JP3177776B2 - ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤 - Google Patents

ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は二重特異性を有するハイブリッドモノクロー
ナル抗体に関する。さらに詳しくは二重特異性の一方が
フィブリンに対するものであり、他方が血栓溶解作用を
有する物質に対するものであるハイブリッドモノクロー
ナル抗体（以下、ハイブリッドMoAbと略記することがあ
る）および該抗体を産生するポリドーマに関する。
本発明はまた、上記のハイブリッドMoAbに血栓溶解作
用を有する物質を免疫結合させてなる血栓溶解剤に関す
る。
〔従来の技術および発明が解決しようとする課題〕
血栓溶解療法は古くから心筋梗塞，動脈塞栓症，脳梗
塞などの血栓性疾患の治療法として用いられ、当初はス
トレプトキナーゼ（以下、SKと略記することがある）や
ウロキナーゼ（以下、UKと略記することがある）などが
有用な血栓溶解剤として臨床応用された。特にUKはフィ
ブリン溶解能が高いことから比較的繁用されてきたが、
フィブリンに対する選択性が低く、フィブリノーゲンに
対しても作用し、投与患者に出血傾向を生ぜしめる欠点
を有している。かかる欠点を踏まえて、次に第２世代の
血栓溶解剤としてティッシュプラスミノーゲンアクチベ
ータ（以下、TPAと略記することがある）やプロウロキ
ナーゼ（以下、ProUKと略記することがある）が登場し
た。これらはUKに比べてフィブリン選択性が高いため、
UKでみられた出血傾向の副作用を軽減すると予測され、
数多くの研究がなされた。特に最近では遺伝子組み換え
技術を利用することによって大量生産の途が開かれたこ
とから、臨床への応用も盛んである〔European Cooper
ative Study Group for Recombinant Tissue−Typ
e Plasminogen Activator:ランセット（The Lance
t）,842（1985）〕。
しかしこれらの臨床応用の結果、TPAなどにも幾つか
の問題があることが分かってきた。すなわち、TPAの
半減期は非常に短かく（２〜３分），血栓溶解には多量
のしかも長時間の投与が必要なこと，かかる大量療法
では必ずしも出血傾向の低減を期待できないことなどで
ある。
そこでさらに効果的な血栓溶解剤の研究・開発がなさ
れ、修飾TPAや,UKあるいはProUKとTPAとのハイブリッド
蛋白などが作製された。修飾TPAに関しては、半減期低
下の原因と考えられる糖鎖構造を一部欠失したTPAムテ
インを遺伝子工学的に作製し、肝細胞などの糖鎖レセプ
ターによる捕捉を避け、血中動態の改善をはかってい
る。またUK−TPAのハイブリッド蛋白ではUKの強い血栓
溶解能とTPAのフィブリン親和性とを併用し、投与量の
軽減を目指している。これらの血栓溶解剤は従来のもの
と比べ若干の出血傾向の減少をもたらすと期待できる
が、大巾な改善についてはさらに今後の研究・開発が待
たれる。
次に第３世代の血栓溶解剤として、抗体ターゲッティ
ングを利用した蛋白複合体が登場した。すなわち実質的
にフィブリノーゲンには反応せずフィブリンにのみ高い
親和性を有する抗体をUK〔C.Bodeら：サイエンス（Scie
nce），229,765（1985）〕やTPA〔M.S.Rungeら：プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエ
ンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），84,7
659（1987）〕に化学結合させることにより、フィブリ
ノーゲンの分解を伴うことなくフィブリンのみを分解す
る血栓溶解剤が開発された。かかる抗体ターゲッティン
グ化血栓溶解剤はin vitroあるいはin vivo実験で、
いずれもUKやTPA単剤よりも３−100倍の効果を示したと
報告されている。しかしながらこれらの蛋白複合体で
は、いずれも抗体と血栓溶解酵素とを化学結合させてお
り、従って化学結合操作時に抗体活性および酵素活性
の低下を伴うこと，抗体と酵素との1:1蛋白複合体を
収率良く得ることが困難なこと，あるいは蛋白変性の
結果、投与患者体内での代謝が早まること、などの欠点
を有している。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、上記に示した生体内代謝，フィブリン
親和性，血栓溶解能などに関する従来の血栓溶解剤でみ
られた問題点を解決するため、近年開発された二重特異
性ハイブリッドモノクローナル抗体の新技術に着目し、
血栓溶解活性物質をかかる二重特異性ハイブリッドモノ
クローナル抗体に免疫結合させ、抗体活性および血栓溶
解活性の低下を伴わないような、二重特異性ハイブリッ
ドモノクローナル抗体と血栓溶解活性物質との1:1免疫
複合体を作製して、フィブリンに特異的で副作用のない
血栓溶解剤を開発した。すなわち本発明は、二重特異性
を有するハイブリッドMoAbであって、二重特異性の一方
がヒトフィブリンに対するものであり、他方がティッシ
ュプラスミノーゲンアクチベータに対するものである抗
体FT2−14、およびこれを産生するマウスハイブリッド
−ハイブリドーマFT2−14と二重特異性の一方がヒトフ
ィブリンに対するものであり、他方がウロキナーゼに対
するものである抗体FU1−74、およびこれを産生するマ
ウスハイブリッド−ハイブリドーマFU1−74とを提供す
るものである。
また本発明は、上記二重特異性ハイブリッドモノクロ
ーナル抗体FT2−14にティッシュプラスミノーゲンアク
チベータを免疫結合させてなる血栓溶解剤および二重特
異性ハイブリッドモノクローナル抗体FU1−74にウロキ
ナーゼを免疫結合させてなる血栓溶解剤を提供するもの
である。
本発明で用いられる抗フィブリン抗体産生ハイブリド
ーマの作製にあたっては、該ハイブリドーマがフィブリ
ンに特異的で実質的にフィブリノーゲンと結合しないMo
Abを産生するものであればいずれのものでもよい。例え
ばかかるフィブリン特異抗体は、ブィブリノーゲンが分
解されて生ずるフィブリンの、α鎖Ｎ末端フラグメント
ペプチドあるいはβ鎖Ｎ末端フラグメントペプチドを免
疫原として用いることにより作製される〔K.Y.Huiら：
サイエンス（Science），222,1129（1983），あるいは
特開昭63−93800号公報〕。また、フィブリンは哺乳動
物のものであればいずれでもよいが、好ましくはヒトフ
ィブリンが挙げられ、とりわけヒトフィブリンのβ鎖Ｎ
末端部に相当するペプチドが用いられる。これにキャリ
ア蛋白を結合させて、動物（例、ウサギ，ラット，マウ
ス，モルモットなど）を免疫し抗体産生細胞を得る。次
いで免疫動物より採取したこれらの抗体産生細胞、例え
ば脾臓細胞やリンパ節細胞などを骨髄腫細胞と融合し、
得られるハイブリドーマの中から実質的にフィブリノー
ゲンに反応せずフィブリンに特異的に結合する抗体産生
細胞をスクリーニングする。上記のヒトフィブリンβ鎖
Ｎ末端ペプチドとして、次のごときアミノ酸配列を有す
るものが特に好ましく用いられる。
Ｈ−Gly−His−Arg−Pro−Leu−Asp−Lys−Ｒ−Cys−
OH 〔式中、ＲはLys−Arg−Glu−Gluで示されるペプチド又
はその一部を示す〕。Ｃ末端のCysはキャリア蛋白との
化学結合用のリンカー部に用いられる。すなわちキャリ
ア蛋白を予め、例えばＮ−（γ−マレイミドブチリルオ
キシサクシニミド）（以下、GMBSと略記することがあ
る）でマレイミド化あるいはＮ−サクシニミジル−３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、SPDPと
略記することがある）でジチオピリジル化することによ
り、上記ペプチドのＣ末端CysのSH基を介してキャリア
蛋白に化学結合させることが可能である。
また本発明における血栓溶解作用を有する物質として
は、血栓溶解能を持つ蛋白あるいは血栓溶解作用を促進
する物質であればいずれのものでも良い。これらの例と
して、プロテアーゼおよびその前駆体，あるいは血栓溶
解促進物質（例、TPA,UK,ProUK,SK,トリプシン，プラス
ミン，プロテインC,プロテインＳなど）などが挙げら
れ、なかでもプロテアーゼが好ましく、さらに好ましく
はTPAおよびUKなどが用いられる。またTPAについては一
本鎖および二本鎖のいずれのものでもよく、またUKにつ
いても一本鎖および二本鎖のいずれのものでもよく［E.
Haberら，サイエンス（Science），243,51（1989）］、
低分子UK,ProUKなどを用いてもよい。抗体産生ハイブリ
ドーマの作製については、上記の蛋白を常法に従い動物
に免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融
合させる方法が用いられる。特に抗UK抗体産生ハイブリ
ドーマの作製については、低分子UKを動物に免疫して得
られる抗体産生細胞を用いるのが好都合である。動物を
免疫し、得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞などと融合
させ、抗体産生ハイブリドーマを得る方法については、
抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマを得る方法と同様
な操作を行ってもよい。
免疫動物としては、例えばウサギ，ラット，マウス，
モルモットなどが用いられるが、MoAb製造の場合にはマ
ウスが特に好ましく用いられる。接種方法としては、通
常実施される方法に従えばよく、例えばマウスに１回１
〜100μｇ、好ましくは10〜25μｇを等容量（0.1ml）の
生理食塩水およびフロイントの完全アジュバンドで乳化
して、背部，腹部の皮下あるいは腹腔内に２〜３週毎に
３〜６回接種する方法がとられる。
これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個
体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓およびあるいはリ
ンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施
でき、融合促進剤としてはポリエチレングリコール（以
下、PEGと略することがある）やセンダイウイルスなど
が挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫
細胞としてはNS−１、P3U1、SP2/0など、特にP3U1が好
ましく用いられる。例えば脾臓細胞と骨髄腫細胞との好
ましい比率は1:1〜10:1で、これに分子量1,000〜6,000
のPEGが10〜80％の濃度で添加され、20〜37℃、好まし
くは30〜37℃で３〜10分インキュベートするのが良い。
抗フィブリン抗体産生ハイブリドーマのスクリーニン
グには種々の方法が使用できる。例えば、マイクロプレ
ートにフィブリノーゲンを吸着させたのち、トロンビン
を作用させフィブリノーゲンをブィブリンに変換する。
次いで過剰のフィブリンノーゲン存在下でハイブリドー
マ培養上清をフィブリン固定マイクロプレートに添加
し、プレートに結合した抗フィブリン特異抗体を検出す
る酵素免疫測定法（以下、EIAと略記することがある）
により培養上清中の抗体価を測定する。HAT（ヒポキサ
ンチン・アミノプテリン・チミジン）添加培地で選別、
育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ちにクロ
ーニングに供されるが、通常これは限界希釈法などで容
易に実施される。クローン化されたハイブリドーマ培養
上清の抗体価を上記の方法で測定し、安定的に力価の高
い抗体を産生するハイブリドーマを選択し、目的とする
モノクローナルな抗フィブリン特異抗体産生ハイブリド
ーマを取得することができる。
以上のような製造法に従って、作製した抗フィブリン
抗体産生ハイブリドーマの例として、後述の実施例１に
示したFIB １−11,FIB ２−11が挙げられる。
また血栓溶解作用を有する物質に対する抗体を産生す
るハイブリドーマのスクリーニングは、それぞれ該物質
を吸着させたマイクロプレートを用いるEIAで簡便に実
施できる。クローニングも上記した常法に従って実施
し、目的の抗体産生ハイブリドーマを取得できる。
以上のような製造法に従って作製した抗TPA抗体産生
ハイブリドーマの例として、後述の実施例２に示したTP
A １−41,TPA １−70,TPA ２−14または抗UK抗体産
生ハイブリドーマの例として後述の実施例３に示したUK
１−3,UK １−87,および後述の実施例12に示したUK
１−６が挙げられる。
本発明の二重特異性を有するハイブリッドMoAbを産生
するポリドーマの作製には幾つかの手法があり〔例、新
本洋士ら：蛋白質・核酸・酵素，33,217（1988）な
ど〕，いずれの方法を用いてもよいが例えば、上記の
HAT抵抗性の血栓溶解作用を有する物質に対する抗体を
産生するハイブリドーマを、５−ブロモデオキシウリジ
ン（以下、BrdUと略記することがある）添加の培養液に
段階的に馴化させ、チミジンキナーゼ欠損株をクローン
化しHAT感受性とする。同様にHAT抵抗性の抗フィブリン
特異抗体産生ハイブリドーマを８−アザグアニン（以
下、AZGと略記することがある）耐性とし、ヒポキサン
チン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠
損株をクローン化しHAT感受性とする。次いで常法に従
い両者を融合して得られるテトラオーマをHAT添加培地
で選別後、フィブリンおよび血栓溶解作用を有する物質
の両者に結合能を有するハイブリッドMoAbを分泌するテ
トラオーマをクローン化する，抗フィブリン特異抗体
産生ハイブリドーマをフルオレセイン・イソチオシアネ
ート（以下、FITCと略記することがある）で標識し、も
う一方の血栓溶解作用を有する物質に対する抗体を産生
するハイブリドーマをテトラメチル・ロダミン・イソチ
オシアネート（以下、TRITCと略記することがある）で
標識後、常法に従い両者を融合する。得られた細胞懸濁
液をフルオレセイン・アクティベイティッド・セルソー
ター（以下、FACSと略記することがある）に供し、FITC
の緑色およびTRICTの赤色の蛍光を同時に有するテトラ
オーマを選別・クローン化するなどの方法が挙げられ
る。また両親株のマーカーを全く逆にして使用し、テト
ラオーマを選別・クローン化することも可能である。
これらの操作における細胞融合に当ってはセンダイウ
イルス、PEGなどの融合促進剤やあるいは電気刺激など
の方法が用いられる。好ましくはPEGが用いられ、以下
にその一例を挙げるが、もちろんこの方法に限定される
ものではない。すなわち、重合度約1,000〜6,000、濃度
約10〜80％等のPEGが用いられ、処理時間は約0.5〜30分
であるが、好ましい条件の一例として、約35〜55％のPE
G 6,000を約４〜10分間、37℃で細胞と接触させ、効率
よく融合させることができる。
ポリドーマの選択は、上記のHAT添加培地などで実施
できるが、このため８−AZG、６−チオグアニン（６−T
G）あるいは５−BrdUなどの薬剤馴化法により、それぞ
れの薬物耐性株が取得される。また新しいマーカの融合
細胞への導入により、種々の選択培地が用いられる。こ
のような例として、ネオマイシンやハイグロマイシンＢ
添加培地などが挙げられる〔B.Sugdenら：モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.），５,410（1985）〕。
さらに前記したように、異った蛍光色素で標識したハ
イブリドーマを融合し、FACSで二重標識されたハイブリ
ッド・ハイブリドーマをソーティングする方法もある
〔L.Karawajewら：ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メソッズ（J.Immunol.Methods），96,265（198
7）〕。
ハイブリッド抗体産生ポリドーマのスクリーニングに
は種々の方法が使用できる。例えば、前述した抗フィ
ブリン特異抗体産生ハイブリドーマと血栓溶解作用を有
する物質に対する抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングのためのEIAの併用，フィブリン結合マイ
クロプレートに被検培養上清を添加し、次にHRP標識し
た血栓溶解作用を有する物質を加えて二重特異性を有す
るハイブリッド抗体検出のためのEIA、あるいは抗フィ
ブリン特異抗体と異なるサブクラスに属する血栓溶解作
用を有する物質に対する抗体を用いる場合は，ブィブ
リン結合マイクロプレートに被検培養上清を添加し、次
にHRP標識した該抗マウスIgGサブクラス特異抗体を加え
て二重特異性抗体を検出するEIA、およびこれらの変法
などを適宜組み合せて用いることができる。
ハイブリッド抗体活性陽性のポリドーマは直ちにクロ
ーニングに供されるが、これは通常限界希釈法などで容
易に実施される。クローン化されたポリドーマの培養上
清については、上記の方法でその抗体価を測定し、安定
的に力価の高い抗体を産生するポリドーマを選択するこ
とにより、目的とするモノクローナルなハイブリッド抗
体産生ポリドーマを取得することができる。
上記した本発明のポリドーマの培養は通常、液体培地
中、または動物の腹腔内（例えば、マウス等哺乳動物の
腹腔内）で公知の方法により実施できる。培養液および
腹水中の抗体の精製については公知の生化学的手法を組
み合わせて用いることによりできる。例えば、培養培養
液もしくは腹水を遠心分離し、上清を取り出し、塩析
（通常は硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用
いる）を実施する。得られたタンパク沈殿物を適当な溶
液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフィー（イオン
交換カラム、ゲルろ過カラム、プロテインＡカラム、ヒ
ドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的とする抗体
を分離精製することができる。以上のような分離精製操
作により、例えば１の培養上清からタンパク重量比で
80％以上の純度のハイブリッドMoAbを約１〜5mg得るこ
とができる。また、20mlの腹水液からは同様の抗体が３
〜10mg得られる。
以上のようにして得られたハイブリットMoAbは蛋白質
として均一であり、蛋白分解酵素（ペプシンなど）処理
などにより、フィブリンおよび血栓溶解作用を有する物
質に対する結合能を保持するＦ（ab′）２断片などを得
ることができ、これらは本発明のハイブリッドMoAbと同
様の目的で用いることができる。
以上のような製造法に従って作製したハイブリッド抗
体産生ポリドーマの例として、後述の実施例4,5および1
3に示したテトラオーマが挙げられる。
なお、本発明のハイブリッドMoAbを産生するポリドー
マとして、抗フィブリンMoAb産生ハイブリドーマと血栓
溶解作用を有する物質に対する抗体を産生するハイブリ
ドーマとのテトラオーマの例を挙げたが、一方のMoAbを
産生するハイブリドーマと他方のMoAbを産生する細胞と
のトリオーマあるいはそれぞれのMoAbを産生する細胞を
エプスタイン・バー・ウイルスなどにより不滅化後、細
胞融合して得られるハイブリドーマなどであっても、本
発明のハイブリッドMoAbを産生するものであれば、上記
テトラオーマと同様の目的で用いることができる。
また、これらのポリドーマがマウスIgG MoAbを産生
する場合には、該二重特異性ハイブリッドMoAbの抗原認
識部位を含む可変領域あるいは超可変領域をコードする
DNAを取得し、これに遺伝子操作技術〔Z.Steplewski
ら：プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA），85,4852（1988）〕を用いてヒトIgGの定常領域を
コードする遺伝子を結合させ、マウス−ヒトキメラ抗体
を作製することもできる。かかるキメラ抗体はヒトへの
投与に際し、抗原性が小さいため有利に用いられる。
本発明の二重特異性ハイブリッドMoAbあるいは血栓溶
解作用を有する物質と該二重特異性ハイブリッドMoAbと
から作製される選択的な血栓溶解蛋白複合体を用いる血
栓溶解治療法においては、幾つかの方法が用いられる。
例えば、本発明のハイブリッドMoAbを予め血栓性疾患
患者に投与し、患者体内に形成された血栓に結合させる
べく十分な時間経過後に、血栓溶解作用を有する物質、
例えばTPAやUKを投与する，該ハイブリッドMoAbと血
栓溶解作用を有する物質とを同時に血栓性疾患患者に投
与する。あるいは予め該ハイブリッドMoAbと血栓溶解
作用を有する物質とを反応させ、未反応の血栓溶解物質
を分離後、得られた選択的血栓溶解蛋白複合体を血栓性
疾患患者に投与するなどの方法が挙げられる。
本発明の血栓溶解剤，ハイブリッドMoAbあるいは血栓
溶解作用を有する物質は、必要により例えばメンブレイ
ンフィルター等によるろ過除菌操作の後に、それ自体あ
るいは適宜の薬理学的に許容され得る担体，賦形剤，希
釈剤などと混合し、注射剤などとして製剤化して、哺乳
動物（マウス，ラット，ネコ，イヌ，ブタ，ウシ，サ
ル，ヒトなど）に投与し、例えば心筋梗塞，末梢動・静
脈閉塞症，網膜動・静脈閉塞症，脳梗塞，肺塞栓症など
の血栓・閉塞性疾患の治療に用いることが可能である。
本発明の血栓溶解剤の投与量は、対象となる疾患，症
状あるいは投与ルートなどによって異なるが、例えば心
筋梗塞の成人患者に静脈内投与する場合、ハイブリッド
MoAbとして１日当り約0.02〜1mg/kg好ましくは約0.04〜
0.4mg/kg、血栓溶解作用を有する物質として１日当りTP
Aでは約0.01〜0.5mg/kg好ましくは約0.02〜0.2mg/kg,UK
では約0.01〜0.5mg/kg、好ましくは約0.02〜0.2mg/kgで
ある。
以上のような方法で、標的血栓部位に対して特異的に
結合可能であり、実質的にフィブリノーゲンと結合しな
い本発明のハイブリッドMoAbと血栓溶解作用を有する物
質とを用いることにより、選択的かつ効率的に血栓を溶
解・除去することができる。
〔実施例〕
以下に参考例・実施例により本発明を具体的に説明す
るが、これらが本発明の範囲を制限するものでないこと
は言うまでもない。
なお、実施例で用いられている動物細胞は、以下の表
に示すように寄託が行なわれている。
また、本明細書においてアミノ酸およびペプチドはIU
PAC−IUB生化学命名委員会（CBN）で採用された略記法
により表示され、例えば下記の略号が使用される。な
お、アミノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Gln:グルタミン残基 Asp:アスパラギン酸残基 Pro:プロリン残基 Tyr:チロシン残基 Val:バリン残基 Lys:リジン残基 Glu:グルタミン酸残基 Ala:アラニン残基 Asn:アスパラギン残基 Leu:ロイシン残基 Phe:フェニルアラニン残基 Gly:グリシン残基 His:ヒスチジン残基 Ser:セリン残基 Thr:スレオニン残基 Ile:イソロイシン残基 Trp:トリプトフアン残基 Arg:アルギニン残基 Met:メチオニン残基 Cys:システイン残基 参考例１ 抗フィブリン抗体測定用EIA 3.3M尿素,0.01％ EDTA含有リン酸食塩緩衝液（PBS,p
H7.3）に溶解したヒトフィブリンモノマー溶液1mg/ml
を、96穴マイクロプレートに50μずつ分注し４℃で一
夜放置後、２％カゼイン,0.01％チメロサール含有PBS15
0μを添加して感作プレートを作製した。次に100単位
/mlヘパリン,3mMフェニルメチルスルホニルフルオリド
含有PBSに溶解したヒトフィブリノーゲン溶液10mg/ml
を、等量の被検ハイブリドーマ培養上清と混じ、室温で
30分間反応後、その100μを上記のフィブリン感作プ
レートを添加し室温で２時間反応させた。0.05％Tween2
0含有PBS（PBS−TW）でプレートを十分に洗浄後、ホー
スラッディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識ウサギ
抗マウスIgG抗体を添加し、さらに室温で２時間反応さ
せた。
洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレンジアミンお
よびH2O2を含有する0.1Mクエン酸緩衝液を各ウェルに加
え、室温で酵素反応を実施した。1N硫酸で反応停止後、
マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長492nmで発
色色素量を測定した。
参考例２ 抗TPA抗体測定用EIA TPA ５μg/ml溶液を96穴マイクロプレートに100μ
ずつ分注し４℃で一夜放置後、２％カゼイン,0.01％チ
メロサール含有PBS150μを添加して感作プレートを作
製した。上記の液を除去しPBS−TWで洗浄後、被検ハイ
ブリドーマ培養上清100μを添加し室温で２時間反応
させた。以下、参考例１に記載の方法で酵素反応を実施
し抗体価を測定した。
参考例３ 抗UK抗体測定用EIA 参考例２に記載のTPAの代りにUKを使用し、UK感作プ
レートを作製後、同様の方法で抗UK抗体価を測定した。
参考例４ 抗フィブリン−抗TPAハイブリッド抗体測定
用EIA 参考例１で作製したフィブリン感作プレートに被検ハ
イブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応させ
る。次いでPBS−TWで洗浄後、ビチオン標識したTPAを添
加し、さらに室温で２時間反応させる。次にアビジン−
HRP複合体を添加し室温で１時間反応後、固相に結合し
たHRP活性を参考例１に示した方法で測定する。
参考例５ 抗フィブリン−抗UKハイブリッド抗体測定用
EIA 参考例４に記載のビチオン標識TPAの代りにビオチン
標識UKを使用し、以下同様の方法で抗フィブリン−抗UK
ハイブリッド抗体価を測定する。
参考例６ フィブリン溶解反応中和試験 TPA溶液（最終濃度20ng/ml）もしくはUK溶液（最終濃
度25ng/ml）に被検ハイブリドーマ培養上清希釈液を添
加し、37℃で１時間反応後反応混液をフィブリンアガロ
ースプレートの１ウェル当り５μ注入した。37℃で２
〜６時間後にフィブリンの溶解斑（直径）を測定し、TP
AもしくはUKの酵素活性に対するハイブリドーマ培養上
清に含まれるMoAbの中和能を測定した。
参考例７ 抗フィブリン−抗TPAハイブリッド抗体測定
用EIA 参考例２で作成したTPA感作プレートにハイブリッド
抗体含有検液を添加し、室温で２時間反応させる。PBS
−TWで洗浄後、HRP標識した抗マウスIgG1（γ１鎖特
異）抗体（コスモバイオK.K.販売）を添加し、さらに室
温で２時間反応させる。次いでPBS−TWで充分に洗浄
後、固相に結合したHPR活性を参考例１に示した方法で
測定する。
参考例８ 抗フィブリン−抗TPAハイブリッド抗体測定
用EIA 参考例２で作成したTPA感作プレートにハイブリッド
抗体含有検液を添加し、室温で２時間反応させる。PBS
−TWで洗浄後、ビオチン標識した実施例１−記載のヒ
トフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−11）−BSA複合
体を添加し、さらに室温で２時間反応させる。次にアビ
ジン−HRP複合体を添加し室温で１時間反応後、固相に
結合したHRP活性を参考例１に示した方法で測定する。
参考例９ 抗フィブリン−抗UKハイブリッド抗体測定用
EIA 参考例３で作成したUK感作プレートにハイブリッド抗
体含有検液を添加し、室温で２時間反応させる。PBS−T
Wで洗浄後、ビオチン標識した実施例１−に記載のヒ
トフィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−11）−BSA複合
体を添加し、さらに室温で２時間反応させる。次にアビ
ジン−HRP複合体を添加し室温で１時間反応後、固相に
結合したHRP活性を参考例１に示した方法で測定する。
参考例10 抗低分子UK抗体測定用EIA 参考２に記載のTPAの代りに低分子UK（二本鎖低分子U
K,JCR社販売）を使用し、低分子UK感作プレートを作製
後、同様の方法で抗低分子UK抗体価を測定した。
参考例11 UK酵素活性中和試験 UK溶液（最終濃度1.7μg/ml）に被検抗体溶液を添加
し室温で30分反応液、ペプチド合成基質Ｓ−2444（1mM,
ピログルタミル・グリシル・アルギニル・パラニトロア
ニリド，カビ社製）を添加した。さらに37℃で15分反応
後、遊離したパラ・ニトロアニリド（405nmにおける吸
光度）を測定した。
実施例１ マウス抗ヒトフィブリンモノクロナール抗体
産生ハイブリドーマの作製 免疫原の調製 公知の固相合成法によりペプチド合成機（アプライド
・システム，モデル430A型）を用いて作製されたヒトフ
ィブリンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−11）−Cys 3.3mg
を、予めGMBSでマレイミド化した牛血清アルブミン（BS
A）（BSA1モル当り13モルのマレイミド基を導入）12mg/
2ml水溶液に加え30℃で１時間反応させ、ヒトフィブリ
ンβ鎖Ｎ末端ペプチド（１−11）−BSA複合体を得た。
次いで生理食塩水で３回透析後（３×３）、凍結保存
し免疫原として用いた。
免疫 ペプチド−BSA複合体1mg/ml生理食塩水溶液に等量の
フロイント完全アジュバンドを加え、マウス（♀,n＝1
0:0.1mg/0.2ml/マウス）の背部および腹部皮下への免疫
を開始した。追加免疫は免疫原に等量のフロイント不完
全アジュバンドを加えて、２−３週毎に５回接種し実施
した。
細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常
法により調製した（約108個）。次いでマウス骨髄腫細
胞（P3U1）２×107個を添加し、PEG 6000を用いてケー
ラーとミルスタインの方法〔ネーチャー（Nature），25
6,495（1975）〕に準じて細胞融合に供した。
融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン・アミノプテ
リンおよびチミジンを含む、いわゆるHAT培地中に懸濁
し、10日間培養した。以後は、親細胞の選択が終了次
第、HAT培地からアミノプテリンを除いたHT培地に代え
培養を続けた。
ハイブリドーマの選択およびクローニング 固相にヒトフィブリンモノマーを吸着させたマイクロ
プレートを用いる参考例１に記載のEIAでハイブリドー
マ培養上清の抗体価を測定した。融合10日から20日後で
ハイブリドーマの出現を認め、かつヒトフィブリンに特
異結合する抗体がみられた。特に結合活性の強いハイブ
リドーマについて、限界希釈法によるクローニングに供
した。
クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様にEI
Aのスクリーニングに供し、ヒトフィブリン結合能の強
いものを選択した。
これらの結果、高濃度ヒトフィブリノーゲン存在下で
フィブリンに特異結合するMoAb産生マウスハイブリドー
マ FIB １−11およびFIB ２−11が得られた。得られ
たハイブリドーマからそれぞれ産生される抗体FIB １
−11およびFIB ２−11の免疫グロブリンクラス、サブ
クラスはオークターロニー法による測定で、いずれもIg
G1であった。
上記の抗ヒトフィブリン特異抗体 FIB １−11およ
びFIB ２−11をフィブリノーゲン存在下および非存在
下で参考例１に記載のEIAで測定した結果を第１表に示
す。なお、コントロールとして抗ヒトフィブリノーゲン
抗体FIB2−162を用いた。
実施例２ マウス抗TPAモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマの作製 免疫 市販の１本鎖TPA（中央科学工業K.K.販売）200μg/ml
生理食塩水溶液に等量のフロイント完全アジュバンドを
添加し十分乳濁液、BALB/cマウス（♀,20μg/0.2ml/マ
ウス）に腹腔および背部皮下投与し、２〜３週間隔で追
加免疫を実施した。３回の追加免疫後、10日で最大の血
清抗体価を示した個体について、TPA抗原液（50μg/0.1
ml生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。
細胞融合 実施例１−に記載の方法に従い、細胞融合を実施し
た。
ハイブリドーマの選択およびクローニング TPA結合マイクロプレートを用いる参考例２記載のEIA
でハイブリドーマをスクリーニングし、以下実施例１−
と同じ方法で抗TPA MoAb産生ハイブリドーマを取得
した。これらの中、フィブリン溶解能を損うことなくTP
Aに特異結合する抗TPA MoAb産生ハイブリドーマとして
マウスハイブリドーマ TPA １−41、TPA中和抗体産生
ハイブリドーマとしてマウスハイブリドーマTPA １−7
0およびTPAに対してプラスミノーゲンアクチベータイン
ヒビタ（PAI）と競争的に結合するTPA非中和抗TPA MoA
b産生ハイブリドーマとしてマウスハイブリドーマTPA
２−14が得られた。得られたハイブリドーマからそれぞ
れ産生される抗体TPA １−14,1−70および２−14の免
疫グロブリンクラス，サブクラスはオークターロニー法
による測定で、それぞれIgG2b,IgG1およびIgG1であっ
た。
上記の抗TPA特異抗体 TPA １−41（−●−）および
TPA １−70（−▲−）を参考例２に記載のEIAで測定し
た結果を第１図に表わす。
実施例３ マウス抗UKモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの作製 免疫 実施例２−に記載のTPAの代りにUK（日本製薬製
造）を用いて、以下全く同様の方法でマウスへの免疫を
実施した。
細胞融合 実施例１−に記載の方法に従い細胞融合を実施し
た。
ハイブリドーマの選択およびクローニング UK結合マイクロプレートを用いる参考例３記載のEIA
でハイブリドーマをスクリーニングし、以下実施例１−
と同じ方法で抗UK MoAb産生ハイブリドーマを取得し
た。これらの中、フィブリン溶解能を損うことなくUKに
特異結合する抗UK MoAb産生ハイブリドーマとしてマウ
スハイブリドーマ UK １−３およびUK １−87が得ら
れた。得られたハイブリドーマからそれぞれ産生される
抗体UK １−３および１−87の免疫グロブリンクラス，
サブクラスはオークターロニー法による測定で、それぞ
れIgG1およびIgG2bであった。
上記の抗UK特異抗体UK １−３（−●−）およびUK
１−87（−▲−）を参考例３に記載のEIAで測定した結
果を第２図に表わす。
実施例４ 抗TPA−抗ヒトフィブリン二重特異性を有す
るハイブリッドモノクローナル抗体の製造 細胞融合 実施例１で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイブ
リドーマFIB １−11および実施例２で取得した抗TPA抗
体産生ハイブリドーマTPA １−41を、それぞれ0.5μg/
mlFITCおよび1.5μg/mlTRITC含有イスコフ−ハムＦ・12
混合培地で37℃,30分間インキュベートし、蛍光染色し
た。次いで、LSM溶液（和光純薬工業K.K.販売）を添加
し死細胞を除去したのち、両ハイブリドーマを1:1の割
合で混じ、PEG6000を用いて実施例１−に記載の方法
で細胞融合した。
37℃で２時間インキュベート後、FACSに供することに
よりフルオレセインおよびローダミンで二重染色された
細胞25000個を分取し、次にフィーダーとしてマウス胸
腺細胞を５×105個／ウエル播種した96穴マイクロプレ
ートに、上記の二重染色細胞を10個／ウエルの割合で播
種し培養した。
ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニン
グ 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウェルの培養上
清を、それぞれ参考例1,2,7および８に記載のEIAに供し
抗体活性を測定した。なお、対照として実施例１−お
よび実施例２−でそれぞれ取得したハイブリドーマFI
B １−11およびTPA １−41の培養上清の抗体活性を同
様にして測定した。結果は第２表に示した通りであっ
た。
高いハイブリッド抗体活性を示したウエルについて限
界希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特異
性抗体産生マウスハイブリッド−ハイブリドーマ（テト
ラオーマ）FT ２−14を取得した。
８）参考例８記載のEIA。
ハイブリッド抗体の精製 予め0.5ml鉱油を腹腔内投与したBALB/cマウス６匹に
５×106個／マウスのマウス ハイブリッド−ハイブリ
ドーマ（テトラオーマ）FT2−14を腹腔内接種した。約1
0〜20日後に貯溜がみられた腹水を20ml採取し、さらに5
0％飽和硫酸アンモニウムで塩析してIgG画分を得た。次
いで20mM PBS（pH7.5）で透析後、フィブリン結合セル
ロファインカラムに供し、pH2.9の0.2Mグリシン・塩酸
緩衝液で溶出した。酸溶出画分をPBSで透析後、さらにT
PA結合セファロース4Bカラムに供し、pH2.3の0.2Mグリ
シン・塩酸緩衝液で溶出した。PBSで透析することによ
り二重特異性抗体FT2−14 9.4mgを得た。
得られた抗体を参考例８に記載のEIAに供し、その二
重特異性抗体の希釈曲線を作製した。結果は第３図に示
した通りであった。第３図から、得られた抗体がTPAと
フィブリンとの両者に対して強い結合能を示したことが
分る。
実施例５ 抗UK−抗ヒトフィブリン二重特異性を有する
ハイブリッドモノクローナル抗体の製造 細胞融合 実施例１で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイブ
リドーマFIB １−11および実施例３で取得した抗UK抗
体産生ハイブリドーマUK1−３を、実施例４−に示し
た方法に従いそれぞれをFITCおよびTRITCで蛍光染色し
たのちPEG6000を用いて細胞融合した。次にFACSに供し
二重染色細胞を選別・培養した。
ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニン
グ 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上
清を、それぞれ参考例1,3および９に記載のEIAに供し抗
体活性を測定した。なお、対照として実施例１−およ
び実施例３−でそれぞれ取得したハイブリドーマFIB
１−11およびUK １−３の培養上清の抗体活性を同様
にして測定した。
最大のハイブリッド抗体活性を示したウエルについて
限界希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特
異性抗体産生マウスハイブリドーマ FU1−74を取得し
た。
ハイブリッド抗体の精製 実施例４−記載の方法に従い腹水を取得し、さらに
硫安塩析およびフィブリン結合カラムとUK結合カラムと
を用いるイムノアフィニティークロマトにより約20mlの
腹水から本発明の抗UK−抗ヒトフィブリン二重特異性抗
体FU1−74 14mgを得た。
得られた抗体を参考例９に記載のEIAに供し、その二
重特異性抗体の希釈曲線を作成した。結果は第４図に示
した通りであった。第４図から明らかなように得られた
FU1−74抗体がUKとフィブリンとの両者に対して強い結
合能を示したことが分る。
実施例６ 抗TPA−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体FT
２−14の性状 径9.5mmのペーパーディスクを2mg/mlのヒトフィブリ
ノーゲン溶液に浸漬し、次いでヒトトロンビン（50NIH
単位/ml）を添加しペーパーディスク上にフィブリンク
ロットを形成させた。このフィブリン結合ペーパーディ
スクを十分に洗浄後、フィブリノーゲン（3mg/ml）存在
下、実施例４−で得た二重特異性抗体FT ２−14溶液
に浸し、抗体のペーパーディスクへの結合量をHRP標識
した抗マウスIgG2b抗体で測定した。結果は第５図に示
した通りであった。
フィブリノーゲン（3mg/ml）存在下（■）においても
非存在下（□）とほぼ同等のフィブリン結合能を示し、
本発明のFT ２−14抗体がフィブリンに特異的であるこ
とが示された。
実施例７ 抗TPA−抗体ヒトフィブリン二重特異性抗体F
T ２−14の性状 種々の濃度のTPAを実施例４−で得た二重特異性抗
体FT ２−14の4.3倍モル濃度溶液と37℃で30分間反応
させ、TPAとFT ２−14抗体との免疫複合体（TPA/FT
２−14抗体）を作製し、次いで3mMのペプチド合成基質
Ｓ−2288（カビ社製）を添加してさらに37℃で２時間反
応させた。遊離したパラーニトロアニリンの405nmにお
ける吸光度を測定し、上記のTPA/FT ２−14抗体複合体
の酵素活性をTPA単剤と比較した。結果は第６図に示し
た通りであった。
第６図中、●はTPA/FT ２−14抗体の酵素活性を示
し、○はTPA単剤の酵素活性を示す。TPAは本発明の二重
特異性抗体FT ２−14との結合によっても全く酵素活性
を減少しないことが明らかとなった。
実施例８ 抗TPA−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体FT
２−14の性状 ヒトフィブリノーゲンを公知の方法に従いセルロファ
イン粒子（生化学工業株式会社販売）に結合させ不溶化
したのち［戎井悦子ら：生化学，54,732（1982）］，ヒ
トトロンビンを加えてフィブリンに変換した。このフィ
ブリン−セルロファイン粒子0.2gに10μg/500μのFT
２−14抗体溶液を加えて37℃で90分間反応後、十分に
洗浄した。次いで100ngのTPAと37℃で40分間反応し洗浄
後、さらにプラスミノーゲン（３単位/ml）を添加し37
℃で１時間反応させた。上澄液中に遊離したペプチド
（フィブリン分解産物:FDP）をFDP−EIAキット（アメリ
カン・ダイアグノスティックス社製）で測定した。
結果は第７図に示した通りであった。
二重特異性抗体FT ２−14で予め処理したフィブリン
−セルロファイン粒子に対してTPAはより効果的に働ら
き、フィブリン溶解能が増強された。
実施例９ 抗UK−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体FU1
−74の性状 UK溶液（25ng/ml）2.5μおよび実施例５−で得た
二重特異性抗体FU1−74溶液（40ng/mlまたは160ng/ml）
2.5μを参考例６に記載のフィブリンアガロースプレ
ートの１ウエルに注入し37℃で４時間反応後、フィブリ
ンの溶解斑を測定し、UK単剤とのフィブリン溶解斑を比
較した。結果は第８図に示した通りであった。UK単剤に
比べ、FU1−74抗体の共存により３−５倍のフィブリン
溶解能の増強が観察された。
実施例10 抗TPA−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体FT2
−14および抗UK−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体FU1
−74のin vitroフィブリン溶解能の増強 実施例８で得たフィブリン−セルロファイン粒子を充
填したカラムに、それぞれ実施例４−で得たFT2−14
（０−100μg/ml）および実施例５−で得たFU1−74
（０−50μg/ml）を結合させたのち、0.01％トリトンＸ
−100含有PBS（PBS−Ｔ）で洗浄した。次いでFT2−14処
理カラムにはTPA溶液を、FU1−74処理カラムにはUK溶液
をそれぞれ240ml/時間の流速で200μg/400ml注入した。
PBS−Ｔで洗浄後、担体セルロファイン粒子を試験管内
に移しプラスミノーゲン（4.5単位/1.5ml）を添加後、3
7℃で２時間反応させた。等量の6mMパラーアミジノフェ
ニルメタンスルホニルフルオリドを添加したのち、セル
ロファイン粒子より遊離したフィブリン分解産物（Fibr
in−Degradation Products;FDP）をEIAキット（アメリ
カンダイアグノスティカ社製）で測定した。結果は第９
図に示した通りであった。抗体未処理のフィブリン−セ
ルロファイン粒子に対するTPA（○）およびUK（●）の
フィブリン分解量をそれぞれ１とした時、100μg/ml F
T2−14処理フィブリン−セルロファイン粒子（○）では
3.8倍,50μg/ml FU1−74処理フィブリン−セルロファ
イン粒子（●）では8.5倍のフィブリン分解能の増強が
みられた。
実施例11 抗TPA−抗ヒトフィブリン二重特異性抗体FT2
−14のin vivo血栓溶解能の増強 ウサギ頚静脈血栓モデルの作成 ウサギ（雄,2.5−3.5kg）にペントバルビタール（90m
g/1.5ml/ウサギ）およびウレタン（1.5mg/3ml/ウサギ）
を腹腔内注射し麻酔後、右大腿静脈に採血用カニュー
レ，左頚静脈に血液注入用カニューレおよび毛糸を挿入
した。当該頚静脈にクリップをかけ約3cm幅の血流を遮
断し、生理食塩水，次いで10U/mlトロンビン含有12mM
CaCl2溶液0.2mlで血管内を洗浄した。洗浄した血管内に
大腿静脈から採血した自家血0.2mlを注入し、直ちにカ
ニューレを抜き穴を結索後、30分間放置して血液を凝固
させた。
被検薬液の注入 血栓モデルウサギにヘパリンを腹腔内（250U/kg）お
よび皮下（500U/kg）注射し、頚静脈部のクリップをは
ずした。次に対側の耳静脈に注射針を挿入して、まず用
量の10％被検薬液を2ml/ウサギで静注、残る90％を6ml/
時間の流速で４時間かけて持続注入した。４時間後に毛
糸に付着した血栓を取りだし、その湿重量を測定した。
被検薬液として、コントロールとしての生理食塩水,TPA
（0.25mg/kgおよび1.0mg/kg），実施例４−で得たFT2
−14抗体液（1.2mg/kg）およびTPA/FT2−14抗体複合体
液（TPA0.25mg/kg＋FT2−14 1.2mg/kg）を用いた。結
果は第10図に示した通りであった。
TPA（0.25mg/kg）を４時間持続注入すると、血栓の湿
重量はコントロール群の61.5±7.2mg（ｎ＝４）から31.
7±10.1mg（ｎ＝６）に減少したが、TPA（0.25mg/kg）
とFT2−14（1.2mg/kg）との併用群（TPAと二重特異性抗
体（bs AB）とのモル比1:2）では19.6±6.5mg（ｎ＝
７）と、さらに血栓溶解能が増強され、TPA（1.0mg/k
g）投与群の血栓湿重量15.5±5.0mg（ｎ＝３）とほぼ同
等の血栓溶解能を示した。なお、FT2−14（1.2mg/kg）
投与群では血栓湿重量が41.5mg（ｎ＝１）であった。
実施例12 マウス抗低分子UKモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマの作製 免疫 実施例２−に記載のTPAの代りに市販の二本鎖低分
子UK（JCR社販売）を用いて、以下全く同様の方法でマ
ウスへの免疫を実施した。
細胞融合 実施例１−に記載の方法に従い細胞融合を実施し
た。
ハイブリドーマの選択およびクローニング 低分子UK結合マイクロプレートを用いる参考例10記載
のEIAでハイブリドーマをスクリーニングし、以下実施
例１−と同じ方法で抗低分子UK MoAb産生ハイブリド
ーマを取得した。これらの中、フィブリン溶解能を損う
ことなくUKに特異結合する抗低分子UK MoAb産生ハイブ
リドーマとしてマウスハイブリドーマ UK1−６が得ら
れた。得られたハイブリドーマから産生される抗体UK
１−６の免疫グロブリンクラス，サブクラスはオークタ
ーロニー法による測定で、IgG1（κ鎖）であった。
実施例13 抗UK−抗ヒトフィブリン二重特異性を有する
ハイブリッドモノクローナル抗体の製造 細胞融合 実施例１で取得した抗ヒトフィブリン抗体産生ハイブ
リドーマFIB １−11および実施例12で取得した抗低分
子UK抗体産生ハイブリドーマUK １−６を、実施例４−
に示した方法に従いそれぞれをFITCおよびTRITCで蛍
光染色したのちPEG6000を用いて細胞融合した。次にFAC
Sに供し二重染色細胞を選別・培養した。
ハイブリッドハイブリドーマの選択およびクローニン
グ 融合後１−２週で細胞増殖のみられたウエルの培養上
清を、それぞれ参考例1,9および10に記載のEIAに供し抗
体活性を測定した。
最大のハイブリッド抗体活性を示したウエルについて
限界希釈法によるクローニングを実施し、目的の二重特
異性抗体産生マウスハイブリッドハイブリドーマFU ２
−16を取得した。
上記のハイブリッドハイブリドーマFU ２−16の培養
上清を、参考例５に記載のEIAで測定した結果を第11図
に表わす。
ハイブリッド抗体の精製 実施例４−記載の方法に従い腹水を取得し、さらに
硫安塩析およびフィブリン結合カラムとUK結合カラムと
を用いるイムノアフィニティークロマトにより約20mlの
腹水から本発明の抗UK−抗ヒトフィブリン二重特異性抗
体FU ２−６約23mgを得た。
実施例14 抗UKモノクローナル抗体の性状 実施例３および12で得た抗UKモノクローナル抗体UK
１−3,1−87および１−６を、UKおよび低分子UK結合マ
イクロプレートを用いるEIA（それぞれ参考例３および1
0記載）に供し、UK［第12図（Ａ）］および低分子UK
［第12図（Ｂ）］への結合能を比較した。結果は第12図
に示した通りであった。
UK １−３抗体は低分子UKには結合しないが、UK １
−87およびUK １−６抗体はいずれもUKと低分子UKとに
対して同等の反応性を示した。
実施例15 抗UKモノクローナル抗体の性状 実施例３および12で得た抗UKモノクローナル抗体UK
１−3,1−87および１−６を、参考例11記載のペプチド
合成基質Ｓ−2444を用いるUK酵素活性中和試験に供し
た。結果は第13図に示した通りであった。
いずれの抗UKモノクローナル抗体もUK酵素活性を阻害
しなかった。
〔発明の効果〕
本発明のハイブリッドMoAbは、実質的にフィブリノー
ゲンと反応せずフィブリンに特異的に結合し、またフィ
ブリン溶解能を損うことなく血栓溶解作用を有する物質
とも特異的に結合することが可能である。従って、ハイ
ブリッドMoAbと血栓溶解作用を有する物質との1:1免疫
複合体を容易に作製することができ、また両者を併用す
ることにより、選択的かつ効率的な血栓の溶解・除去が
可能である。
【図面の簡単な説明】
第１図は参考例２記載のEIAで作製した抗TPA特異抗体TP
A １−41およびTPA １−70の希釈曲線を表わす（実施
例２参照）。 第２図は参考例３記載のEIAで作製した抗UK特異抗体UK
１−３およびUK １−87の希釈曲線を表わす（実施例
３参照）。 第３図は参考例８記載のEIAで作製した抗TPA−抗ヒトフ
ィブリン二重特異性抗体FT2−14の希釈曲線を表わす
（実施例４参照）。 第４図は参考例９記載のEIAで作成した抗UK−抗ヒトフ
ィブリン二重特異性抗体FU1−74の希釈曲線を表わす
（実施例５参照）。 第５図は実施例４−で作製した二重特異性抗体FT ２
−14のフィブリン結合ペーパーディスクへの結合量を示
す。第５図中、■はフィブリノーゲン（3mg/ml）存在下
であることを示し、□はフィブリノーゲン非存在下であ
ることを示す（実施例６参照）。 第６図はTPAと実施例４−で作製した二重特異性抗体F
T ２−14との免疫複合体（・）の酵素活性をTPA単剤 の酵素活性と比較した結果を示す（実施例７参照）。 第７図は、フィブリン結合セルロファイン粒子を実施例
４−で作製した二重特異性抗体FT ２−14で予め処理
した時（TPA/FT ２−14）あるいは処理しない時（TP
A）のTPAのフィブリン溶解能を示す（実施例８参照）。 第８図はUK単剤およびUKと実施例５−で作製した二重
特異性抗体FU1−74との免疫複合体のフィブリン溶解能
を示す（実施例９参照）。 第９図はTPA単独もしくはTPAと実施例４−で作製した
二重特異性抗体FT2−14とを併用した場合のフィブリン
溶解能（○），およびUK単独もしくはUKと実施例５−
で作製した二重特異性抗体FU1−74とを併用した場合の
フィブリン溶解能（●）を示す（実施例10参照）。 第10図は、実施例４−で作製した二重特異性抗体FT2
−14によるTPAの血栓溶解能の増強を、ウサギ頚静脈血
栓モデルにおいて示した結果である（実施例11参照）。 第11図は実施例13で作製した抗UK−抗ヒトフィブリン二
重特異性抗体産生マウスハイブリッドハイブリドーマFU
２−16の培養上清の希釈曲線を表わす（実施例13参
照）。 第12図は参考例３および10記載のEIAで作製した抗UKモ
ノクローナル抗体UK １−3,1−87および１−６の希釈
曲線を表わす（実施例3,12および14参照）。第12図
（Ａ）はUKに対する反応性を示し、第12図（Ｂ）は低分
子UKに対する反応性を示す。 第13図は参考例11記載のUK酵素活性中和試験で測定した
抗UKモノクローナル抗体UK1−3,1−87および１−６の酵
素活性阻害曲線を表わす（実施例3,12および15参照）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願平1−164873 (32)優先日 平成１年６月27日(1989．6．27) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２３３４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８１ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２５１９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２５４８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２１５８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２５４７ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/10 C12N 15/02 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】受託番号FERM BP−2334で寄託されたマウ
    スハイブリッド−ハイブリドーマFU1−74。
  2. 【請求項２】二重特異性を有するハイブリッドモノクロ
    ーナル抗体であって、二重特異性の一方がヒトフィブリ
    ンに対するものであり、他方がウロキナーゼに対するも
    のであり、請求項１記載のマウスハイブリッド−ハイブ
    リドーマFU1−74から産生されうる抗体FU1−74。
  3. 【請求項３】請求項２記載の抗体に、ウロキーゼを免疫
    結合させてなる血栓溶解剤。
  4. 【請求項４】請求項２記載の抗体に、プロウロキーゼを
    免疫結合させてなる血栓溶解剤。
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