JPH0630788A - ヒトインターロイキン−１に対する組換え抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、Ｌ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と
配列番号：１に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ
−１抗体分子の可変部領域とを有し且つＨ鎖がヒト抗体
分子の定常部領域と配列番号：２に記載のアミノ酸配列
のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子の可変部領域とを有す
るヒトＩＬ−１に対するキメラ抗体、その他のヒト・マ
ウスキメラ乃至リシェイプト抗体を提供する。 【効果】本発明抗体は、特にＩＬ−１の異常産生を伴う
各種疾患の治療や体内ＩＬ−１産生部位等の画像診断を
行ない得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＩＬ−１（インターロイ
キン−１）に対する抗体、殊にヒト・マウス組換え抗体
に関する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン１（ＩＬ−１）は、１
９７２年にゲリー（Gery）らによりヒト単球培養上清中
に存在するマウス胸腺細胞増殖促進因子として報告され
た〔Gery,I.,et al.,J.Exp.Med.,139,128(1972) 〕。ま
た該ＩＬ−１は単球やマクロファージをはじめケラチノ
サイト、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、血管内皮細胞、好
中球など多くの細胞から産生され、多くの細胞に作用
し、多種多様の生物活性を示し、免疫、炎症、造血、内
分泌、脳神経、生体恒常性など生体における反応にかか
わっていることが報告されている〔Oppenhim,J.J.,et a
l.,Immunol.Today,7,45(1986)〕。動物種を問わず、Ｉ
Ｌ−１はアミノ酸２７０前後、分子量３０ＫＤの前駆体
としてｍＲＮＡから翻訳され、該前駆体はアミノ酸の１
１０番台で切断されて最終的にはＣ末端側約１５０個の
アミノ酸からなる１７ＫＤの成熟型となる。また、ＩＬ
−１はその等電点の違いによってα型（ｐＩ＝５）とβ
（ｐＩ＝７〜８）の２つの型に分類されており、それら
の一次構造も明らかにされ、さらにはそのポリペプチド
もしくはその前駆体をコードする遺伝子の存在も報告さ
れている〔Proc.Natl.Acad.Sci.,81,7907-7911(1984) :
Nature,31 5,641(1985): J.Exp.Med.,164,237(1986) :
Nucleic Acids Research, 13(16)5869(1985) 〕。

【０００３】上記報告によれば、ヒトＩＬ−１αは１５
９個のアミノ酸からなり、ヒトＩＬ−１βは１５３個の
アミノ酸からなると記されている。上記ＩＬ−１につい
ては、抗腫瘍剤や血小板減少改善剤などの医薬品として
の応用が種々研究されている一方で、ＩＬ−１の異常産
生を伴う各種疾患、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）、
甲状腺炎、肝炎、腎炎等の慢性炎症性疾患、動脈硬化、
川崎病（ＭＣＬＳ）等の血管炎、汎発性血管内凝固症候
群（ＤＩＣ）、血液ガン等において、その異常産生も報
告されており、これらの各疾患においては、亢進したＩ
Ｌ−１の生物活性を抑制乃至中和するための医薬として
の抗ＩＬ−１抗体の開発が望まれている。本出願人らも
先にＩＬ−１αおよびＩＬ−１βのそれぞれに特異反応
性を有することを特徴とするヒトＩＬ−１に対するマウ
スモノクロナール抗体を開発し、該抗体に係わる発明を
特許出願した〔特開昭６３−２５８５９５号公報参
照〕。

【０００４】しかして、１９７５年にマウスの抗体産生
細胞と骨髄腫細胞とを融合させた細胞の増殖法によるモ
ノクロナール抗体の作製法が確立されて以来、今日まで
に上記出願に係わる抗体に限らず、多くのモノクロナー
ル抗体が作製されてきており〔Kohler G & Milstein
C.,Nature,256,495(1975) 〕、今日、特に医学の分野に
おいてこれらのモノクロナール抗体は、インビボ診断、
インビトロ診断、さらに治療への応用が試みられるよう
になってきている。しかるに、ヒトへの投与を考慮した
場合、これらのマウス由来のモノクロナール抗体より
も、ヒト由来のモノクロナール抗体のほうが、抗体自体
の抗原性や抗体の免疫活性の面から、当然に好ましいと
考えられ、従って、近年ヒト型モノクロナール抗体の作
製も試みられつつあるが、ヒト・ヒト融合細胞は、マウ
スにおける骨髄腫細胞株のような優れた融合のパートナ
ーがないことや、人道的な面でなおかなり多くの問題を
有している。そこで、これらの問題を解決するために、
抗体の抗原結合活性を有する可変部（Ｖ）領域をマウス
ハイブリドーマ由来とし、且つ免疫活性を有する定常部
（Ｃ）領域をヒト由来とした、組換え抗体、所謂キメラ
抗体を作製することが、遺伝子組換え技術を用いて試み
られ、１９８４年のモリソン（Morrison）以来、さまざ
まな特異性をもつキメラ抗体が作製されてきた〔Morris
on S.L., et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81,6851(19
84) : Sharon J., et al.,Nature, 309,364(1984) : Ne
uberger,M.S., et al.,Nature,312,604(1984) : Boulia
nne,G.L.,et al.,Nature,312,634(1984) 等参照〕。更
に、上記キメラ抗体は、そのＶ領域が尚マウス１００％
のままであり、抗原性が残っているため、該部分でのヒ
トへの抗原性をも低減させるために、最近、上記Ｖ領域
の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをマウス由来とした組
換え抗体、即ちリシェイプト抗体（Reshaped抗体）の作
製も試みられている〔Jones,P.T.,et al.,Nature, 321,
522(1986) : Riechmann L.,et al.,Nature, 332,323(19
88) 〕。このような抗体を発現させるための遺伝子、即
ちヒト抗体のＤＮＡ配列の一部をマウス抗体のＤＮＡ配
列と置換させた組換え遺伝子の創製を以下「ヒト・マウ
スグラフト」といい、またかくして得られる組換え遺伝
子を「リシェイプト遺伝子」という。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】上記のようにキメラ
抗体やリシェイプト抗体等の組換え抗体は、従来より報
告されているが、ヒトＩＬ−１に対するこれら組換え抗
体についての報告は未だにない。

【０００６】従って、本発明の目的は上記ヒトＩＬ−１
に対するキメラ抗体、リシェイプト抗体及び之等の組合
せ抗体（以下これらを総称して「組換え抗体」という）
を提供することにある。

【０００７】また本発明の目的はヒトＩＬ−１の免疫学
的測定法に利用できるヒトＩＬ−１に対する組換え抗体
を提供することにある。

【０００８】また本発明の他の目的はＩＬ−１の異常産
生を伴う各種疾患において、該ＩＬ−１の作用を抑制乃
至中和を目的として投与適用され得る医薬品としてのヒ
トＩＬ−１に対する組換え抗体を提供することにある。

【０００９】また本発明の他の目的はヒトに対する抗原
性が低く、ヒトへの投与適用によって、体内におけるＩ
Ｌ−１産生部位やその特定等の画像診断を行ない得る標
識された上記組換え抗体を提供することにある。

【００１０】更に本発明の他の目的は上記組換え抗体の
製造技術を提供することにある。

【００１１】

【問題を解決するための手段】本研究者らは鋭意研究の
結果、上記目的に合致するＩＬ−１に対する組換え抗体
の製造に成功し、ここに発明を完成するに至った。

【００１２】即ち、本発明によれば、（１）Ｌ鎖がヒト
抗体分子のＣ領域と配列番号：１に記載のアミノ酸配列
のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＶ領域とを有し且つ
Ｈ鎖がヒト抗体分子のＣ領域と配列番号：２に記載のア
ミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＶ領域と
を有するヒトＩＬ−１に対する組換え抗体、（２）Ｌ鎖
がヒト抗体分子のＣ領域と配列番号：３に記載のアミノ
酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＣＤＲ領域を
含むヒト・マウスグラフトＶ領域とを有し且つＨ鎖がヒ
ト抗体分子のＣ領域と配列番号：２に記載のアミノ酸配
列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＶ領域とを有する
ヒトＩＬ−１に対する組換え抗体、（３）Ｌ鎖がヒト抗
体分子のＣ領域と配列番号：１に記載のアミノ酸配列の
マウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＶ領域とを有し且つＨ
鎖がヒト抗体分子のＣ領域と配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＣＤＲ領域
を含むヒト・マウスグラフトＶ領域とを有するヒトＩＬ
−１に対する組換え抗体、及び（４）Ｌ鎖がヒト抗体分
子のＣ領域と配列番号：３に記載のアミノ酸配列のマウ
ス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マ
ウスグラフトＶ領域とを有し且つＨ鎖がヒト抗体分子の
Ｃ領域と配列番号：４に記載のアミノ酸配列のマウス抗
ヒトＩＬ−１抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウス
グラフトＶ領域とを有するヒトＩＬ−１に対する組換え
抗体が提供される。

【００１３】本発明によれば、また配列番号：１で表わ
され、マウス抗ヒトＩＬ−１抗体Ｌ鎖のＶ領域（Ｖ_L）
をコードするものであるＤＮＡ塩基配列、配列番号：２
で表わされ、マウス抗ヒトＩＬ−１抗体Ｈ鎖のＶ領域
（Ｖ_H）をコードするものであるＤＮＡ塩基配列、配列
番号：３で表わされ、マウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子の
ＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフト抗体Ｌ鎖のＶ領
域（Ｖ_L）をコードするものであるＤＮＡ塩基配列、及
び配列番号：４で表わされ、マウス抗ヒトＩＬ−１抗体
分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフト抗体Ｈ鎖
のＶ領域（Ｖ_H）をコードするものであるＤＮＡ塩基配
列が提供される。

【００１４】更に本発明によれば、ヒト抗体分子のＣ領
域と配列番号：１に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒト
ＩＬ−１抗体分子のＶ領域とを有する組換え抗ヒトＩＬ
−１抗体Ｌ鎖発現ベクター、例えばｐＡＣ５３、ヒト抗
体分子のＣ領域と配列番号：２に記載のアミノ酸配列の
マウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＶ領域とを有する組換
え抗ヒトＩＬ−１抗体Ｈ鎖発現ベクター、例えばｐＡＣ
５２及びｐＡＣ７７、ヒト抗体分子のＣ領域と配列番
号：３に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗
体のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフトＶ領域とを
有する組換え抗ヒトＩＬ−１抗体Ｌ鎖の発現ベクター、
例えばｐＡＬ３１、及びヒト抗体分子のＣ領域と配列番
号：４に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗
体のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフトＶ領域とを
有する組換え抗ヒトＩＬ−１抗体Ｈ鎖発現ベクター、例
えばｐＡＬ３４が提供される。

【００１５】また本発明は、ヒト抗体分子のＣ領域と配
列番号：３に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−
１抗体のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフトＶ領域
とを有する組換え抗ヒトＩＬ−１抗体Ｌ鎖をコードする
ＤＮＡ配列及びヒト抗体分子のＣ領域と配列番号：４に
記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子の
ＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフトＶ領域とを有す
る組換え抗ヒトＩＬ−１抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ配
列を有する組換え抗ヒトＩＬ−１抗体発現ベクター、例
えばｐＡＣ７９をも提供するものである。

【００１６】本発明組換え抗体は、ヒトＩＬ−１に特異
反応性を有するものであり、これはヒトＩＬ−１を高感
度、高精度でしかも簡便に測定可能な新しい免疫検定法
（イムノアッセイ法）やアフィニティークロマトグラフ
ィー等の手法によるヒトＩＬ−１の特異的精製技術に有
利に利用できる。

【００１７】殊に、本発明組換え抗体は、上記特異性に
加えて、ヒトに対する抗原性が低いという特徴を有して
おり、従ってこれはヒト体内ヘの投与適用に適してい
る。

【００１８】また本発明組換え抗体には、ヒトＩＬ−１
の生物活性に対して中和活性を有するタイプの抗体が包
含され、かかる抗体は、ＩＬ−１の異常産生を伴う各種
の疾患、例えば慢性関節リウマチ、甲状腺炎、肝炎、腎
炎等の慢性炎症性疾患、動脈硬化、川崎病等の血管炎、
汎発性血管内凝固症候群、血液ガン等において、その異
常産生に基づく亢進されたＩＬ−１の生物活性を抑制乃
至中和するために有用であり、本発明はかかる各種疾患
の治療上極めて価値ある医薬を提供することができる。

【００１９】更に、本発明組換え抗体を標識して得られ
る標識組換え抗体は、これをヒト体内に投与適用するこ
とによって、体内におけるＩＬ−１産生部位やその特定
等の画像診断が可能であり、本発明によればかかる画像
診断法をも提供することができる。

【００２０】以下、本発明組換え抗体の製造法につき詳
述すれば、本発明組換え抗体は、マウス抗ヒトＩＬ−１
モノクロナール抗体産生細胞由来の抗体を利用して、ま
ず該抗体のｃＤＮＡライブラリーを構築し、そのＨ鎖
（重鎖、heavy-chain ）及びＬ鎖（軽鎖、light-chain
）の各可変部領域（Ｖ領域）をコードするＤＮＡ配列
をそれぞれ再配列させた遺伝子をクローニングし、プロ
モーター領域及びエンハンサー領域などを考慮して、こ
れらをそれぞれヒト由来の抗体の定常部領域（Ｃ領域）
をコードするＤＮＡ配列と結合させて組換え遺伝子（キ
メラ遺伝子）を作製するか、又は上記マウス抗ヒトＩＬ
−１モノクロナール抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤ
ＮＡ配列のＶ領域中の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む
ようにヒト由来の抗体のＶ領域を修飾したＤＮＡ塩基配
列を作製し、かくして得られるマウス抗ヒトＩＬ−１抗
体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフトＶ領域
をコードするＤＮＡ塩基配列を、ヒト由来の抗体のＣ領
域をコードするＤＮＡ配列と結合させて組換え遺伝子
（リシェイプト遺伝子）を作製する。

【００２１】このようにして作製されたＨ鎖及びＬ鎖の
それぞれのキメラ乃至リシェイプト遺伝子を、単独で又
は２種組合せて適当なベクターに組込んで、各遺伝子の
発現ベクターを作製し、これらベクターを適当な細胞に
導入して上記各遺伝子を発現させることにより、所望の
本発明組換え抗体を得ることができる。

【００２２】本発明に用いるマウス抗ヒトＩＬ−１モノ
クロナール抗体産生細胞は、ヒトＩＬ−１を免疫原とし
て或いは遺伝子組換え技術に従い製造される組換え型ヒ
トＩＬ−１を免疫原として、通常のモノクロナール抗体
の製造法に従い作製することができる。該マウス抗ヒト
ＩＬ−１モノクロナール抗体産生細胞の具体例として
は、例えば特開昭６３−２５８５９５号公報に記載の、
ヒトＩＬ−１α及びヒトＩＬ−１βのそれぞれに対する
抗体産生ハイブリドーマを例示できる。これらのハイブ
リドーマはいずれも微工研に寄託されている。即ち上記
ヒトＩＬ−１αに対する抗体産生ハイブリドーマは、Ｋ
ＯＣＯ３０１(FERM BP-1554)として、ヒトＩＬ−１βに
対する抗体産生ハイブリドーマは、ＫＯＣＯ２０３(FER
M BP-1551)、ＫＯＣＯ２０５(FERM BP-1552)、ＫＯＣＯ
２０６(FERM BP-1553)として寄託されている。

【００２３】これらのハイブリドーマは、以下の如き遺
伝子調製を行なうことによって、本発明組換え抗体の製
造に利用することができる。即ち、本発明抗体のＶ領域
をコードする遺伝子断片としては、上記のようなマウス
抗ヒトＩＬ−１モノクロナール抗体産生細胞より分離さ
れ、解析された遺伝子配列を用いることができる。目的
のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体に特異的なＶ領域をコード
する遺伝子（Ｖ_L及びＶ_H）の単離及びクローニングは、
主として２種の方法に従い実施することができる。その
一つとしては、抗体産生細胞の染色体ＤＮＡを適当な制
限酵素により消化させた後、ショ糖密度勾配遠心法によ
り分画し、ファージベクターアームにライゲーションさ
せて、インビトロパッケージング法等に従って、染色体
ライブラリーから、Ｈ鎖及びＬ鎖のそれぞれの３′末端
側プローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション法
等を実施して、所望抗体のＶ領域遺伝子をクローニング
する方法を挙げることができる。この方法はより詳しく
は例えばオイらの方法を参照して実施することができる
〔Vernon T.Oi.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,8
0,825(1983)参照〕。

【００２４】もう一つの方法としては、マウス抗ヒトＩ
Ｌ−１抗体産生細胞から常法に従いｍＲＮＡを抽出し、
ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法〔M.
S.Neuberger,EMBO J.,2,1373(1983)〕を採用して、上記
ｃＤＮＡライブラリーからＶ領域遺伝子をクローニング
するためのプローブを、すでに報告されているマウス免
疫グロブリン遺伝子の塩基配列〔例えば、E.E.Max, et
al.,J.Biol.Chem.,256,5116(1981) 〕等を参考にして、
マウスの免疫グロブリン（Ｉｇ）のＨ鎖とＬ鎖のＣ領域
に相補的な２つのスクリーニング用ＤＮＡプローブを合
成し、スクリーニングする方法を例示できる。

【００２５】該ブローブは市販の自動オリゴヌクレオチ
ド合成機により容易に合成でき、さらにＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて、〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ等を用い
て、その５′末端を標識することができる。

【００２６】この後者の方法におけるクローニングは、
抗体産生細胞よりポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを得た後、グブラ
ーとホフマン〔Gubler,U.,& Hoffman,B.,Gene,25,263-2
68(1983)〕の方法に従い、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、さ
らに二本鎖ｃＤＮＡを合成した後、これをプラスミドベ
クターやファージベクター等に挿入し、コンピテントな
状態にある大腸菌、例えばＨＢ１０１株、ＬＥ３９２
株、ＮＭ５３９株、Ｙ１０９０株などを宿主として、形
質転換させることにより実施でき、かくして所望のｃＤ
ＮＡライブラリーを構築することができる。

【００２７】上記プラスミドベクターを用いる場合は、
例えばｐＳＰ６４（国際特許出願公開ＷＯ８９／０１９
７４号公報参照）等を有利に使用することができ、得ら
れるｃＤＮＡライブラリーから合成したプローブを用い
て、ハナハンら〔Hanahan,R.A., et al.,Gene,10,63(19
80) 〕の方法によるコロニー・ハイブリダイゼーション
により、目的のＶ_L遺伝子及びＶ_H遺伝子のそれぞれを含
む陽性クローンをクローニングすることができる。

【００２８】またファージベクターを用いる場合、該ベ
クターとしては、例えばλgt１０、λgt１１などを利用
して、インビトロパッケージング法等によりｃＤＮＡラ
イブラリーを構築し、このｃＤＮＡライブラリーから合
成したプローブを用いて、ベントンとデービス〔Bento
n,W. and Davis,R.,Science, 196,383-394(1977) 〕ら
の方法によるプラーク・ハイブリダイゼーションによ
り、目的のＶ_L遺伝子及びＶ_H遺伝子のそれぞれを含む陽
性クローンをクローニングすることができる。

【００２９】更に、上記クローニングの別法としては、
例えばポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡから得られた一本鎖ｃＤＮＡ
より、目的とするＶ領域を含む領域のＤＮＡをＰＣＲ
〔ポリメラーゼ・チェイン・リアクション；polymerase
chain reaction, Rosaria,O.,et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A., 86,3833(1989) 〕により増幅し、増幅した
ＤＮＡ断片をベクターに組込む方法を採用することもで
き、これにより所望のＶ_L遺伝子及びＶ_H遺伝子のクロー
ニングが可能である。またプローブとハイブリダイズし
たクローンについて、ベクター側プライマーを用いてＰ
ＣＲにより、そのｃＤＮＡの大きさを確認することがで
きる。更に、上記増幅したＶ領域遺伝子（Ｖ_L遺伝子及
びＶ_H遺伝子）をＩｇ発現ベクターに組込むことによっ
て、本発明の組換え抗体を発現させることもできる。

【００３０】尚、上記でクローニングしたＶ_L遺伝子及
びＶ_H遺伝子のクローンは、アガロースゲル電気泳動に
より単離・精製することができる。

【００３１】上記で得られたＶ_L遺伝子及びＶ_H遺伝子の
それぞれを含むクローニングベクターへの導入は、一般
的方法に従って、適当なベクター例えばｐＵＣ１８、ｐ
ＢＲ３２２など及び適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ
などを用いて実施できる。得られる組換え体プラスミド
の作製後、サンガーら〔Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A., 74,5463(1977) 〕のデオキシ・チェー
ン・ターミネーション法などを利用して、目的とするＶ
_L及びＶ_H遺伝子のｃＤＮＡ領域の塩基配列を決定するこ
とができる。

【００３２】上記のごとくして得られる本発明組換え抗
体作製用のマウス抗ヒトＩＬ−１抗体のＶ_L遺伝子及び
Ｖ_H遺伝子の各塩基配列は、配列番号：１及び配列番
号：２として示した通りである。またこれら各遺伝子を
含むプラスミドの具体例としては、それぞれ後述する実
施例に示すプラスミドｐＩＬ０６８（マウス抗ヒトＩＬ
−１抗体のＨ鎖遺伝子を含む）及びプラスミドｐＩＬ０
８６（マウス抗ヒトＩＬ−１抗体のＬ鎖遺伝子を含む）
を例示できる。

【００３３】一方、本発明組換え抗体のＬ鎖Ｃ領域（Ｃ
_L）及びＨ鎖Ｃ領域（Ｃ_H）としてはヒト抗体分子由来の
各種のもの、例えば一般的なヒト免疫グロブリン由来の
ものを利用できる。該ヒト免疫グロブリンのＣ領域遺伝
子、即ちＣ_L遺伝子及びＣ_H遺伝子は、例えばＲＥＩ産生
細胞株〔human myeloma proein : Epp,O.,et al.,Eur.
J.Biochem.,45,513-524(1974)〕のようなヒト抗体産生
細胞から、前記と同様の方法により単離することがで
き、その際、目的遺伝子のクローニングのためのプロー
ブとしては、すでに報告されているヒト免疫グロブリン
の核酸塩基配列を〔Ellison,J.W., et al.,Nuc.Acids.R
es.,10,4071(1982) : Heiter,P.A., et al.,Cell, 22,1
97(1980)等〕を参照して合成したＤＮＡプローブ等を利
用することが可能である。

【００３４】また上記ヒトＣ領域遺伝子としては、既に
各種のものが知られており、各種のＣ領域遺伝子を有す
るプラスミドベクターが既に確立されている。従って、
本発明では該遺伝子を特に上記のように抗体産生細胞よ
り単離して調製せずとも、これらベクターの保有するも
のを利用するのが簡便であり有利である。かかる公知の
Ｃ領域遺伝子には、例えばＨ鎖の場合は、代表的にはγ
１〜γ４鎖などの遺伝子が、またその他にμ鎖、α鎖の
各鎖の遺伝子が含まれ、Ｌ鎖の場合は、κ鎖、λ鎖など
の遺伝子が包含され、これらはいずれも本発明に利用で
きる。上記ヒト免疫グロブリンのＣ領域及びエンハンサ
ーを含有するプラスミドベクターの具体例としては、例
えばヒトＩｇＧ４のＨ鎖Ｃ領域を有するｐＥ１００４
〔ｐＥＥ６（P.Stephens and M.Cockett,Nucl.Acids Re
s., 17,7110(1989) : Prot.Eng., 1(6)499-505(1987)に
基づいて作製されたもの〕、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖Ｃ領域
を有するｐＥ１００１〔上記ｐＥ１００４と同様にして
ｐＥＥ６に基づいて作製されたもの〕、ヒトＩｇκのＬ
鎖Ｃ領域を有するｐＥ１０８１〔上記と同様にｐＥＥ６
に基づいて作製されたもの〕等を例示できる。更にｐＳ
Ｖ２△Ｈｇｐｔ、ｐＳＶ１８４△Ｈｎｅｏ〔Oi,V.T. an
d Morrison S.L.,Biotechnique, 4 (3),214-221(1980)
〕等も上記ヒト免疫グロブリンのＣ領域遺伝子を有す
るプラスミドベクターに包含される。

【００３５】本発明のヒトＩＬ−１に対するキメラ抗体
の作製のための遺伝子は、上記した各種の遺伝子断片、
即ちマウス由来のＶ_L遺伝子及びＶ_H遺伝子から選ばれる
遺伝子と、ヒト由来のＣ_L遺伝子及びＣ_H遺伝子から選ば
れる遺伝子とを、それぞれ結合させることにより構築さ
れる。

【００３６】上記マウス由来のＶ_L遺伝子とヒト由来の
Ｃ_L遺伝子とを結合させて得られる本発明の組換えヒト
ＩＬ−１抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築の概略は、例えば
図６に示す通りであり、かくして得られる発現ベクター
の具体例としてはｐＡＣ５３を例示できる。これは、ｐ
ＩＬ０８６のＢｓｔＢＩおよびＳｐｌＩ切断断片をヒト
ＩｇκのＬ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列を持つプラ
スミドｐＥ１０８１の同制限酵素切断断片に挿入して構
築されたものであり、その特徴は図８に示す通りであ
る。

【００３７】また、上記マウス由来のＶ_H遺伝子とヒト
由来のＣ_H遺伝子とを結合させて得られる本発明の組換
えヒトＩＬ−１抗体Ｈ鎖発現ベクターの構築の概略は、
例えば図３に示す通りであり、かくして得られる発現ベ
クターの具体例としてはｐＡＣ５２及びｐＡＣ７７を例
示できる。これらは、ｐＩＬ０６８のＨｉｎｄIII およ
びＡｐａＩ切断断片を、ヒトＩｇＧ４のＨ鎖Ｃ領域をコ
ードするＤＮＡ配列を持つプラスミドｐＥ１００４およ
びヒトＩｇＧ１のＨ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ配列を
持つプラスミドｐＥ１００１の同制限酵素切断断片にそ
れぞれ挿入して構築されたものであり、ｐＡＣ５２の特
徴は図５に示す通りである。

【００３８】また、本発明のヒトＩＬ−１に対する抗体
には、上記キメラ抗体の他に、リシェイプト抗体、即ち
Ｌ鎖及びＨ鎖の少なくとも一方がマウス抗ヒトＩＬ−１
抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフトＶ領
域を有する抗体が包含される。かかる本発明リシェイプ
ト抗体の作製のための遺伝子（グラフトされたリシェイ
プト遺伝子、特にグラフトＶ_L遺伝子及びグラフトＶ_H遺
伝子）としては、例えば上記のごとくして得られるマウ
ス由来のＶ_L遺伝子又はＶ_H遺伝子のＤＮＡ配列中のＣＤ
Ｒ領域のＤＮＡ配列を参照して、この配列部分を例えば
ヒト抗体分子の対応するＶ_L遺伝子又はＶ_H遺伝子と置換
させたＤＮＡ配列を有するものを利用する。かかるグラ
フト遺伝子は、上記設計されたＤＮＡ配列を参照して、
その全遺伝子を自動オリゴヌクレオチド合成機により化
学合成することもでき、また上記設計されたＤＮＡ配列
の一部は、前述した各種遺伝子を利用して、ＰＣＲ法に
従って作製、増幅することもできる。

【００３９】上記グラフト遺伝子の具体例としては、配
列番号：３に示すグラフトＶ_L遺伝子及び配列番号：４
に示すグラフトＶ_H遺伝子を例示できる。

【００４０】グラフトＶ_L遺伝子とヒト由来のＣ_L遺伝子
とを結合させて構築されるリシェイプト抗体Ｌ鎖の発現
ベクターの構築の概略は図９に示す通りであり、かくし
て得られる発現ベクターの具体例としてはｐＡＬ３１を
例示できる。これは、後記実施例に示した２段階法によ
り得られる。即ち、配列番号：３のグラフトＶ_L遺伝子
の一部を含むＤＮＡ配列（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域を除
くＢｓｔＢＩおよびＳｐｌＩ切断断片、ＰＣＲにより増
幅したもの）を、プラスミドｐＥ１０８１の同制限酵素
切断断片に挿入し（ステップ１）、次いで得られるプラ
スミドの上記ＢｓｔＢＩ−ＳｐｌＩ間に存在するＢｓｔ
ＥＩＩ−ＫｐｎＩ間に、別途合成したＣＤＲ１〜ＣＤＲ
３領域のＤＮＡ配列（ＢｓｔＥＩＩおよびＫｐｎＩ切断
断片としたもの）を挿入（ステップ２）して構築された
ものであり、その特徴は図１１に示す通りである。

【００４１】またグラフトＶ_H遺伝子とヒト由来のＣ_H遺
伝子とを結合させて構築されるリシェイプト抗体Ｈ鎖の
発現ベクターの構築の概略は図１２に示す通りであり、
かくして得られる発現ベクターには、具体的にはｐＡＬ
３４が包含される。これは、後記実施例に示した方法に
より得られる配列番号：４のグラフトＶ_H遺伝子を含む
ＤＮＡ配列のＨｉｎｄIII およびＡｐａＩ切断断片（Ｐ
ＣＲにより増幅したもの）を、プラスミドｐＥ１００４
の同制限酵素切断断片に挿入して構築されたものであ
り、その特徴は図１４に示す通りである。

【００４２】尚、上記各発現ベクターの構築の際には、
一般に得られる各遺伝子の単離法に応じて、主として次
の２つの結合の組合せ、即ち、染色体ＤＮＡから単離し
たＶ領域とＣ領域遺伝子の組合せ及びｃＤＮＡから単離
したＶ領域とＣ領域の組合せに考慮をはらう必要があ
る。例えば、マウス染色体ＤＮＡから単離したＶ領域遺
伝子をヒト染色体ＤＮＡから単離したＣ遺伝子と結合さ
せる場合は、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロ
モーターやエンハンサー等の発現調節領域を予め含ませ
ておくのが好ましい。但し、プロモーターやエンハンサ
ー等はマウス由来である必要がなくヒト由来であっても
かまわない。上記プロモーターはＶ領域の５′上流域に
位置し、エンハンサーはＶ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の
間に位置するのが好ましいが、エンハンサーについては
必ずしもこの位置に限定されるものではない。他方、マ
ウスｃＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子をヒトｃＤＮＡ
から単離したＣ領域遺伝子と結合させる場合、その結合
部分は適当な制限酵素サイトや、必要であれば適当なリ
ンカーを用いて、Ｖ領域遺伝子のコードしているアミノ
酸配列とＣ領域遺伝子のコードしているアミノ酸配列が
ずれないように、またＶ領域アミノ酸配列とＣ領域アミ
ノ酸配列が変化しないように結合しなければならず、さ
らに動物細胞中で発現を可能にするために適当なプロモ
ーターやエンハンサー等の発現調節領域を遺伝子の５′
上流域に付加してやる必要がある。これらの各操作は、
いずれも常法に従い実施することができ、必要に応じて
利用される発現調節領域、制限酵素サイト作製のための
リンカー等は公知のそれらを参照して適宜決定すること
ができる。

【００４３】このようにして作製された本発明のキメラ
抗体遺伝子乃至リシェイプト抗体遺伝子を、例えば上記
ベクタープラスミドｐＥＥ６、ｐＥ１００１、ｐＥ１０
０４、ｐＥ１０８１等やｐＳＶ２ｇｐｔ〔R.C.Mullgan,
et al.,Pro.NAS.USA,78,2027(1981)〕、ｐＳＶ２−ｎｅ
ｏ〔P.J.Southern,et al.,J.Mol.Appl.Genet.,1,327(19
82) 〕等の選択マーカーの付いた適当なベクタープラス
ミド或いは宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できるウ
ィルス遺伝子の一部（パピローマウィルスなど）を持っ
たベクタープラスミドにＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を別々
に、あるいは同時に組み込むことにより、所望のキメラ
抗体Ｌ鎖発現プラスミド、キメラ抗体Ｈ鎖発現プラスミ
ド、リシェイプト抗体Ｌ鎖発現プラスミド及びリシェイ
プト抗体Ｈ鎖発現プラスミドを構築でき、また上記Ｌ鎖
とＨ鎖との組合せである本発明組換え抗体発現プラスミ
ドを構築することができる。

【００４４】殊に、上記Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子とを別
々に組込んだプラスミドは、その内のＬ鎖発現プラスミ
ドとＨ鎖発現プラスミドとを用いて宿主細胞を形質転換
させることにより、本発明の所望抗体発現形質転換体と
することができる。また上記Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子と
同時に組込んだプラスミドは、これを単独で用いて宿主
細胞を形質転換させることによって、所望の本発明抗体
発現形質転換体を収得できる。

【００４５】上記本発明抗体発現形質転換体の作製のた
めのＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子と同時に組込んだプラスミ
ドの具体例としては、例えば後記実施例に詳述する方法
により得られるｐＡＣ７９を例示できる。これはより詳
しくは図１５に示すように、一方で前記プラスミドｐＡ
Ｌ３４より、ヒトＣＭＶプロモーターを含むＨ鎖Ｖ領域
およびＣ領域にポリＡを含む遺伝子を単離し、他方でｐ
Ｅ１００４のＳＶ４０／ｇｐｔ遺伝子断片を単離し、之
等を前記プラスミドｐＡＬ３１に適当に挿入することに
より得られ、かくして得られるプラスミドは目的のＨ鎖
遺伝子およびＬ鎖遺伝子と共に選択マーカーを保有して
おり、本発明組換え抗体の発現ベクターとして有用であ
る。かくして得られるプラスミドｐＡＣ７９の特徴を図
１５に併記する。

【００４６】本発明の抗ヒトＩＬ−１組換え抗体の製造
は、上記のようにして調製された抗体遺伝子又はそのＨ
鎖もしくはＬ鎖遺伝子のそれぞれを含むプラスミドを用
いて、宿主動物細胞を形質転換し、この形質転換体を培
養することにより実施できる。この形質転換に使用され
る宿主動物細胞としては、ＣＯＳ細胞〔Nuc.Acids Re
s., 12,5707-5717(1988) ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０；Ｃ
Ｖ−１細胞をＳＶ４０ウィルスで形質転換した細胞
株〕、ＣＨＯ細胞〔chinese hamster ovary cell; ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ６１：ＣＨＯ−Ｋ１、ＷＯ８９／０１７８
３号公報〕、ＢＨＫ細胞〔baby hamster kinney cell;
ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０：ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、Ｗ
Ｏ８９／０１７８３号公報〕やＢリンパ系細胞株、例え
ばＰ３Ｘ６３Ａｇ８・６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５
８０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ・１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１５９７）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１８）等の形質細胞腫〔Riechmann,L., et a
l.,Nature, 332,323(1988) :特開平２−２３５２号公報
等参照〕やハイブリドーマを例示できる。

【００４７】ＤＮＡによる細胞の形質転換方法として
は、ＤＥＡＥ−デキストラン法〔Neuberger,M.S.,EMBO
J., 2,1317(1983)〕、リン酸カルシウム共沈降法〔Che
n,C. and Okayama H.,Mol.Cell.Biol.,7,2745-2752(198
7) 〕、プロトプラスト融合法〔Oi,V.T. and Morrison,
S.L.,Bio Techniques, 4 (3),214-221(1986) 〕、エレ
クトロポレーション法〔Potter.H., et al.,Proc.Natl.
Acad.Sci.,U.S.A., 81,7161-7163(1984)〕等の方法があ
り、いずれの方法でもよい。Ｈ鎖とＬ鎖のキメラ抗体遺
伝子を同時に持つプラスミドで形質転換を行なう場合に
は、選択マーカーは一種類でよいが、Ｈ鎖及びＬ鎖を別
々に形質転換させる場合には、２種類のマーカーが必要
である。この場合においては、まず一つのプラスミドで
形質転換を行なった後に、さらに他方のプラスミドで形
質転換を行なう二重形質転換法を用いるのが好ましい。

【００４８】上記のようにして得られた形質転換細胞の
培養、増殖は、通常の動物細胞やハイブリドーマを培養
すると同じ適当な条件下で、適当な培地、常用の標準的
な培地、例えばダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）又はＲＰＭＩ１６４０培地中で行なわれ、これは必
要に応じ哺乳類の血清、例えばウシ胎児血清、または微
量要素および増殖維持補足要素などを補充することもで
きる。また、抗体産生細胞が選択マーカーを保有してい
る場合は、該培地は上記選択培地、例えばＧ４１８また
はキサンチン、ヒポキサンチン、チミジン及びミコフェ
ノール酸を含有する培地で補充されるのが好ましい。上
記のようにして細胞から通常のハイブリドーマの産生す
る抗体と同様にして、本発明の抗ヒトＩＬ−１組換え抗
体を分泌産生させることができる。これら組織培養条件
下での哺乳類の細胞培地のための技術は、当業界におい
て自明である。

【００４９】かくして得られる細胞培養物の上清は、エ
ンザイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ドット−アッセイ、Ｆ
ＩＴＣなどを用いる蛍光標識抗体法またはラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応、血球凝集反
応など、通常使用されるスクリーニング法を用いて、所
望する抗ヒトＩＬ−１組換えモノクロナール抗体につい
てスクリーニングすることができる。

【００５０】かくして得られる所望の抗ヒトＩＬ−１組
換えモノクロナール抗体を産生する細胞は、上記した通
常の培地で継代培養でき、また、液体窒素中で長期間保
存可能である。

【００５１】該抗体産生細胞からの本発明抗ヒトＩＬ−
１組換えモノクロナール抗体の採取は、該細胞を常法に
従って培養し、その培養上清として、或るは該細胞をこ
れと適合性のある哺乳動物の腹腔内に投与して増殖さ
せ、その腹水として得る方法等を採用できる。

【００５２】該組換え抗体の単離には、培養上清中の免
疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、
ＰＥＧのような吸湿性物質に対する透析、選択膜を通す
濾過等により、濃縮する。また、必要に応じ、または所
望により濃縮された該抗体を通常のクロマトグラフィー
法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、
ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィーまたは
プロティンＡを用いるカラムクロマトグラフィー等の通
常の精製手段により精製することができる。

【００５３】かくして得られる本発明抗体は、これを利
用して、例えば免疫沈降法、アフィニティクロマトグラ
フィー等の通常の精製手段により、ヒトＩＬ−１を簡便
且つ特異的に精製することが可能である。

【００５４】上記の如くして得られる本発明抗体の利用
によれば、検体中のヒトＩＬ−１を免疫反応により、特
異的に測定することができる。該方法としては、通常の
競合法、サンドイッチ法によるラジオイムノアセイ法
（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、凝集法等
の通常免疫学的手法が挙げられ、これらの方法の操作、
手順等は、常法と変わるところはない。より具体的に
は、例えば競合法を採用する場合、測定しようとする検
体中のヒトＩＬ−１と一定量の不溶化されたヒトＩＬ−
１とを、標識剤で標識させた本発明の抗体の一定量と競
合反応させ、次いで、不溶化ヒトＩＬ−１と標識抗体と
の結合体及び非結合標識抗体を分離し、その何れか一方
の標識活性を測定することにより、又、サンドイッチ法
を採用する場合は、測定物質と不溶化された本発明抗体
とを反応させて、ヒトＩＬ−１不溶化抗体複合体を形成
させ、この複合体に標識抗体の一定量を反応させ、次い
で複合体と標識抗体との結合体及び非結合標識抗体を分
離し、その何れか一方の標識活性を測定することによ
り、それぞれ検体中のヒトＩＬ−１を定量できる。上記
検定法において検体として用いられる体液としては、例
えば血液、細胞組織液等を例示でき、これらのうちでは
血液、特に血清又は血漿が好ましい。

【００５５】本発明抗体の標識物質としては、グルコア
ミラーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトオキシダーゼ等の各種の酵素、
¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、トリチウム等の放射性物質等が挙げら
れる。該標識化法は、常法に従えばよい〔Nature, 194,
495(1962) ; Acta.Endocrliol.Suppl., 168,206(1972)
等参照〕。

【００５６】不溶化抗体は、ヒトＩＬ−１または本発明
抗体を、不溶性担体に化学的又は物理的に結合させるこ
とにより製造される。不溶性担体としては、セルロース
粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、
濾紙、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、
デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチ
ューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メ
チルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共
重合物、エチレン−マレイン酸今日重合物等が挙げられ
る。不溶化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド
法、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（架橋試
薬としてグルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシア
ナート等を用いる）、Ｕｇｌ反応による担体結合法等の
化学反応；あるいはイオン交換樹脂のような担体を用い
るイオン結合法；ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体
として用いる物理的吸着法によって行なわれる。上記測
定法において反応（免疫反応）は、通常４５℃以下、好
ましくは４〜４０℃の温度で、数時間〜２４時間程度で
行なわれる。かくして、本発明抗体を用いれば、簡便
に、高精度に、検体中のヒトＩＬ−１を測定することが
できる。

【００５７】また、本発明抗体はＩＬ−１の作用を抑制
乃至中和する作用を有するものであり、その利用によれ
ば、ヒトＩＬ−１の異常産生を伴う疾患、代表的には慢
性関節リウマチ、甲状腺炎、腎炎等の慢性炎症性疾患、
動脈硬化、川崎病等の血管炎、ＤＩＣ、血液癌等の各種
疾患の治療および診断を行なうことが可能である。更
に、本発明抗体は抗原性が低く、ヒト体内に投与するこ
とも可能であり、例えばこれを標識してヒト体内に投与
することによって、ヒト体内のＩＬ−１の異常産生を伴
う組織部位等の画像診断にも利用することができる。

【００５８】以上のように、本発明は組換え抗体のみな
らず、その製造方法、該方法に用いられるクローニング
ベクター、発現ベクター、トランスフェクトされた細胞
系等や本発明抗体のヒトＩＬ−１精製系、測定系への利
用並びに該抗体を有効成分とする治療薬乃至診断薬及び
之等の適用方法をも包含している。

【００５９】かかる本発明抗体を利用した精製系、測定
系の設定、治療乃至診断分野への適用、それらの改変な
いし応用は当業者にとり自明である。

【００６０】

【発明の効果】本発明によれば抗ヒトＩＬ−１組換え抗
体が提供される。該組換え抗体の利用によれば、臨床サ
ンプル等の低濃度のヒトＩＬ−１を含有する検体中の該
ヒトＩＬ−１を正確に測定可能な免疫検定法による測定
手法や、ＩＬ−１の異常産生を伴う各種疾患に対する、
ＩＬ−１の作用を抑制乃至中和を目的とする医薬品や、
ヒト体内ＩＬ−１の異常産生組織部位等の画像診断剤等
が提供できる。

【００６１】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、実
施例を挙げる。

【００６２】

【実施例１】 （１） ＡＮＯＣ−３０１産生ハイブリドーマの培養 マウス抗ヒトＩＬ−１αモノクローナル抗体であるＡＮ
ＯＣ−３０１を産生するハイブリドーマ細胞〔ＫＯＣＯ
３０１(FERM BP-1554)、免疫原は組換えヒトＩＬ−１α
であり、得られる抗体のイソタイプはＩｇＧ₁ で、抗体
の親和性は０．８〜２．０×１０^-10 Ｍ／ｌである、特
開昭６３−２５８５９５号公報参照〕を、１０％仔牛胎
児血清（以下ＦＣＳと略す）（ハイブリマックス(Hybri
max)、シグマ(Sigma) 社製）、１ｍＭグルタミン、５０
ユニット／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（ｐ／
ｓ、ギブコ(GIBCO) 社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培
地を用いて、５％ＣＯ₂ ／空気ガスを供給したローラボ
トルで３７℃で培養した。

【００６３】（２） ｍＲＮＡの調製 上述した方法により培養したＡＮＯＣ−３０１産生ハイ
ブリドーマ細胞３×１０⁸ 個（１ｌ培養分）を遠心（２
０００ｒｐｍ、１５分）により集めた後、滅菌したＰＢ
Ｓ（リン酸塩緩衝生理食塩水(phosphate buffered sali
ne) ）で一度洗浄した。上記細胞を、５Ｍグアニジン・
チオシアネート、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭＥＤＴＡ、８％β−メルカプトエタノー
ルから成る２０ｍｌの溶液に溶かした。この細胞溶解液
を１６Ｇの注射針に５回、２１Ｇの注射針に２０回通す
ことによりＤＮＡを切断し、これに７倍容量の４Ｍ塩化
リチウムを加えた。４℃で一晩放置後、遠心（１０００
０ｒｐｍ、６０分、４℃）により沈殿を回収した。沈殿
を２Ｍ塩化リチウム−４Ｍ尿素溶液に再懸濁し、再び遠
心（１００００ｒｐｍ、３０分）した後、１ｍＭＥＤＴ
Ａ及び０．１％ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ７．４）溶液に最小容量（約２０ｍｌ）で溶かした。
この溶液を凍結・融解後、等量のフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２４：２４：１）混液で
２回抽出し、さらにクロロホルムで抽出した。得られた
水層に０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２容量
のエタノールを加えて、全ＲＮＡを沈殿させた。得られ
た全ＲＮＡは１．８ｍｇであった。

【００６４】オリゴ（ｄＴ）−セルロースを有するプレ
パックスパンカラムに基づいたファルマシア社製のｍＲ
ＮＡ精製キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７−９２５８−０
１）を用いて、ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを調製した。得られ
たポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡは、５０μｇであった。

【００６５】（３） ｃＤＮＡライブラリーの調製 ５μｇのポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡよりアマーシャム社製ｃＤ
ＮＡ合成キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＰＮ１２５６Ｙ）を
用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ（０．５ピコモ
ル）に、内部にＥｃｏＲＩ部位を有するリン酸化したＢ
ｓｔＸＩアダプター（１２５ピコモル）を連結し、アダ
プターの付いたｃＤＮＡを、ＡＣＡ３４カラムでゲル濾
過を行なうことにより精製した。該アダプターの付いた
ｃＤＮＡを、ＢｓｔＸＩ部位を含むｐＳＰ６４の修飾ベ
クター〔ベクターＣＤＭ８（B.Seed,Nature,329,840(19
87) ）から単離したＸｂａＩスタッファー断片（stuffe
r fragment) をｐＳＰ６４（プロメガ社(Promegs Corpo
ration,U.S.A.)製のＸｂａＩ部位に挿入した修飾ｐＳＰ
６４ベクターであり、ＸｂａＩスタッファー断片内に２
ケ所のＢｓｔＸＩ部位を有する〕に連結させ、大腸菌Ｈ
Ｂ１０１の派生株であるＬＭ１０３５細胞に形質転換し
た。

【００６６】（４） オリゴヌクレオチドプローブ 表１に示すＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端を
〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを用いてラベルしたオリゴヌクレオ
チドプローブを用いて、上記で得られたｃＤＮＡライブ
ラリーより約１２０００コロニーについて、抗体のＬ鎖
及びＨ鎖の各ｃＤＮＡをスクリーニングした。

【００６７】

【表１】

【００６８】尚、上記Ｒ４９８は、マウスＣκ遺伝子配
列〔Max et al.,J.Biol.Chem.,256,5116(1981)〕の内の
４６５８−４６７７の配列の相補鎖に相当し、Ｒ６２７
は、マウスＣｒ₁ 遺伝子のＣ_H1ドメイン〔Honjo et a
l.,Cell,18,559(1979)〕の１１５−１３３の配列の相補
鎖に相当する。

【００６９】（５） ＡＮＯＣ−３０１のＶ領域のｃＤ
ＮＡのクローニング 上記表１に示す５′末端をラベルしたオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いてスクリーニングを行なった。

【００７０】プレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳ
Ｃ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ−０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム溶液）、５×Denhart's 溶液（１×
Denhart's 溶液＝０．０２％ポリビニルピロリドン−
０．０２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−０．０２％フ
ィコール）、０．１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で、４６℃で３時間行な
った。次に、このプレハイブリダイゼーション溶液と同
組成の溶液中に³²Ｐでラベルしたオリゴヌクレオチドを
５ｎｇ／ｍｌになるように加え、６５℃にした後、室温
にて１６時間以上放置した。フィルターの洗浄は６×Ｓ
ＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で２回行なった後、
６×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液中で４５℃で３回行な
った。

【００７１】その結果、プローブとハイブリダイゼーシ
ョンしたクローンについて、ベクター側のプライマーを
用いたＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション、po
lymerase chain reaction ）によりｃＤＮＡの大きさを
分析した。

【００７２】上記ＰＣＲの反応条件は以下の通りであ
る。テンプレートＤＮＡ０．１μｇ、１０×ＰＣＲ緩衝
液〔５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、ゼラチン０．１％
（Ｗ／Ｖ）〕５μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ、
Ｇ、Ｃ、Ｔ）５μｌ、オリゴＲ８８３ １０ピコモル、
オリゴＲ１７６７ １０ピコモル及びＴａｑポリメラー
ゼ（１Ｕ／μｌ）０．２５μｌ（水で反応液を５０μｌ
とする）。

【００７３】反応は９４℃で１分間、５５℃で１分間、
７２℃で１分間を２０サイクル行なった。

【００７４】尚、オリゴＲ８８３及びＲ１７６７の塩基
配列は下記表２に示す。

【００７５】

【表２】

【００７６】その結果、Ｈ鎖ｃＤＮＡについては８クロ
ーンが全長と考えられる１．９ｋｂのｃＤＮＡを有して
おり、Ｌ鎖ｃＤＮＡについては６クローンが全長と考え
られる１．１ｋｂのｃＤＮＡを有していた。

【００７７】そこで上記２つのＨ鎖ｃＤＮＡクローン
（ｐＩＬ０６８、ｐＩＬ０７２）と２つのＬ鎖ｃＤＮＡ
クローン（ｐＩＬ０８６、ｐＩＬ０８９）の各Ｖ領域に
ついて、塩基配列を調べた。尚、上記Ｈ鎖ｃＤＮＡクロ
ーンｐＩＬ０６８の概略は図１に示す通りであり、また
Ｌ鎖ｃＤＮＡクローンｐＩＬ０８６の概略は図２に示す
通りであり、各図において、ＳＰ６ＲＮＡｐｏｌＰはＳ
Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を、Ａｍｐ
^Rはアンピシリン耐性遺伝子を示す。

【００７８】その結果、ｐＩＬ０６８及びｐＩＬ０７２
の両クローンは共に、全長のマウスＩｇＧ１Ｈ鎖遺伝子
のｃＤＮＡを有していた。一方ｐＩＬ０８６とｐＩＬ０
８９のＬ鎖ｃＤＮＡクローンは、Ｖ領域で異なってい
た。ｐＩＬ０８９は、ハイブリドーマの融合パートナー
から由来した偽Ｌ鎖遺伝子を有しており、ｐＩＬ０８６
がＡＮＯＣ−３０１のマウスカッパ鎖遺伝子を有してい
た。

【００７９】Ｈ鎖ｃＤＮＡクローンｐＩＬ０６８のＶ領
域の塩基配列は配列番号：１として示した通りである。

【００８０】Ｌ鎖ｃＤＮＡクローンｐＩＬ０８６のＶ領
域の塩基配列は配列番号：２として示した通りである。

【００８１】上記ｐＩＬ０８６は、リーダー配列の最初
の３アミノ酸残基が欠けており、そのために発現ベクタ
ー作成時には、以下に示すように既知のカッパ鎖のリー
ダー配列に基づいてメチオニン、アルギニンおよびバリ
ンの配列（ＡＴＧＡＧＧＧＴＣ）を付加した。

【００８２】（６） キメラＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３
０１の発現ベクターｐＡＣ５２の作製 この発現ベクターｐＡＣ５２の作製の概略は図３に示す
通りである。尚、図中Ｖ_HはマウスＨ鎖Ｖ領域遺伝子
を、Ｇ４はヒトＩｇＧ４のＣ領域を、Ｇ１はヒトＩｇＧ
１のＣ領域を、ｈＣＭＶはヒトサイトメガロウイルスの
ＭＩＥ（major immediate early)プロモーターを、ｇｐ
ｔはキサンチングアニンフォスホリボシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子を、ｐＡはポリＡ付加シグナル配列を、Ｓ
Ｖori はＳＶ４０ウイルスの複製起源をそれぞれ示す。
以下の図においても同様とする。

【００８３】まずマウスＨ鎖Ｖ領域遺伝子（Ｖ_H）を含
むｐＩＬ０６８より、図４に示す２種のプライマー（フ
ォワード・プライマー（Ｒ２３９１）及びリバース・プ
ライマー（Ｒ２３９０）、それぞれ自動オリゴヌクレオ
チド合成機により化学合成した）を用いて、上記（５）
で述べたと同様の条件でＰＣＲ法にて、上記Ｖ_H遺伝子
を含むＤＮＡ断片を単離した。このものの塩基配列及び
対応するアミノ酸配列は、配列番号：１として示す通り
である。

【００８４】次いで、上記ＰＣＲ法により増幅させたＶ
_H遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄIII と
ＡｐａI で切断し、これをヒトＩｇＧ４のＣ領域を有す
るベクターｐＥ１００４〔ｐＥＥ６（P.Stephens and
M.Cockett,Nucl.Acids Res.,17,7110(1989) に基づいて
作製した〕のＨｉｎｄIII とＡｐａＩ間に挿入して、目
的のｐＡＣ５２を得た。得られたｐＡＣ５２の特徴及び
制限酵素地図を図５に示す。

【００８５】（７） キメラＨ鎖ＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３
０１の発現ベクターｐＡＣ７７の作製 この発現ベクターｐＡＣ７７の作製の概略も図３に併記
する通りであり、このものはヒトＩｇＧ４のＣ領域を有
するベクターｐＥ１００４に代えてヒトＩｇＧ１のＣ領
域を有するベクターｐＥ１００１〔ｐＥ１００４と同様
にｐＥＥ６に基づいて作製した〕を用いて、上記６と同
様にして作製できるが、この例では、以下の如くして作
製した。

【００８６】即ち、上記（６）で作製したキメラＨ鎖Ｉ
ｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１の発現ベクターｐＡＣ５２よ
り、制限酵素ＨｉｎｄIII とＡｐａＩでＡＮＯＣ−３０
１のマウスＨ鎖Ｖ領域遺伝子を切り出し、これをベクタ
ーｐＥ１００１のＨｉｎｄIIIとＡｐａＩ間に挿入し
た。かくして目的のｐＡＣ７７を得た。

【００８７】（８） キメラＬ鎖ＡＮＯＣ−３０１の発
現ベクターｐＡＣ５３の作製 この発現ベクターｐＡＣ５３の作製の概略は図６に示す
通りである。尚、図中Ｖ_LはＡＮＯＣ３０１（マウス）
のＬ鎖Ｖ領域遺伝子を、Ｃ_K（Ｃ_kappa 又はＣκとも表
示する）はヒトカッパ鎖Ｃ領域を示し、ＡｍｐＲ、ｈＣ
ＭＶは前記に同じである。

【００８８】即ち、まずマウスＬ鎖可変領域遺伝子（Ｖ
_L）を含むｐＩＬ０８６より、図７に示す２種のプライ
マー（フォワード・プライマー（Ｒ２４２９）及びリバ
ース・プライマー（Ｒ２４３０）、それぞれ自動オリゴ
ヌクレオチド合成機により化学合成した）を用いて、前
記（５）で述べたと同様の条件でＰＣＲ法にて、上記Ｖ
_L遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このものの塩基
配列及び対応するアミノ酸配列は、配列番号：２として
示す通りである。

【００８９】次いで、上記ＰＣＲ法により増幅させたＶ
_L遺伝子を制限酵素ＢｓｔＢＩとＳｐｌＩで切断し、こ
れをヒト・カッパ鎖Ｃ領域を有するベクターｐＥ１０８
１〔ｐＥ１００４の場合と同様にｐＥＥ６に基づいて作
製した〕のＢｓｔＢＩとＳｐｌＩ間に挿入して、ｐＡＣ
５３を得た。かくして得られたｐＡＣ５３の特徴及び制
限酵素地図を図８に示す。

【００９０】（９） ＣＤＲ−グラフトＬ鎖ＡＮＯＣ−
３０１発現ベクターｐＡＬ３１の作製 この発現ベクターｐＡＬ３１の作製の概略は図９に示す
通りである。該ベクターは、ヒト抗体ＲＥＩ〔E.A.Kaba
t, et al., (1987) in Sequences of Proteinsof Immun
ological Interest., 4th edition, (US Department of
Health and Human Services)〕のカッパ鎖Ｖ_Lドメイン
内ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を、ＡＮＯＣ−３０１のＶ
_Lドメイン内のＣＤＲ領域のアミノ酸配列で置換させた
ものであり、以下の通り作製された。

【００９１】即ちまず、ドウターティ(Daughterty)らの
方法（Nucl.Acids Res.,19,2471(1991) によって述べら
れた方法に準じて、オリゴヌクレオチドを用いて、下記
ステップ１及びステップ２に従い、ＣＤＲ−グラフトＶ
_L遺伝子を得た。

【００９２】（ステップ１）ヒト抗体ＲＥＩのカッパ鎖
のリーダー配列、フレームワーク１の部分及びフレーム
ワーク４の部分をコードするユニバーサルＶ_Lカセット
を構築した。具体的には、図１６に示すオリゴヌクレオ
チドを用いてＰＣＲ反応を行なった。反応液は５０μｌ
からなり各１０ピコモルの３′及び５′−ショート・オ
リゴヌクレオチド（EUNEW-20、L-REIVEC 3）、各１ピコ
モルのインターナル・オリゴヌクレオチド（EUNEW-1 、
L-REIVEC 1、L-REIVEC 2）、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐ
Ｈ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．０１％（ｗ
／ｖ）ゼラチン、５０ｍＭＫＣｌ、０．２５ｍＭｄＮＴ
Ｐｓ（Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）及び０．２５ユニットのＴ
ａｑポリメラーゼの組成を有し、９４℃で１分間、５５
℃で１分間、７２℃で１分間の２０サイクルを行なっ
た。反応終了後、フェノール・クロロホルムで２回抽出
し、エタノール沈殿を行ない、その後、水に溶解後、制
限酵素ＢｓｔＢＩとＳｐｌＩで切断し、ｐＥ１０８１の
ＢｓｔＢＩとＳｐｌＩ間に挿入して、ユニバーサルＶ_L
カセットｐＡＬ２９を得た。このＢｓｔＢＩとＳｐｌＩ
間の塩基配列は図１７に示す通りである。

【００９３】（ステップ２）ＣＤＲ−１〜ＣＤＲ−３の
領域については、図１８に示したオリゴヌクレオチドを
用い、ステップ１と同様の方法でＰＣＲ反応を行ない、
最終的にＢｓｔＥＩＩ−ＫｐｎＩ間のＤＮＡ断片を得
た。これを、予め制限酵素ＢｓｔＥＩＩ及びＫｐｎＩで
切断しておいた前記ステップ１で得られたユニバーサル
Ｖ_LカセットｐＡＬ２９のＢｓｔＥＩＩ−ＫｐｎＩ間に
挿入して、ｐＡＬ３１を得た。

【００９４】得られたＣＤＲ−グラフトＶ_L遺伝子のＤ
ＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列は、配列番号：３と
して示す通りである。

【００９５】ＢｓｔＢＩ−ＳｐｌＩ断片（図１０）を挿
入された目的のｐＡＬ３１の特徴及び制限酵素地図を図
１１に示す。

【００９６】（１０） ＣＤＲ−グラフトＨ鎖ＩｇＧ４
ＡＮＯＣ−３０１発現ベクターｐＡＬ３４の作製 この発現ベクターｐＡＬ３４の作製の概略は図１２に示
す通りであり、該ベクターは、ヒト抗体ＫＯＬ〔E.A.Ka
bat, et al., (1987) in Sequences of Proteins of Im
munological Interest., 4th edition, (US Department
of Health andHuman Services)〕のＨ鎖Ｖ_Hドメイン内
の３ヶ所のＣＤＲ領域のアミノ酸配列及びフレームワー
ク内の１２ヶ所のアミノ酸残基をＡＮＯＣ−３０１のＶ
_Hドメイン内の対応するアミノ酸残基で置換したもので
あり、以下の通り作製された。

【００９７】即ち、上記９で述べた方法と同様の方法
で、オリゴヌクレオチド（図１９）を用いたＰＣＲ法に
より一段階で、ＣＤＲ−グラフトＶ_H鎖遺伝子（そのＤ
ＮＡ配列は配列番号：４として示す）を得た。得られた
遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＡｐａＩで切断して、
ヒト・マウスグラフトＶ_H遺伝子を含むＤＮＡ断片を得
た。このものは図１３に示すＤＮＡ配列及び対応アミノ
酸配列を有している。

【００９８】上記ＨｉｎｄIII −ＡｐａＩ断片を、ベク
ターｐＥ１００４のＨｉｎｄIII とＡｐａＩ間に挿入し
て、目的のｐＡＬ３４を得た。かくして得られたｐＡＬ
３４の特徴及び制限酵素地図を図１４に示す。

【００９９】（１１） ＣＤＲ−グラフトＡＮＯＣ−３
０１発現ベクターｐＡＣ７９の作製 ＣＤＲ−グラフト−Ｈ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１発現
ベクターｐＡＬ３４のｈＣＭＶプロモーターの５′末端
のＣｌａＩ部位に、ＢａｍＨＩ認識部位を挿入して、ｈ
ＣＭＶ／ＣＤＲＩｇＧ４カセットを、ＢａｍＨＩＤＮＡ
断片として単離した。

【０１００】一方、ｐＥ１００４からＳＶ４０／ｇｐｔ
遺伝子のカセットを、ＳａｌＩＤＮＡ断片として単離
し、これをＣＤＲ−グラフトＬ鎖ＡＮＯＣ−３０１発現
ベクターｐＡＬ３１のＳａｌＩ部位に挿入した。さら
に、得られたベクターのＢａｍＨＩ部位にｈＣＭＶ／Ｃ
ＤＲＩｇＧ４カセットを挿入して、目的の発現ベクター
ｐＡＣ７９を作製した。その操作の概略は図１５に示す
通りである。

【０１０１】かくして得られたｐＡＣ７９の特徴及び制
限酵素地図を図１５に併記する。

【０１０２】（１２） ＣＨＯＬ７６１ｈ細胞を用いた
組換え抗体の一過的発現 １０％ＦＣＳ、１ｍＭグルタミン及び５０Ｕ／ｍｌペニ
シリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾イー
グル培地で培養されたＣＨＯＬ７６１ｈ細胞〔M.I.Cock
ett, et al.,Nucl.Acids Res., 19,319(1991) 〕を、フ
ァルコンＴ１７５フラスコに約２×１０⁷ 細胞数で播
き、この細胞に５０μｇの各プラスミドＤＮＡをリン酸
カルシウム法によってトランスフェクションした。

【０１０３】用いたプラスミドＤＮＡは、上記（６）〜
（１１）で得られたもの又はそれらの組合せ、即ちキメ
ラＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１の発現ベクターｐＡＣ
５２とキメラＬ鎖ＡＮＯＣ−３０１の発現ベクターｐＡ
Ｃ５３との組合せ、キメラＬ鎖ＡＮＯＣ−３０１の発現
ベクターｐＡＣ５３とキメラＨ鎖ＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３
０１発現ベクターｐＡＣ７７の組合せ、キメラＬ鎖ＡＮ
ＯＣ−３０１の発現ベクターｐＡＣ５３とＣＤＲ−グラ
フトＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１発現ベクターｐＡＬ
３４との組合せ、ＣＤＲ−グラフトＬ鎖ＡＮＯＣ−３０
１発現ベクターｐＡＬ３１とキメラＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯ
Ｃ−３０１の発現ベクターｐＡＣ５２との組合せ及びＣ
ＤＲ−グラフトＨ鎖及びＬ鎖を組み合わせた発現ベクタ
ーｐＡＣ７９を用いた。

【０１０４】トランスフェクション後、７２時間で培地
を回収した。

【０１０５】発現される組換え抗体は以下の通りであ
る。 ・キメラＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１ ・キメラＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３０１ ・キメラＬ鎖／グラフトＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１ ・グラフトＬ鎖／キメラＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１ ・グラフトＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１

【０１０６】（１３） 組換え抗体の精製 キメラＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３０１は、プロテインＡ・セ
ファロース・ファースト・フロー（ＦＦ）（ファルマシ
ア社製）を使用して培養上清から精製した。尚、プロテ
インＡ・セファロースカラム（２２ｍｌベット容量）
は、あらかじめ４．３Ｍ・ＮａＣｌを含む５０ｍＭグリ
シン／グリシン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．８）で平
衡化した（５カラム容量、１１０ｍｌ）。そして４８０
μｇのキメラＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３０１（ＥＬＩＳＡに
よる測定値）を含む２．４ｌの培養上清を上記カラムに
かけた。培養上清をカラムに乗せ終わった後、マトリッ
クスを平衡緩衝液で洗い（３カラム容量、６６ｍｌ）、
その後５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）
（３カラム容量、６６ｍｌ）で培養上清中の牛ＩｇＧを
溶出した。その後０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．５）
溶液でキメラＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３０１を溶出し、溶出
液を２Ｍトリス・塩酸（ｐＨ８．０）ですぐに中和し
た。キメラＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３０１を含む画分を、
０．０５％チメロザール含有リン酸緩衝食塩水にて透析
し、−７０℃で保存した。得られたキメラＩｇＧ１ＡＮ
ＯＣ−３０１は３５７μｇであった。

【０１０７】キメラＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１、キメラ
Ｌ鎖／グラフトＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１、グラフ
トＬ鎖／キメラＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１及びグラ
フトＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１の精製も、上記キメラＩ
ｇＧ１ＡＮＯＣ−３０１と同様にして行なった。

【０１０８】その結果、キメラＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０
１は２．４ｌの培養上清より３２５μｇ、キメラＬ鎖／
グラフトＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１は、２．１ｌの
培養上清より８２０μｇ、グラフトＬ鎖／キメラＨ鎖Ｉ
ｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１は、１．１ｌの培養上清より９
４．５μｇ、グラフトＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１は１．
３ｌの培養上清より１４００μｇで得られた。

【０１０９】（１４） ヒト組換えＩＬ−１αの ¹²⁵Ｉ
標識体の作製 １．５ｍｌのポリプロピレン製エッペンドルフ・タイプ
のチューブに２０μｌのヨードゲン溶液（ジクロロメタ
ン或いはクロロホルムに溶かした０．２ｍｇ／ｍｌのヨ
ードゲン（１，３，４，６−テトラクロロ−３ａ，６ａ
−ジフェニルグリコールリル(1,3,4,6-tetrachloro-3a,
6a-diphenglglycoluril)、ピアス社(Pirerce Chemical
Company,U.S.A.) ）を加え、減圧下で溶媒を除いた。こ
のようにして得られたヨードゲンをコーティングしたチ
ューブに１０μｌの０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．５）と５μｌ（１８．５ＭＢｑ）の３．７Ｇ
Ｂｑ／ｍｌＮａ・ ¹²⁵Ｉ（アマシャム社(Amersham,code
1MS30) ）を加え、さらに１０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ
ヒト・組換えＩＬ−１α（０．０５Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７．５に溶解）を加えた後、ピペットで反
応液を混合し、氷上に３分間放置した。０．０５Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えた
後、あらかじめ０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン(bov
in serum albumin) 、シグマ社(Sigma) 製）と０．０５
％チメロザール（シグマ社製）を含むＰＢＳ（リン酸塩
緩衝生理食塩水(phosphato buffered saline) ）で平衡
化したプレパックＰＤ−１０(pre-packed PD-10)カラム
（ファルマシア社製）にかけ、各分画（１ｍｌ／分画）
についてカウントし、 ¹²⁵ＩＬ−１αを含む画分を４℃
で保存した。

【０１１０】（１５） ¹²⁵ＩＬ−１αを用いた抗体の
力価の測定 ＡＮＯＣ−３０１及び組換え抗体をそれぞれ３％正常ヤ
ギ血清と０．０５％チメロザール（シグマ社製）を含む
ＰＢＳ（以後抗体希釈剤とする）で１０μｇ／ｍｌから
１．２５ｎｇ／ｍｌまで２倍ずつ段階希釈し、それぞれ
１００μｌずつをアッセイチューブ（ガラスチューブ、
１０ｍｍ×７５ｍｍ、コーニング(Corning) 社製）に入
れ、さらに１００μｌ（１００００ｃｐｍ）の ¹²⁵ＩＬ
−１αと３００μｌの抗体希釈液を加えて混合した後、
４℃で４８時間放置した。５００μｌの２５％ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール、和光純薬製）を加えて攪拌
し、３０分間、４℃で放置した。遠心（３０００ｒｐ
ｍ、１５分、４℃）後、上清を除いて沈殿物のカウント
をγ−カウンターで測定した。

【０１１１】その結果、５０％Ｂ／Ｔ（Ｂ：結合したカ
ウント、Ｔ：全カウント）を示す抗体の濃度を力価とし
て、表３に示す。

【０１１２】

【表３】

【０１１３】（１６） 抗体の親和性の測定 抗体の親和性を、競合法によるＲＩＡ（ラジオイムノア
ッセイ）により、以下の通り測定した。即ちヒト・組換
えＩＬ−１αを抗体希釈液で１０μｇ／ｍｌから２．５
ｎｇ／ｍｌまで２倍ずつ段階希釈し、それぞれ１００μ
ｌをアッセイチューブに入れ、ついで各抗体を抗体希釈
液で５０％Ｂ／Ｔを示す付近の濃度まで希釈した液を１
００μｌ、 ¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１αを１００μｌ（１０００
０ｃｐｍ）、抗体希釈液を２００μｌ加え、全量を５０
０μｌとし、４℃で４８時間反応させた。その後、５０
０μｌの２５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、和光
純薬社製）を加えて攪拌し、３０分間、４℃で放置した
後、遠心（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）し、上清を
除いて沈殿物のカウントをγ−カウンターで測定した。

【０１１４】その結果よりスカッチャードプロットを行
ない、親和性を算出した。結果を表４に示す。

【０１１５】

【表４】

【配列表】

【０１１６】配列番号：１ 配列の長さ：４５３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３１，４５３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： GTTAGTCT TAGGCACCAC TTCTTAGACA TC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG 51 Met Ala Trp Val Trp Thr Leu -15 CTA TTC CTG ATG GCA GCT GCC CAA AGT GCC CAA GCA CAG ATC CAG TTG 99 Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu -10 -5 1 GTG CAG TCT GGA CCT GAG TTG AAG AAG TCT GGA GAG ACA GTC AAG ATC 147 Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Ser Gly Glu Thr Val Lys Ile 5 10 15 20 TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC AGA AAC TAT GGA ATG AAC TGG 195 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Tyr Gly Met Asn Trp 25 30 35 GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG GGC TGG ATA AGT 243 Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Ser 40 45 50 ACT TAC ACT GGA GAG CCA ACA TAT GCT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT 291 Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe 55 60 65 GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCC TAT TTG CAG ATC AAC 339 Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn 70 75 80 AAT TTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT GCA AGA GGG CTC 387 Asn Phe Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Leu 85 90 95 100 TAT TAC TTC GGT AGT AGC TAT GCT TTG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC 435 Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 105 110 115 TCA GTC ACC GTC TCC TCA 453 Ser Val Thr Val Ser Ser 120

【０１１７】配列番号：２ 配列の長さ：３７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１，３７２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： TCT GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA GGT ACC AGA 48 Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly Thr Arg -15 -10 -5 TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT GCC TCT CTG 96 Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 1 5 10 10 GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC AGG ACA AGT CAG GAC ATT AAC AAT 144 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Asn Asn 15 20 25 AAT TTA AAC TGG TTT CAA CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT AAA CTC CTG 192 Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu 30 35 40 ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA AGG TTC AGT 240 Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 45 50 55 GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGC AAC CTG GAA 288 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu 60 65 70 75 GAA GAA GAT GCT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GGT AAA ACC CTT CCG 336 Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Lys Thr Leu Pro 80 85 90 TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA TTC AAA 372 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Lys 95 100

【０１１８】配列番号：３ 配列の長さ：３９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１，３９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ATG TCT GTC CCC ACC CAA GTC CTC GGT CTC CTG CTG CTG TGG CTT ACA 48 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr -20 -15 -10 -5 GAT GCC AGA TGT GAC ATT CAA ATG ACC CAG AGC CCA TCC AGC CTG AGC 96 Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 1 5 10 GCA TCT GTA GGA GAC CGG GTC ACC ATC ACA TGT AGA ACA TCT CAG GAC 144 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp 15 20 25 ATC AAC AAC AAC CTG AAC TGG TAT CAG CAG ACA CCT GGA AAG GCT CCT 192 Ile Asn Asn Asn Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro 30 35 40 AAG CTG CTG ATC TAC TAC ACA TCT CGT CTG CAT TCT GGA GTC CCT TCT 250 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 45 50 55 60 AGA TTC TCT GGT TCT GGC TCT GGA ACA GAC TAC ACA TTC ACA ATC TCT 298 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser 65 70 75 TCT CTC CAA CCT GAG GAC ATC GCT ACA TAC TAC TGC CAA CAG GGA AAG 346 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Lys 80 85 90 ACA CTG CCT TGG ACA TTC GGA CAG GGT ACC AAA TTG CAG ATC ACA CGT 394 Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

【０１１９】配列番号：４ 配列の長さ：４２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１，４２３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ATG GAA TGG AGC TGG GTC TTT CTC TTC TTC CTG TCA GTA ACT ACA GGA 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly -15 -10 -5 GTC CAT TCT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA GGA GTG GTG CAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln 1 5 10 CCT GGA AGA TCT CTG AGA CTG TCT TGT AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 AGA AAC TAC GGC ATG AAT TGG GTG AAA CAG GCA CCT GGA AAG GGA CTC 192 Arg Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 30 35 40 45 AAG TGG ATG GGA TGG ATT TCT ACA TAC ACA GGA GAG CCT ACG TAC GCA 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 50 55 60 GAC GAC TTC AAG GGA AGA TTC ACA TTT TCT CTG GAC ACA TCT GCA TCT 288 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser 65 70 75 ACA GCT TTC CTG CAG ATG GAC TCT CTG AGA CCT GAG GAC ACA GGA GTG 336 Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val 80 85 90 TAC TTC TGT GCA AGA GGA CTG TAC TAC TTC GGA TCT TCT TAC GCA CTG 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Leu Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Tyr Ala Leu 95 100 105 GAC TAC TGG GGA CAG GGA ACA CCT GTG ACA GTG TCT TCT 423 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 110 115 120

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＨ鎖ｃＤＮＡクローンｐＩＬ０６８の概
略図である。

【図２】マウスＬ鎖ｃＤＮＡクローンｐＩＬ０８６の概
略図である。

【図３】キメラＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３０１発現ベク
ターｐＡＣ５２およびキメラＨ鎖ＩｇＧ１ＡＮＯＣ−３
０１発現ベクターｐＡＣ７７作製の概略図である。

【図４】プライマーＲ２３９１（フォワード・プライマ
ー）およびＲ２３９０（リバース・プライマーのＤＮＡ
配列を示す。

【図５】ベクターｐＡＣ５２の特徴および制限酵素地図
を示す。

【図６】キメラＬ鎖ＡＮＯＣ−３０１発現ベクターｐＡ
Ｃ５３作製の概略図である。

【図７】プライマーＲ２４２９（フォワード・プライマ
ー）およびＲ２４３０（リバース・プライマーのＤＮＡ
配列を示す。

【図８】発現ベクターｐＡＣ５３の特徴および制限酵素
地図を示す。

【図９】ＣＤＲ−グラフトＬ鎖ＡＮＯＣ−３０１発現ベ
クターｐＡＬ３１作製の概略図である。

【図１０】ヒト・マウスグラフトＶ_L遺伝子のＤＮＡ配
列および対応するアミノ酸配列を示す。

【図１１】発現ベクターｐＡＬ３１の特徴および制限酵
素地図示す。

【図１２】ＣＤＲ−グラフトＨ鎖ＩｇＧ４ＡＮＯＣ−３
０１発現ベクターｐＡＬ３４作製の概略図である。

【図１３】ヒト・マウスグラフトＶ_H遺伝子のＤＮＡ配
列および対応するアミノ酸配列を示す。

【図１４】発現ベクターｐＡＬ３４の特徴および制限酵
素地図を示す。

【図１５】ＣＤＲ−グラフトＡＮＯＣ−３０１発現ベク
ターｐＡＣ７９作製の概略図である。

【図１６】ＣＤＲグラフトＬ鎖遺伝子構築のためのオリ
ゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。

【図１７】ＣＤＲグラフトＬ鎖遺伝子のＢｓｔＢＩ−Ｓ
ｐｌＩ間のＤＮＡ配列及び対応アミノ酸配列を示す。

【図１８】ＣＤＲグラフトＬ鎖遺伝子構築のためのオリ
ゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。

【図１９】ＣＤＲグラフトＨ鎖遺伝子構築のためのオリ
ゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 西田 勉 徳島県鳴門市大津町大代240−118

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と配列
   番号：１に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１
   抗体分子の可変部領域とを有し且つＨ鎖がヒト抗体分子
   の定常部領域と配列番号：２に記載のアミノ酸配列のマ
   ウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子の可変部領域とを有するこ
   とを特徴とするヒトＩＬ−１に対する組換え抗体。
2. 【請求項２】 Ｌ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と配列
   番号：３に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１
   抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフト可変
   部領域とを有し且つＨ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と
   配列番号：２に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ
   −１抗体分子の可変部領域とを有することを特徴とする
   ヒトＩＬ−１に対する組換え抗体。
3. 【請求項３】 Ｌ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と配列
   番号：１に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１
   抗体分子の可変部領域とを有し且つＨ鎖がヒト抗体分子
   の定常部領域と配列番号：４に記載のアミノ酸配列のマ
   ウス抗ヒトＩＬ−１抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・
   マウスグラフト可変部領域とを有することを特徴とする
   ヒトＩＬ−１に対する組換え抗体。
4. 【請求項４】 Ｌ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と配列
   番号：３に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ−１
   抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフト可変
   部領域とを有し且つＨ鎖がヒト抗体分子の定常部領域と
   配列番号：４に記載のアミノ酸配列のマウス抗ヒトＩＬ
   −１抗体分子のＣＤＲ領域を含むヒト・マウスグラフト
   可変部領域とを有することを特徴とするヒトＩＬ−１に
   対する組換え抗体。