。
実施例3.3.5.C.結果
図6に示すように、抗マウスIL−1αモノクローナル抗体(9H10,6mg/kg)と抗マウスIL−1βモノクローナル抗体(10G11,6mg/kg)又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(6mg/kg)による併用療法は変形性関節症のマウスDMMモデルにおける軟骨変性を有意に抑制した。
図6に示すように、抗マウスIL−1αモノクローナル抗体(9H10,6mg/kg)と抗マウスIL−1βモノクローナル抗体(10G11,6mg/kg)又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(6mg/kg)による併用療法は変形性関節症のマウスDMMモデルにおける軟骨変性を有意に抑制した。
実施例3.3.6.変形性関節症の内側半月板不安定化(DMM)モデルのマウスにおける抗IL−1α及び抗IL−1β活性の力価測定(8週間試験)
単独又は併用下の抗mIL−1αモノクローナル抗体(9H10 mAb)及び抗mIL−1βモノクローナル抗体(10G11 mAb)と、mIL−1α/β 10G11−9H10 DVD−Ig結合性蛋白質を各種用量で変形性関節症のDMMモデルに投与した場合の軟骨変性に及ぼす効果について8週間試験を実施した。
単独又は併用下の抗mIL−1αモノクローナル抗体(9H10 mAb)及び抗mIL−1βモノクローナル抗体(10G11 mAb)と、mIL−1α/β 10G11−9H10 DVD−Ig結合性蛋白質を各種用量で変形性関節症のDMMモデルに投与した場合の軟骨変性に及ぼす効果について8週間試験を実施した。
実施例3.3.6.A.試験デザイン
体重約30グラムの雄性SV129マウスを5匹ずつケージに入れ、0日目にケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内(ip)投与して麻酔した後、鈍的剥離により内側側副靱帯を露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを8−0 vicryl縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を8−0 vicryl縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表(表24)に従って抗mIL−1α及び抗mIL−1βモノクローナル抗体(単独又は併用)、mIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質、又はビヒクルを動物群に腹腔内(ip)注射により投与した。8週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
体重約30グラムの雄性SV129マウスを5匹ずつケージに入れ、0日目にケタミン/キシラジンカクテルを腹腔内(ip)投与して麻酔した後、鈍的剥離により内側側副靱帯を露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを8−0 vicryl縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を8−0 vicryl縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表(表24)に従って抗mIL−1α及び抗mIL−1βモノクローナル抗体(単独又は併用)、mIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質、又はビヒクルを動物群に腹腔内(ip)注射により投与した。8週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
上記表の3列目の括弧内の数字(動物数)はデータセットに含まれる実際の動物数である。除外について以下に簡単に説明する。
B群:B群は9匹のみとした。1匹は組織学的試験時に内側半月板が無傷であると思われ、変形性関節症の変化が実質的になかったのでデータから除外した。
C群:C群は5匹のみとした。5匹は組織学的試験時に内側半月板がほぼ無傷であると思われ、変形性関節症の変化が殆どなかったのでデータから除外した。
D群:D群は8匹のみとした。1匹にはスライドがなかった。別の1匹は組織学的試験時に内側半月板がほぼ無傷であると思われ、変形性関節症の変化が殆どなかったのでデータから除外した。
E群:E群は8匹のみとした。2匹は外れ値とみなされたので除外した。
F群:F群は9匹のみとした。1匹は組織学的試験時に内側半月板が無傷であると思われ、変形性関節症の変化が実質的になかったのでデータから除外した。
実施例3.3.6.B.組織標本作製及び試験
上記実施例3.3.5に記載したように組織から標本を作製し、採点した。
上記実施例3.3.5に記載したように組織から標本を作製し、採点した。
実施例3.3.6.C.結果
結果を図7に示す。変形性関節症の関節不安定性モデル(JIM)で得られた結果(上記)と同様に、抗IL−1αモノクローナル抗体(9H10)又は抗IL−1βモノクローナル抗体(10G11)を単独投与すると、軟骨変性が抑制されたが、ビヒクル対照関節で認められた結果と統計的有意差はなかった。他方、両者モノクローナル抗体又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(1.5mg/kgのIL−1α/β DVDを除く)による併用療法では平均合計チェンバーズスコア(軟骨変性全体を示す)と平均最大チェンバーズスコア(関節の最重篤患部)が有意に低下した。mIL−1α/β DVD−Ig投与群では平均合計チェンバーズスコアに統計的に有意な用量効果が認められた。従って、本試験では、抗mIL−1αモノクローナル抗体と抗mIL−1βモノクローナル抗体の両方(各6mg/kg)及びmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(3mg/kg及び6mg/kg)を8週間投与すると、変形性関節症のDMMモデルで誘発させた軟骨変性の進行が改善された。
結果を図7に示す。変形性関節症の関節不安定性モデル(JIM)で得られた結果(上記)と同様に、抗IL−1αモノクローナル抗体(9H10)又は抗IL−1βモノクローナル抗体(10G11)を単独投与すると、軟骨変性が抑制されたが、ビヒクル対照関節で認められた結果と統計的有意差はなかった。他方、両者モノクローナル抗体又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(1.5mg/kgのIL−1α/β DVDを除く)による併用療法では平均合計チェンバーズスコア(軟骨変性全体を示す)と平均最大チェンバーズスコア(関節の最重篤患部)が有意に低下した。mIL−1α/β DVD−Ig投与群では平均合計チェンバーズスコアに統計的に有意な用量効果が認められた。従って、本試験では、抗mIL−1αモノクローナル抗体と抗mIL−1βモノクローナル抗体の両方(各6mg/kg)及びmIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質(3mg/kg及び6mg/kg)を8週間投与すると、変形性関節症のDMMモデルで誘発させた軟骨変性の進行が改善された。
実施例3.3.7.変形性関節症の内側半月板不安定化(DMM)モデルの動物における軟骨変性に及ぼす抗IL−1α及び抗IL−1β活性と低分子投与の効果
ドキシサイクリンは変形性関節症のDMMモデル(Effects of Disease−modifying Osteoarthritis Drugs in an in−vivo Animal Model,Silva et al.,Univ.Mass.Med.School,Worcester,MA,USA,Trans ORS 2009−要完全引用)及びヒト臨床試験(Brandt et al.(2005)Arthrit.Rheum.52(7):2015−2025)において軟骨劣化を予防することが示されている。本試験では、DMMモデルの動物にドキシサイクリンを投与した効果を、抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を動物に併用投与した効果と比較した。
ドキシサイクリンは変形性関節症のDMMモデル(Effects of Disease−modifying Osteoarthritis Drugs in an in−vivo Animal Model,Silva et al.,Univ.Mass.Med.School,Worcester,MA,USA,Trans ORS 2009−要完全引用)及びヒト臨床試験(Brandt et al.(2005)Arthrit.Rheum.52(7):2015−2025)において軟骨劣化を予防することが示されている。本試験では、DMMモデルの動物にドキシサイクリンを投与した効果を、抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を動物に併用投与した効果と比較した。
実施例3.3.7.A.試験デザイン
体重約30グラムの雄性SV129マウスの内側側副靱帯を鈍的剥離により露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを8−0 vicryl縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を8−0 vicryl縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表に従って動物群にビヒクル又は治療薬を経口(po)投与又は腹腔内(ip)注射した。雌雄別と年齢と系統を一致させたナイーブマウス3匹も試験に加えた。4週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
体重約30グラムの雄性SV129マウスの内側側副靱帯を鈍的剥離により露出させ、横に切開し、半月板を大腿骨側に反転させた。関節スペースを8−0 vicryl縫合糸で縫合した。皮膚を創傷接着剤で閉鎖した。偽手術では、膝の内側に垂直皮膚切開を行い、関節包を切開した。関節包を8−0 vicryl縫合糸で縫合し、皮膜を創傷接着剤で閉鎖した。次に下記試験デザイン表に従って動物群にビヒクル又は治療薬を経口(po)投与又は腹腔内(ip)注射した。雌雄別と年齢と系統を一致させたナイーブマウス3匹も試験に加えた。4週間投与後に動物を安楽死させ、膝関節を採取し、10%中性緩衝ホルマリンに浸漬した。
実施例3.3.7.B.組織標本作製及び試験
上記実施例3.3.5に記載したように組織から標本を作製し、採点した。
上記実施例3.3.5に記載したように組織から標本を作製し、採点した。
実施例3.3.7.C.結果
結果を図8に示す。試験条件下で抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を各々1匹当たり180μgの用量で4週間併用投与した処、内側半月板の不安定化により雄性SV129マウスに誘発させた変形性関節炎変化は有意に改善された。平均合計チェンバーズスコアと平均最大チェンバーズスコアは有意に低下し、平均総合計チェンバーズスコアはビヒクル対照群と比較してこの併用投与により著しく低下した。ドキシサイクリン30mg/kgを投与した場合も、同等の投与効果が得られたが、抗体併用投与のほうがより効果的であった。
結果を図8に示す。試験条件下で抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を各々1匹当たり180μgの用量で4週間併用投与した処、内側半月板の不安定化により雄性SV129マウスに誘発させた変形性関節炎変化は有意に改善された。平均合計チェンバーズスコアと平均最大チェンバーズスコアは有意に低下し、平均総合計チェンバーズスコアはビヒクル対照群と比較してこの併用投与により著しく低下した。ドキシサイクリン30mg/kgを投与した場合も、同等の投与効果が得られたが、抗体併用投与のほうがより効果的であった。
実施例4.抗IL−1α/β療法の疼痛効力
DMMモデルは更にマウスに測定可能な疼痛を生じる。最近、Malfaitら(Malfait et al.(2010)Osteoarthritis Cartilage,18:572−580参照)はDMM後の後足で足引っ込め閾値(疼痛の機械的アロディニア指標)が著しく低下するが、偽手術の場合にはそうではないことを示している。抗IL−1α/β療法の効力をDMM動物モデルで試験した。このシリーズの試験で示されるように、DMM手術を施したマウスは手術から7日後という早期にアロディニア症状を示し、35日目までに足引っ込め閾値の低下を示した。
DMMモデルは更にマウスに測定可能な疼痛を生じる。最近、Malfaitら(Malfait et al.(2010)Osteoarthritis Cartilage,18:572−580参照)はDMM後の後足で足引っ込め閾値(疼痛の機械的アロディニア指標)が著しく低下するが、偽手術の場合にはそうではないことを示している。抗IL−1α/β療法の効力をDMM動物モデルで試験した。このシリーズの試験で示されるように、DMM手術を施したマウスは手術から7日後という早期にアロディニア症状を示し、35日目までに足引っ込め閾値の低下を示した。
抗IL−1療法が疼痛を改善する可能性をOAのDMMマウスモデルで機械的アロディニアについて試験した。IL−1α及びIL−1β mAbの併用投与を手術日に開始し、週2回ずつ5週間繰返した。動物にPBSビヒクル単独、IgGアイソタイプ対照、又は抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの併用(各mAb 6mg/kgの用量)を投与した。動物の足引っ込め閾値を毎週試験した。PBS又はIgGアイソタイプ対照を投与した群の同側(手術)の足は対側(無手術)の足又は偽手術を施した動物と比較してアロディニア(疼痛)を示した。図9参照。他方、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを併用投与した群は5週(35日)目にPBSビヒクル又はIgGアイソタイプ投与群と比較して有意に高い足引っ込め閾値を示し、アロディニア(疼痛)の発現低下を示した。図10参照。この疼痛抑制は投与から1週間後という早期に認められた(データは示さず)。
慢性化疼痛におけるIL−1療法の効果を評価するために、慢性化OAと機械的アロディニアに罹患したIgG対照群の動物に35日目に抗IL−1α及び抗IL−1βモノクローナル抗体を併用投与し、24時間後(36日)に足引っ込め閾値を試験した。データから明らかなように、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの併用療法は慢性疾患をもつ動物においてアロディニアを改善(OA疼痛を軽減)した。これらのデータによると、抗IL−1療法は潜在的疾患緩和効果から独立した鎮痛効果を提供すると判断される。図11参照。
実施例5.抗IL−1α/β併用療法の疼痛効力の追加試験
抗IL−1療法がOAのDMMマウスモデル(上記参照)で機械的アロディニアに関して疼痛を改善する可能性を更に評価した。IL−1α及びIL−1β mAbの併用投与を手術日に開始し、週2回ずつ4週間繰返した。DMM動物にPBSビヒクル単独、抗IL−1α mAb(6mg/kg)、抗IL−1β mAb(6mg/kg),又は抗IL−1α mAb(6mg/kg)と抗IL−1β mAb(6mg/kg)の併用を週2回ずつ4週間腹腔内(ip)投与した。28日目に動物をアロディニアについて試験した。ビヒクル投与群の同側(手術)の足は対側(無手術)の足又は偽手術を施した動物と比較してアロディニア(疼痛)を示した。図12参照。同様に、抗IL−1α又は抗IL−1β mAbを単独投与した群はアロディニア(疼痛)を示した。他方、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを併用投与した群はビヒクル投与群と比較して有意に高い足引っ込め閾値を示し、アロディニア(疼痛)の発現低下が判明した(図12)。
抗IL−1療法がOAのDMMマウスモデル(上記参照)で機械的アロディニアに関して疼痛を改善する可能性を更に評価した。IL−1α及びIL−1β mAbの併用投与を手術日に開始し、週2回ずつ4週間繰返した。DMM動物にPBSビヒクル単独、抗IL−1α mAb(6mg/kg)、抗IL−1β mAb(6mg/kg),又は抗IL−1α mAb(6mg/kg)と抗IL−1β mAb(6mg/kg)の併用を週2回ずつ4週間腹腔内(ip)投与した。28日目に動物をアロディニアについて試験した。ビヒクル投与群の同側(手術)の足は対側(無手術)の足又は偽手術を施した動物と比較してアロディニア(疼痛)を示した。図12参照。同様に、抗IL−1α又は抗IL−1β mAbを単独投与した群はアロディニア(疼痛)を示した。他方、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを併用投与した群はビヒクル投与群と比較して有意に高い足引っ込め閾値を示し、アロディニア(疼痛)の発現低下が判明した(図12)。
実施例6.抗IL−1α/β併用療法の用量依存的疼痛効力
DMMマウスモデルの動物に手術を行った当日にIL−1α及びIL−1β mAbの併用投与を開始し、週2回ずつ4週間繰返した。動物にPBSビヒクル単独又は抗IL−1α mAbと抗IL−1β mAbを各々1mg/kg、3mg/kg、又は6mg/kgずつ併用し、4日おきに4週間腹腔内(ip)投与した。28日目に動物の足引っ込め閾値を試験した。ビヒクル投与群の同側(手術)の足は対側(無手術)の足又は偽手術を施した動物と比較して足引っ込め閾値の有意低下を示し、アロディニア(疼痛)を示した(図13)。他方、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを併用投与した群はビヒクル投与群と比較して足引っ込め閾値の用量依存的増加を示し、アロディニア(疼痛)の発現低下を示した(図13)。
DMMマウスモデルの動物に手術を行った当日にIL−1α及びIL−1β mAbの併用投与を開始し、週2回ずつ4週間繰返した。動物にPBSビヒクル単独又は抗IL−1α mAbと抗IL−1β mAbを各々1mg/kg、3mg/kg、又は6mg/kgずつ併用し、4日おきに4週間腹腔内(ip)投与した。28日目に動物の足引っ込め閾値を試験した。ビヒクル投与群の同側(手術)の足は対側(無手術)の足又は偽手術を施した動物と比較して足引っ込め閾値の有意低下を示し、アロディニア(疼痛)を示した(図13)。他方、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを併用投与した群はビヒクル投与群と比較して足引っ込め閾値の用量依存的増加を示し、アロディニア(疼痛)の発現低下を示した(図13)。
実施例7.慢性化疼痛における抗IL−1α/β併用療法
慢性化疼痛における抗IL−1α/β併用療法の効果を評価するために、慢性化OAと機械的アロディニアに罹患したDMMマウスモデルの動物に28日目のアロディニア試験の24時間前の27日目に抗IL−1α mAbと抗IL−1β mAbを各々1mg/kg、3mg/kg、又は6mg/kgずつ併用して腹腔内(ip)投与した。結果を図14に示す。データから明らかなように、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの併用療法は慢性疾患をもつ動物において機械的アロディニアを用量依存的に改善(OA疼痛を軽減)した(図14)。
慢性化疼痛における抗IL−1α/β併用療法の効果を評価するために、慢性化OAと機械的アロディニアに罹患したDMMマウスモデルの動物に28日目のアロディニア試験の24時間前の27日目に抗IL−1α mAbと抗IL−1β mAbを各々1mg/kg、3mg/kg、又は6mg/kgずつ併用して腹腔内(ip)投与した。結果を図14に示す。データから明らかなように、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの併用療法は慢性疾患をもつ動物において機械的アロディニアを用量依存的に改善(OA疼痛を軽減)した(図14)。
実施例8.抗IL−1α/β併用療法の抗痛覚過敏効果
IL−1α及びIL−1βの中和が炎症性疼痛状態に抗侵害受容効果を生じるか否かを評価するために、侵害受容性疼痛のマウスカラギ−ナン足モデルにおける慢性化疼痛を改善する能力について抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを評価した。
IL−1α及びIL−1βの中和が炎症性疼痛状態に抗侵害受容効果を生じるか否かを評価するために、侵害受容性疼痛のマウスカラギ−ナン足モデルにおける慢性化疼痛を改善する能力について抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを評価した。
マウスカラギ−ナンモデルで単独又は併用投与した場合の抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの効力を評価した(図15)。足底内カラギ−ナン注射から30時間後に900μgの抗IL−1α mAb、抗IL−1β mAb、又はその併用を各種マウス群に投与した。カラギ−ナン注射から48時間後と96時間後に熱痛覚過敏試験を実施した。先の試験で認められたように、900μg用量を併用投与すると、熱痛覚過敏は有意に緩和された(48時間でPBS群のカラギ−ナン足4.98±0.34sに対して8.11±0.62s、p<0.01,図15A;96時間でPBS群のカラギ−ナン足4.45±0.55sに対して7.62±0.45s、p<0.01,図15B)。900μg併用群における抗侵害受容効果は48時間で53±7%であり、96時間で82±11%であった。ジクロフェナク(非ステロイド性抗炎症鎮痛薬)陽性対照も熱痛覚過敏の有意緩和を示した(両時点でp<0.01)。他方、抗IL−1α及び抗IL−1β mAbを単独投与した場合には両時点で有意な抗侵害受容効果は認められず、マウスカラギ−ナン炎症性疼痛モデルで抗侵害受容効果を得るにはIL−1αとIL−1βの両方の同時中和が必要があると判断された。
実施例9.抗IL−1α/β併用療法の用量依存的抗痛覚過敏効果
図16に示すように、マウス(雌性BALB/c)に足底内カラギ−ナン注射すると、輻射熱刺激に対する足引っ込め潜時の減少(カラギ−ナン注射から48時間後と96時間後に実施した試験;両時点でPBSビヒクル群におけるカラギ−ナン足に対する対照非損傷足p<0.01)が認められたことが明らかなように、長期持続性熱痛覚過敏が誘発される。カラギ−ナン注射から30時間後に各群の動物にビヒクル又は抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの併用(マウス1匹当たり各mAb100μg、300μg又は900μg)を投与した。用量依存効果が認められ、抗IL−1α及び抗IL−1β mAb900μgを併用投与した場合には、熱痛覚過敏が有意に緩和された(48時間で900μg群のカラギ−ナン足7.88±0.93sに対してPBS群の3.23±0.34s、p<0.01,図16A;96時間で900μg群のカラギ−ナン足7.62±0.45sに対してPBS群の4.45±0.55s、p<0.01,図16B)。900μg投与群における抗侵害受容効果は48時間で70±9%であり、96時間で62±4%であった。非ステロイド性抗炎症鎮痛薬であるジクロフェナク(30mg/kg)を陽性対照として試験に加えた処、試験の60分前にp.o.投与した場合に損傷足の平均足引っ込め潜時は48時間で7.01±0.58s、96時間で7.48±0.34sまで増加した(両時点でp<0.01)。IgG対照群と低用量100μg mAb群はどの時点でも熱痛覚過敏が緩和されなかった。mAbとジクロフェナクでは対照非損傷足における足引っ込め潜時値は有意に変化しなかった。
図16に示すように、マウス(雌性BALB/c)に足底内カラギ−ナン注射すると、輻射熱刺激に対する足引っ込め潜時の減少(カラギ−ナン注射から48時間後と96時間後に実施した試験;両時点でPBSビヒクル群におけるカラギ−ナン足に対する対照非損傷足p<0.01)が認められたことが明らかなように、長期持続性熱痛覚過敏が誘発される。カラギ−ナン注射から30時間後に各群の動物にビヒクル又は抗IL−1α及び抗IL−1β mAbの併用(マウス1匹当たり各mAb100μg、300μg又は900μg)を投与した。用量依存効果が認められ、抗IL−1α及び抗IL−1β mAb900μgを併用投与した場合には、熱痛覚過敏が有意に緩和された(48時間で900μg群のカラギ−ナン足7.88±0.93sに対してPBS群の3.23±0.34s、p<0.01,図16A;96時間で900μg群のカラギ−ナン足7.62±0.45sに対してPBS群の4.45±0.55s、p<0.01,図16B)。900μg投与群における抗侵害受容効果は48時間で70±9%であり、96時間で62±4%であった。非ステロイド性抗炎症鎮痛薬であるジクロフェナク(30mg/kg)を陽性対照として試験に加えた処、試験の60分前にp.o.投与した場合に損傷足の平均足引っ込め潜時は48時間で7.01±0.58s、96時間で7.48±0.34sまで増加した(両時点でp<0.01)。IgG対照群と低用量100μg mAb群はどの時点でも熱痛覚過敏が緩和されなかった。mAbとジクロフェナクでは対照非損傷足における足引っ込め潜時値は有意に変化しなかった。
実施例10.CFA疼痛モデルにおける抗IL−1α/β併用療法の効力
CFA(完全フロイントアジュバント)炎症性疼痛モデルを使用して抗IL−1α及び抗IL−1β mAb併用が機械的端点に対して効力を生じるか否かを試験した。従って、動物(雌性BALB/cマウス)にCFAを足底内注射してから48時間後にフォン・フライ・モノフィラメントを使用して機械的アロディニアを評価した。図17Aから明らかなように、CFAを注射した足にPBSビヒクルを単独投与した場合の足引っ込め閾値の低下により明らかなように、足底内CFAは強い機械的アロディニアを生じた(対側非損傷足の0.860±0.090gに対して0.052±0.028g,p<0.01)。別の群の動物にCFA注射から30時間後にIgGアイソタイプ対照又は抗IL−1α及び抗IL−1β mAb併用(マウス1匹当たり各mAb900μg)を投与した。mAb投与群は機械的アロディニアの有意緩和を示した(0.419±0.101g,PBSビヒクルに対してp<0.01,図17A)。効力の強さ(%MPE)は65.51±12.35%であった(図17B)。抗炎症鎮痛薬陽性対照ジクロフェナク(30mg/kg,1時間前投与)も足引っ込め閾値を増加することにより機械的アロディニアを緩和し(0.359±0.088g,PBSビヒクルに対してp<0.01)、%MPEは64.51±10.20%であった。
CFA(完全フロイントアジュバント)炎症性疼痛モデルを使用して抗IL−1α及び抗IL−1β mAb併用が機械的端点に対して効力を生じるか否かを試験した。従って、動物(雌性BALB/cマウス)にCFAを足底内注射してから48時間後にフォン・フライ・モノフィラメントを使用して機械的アロディニアを評価した。図17Aから明らかなように、CFAを注射した足にPBSビヒクルを単独投与した場合の足引っ込め閾値の低下により明らかなように、足底内CFAは強い機械的アロディニアを生じた(対側非損傷足の0.860±0.090gに対して0.052±0.028g,p<0.01)。別の群の動物にCFA注射から30時間後にIgGアイソタイプ対照又は抗IL−1α及び抗IL−1β mAb併用(マウス1匹当たり各mAb900μg)を投与した。mAb投与群は機械的アロディニアの有意緩和を示した(0.419±0.101g,PBSビヒクルに対してp<0.01,図17A)。効力の強さ(%MPE)は65.51±12.35%であった(図17B)。抗炎症鎮痛薬陽性対照ジクロフェナク(30mg/kg,1時間前投与)も足引っ込め閾値を増加することにより機械的アロディニアを緩和し(0.359±0.088g,PBSビヒクルに対してp<0.01)、%MPEは64.51±10.20%であった。
実施例11.神経障害性疼痛における抗IL−1α/β併用療法の効力
マウス(雄性CD1)のL5/L6脊髄神経結紮(SNL)モデルで抗IL−1α及び抗IL−1β mAb併用療法が神経障害性疼痛状態に効力を生じるか否かを試験した。SNL手術から6日後、mAb併用投与(マウス1匹当たり各mAb900μg)から24時間後と72時間後に試験を行った。フォン・フライ・モノフィラメント刺激に対する足引っ込め閾値の低下により明らかなように、SNL手術後にPBSビヒクルを単独投与したマウスでは機械的アロディニアが認められた(24時間で対側足の0.735±0.109gに対して0.073±0.032g、図18A;72時間で対側足の0.732±0.132gに対して0.128±0.048g、図18B;両時点でp<0.01)。mAb投与群は両時点で機械的アロディニアの有意緩和を示した(24時間で0.477±0.131g,PBSビヒクルに対してp<0.01、図18A;72時間で0.527±0.111g、PBSビヒクルに対してp<0.01、図18B)。効力の強さ(%MPE)は24時間で72.20±14.39%であり、72時間で80.62±12.33%であった(図19)。陽性対照ガバペンチン(100mg/kg,1時間前投与)は足引っ込め閾値を有意に増加することにより機械的アロディニアの緩和に完全に有効であった(24時間で0.858±0.077g、72時間で1.138±0.096g、両時点でPBSビヒクルに対してp<0.01)。他方、IgG対照群は両時点で機械的アロディニアに何ら効果がなかった。
マウス(雄性CD1)のL5/L6脊髄神経結紮(SNL)モデルで抗IL−1α及び抗IL−1β mAb併用療法が神経障害性疼痛状態に効力を生じるか否かを試験した。SNL手術から6日後、mAb併用投与(マウス1匹当たり各mAb900μg)から24時間後と72時間後に試験を行った。フォン・フライ・モノフィラメント刺激に対する足引っ込め閾値の低下により明らかなように、SNL手術後にPBSビヒクルを単独投与したマウスでは機械的アロディニアが認められた(24時間で対側足の0.735±0.109gに対して0.073±0.032g、図18A;72時間で対側足の0.732±0.132gに対して0.128±0.048g、図18B;両時点でp<0.01)。mAb投与群は両時点で機械的アロディニアの有意緩和を示した(24時間で0.477±0.131g,PBSビヒクルに対してp<0.01、図18A;72時間で0.527±0.111g、PBSビヒクルに対してp<0.01、図18B)。効力の強さ(%MPE)は24時間で72.20±14.39%であり、72時間で80.62±12.33%であった(図19)。陽性対照ガバペンチン(100mg/kg,1時間前投与)は足引っ込め閾値を有意に増加することにより機械的アロディニアの緩和に完全に有効であった(24時間で0.858±0.077g、72時間で1.138±0.096g、両時点でPBSビヒクルに対してp<0.01)。他方、IgG対照群は両時点で機械的アロディニアに何ら効果がなかった。
疼痛治療試験の結論
本願に記載する疼痛試験の結果から明らかなように、本発明による抗IL−1α/β併用療法は変形性関節症に関連する疼痛だけでなく、任意型の疼痛の治療法として有効である。このような抗IL−1α/β併用療法は限定されないが、アロディニア、痛覚過敏及びアロディニアと痛覚過敏の併発の疼痛状態を含む任意型の疼痛状態に罹患した個体における疼痛を治療するために使用することができる。抗IL−1α/β併用療法は抗IL−1αモノクローナル抗体と抗IL−1βモノクローナル抗体の組合せ等のIL−1α結合性蛋白質とIL−1β結合性蛋白質の組合せ(例えば混合物、同時投与、又は順次投与)を個体に投与することにより、あるいはIL−α及びIL−1βの両方と結合する二重特異性抗体又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質等のIL−α及びIL−1βの両方と結合する蛋白質を個体に投与することにより実施することができる。
本願に記載する疼痛試験の結果から明らかなように、本発明による抗IL−1α/β併用療法は変形性関節症に関連する疼痛だけでなく、任意型の疼痛の治療法として有効である。このような抗IL−1α/β併用療法は限定されないが、アロディニア、痛覚過敏及びアロディニアと痛覚過敏の併発の疼痛状態を含む任意型の疼痛状態に罹患した個体における疼痛を治療するために使用することができる。抗IL−1α/β併用療法は抗IL−1αモノクローナル抗体と抗IL−1βモノクローナル抗体の組合せ等のIL−1α結合性蛋白質とIL−1β結合性蛋白質の組合せ(例えば混合物、同時投与、又は順次投与)を個体に投与することにより、あるいはIL−α及びIL−1βの両方と結合する二重特異性抗体又はIL−1α/β DVD−Ig結合性蛋白質等のIL−α及びIL−1βの両方と結合する蛋白質を個体に投与することにより実施することができる。
資料援用
本願の随所に引用する場合がある全引用資料(文献資料、特許、特許出願及びウェブサイトを含む)とその引用資料はその内容全体を特に本願に援用する。特に指定しない限り、本発明の実施には、当分野で周知の薬学、免疫学、分子生物学及び細胞生物学の慣用技術を利用する。
本願の随所に引用する場合がある全引用資料(文献資料、特許、特許出願及びウェブサイトを含む)とその引用資料はその内容全体を特に本願に援用する。特に指定しない限り、本発明の実施には、当分野で周知の薬学、免疫学、分子生物学及び細胞生物学の慣用技術を利用する。
等価物
本発明はその趣旨又は本質的特徴から外れない限り、他の特定形態で実施することもできる。従って、上記態様はあらゆる点において例証とみなすべきであり、本願に記載する発明を限定するものではない。従って、本発明の範囲は上記記載ではなく、特許請求の範囲により指定され、従って、特許請求の範囲と等価の意味及び範囲内に該当する全変更も本願に含むものとする。
本発明はその趣旨又は本質的特徴から外れない限り、他の特定形態で実施することもできる。従って、上記態様はあらゆる点において例証とみなすべきであり、本願に記載する発明を限定するものではない。従って、本発明の範囲は上記記載ではなく、特許請求の範囲により指定され、従って、特許請求の範囲と等価の意味及び範囲内に該当する全変更も本願に含むものとする。
Claims (35)
- 個体における変形性関節症の治療方法であって、
IL−1αと結合する結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結合性蛋白質、又は
IL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質
を前記個体に投与する段階を含む、方法。 - IL−1αと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1α抗体である、請求項1に記載の方法。
- IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1β抗体である、請求項1に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1α抗体であり、及びIL−1βと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1β抗体である、請求項1に記載の方法。
- IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結合性蛋白質が二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)結合性蛋白質である、請求項1に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質と、IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物として製剤化されている、請求項1に記載の方法。
- IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結合性蛋白質が医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物として製剤化されている、請求項1に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質と、IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が結晶化されている、請求項1に記載の方法。
- IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結合性蛋白質が結晶化されている、請求項1に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結晶化結合性蛋白質と、IL−1βと結合する前記結晶化結合性蛋白質が成分とポリマー担体を含有する組成物として製剤化されている、請求項8に記載の方法。
- 前記結晶化結合性蛋白質が成分とポリマー担体を含有する組成物として製剤化されている、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリマー担体が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(酸無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸コポリマーないしPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ[(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の1種以上から選択されるポリマーである、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記成分がアルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される、請求項10又は11に記載の方法。
- 望ましい特性を提供する第2の作用剤を前記個体に投与する段階を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の作用剤が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、IL−1受容体アンタゴニスト、抗IL−1βモノクローナル抗体、抗IL−6モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物;TNF、LT、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−18、IL−23、EMAP−II、GM−CSF、FGF及びPDGFの抗体;CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90又はそのリガンドの抗体;メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬;IRAK、NIK、IKK、p38、MAPキナーゼ阻害剤;IL−1β変換酵素阻害剤、TNFα変換酵素阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性p55TNF受容体、可溶性p75TNF受容体;sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R;抗炎症性サイトカイン、IL−4、IL−10、IL−11、IL−13及びTGFβから構成される群の1種以上の化合物である、請求項14に記載の方法。
- 前記個体に投与する前記段階が非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱腔内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内及び経皮から選択される少なくとも1種の方法により実施される、請求項1から11、14及び15のいずれか一項に記載の方法。
- 個体における疼痛の治療方法であって、
IL−1αと結合する結合性蛋白質と、IL−1βと結合する結合性蛋白質を前記個体に混合物として、同時又は順次投与する段階、あるいは
IL−1α及びIL−1βの両方と結合する結合性蛋白質を前記個体に投与する段階
を含む、方法。 - 前記個体がアロディニア、痛覚過敏及びアロディニアと痛覚過敏の併発から構成される群から選択される疼痛状態に罹患している、請求項17に記載の疼痛の治療方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1α抗体である、請求項17に記載の方法。
- IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1β抗体である、請求項17に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1α抗体であり、IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が抗IL−1β抗体である、請求項17に記載の方法。
- IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結合性蛋白質が二重特異性抗体又は二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD−Ig)結合性蛋白質である、請求項17に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質と、IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物として製剤化されている、請求項17に記載の方法。
- IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結合性蛋白質が医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物として製剤化されている、請求項17に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結合性蛋白質と、IL−1βと結合する前記結合性蛋白質が結晶化されている、請求項17に記載の方法。
- IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結合性蛋白質が結晶化されている、請求項17に記載の方法。
- IL−1αと結合する前記結晶化結合性蛋白質と、IL−1βと結合する前記結晶化結合性蛋白質が、
場合により成分と、
ポリマー担体
を含有する組成物として製剤化されている、請求項25に記載の方法。 - IL−1α及びIL−1βの両方と結合する前記結晶化結合性蛋白質が、
場合により成分と、
ポリマー担体
を含有する組成物として製剤化されている、請求項26に記載の方法。 - 前記ポリマー担体が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(酸無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸コポリマーないしPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ[(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド]、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、マレイン酸無水物・アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸塩、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン、硫酸化多糖、並びにそのブレンド及びコポリマーから構成される群の1種以上から選択されるポリマーである、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記成分が存在する場合には、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールから構成される群から選択される、請求項27又は28に記載の方法。
- 望ましい特性を提供する第2の作用剤を前記個体に投与する段階を更に含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の作用剤が、ブデノシド、上皮成長因子、コルチコステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸塩、6−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害剤、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化剤、トロンボキサン阻害剤、IL−1受容体アンタゴニスト、抗IL−1βモノクローナル抗体、抗IL−6モノクローナル抗体、成長因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物;TNF、LT、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−18、IL−23、EMAP−II、GM−CSF、FGF及びPDGFの抗体;CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90又はそのリガンドの抗体;メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、イブプロフェン、コルチコステロイド、プレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬;IRAK、NIK、IKK、p38、MAPキナーゼ阻害剤;IL−1β変換酵素阻害剤、TNFα変換酵素阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体、可溶性p55TNF受容体、可溶性p75TNF受容体、sIL−1RI、sIL−1RII、sIL−6R、抗炎症性サイトカイン、IL−4、IL−10、IL−11、IL−13及びTGFβから構成される群の1種以上の化合物である、請求項31に記載の方法。
- 前記個体が、変形性関節症、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェグナー肉芽腫症、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫症、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性I型多腺性内分泌不全症、II型多腺性内分泌不全症(シュミット症候群)、成人(急性)呼吸窮迫症候群、脱毛症、先天性脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸病性滑膜炎、クラミジア関連関節症、エルシニア関連関節症、サルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患/動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎/ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、特発性自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全症関連疾患、B型肝炎、C型肝炎、分類不能型免疫不全症(分類不能型低ガンマグロブリン血症)、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣不全、早発卵巣不全、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織病関連間質性肺疾患、混合性結合組織病関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス関連肺疾患、皮膚筋炎/多発性筋炎関連肺疾患、ショーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症関連肺疾患、薬物誘発性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風性関節炎、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎(古典的自己免疫性肝炎ないしルポイド肝炎)、2型自己免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自己免疫介在性低血糖症、黒色表皮腫を伴うB型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、1型乾癬、2型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患NOS、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、特発性ないしNOS男性不妊症、精子自己免疫、多発性硬化症(全サブタイプ)、交感性眼炎、結合組織病続発性肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、ショーグレン症候群、高安病/動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝傷害、胆汁鬱滞症、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、アレルギー、B群連鎖球菌(GBS)感染症、精神障害(例えば鬱病及び統合失調症)、Th2型及びTh1型細胞介在性疾患、急性及び慢性疼痛(各種疼痛)、癌(例えば肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌)及び血液悪性疾患(白血病及びリンパ腫)、無βリポ蛋白血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫又は感染プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性又は慢性細菌感染症、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、エイズ痴呆合併症、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植片拒絶反応、α1アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗CD3抗体療法、抗リン脂質抗体症候群、抗受容体過敏反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈瘻、運動失調症、心房細動(持続性又は発作性)、心房粗動、房室ブロック、B細胞リンパ腫、骨移植拒絶反応、骨髄移植(BMT)拒絶反応、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶反応、小脳皮質変性、小脳障害、無秩序型ないし多源性心房頻拍、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性アルコール依存症、慢性炎症性疾患、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツェルフェルト・ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、拳闘家痴呆、脱髄疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚疾患、糖尿病、糖尿病性動脈硬化症、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、基底核障害、中高年ダウン症候群、CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘発される薬物誘発性運動障害、薬物過敏症、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン・バールウイルス感染症、肢端紅痛症、錐体外路及び小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶反応、フリードリヒ運動失調症、機能性末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意臓器又は組織の移植片拒絶反応、グラム陰性菌敗血症、グラム陽性菌敗血症、細胞内生物による肉芽腫、ヘアリー細胞白血病、ハレルフォルデン・スパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶反応、ヘモクロマトーシス、血液透析、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、出血、A型肝炎、ヒス束不整脈、HIV感染症/HIV神経障害、ホジキン病、運動過多性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部−下垂体−副腎軸評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体介在性細胞傷害、無力症、小児脊髄性筋萎縮症、大動脈炎症、A型インフルエンザ、電離放射線被爆、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎/視神経炎、虚血再潅流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶反応、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系傷害、脂肪性浮腫、肝移植拒絶反応、リンパ水腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性偏頭痛、特発性偏頭痛、ミトコンドリア多系統疾患、混合性結合組織病、モノクローナル免疫グロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症(Menzel,Dejerine−Thomas,Shy−Drager及びMachado−Joseph)、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ菌感染症、ヒト型結核菌感染症、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、上咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性筋委縮症、好中球減少時の発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈とその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、OKT3(登録商標)療法、精巣炎/副睾丸炎、精巣炎/精管切除再吻合術、臓器腫大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶反応、膵臓癌、腫瘍随伴症候群/悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶反応、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、POEMS症候群(多発ニューロパシー、臓器腫大、内分泌障害、モノクローナル免疫グロブリン血症及び皮膚変化症候群)、潅流後症候群、ポストポンプ症候群、MI心膜切開後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧症、放射線療法、レイノー現象、レイノー病、レフサム病、規則的で狭いQRS幅の頻拍、腎血管性高血圧症、再潅流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老人性舞踏病、レビー小体型老人性痴呆症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚同種移植片拒絶反応、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶反応、充実性腫瘍、特異的不整脈、脊髄性運動失調症、脊髄小脳変性症、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造傷害、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型発症若年性関節リウマチ、T細胞性ないしFAB ALL、毛細血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、中毒症、移植、外傷/出血、III型過敏反応、IV型過敏反応、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、蕁麻疹、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染症、ウイルス性脳炎/無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意臓器又は組織の異種移植片拒絶反応、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発根神経炎、急性虚血、成人スティル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫疾患、自己免疫性腸症、自己免疫性聴力低下、自己免疫性リンパ球増殖症候群(ALPS)、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早発卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心臓血管疾患、劇症型抗リン脂質抗体症候群、セリアック病、頸椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症の危険を伴う最初のエピソードからなる症候群(CIS)、小児期発症型精神障害、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病網膜症、椎間板ヘルニア、椎間板脱出、薬物誘発性免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜炎、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群(GBS)、花粉症、ヒューズ症候群、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、IgE介在型アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症性疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、IPF/UIP、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病ないしクスマウル・マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞組織球症、網状皮斑、黄斑変性症、顕微鏡的多発血管炎、ベヒテレフ病、運動ニューロン障害、粘膜類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、非A非B肝炎、視神経炎、骨溶解症、卵巣癌、少関節型JRA、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患(PAD)、静脈炎、結節性多発動脈炎(ないし結節性動脈周囲炎)、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛症、白毛症、多関節型JRA、多腺性内分泌不全症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症(PMR)、ポストポンプ症候群、原発性パーキンソン病、前立腺癌及び直腸癌及び血液悪性疾患(白血病及びリンパ腫)、前立腺炎、純赤血球形成不全症、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心臓病、SAPHO(滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化症及び骨炎)、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、座骨神経痛、続発性副腎不全、シリコン関連結合組織病、スネッドン・ウィルキンソン皮膚病、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群(SJS)、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラズマ性網膜炎、中毒性表皮壊死、横断性脊髄炎、TRAPS(腫瘍壊死因子1型受容体(TNFR)関連周期性症候群)、1型アレルギー反応、II型糖尿病、蕁麻疹、通常型間質性肺炎(UIP)、血管炎、春季カタル、ウイルス性網膜炎、フォークト・小柳・原
田症候群(VKH症候群)、滲出型黄斑変性症、並びに創傷治癒から構成される群から選択される疾患ないし障害に罹患している、請求項17に記載の個体における疼痛の治療方法。 - 前記個体が、原発性癌、転移性癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、結腸癌、尿管癌、腎臓癌、膀胱癌、尿路上皮癌、女性生殖管癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌、妊娠性絨毛性疾患、男性生殖管癌、前立腺癌、精嚢癌、精巣癌、胚細胞腫瘍、内分泌腺癌、甲状腺癌、副腎癌、下垂体癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、骨癌、軟部組織癌、カポジ肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼の癌、髄膜癌、星状細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、血液悪性疾患に起因する充実性腫瘍、白血病、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫から構成される群から選択される疾患に罹患している、請求項17に記載の個体における疼痛の治療方法。
- 前記個体に投与する前記段階が、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹腔内、関節包内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱腔内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内及び経皮から選択される少なくとも1種の方法により実施される、請求項17から28及び31から34のいずれか一項に記載の方法。
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