JP2000014383A - ヒト化抗体 - Google Patents
ヒト化抗体Info
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- JP2000014383A JP2000014383A JP10204318A JP20431898A JP2000014383A JP 2000014383 A JP2000014383 A JP 2000014383A JP 10204318 A JP10204318 A JP 10204318A JP 20431898 A JP20431898 A JP 20431898A JP 2000014383 A JP2000014383 A JP 2000014383A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 自己免疫疾患の治療・診断等に使用可能な、
ヒト化抗Fas抗体を提供すること、及び該ヒト化抗Fas抗
体を産生するために用いられるヒト化抗Fas抗体をコー
ドするＤＮＡを提供することを課題とする。 【解決手段】 遺伝子工学的手法により、ヒト化抗Fas
抗体をコードするＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを発現させ
組換え抗体を得た。該組換え抗体のFas抗原への結合能
及びFas抗原を発現している細胞のアポトーシスを誘発
する活性を確認した。
ヒト化抗Fas抗体を提供すること、及び該ヒト化抗Fas抗
体を産生するために用いられるヒト化抗Fas抗体をコー
ドするＤＮＡを提供することを課題とする。 【解決手段】 遺伝子工学的手法により、ヒト化抗Fas
抗体をコードするＤＮＡを作成し、該ＤＮＡを発現させ
組換え抗体を得た。該組換え抗体のFas抗原への結合能
及びFas抗原を発現している細胞のアポトーシスを誘発
する活性を確認した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗体、特にヒト化
抗体の分野に関する。
抗体の分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】多細胞生物においては、個体発生の過程
において多くの細胞が細胞死により除去される。この細
胞死はあらかじめ決められたプログラムによって起こっ
ていると推測されており、火傷等の外的原因によって起
こる受動的な細胞死（これを「ネクロ−シス」と呼ぶ）
と区別して「アポト−シス」と呼ばれている。発生や分
化あるいは組織のタ−ンオ−バ−の過程で見られる細胞
死は、アポト−シスによって起こると考えられている。
において多くの細胞が細胞死により除去される。この細
胞死はあらかじめ決められたプログラムによって起こっ
ていると推測されており、火傷等の外的原因によって起
こる受動的な細胞死（これを「ネクロ−シス」と呼ぶ）
と区別して「アポト−シス」と呼ばれている。発生や分
化あるいは組織のタ−ンオ−バ−の過程で見られる細胞
死は、アポト−シスによって起こると考えられている。
【０００３】アポトーシスまたはプログラム細胞死と呼
ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている生
体構成細胞表層に存在するタンパク質は、Fas抗原と呼
ばれる膜貫通タンパク質である。マウス及びヒトFas抗
原のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコードするcDNA
配列は既に明らかにされている（Itoh N.et al.,Cell,
66: 233-243 (1991); Watanabe-Fukunaga R.et al.,J.
Immunol.148, 4: 1274-1279 (1992); Alexander Oehm e
t al.,J. Biol. Chem. 267, 15: 10709-70715(1992);Yo
nehara S. et al.,J. Exp. Med.,169: 1747-1756 (198
9);Kobayashi N.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87: 9620-9624 (1990); Bernhard C. Trauthet al.,Sci
ence, 245: 301-305 (1989); Jeas Dein et al.,J. Imm
unol.149, 10: 3166-3173 (1992); Klaus-Micahel Deba
tin et al.,The Lancet, 335: 497-500 (1990); Miyawa
ki T.et al.,J. Immunol., 149, 11: 3753-3758 (199
2);Peter Lichter et al.,Genomics, 14: 179-180 (199
2)）。
ばれる細胞死の制御に深く関連すると考えられている生
体構成細胞表層に存在するタンパク質は、Fas抗原と呼
ばれる膜貫通タンパク質である。マウス及びヒトFas抗
原のアミノ酸配列、及びアミノ酸配列をコードするcDNA
配列は既に明らかにされている（Itoh N.et al.,Cell,
66: 233-243 (1991); Watanabe-Fukunaga R.et al.,J.
Immunol.148, 4: 1274-1279 (1992); Alexander Oehm e
t al.,J. Biol. Chem. 267, 15: 10709-70715(1992);Yo
nehara S. et al.,J. Exp. Med.,169: 1747-1756 (198
9);Kobayashi N.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87: 9620-9624 (1990); Bernhard C. Trauthet al.,Sci
ence, 245: 301-305 (1989); Jeas Dein et al.,J. Imm
unol.149, 10: 3166-3173 (1992); Klaus-Micahel Deba
tin et al.,The Lancet, 335: 497-500 (1990); Miyawa
ki T.et al.,J. Immunol., 149, 11: 3753-3758 (199
2);Peter Lichter et al.,Genomics, 14: 179-180 (199
2)）。
【０００４】1989年に、米原らは、ヒトFS-7細胞の表面
抗原に対するモノクロ−ナル抗体を作製し、この中から
アポト−シスを誘導する抗体、抗Fas抗体を得た(Yoneha
ra S. et al., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (198
9))。また、これとは別に、トラウス(Trauth)らも、抗F
as抗体によく似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示すモ
ノクロ−ナル抗体、APO-1抗体を得た(Trauth, B. C. et
al., Science, 245: 301-305 (1989))。この二つは、
認識する抗原の分布や分子量などが極めてよく似てお
り、同一の抗原を認識することが明らかにされている。
抗原に対するモノクロ−ナル抗体を作製し、この中から
アポト−シスを誘導する抗体、抗Fas抗体を得た(Yoneha
ra S. et al., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (198
9))。また、これとは別に、トラウス(Trauth)らも、抗F
as抗体によく似た性質を持ち、細胞を殺す活性を示すモ
ノクロ−ナル抗体、APO-1抗体を得た(Trauth, B. C. et
al., Science, 245: 301-305 (1989))。この二つは、
認識する抗原の分布や分子量などが極めてよく似てお
り、同一の抗原を認識することが明らかにされている。
【０００５】抗Fas抗体の結合するFas抗原は、その構造
解析の結果、腫瘍壊死因子(TNF)レセプタ−や神経成長
因子(NGF)レセプターによく似た構造を有しているこ
と、外部からのシグナルを受けて細胞死を起こす新しい
種類のレセプタ−であることが明らかにされ、TNF/NGF
受容体ファミリ−を形成する受容体の一つとされてい
る。
解析の結果、腫瘍壊死因子(TNF)レセプタ−や神経成長
因子(NGF)レセプターによく似た構造を有しているこ
と、外部からのシグナルを受けて細胞死を起こす新しい
種類のレセプタ−であることが明らかにされ、TNF/NGF
受容体ファミリ−を形成する受容体の一つとされてい
る。
【０００６】また、最近において、自己免疫の症状を呈
するマウス（MRL/lprマウス）においてFas遺伝子の異常
が認められることなどから（Watanabe-Fukunaga R. et
al., Nature 356, 314-317 (1992)）、Fas抗原の発現と
自己免疫疾患の関連が注目されるようになった。自己免
疫疾患とは、生体防御機構である免疫系が自己の細胞成
分と反応する自己抗体やリンパ球を産生し、その結果組
織障害や病変を生ずるものであるが、このような自己免
疫の成立機序には交叉反応や抗原の修飾等の抗原側の原
因の他に、本来ならば発生過程においてアポト−シスに
より除かれるべき自己の細胞成分との反応性を有するリ
ンパ球が、アポト−シスの異常によって生体に残存する
ことによって引き起こされているとする説が有力になり
つつある（Dhein, J. et al., Nature 373, 438-441 (1
995); Brunner,T. et al., Nature 373, 441-444 (199
5); Shyr-Te Ju et al, Nature 373, 444-448 (199
5)）。
するマウス（MRL/lprマウス）においてFas遺伝子の異常
が認められることなどから（Watanabe-Fukunaga R. et
al., Nature 356, 314-317 (1992)）、Fas抗原の発現と
自己免疫疾患の関連が注目されるようになった。自己免
疫疾患とは、生体防御機構である免疫系が自己の細胞成
分と反応する自己抗体やリンパ球を産生し、その結果組
織障害や病変を生ずるものであるが、このような自己免
疫の成立機序には交叉反応や抗原の修飾等の抗原側の原
因の他に、本来ならば発生過程においてアポト−シスに
より除かれるべき自己の細胞成分との反応性を有するリ
ンパ球が、アポト−シスの異常によって生体に残存する
ことによって引き起こされているとする説が有力になり
つつある（Dhein, J. et al., Nature 373, 438-441 (1
995); Brunner,T. et al., Nature 373, 441-444 (199
5); Shyr-Te Ju et al, Nature 373, 444-448 (199
5)）。
【０００７】このことから、抗Fasモノクロ−ナル抗体
を生体に投与してアポト−シスを誘導し、生体中に残存
する自己抗体産生細胞を除くことによって自己免疫疾患
の治療に役立てることが考えられる。実際、米原らは、
抗Fasモノクロ−ナル抗体を自己免疫疾患モデルマウス
に投与することにより症状が治癒することを明らかにし
ている(Nishimura-Morita Y. et al.,Int. Immunol.9,
1793-1799(1997))。
を生体に投与してアポト−シスを誘導し、生体中に残存
する自己抗体産生細胞を除くことによって自己免疫疾患
の治療に役立てることが考えられる。実際、米原らは、
抗Fasモノクロ−ナル抗体を自己免疫疾患モデルマウス
に投与することにより症状が治癒することを明らかにし
ている(Nishimura-Morita Y. et al.,Int. Immunol.9,
1793-1799(1997))。
【０００８】しかし、通常モノクローナル抗体は他の動
物細胞由来であるため、その免疫原性からヒトに反復投
与できないという大きな課題を抱えていた。その課題を
解決するために遺伝子工学を利用してヒトの抗体に構造
が類似した抗体を作製することが試みられている。
物細胞由来であるため、その免疫原性からヒトに反復投
与できないという大きな課題を抱えていた。その課題を
解決するために遺伝子工学を利用してヒトの抗体に構造
が類似した抗体を作製することが試みられている。
【０００９】一般に、抗体（免疫グロブリン）は、分子
量の大きな重鎖及び分子量の小さな軽鎖から構成されて
いる。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基に
おいて可変領域と称されるアミノ酸配列の異なる領域を
有しており、重鎖の可変領域はＶH、軽鎖の可変領域は
ＶLと表される。この重鎖の可変領域ＶHと軽鎖の可変領
域ＶLが相対して静電的な結合を形成することにより、
抗原結合部位が形成される。可変領域の中でも特にアミ
ノ酸配列の変異の頻度が高い領域を超可変領域といい、
この重鎖の超可変領域と軽鎖の超可変領域が、抗Fas抗
体固有の抗原結合部位構造をつくりだし、抗原への親和
性・特異性を決定する。
量の大きな重鎖及び分子量の小さな軽鎖から構成されて
いる。重鎖と軽鎖は、ともにＮ末端から約１１０残基に
おいて可変領域と称されるアミノ酸配列の異なる領域を
有しており、重鎖の可変領域はＶH、軽鎖の可変領域は
ＶLと表される。この重鎖の可変領域ＶHと軽鎖の可変領
域ＶLが相対して静電的な結合を形成することにより、
抗原結合部位が形成される。可変領域の中でも特にアミ
ノ酸配列の変異の頻度が高い領域を超可変領域といい、
この重鎖の超可変領域と軽鎖の超可変領域が、抗Fas抗
体固有の抗原結合部位構造をつくりだし、抗原への親和
性・特異性を決定する。
【００１０】ヒトの抗体に構造が類似した抗体として
は、抗体の定常領域のみをヒト抗体の構造としたキメラ
抗体と、定常領域及び可変領域に存在する3つのCDR（co
mplementarity determining region:相補性決定部位）
以外の部位をヒト抗体の構造としたヒト化抗体（CDR-gr
afted抗体）があるが（P.T.Jones et al., Nature 321,
522 (1986)）、ヒト化抗体の方がヒト抗体の構造により
類似しているため、より免疫原性が少ないと考えられる
（Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (198
8); Isaacs, JD. et al., Lancet 340, 748-752 (199
2)）。なお、CDRとは、抗原分子と相補的な立体構造を
形成し抗体の特異性を決定する部位であり、CDRの立体
構造の維持に働いている4つのFR（Framework region:枠
組み構造領域）に挟まれて3つのCDRが可変領域中にモザ
イク状に存在する(E. A. Kabat et al.,「免疫学的観点
におけるタンパク質の配列(Sequences of proteins of
immunological interest)」,vol I,第5版,NIH publicat
ion (1991))。
は、抗体の定常領域のみをヒト抗体の構造としたキメラ
抗体と、定常領域及び可変領域に存在する3つのCDR（co
mplementarity determining region:相補性決定部位）
以外の部位をヒト抗体の構造としたヒト化抗体（CDR-gr
afted抗体）があるが（P.T.Jones et al., Nature 321,
522 (1986)）、ヒト化抗体の方がヒト抗体の構造により
類似しているため、より免疫原性が少ないと考えられる
（Riechmann, L., et al., Nature 332, 323-327 (198
8); Isaacs, JD. et al., Lancet 340, 748-752 (199
2)）。なお、CDRとは、抗原分子と相補的な立体構造を
形成し抗体の特異性を決定する部位であり、CDRの立体
構造の維持に働いている4つのFR（Framework region:枠
組み構造領域）に挟まれて3つのCDRが可変領域中にモザ
イク状に存在する(E. A. Kabat et al.,「免疫学的観点
におけるタンパク質の配列(Sequences of proteins of
immunological interest)」,vol I,第5版,NIH publicat
ion (1991))。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、自己
免疫疾患の治療・診断等に使用可能な、ヒト化抗Fas抗
体を提供すること、及び該ヒト化抗Fas抗体を産生する
ために用いられるヒト化抗Fas抗体をコードするＤＮＡ
を提供することにある。
免疫疾患の治療・診断等に使用可能な、ヒト化抗Fas抗
体を提供すること、及び該ヒト化抗Fas抗体を産生する
ために用いられるヒト化抗Fas抗体をコードするＤＮＡ
を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗Fasマ
ウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡをクローニングし、その
塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。更に、軽
鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列と相同性の高い公
知のヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列を選択し、ＣＤ
Ｒ領域はマウス由来、またＦＲ領域は該相同性の高いヒ
ト由来の、ヒト化抗体のアミノ酸配列を設計し、該アミ
ノ酸配列をもとに、軽鎖、重鎖の可変領域をコードする
ＤＮＡを合成した。更に、それらをそれぞれヒトμ鎖の
定常領域をコードするＤＮＡ、ヒトκ鎖の定常領域をコ
ードするＤＮＡと結合し、ヒト化抗体軽鎖及びヒト化抗
体重鎖を発現するベクターを構築した。これらのベクタ
ーを用いてＣＨＯ細胞を形質転換し、抗Fasヒト化抗体
を得ることに成功した。そして、該抗体は、Fas抗原発
現細胞と結合し、該細胞にアポトーシスを誘起すること
を確認し、本発明を完成した。即ち、本発明は、本明細
書特許請求の範囲に記載の各発明からなる。
ウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡをクローニングし、その
塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。更に、軽
鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列と相同性の高い公
知のヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列を選択し、ＣＤ
Ｒ領域はマウス由来、またＦＲ領域は該相同性の高いヒ
ト由来の、ヒト化抗体のアミノ酸配列を設計し、該アミ
ノ酸配列をもとに、軽鎖、重鎖の可変領域をコードする
ＤＮＡを合成した。更に、それらをそれぞれヒトμ鎖の
定常領域をコードするＤＮＡ、ヒトκ鎖の定常領域をコ
ードするＤＮＡと結合し、ヒト化抗体軽鎖及びヒト化抗
体重鎖を発現するベクターを構築した。これらのベクタ
ーを用いてＣＨＯ細胞を形質転換し、抗Fasヒト化抗体
を得ることに成功した。そして、該抗体は、Fas抗原発
現細胞と結合し、該細胞にアポトーシスを誘起すること
を確認し、本発明を完成した。即ち、本発明は、本明細
書特許請求の範囲に記載の各発明からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡのＣＤＲ領域のア
ミノ酸配列は、例えば、抗ヒトFasマウスモノクロナー
ル抗体の重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列、軽鎖のＣＤ
Ｒ領域のアミノ酸配列を採用することができる。かかる
抗ヒトFasマウスモノクロナール抗体としては、例え
ば、ハイブリドーマ（Mouse-Mouse hybridoma)ＣＢＥ、
ＷＢ３、ＶＢ３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及び
ＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一つのハイブリド
ーマから産生される抗体を用いることができる。
ミノ酸配列は、例えば、抗ヒトFasマウスモノクロナー
ル抗体の重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列、軽鎖のＣＤ
Ｒ領域のアミノ酸配列を採用することができる。かかる
抗ヒトFasマウスモノクロナール抗体としては、例え
ば、ハイブリドーマ（Mouse-Mouse hybridoma)ＣＢＥ、
ＷＢ３、ＶＢ３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及び
ＣＨ１１からなる群の中から選ばれた一つのハイブリド
ーマから産生される抗体を用いることができる。
【００１４】ここで、例えば、ハイブリドーマＺＢ４、
ＵＢ２は、ヒトFas抗原ｃＤＮＡで形質転換したマウス
細胞より得たリコンビナントFas抗原をＢＡＬＢ／ｃマ
ウスに免疫後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｎ
Ｓ−１）とを融合させることにより得ることができる。
また、ハイブリドーマＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ３、ＪＡ
Ｅ、ＡＸ６も、ハイブリドーマＺＢ４、ＵＢ２と同様に
作製できる。一方、ハイブリドーマＣＨ１１は、ヒト二
倍体線維芽細胞ＦＳ−７をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫
後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）と
を融合させることにより得ることができる（Yonehara,
S, Ishii，A．＆ Yonehara，M. ：”A cellkilling mon
oclonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antig
en co-downregulated with the receptor of tumor nec
rosis factor．”J．Exp. Med.， 169：1747−1756(198
9)）。
ＵＢ２は、ヒトFas抗原ｃＤＮＡで形質転換したマウス
細胞より得たリコンビナントFas抗原をＢＡＬＢ／ｃマ
ウスに免疫後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞（Ｎ
Ｓ−１）とを融合させることにより得ることができる。
また、ハイブリドーマＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ３、ＪＡ
Ｅ、ＡＸ６も、ハイブリドーマＺＢ４、ＵＢ２と同様に
作製できる。一方、ハイブリドーマＣＨ１１は、ヒト二
倍体線維芽細胞ＦＳ−７をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫
後、その脾細胞とマウスミエローマ細胞（ＮＳ−１）と
を融合させることにより得ることができる（Yonehara,
S, Ishii，A．＆ Yonehara，M. ：”A cellkilling mon
oclonal antibody(anti-Fas) to a cell surface antig
en co-downregulated with the receptor of tumor nec
rosis factor．”J．Exp. Med.， 169：1747−1756(198
9)）。
【００１５】尚、ハイブリドーマＣＢＥ、ＷＢ３、ＶＢ
３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及びＣＨ１１は、
それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０１、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５７０２、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０３、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５７０４、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０５、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７０６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０７、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５７０８として、工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。また、これらのうちハ
イブリドーマＺＢ４、ＵＢ２、ＣＨ１１から生産される
モノクローナル抗体は、（株）医学生物学研究所より市
販されており、それぞれのカタログ番号はＭＤ−１１−
３、ＭＤ−１０−３、ＳＹ−００１である。
３、ＪＡＥ、ＡＸ６、ＺＢ４、ＵＢ２及びＣＨ１１は、
それぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０１、ＦＥＲＭ
Ｐ−１５７０２、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０３、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５７０４、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０５、ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５７０６、ＦＥＲＭ Ｐ−１５７０７、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５７０８として、工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。また、これらのうちハ
イブリドーマＺＢ４、ＵＢ２、ＣＨ１１から生産される
モノクローナル抗体は、（株）医学生物学研究所より市
販されており、それぞれのカタログ番号はＭＤ−１１−
３、ＭＤ−１０−３、ＳＹ−００１である。
【００１６】なお、本発明において、マウスモノクロー
ナル抗体のＣＤＲ領域の配列を１個または数個改変した
アミノ酸配列も、ヒト化抗体の抗原結合能、またはアポ
トーシスを制御する活性が保持される限り、ＣＤＲ領域
のアミノ酸配列として利用することができる。更に、マ
ウス及びヒト以外の哺乳動物の抗Fas抗体のＣＤＲ領域
のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列を１個または数個
改変したアミノ酸配列も、ヒト化抗体の抗原結合能、ま
たはアポトーシスを制御する活性が保持される限り、Ｃ
ＤＲ領域のアミノ酸配列として利用することができる。
ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の中で変換するアミノ酸は、
好ましくは全体のＣＤＲの３０％以下であり、更に好ま
しくは全体の２０％以下であり、更に好ましくは全体の
１０％以下である。
ナル抗体のＣＤＲ領域の配列を１個または数個改変した
アミノ酸配列も、ヒト化抗体の抗原結合能、またはアポ
トーシスを制御する活性が保持される限り、ＣＤＲ領域
のアミノ酸配列として利用することができる。更に、マ
ウス及びヒト以外の哺乳動物の抗Fas抗体のＣＤＲ領域
のアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列を１個または数個
改変したアミノ酸配列も、ヒト化抗体の抗原結合能、ま
たはアポトーシスを制御する活性が保持される限り、Ｃ
ＤＲ領域のアミノ酸配列として利用することができる。
ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の中で変換するアミノ酸は、
好ましくは全体のＣＤＲの３０％以下であり、更に好ま
しくは全体の２０％以下であり、更に好ましくは全体の
１０％以下である。
【００１７】抗体のCDR領域以外のマウスのFRをヒトのF
Rに変換するヒト化抗体の設計において最も重要な点
は、ヒトのFRの選択である。ヒト化抗体の作製法は、今
までにいくつかの報告がなされているが、おおよそ3つ
の方法に分けることができる。1つめの方法は、NEWM、R
EIなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレー
ムを用いる方法である（Riechmann L. et al., Nature
332, 323-3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein E
ngineering 7, 1501-1507 (1994); Ellis JH. etal.,
J. Immunol 155, 925-937 (1995)）。2つめの方法は、
データーベースにより、目的のマウス抗体可変領域と最
も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域を選択し、そ
のFRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl
Acad SciUSA 86, 10029-10033 (1989); Rozak MJ. et
al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearman
CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991)）。3
つめの方法は、ヒト抗体のFRで最も共通に用いられるア
ミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Im
munol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Prot
ein Engineering 6, 971-980 (1993); Kettleborough C
A. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (199
1)）。なお、本明細書実施例においては2つめの方法を
選択しているが、本発明は他の方法を用いても実施可能
である。
Rに変換するヒト化抗体の設計において最も重要な点
は、ヒトのFRの選択である。ヒト化抗体の作製法は、今
までにいくつかの報告がなされているが、おおよそ3つ
の方法に分けることができる。1つめの方法は、NEWM、R
EIなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレー
ムを用いる方法である（Riechmann L. et al., Nature
332, 323-3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein E
ngineering 7, 1501-1507 (1994); Ellis JH. etal.,
J. Immunol 155, 925-937 (1995)）。2つめの方法は、
データーベースにより、目的のマウス抗体可変領域と最
も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域を選択し、そ
のFRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl
Acad SciUSA 86, 10029-10033 (1989); Rozak MJ. et
al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearman
CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991)）。3
つめの方法は、ヒト抗体のFRで最も共通に用いられるア
ミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Im
munol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Prot
ein Engineering 6, 971-980 (1993); Kettleborough C
A. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (199
1)）。なお、本明細書実施例においては2つめの方法を
選択しているが、本発明は他の方法を用いても実施可能
である。
【００１８】なお、本発明において、公知のヒトＦＲ領
域のアミノ酸配列の１個または数個を改変したアミノ酸
配列も、ヒト化抗体の抗原結合能、またはアポトーシス
を制御する活性が保持される限り、ＦＲ領域のアミノ酸
配列として利用することができる。特に、公知のヒトＦ
Ｒ領域のアミノ酸の一部をＣＤＲ領域の由来となった抗
体のＦＲ領域のアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が
維持される可能性が高い。変換するアミノ酸は、好まし
くは全体のＦＲの３０％以下であり、更に好ましくは全
体の２０％以下であり、更に好ましくは全体の１０％以
下である。
域のアミノ酸配列の１個または数個を改変したアミノ酸
配列も、ヒト化抗体の抗原結合能、またはアポトーシス
を制御する活性が保持される限り、ＦＲ領域のアミノ酸
配列として利用することができる。特に、公知のヒトＦ
Ｒ領域のアミノ酸の一部をＣＤＲ領域の由来となった抗
体のＦＲ領域のアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が
維持される可能性が高い。変換するアミノ酸は、好まし
くは全体のＦＲの３０％以下であり、更に好ましくは全
体の２０％以下であり、更に好ましくは全体の１０％以
下である。
【００１９】本発明において、化学合成または生化学的
切断／再結合等によって得られたヒト化抗体の軽鎖可変
領域をコードするＤＮＡは、軽鎖の定常領域（例えばヒ
ト免疫グロブリン重鎖の定常領域）をコードするＤＮＡ
と共に発現ベクターに組み込み、軽鎖を発現するベクタ
ーとすることができる。また、本発明において、化学合
成または生化学的切断／再結合等によって得られたヒト
化抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡは、重鎖の定
常領域（例えばヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域）を
コードするＤＮＡと共に発現ベクターに組み込み、重鎖
を発現するベクターとすることができる。発現ベクター
としては、例えばSV40 virus basedベクター、EB virus
basedベクター、BPV(パピローマウイルス) basedベク
ターなどを用いることができるが、特にこれらに限定さ
れない。
切断／再結合等によって得られたヒト化抗体の軽鎖可変
領域をコードするＤＮＡは、軽鎖の定常領域（例えばヒ
ト免疫グロブリン重鎖の定常領域）をコードするＤＮＡ
と共に発現ベクターに組み込み、軽鎖を発現するベクタ
ーとすることができる。また、本発明において、化学合
成または生化学的切断／再結合等によって得られたヒト
化抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡは、重鎖の定
常領域（例えばヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域）を
コードするＤＮＡと共に発現ベクターに組み込み、重鎖
を発現するベクターとすることができる。発現ベクター
としては、例えばSV40 virus basedベクター、EB virus
basedベクター、BPV(パピローマウイルス) basedベク
ターなどを用いることができるが、特にこれらに限定さ
れない。
【００２０】そして、これらのヒト化軽鎖発現ベクター
及びヒト化重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換
し、この形質転換細胞からヒト化抗Fas抗体を得ること
ができる。形質転換の宿主としては、CHO細胞(チャイニ
ーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immu
nol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエロ
ーマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-51
9 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-15
02 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換に
は、リポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレ
ーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.va
n der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran
法等が好適に用いられる。なお、得られた組換えヒト化
抗Fas抗体は、プロテインAカラム、プロテインGカラ
ム、抗ヒトイムノグロブリン抗体アフィニティーカラム
等を用いて精製し、医療用途等に適用することができ
る。
及びヒト化重鎖発現ベクターにより細胞を共形質転換
し、この形質転換細胞からヒト化抗Fas抗体を得ること
ができる。形質転換の宿主としては、CHO細胞(チャイニ
ーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immu
nol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエロ
ーマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-51
9 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-15
02 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換に
は、リポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレ
ーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.va
n der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran
法等が好適に用いられる。なお、得られた組換えヒト化
抗Fas抗体は、プロテインAカラム、プロテインGカラ
ム、抗ヒトイムノグロブリン抗体アフィニティーカラム
等を用いて精製し、医療用途等に適用することができ
る。
【００２１】なお、本発明のヒト化抗Fas抗体は、Fas抗
原を発現している細胞に結合する活性を有するので、該
細胞を検出する試薬として利用可能である。なお、本明
細書において、Fas抗原とは、生体内におけるアポトー
シスに深く関与すると考えられている細胞表層の存在す
る膜貫通タンパク質を指し、ヒトのFas抗原が代表的で
あるが、それに限定されない（Itoh N.et al.,Cell, 6
6: 233-243 (1991); Watanabe-Fukunaga R.et al.,J. I
mmunol.148, 4: 1274-1279 (1992); AlexanderOehm et
al.,J. Biol. Chem. 267, 15: 10709-70715 (1992);Yon
ehara S. et al.,J. Exp. Med.,169: 1747-1756 (198
9);Kobayashi N.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87: 9620-9624 (1990); Bernhard C. Trauthet al.,Sci
ence, 245:301-305 (1989); Jeas Dein et al.,J. Immu
nol.149, 10: 3166-3173 (1992);Klaus-Micahel Debati
n et al.,The Lancet, 335: 497-500 (1990); Miyawaki
T.et al.,J. Immunol., 149, 11: 3753-3758 (1992);
Peter Lichter et al.,Genomics, 14: 179-180 (199
2))。また、本明細書において、Fas抗原を発現している
細胞とは、本来Fas抗原を発現している細胞（例えば、J
urkat細胞(M.E.Peteret al.,Int.Immunol.7,1873-1877
(1995))、KT-3細胞(N.Itoh et al.,Cell 66,233-243 (1
991))の他、Fas遺伝子が導入された形質転換細胞（例え
ばWR19L12a(N.Itoh et al.,Cell 66, 233-243 (199
1))）があげられる。
原を発現している細胞に結合する活性を有するので、該
細胞を検出する試薬として利用可能である。なお、本明
細書において、Fas抗原とは、生体内におけるアポトー
シスに深く関与すると考えられている細胞表層の存在す
る膜貫通タンパク質を指し、ヒトのFas抗原が代表的で
あるが、それに限定されない（Itoh N.et al.,Cell, 6
6: 233-243 (1991); Watanabe-Fukunaga R.et al.,J. I
mmunol.148, 4: 1274-1279 (1992); AlexanderOehm et
al.,J. Biol. Chem. 267, 15: 10709-70715 (1992);Yon
ehara S. et al.,J. Exp. Med.,169: 1747-1756 (198
9);Kobayashi N.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87: 9620-9624 (1990); Bernhard C. Trauthet al.,Sci
ence, 245:301-305 (1989); Jeas Dein et al.,J. Immu
nol.149, 10: 3166-3173 (1992);Klaus-Micahel Debati
n et al.,The Lancet, 335: 497-500 (1990); Miyawaki
T.et al.,J. Immunol., 149, 11: 3753-3758 (1992);
Peter Lichter et al.,Genomics, 14: 179-180 (199
2))。また、本明細書において、Fas抗原を発現している
細胞とは、本来Fas抗原を発現している細胞（例えば、J
urkat細胞(M.E.Peteret al.,Int.Immunol.7,1873-1877
(1995))、KT-3細胞(N.Itoh et al.,Cell 66,233-243 (1
991))の他、Fas遺伝子が導入された形質転換細胞（例え
ばWR19L12a(N.Itoh et al.,Cell 66, 233-243 (199
1))）があげられる。
【００２２】ヒト化抗Fas抗体はFas抗原の認識部位を決
定するＣＤＲ領域以外は、本質的にヒト由来であるの
で、ヒトに投与した場合であってもヒト蛋白と認識され
るためヒトの循環系から排除されにくく、アレルギー反
応も起こりにくいので、体内診断薬としての利用が期待
される。また、このヒトにおける低い抗原性のため、医
薬としての利用も期待される。例えば、本来ならばアポ
トーシスにより除かれるべきリンパ球であって自己の細
胞成分との反応性を有するものが生体に残存している患
者に対して、この抗Fas抗体を投与すれば、アポトーシ
スが誘導されてかかるリンパ球が除かれるため、自己免
疫疾患の有効な治療剤となることが期待される。
定するＣＤＲ領域以外は、本質的にヒト由来であるの
で、ヒトに投与した場合であってもヒト蛋白と認識され
るためヒトの循環系から排除されにくく、アレルギー反
応も起こりにくいので、体内診断薬としての利用が期待
される。また、このヒトにおける低い抗原性のため、医
薬としての利用も期待される。例えば、本来ならばアポ
トーシスにより除かれるべきリンパ球であって自己の細
胞成分との反応性を有するものが生体に残存している患
者に対して、この抗Fas抗体を投与すれば、アポトーシ
スが誘導されてかかるリンパ球が除かれるため、自己免
疫疾患の有効な治療剤となることが期待される。
【００２３】ここで、抗Fas抗体は単独でもアポトーシ
ス活性を有するが、ＩｇＧに分類されるものについては
単独では十分にアポトーシスを誘導することができな
い。その理由は、アポトーシスの誘導のためには細胞表
面上のFas抗原のうち３つが架橋される必要があるのに
対し、ＩｇＧクラスのものは単独ではFas抗原と反応は
しても架橋することができないからと考えられる。
ス活性を有するが、ＩｇＧに分類されるものについては
単独では十分にアポトーシスを誘導することができな
い。その理由は、アポトーシスの誘導のためには細胞表
面上のFas抗原のうち３つが架橋される必要があるのに
対し、ＩｇＧクラスのものは単独ではFas抗原と反応は
しても架橋することができないからと考えられる。
【００２４】このため、ＩｇＧを架橋可能な２次抗体を
用いて、反応した抗Fas抗体同士を架橋することによ
り、単独で用いる場合に比べて高いアポトーシス活性を
誘導するのが好ましい。本発明のヒト化抗Fas抗体とこ
のような2次抗体とを適宣併用することにより、例えば
ＷＲ１９Ｌ１２ａの細胞生存率（ＭＴＴアッセイ法によ
る）を２０％以下に抑えることができる。なお、このよ
うな２次抗体としては、例えば、抗ヒトγ重鎖抗体、抗
ヒトκ軽鎖抗体、抗ヒトＦｃ抗体、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体等の抗体のほか、プロテインＡ、プロテインＧ
等が挙げられる。
用いて、反応した抗Fas抗体同士を架橋することによ
り、単独で用いる場合に比べて高いアポトーシス活性を
誘導するのが好ましい。本発明のヒト化抗Fas抗体とこ
のような2次抗体とを適宣併用することにより、例えば
ＷＲ１９Ｌ１２ａの細胞生存率（ＭＴＴアッセイ法によ
る）を２０％以下に抑えることができる。なお、このよ
うな２次抗体としては、例えば、抗ヒトγ重鎖抗体、抗
ヒトκ軽鎖抗体、抗ヒトＦｃ抗体、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋
Ｌ）抗体等の抗体のほか、プロテインＡ、プロテインＧ
等が挙げられる。
【００２５】なお、本発明のヒト化抗体には、Fas抗原
を発現している細胞のアポトーシスを誘導する活性を有
する抗体（アゴニスト抗体）のほか、Fas抗原を発現し
ている細胞のアポトーシスを抑制する活性を有するもの
（アンタゴニスト抗体）も含まれる。なお、アンタゴニ
スト抗体は、例えば、異常なアポトーシスによる細胞死
を抑制する医薬としての利用が期待される。
を発現している細胞のアポトーシスを誘導する活性を有
する抗体（アゴニスト抗体）のほか、Fas抗原を発現し
ている細胞のアポトーシスを抑制する活性を有するもの
（アンタゴニスト抗体）も含まれる。なお、アンタゴニ
スト抗体は、例えば、異常なアポトーシスによる細胞死
を抑制する医薬としての利用が期待される。
【００２６】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限される
ものではない。
るが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限される
ものではない。
【００２７】［実施例1］ IgM型キメラ抗体の作製 1）CH11可変領域遺伝子の単離および配列の決定 ヒトFas発現細胞にアポトーシスを誘起させることので
きるマウスモノクロ−ナル抗体（IgMクラス）を産生し
ているハイブリドーマCH11（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１５７０８）を、DMEM/10％FCSで培養し、ポリA+RNAを
調製した。そのポリA+RNA 5μgより、一本鎖cDNAを合成
した。
きるマウスモノクロ−ナル抗体（IgMクラス）を産生し
ているハイブリドーマCH11（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−
１５７０８）を、DMEM/10％FCSで培養し、ポリA+RNAを
調製した。そのポリA+RNA 5μgより、一本鎖cDNAを合成
した。
【００２８】次に抗体の重鎖(H鎖とも呼ぶ)と軽鎖(L鎖
とも呼ぶ)の可変領域(それぞれVH、VLとも呼ぶ)をクロ
ーニングするために、VHミックスセンスプライマー（配
列番号：２３）、VHミックスアンチセンスプライマー
（配列番号：２４）、VLミックスセンスプライマー（配
列番号：２５）、およびVLミックスアンチセンスプライ
マー（配列番号：２６）を作製した。前記のcDNA 3μl
に20μMの前記センス、アンチセンスプライマー対各 5
μl、20mM dNTP 1μl、TaqDNAポリメラーゼ 1μl、10×
PCRバッファー 10μl、滅菌水 75μlを加え、DNAサーマ
ルサイクラー(MJ Research社)を使用して、PCRを行っ
た。PCRは94℃1分、55℃2分、72℃2分を1サイクルと
し、30サイクル行った。得られたPCR産物を1％アガロー
スゲルにて電気泳動し、それぞれ約300bpの産物を確認
した。ゲルより回収したそれぞれのフラグメントをpUC1
9のSmaIサイトに組み込み、それぞれ「pUC-VH」および
「pUC-VL」と命名した。「pUC-VH」および「pUC-VL」中
のDNA配列は、[α-32P]dATPを用いたジデオキシ法(F.Sa
nger, Science 214, 1205-1210 (1981))により確認し
た。
とも呼ぶ)の可変領域(それぞれVH、VLとも呼ぶ)をクロ
ーニングするために、VHミックスセンスプライマー（配
列番号：２３）、VHミックスアンチセンスプライマー
（配列番号：２４）、VLミックスセンスプライマー（配
列番号：２５）、およびVLミックスアンチセンスプライ
マー（配列番号：２６）を作製した。前記のcDNA 3μl
に20μMの前記センス、アンチセンスプライマー対各 5
μl、20mM dNTP 1μl、TaqDNAポリメラーゼ 1μl、10×
PCRバッファー 10μl、滅菌水 75μlを加え、DNAサーマ
ルサイクラー(MJ Research社)を使用して、PCRを行っ
た。PCRは94℃1分、55℃2分、72℃2分を1サイクルと
し、30サイクル行った。得られたPCR産物を1％アガロー
スゲルにて電気泳動し、それぞれ約300bpの産物を確認
した。ゲルより回収したそれぞれのフラグメントをpUC1
9のSmaIサイトに組み込み、それぞれ「pUC-VH」および
「pUC-VL」と命名した。「pUC-VH」および「pUC-VL」中
のDNA配列は、[α-32P]dATPを用いたジデオキシ法(F.Sa
nger, Science 214, 1205-1210 (1981))により確認し
た。
【００２９】また、哺乳動物細胞で発現させる場合、シ
グナル配列も決定する必要があると考えられた。そこで
「ZAPcDNAキット」（ストラタジーン社）を用いてcDNA
ライブラリーを作製した。作製方法はキット中のプロト
コールに従った。CH11よりポリA+RNAを調製し、そのポ
リA+RNA 5μlより、第1鎖cDNAを合成した後、第2鎖cDNA
を合成し、次にリンカー（EcoRI、XhoIサイトをもつ）
をライゲーションし、そのcDNAをキット中の「Uni-ZAP
XRベクター」のEcoRI/XhoIサイトに組み込んだ。次に
「ZAPcDNA Gigapack III Gold Cloning Kit」(ストラタ
ジーン社)を用いてベクターをVCMG13ファージにパッケ
ージングした。
グナル配列も決定する必要があると考えられた。そこで
「ZAPcDNAキット」（ストラタジーン社）を用いてcDNA
ライブラリーを作製した。作製方法はキット中のプロト
コールに従った。CH11よりポリA+RNAを調製し、そのポ
リA+RNA 5μlより、第1鎖cDNAを合成した後、第2鎖cDNA
を合成し、次にリンカー（EcoRI、XhoIサイトをもつ）
をライゲーションし、そのcDNAをキット中の「Uni-ZAP
XRベクター」のEcoRI/XhoIサイトに組み込んだ。次に
「ZAPcDNA Gigapack III Gold Cloning Kit」(ストラタ
ジーン社)を用いてベクターをVCMG13ファージにパッケ
ージングした。
【００３０】そのファージを前出の「ZAPcDNA Gigapack
III Gold Cloning Kit」中の大腸菌／XL-I blueに感染
させ、培地上でプラークを形成させた後、以下のように
してプラークハイブリダーゼーションを行った。PCRに
て得られた前出の「pUC-VH」、「pUC-VL」をEcoRI/BamH
I処理し、ゲルより切り出したVH、VLフラグメントをプ
ローブとした。プラークを形成させたNZY培地上に「Hyb
ond-N+メンブレン」（アマシャム社）をのせ、プラーク
をメンブレンに転写させた後、メンブレンを1.5M NaCl/
0.5M NaOHで2分、次に1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl(pH7.5)
で5分、0.2MTris-HCl(pH7.5)/2×SSCで30秒処理し風乾
させ「ECL direct nucleic acid labelling and detect
ion systems」（アマシャム社）を用いてDNAプローブを
ラベルし、そのラベルプローブとメンブレンを42℃、4
時間インキュベートした後、洗浄し、発色基質に浸し
た。次にそのメンブレンを「Hyper-film ECL」（アマシ
ャム社）に密着させ5分感光した。そのフィルムをもと
に培地よりポジティブプラークを単離した。ポジティブ
ファージを選択した後、「Uni-ZAP XRベクタークローニ
ングキット」（ストラタジーン社）を用いて、ポジティ
ブファージを該キットに添付の大腸菌／SOLR株に感染さ
せ、ファージ中の「Uni-ZAP XR DNA」から、ファージミ
ドを切り出させた。その大腸菌／SOLR株からファージミ
ドDNAをアルカリSDS法により精製した。このファージミ
ドDNAを「pBluescript-VH」「pBluescript-VL」と命名
し、ジデオキシ法によりインサートの配列を決定した。
決定された重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：１
（１位から１９位までの配列はシグナル配列をコードす
る）、その塩基配列を配列番号：２０（１位から５７位
までの配列はシグナル配列をコードする）に、また軽鎖
可変領域のアミノ酸配列を配列番号：２（１位から１９
位までの配列はシグナル配列をコードする）、その塩基
配列を配列番号：２１（１位から５７位までの配列はシ
グナル配列をコードする）にそれぞれ示す。
III Gold Cloning Kit」中の大腸菌／XL-I blueに感染
させ、培地上でプラークを形成させた後、以下のように
してプラークハイブリダーゼーションを行った。PCRに
て得られた前出の「pUC-VH」、「pUC-VL」をEcoRI/BamH
I処理し、ゲルより切り出したVH、VLフラグメントをプ
ローブとした。プラークを形成させたNZY培地上に「Hyb
ond-N+メンブレン」（アマシャム社）をのせ、プラーク
をメンブレンに転写させた後、メンブレンを1.5M NaCl/
0.5M NaOHで2分、次に1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl(pH7.5)
で5分、0.2MTris-HCl(pH7.5)/2×SSCで30秒処理し風乾
させ「ECL direct nucleic acid labelling and detect
ion systems」（アマシャム社）を用いてDNAプローブを
ラベルし、そのラベルプローブとメンブレンを42℃、4
時間インキュベートした後、洗浄し、発色基質に浸し
た。次にそのメンブレンを「Hyper-film ECL」（アマシ
ャム社）に密着させ5分感光した。そのフィルムをもと
に培地よりポジティブプラークを単離した。ポジティブ
ファージを選択した後、「Uni-ZAP XRベクタークローニ
ングキット」（ストラタジーン社）を用いて、ポジティ
ブファージを該キットに添付の大腸菌／SOLR株に感染さ
せ、ファージ中の「Uni-ZAP XR DNA」から、ファージミ
ドを切り出させた。その大腸菌／SOLR株からファージミ
ドDNAをアルカリSDS法により精製した。このファージミ
ドDNAを「pBluescript-VH」「pBluescript-VL」と命名
し、ジデオキシ法によりインサートの配列を決定した。
決定された重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：１
（１位から１９位までの配列はシグナル配列をコードす
る）、その塩基配列を配列番号：２０（１位から５７位
までの配列はシグナル配列をコードする）に、また軽鎖
可変領域のアミノ酸配列を配列番号：２（１位から１９
位までの配列はシグナル配列をコードする）、その塩基
配列を配列番号：２１（１位から５７位までの配列はシ
グナル配列をコードする）にそれぞれ示す。
【００３１】2）ヒトμ鎖、ヒトκ鎖、ヒトJ鎖DNA遺伝
子の単離 ヒトμ鎖定常領域DNAは、ヒトリンパ球cDNAをテンプレ
ートにして、「Mプライマー1」および「Mプライマー2」
（それぞれ配列番号：２７および２８）を用いたPCRで
増幅したのち、直接配列を確認した。
子の単離 ヒトμ鎖定常領域DNAは、ヒトリンパ球cDNAをテンプレ
ートにして、「Mプライマー1」および「Mプライマー2」
（それぞれ配列番号：２７および２８）を用いたPCRで
増幅したのち、直接配列を確認した。
【００３２】ヒトκ鎖定常領域DNAは、ヒトリンパ球cDN
Aをテンプレートにして、「Kプライマー1」および「Kプ
ライマー2」（それぞれ配列番号：２９および３０）を
用いたPCRで増幅したのち、直接配列を確認した。
Aをテンプレートにして、「Kプライマー1」および「Kプ
ライマー2」（それぞれ配列番号：２９および３０）を
用いたPCRで増幅したのち、直接配列を確認した。
【００３３】ヒトJ鎖遺伝子は、シグナル配列部分が未
知であったため、ヒトリンパ球cDNAをテンプレートにし
て、「Jプライマー1」および「Jプライマー2」（それぞ
れ配列番号：３１および３２）を用いたPCRで増幅したD
NAをプローブとして、ヒト脾臓cDNAライブラリー（λgt
11、クローンテック社）よリ、1)と同様にしてプラーク
ハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブプラーク
をスクリーニングした。λgt11プライマーを用いてファ
ージより直接PCRにて増幅したのち、pUCベクターのSmaI
サイトに組み込み、シグナル配列部分の配列を決定し
た。そのアミノ配列を配列番号：３（１位から２２位ま
での配列はシグナル配列をコードする）に、塩基配列を
配列番号：２２（１位から６６位までの配列はシグナル
配列をコードする）に示す。
知であったため、ヒトリンパ球cDNAをテンプレートにし
て、「Jプライマー1」および「Jプライマー2」（それぞ
れ配列番号：３１および３２）を用いたPCRで増幅したD
NAをプローブとして、ヒト脾臓cDNAライブラリー（λgt
11、クローンテック社）よリ、1)と同様にしてプラーク
ハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブプラーク
をスクリーニングした。λgt11プライマーを用いてファ
ージより直接PCRにて増幅したのち、pUCベクターのSmaI
サイトに組み込み、シグナル配列部分の配列を決定し
た。そのアミノ配列を配列番号：３（１位から２２位ま
での配列はシグナル配列をコードする）に、塩基配列を
配列番号：２２（１位から６６位までの配列はシグナル
配列をコードする）に示す。
【００３４】3）キメラH鎖ベクター、キメラL鎖ベクタ
ー、J鎖ベクターの作製 発現ベクター「BCMGS Neoベクター」(烏山一「ウシパピ
ローマウイルスベクター」,村松正実および岡山博人編,
実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック,羊土社,pp.297
-299 (1991))（Xho1/Not1で切断）と、CH11由来のH鎖可
変領域DNA（XhoI-平滑末端）と、PCRにて制限酵素サイ
トを付けたヒトμ鎖DNA（平滑末端-NotI）とをライゲー
ションし、キメラH鎖ベクターを作製した（図１）。
ー、J鎖ベクターの作製 発現ベクター「BCMGS Neoベクター」(烏山一「ウシパピ
ローマウイルスベクター」,村松正実および岡山博人編,
実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック,羊土社,pp.297
-299 (1991))（Xho1/Not1で切断）と、CH11由来のH鎖可
変領域DNA（XhoI-平滑末端）と、PCRにて制限酵素サイ
トを付けたヒトμ鎖DNA（平滑末端-NotI）とをライゲー
ションし、キメラH鎖ベクターを作製した（図１）。
【００３５】また、BCMGS Neoベクター（Xho1/Not1で切
断）と、CH11由来のL鎖可変領域DNA（XhoI-平滑末端）
と、ヒトκ鎖DNA（平滑末端-NotI）とをライゲーション
し、キメラL鎖ベクターを作製した（図２）。
断）と、CH11由来のL鎖可変領域DNA（XhoI-平滑末端）
と、ヒトκ鎖DNA（平滑末端-NotI）とをライゲーション
し、キメラL鎖ベクターを作製した（図２）。
【００３６】更に、BCMGS Neoベクター（予めXho1/Not1
で切断）に、PCRにて制限酵素サイトを付けたシグナル
配列を含むJ鎖（Xho1/NotI）を組み込んで、J鎖ベクタ
ーを作製した（図３）。
で切断）に、PCRにて制限酵素サイトを付けたシグナル
配列を含むJ鎖（Xho1/NotI）を組み込んで、J鎖ベクタ
ーを作製した（図３）。
【００３７】4）トランスフェクション 3種類のベクター（キメラH鎖ベクター、キメラL鎖ベク
ター、J鎖ベクター）をCHO（チャイニーズハムスター卵
巣）細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトランスフ
ェクションし、37℃で12時間培養した後96穴プレートに
移植し、ネオマイシン500μg/mlを含むDMEM/10％FCSで
選択した。
ター、J鎖ベクター）をCHO（チャイニーズハムスター卵
巣）細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトランスフ
ェクションし、37℃で12時間培養した後96穴プレートに
移植し、ネオマイシン500μg/mlを含むDMEM/10％FCSで
選択した。
【００３８】培養液中のIgM量は以下のようにして測定
した。抗ヒトμ鎖（MBL:code107G）を10μg/mlにPBSで
希釈調製し、ポリスチレン製マイクロプレートに100μl
/ウェルずつ分注し、4℃で一晩感作し、次に5％BSA/5％
ショ糖/PBSで4℃で一晩ブロッキングした。100μlのサ
ンプルを37℃で1時間反応させた後、PBS/0.05％Tween20
で洗浄後、4000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒト
IgM（医学生物学研究所:コード212）を37℃で1時間反応
させ、PBS/0.05％Tween20で洗浄後、酵素基質液を100μ
l分注し、室温で15分反応させ、2N硫酸を100μlずつ分
注し、A492を測定した。コントロールには、ヒト血清
（IgM量：200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml）を用
いた。このようにして、最も発現量の多いクローンを選
択し、その培養上清を回収した。
した。抗ヒトμ鎖（MBL:code107G）を10μg/mlにPBSで
希釈調製し、ポリスチレン製マイクロプレートに100μl
/ウェルずつ分注し、4℃で一晩感作し、次に5％BSA/5％
ショ糖/PBSで4℃で一晩ブロッキングした。100μlのサ
ンプルを37℃で1時間反応させた後、PBS/0.05％Tween20
で洗浄後、4000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒト
IgM（医学生物学研究所:コード212）を37℃で1時間反応
させ、PBS/0.05％Tween20で洗浄後、酵素基質液を100μ
l分注し、室温で15分反応させ、2N硫酸を100μlずつ分
注し、A492を測定した。コントロールには、ヒト血清
（IgM量：200ng/ml、20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml）を用
いた。このようにして、最も発現量の多いクローンを選
択し、その培養上清を回収した。
【００３９】5）IgMキメラ抗体の性質 5-1)SDS-PAGE クローン化したIgMキメラ細胞の培養上清（IgM量：1μg
/ml）15μlに3×泳動サンプルバッファーを5μl加え、1
2.5％アクリルアミドゲルで電気泳動した後、メンブレ
ンにブロッティングし、そのメンブレンを抗ヒトμ抗体
（Dako社）、抗ヒトκ抗体（医学生物学研究所：コード
159）と反応させた後、PODラベル2次抗体と反応させ、
発色基質を加え発色させたところ、約30Kdの位置にL
鎖、約70Kdの位置にH鎖に対応するバンドが検出され
た。
/ml）15μlに3×泳動サンプルバッファーを5μl加え、1
2.5％アクリルアミドゲルで電気泳動した後、メンブレ
ンにブロッティングし、そのメンブレンを抗ヒトμ抗体
（Dako社）、抗ヒトκ抗体（医学生物学研究所：コード
159）と反応させた後、PODラベル2次抗体と反応させ、
発色基質を加え発色させたところ、約30Kdの位置にL
鎖、約70Kdの位置にH鎖に対応するバンドが検出され
た。
【００４０】5-2)フローサイトメトリー 次に、フローサイトメトリーをFas発現細胞WR19L12a(N.
Itoh et al.,Cell 66,233-243 (1991))とコントロール
細胞のWR19L(マウスリンフォーマ,ATCC TIB-52)に対し
行なった。PBS/1％BSAで洗浄した1×105細胞に正常ヤギ
血清20μlを反応させブロッキングした後、抗GST抗体
（培養上清、マウスネガティブコントロール）、精製ヒ
トIgM（100ng/ml）、CH11（100ng/ml）、キメラ抗体（1
00ng/ml）をそれぞれ40μl、室温で30分反応させPBS/1
％BSAで洗浄した。次に抗ヒトμFITCラベル抗体（×200
希釈）（イムノテック：コード0819）または抗マウスFI
TCラベル抗体（×50希釈）（医学生物学研究所：コード
218）を30分反応させた後、PBS/1％BSAで洗浄し、200μ
lのPBS/1％BSAに懸濁した。その細胞をFACSCANにセット
し蛍光強度を測定した。細胞の蛍光強度を数値化し、そ
の結果を後述のヒト化抗体の結果とあわせて表１に示
す。
Itoh et al.,Cell 66,233-243 (1991))とコントロール
細胞のWR19L(マウスリンフォーマ,ATCC TIB-52)に対し
行なった。PBS/1％BSAで洗浄した1×105細胞に正常ヤギ
血清20μlを反応させブロッキングした後、抗GST抗体
（培養上清、マウスネガティブコントロール）、精製ヒ
トIgM（100ng/ml）、CH11（100ng/ml）、キメラ抗体（1
00ng/ml）をそれぞれ40μl、室温で30分反応させPBS/1
％BSAで洗浄した。次に抗ヒトμFITCラベル抗体（×200
希釈）（イムノテック：コード0819）または抗マウスFI
TCラベル抗体（×50希釈）（医学生物学研究所：コード
218）を30分反応させた後、PBS/1％BSAで洗浄し、200μ
lのPBS/1％BSAに懸濁した。その細胞をFACSCANにセット
し蛍光強度を測定した。細胞の蛍光強度を数値化し、そ
の結果を後述のヒト化抗体の結果とあわせて表１に示
す。
【００４１】
【表１】 ─────────────────────────────── 反応させた抗体 平均蛍光強度 平均蛍光強度 （WR19L12a） （WR19L） ─────────────────────────────── 抗GST抗体 3.29 5.66 CH11 18.65 4.09 IgM 2.96 4.73 キメラ抗体 13.53 3.95 キメラH CDRL 10.39 4.40 CDR-HV1a 13.09 4.73 CDR-HV1b 10.09 4.40 CDR-HV1c 11.05 3.67 CDR-HG3a 10.03 4.40 CDR-HG3b 11.05 4.30 ─────────────────────────────── 表中、値が大きいほど細胞がその抗体と強く反応したこ
とを示す。従って、WR19L（Fasネガティブ細胞）の値に
比較して、WR19L12a（Fasポジティブ細胞）における値
が大きいと、その抗体はFas特異的に反応したことを示
す。この結果より、IgMキメラ抗体はCH11とほぼ同等のF
as抗原発現細胞特異的結合能を持つことが明らかとなっ
た。
とを示す。従って、WR19L（Fasネガティブ細胞）の値に
比較して、WR19L12a（Fasポジティブ細胞）における値
が大きいと、その抗体はFas特異的に反応したことを示
す。この結果より、IgMキメラ抗体はCH11とほぼ同等のF
as抗原発現細胞特異的結合能を持つことが明らかとなっ
た。
【００４２】5-3)MTTアッセイ 次にキメラ抗体のアポトーシス活性を、WR19L12a細胞と
WR19L細胞を用いてMTTアッセイ法で測定した。細胞を96
穴プレートに1×105個／mlの濃度で1ウェル当たり100μ
lまき、100μlの抗体を反応させて一晩培養した。抗体
としては、精製CH11（100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml）、
キメラ培養上清（100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml）、DMEM/
10％FCSをそれぞれ用いた。その後、100μlの培地を除
き、MTT（5mg/ml、Chemicon International INC）を10
μl加え、4時間培養し、イソプロパノール／塩酸を100
μl加え、A570/620を測定した。細胞の生存率を細胞を
まかないウェルの吸光度を0％とし、DMEM/10％FCSを加
えたウェルの吸光度を100％として示した。その結果を
後述のH鎖キメラL鎖ヒト化抗体（キメラH CDRL）を用い
た結果と共に図５に示す。IgM型キメラ抗体は単独でア
ポトーシス活性をCH11より、若干弱いものの、ほぼ同等
に持つことが明らかとなった。
WR19L細胞を用いてMTTアッセイ法で測定した。細胞を96
穴プレートに1×105個／mlの濃度で1ウェル当たり100μ
lまき、100μlの抗体を反応させて一晩培養した。抗体
としては、精製CH11（100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml）、
キメラ培養上清（100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml）、DMEM/
10％FCSをそれぞれ用いた。その後、100μlの培地を除
き、MTT（5mg/ml、Chemicon International INC）を10
μl加え、4時間培養し、イソプロパノール／塩酸を100
μl加え、A570/620を測定した。細胞の生存率を細胞を
まかないウェルの吸光度を0％とし、DMEM/10％FCSを加
えたウェルの吸光度を100％として示した。その結果を
後述のH鎖キメラL鎖ヒト化抗体（キメラH CDRL）を用い
た結果と共に図５に示す。IgM型キメラ抗体は単独でア
ポトーシス活性をCH11より、若干弱いものの、ほぼ同等
に持つことが明らかとなった。
【００４３】［実施例２］ CH11ヒト化抗体の作製 1）ヒト化抗体の設計 L鎖はCH11のL鎖とホモロジーの高いヒトκ鎖サブグルー
プIIの中からGM607'CL（Swiss-prot accession no．p06
309；Kabat database：005032）の配列を選択した。GM6
07'CL配列（配列番号：１６）のCH11配列とのアライン
メントを図６に示す。 GM607'CLはシグナル配列部分が
未知のため、シグナル配列部分はA3'CL（Kabat databas
e：005032）（配列番号：１７）を選択した。最終的な
ヒト化L鎖（図中「CDRL」と表示されたもの／また以下
「CDRL」と称する）の配列を図６及び配列番号：４に示
す。また、CDRLのCDR1、CDR2、CDR3の配列をそれぞれ配
列番号：５、配列番号：６、配列番号：７に示す。
プIIの中からGM607'CL（Swiss-prot accession no．p06
309；Kabat database：005032）の配列を選択した。GM6
07'CL配列（配列番号：１６）のCH11配列とのアライン
メントを図６に示す。 GM607'CLはシグナル配列部分が
未知のため、シグナル配列部分はA3'CL（Kabat databas
e：005032）（配列番号：１７）を選択した。最終的な
ヒト化L鎖（図中「CDRL」と表示されたもの／また以下
「CDRL」と称する）の配列を図６及び配列番号：４に示
す。また、CDRLのCDR1、CDR2、CDR3の配列をそれぞれ配
列番号：５、配列番号：６、配列番号：７に示す。
【００４４】H鎖は「Fasta database search」でCH11の
H鎖とのホモロジーが最も高い配列を2つ選択した（HV1
G：Swiss-prot acccssion no. p23083）（HG3：Swiss-p
rotaccession no. p01743）。HV1G配列（配列番号：１
８）、HG3配列（配列番号：１９）のCH11配列とのアラ
インメントを図７に示す。HV1G配列及びHG3配列は、CDR
3以降の配列が未知であった。しかし、最後のFR（FR4）
領域（CH11のWGQGTSVTVSS、CDR3のすぐ下流に相当）はH
鎖の可変領域遺伝子のVDJのうちJセグメントに相当す
る。ヒトJHセグメントは6種類しか存在しないため、こ
の部分は、ヒトJH6に相当する配列で補った。HV1Gを基
に3種類（CDR-HV1a、CDR-HV1b、CDR-HV1c）、HG3を基に
2種類（CDR-HG3aおよびCDR-HG3b）のヒト化H鎖（「以下
「CDRH」とする」）を設計した。CDRHの配列を図８及び
図９にまとめて示す。また、CDR-HV1a、CDR-HV1b、CDR-
HV1c、CDR-HG3a、およびCDR-HG3bの各アミノ酸配列を、
それぞれ配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１
０、配列番号：１１、および配列番号：１２に示す。更
に、CDRHのCDR1、CDR2、CDR3の配列をそれぞれ配列番
号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５に示す。
H鎖とのホモロジーが最も高い配列を2つ選択した（HV1
G：Swiss-prot acccssion no. p23083）（HG3：Swiss-p
rotaccession no. p01743）。HV1G配列（配列番号：１
８）、HG3配列（配列番号：１９）のCH11配列とのアラ
インメントを図７に示す。HV1G配列及びHG3配列は、CDR
3以降の配列が未知であった。しかし、最後のFR（FR4）
領域（CH11のWGQGTSVTVSS、CDR3のすぐ下流に相当）はH
鎖の可変領域遺伝子のVDJのうちJセグメントに相当す
る。ヒトJHセグメントは6種類しか存在しないため、こ
の部分は、ヒトJH6に相当する配列で補った。HV1Gを基
に3種類（CDR-HV1a、CDR-HV1b、CDR-HV1c）、HG3を基に
2種類（CDR-HG3aおよびCDR-HG3b）のヒト化H鎖（「以下
「CDRH」とする」）を設計した。CDRHの配列を図８及び
図９にまとめて示す。また、CDR-HV1a、CDR-HV1b、CDR-
HV1c、CDR-HG3a、およびCDR-HG3bの各アミノ酸配列を、
それぞれ配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１
０、配列番号：１１、および配列番号：１２に示す。更
に、CDRHのCDR1、CDR2、CDR3の配列をそれぞれ配列番
号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５に示す。
【００４５】HV1Gシリーズ（CDR-HV1a、CDR-HV1b、CDR-
HV1c）は、FR部位のヒトの配列を、クラスターごとに一
部マウスに戻してある。HG3由来のCDR-HG3aおよびCDR-H
G3bは、FR部位がほぼ完全にヒトの配列となるように設
計した。
HV1c）は、FR部位のヒトの配列を、クラスターごとに一
部マウスに戻してある。HG3由来のCDR-HG3aおよびCDR-H
G3bは、FR部位がほぼ完全にヒトの配列となるように設
計した。
【００４６】2）ヒト化抗体発現ベクターの作製 ヒト化抗体の可変領域（約400bp）の作製は次のように
行なった。
行なった。
【００４７】最初に、合成DNAを図１０に示すように8本
作製した。これら合成DNAは可変領域の約400bpをカバー
し、且つそれぞれ約20bpずつオーバーラップするように
作製されている。これら合成DNA 10pmol/10μlを100℃
で5分処理した後、急冷し、合成DNAの1と2、 3と4、 5
と6、7と8をそれぞれ混ぜ、ヒートブロックで65℃で30
分加熱したのち、12時間放置し、ゆっくりとアニールさ
せた。次に、20mM dNTPを1μl、シーケナーゼ（アマシ
ャム社）1μl、5×シーケナーゼバッファー10μlを加
え、滅菌水で最終的に5Oμlとし、37℃、1時間インキュ
ベートした。このDNAフラグメント（1-2、3-4、5-6、7-
8）を2％アガロースで泳動し、切り出し、30μlの滅菌
水に溶解した。次に、切り出したDNAフラグメント1-2と
3-4、5-6と7-8、それぞれ2μlに、Pfuポリメラーゼ1μ
l、DMSO 5μl、10×Pfuバッファー9μlを加え、滅菌水
を加え90μlとしたのち、PCRを94℃1分、55℃1分、72℃
2分で6サイクル行なった。次にさらに10×バッファー1
μl、20μMプライマー（aとb、またはcとd）をそれぞれ
5μl加え、PCRをさらに94℃1分、55℃1分、72℃2分で25
サイクル行なった。増幅されたDNAフラグメント（1-2-3
-4と5-6-7-8）を切り出し、30μlの滅菌水に溶解し、そ
れぞれのDNA2μlを用いてPCRを前述の条件で6サイクル
行ない、プライマーe、fを加えてさらにPCRを前述の条
件で25サイクル行なった。得られたDNAフラグメントを
切り出し、pT7blueTベクターにクローニングし、配列を
確認した。
作製した。これら合成DNAは可変領域の約400bpをカバー
し、且つそれぞれ約20bpずつオーバーラップするように
作製されている。これら合成DNA 10pmol/10μlを100℃
で5分処理した後、急冷し、合成DNAの1と2、 3と4、 5
と6、7と8をそれぞれ混ぜ、ヒートブロックで65℃で30
分加熱したのち、12時間放置し、ゆっくりとアニールさ
せた。次に、20mM dNTPを1μl、シーケナーゼ（アマシ
ャム社）1μl、5×シーケナーゼバッファー10μlを加
え、滅菌水で最終的に5Oμlとし、37℃、1時間インキュ
ベートした。このDNAフラグメント（1-2、3-4、5-6、7-
8）を2％アガロースで泳動し、切り出し、30μlの滅菌
水に溶解した。次に、切り出したDNAフラグメント1-2と
3-4、5-6と7-8、それぞれ2μlに、Pfuポリメラーゼ1μ
l、DMSO 5μl、10×Pfuバッファー9μlを加え、滅菌水
を加え90μlとしたのち、PCRを94℃1分、55℃1分、72℃
2分で6サイクル行なった。次にさらに10×バッファー1
μl、20μMプライマー（aとb、またはcとd）をそれぞれ
5μl加え、PCRをさらに94℃1分、55℃1分、72℃2分で25
サイクル行なった。増幅されたDNAフラグメント（1-2-3
-4と5-6-7-8）を切り出し、30μlの滅菌水に溶解し、そ
れぞれのDNA2μlを用いてPCRを前述の条件で6サイクル
行ない、プライマーe、fを加えてさらにPCRを前述の条
件で25サイクル行なった。得られたDNAフラグメントを
切り出し、pT7blueTベクターにクローニングし、配列を
確認した。
【００４８】次に、実施例１と同様、発現ベクターであ
る「BCMGS Neoベクター」（XhoI/Not1で切断）と、PCR
にて制限酵素サイトを付けた合成ヒト化 H鎖可変領域DN
A（XhoI-平滑末端）と、ヒトμ鎖DNA（平滑末端-NotI）
とをライゲーションし、CDRH鎖ベクターを作製した。ま
た、合成ヒト化 L鎖可変領域DNA（XhoI-平滑末端）と、
ヒトκ鎖DNA（平滑末端-NotI）とをライゲーションし、
CDRL鎖ベクターを作製した。J鎖ベクターは、実施例１
の方法で作製されたものを用いた。
る「BCMGS Neoベクター」（XhoI/Not1で切断）と、PCR
にて制限酵素サイトを付けた合成ヒト化 H鎖可変領域DN
A（XhoI-平滑末端）と、ヒトμ鎖DNA（平滑末端-NotI）
とをライゲーションし、CDRH鎖ベクターを作製した。ま
た、合成ヒト化 L鎖可変領域DNA（XhoI-平滑末端）と、
ヒトκ鎖DNA（平滑末端-NotI）とをライゲーションし、
CDRL鎖ベクターを作製した。J鎖ベクターは、実施例１
の方法で作製されたものを用いた。
【００４９】3）H鎖キメラ、L鎖ヒト化抗体の作製 まず最初に、L鎖のみヒト化抗体とし、H鎖はキメラであ
るハイブリッド抗体を作製し、抗体の活性への影響を調
べた。キメラH（μ）ベクター、CDRLベクター、Jベクタ
ーをCHO細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトラン
スフェクションし、37℃12時間培養した後、96穴プレー
トに移植し、ネオマイシン500μg/mlを含むDMEM/10％FC
Sで選択した。その後ELISAにて培養上清中にIgMの最も
発現量の多いクローンを選択し、その培養上清を回収し
た。
るハイブリッド抗体を作製し、抗体の活性への影響を調
べた。キメラH（μ）ベクター、CDRLベクター、Jベクタ
ーをCHO細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトラン
スフェクションし、37℃12時間培養した後、96穴プレー
トに移植し、ネオマイシン500μg/mlを含むDMEM/10％FC
Sで選択した。その後ELISAにて培養上清中にIgMの最も
発現量の多いクローンを選択し、その培養上清を回収し
た。
【００５０】4）H鎖キメラ、L鎖ヒト化抗体の性質 4-1)フローサイトメトリー フローサイトメトリーを、Fas発現細胞WR19L12aとコン
トロール細胞のWR19Lに対し行なった。PBS/1％BSAで洗
浄した1×105細胞に正常ヤギ血清20μlを反応させブロ
ッキングした後、抗GST抗体培養上清、精製ヒトIgM(100
ng/ml)、CH11(100ng/ml)、キメラ抗体(100ng/ml)、キメ
ラH-CDRL抗体(100ng/ml)をそれぞれ40μl、室温で30分
反応させPBS/1％BSAで洗浄した。次に抗ヒトμFITCラベ
ル抗体または抗マウスFITCラベル抗体を30分反応させた
後、PBS/1％BSAで洗浄し、200μlのPBS/1％BSAに懸濁し
た。その細胞をFACSCANにセットし測定した。その結果
は表１の「キメラH-CDRL」の項に示してある。この結果
より、キメラH-CDRL抗体はIgMキメラ抗体とほぼ同等のF
as抗原発現細胞特異的結合能を持つことが明らかとなっ
た。
トロール細胞のWR19Lに対し行なった。PBS/1％BSAで洗
浄した1×105細胞に正常ヤギ血清20μlを反応させブロ
ッキングした後、抗GST抗体培養上清、精製ヒトIgM(100
ng/ml)、CH11(100ng/ml)、キメラ抗体(100ng/ml)、キメ
ラH-CDRL抗体(100ng/ml)をそれぞれ40μl、室温で30分
反応させPBS/1％BSAで洗浄した。次に抗ヒトμFITCラベ
ル抗体または抗マウスFITCラベル抗体を30分反応させた
後、PBS/1％BSAで洗浄し、200μlのPBS/1％BSAに懸濁し
た。その細胞をFACSCANにセットし測定した。その結果
は表１の「キメラH-CDRL」の項に示してある。この結果
より、キメラH-CDRL抗体はIgMキメラ抗体とほぼ同等のF
as抗原発現細胞特異的結合能を持つことが明らかとなっ
た。
【００５１】4-2)MTTアッセイ 次に、キメラ抗体のアポトーシス活性を、WR19L12aとWR
19L細胞を用いて、実施例1の5)と同様のMTTアッセイ法
で測定した。抗体としては、精製CH11（100ng/ml、10ng
/ml、1ng/ml）、キメラ培養上清（100ng/ml、10ng/ml、
1ng/ml）、キメラH-CDRL抗体培養上清（100ng/ml、10ng
/ml、1ng/ml）、DMEM10％FCSをそれぞれ反応させた。細
胞の生存率を細胞をまかないウェルの吸光度を0％と
し、DMEM/10％FCSのウェルを100％として示した。その
結果を図４に示す。キメラH-CDRL抗体はアポトーシス活
性をキメラ抗体とほぼ同様に持つことが明らかとなり、
L鎖をヒト化した影響はみられなかった。
19L細胞を用いて、実施例1の5)と同様のMTTアッセイ法
で測定した。抗体としては、精製CH11（100ng/ml、10ng
/ml、1ng/ml）、キメラ培養上清（100ng/ml、10ng/ml、
1ng/ml）、キメラH-CDRL抗体培養上清（100ng/ml、10ng
/ml、1ng/ml）、DMEM10％FCSをそれぞれ反応させた。細
胞の生存率を細胞をまかないウェルの吸光度を0％と
し、DMEM/10％FCSのウェルを100％として示した。その
結果を図４に示す。キメラH-CDRL抗体はアポトーシス活
性をキメラ抗体とほぼ同様に持つことが明らかとなり、
L鎖をヒト化した影響はみられなかった。
【００５２】5）ヒト化抗体シリーズの作製 BCMG-CDRH（μ）ベクター、BCMG-CDRLベクター、BCMG-J
ベクターをCHO細胞にリポフェクチン法を用いて同時に
トランスフェクションし、37℃12時間培養した後、96穴
プレートにまき直し、ネオマイシン500μg/mlを含むDME
M/10％FCSで選択した。その後ELISAにて最も発現量の多
いクローンを選択した。
ベクターをCHO細胞にリポフェクチン法を用いて同時に
トランスフェクションし、37℃12時間培養した後、96穴
プレートにまき直し、ネオマイシン500μg/mlを含むDME
M/10％FCSで選択した。その後ELISAにて最も発現量の多
いクローンを選択した。
【００５３】6）ヒト化抗体の性質 6-1)フローサイトメトリー ヒト化H鎖抗体としてCDR-HV1a〜c、CDR-HG3a、CDR-HG3b
を用いたヒト化抗体に関して、フローサイトメトリーを
Fas発現細胞WR19L12aとコントロール細胞のWR19Lに対し
行なった。PBS/1％BSAで洗浄した1×105細胞に正常ヤギ
血清20μlを反応させブロッキングした後、抗GST抗体培
養上清、精製ヒトIgM(100ng/ml)、CH11(100ng/ml)、キ
メラ抗体(100ng/ml)、ヒト化抗体(100ng/ml)をそれぞれ
40μl、室温で30分反応させPBS/1％BSAで洗浄した。次
に抗ヒトμFITCラベル抗体または抗マウスFITCラベル抗
体を30分反応させた後、PBS/1％BSAで洗浄し、200μlの
PBS/1％BSAに懸濁した。その細胞をFACSCANにセットし
測定した。その結果は表１に示してある（表中では、各
ヒト化抗体を、用いたH鎖抗体の名称「CDR-HV1a〜c、CD
R-HG3a、CDR-HG3b」で表した）。この結果より、各ヒト
化抗体はIgMキメラ抗体およびキメラH-CDRL抗体とほぼ
同等のFas抗原発現細胞特異的結合能を持つことが明ら
かとなった。
を用いたヒト化抗体に関して、フローサイトメトリーを
Fas発現細胞WR19L12aとコントロール細胞のWR19Lに対し
行なった。PBS/1％BSAで洗浄した1×105細胞に正常ヤギ
血清20μlを反応させブロッキングした後、抗GST抗体培
養上清、精製ヒトIgM(100ng/ml)、CH11(100ng/ml)、キ
メラ抗体(100ng/ml)、ヒト化抗体(100ng/ml)をそれぞれ
40μl、室温で30分反応させPBS/1％BSAで洗浄した。次
に抗ヒトμFITCラベル抗体または抗マウスFITCラベル抗
体を30分反応させた後、PBS/1％BSAで洗浄し、200μlの
PBS/1％BSAに懸濁した。その細胞をFACSCANにセットし
測定した。その結果は表１に示してある（表中では、各
ヒト化抗体を、用いたH鎖抗体の名称「CDR-HV1a〜c、CD
R-HG3a、CDR-HG3b」で表した）。この結果より、各ヒト
化抗体はIgMキメラ抗体およびキメラH-CDRL抗体とほぼ
同等のFas抗原発現細胞特異的結合能を持つことが明ら
かとなった。
【００５４】6-2)MTTアッセイ 次に、ヒト化抗体（CDR-HV1a〜c、CDR-HG3a、CDR-HG3b
をH鎖として持つもの）のアポトーシス活性を、WR19L12
aとWR19L細胞を用いて、実施例1の5)と同様のMTTアッセ
イ法で測定した。抗体としては、精製CH11（100ng/ml、
10ng/ml、1ng/ml）、キメラ培養上清（100ng/ml、10ng/
ml、1ng/ml）、上記５種類のヒト化抗体培養上清（100n
g/ml、10ng/ml、1ng/ml）、DMEM/10％FCSをそれぞれ反
応させた。細胞の生存率を細胞を蒔かないウェルの吸光
度を0％とし、DMEM/10％FCSのウェルを100％として示し
た。その結果を図１０および図１１に示す。この結果よ
り、ヒト化抗体は、IgM型キメラ抗体とほぼ同様のアポ
トーシス活性を持つことが明らかとなった。
をH鎖として持つもの）のアポトーシス活性を、WR19L12
aとWR19L細胞を用いて、実施例1の5)と同様のMTTアッセ
イ法で測定した。抗体としては、精製CH11（100ng/ml、
10ng/ml、1ng/ml）、キメラ培養上清（100ng/ml、10ng/
ml、1ng/ml）、上記５種類のヒト化抗体培養上清（100n
g/ml、10ng/ml、1ng/ml）、DMEM/10％FCSをそれぞれ反
応させた。細胞の生存率を細胞を蒔かないウェルの吸光
度を0％とし、DMEM/10％FCSのウェルを100％として示し
た。その結果を図１０および図１１に示す。この結果よ
り、ヒト化抗体は、IgM型キメラ抗体とほぼ同様のアポ
トーシス活性を持つことが明らかとなった。
【００５５】
【発明の効果】本発明によって、Fas抗原を発現してい
る細胞に結合するヒト化抗Fas抗体、Fas抗原を発現して
いる細胞のアポトーシスを制御する活性を有するヒト化
抗Fas抗体が得られた。これらの抗体はヒトに対する免
疫原性が少ないので、体内診断用薬剤や、自己免疫疾患
などの疾病の治療のための薬剤としての利用が期待され
る。
る細胞に結合するヒト化抗Fas抗体、Fas抗原を発現して
いる細胞のアポトーシスを制御する活性を有するヒト化
抗Fas抗体が得られた。これらの抗体はヒトに対する免
疫原性が少ないので、体内診断用薬剤や、自己免疫疾患
などの疾病の治療のための薬剤としての利用が期待され
る。
【００５６】
【配列表】 （１）出願人の氏名又は名称： 株式会社医学生物学研究所 （２）発明の名称： ヒト化抗体 （３）整理番号： Ｍ３−００２ （４）出願番号： （５）出願日： （６）配列の数：３２ 配列番号 : 1 配列の長さ : 135 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 2 配列の長さ : 132 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg 130 配列番号 : 3 配列の長さ : 159 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Glu Asp His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys 1 5 10 15 Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp 20 25 30 Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser 35 40 45 Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val 50 55 60 Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg 65 70 75 80 Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro 85 90 95 Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn 100 105 110 Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg 115 120 125 Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr 130 135 140 Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp 145 150 155 配列番号 : 4 配列の長さ : 133 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser 35 40 45 Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gln Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg 130 配列番号 : 5 配列の長さ : 16 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 配列番号 : 6 配列の長さ : 7 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 配列番号 : 7 配列の長さ : 9 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala 1 5 配列番号 : 8 配列の長さ : 135 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 9 配列の長さ : 135 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 10 配列の長さ : 135 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 11 配列の長さ : 135 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 12 配列の長さ : 135 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Asn Asp Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 13 配列の長さ : 5 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Asp Tyr Asn Met His 1 5 配列番号 : 14 配列の長さ : 17 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser 配列番号 : 15 配列の長さ : 7 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 配列番号 : 16 配列の長さ : 113 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gln Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg 配列番号 : 17 配列の長さ : 20 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly 20 配列番号 : 18 配列の長さ : 117 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 配列番号 : 19 配列の長さ : 116 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : タンパク質 配 列 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Asn Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala 115 配列番号 : 20 配列の長さ : 405 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 1 .. 405 特徴を決定した方法 : E 配 列 ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA ACT GCA GGC 48 Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 GTC CAC TCT GAG GTC CAG CTT CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAA 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys 20 25 30 CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 ACT GAC TAC AAC ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT 192 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 GAG TGG ATT GGA TAT ATT TAT CCT TAC AAT GGT GGT ACT GGC TAC AAC 240 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 65 70 75 80 CAG AAG TTC AAG AGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAT TCC TCC AGC 288 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser 85 90 95 ACA GCC TAC ATG GAG CTC CGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 TAT TAC TGT GCA AGA AGT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 405 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 配列番号 : 21 配列の長さ : 396 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 1 .. 396 特徴を決定した方法 : E 配 列 ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG ATG TTC TGG ATT CCT GCT 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 TCC AGC AGT GAT GTT GTG ATG ACC CAA AGT CCA CTC TCC CTG CCT GTC 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 AGT CTT GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT AAG AGC CTT 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 GTA CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT TCT 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT TAT TTC TGC 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG GCG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG 384 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 GAA ATC AAA CGG 396 Glu Ile Lys Arg 130 配列番号 : 22 配列の長さ : 480 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 1 .. 467 特徴を決定した方法 : E 配 列 ATG GAG GAC CAT TTG CTT TTC TGG GGA GTC CTG GCG GTT TTT ATT AAG 48 Met Glu Asp His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys 1 5 10 15 GCT GTT CAT GTG AAA GCC CAA GAA GAT GAA AGG ATT GTT CTT GTT GAC 96 Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp 20 25 30 AAC AAA TGT AAG TGT GCC CGG ATT ACT TCC AGG ATC ATC CGT TCT TCC 144 Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser 35 40 45 GAA GAT CCT AAT GAG GAC ATT GTG GAG AGA AAC ATC CGA ATT ATT GTT 192 Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val 50 55 60 CCT CTG AAC AAC AGG GAG AAT ATC TCT GAT CCC ACC TCA CCA TTG AGA 240 Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg 65 70 75 80 ACC AGA TTT GTG TAC CAT TTG TCT GAC CTC TGT AAA AAA TGT GAT CCT 288 Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro 85 90 95 ACA GAA GTG GAG CTG GAT AAT CAG ATA GTT ACT GCT ACC CAG AGC AAT 336 Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn 100 105 110 ATC TGT GAT GAA GAC AGT GCT ACA GAG ACC TGC TAC ACT TAT GAC AGA 384 Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg 115 120 125 AAC AAG TGC TAC ACA GCT GTG GTC CCA CTC GTA TAT GGT GGT GAG ACC 432 Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr 130 135 140 AAA ATG GTG GAA ACA GCC TTA ACC CCA GAT GCC TGC TAT CCT GAC TAA 480 Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp 145 150 155 配列番号 : 23 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 SAGGTSMAGC TKSAGSAGTC W 21 配列番号 : 24 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 TGMGGAGATK GTGASMGTGG T 21 配列番号 : 25 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GAHRTTKTGM TGACCCARWC T 21
配列番号 : 26 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 CCGTTTBAKY TCCAGCTTGG T 21 配列番号 : 27 配列の長さ : 19 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GGGAGTGCAT CCGCCCCAA 19 配列番号 : 28 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GTAGCAGGTG CCAGCTGTGT 20 配列番号 : 29 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 ACTGTGGCTG CACCATCTGT 20 配列番号 : 30 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 ACACTCTCCC CTGTTGAAGC 20 配列番号 : 31 配列の長さ : 24 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 CAAGAAGATG AAAGGATTGT TCTT 24 配列番号 : 32 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GTCAGGATAG CAGGCATCTG G 21
配列番号 : 26 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 CCGTTTBAKY TCCAGCTTGG T 21 配列番号 : 27 配列の長さ : 19 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GGGAGTGCAT CCGCCCCAA 19 配列番号 : 28 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GTAGCAGGTG CCAGCTGTGT 20 配列番号 : 29 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 ACTGTGGCTG CACCATCTGT 20 配列番号 : 30 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 ACACTCTCCC CTGTTGAAGC 20 配列番号 : 31 配列の長さ : 24 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 CAAGAAGATG AAAGGATTGT TCTT 24 配列番号 : 32 配列の長さ : 21 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 GTCAGGATAG CAGGCATCTG G 21
【図１】抗Fasキメラ抗体の重鎖の発現ベクターの構築
方法を示す図である。
方法を示す図である。
【図２】抗Fasキメラ抗体の軽鎖の発現ベクターの構築
方法を示す図である。
方法を示す図である。
【図３】抗Fas抗体Ｊ鎖の発現ベクターの構築方法を示
す図である。
す図である。
【図４】CH11、抗Fasキメラ抗体、およびキメラH-CDRL
についてのMTTアッセイの結果を示す図である。
についてのMTTアッセイの結果を示す図である。
【図５】CH11のL鎖（CH11L）のアミノ酸配列、抗Fasヒ
ト化抗体L鎖（CDRL）のアミノ酸配列、GM607'CLのアミ
ノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ．は、CH1
1Lの配列と同一であることを示し、−は配列が未知であ
ることを示し、*は３つの配列においてアミノ酸が等し
いことを示す。
ト化抗体L鎖（CDRL）のアミノ酸配列、GM607'CLのアミ
ノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ．は、CH1
1Lの配列と同一であることを示し、−は配列が未知であ
ることを示し、*は３つの配列においてアミノ酸が等し
いことを示す。
【図６】CH11のH鎖（CH11H）のアミノ酸配列と、HG3の
アミノ酸配列およびHV1Gのアミノ酸配列とのアラインメ
ントを示す図である。 ．は、CH11Hの配列と同一である
ことを示し、−は配列が未知であることを示し、*は２
つの配列においてアミノ酸が等しいことを示す。
アミノ酸配列およびHV1Gのアミノ酸配列とのアラインメ
ントを示す図である。 ．は、CH11Hの配列と同一である
ことを示し、−は配列が未知であることを示し、*は２
つの配列においてアミノ酸が等しいことを示す。
【図７】CH11のH鎖（CH11H）、CDR-HV1a、CDR-HV1b、CD
R-HV1c、およびHV1Gのアミノ酸配列のアラインメントを
示す図である。 ．は、CH11Hの配列と同一であることを
示し、−は配列が未知であることを示し、*は全ての配
列においてアミノ酸が等しいことを示す。
R-HV1c、およびHV1Gのアミノ酸配列のアラインメントを
示す図である。 ．は、CH11Hの配列と同一であることを
示し、−は配列が未知であることを示し、*は全ての配
列においてアミノ酸が等しいことを示す。
【図８】CH11のH鎖（CH11H）、CDR-HG3a、CDR-HG3b、お
よびHG3のアミノ酸配列のアラインメントを示す図であ
る。 ．は、CH11Hの配列と同一であることを示し、−は
配列が未知であることを示し、*は全ての配列において
アミノ酸が等しいことを示す。
よびHG3のアミノ酸配列のアラインメントを示す図であ
る。 ．は、CH11Hの配列と同一であることを示し、−は
配列が未知であることを示し、*は全ての配列において
アミノ酸が等しいことを示す。
【図９】抗Fas抗体可変領域の合成手法を模式的に示す
図である。
図である。
【図１０】CH11、抗Fasキメラ抗体、ならびに、CDR-HV1
a、CDR-HV1b、およびCDR-HV1cをH鎖に持つヒト化抗体に
ついてのMTTアッセイの結果を示す図である。
a、CDR-HV1b、およびCDR-HV1cをH鎖に持つヒト化抗体に
ついてのMTTアッセイの結果を示す図である。
【図１１】CH11、抗Fasキメラ抗体、ならびに、CDR-HG3
aおよびCDR-HG3bをH鎖に持つヒト化抗体についてのMTT
アッセイの結果を示す図である。
aおよびCDR-HG3bをH鎖に持つヒト化抗体についてのMTT
アッセイの結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA61 CA01 DA02 DA03 EA10 GA04 GA11 HA08 4B064 AG01 AG26 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90Y AA91Y AA93Y AB01 AB04 AB05 AB06 BA02 CA24 CA44 CA46
Claims (22)
- 【請求項１】 ＣＤＲ領域のアミノ酸配列がヒト以外の
哺乳動物の抗Fas抗体のアミノ酸配列または該アミノ酸
配列を１個または数個改変したアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ領域以外の領域のアミノ酸配列がヒトの抗体のア
ミノ酸配列または該アミノ酸配列を１個または数個改変
したアミノ酸配列からなり、かつFas抗原を発現してい
る細胞に結合する活性を有する、組換え抗体。 - 【請求項２】 ＣＤＲ領域のアミノ酸配列がヒト以外の
哺乳動物の抗Fas抗体のアミノ酸配列または該アミノ酸
配列を１個または数個改変したアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ領域以外の領域のアミノ酸配列がヒトの抗体のア
ミノ酸配列または該アミノ酸配列を１個または数個改変
したアミノ酸配列からなり、かつFas抗原を発現してい
る細胞のアポトーシスを制御する活性を有する、組換え
抗体。 - 【請求項３】 Fas抗原を発現している細胞のアポトー
シスを誘起する活性を有する、請求項２記載の組換え抗
体。 - 【請求項４】 軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番
号：５に記載されたものである、請求項１〜３のいずれ
かに記載の組換え抗体。 - 【請求項５】 軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番
号：６に記載されたものである、請求項１〜３のいずれ
かに記載の組換え抗体。 - 【請求項６】 軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番
号：７に記載されたものである、請求項１〜３のいずれ
かに記載の組換え抗体。 - 【請求項７】 軽鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列がマウ
スの抗Fas抗体のアミノ酸配列に由来する、請求項１〜
３のいずれかに記載の組換え抗体。 - 【請求項８】 軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番
号：４に記載されたものである、請求項１〜３のいずれ
かに記載の組換え抗体。 - 【請求項９】 重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番
号：１３に記載されたものである、請求項１〜３のいず
れかに記載の組換え抗体。 - 【請求項１０】 重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列
番号：１４に記載されたものである、請求項１〜３のい
ずれかに記載の組換え抗体。 - 【請求項１１】 重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列
番号：１５に記載されたものである、請求項１〜３のい
ずれかに記載の組換え抗体。 - 【請求項１２】 重鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸配列がマ
ウスの抗Fas抗体のアミノ酸配列に由来するものであ
る、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え抗体。 - 【請求項１３】 重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番
号：８、９、１０、１１または１２のいずれかに記載さ
れたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の組換
え抗体。 - 【請求項１４】 請求項１〜８のいずれかに記載の組換
え抗体の軽鎖をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１５】 請求項１〜３または９〜１３のいずれ
かに記載の組換え抗体の重鎖をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１６】 請求項１４記載のＤＮＡを発現可能に
含むベクター。 - 【請求項１７】 請求項１５記載のＤＮＡを発現可能に
含むベクター。 - 【請求項１８】 請求項１６記載のベクターで形質転換
された細胞。 - 【請求項１９】 請求項１７記載のベクターで形質転換
された細胞。 - 【請求項２０】 請求項１６記載のベクター及び請求項
１７記載のベクターで共形質転換された細胞。 - 【請求項２１】 細胞が哺乳動物由来の細胞である請求
項１８〜２０のいずれかに記載の細胞。 - 【請求項２２】 請求項２０または２１記載の細胞を培
養し、発現された組換え抗体を回収する工程を含む、組
換え抗体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10204318A JP2000014383A (ja) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | ヒト化抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10204318A JP2000014383A (ja) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | ヒト化抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000014383A true JP2000014383A (ja) | 2000-01-18 |
Family
ID=16488505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10204318A Pending JP2000014383A (ja) | 1998-07-03 | 1998-07-03 | ヒト化抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000014383A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8268617B2 (en) | 2002-06-14 | 2012-09-18 | Immunogen, Inc. | Anti-IGF-I receptor antibodies, DNAs, vectors, host cells and genetic constructs |
| WO2018139608A1 (ja) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | 株式会社Ａ－Ｃｌｉｐ研究所 | 感染性疾患または炎症性疾患の予防および／または治療剤 |
| CN109641970A (zh) * | 2016-07-06 | 2019-04-16 | 加拿大国家研究委员会 | 穿过血脑屏障的人源化抗体及其用途 |
-
1998
- 1998-07-03 JP JP10204318A patent/JP2000014383A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8268617B2 (en) | 2002-06-14 | 2012-09-18 | Immunogen, Inc. | Anti-IGF-I receptor antibodies, DNAs, vectors, host cells and genetic constructs |
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| CN109641970B (zh) * | 2016-07-06 | 2022-11-18 | 加拿大国家研究委员会 | 穿过血脑屏障的人源化抗体及其用途 |
| WO2018139608A1 (ja) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | 株式会社Ａ－Ｃｌｉｐ研究所 | 感染性疾患または炎症性疾患の予防および／または治療剤 |
| KR20190108152A (ko) | 2017-01-27 | 2019-09-23 | 가부시키가이샤 에이클립켄규쇼 | 감염성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및/또는 치료제 |
| EP4317431A2 (en) | 2017-01-27 | 2024-02-07 | A-Clip Institute, Co., Ltd. | Preventive and/or therapeutic agent for infectious diseases or inflammatory diseases |
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