JPH0576385A

JPH0576385A - キメラ抗体およびその用途

Info

Publication number: JPH0576385A
Application number: JP3294464A
Authority: JP
Inventors: Susumu Iwasa; 進岩佐; Hiroko Tada; 宏子多田; Takeshi Watanabe; 武渡辺
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-12-18
Filing date: 1991-11-11
Publication date: 1993-03-30
Also published as: EP0491351A2; EP0491351A3; CA2057951A1

Abstract

(57)【要約】【目的】抗体のヒト・キメラ化により、免疫原性の小さ
い抗ヒトフィブリン、抗ウロキナーゼ類および抗ヒトフ
ィブリン／抗ウロキナーゼ類二重特異性キメラ・モノク
ローナル抗体を提供する。また該二重特異性キメラ抗体
にウロキナーゼ類を免疫結合させてなる血栓溶解蛋白複
合体を提供する。【構成】抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域または／お
よび抗ウロキナーゼ類抗体軽鎖可変領域とヒト抗体軽鎖
定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗体、また
は／および、抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域または
／および抗ウロキナーゼ類抗体重鎖可変領域とヒト抗体
重鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗体。
該抗体の軽鎖または／および重鎖の可変または／および
定常領域をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。該抗体
を発現させうる真核細胞。該二重特異性抗体のウロキナ
ーゼ類認識部位にウロキナーゼ類を免疫結合させてなる
血栓溶解蛋白複合体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトフィブリン，ウロ
キナーゼ類およびヒトフィブリン／ウロキナーゼ類に特
異的なキメラ・モノクローナル抗体、該抗体をコードす
るデオキシリボ核酸、該抗体を産生する真核細胞および
該抗体を含有する血栓溶解蛋白複合体に関する。本明細
書においてアミノ酸およびペプチドはＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略記法によ
り表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、ア
ミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明
示しなければＬ体を示すものとする。Ｇln：グルタミン残基Ａsp：アスパラギン酸残基Ｐro：プロリン残基Ｔyr ：チロシン残基Ｖal：バリン残基Ｌys：リジン残基Ｇlu：グルタミン酸残基Ａla：アラニン残基Ａsn：アスパラギン残基Ｌeu：ロイシン残基Ｐhe：フェニルアラニン残基Ｇly：グリシン残基Ｈis：ヒスチジン残基Ｓer：セリン残基Ｔhr：スレオニン残基Ｉle：イソロイシン残基Ｔrp：トリプトファン残基Ａrg：アルギニン残基Ｍet：メチオニン残基特にことわらない限り、配列の左から右への方向はアミ
ノ末端からカルボキシ末端への方向を示し、配列の両末
端の−は、結合手を示すものとする。本明細書において
デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡと略記することがあ
る）のポリマー、又はオリゴマーは下記の如き略号の配
列により表記し、Ａ：２’−デオキシアデニル酸残基Ｃ：２’−デオキシシチジル酸残基Ｇ：２’−デオキシグアニル酸残基Ｔ：チミジル酸残基特にことわらない限り、配列の左から右への方向は５’
から３’への方向を示すものとする。

【０００２】

【従来の技術】ケーラーとミルスタインにより開発され
たハイブリドーマを用いるモノクローナル抗体（以下、
ＭoＡbと略記することがある）の製造法は、単一の特異
性を示す抗体を大量かつ安定的に得られるという利点を
有しており、その技術は広範囲に応用されている［Koeh
ler, G., Milstein, C. :ネイチャー（Nature），２５
６，４９５（１９７５）］。特に最近では、各種抗原の
検出・精製あるいは診断薬の開発だけでなく、疾病の予
防薬や治療薬の創製においても大きく寄与しつつある。
しかし、予防薬、治療薬としてＭoＡbを用いる場合、ヒ
トにとって異種蛋白であるＭoＡb例えば、マウスＭoＡb
を投与することは、ヒト体内でのマウスＭoＡbに対する
抗体の産生による治療効果の低減あるいは重篤なアレル
ギー反応を誘起する危険性を伴う。したがって予防薬、
治療薬としては、ヒトＭoＡbを用いることがはるかに望
ましいが、一般にその作製技術はマウスのそれに比べて
著しく遅れており、実際の成功例も少ない。ヒトＭoＡb
はヒト−ヒト・ハイブリドーマ，マウス−ヒト・ヘテロハ
イブリドーマあるいはヒトリンパ球のエプスタインー・
バー・ウイルス（以下、ＥＢＶと略記することがある）
トランスホーマントなどにより産生されるが、後２者は
抗体産生能の安定性および増殖能に劣るため、前者のヒ
ト−ヒト・ハイブリドーマによる産生が望ましい。しか
し、一般にヒト−ヒト・ハイブリドーマ作成における融
合効率は非常に低く、このため医薬としてのヒトＭoＡb
の開発は著しく遅れている。

【０００３】しかし、前述のようにモノクローナル抗体
の医薬への応用はその期待がきわめて大きく、特に癌に
対するミサイル療法や抗体ターゲティング化血栓溶解療
法への臨床応用については著しい進歩を遂げつつある
［R. K. Oldhamら：ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・レスポンス・モディファイアーズ（J. Biol. Respons
eModifiers)，２，１（１９８３），E. S. Vittetaら：
サイエンス（Science），２１９，６４４（１９８
３），E. Haberら：サイエンス（Science），２４３，
５１（１９８９），H. K. Goldら：サーキュレーション
（Circulation），７７，６７０（１９８８）］。抗体
ターゲティング化血栓溶解療法においては、ストレプト
キナーゼ（以下、ＳＫと略記することがある）、ウロキ
ナーゼ（以下、ＵＫと略記することがある）、テイッシ
ュ・プラスミノーゲン・アクチベータ（以下、ＴＰＡと
略記することがある）、プロウロキナーゼ（以下、Pro
ＵＫと略記することがある）などの血栓溶解に関わる
酵素やその前駆体などの血栓溶解蛋白を血栓部位、特に
血栓に含まれるフィブリンへ選択的に運搬する抗体を用
いる療法が検討されている［M. S. Rungeら：プロシー
ディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.Ｕ
ＳＡ），８４，７６５９（１９８９），C.Bodeら：ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol. Chem.)，２６４，９４４（１９８９）］。また、
血栓溶解剤を保持しつつ、標的血栓部位のフィブリンに
特異的に結合可能な二重特異性抗体も開発された［T. K
urokawaら：バイオテクノロジー（Bio/Technology），
７，１１６３（１９８９）、ヨーロッパ公開第３６３７
１２号公報］。これらの抗体ターゲティング化血栓溶解
剤では、上記血栓溶解蛋白の副作用を軽減するために、
フイブリノーゲンには反応せず、フィブリンにのみ特異
的に結合する抗体が用いられている。［B. L. Pacella,
Jr.ら：モレキュラー・イムノロジー（Mole. Immuno
l.），２０，５２１（１９８３），K. Y. Huiら：サイ
エンス（Science），２２２，１１２９（１９８
３）］。しかしこれらの抗フィブリン特異抗体や抗ＴＰ
Ａ抗体，抗ＵＫ抗体などの抗血栓溶解蛋白抗体はマウス
型のものであり、ヒトに対する投与では、患者において
免疫応答を惹起するため、投与回数を重ねるにつれて抗
体の標的抗原に対するターゲティング効果が徐々に減少
し、循環系からの迅速なクリアランスに帰せられること
がある。

【０００４】一方、最近の遺伝子組換え技術の進歩は、
ある動物種から導かれた抗体の可変領域と別の動物種か
ら導かれた抗体の定常領域とが結合しているキメラ抗体
の生産を可能とした［D. R. Shawら：ジャーナル・オブ
・イムノロジー（J. Immunol.），１３８，４５３４
（１９８７），L. K. Sunら：プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユ
ーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８
４，２１４（１９８７），M. S. Neubergerら：ネーチ
ャー（Nature），３１４，２６８（１９８５），S. L.
Morrisonら：プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc.
Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１，６８５１（１９８
４）など］。二重特異性抗体についても癌ターゲティ
ングに応用可能なマウス−ヒト・キメラ抗体の報告があ
る［特開平２−１４５１８７］。この技術を用いたキメ
ラ抗体としては、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定
常領域とを結合させたマウス−ヒト・キメラ抗体が多く
作製されている。かかるキメラ抗体は、その免疫原性の
多くを担うＦc部分がヒト型であるため、ヒトへの投与
に際し有利に用いられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、予防薬
や治療薬としてＭoＡbを用いる場合、ヒトにとって異種
蛋白であるＭoＡb例えば、マウスＭoＡbを投与すること
は、ヒト体内でのマウスＭoＡbに対する抗体の産生によ
る治療効果の低減あるいは重篤なアレルギー反応を誘起
する危険性を伴う。したがって、ヒトＭoＡbを用いるこ
とがはるかに望ましいが、作製技術もマウスのそれに比
べて著しく遅れているため、医薬としてのヒトＭoＡbの
開発は著しく遅れている。このため、臨床応用可能な免
疫原性の低い抗体の利用が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはかかる技術
的背景のもとに、血栓溶解蛋白のターゲティング化に用
いうる抗ヒトフィブリン特異抗体，抗ＵＫ抗体および抗
フィブリン／抗ＵＫ二重特異性抗体のキメラ化について
鋭意検討した。その結果、抗ヒトフィブリン特異抗体産
生ハイブリドーマおよび抗ＵＫ抗体産生ハイブリドーマ
よりそれぞれＤＮＡあるいはＲＮＡを抽出し、ヒトフィ
ブリンおよびＵＫとの結合に関与する抗体の可変領域を
コードする塩基配列を決定し、さらにヒト抗体の定常領
域をコードする塩基配列との組合せにより、ヒトフィブ
リンおよびＵＫと特異的に結合できるキメラ抗体、その
産生細胞、およびキメラ抗体をコードするＤＮＡを作製
した。さらには、これら２種のキメラ抗体をコードする
遺伝子を動物細胞に移入し、二重特異性キメラ抗体産生
細胞を作製した。すなわち本発明は、（１）式Ａ： -Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu AspSer Asp Gly L
ys Thr Tyr Leu Asn-,〔配列番号１〕Ｂ： -Leu Val Ser Lys Leu Tyr Ser- 〔配列番号２〕
およびＣ： -Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Tyr-〔配列番号
３〕で示されるポリペプチド鎖Ａ，ＢおよびＣの少なくとも
一つを含む抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域とヒト抗
体軽鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗
体、（２）上記抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域をコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡおよび（３）上記（２）のＤＮＡにヒト抗体軽鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡをさらに含有するＤＮＡであり、また本
発明は、（４）式Ｄ： -Asn Tyr Asp Met Ser-〔配列番号４〕，Ｅ： -Ser Ile Ser Val Gly Gly Thr ThrTyr Tyr Pro A
sp Ser Met Lys Gly-〔配列番号５〕およびＦ： -Gly Asn Phe Ala Asp Ala Met AspTyr-〔配列番
号６〕で示されるポリペプチド鎖Ｄ，ＥおよびＦの少なくとも
一つを含む抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域とヒト抗
体重鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗
体、（５）上記抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域をコード
するＤＮＡを含有するＤＮＡおよび（６）上記（５）のＤＮＡにヒト抗体重鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡをさらに含有するＤＮＡである。

【０００７】また本発明は、（７）式Ｇ： -Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met Tyr-
〔配列番号１３〕, Ｈ： -Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser- 〔配列番号１
４〕およびＩ： -Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr-〔配列
番号１５〕で示されるポリペプチド鎖Ｇ，ＨおよびＩの少なくとも
一つを含むＵＫ類認識抗体軽鎖可変領域とヒト抗体軽鎖
定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗体、（８）上記ＵＫ類認識抗体軽鎖可変領域をコードするＤ
ＮＡを含有するＤＮＡ、および（９）上記（８）のＤＮＡにヒト抗体軽鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡをさらに含有するＤＮＡであり、また本
発明は、（１０）式Ｊ： -Ser Asp Tyr Ala Trp Asn-〔配列番号１６〕, Ｋ： -Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn
Pro Ser Leu Lys Ser-〔配列番号１７〕およびＬ： -Leu Gly Asp Phe Asp Ala Gly AspTyr Phe Asp T
yr-〔配列番号１８〕で示されるポリペプチド鎖Ｊ，ＫおよびＬの少なくとも
一つを含むＵＫ類認識抗体重鎖可変領域とヒト抗体重鎖
定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗体、（１１）上記ＵＫ類認識抗体重鎖可変領域をコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ，および（１２）上記（１１）のＤＮＡにヒト抗体重鎖定常領域
をコードするＤＮＡをさらに含有するＤＮＡである。ま
た本発明は、（１３）ヒトフィブリンおよびＵＫ類をそれぞれ特異的
に認識する２種の軽鎖および重鎖可変領域を含有し、さ
らに全ての軽鎖および重鎖定常領域がヒト抗体定常領域
を含有している二重特異性キメラモノクローナル抗体で
ある。（１４）さらに本発明は、ヒトフィブリンに結合するキ
メラ抗体フラグメントとウロキナーゼ類に結合するキメ
ラ抗体フラグメントを含有し、後者のキメラ抗体フラグ
メントにウロキナーゼ類を免疫結合させてなる血栓溶解
蛋白複合体である。また本発明は、上記（１）、（４）、（７）、（１０）
または（１３）のキメラモノクローナル抗体を発現させ
うる真核細胞に関する。さらにまた本発明は、マウス−
ヒト・キメラ抗ヒトフィブリン特異抗体産生マウス骨髄
腫細胞トランスホーマントＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３、
マウス−ヒト・キメラ抗ヒトＵＫ抗体産生マウスハイブ
リドーマトランスホーマントＳＵ／Ｓ−９.２１および
マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフィブリン／抗ＵＫ類二重
特異性抗体産生マウスハイブリドーマトランスホーマン
トＳＵＳＦ／Ｓ−８.４に関する。

【０００８】本発明のキメラモノクローナル抗体におけ
る抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域としては、上記式
Ａ，ＢおよびＣで示されるポリペプチド鎖Ａ，Ｂおよび
Ｃの少なくとも一つを含むものであればいずれでもよ
く、ヒトフィブリンに対する高い親和性および特異性を
示す抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域が好ましいが、
なかでもポリペプチド鎖Ａ，ＢおよびＣの二種以上、と
りわけポリペプチド鎖Ａ，ＢおよびＣの三種を、ＣＤＲ
（complementaritydeterminig region：相補性決定領
域）として含有する抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域
が好ましく、さらに下記式（I）で示されるアミノ酸配
列を含むものが好ましい。 Asp Val Val Met Ala Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Phe Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys （I）〔配列番号７〕

【０００９】本発明のキメラモノクローナル抗体におけ
る抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域としては、上記式
Ｄ，ＥおよびＦで示されるポリペプチド鎖Ｄ，Ｅおよび
Ｆの少なくとも一つを含むものであればいずれでもよ
く、ヒトフィブリンに対する高い新和性および特異性を
示す抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域が好ましいが、
なかでもポリペプチド鎖Ｄ，ＥおよびＦの二種以上、と
りわけポリペプチド鎖Ｄ，ＥおよびＦの三種を、ＣＤＲ
として含有する抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域が好
ましく、さらに下記式（II）で示されるアミノ酸配列を
含むものが好ましい。 Asp Val Gln Leu Trp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Asn Phe Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser （II）〔配列番号８〕

【００１０】本発明のキメラモノクローナル抗体として
は、上記抗ヒトフィブリン抗体軽鎖および重鎖可変領域
の少なくとも一つを含むキメラモノクローナル抗体が挙
げられ、なかでも上記抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領
域を含むキメラモノクローナル抗体が好ましく、さらに
上記抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域を含有するキメ
ラモノクローナル抗体が好ましい。本発明のキメラモノ
クローナル抗体における軽鎖および重鎖定常領域はヒト
抗体の軽鎖および重鎖定常領域であればいずれでもよ
く、例えばアミノ酸配列が公知のヒト抗体軽鎖および重
鎖定常領域をそれぞれ使用することができ、上記抗ヒト
フィブリン抗体軽鎖および重鎖可変領域と組み合わせる
ことにより、本発明のキメラモノクローナル抗体の軽鎖
および重鎖が得られる。本発明のキメラモノクローナル
抗体としては、かくして得られる軽鎖および重鎖の少く
とも一つを含み、かつヒトフィブリンに対する親和性お
よび特異性を示すものであればいずれのものでもよい
が、なかでも上述の軽鎖および重鎖の両者を含有するも
のが好ましい。本発明のキメラＵＫ類認識抗体におい
て、ＵＫ類とは、一本鎖または二本鎖ＵＫ，低分子Ｕ
Ｋ，ＰroＵＫなどの総称であり、血栓溶解作用を示しか
つ抗体により認識可能なウロキナーゼの前駆体あるいは
誘導体等が含まれる。

【００１１】本発明のキメラモノクローナル抗体におけ
る抗ＵＫ類認識抗体軽鎖可変領域としては、上記式Ｇ，
ＨおよびＩで示されるポリペプチド鎖Ｇ，ＨおよびＩの
少なくとも一つを含むものであればいずれでもよく、Ｕ
Ｋ類に対する高い親和性および特異性を示す抗ＵＫ類認
識抗体軽鎖可変領域が好ましいが、なかでもポリペプチ
ド鎖Ｇ，ＨおよびＩの２種以上、とりわけポリペプチド
鎖Ｇ，ＨおよびＩの３種を、ＣＤＲとして含有するＵＫ
類認識抗体軽鎖可変領域が好ましく、さらに下記の（II
I）で示されるアミノ酸配列を含むものが好ましい。 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Val Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Ser Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg(III) 〔配列番号１９〕本発明のキメラモノクローナル抗体におけるＵＫ類認識
抗体重鎖可変領域としては、上記式Ｊ，ＫおよびＬで示
されるポリペプチド鎖Ｊ，ＫおよびＬの少なくとも一つ
を含むものであればいずれでもよく、ＵＫ類に対する高
い親和性および特異性を示すＵＫ類認識抗体重鎖可変領
域が好ましいが、なかでもポリペプチド鎖Ｊ，Ｋおよび
Ｌの２種以上、とりわけポリペプチド鎖Ｊ，ＫおよびＬ
の３種を、ＣＤＲとして含有するＵＫ類認識抗体重鎖可
変領域が好ましく、さらに下記の式（IV）で示されるア
ミノ酸配列を含むものが好ましい。 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Cly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asp Phe Asp Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser (IV) 〔配列番号２０〕

【００１２】本発明の軽鎖および重鎖可変領域をコード
しているＤＮＡは、これらのポリペプチドが真核細胞に
よって発現されるために必要なリーダーペプチドをコー
ドするＤＮＡをも含有していることが好ましく、なかで
も可変軽鎖ポリペプチドのリーダーペプチドをコードす
るＤＮＡ配列としては、実質上、式： Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu Thr ATG ATG AGT CCT GCC CAG TTC CTG TTT CTG TTA GTG CTC TGG ATT CGG GAA ACC Asn Gly AAC GGT（配列番号１１の核酸の第１５３〜２０１番目
および第６０３〜６１３番目の塩基配列）で示されるＤ
ＮＡ配列と同一であることが好ましく、可変重鎖ポリペ
プチドの発現のためには、リーダーペプチドのＤＮＡ配
列としては、実質上、式： Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly Val Gln ATG GAC TCC AGG CTC AAT TTA GTT TTC CTT GTC CTT ATT TTA AAA GGT GTC CAG Cys TGT（配列番号１２の核酸の第１５１〜１９６番目およ
び第３１４〜３２４番目の塩基配列）で示されるＤＮＡ
配列と同一であることが好ましい。ここに開示したリー
ダーペプチドのＤＮＡは翻訳開始シグナル、すなわち、
機能的なポリペプチドの翻訳を開始するＤＮＡをも含ん
でいる。しかしながらリーダーペプチドはフィブリンや
ＵＫ類との結合には関与しないので、特定の真核性リー
ダーペプチドの使用に限定されることはなく、他の真核
性リーダーペプチドをコードしているＤＮＡ配列をも本
発明の目的に使用できる。また本発明の軽鎖または重鎖
可変領域をコードするＤＮＡを、例えば部位特異的突然
変異の誘発などにより改変し、実質上、本発明と同一の
キメラ抗体に翻訳されるならば、本発明の範囲内に含ま
れる。かかる操作により、ヒトフィブリンあるいは／お
よびＵＫ類に対する親和性および特異性に好ましい変化
をもたらすキメラ抗体が得られることがある。

【００１３】本発明の軽鎖および重鎖可変領域をコード
するＤＮＡは、ヒトフィブリンあるいはＵＫ類に対する
特異性を有するＭoＡbを産生するマウスハイブリドーマ
由来のゲノムＤＮＡあるいはmＲＮＡから調製されるこ
とが好ましい。特にマウスハイブリドーマとしては、そ
れぞれヒトフィブリンおよびＵＫ類に対する高い特異性
と親和性とを有するマウスハイブリドーマＦＩＢ１−１
１（ＩＦＯ No. ５０１７４，ＦＥＲＭ No. ＢＰ−２
０８１）およびＵＫ１−３（ＩＦＯ No. ５０１７６，
ＦＥＲＭ No. ＢＰ−２０８３）がそれぞれ好ましく用
いられる［T. Kurokawaら：バイオテクノロジー（Bio／
Technology），７，１１６３（１９８９）］。しかしな
がら、ＤＮＡ配列あるいは翻訳後の軽鎖および重鎖可変
領域のアミノ酸配列が実質上、本発明で開示した配列と
同等のものであれば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシなどの
他の哺乳類種から得られたＤＮＡあるいはmＲＮＡを用
いることもできる。

【００１４】本発明に用いるゲノムＤＮＡは、通常用い
られる方法およびその他の様々な方法で取得し、クロー
ニングすることができる［L. G. Davisら編：ベーシッ
ク・メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ba
sic Methods in Molecular Biology），エルスビアー
（Elsevier）発行、ニューヨーク（New York），１９８
６、およびJ. Federら：アメリカン・ジャーナル・オブ
・ヒューマン・ジェネテイックス（Am. J. Hum. Geneti
cs），３７，６３５（１９８５）］。また本発明に用い
られるmＲＮＡについても、通常用いられる公知の方法
で調製し、それを材料にしてcＤＮＡを作製しクローニ
ングすることができる［J. Sambrookら編：モレキュラ
ー・クローニング−ラボラトリー・マニュアル−（Mole
cular Cloning−A Laboratory Manual−），コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・ブレス（Cold S
pring Harbor Laboratory Press）発行，ニューヨーク
（New York），１９８９］。例えば、公知の方法によ
り、ゲノムライブラリーから得ることができる。すなわ
ち、まずハイブリドーマ細胞のゲノムＤＮＡを標準的な
方法で調製する。例えば、細胞にドデシル硫酸ナトリウ
ム（Sodium Dodecyl SulphateＳＤＳ）存在下でプロテ
ィナーゼＫを作用させた後、フェノール抽出を行ない、
さらにDNase−free RNase A を作用させたのちフェノー
ル抽出することにより、ゲノムＤＮＡが取得される［村
松正實編：ラボマニュアル遺伝子工学；丸善株式会社，
５９頁（１９８８）］。次に目的とする可変部領域を含
むゲノムＤＮＡは、標準的な方法、すなわち、制限エン
ドヌクレアーゼによりゲノムＤＮＡを断片化して制限断
片とし、得られた断片を適当な組換えＤＮＡクローニン
グベクターにクローニングし、放射性標識または酵素標
識プローブを用いて、本発明で開示したＤＮＡ配列の存
在に関してスクリーニングすることにより、単離され
る。ゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡは一般的にポリペ
プチドをコードしていない介在配列をも含んでいるの
で、公知の方法を用いてＤＮＡの欠失または置換を行い
改変する［W. Kramerら：ニュークレイック・アシッズ
・リサーチ（Nucleic Acids Res. ），１２，９４４１
（１９８４）、およびT. A. Kvnkel：プロシーデイング
ズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ），８
２，４８８（１９８５）］。

【００１５】本発明のキメラ抗体の軽鎖および重鎖可変
領域であるポリペプチドをコードしているＤＮＡは、公
知の方法によりcＤＮＡライブラリーから得ることもで
きる［H. Okayamaら：モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー(Mol. Cell. Biol.），２，１６１（１
９８２）］。すなわち、ハイブリドーマ細胞のmＲＮＡ
を標準的な方法、例えば、細胞をチオシアン酸グアニジ
ンを含む溶液にホモゲナイズしたのち、セシウムトリフ
ルオロアセテート−ＥＤＴＡ液の密度勾配での超遠心分
離によりＲＮＡペレットを取得し、さらにOligo−dＴカ
ラムを用いてpoly(A)⁺−ＲＮＡを調製する。このpoly
(A)⁺−ＲＮＡを鋳型とし、オリゴ−dＴプライマーまた
はランダムプライマーあるいは抗体遺伝子のＤＮＡ配列
に特異的なプライマーを用いた公知の方法によりファー
ストストランドcＤＮＡが合成され、さらにこのファー
ストストランドcＤＮＡを鋳型としてセカンドストラン
ドcＤＮＡが合成される［村松正實編：ラボマニュアル
遺伝子工学；丸善株式会社，７０頁，７７頁（１９８
８）］。このような公知の方法で取得されたcＤＮＡを
適当なクローニングベクターにクローニングし、得られ
たクローンを本明細書中に明示した可変領域をコードし
ているcＤＮＡに関して適当なプローブでスクリーニン
グする。所望のクローンを単離したのち、基本的にはゲ
ノムＤＮＡと同じ方法でcＤＮＡを処理することができ
る。また、本発明のキメラ抗体の軽鎖および重鎖可変領
域をコードするＤＮＡを、公知の方法によりポリメラー
ゼチエインリアクションで特異的に増幅することに
より取得することもできる［R. Orlandiら：Proc. Nat
l. Acad.Sci. USA，８６，３８３３（１９８９）］。ま
たヒトフィブリンあるいはＵＫ類に特異的な軽鎖および
重鎖可変領域をコードするＤＮＡを常法により化学合成
することもできる［N. D. Shinaら：ニュークレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），１２，
４３５９（１９８４）］。これらの合成ＤＮＡは、縮重
コドンで元のコドンが置換されていても、翻訳された時
に同じアミノ酸をコードしている限り、クローニングに
より得られたＤＮＡと同一である必要はない。

【００１６】本発明のキメラ抗体のヒト抗体軽鎖および
重鎖定常領域をコードしているＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ
およびcＤＮＡからクローニングすることができる。ま
た化学的に合成することもできる。このようにして得ら
れた、ヒト抗体定常領域をコードしているＤＮＡを使用
することにより、免疫原性のきわめて小さいキメラ軽鎖
および重鎖ポリペプチドが得られる。このような、ヒト
抗体定常領域ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒト
リンパ細胞、例えば末梢血リンパ細胞から採取すること
が好ましい。さらに、軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ
としては、ヒト抗体κ鎖（カッパ鎖；以下、Ｃκと略記
することがある）ＤＮＡから得られたＤＮＡが、また重
鎖定常領域をコードするＤＮＡとしては、ヒト抗体γ鎖
ＤＮＡなかでもγ₁鎖（以下、Ｃγ₁と略記することがあ
る）ＤＮＡから得られたＤＮＡが特に好ましく使用でき
る［P. A. Heiterら：セル（Cell），２２，１９７（１
９８０）］。このようにして得られたＤＮＡ構築物は、
公知の方法に従い適当な組換えＤＮＡクローニングベク
ターおよび組換えＤＮＡ発現ベクターに導入できる［Y.
Gluzman編：ユーカリテイック・バイラル・ベクター
（Eukaryotic Viral Vectors），コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Lab
oratories）発行、ニューヨーク（New York），１９８
２、Y. Gluzman編：ユーカリテイック・トランスクリプ
ション（Eukaryotic Transcription）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリーズ（Cold Spring Harb
orLaboratories）発行、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒ
ｋ），１９８５およびヨーロッパ公開第３８００６８号
公報］。

【００１７】本発明においては、軽鎖および重鎖ポリペ
プチドをコードしているＤＮＡ構築物を発現ベクターの
一部として適当な真核宿主細胞に導入する。これら２種
の構築物は単一の真核細胞用発現ベクター上に同時に含
有させることができるが、別々の発現ベクター上に分け
て維持してもよい。しかしながら、キメラポリペプチド
の発現のためには、選択した真核宿主細胞内で機能的な
転写および翻訳調節配列を含有していることが必要であ
る。したがって、５’および３’非翻訳領域並びに介在
配列を含有し、真核宿主細胞内で機能する、プロモータ
ー、エンハンサー、および転写ターミネーター並びにポ
リアデニル化部位（以下、polyＡ部位と略記することが
ある）等のホモローガスな調節配列をすべて包含する大
きなＤＮＡ断片として構築されたキメラ遺伝子が好まし
く使用される。あるいは、ウイルス性プロモーター、エ
ンハンサー、転写ターミネーターおよびpolyＡ部位を含
有する周知のＳＶ４０およびHerpes ＴＫ（ヘルペスＴ
Ｋ）ウイルス配列などの様々なヘテロローガス(異種
の）調節領域と、キメラ軽鎖あるいは重鎖ポリペプチド
をコードするＤＮＡ構築物とを組換えて結合させてもよ
い。キメラ遺伝子構築物はまた、それらの要素が真核宿
主細胞内で機能的であり、該キメラ遺伝子と適切に融合
するかぎり、合成調節要素と結合させることもできる。
cＤＮＡクローンまたは合成遺伝子も、ポリペプチドと
して発現されるために、ホモローガスまたはヘテロロー
ガス、いずれかの調節配列と結合させることができる。
多くの組換え発現ベクターが公知であり、それらを本発
明に適用することができるが、特にpＳＶ２型ベクター
が好ましく用いられる。pＳＶ２型ベクターはＳＶ４０
ゲノムの真核性転写単位を構成するセグメンントを含有
しており、哺乳類および他の真核宿主細胞の宿主細胞染
色体ＤＮＡに組み込むことにより、これらの細胞を形質
転換できる。ＳＶ４０プロモーターによって挿入遺伝子
の転写が指令される様々なプラスミドpＳＶ２型ベクタ
ー、たとえばプラスミドpＳＶ２−gpt、pＳＶ２−neo、
pＳＶ２−dhfr、pＳＶ２−β−グロビンなどが既に構築
されている［“ユーカリテイック・バイラル・ベクタ
ー”参照］。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルスに基づく発
現ベクターおよびエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢ
Ｖ）発現ベクターのように染色体外で維持される発現ベ
クターも使用できる［“ユーカリテイック・バイラル・
ベクター”、およびD. Kioosis：エンボ（ＥＭＢＯ），
６，３５５（１９８７）］。プロモーター・リーダーペ
プチド配列は各可変領域５’上流に存在しているが、こ
れらの配列はホモローガスな免疫グロブリン遺伝子だけ
でなく、ヘテロローガスな免疫グロブリン遺伝子の発現
にも用いられる。例えば、ＮＬ１株重鎖プロモーター・
リーダー配列にマウスハイブリドーマＦＩＢ１−１１由
来重鎖可変領域とヒト抗体重鎖定常領域とを含むプラス
ミドpＳＶ₂−hＦＨをトランスフェクトしたマウス骨髄
腫細胞株Ｘ６３．Ａg８．６５３は高い発現レベルを示
す。ほとんど全てのゲノム性免疫グロブリン遺伝子はエ
ンハンサー配列を含んでいる。マウスあるいはヒト型の
免疫グロブリン・エンハンサーは免疫グロブリン・プロ
モーター配列との共存により高レベルの発現を達成でき
る。これらのエンハンサー配列は高発現レベルを変える
ことなく、発現ベクター上の種々の部位に移動すること
もできる。

【００１８】本発明のキメラモノクローナル抗体を発現
させる宿主細胞として用いられる真核宿主細胞として
は、ハイブリドーマ、ＣＨＯ（chinese hamster ovar
y）細胞、骨髄腫、形質細胞腫、リンパ腫細胞等が好ま
しい。しかしながら、哺乳類宿主細胞がキメラ遺伝子の
発現のための転写および翻訳ＤＮＡ配列を認識し、リー
ダーペプチドをプロセッシングしてリーダー配列を切断
し、キメラタンパク質を分泌させ、キメラタンパク質の
翻訳後修飾（例、グリコシル化）が可能ならば、他の真
核宿主細胞も使用されうる。本発明の宿主細胞は、公知
のトランスフェクション法により形質転換できる。特に
電気穿孔法、プロトプラスト融合法、ＤＥＡＥ−デキス
トラン法、あるいはリン酸カルシウム沈澱法などが好ま
しく用いられる［F. Toneguzzo：モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー（Mol. Cell. Biol.），６，
７０３（１９８６），およびV. Oiら：プロシーデイン
グズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳ
Ａ），８０，８２５（１９８３）］。

【００１９】本発明のキメラ抗体を発現させるために
は、例えば免疫グロブリン軽鎖および重鎖をそれぞれコ
ードする２種の組換え発現ベクターで宿主細胞を連続的
にトランスフェクトする方法が用いられる。例えば、宿
主細胞をまず本発明のキメラ軽鎖をコードするＤＮＡ構
築物でトランスフェクトし、次いでキメラ軽鎖ポリペプ
チドを発現する形質転換宿主細胞を酵素免疫測定法（以
下、ＥＩＡと略記することがある）を用いて選択する。
さらに、選択したキメラ軽鎖発現宿主細胞を、重鎖をコ
ードするＤＮＡ構築物好ましくは本発明のキメラ重鎖を
コードするＤＮＡ構築物でトランスフェクトし、キメラ
抗体を発現する宿主細胞を選定する。同様の方法で本発
明のキメラ重鎖を含有する抗体を得ることができる。ま
た、キメラ軽鎖および重鎖発現ベクターを同時に宿主細
胞に導入することもできる。さらに別法として、キメラ
軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ構築物相方を宿主細
胞のトランスフェクションに用いる単一の発現ベクター
上に結合させ、１回のトランスフェクションでキメラ抗
体を発現させることもできる。いずれの場合も、トラン
スフェクション後、公知の方法、例えばヒトフィブリン
やＵＫ類に対する特異抗体を検出するＥＩＡで、本発明
により開示されたキメラ軽鎖あるいはキメラ重鎖のいず
れかを検出することにより目的のキメラ抗体を産生する
宿主細胞を同定、育種できる。

【００２０】本発明の二重特異性キメラ抗体を発現させ
るためには、例えば片方の特異抗体の免疫グロブリン軽
鎖および重鎖をコードする組換え発現ベクターともう一
方の特異抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコード
する組換え発現ベクターとを用いて、宿主細胞を連続的
にトランスフェクトする方法が用いられる。例えば片方
の特異抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ構築物で
トランスフェクトし、次いでキメラ抗体を発現する形質
転換宿主細胞をＥＩＡを用いて選択する。さらに、選択
したキメラ抗体発現細胞をもう一方の特異抗体軽鎖およ
び重鎖をコードするＤＮＡ構築物でトランスフェクト
し、目的の二重特異性抗体を発現する細胞を選択するこ
とにより、二重特異性抗体を得ることができる。また、
片方の特異抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコー
ドする組換え発現ベクターと、もう一方の特異抗体の免
疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードする組換え発現ベ
クターとを、同時に宿主細胞に導入することも可能であ
る。さらに別法として、片方の特異抗体を発現する形質
転換細胞と、もう一方の特異抗体を発現する形質転換細
胞とを、別々に取得したのち、この２種の形質転換細胞
を細胞融合することによっても、二重特異性キメラ抗体
を発現させることができる。いずれの場合も公知の方
法、例えばヒトフィブリンとＵＫ類とを同時に認識する
二重特異性抗体を検出するＥＩＡを用いることにより、
目的のキメラ二重特異性抗体を産生する宿主細胞を同
定、育種することができる。

【００２１】上記した本発明のキメラ抗体産生細胞の培
養は通常、液体培地中、または動物の腹腔内（例えば、
マウス等哺乳動物の腹腔内）で公知の方法により実施で
きる。培養液および腹水中の抗体の精製については公知
の生化学的手法を組み合わせて用いることによりでき
る。例えば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上
清を取り出し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくは
硫酸ナトリウムを用いる）を実施する。得られたタンパ
ク沈殿物を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマト
グラフィー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロ
テインＡカラム、ヒドロキシアパタイトカラム、抗原結
合カラム等）に付し、目的とする抗体を分離精製するこ
とができる。以上のような分離精製操作により、例えば
１リットルの培養上清からタンパク重量比で９０％以上
の純度のキメラ抗体を約１〜５ｍｇ得ることができる。
また、２０mlの腹水液からは同様の抗体が３〜１０mg得
られる。以上のようにして得られたキメラ抗体は蛋白質
として均一であり、蛋白分解酵素（ペプシン，パパイ
ン，ブロメライン，フィシンなど）処理などにより、ヒ
トフィブリンに対する結合能を保持するＦ(ab')₂，Ｆab
断片などを得ることができ、これらは本発明のキメラ抗
体と同様の目的で用いることができる。

【００２２】本発明のキメラ抗体は、インビボおよびイ
ンビトロの両方に使用できるが、特にインビボの使用に
おいてその特性が発揮できる。すなわち、ヒトにおいて
マウス抗体に比べてきわめて免疫原性が低いため、診断
および治療において人体へ安全に投与可能である。また
元のマウス抗体と比べて安定性が高く、血中半減期が長
いため本発明の治療目的に有利に用いられる。特に血栓
溶解療法においては、ＴＰＡやＵＫの血中半減期が短い
ため持続静脈投与法が採用されてきたが、かかるキメラ
抗体との組み合わせにおいては血中半減期の大幅な延長
が期待でき、bolus投与が可能となる。例えば抗ヒトフ
ィブリン抗体の場合、適当な放射性核種（例えば、¹¹¹
Ｉn，¹²³Ｉ，^99mＴcなど）と結合させ体内に投与するこ
とにより、血管内に形成された血栓のイメージングが
可能となる。さらには、種々の血栓溶解作用を有する物
質（例えば、ＳＫ，ＵＫ，ＰroＵＫ，ＴＰＡ，トリプシ
ン，プラスミン，プロテインＣ，プロテインＳなど）好
ましくはＵＫ類と本発明のキメラ抗ヒトフィブリン抗体
とを結合させ、心筋梗塞、末梢動・静脈閉塞症、脳梗塞
などの血栓性疾患の予防および治療に使用できる。また
本発明のキメラＵＫ類認識抗体と化学的に結合させてキ
メラ抗ヒトフィブリン／抗ヒトＵＫ二重特異性抗体を作
製し、ＵＫあるいはＰroＵＫなどのＵＫ類との免疫複合
体として投与し、上記の心筋梗塞や脳梗塞などの血栓性
疾患の治療に使用できる。さらに、この目的のために
は、本発明のキメラ抗ヒトフィブリン／抗ＵＫ類二重特
異性モノクローナル抗体が上記の化学的に合成した二重
特異性抗体と同様に、ＵＫあるいはＰroＵＫなどのＵＫ
類との免疫複合体として血栓性疾患の治療に使用でき
る。これらのキメラ二重特異性抗体とＵＫ類から作製さ
れる選択的な血栓溶解蛋白複合体を用いる血栓溶解治療
法においては、幾つかの方法が用いられる。例えば、
本発明のキメラ二重特異性抗体を予め血栓性疾患患者に
投与し、患者体内に形成された血栓に結合させるべく十
分な時間経過後にＵＫ類を投与する、該キメラ二重特
異性抗体とＵＫ類とを同時に血栓性疾患患者に投与す
る。あるいは予め該キメラ二重特異性抗体と血栓溶解
剤とを反応させ、未反応のＵＫ類を分離後、得られた選
択的血栓溶解蛋白複合体を血栓性疾患患者に投与する、
などの方法が挙げられる。

【００２３】本発明の血栓溶解剤あるいは血栓溶解蛋白
複合体は、必要により例えばメンブレインフィルター等
によるろ過、除菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の
薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤などと混
合し、注射剤などとして製剤化して投与し、例えば心筋
梗塞、末梢動・静脈閉塞症、網膜動・静脈閉塞症、脳梗
塞、肺塞栓症などの血栓・閉塞性疾患の治療に用いるこ
とが可能である。本発明の血栓溶解蛋白複合体の投与量
は、対象となる疾患、症状あるいは投与ルートなどによ
って異なるが、例えば心筋梗塞の成人患者に静脈内投与
する場合、キメラ二重特異性抗体として１日当り０.０
３〜１.５mg／kg好ましくは約０.０６〜０.６mg／kg、
血栓溶解剤として１日当りＵＫでは約０.０１〜０.５mg
／kg好ましくは約０.０２〜０.２mg／kg、あるいはＰro
ＵＫでは約０.０１〜１mg／kg、好ましくは約０.０２〜
０.５mg／kgである。以上のような方法で、標的血栓部
位に対して特異的に結合可能であり、実質的に血中のフ
ィブリノーゲンと結合しない本発明のキメラ二重特異性
抗体と血栓溶解剤とを用いることにより、投与患者にお
ける免疫応答を大巾に減少し副作用を軽減しつつ、選択
的かつ効率的に血栓を溶解ないし除去することができ
る。

【００２４】以下に参考例および実施例により本発明を
具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を制限する
ものでないことはいうまでもない。本発明の実施にあた
り組み換えＤＮＡの作製、組み換え体の動物細胞や微生
物などへの導入は特に断わらない限り下記の実験書に従
って実施した。（１）T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook著，
「モレキュラークローニング（Molecular Clonin
g）」，Cold Spring Harbor Laboratory刊（米国）（２）高木康敬編著「遺伝子操作実験法」講談社刊なお、実施例で用いられている動物細胞は、以下の表に
示すように寄託が行なわれている。 ────────────────────────────────── （ＩＦＯ）（ＦＲＩ）動物細胞ＩＦＯ No. ＦＥＲＭ No. ────────────────────────────────── マウス・ハイブリドーマ FIB1-11 ５０１７４ＢＰ−２０８１ (1988.9.21) (1988.10.4) マウス・ハイブリドーマ UK1-3 ５０１７６ＢＰ−２０８３ (1988.9.21) (1988.10.4) マウス・ミエローマ５０２５７ＢＰ−３１４１ FIB1−HO1／X63 (1990.10.17) (1990.10.25) マウス・ハイブリット・ハイブリドーマ５０１８５ＢＰ−２３３４ FU1−74 (1989.3.13) (1989.3.14) マウス・ハイブリドーマ SS/S-3 ５０３５１ＢＰ−３６３５ (1991.10.23) (1991.10.29) マウス・ハイブリドーマ SU/S-9.21 ５０３５２ＢＰ−３６３６ (1991.10.23) (1991.10.29) マウス・ハイブリドーマ SUSF/S-8.4 ５０３５３ＢＰ−３６３７ (1991.10.23) (1991.10.29) ────────────────────────────────── ＩＦＯ：財団法人発酵研究所（大阪）ＦＲＩ：通商産業省微生物工業技術研究所

【００２５】参考例１抗フィブリン抗体測定用ＥＩＡ３.３Ｍ尿素，０.０１％エチレンジアミン四酢酸塩（以
下、ＥＤＴＡと略記することがある）リン酸食塩緩衝液
（pＨ７.３；以下、ＰＢＳと略記することがある）に溶
解したヒトフィブリンモノマー溶液１mg／mlを、９６穴
マイクロプレートに５０μlずつ分注し４℃で一夜放置
後、２％カゼイン，０.０１％チメロサール含有ＰＢＳ
１５０μlを添加して感作プレートを作製した。次に抗
体産生細胞の培養上清５０μlを上記のフィブリン感作
プレートに添加し室温で２時間反応させた。０.０５％
Tween ２０含有ＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−ＴＷと略記する
ことがある）でプレートを十分に洗浄後、ホースラッデ
ィシュペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略記すること
がある）標識したウサギ抗マウスＩgＧ抗体もしくはヤ
ギ抗ヒトＩgＧ抗体（いずれもフナコシ社販売）を添加
し、さらに室温で２時間反応させた。洗浄後、酵素基質
としてオルソフェニレンジアミンおよびＨ₂Ｏ₂を含有す
る０.１Ｍクエン酸緩衝液を各ウエルに加え、室温で酵
素反応を実施した。１Ｎ硫酸で反応停止後、マルチスキ
ャン（フロー社製）を用いて波長４９２ｎｍで発色色素
量を測定した。

【００２６】参考例２マウス抗ヒトフィブリンモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマの作製（１）免疫原の調製公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド・
システム，モデル４３０Ａ型）を用いて作製されたヒト
フィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−Ｃys ３.
３mgを、予めＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシサク
シミド）（以下、ＣＭＢＳと略記することがある）でマ
レイミド化した牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記
することがある）（ＢＳＡ１モル当り１３モルのマレイ
ミド基を導入）１２mg／２ml水溶液に加え３０℃で１時
間反応させ、ヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−
１１）−ＢＳＡ複合体を得た。次いで生理食塩水で３回
透析後（３リットル×３）、凍結保存し免疫原として用
いた。（２）免疫ペプチド−ＢＳＡ複合体１mg／ml生理食塩水溶液に等量
のフロイント完全アジュバンドを加え、マウス（♀，ｎ
＝１０：０.１mg／０.２ml／マウス）の背部および腹部
皮下への免疫を開始した。追加免疫は免疫原に等量のフ
ロイント不完全アジュバンドを加えて、２−３週毎に５
回接種し実施した。（３）細胞融合最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０⁸個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０⁷個を添加し、ポリエチレング
リコール（以下、ＰＥＧと略記することがある）６００
０を用いてケーラーとミルスタインの方法〔ネーチャー
（Nature），２５６，４９５（１９７５）〕に準じて細
胞融合に供した。融合終了後、細胞混液をヒポキサンチ
ン・アミノプテリンおよびチミジンを含む、いわゆるＨ
ＡＴ培地中に懸濁し、１０日間培養した。以後は、親細
胞の選択が終了次第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを
除いたＨＴ培地に代え培養を続けた。

【００２７】（４）ハイブリドーマの選択およびクロー
ニング固相にヒトフィブリンモノマーを吸着させたマイクロプ
レートを用いる参考例１に記載のＥＩＡを用いて、ヒト
フィブリノーゲン（５mg／ml）存在下でハイブリドーマ
培養上清の抗体価を測定した。融合１０日から２０日後
でハイブリドーマの出現を認め、かつヒトフィブリンに
特異結合する抗体がみられた。特に結合活性の強いハイ
ブリドーマについて、限界希釈法によるクローニングに
供した。クローン化したハイブリドーマの培養上清を同
様にＥＩＡのスクリーニングに供し、ヒトフィブリン結
合能の強いものを選択した。これらの結果、高濃度ヒト
フィブリノーゲン存在下でヒトフィブリンに特異結合す
るＭoＡb産生マウスハイブリドーマＦＩＢ１−１１が
得られた。得られたハイブリドーマから産生される抗体
の免疫グロブリンクラスおよびサブクラスはＩgＧ₁（κ
鎖）であった。

【００２８】参考例３ヒトＣ _kゲノム遺伝子のクロー
ニングヒト形質芽細胞ＡＲＨ７７細胞（以下、ＡＲＨ７７と略
記することがある）より高分子ＤＮＡを調製し、そのＥ
coＲＩ分解物をλgtＷＥＳλＢファージベクターに挿入
することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製した
［Y. Nishimuraら：キャンサー・リサーチ（Cancer Re
s.），４７，９９９（１９８７）］。次いで、マウスＣ
_k遺伝子をクロス・ハイブリダイゼーション・プローブ
として用いるプラーク・ハイブリダイゼーションによ
り、ヒトＣ_kゲノム遺伝子を含むクローンを取得した。

【００２９】参考例４ヒトＣγ ₁ゲノム遺伝子のクロ
ーニング上記参考例３に記載のＡＲＨ７７細胞由来の高分子ＤＮ
ＡＥcoＲＩ分解物を、λCharon ４Ａファージベクタ
ーに挿入することによりゲノムＤＮＡライブラリーを作
製した［A. Kudoら：ジーン（Gene），３３，１８１
（１９８５）］。次いで、３.５kbのヒトＪ_H遺伝子断片
をプローブとして用いるプラーク・ハイブリダイゼーシ
ョンにより約１０⁶個のファージをスクリーニングし、
その結果ヒトＣγ_１ゲノム遺伝子を含むクローンを取得
した。

【００３０】参考例５ＮＬ−１株由来Ｖ _Hゲノム遺伝
子のクローニング Common acute lymphocytic leukemia抗原（以下、ＣＡ
ＬＬＡと略記することがある）を認識するＩgＧ_2a（κ
鎖）抗体産生マウス・ハイブリドーマＮＬ−１（以下、
ＮＬ−１と略記することがある）株［A. Kudoら：ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（J. Immunol），１３
５，６４２（１９８５）］よりＤＮＡを抽出し、これを
ＥcoＲＩで切断後、Charon ４Ａベクターに挿入しゲノ
ムＤＮＡライブラリーを作製した。マウスＪ_H4 ＥcoＲ
Ｉ−ＨindIII １.５kb断片をプローブとしたプラーク
・ハイブリダイゼーションにより、このライブラリーを
スクリーニングした結果、それぞれ８.１kbおよび７.９
kbの挿入断片を持つファージ・クローンが取得された。
ＮＬ−１細胞の全ＲＮＡを用いたノーザン・ブロット解
析およびジデオキシ・チエイン・ターミネーション（di
deoxy chain termination）による塩基配列決定によ
り、この７.９kbの挿入断片がＮＬ−１抗体分子の組換
え型重鎖遺伝子（Ｖ_H遺伝子）を含むことを明らかにし
た。

【００３１】参考例６抗ＵＫ抗体測定用ＥＩＡ市販のＵＫ（日本製薬製造販売）５μl／ml溶液を９６
穴マイクロプレートに１００μlずつ分注し４℃で一夜
放置後、２％カゼイン、０.０１％チメロサール含有Ｐ
ＢＳ１５０μlを添加して感作プレートを作製した。上
記の液を除去しＰＢＳ−Ｔwで洗浄後、被検培養上清１
００μlを添加し室温で２時間反応させた。以下、参考
例１に記載の方法で酵素反応を実施し抗体価を測定し
た。

【００３２】参考例７抗フィブリン−抗ＵＫ二重特異
性抗体測定用ＥＩＡ参考例６で作成したＵＫ感作プレートに二重特異性抗体
含有検液を添加し、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−
Ｔwで洗浄後、ビオチン標識した参考例２−に記載の
ヒトフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−１１）−ＢＳ
Ａ複合体を添加し、さらに室温で２時間反応させた。次
にアビジン−ＨＲＰ複合体を添加し室温で１時間反応
後、固相に結合したＨＲＰ活性を参考例１に示した方法
で測定した。

【００３３】参考例８フィブリン溶解反応中和試験ＵＫ溶液（最終濃度２５ng／ml）に被検ハイブリドーマ
培養上清希釈液を添加し、３７℃で１時間反応後反応混
液をフィブリン・アガロース・プレートの１ウエル当り
５μl注入した。３７℃で２〜６時間後にフィブリンの
溶解斑（直径）を測定し、ＵＫの酵素活性に対するハイ
ブリドーマ培養上清に含まれるＭoＡbの中和能を測定し
た。

【００３４】参考例９マウス抗ＵＫモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマの作製免疫ＵＫ（日本製薬製造販売）２００μg／ml生理食塩水溶
液に等量のフロイント完全アジュバンドを添加し十分乳
濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀，２０μg／０.２ml／マ
ウス）に腹腔および背部皮下投与し、２〜３週間隔で追
加免疫を実施した。３回の追加免疫後、１０日で最大の
血清抗体価を示した個体について、ＵＫ抗原液（５０μ
g／０.１ml生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。細胞融合参考例２−に記載の方法に従い細胞融合を実施した。ハイブリドーマの選択およびクローニングＵＫ結合マイクロプレートを用いる参考例６に記載のＥ
ＩＡでハイブリドーマをスクリーニングし、以下参考例
２−と同じ方法で抗ＵＫＭoＡb産生ハイブリドーマ
を取得した。これらの中、参考例８に記載の方法におい
てフィブリン溶解能を損なうことなく特異結合する抗Ｕ
ＫＭoＡb産生ハイブリドーマとしてマウスハイブリド
ーマＵＫ１−３が得られた。得られたハイブリドーマか
ら産生される抗体ＵＫ１−３の免疫グロブリンクラス、
サブクラスはオークターロニー法による測定で、ＩｇＧ
₁であった。

【００３５】参考例１０抗ＵＫ−抗ヒトフィブリン二
重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体の製
造細胞融合参考例２で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイブリ
ドーマＦＩＢ１−１１および参考例９で取得した抗ＵＫ
抗体産生ハイブリドーマＵＫ１−３を、それぞれ０.５
μg／mlフルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）および１.５μg／mlテトラメチル・ロダミン・イソ
シアネート（ＴＲＩＴＣ）含有イスコフ−ハムＦ・１２
混合培地（以下ＩＨと略記することがある）で３７℃，
３０分間インキュベートし、蛍光染色した。次いで、Ｌ
ＳＭ溶液（和光純薬工業K.K.販売）を添加し死細胞を除
去したのち、両ハイブリドーマを１：１の割合で混じ、
ＰＥＧ６０００を用いて参考例２−に記載の方法で細
胞融合した。３７℃で２時間インキュベート後、フルオ
レセイン・アクティベイテッド・セルソータ（ＦＡＣ
Ｓ）に供することによりフルオレセインおよびローダミ
ンで二重染色された細胞２５０００個を分取し、次にフ
ィーダーとしてマウス胸腺細胞を５×１０⁵個／ウエル
播種した９６穴マイクロプレートに、上記の二重染色細
胞を１０個／ウエルの割合で播種し培養した［ヨーロッ
パ公開第３６３７１２号公報参照］。ハイブリッド・ハイブリドーマの選択およびクローニ
ング融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上清
を、それぞれ参考例１，６および７に記載のＥＩＡに供
し抗体活性を測定した。最大のハイブリッド抗体活性を
示したウエルについて限界希釈法によるクローニングを
実施し、目的の二重特異性抗体産生マウス・ハイブリッ
ド・ハイブリドーマＦＵ１−７４を取得した。ハイブリッド抗体の精製公知の方法に従い腹水を取得し、さらに硫安塩析および
フィブリン結合カラムとＵＫ結合カラムとを用いるイム
ノアフィニティークロマトにより約２０mlの腹水から本
発明の抗ＵＫ−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体ＦＵ１
−７４約２８mgを得た。

【００３６】参考例１１ヒトＩgＧ抗体測定用ＥＩＡ市販のヤギ抗ヒトＩgＧ（Ｆc フラグメント）抗体（カ
ッペル社）５μg／ml溶液を９６穴マイクロプレートに
５０μlずつ分注し、４℃で一夜放置後、２％カゼイ
ン，０.０１％チメロサール含有ＰＢＳ１５０μlを添加
して抗体感作プレートを作製した。ＰＢＳ−Ｔwでプレ
ート洗浄後、被検培養上清５０μlを添加し室温で２時
間反応させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素反応
を実施し抗体価を測定した。また、ヒトＩgＧ標準品と
しては、市販のクロマト精製ヒトＩgＧ（カッペル社）
を用いた。

【００３７】実施例１マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフ
ィブリン抗体軽鎖発現用ベクターpＳＶ ₂−hＦ_Kの作製（１）ゲノムＤＮＡのクローニング参考例２で取得したマウス抗ヒトフィブリン特異抗体産
生ハイブリドーマＦＩＢ１−１１より高分子ゲノムＤＮ
Ａを調製し制限酵素ＥcoＲＩで切断後、１０−４０％シ
ョ糖密度勾配遠心分離法に供した。１２−２０kbのＤＮ
Ａ断片を集めＥＭＢＬ４ファージベクター（ストラータ
・ジーン製）に挿入し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作
製した［Y. Nishimuraら：キャンサー・リサーチ（Canc
er Res.），４７，９９９（１９８７）］。次いで³²Ｐ
で標識したマウスＪ_K4-5遺伝子断片（０.７kb ＡvaＩ−
ＰstＩ断片）をハイブリダイゼーション・プローブとし
て用いてスクリーニングし、陽性組換え体ファージ・ク
ローン３種を取得した。ＦＩＢ１−１１細胞の全ＲＮＡ
を、これらクローンの挿入ＤＮＡ断片をプローブとして
用いてノーザン・ブロット解析を実施することによりＦ
ＩＢ１−１１細胞で発現されているＶ_K遺伝子（以下、
Ｖ_FK遺伝子と略記することがある）をコードする１５k
bのＥcoＲＩ断片を含むファージクローンＫＥ１４を同
定した。（２）塩基配列の決定ファージクローンＫＥ１４をプラスミドベクターpＵＣ
１１９にサブクローニングし、公知のジデオキシ・チエ
イン・ターミネーション（dideoxy chain terminatio
n）法で塩基配列を決定したところ、転写プロモーター
（オクタマー配列），リーダーペプチドおよびＶ_K構造
遺伝子を含むＤＮＡ断片と判明した。また、Ｖ_FKはサブ
グループIIに属するＶ_K遺伝子（Ｖ_KII）とＪ_K2遺伝子と
の組換えにより形成された機能的なＶ_K遺伝子であっ
た。結果は〔図１〕，〔図２〕〔配列番号１１〕に示さ
れた通りであった。（３）発現用ベクターの構築上記（１）に記載のファージクローンＫＥ１４に含まれ
る１５kb挿入ＤＮＡ断片よりＶ_FKゲノム遺伝子を含む
２.６kb ＥcoＲＩ−ＰstＩ断片を単離し、pＵＣ１１９
のＥcoＲＩ−ＰstＩサイトに挿入した。得られたプラス
ミドをＥcoＲＩで切断しＴ₄ポリメラーゼ（以下、Ｔ₄ p
olと略記することがある）で末端平滑化したのち、Ｂam
ＨＩリンカーを結合させ、さらにＢamＨＩ−ＨindIIIで
切断し２.６kb断片を単離した。また、ヒト形質芽細胞
株ＡＲＨ７７より単離されたヒトκ鎖定常領域ゲノム遺
伝子（以下、hＣ_Kと略記することがある）を含む２.５k
b ＥcoＲＩ断片を、プラスミドベクターpＢＲ３２２の
ＥcoＲＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをＥco
ＲＩで部分切断して６.９kb断片を単離し、さらにＢam
ＨＩで切断して２.９kb断片を単離した。このＤＮＡ断
片をpＳＶ₂−neoベクターのＥcoＲＩ−ＢamＨＩサイト
に挿入することにより得られたプラスミドを、さらにＨ
indIII−ＢamＨＩで切断し５.３kbと２.４kbの断片をそ
れぞれ単離した。これら２種のＤＮＡ断片と、上記のＶ
_FK遺伝子を含む２.６kb ＢamＨＩ−ＨindIII断片とを結
合させ、Ｖ_FK遺伝子とhＣ_K遺伝子とが順次同方向に並ん
だプラスミドを得た。一方、ＡＲＨ７７より単離された
ヒトＩgＨエンハンサーを含むＭluＩ−ＨpaＩ０.９kb断
片を、Ｔ₄ polで平滑化しＥcoＲＩリンカーを用いてpＵ
Ｃ１１９のＥcoＲＩサイトに挿入した。得られたプラス
ミドをＥcoＲＩで切断してエンハンサーを含む０.９kb
断片を単離し、Ｔ₄ polで平滑化したのち、ＢamＨＩリ
ンカーを結合させた。このエンハンサー断片を前述のプ
ラスミド（hＣ_K遺伝子とＶ_FK遺伝子とを含むpＳＶ₂−ne
oベクター）のＢamＨＩサイトに挿入することにより、
κ鎖発現用ベクターpＳＶ₂−hＦ_Kを構築した。構築図は
〔図３〕，〔図４〕に示された通りであった。

【００３８】実施例２マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフ
ィブリン抗体重鎖発現用ベクターpＳＶ ₂−hＦＨの作製（１）cＤＮＡのクローニング参考例２に記載のＦＩＢ１−１１細胞よりＲＮＡを調製
し、さらにoligotex−dＴ３０（タカラ酒造社製）で精
製してpoly(Ａ)⁺−ＲＮＡを調製した。このpoly(Ａ)⁺−
ＲＮＡ１０μg、３’mＶ_Hプライマー２０pmol、dＮＴＰ
各２μＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと略記する
ことがある）１０mＭ、Tris−ＨＣl（pＨ８.３）１００
mＭ、ＭgＣｌ₂ １０mＭ、ＫＣl １４０mＭを含む反応液
５０μlを７０℃で１０分処理した後、室温に戻した。
逆転写酵素４６unitsを添加し４２℃で１時間インキュ
ベートした。この反応液５μlと５’mＶ_Hプライマー２
５pmol、３’mＶ_Hプライマー２５pmol、dＮＴＰ各２５
０μＭ、Tris−ＨＣl（pＨ８.８）６７mＭ、ＭgＣl₂ １
０mＭ、（ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １７mＭ、およびゼラチン２０
０μg／mlとを含む反応液５０μlに２unitsのＴaqポリ
メラーゼを加え、流動パラフィンを上層した後、ポリメ
ラーゼ・チエイン・リアクション（以下、ＰＣＲと略記
することがある）を行った。温度サイクルは９５℃で１
分，５２℃で２分，７２℃で２分をそれぞれ３０サイク
ル反応させた。反応後サンプルを５％−ポリアクリルア
ミド電気泳動（以下、ＰＡＧＥと略記することがある）
に供し、約３３０bpの増幅ＤＮＡ断片を単離した。用い
たＰＣＲプライマーの塩基配列であり、クローニング・
サイトとしてそれぞれＰvuIIおよびＢstＥIIサイトが含
まれている。得られた結果は〔図５〕に示された通りで
あった。５'mＶ_H：5'-AGGTGCAGCTG(G/T)(G/T)G(G/C)AGTC(G/T)GG-3' 22-mer 〔配列番号９〕３'mＶ_H：5'-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTCCCTTGGCCCCAG-3' 34-mer 〔配列番号１０〕（２）塩基配列の決定上記（１）に記載のＰＣＲ法で取得したＶ_H遺伝子を含
む約３３０bpのＤＮＡ断片を単離し、pＵＣ１１９にサ
ブクローニングして塩基配列を調べたところ、サブグル
ープIIIに属するＶ_H遺伝子（Ｖ_HIII）とＤ_SP2、遺伝子
Ｊ_H4遺伝子とより成る機能的なＶ_H構造遺伝子であった
（以下、Ｖ_FHと略記することがある）。また、ＦＩＢ１
−１１細胞の全ＲＮＡを用いたノーザン・ブロット解析
により、Ｖ_FHがＦＩＢ１−１１細胞で発現されている遺
伝子であることを確認した。結果は〔図６〕，〔図７〕
〔配列番号１２〕に示された通りであった。

【００３９】（３）発現用ベクターの構築上記（１）に記載のＰＣＲ法で取得したＶ_FH−cＤＮＡ
を用いてキメラＨ鎖を発現させるために、ヒトγ鎖定常
領域遺伝子hＣγ₁の他に真核生物における発現に必要な
プロモーター，リーダー，スプライシングシグナル配列
を付与した。すなわち、参考例５に記載のマウス・ハイ
ブリドーマＮＬ−１由来のＶ_Hゲノム遺伝子を利用し、
ＮＬ−１細胞の産生する抗体Ｈ鎖ゲノム由来のプロモー
ター，リーダー，スプライシングシグナル配列と、ＦＩ
Ｂ１−１１細胞由来のＶ_Hエキソンとを有するキメラＶ
_FHゲノム遺伝子を作製した。まず、pＵＣ１１９の２.８
kbＰvuII断片とＮＬ−１細胞由来Ｖ_H遺伝子（以下、Ｖ
_HNL1と略記することがある）を含む２.１kb ＥcoＲＶ−
ＢglIIゲノムＤＮＡ断片とをＥcoＲＩリンカーを介して
結合させた。次に、得られたプラスミドのＶ_HNL1エキソ
ン部のＰvuII−ＢstＰＩ断片を除去し、上記のＶ_FH−c
ＤＮＡの０.３４kb ＰvuII−ＢstＰＩ断片で置換し
た。このプラスミドよりキメラＶ_FHゲノム遺伝子を含む
２.１kb ＥcoＲＩ断片を調製した。一方、ヒト形質芽細
胞ＡＲＨ７７より取得したヒトＣγ₁遺伝子とヒト重鎖
エンハンサーを含むＥcoＲＩ断片をＭluIで切断し、Ｔ₄
ポリメラーゼで末端平滑化した。この断片にＥcoＲＩリ
ンカーを結合後、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩで切断し１３kb断
片を取得し、この断片をpＳＶ₂−gptベクターのＥcoＲ
Ｉ−ＢamＨＩサイトに挿入した。得られたプラスミドを
ＥcoＲＩで切断後、上記のキメラＶ_FHゲノム遺伝子Ｅco
ＲＩ断片を挿入し、Ｖ_FHとhＣγ₁とが同方向に結合した
ものを選び、キメラ重鎖発現用ベクターpＳＶ₂−hＦＨ
を構築した。構築図は〔図８〕，〔図９〕に示す通りで
あった。

【００４０】実施例３キメラ抗ヒトフィブリン抗体の
作製（１）遺伝子の導入と形質転換細胞株の選択実施例１および２でそれぞれ構築したベクターpＳＶ₂−
hＦ_KとpＳＶ₂−hＦ_Hとを、電気穿孔法を用いて同時にマ
ウス骨髄腫細胞株Ｘ６３.Ａg８.６５３へ導入した。す
なわち、細胞をＰＢＳで１回洗浄後、１×１０^７個／ml
の濃度でＰＢＳに懸濁した。この懸濁液０.５mlにプラ
スミドＤＮＡ（pＳＶ₂−hＦ_KとpＳＶ₂-hＦ_H）各２０μg
を添加し、ジーンパルサー^TM（バイオ・ラッド社）を用
いて電気パルスを加えた。氷冷下１０分放置後、１０％
ＦＣＳを含む培地を加え培養した。形質転換細胞株はミ
コフェノール酸６.５μg／mlおよびジエネティシン（Ｇ
４１８）（シグマ社販売；以下Ｇ４１８と略記する）
１.０mg／ml含有培地を用いて選択した。（２）キメラ抗体産生細胞のクローニング上記選択培地中で増殖を示した１３ウエルの培養上清を
参考例１１のヒトＩgＧ抗体測定用ＥＩＡに供したとこ
ろ１ウエルの培養上清中に、ヒト免疫グロブリン定常領
域を持つ抗体が検出された。また同時にこの培養上清を
参考例１に記載のＨＲＰ標識抗ヒトＩgＧ抗体を用いる
ＥＩＡに供したところ、抗ヒトフィブリン抗体活性をも
示し、目的の抗フィブリン活性をもつキメラ抗体産生細
胞であることが判明した。そこで限界希釈法によるクロ
ーニングを実施し、クローン化された細胞の培養上清を
同様のＥＩＡのスクリーニングに供して、ヒトフィブリ
ン結合能の強い抗体を安定的に産生するクローンマウス
−ヒトキメラ抗体産生細胞ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３を
取得した。（３）キメラ抗体産生細胞の性状ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３細胞を２×１０⁴個／mlの濃
度で播種し、経時的に増殖細胞数および培養上清中の抗
体量を測定した。抗体量は参考例１１に記載のヤギ抗ヒ
トＩgＧ抗体感作マイクロプレートを用いるＥＩＡで測
定した。得られた結果は〔図１０〕に示された通りであ
った。細胞の倍加時間は約１日（２４時間），抗体産生
量は約２μg／mlであった。

【００４１】（４）キメラ抗体の性状ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３細胞の産生するキメラ抗体
を、参考例２に記載のマウス・ハイブリドーマＦＩＢ１
−１１の産生する抗ヒトフィブリンマウス抗体と比較し
た。すなわち、両抗体（最終濃度５０ng／ml）を種々の
濃度の参考例２−（１）に記載のペプチド−ＢＳＡ複合
体と室温で１時間反応させ、次いでこれらの反応混液を
参考例１に記載のＥＩＡに供した。得られた結果は〔図
１１〕に示された通りであった。抗フィブリン抗体のフ
ィブリン・モノマー感作プレートへの結合を５０％阻止
するために必要なペプチド−ＢＳＡ複合体濃度は、キメ
ラ抗体ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３で３.２ng／ml、マウ
ス抗体ＦＩＢ１−１１で４.６ng／mlであった。これら
の結果から、キメラ抗体は元のマウス抗体とほぼ同等の
フィブリン親和性を有することが判明した。（５）キメラ抗体の精製予め鉱油０.５mlを腹腔内投与したハイブリッド・ヌー
ドマウス（Ｊcl：ＡＦ−nu）に１０⁷個／マウスのキメ
ラ抗体産生細胞ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３を腹腔内接種
した。約１０〜２０日後に貯溜がみられた腹水を２０ml
採取し、さらに５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析して
ＩgＧ画分を得た。次いで２０mＭＰＢＳ（pＨ７.５）
で透析後、フィブリン結合セルロファインカラムに供
し、pＨ２.９の０.２Ｍグリシン・塩酸緩衝液で溶出し
た。酸溶出画分をＰＢＳで透析することにより、マウス
−ヒト・キメラ抗フィブリン特異抗体を得た。腹水１０
mlより約１２mgのマウス−ヒト・キメラ抗フィブリン特
異抗体を取得した。

【００４２】実施例４マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフ
ィブリン抗体cＤＮＡ発現用ベクター（ pＴＢ１３８７）
の作製（１）マウス−ヒト・キメラ抗体軽鎖cＤＮＡの取得実施例３で得られたキメラ抗フィブリン抗体産生形質転
換細胞ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３より、First Truck^TM
mＲＮＡ Isolation Kit (In Vitrogen社)を用いてpoly
(A)⁺ −ＲＮＡを調製した。このpoly(A)⁺ −ＲＮＡを鋳
型として、Oligo-dＴ（ファルマシア社）プライマーを
第一鎖cＤＮＡ合成用プライマーに、３’Ｅκプライマ
ーと５’ＣκプライマーとをＰＣＲ用プライマーに用
い、ヒトＣκcＤＮＡをクローニングした。すなわち、p
oly(A)⁺ −ＲＮＡ１μgとOligo−dＴプライマー１０pＭ
とを含む１１μlの反応液を、７０℃で１０分間処理し
たのち、室温に戻した。この反応液にＴris−ＨＣl（p
Ｈ８.３）、ＭgＣl₂、ＫＣl、ＤＴＴ、および４種のdＮ
ＴＰをそれぞれ最終濃度１００mＭ、１０mＭ、１４０m
Ｍ、１０mＭ、０.５ｍＭとなるように加え、最終液量を
２０μlとし、さらに逆転写酵素［ＭＭＴＶ−ＲＴ（Mol
oney Murin T Cell Leukemia Virus RNase Reverse Tra
nscrittase）２００u／μl、ＢＲＬ社］１μlを添加し
４５℃で１時間インキュベートした。この反応液４μl
と、５’Ｃκプライマー２５pmol、３’Ｅκプライマー
２５pmol、dＮＴＰ各２００μＭ、Ｔris−ＨＣl（pＨ
８.３）１０mＭ、ＭgＣl₂ １.５mＭ、ＫＣl ５０mＭ
およびゼラチン０.０１％とを含む反応液５０μlに、さ
らに２unitsのＴaq ＤＮＡポリメラーゼ（シータス・キ
ット）を加え流動パラフィンを上層した後、ＰＣＲを実
施した。温度サイクルは９５℃で１分、５２℃で２分、
７２℃で３分を各々３０サイクル反応させた。反応後サ
ンプルを５％−ＰＡＧＥに供して約０.３３kbの増幅Ｄ
ＮＡ断片を単離し、さらにＳmaＩで切断したプラスミド
pＵＣ１１９（タカラ酒造）と結合させることによりＣ
κ cＤＮＡを含むベクターpＴＢ１３９４を取得した。
上記と同様の手法を用いて、第一鎖合成用プライマーと
して３’Ｅκプライマーを、ＰＣＲ用プライマーとして
５’Ｌκプライマーと３’Ｃκプライマーとを用いるこ
とにより、抗フィブリンＶκ cＤＮＡＣ３’末端にＢcl
Ｉサイトを有するもの（以下、Ｖκvと略記することが
ある）を増幅した。また、第一鎖合成用プライマーとし
て３’Ｅκプライマーを、ＰＣＲ用プライマーとして
５’mＶκプライマーと３’mＶκプライマーとを用いる
ことにより、抗フィブリンＶκ cＤＮＡ（３’末端にＢ
glIIサイトを有するもの；以下、Ｖκ−ＦＩＢと略記す
ることがある）を増幅した。さらに、第一鎖合成用プラ
イマーとして３’Ｃκプライマーを、ＰＣＲ用プライマ
ーとして５’Ｓκプライマーと３’Ｌκプライマーとを
用いることにより、リーダー配列cＤＮＡ（以下、Ｌκ
と略記することがある）を増幅した。各々の増幅遺伝子
断片（Ｌκ：０.０７kb，Ｖκv：０.３５kb，Ｖκ−Ｆ
ＩＢ：０.３５kb）を単離したのち、ＳmaＩで切断したp
ＵＣ１１９に結合させることにより、それぞれＬκ、Ｖ
κvおよびＶκ−ＦＩＢを含むプラスミドpＴＢ１３９
１，pＴＢ１３９２およびpＴＢ１３９３を取得した。得
られたcＤＮＡ断片の塩基配列を確認後、Ｌκ、Ｖκお
よびＣκを順方向に連結することにより、キメラκ鎖c
ＤＮＡ全長を含むプラスミドpＴＢ１４２７を取得した
〔図１２〕，〔図１３〕。

【００４３】すなわち、pＴＢ１３９１を制限酵素Ｐst
ＩとＭluＩとで消化後、Ｌκ cＤＮＡを含む０.１kbの
ＤＮＡ断片を単離した。同様にpＴＢ１３９２をＳplＩ
とＭluＩとで消化後、Ｖκv cＤＮＡを含む０.３５kbの
ＤＮＡ断片を単離した。一方、Ｃκ cＤＮＡを含むpＴ
Ｂ１３９４をＳplＩとＰstＩとで切断後、先に調製した
０.０７kb ＰstＩ−ＭluＩ断片と０.３５kb ＳplＩ−Ｍ
luＩ断片とを加え、同時に結合することにより、キメラ
抗体κ鎖open reading frame 全長（Ｌκ，Ｖκ，Ｃκ
が正しい方向で連結されたもの：以下、Ｉgkvと略記す
ることがある）を含むプラスミドpＴＢ１４２７を取得
した。ここで用いたＶκv cＤＮＡは、ＰＣＲで増幅し
たＶκ cＤＮＡ遺伝子をクローニングするための制限酵
素部位としてＢclＩサイトを含んでいるが、このサイ
トを導入したために１アミノ酸の置換（Ｇlu 130→Ｖal
130）を生じている。そこで、このアミノ酸の置換を修
正するために以下の操作を実施した。すなわち、pＵＣ
１１９をＰvuIIで切断後、pＥcoＲＩリンカー（GGAATTC
C，タカラ酒造）を連結し、さらにＥcoＲＩで切断後、
２.８kbの断片を単離した。このＤＮＡ断片と、pＴＢ１
４２７より単離したＩgkv cＤＮＡを含む０.７３kb Ｅc
oＲＩ断片とを結合することにより、pＴＢ１４０５プラ
スミドを構築した。pＴＢ１４０５プラスミドをＢclＩ
とＰvuIIとで切断後、pＴＢ１３９３より単離したＶκ
−ＦＩＢ cＤＮＡを含む０.３３kb ＰvuII−ＢglII断
片を結合することにより、元のＶal 130→Ｇlu 130に修
正されたキメラκ鎖cＤＮＡ遺伝子（Ｉgk−ＦＩＢ）を
含むプラスミドpＴＢ１４１０を取得した。

【００４４】pＴＢ１４２７に含まれるキメラκ鎖cＤＮ
Ａの全塩基配列を〔図１４〕，〔図１５〕に示す。ま
た、本実験に用いたプライマーの塩基配列を下記する。５'SK ５'-AGAATTCCGCC ATG ATG AGT CCT GCC CAG TTC CTG-3'〔配列番号２８] ３'LK ５'-C ACG CGT TTC CCG AAT CCA GAG CAC TAA-3' 〔配列番号２７〕５'LK ５'-A ACG CGT GGT GAT ATT CAG CTG GCC CAG ACT CCA CTFC ACT-3' 〔配列番号２６〕３'CK ５'-C CGT ACG TTT GAT CAC CAG CTT GGT CCC CCC TCC GAA-3' 〔配列番号２５〕５'CK ５'-A CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC T-3' 〔配列番号２４〕３'EK ５'-AGAATT CTA ACA CTC TCC GCG GTT GAA GCT CTT TGT GAC-3' 〔配列番号２３〕３'mVK. ５'-G TTA GAT CTC CAG CTT GGT CCC-3' 〔配列番号４０〕

【化１】（２）マウス−ヒト・キメラ抗体重鎖cＤＮＡの取得上記（１）と同様の手法を用いて、マウス−ヒト・キメ
ラ抗ヒトフィブリン重鎖cＤＮＡ open reading frame
全長を含むプラスミドpＴＢ１３７３を取得した。すな
わち、上記（１）で調製したＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３
細胞のpoly(A)⁺−ＲＮＡを鋳型とし、Oligo−dＴプライ
マーを第一鎖cＤＮＡ合成用プライマーに、５'Ｃ２Ｈプ
ライマーと３'ＥＨプライマーとをＰＣＲ用プライマー
に用いて、ヒトγ₁鎖CH2−CH3ドメインをコードするcＤ
ＮＡ（以下、CH2CH3と略記することがある）を増幅し
た。同様に第一鎖cＤＮＡ合成用プライマーとして各々
３'ＥＨ，３'Ｃ２Ｈおよび３'Ｃ１Ｈプライマーを、Ｐ
ＣＲ用プライマーとして５'Ｃ１Ｈと３'Ｃ２Ｈ、５'Ｌ
Ｈと３'Ｃ１Ｈおよび５'ＳＨと３'ＬＨの組合わせを用
いることにより、ヒトγ₁鎖ＣＨ１ドメインをコードす
るcＤＮＡ(以下、ＣＨ１と略記することがある)、抗フ
ィブリン抗体Ｖ_H cＤＮＡ（以下、Ｖ_H−ＦＩＢと略記す
ることがある）およびリーダーペプチド cＤＮＡ(以
下、Ｌ_Hと略記することがある)を増幅した。各々の増幅
遺伝子断片（Ｌ_H：０.０８kb，Ｖ_H−ＦＩＢ：０.３５k
b，ＣＨ１：０.３３kb，ＣＨ２ＣＨ３：０.６７kb）を
単離後、ＳmaＩで切断したpＵＣ１１９に結合させるこ
とにより、各々Ｌ_H，Ｖ_H−ＦＩＢ，ＣＨ１あるいはＣＨ
２ＣＨ３を含むプラスミドpＴＢ１３８６，pＴＢ１３８
９，pＴＢ１３８８およびpＴＢ１３９０を取得した。得
られたcＤＮＡ断片の塩基配列を確認後、Ｌ_H，Ｖ_H，Ｃ
Ｈ１およびＣＨ２ＣＨ３を順方向に連結した〔図１
６〕，〔図１７〕。

【００４５】すなわち、ｐＴＢ１３８８を制限酵素Ｈin
d IIIとＸhoＩとで消化後、ＣＨ１を含む０.３３kbのＤ
ＮＡ断片を単離した。一方、Ｖ_H−ＦＩＢ１を含むプラ
スミドpＴＢ１３８９をＨind IIIとＸhoＩとで消化後、
先に調製した０.３３kbのＣＨ１断片と結合することに
より、Ｖ_H−ＦＩＢ１とＣＨ１ cＤＮＡが正方向に連結
したプラスミドpＴＢ１３７１を得た。同様にこのpＴＢ
１３７１を制限酵素ＥcoＲＩとＳpeＩとで消化後、プラ
スミドpＴＢ１３８６より単離されたＬ_H cＤＮＡをコー
ドする０.０８kbのＥcoＲＩ−ＳpeＩ断片と結合するこ
とにより、Ｌ_H，Ｖ_H−ＦＩＢ１とＣＨ１ cＤＮＡとが正
方向に連結したプラスミドpＴＢ１３７２を得た。さら
に、このpＴＢ１３７２プラスミドよりＬ_H，Ｖ_Hおよび
ＣＨ１ cＤＮＡを含む０.７４kbのＥcoＲＩ−ＰmaＣＩ
断片を、またpＴＢ１３９０プラスミドよりＣＨ２ＣＨ
３ cＤＮＡを含む０.６７kbのＥcoＲＩ−ＰmaＣＩ断片
を単離し、これら２つの断片を同時にpＵＣ１１９のＥc
oＲＩ消化物と結合することにより、キメラＨ鎖遺伝子
全長（Ｌ_H，Ｖ_H，ＣＨ１，ＣＨ２ＣＨ３：以下、ＩgＨ
−ＦＩＢと略記することがある）をコードするpＴＢ１
３７３を取得した。pＴＢ１３７３に含まれるキメラＨ
鎖cＤＮＡの全塩基配列を〔図１８〕，〔図１９〕，
〔図２０〕および〔図２１〕に示す。また、用いたプラ
イマーの塩基配列を下記する。５'SH ５'-TGAATTCCACC ATG GAC TCC AGG CTC AAT-3' 〔配列番号３６〕３'LH ５'-CAC TAG TTG CAC CTC ACA GTC GAC ACC TTT TAA AAT AAG-3' 〔配列番号３５〕５'LH ５'-CAA CTA GTG GAG TCG GGG GGA GGC TTA GTG-3' 〔配列番号３４〕３'C1H ５'-ACT CGA GAC GGT GAC CAG GGT CCC TT-3' 〔配列番号３３〕５'C1H ５'-TC TCG AGT GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC-3' 〔配列番号３２〕３'C2H ５'-GCA CGT GTG AGT TTT GTC ACA AGA T-3' 〔配列番号３１〕５'C2H ５'-AC ACG TGT CCA CCG TGC CCG GCG CCT GAA CTC CTG GGG-3' 〔配列番号２９〕３'EH ５'-CGAATTCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA GAG GCT-3' 〔配列番号３０〕

【００４６】（３）マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフィブ
リン抗体cＤＮＡ発現用ベクターpＴＢ１３８７の構築上記（１）および（２）で構築したpＴＢ１３７３およ
びpＴＢ１４１０からそれぞれＩgＨ−ＦＩＢを含む１.
４kbのＥcoＲＩ断片およびＩgＫ−ＦＩＢを含む０.７３
kb ＥcoＲＩ断片を単離し、ＥcoＲＩで切断した動物細
胞発現用ベクターpＣＤＬ−ＳＲα２９６と結合させる
ことにより各々キメラ抗体Ｈ鎖発現用ベクターpＴＢ１
３７４およびキメラ抗体κ鎖発現用ベクターpＴＢ１４
１１を構築した〔図２２〕。なお本実験で用いたpＣＤ
Ｌ−ＳＲα２９６は、cＤＮＡを動物細胞を発現させる
ために作製されたベクターであり、ＳＲαプロモーター
（ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ＨＴ
ＬＶ（Ｉ）ＬＴＲの部分（ＲおよびＵ５の一部）および
ＳＶ４０後期領域イントロンより成る）およびＳＶ４０
後期poly Ａ付加シグナル（poly Ａと略記することがあ
る）を有している。このＳＲαプロモーターとpoly Ａ
の間に存在するＥcoＲＩ部位に挿入することによりcＤ
ＮＡを効率よく発現させることができる［Takabe ら：
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.
Cell. Biol.）Vol.８，p４６６−４７２（１９８
８）］。次にマウス−ヒト・キメラＨ鎖とマウス−ヒト
・キメラκ鎖および動物細胞選択マーカー遺伝子（Ｅco
−gpt）を同時に発現できるベクターpＴＢ１３８７を構
築した〔図２３〕，〔図２４〕および〔図２５〕。すな
わち、pＨＳＧ３９６（タカラ酒造）を制限酵素ＨindII
I−ＳacＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑化
後、マルチクローニングサイトを含む０.０６kbのＤＮ
Ａ断片を単離した。pＣＵ１１８（タカラ酒造）をＰvuI
Iで切断し２.８kbの断片を単離後、上記のマルチクロー
ニングサイトを含む０.０６kb断片と結合することによ
りpＴＢ１３７９を構築した。一方、pＭＡＭ（クローン
テック社）をＢamＨＩで切断しＴ４ポリメラーゼで末端
平滑化後、pＣlaＩリンカー（CATCGATG：タカラ酒造）
を連結し、さらにＣlaＩで切断後、E.coli gpt を含む
２.２５kbの断片を単離した。この２.２５kb E.coli gp
t 断片を、ＣlaＩで切断したpＴＢ１３７９と結合する
ことにより、E.coli gpt を含むプラスミドpＴＢ１３７
５を取得した。

【００４７】次にpＴＢ１４１１をＳalＩ−ＳcaＩで切
断しＴ４ポリメラーゼで末端平滑化後、ＳＲαプロモ
ーター・ＩgＫ−ＦＩＢ・poly Ａ部位を含む２.４kbの
断片を単離した。このＤＮＡ断片をpＴＢ１３７５をＸh
oＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑化した断片
と結合させることにより、pＴＢ１４２５を構築した。
さらに、pＴＢ１３７４をまずＳcaＩで切断し、ＳalＩ
で部分分解後、Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑化してＳＲ
αプロモーター・ＩgＨ−ＦＩＢ・poly Ａ部位を含む
３.０１kbのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片と
上記pＴＢ１４２５をＸbaＩで切断しＴ４ポリメラーゼ
で末端平滑化した断片とを結合することにより、ＩgＫ
−ＦＩＢ，ＩgＨ−ＦＩＢおよびE.coli gptを同時に発
現しうるベクターpＴＢ１３８７を取得した。（４）マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフィブリン抗体の作
製上記（３）で構築したpＴＢ１３８７を、電気穿孔法を
用いてマウス・ハイブリドーマＳＰ２／０細胞へ導入し
た。形質転換細胞株はミコフェノール酸６.５μg／ml含
有培地を用いて選択した。増殖を示した３１ウエルの培
養上清を参考例１に記載の抗フィブリン−キメラ抗体測
定用ＥＩＡに供した結果、７ウエルに抗フィブリン活性
が検出された。このようにして取得されたキメラ抗フィ
ブリン抗体産生形質転換細胞株（ＳＳ／Ｓ−３）は１５
０ng／mlの抗体を産生した。

【００４８】実施例５マウス−ヒト・キメラ抗ＵＫ抗
体発現用ベクターの構築（１）クローニング用ベクターの構築ＰＣＲで増幅した抗体Ｖ_H遺伝子およびＶ_K遺伝子をクロ
ーニングするためのベクターpＴＢ１４２０およびpＴＢ
１４２３を構築した〔図２６〕，〔図２７〕および。
〔図２８〕まず、実施例４で作成したpＴＢ１３７４をＳalＩ−Ｘh
oＩで切断しＴ４ポリメラーゼで末端平滑化後、転写タ
ーミネーターとpolyＡ部位とを含む０.４８kbのＤＮＡ
断片を単離した。このＤＮＡ断片と実施例４で作成した
pＴＢ１３７９をXbaＩ−ＢamＨＩで消化後、Ｔ４ポリメ
ラーゼで末端平滑化して得られる２.９kb断片とを結合
することにより、pＴＢ１４１５を構築した。次に、pＴ
Ｂ１３７４をＣlaＩ−ＸhoＩで切断しＴ４ポリメラーゼ
で末端平滑化後、得られる０.６４kbと０.１７kbのＤＮ
Ａ断片を回収した。一方でpＴＢ１４１５をＸhoＩで切
断し、Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑化したのち、先に調
製した０.６４kbおよび０.１７kbのＤＮＡ断片を同時に
結合させ、０.６４kb断片および０.１７kb断片がpoly
Ａ部位に対して正しい方向に並んだプラスミドpＴＢ１
４１７を得た。pＴＢ１４１７においては、ＳＲαプロ
モーター内部とpoly Ａ部位上流に存在したＸhoＩ部位
が消去されている（以下、ＳＲα'−プロモーターと称
する）。次に、実施例４で構築したpＴＢ１３７３およ
びpＴＢ１４２７をＥcoＲＩで切断し、それぞれ１.４kb
のＩgＨ−ＦＩＢを含むＥcoＲＩ断片および０.７kbのＩ
gkvを含むＥcoＲＩ断片を単離した。pＴＢ１４１７をＳ
alＩで切断しＴ４ポリメラーゼで切断後、pＥcoＲＩリ
ンカー（GGAATTCC：タカラ酒造）を結合した。さらにＥ
coＲＩで切断して得られる断片と、先に調製した１.４k
bのＩgＨ−ＦＩＢのＥcoＲＩ断片あるいは０.７kbのＩg
kv ＥcoＲＩ断片とを各々プロモーターに対して順方向
に結合することにより、Ｖ_H遺伝子クローニング用ベク
ターpＴＢ１４２０およびＶ_K遺伝子クローニング用ベク
ターpＴＢ１４２１を構築した。Ｖ_K遺伝子クローニング
用ベクターとしては、さらにpＴＢ１４２１をＨindIII
−ＣlaＩで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑化
後、pＸbaＩリンカー（CTCTAGAG：タカラ酒造）を結合
させた。次にＸbaＩで切断後、ＳＲα'−プロモーター
・Ｉgkv・poly Ａ部位を含む２kbの断片を単離した。こ
の２kb断片をpＴＢ１３７５のＸbaＩ部位に挿入するこ
とによりpＴＢ１４２３を得た。

【００４９】（２）抗ＵＫ抗体軽鎖可変部領域cＤＮＡ
の取得参考例９で得られたマウス抗ＵＫ抗体産生ハイブリドー
マＵＫ１−３細胞より、First Truck^TM mＲＮＡ Isolat
ion Kit (In Vitrogen社)を用いてpoly(A)⁺−ＲＮＡを
調製した。このpoly(A)⁺ −ＲＮＡを鋳型として、mＣκ
プライマーを第一鎖cＤＮＡ合成用プライマーに、実施
例４−(１)に記載の３'mＶκプライマーと５'mＶκプラ
イマーとをＰＣＲ用プライマーに用いることにより、実
施例４と同様の手法を用いて、抗ＵＫ抗体Ｖ_K cＤＮＡ
（以下、Ｖ_KUKと略記することがある）を増幅した。こ
の増幅断片を制限酵素ＰvuII−ＢglIIで切断後、上記
（１）で作製したpＴＢ１４２３ベクターの６.６kb Ｐv
uII−ＢclＩ断片と結合することにより、抗ＵＫ抗体Ｖ_K
cＤＮＡを含むプラスミドpＴＢ１４５６を取得した。p
ＴＢ１４５６にコードされるcＤＮＡの塩基配列を決定
したところ、機能的なＶ_K遺伝子であることが確認され
た。〔図２９〕〔配列番号２２〕にその塩基配列を示
す。また、用いたプライマーの塩基配列を下記する。 mＣγ₁ ５'−CAGGGGCCAGTGGATAGAC−３'〔配列番号４
３〕

【００５０】（３）抗ＵＫ抗体可変部重鎖領域cＤＮＡ
の取得上記（２）で調製したＵＫ１−３細胞poly(Ａ)⁺−ＲＮ
Ａを鋳型とし、mＣγ₁プライマーを第一鎖cＤＮＡ合成
用プライマーに、３'mＶ_H ²プライマーと５'mＶHiプライ
マーとをＰＣＲ用プライマーに用いることにより、実施
例４−（１）と同様の手法で抗ＵＫ抗体Ｖ_H cＤＮＡ
（以下、Ｖ_HＵＫと略記することがある）を増幅した。
約０.３６kbの増幅Ｖ_HＵＫ断片を単離後、このＤＮＡ断
片４０pgを鋳型とし、Ｖ_H０１プライマーとＪ_H０１プラ
イマーとを用いたＰＣＲを行ない、約０.３７kbの増幅
Ｖ_HＵＫ断片を単離した。このＤＮＡ断片をＳalＩ−Ｎh
eＩで切断後、pＴＢ１４２０の６.６kb ＳalＩ−ＮheＩ
断片と結合することによりＶ_HＵＫを含むプラスミドpＴ
Ｂ１４５５を取得した。pＴＢ１４５５にコードされるc
ＤＮＡの塩基配列を決定したところ、機能的なＶ_H遺伝
子であることが確認された〔図３０〕〔配列番号２
１〕。また、上記（２）で取得されたpＴＢ１４５６とp
ＴＢ１４５５とをＤＥＡＥ−デキストラン法（ＤＥＡＥ
−dextran法）［Nigel Whittleら：Protein Engineerin
g, Vol.１ No.６，４９９−５０５（１９８７）］を用
いてＣＯＳ細胞に同時に導入した。すなわち、ＣＯＳ細
胞を５％ＦＣＳを含むダルベッコ・モディファイド・イ
ーグル培地（以下、ＤＭＥＭと略すことがある）に懸濁
し、直径６cmの組織培養用ディシュに６×１０⁵個とな
るように播種した。３７℃で一晩培養後、培地を交換
し、２時間培養後プラスミドＤＮＡ（pＴＢ１４５６とp
ＴＢ１４５５）各１μgを含む１０mg／ml ＤＥＡＥ−デ
キストラン（ファルマシア社製）溶液１００μlと１０
０mＭクロロキン溶液２μlとを滴下し、３７℃でさらに
２〜４時間培養した。培養液を除去し、１０％ジメチル
スルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略すことがある）を含
むＰＢＳ２mlを加え２分間室温で放置後ＰＢＳで細胞
を洗浄し、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地２mlを加え３
７℃で培養した。３日後の培養上清を参考例６に記載の
ＨＲＰ標識抗ヒトＩgＧ抗体を用いるキメラ抗ＵＫ抗体
測定用ＥＩＡに供したところ、抗ＵＫ抗体活性を示し、
pＴＢ１４５５とpＴＢ１４５６とがそれぞれ目的の抗Ｕ
Ｋ活性を有するＶ_HおよびＶ_K遺伝子を含んでいることが
判明した。用いたプライマーの塩基配列を下記した。ｍＣ_K-1 ５'-CATTTTGTCGTTCACTGCCATC-3' 〔配列番号４４〕５'mVHi ５'-AT GTG CAA CTA GTG GAG TCG GG-3' 〔配列番号３７〕３'mVH2 ５'-ATTAACT CGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA-3' 〔配列番号３８〕 V_H01．５'-TC GTC GAC TGT GAG GTG CAA CTA GTG GAG-3' 〔配列番号４１〕 J_H01. ５'-TC GCT AGC ACT CGA GAC GGT GAC CG-3' 〔配列番号４２〕

【００５１】（４）マウス−ヒト・キメラ抗ＵＫ抗体発
現用ベクター（pＴＢ１４５８）の構築プラスミドpＭＡＭ−neo（クローンテック社）をＢamＨ
Ｉで切断しＴ４ポリメラーゼで末端平滑化後、ネオマイ
シン耐性遺伝子を含む２.７kbのＤＮＡ断片を単離し
た。この２.７kb断片と上記（３）で取得したpＴＢ１４
５５をＨindIIIで切断後、Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑
化して得られるＤＮＡ断片とを結合することにより、p
ＴＢ１４５７を構築した。次に、上記（２）で取得した
pＴＢ１４５６をＸbaＩで切断しＴ４ポリメラーゼで末
端平滑化後、キメラκ鎖cＤＮＡを含む２.０kbの断片を
単離した。この２.０kb断片と、pＴＢ１４５７をＣlaＩ
で消化後Ｔ４ポリメラーゼで末端平滑化して得られるＤ
ＮＡ断片とを結合することにより、pＴＢ１４５８を取
得した。pＴＢ１４５８はキメラ抗ヒトＵＫ重鎖、キメ
ラ抗ヒトＵＫ軽鎖およびネオマイシン耐性遺伝子を同時
に発現しうるベクターである。以上の操作は〔図３１〕
に示した通りである。（５）マウス−ヒト・キメラ抗ヒトＵＫ抗体の作製上記（４）で構築したpＴＢ１４５８を電気穿孔法を用
いてマウス・ハイブリドーマＳＰ２／０細胞へ導入し
た。形質転換体はＧ４１８１mg／ml含有培地を用いて
選択した。増殖を示した７２ウエルの培養上清を、参考
例６に記載のＨＲＰ標識抗ヒトＩgＧ抗体を用いるキメ
ラ抗ＵＫ抗体測定用ＥＩＡに供したところ、全ウエルに
抗ＵＫ抗体活性が検出され、目的のキメラ抗ＵＫ抗体産
生細胞であることが判明した。そこで限界希釈法による
クローニングを実施し、クローン化された細胞の培養上
清を同様のＥＩＡのスクリーニングに供して、ヒトＵＫ
結合能の強い抗体を安定的に産生するマウス−ヒト・キ
メラ抗体産生細胞クローンＳＵ／Ｓ−９.２１を取得し
た。（６）キメラ抗体産生細胞の性状ＳＵ／Ｓ−９.２１細胞を１×１０⁵個／mlの濃度で播種
し、経時的に培養上清中の抗体量を測定した。抗体量は
ヤギ抗ヒトＩgＧ抗体感作マイクロプレートを用いるＥ
ＩＡで測定した。得られた結果は〔図３２〕に示される
通りであった。抗体産生量は約１８μg／mlであった。

【００５２】実施例６マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフ
ィブリン−抗ヒトＵＫ二重特異性抗体の作製（１）（１）遺伝子の導入と形質転換細胞株の選択実施例５で構築したベクターpＴＢ１４５８を、実施例
４で取得したマウス−ヒト・キメラ抗フィブリン抗体産
生形質転換細胞株ＳＳ／Ｓ−３へ電気穿孔法を用いて導
入した。新たな形質転換細胞株はミコフェノール酸６.
５μg／mlおよびＧ４１８１.０mg／ml含有培地を用い
て選択した。上記培地中で増殖を示した４８ウエルの培
養上清を、参考例７に記載の抗フィブリン−抗ＵＫ二重
特異性抗体測定用ＥＩＡに供したところ、１７ウエルに
二重特異性抗体活性が検出された。そこで二重特異性抗
体活性の強いウエルについて限界希釈法によるクローニ
ングを実施し、クローン化された細胞の培養上清を同様
のＥＩＡのスクリーニングに供して、二重特異性抗体を
安定的に産生するマウス−ヒト・キメラ二重特異性抗体
産生細胞クローンＳＵＳＦ／Ｓ−８.４を取得した。（２）キメラ二重特異性抗体産生細胞の性状ＳＵＳＦ／Ｓ−８.４細胞を１×１０⁶個／mlの濃度で播
種し、２４時間後の培養上清中の二重特異性抗体活性を
参考例７に記載のＥＩＡで測定した。得られた結果を
〔図３３〕に示した。

【００５３】実施例７マウス−ヒト・キメラ抗ヒトフ
ィブリン−抗ＵＫ二重特異性抗体の作製（２）（１）キメラ抗フィブリン抗体のマレイミド化実施例３−（５）で取得したキメラ抗フィブリン抗体Ｆ
ＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３１０mgを５mＭ酢酸緩衝液（pＨ
５.０）２mlに溶解後、２倍モルのＮ−（ε−マレイミ
ドカプロイロキシ）スクシミドエステルのジメチルホル
ムアミド溶液５０μlを添加し３０℃で２０分間反応さ
せた。反応混液を０.１Ｍリン酸緩衝液（pＨ６.５）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに供し結合試
薬を除去した。（２）キメラ抗ＵＫ抗体スルフヒドリル化実施例５−（５）で取得したキメラ抗ＵＫ抗体産生細胞
ＳＵ／Ｓ−９.２１を実施例３−（５）に記載の方法に
従い腹水化した。得られた精製抗体１０mgを２mlの０.
０５ＭＰＢＳ（pＨ７.３）に溶解後、２倍モルのＳＰ
ＤＰメタノール溶液５０μlを添加した。３０℃で３０
分間反応後、０.１ＭＤＴＴ水溶液５０μlを添加し還
元後、（１）に記載のセファデックスＧ−２５カラムに
供して過剰の試薬を除去した。（３）キメラ二重特異性抗体の作製（１）で得たマレイミド化抗フィブリン抗体８mgに、
（２）で作製したスルフヒドリル化抗ＵＫ抗体８mgを氷
冷下撹拌しながらゆっくりと添加し、一夜反応させた。
反応混液をセファクリルＳ−２００カラムに供し、未反
応の抗体を化学結合二重特異性抗体から分離除去した結
果、約７mgのキメラ抗ヒト・フィブリン抗ＵＫ二重特異
性抗体を取得した。（４）二重特異性抗体の結合能（３）で作製した二重特異性抗体を参考例３に記載のＥ
ＩＡに供したところ、実施例６−（２）記載のキメラ二
重特異性抗体と同様にヒト・フィブリンおよびＰroＵＫ
の両者に強い結合能を示した。

【００５４】実施例８ＰroＵＫフィブリン溶解能の増
強（１）公知の方法［D. Collenら：スロンボーシス・アンド・
ヘモスターシス（Thromb.Haemostasis）．４５，２２５
（１９８１）］に従い、血漿凝塊溶解試験（plasma clo
t lysis assay）を実施した。すなわち、一定量のＰro
ＵＫ（最終濃度２５０ng／ml）に実施例６−（１）で取
得したキメラ二重特異性抗体産生細胞ＳＵＳＦ／Ｓ−
８.４を実施例３−（５）に記載の方法に従い腹水化
後、培養して得られたキメラ二重特異性抗体を種々の濃
度で添加し、室温で２０分間反応させた。このＰroＵＫ
−抗体混液にヒト血漿を添加し、次いでヒトトロンビン
を最終濃度１.０Ｕ／mlとなるように加えて血漿を凝固
させた。溶解度分析計（Euglobulin lysis analyzer
“ELT-6"Mebanix Co.）を用いて血漿の濁度を経時的に
観察し、溶解に要する時間を測定した。得られた結果は
〔図３４〕に示した通りであった。ＰroＵＫへのキメラ
二重特異性抗体ＳＵＳＦ／Ｓ−８.４（●）の添加によ
り血漿溶解能は増強され、モル比１：１でほぼプラトー
となった。このＰroＵＫの溶解能増強効果は元のマウス
二重特異性抗体ＦＵ１−７４（○）とほぼ同等の強い活
性を示した。

【００５５】実施例９ＰroＵＫフィブリン溶解能の増
強（２）（１）¹²⁵Ｉ標識プラズマ塊の作製市販の¹²⁵Ｉ標識ヒトフィブリノーゲン（１０μg／１０
μl：室町化学工業販売）をヒト血漿６００μlに加えた
のち、ウシトロンビン（１Ｕ／１００μl）を添加し迅
速に撹拌した。１０％Tween８０で処理したカテーテル
に吸い上げ室温で１分間放置後、さらに３７℃で３０
分間インキュベートした。得られたプラズマ塊を生理食
塩水を入れたシャーレに押し出し、メスで１cm間隔に切
断し、各切片の放射活性をγ−カウンターで測定した。（２）ハムスター肺動脈塞栓モデル実験ハムスター（体重８０−１００ｇ）にペントバルビター
ル（６mg／０.３ml）を腹腔内投与後、大腿静脈に採血
用カテーテルを挿入した。次に（１）で作製した¹²⁵Ｉ
標識プラズマ塊をカテーテルに吸い上げ頚静脈から注入
後、サンプル投与用カテーテルを挿入した。頚静脈から
ＮaＩ（０.２mg／０.１ml）とヘパリン（１００Ｕ／０.
１ml）とを投与後、さらにＰroＵＫもしくはＰroＵＫに
２倍モルのキメラ二重特異性抗体を添加した免疫複合
体３５０μlを投与した。室温で９０分間放置後採血
（１ml）し、さらに胸部を開き、右肺、左肺および心臓
を摘出し、それぞれの臓器の放射活性をγ−カウンター
で測定した。投与した全放射活性量に対する３つの臓器
における残存放射活性量の割合から、プラズマ塊の溶解
率を測定した。得られた結果は〔図３５〕に示した通り
であった。

【００５６】

【配列表】

配列番号（SEQ ID NO)：1 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：16 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11 配列: Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15

【００５７】配列番号（SEQ ID NO)：2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：７配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥＴＹＰＥ）：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11

【００５８】配列番号（SEQ ID NO)：3 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：8 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11

【００５９】配列番号（SEQ ID NO)：4 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：5 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acidトポロジ -(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11

【００６０】配列番号（SEQ ID NO)：5 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：16 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11 配列: Ser Ile Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys Gly 1 5 10 15

【００６１】配列番号（SEQ ID NO)：6 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：9 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：ｌｉｎｅａｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11

【００６２】配列番号（SEQ ID NO)：7 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：112 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：protein 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11 配列: Asp Val Val Met Ala Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Phe Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Tyr Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Ile His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

【００６３】配列番号（SEQ ID NO)：8 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：115 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：protein 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11 配列: Asp Val Gln Leu Trp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Val Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly 85 90 95 Asn Phe Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115

【００６４】配列番号（SEQ ID NO)：9 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：22 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： AGGTGCAGCT GKKGSAGTCK GG 22

【００６５】配列番号（SEQ ID NO)：10 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：34 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTGGCC CCAG 34

【００６６】配列番号（SEQ ID NO):11 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：973 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：double トポロジ−(TOPOLOGY)：ｌｉｎｅａｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：Genomic
DNA 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：FIB1-11 配列の特徴(FEATURE)1..152 S intron 1202..602 S intron 2951..973 S intron 3153..613 S sig peptide614..949 S mat peptide 配列： GCCCACATAA CTGCCCCTTC TTTGTATACT GTTATACTGT CCAGAACATT TGCATATTGT 60 TCCCTGGGAA ATCTTTGCCC TGTTGGCCTG AGATAAAACC TCAAGTGTCC TCTTGCCTCC 120 ACTGATCACT CTCCTATGTT CATTTCCTCA AA ATG ATG AGT CCT GCC CAG TTC CTG 176 Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu -20 -15 TTT CTG TTA GTG CTC TGG ATT CGG GGTAAGGAGT TCTGGAATGG GAGGGATGAG 230 Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg -IO -5 AATGGGGATG GAGGGTGATC TCTGGATGCC TATGTGTGCT GTTTATTTGT GGTGGGGCAG 290 GTCATATCTT CTAGGATGTG AGGTTTTGTT ACATCCTAAT GAGATATTCC AGATGGAACA 350 GTAGGTGTAC TGAGATCAAT ATTCTGACAT AGATTGGATG GAGTGGTGTA GACTCTGATG 410 ATTAGAGCCT TCAACATTTG TTTCATGACA AAATATTTGA TATATAATAT TTTTAAATCT 470 GAAAAACTGG TAGGATCTTA CTTGAAGGAA TACCATTTTC GAGTAAGATT TCAAGAAGAT 530 TTTCAAGTAG ATTTCACAAA GGTTACTCAG GACCTTTGCA CATGATTTTC CACTATTCTA 590 TTGTCATTTC AG AA ACC AAC GGT GAT GTT GTG ATG GCC CAG ACT CCA CTC 640 Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Ala Gln Thr Pro Leu 1 5 ACT TTG TCG GTT ACC ATT GGA CAA CCA GCC TTC ATC TCT TGC ACG TCA 688 Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Phe Ile Ser Cys Thr Ser 10 15 20 25 AGT CAG AGC CTC TTA GAT AGT GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT TGG TTG 736 Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu 30 35 40 TTA CAG AGG CCA GGC CAG TCT CCA AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT 784 Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser 45 50 55 AAA CTG TAC TCT GGA GTC CCT GAC AGG TTC ACT GGC AGT GGA TCA GGG 832 Lys Leu Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 60 65 70 ACA GCT TTC ACA CTG AAA ATC AAC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA 880 Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 75 80 85 GTT TAT TAT TGC TGG CAA GGT ATA CAT TTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG 928 Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 90 95 100 105 GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGTAAGTAGT CTTCTCAACT CTTG 973 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 110

【００６７】配列番号（SEQ ID NO)：12 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：684 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：double トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：Other nucleic acid(cDN
A to mRNA ＋ Genomic DNA) 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE)：FIB1-11 配列の特徴(FEATURE)1..150 S intron 1197..313 S intron 2670..684 S intron 3151..324 S sig peptide325..669 S mat peptide 配列 GCATGCTATA GAGGAAGATA TGCAAATAAT TCTTCTCTGA GTTCATATAA ACCAGCCCTG 60 CCCCGAGTCT GTAGCTCTGA CAGAGGAGCC AAGCCCTGGA TTCCCAGGTC CTCACATTCA 120 GTGATCAGCA CTGAACACAG ACCACTCACC ATG GAC TCC AGG CTC AAT TTA GTT 174 Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val -15 TTC CTT GTC CTT ATT TTA AAA GGTAATTTGT AGAGATGAGT TTCTGCCTGT 225 Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys -10 -5 TGTGTGCCCA AGGGAAATAG AAACATTGTT TGTTTCATTA TTTTATTTTG TTAGTAACAG 285 TTTTCTGACC AGCATTCTCT GTTTGCAG GT GTC CAG TGT GAT GTG CAG CTG TGG 339 Gly Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Trp 1 5 GAG TCG GGG GGA GGC TTA GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC 387 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 10 15 20 TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAT GAC ATG TCT TGG GTT 435 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Asp Met Ser Trp Val 25 30 35 CGC CAG ACT CCA GAG AGG AGG CTG GAG TGG GTC GCA TCC ATT AGT GTT 483 Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Val 40 45 50 GGT GGT ACC ACC TAC TAT CCA GAC AGT ATG AAG GGC CGA TTC ACC ATC 531 Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile 55 60 65 TCC AGA GAT AAT GCC AGG AAC ATC CTG TAT CTG CAA TTG AGC AGT CTG 579 Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu 70 75 80 85 AGG TCT GAA GAC ACG GCC ATG TAT TAC TGT GGT AAC TTC GCG GAT GCT 627 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Asn Phe Ala Asp Ala 90 95 100 ATG GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGTAAGCTGG 679 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 105 110 115 CTTTT 684

【００６８】配列番号（SEQ ID NO)：13 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：10 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3

【００６９】配列番号（SEQ ID NO)：14 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：7 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3

【００７０】配列番号（SEQ ID NO)：15 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：9 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3

【００７１】配列番号（SEQ ID NO)：16 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：6 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3

【００７２】配列番号（SEQ ID NO)：17 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：16 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3 配列: Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15

【００７３】配列番号（SEQ ID NO)：18 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：12 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：peptide 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3

【００７４】配列番号（SEQ ID NO)：19 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：107 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：protein 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3 配列: Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Val Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Ser 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

【００７５】配列番号（SEQ ID NO)：20 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：123 配列の型(SEQUENCE TYPE)：amino acid トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：protein 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3 配列: Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Asp Phe Asp Ala Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120

【００７６】配列番号（SEQ ID NO):21 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：378 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：double トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：cDNA 起源(ORIGINAL SOURCE) 生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE）：UK1-3 配列の特徴(FEATURE)1..9 S sig peptide10..378 S mat peptide 配列： GTC GAC TGT GAG GTG CAA CTA GTG GAG TCG GGA CCT GGC CTG GTG AAA 48 Val Asp Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 1 5 10 15 CCT TCT CAG TCT CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC ACT GGC TAC TCA ATC 96 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile 20 25 30 ACC AGT GAT TAT GCC TGG AAC TGG ATC CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA 144 Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys 35 40 45 CTG GAG TGG ATG GGC TAC ATA AAC TAC AGT GGT ACC ACT AGT TAC AAC 192 Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn 50 55 60 CCA TCT CTC AAA AGT CGA ATC TCT ATC ACT CGA GAC ACA TCC AAT AAC 240 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Asn Asn 65 70 75 80 CAG TTC TTC CTG CAG TTG AAT TCT GTG ACT TCT GAG GAC ACT GCC ACA 288 Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr 85 90 95 TAT TAC TGT GCA AGA TTG GGT GAT TTC GAC GCG GGT GAC TAC TTT GAC 336 Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asp Phe Asp Ala Gly Asp Tyr Phe Asp 100 105 110 TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCG AGT GCT AGC 378 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

【００７７】配列番号（SEQ ID NO)：22 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：321 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：double トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：ｃＤＮＡ起源（ＯＲＩＧＩＮＡＬＳＯＵＲＣＥ）生物名(ORGANISM)：BALB/c mouse 組織の種類(TISSUE TYPE)：spleen 細胞の種類(CELL TYPE)：B cell hybridoma セルライン(CELL LINE)：UK1-3 配列の特徴(FEATURE)1..321 S mat peptide 配列：ＧＡＴＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡ
ＣＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧ４８ＡｓｐＩｌｅＧｌｎＬｅｕＴｈｒＧｌｎＳｅｒＰｒｏＡｌａ
ＬｅｕＭｅｔＳｅｒＡｌａＶａｌＰｒｏＧｌｙ１５
１０１５ＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣ
ＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＧＧＴＴＡＣＡＴＧ９６ＧｌｕＬｙｓＶａｌＴｈｒＭｅｔＴｈｒＣｙｓＳｅｒＡｌａ
ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＶａｌＧｌｙＴｙｒＭｅｔ２０２５
３０ＴＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣ
ＴＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴ１４４ＴｙｒＴｒｐＴｙｒＧｌｎＧｌｎＬｙｓＰｒｏＡｒｇＳｅｒ
ＳｅｒＰｒｏＬｙｓＰｒｏＴｒｐＩｌｅＳｅｒ３５４０
４５ＣＴＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣ
ＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴ１９２ＬｅｕＴｈｒＳｅｒＡｓｎＬｅｕＡｌａＳｅｒＧｌｙＶａｌ
ＰｒｏＡｌａＡｒｇＰｈｅＳｅｒＧｌｙＳｅｒ５０５５
６０ＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ
ＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡ２４０ＧｌｙＳｅｒＧｌｙＴｈｒＳｅｒＴｙｒＳｅｒＬｅｕＴｈｒ
ＩｌｅＳｅｒＳｅｒＭｅｔＧｌｕＡｌａＧｌｕ６５７０
７５８０ＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＡＧＴＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧ２８８ＡｓｐＡｌａＡｌａＴｈｒＴｙｒＴｙｒＣｙｓＧｌｎＧｌｎ
ＴｒｐＳｅｒＳｅｒＡｓｐＰｒｏＰｒｏＴｈｒ８５
９０９５ＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣ
ＡＡＡＣＧＴ３２１ＰｈｅＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｈｒＬｙｓＬｅｕＧｌｕＩｌｅ
ＬｙｓＡｒｇ１００１０５

【００７８】配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：23 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：39 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジ−(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： AGAATTCTAA CACTCTCCGC GGTTGAAGCT CTTTGTGAC 39

【００７９】配列番号（SEQ ID NO)：24 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：26 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCT 26

【００８０】配列番号（SEQ ID NO)：25 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：37 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CCGTACGTTT GATCACCAGC TTGGTCCCCC CTCCGAA 37

【００８１】配列番号（SEQ ID NO)：２６配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＥＮＧＴＨ）：40 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： AACGCGTGGT GATATTCAGC TGGCCCAGAC TCCACTCACT 40

【００８２】配列番号（SEQ ID NO)：27 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：28 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CACGCGTTTC CCGAATCCAG AGCACTAA 28

【００８３】配列番号（SEQ ID NO)：28 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：35 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： AGAATTCCGC CATGATGAGT CCTGCCCAGT TCCTG 35

【００８４】配列番号（SEQ ID NO)：29 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：38 配列の型(SEQUENCE TYPE)：ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： ACACGTGTCC ACCGTGCCCG GCGCCTGAAC TCCTGGGG 38

【００８５】配列番号（SEQ ID NO)：30 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：32 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CGAATTCATT TACCCGGGGA CAGGGAGAGG CT 32

【００８６】配列番号（SEQ ID NO)：31 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：35 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： GCACGTGTGA GTTTTGTCAC AAGAT 25

【００８７】配列番号（SEQ ID NO)：32 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：35 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：ｌｉｎｅａｒ配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥＴＹＰＥ）：other nu
cleicacid（synthetic DNA) 配列： TCTCGAGTGC TAGCACCAAG GGCCCATCGG TCTTC 35

【００８８】配列番号（SEQ ID NO)：33 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：26 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： ACTCGAGACG GTGACCAGGG TCCCTT 26

【００８９】配列番号（SEQ ID NO)：34 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：30 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CAACTAGTGG AGTCGGGGGG AGGCTTAGTG 30

【００９０】配列番号（SEQ ID NO)：35 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：39 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CACTAGTTGC ACCTCACAGT CGACACCTTT TAAAATAAG 39

【００９１】配列番号（SEQ ID NO)：36 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：29 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： TGAATTCCAC CATGGACTCC AGGCTCAAT 29

【００９２】配列番号（SEQ ID NO)：37 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：22 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： ATGTGCAACT AGTGGAGTCS GG 22

【００９３】配列番号（SEQ ID NO)：38 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：37 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列：ＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣ
ＣＣＣＡ３７

【００９４】配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：39 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：24 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： GACATTCAGC TGACMCAGWC TCCA 24

【００９５】配列番号（SEQ ID NO)：40 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：22 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： GTTAGATCTC CAGCTTGGTC CC 22

【００９６】配列番号（SEQ ID NO)：41 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：29 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： TCGTCGACTG TGAGGTGCAA CTAGTGGAG 29

【００９７】配列番号（SEQ ID NO)：４２配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＥＮＧＴＨ）：25 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： TCGCTAGCAC TCGAGACGGT GACCG 25

【００９８】配列番号（SEQ ID NO)：43 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：19 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CAGGGGCCAG TGGATAGAC 19

【００９９】配列番号（SEQ ID NO)：44 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：22 配列の型(SEQUENCE TYPE)：nucleic acid 鎖の数（STRANDEDNESS)：single トポロジー(TOPOLOGY)：linear 配列の種類（MOLECULE TYPE)：other nucleic acid（sy
nthetic DNA) 配列： CATTTTGTCG TTCACTGCCA TC 22

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１−（１）で作製したＶ_FKゲノム遺伝子
の塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。リーダー配列
（Leader）の位置を示し、転写プロモーター（オクタマ
ー配列）を四角で囲った。

【図２】実施例１−（１）で作製したＶ_FKゲノム遺伝子
の塩基配列と推定アミノ酸配列（〔図１〕の続き）を示
す。さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）、相補性決定
領域（ＣＤＲ）および推定されるＶ_KII遺伝子とＪ_K2遺
伝子の組換え位置を示す。

【図３】実施例１−（３）で構築したマウス−ヒト・キ
メラ抗体軽鎖発現用ベクター（pＳＶ₂−hＦ_K）の構造を
示す。さらに、抗体遺伝子エキソン部は□で示す。

【図４】実施例１−（３）で構築したマウス−ヒト・キ
メラ抗体軽鎖発現用ベクター（pＳＶ₂−hＦ_K）の構造
（〔図３〕の続き）を示す。さらに、抗体遺伝子エキソ
ン部は□で示す。

【図５】実施例２−（１）で取得した増幅cＤＮＡ断片
（レーンＦ）のＰＡＧＥを示す。レーンＭは分子量マー
カー（pＢＲ３２２／ＨinfＩ）を示す。

【図６】実施例２−（１）で作製したキメラＶ_FHゲノム
遺伝子の塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。リーダー
配列（Leader）の位置を示し、転写プロモーター（オク
タマー配列）を四角で囲った。

【図７】実施例２−（１）で作製したキメラＶ_FHゲノム
遺伝子の塩基配列と推定アミノ酸配列（〔図６〕の続
き）を示す。さらに、フレームワーク領域（ＦＲ）、相
補性決定領域（ＣＤＲ）およびＶ_HNL1とＶ_FH−cＤＮＡ
との組換え位置とＶ_HIII−Ｄ_SP2−Ｊ_H4遺伝子組換えの
推定位置を示す。また、ＰＣＲプライマーに由来する配
列を下線で示す。

【図８】実施例２−（３）で構築したマウス−ヒト・キ
メラ抗体重鎖発現用ベクター（pＳＶ₂−hＦＨ）の構造
を示す。さらに、抗体遺伝子エキソン部は□で示す。ま
た、ＰＣＲで得られたＶ_FH−cＤＮＡ部はＶＦＨで示
す。

【図９】実施例２−（３）で構築したマウス−ヒト・キ
メラ抗体重発現用ベクター（pＳＶ₂-hＦＨ）の構造
（〔図８〕の続き）を示す。さらに、抗体遺伝子エキソ
ン部は□で示す。また、ＰＣＲで得られたＶ_FH−cＤＮ
Ａ部はＶＦＨで示す。

【図１０】実施例３−（２）で取得したマウス−ヒト・
キメラ抗体産生細胞ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３の増殖能
（●）および抗体産生能（○）を示す。

【図１１】実施例３−（４）に記載のキメラ抗体ＦＩＢ
１−ＨＯ１／Ｘ６３（○）とマウス抗体ＦＩＢ１−１１
（●）のフィブリン・モノマー感作マイクロプレートへ
の結合に対する、参考例２−（１）に記載のペプチド−
ＢＳＡ複合体の結合阻害を示す。

【図１２】実施例４−（１）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリンκ鎖cＤＮＡをコードするプラ
スミドpＴＢ１４１０の構築図を示す。

【化２】

【図１３】実施例４−（１）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリンκ鎖cＤＮＡをコードするプラ
スミドpＴＢ１４１０の構築図（〔図１２〕の続き）を
示す。

【化３】

【図１４】実施例４−（１）で作製したキメラκ鎖cＤ
ＮＡ（Ｉgkv）の塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。
さらにリーダー配列（Leader）および可変部領域
（Ｖ_K）を示す。

【図１５】実施例４−（１）で作製したキメラκ鎖cＤ
ＮＡ（Ｉgkv）の塩基配列と推定アミノ酸配列（〔図１
４〕の続き）を示す。さらに可変部領域（Ｖ_K）および
定常部領域（Ｃ_K）を示す。

【図１６】実施例４−（２）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリン重鎖cＤＮＡをコードするプラ
スミドpＴＢ１３７３の構築図を示す。

【化４】

【図１７】実施例４−（２）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリン重鎖cＤＮＡをコードするプラ
スミドpＴＢ１３７３の構築図（〔図１６〕の続き）を
示す。

【化５】

【図１８】実施例４−（２）で作製したキメラＨ鎖cＤ
ＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。さらにリー
ダー配列（Leader）および可変部領域（Ｖ_H）を示す。

【図１９】実施例４−（２）で作製したキメラＨ鎖cＤ
ＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列（〔図１８〕の続
き）を示す。さらに可変部領域（Ｖ_H）および定常部領
域（ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２）を示す。

【図２０】実施例４−（２）で作製したキメラＨ鎖cＤ
ＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列（〔図１９〕の続
き）を示す。さらに定常部領域（ＣＨ２，ＣＨ３）を示
す。

【図２１】実施例４−（２）で作製したキメラＨ鎖cＤ
ＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列（〔図２０〕の続
き）を示す。

【図２２】実施例４−（３）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリンκ鎖発現用ベクター（ｐＴＢ１
４１１）およびＨ鎖発現用ベクター（pＴＢ１３７４）
の構築図を示す。pcＤＬ−ＳＲα２９６由来のＳＲα−
プロモーター（ＳＲα）を

【化６】

【図２３】実施例４−（３）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリン抗体cＤＮＡ発現用ベクター（p
ＴＢ１３８７）の構築図を示す。

【化７】

【図２４】実施例４−（３）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリン抗体cＤＮＡ発現用ベクター（p
ＴＢ１３８７）の構築図（〔図２３〕の続き）を示す。

【化８】

【図２５】実施例４−（３）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ヒトフィブリン抗体cＤＮＡ発現用ベクター（p
ＴＢ１３８７）の構築図（〔図２４〕の続き）を示す。

【化９】

【図２６】実施例５−（１）で作製した抗体Ｖ_H cＤＮ
Ａクローニング用ベクターpＴＢ１４２０および抗体Ｖ_K
cＤＮＡクローニング用ベクターpＴＢ１４２３の構築
図を示す。

【化１０】

【図２７】実施例５−（１）で作製した抗体Ｖ_H cＤＮ
Ａクローニング用ベクターpＴＢ１４，２０および抗体
Ｖ_K cＤＮＡクローニング用ベクターpＴＢ１４２３の構
築図（〔図２６〕の続き）を示す。

【化１１】

【図２８】実施例５−（１）で作製した抗体Ｖ_H cＤＮ
Ａクローニング用ベクターpＴＢ１４２０および抗体Ｖ_K
cＤＮＡクローニング用ベクターpＴＢ１４２３の構築
図（〔図２７〕の続き）を示す。

【化１２】

【図２９】実施例５−（２）で得られた抗ＵＫ抗体Ｖ_K
cＤＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。また、
相補性決定領域（ＣＤＲ）の推定位置を示し、ＰＣＲプ
ライマーに由来する配列を下線で示す。

【図３０】実施例５−（３）で得られた抗ＵＫ抗体Ｖ_H
cＤＮＡの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。また相
補性決定領域（ＣＤＲ）の推定位置を示し、ＰＣＲプラ
イマーに由来する配列を下線で示す。

【図３１】実施例５−（４）で作製したマウス−ヒト・
キメラ抗ＵＫ抗体発現用ベクター（pＴＢ１４５８）の
構築図を示す。ＳＲα′−プロモーターとpoly Ａシグ
ナル

【化１３】

【図３２】実施例５−（６）で取得したマウス−ヒト・
キメラ抗ＵＫ抗体産生細胞ＳＵ／Ｓ−９.２１の抗体産
生能を示す。

【図３３】実施例６−（１）で取得したキメラ二重特異
性抗体産生細胞ＳＵＳＦ／Ｓ−８.４の二重特異性抗体
産生能を示す。

【図３４】実施例６−（１）に記載のキメラ二重特異性
抗体ＳＵＳＦ／Ｓ−８.４をin vitro 血漿凝塊溶解試験
に供した結果を表す。縦軸はＰroＵＫ単剤（抗体非存在
下）の溶解能を１とした時のＰroＵＫ／抗体複合体の溶
解能を表す。

【図３５】実施例６−（１）に記載のキメラ二重特異性
抗体ＳＵＳＦ／Ｓ−８.４をＰroＵＫと結合させ、in vi
tro ハムスター肺動脈塞栓モデル実験に供した時の結果
を表す。ＰroＵＫ単剤投与の結果との比較を示す。

【符号の説明】

Ｅ：ＥcoＲＩサイトＨ：ＨindIII サイトＢ：ＢamＨＩサイトＭ：ＭluＩサイトＨp ：ＨpaＩサイトＰ：ＰstＩサイト hＣＫ：ヒト κ鎖Ｃ領域遺伝子（エキソン）ＶＦＫ：ＦＩＢ１−１１ κ鎖Ｖ領域遺伝子エキ
ソンＬ：〔図３〕および〔図４〕においてＦＩＢ１
−１１ κ鎖リーダー配列遺伝子エキソンを、〔図
８〕および〔図９〕においてＮＬ−１Ｈ鎖リーダー
ペプチドエキソンをそれぞれ示す。 ● ：〔図３〕および〔図４〕においてＦＩＢ１
−１１ κ プロモーターを、〔図８〕および〔図９〕
においてＮＬ−１細胞Ｈ鎖プロモーターをそれぞれ
示す。Ｅn ：ヒトＩgＧＨ鎖エンハンサー hＣγ₁ ：ヒト γ鎖定常領域エキソンＶＨＮＬ−１：ＮＬ−１Ｈ鎖Ｖ領域エキソンＶＦＨ：ＦＩＢ１−１１Ｈ鎖Ｖ領域cＤＮＡＥＶ：ＥcoＲＶサイトＢg ：ＢglII サイトＢs ：ＢstＰＩサイトＰv ：ＰvuII サイトＢc ：ＢclＩサイトＰs ：ＰstＩサイトＳpl ：ＳplＩサイトＰm ：ＰmacＩサイトＳp ：ＳpeＩサイトＸh ：ＸhoＩサイトＣ：ＣlaＩサイトＳac ：ＳacＩサイトＳca ：ＳcaＩサイトＳ：ＳalＩサイトＳpe ：ＳpeＩサイトＸb ：ＸbaＩサイト

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【手続補正書】

【提出日】平成４年２月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５５】実施例９ＰroＵＫフィブリン溶解能の増
強（２）（１）¹²⁵Ｉ標識プラズマ塊の作製市販の¹²⁵Ｉ標識ヒトフィブリノーゲン（１０μg／１０
μl：室町化学工業販売）をヒト血漿６００μlに加えた
のち、ウシトロンビン（１Ｕ／１００μl）を添加し迅
速に撹拌した。１０％Tween８０で処理したカテーテル
に吸い上げ室温で１分間放置後、さらに３７℃で３０
分間インキュベートした。得られたプラズマ塊を生理食
塩水を入れたシャーレに押し出し、メスで１cm間隔に切
断し、各切片の放射活性をγ−カウンターで測定した。（２）ハムスター肺動脈塞栓モデル実験ハムスター（体重８０−１００ｇ）にペントバルビター
ル（６mg／０.３ml）を腹腔内投与後、大腿静脈に採血
用カテーテルを挿入した。次に（１）で作製した¹²⁵Ｉ
標識プラズマ塊をカテーテルに吸い上げ頚静脈から注入
後、サンプル投与用カテーテルを挿入した。頚静脈から
ＮaＩ（０.２mg／０.１ml）とヘパリン（１００Ｕ／０.
１ml）とを投与後、さらにＰroＵＫもしくはＰroＵＫに
２倍モルのキメラ二重特異性抗体を添加した免疫複合
体３５０μlを投与した。室温で９０分間放置後採血
（１ml）し、さらに胸部を開き、右肺、左肺および心臓
を摘出し、それぞれの臓器の放射活性をγ−カウンター
で測定した。投与した全放射活性量に対する３つの臓器
における残存放射活性量の割合から、プラズマ塊の溶解
率を測定した。得られた結果は〔図３５〕に示した通り
であった。図中（●）はＰr oＵＫと二重特異性抗体ＳＵ
ＳＦ／Ｓ−８．４との１：２複合体投与を、（○）はＰ
roＵＫ単独投与を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 8413−4ＣＭ 8413−4ＣＣ０７Ｋ 15/28 7731−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 9/72 7823−4Ｂ 15/13 15/62 // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8828−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式Ａ： -Thr Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly
Lys Thr Tyr Leu Asn-, Ｂ： -Leu Val Ser Lys Leu Tyr Ser- およびＣ： -Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Tyr- で示されるポリペプチド鎖Ａ，ＢおよびＣの少なくとも
一つを含む抗ヒトフィブリン抗体軽鎖可変領域とヒト抗
体軽鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗
体。
【請求項２】請求項１記載の抗ヒトフィブリン抗体軽鎖
可変領域をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項３】請求項１記載のヒト抗体軽鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡをさらに含有する請求項２記載のＤＮ
Ａ。
【請求項４】式Ｄ： -Asn Tyr Asp Met Ser-，Ｅ： -Ser Ile Ser Val Gly Gly Thr ThrTyr Tyr Pro A
sp Ser Met Lys Gly-およびＦ： -Gly Asn Phe Ala Asp Ala Met AspTyr- で示されるポリペプチド鎖Ｄ，ＥおよびＦの少なくとも
一つを含む抗ヒトフィブリン抗体重鎖可変領域とヒト抗
体重鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗
体。
【請求項５】請求項４記載の抗ヒトフィブリン抗体重鎖
可変領域をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】請求項４記載のヒト抗体重鎖定常領域をコ
ードするＤＮＡをさらに含有する請求項５記載のＤＮ
Ａ。
【請求項７】抗ヒトフィブリン抗体可変領域をコードす
るＤＮＡがマウスハイブリドーマ由来のＤＮＡである請
求項２、３、５または６記載のＤＮＡ。
【請求項８】マウスハイブリドーマがマウスハイブリド
ーマＦＩＢ１−１１である請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項９】請求項５もしくは６記載のＤＮＡをさらに
含有する請求項２もしくは３記載のＤＮＡ。
【請求項１０】請求項２もしくは３記載のＤＮＡを保持
することを特徴とする、キメラモノクローナル抗体を発
現させうる真核細胞。
【請求項１１】請求項５もしくは６記載のＤＮＡを保持
することを特徴とするキメラモノクローナル抗体を発現
させうる真核細胞。
【請求項１２】請求項９記載のＤＮＡを保持することを
特徴とする請求項１０記載の真核細胞。
【請求項１３】キメラモノクローナル抗体を発現させう
る真核細胞がマウス−ヒトキメラ抗ヒトフィブリン特異
抗体産生マウス骨髄腫細胞ＦＩＢ１−ＨＯ１／Ｘ６３で
ある請求項１２記載の真核細胞。
【請求項１４】請求項４記載の抗ヒトフィブリン抗体重
鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１記載の
キメラモノクローナル抗体。
【請求項１５】キメラモノクローナル抗体がマウス−ヒ
トキメラ抗ヒトフィブリン特異抗体である請求項１、４
または１４記載の抗体。
【請求項１６】式Ｇ： -Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met Tyr-, Ｈ： -Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser- およびＩ： -Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr- で示されるポリペプチド鎖Ｇ，ＨおよびＩの少なくとも
一つを含むウロキナーゼ類認識抗体軽鎖可変領域とヒト
抗体軽鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗
体。
【請求項１７】請求項１６記載のウロキナーゼ類認識抗
体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項１８】請求項１６記載のヒト抗体軽鎖定常領域
をコードするＤＮＡをさらに含有する請求項１７記載の
ＤＮＡ。
【請求項１９】式Ｊ： -Ser Asp Tyr Ala Trp Asn-, Ｋ： -Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Thr Thr Ser Tyr Asn
Pro Ser Leu Lys Ser-およびＬ： -Leu Gly Asp Phe Asp Ala Gly AspTyr Phe Asp T
yr- で示されるポリペプチド鎖Ｊ，ＫおよびＬの少なくとも
一つを含むウロキナーゼ類認識抗体重鎖可変領域とヒト
抗体重鎖定常領域とを含有するキメラモノクローナル抗
体。
【請求項２０】請求項１９記載のウロキナーゼ類認識抗
体重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項２１】請求項１９記載のヒト抗体重鎖定常領域
をコードするＤＮＡをさらに含有する請求項２０記載の
ＤＮＡ。
【請求項２２】ウロキナーゼ類認識抗体可変領域をコー
ドするＤＮＡがマウスハイブリドーマ由来のＤＮＡであ
る請求項１７、１８、２０または２１記載のＤＮＡ。
【請求項２３】マウスハイブリドーマがマウスハイブリ
ドーマＵＫ１−３である請求項２２記載のＤＮＡ。
【請求項２４】請求項２０もしくは２１記載のＤＮＡを
さらに含有する請求項１７もしくは１８記載のＤＮＡ。
【請求項２５】請求項１７もしくは１８記載のＤＮＡを
保持することを特徴とする、キメラモノクローナル抗体
を発現させうる真核細胞。
【請求項２６】請求項２０もしくは２１記載のＤＮＡを
保持することを特徴とするキメラモノクローナル抗体を
発現させうる真核細胞。
【請求項２７】請求項２４記載のＤＮＡを保持すること
を特徴とする請求項２５記載の真核細胞。
【請求項２８】キメラモノクローナル抗体を発現させう
る真核細胞がマウス−ヒトキメラウロキナーゼ類認識抗
体産生マウス骨髄腫細胞ＳＵ／Ｓ−９.２１である請求
項２７記載の真核細胞。
【請求項２９】請求項１９記載のウロキナーゼ類認識抗
体重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１６
記載のキメラモノクローナル抗体。
【請求項３０】キメラモノクローナル抗体がマウス−ヒ
ト・キメラウロキナーゼ類認識抗体である請求項１６、
１９または２９記載の抗体。
【請求項３１】ヒトフィブリンを特異的に認識する可変
領域とウロキナーゼ類を特異的に認識する可変領域とを
含有し、かつヒト抗体定常領域を含有している二重特異
性キメラモノクローナル抗体。
【請求項３２】請求項１記載のポリペプチド鎖Ａ，Ｂお
よびＣの少なくとも１つを含む抗ヒトフィブリン抗体軽
鎖可変領域を含有する請求項３１記載の二重特異性キメ
ラモノクローナル抗体。
【請求項３３】請求項４記載のポリペプチド鎖Ｄ，Ｅお
よびＦの少なくとも１つを含む抗ヒトフィブリン抗体重
鎖可変領域をさらに含有する請求項３２記載の二重特異
性キメラモノクローナル抗体。
【請求項３４】請求項１６記載のポリペプチド鎖Ｇ，Ｈ
およびＩの少なくとも１つを含むウロキナーゼ類認識抗
体軽鎖可変領域を含有する請求項３１記載の二重特異性
キメラモノクローナル抗体。
【請求項３５】請求項１９記載のポリペプチド鎖Ｊ，Ｋ
およびＬの少なくとも１つを含むウロキナーゼ類認識抗
体重鎖可変領域をさらに含有する請求項３４記載の二重
特異性キメラモノクローナル抗体。
【請求項３６】請求項９記載のＤＮＡおよび請求項２４
記載のＤＮＡを保持することを特徴とする二重特異性キ
メラモノクローナル抗体を発現させうる真核細胞。
【請求項３７】二重特異性キメラモノクローナル抗体を
発現させうる真核細胞がマウス−ヒト・キメラ抗体ヒト
フィブリン／抗ウロキナーゼ類二重特異性抗体産生マウ
スハイブリドーマＳＵＳＦ／Ｓ−８.４である請求項３
３記載の真核細胞。
【請求項３８】ヒトフィブリンに結合するキメラ抗体フ
ラグメントとウロキナーゼ類に結合するキメラ抗体フラ
グメントとを含有し、後者のキメラ抗体フラグメントに
ウロキナーゼ類を結合させてなる血栓溶解蛋白複合体。
【請求項３９】ヒトフィブリンに結合するキメラモノク
ローナル抗体とウロキナーゼ類に結合するキメラモノク
ローナル抗体とを共有結合させて得られる蛋白複合体
に、ウロキナーゼ類を免疫結合させてなる請求項３８記
載の血栓溶解蛋白複合体。
【請求項４０】請求項１または４記載のキメラモノクロ
ーナル抗体に請求項１６または１９記載のキメラモノク
ローナル抗体とを共有結合させて得られる蛋白複合体
に、ウロキナーゼ類を免疫結合させてなる請求項３９記
載の血栓溶解蛋白複合体。
【請求項４１】請求項１４記載のキメラモノクローナル
抗体に請求項２９記載のキメラモノクローナル抗体とを
共有結合させて得られる蛋白複合体に、ウロキナーゼ類
を免疫結合させてなる請求項３９記載の血栓溶解蛋白複
合体。
【請求項４２】ヒトフィブリンを特異的に認識する可変
領域とウロキナーゼ類を特異的に認識する可変領域とを
含有し、かつヒト抗体定常領域を含有している二重特異
性キメラモノクローナル抗体にウロキナーゼ類を免疫結
合させてなる請求項３８記載の血栓溶解蛋白複合体。