CZ299025B6 - Farmaceutická kompozice a její použití - Google Patents

Farmaceutická kompozice a její použití Download PDF

Info

Publication number
CZ299025B6
CZ299025B6 CZ0237398A CZ237398A CZ299025B6 CZ 299025 B6 CZ299025 B6 CZ 299025B6 CZ 0237398 A CZ0237398 A CZ 0237398A CZ 237398 A CZ237398 A CZ 237398A CZ 299025 B6 CZ299025 B6 CZ 299025B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
pharmaceutical composition
protein
sequence
amino acid
composition according
Prior art date
Application number
CZ0237398A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ237398A3 (cs
Inventor
S. Collins@David
P. Bevilacqua@Michael
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/798,414 external-priority patent/US6096728A/en
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ237398A3 publication Critical patent/CZ237398A3/cs
Publication of CZ299025B6 publication Critical patent/CZ299025B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Farmaceutická kompozice, která obsahuje synergická množství hyaluronanu nebo jeho soli a antagonisty (IL-1ra) receptoru interleukinu 1 (IL-1), pricemž IL-1ra obsahuje celou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 nebo sekvenci, která je alespon ze 70 % homologní vzhledem k této sekvenci, nebo IL-1 inhibující fragment kterékoliv z techto sekvencí. Použití této kompozice pro výrobu léciva pro lécení zánetlivých chorob kloubu, roztroušené sklerózy, leukemie, ischemického poškození nebo reperfuzního poškození.

Description

Oblast techniky 5
Vynález se týká farmaceutické kompozice a jejího použití pro výrobu léčiva pro léčení zejména zánětlivých chorob.
Dosavadní stav techniky
Zánět je obranná reakce organizmu na poranění, jako například poranění způsobená mechanickým poškozením, infekcí nebo stimulací antigenem. Zánětlivá reakce může být považována za patologickou v případech, kdy je indukována nepatřičným stimulem, jako například nějakým autoantigenem, je-li nepřiměřeně intenzivní nebo přetrvává-li i po odstranění agens, které tuto reakci vyvolalo.
Zatímco porozumění etiologii zánětu je stále nedokonalé, v nedávné době bylo získáno množství informací týkajících se modulárních aspektů zánětlivých procesů. Výzkum v této oblasti vedl k identifikaci určitých cytokinů, u nichž se předpokládá, že hrají při zprostředkování zánětů klíčovou úlohu. Cytokiny jsou extracelulámí proteiny, které ovlivňují činnost buněk, zvláště pak buněk nacházejících se v bezprostřední blízkosti místa syntézy a uvolňování cytokinů. Interleukin-1 (1L-1) je jedním z nejúěinnějších dosud identifikovaných cytokinů zánětu a předpokládá se, že tento cytokin je hlavním mediátorem u mnoha onemocnění a patologických stavů označo25 váných jako „onemocnění zprostředkovaná interleukinem-1“ IL-1, produkovaný (nejenom, ale především) buňkami makrofágové/monocytámí linie, se může vyskytovat ve dvou formách: IL-1 alfa (IL-Ια) a IL-1 beta (IL-1 β).
Za onemocnění nebo patologický stav označovaný jako „onemocnění zprostředkované interleuki30 nem-1“ je považováno spontánně s vyskytující nebo experimentálně navozené onemocnění nebo patologický stav, které je spojeno se zvýšeným výskytem IL-1 v tělních tekutinách nebo tkáních, nebo při kterém buňky nebo tkáně izolované z takto postiženého organizmu produkují v kultuře zvýšená množství IL-1. V mnoha případech jsou „onemocnění zprostředkovaná interleukinem1“ navíc charakterizovaná ještě následujícími dvěma podmínkami“ (1) patologické nálezy spoje35 né s příslušným onemocněním nebo chorobným stavem mohou být v experimentálních živočišných modelech mimikovány podáním IL-1; a (2) patologie příslušného onemocnění nebo chorobného stavu navozeného v experimentálních živočišných modelech mohou být inhibovány nebo odstraněny podáním látek inhibujících aktivitu IL-1. U většiny „onemocnění zprostředkovaných interleukinem-1“ jsou zvýše zmíněných tří podmínek splněny alespoň dvě podmínky a v mnoha případech těchto onemocnění pak všechny tři podmínky. Seznam akutních a chronických zánětlivých onemocnění zprostředkovaných interleukinem-1 (IL-1) zahrnuje (nejenom) následující onemocnění: akutní pankreatitida, ALS, Alzheimerova choroba, kachexie/anorexie, astma, ateroskleróza, chronický únavový syndrom, horečka, diabetes (např. inzulínový diabetes), glomerulonefritida, odmítnutí štěpu hostitelem, hemoragický šok, hyperalgézie, zánětlivé onemocnění střev, zánětlivá kloubní onemocnění včetně osteoartritidy, psoriatické artritidy a revmatické artritidy, ischemie včetně mozkové ischemie (např. poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemoragie nebo mrtvice; každá z těchto poruch může vést k neurodegeneraci), plicní onemocnění (např. ARSD), mnohotný myelom, roztroušená skleróza, myeloidní (např. AML a CML) a jiné leukemie, myopatie (například metabolismus svalových proteinů, zvláště při sepsi), osteoporóza, Parkinsonova choroba, bolest, předčasný porod, lupénka, poškození při obnovení průtoku krve, septický šok, vedlejší účinky radioterapie, dočasné onemocnění mandibulámího kloubu, metastázující nádory, zánětlivé stavy, které jsou důsledkem natažení, podvrtnutí, poškození šlachy, ortopedické operace, infekce nebo jiné zánětlivé procesy.
- 1 CZ 299025 B6
Záněty kloubů jsou chronická kloubní onemocnění, která různou měrou postihují lidi na celém světě. Revmatická artritida je kloubní onemocnění, při němž dochází k pozvolné erozi chrupavky a kosti činností proliferující, invazivní pojivové tkáně, nazývané panus, odvozené ze synoviální membrány. Tímto onemocněním mohou být postiženy periartikulámí struktuiy jako například tíhový váček, pochvy šlach a šlachy a rovněž extraartikulámí (mimokloubní) tkáně jako například podkoží, kardiovaskulární systém, plíce, slezina, lymfatické uzliny, kosterní svalstvo, nervový systém (centrální a periferní) a oči (Silberberg, Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II: strana 1828, 1985). Osteoartritida je běžné kloubní onemocnění charakterizované degenerativními změnami chrupavky kloubů a reaktivní proliferací kostí a chrupavek obklopujících kloub. Osteoartri10 tida je buněčně zprostředkovaný aktivní proces, který může být důsledkem nepatřičné reakce chondrocytů na katabolické nebo anabolické podněty. V časné fázi osteoartritidy dochází ke změnám v určitých molekulách tvořících matrix chrupavky kloubu (Thonar a další, Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19:635 až 657, 1993; Shinmei a další, Arthritis Rheum., 35:1304 až 1308, 1992).
Předpokládá se, že revmatická artritida je důsledkem vystavení imunogeneticky susceptibilního hostitele určitému antigenu. Antigeny, které mohou potenciálně vyvolat imunitní reakce, jejichž důsledkem je vznik revmatické artritidy, mohou být endogenního nebo exogenního původu. Mezi potenciální endogenní antigeny patří kolagen, mukopolysacharidy a revmatické faktory. Exogen20 ní antigeny zahrnující mykoplazmy, mykobakterie, spirochety a viry.Vedlejší produkty imunitní reakce (například prostaglandiny a kyslíkové radikály) vyvolávají znět synovia a spustí destruktivní změny v kloubu (například kolagenázu).
Existuje široké spektrum závažnosti tohoto onemocnění, nicméně u množství pacientů dochází v průběhu nemoci k recidivám (zhoršení stavu) a remisím (vymizení projevů nemoci) s celkovým schématem vyznačujícím se postupnou destrukcí a deformací kloubu. Klinické příznaky mohou zahrnovat symetrickou polyartritidu periferních kloubů spojenou s bolestí, citlivostí, otoky a ztrátou funkce takto postižených kloubů; ranní ztuhlost; a ztrátu chrupavek, erozi kostní hmoty a subluxaci (neúplné vykloubení) kloubů po přetrvávajících zánětech. Mezi extraartikulámí (mimo30 kloubní) příznaky patří výskyt revmatických modulů, revmatická vaskulitida, pleuropulmonální záněty, skleritida (zánět bělimy), Sjorgenův syndrom, Feltyho syndrom (splenomegalie a neutropenie), osteoporóza a ztráta hmotnosti (Katz, Am. J. Med., 79: strana 24, 1985; Krane a Simon, Advances in Rheumatology, Sunderman (ed.), 70(2):263 až 284, 1986). Tyto klinické příznaky mají za následek vysoký stupeň morbidity způsobující narušení každodenního života pacientů.
Úloha interleukinu-1 při artritidě byla vyvozena z výsledků dvou nezávislých přístupů. Za prvé, v synoviální membráně a synoviální tekutině artritických kloubů byly zjištěny zvýšené hladiny interleukinu-1 a MR-NA kódující IL—1 (viz. například Buchán a další, „Third Annual General Meeting of the British Society for Rheumatology“, Londýn, Anglie, 19. až 21 prosinec, 1988,
J. Rheumatol., 25(2); Fontana a další, Rheumatology Int., 2:49 až 53, 1982; Duff a další, Monokines and Other Non-Lymphocytis Cytokines, M. Powanda a další (editoři), strany 387 až 92, Alan R. Liss, lne., 1988).
Za druhé bylo prokázáno, že aplikace interleukinu-1 do zdravé tkáně kloubu vede ve velkém počtu případů k erozi chrupavky s kosti. Při jednom experimentu bylo prokázáno, že intraartikulámí injekce IL—1 vedou u králíků k destrukci chrupavky in vivo (Pettipher a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:8749 až 8753, 1986). V jiných studiích bylo prokázáno, že IL—1 způsobuje ve tkáňových explantátech destrukci jak chrupavky, tak kosti (Saklatavala a další, Development of Diseases of Cartilage and Bone Matrix, Sen a Thomhill (editoři), strany 291 až 298, Alan R.
Liss, lne., 1987; Stashenko a další, The American Association of Immunologists, 183:1464 až 1468, 1987). Jednou z obecně přijímaných teorií vysvětlujících příčinnou souvislost mezi IL—1 a artritidou je teorie, že IL—1 stimuluje u různých typů buněk (jako například fíbroblastů a chondrocytů) produkci a sekreci prozánětlivých nebo degradačních sloučenin jakými jsou například prostaglandin E2 nebo metaloproteinázy.
-2CZ 299025 B6
Antagonista receptoru nebo interleukin-1 (IL-lra) je lidský protein, který funguje jako přirozený inhibitor interleukinu-1. Antagonista receptoru pro interleukin-1 (IL-lra) byl popsán jako potenciální agens pro použití při klinické léčbě onemocnění zprostředkovaných IL—1 (Australský patent 649245). IL-lra má nicméně relativně krátký poločas života a při léčbě onemocnění zpro5 středkovaných IL—1 by tudíž bylo výhodné podávat IL-lra v přípravcích pro řízené uvolňování léčiva.
Jednou z látek použitelnou v přípravcích pro řízené uvolňování léčiva je kyselina hyaluronová. Kyselina hyaluronová je přirozeně se vyskytující mukopolysacharid složený z kyseliny D-gluku10 ronové a N-acetyl-D-glukosaminu spojených v nevětveném řetězci. Tento polymer má průměrnou molekulovou hmotnost 5x106 až 6x106 a vykazuje vynikající biokompatibilitu. V chrupavce kloubů hraje kyselina hyaluronová důležitou úlohu při vytváření matrix chrupavky tím, že agreguje s proteoglykany. Navíc bylo popsáno, že při patologických stavech, jakými jsou například revmatická artritida, osteoartritida a infekční artritida, dochází ke změnám v koncentracích a molekulových hmotnostech kyseliny hyaluronové v kloubu, a že tyto skutečnosti vedou ke změnám ve složení synoviální tekutiny.
Za účelem zlepšení Teologických vlastností nebo prodloužení doby degradace určitých léčiv bylo využito jak chemického zesíťování, tak derivatizace kyseliny hyaluronové (Cortivo a další,
Biomaterials, 2:727 až 730, 1991; Benedetti a další, J. Controlled Release, 13:3 až 41, 1990; Hunt a další, J. Controlled Release, 12:159 až 169, 1990).
Bylo prokázáno, že injekce vysokomolekulámích derivátů kyseliny hyaluronové může obnovit poškozenou vrstvu kyseliny hyaluronové na chrupavce kloubu a kyselina hyaluronová tedy může být účinná při léčbě určitých kloubních onemocnění v klinických testech (nebo při testech prováděných v základním výzkumu). Příkladem vědeckých prací popisujících použití derivátů kyseliny hyaluronové k léčbě patologických stavů kloubů jsou například publikace Nizolek aWhite, Comell Vet., 71:355 až 375, 1981; Namiki a další, Int. J. Chem. Pharmacol., Therapy and Toxicol., 20:501 až 507, 1982; Asheim a Lindblad, Acta Vet Scand., 17(4): 379 až 394, 1976;
Svanstrom, Proceedings of the 24th Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners, St Louis, MO, strana 345 až 348, 1978; Wigren a další, Upsala J. Med. Sci., Suppl., 17:1 až 20, 1975; Gingerich a další, Res. Vet. Sci., 30:192 až 197, 1980. Použití kyseliny hyaluronové v lidských kloubech je popsáno v publikaci Peyron a další, Pathologie Biologie, 22(8):731 až 736, 1974. Intraartikulámí použití kyseliny hyaluronové u koní je komerčně podpo35 řeno ve spojení s přípravky Hylartil™ a Hilartin V™ společnosti Pharmacia a přípravkem Synacid™ společnosti Sterivet. Ačkoliv jsou symptomy, jako například bolest nebo ztuhlost kloubů, vážnými problémy při léčbě kloubních onemocnění, použití kyseliny hyaluronové tyto příznaky nezmirňuje.
Kyselina hyaluronová byla rovněž použita jako nosič při aplikaci léčivých látek. Vědecká publikace autorů Rydell a další, Clinical Orthopaedics and Related Research, 80:25 až 32, 1971, popisuje použití kyseliny hyaluronové jak samostatně, tak spolu s kortisonem, v kloubech různých živočichů, zvláště pak koní. Jiná vědecká práce popisuje přípravu mikročástic na bázi esterů kyseliny hyaluronové a jejich po užití k intranazální aplikaci inzulínu (lllum a další, J. Controlled
Release, 29:133 až 141, 1994). Samotné mikročástice byly připraveny způsobem emulzifikace/odpaření rozpouštědla a následně na jednu hodinu umístěny do roztoku inzulínu a poté lyofilizovány. Po podání ovcím bylo zjištěno, že průměrná biologická dostupnost odpovídá 11% biologické dostupnosti inzulínu podávaného subkutánně. Tento systém byl rovněž využit jako nosič při aplikaci růstového faktoru nerovových buněk (Ghezzo a další, Int. J. Pharm., 87:21 až 29,
1 992). Bylo nicméně rovněž publikováno, že při injekční aplikaci fyziologických koncentrací (3 mg/ml) vysokomolekulámí (molekulová hmotnost 6x106) nebo nízkomolekulámí (molekulová hmotnost 5x105) kyseliny hyaluronové spolu s radioaktivně značených albuminech do kolenních kloubů psů bylo, ve srovnání s aplikací nižších koncentrací kyseliny hyaluronové (0,03 mg/ml pro vysokomolekulámí kyselinu hyaluronovou a 0,3 mg/ml pro nízkomolekulámí kyselinu hyalu55 ronovou), dosaženo poněkud většího objemu distribuce albuminu a vyšší rychlosti clearence
-3 CZ 299025 B6 (Myers a Brandt, J. Rheumatol., 22:1732 až 1739, 1995). Tato skutečnost naznačuje, že kombinace kyseliny hyaluronové spolu s nějakým proteinem, jako například IL-lra, nebude při léčbě zánětlivých onemocnění (zvláště je-li podávána ve formě intraartikulámí injekce) účinnosti než samotná kyselina hyaluronová.
Cílem vynálezu je poskytnout přípravky a způsoby použitelné k léčbě zánětlivých onemocnění zprostředkovaných IL—1. Tento a další cíle vynálezu budou zřejmé následujících popisů.
ío Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, která obsahuje synergická množství hyaluronanu nebo jeho soli a antagonisty (IL-lra) receptoru interleukinu 1 (IL-1), přičemž IL-lra obsahuje celou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 nebo sekvenci, která je alespoň ze 70 % homologní vzhledem k této sekvenci, nebo IL—1 inhibující fragment kterékoliv z těchto sekvencí.
Předmětem vynálezu je dále také použití této kompozice pro výrobu léčiva pro léčení zánětlivých chorob kloubů, roztroušené sklerózy, leukemie, ischemického poškození nebo reperfuzního poškození.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje časovou závislost sérových koncentrací IL-lra po subkutánní injekcí
IL-lra pouze v citrátovém pufru (plná kolečka) nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (prázdné kroužky).
Obrázek 2 znázorňuje časovou závislost množství IL-lra zbylého v kloubech morčat pro intraartikulámí injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru (plná kolečka) nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (prázdné kroužky).
Obrázek 3 znázorňuje časovou závislost koncentrace IL-lra v synoviální tekutině králíků po intraartikulámí injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru (plná kolečka) nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (prázdné kroužky).
Obrázek 4 znázorňuje vyhodnocení závažnosti onemocnění v kolenních kloubech potkanů imunizovaných bovinním kolagenem typu II, po intraartikulámí injekci IL-lra pouze v citrátovém pufru nebo v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou. Závažnost onemocnění byla sledována histologickými metodami. Jednotlivé sloupce označují zánět synovia (prázdný sloupec), panus (tečky, řidčeji), celkové poškození chrupavky (tečkování, hustší), poškození kosti (čárky) a kloub jako celek (prázdný sloupec).
Obrázek 5 znázorňuje nukleotidovou sekvenci (SEK. ID. Č. 1) kódující rekombinantní lidský ILlra (rhuIL-lra). Na obrázku je rovněž znázorněna aminokyselinová sekvence (SEK. ID. Č: 2) rhuIL-lra s methioninem jako počáteční aminokyselinou označeným Mn, kde n je rovno 0 nebo 1.
Obrázek 6 znázorňuje vliv (časová závislost) injekčního podávání (jednou denně) IL-lra (lOOmg/kg) v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou (plné trojúhelníky), IL-lra (lOOmg/kg) pouze v citrátovém pufru (prázdné trojúhelníky), kyselina hyaluronové pouze v citrátovém pufru (plná kolečka), samotného citrátového pufru (prázdné kroužky) na průměr kotníku potkanů postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II. Prázdné čtverečky označují normální stav.
-4CZ 299025 B6
Obrázek 7 znázorňuje vliv injekčního podávání (jednou denně) IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou ve srovnání s injekčním podáváním IL-lra pouze v citrátovém pufru, kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru, samotného citrátového pufru na hmotnost klapek potkanů (na konci experimentu) postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II.
První sloupec označuje normální stav.
Obrázek 8 znázorňuje vliv injekčního podávání (jednou denně) IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou ve srovnání s injekčním podáváním IL-lra pouze v citrátovém pufru, kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru, samotného citrátového pufru na intenzitu zánětu ío (plný sloupec), tvorbu pannu (šikmé šrafování), poškození chrupavky (tečky) a poškození kosti (krátké čárky), u potkanů postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II.
Obrázek 9 znázorňuje vliv (časová závislost) IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou injekčně podávaného jednou denně (plná kolečka) jednou ze 48 hodin (plné kosočtver15 ce) a jednou za 72 hodin (plné trojúhelníky) ve srovnání s injekčním podáním kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru (jednou denně) nebo ve srovnání s neléčeným stavem (prázdné trojúhelníky) na průměr kotníku potkanů postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II. Prázdné čtverečky označují normální stav.
Obrázek 10 znázorňuje vliv IL-lra v citrátovém pufru spolu s kyselinou hyaluronovou injekčně podávanou jednou denně, jednou za 48 hodin a jednou za 72 hodin ve srovnání s injekčním podáváním kyseliny hyaluronové pouze v citrátovém pufru (jednou denně) nebo ve srovnání s neléčeným stavem na hmotnost tlapek potkanů (po skončení experimentu) postižených artritidou vyvolanou podáním kolagenu typu II. První sloupec označuje normální stav.
Následuje podrobnější popis vynálezu.
Vynález se týká farmaceutického přípravku obsahujícího polymer pro řízené uvolňování léčiva (například hyaluronát) a proteinový inhibitor IL-1 (například IL-lra) jako agens k léčbě zánětli30 vých onemocnění zprostředkovaných IL-1. Popisovaný způsob léčby může být využit jak ve veterinární, tak v humánní medicíně.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují směs polymeru pro řízené uvolňování léčiva (například hyaluronát) a proteinového inhibitoru IL-1 (například IL-lra). Cílem charakteristické35 ho provedení vynálezu je aplikace farmaceutického přípravku obsahujícího hyaluronát a proteinový inhibitor IL-1 (například IL-lra) vedoucí k relativnímu prodloužení přítomnosti zvýšených koncentrací L-lra; viz prozatímní přihlášky US 60/011419, podaná 9. února 1996 Collinsem, v průvodním dopise ktéto prozatímní přihlášce nazvaná „Composition and Method for Treating Inflammatory Diseases“ (číslo spisu A-365P), prozatímní přihláška US 60/032789, podaná
6. prosince 1996 Collinsem a Bevilacquaou, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná „Composition and Method for Treating Inflammatory Diseases“ (číslo spisu A-365AP) Collinsem a Bevilacquaou, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná „Composition and Method for Treating Inflammatory Diseases“ (číslo spisu A-365P). Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Inhibitorem interleukinu-1 může být jakýkoliv protein schopný specificky inhibovat aktivaci buněčných receptorů IL-1. Jednotlivé skupiny inhibitorů interleukinu-1 jsou: antagonisté receptoru pro interleukin-1, jako například IL-lra popsaný níže; monoklonální protilátky namířené proti receptoru pro IL-1 (EP 623674); proteiny vážící IL-1 jako například rozpustné receptoiy pro IL-1 (patenty US 5492888, US 5488032, US 5464937, US 5319071 a US 5180812); monoklonální protilátky namířené proti IL-1 (WO 95/01997, WO 94/02627, WO 90/06371, US 4935343, EP 364778, EP 267611 a EP 220063); a pomocné proteiny receptoru pro IL-1 (WO 96/23067). Zmíněné publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
-5 CZ 299025 B6
Výhodně používané IL-lra (jak glykosylované tak neglykosylované), jakož i způsoby jejich přípravy a použití jsou popsány v patentu US 5075222 (v tomto textu označovaném jako přihláška '222); WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221 A WO 96/22793. Zmíněné publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynále5 zu.
Tři zvláště užitečné formy IL-lra (IL-lraa, IL-lraP a IL-lrax) a jejich varianty jsou popsány v přihlášce '222. IL-lraa je charakterizován jako molekula s molekulovou hmotností 22 až 23 kDa (stanoveno pomocí SDS-PAGE) a izoelektrickým bodem přibližně 4,8, která je z kolony ío Mono Q pro FPLC eluována pufrem Tris-HCl (pH 7,6) při koncentraci NaCl přibližně 52 mM.
IL-lraP je charakterizován jako molekula s molekulovou hmotností 22 až 23 kDa (SDS-PAGE), která je z klony Mono Q eluována pufrem Tris-HCl (pH 7,6) při koncentraci NaCl přibližně 48 mM. Jak IL-lraa, tak IL-lra3 jsou glykosylovány. IL-lrax je charakterizován jako protein s molekulovou hmotností 20 kDa (SDS-PAGE), který je z kolony Mono Q eluován pufrem Tris15 HC1 (pH 7,6) při koncentraci NaCl přibližně 48 mM, a tento protein není glykosylován. Všechny tři zmíněné inhibitory mají podobné funkční a imunologické vlastnosti.
Jeden popsaný způsob pro produkci IL-lra zahrnuje izolaci IL-ra z lidských monocytů, které tento protein přirozeně produkují. Druhý způsob zahrnuje izolaci genu kódujícího IL-lra, zaklo20 nování tohoto genu do vhodných vektorů a typů buněk, expresi zmíněného genu za účelem produkce inhibitorů a izolace takto připravených inhibitorů. Ve výhodných provedeních je používán tento druhý způsob, který je ukázkovým příkladem obecných rekombinantních metod. Rekombinantní přístupy jsou částečně upřednostňovány proto, že umožňují dosáhnout vyšších výtěžků proteinu ve větší čistotě. Do rozsahu vynálezu tudíž spadá i IL-lra obsahující na N-konci methionin, což je důsledkem exprese v prokaryotickém expresivním systému jakým je například exprese v E. coli.
Jak je zmíněno výše, vynález se rovněž týká modifikovaných forem IL-lra. Termín „modifikované formy IL-lra“, použitý v této přihlášce, zahrnuje polypeptidové varianty, ve kterých byla aminokyselinová sekvence IL-lra pozměněna tím, že v ní byly některé aminokyseliny (1) odstraněny („deleční varianty“), (2) nahrazeny jinými aminokyselinovými zbytky („substituční varianty“) nebo (3) vloženy („varianty s vloženými aminokyselinami“).
Co se týká delečních variant IL-lra, počet odstraněných aminokyselinových zbytků v polypepti35 du se přibližně pohybuje v rozmezí 1 až 30 zbytků, obvykleji pak 1 až 10 zbytků a typicky v rozmezí 1 až 5 po sobě jdoucích aminokyselinových zbytků. Do rozsahu vynálezu spadají delece na N-konci, C-konci nebo ve vnitřní sekvenci. Delece v aminokyselinové sekvenci IL-lra mohou být provedeny v oblastech vykazujících nízký stupeň homologie k sekvencím přítomným u jiných zástupců rodiny IL-1. Delece provedené v oblastech s vysokým stupněm homologie k jiným zástupcům rodiny IL-1 budou s větší pravděpodobností daleko výrazněji modifikovat biologickou aktivitu IL-1.
Co se týká variant IL-lra s vloženými aminokyselinovými zbytky, jedná se obvykle o přidání aminokyselinových sekvencí na N-konec a/nebo C-konec, přičemž počet přidaných aminokyse45 línových zbytků se pohybuje v rozmezí 1 až 100 nebo více aminokyselin. Jeden nebo více aminokyselinových zbytků může být vloženo rovněž do vnitřní oblasti sekvence. Do vnitřní oblasti sekvence je obvykle vkládáno přibližně 1 až 10 aminokyselinových zbytků, obvykleji pak 1 až 5 zbytků a typicky 1 až 3 aminokyselinové zbytky.
Příkladem variant s aminokyselinovými zbytky vloženými na N-konec je IL-lra s methioninem (například jako artefakt exprese v buněčné kultuře rekombinantních bakterií), jiným aminokyselinovým zbytkem nebo sekvencí aminokyselin vloženou na N-konec. Dalším příkladem variant s inzercí na N-konci je fúzní protein se signální sekvencí, jakož i s jinými pre-pro sekvencemi, kde tyto sekvence usnadňují sekreci daného proteinu z rekombinantních hostitelských buněk.
Každý polypeptid může obsahovat signální sekvenci zvolenou tak, aby byla rozpoznávána a pro-6CZ 299025 B6 cesována, tj. odštěpena signální peptidázou, hostitelskou buňkou. Pro expresi v prokaryotických hostitelských buňkách, které nejsou schopny rozpoznávat a procesovat nativní signální sekvenci
IL-lra, může každý polypeptid obsahovat prokaryotickou signální sekvenci vybranou například ze skupiny zahrnující vedoucí sekvence alkalické fosfatázy, penicilinázy nebo tepelně stabilního enterotoxinu II. Pro expresi v buňkách kvasinek může každý polypeptid obsahovat signální sekvenci vybranou například ze skupiny zahrnující vedoucí sekvence invertáz, faktoru alfa nebo kyselé fosfatázy. Pro expresi v savčích buňkách může každý polypeptid obsahovat nativní signální sekvenci IL-lra, nicméně mohou být rovněž použity jiné savčí signální sekvence jako například sekvence odvozené z jiných zástupců rodiny IL—1.
Varianty s aminokyselinovými zbytky vloženými na C-konec zahrnují chimérické proteiny, kde každý takový protein obsahuje IL-lra připojený kčásti nebo celé konstantní doméně těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Z těchto chimérických proteinů jsou ve výhodném provedení používány proteiny, jejichž část odvozená od imunoglobulinu obsahuje všechny domény s výjimkou první domény konstantní oblasti těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, jako například IgG, IgA, IgM nebo IgE (zvláště pak IgG, například IgGl nebo IgG3). Odborník zajisté pochopí, že v části odvozené od imunoglobulinu může být odstraněna nebo substituována (jednou nebo více aminokyselinami) jakákoliv aminokyselina, nebo zde může být vložena jeden nebo více aminokyselinových zbytků, a to pokud IL-lra stále funguje jako antagonista receptoru pro IL—1 a imunoglobulinová část vykazuje jednu nebo více z jejích charakteristik.
U substitučních variant IL-lra je alespoň jeden aminokyselinový zbytek z aminokyselinové sekvence IL-lra odstraněn a na jeho místo je vloženo zbytek odlišný. Mezi takové substituční varianty patří alelické formy, jež jsou charakterizovány přirozeně se vyskytujícími změnami v nukleotidové sekvenci u populace daného druhu, přičemž tyto změny mohou, ale nemusí, vést ke změně aminokyselinové sekvence. Odborník může využít informace týkající se vazby nebo aktivního místa daného polypeptidu k výběru možných míst mutací. Příklady substitučních variant jsou uvedeny v WO 91/17184, WO 92/16221 a WO 96/09323.
Jeden způsob, který slouží k identifikaci aminokyselinových zbytků nebo oblastí proteinů vhodných k mutagenezi, je „mutageneze záměnou za alanin“, jak je popsána v článku autorů Cunningham a Wells (Science, 244:1081 až 1085, 1989; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Při této metodě je identifikován jeden nebo skupina aminokyselinových zbytků (například nabité zbytky jako například Arg, Asp, His,
Lys a Glu) a tyto jsou následně nahrazeny neutrálními nebo negativně nabitými aminokyselinami (ve výhodném provedení alaninem nebo polyalaninem). Tato záměna má vliv na interakci zmíněných aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buněk. Aminokyseliny, jejichž funkce je zmíněnými substitucemi ovlivněna, jako dále modifikovány zavedením dalších aminokyselinových zbytků nebo záměnou stávajících aminokyselin v místech substitucí. Takže shrnu40 to: je nalezeno cílové místo pro zavedení změn do aminokyselinové sekvence, za účelem optimalizace mutace v tomto místě může být provedena „mutageneze záměnou za alanin“ nebo náhodná mutageneze a tímto způsobem připravená varianta polypeptidu je testována za účelem nalezení optimální kombinace požadovaná aktivita/stupeň aktivity.
Místa, která jsou z hlediska mutageneze zavádějící do sekvence jiné aminokyselinové zbytky nej zajímavější, zahrnují oblasti, v nichž se aminokyseliny v IL-lra podstatně liší ve velikosti, náboji a/nebo hydrofobicitě postranního řetězce od místa v proteinech podobných IL-lra, jako například v IL-lra jiných druhů nebo jiných zástupců rodiny IL—1. Dalšími místy, zajímavými z hlediska mutageneze zavádějící do sekvence jiné aminokyselinové zbytky, jsou oblasti, v nichž jsou aminokyseliny IL-lra identické s aminokyselinami v proteinech podobných IL-lra. Taková místa jsou obvykle důležitá pro biologickou aktivitu daného proteinu. Na počátku je v těchto místech provedena v podstatě konzervativní záměna. Takové konzervativní záměny jsou zobrazeny v tabulce 1 ve sloupci s názvem „Výhodná substituce“. Dojde-li po zavedení těchto substitucí ke změně biologické aktivity, následuje zavedení podstatnějších změn (sloupec Příklady jiných
-7CZ 299025 B6 substitucí) a/nebo mohou být do sekvence přidány (adice) nebo ze sekvence odstraněny (delece) aminokyseliny a u takto získaných produktů je testována jejich aktivita.
Tabulka 1
Aminokyselinové substituce
Původní aminokyse- lina Výhodná substi- tuce Příklady jiných sub- stitucí
Ala (A) Val Val; Leu; Ile
Arg (R ) Lys Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gin (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro Pro
His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg
Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Leu (L) Ile Ile; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Leu Leu; Val; Ile; Ala
Pro (P) Gly Gly
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V) Leu Leu; Ile; Met; Ala; Phe; norleucin
ío Předpokládá se, že výsledkem konzervativních změn v aminokyselinové sekvenci (a odpovídajících změn v kódující nukleotidové sekvenci) IL-lra bude vytvoření proteinů, které budou funkčně a svými chemickými charakteristikami podobné IL—Ira. Podstatných změn ve funkci a/nebo
-8CL 299025 B6 chemických charakteristikách IL-lra může být naproti tomu dosaženo zavedením substitucí, které podstatně pozměňují (a) strukturu hlavního řetězce polypeptidu vmiste substituce, například pozměňují konfiguraci α-helixu nebo flskládaného listu; (b) náboji nebo hydrofobicitu dané molekuly v cílové místě; nebo (c) velikost postranního řetězce. Přirozeně se vyskytující amino5 kyselinové zbytky jsou na základě společných charakteristik postranního řetězce děleny do následujících skupin:
1. Hydrofobní: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2. Neutrální hydrofilní: Cys, Set, Thr; io 3. Kyselé: Asp, Glu;
4. Zásadité: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
5. Zbytky ovlivňující orientaci řetězce: Gly, Pro; a
6. Aromatické: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativní záměny mohou zahrnovat záměnu některého zástupce jedné z těchto skupin za aminokyselinu z jiné skupiny. Tyto substituce mohou být zavedeny do oblastí IL-lra, které jsou nebo nejsou homologní s oblastmi u jiných zástupců rodiny IL-1.
Charakteristické mutace v aminokyselinové sekvenci IL-lra mohou zahrnovat substituce „nepři20 rozenými“ aminokyselinami na N-konci, C-konci nebo v jakémkoliv místě proteinu, které je modifikováno připojením sacharidu prostřednictvím N-glykosidické nebo O-glykosidické vazby, takové záměny mohou být zvláště užitečné ajejich příkladem je vložení nějaké aminokyseliny (například cysteinu), která je výhodně používána k připojení k polymeru rozpustnému ve vodě za účelem vytvoření derivátu popsaného v dalším textu. Sekvence IL-lra může být dále modifíko25 vána vložením nebo odstranění míst pro N- nebo O-glykosylaci. Sekvence rozpoznávané při Nglykosylaci (na asparaginu) zahrnují tripeptidy, které jsou specificky rozpoznávány enzymy odpovědnými za N-glykosylaci. Zmíněné tripeptidy mají buď sekvenci Asn-Xaa-Thr nebo AsnXaa-Ser, v níž symbol Xaa zastupuje jakoukoliv aminokyselinu vyjma prolinu.
Ve specifickém provedení vynálezu vykazují varianty vysoký stupeň homologie k aminokyselinové sekvenci IL-lra (SEK. Id. C: 2). Termín „vykazující vysoký stupeň homologie“ používaný ve vynálezu označuje skutečnost, že stupeň homologie přesahuje ve výhodném provedení vynálezu 70 %, ve výhodnějším provedení pak přesahuje hranici 80 % a nejvýhodněji pak přesahuje 90 % nebo 95 %. Procento homologie, tak jak je chápáno v této přihlášce je definováno jako pro35 cento aminokyselinových zbytků přítomných v kratší ze dvou sekvencí, které jsou srovnávány, přičemž při přiřazování odpovídajících si aminokyselinových zbytků mohou být, za účelem maximalizace přiřazení, do řetězce o délce 100 aminokyselin zavedeny čtyři mezery. Tento předpis je navržen v publikaci Dayhoff, „Atlas of Protein Science and Structure“, svazek 5, strana 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., 1972, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Jako varianty „vykazující vysoký stupeň homologie“ jsou varianty IL-lra, které mohou být izolovány na základě křížové reaktivity s protilátkami proti aminokyselinové sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č: 2, nebo varianty, jejichž geny mohou být izolovány s využitím hybridizace s DNA (nebo jejími částmi) znázorněnou jako SEK. ID. Č:l.
Produkce variant IL-lra je detailně popsána v dalším textu. Tyto varianty mohou být připraveny zavedením příslušných záměn do nukleotidové sekvence DNA kódující varianty IL-lra nebo chemickou syntézou požadovaných variant IL-lra prováděnou in vitro. Odborníkům je zřejmé, že může být provedeno množství delecí, inzercí a substitucí (ajejich kombinací) za předpokladu, že výsledné varianty IL-lra budou biologicky aktivní.
-9CZ 299025 B6
Techniky mutageneze sloužící k substituci, inzerci nebo deleci jedné nebo více zvolených aminokyselin jsou odborníkům dobře známé (například přihláška US 4518584, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Při vytváření každé změny v aminokyselinové sekvenci existují dvě hlavní proměnné: umístění mutovaného místa a podstata mutace. V návrhu každé varianty budou místění mutovaného místa a podstata mutace záviset na biochemické(-ých) charakteristice (charakteristikách), která bude měněna. Každé mutované místo může být modifikováno samostatně nebo spolu s jinými místy, například (1) nejprve substitucí konzervativní aminokyselinou a poté, v závislosti na dosažených výsledcích, méně konzervativní substitucí, (2) deleci cílového aminokyselinového zbytku nebo (3) vložením jednoho nebo více aminokyselinových zbytků do místa přiléhajícího ke zvolenému místu.
Chemicky modifikované deriváty IL-lra nebo různých variant IL-lra mohou být odborníkem připraveny s využitím postupů popsaných v tomto vynálezu. Ke konjugaci mohou být použity glykosylované, neglykosylované nebo deglykosylované IL-lra nebo varianty IL-lra. Obvykle budou použity neglykosylované IL-lra nebo varianty IL-lra. Mezi chemické sloučeniny vhodné k derivatizaci IL-lra nebo varianty IL-lra patří polymery rozpustné ve vodě.
Použití polymerů rozpustných ve vodě je žádoucí zejména proto, že protein, ke kterému je tento polymer připojen, nebude ve vodném prostředí, jako například ve fyziologickém prostředí, preci20 pitovat. Ve výhodném provedení bude zmíněný polymer přijatelný pro farmaceutickou přípravu léčivého produktu nebo přípravku. Odborník bude schopen zvolit požadovaný polymer na základě takových úvah, jako například bude-li konjugát polymer/protein používán terapeuticky, a jestliže ano, pak vzhledem k požadovanému dávkování, požadované době setrvání v krevním oběhu a rezistenci vůči proteolýze.
Mezi vhodné, farmaceuticky přijatelné, polymery rozpustné ve vodě patří (nejenom) polyethylenglykol (PEG), polyethylenglykolpropionaldehyd, kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, monomethoxypolyethylenglykol, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol (PVA), polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-l,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, poly(P-aminokyseliny) (buď homopolymery nebo kopolymery s náhodnou sekvencí), poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, homopolymery polypropylenglykolu (PPG) a jiné polyalkenoxidy, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly (POG) (například glycerol) a jiné polyoxyethylované polyoly, polyoxyethylovaný sorbitol nebo polyoxyethylovaná glukóza, polymery karbohydrátů, Ficoll nebo dextran, a jejich směsi.
Termín „polyethylenglykol“ používaný v přihlášce zahrnuje jakoukoliv z forem polyethylenglykolu, která byla použita k přípravě derivátu jiných proteinů, jako například mono- (Cl až CIO) alkyloxy- nebo aryloxy-polyethylenglykol. Vzhledem ke své stabilitě ve vodě je výhodná výroba polyethylenglykolpropionaldehydu.
Zmíněné polymery rozpustné ve vodě mohou mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené. Tyto polymery rozpustné ve vodě mají obvykle průměrnou molekulovou hmotnost v intervalu přibližně 2 kDa až přibližně 100 kDa (termín „přibližně“ vyznačuje, že v preparátech polymeru rozpustného ve vodě se vyskytují molekuly s vyšší nebo naopak nižší molekulovou hmotností než udává daný údaj). Průměrná molekulová hmotnost polymeru rozpustného ve vodě spadá ve výhodném provedení do intervalu přibližně 5 kDa až přibližně 50 kDa, výhodněji pak do intervalu přibližně 12 kDa až přibližně 25 kDa a nejvýhodněji se pohybuje kolem 20 kDa. Obecně platí, že čím je vyšší molekulová hmotnost daného polymeru nebo čím je polymer rozvětvenější, tím vyšší poměr polymer:protein je nutno použít.
Každý polymer rozpustný ve vodě by měl být k proteinu připojen s ohledem na možné ovlivnění funkčních a antigenních domén tohoto proteinu. Obecně lze říci, že derivatizace může být provedena za podmínek vhodných pro reakci proteinu s aktivovanou molekulou polymeru. Mezi aktivovatelné skupiny polymeru, které mohou být použity pro připojení polymeru k aktivním zbyt-10CZ 299025 B6 kům na proteinu, patří: sulfon, maleinimid, sulfohydryl, thiol, trifluormethansulfonát, tresylát, aziridin, oxiran a 5-pyridyl.
Polymeiy rozpustné ve vodě jsou obvykle k danému proteinu připojeny prostřednictvím a- nebo ε-aminoskupin aminokyselin nebo reaktivních -SH skupin. Do rozsahu vynálezu nicméně rovněž spadá připojení polymerů rozpustných ve vodě k jakékoliv reaktivní skupině daného proteinu, kde tato skupina je dostatečně reaktivní, aby mohla být za vhodných reakčních podmínek připojena k danému polymeru rozpustnému ve vodě. Polymer rozpustný ve vodě může tudíž být kovalentně navázán k proteinu prostřednictvím reaktivních skupin jako například volné amino10 skupiny nebo karboxylové skupiny. Aminokyselinovými zbytky s volnou aminoskupinou mohou být lysin a N-koncový aminokyselinový zbytek. Aminokyseliny s volnou karboxylovou skupinou zahrnují kyselinu asparágovou, kyselinu glutamovou a C-koncový aminokyselinový zbytek. Aminokyselinou s reaktivní -SH skupinou může být cystein.
Postupy sloužící k přípravě konjugátů proteinů a polymerů rozpustných ve vodě budou obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s polymerem rozpustným ve vodě za podmínek, které umožní připojení proteinu k jedné nebo více molekulám polymeru rozpustného ve vodě; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Reakční podmínky pro jednotlivé konjugační rekce mohou být zvoleny z podmínek v současnosti známých nebo podmínek v budoucnu vyvinutých.
Tyto podmínky by nicméně měly být zvoleny tak, aby modifikovaný protein nebyl vystaven (nebo aby toto vystavení bylo minimalizováno) podmínkám, jako například teplotě, rozpouštědlům nebo hodnotám pH, které by protein inaktivovaly. Obecně lze říci, že optimální reakční podmínky budou stanoveny případ od případu na základě známých parametrů a požadovaných výsledků. Například čím větší bude poměr polymeru rozpustného ve vodě ku proteinu, tím větší bude procento konjugovaného produktu. Optimální poměr (vzhledem k účinnosti reakce tak, aby se v reakční směsi nevyskytoval nadbytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) může být stanoven v závislosti na požadovaném stupni derivatizace (například mono-, di-, tri-deriváty a podobně), molekulové hmotnosti zvoleného polymeru, typu polymeru (rozvětvený nebo nerozvětvený polymer) a reakčních podmínkách. Poměr polymeru rozpustného ve vodě (například
PEG) ke proteinu bude obvykle v intervalu 1:1 až 100:1. Pomocí standardních purifikačních postupů, jakými jsou například (mimo jiné) dialýza, vysolování, ultrafiltrace, ionexová chromatografie, gelová chromatografie a elektroforéza, může být z každé reakční směsi izolován jeden nebo více konjugátů.
V některých případech může být zvláště žádoucí protein chemicky modifikovaný na N-konci. Polymer rozpustný ve vodě může být zvolen na základě molekulové hmotnosti, požadovaném větvení atd., poměru počtu molekul polymeru rozpustného ve vodě k počtu molekul proteinu (nebo peptidů) v reakční směsi, typu reakce použité pro navázání polymeru a způsobu izolace zvoleného proteinu s daným polymerem navázaným na N-konec. Způsobem k získání proteinu chemicky modifikovaného na N-konci (tj. oddělením takového produktu od jiných produktů) může být purifíkace proteinu chemicky modifikovaného na N-konci z populace proteinových molekul s polymerem navázaným jiným způsobem. Selektivní chemické modifikace N-konci může být rovněž dosaženo redukční alkylací, při níž je využito rozdílné reaktivity odlišných typů primárních aminoskupin (lysin oproti N-konci) dostupných při derivatizaci daného proteinu.
Za vhodných reakčních podmínek je, za použití polymeru nesoucího karboxylovou skupinu, dosaženo v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci. Selektivního navázání polymeru rozpustného ve vodě na N-konec proteinu je možné například dosáhnout tak, že je reakce prováděna při hodnotě pH umožňující využití rozdílů v hodnotách pak mezi ε-aminoskupinou lysinu a a-aminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Při této selektivní derivatizaci je připojení polymeru rozpustného ve vodě cílené: konjugace daného polymeru s proteinem probíhá přednostně na N-konci tohoto proteinu a ve významné míře nedochází k modifikaci dalších reaktivních skupin, jako například postranních řetězců lysinu. Při redukční alkylací mohou být polymery rozpustné ve vodě stejného typu jak je popsáno výše a tyto polymery by měly mít jednu reaktivní aldehydovou skupinu použitelnou k vazbě na protein. Může být využit polyethylen55 glykolpropionaldehyd nesoucí jednu reaktivní aldehydovou skupinu.
-11 CZ 299025 B6
Do rozsahu vynálezu specificky spadají proteiny derivatizováné jednou nebo více (například 2 až
4) molekulami PEG. Navázání polyethylenglykolu může být provedeno jakoukoliv reakcí v současnosti za tímto účelem používanou. Postupy sloužící k přípravě proteinového produktu s připo5 jenou molekulou (molekulami) polyethylenglykolu budou obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinu s polyethylenglykolem (jako například s reaktivním esterem nebo derivátem polyethylenglykolu nesoucím aldehydovou skupinu) za podmínek, která umožní připojení proteinu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolu; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Obecně lze říci, že optimální reakční podmínky těchto reakcí budou stanovovány případ od io případu na základě známých parametrů a požadovaných výsledků.
Odborníkům je známo množství způsobů použitelných k připojení polymeru rozpustného ve vodě k proteinu; viz. například EP 0401384, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu; Malin a další, Exp. Hematol. 20:1028 až 1035, 1992; Francis,
Focus on Growth Factors, 3 (2): 4 až 10, 1992 (Mediscript, Montain Court, Friem, Bamet Lané, Londýn, N20 OLD, UK); EP 0154316; EP 0401384; WO 92/16221; WO 95/34326; a další publikace, které jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Navázání polyethylenglykolu může být provedeno acylační nebo alkylační reakcí proteinu s reaktivní molekulou polyethylenglykolu. Mezi proteinové produkty podle vynálezu patří proteiny s navázanou (navázanými) molekulou (molekulami) polyethylenglykolu, kde je (jsou) tato (tyto) molekula (molekuly) připojena prostřednictvím acylových nebo alkylových skupin. Zmíněné produkty mohou obsahovat jednu nebo více molekul polyethylenglykolu (například 2 až 6 a ve výhodném provedení 2 až 5 molekul PEG). Molekuly polyethylenglykolu jsou obvykle k danému proteinu připojeny prostřednictvím a- nebo ε-aminoskupin aminokyselin, nicméně do rozsahu vynálezu rovněž spadá připojení těchto molekul prostřednictvím jakékoliv aminoskupiny připojené k danému proteinu a to v případě, je-li tato skupina dostatečně reaktivní k tomu, aby mohla být za vhodných reakčních podmínek připojena k molekule polyethylenglykolu.
Při acylačním navázání polyethylenglykolu je obvykle využívána reakce aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu s proteinem. Polymer (-y) používaný při acylačních reakcích by měl obsahovat jednu reaktivní esterovou skupinu. K navázání polyethylenglykolu může být využita jakákoliv známá nebo v budoucnosti objevená reaktivní molekula polyethylenglykolu. Ve výhod35 ném provedení je jako aktivovaný ester polyethylenglykolu používán ester s N-hydroxysukcinimidem (NHS). Termín „acylační navázání“ používaný ve vynálezu zahrnuje, bez jakýchkoliv omezení, následující typy vazeb mezi terapeutickým proteinem a polymerem rozpustným ve vodě (jakým je například polyethylenglykol): amid, karbamát, urethan a podobně viz. Chamow, Bioconjugate Chem., 5:133 až 140, 1994. Jako reakční podmínky mohou být zvoleny jakékoliv pod40 minky v současnosti používané (nebo v budoucnosti objevené) pro navázání polyethylenglykolu, nicméně reakce by neměla probíhat za podmínek (teplota, hodnota pH nebo povaha rozpouštědla), které vedou k inaktivaci modifikovaných proteinů.
Výsledkem acylačního navázání polyethylenglykolu obvykle bude protein s více (než jednou) navázanými molekulami polyethylenglykolu. Ve výhodném provedení bude spojující vazbou vazba amidová. Rovněž výhodné je, aby vzniklý produkt obsahoval téměř výhradně (například > 95 %) jednu, dvě nebo tři molekuly polyethylenglykolu na jednu molekulu proteinu. V závislosti na použitých reakčních podmínkách může nicméně dojít ke vzniku produktů s vyšším počtem navázaných molekul polyethylenglykolu. Je-li to žádoucí, může být z reakční směsi (zvláště od nezreagovaných reaktantů) odděleno více produktů s navázaným polyethylenglykolem, a to s využitím standardních purifikačních postupů včetně (mimo jiné) dialýzy, vysolování, ultrafiltrace, chromatografíe na iontoměničích, gelové filtrace nebo elektroforeticky.
Při alkylačním navázání polyethylenglykolu je obvykle využívána reakce derivátu polyethylen55 glykolu nesoucího na konci molekuly aldehydovou skupinu s proteinem v přítomnosti redukční- 12CZ 299025 B6 ho činidla. Polymer (-y) používaný při redukční alkylační reakci by měl obsahovat jednu reaktivní aldehydovou skupinu. Příkladem polyethylenglykolu s reaktivní aldehydovou skupinou je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stabilní ve vodném prostředí, nebo jeho mono Cl až CIO alkyloxy nebo aryloxy deriváty (viz. Patent US 5252714).
Výsledkem alkylačního navázání polyethylenglykolu může být rovněž protein s více (než jednou) navázanými molekulami polyethylenglykolu. Reakční podmínky můžou být rovněž upraveny tak, aby docházelo k navázání polyethylenglykolu v podstatě pouze na α-aminoskupinu na N-konci proteinu (tj. vznik produktu s jedinou navázanou molekulou polyethylenglykolu). Molekula(-y) ío polyethylenglykolu jsou ve výhodném provedení k proteinu připojeny vazbou -CH2-NHS odkazem na skupinu -CH2-je tento typ vazby označován jako „alkylová vazba“.
Redukční alkylace sloužící k přípravě v podstatě homogenní populace konjugátů monopolymer/protein bude obvykle zahrnovat následující kroky: (a) rekci proteinu s reaktivní molekulou poly15 ethylenglykolu, a to za podmínek pro redukční alkylaci a při hodnotě pH, které umožní selektivní modifikace α-aminoskupiny na N-konci zmíněného proteinu; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Derivatizace prováděná metodou redukční alkylace tak, aby byl protein derivatizován pouze jednou molekulou polyethylenglykolu, obvykle využívají rozdíly v hodnotách pak mezi aminoskupinami lysinu a α-aminoskupinami na N-konci (hodnota pKa odpovídá hodnotě pH, při které má 50 % aminoskupin kladný náboj (je protonizováno) a 50 % aminoskupin protonizováno není).
Tato reakce je prováděna při hodnotě pH umožňující využit rozdílů v hodnotách pak mezi εaminoskupinou lysinu a α-aminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Obecně lze říci, že při nižších pH bude žádoucí použít větší nadbytek polymeru vzhledem k proteinu (tzn. čím méně reaktivní je N-koncová α-aminoskupina, tím větší množství polymeruje nutno použít k dosažení optimálních podmínek). Jeli hodnota pH vyšší, nemusí být poměr polymer/protein tak vysoký (tzn., že čímž reaktivnější skupiny jsou dostupné, tím méně molekul polymeruje třeba). Hodnoty pH používané pro účely popsané v této přihlášce spadají do intervalu 3 až 9 a ve výhod30 něm provedení do intervalu 3 až 6. Při redukční alkylaci by redukční činidlo mělo být stabilní ve vodném prostředí a ve výhodném provedení by mělo účinně redukovat pouze Schiffovou bázi vytvořenou v počátečním kroku této reakce. Výhodně používanými redukčními činidly jsou tetrahydroboritan sodný, kyanoborohydrid sodný, dimethylaminboran, trimethylaminboran a pyridinboran. Zvláště výhodné je použití kyanoborohydridu sodného jako redukčního činidla.
Ostatní reakční podmínky, jako například rozpouštědlo, reakční čas, teploty a podobně a způsoby purifikace reakčních produktů, mohou být stanoveny případ od případu na základě publikovaných informací týkajících se přípravy derivátů proteinů s využitím polymerů rozpustných ve vodě.
Za podmínek naznačených výše bude alkylaci v redukčním prostředí dosaženo selektivního připojení polymeru rozpustného ve vodě (obsahujícího reaktivní skupinu jako například aldehydovou skupinu). Konjugace s polymerem proběhne přednostně na N-konci proteinu a nedojde v podstatě k žádným modifikacím jiných reaktivních skupin jako například aminoskupin postranních řetězců lysinu. V preparátu bude ve výhodném provedení více než 90 % konjugátů mono45 polymer/protein a výhodněji pak více než 95 % konjugátů monopolymer/protein, přičemž ostatní pozorovatelné molekuly budou nezreagované (tzn. protein postrádající molekulu polymeru).
Derivatizace polyethylenglykolem může být rovněž specificky prováděna s využitím polymerů rozpustných ve vodě obsahujících alespoň jednu reaktivní hydroxylovou skupinu (například poly50 ethylenglykol), která je schopna reagovat s látkou nesoucí reaktivní karbonylovou, nitridovou nebo sulfonovou skupinu. Při reakci dojde k přeměně hydroxylové skupiny na Michaelův akceptor a tím k vytvoření „aktivovaného linkeru“ použitelného k modifikaci nejrůznějších proteinů za účelem vytvoření „vylepšených“ biologicky aktivních konjugátů. Termín „reaktivní karbonyl, nitril nebo sulfon“, používaný v přihlášce, označuje karbonylovou, nitrilovou nebo sulfonovou
-13 CZ 299025 B6 skupinu připojenou ke dvojuhlíkovému řetězci nesoucímu na druhém uhlíku (uhlík odlišný od uhlíku nesoucího karbonylovou, nitrilovou nebo sulfonovou skupinu) reaktivní místo použitelné pro specifickou reakci s thiolovou skupinou (WO 92/16221).
Aktivované linkery mohou být monofunkční, bifunkční nebo multifunkční. Užitečnými činidly (použitelnými ve zmíněných postupech) nesoucími reaktivní sulfonovou skupinu jsou (nejenom) chlorsulfon, vinylsulfon a divinylsulfon.
V jednom provedení vynálezu je polymer rozpustný ve vodě aktivován Michaelovým akcepto10 rem. WO 95/13313 popisuje, mezi jinými, polyethylenglykoly (rozpustné ve vodě) aktivované sulfonovou skupinou, které jsou použitelné pro vysoce selektivní připojení ke thiolovým skupinám (namísto aminoskupin) na molekulách nebo površích. Tyto deriváty polyethylenglykolu jsou odolné (v delším časovém intervalu) vůči hydrolýze ve vodných prostředích při hodnotách pH přibližně 11 nebo méně a mohou vytvářet vazby s molekulami za vzniku konjugátů, které jsou rovněž odolné vůči hydrolýze. Vazba, kterou jsou spojeny polyethylenglykol a biologicky aktivní molekuly, zahrnuje sulfonovou skupinu připojenou ke thiolové skupině a má strukturu PEGSO2-CH2-CH2-S-W, kde písmeno W reprezentuje biologicky aktivní molekulu a kde činidlem nesoucím sulfonovou skupinu je vinylsulfon nebo aktivní ethylsulfon. Dvěma zvláště užitečnými homobifunkčními deriváty jsou PEG-bis-chlorsulfon a PEG-bis-vinylsulfon.
Přihláška US 08/473809, podaná 7. června 1995, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu, popisuje způsoby přípravy linkerů s aktivovanou sulfonovou skupinou. Tyto způsoby zahrnují získání sloučeniny nesoucí reaktivní hydroxylovou skupinu a přeměnu této skupiny na reaktivní Michaelův akceptor, čímž je vytvořen aktivovaný linker. Při zmíněné přeměně je jako rozpouštědlo použit tetrahydrogenfuran (THF). Přihláška US 08/611918, podaná 6. března, 1996, která je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu, popisuje metodu purifikace aktivovaných linkerů, kde tato metoda využívá k separaci linkerů na základě jejich velikosti a povaze koncové skupiny chromatografii na obrácené fázi.
Polynukleotidy
Do rozsahu vynálezu dále spadají polynukleotidy, které kódují IL-lra a varianty IL-lra. Na základě předkládaného popisu a za použití tabulky kodonů může odborník snadno určit všechny nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence IL-lra nebo variant IL-lra.
K přípravě zmíněných polynukleotidů a expresi proteinů kódovaných těmito polynukleotidy mohou být využity rekombinantní techniky popsané dále v textu. Například vložením nukleotidové sekvence kódující IL-lra nebo nějakou z variant IL-lra do vhodného vektoru může odborník snadno připravit velká množství požadované nukleotidové sekvence. Tyto sekvence mohou být použity k přípravě detekčních sond nebo amplifikačních primerů. Jinou možností je vložení polynukleotidu kódujícího IL-lra nebo nějakou z variant IL-lra do expresivního vektoru. Zavedením takto připraveného expresivního vektoru do vhodného hostitele může být produkováno velké množství požadovaného proteinu.
Jak je popsáno v dalším textu, existuje množství dostupných systémů hostitel/vektor použitelných k amplifikaci požadovaných nukleotidových sekvencí a/nebo k produkci požadovaných proteinů, tyto systémy zahrnují (bez omezení) plazmidy, virové nebo inzerční vektory a prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky. Odborník může přizpůsobit systém hostitel/vektor, použi50 telný k amplifikaci nebo expresi heterologní DNA, pro produkci nebo expresi sekvencí podle vynálezu.
Odborníci dále zajisté pochopí, že do rozsahu vynálezu spadají i degenerované nukleotidové sekvence kódující IL-lra o sekvencích zobrazených na obrázku 5 a rovněž nukleotidové sekven55 ce, které hybridizují (ve výhodném provedení za podmínek vyžadujících vysokou míru komple-14CZ 299025 B6 mentarity) s komplementárními sekvencemi zmíněných nukleotidových sekvencí (Maniatis a další, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, Strana 387 až 289, 1992). Příkladem takových hybridizačních podmínek je hybridizace v pufru 4 x SSC při 62 až 67 °C následovaná promýváním v 0,1 x SSC při 62 až 67 °C po dobu jedné hodiny. Jiným příkladem hybridizačních podmínek vyžadujících vysokou míru komplementarity je hybridizace v 45 až 55% formamidu, 4 x SSC při 40 až 45 °C. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají sekvence DNA, které hybridizují se sekvencí komplementární k nukleotidové sekvenci zobrazené jako SEK. ID. Č: 1 za podmínek vyžadujících nižší míru komplementarity. Vynález se rovněž týká sekvencí kódujících variant IL-lra. Příkladem hybridizačních podmínek ío vyžadujících nižší míru komplementarity je hybridizace v pufru 4 x SSC při 45 až 55 °C nebo hybridizace v pufru s přídavkem 30 až 40% formamidu při 40 až 45 °C.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají rekombinantní konstrukty DNA obsahující vektorovou DNA spolu se sekvencemi DNA kódujícími požadované proteiny. V každém takovém konstruktu je nukleotidová sekvence kódující požadovaný protein (s nebo bez signálního peptidu) funkčně spojena s vhodnou řídicí nebo regulační sekvencí umožňující replikaci a/nebo expresi požadovaného proteinu v hostitelské buňce.
Exprese rekombinantních proteinů
Příprava polynukleotidů
Nukleotidové sekvence kódující IL-lra nebo varianty IL-lra mohou být snadno získány různými postupy včetně (nejenom) chemické syntézy, screeningu gumového nebo cDNA knihovny, scree25 ningu expresivní knihovny a/nebo amplifikací cDNA s využitím PCR. Tyto a jiné postupy použitelné k izolaci zmíněných nukleotidových sekvencí jsou uvedeny v publikacích Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989; Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology; Green Publishers inc. and Wiley and Sons, NY, 1994; Berger a Kimmel, Methods in Enzymology:
Guide to Molecular Cloning Techniques, svazek 152, Academie Press, lne., San Diego, CA. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Chemická syntéza nukleotidových sekvencí může být provedena postupy v současnosti dobře známými; viz například publikace Engels a další, Angew. Chem. Intl. Ed., svazek 28, strany 716 až 734, 1989; a Wells a další, Gene, 34: strana 315, 1985. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Zmíněné postupy zahrnují, mimo jiné, syntézu nukleotidových sekvencí s využitím fosfotriesterové, fosforamiditové a Hfosfonátové metody. Dlouhé nukleotidové sekvence, například sekvence delší než přibližně 100 nukleotidů, mohou být syntetizovány ve formě několika fragmentů. Tyto fragmenty mohou být následně spojeny dohromady a tím je vlastně vytvořena nukleotidová sekvence kódující požadovaný protein. Ve výhodném provedení je používána standardní syntéza na polymemím nosiči a fosforamiditový přístup.
Jinou možností získání příslušné nukleotidové sekvence je screening vhodné knihovny cDNA (tj. knihovny připravené z jedné nebo více tkání, u kterých se předpokládá, že exprimují daný protein) nebo genomové knihovny (knihovny připravené z celkové genomové DNA). Zdrojem pro cDNA knihovnu je obvykle tkáň z jakéhokoliv organizmu, u něhož se předpokládá, že exprimuje požadovaný protein v dostatečném množství. Zdrojem pro genomovou knihovnu může být jaká50 koliv tkáň nebo tkáně z jakéhokoliv savce nebo jiného druhu, u něhož se předpokládá, že nese gen kódující požadovaný protein.
Přítomnost DNA kódující požadovaný protein může být v hybridizačních médiích testována pomocí jedné nebo více nukleotidových sond (oligonukleotidů, fragmentů cDNA nebo genomové
DNA, které vykazují přijatelnou míru homologie k cDNA nebo genu, který má být klonován),
-15CZ 299025 B6 které budou selektivně hybridizovat s cDNA nebo genem (geny) nacházejícími se v příslušné knihovně. Sondy používané pro takové testování (screening) obvykle kódují krátkou oblast sekvence DNA ze stejného nebo příbuzného druhu jako byl organizmus použitý k vytvoření knihovny. Sondy mohou být rovněž degenerované (jak je zmíněno v dalším textu).
Hybridizace je obvykle uskutečněna „nasednutím“ oligonukleotidové sondy nebo cDNA na klony, a to za takových podmínek, které brání nespecifickým vazbám, ale které umožňují navázání klonů vykazujících značnou míru homologie se sondou nebo primerem. Podmínky hybridizace a promývání hybridizačních membrán částečně závisejí na velikosti (tj. počtu nukleotidů) cDNA nebo oligonukleotidové sondy a na degeneraci sondy. Při volbě hybridizačního média je rovněž zvažována pravděpodobnost identifikace daného klonu (tj. zda-li je testována cDNA nebo genomová knihovna).
Jestliže je jako hybridizační sonda použit fragment DNA (jako například cDNA), jsou typickými hybridizačními podmínkami popsané v publikaci Ausubel a další, 1994, viz výše. Po hybridizaci je hybridizační médium nahrazeno promývacím roztokem jehož složení závisí na několika faktorech jako například velikosti sondy, předpokládaném procentu homologie sondy a klonu, testovaném hybridizačním médiu, počtu testovaných klonů a podobně. Příklady promývacích roztoků (které zachovávají „našedlé“ pouze dvojice sonda/klon s vysokou komplementaritou), obvykle o nízké iontové síle a používané při relativně vysokých teplotách, jsou: 0,015 M NaCl, 0,05 M citronan sodný a 0,1% SDS při teplotě 55 až 65 °C; jiný promývací roztok má složení 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7,2 a 1% SDS při teplotě přibližně 40 až 50 °C; další promývací roztok má složení 0,2 x SSC a 0,1% SDS při teplotě 55 až 60 °C.
Existují rovněž postupy pro promývání hybridizačních membrán za podmínek, kdy jsou ke screeningu hybridizačních médií použity oligonukleotidové sondy. První protokol například využívá 6 x SSC s 0,05% difosforečnanu sodného při teplotě v intervalu 35 °C až 63 °C (v závislosti na délce sondy). Například sondy o 14 bázích jsou promývány při 35 až 40 °C, sondy o 17 bázích při 45 až 50 °C, sondy o 20 bázích při 52 až 57 °C a sondy o 23 bázích při 57 až 63 °C. Jestliže je pozorována vysoká intenzita nespecifických vazeb, může být teplota zvýšena o 2 až 3 °C. Druhý protokol využívá k promývání chlorid trimethylamonia (TMAC). Jeden takový promývací roztok má složení 3M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a 0,2% SDS.
Další metodou vhodnou k získání požadované nukleotidové sekvence je polymerázová řetězcová reakce (PCR). Při této metodě je za použití reverzní transkriptázy z poly(A)+RNA nebo celkové RNA připravena cDNA. Následně jsou ktéto cDNA přidány dva primery, obvykle komplementární ke dvěma odděleným úsekům cDNA (oligonukleotidy) kódujícím požadovaný protein, spolu s nějakou polymerázou jako například polymerázou Taq. Tato polymeráza amplifikuje oblast cDNA nacházející se mezi dvěma použitými primery.
Oligonukleotidové sekvence použité jako sondy nebo primery by měly být přiměřeně dlouhé a dostatečně specifické, aby byly minimalizovány nespecifické vazby, ke kterým může docházet při screeningu nebo amplifikaci pomocí PCR. Přesná sekvence sond nebo primerů je obvykle založena na sekvenci konzervativních nebo vysoce homologních oblastí. Sondy nebo primery mohou být rovněž úplně nebo částečně degenerované, tzn., že mohou obsahovat směs sond/primerů, kde všechny kódují stejnou aminokyselinovou sekvenci, avšak s využitím různých kodonů. Alternativou k přípravě degenerovaných sond je umístění inosinu do některých nebo do všech pozic kodonů, které jsou mezidruhově odlišné. Oligonukleotidové sondy nebo primery mohou být připraveny postupy chemické syntézy DNA popsanými v předchozím textu.
Vektory
DNA kódující požadovaný protein může být, za účelem dalšího klonování (amplifíkace DNA) nebo za účelem exprese, vložena do vektorů. Vhodné vektory jsou komerčně dostupné nebo mohou být specificky vytvořeny. Volba nebo vytvoření vhodného vektoru bude záviset na (1)
-16CZ 299025 B6 bude-li vektor použit k amplifikaci DNA nebo k expresi; (2) velikosti DNA vkládané do vektoru;
a (3) hostitelské buňce, které bude tímto vektorem transformována. Každý vektor obsahuje, v závislosti na své funkci (amplifikace DNA nebo exprese DNA) a slučitelnost s použitou hostitelskou buňkou, různé sekvence. Tyto sekvence obvykle zahrnují (nejenom) jednu nebo více z nás5 ledujících: signální sekvence, počátek replikace, jeden nebo více genů pro selekční markéry, promotor, posilovač transkripce, terminátor transkripce a podobně. Tyto sekvence mohou být získány z přirozených zdrojů nebo mohou být syntetizovány s využitím známých postupů.
Příkladem vhodných prokaryotických vektorů jsou bakteriofágy jako například bakteriofágy ío odvozené od bakteriofága lambda nebo plazmidu z E. coli (například pBR322, colEl, pUC,
F-faktor a plazmidu odvozené od plazmidu Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Za tímto účelem mohou být rovněž použity jiné vhodné expresivní vektory různých typů, které jsou v současnosti používané v kombinaci s hostitelskými buňkami popsanými v dalším textu.
Signální sekvence
Nukleotidová sekvence kódující signální sekvence může být vložena do místa přiléhajícího k 5' konci sekvence kódující požadovaný protein (signální sekvence například může být součástí vektoru nebo může být části nukleotidové sekvence kódující požadovaný protein). Nukleotidová sekvence kódující nativní signální sekvence IL-lra je například známa (patent US 5075222). Počátek replikace
Expresivní a klonovací vektory obvykle obsahují nukleotidovou sekvenci, která umožňuje repli25 kaci tohoto vektoru v jedné nebo více hostitelských buňkách. V klonovacím vektoru tato sekvence obvykle umožňuje replikaci tohoto vektoru nezávislou na replikaci hostitelské chromozomální DNA a zahrnuje počátek replikace hostitelské chromozomální DNA a zahrnuje počátek replikace nebo autonomně se replikující z plazmidu pBR322 je vhodný pro většinu gram-negativních bakterií a různé počátky replikace (například SV40, polyoma, adenovirus, VSV nebo BPV) jsou použitelné pro klonovací vektory savčích buněk. U savčích expresivních vektorů není obvykle počátek replikace potřený (například počátek replikace SV40 je často používán pouze proto, že obsahuje časný promotor).
Selekční gen
Expresivní a klonovací vektory obvykle obsahují nějaký selekční gen. Tento gen kóduje „selekční markér“ nezbytný pro přežití a růst transformovaných hostitelských buněk kultivovaných v selekčním médiu. Hostitelské buňky, které nejsou daným vektorem transformovány, nebudou obsahovat selekční gen a nebudou tudíž schopny přežívat v kultivačním médiu. Obvykle použí40 váné selekční geny kódují proteiny, které (a) propůjčují nositeli rezistenci vůči antibiotikům nebo jiným toxinům, například vůči ampicilinu, neomycinu, methotrexátu nebo tetracyklinu; (b) komplementují auxotrofní deficience buněk; nebo (c) dodávají životně důležité látky, které nejsou dostupné z komplexních médií.
Jiné selekční geny mohou být použity k amplifikaci exprimovaných genů. Amplifikace je proces, při kterém jsou geny nutné k produkci proteinu nezbytného pro růst, v chromozomech následných generací hostitelských buněk tandemově zmnoženy. Příklady vhodných selekčních markérů pro savčí buňky jsou dihydrofolát reduktáza (DHFR) a thymidin kináza. Transformované buňky jsou vystaveny selekčnímu tlaku, které jsou schopny přizpůsobit se (a přežít) pouze transformo50 váné buňky, a to na základě fungování markérů přítomných ve vektorech. Selekčního tlaku je dosaženo kultivací transformovaných buněk za podmínek, při kterých je koncentrace selekčního agens v médiu postupně měněna, což vede k amplifikaci jak selekčního genu, tak DNA kódující požadovaný protein. Výsledkem je syntéza zvýšeného množství požadovaného proteinu z amplifikované DNA.
- 17CZ 299025 B6
Například buňky transformované selekčním genem pro DHFR jsou nejprve identifikovány kultivací všech transformantů v kultivačním médiu obsahujícím methotrexát, kompetitivního antagonistu DHFR. Při použití DHFR divokého typu jsou vhodnými hostitelskými buňkami linie buněk křečcích ovárií deficientní v aktivitě DHFR (Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA,
77(7):4216 až 4220, 1980; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Transformované buňky jsou následně vystaveny zvýšeným koncentracím methotrexátu. To vede k syntéze mnoha kopií genu pro DHFR a současně stím k syntéze mnoha kopií jiných sekvencí DNA nacházejících se v expresivním vektoru, jako například DNA kódující požadovaný protein.
Promotor
Expresivní a klonovací vektory obvykle obsahují promotor, který je rozpoznáván hostitelským organizmem a je funkčně připojen k nukleotidové sekvenci kódující požadovaný protein. Promo15 tor je nepřekládaná sekvence umístěná proti směru transkripce (5') od startovního kodonu strukturního genu (obvykle ve vzdálenosti 100 až 1000 bp), která řídí transkripci a translaci dané nukleotidové sekvence jako například sekvence kódující požadovaný protein. Promotory mohou být rozděleny do dvou skupin, inducibilní promotory a konstitutivní promotory. Inducibilní promotor spouští zvýšenou transkripci DNA pod svou kontrolou jako odpověď na přítomnost nebo absenci nějaké nutriční složky nebo změnu teploty. V současnosti je známo velké množství promotorů rozpoznávaných různými potenciálními hostitelskými buňkami. Promotor může být funkčně připojen k DNA kódující požadovaný protein tak, že je štěpením restrikčními enzymy odstraněn promotor ze zdrojové DNA a tento je nahrazen požadovanou promotorovou sekvencí. Promotorová sekvence nativního IL-lra může být použita křížení amplifikace a/nebo exprese
DNA kódující tento protein. Ve výhodném provedení je nicméně používán heterologní promotor a to za předpokladu, že umožňuje, ve srovnání s nativním promotorem, dosažení silnější transkripce a větších výtěžků exprimovaného proteinu, a že je kompatibilní se zvoleným hostitelským systémem. K řízení amplifikace a/nebo exprese DNA kódující IL-lra může být například použita jakákoliv z nativních promotorových sekvencí jiných zástupců rodiny IL—1.
Promotory vhodné pro použití v prokaryotických hostitelích zahrnují promotorové systémy betalaktamázy a laktózy; promotorové systémy alkalické fosfatázy a tryptofanu (trp); systém genu bakteriální luminiscence (luxR) a hybridní promotory jako například promotor tac. Jiné známé bakteriální promotory jsou rovněž použitelné. Nukleotidové sekvence promotorů byly publiková35 ny a odborník tudíž bude schopen za použití linkerů nebo adaptorů (které obsahují požadovaná restrikční místa) připojit tyto promotory k požadované sekvenci (sekvencím) DNA.
V současnosti jsou dobře známy promotorové sekvence pro použití v buňkách kvasinek. Promotory vhodné pro použití v savčích buňkách jsou v současnosti rovněž známy a zahrnují sekvence získané z genomů jako například polyoma viru, viru planých neštovic (varicela), adenoviru (jako například adenoviru 2), bovinního papilloma viru, viru způsobujícího vznik sarkomů u ptáků, cytomegaloviru, nějakého retroviru, viru hepatitidy typu B a ve výhodném provedení viru SV40 (Simian virus 40). Jinými vhodnými savčími promotory jsou heterologní savčí promotory, například promotory heat-shock proteinů a promotor aktinu.
Posilovač transkripce (enhancery)
Expresivní a klonovací vektory obvykle obsahují sekvenci posilovače transkripce, která u vyšších eukaryot vede ke zvýšení intenzity transkripce sekvence DNA kódující požadovaný protein. Posi50 lovaěe transkripce jsou element DNA fungující v pozici cis (pozn. tj. na stejném vláknu DNA, na němž je i sekvence kódující požadovaný protein), které jsou obvykle dlouhé 10 až 300 bp, a které ovlivňují promotor tak, aby docházelo ke zvýšení intenzity transkripce. Posilovače transkripce jsou relativně nezávislé na orientaci a umístění. Mohou se nalézat proti i po směru transkripce od transkripční jednotky. Kvasinkové posilovače transkripce jsou ve výhodném provedení používá-18CZ 299025 B6 ny spolu s kvasinkovými promotory. Je známo několik sekvencí posilovačů transkripce ze savčích genů (například genů kódujících globin, elastázu, albumin, alfa-feto protein a inzulín).
Příkladem posilovačů transkripce použitelných k aktivaci eukaryotických promotorů jsou rovněž virové posilovače transkripce, jako například posilovač transkripce SV40, posilovač transkripce časného promotoru cytomegaloviru, posilovač transkripce polyoma viru a posilovač transkripce adenoviru. I když mohou být posilovače transkripce umístěny jak proti směru transkripce, tak i po směru transkripce od DNA kódující požadovaný protein, obvykle jsou umístěny proti směru transkripce od promotoru.
Terminátor transkripce
Expresivní vektory použité v eukaryotických hostitelských buňkách obvykle obsahují sekvenci nezbytnou k ukončení transkripce a ke stabilizaci mRNA. Takové sekvence mohou být obvykle získány z 5' (a příležitostně 3') konců nepřekládaných oblastí eukaryotických DNA nebo cDNA. Tyto oblasti obsahují nukleotidové sekvence přepisované jako polyadenylační fragmenty v nepřekládané části mRNA kódující požadovaný protein.
Konstrukce vektorů
Vytvoření vhodných vektorů, z nichž každý obsahuje jednu nebo více z výše uvedených sekvencí (spolu se sekvencí kódující požadovaný protein), může být uskutečněno pomocí standardních ligačních reakcí. Izolované plazmidy nebo fragmenty DNA jsou restrikčně štěpeny, upraveny a v požadovaném pořadí ligovány tak, aby byl vytvořen daný vektor. Za účelem potvrzení vytvo25 ření požadované sekvence, může být ligační směs použita k transformaci buněk E. coli a transformanty mohou být selektovány pomocí známých postupů popsaných výše. Z transformovaných buněk jsou připravena větší množství příslušného vektoru a štěpením restrikčními endonukleázami a/nebo sekvencí je potvrzena přítomnost požadovaného konstruktu.
Může být rovněž použit vektor sloužící ktransientní expresi DNA kódující požadovaný protein v savčích buňkách. Obecně lze říci, že transientní exprese zahrnuje použití expresivního vektoru, který je v hostitelské buňce schopen účinné replikace a tím dochází k akumulaci mnoha kopí tohoto vektoru v dané hostitelská buňce, a následně je syntetizováno velké množství požadovaného proteinu kódovaného expresivním vektorem. Každý transientní expresivní systém zahrnující vhodný expresivní vektor a hostitelskou buňku umožňuje snadnou pozitivní identifikaci proteinů kódovaných klonovanými DNA, jakož i rychlý screening požadovaných biologických nebo fyziologických vlastností těchto proteinů, tj. identifikaci biologicky aktivních variant IL-lra.
Hostitelské buňky
Do rozsahu vynálezu rovněž spadá množství rekombinantních hostitelských buněk, které obsahují nukleotidovou sekvenci použitelnou k expresi požadovaného proteinu. Příkladem prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk jsou bakteriální, savčí, rostlinné a hmyzí buňky a buňky kvasinek a hub.
Prokaiyotické hostitelské buňky zahrnují (výčet není limitující) eubakterie jako například gramnegativní nebo gram-pozitivní organizmy (například E. coli (HB101, DH5a, DH10 a MCI061); zástupce rodu Bacillus jako například B. subtilis; zástupce Pseudomonas jako například P. aeruginosa; Streptomycety; Salmonella typhimurium; nebo Serratia marcescans). V charakteris50 tickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován v E. coli.
Mimo prokaryotických hostitelských buněk mohou být jako hostitelské buňky vhodné pro expresi požadovaného proteinu použity eukaryotické mikroorganizmy jako například filamentózní houby nebo kvasinky. Mezi nižšími eukaryotickými hostitelskými mikroorganizmy jsou nejčas-19CZ 299025 B6 něji používány pekařské kvasnice (Saccharomyces cerevisiae), nicméně dobře popsané a snadno dostupné jsou i jiné rody, druhy a kmeny.
Požadovaný protein může být v glykosylované formě exprimován jakoukoliv z velkého počtu vhodných hostitelských buněk odvozených z mnohobuněčných organizmů. Tyto hostitelské buňky jsou schopny komplexního processingu a provádějí glykosylaci. V principu může být použita jakákoliv buněčná kultura z vyšších eukaryotických buněk, a to jak buněk obratlovců tak bezobratlých, včetně rostlinných a hmyzích buněk. V charakteristickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován s využitím bakulovirového systému.
Jelikož je kultivace buněk obratlovců (tkáňová kultura) známým postupem, mohou být tyto buňky používány. Příkladem použitelných savčích hostitelských buněčných linií jsou (nejenom) linie CV1 odvozená z opičích ledvin transformovaná SV40 (COS-7), buněčná linie odvozená z ledvin lidského embrya (buňky 293 nebo buňky 293 upravené za účelem kultivace v suspenzní kultuře), ledvinné buňky mláďat křečků nebo buňky křeččích ovárií. Dalšími vhodnými savčími buněčnými liniemi jsou (výčet není limitující) buňky HeLa, myší buňky L-929, linie 3T3 odvozené z myší Swiss, Balb-C nebo NIH, a křeččí buněčné linie BHK a HaK. V charakteristickém provedení vynálezu může být požadovaný protein exprimován v buňkách COS.
Hostitelské buňky mohou být transformovány a ve vhodném provedení transfekovány požadovanou nukleovou kyselinou, a to za vhodných podmínek umožňujících expresi této nukleotidové sekvence. Výběr vhodných hostitelských buněk a způsobu transformace, kultivace, amplifikace, testování (screeningu) a produkce a purifikace produktů jsou v současnosti dobře známy (Gething a Sambrook, Nátuře, 293: 620 až 625, 1981; nebo alternativně Kaufman a další, Mol. Cell, Biol,
5(7): 175 0 až 1759, 1985; nebo patent US 4419446. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Savčí buňky bez buněčné stěny mohou být například transfekovány postupem využívajícím precipitaci s fosforečnanem vápenatým. K transfekci může být rovněž použita elektroporace, mikroinjekce a jiné známé techniky.
Požadovaný protein může být rovněž produkován homologní rekombinantní nebo pomocí rekombinantních postupů využívajících zavedení řídicích prvků do buněk které již obsahují DNA kódující požadovaný protein. Homologní rekombinace je technika původně vyvinutá ke směrování genů zavádějících nebo odstraňujících mutace v transkripčně aktivních genech (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid. Res. and Mol. Biol., 6: 301, 1989; tato publikaci je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Základní metoda byla vyvinuta za účelem zavedení specifických mutací do daných oblastí savčího genomu (Thomas a další Cel, 44: 419 až 428, 1986; Thomas a Capecchi, Cell, 51: 503 až 512, 1987; a Doetschman a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 8583 až 8587, 1988; tyto publikace jsou zde uvedeny záměno za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu) nebo za účelem „opravy“ určitých mutací v defektních genech (Doetschman a další, Nátuře, 330: 576 až 578, 1987; tato publikace jezde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Příklady takových postupů jsou popsány v patentu US 5272071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 a WO 94/31560. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Při homologní rekombinaci může být sekvence DNA, která má být vložena do genomu, směrována do požadované oblasti daného genu připojením ke „směrující DNA“. „Směrující DNA“ je sekvence DNA komplementární (homologní) k nějaké oblasti genomové DNA. V průběhu replikace genomové DNA se malé části „směrující DNA“, které jsou komplementární kdané oblasti genomu, dostanou do kontaktu s rodičovským řetězcem genomové DNA. Obecnou vlastností DNA zavedené do buněk je její schopnost hybridizace a následné rekombinace s jinými částmi endogenní DNA, a to prostřednictvím sdílených homologních oblastí. Je-li takový komplementární řetězec připojen k oligonukleotidu obsahujícímu mutaci nebo jinou sekvenci DNA, je tento oligonukleotid, jako důsledek rekombinace, rovněž začleněn do nově syntetizovaného řetězce.
Důsledkem „proofreadingu“ („korektury při syntéze DNA“) je skutečnost, že nová sekvence
-20CZ 299025 B6
DNA může sloužit jako templát pro syntézu dalšího řetězce. Transfekovaná DNA je tudíž začleněna do genomu.
Je-li sekvence příslušného genu známa (například nukleotidová sekvence požadovaného pro5 teinu), může být sekvence řídící expresi (úsek DNA komplementární ke zvolené oblasti daného genu) syntetizována nebo získána jiným způsobem (například vhodným restrikčním štěpením nativní DNA v místech sousedících s danou oblastí). Tento úsek DNA slouží po zavedení do buňky jak „směrující“ sekvence a bude hybridizovat s homologní oblastí v genomu. Nastane-li tato hybridizace během replikace DNA, bude zmíněný úsek a jakékoliv sekvence k tomuto úseku připojená, fungovat jako Okazakiho fragment a bude přepsán do nově syntetizovaného dceřinného řetězce DNA.
K úsekům „směrující DNA“ jsou připojeny oblasti DNA, které mohou ovlivňovat expresi požadovaného proteinu. Do genomu příslušné hostitelské buňky je například vložen, v místě a orien15 tací vhodné k ovlivnění transkripce DNA kódující požadovaný protein, prvek promotor/posilovač transkripce, supresor nebo exogenní prvek modulující transkripci. Tento řídicí prvek nekóduje požadovaný protein, ale namísto toho řídí transkripci části DNA přítomné v genomu hostitelské buňky. Exprese požadovaného proteinu není tudíž dosaženo transfekcí DNA kódující tento protein, ale použitím „směřující DNA“ (obsahující úseky homologní k oblastem požadovaného endogenního genu) připojené k regulačním segmentům, které poskytují sekvenci endogenního genu signály rozpoznávané při transkripci daného proteinu.
Kultivace hostitelských buněk
Způsoby kultivace jednotlivých druhů rekombinantních hostitelských buněk používaných k produkci požadovaného proteinu se budou lišit v závislosti na množství faktorů a úvah; optimální postup pro produkci požadovaného proteinu bude odborníkům v dané situaci zřejmý a může být stanoven bez přílišného experimentování. Rekombinantní hostitelské buňky jsou kultivovány ve vhodném médiu a exprimovaný protein může být z kultivačního média (nebo z buněk, je-li expri30 mován intracelulámě) izolován a purifíkován s využitím vhodných technik odborníkům známých.
Rekombinantní buňky sloužící k produkci požadovaného proteinu mohou být kultivovány v médiu vhodném k indukci promotorů, selekci vhodných rekombinantních hostitelských buněk nebo k amplifikaci genu kódujícího požadovaný protein. Do kultivačních médií může být (je-li to nezbytné) přidány hormony a/nebo jiné růstové faktory (například inzulín, transferin nebo epidermální růstový faktor), soli (například chlorid sodný, ionty vápníku, hořčíku nebo fosforečnanový anoin), nukleosidy (například adenosin a thymidin), antibiotika (například gentamicin), stopové prvky (definované jako anorganické sloučeniny obvykle přítomné mikromolámích koncentra40 cích) a glukóza nebo jiné zdroje energie. Odborníkům je rovněž zřejmé, že do kultivačních médií mohou být ve vhodných koncentracích přidány rovněž další sloučeniny. Odborníci rovněž dobře znají vhodné podmínky kultivace (jako například teplota, pH a podobně) zvolených hostitelských buněk.
Vzniklý produkt exprese může být následně purifíkován téměř do homogenity za použití postupů v současnosti známých. Příklady způsobů purifikace jsou popsány v patentu US 5075222 a WO 91/08285. Ve výhodném provedení je produkt exprese produkován v podstatě čisté formě. Termínem „v podstatě čistý“ je označována skutečnost, že v nemodifikované formě má IL-lra poměrně vysokou specifickou aktivitu, ve výhodném provedení v intervalu přibližně 150 000 až
500 000 jednotek receptorů/m, jak je definováno v publikacích Hannum a další, Nátuře, 343: 336 až 340, 1990; a Eisenberg a další, Nátuře, 343: 341 až 346, 1990. (Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Je rovněž zřejmé, že jednotlivé varianty IL-lra mohou mít rozdílné specifické aktivity.
-21 CZ 299025 B6
Farmaceutické přípravky
Farmaceutické přípravky budou obvykle obsahovat terapeuticky účinné množství (alespoň jednoho z následujících) IL-lra, nějaké varianty IL-lra nebo jejich chemických derivátů (souborně v této přihlášce označované jako „produkt IL-lra), spolu s látkou sloužící k řízenému uvolňování v optimálním případě v nějakém vehikulu. Vehikulum ve výhodném provedení zahrnuje jednu nebo více farmaceuticky a fyziologicky přijatelných látek pro formulaci přípravků obsahujících produkt IL-lra a látku pro řízené uvolňování.
Polymer pro řízené uvolňování může být vybrán ze skupiny zahrnující polymery erodující (rozpadající se) v celém objemu (například kopolymery kyselina polymléčná/kyselina polyglykolová (PLGA), polymerní směsi PLGA, blokové kopolymery polyethylenglykolu a kyseliny mléčné a glykolové, poly(kyanoakryláty); polymery erodující (rozpadající se) pouze v povrchové vrstvě (například polyanhydridy a polyorthoestery); estery hydrogelů (například polyoly Pluronic, poly15 vinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, kopolymery anhydrid kyseliny maleinové/alkylvinylether, poly(2-hydroxymethylmetakrylát) (pHEMA), kyselina metakrylová (MAA), směsi pHEMA a MAA, celulóza (například karboxymethylcelulóza); hyaluronát, alginát, kolagen, želatina, albumin a škroby a dextrany) a směsi výše uvedených sloučenin; přípravky na bázi lipozomů nebo mikročástice. Výše uvedené sloučeniny (a jejich směsi) mohou ovlivnit fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost clearence in vivo proteinů podle vynálezu a jejich derivátů. Optimální složení farmaceutického přípravku pro požadovaný protein bude odborníkem určeno v závislosti na způsobu podávání a požadovaném dávkování. Příklady farmaceutických přípravků jsou popsány v publikacích Gombotz a Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 až 351, 1995; aRemington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435 až 1712, 1990. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Specifické směsi pro řízené uvolňování jsou dostupné od následujících dodavatelů: DepoTech Corp., San Diego, CA (Depofoam™, multivesikulámí liposomy) a Alkermes, lne., Cambridge, MA (ProLease™, mikročástice PLGA).
Jedno charakteristické provedení vynálezu popisuje systémy pro aplikaci léčiva založené na použití hyaluronátu, a to v rozpustné nebo nerozpustné, zesíťované formě. Termín „hyaluronát“ používaný v této přihlášce zahrnuje hyaluronát, kyselinu hyaluronovou, její soli (například hyaluronát sodný), estery, ethery, enzymaticky připravené deriváty a zesíťované gely kyseliny hyaluronové a chemicky modifikované deriváty kyseliny hyaluronové (například hylan). Nemodifikova35 ná nebo modifikovaná kyselina hyaluronová slouží jako nosič, který umožňuje řízené uvolňování léčiva z daného systému.
Použitým hyaluronátem může být jakýkoliv typ hyaluronátu v současnosti za těmito účely využívaným. Hyaluronát může být extrahován z různých zdrojů jako například kohoutích hřebínků, pupečníkových šňůr nebo bakteriálních kultur jako například hemolytických streptokoků skupiny A nebo C. Příklady jednotlivých forem hyaluronátu jsou uvedeny v publikacích Peyron a Balazc, Path. Biol., 22(8):731 až 736, 1974; Isdale a další, J. Drug Dev., (2): 93 až 99, 1991; Larsen a další, Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129 až 1134, 1993; Namiki a další, International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11):501 až 507, 1982;
Meyer a další, Journal of Controlled Release, 35:67 až 72, 1995; Kikuchi a další, Osteoarthritis and Cartilage, 4:99 až 110, 1996; Sakakibara a další, Clinical Orthopaedics and Related Research, 229:282 až 292, 1994; Meyers a Brandt, 22(9):1732 až 1739, 1995; Laurent a další, Acta Orthop Scand, 66(226): 116 až 120, 1995; Cascone a další, Biomaterials, 16(7):569 až 574, 1995; Yerashalmi a další, Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2): 267 až 273, 1949;
Bematchez a další, Journal of Biomedical Materials Research, 27(5):677 až 681, 1993; Tan a další, Australian Journal of Biotechnology, 4(1):38 až 43, 1990; Gombotz a Pettit, Bioconjugate Chem., 6:332 až 351, 1995; patenty US 4582865, US 4605691, US 4636524, US 4713448, US 4716154, US 4716224, US 4772419, US 4851521, US 4957774, US 4863907, US 5182326, US 5202431, US 5336767, US 5356883, Evropská patentová přihláška EP 0 507604 A2
-22CZ 299025 B6 aEP 0 718312 A2; a WO 96/05845. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Hyaluronát by měl být používán v takové čistotě, aby v organizmu savce podstupujícího léčbu nevyvolával žádné nepříznivé nebo toxické reakce. To znamená, že by měl být zbaven pyrogenů, a měl by obsahovat pouze tak malé množství proteinů a/nebo nukleových kyselin (se kterými je přirozeně asociován), aby nevyvolával výraznou imunitní odpověď organizmu. Vhodné postupy purifíkace hyaluronátu jsou popsány v patentech US 4141973, US 5411874, US 542053, US 5559104, US 5563051 a japonských přihláškách číslo 14594/1077, 67100/1979 ío a 74796/1980. Tyto dokumenty jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Hyaluronát může být použit ve formě volné kyseliny nebo ve formě jakékoliv farmaceuticky přijatelné soli. Jako sůl hyaluronátu je možné zmínit sůl alkalických kovů jako například sodnou nebo draselnou sůl a sůl kovů alkalických zemin jako například vápenatou nebo hořečnatou sůl. Ve výhodném provedení je zdrojem hyaluronátu kultura vhodného mikroorganizmu.
Ve vynálezu může být použity hyaluronát o molekulové hmotnosti spadající do širokého intervalu. Molekulová hmotnost hyaluronátu se obvykle pohybuje v rozmezí 0,1x106 až lxlO7, ve výhodném provedení v rozmezí 0,5xl06 až 5xl06, výhodněji pak v rozmezí lxlO6 až 5xl06 a nejvýhodněji v intervalu lxl O6 až 4x106 (například v intervalu lxl O6 až 2x106).
Zvýšení molekulové hmotnosti hyaluronátu zesíťováním může být provedeno mnoha způsoby. V patentu US 4716224 popisuje Sakuria a další zesíťováním kyseliny hyaluronové nebo jejích solí prostřednictvím polyfunkčního epoxidu. V patentu US 4863907 popisuje Sakuria a další zesíťované glykosaminoglykany nebo jejich soli připravené zesíťováním glykosaminoglykanů nebo jejich solí prostřednictvím polyfunkční sloučeniny epoxidu. V evropské přihlášce EP 0 507604 A2 popisuje Huang a další iontově zesíťované polysacharidy obsahující karboxylové skupiny, kde látkou použitou k tomuto zesíťování byla sloučenina s trojmocným kationtem.
V patentech US 4716154 a US 4772419 popisuje Malson a další zesíťování kyseliny hyaluronové prostřednictvím bi- nebo polyfunkčních epoxidů nebo odpovídajících halohydrinů, epihalohydrinů nebo halidů, a divinylsulfonu. V patentu US 4957744 popisuje della Valle a další zesíťované estery kyseliny hyaluronové připravené esterifikací karboxylových skupin kyseliny hyaluronové vícesytnými alkoholy. V patentech US 4582865, US 4605691 a US 4636524 popisuje Balazs a další zesíťované kyseliny hyaluronové a jejich solí a jiných polysacharidů prostřednictvím reakce s divinylsulfonem. V patentech US 5128326 a US 4582865 popisuje Balazs a další zesíťování kyseliny hyaluronové pomocí formaldehydu, epoxidů, polyaziridylových sloučenin a divinylsulfonu. V patentech US 4713448 popisuje Balazs a další chemickou modifikaci kyseliny hyaluronové prováděnou reakcí s aldehydy, jako například formaldehydem, glutaraldehydem a glyoxalem, a rovněž uvádí možnost vzniku zesíťovaných produktů. V patentu US 5356883 popisuje Kuo a další zesíťování kyseliny hyaluronové reakcí s biskarbodiimidy. V EP 0 718312 A2 popisuje Nguyen zesíťování kyseliny hyaluronové nebo jejích solí a jiných polysacharidů reakcí s di- nebo polyanhydridy.
V závislosti na konečném použití produktu může být koncentrace hyaluronátu v těchto produktech (vzhledem k rozpustným polymerům) v intervalu přibližně 0,5 % až 5 % (hmotnostně) nebo více, ve výhodném provedení v rozmezí 0,1 % až 4 % (hmotnostně) a výhodněji pak v rozmezí 1 % až 3 % (hmotnostně). Koncentrace inhibitoru IL-1 se může pohybovat v širokém rozmezí a ve výhodném provedení by měla být zvolena v závislosti na rozpustnosti daného inhibitoru IL50 1, na jeho farmakologické aktivitě, požadovaných účincích koncového produktu a podobně.
Zesíťovaný hyaluronát je obvykle rozpuštěn v nějakém rozpouštědle (například fyziologickém roztoku) na takovou viskozitu, aby vzniklý roztok (gel) mohl procházet injekční jehlou. Materiál o nízké viskozitě velmi usnadňuje injekční podávání například tím, že umožňuje použití koncent55 rovaných vodných roztoků hyaluronátu v dávkách o praktické velikosti Jestliže je viskozita 1%
-23CZ 299025 B6 vodného roztoku hyaluronátu při 37 °C nižší než přibližně 200 c/s (stanoveno pomocí CannonManningova semimikroviskozimetru postupy popsanými v ASTM D 445 a D 2515) může být tento roztok snadno použit v dávkách pro injekční aplikaci o objemu přibližně 10 mililitrů, kde každá z těchto dávek obsahuje přibližně 100 miligramů aktivní složky.
Systémy pro aplikaci léčiva podle vynálezu obsahují následující složky:
1) roztoky hyaluronátu s rozpouštěnou nebo dispergovanou léčivou látkou;
ío 2) gel na bází zesíťovaného hyaluronátu vytvářející makromolekulámí „klec“, ve které je léčivá látka dispergována;
3) gel na bázi směsi zesíťovaného hyaluronátu spolu s přinejmenším jedním dalším hydrofilním polymerem, v němž je léčivá látka dispergována; a
4) gel na bázi zesíťovaného hyaluronátu nebo gel na bázi směsi zesíťovaného hyaluronátu spolu s přinejmenším jedním dalším hydrofilním polymerem, obsahující léčivou látku, která je kovalentně připojena k makromolekule kyseliny hyaluronové nebo dalšího použitého polymeru.
Existuje několik způsobů smíchání léčivé látky a gelu a z toho vyplývá, že může být získáno několik typů produktů.
Jeden z těchto způsobů zahrnuje difundování léčivé látky do gelu, je-li tento gel umístěn do roz25 toku zmíněné léčivé látky. Difúze je obvykle velmi pomalá a závisí na koncentraci léčivé látky, teplotě roztoku, velikosti částic a tvořících gel a podobně. Produktem získaným tímto postupem je gel, v němž je léčivá látka rovnoměrně dispergována.
Produkt stejného typu může být připraven dehydratací gelu na bázi hyaluronátu a následnou 30 rehydratací tohoto gelu roztokem léčivé látky. K dehydrataci gelu může být použito organické rozpouštědlo mísitelné s vodou nebo může být voda z gelu odstraněna sušením. Ve výhodném provedení je nicméně využíváno rozpouštědla, neboť po vysušení při nízké nebo zvýšené teplotě nelze dosáhnout nabobtnání gelu odpovídajícímu počátečnímu stavu. Na druhé straně, po dehydrataci prováděné pomocí rozpouštědla je možné dosáhnout nabobtnání gelu na objem odpovídají35 cí objemu gelu před dehydratací. Ve výhodném provedení jsou jako rozpouštědla používány ethanol a izopropanol a ketony jako například aceton. Mohou být nicméně použita i jiná rozpouštědla.
K získání produktů tohoto typu může být využit ještě jiný postup. Při tomto postupuje koncent40 rovaný gel kyseliny hyaluronové vzniklý zesíťovací reakcí prováděnou v poměrně koncentrovaném roztoku hyaluronátu ponechán bobtnat v roztoku léčivé látky.
Ačkoliv pomocí všech tří zmíněných metod je možné získat v podstatě totožné produkty, každá z těchto metod má, ve srovnání se dvěma zbývajícími metodami, určité výhody při přípravě urči45 tého produktu, a tudíž volba použité metody by měla záviset na úvahách beroucích v potaz takové parametry jako charakter léčivé látky, požadovaná koncentrace léčivé látky v systému, rychlost uvolňování látky a podobně.
Za účelem získání roztoku hyaluronátu s rozpuštěnou nebo dispergovanou léčivou látkou může být využit jakýkoliv konvenční postup. Hyaluronát získaný z jakéhokoliv zdroje může být rozpouštěn ve vodě nebo fyziologickém roztoku na požadovanou koncentraci a v tomto připraveném roztoku může být léčivá látka rozpouštěna nebo dispergována. Jinou možností je smíchání roztoku nebo disperze léčivé látky s roztokem hyaluronátu. Koncentrace polymeruje volena v závislosti na výsledném použití připraveného produktu a molekulové hmotnosti hyaluronátu. Zvolená koncentrace léčivé látky závisí na požadované aktivitě výsledného produktu.
Za účelem „naplnění“ zesíťovaného nabobtnaného gelu léčivou látkou difúzí, může být tento gel umístěn do roztoku dané léčivé látky. Čas nutný k dokončení tohoto procesu závisí na velikosti částic gelu, poměru objemu nabobtnaného gelu k objemu původního vzorku, teplotě, intenzitě míchání, koncentraci léčivé látky v roztoku a podobně. Vhodnou volbou kombinace těchto parametrů může být „naplnění“ nabobtnaného gelu léčivou látkou dosaženo v poměrně krátkém čase.
Za účelem dehydratace zesíťovaného gelu pomocí nějakého rozpouštědla je dostačující umístit tento gel v jakékoliv formě (například malých částic nebo ve formě membrány) do rozpouštědla, ve výhodném provedení těkavého rozpouštědla (například izopropanolu), a ponechat ho v tomto rozpouštědle dostatečně dlouho, aby došlo k odstranění vody z daného gelu. Množství odstraněné vody závisí na velikosti částic nebo tloušťce membrány, poměru gel/rozpouštědlo a podobně. Je-li to žádoucí, může být působení rozpouštědlem opakováno několikrát. Rozpouštědlo může být z gelu odstraněno sušením za normálního tlaku nebo při pokojové nebo zvýšené teplotě ve vakuu. Tímto způsobem dehydratovaný gel nabobtná po vložení do roztoku léčivé látky na původní objem.
Přípravky hyaluronátu jsou dostupné od následujících dodavatelů: BioMatrix, Inc., Ridgefíeld, NJ (Synvisc™, směs hylanu ve formě kapaliny a hylanu ve formě gelu v poměru 90:10); Fidia .p.A., Abano Terme, Itálie (Hyalgan™, sodná sůl kyseliny hyaluronové pocházející z hřebínků kohoutů (molekulová hmotnost přibližně 500 000 až 700 000)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japonsko (Artz™, 1% roztok kyseliny hyaluronové pocházející z hřebínků kohoutů (molekulová hmotnost přibližně 700 000)); Pharmacia AB, Stockholm, Švédsko (Healon™, kyselina hyaluronová pocházející z hřebínků kohoutů, molekulová hmotnost přibližně 4xl06);
Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoat™, rekombinantní kyselina hyaluronová); Pronova Biopolymer, Inc., Portsmouth, NH (kyselina hyaluronová FCH, vysokomolekulámí (molekulová hmotnost přibližně 1,5 x 2,2 x 106), kyselina hyaluronová připravená z kultur Streptococcus zooepidemicus; hyaluronát sodný MV, molekulová hmotnost přibližně 1,0 až 1,6 x 106, a hyaluronát sodný LV, molekulová hmotnost přibližně 1,5 až 2,2 x 106); Calbiochem30 Novabiochem AB, Lautelfíngen, Švýcarsko (kyselina hyaluronová, sodná sůl (katalogové číslo (rok 1997) 385908) připravená z mikroorganizmů rodu Streptococcus); Intergen Company, Purchase, NY (kyselina hyaluronová pocházející z hřebínků kohoutů, molekulová hmotnost vyšší než 1 x 106); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ a Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japonsko.
Primární rozpouštědlo ve vehikulu může být svým charakterem vodné nebo nevodné. Vehikulum může navíc obsahovat další farmaceuticky přijatelné pomocné látky k modifikaci nebo udržování pH, ve výhodném provedení v rozmezí hodnot 6,0 až 7,0, výhodněji pak na hodnotě 6,5 (například pufiy jako citronany, fosforečnany nebo aminokyseliny jako například glycin); plniva pro lyofilizované přípravky (například mannitol nebo glycin); látky k modifikaci nebo udržování osmolarity (například mannitol nebo chlorid sodný); povrchově aktivní látky (například polysorbát 20, polysorbát 80, Triton, Pluronic); viskozity; čirosti; barvy; sterility; stability (například sacharóza a sorbitol); antioxidanty (například siřiěitan sodný nebo hydrogensiřičitan sodný); konzervační látky (například kyselina benzoová a kyselina salicylová); vůni přípravku; ochuco45 vadla a ředicí látky; rychlost rozpouštění (například solubilizátory nebo solubilizující látky jako například alkoholy, polyethylenglykoly a chlorid sodný); rychlost uvolňování; emulzifikátory; suspenzační činidla; rozpouštědla; plniva; aplikační vehikula; zřeďovadla; pomocné látky a/nebo farmaceutické adjuvans. Optimální sloužení farmaceutického přípravku pro požadovaný protein bude odborníkem stanoveno v závislosti na způsobu aplikace a požadovaném dávkování (viz například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435 až 1712, 1990; tato publikace je zde uvedena záměnou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Charakteristické farmaceutické přípravky mají následující složení: 10 mM Citronan sodný, 140 mM chlorid sodný, 0,5 mM EDTA, 0,1% polysorbát 80 ve vodě (hmotnostně), pH 6,5 („přípravek s citronanovým pufrem“); a 10 mM fosforečnan
-25CZ 299025 B6 sodný, 140 mM chlorid sodný, 0,01% až 0,1% polysorbát 80 ve vodě (hmotnostně) a volitelně
0,5 mM EDTA, pH 6,5 („přípravek s fosforečnanovým pufrem“).
Ve výhodném provedení vynálezu je IL-lra (ve formě jemných částic) rozpouštěn nebo roz5 suspendován v 0,1% až 5% (w/v; hmotnost na objem) roztoku hyaluronátu nebo solí kyseliny hyaluronové (například hyaluronátu sodného), a to jako suchý prášek nebo rozpuštěný ve vodě nebo ve vodném rozpouštědle (například fyziologických roztocích jako například nějaké sodné soli rozpustné ve vodě, 3 až 5% roztocích glykózy a 3 až 5% roztocích xylitolu a přípravcích s citronanovým nebo fosforečnanovým pufrem). Hyaluronát a IL-lra mohou být smíchány io různými postupy jako například vstřikováním roztoku IL-lra v jedné stříkačce do druhé stříkačky obsahující hyaluronát (a zpět), mícháním nebo mikrofluidizací. Směsi IL-lra mohou být skladovány při teplotách 0 °C až 5 °C, aniž by docházelo k degradaci nebo agregaci proteinu. Koncentrace hyaluronátu se může pohybovat v intervalu 0,1 až 5 % (w/v), výhodně používaná koncentrace je nicméně 2 %. Podobně, výsledná koncentrace IL-lra v přípravku se může pohy15 bovat v rozmezí 0,1 až 200 mg/ml, ve výhodném provedení se jedná o koncentraci 100 mg/ml. pH výsledného roztoku nebo suspenze je ve výhodném provedení upraveno na hodnotu 6,0 až 7,5.
Jakmile byl farmaceutický přípravek formulován, může být tento skladován ve sterilních ampul20 kách ve formě roztoku, suspenze, gelu, emulze, pevné látky nebo ve formě dehydratovaného nebo lyofilizovaného prášku. Přípravky mohou být skladovány buď ve formě určené k přímému použití nebo ve formě (například lyofilizované) vyžadující před vlastní aplikací rekonstituci. Ve výhodném provedení jsou tyto přípravky skladovány při teplotách nejvýše 4 °C, výhodněji pak při -70 °C. Ve výhodném provedení jsou přípravky obsahující IL-lra skladovány a apliková25 ny při fyziologickém pH nebo při hodnotě pH blízké fyziologickému pH. V současné době se má zato, že skladování a aplikace přípravků o vysokém pH (tj. pH vyšším než 8) nebo o nízkém pH (tj. pH nižším než 5) je nežádoucí, a ve výhodném provedení by pH přípravku mělo spadat do intervalu 6,0 až 7,0, výhodněji pak by pH přípravku mělo mít hodnotu 6,5.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k používání souprav (kitu) sloužících k přípravě jednotlivých aplikačních dávek. Zmíněné soupravy mohou zahrnovat dvě nádobky: první obsahující protein v pevném stavu a druhou obsahující kapalný přípravek. Soupravy spadající do rozsahu tohoto vynálezu jsou jednokomorové nebo vícekomorové přednaplněné injekční stříkačky; přednaplněné injekční stříkačky (například kapalné stříkačky a lyostříkačky jako například
Lyo-Ject®, dvoukomorové přednaplněné lyostříkačky) mohou být získány od společnosti Vetter GmbH, Ravensburg, Německo.
Inhibitory 1L-1 (například produkty IL-lra) mohou být pacientům podávány v terapeuticky účinných množstvích za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (jak jsou definována výše), včetně zánětlivých onemocnění kloubů (například psoriatické artritidy a revmatické artritidy). Termín „pacient“ označuje jak zvířata (například kočky, psy a koně), tak lidi.
Inhibitor IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) může být aplikován místně, enterálně nebo parenterálně včetně (výčet není limitující) injekcí a infuzí aplikovaných intravenózně, intramuskulámě, intraarteriálně, intrathekálně, intrakapsulámě, intraorbitálně, intrakardiálně, intradermálně, intraperitoneálně, transtracheálně, subkutánně, subkutikulámě, intraartikulámě, subkapsulámě, subarachnoidálně, intraspinálně, intraventrikulámě a intrastemálně. Inhibitor IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) může být rovněž za účelem systematického podání aplikován orálně nebo přes sliznice, tj. intranazálně, subligválně (pod jazyk), bukálně nebo rektálně. Ve výhodném provedení jsou inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) podávány ve formě injekcí aplikovaných intraartikulámě, subkutánně, intramuskulámě nebo intravenózně. V jednom charakteristickém provedení, uvedeném jako příklad a nikoliv jako omezení vynálezu, mohou být inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra), za účelem léčby revmatické artritidy nebo osteoartritidy, podávány
-26CZ 299025 B6 intraartikulámě. V jiném charakteristickém provedení, uvedeném jako příklad a nikoliv jako omezení vynálezu, mohou být inhibitory IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra), za účelem léčby revmatické artritidy, zánětlivého onemocnění střev, roztroušené sklerózy, mnohotného myelomu nebo myeloidní (například AML nebo CML) a jiných leukémií, podávány subkutánně nebo intramuskulámě. V dalším charakteristickém provedení, uvedeném jako příklad a nikoliv jako omezení vynálezu, mohou být inhibitory IL—1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) podávány intravenózně za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemorhagie nebo mrtvice, nebo za účelem léčby odmítnutí štěpu hostitelem; nebo mohou být podávány inraventriio kulámě za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem úrazu.
Bez ohledu na způsob podávání vyžaduje léčba onemocnění zprostředkovaných IL—1 aplikaci jedné nebo několika dávek (ve stanoveném režimu dávkování) inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v účinných množstvích, tj. množíš ství účinných k prevenci, potlačení nebo zmírnění příznaků daného onemocnění, jako například k neutralizaci postupné destrukce chrupavky kloubu, jež je způsobena degradací proteoglykanů, které jsou složkami chrupavky kloubu. Jelikož jsou hyaluronát i IL-lra přirozeně se vyskytujícími látkami v organizmu savců, předpokládá se, že neexistuje homí mez tolerované dávky. Jako při každé léčbě je nicméně rozumné používat dávky nepřevyšující množství nezbytná k dosažení požadovaného účinku.
Specifická dávka je vypočítána v závislosti na přibližné tělesné hmotnosti nebo ploše těla pacienta. Mezi další faktory zohledňované při stanovení vhodného dávkování patří povaha léčeného nebo předcházeného onemocnění nebo patologického stavu, závažnost onemocnění, způsob podávání a věk, pohlaví a celkový zdravotní stav pacienta. Odborníci jsou schopni provést další zpřesnění výpočtů nezbytných ke stanovení vhodného dávkování při léčbě, a to zvláště ve světle stanovení a informací o dávkách popsaných v této přihlášce. Dávkování může být rovněž stanoveno s využitím známých postupů pro určení dávkování používaných spolu s odpovídajícími údaji o reakci organizmu na podávanou dávku.
Frekvence podávání jednotlivých dávek závisí na povaze onemocnění nebo patologického stavu pacienta, a rovněž na farmakokinetických parametrech daného inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) použitého v přípravku a na způsobu aplikace. Inhibitor IL—1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak
IL-lra) může být aplikován pouze jednou anebo, v případech závažných nebo déletrvajících poruch, může být podáván denně (nebo méně častěji) nebo může být aplikován ve velké počáteční dávce následované kontinuálním přísunem nebo prodlouženým uvolňováním. Do rozsahu vynálezu rovněž spadá využití jiných režimů kontinuálního nebo téměř kontinuálního dávkování. Výsledkem chemické derivatizace mohou například být formy s prodlouženým účinkem, které umožňují dosažení kontinuální přítomnosti dané látky v krevních oběhu v předvídatelných množstvích odvozených od stanoveného režimu dávkování.
Výhodně používané režimy dávkování produktů IL-lra při léčbě onemocnění zprostředkovaných IL—1 (včetně zánětlivých onemocnění kloubů jako například revmatické artritidy a psoriatické artritidy) jsou popsány v přihlášce AU 9173636. Tyto režimy zahrnují; (1) intraartikulámí injekci IL-lra podávanou opakovaně za účelem prevence nebo léčby recidivy artritidy a (2) opakovaně aplikované subkutánní injekce produktu IL-lra. Při parenterální aplikaci může být jedna dávka až 200 mg, obvykle méně než 150 mg a nejčastěji až 100 mg. Při aplikaci do kloubní dutiny je farmaceutický přípravek ve výhodném provedení podáván ve formě jedné injekce o objemu 3 až
10 obsahující dávku maximálně 200 mg/ml, obvykle méně než 150 mg a nejčastěji až 100 mg produktu IL-lra rozpuštěného ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanovým pufrem (PBS). Tento přípravek je do kloubní dutiny aplikován jednou za 7 až 10 dní. V tomto případě je aplikace provedena 4 až 5-krát a je-li to nezbytné, při jednotlivých podáních mohou být dávky rozdílné.
-27CZ 299025 B6
Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být aplikovány spolu s dalšími léčivými látkami vhodnými k léčbě daného onemocnění. Produkt inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produkt IL-lra a výhodněji pak IL-lra) může být aplikován samostatně nebo v kombinaci s jedním nebo více protizánětlivými léčivy. Informace týkající se následujících sloučenin mohou být nalezeny v publikacích „The Merck Manual of Diagnosis and Therapy“, 16. vydání, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ, 1992; a „Pharmaprojects“, PJB Publications Ltd.
V současnosti používaná léčba onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány io výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například revmatická artritida), zahrnuje v první řadě použití léčivých látek k potlačení bolesti a zánětu, označovaných jako nesteroidní protizánětlivá léčiva (NSAID). Dále pak nastupuje použití kortikosteroidů, pomalu účinkujících Antirevmatik (SAARD - slow acting antirheumatic drugs) nebo léčiv modifikujících onemocnění.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) a jednoho nebo více NSAID za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteo20 artritidy, psoriatické artritidy a/nebo revmatické artritidy); a odmítnutí štěpu hostitelem. Protizánětlivý účinek NSAID je, alespoň částečně, důsledkem inhibice syntézy prostaglandinů (Goodman a Gilman v publikaci „The Pharmacological Basis of Therapeutics“, 7. vydání, MacMillan, 1985). NSAID jsou rozděleny do devíti skupin: (1) deriváty kyseliny salicylové; (2) deriváty kyseliny propionové; (3) deriváty kyseliny octové; (4) deriváty kyseliny fenamové; (5) deriváty kyseliny karboxylové; (6) deriváty kyseliny butanové; (7) oxikamy; (8) pyrazoly a (9) pyrazolony.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) a jednoho nebo více derivátů kyseliny salicylové, jejích prekurzorů ve formě ester nebo farmaceuticky přijatelných solí. Zmíněné deriváty kyseliny salicylové, její prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: acetaminosalol, aloxiprin, aspirin, benorylát, bromosaligenin, acetylsalicylát vápenatý, cholin magnézium trisalicylát diflusinal, etersalát, fendosal, kyselinu gentisovou, acetylsalicylát lysinia, mesalamin, salicylát morfolinia, 1-naftylsalicylát, olsalazin, parsalmid, fenylacetylsalicylát, fenylsalicylát, salacetamid, kyselinu salicylamid O-octovou, salsalát a sulfasalazin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny salicylové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhod40 ném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné solemi. Zmíněné deriváty kyseliny octové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přija45 telné soli zahrnují: alminoprofen, benoxaprofen, kyselinu bukloxovou, karprofen, dexindoprofen, fenoprofen, flunoxaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furkloprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminia, ibuproxam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loxoprofen, miroprofen, naproxen, oxaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, kyselinu tiaprofenovou a tioxaprofen. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny propionové vykazující obdobné anal50 getické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty
-28CZ 299025 B6 kyseliny propionové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné solemi.
Zmíněné deriváty kyseliny octové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: acemetacin, alclofenak, amfenak, bufexamak, cinmetacin, klopirak, delmetacin, diklofenak sodný, etodolak, felbinak, fenklofenak, fenklorak, kyselinu fenklozovou, fentiazak, furofenak, glukametacin, ibufenak, indomethacin, isofezolac, isoxepak, lonazolak, kyselinu metiazinovou, oxametacin, oxpinak, pimetacin, proglumetacin, sulindak, talmetacin, tiaramid, tiopinak, tolmetin, zidometacin a zomepirak. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny octové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi.
Zmíněné deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: kyselinu emfenamovou, etofenamát, kyselinu flufenamovou, isonixin, kyselinu meklofenamovou, meklofenamát sodný, kyselinu medofenamovou, kyselinu mefanamovou, kyselinu niflumovou, talniflumát, terofenamát, kyselinu tolfenamovou a ufenamát. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny fenamové vykazující obdobné analge20 tické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny karboxylové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: clidanac, diflunisal, flufenisal, inoridin, ketorolac atinoridin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny karboxylové vykazující obdobné anal30 getické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více deriváty kyseliny butanové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné deriváty kyseliny butanové, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: bumadizon, butibufen, fenbufen a xenbucin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné deriváty kyseliny butanové vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více oxikamy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné oxikamy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: droxikam, enolikam, isoxikam, piroxi45 kam, suroxikam, tenoxikam a 4-hydroxyl-l,2-benzthiazin 1,1-dioxid 4-(N-fenyl)-karboxamid. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné oxikamy vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhod50 ném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pyrazoly, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné pyrazoly, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: difenamizol a epirizol. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné pyrazoly vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
-29CZ 299025 B6
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pyrazolony, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi. Zmíněné pyrazolony, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: apazon, azapropazon, benzpiperylon, feprazon, mofebutazon, morazon, oxyfenbutazon, fenylbutazon, pipebuzon, propylfenazon, ramifenazon, suxibuzon a thiazolinobutazon. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné pyrazolony vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více z následujících NSAID: kyselina ε-acetamidokapronová, S-adenosylmethionin, kyselina 3-amino-4-hydroxybutanová, amixetrin, anitrazafen, antrafenin, bendazak, benzadak lysinia, benzydamin, beprozin, broperamol, buko15 lom, bufezolak, ciproquazon, kloximát, dazidamin, deboxamet, detomidin, difenpiramid, difenpyramid, difisalamin, ditazol, emorfazon, fanetizol mesylát, fenflumizol, floktafenin, flumizol, flunixin, fluproquazon, fopirtolin, fosfosal, quaimesal, guaiazolen, isonixim, lefetamin HC1, leflunomid, lofemizol, lotifazol, klonixinát lysinia, meseklazon, nabumeton, niktindil, nimesulid, orgotein, orpanoxin, oxaceprolm, oxapadol, paranylin, perisoxal, citrát perisoxalu, pifoxim, piproxen, pirazolak, pirfenidon, proquazon, proxazol, thielavin B, tiflamizol, timegadin, tolektin, tolpadol, tryptamid a sloučeniny označené firemními kódovými čísly jako například 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EP508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440,
SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (kyselina 4-benzoyl-lindankarboxylová), TVX2706, U60257, UR2301 a WY41770. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné NSAID vykazující analgetické a protizánětlivé účinky obdobné výše uvedeným NSAID.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více kortikosteroidy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako napří35 klad zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické artritidy a/nebo revmatické artritidy); odmítnutí štěpu hostitelem a roztroušené sklerózy. Kortikosteroidy, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelné soli zahrnují hydrokortizon a sloučeniny z hydrokortizonu odvozené, jako například 21-acetoxypregnenolon, alklomerason, algeston, amcinonid, beklomethazon, betamethazon, valerát betamethasonu, budesonid, chloroprednison, klobetasol, propionát klobetasolu, klobetason, butyrát klobetasonu, klokortolon, kloprednol, kortikosteron, kortison, kortivazol, deflazakon, desonid, desoximerazon, dexamethason, diflorason, diflukortolon, difluprednát, enoxolon, fluazakort, flukloronoid, flumethason, pivalát flumethasonu, flunisolid, flucinolon acetonid, flucionid, fluorocinolon acetonid, fluocinonid, fluorocinolon acetonid, butyl fluokortin, fluokortolon, fluorokortolon hexanoát, diflukortolon valerát, flurometholon, fluperolon acetát, flupredniden acetát, fluprednisolon, florandelonid, formokortal, halcinonid, halometason, halopredon acetát, hydrokortamát, hydrokortison, hydrokortison acetát, hydrokortison butyrát, hydrokortison fosfát, sodná sůl hydrokortison 21sukcinátu, hydrokortisotebutát, mezipredon, medryson, meprednison, methylprednikolon, mometason furoát, paramethason, prednikarbát, prednisolon, prednisolon 21-diedryaminoacetát, sodná sůl prednisolonfosfátu, sodná sůl prednisolon sukcinátu, sodná sůl prednisolon 21-zw-sulfobenzoátu, sodná sůl prednisolon 21-stearoglykolátu, prednisolon tebutát, prednisolon 21-trimethylacetát, prednison, prednival, predniliden, predniliden 21-diethylaminoacetát, tixokortol, triamcinolon, triamcinolon acetonid, triamcinolon benetonid a triamcinolon hexacetonid. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné kortikosteroidy vykazující obdobné analgetické a proti55 zánětlivé účinky.
-30CZ 299025 B6
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více pomalu účinkujícím antirevma5 tickým léčivem (SAARD - slow-acting antirheumatic drug) nebo antirevmatickým léčivem modifikujícím onemocnění (DMARDS - disease modifying antirheumatic drug), jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL—1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické artritidy a/nebo ío revmatické artritidy); odmítnutí štěpu hostitelem a roztroušené sklerózy. SAARD nebo DMARD, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli zahrnují: allokupreid sodný, auranofin, aurothioglukózu, aurothioglykanid, azathioprin, brequinar sodný, bucillamin, 3-aurothio-2-propanol-l-sulfonát vápenatý, chlorambucil, chloroquin, klobuzarit, kuproxolin, cyklofosfamid, cyklosporin, dapson, 15-deoxyspergualin, diacerein, glukosamin, soli zlata (například zlatá sůl cykloquinu, thiomalát sodnozlatný, thiosíran sodnozlatný), hydroxychloroquin, hydroxymočovinu, kebuzon, levamisol, lobenzarit, melittin, 6-merkaptopurin, methotrexát, mizoribin, mykofenolát mofetil, myoral, 2-chlor-N-(2-chlorethyl)-N-methyl, Dpenicillamin, imidazoly pyridinolu jako SK.NF86002 a SB203580, rapamycin, thioly, thymopoietin a vinkristin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné SAARD a DMARD vyka20 zující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více inhibitory COX2, jejich prekur25 zory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby akutních nebo chronických zánětů. Inhibitory COX2, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli zahrnují například celecoxib. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobné inhibitory COX2 vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více bakteriostatiky, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby akutních nebo chronických zánětů. Bakteriostatika, jejich prekurzory ve formě esterů nebo jejich farmaceuticky přija35 telné soli zahrnují například ampicilin, amoxycilin, aureomycin, bacitracin, ceftazidim, cefitriaxon, cefotaxim, cefachlor, cefalexin, cefradin, ciprofloxacin, kyselinu klavulanikovou, kloxacilin, dikloxacilan, erythromycin, flokloxacilan, gentamicin, gramicidin, methicilan, neomycin, oxacilan, penicilín a vankomycin. Do této skupiny rovněž patří strukturně podobná bakteriostatika vykazující obdobné analgetické a protizánětlivé účinky.
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více inhibitory TNF, jejich prekurzory ve formě esterů nebo farmaceuticky přijatelnými solemi, za účelem léčby onemocnění zprostřed45 kovaných IL—1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické artritidy a/nebo revmatické artritidy); poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemoragie nebo mrtvice; a odmítnutí štěpu hostitelem. Tyto inhibitory TNF zahrnují sloučeniny a proteiny, které in vivo blokují syntézu nebo extracelulámí uvolňování TNF. Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL—1 (ve výhodném provedení například produktu ILlra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jedním nebo více z následujících inhibitorů TNF: proteiny vážící TNF (rozpustné receptory pro TNF), protilátky proti TNF, faktor stimulující růst kolonií granulocytů, thalidomid, BN 4248, tenidap, E 5531, tiapafant PCA 4248, nimesulid, panavir, rolipram, RP 73401, T peptid, MDL
201, 449A, (1 R,3S)-cis-l-[9-(2,6-diaminopurinyl)]-3-hydroxy-4-cyklopenten hydrochlorid,
-31 CZ 299025 B6 (lR,3R)-trans-l-[9-(2,6-diamido)purin]-3-acetoxycyklopentan, (lR,3R)-trans-l-[9-adenyl)3-azidocyklopentan hydrochlorid a (lR,3R)-trans-l-[6-hydroxy-purin-9-yl)-3-azidocyklopentan.
Proteiny vážící TNF jsou v současnosti známy (EP 308378, EP 422339, GB 2218101, EP 393438, WO 90/13575, EP 398327, EP 412486, WO 91/03553, EP 418014, JP 127800/1991, EP 433900, US 5136021, GB 2246569, EP 464533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512528, EP 526905, WO 93/07863, EP 568928, WO 93/21946, WO 93/1977, EP 417563, prozatímní přihláška US 60/021443, podaná 9. července 1996 Fisherem, Edwardsem ío a Kieftem, v průvodním dopise ktéto prozatímní přihlášce nazvaná „Tumor Necrosis Factor
Binding Proteins“ (číslo spisu A-415), prozatímní přihláška US_, podaná 6. prosince 9196
Fisherem, Edwardsem a Kieftem, v průvodním dopise ktéto prozatímní přihlášce nazvané „Low Molecular Weight Tumor Necrosis Factor Binding Proteins“ (číslo spisu A-415A-P), prozatímní přihláška US_, podaná 23. ledna 1997 Fisherem, Edwardsem a Kieftem, v průvod15 ním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná „Low Molecular Weight Tumor Necrosis Factor
Binding Proteins“ (číslo spisu A^U5B-P) a prozatímní přihláška US_, podaná 7. února
1997 Fisherem, Edwardsem a Kieftem, v průvodním dopise k této prozatímní přihlášce nazvaná „Low Molecular Weight Tumor Necrosis Factor Binding Proteins“ (číslo spisu A-415C-P). Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynále20 ZU.
Přihlášky EP 393438 a EP 422339 například popisují aminokyselinové a nukleotidové sekvence „30 kDa inhibitoru TNF“ (rovněž známého jako receptor P55) a „45 kDa inhibitoru TNF“ (rovněž známého jako receptor p75), jakož i jejich modifikovaných forem (například fragmentů, funkčních derivátů a variant). Přihlášky EP 393438 a EP 422339 rovněž popisují způsoby izolace genů kódujících tyto inhibitory, klonování těchto genů do vhodných vektorů a hostitelských buněk a jejich expresi za účelem produkce inhibitorů. Ve zmíněných přihláškách jsou rovněž popsány polyvalentní formy (tj. molekuly obsahující více než jednu aktivní část) výše zmíněných inhibitorů TNF. V jednom provedení vynálezu mohou být zmíněné polyvalentní formy vytvořeny například spojením (chemicky) alespoň jedné molekuly inhibitoru TNF a druhé části (1) pomocí klinicky přijatelného linkeru, například polyethylenglykolu (WO 92/16221 a WO 95/34326); (2) nějakého peptidového linkeru (Neve a další, Cytokine, 8(5):365 až 370, 1996); (3) připojením biotinu chemickou syntézou a následnou vazbou na avidin (WO 91/03553); a (4) vytvořením chimérických molekul protilátek (US 5116964, WO 89/09622, WO 91/16437 a EP 315062).
Mezi protilátky namířené proti TNF patří Fab fragment protilátky MAK195F (Holler a další, 1. mezinárodní sympozium o cytokinech v transplantátech kostní dřeně, 147); monoklonální protilátka CDP571 proti TNF (Rankin a další, British Journal of Rheumatology, 34:334 až 342, 1995); myší monoklonální protilátka BAYX1351 proti TNF (Kieft a další, 7. evropský kongres klinické mikrobiologie a infekčních onemocnění, 9); monoklonální protilátka CenTNF cA2 proti TNF (Elliott a další, Lancet, 344:1125 až 1127, 1994 a Elliott a další, Lancet, 344:1105 až 1110, 1994).
Charakteristické provedení vynálezu je směrováno k použití nějakého inhibitoru IL-1 (ve výhod45 něm provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra) v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s rozpustnými rekombinantním lidským antigenem Fas nebo rekombinantními verzemi tohoto antigenu, za účelem léčby onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak, jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například osteoartritidy, psoriatické artritidy a/nebo revmatické artritidy); a odmítnutí štěpu hostitelem. Rozpustný rekombinantní lidský antigen Fas a jeho varianty jako například fúzní protein fas, způsoby izolace genů kódujících rozpustný rekombinantní lidský antigen Fas, klonování těchto genů do vhodných vektorů a hostitelských buněk a způsoby jejich exprese za účelem produkce těchto inhibitorů jsou v současnosti známy (WO 96/20206 a Mountz a další, J. Immunology, 155:4829 až 4837. Tyto publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu).
-32CZ 299025 B6
Výše zmíněné informace jsou uvedeny pouze jako příklady a nevylučují souběžné použití antiartritických sloučenin, které jsou odborníkům známé nebo které mohou odborníci vyvodit z principů popsaných v této přihlášce.
Je zvláště výhodné formulovat přípravky obsahující doplňkové protizánětlivé sloučeniny ve formě jednotlivých dávek, a to za účelem snadné aplikace a rovnoměrného dávkování. Termín „forma jednotlivých dávek“, jak je chápán v této přihlášce, označuje fyzicky oddělené jednotky vhodné jako jednotkové dávky aplikované léčenému savci. Každá jednotka obsahuje přesně stanovené množství doplňkových protizánětlivých sloučenin vypočítané tak, aby spolu s požadovaným farmaceutickým nosičem vyvolalo požadovaný terapeutický účinek. Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“, jak je chápán v této přihlášce, zahrnuje jakékoliv z rozpouštědel, disperzní média, obalové agens, antibakteriální a antifungální agens, látky upravující tonicitu, agens zpomalující absorpci a podobně, kde jsou tato agens slučitelná s aktivní složkou, způsobem aplikace a dalšími složkami přípravku a nejsou pro příjemce škodlivá. Použití těchto médií a agens je v současnosti známé (viz. například Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání. Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, strany 1435 až 1712, 1990). Charakteristickým příkladem farmaceuticky přijatelného nosiče je fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanovým pufrem. Do přípravu mohou být rovněž začleněny další aktivní látky.
Za účelem orální terapeutické aplikace může být doplňková protizánětlivá sloučenina formulována s pomocnými látkami a použita ve formě poživatelných tablet, bukálních tablet, pastilek, tobolek, elixírů, suspenzí, sirupů oplatek a podobně nebo může být přímo začleněna do přijímané potravy. Tablety, pastilky, pilulky, tobolky a podobně mohou rovněž obsahovat následující slož25 ky: pojivo jako například tragant, arabskou gumu, kukuřičný škrob nebo želatinu; pomocné látky jako například fosforečnan sodný; rozvolňovadla jako například kukuřičný škrob, kyselinu alginovou a podobně; maziva jako například stearan hořečnatý; sladidla jako například sacharózu, laktózu nebo sacharin; nebo ochucovadlo jako například pepermint, libavkovou silici nebo višňovou nebo pomerančovou příchuť. Jsou-íi jednotlivé dávky ve formě tobolek, mohou mimo látek uvedených výše rovněž obsahovat nějaký kapalný nosič. K povrchové úpravě nebo za účelem jiných modifikací formy jednotlivých dávek mohou být použity nejrůznější další materiály. Tablety, pilulky nebo tobolky mohou být například obaleny šelakem, cukrem nebo oběma současně. Veškerý materiál používaný při přípravě jakékoliv formy jednotlivých dávek by samozřejmě měl být ve farmaceutické kvalitě a v používaném množství v podstatě netoxický. Doplň35 ková protizánětlivá sloučenina může být navíc začleněna do přípravku pro řízené uvolňování léčiva. Množství doplňkového protizánětlivého léčiva v tomto terapeuticky využitelném přípravku je takové, aby byla získána vhodná dávka.
Za účelem parenterální terapeutické aplikace může být doplňková protizánětlivá sloučenina formulována spolu se sterilním roztokem vhodným pro injekční aplikaci. Sterilní roztok může být připraven včleněním požadovaného množství doplňkové protizánětlivé sloučeniny, spolu s dalšími složkami vyjmenovanými dále v textu, do vhodného farmaceuticky přijatelného nosiče a následnou sterilizací provedenou filtrací. Za účelem přípravy disperzí může být doplňková protizánětlivá sloučenina včleněna do sterilního vehikula, která obsahuje základní disperzní médium a další požadované složky vybrané ze seznamu uvedeného výše. Sterilní roztoky vhodné pro injekční aplikaci mohou být připraveny začleněním alespoň jedné doplňkové protizánětlivé sloučeniny ve formě prášku a (volitelně) jakékoliv další požadované složky do roztoku sterilizovaného filtrací. Prášek (doplňkové protizánětlivé sloučeniny) může být připraven jakýmkoliv vhodným způsobem (například vakuovým sušením nebo lyofilizací).
Specifická dávka doplňkové protizánětlivé sloučeniny je vypočítána na základě přibližně tělesné hmotnosti nebo povrchu těla pacienta. Mezi další faktoiy zohledňované při stanovení vhodného dávkování patří povaha léčeného nebo předcházeného akutního nebo chronického zánětlivého onemocnění nebo patologického stavu, závažnost tohoto onemocnění, způsob podávání a věk, pohlaví a celkový zdravotní stav pacienta. Odborníci jsou schopni provést další zpřesnění
-33CZ 299025 B6 výpočtů nezbytných ke stanovení vhodného dávkování pri léčbě zahrnující aplikaci jakéhokoliv z výše uvedených přípravků. Dávkování může být rovněž stanoveno s využitím známých postupů sloužících k určení dávkování používaných spolu s odpovídajícími údaji o reakci organizmu na podávanou dávku.
Do rozsahu vynálezu tudíž například spadá skutečnost, že lze měnit dávky doplňkových protizánětlivých sloučenin zvolených za účelem léčby daného akutního nebo chronického zánětlivého onemocnění, a to tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku. Jestliže některá z doplňkových protizánětlivých sloučenin vykazuje vedlejší účinky, může být tato pacientovi při kombinované terapii podávána pouze v některých obdobích. Například chronická léčba prostřednictvím methotrexátu je spojena s toxickými účinky na gastrointestinální trakt, játra, kostní dřeň a plíce (Sandoval a další, British Journal of Rheumatology, 34:49 až 56, 1995).
Testy sledující zlepšení stavu pacienta mohou zahrnovat specifické testy, při kterých je například stanovována reakce organizmu na zánět. Tyto testy zahrnují sledování rychlosti sedimentace erythrocytů (ESR) a výskyt reaktantů akutní fáze (APR). Jsou rovněž pozorovány otoky, atd. postižených částí těla. Rovněž jsou sledovány ústup ztuhlosti a zlepšení úchopu (je-li použitelné) a zmírnění bolesti pacienta. Je-li pacientův stav stabilizovaný, je mu podávána stejná dávka jednou týdně a rovněž jednou týdně je sledován jeho stav. Za předpokladu, že je stav pacienta stabilní, může léčba pokračovat. Po šesti měsících léčby jsou anatomické změny na kostře vyhodnoceny nějakou radiologickou zobrazovací metodou, například rentgenografií.
Po skončení každého období je pacient opět vyšetřen. Srovnání výsledků radiografie, ESR a APR před a po léčbě ukazuje na účinnost léčby. V závislosti na účinnosti léčby a stavu pacientů může být dávkování v dalším průběhu léčby zvýšeno nebo zachováno na stejné úrovni.
Ve výhodném provedení je vynález směrován k využití způsobů léčby zahrnujících použití ILlra v jedné z následujících kombinací (volitelně), a to za účelem léčby nebo prevence onemocnění zprostředkovaných IL-1 (tak jak jsou definovány výše), včetně akutních a chronických zánětů jako například zánětlivých onemocnění kloubů (například psoriatické artritidy a/nebo revmatické artritidy) a symptomů snimi spojených: produkt IL-lra (například IL-lra) a methotrexát; produkt IL-lra (například IL-lra) a jeden nebo více ze skupiny zahrnující methotrexát, sulfasazin a hydroxychloroquin; produkt IL-lra (například IL-lra), methotrexát a hydroxychloroquin; produkt IL-lra (například IL-lra), methotrexát a sulfasazin; a produkt IL-lra (například IL-lra), methotrexát a nějaký inhibitor TNF, ve výhodném provedení TNFbp.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například intraartikulámí, subkutánní nebo intramuskulámí) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s methotrexátem a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby artritidy (například osteoartritidy, psoriatické artritidy a/nebo revmatické artritidy) a symptomů s ní spojených.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například intravenózní nebo intraventrikulámí) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s tkáňovým aktivátorem plazminogenu a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby poškození mozku, které je důsledkem úrazu, epilepsie, hemorhagie nebo mrtvice, kde každý z těchto stavů může vést k neurodegeneraci.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněny způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní nebo intramuskulámí) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (napří55 klad hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná
-34CZ 299025 B6 léčba) s jednou nebo více sloučeninami ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, cyklosporin, nějaký interferon (například interferon alfa, interferon beta, interferon gama nebo konzervativní interferon) a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby roztroušené sklerózy.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například intravenózní) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s jednou nebo více sloučeninami ze skupiny zahrnující methotrexát, nějaký kortikosteroid, FK-506, cyklosporin, rozpustný protein fas a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby odmítnutí štěpu hostitelem.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní nebo intramuskulámí) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (napří15 klad hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s G-CSF a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby zánětlivého onemocnění střev.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní nebo intramuskulámí) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu
IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s nějakým interferon (například interferon alfa, interferon beta, interferon gama nebo konzervativní interferon), a to za účelem léčby mnohotného myelomu nebo myeloidních (například AML nebo CML) nebo jiných leukémií.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například subkutánní intraventrikulámí nebo intrathekální) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)), volitelně v kombinaci (předběžná léčba, následná léčba nebo souběžná léčba) s nějakým NSAID (například indomethacin) a/nebo TNFbp, a to za účelem léčby Alzheimerova onemocnění.
V charakteristickém výhodném provedení zmíněný způsob léčby zahrnuje podání (například lokální injekce, subkutánní nebo intramuskulámí) inhibitoru IL-1 (ve výhodném provedení například produktu IL-lra a výhodněji pak IL-lra formulovaného spolu s polymerem pro řízené uvolňování (například hyaluronátem)) a to za účelem léčby dočasného onemocnění mandibulárního kloubu.
Následující příklady jsou uvedeny za účelem úplného dokreslení vynálezu. Je pochopitelné, že v popsaných postupech mohou být provedeny změny, aniž by došlo k odchýlení se od podstaty vynálezu.
Příklady povedení vynálezu
Standardní metody (nebo vhodné alternativní metody) použitelné v postupech popsaných v následujících příkladech jsou popsány v obecně uznávaných manuálech molekulární biologie jako například v publikacích Sambrook a další, Molecular Cloning, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987 a Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing Associates/Willey Interscience, New York, 1990. Všechny chemikálie byly buď analytické třídy čistoty nebo třídy USP.
-35CZ 299025 B6
Příklad 1
Příprava vzorku: Rekombinantní antagonista lidského receptoru pro IL—1 produkovaný v E. coli (rhuIL-lra), připravený v souladu s popisem v patentu US 5075222, byl formulován ve vodném roztoku 10 mM citronanu sodného, 140 mM chloridu sodného, 0,5 mM EDTA, 0,1% polysorbátu (hmotnostně), pH 6,5 (CSEP). Injekční stříkačky obsahující přípravek sIL-lra byly následně prostřednictvím uzavíracího kohoutu připojeny ke stříkačkám obsahujícím jeden z níže uvedených materiálů pro řízené uvolňování: hylan H-10™ ve formě kapaliny (Biomatrix, lne., Ridgeio field, lne.), zesíťovanou kyselinu hyaluronovou (molekulová hmotnost větší než 4x106) buď ve formě prášku nebo prášku rekonstituovaného v PBS; kyselinu hyaluronovou (molekulová hmotnost větší než 570 000) v PBS, odvozenou z kultur Streptococcus zooepidemicus (katalogové číslo H9390, Sigma, lne., St., Louis, MO) ve formě prášku; polyvinylpyrrolidon (molekulová hmotnost l,3xl06) (katalogové číslo 43719-0, Aldridge Chemical Co., lne., Milwaukee, Wl) ve formě prášku; a karboxymethylcelulózu (karboxymethylcelulóza (katalogové číslo 06139), Polysciences, lne., Warrington, PA) ve formě prášku. IL-lra byl s materiálem pro řízené uvolňování promíchán vstříknutím roztoku rhuIL-lra do stříkačky obsahující kyselinu hyaluronovou a následným několikanásobným převedením vzniklé směsi s jedné stříkačky do druhé tak, aby bylo dosaženo dokonalého promíchání.
Podobným postupem byly připraveny následující směsi: (1) IL-lra (100mg/ml)/2% hylan H-10™; (2) IL-lra (100mg/mI)/l% kyselina hyaluronová; (3) IL-lra (10mg/ml)/0,5% hylan H-10™; (4) IL-lra (100mg/ml)/2% kyselina hyaluronová; (5) IL-lra (100mg/ml)/4% polyvinylpyrrolidon; a (6) IL-lra (100mg/ml)/3% karboxymethylcelulóza.
Tyto přípravky byly subkutánně injikovány samicím potkanů Lewis (200 až 250g, Charles River, Portage, MI). V různých časových intervalech po injekci byla pomocí katétrů zavedených do jugulámí žíly (véna jugularis) zvířat odebírána krev. Centrifugací byly z odebrané krve následně odstraněny krvinky a pomocí soupravy pro stanovení metodou ELISA (Quantikine™ human
IL-lra immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN), postupem doporučeným výrobcem, byl v plazmě stanoven obsah IL-lra. Získaná data jsou vyjádřeny jako plazmatická koncentrace ILlra (pg/ml IL-lra v plazmě) v závislosti na čase po injekci (jak jsou znázorněny v tabulce 2 a na obrázku 1).
-36.J
H rH ε
a σ>
ε o
o rd flj ri cn £
o o
ft >
Λ
0) ω
>1
Ή u
(1)
Ό c
•H
Μ i1 ο
ο
Μΰ >
Ο
C ο
I—[ £
Ο>
Αί h
S
Plazmatická koncentrace IL-lra (^g/ml) po subkutánní
>s
Λ
•a >
fú '-a
M r-1 &
rd 1 £ a. ffi olP
Ω m β d rH tn
H t a
o o O
rd
>1
2
cd O rd ?
rd t £ i s
m oV3
H ε <ΰ i—t rd
O o
i—f
>
<λ»
Ο
ÍX η
πί
XJ
Ω
Η 'S ΰ
jj
Ο £
d •Η υ
λ;
0) •η β
•Η
-Η
Ό
Ο
00 to Φ 04 04
ιη ιη L0 ch VO 04
«, S a a a a
» » ο ο O O O O
Ω Ω +1 +1 +1 -H +1 -H
Ή cd L0 Φ1 to <h
<η φ LO o φ 04
a χ a a a a
rd 03 CD to Φ* Φ
Η rd OJ to Ch L0 L0
Η rH γΗ CD Ch 00 O
CD CD θ' Ch co rd -Φ
a a a a a a a
Ο ο * Ο rd O rH 03
+1 +1 Ω +1 +1 +1 +! +1
OJ Γ0 03 Ch rd 00
ο 01 Φ1 o L0
ιη LD to co <Φ 04 Φ
«, a a a a a a
ο Ή 03 Φ to t> 00
<φ 00 Ch H Φ tn to
ο 0- o to rd φ
ο 04 m L0 ch in
a a a a a a a
ο Ο * O O O O O
+1 +1 Ω +1 +1 +1 +1 +1
Ο* rd S Ch Φ Lf) 00
ο <Φ co H o Ch m
ο CD φ< Ol 0* Φ Φ1
ο 03 Φ* to L0 Φ CD
οο 03 to <h 00 ch
Ch in to Φ M·
ο Φ* to 4* ch *Φ
* Ο • o * o o o
ο +1 +1 ιη g +1 O“ +1 CD 04 50 03 +1 in +1 to
ο 00 ο VO H Ol 04 03 Φ rd
ο ΓΩ Eh 11 Ch tn
04 10 to 'φ 04 to
ο ’φ Η σ\ to m tn H
ο CD OO to 00
ο • o O o o o
+1 -Η ιη lo Ω +1 +1 +1 +1 +1
ο χί to H 00 04 Φ
ο σν oo Ό CD Ί1
ο o 00 tn r*
a a, a a a a
ο Η Φ* to L0 tn Φ
012 σ» 03 Φ* 567 LO 04 co 697 834 , 279
Ο +1 > 03 Ο Ή ιη Η « O -H ch 03 o +1 00 ch O +1 rd O O +1 04 O +1 rd Φ tn
Ο ιπ -Φ 03 CD
Ο π Φ to to to CD
CD 03 οι rd to Ln 03
σο to 03 CD tn Φ*
ο Ol a rd o rd
a a 03 a a a
-Η 04 οο <0 ο ο • o +1 rd O O
+1 Ω +1 ch +1 -H -H
ΙΟ Ή 00 to CD 03 Ol
00 in VO H tn 00
Η to CD 00 03 o
ο sř 0* rd Ch tn i—t
ο 0* to rd 25 tn H 03 *Φ 00
Ο Ο o
to
Data neuvedena
-37CZ 299025 B6
Z tabulky 2 a obrázku 1 je vidět, že ve srovnání s aplikací samotného IL-lra má inkorporace ILlra do hyaluronátu, polyvinylpyrrolidonu a karboxymethylcelulózy za následek vyšší plazmatickou koncentraci IL-lra v delším časovém intervalu.
Příklad 2
IL-lra v CSEP byl radioaktivně označen pomocí Na[125I] a následně postupem popsaným výše zainkorporován do roztoku hylanu H-10™(výsledná koncentrace 2 %). Radioaktivně značený ío IL-lra nebo IL-lra/hylan H-10™ byly intraartikulámí injekcí vpraveny do kolon zadních končetin morčat (Charles River, Portage, Ml). V různých časových intervalech po injekci byla zvířata usmrcena, kolenní klouby byly vyjmuty a radioaktivita změřena na čítači zařízení gama (postupem popsaným v publikaci van Lent a další, J. Rheumatol., 16:1295 až 1303, 1989). Množství IL-lra zbývajícího v jednotlivých časových intervalech v kloubech jsou znázorněny na obrázku 2. Z grafů podobných grafu na obrázku 2 byly vypočítány poločasy života IL-lra ve třech různých přípravcích obsahujících hyaluronát aplikovaných intraartikulámě. Tato data jsou uvedena v tabulce 3.
Tabulka 3
Poločasy života přípravků IL-lra v kloubech morčat po intraartikulámí injekci
Přípravek Í5l) Poměr {b' Poločas života ílludinyl
Samotný IL-lra NA 1,36
IL-lra/hyaluronát 90/10 3,54
IL-lra/hyaluronát 80/20 2,45
IL-lra/hyaluronát 50/50 1,45
<a) Koncentrace IL-lra byla 100 mg/ml. Koncentrace hyaluronátu byla 2% (w/v).
<b) Poměr kapalného (nezesíťovaného) hyaluronát k hyaluronátu ve formě gelu (zesíťovaný) v přípravku.
Z tabulky 3 a obrázku 2 je patrné, že inkorporace IL-lra do hyaluronátu vede po intraartikulámí aplikaci k delšímu zadržování IL-lra v kolenních kloubech. Míra retence může být řízena poměrem zesíťovaného (gel) a nezesíťovaného (kapalina) hyaluronátu v přípravku.
Příklad 3
IL-lra v CSEP nebo přípravek obsahující IL-lra (100 mg/ml)/2% hylan H-10™, tak jak jsou popsány výše, byly intraartikulámí injekcí aplikovány do klen zadních končetin králíků (Charles River, Portage, MI). V různých časových intervalech po injekci byla zvířata usmrcena, kolenní klouby byly vypláchnuty PBS, čímž byla získána synoviální tekutina. V této synoviální tekutině byla pomocí soustavy pro stanovení metodou ELISA (Quantikine™ human IL-lra immunoassay, R&D Systems, Minneapolis, MN), postupem doporučeným výrobcem, stanovena koncentrace IL-lra (pg/ml). Získaná data jsou uvedena na obrázku 3 a v tabulce 4.
-38CZ 299025 B6
Tabulka 4
Poločasy života přípravků IL-lra v kolenních kloubech zadních končetin králíků po intraartikulámí injekci
Čas po injekci (hodiny) Samotný IL-lra IL-lra (lOOmg/ml)/hyaluronát (2% w/v)
0,5 2280 2440
0,5 11000 6200
0,5 5000 2400
0,5 8090 ND*
1 1400 5150
1 3450 6830
1 3090 7180
1 1840 2620
4 56,98 224
4 31,24 1600
4 62,43 3250
4 ND* 237
8 0,0641 575
8 0,0312 55,98
8 ND* 125
8 ND* ND*
24 ND* 0,5644
24 ND* 0,1539
24 ND* 0,8852
Data neuvedena
Uvedená data ukazují, že přípravek obsahující spolu s IL-lra i hyaluronát je po intraartikulámí injekci schopen prodlouženého uvolňování intaktního IL-lra do synoviální tekutiny.
Příklad 4
Samice potkanů Lewis (200 až 250g, Charles River, Portage, MI) byly ve dnech 0 a 7 imunizovány bovinním kolagenem typu II (Elastin Products, Owensville, MO). Ve 12 až 13 dni začalo docházet k vývinu artritidy. Ve dnech 15 a 18 po počáteční imunizační dávce byl potkanům
-39CZ 299025 B6 (8 zvířat/skupina) intraartikulámí injekcí aplikován buď roztok hylanu H-10™ v CSEP (50 μΐ/koleno; celkově 1 mg hyaluronátu) nebo IL-lra (100 mg/ml)/2% hylan H-10™ (50 μΐ/koleno; 5 mg IL-lra/1 mg hyaluronátu). Kontrolní skupině postižené artritidou nebyla aplikována žádná injekce. Ve 20 dni po počáteční imunizační dávce byli potkani usmrceni a histologickými technikami byla v odebraných kolenních kloubech stanovována závažnost onemocnění. Z údajů znázorněných v tabulce 5 a na obrázku 4 vyplývá: (a) léčba pomocí IL-lra podstatně potlačuje poškození chrupavky a kosti a má mírný vliv na zánět synovia; (b) ve srovnání s kontrolními vzorky bylo celkové poškození kloubu sníženo o 70 %; a (c) ve srovnání s kontrolní skupinou neměla léčba samotným hyaluronátem na průběh onemocnění žádný blahodárný vliv.
Tabulka 5
Koncentrace IL-lra v synoviální tekutině po intraartikulámí injekci
Přípravek Zánět synovia Panus Chrupavka (celkově) Poškození kosti Kloub (celkově)
Neléčení 3,25±0,14 l,5±0,16 17,69±2,27 l,44±0,16 23,88+2,57
hyaluronát (2% w/v) 2,88±0,39 1,44+0,22 16,88±3,14 l,31±0,28 22,5±3,87
IL-lra (100 mg/ml)/ hyaluronát (2% w/v) 2,06+0,28 0,5±0,18 4,69±1,77 0,19±0,14 7,53±2,33
Příklad 5
Samicím potkanů Lewis (200 až 250g, Charles River, Portage, MI) byl do kořene ocasu a na třech místech na hřbetě (250 μΐ do každého místa) intradermální injekcí aplikován bovinní kolagen typu II (Elastin Products, Owensville, MO) v koncentraci 2 mg/ml v nekompletním Freundově adjuvans (Difco Laboratories, lne., Ann Arbor, MI), a to ve dnech 0 a 7. Dvanáctý den byl těmto zvířatům intraperitoneální injekcí aplikován endotoxin (typ LPS L3129, Sigma) v množství 3 mg/kg. V dalších 3 dnech byl pozorován nástup artritidy a jakmile došlo k propuknutí onemoc25 nění byli potkani náhodně rozděleni do skupin (6 až 8/skupina) a započala léčba. Léčba probíhala 6 dní (subkutánní injekce IL-lra (100 mg/ml)/2% hylan H-10™ ve formě roztoku, jak je definováno výše, do hřbetu). Sedmý den po propuknutí onemocnění byla zvířata usmrcena a byla zjišťována hmotnost tlapek a zkoumány vzorky tkáně.
Měření šířky kotníku pomocí kaliperu bylo prováděno před propuknutím onemocnění, ve dni, kdy byly potkani rozděleni do skupin, a poté každý další den až do ukončení experimentu v sedmém dni. Získaná data byla následně vyjádřena jako plocha pod křivkou, a to za účelem stanovení procentuálního omezení závažnosti průběhu artritidy ve srovnání s kontrolní skupinou. Při ukončení experimentu byl tibiotarsální kloub příčným řezem oddělen na úrovni mediálního a laterálního kotníku, a to za účelem stanovení konečné hmotnosti tlapky, jako dalšího kritéria zánětu. Kotníky byly následně uloženy do formalinu a podrobeny zkoumání histologickými metodami (histopatologie).
Histopatologie: Před umístěním do dekalcifikátoru Surgipath I (Surgipath, Grayslake, IL) na dobu přibližně 1 týdne, byly kotníky uloženy do 10% formalitu o neutrálním pH. Do ukončení
-40CZ 299025 B6 dekalcifikace byly odstraněny články prstů a kotníky byly řezem v podélné rovině rozděleny na dvě přibližně stejně velké poloviny. Tyto byly následně zality do parafínu, rozřezány a obarveny hematoxylinem a eosinem (za účelem obecného stanovení zánětu a poškození kosti) a toluidinovou modří (za účelem určení charakteristických změn chrupavky, a to podle následujících krité5 rií):
Zánět = normální stav, ίο 1 = minimální infiltrace buněk zánětu v periartikulámí tkáni, = mírná infiltrace, = nepříliš intenzivní infiltrace s mírným otokem, = výrazná infiltrace se silným otokem, = masivní infiltrace s těžkým otokem.
Poškození chrupavky
- normální stav,
1 = minimální až mírné snížení intenzity barvení toluidinovou modří, nepozorován žádný výrazný úbytek chondrocytů nebo narušení kolagenu, = mírné snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována ložiska mírného úbytku chondrocytů (povrchový úbytek) a/nebo narušení kolagenu, = nepříliš velké snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována mnohotná ložiska většího úbytku chondrocytů (střední až hlubší zóna) a/nebo narušení kolagenu, = výrazné snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována mnohotná ložiska velkého úbytku chondrocytů (hlubší až hluboká zóna) a/nebo narušení kolagenu, = masivní snížení intenzity barvení toluidinovou modří, pozorována mnohotná ložiska ohromného úbytku chondrocytů (hluboká zóna až hraniční zóna) a/nebo narušení kolagenu.
Resorpce kostí = normální stav, = minimální malé oblasti resorpce, obtížně pozorovatelné při malých zvětšeních, nevýznamná přítomnost osteoklastů, = větší počet oblastí resorpce, tyto oblasti obtížně pozorovatelné při malých zvětšeních, vyšší počet osteoklastů,
3 = zřetelná resorpce dřeňové trabakuly a kortikální kosti bez výskytu defektů v celé tloušťce kortexu, ztráta části medulámí trámčiny (trabekuly), při malém zvětšení jsou pozorovatelné léze, početnější výskyt osteoklastů, = defekty v celé tloušťce kortexu kosti, často spojené s distorzí zbylého povrchu kosti, výrazná ztráta dřeně, početné osteoklasty,
-41 CZ 299025 B6 = defekty v celé tloušťce kortexu kosti, často spojené s distorzí zbylého povrchu kosti, výrazná ztráta dřeně kosti distální tibie, velký počet osteoklastů, výskyt resorpce rovněž v menších tarsálních kostech.
Statistická analýza: Klinické údaje sledující tloušťku kotníku byly analyzovány stanovením plochy pod křivkou znázorňující podávané dávky a následnou analýzou změn. Pomocí Studentova testu byly v každé skupině analyzovány hmotnosti tlapek (průměr ± směrodatná odchylka).
Při podávání 100 mg/kg IL-lra v CSEP (jedna dávka denně) nebyl pozorován žádný účinek, ío Oproti tomu aplikace IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny (jedna dávka denně, subkutánní injekce) měla v průběhu experimentu za následek zmenšení otoků o 62 % a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) a 74 % (obrázky 6 a 7). Tyto výsledky jasně ukazují na lepší klinické účinky denního podávání IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny oproti aplikaci IL-lra v CSEP. Histologická analýza kotníkového kloubu navíc odhalila, že ve srovnání s potkany léčenými IL-lra v CSEP dochází u potkanů léčených IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny k podstatnému snížení intenzity zánětu, tvorby pannu a poškození chrupavky a kosti (obrázek 8).
Po ověření, že dávka IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaná jednou denně ve formě subkutánních injekcí je schopna modulovat vývin onemocnění, byly provedeny studie stanovující trvání tohoto účinku. U potkanů léčených přípravkem IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaných jednou denně bylo v průběhu experimentu pozorováno zmenšení otoků o 53 % a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) o 78 % obrázky 9 a 10). U potkanů postižených artritidou léčených přípravkem IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaným jednou za dva dny bylo v průběhu experimentu pozorováno zmenšení otoků o 35 % a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) o 62 %, U potkanů postižených artritidou léčených přípravkem IL-lra (100 mg/kg)/2% hylan™ ve formě kapaliny podávaným jednou za tři dny bylo v průběhu experimentu pozorováno zmenšení otoků o 27 % (nevýznamné) a snížení hmotností tlapek (na konci experimentu) o 19 %. Tyto výsledky znovu ukazují za důle30 žitost udržování plazmatické koncentrace IL-lra na minimální hladině 200 ng/ml, a to v období, kdy IL-1 účinkuje v patogenezi tohoto modelu. Přerušované blokování receptoru pro IL-lra má za následek snížení účinnosti. Potkanům, kterým byl přípravek aplikován jednou za tři dny, byl tento přípravek podán v 1. a 4. dni artritidy. Je zajímavé, že měření kaliperem prováděná 24 hodin po aplikaci přípravku (ve 2. a 5. dni) naznačovala potlačení postupu artritidy (obrázek 9).
Měření prováděná dva nebo tři dny po aplikaci přípravku (před tím, než byla potkanům aplikována další dávka) ukazují postup onemocnění, což je pravděpodobně důsledkem nižších než optimálních plazmatických koncentrací IL-lra.
I když byl v předešlém textu vynález popsán jak obecně, tak s poukazem na výhodná provedení, je zřejmé, že ve světle tohoto popisu napadnou odborníka další obměny a modifikace tohoto vynálezu.
-42CZ 299025 B6
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Collins, David S.
Bevilacqua, Michale P.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Způsob léčby pacienta postiženého onemocněním ío zprostředkovaným IL-1 (iii) POČET SEKVENCÍ: 2 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠÍ-VRBA, Advokátní a patentová kancelář (B) ULICE: Národní 32 (C) MĚSTO: Praha 1 (D) STÁT: Česká Republika (E) PSČ: 116 66 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk 25 (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.3 (vi) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: nepřiděleno (B) DATUM PODÁNÍ: 7. února 1997 (C) ZATŘÍDĚNÍ:
(vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 60/011419 (B) DATUM PODÁNÍ: 9. února 1996 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 60/032789 (B) DATUM PODÁNÍ: 6. prosince 1996 (vii) DATA O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US (A-365B-P) (B) DATUM PODÁNÍ: 23. ledna 1997 (viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Zindric, Thomas D.
(B) ČÍSLO SPISU: 32185 (C) REFERENČNÍ ČÍSLO: A-365C
-43CZ 299025 B6 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 (C) TELEX:
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č. 1: io (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 462 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 3..462 (ix) CHARAKTERICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1...3 (D) DALŠÍ INFORMACE: /poznámka: „Přítomnost počátečního methioninu není nezbytná“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.: 1:
ATG CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA GCC TTC AGA ATC Phe Arg Ile 15 48
Met 1 Arg Pro Ser Gly Arg 5 Lys Ser Ser Lys 10 Met Gin Ala
TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC AAC CAA CTA GTT 96
Trp Asp Val Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Val
20 25 30
GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT TTA GAA GAA AAG ATA GAT 144
Ala Gly Tyr Leu Gin cly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp
35 40 45
GTG GTA CCC ATT GAG CČT CAT GCT CTG TTC TTG GGA ATC CAT GGA GGG 192
Val Val Pro ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly
50 55 60
AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG ACC AGA CTC CAG 240
Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gin
65 70 75 80
CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC AGA AAG CAG GAC 288
Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gin Asp
85 90 95
-44CZ 299025 B6
AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC ACC ACC AGT TTT 336
Lys Arg Phe Ala 100 Phe Ile Arg Ser Asp 105 Ser Gly Pro Thr Thr 110 Ser Phe
GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA GCG ATG GAA GCT 384
Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala
115 120 125
GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA GGC GTC ATG GTC 432
Asp Gin Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val
130 135 140
ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAG 462
Thr Lys Phe Tyr Phe Gin Glu Asp Glu *
145 150 (2) INFORMACE O SEK. ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 154 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o
(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.: 2:
Met 1 Arg Pro Ser Gly 5 Arg Lys Ser Ser Lys Met Gin Ala Phe Arg Ile
10 15
Trp Asp Val Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Val
20 25 30
Ala Gly Tyr Leu Gin Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp
35 40 45
Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly
50 55 60
Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gin
65 70 75 80
Leu Glu Ala Val Asn ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gin Asp
85 90 95
Lys Arg Phe Ala Phe ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe
100 105 110

Claims (24)

1. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje synergická množ10 štvi hyaluronanu nebo jeho soli a antagonisty (IL-lra) receptoru interleukinu-1 (IL-1), přičemž
IL-lra obsahuje celou aminokyselinou sekvence SEQ ID NO:
2 nebo sekvenci, která je alespoň ze 70 % homologní vzhledem k této sekvenci, nebo IL-1 inhibující fragment kterékoliv z těchto sekvencí.
15 2. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že hyaluronanem je kyselina hyaluronová.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že hyaluronanem je hylan.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že hyaluronanem je hyaluronát sodný.
5. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, 25 že hyaluronan je přítomný v množství od 0,1 do 5 % hmotnost/objem.
6. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků laž5, vyznačující se tím, že IL-lra obsahuje sekvenci, která je alespoň z 80 % homologní vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:2.
7. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků lažó, vyznačující se tím, že IL-lra obsahuje sekvenci, která je alespoň z 90% homologní vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:2.
35
8. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že IL-lra obsahuje sekvenci, která je alespoň z 95 % homologní vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:2.
9. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků laž5, vyznačující se tím,
40 že IL-lra obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 nebo její biologicky účinnou deleční variantu.
10. Farmaceutická kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že IL-1 ra obsahuje deleci u N-konce nebo C-konce SEQ ID NO:2.
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že IL-lra obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2.
-46CZ 299025 B6
12. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že IL-lra je neglykosylován.
5
13. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že úvodní aminokyselinou SEQ ID NO:2 je Mn, kde n je 1.
14. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že IL-lraje glykosylován.
15. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že IL-lraje vybaven metodami rekombinace DNA.
16. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím,
15 že IL-lraje fúzován s konstantní doménou nebo částí konstantní domény těžkého nebo lehkého řetězce lidského immunoglobulinu u karboxylového konce.
17. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že IL-lraje konjugován k dextranu.
18. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že IL-lraje přítomen v množství od 0,1 do 200 mg/ml.
19. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím,
25 že hyaluronan je přítomen v množství od 0,1 do 5 % hmotnost/objem.
20. Farmaceutická kompozice podle některého z nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že hyaluronan je přítomen v koncentraci 2% hmotnost/objem a IL-lraje přítomen v koncentraci 100 mg/ml.
21. Použití farmaceutické kompozice podle některého z nároků 1 až 20 pro výrobu léčiva pro léčení zánětlivých chorob kloubů, roztroušené sklerózy, leukemie, ischemické poškození nebo reperfusního poškození.
35
22. Použití podle nároku 21, kde zánětlivá choroba kloubů je zvolena zrevmatoidní artritis, osteoartritis a jiných zánětlivých stavů, které jsou následkem natažení, podvrtnutí, úrazu, infekce, poškození chrupavky nebo ortopedického chirurgického zákroku.
23. Použití podle některého z nároků 21 až 22, kde léčivo je ve formě vhodné pro intravenózní,
40 intramuskulámí, intradermální, subkutánní, intraartikulámí nebo infuzní podávání.
24. Použití podle nároků 21 až 22, kde léčivo má formu kombinovaného léčiva nebo kitu, zahrnujícího jako další složku protizánětlivé činidlo.
45 25. Použití podle nároku 24, kde protizánětlivé činidlo je zvoleno z nesteroidních protizánětlivých činidel (NSAID), kortikosteroidů, pomalu působících antirevmatických činidel (SAARD) a činidel modifikujících chorobu (DM).
CZ0237398A 1996-02-09 1997-02-10 Farmaceutická kompozice a její použití CZ299025B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1141996P 1996-02-09 1996-02-09
US3278996P 1996-12-06 1996-12-06
US3624197P 1997-01-23 1997-01-23
US08/798,414 US6096728A (en) 1996-02-09 1997-02-07 Composition and method for treating inflammatory diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ237398A3 CZ237398A3 (cs) 1999-09-15
CZ299025B6 true CZ299025B6 (cs) 2008-04-02

Family

ID=27486083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0237398A CZ299025B6 (cs) 1996-02-09 1997-02-10 Farmaceutická kompozice a její použití

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0904112B1 (cs)
JP (2) JP4344404B2 (cs)
KR (1) KR20040010739A (cs)
CN (1) CN1215340A (cs)
AT (1) ATE448797T1 (cs)
AU (1) AU724960C (cs)
BR (1) BR9707325A (cs)
CA (2) CA2244664C (cs)
CZ (1) CZ299025B6 (cs)
DE (1) DE69739656D1 (cs)
EA (2) EA001792B1 (cs)
ES (1) ES2334726T3 (cs)
HU (1) HU230160B1 (cs)
IL (1) IL125552A0 (cs)
MX (1) MX9806191A (cs)
NO (1) NO983543L (cs)
NZ (2) NZ331163A (cs)
SK (1) SK288144B6 (cs)
WO (1) WO1997028828A1 (cs)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69738948D1 (de) 1996-12-06 2008-10-09 Amgen Inc Il-1-inhibitor in kombinationstherapie zur behandlung il-1-vermittelter krankheiten
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
ES2422231T3 (es) 1998-10-23 2013-09-09 Kirin Amgen Inc Péptidos miméticos de trombopoyetina diméricos que se unen al receptor MP1 y que tienen actividad trombopoyética
AT406054B (de) * 1998-11-04 2000-02-25 Andreas Bernkop-Schnuerch Verfahren zur verbesserung der mucoadhäsion von polymeren sowie deren herstellung und verwendung
AU5428300A (en) * 1999-06-21 2001-01-09 Santen Pharmaceutical Co. Ltd. Remedies for arthrosis deformans
DE60039301D1 (de) * 1999-07-21 2008-08-07 Omeros Corp Spüllösungen und verfahren zur schmerzhemmung, entzündungshemmung und hemmung des knorpelabbaus
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
JP2003533187A (ja) * 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
US7324635B2 (en) 2000-05-04 2008-01-29 Telemaze Llc Branch calling and caller ID based call routing telephone features
AU2001259758A1 (en) * 2000-05-12 2001-11-26 Immunex Corporation Interleukin-1 inhibitors in the treatment of diseases
SI1324776T2 (en) 2000-10-12 2018-06-29 Genentech, Inc. Concentrated protein formulations with reduced viscosity
US8703126B2 (en) 2000-10-12 2014-04-22 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
US7087224B2 (en) * 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
KR101038585B1 (ko) 2001-06-26 2011-06-03 암젠 인코포레이티드 Ｏｐｇｌ 에 결합하는 항체, 이의 조성물 및 이의 제조방법
US6818613B2 (en) 2001-11-07 2004-11-16 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Aqueous sustained-release formulations of proteins
WO2003061626A1 (en) * 2002-01-18 2003-07-31 Control Delivery Systems, Inc. Polymeric gel system for the controlled delivery of codrugs
AU2003234628B2 (en) 2002-05-21 2007-08-23 Amgen Inc. Substituted heterocyclic compounds and methods of use
SI1572946T1 (sl) 2002-09-06 2012-09-28 Amgen Inc Terapevtsko humano anti-il-1r1 monoklonsko protitelo
US7344716B2 (en) 2003-05-13 2008-03-18 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines
US7553827B2 (en) 2003-08-13 2009-06-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of cycline compounds
US7429378B2 (en) 2003-05-13 2008-09-30 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of high affinity anti-MMP inhibitors
US8273347B2 (en) 2003-05-13 2012-09-25 Depuy Spine, Inc. Autologous treatment of degenerated disc with cells
US8361467B2 (en) * 2003-07-30 2013-01-29 Depuy Spine, Inc. Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
US7619066B2 (en) * 2004-04-02 2009-11-17 Amgen Inc. IL-1ra variants
CA2580796C (en) 2004-09-24 2013-03-26 Amgen Inc. Modified fc molecules having peptides inserted in internal loop regions
EP1835923B1 (en) * 2004-12-30 2013-10-09 Genzyme Corporation Regimens for intra-articular viscosupplementation
WO2007002362A2 (en) * 2005-06-24 2007-01-04 Duke University A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
GB0708376D0 (en) 2007-05-01 2007-06-06 Alligator Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
WO2009062339A1 (en) 2007-11-14 2009-05-22 General Regeneratives, Ltd. Methods of using interleukin-1 receptor antagonist as a myeloprotective agent
US8986696B2 (en) 2007-12-21 2015-03-24 Depuy Mitek, Inc. Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints
WO2009108890A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Biomet Biologics, Llc Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
KR200451958Y1 (ko) * 2008-10-09 2011-01-21 (주)에이치시티 모바일기기용 카드형 안테나장치
TW201039854A (en) 2009-03-06 2010-11-16 Genentech Inc Antibody formulation
US20110052561A1 (en) * 2009-08-27 2011-03-03 Biomet Biologics,LLC Osteolysis treatment
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
CN101690801B (zh) 2009-10-26 2012-08-01 上海交通大学 白细胞介素-1受体拮抗剂的用途及其药物组合物
DE202009017772U1 (de) 2009-12-10 2011-04-21 Orthogen Ag Kombinationspräparate mit Cytokin-Antagonist und Corticosteroid
PH12013501636A1 (en) * 2011-02-08 2013-10-14 Abbvie Inc Treatment of osteoarthritis and pain
DK2672985T3 (en) 2011-02-11 2016-06-27 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) CITRATFRIE pharmaceutical formulations comprising anakinra
US20140234330A1 (en) 2011-07-22 2014-08-21 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
AU2012300815A1 (en) 2011-09-02 2014-02-20 Novozymes Biopharma Dk A/S Oral formulations containing hyaluronic acid for sustained drug release
US10143725B2 (en) 2013-03-15 2018-12-04 Biomet Biologics, Llc Treatment of pain using protein solutions
US9878011B2 (en) 2013-03-15 2018-01-30 Biomet Biologics, Llc Treatment of inflammatory respiratory disease using biological solutions
US9758806B2 (en) 2013-03-15 2017-09-12 Biomet Biologics, Llc Acellular compositions for treating inflammatory disorders
US9895418B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Biomet Biologics, Llc Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions
US20140271589A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biomet Biologics, Llc Treatment of collagen defects using protein solutions
EP3054982B1 (en) * 2013-10-08 2019-05-01 Ascendis Pharma A/S Hydrogel-linked il-1ra prodrug
WO2015191783A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Abbvie Inc. Biomarkers for inflammatory disease and methods of using same
CZ309295B6 (cs) * 2015-03-09 2022-08-10 Contipro A.S. Samonosný, biodegradabilní film na bázi hydrofobizované kyseliny hyaluronové, způsob jeho přípravy a použití
WO2018022982A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Trustees Of Boston University Age-associated clonal hematopoiesis accelerates cardio-metabolic disease development
SG10202107829YA (en) 2017-03-22 2021-08-30 Genentech Inc Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
EP3810098B1 (en) * 2018-06-22 2024-01-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Sustained release compositions and methods for treatment of temporomandibular joint degeneration
WO2020035482A1 (en) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combination of interleukin-2 with an interleukin 1 inhibitor, conjugates and therapeutic uses thereof
EP3886809A4 (en) 2018-11-28 2022-03-30 Genascence Corporation Methods and compositions for treating osteoarthritis
JP7395210B2 (ja) * 2019-08-08 2023-12-11 アヴィデンス セラピューティクス， インコーポレイテッド ミクロスフェアに基づく注射用セレコキシブ製剤
EP4526469A1 (en) 2022-05-16 2025-03-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for assessing the exhaustion of hematopoietic stems cells induced by chronic inflammation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7363691A (en) * 1990-04-02 1991-10-03 Amgen, Inc. Methods for treating interleukin-1 mediated diseases
WO1995010298A1 (en) * 1993-10-12 1995-04-20 Mary Lake Polan Method of contraception
WO1996000081A1 (en) * 1994-06-24 1996-01-04 Immunex Corporation Controlled release polypeptide compositions and methods of treating inflammatory bowel disease

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
JPH02503867A (ja) 1988-04-15 1990-11-15 プロテイン　デザイン　ラブズ　インコーポレーテッド Ｉｌ‐２レセプター特異的キメラ抗体
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
DE59010941D1 (de) 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
IL95031A (en) 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc Method for the production of a human recombinant tumor necrosis factor inhibitor
CA2065346C (en) 1989-09-05 2005-03-29 Craig A. Smith Tumor necrosis factor-.alpha. and-.beta. receptors
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US6458360B1 (en) 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
AU7683391A (en) 1990-04-27 1991-11-27 Upjohn Company, The Modified interleukin-1 inhibitors
GEP20033082B (en) 1991-03-15 2003-10-27 Amgen Inc Pegylation of Polypeptides
NO940913L (no) * 1993-03-26 1994-09-27 Bristol Myers Squibb Co Preparater for kontrollert frigivelse av biologisk aktiv TGF-
JPH06321803A (ja) * 1993-05-17 1994-11-22 Kirin Brewery Co Ltd 水溶性ペプチドホルモンの徐放性製剤
US5385887A (en) * 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
IT1269989B (it) 1994-09-21 1997-04-16 Dompe Spa Antagonisti recettoriali di il-1 ad aumentata attivita' inibitoria

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7363691A (en) * 1990-04-02 1991-10-03 Amgen, Inc. Methods for treating interleukin-1 mediated diseases
WO1995010298A1 (en) * 1993-10-12 1995-04-20 Mary Lake Polan Method of contraception
WO1996000081A1 (en) * 1994-06-24 1996-01-04 Immunex Corporation Controlled release polypeptide compositions and methods of treating inflammatory bowel disease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Larsen et Al:" Adv. Drug. Deliv. Rev"., vol.7, no.,2,1991, str.279-293 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2539273A1 (en) 1997-08-14
AU724960C (en) 2002-08-15
CZ237398A3 (cs) 1999-09-15
EA200000825A1 (ru) 2001-02-26
NO983543L (no) 1998-10-08
HUP9902612A2 (hu) 1999-11-29
SK103698A3 (en) 2001-01-18
HUP9902612A3 (en) 2001-11-28
SK288144B6 (sk) 2013-12-02
CN1215340A (zh) 1999-04-28
BR9707325A (pt) 1999-04-13
CA2539273C (en) 2014-02-04
AU2121397A (en) 1997-08-28
EA199800694A1 (ru) 1999-02-25
JP4344404B2 (ja) 2009-10-14
JP2001500472A (ja) 2001-01-16
EA001792B1 (ru) 2001-08-27
AU724960B2 (en) 2000-10-05
ES2334726T3 (es) 2010-03-15
EP0904112A1 (en) 1999-03-31
KR20040010739A (ko) 2004-01-31
EP0904112B1 (en) 2009-11-18
IL125552A0 (en) 1999-03-12
MX9806191A (es) 1998-10-31
HU230160B1 (hu) 2015-09-28
CA2244664A1 (en) 1997-08-14
NZ331163A (en) 2000-07-28
NO983543D0 (no) 1998-07-31
ATE448797T1 (de) 2009-12-15
CA2244664C (en) 2008-06-03
DE69739656D1 (de) 2009-12-31
JP2007211027A (ja) 2007-08-23
WO1997028828A1 (en) 1997-08-14
NZ503548A (en) 2001-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ299025B6 (cs) Farmaceutická kompozice a její použití
US6294170B1 (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
US6096728A (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
CA2273852C (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases
DE69737814T2 (de) Gekürzte lösliche typ-i-rezeptoren für tumor-nekrose-faktor
AU748575B2 (en) Composition comprising interleukin-1 inhibitor and controlled release polymer
AU5400701A (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases
MXPA99005224A (en) Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
MXPA99005227A (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20170210