JP2023538366A - 制約され、条件付きで活性化された結合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、活性プロドラッグ形式で投与される条件付き二重特異性再方向付け活性化構築物、またはＣＯＢＲＡに関する。腫瘍プロテアーゼに曝露されると、構築物は開裂されて活性化され、その結果、１つ以上の腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）及びＣＤ３に結合できるようになり、ＣＤ３を発現するＴ細胞が腫瘍に動員され、治療が行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍標的抗原には、Ｂ７Ｈ３、ＣＡ９（ＣＡＩＸ）、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、ＬｙＰＤ３及び／またはＴｒｏｐ２が含まれる。【選択図】図２
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関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１７日に出願された米国仮出願第６３／０６６，５６５号の優先権を主張するものであり、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年８月１７日に出願された米国仮出願第６３／０６６，５６５号の優先権を主張するものであり、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年８月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１８４５９－５０１４－ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１，３４１，８８９バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年８月１３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１１８４５９－５０１４－ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１，３４１，８８９バイトである。
個々の細胞または特定の細胞型を選択的に破壊することは多くの場合、様々な臨床環境において望ましいものである。例えば、健常細胞及び健常組織を可能な限りインタクトで損傷を受けていない状態に残しつつ腫瘍細胞を特異的に破壊することは、がん治療の主要な目的である。１つのこのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘導して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによるものである。
腫瘍関連抗原に対する優れた結合特異性及び親和性をもたらすインタクトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、がんの治療及び診断の領域にうまく応用されている。しかしながら、インタクトｍＡｂの大きなサイズ、その体内分布不良、低い効力及び血液プールにおける長期持続性不良により、その臨床用途は限定的なものとなっている。例えば、インタクト抗体は、腫瘍領域内への特異的な集積を示し得る。体内分布試験では、腫瘍を精密に調査した際に、末梢領域における初期集積を伴う不均一な抗体分布が認められている。腫瘍壊死によって抗原分布が不均一となり間質圧が高くなることから、インタクト抗体構築物を腫瘍の中心部分に到達させることは不可能である。それに対し、より小さな抗体断片は、速やかな腫瘍への局在化を示し、腫瘍内へとより深く浸透し、更に、血流から比較的速やかに取り除かれる。しかし、ｓｃＦｖ及び他の構築物を含む多くの抗体は、「ｏｎ ｔａｒｇｅｔ／ｏｆｆ ｔｕｍｏｒ」効果を示し、分子は、非腫瘍細胞に対して活性で、副作用を引き起こし、そのいくつかは毒性であり得る。本発明は、腫瘍プロテアーゼの存在下で選択的に活性化される新規構築物に関する。
一態様では、Ｎ末端からＣ末端まで、（ａ）ＨＥＲ２に結合する第１のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２）、（ｂ）第１のドメインリンカー、（ｃ）（ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインとを含む制約性Ｆｖドメイン、（ｄ）第２のドメインリンカー、（ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、（ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）、（ｇ）（ｉ）第１の疑似可変軽ドメインと（ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）と（ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインとを含む制約性疑似Ｆｖドメイン、（ｈ）第３のドメインリンカー、（ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む融合タンパク質が提供され、ここで、制約性Ｆｖドメインの第１の可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、制約性疑似ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、第１の可変軽ドメイン及び第１の疑似可変重ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。
いくつかの実施形態では、第１の及び／または第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、（ａ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、（ｂ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、（ｃ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、（ｄ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、（ｅ）配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３、（ｆ）配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３、（ｇ）配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５２のｓｄＣＤＲ３、（ｈ）配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３、（ｉ）配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３、（ｊ）配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３、（ｋ）配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３、（ｌ）配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３、（ｍ）配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３、（ｎ）配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３、（ｏ）配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３、（ｐ）配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３、（ｑ）配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３、（ｒ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、（ｓ）配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３、（ｔ）配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３、（ｕ）配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３、（ｖ）配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３、（ｗ）配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３、（ｘ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、（ｙ）配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３、（ｚ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、（ａａ）配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３、（ａｂ）配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３、（ａｃ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、（ａｄ）配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３、（ａｅ）配列番号５００のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０２のｓｄＣＤＲ３、（ａｆ）配列番号５０４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０６のｓｄＣＤＲ３、（ａｇ）配列番号５０８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１０のｓｄＣＤＲ３、ならびに（ａｈ）配列番号５１２のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセットを含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の及び／または第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、配列番号１９３、配列番号２１７、配列番号２２５、配列番号２３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２２１、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２４１、配列番号４９９、配列番号５０３、配列番号５０７及び配列番号５１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２と第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は同じである。
いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２と第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は異なる。
いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変重ドメインは疑似可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、疑似可変重ドメインは疑似可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、ＨＳＡに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）は、（ａ）（ｉ）配列番号２４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４８のｓｄＣＤＲ３ならびに（ｉｉ）配列番号２５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２５２のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセット、または（ｂ）配列番号２４５及び配列番号２４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、配列番号３３９～４０８及び配列番号５３２～５３５からなる群から選択される開裂ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリンＡ、メプリンＢ、カテプシンＳ、カプテプシンＫ、カプテシンＬ、グランザイムＢ、ｕＰＡ、カレクリエイン７、マトリプターゼ及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４５９～４８４及び配列番号４９１～４９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
記載された融合タンパク質のいずれかをコードする核酸が本明細書において提供される。
記載された核酸のいずれかを含む発現ベクターが本明細書において提供される。
記載された発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞が本明細書において提供される。
いくつかの態様では、（ｉ）融合タンパク質が発現される条件下で記載の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）融合タンパク質を回収することとを含む、本開示の融合タンパク質を作製する方法が提供される。
いくつかの態様では、記載された融合タンパク質のいずれかを対象に投与することを含む、対象のがんを治療する方法が提供される。
いくつかの態様では、（ｉ）配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９３、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号４９９、配列番号５０３、配列番号５０７及び配列番号５１１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または（ａ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、（ｂ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、（ｃ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、（ｄ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、（ｅ）配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３、（ｆ）配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３、（ｇ）配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５２のｓｄＣＤＲ３、（ｈ）配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３、（ｉ）配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３、（ｊ）配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３、（ｋ）配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３、（ｌ）配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３、（ｍ）配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３、（ｎ）配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３、（ｏ）配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３、（ｐ）配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３、（ｑ）配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３、（ｒ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、（ｓ）配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３、（ｔ）配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３、（ｕ）配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３、（ｖ）配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３、（ｗ）配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３、（ｘ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、（ｙ）配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３、（ｚ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、（ａａ）配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３、（ａｂ）配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３、（ａｃ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、（ａｄ）配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３、（ａｅ）配列番号５００のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０２のｓｄＣＤＲ３、（ａｆ）配列番号５０４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０６のｓｄＣＤＲ３、（ａｇ）配列番号５０８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１０のｓｄＣＤＲ３、ならびに（ａｈ）配列番号５１２のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１４のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセットを含むアミノ酸配列を含む、ヒトＨＥＲ２に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２）が提供される。
いくつかの態様では、Ｎ末端からＣ末端まで、（ａ）腫瘍標的抗原に結合する第１のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）、（ｂ）第１のドメインリンカー、（ｃ）（ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインとを含む制約性Ｆｖドメイン、（ｄ）第２のドメインリンカー、（ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、（ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）、（ｇ）（ｉ）第１の疑似可変軽ドメインと（ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）と（ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインとを含む制約性疑似Ｆｖドメイン、（ｈ）第３のドメインリンカー、（ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む融合タンパク質が提供され、ここで、制約性Ｆｖドメインの第１の可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、制約性疑似ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、第１の可変軽ドメイン及び第１の疑似可変重ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成しており、（１）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２もしくはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３であり、第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択されるか、または（２）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２もしくはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である、のいずれかである。
いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはそれぞれｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＬＰＹＤ３は同じである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のｓｄＡＢＤ－ＬＰＹＤ３は異なる。
融合タンパク質のいくつかの実施形態では、（ａ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２であり、第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、（ｂ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３であり、第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、（ｃ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、第２のＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２であり、または（ｄ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、第２のＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、（ａ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｂ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｃ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｄ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０を含むＣＤＲのセット、（ｅ）配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｆ）配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｇ）配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｈ）配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉ）配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｊ）配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｋ）配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｌ）配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｍ）配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｎ）配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｏ）配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｐ）配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｑ）配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｒ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｓ）配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｔ）配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｕ）配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｗ）配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｘ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｙ）配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｚ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ａａ）配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ａｂ）配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ａｃ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、ならびに（ａｄ）配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ａｅ）配列番号１４１、（ａｆ）配列番号１４５、（ａｇ）配列番号１４９、（ａｇ）配列番号１５３、（ａｉ）配列番号１５７、（ａｊ）配列番号１６１、（ａｋ）配列番号１６５、（ａｌ）配列番号１６９、（ａｍ）配列番号１７３、（ａｎ）配列番号１７７、（ａｏ）配列番号１８１、（ａｐ）配列番号１８５、（ａｑ）配列番号１８９、（ａｒ）配列番号１９３、（ａｓ）配列番号１９７、（ａｔ）配列番号２０１、（ａｕ）配列番号２０５、（ａｖ）配列番号２０９、（ａｗ）配列番号２１３、（ａｘ）配列番号２１７、（ａｙ）配列番号２２１、（ａｚ）配列番号２２５、（ｂａ）配列番号２２９、（ｂｂ）配列番号２３３、（ｂｃ）配列番号２３７及び（ｂｄ）配列番号２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、（ａ）配列番号１１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｂ）配列番号１２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｃ）配列番号１２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｄ）配列番号１３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｅ）配列番号１３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｆ）配列番号１３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｇ）配列番号１１７、（ｈ）配列番号１２１、（ｉ）配列番号１２５、（ｊ）配列番号１２９、（ｋ）配列番号１３３、ならびに（ｌ）配列番号１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、（ｉ）配列番号３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号３６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉｉ）配列番号５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｘ）配列番号３３、（ｘ）配列番号３７、（ｘｉ）配列番号４１、（ｘｉｉ）配列番号４５、（ｘｉｉｉ）配列番号４９、（ｘｉｖ）配列番号５３、ならびに（ｘｖ）配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９は、（ｉ）配列番号１０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１０４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号１０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１０８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号１１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１１２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号１１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１１６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号１０１、（ｖｉ）配列番号１０５、（ｖｉｉ）配列番号１０９、ならびに（ｖｉｉｉ）配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、（ｉ）配列番号２のｓｄＣＤＲ１、配列番号３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号６のｓｄＣＤＲ１、配列番号７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号１、（ｖｉｉ）配列番号５、（ｖｉｉｉ）配列番号９、（ｉｘ）配列番号１３、ならびに（ｘ）配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、（ｉ）配列番号６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号７２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号７６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号４９６のｓｄＣＤＲ１、配列番号４９７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４９８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号６１、（ｖｉｉ）配列番号６５、（ｖｉｉｉ）配列番号６９、（ｉｘ）配列番号７３、ならびに（ｘ）配列番号４９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１は、（ｉ）配列番号２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号３２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号２１、（ｖ）配列番号２５、ならびに（ｖｉ）配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、（ｉ）配列番号７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号９２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号９６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１００のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉｉ）配列番号７７、（ｖｉｉｉ）配列番号８１、（ｉｘ）配列番号８５、（ｘ）配列番号８９、（ｘｉ）配列番号９３、（ｘｉｉ）配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第１の可変重ドメインは第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変重ドメインは疑似可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、第１の可変軽ドメインは第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、疑似可変重ドメインは疑似可変軽ドメインのＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、ＨＳＡに結合する第３のｓｄＡＢＤは、（ａ）（ｉ）配列番号２４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４８のｓｄＣＤＲ３ならびに（ｉｉ）配列番号２５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２５２のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセット、または（ｂ）配列番号２４５及び配列番号２４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、配列番号３３９～４０８及び配列番号５３２～５３５からなる群から選択される開裂ドメイン配列を含む。
いくつかの実施形態では、開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリンＡ、メプリンＢ、カテプシンＳ、カプテプシンＫ、カプテシンＬ、グランザイムＢ、ｕＰＡ、カレクリエイン７、マトリプターゼ及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７及び配列番号４５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
記載された融合タンパク質のいずれかをコードする核酸が本明細書において提供される。記載された核酸のいずれかを含む発現ベクターが本明細書において提供される。記載された発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞が本明細書において提供される。
いくつかの態様では、（ｉ）融合タンパク質が発現される条件下で記載の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）融合タンパク質を回収することとを含む、本開示の融合タンパク質を作製する方法が提供される。
いくつかの態様において、（ｉ）配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３及び配列番号１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または（ｉｉ）（ａ）配列番号１１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２０のｓｄＣＤＲ３、（ｂ）配列番号１２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２４のｓｄＣＤＲ３、（ｃ）配列番号１２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２８のｓｄＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３２のｓｄＣＤＲ３、（ｅ）配列番号１３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３６のｓｄＣＤＲ３、ならびに（ｆ）配列番号１３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４０のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセットを含むアミノ酸配列を含む、ヒトＬｙＰＤ３と結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３）が提供される。
記載された単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）のいずれかをコードする核酸もまた提供される。核酸のいずれかを含む発現ベクターもまた提供される。記載された発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞が本明細書において提供される。
いくつかの態様では、（ａ）ｓｄＡＢＤが発現される条件下で本明細書に記載の宿主細胞のいずれかを培養することと、（ｂ）ｓｄＡＢＤを回収することとを含む、単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）を作製する方法が提供される。
記載の融合タンパク質のいずれか、または記載の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）のいずれかを含む医薬組成物もまた提供される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を更に含む。
いくつかの態様では、記載された融合タンパク質のいずれか、記載された単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）のいずれか、または本開示の医薬組成物のいずれかを投与することを含む、対象のがんを治療する方法が提供される。
序論
本発明は、重要な生理学的標的、例えばＣＤ３及び腫瘍抗原などに結合する二重特異性抗体（抗体様機能性タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低下させる方法に関する。多くの抗原結合タンパク質、例えば抗体などは、正常な組織を標的とすることにより重大な副作用を示す場合があることから、治療用分子の結合能を疾患組織近傍においてのみ有効化させて正常な組織相互作用を回避する必要がある。それゆえ、本発明は、いくつかの機能性タンパク質ドメインを有する多価条件的有効化型（multivalent conditionally effective、「ＭＣＥ」）タンパク質に関する。一般的に、これらのドメインの１つは、標的腫瘍抗原（target tumor antigen、ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（antigen binding domain、ＡＢＤ）であり、もう１つは、ＣＤ３などのＴ細胞抗原と特定の条件下で結合するＡＢＤである。加えて、ＭＣＥタンパク質はまた、１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。それはつまり、腫瘍環境に曝露されるまでＣＤ３結合ドメインが不活性である「プロドラッグ」様形態で、治療用分子が作製されるということである。腫瘍環境にはプロテアーゼが含まれているため、プロテアーゼに曝露されると、プロドラッグが開裂され、活性化される。
本発明は、重要な生理学的標的、例えばＣＤ３及び腫瘍抗原などに結合する二重特異性抗体（抗体様機能性タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低下させる方法に関する。多くの抗原結合タンパク質、例えば抗体などは、正常な組織を標的とすることにより重大な副作用を示す場合があることから、治療用分子の結合能を疾患組織近傍においてのみ有効化させて正常な組織相互作用を回避する必要がある。それゆえ、本発明は、いくつかの機能性タンパク質ドメインを有する多価条件的有効化型（multivalent conditionally effective、「ＭＣＥ」）タンパク質に関する。一般的に、これらのドメインの１つは、標的腫瘍抗原（target tumor antigen、ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（antigen binding domain、ＡＢＤ）であり、もう１つは、ＣＤ３などのＴ細胞抗原と特定の条件下で結合するＡＢＤである。加えて、ＭＣＥタンパク質はまた、１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。それはつまり、腫瘍環境に曝露されるまでＣＤ３結合ドメインが不活性である「プロドラッグ」様形態で、治療用分子が作製されるということである。腫瘍環境にはプロテアーゼが含まれているため、プロテアーゼに曝露されると、プロドラッグが開裂され、活性化される。
これは一般的に、本明細書において、ＭＣＥのＣＤ３ Ｆｖを本明細書で考察する不活性形態に制約し、ＣＤ３などのＴ細胞抗原を標的とする「疑似」可変重ドメイン及び「疑似」可変軽ドメインを含むタンパク質を用いることによって達成される。ＴＴＡがＭＣＥを腫瘍近傍へと向かわせると、その結果として、ＭＣＥがプロテアーゼに曝露されることになる。開裂が生じると、活性可変重ドメイン及び活性軽ドメインがその時点で対をなし、ＣＤ３に対する１つ以上の活性ＡＢＤを形成することにより、Ｔ細胞を腫瘍へと動員して、治療をもたらすことができる。
一般的に、ＣＤ３結合ドメイン（「Ｆｖ」）は、伝統的にＦｖを形成する活性可変重ドメインと活性可変軽ドメインとの間のリンカーが短すぎて、２つの活性可変ドメインが互いに結合することができない制約性形式である。これは「制約性リンカー」と呼ばれる。これらは、制約性かつ開裂性（形式１で使用されるＣＣＬ）または制約性かつ非開裂性（形式２で使用されるＣＮＣＬ）であり得る。むしろ、プロドラッグ（例えば、未開裂）形式において、プロドラッグポリペプチドはまた、「疑似Ｆｖドメイン」を含む。疑似Ｆｖドメインは可変重ドメイン及び可変軽ドメインを含み、標準的なフレームワーク領域を備えるが、ＣＤＲは「不活性（inert）」または「不活性（inactive）」である。疑似Ｆｖドメインはまた、不活性可変重ドメインと不活性可変軽ドメインの間に制約性リンカーを有する。Ｆｖドメインも疑似Ｆｖドメインも立体的な制約により自己集合できないため、それぞれのフレームワーク領域の親和性により、ａＶＬとｉＶＨ及びａＶＨとｉＶＬを対にする分子内集合体が存在する。しかしながら、疑似ドメインの「不活性」ＣＤＲにより、結果として生じるＡＢＤはＣＤ３と結合せず、その結果、腫瘍などの疾患組織外での毒性を防止する。しかしながら、腫瘍内または腫瘍近接にあるプロテアーゼの存在下では、プロドラッグ構築物は、疑似Ｆｖドメインが表面から放出され、「真性」の可変重ドメイン及び可変軽ドメインが分子間で会合可能となる（例えば、２つの開裂された構築物が一緒になる）ように、開裂することにより、有効なＣＤ３結合を誘発して、抗腫瘍効果をもたらす。これらの構築物は、一般に、本明細書では条件付き二重特異的再方向付け活性化構築物または「ＣＯＢＲＡ（商標）」と称される。分子内集合体の安定性は、本明細書において条件付け実験によって示され、プロテアーゼの非存在下で、未開裂構築物は、活性を有しない（例えば、活性ＣＤ３結合ドメインは形成されない）。
興味深いことに、説明を簡単にするために、これらの構築物はすべて、本明細書において「制約された」と称される一方で、更なる研究は、分子内集合体が、Ｆｖドメインのうちの１つが制約されていない場合、例えばドメインのうちの１つがより長く柔軟なリンカーを有することができる場合でさえ好ましいことを示す。すなわち、図３７～図３９に示されるように、分子内集合体は、Ｆｖドメインのうちの１つのみ、活性ＶＬ及びＶＨを有するドメイン、または疑似Ｆｖドメインのいずれかが制約されている場合でもやはり生じる（例えば、未開裂構築物は、プロテアーゼ開裂の非存在下で不活性である）。しかしながら、本系において、両方のリンカーが制約されているとき、タンパク質はより良好な発現を有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、本明細書の形式１、形式２または形式４構築物のいずれかは、「非制約性」または「柔軟性」リンカーを有するこれらのＦｖドメインのうちの１つを有することができる。参照を容易にするために、構築物は、両方のＦｖドメインが制約された形式で示される。
本発明の構築物及び形式は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１７／１５６１７８号、同第ＷＯ２０１９／０５１１０２号、同第ＷＯ２０２０／１８１１４０号、米国特許第２０１９／００７６５２４号及び同第２０２０／０３４７１３２号に記載された実施形態のバリエーションである。国際公開第ＷＯ２０１７／１５６１７８号の図１７～図２１、国際公開第ＷＯ２０１９／０５１１０２号の図及び国際公開第ＷＯ２０２０／１８１１４０号の図に示すように、以前の構築物は、単一ポリペプチド中のＶＨ及びＶＬドメインの２つのセットの存在により異性化して、二価ｓｃＦｖ及び単鎖二重特異性抗体の両方を形成する能力を有する。各アイソフォームの精製後でさえ、二価構築物はなお、二重特異性抗体アイソフォームとの均衡状態に達することができる。単鎖二重特異性抗体は、プロテアーゼ開裂の非存在下でＣＤ３に結合する能力を有し、構築物の有用性は低下する。
この問題を解決するために、本発明は、この条件付き活性化を達成するために４つの別々のタイプの構築物を提供する。プロドラッグ活性化は、図に概ね示されるように、４つの一般的な方法のうちの１つで起こり得る。図１では、「形式１」メカニズムが示される。この実施形態では、プロドラッグ構築物は２つの開裂部位を有する。１つは、制約性ＦｖのＶＨドメインとｖｌドメインとの間にあり、したがって２つの可変ドメインを自由に会合させ、第２の開裂部位は、プロドラッグ構築物から疑似Ｆｖドメインを放出する部位にあり、可変重及び可変軽ドメインの固有の自己集合により会合する２つの分子を残し、それぞれは、同様に腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを有し、したがってＴ細胞の腫瘍部位への動員を可能にする。
代替の実施形態では、プロドラッグ構築物は、図２の「形式２」メカニズムに示される。この実施形態では、活性可変重鎖と活性軽鎖との間のドメインリンカーは、制約されているが非開裂性のリンカー（「ＣＮＣＬ」）である。プロドラッグ形式において、制約性疑似Ｆｖドメイン不活性ＶＨ及びＶＬは、ＣＤ３結合が存在しないように、制約性ＦｖドメインのＶＨ及びＶＬと会合する。しかしながら、いったん腫瘍環境における開裂が起こると、それぞれが活性可変重及び軽ドメインを含む２つの異なる活性化タンパク質は会合して、２つの抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。この形式２は、２つの標的腫瘍抗原結合ドメイン（「ＴＴＡ－ＡＢＤ」）を有し、以下により十分に説明するように、同一（例えば「ホモ－ＣＯＢＲＡ」）または異なる（例えば「ヘテロ－ＣＯＢＲＡ」）ことができる。異なる場合、それらはそれぞれ異なる腫瘍抗原に向けられているか、または同じ腫瘍抗原に向けられているが、以下でより完全に説明されているように異なるエピトープに向けられている可能性がある。
すべての構成成分が単一のアミノ酸配列上に含有される上で考察される「単鎖タンパク質」ＣＯＢＲＡ形式に加えて、図３に示されるように、対で作用する２つのタンパク質「半ＣＯＢＲＡ」に依存する構築物も存在する。この実施形態では、各タンパク質は、プロテアーゼ開裂部位によって分離される１つの活性可変ドメイン及び１つの非活性可変ドメインを有する。各分子は、ＴＴＡ結合ドメインを含有し、これにより、分子がＴＴＡに結合され、腫瘍プロテアーゼに曝露されたとき、非活性ドメインが開裂され、２つの活性可変ドメインが自己集合して、抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。
更に、本発明は、図４に示されるように、同様に「形式４」構築物を提供する。これらは、ＴＴＡに対して単一のＡＢＤが使用され、これにより開裂すると、以下に更に記載されるように、プロドラッグ分子のうちの２つがここで、２つの活性抗ＣＤ３ドメインを含有する四価の二重特異性構築物を形成することを除いて、「形式２」の設計と同様である。
したがって、本発明の形式及び構築物は、疾患の治療で使用される。
定義
本出願をより完全に理解することができるように、いくつかの定義を以下に記載する。このような定義は、文法上の等価物を包含することを意味する。
本出願をより完全に理解することができるように、いくつかの定義を以下に記載する。このような定義は、文法上の等価物を包含することを意味する。
「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、本明細書で使用する場合、特定の所定の位置に存在し得る２０種の天然アミノ酸のうちの１種または任意の非天然類似体のことを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」とは、２０種の天然アミノ酸のうちの１種のことを意味する。「タンパク質」とは、本明細書において、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸のことを意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドが挙げられる。
「アミノ酸修飾」とは、本明細書において、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／または欠失、またはタンパク質に化学的に結合した部分に対する改変のことを意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変糖質またはＰＥＧ構造であってもよい。わかりやすくするために付言すると、別途示さない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡがコードするアミノ酸、例えばＤＮＡ及びＲＮＡにコドンを有する２０種のアミノ酸に対するものである。本明細書における好ましいアミノ酸修飾は置換である。
「アミノ酸置換」または「置換」とは、本明細書において、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸に置き換えることを意味する。とりわけ、いくつかの実施形態では、置換は、生物内の天然ではないものまたは任意の生物のいずれかにおける、特定の位置の、天然ではないアミノ酸に対するものである。わかりやすくするために付言すると、核酸コード配列は変化させるが開始アミノ酸は変化させない（例えば、宿主生物での発現レベルを上昇させるように、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（やはりアルギニンをコードする）に交換する）ように工学操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子を作製したにもかかわらず、そのタンパク質が開始した特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、本明細書で使用する場合、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。
「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、本明細書で使用する場合、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸配列を除去することを意味する。
本発明のポリペプチドは、ＣＤ３及び標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）、例えば、本明細書で概要を示す標的細胞受容体などに特異的に結合する。「特異的結合」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に特異的に結合する」もしくは「に特異的な」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合のことを意味する。特異的結合は、例えば、一般的には結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した、分子の結合を求めることにより、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合により測定することができる。
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対する少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤ（ＫＤとは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度のことを意味する）を有する抗体により示され得る。一般的に、抗原に特異的に結合する抗体は、対照分子と比較して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上の倍数より大きな、抗原またはエピトープに対するＫＤを有する。
同様に、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍またはそれ以上の倍数より大きな、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａ（ＫＡまたはＫａとは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度のことを意味する）を有する抗体により示され得る。結合親和性は通常、当技術分野において周知のとおり、ＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔを用いて測定される。
「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃ親またはＦｃ前駆体を含む）とは、本明細書で使用する場合、バリアントを作製するためにその後に修飾されるポリペプチドのことを意味する。前記親ポリペプチドは、天然ポリペプチド、または天然ポリペプチドのバリアントもしくは改変型であってもよい。親ポリペプチドとは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、または親ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を指し得る。それゆえ、「親Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、バリアントを作製するために修飾される未修飾Ｆｃポリペプチドのことを意味し、「親抗体」とは、本明細書で使用する場合、バリアント抗体を作製するために修飾される未修飾抗体のことを意味する。
「位置」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質の配列内の場所のことを意味する。順に、または確立された方式、例えば、抗体ナンバリング用のＥＵインデックスに従って、位置に番号を振ってもよい。
「標的抗原」とは、本明細書で使用する場合、任意の抗体の可変領域が特異的に結合する分子のことを意味する。標的抗原は、タンパク質、糖質、脂質、または他の化合物であってもよい。様々な好適で例示的な標的抗原については本明細書に記載している。
「標的細胞」とは、本明細書で使用する場合、標的抗原を発現する細胞のことを意味する。概して、本発明の目的で、標的細胞は、ＴＴＡを発現させる腫瘍細胞またはＣＤ３抗原を発現させるＴ細胞のいずれかである。
「Ｆｖ」または「Ｆｖドメイン」もしくは「Ｆｖ領域」とは、本明細書で使用する場合、概して抗体からの抗原結合ドメインのＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖドメインは通常、それらが活性ＶＨ及びＶＬドメインを含有する場合、本明細書で考察されるような「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」を形成する（場合によっては、制約性リンカーを含有するＦｖが使用され、これにより活性ＡＢＤは、開裂前に形成されないが）。以下で考察されるように、Ｆｖドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、ｓｃＦｖ形式、制約性Ｆｖ形式、疑似Ｆｖ形式などで「活性」または「不活性」であり得る。本発明において、場合によっては、Ｆｖドメインは、図１及び図２に示されるように、単一のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインで構成されるが、分子内ＡＢＤを形成することができないように制約性リンカーを有することが理解されるべきである。これらの実施形態では、２つの活性ＡＢＤが形成されるのは開裂後である。場合によっては、Ｆｖドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインで構成され、そのうちの１つは非活性であり、これにより、開裂後にのみ分子間ＡＢＤが形成される。以下で考察されるように、Ｆｖドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、ｓｃＦｖ形式、制約性Ｆｖ形式、疑似Ｆｖ形式などで「活性」または「不活性」であり得る。加えて、本明細書で考察されるように、ＶＨ及びＶＬを含有するＦｖドメインは、ＡＢＤであり得／ＡＢＤを形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインを含有しない他のＡＢＤは、ｓｄＡＢＤを使用して形成され得る。
「可変ドメイン」とは、本明細書において、カッパ免疫グロブリン遺伝子座、ラムダ免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成する、Ｖκ遺伝子、Ｖλ遺伝子及び／またはＶＨ遺伝子のいずれかが実質的にコードする１つ以上のＩｇドメインを含む、免疫グロブリンの領域のことを意味する。場合によっては、ｓｄＦｖ（また、本明細書においてｓｄＡＢＤとも称される）などの単一の可変ドメインが使用され得る。
可変重（ＶＨ）ドメイン及び可変軽（ＶＬ）ドメインの両方を利用する実施形態では、各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、以下の順序、すなわちＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で並んだ、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）、及び４つの「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」で構成されている。それゆえ、ＶＨドメインは、構造ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を有し、ＶＬドメインは、構造ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。本明細書でより詳細に記載するとおり、ｖｈＦＲ領域及びｖｌＦＲ領域は自己集合してＦｖドメインを形成する。一般に、本発明のプロドラッグ形式では、ＶＨ及びＶＬドメインが自己会合することができない「制約性Ｆｖドメイン」、ならびにＣＤＲが自己会合したときに抗原結合ドメインを形成しない「疑似Ｆｖドメイン」が存在する。
超可変領域は、抗原結合特異性を付与するものであり、通常、軽鎖可変領域のおよそアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域のおよそ３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）あたりの、アミノ酸残基；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、及び／または、超可変ループ（例えば、軽鎖可変領域の残基２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域の残基２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５３～５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６～１０１（ＨＣＤＲ３））を形成するアミノ酸残基；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、を包含する。本発明の具体的なＣＤＲについて以下で説明する。
当業者が理解するように、ＣＤＲの厳密なナンバリング及び配置は、個別のナンバリングシステムの間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖配列及び／または可変軽鎖配列の本開示が、会合する（固有の）ＣＤＲの本開示を含むということを理解すべきである。それゆえ、それぞれの可変重鎖領域の本開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、それぞれの可変軽鎖領域の本開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。
ＣＤＲナンバリングの利用可能な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照されたい。
本明細書の全体にわたり、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７、及び重鎖可変領域の残基１～１１３）に言及する場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを一般的に使用し、Ｆｃ領域にはＥＵナンバリングシステム（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９１））を使用する。
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、抗ＣＤ３構成成分の文脈における「完全なＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖ＣＤＲ及び３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む。当業者が理解するように、ＣＤＲのそれぞれのセット、ＶＨＣＤＲ及びＶＬＣＤＲは、個別に及びセットとしての両方で、抗原に結合することができる。例えば、制約性Ｆｖドメインにおいて、ｖｈＣＤＲは、例えばＣＤ３に結合することができ、ｖｌＣＤＲはＣＤ３に結合することができるが、制約された形式において、ｖｈＣＤＲ及びｖｌＣＤＲはＣＤ３に結合することができない。
標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するために本明細書において概して使用されるような単一ドメインＡＢＤ（「ｓｄＡＢＤ」）の文脈において、ＣＤＲセットは、３つのＣＤＲのみである。これらは、当技術分野において「ＶＨＨ」ドメインとも称されるときがある。
これらのＣＤＲはそれぞれ、より大きな可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であってもよい。加えて、本明細書においてより十分に概説されるように、可変重及び可変軽ドメインは、本明細書の部分の形式及び配置に応じて、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
ＣＤＲは、抗原結合部位、またはより具体的にはエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている可変領域の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基のことを意味する。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集合であり、通常、特定の構造特性に加えて特定の荷電特性を有する。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有していてもよい。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの主要抗原構成要素とも呼ばれる）、及び、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的に阻害されるアミノ酸残基（すなわち、そのアミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内にある）を含んでもよい。
エピトープは立体配座または直鎖状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントに由来する、空間的に並べられたアミノ酸により生成される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基により生成されるエピトープである。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は失われるが後者に対しては失われないという点で区別することができる。
エピトープは通常、独特な空間立体配座で、少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５つ、または８～１０つのアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体については、一方の抗体が、もう一方の抗体の標的抗原への結合を阻害する能力を示す単純なイムノアッセイ、例えば、「ビニング」により、検証することができる。以下で概要を示すとおり、本発明は、本明細書で列挙する抗原結合ドメイン及び抗体だけではなく、列挙した抗原結合ドメインが結合するエピトープとの結合において競合する抗原結合ドメイン及び抗体も含む。
本発明の可変重ドメイン及び可変軽ドメインは「活性」または「不活性」であってもよい。
本明細書で使用する場合、「不活性ＶＨ」（「ｉＶＨ」）及び「不活性ＶＬ」（「ｉＶＬ」）とは、疑似Ｆｖドメインの構成要素のことを指し、「不活性ＶＨ」（「ｉＶＨ」）及び「不活性ＶＬ」（「ｉＶＬ」）は、それらの同種ＶＬパートナーまたは同種ＶＨパートナーとそれぞれ対をなす場合に、「活性」ＶＨまたは「活性」ＶＬが結合し得る抗原に特異的に結合しない、結果として生じるＶＨ／ＶＬ対を形成するが、抗原が類似ＶＬまたは類似ＶＨに結合する場合、その類似ＶＬまたは類似ＶＨは「不活性」ではない。例示的な「不活性ＶＨ」及び「不活性ＶＬ」ドメインは、以下でより十分に概説されるように、野生型ＶＨまたはＶＬ配列の突然変異によって形成される。例示的な変異は、ＶＨもしくはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３の内部に存在する。例示的な変異は、ドメインリンカーをＣＤＲ２内に配置することにより、「不活性ＶＨ」ドメインまたは「不活性ＶＬ」ドメインを形成することを含む。それに対し、「活性ＶＨ」または「活性ＶＬ」は、その「活性」同種パートナー、すなわち、ＶＬまたはＶＨとそれぞれ対をなす場合に、その標的抗原に特異的に結合することができるＶＨまたはＶＬである。したがって、疑似ＦｖがＶＨ／ｉＶＬ対、ｉＶＨ／ＶＬ対またはｉＶＨ／ｉＶＬ対であり得ることが理解されるべきである。
それに対し、本明細書で使用する場合、「活性」という用語は、ＣＤ３に特異的に結合することができるＣＤ３結合ドメインを指す。この用語は、２つの文脈、すなわち（ａ）Ｆｖ結合対の単一のメンバー（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）（その同種パートナーと対をなしてＣＤ３に特異的に結合することができる配列のもの）に言及する場合、及び（ｂ）ＣＤ－に特異的に結合することができる配列の同種の対（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）で使用される。例示的な「活性」ＶＨ、ＶＬまたはＶＨ／ＶＬ対は、野生型配列または親配列である。
「ＣＤ－ｘ」は分化抗原群（ＣＤ）タンパク質を指す。例示的な実施形態では、ＣＤ－ｘは、本発明のポリペプチド構築物を投与した対象におけるＴ細胞を動員または活性化させる役割を有するそれらＣＤタンパク質から選択される。例示的な実施形態では、ＣＤ－ｘはＣＤ３であり、その配列は図７に示される。
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関係において、標的分子（抗原）、例えば、それぞれＥＧＦＲ及びＣＤ３上の任意の標的エピトープまたは任意の標的部位に（特異的に）結合する／と相互作用する／を認識するドメインを特徴としている。標的抗原結合ドメイン（ＥＧＦＲを認識する）の構造及び機能、及び好ましくはまた、ＣＤ３結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能は、抗体、例えば、ｓｄＡＢＤを含む全長の抗体または完全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づいている。本発明によれば、標的抗原結合ドメインは通常、標的腫瘍抗原と結合する３つのＣＤＲの存在を特徴としている（対応する軽鎖ＣＤＲは存在しないが、当技術分野においては一般的に、可変重ドメインと呼ばれる）。代替的に、ＴＴＡに対するＡＢＤは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含んでいてもよい。ＣＤ３結合ドメインはまた、標的結合を可能とする少なくとも最低限の抗体の構造的要件を含んでいることが好ましい。より好ましくは、ＣＤ３結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）及び／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。例示的な実施形態では、ファージディスプレイ法またはライブラリスクリーニング法を用いて、標的抗原及び／またはＣＤ３結合ドメインを作製することまたは得ることができることが想定されている。
「ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、本明細書で概要を示す機能を有するタンパク質配列のことを意味する。本発明のドメインとしては、腫瘍標的抗原結合ドメイン（ＴＴＡドメイン）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、ｓｃＦｖドメイン、リンカードメイン、及び半減期延長ドメインが挙げられる。
「ドメインリンカー」とは、本明細書において、本明細書で概要を示す２つのドメインを連結するアミノ酸配列のことを意味する。ドメインリンカーは、開裂性リンカー、制約性開裂性リンカー、非開裂性リンカー、制約性非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなどであってもよい。
「開裂性リンカー」（「ＣＬ」）とは、本明細書において、本明細書で概要を示す疾患組織において、プロテアーゼ、好ましくはヒトプロテアーゼによって開裂され得るアミノ酸配列のことを意味する。開裂性リンカーは通常、少なくとも３アミノ酸長であり、必要な柔軟性に応じて、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のアミノ酸が本発明において有用である。図６及び図７には、多くの開裂性リンカー配列が示される。
「非開裂性リンカー」（「ＮＣＬ」）とは、本明細書において、通常の生理学的条件下においてヒトプロテアーゼによって開裂され得ないアミノ酸配列のことを意味する。
「制約性開裂性リンカー」（「ＣＣＬ」）とは、本明細書において、２つのドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在するようになる後、例えば、開裂後まで、２つのドメインが互いに有意に相互作用し得ないような状態で、本明細書で概要を示す２つのドメインを連結するプロテアーゼ開裂部位（本明細書で定義する）を含有する短いポリペプチドのことを意味する。ＣＣＬが本明細書で定義するＶＨドメイン及びＶＬドメインと結合する場合、ＶＨ及びＶＬは、分子間での立体障害により、開裂前に自己集合して機能性Ｆｖを形成することができない（それらは、分子間で疑似Ｆｖドメインに集合し得るが）。関連するプロテアーゼによって開裂すると、ＶＨ及びＶＬは集合して、分子間で活性抗原結合ドメインを形成することができる。通常、ＣＣＬは１０未満のアミノ酸長であり、９、８、７、６、５及び４アミノ酸が本発明において有用である。一般的に、プロテアーゼ開裂部位は通常、図６に示すとおり、十分な特異性を付与するために少なくとも４＋アミノ酸長である。
「制約性非開裂性リンカー」（「ＣＮＣＬ」）とは、本明細書において、２つのドメインが互いに有意に相互作用し得ず、かつ生理学的条件下においてヒトプロテアーゼによって有意に開裂されないような状態で、本明細書で概要を示す２つのドメインを結合する短いポリペプチドのことを意味する。
「制約性Ｆｖドメイン」とは、本明細書において、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインが分子内で相互作用して、ＣＤ３などの抗原と結合する活性Ｆｖを形成し得ないような状態で、本明細書で概要を示す制約性リンカーと共有結合で連結した活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含むＦｖドメインのことを意味する。それゆえ、制約性Ｆｖドメインは、ｓｃＦｖに類似してはいるが、制約性リンカーの存在によって抗原に結合することができないドメインである（それらは、分子間で非活性可変ドメインと集合して、疑似Ｆｖドメインを形成し得るが）。
「疑似Ｆｖドメイン」とは、本明細書において、ドメインリンカー（開裂性、制約性、非開裂性、非制約性などであってもよい）を用いて結合させた疑似または不活性の可変重ドメインまたは疑似もしくは不活性の可変軽ドメインを含むドメインのことを意味する。疑似ＦｖドメインのｉＶＨドメイン及びｉＶＬドメインは、互いに会合した場合（ｉＶＨ／ｉＶＬ）、または活性ＶＨまたは活性ＶＬと会合した場合のいずれにおいても、ヒト抗原に結合しない。そのため、ｉＶＨ／ｉＶＬ Ｆｖドメイン、ｉＶＨ／ＶＬ Ｆｖドメイン、及びｉＶＬ／ＶＨ Ｆｖドメインは、測定できるほどにはヒトタンパク質に結合せず、その結果、これらのドメインはヒト体内において不活性である。
「一本鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」とは、本明細書において、本明細書で考察するドメインリンカーを一般的に用いてｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成するための、共有結合で可変軽（ＶＬ）ドメインに結合した可変重（ＶＨ）ドメインのことを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端のいずれの配向（ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ）であり得る。
「単一ドメインＦｖ」、「ｓｄＦｖ」または「ｓｄＡＢＤ」とは、本明細書において、一般的にラクダ抗体技術に基づいて、３つのＣＤＲを有するに過ぎない抗原結合ドメインのことを意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ９（７）：１１２９－３５（１９９４）、Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ７４：２７７－３０２（２００１）、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ８２：７７５－９７（２０１３）を参照されたい。本明細書で概説するように、２つの一般的なタイプのｓｄＡＢＤ、ＴＴＡに結合し、そのようなものとして注釈が付けられるｓｄＡＢＤ（一般名称にはｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、またはＥＧＦＲに結合するものにはｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１に結合するものにはｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１など）、及びＨＳＡに結合するｓｄＡＢＤ（「ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ」または「ｓｄＡＢＤ（１／２）」）が本明細書で使用される。
「プロテアーゼ開裂部位」は、プロテアーゼが認識して開裂するアミノ酸配列を指す。好適なプロテアーゼ開裂部位については以下で概説され、図７及び図６に示される。
本明細書で使用する場合、「プロテアーゼ開裂ドメイン」とは、「プロテアーゼ開裂部位」、及び、個々のプロテアーゼ開裂部位間及びプロテアーゼ開裂部位（複数可）間の任意のリンカー、ならびに、本発明の構築物の他の機能性構成要素（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬ、標的抗原結合ドメイン（複数可）、半減期延長ドメインなど）を組み込んだペプチド配列のことを意味する。本明細書で概説するように、プロテアーゼ開裂ドメインはまた、必要に応じて、例えば柔軟性を与えるために、追加のアミノ酸も含み得る。
「ＣＯＢＲＡ（商標）」及び「条件付き二重特異性再方向付け活性化」という用語は、いくつかの機能性タンパク質ドメインを有する二重特異性の条件的に有効なタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、機能性ドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）と結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。特定の実施形態では、別のドメインは、特定の条件下でＴ細胞抗原に結合するＡＢＤである。Ｔ細胞抗原としては、ＣＤ３が挙げられるがこれらに限定されない。「半ＣＯＢＲＡ（商標）」という用語は、標的発現細胞の表面上に凝集した際の固有の自己集合により半ＣＯＢＲＡの可変重鎖が別の半ＣＯＢＲＡ（商標）（相補的な半ＣＯＢＲＡ（商標））の可変軽鎖に会合可能となる場合にＴ細胞抗原と結合することができる、条件的に有効なタンパク質のことを意味する。
発明を実施するための形態
Ｉ．本発明の融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、本明細書では一般的にドメインと呼ぶ、様々な様式で共に連結するいくつかの異なる構成成分を有する。ドメインのいくつかは、それぞれが標的抗原（例えば、ＴＴＡまたはＣＤ３）に結合する結合ドメインである。結合ドメインが２つ以上の抗原に結合する場合、それら結合ドメインは本明細書において「多重特異性」と呼ばれ、例えば、本発明のプロドラッグ構築物はＴＴＡ及びＣＤ３に結合し得、したがって「二重特異性」である。タンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第１のαＴＴＡがＥＧＦＲに結合し、第２のαＴＴＡがＥｐＣＡＭに結合し、抗ＣＤ３結合ドメインが存在する場合、これは「三重特異性」分子である。同様に、この構築物への抗ＨＳＡ結合ドメインの付加は、図３Ｂに示されるように「四重特異性」である。
Ｉ．本発明の融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、本明細書では一般的にドメインと呼ぶ、様々な様式で共に連結するいくつかの異なる構成成分を有する。ドメインのいくつかは、それぞれが標的抗原（例えば、ＴＴＡまたはＣＤ３）に結合する結合ドメインである。結合ドメインが２つ以上の抗原に結合する場合、それら結合ドメインは本明細書において「多重特異性」と呼ばれ、例えば、本発明のプロドラッグ構築物はＴＴＡ及びＣＤ３に結合し得、したがって「二重特異性」である。タンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第１のαＴＴＡがＥＧＦＲに結合し、第２のαＴＴＡがＥｐＣＡＭに結合し、抗ＣＤ３結合ドメインが存在する場合、これは「三重特異性」分子である。同様に、この構築物への抗ＨＳＡ結合ドメインの付加は、図３Ｂに示されるように「四重特異性」である。
当業者によって理解されるように、本発明のタンパク質は、異なる原子価を有することができ、かつ多重特異性であり得る。つまり、本発明のタンパク質は、標的を２つ以上の結合部位と結合することができ、例えば、Ｐｒｏ１８６はＥＧＦＲに対して二価である。
本発明のタンパク質は、本明細書で概要を示す様々な様式で並べられたＣＤ３抗原結合ドメイン、腫瘍標的抗原結合ドメイン、半減期延長ドメイン、リンカーなどを含んでいてもよい。
Ａ．ＣＤ３抗原結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合遺伝子複合体、ＭＨＣに関連して提示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、２つのＣＤ３ｅ（イプシロン）鎖、及び２つのＣＤ３ζ（ゼータ）鎖を含む、タンパク質複合体である。ＣＤ３分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）及びβ（ベータ）鎖と会合して、ＴＣＲ複合体を含む。ＣＤ３に結合するＦｖドメインなどによるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化をもたらす。
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合遺伝子複合体、ＭＨＣに関連して提示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、２つのＣＤ３ｅ（イプシロン）鎖、及び２つのＣＤ３ζ（ゼータ）鎖を含む、タンパク質複合体である。ＣＤ３分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）及びβ（ベータ）鎖と会合して、ＴＣＲ複合体を含む。ＣＤ３に結合するＦｖドメインなどによるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化をもたらす。
しかしながら、当技術分野において周知のとおり、ＣＤ３の活性化は多くの毒性副作用を引き起こすことから、本発明は、特異的なプロテアーゼが存在することにより本発明のプロドラッグポリペプチドが開裂して活性ＣＤ３結合ドメインがもたらされる腫瘍細胞の存在下でのみ、本発明のポリペプチドの有効なＣＤ３結合をもたらすことに関する。それゆえ、本発明において、抗ＣＤ３ ＦｖドメインのＣＤ３への結合は、ＣＤ３ ＦｖドメインのＣＤ３への結合を、プロテアーゼレベルが高い疾患細胞または組織の微小環境、例えば本明細書に記載の腫瘍微小環境にのみ制限するプロテアーゼ開裂ドメインによって制御される。
したがって、本発明は、ＶＨ及びＶＬドメインの２つのセット、活性セット（ＶＨ及びＶＬ）ならびに不活性セット（不活性ＶＨ及び不活性ＶＬ）を提供し、４つすべてがプロドラッグ構築物中に存在する。構築物は、ＶＨ及びＶＬセットが自己会合することができず、むしろ不活性パートナー、例えば、本明細書に示されるようなｉＶＨ及びＶＬならびにｉＶＬ及びＶＨと会合するように形式設定される。
１．活性抗ＣＤ３可変重及び可変軽ドメイン
本発明に有用な、当技術分野において周知の多くの好適な活性ＣＤＲセット及び／またはＶＨドメイン及びＶＬドメインが存在する。例えば、ＣＤＲ及び／またはＶＨドメイン及びＶＬドメインは、周知の抗ＣＤ３抗体、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（ヌビオン）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ－６６またはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、及びＷＴ－３１などに由来している。
本発明に有用な、当技術分野において周知の多くの好適な活性ＣＤＲセット及び／またはＶＨドメイン及びＶＬドメインが存在する。例えば、ＣＤＲ及び／またはＶＨドメイン及びＶＬドメインは、周知の抗ＣＤ３抗体、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（ヌビオン）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ－６６またはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、及びＷＴ－３１などに由来している。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する活性Ｆｖドメインを形成するＶＨ及びＶＬ配列は、図７Ａ～図７Ｂに示される。本明細書に示されるように、これらの活性ＶＨ（「ａＶＨ」）及び活性ＶＬ（「ａＶＬ」）ドメインは、異なる配置ならびに形式１、２、３及び４で使用され得る。
２．不活性抗ＣＤ３可変重及び可変軽ドメイン
不活性ｉＶＨ及びｉＶＬドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域（ＦＲ）を含有し、これにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、ＣＤ３に結合できないようにする。
不活性ｉＶＨ及びｉＶＬドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域（ＦＲ）を含有し、これにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、ＣＤ３に結合できないようにする。
当業者が理解するように、本発明に有用ないくつかの「不活性」可変ドメインが存在する。基本的には、たとえどのようなアミノ酸が可変領域のＣＤＲ位置にあったとしても、別の可変ドメインとの自己集合を可能とするヒトフレームワーク領域を有するあらゆる可変ドメインを使用することができる。わかりやすくするために、厳密には不活性可変ドメインは結合能を付与しないが、不活性ドメインはＣＤＲを含むと言われている。
当技術分野において理解されるように、不活性ＶＨまたはＶＬドメインを生成することが概して単純であり、様々な方法で行われ得る。いくつかの実施形態では、不活性可変ドメインの生成は概して、活性可変ドメインの３つのＣＤＲのうちの１つ以上を変化させることを含む、活性ＦｖのＣＤＲのうちの１つ以上を改変することによって行われる。これは、１つ以上のＣＤＲの機能的に重要な残基において１つ以上のアミノ酸置換を行うこと、いくつかもしくはすべてのＣＤＲ残基をランダム配列で置き換えること、１つ以上のＣＤＲをタグもしくはフラグ配列で置き換えること、及び／またはＣＤＲ及び／または可変領域を無関係の抗体（例えば、異なる生物のタンパク質に向けられたもの）からのものと交換することによって行われ得る。
場合によっては、可変領域内のＣＤＲのうちの１つのみがそれを不活性にするように改変され得るが、他の実施形態は、１、２、３、４、５または６つのＣＤＲの改変を含む。
場合によっては、不活性ドメインは、プロドラッグ形式で選択的結合を促進して、開裂前の分子内ｉＶＨ－ＶＬ及びＶＨ－ｉＶＬドメインの形成を（例えば、分子間対形成よりも）促すように操作され得る。例えば、参照によりその全体が、特に界面残基アミノ酸置換に関して本明細書に明示的に組み込まれるＩｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ２３（８）：６６７－６７７（２０１０）を参照されたい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３に対する強力なＣＤ３結合親和性を示すだけでなく、対応するカニクイザルＣＤ３タンパク質との良好な交差反応性もまた示す。場合によっては、ポリペプチド構築物のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザル由来のＣＤ３と交差反応する。特定の場合では、ＣＤ３に対するヒト：カニクイザルのＫＤ比率は５～０．２である。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に結合する任意のドメインであってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体に由来するドメインが挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、ＣＤ３結合ドメインが、抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトに使用する場合、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインに由来するヒト残基またはヒト化残基を、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインに含ませることが有利となり得る。
それゆえ、一態様では、抗原結合ドメインはヒト化結合ドメインまたはヒト結合ドメインを含む。一実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）、及び／または、本明細書に記載のヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、１つ以上、例えば３つすべてのＬＣ ＣＤＲ、及び１つ以上、例えば３つすべてのＨＣ ＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化軽鎖可変領域またはヒト軽鎖可変領域を含み、そのＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域内にヒト軽鎖ＣＤＲまたは非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。特定の例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは、ヒト化されている、または完全にヒトである。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインはカニクイザルＣＤ３との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ３結合ドメインは本明細書で提供するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化重鎖可変領域またはヒト重鎖可変領域を含み、そのＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域内にヒト重鎖ＣＤＲまたは非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むＦｖである。一実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの修飾（例えば、置換）ではあるが３０つ、２０つもしくは１０つ以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、及び／または本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つもしくは３つの修飾（例えば、置換）ではあるが３０つ、２０つもしくは１０つ以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化抗ＣＤ３結合ドメインまたはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合している。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向、すなわち軽鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－重鎖可変領域または重鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－軽鎖可変領域のいずれかであってもよい。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下のＫＤの親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３εに対する、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下のＫＤの親和性を有する。更なる実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に対する低い親和性、すなわち約１００ｎＭ以上の親和性を有する。
例えば、当技術分野において周知のとおり、アッセイプレート上にコーティングされた、細菌細胞表面上に提示された、溶液中などの、ＣＤ３への、抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインの結合能（一般的には、ＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔアッセイを用いる）により、ＣＤ３への結合親和性を測定してもよい。リガンド（例えば、ＣＤ３）または抗原結合タンパク質自体もしくはそのＣＤ３結合ドメインをビーズ、基材、細胞などに固定することにより、本開示の抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメインのＣＤ３に対する結合活性をアッセイしてもよい。適切な緩衝液及び結合パートナーに薬剤を加えて、任意の温度でしばらくの間培養してもよい。洗浄して非結合物質を除去した後、例えばＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液などを用いて結合タンパク質を剥離してから、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による解析を行ってもよい。
多くの実施形態では、好ましい活性及び非活性結合ドメインは、図７に示されるものである。図７は、異なる方法で不活性化された１つの活性ＶＨ及びＶＬならびに３つの不活性ＶＨｉ及び３つの不活性ＶＬｉを示す。
図７に示すように、特に有用な活性抗ＣＤ３ ＶＬ及びＶＨドメインの対は、配列番号２５５のｖｌＣＤＲ１、配列番号２５６のｖｌＣＤＲ２及び配列番号２５７のｖｌＣＤＲ３を備えるＶＬ、ならびに配列番号２７１のｖｈＣＤＲ１、配列番号２７２のｖｈＣＤＲ２及び配列番号２７３のｖｈＣＤＲ３を備えるＶＨを有する。
図７に示すように、活性抗ＣＤ３ ＶＬ及びＶＨドメインの特に有用な対は、配列番号２５４のＶＬ及び配列番号２７０のＶＨを有する。
Ｂ．腫瘍標的抗原に対する抗原結合ドメイン
記載されるＣＤ３及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、１つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する標的ドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりＣＤ３結合ドメインをＴ細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、ＴＴＡ結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、Ｔ細胞誘導として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも１つの標的抗原は、疾患、障害もしくは状態に関与及び／または関連している。例示的な標的抗原としては、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病に関係する標的抗原が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。代替的に、いくつかの実施形態では、標的抗原は、病原体、例えばウイルスまたは細菌などに関係している。少なくとも１つの標的抗原はまた、健常組織に関係し得る。
記載されるＣＤ３及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、１つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する標的ドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりＣＤ３結合ドメインをＴ細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、ＴＴＡ結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、Ｔ細胞誘導として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも１つの標的抗原は、疾患、障害もしくは状態に関与及び／または関連している。例示的な標的抗原としては、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病に関係する標的抗原が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。代替的に、いくつかの実施形態では、標的抗原は、病原体、例えばウイルスまたは細菌などに関係している。少なくとも１つの標的抗原はまた、健常組織に関係し得る。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、細胞表面分子、例えばタンパク質、脂質または多糖である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷赤血球、動脈プラーク細胞または線維性組織細胞の上にある。
本発明の好ましい実施形態は、標的化ドメインとしてｓｄＡＢＤを利用する。これらは、本発明の構築物への他のＶＨ及びＶＬドメインの付加が、疑似Ｆｖドメインの形式を複雑にし得るため、ｓｃＦｖ ＡＢＤよりも好ましい。
いくつかの実施形態では、本発明のプロドラッグ構築物は、概してｓｄＡＢＤ－ＴＴＡの対として図３のＡに、かつ「形式４」配置として図４に示されるような、単一ＴＴＡ結合ドメインを利用する。図４は、単一抗ＥＧＦＲ ＡＢＤの使用を示すが、他のＴＴＡ結合ドメインが使用され得る。
いくつかの実施形態では、特に形式１及び形式２構築物において、本発明のプロドラッグ構築物は、この場合もやはり好ましくはｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ形式で、２つのＴＴＡ ＡＢＤを利用する。二重標的化ドメインが使用される場合、それらは、同じＴＴＡの同じエピトープに結合することができる。例えば、本明細書で考察されるように、本明細書の構築物のうちの多くは、２つの同一の標的化ドメインを利用する。いくつかの実施形態では、同じＴＴＡの異なるエピトープに結合する２つの標的化ドメインが使用され得、例えば、図７に示されるように、２つのＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤは、ヒトＥＧＦＲ上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインは、以下により完全に記載されるように、異なるＴＴＡに結合する。
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、その抗原結合ドメインは少なくとも１つの標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＬｙＰＤ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＡ９、Ｔｒｏｐ２及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍標的抗原（「ＴＴＡ」）に特異的にかつ独立して結合する。以下で説明するように、これらは様々な方法で組み合わせることができる。
（ａ）ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ
図５のＡに示すように、本明細書において「αＥＧＦＲ」、「ａＥＧＦＲ」、「ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ」、「ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ」、「ＥＧＦＲ ｓｄＡｂｓ」、「ＥＧＦＲ ＡＢＤ」または「ＥＧＦＲＡＢＤ」と称されるヒトＥＧＦＲに結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＡに示すように、本明細書において「αＥＧＦＲ」、「ａＥＧＦＲ」、「ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ」、「ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ」、「ＥＧＦＲ ｓｄＡｂｓ」、「ＥＧＦＲ ＡＢＤ」または「ＥＧＦＲＡＢＤ」と称されるヒトＥＧＦＲに結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ（例えば、ｓｄＡＢＤ－αＥＧＦＲ１）は、配列番号２のｓｄＣＤＲ１、配列番号３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、図５のＡに示すように配列番号１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ（例えば、ｓｄＡＢＤ－αＥＧＦＲ２）は、配列番号６のｓｄＣＤＲ１、配列番号７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、図５のＡに示すように配列番号５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ｈαＥＧＦＲ１）は、配列番号１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、図５のＡに示すように配列番号９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ａＥＧＦＲ２ａ）は、配列番号１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、図５のＡに示すように配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ｈαＥＧＦＲ２ｄ）は、配列番号１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、図５のＡに示すように配列番号１７のアミノ酸配列を有する。
（ｂ）ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤ
図５のＤ～Ｅに示すように、本明細書において「αＥｐＣＡＭ」、「ａＥｐＣＡＭ」、「ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ」、「ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤ」、「ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ」、「 ＥｐＣＡＭ ＡＢＤ」または「ＥｐＣＡＭＡＢＤ」と称されるヒトＥｐＣＡＭに結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＤ～Ｅに示すように、本明細書において「αＥｐＣＡＭ」、「ａＥｐＣＡＭ」、「ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ」、「ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤ」、「ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ」、「 ＥｐＣＡＭ ＡＢＤ」または「ＥｐＣＡＭＡＢＤ」と称されるヒトＥｐＣＡＭに結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ ｈ１３）は、配列番号６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、図５のＤに示すように配列番号６１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ ｈ２３）は、配列番号６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、図５のＤに示すように配列番号６５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６５）は、配列番号７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号７２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、図５のＥに示すように配列番号６９のアミノ酸配列を有する。ｈ１３及びｈ２３ ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとは対照的に、ｈＶＩＢ６６５（「ａｃＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６５」とも称される）は、開裂された形態及び開裂されていない形態のＥｐＣＡＭ（ｉｎ ｖｉｖｏで開裂を受けることが知られている）の両方に結合することに留意すべきである。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６６）は、配列番号７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号７６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、図５のＥに示すように配列番号７３のアミノ酸配列を有する。ｈ１３及びｈ２３ ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとは対照的に、ｈＶＩＢ６６６（「ａｃＥｐＣＡＭ ｈＶＩＢ６６６」とも称される）は、開裂された形態及び開裂されていない形態のＥｐＣＡＭ（ｉｎ ｖｉｖｏで開裂を受けることが知られている）の両方に結合することに留意すべきである。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ（例えば、ヒト化ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ）は、配列番号４９６のｓｄＣＤＲ１、配列番号４９７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４９８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、図７５に示すように配列番号４９５のアミノ酸配列を有する。
（ｃ）Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤ
図５のＢ～Ｄに示すように、本明細書において、「αＢ７Ｈ３」、「ａＢ７Ｈ３」、「ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３」、「Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡｂ」、「Ｂ７Ｈ３ ＡＢＤ」、「Ｂ７Ｈ３ＡＢＤ」または「Ｂ７Ｈ３－ＡＢＤ」と称されるヒトＢ７Ｈ３に結合する特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＢ～Ｄに示すように、本明細書において、「αＢ７Ｈ３」、「ａＢ７Ｈ３」、「ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３」、「Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡｂ」、「Ｂ７Ｈ３ ＡＢＤ」、「Ｂ７Ｈ３ＡＢＤ」または「Ｂ７Ｈ３－ＡＢＤ」と称されるヒトＢ７Ｈ３に結合する特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）は、配列番号３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号３６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＢに示すように配列番号３３のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２）は、配列番号３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＣに示すように配列番号３７のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｑ））は、配列番号４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＣに示すように配列番号４１のアミノ酸配列を有する。ｈＦ７及びｈＦ１２ Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとは対照的に、アミノ酸置換Ｎ５７Ｑはグリコシル化部位を除去する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ＨＦ１２（Ｎ５７Ｅ））は、配列番号４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＣに示すように配列番号４５のアミノ酸配列を有する。ｈＦ７及びｈＦ１２ Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとは対照的に、アミノ酸置換Ｎ５７Ｅはグリコシル化部位を除去する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｎ５７Ｄ））は、配列番号５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＢに示すように配列番号４９のアミノ酸配列を有する。ｈＦ７及びｈＦ１２ Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとは対照的に、アミノ酸置換Ｎ５７Ｄはグリコシル化部位を除去する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ａ））は、配列番号５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＤに示すように配列番号５３のアミノ酸配列を有する。ｈＦ７及びｈＦ１２ Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとは対照的に、アミノ酸置換Ｓ５９Ａはグリコシル化部位を除去する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３ ｈＦ１２（Ｓ５９Ｙ））は、配列番号５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、図５のＤに示すように配列番号５７のアミノ酸配列を有する。ｈＦ７及びｈＦ１２ Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとは対照的に、アミノ酸置換ＮＳ５９Ｙはグリコシル化部位を除去する。
（ｄ）ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤ
図５のＢに示すように、本明細書において「αＦＯＬＲ１」、「ａＦＯＬＲ１」、「ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１」、「ＦＯＬＲ１ ｓｄＡｂ」、「ｓｄＡＢＤ ＦＯＬＲ１」、「ＦＯＬＲ１ ＡＢＤ」、「ＦＯＬＲ１ＡＢＤ」または「ＦＯＬＲ１－ＡＢＤ」と称されるヒトＦＯＬＲ１に結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＢに示すように、本明細書において「αＦＯＬＲ１」、「ａＦＯＬＲ１」、「ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１」、「ＦＯＬＲ１ ｓｄＡｂ」、「ｓｄＡＢＤ ＦＯＬＲ１」、「ＦＯＬＲ１ ＡＢＤ」、「ＦＯＬＲ１ＡＢＤ」または「ＦＯＬＲ１－ＡＢＤ」と称されるヒトＦＯＬＲ１に結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１ ｈ７７－２）は、配列番号２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１は、図５のＢに示すように配列番号２１のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１ ｈ５９．３）は、配列番号２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１は、図５のＢに示すように配列番号２５のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１ ｈ２２－４）は、配列番号３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号３２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１は、図５のＢに示すように配列番号２９のアミノ酸配列を有する。
（ｅ）Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤ
図５のＥに示すように、本明細書において「αＴｒｏｐ２」、「ａＴｒｏｐ２」、「ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２」、「ｓｄＡＢＤ Ｔｒｏｐ２」、「Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡｂ」、「Ｔｒｏｐ２ＡＢＤ」または「Ｔｒｏｐ２－ＡＢＤ」と称されるヒトＴｒｏｐ２に結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＥに示すように、本明細書において「αＴｒｏｐ２」、「ａＴｒｏｐ２」、「ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２」、「ｓｄＡＢＤ Ｔｒｏｐ２」、「Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡｂ」、「Ｔｒｏｐ２ＡＢＤ」または「Ｔｒｏｐ２－ＡＢＤ」と称されるヒトＴｒｏｐ２に結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５５７）は、配列番号７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＥに示すように配列番号７７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５６５）は、配列番号８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＥに示すように配列番号８１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７５）は、配列番号８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＦに示すように配列番号８５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ５７８）は、配列番号９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号９２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＦに示すように配列番号８９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６０９）は、配列番号９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号９６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＦに示すように配列番号９３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２ ｈＶＩＢ６１９）は、配列番号９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１００のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＦに示すように配列番号９７のアミノ酸配列を有する。
（ｆ）ＣＡ９ ｓｄＡＢＤ
図５のＦ～Ｇに示すように、本明細書において「αＣＡ９」、「ａＣＡ９」、「ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９」、「ｓｄＡＢＤ ＣＡ９」、「ＣＡ９ ｓｄＡｂ」、「ＣＡ９ ＡＢＤ」または「ＣＡ９－ＡＢＤ」と称されるヒトＣＡ９に結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＦ～Ｇに示すように、本明細書において「αＣＡ９」、「ａＣＡ９」、「ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９」、「ｓｄＡＢＤ ＣＡ９」、「ＣＡ９ ｓｄＡｂ」、「ＣＡ９ ＡＢＤ」または「ＣＡ９－ＡＢＤ」と称されるヒトＣＡ９に結合する、特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９ ｈＶＩＢ４５６）は、配列番号１０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１０４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＦに示すように配列番号１０１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９ ｈＶＩＢ４７６）は、配列番号１０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１０８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＧに示すように配列番号１０５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９ ｈＶＩＢ４０７）は、配列番号１１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１１２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＧに示すように配列番号１０９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９ ｈＶＩＢ４４５）は、配列番号１１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１１６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、図５のＧに示すように配列番号１１３のアミノ酸配列を有する。
（ｇ）ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤ
図５のＧ～Ｈに示すように、本明細書において「αＬｙＰＤ３」、「ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３」、「ｓｄＡＢＤｓ ＬｙＰＤ３」、「ＬｙＰＤ３ ｓｄＡｂ」、「ＬｙＰＤ３ ＡＢＤ」、「ＬｙＰＤ３ＡＢＤ」または「ＬｙＰＤ３－ＡＢＤ」と称される、ヒトＬｙＰＤ３に結合する特に有用なｓｄＡＢＤが多数ある。
図５のＧ～Ｈに示すように、本明細書において「αＬｙＰＤ３」、「ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３」、「ｓｄＡＢＤｓ ＬｙＰＤ３」、「ＬｙＰＤ３ ｓｄＡｂ」、「ＬｙＰＤ３ ＡＢＤ」、「ＬｙＰＤ３ＡＢＤ」または「ＬｙＰＤ３－ＡＢＤ」と称される、ヒトＬｙＰＤ３に結合する特に有用なｓｄＡＢＤが多数ある。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３ ｈ７８７）は、配列番号１１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、図５のＧに示すように配列番号１１７のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３ ｈ７９０）は、配列番号１２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、図５のＧに示すように配列番号１２１のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３ Ｈ８０４）は、配列番号１２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、図５のＨに示すように配列番号１２５のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３ ｈ７７３）は、配列番号１３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、図５のＨに示すように配列番号１２９のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３ ｈ８４０）は、配列番号１３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、図５のＨに示すように配列番号１３３のアミノ酸配列を有する。
１つの有用な実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３ ｈ８８５）は、配列番号１３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、図５のＨに示すように配列番号１３７のアミノ酸配列を有する。
（ｈ）ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ
図５のＨ～Ｍに示すように、本明細書において「αＨＥＲ２」、「ａＨＥＲ２」、「ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２」、「ｓｄＡＢＤ ＨＥＲ２」、「ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ」、「ＨＥＲ２ ＡＢＤ」、「ＨＥＲ２ＡＢＤ」または「ＨＥＲ２－ＡＢＤ」と称される、ヒトＨＥＲ２に結合する特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
図５のＨ～Ｍに示すように、本明細書において「αＨＥＲ２」、「ａＨＥＲ２」、「ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２」、「ｓｄＡＢＤ ＨＥＲ２」、「ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ」、「ＨＥＲ２ ＡＢＤ」、「ＨＥＲ２ＡＢＤ」または「ＨＥＲ２－ＡＢＤ」と称される、ヒトＨＥＲ２に結合する特に有用なｓｄＡＢＤが多数存在する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０５４）は、配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＨに示すように配列番号１４１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０５５）は、配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＩに示すように配列番号１４５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０５８）は、配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５３のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＩに示すように配列番号１４９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０５９）は、配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＩに示すように配列番号１５３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０６５）は、配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＩに示すように配列番号１５７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０９０）は、配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＩに示すように配列番号１６１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１９１）は、配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＪに示すように配列番号１６５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０９２）は、配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＪに示すように配列番号１６９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １０９７）は、配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＪに示すように配列番号１７３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１１８）は、配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＪに示すように配列番号１７７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１２１）は、配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＪに示すように配列番号１８１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１３４）は、配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＫに示すように配列番号１８５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１３８）は、配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＫに示すように配列番号１８９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１３９）は、配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＫに示すように配列番号１９３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１４０）は、配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＫに示すように配列番号１９７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１４５）は、配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＫに示すように配列番号２０１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１４６）は、配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＬに示すように配列番号２０５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１４９）は、配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＬに示すように配列番号２０９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１５０）は、配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＬに示すように配列番号２１３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１５６）は、配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＬに示すように配列番号２１７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１５８）は、配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＬに示すように配列番号２２１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１５９）は、配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＭに示すように配列番号２２５のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１６０）は、配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＭに示すように配列番号２２９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１６１）は、配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＭに示すように配列番号２３３のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１６２）は、配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＭに示すように配列番号２３７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２ １１６３）は、配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図５のＭに示すように配列番号２４１のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ヒト化ａＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１３０）は、配列番号５００のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０２のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図７５に示すように配列番号４９９のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ヒト化ａＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１５６）は、配列番号５０４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０６のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図７５に示すように配列番号５０３のアミノ酸配列を有する。エピトープマッピングは、ヒト化ａＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１５６が、ＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸位置１４７～１４８でアミノ酸配列ＷＫ、アミノ酸位置１５７～１６１でアミノ酸配列ＬＡＬＴＬ（配列番号５１５）、及びアミノ酸位置１９４～１９８でアミノ酸配列ＴＲＴＶＣ（配列番号５１６）に結合することを明らかにした（図３６）。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ヒト化ａＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１５９）は、配列番号５０８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１０のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図７５に示すように配列番号５０７のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２（例えば、ヒト化ａＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１６２）は、配列番号５１２のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１４のｓｄＣＤＲ３を有する。場合によっては、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、図７５に示すように配列番号５１１のアミノ酸配列を有する。エピトープマッピングは、ヒト化ａＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１６２がＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸位置４６２～４７２でアミノ酸配列ＱＬＴＦＲＮＰＨＱＡＬＬに結合することを明らかにした（図３６）。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂前のタンパク質は約１００ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂後のタンパク質は約２５～約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を超えるサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織浸透を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織分布を有する。
Ｃ．半減期延長ドメイン
本発明のＭＣＥタンパク質（この場合もやはり、本明細書において、「ＣＯＢＲＡ（商標）」タンパク質または構築物とも称される）は、任意に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
本発明のＭＣＥタンパク質（この場合もやはり、本明細書において、「ＣＯＢＲＡ（商標）」タンパク質または構築物とも称される）は、任意に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子質量約６７ｋＤａ）は、約５０ｍｇ／ｍＬ（６００μＭ）で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約２０日間の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役割を果たす。
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命タンパク質の消失半減期を延長する。例えば、Ｆａｂ断片へのアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、Ｆａｂ断片単独の投与と比較して、マウス及びウサギのそれぞれに静脈内投与されたときに、２５～５８倍の低減されたｉｎ ｖｉｖｏクリアランス及び２６～３７倍の半減期延長をもたらした。別の例では、インスリンが脂肪酸でアシル化されてアルブミンとの会合を促進する場合、ウサギまたはブタに皮下注射されたときに持続的な効果が観察された。合わせて、これらの実験は、アルブミン結合と持続性作用との間のつながりを実証した。
多くの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＨＳＡに結合する単一ドメイン抗体からの単一ドメイン抗原結合ドメインである。このドメインは概して、これらの結合ドメインをＴＴＡに対するｓｄＡＢＤと区別するために、本明細書においてヒトＨＳＡに対する「ｓｄＡＢＤ」（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）、あるいは「ｓｄＡＢＤ（１／２）」と称される。特に有用なｓｄＡＢＤ（１／２）は、図６に示される。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ（例えば、ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ（１０ＧＥ））は、配列番号２４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４８のｓｄＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡは、配列番号２４５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ（例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを備えるｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）は、配列番号２５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２５２のｓｄＣＤＲ３を有する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡは、配列番号２４９のアミノ酸配列を有する。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、抗原結合タンパク質自体の改変した薬力学及び薬物動態を提供する。上記のとおり、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはまた、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透及び拡散の改変を含む、薬理学的特性を改変させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインなしのタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散及び増強した有効性を提供する。一実施形態では、治療法は、低減した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の低減などの副作用の低減をもたらす。
更に、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡ結合ドメインの特徴は、ＨＳＡに対するＨＳＡ結合ドメインの結合親和性を含む。前述のＨＳＡ結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特定の消失半減期を標的とするように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、高い結合親和性を有する。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。更に他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ～１００ｎＭ（中）、及び１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度を含む。上記のとおり、ＨＳＡへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
Ｄ．プロテアーゼ開裂部位
本発明のタンパク質組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
本発明のタンパク質組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
本明細書に記載するとおり、本発明のプロドラッグ構築物は、少なくとも１つのプロテアーゼによって開裂されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つのプロテアーゼ開裂部位を含む。場合によっては、本明細書に記載のＭＣＥタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０つまたはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。本明細書でより十分に考察されるように、２つ以上のプロテアーゼ開裂部位がプロドラッグ構築で使用される場合、それらは同じであっても（例えば、単一プロテアーゼによって開裂される複数の部位）、異なっていてもよい（２つ以上の開裂部位が少なくとも２つの異なるプロテアーゼによって開裂される）。当業者によって理解されるように、３つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する構築物は、１、２、３つなどを利用することができ、例えば、いくつかの構築物は、２つの異なるプロテアーゼに対して３つの部位などを利用することができる。
プロテアーゼ開裂部位のアミノ酸配列は、標的とするプロテアーゼによって決まる。当技術分野において周知のとおり、体内に存在し疾患状態に関係し得る多くのヒトプロテアーゼが存在する。
プロテアーゼは、一部の疾患細胞及び疾患組織、例えば、プロテアーゼが豊富な微小環境、すなわちプロテアーゼリッチ微小環境を生成する腫瘍細胞またはがん細胞によって分泌されていることが知られている。場合によっては、対象の血液は、プロテアーゼが豊富である。場合によっては、腫瘍を取り囲む細胞が、腫瘍微小環境へとプロテアーゼを分泌している。プロテアーゼを分泌する、腫瘍を取り囲む細胞としては、腫瘍性の間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、肥満細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔリンパ球、樹状細胞、間葉系幹細胞、多形核細胞及び他の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、プロテアーゼは対象の血液中に存在しており、例えば、アミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは細菌ペプチド内に存在している。標的細胞または標的組織のプロテアーゼリッチ微小環境を除き、抗原結合タンパク質がＴ細胞に結合しないことから、この特性により、抗原結合タンパク質などの標的化治療薬に追加の特異性を持たせることが可能となる。
プロテアーゼは、場合によっては、配列特異的な様式で、タンパク質を開裂するタンパク質である。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ）、カリクレイン、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ＫＬＫ７、グランザイムＢ、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、ＸＡ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ３）、Ｍｉｒ１－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、メプリン、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン－１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－α）、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの好適なプロテアーゼ及びプロテアーゼ開裂配列については、図８のＡ～Ｄに示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つは、配列番号３３９～４０８及び配列番号５３２～５３５のいずれか１つに示されるプロテアーゼ開裂ドメイン配列を含む開裂性リンカーを含む。
Ｅ．リンカー
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは、同様に柔軟性または非柔軟性（例えば、立体障害）を含む機能性、ならびにｉｎ ｓｉｔｕ原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは、同様に柔軟性または非柔軟性（例えば、立体障害）を含む機能性、ならびにｉｎ ｓｉｔｕ原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
本発明は、２つ以上のドメインを結合するために使用される「ドメインリンカー」を提供する（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨまたはＶＬに対する標的腫瘍抗原結合ドメイン（ＴＴＡＢＤ、本明細書において「αＴＴＡ」（「抗ＴＴＡ」に対して）と称されるときもある）、別の構成成分に対する半減期延長ドメインなど）。ドメインリンカーは、例えば、非開裂性（ＮＣＬ）、開裂性（「ＣＬ」）、制約性かつ開裂性（ＣＣＬ）、及び制約性かつ非開裂性（ＣＮＣＬ）であり得る。
１．非開裂性リンカー
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは非開裂性である。概して、これらは、構築物のリンカーの構成成分「上流」及び「下流」が特定の方法で分子内で自己集合することを可能にする非開裂性かつ柔軟性、またはリンカーによって分離された２つの構成成分が分子内で自己集合することができない非開裂性かつ制約性の２つのタイプのうちの１つであり得る。しかしながら、後者の場合、非開裂性制約性リンカーによって分離された２つの構成成分ドメインが分子内で自己集合しない一方で、他の分子内構成成分が自己集合して、疑似Ｆｖドメインを形成することに留意されたい。
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは非開裂性である。概して、これらは、構築物のリンカーの構成成分「上流」及び「下流」が特定の方法で分子内で自己集合することを可能にする非開裂性かつ柔軟性、またはリンカーによって分離された２つの構成成分が分子内で自己集合することができない非開裂性かつ制約性の２つのタイプのうちの１つであり得る。しかしながら、後者の場合、非開裂性制約性リンカーによって分離された２つの構成成分ドメインが分子内で自己集合しない一方で、他の分子内構成成分が自己集合して、疑似Ｆｖドメインを形成することに留意されたい。
（ａ）非開裂性であるが柔軟性のリンカー
この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインにより、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチド中のドメインに連結するのに好適な内部の非開裂性リンカーの例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ［配列番号５１８］、（ＧＧＳＧ）ｎ［配列番号５１９］、（ＧＧＳＧＧ）ｎ［配列番号５２０］、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ［配列番号５２１］が挙げられ、これらに限定されないが、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、約１５アミノ酸であり得る。
この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインにより、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチド中のドメインに連結するのに好適な内部の非開裂性リンカーの例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ［配列番号５１８］、（ＧＧＳＧ）ｎ［配列番号５１９］、（ＧＧＳＧＧ）ｎ［配列番号５２０］、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ［配列番号５２１］が挙げられ、これらに限定されないが、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、約１５アミノ酸であり得る。
（ｂ）非開裂性かつ制約性リンカー
場合によっては、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎる、「制約性非開裂性リンカー」または「ＣＮＣＬ」である。例えば、Ｐｒｏ１８６において、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＶＨ及びＶＬが活性抗原結合ドメインに自己集合することを可能にしない８アミノ酸（「８－ｍｅｒ」または「８ｍｅｒ」）によって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２）である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
場合によっては、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎる、「制約性非開裂性リンカー」または「ＣＮＣＬ」である。例えば、Ｐｒｏ１８６において、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＶＨ及びＶＬが活性抗原結合ドメインに自己集合することを可能にしない８アミノ酸（「８－ｍｅｒ」または「８ｍｅｒ」）によって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２）である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
２．開裂性リンカー
本明細書のプロドラッグ構築物のすべては、少なくとも１つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性（ＣＬ）であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」（「ＰＣＤ」）と称されるときもある。この実施形態では、ＣＬは、本明細書で概説されるように、かつ図８のＡ～Ｄに示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、ＣＬは、プロテアーゼ開裂部位のみを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、ＣＬのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に更に数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に１、２、３、４または５つのアミノ酸が存在し得る。したがって、開裂性リンカーはまた、制約されているか（例えば、８ｍｅｒ）または柔軟性である。
本明細書のプロドラッグ構築物のすべては、少なくとも１つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性（ＣＬ）であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」（「ＰＣＤ」）と称されるときもある。この実施形態では、ＣＬは、本明細書で概説されるように、かつ図８のＡ～Ｄに示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、ＣＬは、プロテアーゼ開裂部位のみを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、ＣＬのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に更に数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に１、２、３、４または５つのアミノ酸が存在し得る。したがって、開裂性リンカーはまた、制約されているか（例えば、８ｍｅｒ）または柔軟性である。
本発明で特に興味深いのは、ＭＭＰ９開裂性リンカー及びメプリン開裂性リンカー、特にＭＭＰ９制約性開裂性リンカー及びメプリン制約性開裂性リンカーである。
ＩＩ．本発明のドメイン
本発明は、本発明のプロドラッグポリペプチドに対する多くの異なる形式を提供する。本発明は、制約性Ｆｖドメイン及び制約性疑似Ｆｖドメインを提供する。加えて、本発明は、２つのＦｖドメインを含有するが、非異性化構築物である、多価の条件的に有効な（「ＭＣＥ」）タンパク質を提供する。本明細書で概説されるように、これらは、非異性化開裂性形式または非異性化非開裂性形式であり得るが、すべての構築物が、少なくとも１つのプロテアーゼ開裂ドメインを含有する。
本発明は、本発明のプロドラッグポリペプチドに対する多くの異なる形式を提供する。本発明は、制約性Ｆｖドメイン及び制約性疑似Ｆｖドメインを提供する。加えて、本発明は、２つのＦｖドメインを含有するが、非異性化構築物である、多価の条件的に有効な（「ＭＣＥ」）タンパク質を提供する。本明細書で概説されるように、これらは、非異性化開裂性形式または非異性化非開裂性形式であり得るが、すべての構築物が、少なくとも１つのプロテアーゼ開裂ドメインを含有する。
重要なことに、これらのドメイン（Ｆｖドメイン及び疑似Ｆｖドメイン）の両方が、本明細書において「制約された」と称され、上記で考察されるように、かつ図１～５に示されるように、これらのうちの１つのみが制約される必要があることを意味するが、概して、両方のリンカーが制約されているときに、タンパク質は、より良好な発現を有する。
当業者は、形式１、２及び４に関して、本発明の制約性及び疑似ＦｖドメインのＮ末端からＣ末端への順序（リンカーは示さず）に対して４つの可能性、ａＶＨ－ａＶＬ及びｉＶＬ－ｉＶＨ、ａＶＨ－ａＶＬ及びｉＶＨ－ｉＶＬ、ａＶＬ－ａＶＨ及びｉＶＬ－ｉＶＨ、ａＶＬ－ａＶＨ及びｉＶＨ－ｉＶＬがあることを理解するであろう。４つすべてが試験され、４つすべてが活性を有するが、第１の順序、ａＶＨ－ａＶＬ及びｉＶＬ－ｉＶＨは、他の３つよりも良好な発現を示す。したがって、本明細書の説明は概して、このａＶＨ－ａＶＬ及びｉＶＬ－ｉＶＨ形式で示されるが、本明細書のすべての開示は、これらのドメインの他の順序も含む。
概して、本発明の完全長構築物のＮ末端からＣ末端への順序が、ａＶＨ－ａＶＬ及びｉＶＬ－ｉＶＨ配向に基づくことに留意されたい。
加えて、特定のＡＢＤのＣ末端配列に由来するヒトにおける免疫原性が存在し得ることが、当技術分野において既知である。したがって、一般に、特に構築物のＣ末端がｓｄＡＢＤ（例えば、構築物のうちの多くのｓｄＡＢＤ－ＨＳＡドメイン）で終端するとき、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６またはＨｉｓ１０のいずれか）が使用され得る。本明細書の配列のうちの多くまたはほとんどを、精製の理由でＨｉｓ６ Ｃ末端タグを使用して生成したが、これらの配列はまた、Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＤＯＩ１０．１００７／ｓ１０８７５－０１３－９９１５－０及び国際公開第ＷＯ２０１３／０２４０５９号によって示されるように、ヒトにおける免疫原性を低減するためにも使用され得る。
Ａ．制約性Ｆｖドメイン
本発明は、制約性リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性（形式１及び３）または非開裂性（形式２及び４）であり得る）を使用して共有結合された活性ＶＨ及び活性ＶＬドメインを含む、制約性Ｆｖドメインを提供する。制約性リンカーは、開裂の非存在下でＶＨとＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、制約性Ｆｖドメインは概して、可変ドメイン内に含有された６つのＣＤＲのセットを含み、ＶＨのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合し、ＶＬのｖｌＣＤＲ１、ｖＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合するが、プロドラッグ形式（例えば、非開裂）では、ＶＨ及びＶＬは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができず、むしろ疑似Ｆｖと分子内で対になることを好む。
本発明は、制約性リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性（形式１及び３）または非開裂性（形式２及び４）であり得る）を使用して共有結合された活性ＶＨ及び活性ＶＬドメインを含む、制約性Ｆｖドメインを提供する。制約性リンカーは、開裂の非存在下でＶＨとＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、制約性Ｆｖドメインは概して、可変ドメイン内に含有された６つのＣＤＲのセットを含み、ＶＨのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合し、ＶＬのｖｌＣＤＲ１、ｖＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３は、ヒトＣＤ３に結合するが、プロドラッグ形式（例えば、非開裂）では、ＶＨ及びＶＬは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができず、むしろ疑似Ｆｖと分子内で対になることを好む。
制約性Ｆｖドメインは、本明細書に記載されるように、活性ＶＨ及び活性ＶＬ（ａＶＨ及びａＶＬ）もしくは不活性ＶＨ及びＶＬ（ｉＶＨ及びｉＶＬ、この場合、それは制約性疑似Ｆｖドメインである）、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
当業者によって理解されるように、制約性Ｆｖドメイン中のＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
本明細書で概説されるように、形式１構築物に関して、制約性Ｆｖドメインは、図１に示されるものなどの場合、開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬを含むことができる。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＣＬ－ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。一般に、制約性Ｆｖドメインは、活性ＶＨ及びＶＬドメイン（例えば、会合したときにＣＤ３に結合することが可能）を含有し、したがって構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１－ａｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ａｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ａｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＣＬ－ｖｌＦＲ１－ａｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ａｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ａｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。
本明細書で概説されるように、形式２構築物に関して、制約性Ｆｖドメインは、非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬを含むことができる。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＮＣＬ－ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。一般に、制約性Ｆｖドメインは、活性ＶＨ及びＶＬドメイン（例えば、会合したときにＣＤ３に結合することが可能）を含有し、したがって構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１－ａｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ａｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ａｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＮＣＬ－ｖｌＦＲ１－ａｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ａｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ａｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。
配列番号２７０を有するＶＨ、配列番号２５４を有するＶＬ及び配列番号２８７を有するドメインリンカーを有する制約性非開裂性Ｆｖドメインが、本発明で特に使用される。
Ｂ．制約性疑似Ｆｖドメイン
本発明は、制約性リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る）を使用して共有結合された不活性または疑似ｉＶＨ及びｉＶＬドメインを含む、制約性疑似Ｆｖドメインを提供する。制約性リンカーは、開裂の非存在下でｉＶＨとｉＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、制約性疑似Ｆｖドメインは概して、ｉＶＨ及びｉＶＬの会合（非制約形式であるとき）を可能にするフレームワーク領域を有するｉＶＨ及びｉＶＬを含むが、得られる疑似Ｆｖドメインは、ヒトタンパク質に結合しない。ｉＶＨドメインは、ａＶＬドメインと集合することができ、ｉＶＬドメインは、ａＶＨドメインと集合することができるが、得られる構造はＣＤ３に結合しない。
本発明は、制約性リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る）を使用して共有結合された不活性または疑似ｉＶＨ及びｉＶＬドメインを含む、制約性疑似Ｆｖドメインを提供する。制約性リンカーは、開裂の非存在下でｉＶＨとｉＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、制約性疑似Ｆｖドメインは概して、ｉＶＨ及びｉＶＬの会合（非制約形式であるとき）を可能にするフレームワーク領域を有するｉＶＨ及びｉＶＬを含むが、得られる疑似Ｆｖドメインは、ヒトタンパク質に結合しない。ｉＶＨドメインは、ａＶＬドメインと集合することができ、ｉＶＬドメインは、ａＶＨドメインと集合することができるが、得られる構造はＣＤ３に結合しない。
制約性疑似Ｆｖドメインは、不活性ＶＨ及びＶＬ（ｉＶＨ及びｉＶＬ）を含む。
当業者によって理解されるように、制約性疑似Ｆｖドメイン中のＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
本明細書で概説されるように、制約性疑似Ｆｖドメインは、形式１、２及び４に示されるような非開裂性リンカーを使用して、または形式３に示されるような開裂性リンカーを用いて連結されたｉＶＨ及びｉＶＬを含むことができる。
一般に、制約性Ｆｖドメインは、非活性ＶＨ及びＶＬドメインを含有し（例えば、会合したときにＣＤ３に結合することが可能）、したがって、構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１－ｉｖｌＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｉｖｌＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｉｖｌＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４－ＣＮＣＬ－ｖｌＦＲ１－ｉｖｈＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｉｖｈＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｉｖｈＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を有する。
本発明で特に使用されるのは、（ｉ）配列番号２７４（αＣＤ３ ＶＨｉ）、配列番号２７８（αＣＤ３ ＶＨｉ２）または配列番号２８２（αＣＤ３ ＶＨｉＧＬ４）を有するｉＶＨ、（ｉｉ）配列番号２５８（αＣＤ３ ＶＬｉ）、配列番号２６２（αＣＤ３ ＶＬｉ２）または配列番号２６６（αＣＤ３ ＶＬｉＧＬ）を有するｉＶＬ、及び（ｉｉｉ）配列番号２８７を有するドメインリンカーを有する制約性非開裂性疑似Ｆｖドメインが、本発明で特に使用される。いくつかの実施形態では、制約性非開裂性疑似Ｆｖドメインは、（ｉ）配列番号２７４のアミノ酸配列を有するｉＶＨ（αＣＤ３ ＶＨｉ）、（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を有するｉＶＬ（αＣＤ３ ＶＬｉ）及び（ｉｉｉ）配列番号２８７のアミノ酸配列を有するドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、制約性非開裂性疑似Ｆｖドメインは、（ｉ）配列番号２７８のアミノ酸配列を有するｉＶＨ（αＣＤ３ ＶＨｉ２）、（ｉｉ）配列番号２６２のアミノ酸配列を有するｉＶＬ（αＣＤ３ ＶＬｉ２）及び（ｉｉｉ）配列番号２８７のアミノ酸配列を有するドメインリンカーを含む。いくつかの実施形態では、制約性非開裂性疑似Ｆｖドメインは、（ｉ）配列番号２８２のアミノ酸配列を有するｉＶＨ（αＣＤ３ ＶＨｉ２ＧＬ４）、（ｉｉ）配列番号２６６のアミノ酸配列を有するｉＶＬ（αＣＤ３ ＶＬｉ２ＧＬ）及び（ｉｉｉ）配列番号２８７のアミノ酸配列を有するドメインリンカーを含む。
ＩＩＩ．本発明の形式
本明細書で考察されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、二重ＴＴＡ結合ドメインを有する開裂性形式、二重ＴＴＡ結合ドメインを有する非開裂性形式（そのうちのいずれかが同じＴＴＡ結合ドメインまたは異なる結合ドメインを有することができる）、及び単一標的化ドメインを有する非開裂性形式を含む、多くの異なる形式をとることができる。
本明細書で考察されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、二重ＴＴＡ結合ドメインを有する開裂性形式、二重ＴＴＡ結合ドメインを有する非開裂性形式（そのうちのいずれかが同じＴＴＡ結合ドメインまたは異なる結合ドメインを有することができる）、及び単一標的化ドメインを有する非開裂性形式を含む、多くの異なる形式をとることができる。
Ａ．「形式２」構築物
図２に示されるように、本発明は、非異性化非開裂性形式を提供する。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が制約性Ｆｖドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、制約性非開裂性リンカーを使用して連結されるＶＨ及びＶＬドメインを含み、制約性疑似Ｆｖドメインは制約性非開裂性リンカーを使用する。
図２に示されるように、本発明は、非異性化非開裂性形式を提供する。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が制約性Ｆｖドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、制約性非開裂性リンカーを使用して連結されるＶＨ及びＶＬドメインを含み、制約性疑似Ｆｖドメインは制約性非開裂性リンカーを使用する。
当業者によって理解されるように、制約性Ｆｖドメインまたは制約性疑似ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－制約性Ｆｖドメイン－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－開裂性リンカー－制約性疑似Ｆｖドメイン－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む、プロドラッグタンパク質を提供する。
当業者によって理解されるように、制約性Ｆｖドメインまたは制約性疑似ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＨ－ＣＮＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＬ－ＣＮＣＬ－ａＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＬ－ＣＮＣＬ－ａＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＨ－ＣＮＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロドラッグタンパク質は、例示的なタンパク質Ｐｒｏ２２５、Ｐｒｏ２２６、Ｐｒｏ２３３、Ｐｒｏ３１１、Ｐｒｏ３１２、Ｐｒｏ３１３、Ｐｒｏ２４６、Ｐｒｏ２５６、Ｐｒｏ４２０、Ｐｒｏ４２１、Ｐｒｏ３９３、Ｐｒｏ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４２９、Ｐｒｏ４３０、Ｐｒｏ４３１、Ｐｒｏ２５８、Ｐｒｏ２２１、Ｐｒｏ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｐｒｏ２２４、Ｐｒｏ２５４、Ｐｒｏ２５５、Ｐｒｏ２６２、Ｐｒｏ３５６、Ｐｒｏ３５９、Ｐｒｏ３６４、Ｐｒｏ３８８、Ｐｒｏ４２９、Ｐｒｏ４３０、Ｐｒｏ４３１、Ｐｒｏ４３２、Ｐｒｏ４４８、Ｐｒｏ４４９、Ｐｒｏ４５０、Ｐｒｏ４５１、Ｐｒｏ４７９、Ｐｒｏ４８０及びＰｒｏ４９５を表す、図９のＣ～Ｖを含む図ならびに配列番号４１３～４５２として示される対応する配列で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロドラッグタンパク質は、（ｉ）例示的なタンパク質Ｐｒｏ６０１、Ｐｒｏ６０２、Ｖ３、Ｖ４、Ｐｒｏ６６４、Ｐｒｏ６６５、Ｐｒｏ６６７、Ｐｒｏ６９４、Ｐｒｏ６９５、Ｐｒｏ５６５、Ｐｒｏ５６６、Ｐｒｏ５６７、Ｐｒｏ７２７、Ｐｒｏ７２８、Ｐｒｏ７２９、Ｐｒｏ７３０、Ｐｒｏ７３１、Ｐｒｏ６７６、Ｐｒｏ６７７、Ｐｒｏ６７８、Ｐｒｏ６７９、Ｐｒｏ８０８、Ｐｒｏ８１９、Ｐｒｏ６２１、Ｐｒｏ６２２、Ｐｒｏ６４０、Ｐｒｏ６４１、Ｐｒｏ６４２、Ｐｒｏ６４３、Ｐｒｏ７４４、Ｐｒｏ７４６、Ｐｒｏ１０８、Ｐｒｏ１０９、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４７６、Ｐｒｏ７０６、Ｐｒｏ７０９、Ｐｒｏ４７０、Ｐｒｏ４７１、Ｐｒｏ５５１、Ｐｒｏ５５２、Ｐｒｏ６２３、Ｐｒｏ６２４、Ｐｒｏ６９８、Ｐｒｏ６５５、Ｐｒｏ６５６、Ｐｒｏ６５７、Ｐｒｏ６５８、Ｐｒｏ５１６、Ｐｒｏ５１７、Ｐｒｏ５１８、Ｐｒｏ５１９、Ｐｒｏ５１３、Ｐｒｏ１８６、Ｐｒｏ２２５及びＰｒｏ８１７を表す、図１０のＡ～ＥＥならびに配列番号２８８～２９０、２９１～３０２、３０４～３３４、３３６、３３８及び５２２～５３０として示される対応する配列、（ｉｉ）例示的なタンパク質ａＬｙＰＤ３ ｈ７８７ ＣＯＢＲＡ、ａＬｙＰＤ３ ｈ７９０ ＣＯＢＲＡ、ａＬｙＰＤ３ ｈ８０４ ＣＯＢＲＡ、ａＬｙＰＤ３ ｈ７７３ ＣＯＢＲＡ、ａＬｙＰＤ３ ｈ８４０ ＣＯＢＲＡ、ａＬｙＰＤ３ ｈ８８５ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０５４ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０５５ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０５８ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０５ １０９０ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０９１ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０９２ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １０９７ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１１８ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１２１ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１３４ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１３８ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１３９ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１４０ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１４５ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１５０ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１５６ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１５８ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１５９ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１６０ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１６１ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１６２ ＣＯＢＲＡ、ａＨＥＲ２ １１６３ ＣＯＢＲＡ、Ｐｒｏ８２４及びＰｒｏ８２６を表す、図１２のＡ～Ｑならびに配列番号４５３～４８６として示される対応する配列、（ｉｉｉ）例示的なタンパク質Ｐｒｏ７５１、Ｐｒｏ７５２、Ｐｒｏ８２４、Ｐｒｏ８２６、Ｐｒｏ１１０９、Ｐｒｏ１１１１、Ｐｒｏ１１１７及びＰｒｏ１１１８を表す、図７１～７４ならびに対応する配列番号４８７～４９４として示される配列を含む図で提供される。
１．単一標的化形式２構築物「単一特異性ＣＯＢＲＡ」
いくつかの実施形態では、αＴＴＡドメインの両方は同じ腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、Ｂ７Ｈ３、ＬｙＰＤ３またはＨＥＲ２であり得る同じＴＴＡに結合し、その配列は図５のＡ～Ｍに示される。
いくつかの実施形態では、αＴＴＡドメインの両方は同じ腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、Ｂ７Ｈ３、ＬｙＰＤ３またはＨＥＲ２であり得る同じＴＴＡに結合し、その配列は図５のＡ～Ｍに示される。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１及びｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、同じ標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１及びｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、同じ標的抗原に結合するが、異なる位置で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１及びｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、同じ標的抗原に同じ位置で結合する。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１及びｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、同じアミノ酸配列を有する。本明細書に記載されるｓｄＡＢＤの任意の配列は、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２または両方の配列であり得る。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１のｓｄＣＤＲ１、ｓｄＣＤＲ２及びｓｄＣＤＲ３は、それぞれｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２のｓｄＣＤＲ１、ｓｄＣＤＲ２及びｓｄＣＤＲ３と同じである。
いくつかの実施形態では、例示的な単一特異性ＣＯＢＲＡ（単一腫瘍抗原標的化ＣＯＢＲＡとも称される）は、Ｂ７Ｈ３、ＣＡ９、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、ＬｙＰＤ３及びＴｒｏｐ２からなる群から選択される腫瘍標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、単一特異性ＣＯＢＲＡは、図及び正式な配列表を含む、本明細書に提供されるｓｄＡＢＤの配列のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ７Ｈ３（例えば、ヒトＢ７Ｈ３）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、Ｐｒｏ２２５（配列番号４１３）及びＰｒｏ２２６（配列番号４１４）などの図９のＣ；Ｐｒｏ６０１（配列番号５２２）、Ｐｒｏ６０２（配列番号５２３）、Ｖ３（配列番号５２４）、Ｖ４（配列番号５２５）、Ｐｒｏ６６４（配列番号５２６）、Ｐｒｏ６６５（配列番号５２７）、Ｐｒｏ６６７（配列番号５２８）、Ｐｒｏ６９４（配列番号５２９）及びＰｒｏ６９５（配列番号５３０）などの図１０のＡ～Ｅ；Ｐｒｏ６４０（配列番号３０６）、Ｐｒｏ６４１（配列番号３０７）、Ｐｒｏ６４２（配列番号３０８）、Ｐｒｏ６４３（配列番号３０９）、Ｐｒｏ７７４（配列番号３１０）及びＰｒｏ７４６（配列番号３１１）などの図１０のＯ～Ｑ；Ｐｒｏ２２５（配列番号３３６）及びＰｒｏ８１７（配列番号３３８）などの図１０のＤＤ～ＥＥの融合タンパク質のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡ９（例えば、ヒトＣＡ９）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、Ｐｒｏ５１６（配列番号３２９）、Ｐｒｏ５１７（配列番号３３０）、Ｐｒｏ５１８（配列番号３３１）及びＰｒｏ５１９（配列番号３３２）などの図１０のＺ～ＢＢの融合タンパク質のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ（例えば、ヒトＥＧＦＲ）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、Ｐｒｏ３９６（配列番号３１４）、Ｐｒｏ４７６（配列番号３１５）、Ｐｒｏ７０６（配列番号３１６）及びＰｒｏ７０９（配列番号３１７）などの図１０のＳ～Ｔの融合タンパク質のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ（例えば、ヒトＥｐＣＡＭ）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、Ｐｒｏ５６５（配列番号２８８）、Ｐｒｏ５６６（配列番号２８９）、Ｐｒｏ５６７（配列番号２９０）、Ｐｒｏ７２７（配列番号２９２）、Ｐｒｏ７２８（配列番号２９３）、Ｐｒｏ７２９（配列番号２９４）、Ｐｒｏ７３０（配列番号２９５）及びＰｒｏ７３１（配列番号２９６）などの図１０のＦ～Ｊの融合タンパク質のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、ＦＯＬＲ１（例えば、ヒトＦＯＬＲ１）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、Ｐｒｏ３１１（配列番号４１６）、Ｐｒｏ３１２（配列番号４１７）及びＰｒｏ３１３（配列番号４１８）などの図９のＤならびにＥの融合タンパク質のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２（例えば、ヒトＨＥＲ２）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、配列番号４５９～４８４のいずれか１つなどの図１２のＤ～Ｐ、ならびにＰｒｏ１１０９（配列番号４９１）、Ｐｒｏ１１１１（配列番号４９２）、Ｐｒｏ１１１７（配列番号４９３）及びＰｒｏ１１１８（配列番号４９４）などの図７３及び図７４の融合タンパク質のいずれかを含む
いくつかの実施形態では、ＬｙＰＤ３（例えば、ヒトＬｙＰＤ３）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、配列番号４５３～４５８のいずれかなどの図１２のＡ～Ｃの融合タンパク質のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、Ｔｒｏｐ２（例えば、ヒトＴｒｏｐ２）に結合する単一特異性ＣＯＢＲＡは、Ｐｒｏ６７６（配列番号２９７）、Ｐｒｏ６７７（配列番号２９８）、Ｐｒｏ６７８（配列番号２９９）、Ｐｒｏ６７９（配列番号３００）、Ｐｒｏ８０８（配列番号３０１）及びＰｒｏ８１９（配列番号３０２）などの図１０のＪ～Ｍの融合タンパク質のいずれかを含む。
２．二重標的化形式２構築物「ヘテロＣＯＢＲＡ」
いくつかの実施形態では、αＴＴＡドメインのそれぞれは異なる腫瘍標的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは異なるＴＴＡに結合する。
いくつかの実施形態では、αＴＴＡドメインのそれぞれは異なる腫瘍標的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは異なるＴＴＡに結合する。
形式２では、好ましい二重腫瘍抗原標的化構築物（本明細書では「ヘテロ特異性ＣＯＢＲＡ」または「ヘテロＣＯＢＲＡ」と呼ばれることもある）は、ＥＧＦＲとＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲとＴｒｏｐ２、ＥＧＦＲとＦＯＬＲ１、ＥＧＦＲとＢ７Ｈ３、ＥＧＦＲとＬｙＰＤ３、ＥＧＦＲとＨＥＲ２、ＥｐＣＡＭとＦＯＬＲ１、ＥｐＣＡＭとＢ７Ｈ３、ＥｐＣＡＭとＴｒｏｐ２、ＥｐＣＡＭとＬｙＰＤ３、ＥｐＣＡＭとＨＥＲ２、ＦＯＬＲ１とＢ７Ｈ３、ＦＯＬＲ１とＨＥＲ２、ＦＯＬＲ１とＴｒｏｐ２、ＦＯＬＲ１とＬｙＰＤ３、Ｂ７Ｈ３とＨＥＲ２、Ｂ７Ｈ３とＴｒｏｐ２、Ｂ７Ｈ３とＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２とＴｒｏｐ２、ＨＥＲ２とＬｙＰＤ３及びＴｒｏｐ２とＬｙＰＤ３を標的とする組み合わせを含む。これらは、本明細書において「ＥＧＦＲ Ｘ ＥｐＣＡＭ」などの構築物として論じられることがある。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１及びｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、異なる標的抗原に結合する。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３であり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－ＣＡ９であり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲであり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭであり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１であり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２であり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３であり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１はｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２であり、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及びｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３からなる群から選択される。ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２の配列などの本明細書に記載のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡの任意の配列は、二重標的化形式２構築物またはヘテロＣＯＢＲＡで使用できる。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－ＣＡ９である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭである。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１は、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及びｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３からなる群から選択され、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２はｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２である。ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２の配列などの本明細書に記載のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡの任意の配列は、二重標的化形式２構築物またはヘテロＣＯＢＲＡで使用できる。
ａ．ＥＧＦＲ×ＥｐＣＡＭ
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｄ及びＥならびに図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｄ及びＥならびに図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｂ．ＥＧＦＲ×ＦＯＬＲ１
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｂの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡｂとＦＯＬＲ１ ｓｄＡｂのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｂの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡｂとＦＯＬＲ１ ｓｄＡｂのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｃ．ＥＧＦＲ×Ｂ７Ｈ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｄの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｄの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｄ．ＥＧＦＲ×Ｔｒｏｐ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７に示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及び Ｔｒｏｐ２，に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｅ及びＦの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７に示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及び Ｔｒｏｐ２，に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｅ及びＦの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｅ．ＥＧＦＲ×ＬｙＰＤ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｆ．ＥＧＦＲ×ＨＥＲ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤとＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはそれのＣ末端にあることを意味する。
ｇ．ＥｐＣＡＭ×ＦＯＬＲ１
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｄ、Ｅ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｄ、Ｅ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｈ．ＥｐＣＡＭ×Ｂ７Ｈ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｅ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｅ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｉ．ＥｐＣＡＭ×Ｔｒｏｐ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＤ、Ｅ、Ｆ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤの好ましい組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＤ、Ｅ、Ｆ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤの好ましい組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｊ．ＥｐＣＡＭ×ＬｙＰＤ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＤ、Ｅ、Ｈ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤとＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＤ、Ｅ、Ｈ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤとＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはそれのＣ末端にあることを意味する。
ｋ．ＥｐＣＡＭ×ＨＥＲ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＤ、Ｅ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤとＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＤ、Ｅ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤとＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「ＥＯ」とは、ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはそれのＣ末端にあることを意味する「どちらの向きでも」である。
ｌ．ＦＯＬＲ１×Ｂ７Ｈ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｄの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｄの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはそれのＣ末端にあることを意味する。
ｍ．ＦＯＬＲ１×ＨＥＲ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＨＥＲ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＨＥＲ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｎ．ＦＯＬＲ１×Ｔｒｏｐ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｅ及びＦの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤの好ましい組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｅ及びＦの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤの好ましい組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｏ．ＦＯＬＲ１×ＬｙＰＤ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＦＯＬＲ１及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ、Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＦＯＬＲ１ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、または ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｐ．Ｂ７Ｈ３×ＨＥＲ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＢ７Ｈ３及びＨＥＲ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＣ、Ｄ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＢ７Ｈ３及びＨＥＲ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＣ、Ｄ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｑ．Ｂ７Ｈ３×Ｔｒｏｐ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＢ７Ｈ３及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｆの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＢ７Ｈ３及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｆの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｒ．Ｂ７Ｈ３×ＬｙＰＤ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＢ７Ｈ３及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｄ、Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＢ７Ｈ３及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＢ～Ｄ、Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｂ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、または ＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｓ．ＨＥＲ２×Ｔｒｏｐ２
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＨＥＲ２及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＥ、Ｆ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＨＥＲ２及びＴｒｏｐ２に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＥ、Ｆ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤとＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
ｔ．ＨＥＲ２×ＬｙＰＤ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＨＥＲ２及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＧ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＨＥＲ２及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＧ、Ｈ～Ｍ及び図７５の配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはそれのＣ末端にあることを意味する。
ｕ．Ｔｒｏｐ２×ＬｙＰＤ３
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＴｒｏｐ２及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＥ～Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインはＴｒｏｐ２及びＬｙＰＤ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＥ～Ｇ及びＨの配列、ならびにそこに提供される配列及び対応する配列表を有する。この実施形態では、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤとＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのいくつかの組み合わせには以下が含まれる。
この場合、「どちらの向きでも」とは、Ｔｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤが本発明の構築物においてＬｙＰＤ３ ｓｄＡＢＤのＮ末端にあるか、またはＴｒｏｐ２ ｓｄＡＢＤがそれのＣ末端にあることを意味する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。いくつかの実施形態では、２つの標的化メインは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、ＣＡ９、Ｔｒｏｐ２、ＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２またはＥｐＣＡＭであり得る同じＴＴＡに結合し、その配列は図５のＡ～Ｍ及び図７５に示され、ＣＣＬ及びＣＬは、ＭＭＰ９またはメプリンによって開裂されるリンカーから選択され、ｓｄＡＢＤ（１／２）は配列番号２４９を有する。
形式２において、好ましいドメインリンカーは、配列番号２８７である（これはまた、好ましい制約性非開裂性リンカーとしても機能する）。
Ｂ．二重標的化を有する開裂性形式
本発明は、図１の「形式１」型の非異性化開裂性形式を提供する。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、制約性開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、制約性疑似Ｆｖドメインは制約性非開裂性リンカーを使用する。考察を容易にするために、これらのうちの両方が本明細書において「制約された」と称されるが、上記で考察されるように、かつ国際公開第ＷＯ２０１９／０５１１０２号の図３７、図３８及び図３９に示されるように、これらのうちの１つのみが制約される必要があるが、概して、両方のリンカーが制約されているときに、タンパク質はより良好な発現を有する。
本発明は、図１の「形式１」型の非異性化開裂性形式を提供する。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、制約性開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、制約性疑似Ｆｖドメインは制約性非開裂性リンカーを使用する。考察を容易にするために、これらのうちの両方が本明細書において「制約された」と称されるが、上記で考察されるように、かつ国際公開第ＷＯ２０１９／０５１１０２号の図３７、図３８及び図３９に示されるように、これらのうちの１つのみが制約される必要があるが、概して、両方のリンカーが制約されているときに、タンパク質はより良好な発現を有する。
形式１（ならびに他の形式）のすべての構築物はまた、ヒト腫瘍プロテアーゼによって開裂される開裂性リンカー（ＣＬ）を有する。
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－制約性Ｆｖドメイン－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－制約性疑似Ｆｖドメイン－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む、プロドラッグタンパク質を提供する。
当業者によって理解されるように、制約性Ｆｖドメインまたは制約性疑似ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＨ－ＣＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＬ－ＣＣＬ－ａＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＬ－ＣＣＬ－ａＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＨ－ＣＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ＮＣＬ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ及びｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、ＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２またはＢ７Ｈ３であり得る同じＴＴＡに結合し、その配列は図５のＡ～Ｍ及び図７５に示される。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは異なるＴＴＡに結合する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｍ及び図７５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｍ及び図７５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥＧＦＲ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｍ及び図７５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｍ及び図７５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインはＥｐＣＡＭ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｍ及び図７５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは Ｂ７Ｈ３及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、図５のＡ～Ｍ及び図７５の配列を有する。
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化メインは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、ＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２またはＥｐＣＡＭであり得る同じＴＴＡに結合し、その配列は図５に示され、ＣＣＬ及びＣＬは、ＭＭＰ９またはメプリンによって開裂されるリンカーから選択され、ｓｄＡＢＤ（１／２）は配列番号２４５または配列番号２４９を有する。
形式１において、好ましいドメインリンカーは、配列番号２８７である（これはまた、好ましい制約性非開裂性リンカーとしても機能する）。
Ｃ．単一ＴＴＡ構築物
図４に示されるように、形式２構築物と同様であるが、第２のＴＴＡ ＡＢＤがない「形式４」構築物もまた、本発明の組成物に含まれる。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が制約性Ｆｖドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、制約性非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、制約性疑似Ｆｖドメインは制約性非開裂性リンカーを使用する。
図４に示されるように、形式２構築物と同様であるが、第２のＴＴＡ ＡＢＤがない「形式４」構築物もまた、本発明の組成物に含まれる。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が制約性Ｆｖドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、制約性Ｆｖドメインは、制約性非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、制約性疑似Ｆｖドメインは制約性非開裂性リンカーを使用する。
当業者によって理解されるように、制約性Ｆｖドメインまたは制約性疑似ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）－ドメインリンカー－制約性Ｆｖドメイン－開裂性リンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）－制約性疑似Ｆｖドメインを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。この形式のすべての構築物について、ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡが概してＨｉｓ６を有しないが、それが含まれ得ることに留意されたい。
当業者によって理解されるように、制約性Ｆｖドメインまたは制約性疑似ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであり得る。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ＣＬ－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）－ドメインリンカー－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ＣＬ－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）－ドメインリンカー－ｉＶＨ－ＣＮＣＬ－ｉＶＬを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）－ドメインリンカー－ａＶＬ－ＣＮＣＬ－ａＶＨ－ＣＬ－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）－ドメインリンカー－ｉＶＨ－ＣＮＣＬ－ｉＶＬを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）－ドメインリンカー－ａＶＬ－ＣＮＣＬ－ａＶＨ－ＣＬ－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）－ドメインリンカー－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨを含む。
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ＣＬ－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）－ドメインリンカー－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図７のＡ～Ｂに示される配列を有する。この実施形態では、標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、ＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２またはＢ７Ｈ３であり得るＴＴＡに結合し、その配列は図５のＡ～Ｍ及び図７５に示される。
Ｄ．２つのタンパク質組成物
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、開裂の非存在下で、分子内で会合して疑似Ｆｖを形成する、「半ＣＯＢＲＡ（商標）」または「半構築物」と称されるときがある、２つの異なる分子を含む。プロテアーゼの存在下で、開裂部位は開裂され、非活性可変ドメインを放出し、次いで、タンパク質対は、概して図３に示されるように、ＣＤ３に対する活性抗原結合ドメインを形成する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、開裂の非存在下で、分子内で会合して疑似Ｆｖを形成する、「半ＣＯＢＲＡ（商標）」または「半構築物」と称されるときがある、２つの異なる分子を含む。プロテアーゼの存在下で、開裂部位は開裂され、非活性可変ドメインを放出し、次いで、タンパク質対は、概して図３に示されるように、ＣＤ３に対する活性抗原結合ドメインを形成する。
半構築物の設計で重要なことは、活性可変ドメイン及びｓｄＡＢＤ－ＴＴＡが開裂後に一緒のままであり、これにより、２つの開裂部分が腫瘍表面上の腫瘍抗原受容体によって一緒に保持され、次いで活性抗ＣＤ３結合ドメインを形成することができることである。
対の各メンバーが単一ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡを有するもの（図３のＡ）、及びそれぞれが異なるＴＴＡに対する２つの異なるｓｄＡＢＤ－ＴＴＡを有するもの（図３のＢ）の、２つの異なる一般的な形式３構築物が存在する。
１．単一ＴＴＡ結合ドメインを有する半ＣＯＢＲＡ（商標）構築物（形式３Ａ）
いくつかの実施形態では、第１の半ＣＯＢＲＡ（商標）は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（１／２）を有し、第２の半ＣＯＢＲＡ（商標）は、ｓｄＡＢＤ（１／２）－ドメインリンカー－ｉＶＨ－ＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）を有する。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬ及びｓｄＡＢＤ（１／２）は、図６及び図７に示される配列を有し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡａは、ヒトＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、ＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２、ＯＬＲ１及び／またはＢ７Ｈ３に結合し、図５のＡ～Ｍ及び図７５に示される配列を有する。
いくつかの実施形態では、第１の半ＣＯＢＲＡ（商標）は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（１／２）を有し、第２の半ＣＯＢＲＡ（商標）は、ｓｄＡＢＤ（１／２）－ドメインリンカー－ｉＶＨ－ＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）を有する。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬ及びｓｄＡＢＤ（１／２）は、図６及び図７に示される配列を有し、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡａは、ヒトＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、ＬｙＰＤ３、ＨＥＲ２、ＯＬＲ１及び／またはＢ７Ｈ３に結合し、図５のＡ～Ｍ及び図７５に示される配列を有する。
２．二重ＴＴＡ ＡＢＤを有する半ＣＯＢＲＡ（商標）構築物
いくつかの実施形態では、対になったプロドラッグ構築物は、図３Ｂに示されるように、構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ結合ドメインを有することができる。この実施形態では、対の第１のメンバーは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＨＡＳ）を含み、第２のメンバーは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２－ａＶＬ－ＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、対になったプロドラッグ構築物は、図３Ｂに示されるように、構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ結合ドメインを有することができる。この実施形態では、対の第１のメンバーは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＬ－ｉＶＬ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ（ＨＡＳ）を含み、第２のメンバーは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ１－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ２－ａＶＬ－ＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
対の各メンバー上の２つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは異なるが、概して、両方のメンバー（半ＣＯＢＲＡ（商標））は同じ２つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡを有し、例えば、両方はＥＧＦＲとＦＯＬＲ１またはＥＧＦＲとＢ７Ｈ３などを有する。
２つのｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、いくつかの実施形態では、図５のＡ～Ｍ及び図７５に示されるものから選択される。
ＩＶ．本発明の組成物の作製方法
本発明のプロドラッグ組成物は、概して当業者によって理解されるように、かつ以下で概説されるように作製される。
本発明のプロドラッグ組成物は、概して当業者によって理解されるように、かつ以下で概説されるように作製される。
本発明は、本発明のプロドラッグ組成物をコードする核酸組成物を提供する。当業者によって理解されるように、核酸組成物は、プロドラッグポリペプチド（複数可）の形式によって決まる。したがって、例えば、「形式３」構築物など、形式が２つのアミノ酸配列を必要とする場合、２つの核酸配列は、発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、単一ポリペプチドであるプロドラッグ構築物（形式１、２及び４）は、産生のために単一発現ベクター中に単一核酸を必要とする。
当技術分野において既知であるように、本発明の構成成分をコードする核酸は、当技術分野において既知であるように、かつ本発明のプロドラッグ組成物を産生するために使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込まれ得る。概して、核酸は、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能なマーカー、リボゾーム結合部位、誘導因子など）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外または組み込みベクターであり得る。
次いで、本発明の核酸及び／または発現ベクターは、多くの実施形態で使用される哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞）で、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫及び／または真菌細胞を含む、当技術分野において周知であるような任意の数の異なる型の宿主細胞に変換される。
本発明のプロドラッグ組成物は、当技術分野において周知であるように、発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。いったん産生されると、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィステップ及び／またはイオン交換クロマトグラフィステップを含む、従来の抗体精製ステップが行われる。
Ｖ．本発明のプロドラッグ組成物の製剤及び投与
本発明に従って使用されるプロドラッグ組成物の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］で概説されるように）任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を伴い所望の純度を有するプロドラッグ（形式１、２及び４の場合は単一タンパク質、ならびに形式３の場合は２つのタンパク質）を混合することによって、保存のために調製される。
本発明に従って使用されるプロドラッグ組成物の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］で概説されるように）任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を伴い所望の純度を有するプロドラッグ（形式１、２及び４の場合は単一タンパク質、ならびに形式３の場合は２つのタンパク質）を混合することによって、保存のために調製される。
本発明のプロドラッグ組成物は、ボーラスとしての、またはある期間にわたる持続注入による静脈内投与などの既知の方法に従って、対象に投与される。
本発明のプロドラッグ組成物は、がんの治療に有用である。記載されたプロドラッグ組成物のいずれかを含む、患者のがんを治療する方法が本明細書に提供される。医薬品として使用するためのプロドラッグ組成物が本明細書に記載される。記載されたプロドラッグ組成物のいずれかを含む、がんを治療するための医薬組成物が提供される。それを必要とする患者のがんを治療するための、記載されたプロドラッグ組成物のいずれかを含む医薬組成物が提供される。がんを治療するための治療またはそのための方法で使用するための記載されたプロドラッグ組成物が提供される。それを必要とする患者のがんを治療するための本明細書に記載のプロドラッグ組成物が提供される。がんの治療のための薬剤の製造におけるプロドラッグ組成物の使用が提供される。
ＶＩ．例示的な実施形態
本発明は、がんの治療のための多くの異なるタンパク質組成物を提供する。したがって、一態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、ｂ）ドメインリンカーと、ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）ならびにｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインを含む制約性Ｆｖドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、ｇ）ｉ）疑似軽可変ドメイン、ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）及びｉｉｉ）疑似重可変ドメインを含む制約性疑似Ｆｖドメインと、ｈ）第３のドメインリンカーと、ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含む「形式２」タンパク質を提供し、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、制約性Ｆｖドメインは、ＣＤ３に結合せず、可変重ドメイン及び疑似可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、可変軽ドメイン及び疑似可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。いくつかの実施形態では、ヒト腫瘍標的抗原はＢ７Ｈ３である。
本発明は、がんの治療のための多くの異なるタンパク質組成物を提供する。したがって、一態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、ｂ）ドメインリンカーと、ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重ドメイン、ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）ならびにｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽ドメインを含む制約性Ｆｖドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、ｇ）ｉ）疑似軽可変ドメイン、ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）及びｉｉｉ）疑似重可変ドメインを含む制約性疑似Ｆｖドメインと、ｈ）第３のドメインリンカーと、ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含む「形式２」タンパク質を提供し、可変重ドメイン及び可変軽ドメインは、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、制約性Ｆｖドメインは、ＣＤ３に結合せず、可変重ドメイン及び疑似可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、可変軽ドメイン及び疑似可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。いくつかの実施形態では、ヒト腫瘍標的抗原はＢ７Ｈ３である。
更なる態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端まで、ｓｄＦＲ１－ｓｄＣＤＲ１－ｓｄＦＲ２－ｓｄＣＤＲ２－ｓｄＦＲ３－ｓｄＣＤＲ３－ｓｄＦＲ４を含む、ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｉ）ｖｈＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ｖｈＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ｖｈＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ｖｈＦＲ４を含む可変重ドメイン、ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）ならびにｉｉｉ）ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を含む可変軽ドメインを含む制約性Ｆｖドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、ｇ）ｉ）ｓｄＦＲ１－ｓｄＣＤＲ１－ｓｄＦＲ２－ｓｄＣＤＲ２－ｓｄＦＲ３－ｓｄＣＤＲ３－ｓｄＦＲ４を含む疑似軽可変ドメイン、ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）及びｉｉｉ）ｖｌＦＲ１－ｖｌＣＤＲ１－ｖｌＦＲ２－ｖｌＣＤＲ２－ｖｌＦＲ３－ｖｌＣＤＲ３－ｖｌＦＲ４を含む疑似重可変ドメインを含む制約性疑似Ｆｖドメインと、ｈ）第３のドメインリンカーと、ｉ）ｓｄＦＲ１－ｓｄＣＤＲ１－ｓｄＦＲ２－ｓｄＣＤＲ２－ｓｄＦＲ３－ｓｄＣＤＲ３－ｓｄＦＲ４を含むヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含むタンパク質を提供し、可変重ドメイン及び可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、制約性ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、可変重ドメイン及び疑似可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、可変軽ドメイン及び疑似可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。いくつかの実施形態では、ヒト腫瘍標的抗原はＢ７Ｈ３である。
形式２タンパク質のいくつかの実施形態では、可変重ドメインは可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＣ末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは可変軽ドメインのＣ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。いくつかの実施形態では、可変重ドメインは可変軽ドメインのＣ末端にあり、疑似可変軽ドメインは疑似可変重ドメインのＣ末端にある。
形式２タンパク質のいくつかの実施形態では、第１のｓｄＡＢＤＴＴＡと第２のｓｄＡＢＤＴＴＡは同じである。いくつかの実施形態では、第１のｓｄＡＢＤＴＴＡと第２のｓｄＡＢＤＴＴＡは異なる。これらの実施形態では、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号１１３を含む図７に示されるものから選択される。
形式２タンパク質のいくつかの実施形態では、制約性疑似Ｆｖドメインの疑似重鎖可変ドメインは、図７に示すように配列番号１４６（ＶＨｉ）、配列番号１５０（ＶＨｉ２）及び配列番号１５４（ＶＨｉＧＬ４）の群から選択される。いくつかの実施形態では、制約性疑似Ｆｖドメインの疑似軽可変ドメインは、図７に示すように配列番号１３０（ＶＬｉ）、配列番号１３４（ＶＬｉ２）及び配列番号１３８（ＶＬｉＧＬ）の群から選択される。
更なる態様では、Ｎ末端からＣ末端まで、（ａ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、（ｂ）第１のドメインリンカー、（ｃ）（ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＣＬ）と（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインとを含む制約性Ｆｖドメイン、（ｄ）第２のドメインリンカー、（ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、（ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）、（ｇ）（ｉ）第１の疑似可変軽ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインとを含む制約性疑似Ｆｖドメイン、（ｈ）第３のドメインリンカー、（ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤを含む「形式１」タンパク質が提供され、ここで、第１の可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、制約性ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、第１の可変軽ドメイン及び第１の疑似可変重ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。更なる態様では、Ｎ末端からＣ末端まで、（ａ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）、（ｂ）第１のドメインリンカー、（ｃ）（ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインとを含む制約性Ｆｖドメイン、（ｄ）開裂性リンカー（ＣＬ）、（ｅ）ヒト血清アルブミンに結合する第２のｓｄＡＢＤ、（ｆ）ドメインリンカー、（ｇ）（ｉ）第１の疑似可変軽ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインとを含む制約性疑似Ｆｖドメインを含む「形式４」タンパク質が提供され、ここで、第１の可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、制約性疑似ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、第１の可変軽ドメイン及び第１の疑似可変重ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。
上記の形式１、形式２及び形式４タンパク質の更なる態様では、第１の可変重ドメインは第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似軽可変ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。
上記の形式１、形式２及び形式４タンパク質の更なる態様では、第１の可変重ドメインは第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、疑似可変重ドメインは疑似可変軽ドメインのＮ末端にある。
上記の形式１、形式２及び形式４タンパク質の更なる態様では、第１の可変軽ドメインは第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、疑似軽可変ドメインは疑似可変重ドメインのＮ末端にある。
上記の形式１、形式２及び形式４タンパク質の更なる態様では、第１の可変軽ドメインは第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、疑似可変重ドメインは疑似可変軽ドメインのＮ末端にある。
追加の態様において、本発明は、第１及び第２のＴＴＡが同じである形式１及び形式２タンパク質を提供する。更なる態様において、本発明は、第１及び第２のＴＴＡが異なる形式１及び形式２タンパク質を提供する。
追加の態様において、本発明は、第１及び第２のＴＴＡがＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、Ｔｒｏｐ２、ｃａ９及びＢ７Ｈ３から選択される、形式１、形式２ならびに形式４タンパク質を提供する。これらの配列は、ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号１１３からなる群から選択され得る。
更なる態様において、本発明は、半減期延長ドメインが配列番号１１７（ａＨＳＡ（１０ＧＥ））及び配列番号１２１（ＨＩＳタグを有するａＨＳＡ）を有する、形式１、形式２ならびに形式４タンパク質を提供する。
追加の態様において、本発明は、開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリンＡ、メプリンＢ、カテプシンＳ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、グランザイムＢ、ｕＰＡ、カレクリエイン７、マトリプターゼ及びトロンビン、または図６に示す他のものからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、形式１、形式２ならびに形式４タンパク質を提供する。
更なる態様において、本発明は、Ｐｒｏ１８６、Ｐｒｏ２２５、Ｐｒｏ２２６、Ｐｒｏ２３３、Ｐｒｏ２６２、Ｐｒｏ３１１、Ｐｒｏ３１２、Ｐｒｏ３１３、Ｐｒｏ３５６、Ｐｒｏ３５９、Ｐｒｏ３６４、Ｐｒｏ３８８、Ｐｒｏ４４８、Ｐｒｏ４４９、Ｐｒｏ４５０、Ｐｒｏ４５１、Ｐｒｏ４９５、Ｐｒｏ２４６、Ｐｒｏ２５４、Ｐｒｏ２５５、Ｐｒｏ２５６、Ｐｒｏ４２０、Ｐｒｏ４２１、Ｐｒｏ４３２、Ｐｒｏ４７９、Ｐｒｏ４８０、Ｐｒｏ１８７、Ｐｒｏ２２１、Ｐｒｏ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｐｒｏ２２４、Ｐｒｏ３９３、Ｐｒｏ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４２９、Ｐｒｏ４３０、Ｐｒｏ４３１、Ｐｒｏ６０１、Ｐｒｏ６０２、Ｖ３及びＶ４、Ｐｒｏ６６４、Ｐｒｏ６６５、Ｐｒｏ６６７、Ｐｒｏ６９４、Ｐｒｏ６９５、Ｐｒｏ５６５、Ｐｒｏ５６６、Ｐｒｏ５６７、Ｐｒｏ７２７、Ｐｒｏ７２８、Ｐｒｏ７２９、Ｐｒｏ７３０、Ｐｒｏ７３１、Ｐｒｏ６７６、Ｐｒｏ６７７、Ｐｒｏ６７８、Ｐｒｏ６７９、Ｐｒｏ８０８、Ｐｒｏ８１９、Ｐｒｏ６２１、Ｐｒｏ６２２、Ｐｒｏ６４０、Ｐｒｏ６４１、Ｐｒｏ６４２、Ｐｒｏ６４３、Ｐｒｏ７４４、Ｐｒｏ７４６、Ｐｒｏ６３８、Ｐｒｏ６３９、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４７６、Ｐｒｏ７０６、Ｐｒｏ７０９、Ｐｒｏ４７０、Ｐｒｏ４７１、Ｐｒｏ５５１、Ｐｒｏ５５２、Ｐｒｏ６２３、Ｐｒｏ６２４、Ｐｒｏ６９８、Ｐｒｏ６５５、Ｐｒｏ６５６、Ｐｒｏ６５７、Ｐｒｏ６５８、Ｐｒｏ５１６、Ｐｒｏ５１７、Ｐｒｏ５１８ならびにＰｒｏ５１９からなる群から選択されるタンパク質を提供する。
追加の態様において、本発明は、本明細書に記載の形式１、形式２または形式４タンパク質をコードする核酸、ならびにタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
更なる態様において、本発明は、本発明のタンパク質を作製する方法、及びそれを必要とする患者を治療する方法を提供する。
追加の態様において、本発明は、ａ）Ｎ末端からＣ末端までｉ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｉｉ）第１のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、２）開裂性リンカーならびに３）ｉＶＬＣＤＲ１、ｉＶＬＣＤＲ２及びｉＶＬＣＤＲ３を含む第１の疑似可変軽ドメインを含む疑似Ｆｖドメインと、ｉｖ）第２のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡとを含む第１のタンパク質と、ａ）Ｎ末端からＣ末端までｉ）ヒト腫瘍標的抗原に結合する第３のｓｄＡＢＤと、ｉｉ）第３のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、１）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖、２）開裂性リンカーならびに３）ｉＶＨＣＤＲ１、ｉＶＨＣＤＲ２及びｉＶＨＣＤＲ３を含む第１の疑似可変重ドメインを含む疑似Ｆｖドメインと、ｉｖ）第４のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡとを含む第２のタンパク質と含む、プロドラッグタンパク質の「形式３Ａ」対を含む組成物を提供し、ここで、第１の可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインは会合した場合にヒトＣＤ３に結合することができ、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子間会合して不活性Ｆｖを形成し、第１の可変軽ドメイン及び第１の疑似可変重ドメインは分子間会合して不活性Ｆｖを形成し、第１及び第３のｓｄＡＢＤは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号１１３からなる群から選択される。
更なる態様において、本発明は、ａ）Ｎ末端からＣ末端までｉ）第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｉｉ）第１ドメインリンカーと、ｉｉｉ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｉｖ）第２のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、２）開裂性リンカーならびに３）ｉＶＬＣＤＲ１、ｉＶＬＣＤＲ２及びｉＶＬＣＤＲ３を含む第１の疑似可変軽ドメインを含む疑似Ｆｖドメインと、ｉｖ）第３のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡを含む第１のタンパク質と、ａ）Ｎ末端からＣ末端までｉ）第３のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｉｉ）第４のドメインリンカーと、ｉｉｉ）第４のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、ｉｖ）第５のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで１）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖、２）開裂性リンカーならびに３）ｉＶＨＣＤＲ１、ｉＶＨＣＤＲ２及びｉＶＨＣＤＲ３を含む第１の疑似可変重ドメインを含む疑似Ｆｖドメインと、ｉｖ）第６のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡとを含む第２のタンパク質とを含む、プロドラッグタンパク質の「形式３Ｂ」対を含む組成物を提供し、ここで、第１の可変重ドメイン及び第１の可変軽ドメインは会合した場合にヒトＣＤ３に結合することができ、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子間会合して不活性Ｆｖを形成し、第１の可変軽ドメイン及び第１の疑似可変重ドメインは分子間会合して不活性Ｆｖを形成する。
追加の態様において、形式３Ａ及び形式３Ｂタンパク質は、配列番号１１７または配列番号１２１を有するｓｄＡＢＤ－ＨＳＡを有する。更なる態様では、形式３Ａ及び形式３Ｂタンパク質は、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、ＣＡ９、ＦＯＬＲ１及びＢ７Ｈ３から選択されるＴＴＡに結合するｓｄＡＢＤ－ＴＴＡを有する。ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３、配列番号９７、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号１１３からなる群から選択され得る。
追加の態様において、本発明は、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９及び配列番号９３から選択された配列を有するヒトＴｒｏｐ２に結合するｓｄＡＢＤを提供する。更なる態様において、本発明は、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３及び配列番号５７から選択された配列を有するヒトＢ７Ｈ３に結合するｓｄＡＢＤを提供する。追加の態様において、本発明は、配列番号１０１、配列番号１０５、配列番号１０９及び配列番号１１３から選択された配列を有する、ヒトＣＡ９に結合するｓｄＡＢＤを提供する。更なる態様において、本発明は、配列番号６９及び配列番号７３から選択された配列を有するヒトＥｐＣＡＭに結合するｓｄＡＢＤを提供する。
いくつかの態様では、Ｎ末端からＣ末端まで、（ａ）腫瘍標的抗原に結合する第１のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）、（ｂ）第１のドメインリンカー、（ｃ）（ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインとを含む制約性Ｆｖドメイン、（ｄ）第２のドメインリンカー、（ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、（ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）、（ｇ）（ｉ）第１の疑似可変軽ドメインと（ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）と（ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインとを含む制約性疑似Ｆｖドメイン、（ｈ）第３のドメインリンカー、及び（ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、制約性ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ及び第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはＢ７Ｈ３、ＣＡ９、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、ＬｙＰＤ３及びＴｒｏｐ２からなる群から選択される同じＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１の及び／または第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、本明細書に開示される任意のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡであり得る。
いくつかの態様では、Ｎ末端からＣ末端まで、（ａ）腫瘍標的抗原に結合する第１のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）、（ｂ）第１のドメインリンカー、（ｃ）（ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメインと（ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）と（ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインとを含む制約性Ｆｖドメイン、（ｄ）第２のドメインリンカー、（ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ、（ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）、（ｇ）（ｉ）第１の疑似可変軽ドメインと（ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）と（ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインとを含む制約性疑似Ｆｖドメイン、（ｈ）第３のドメインリンカー、及び（ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む融合タンパク質が提供され、ここで、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、制約性ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、第１の可変重ドメイン及び第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはＢ７Ｈ３、ＣＡ９、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、ＬｙＰＤ３及びＴｒｏｐ２からなる群から選択されるＴＴＡに結合し、第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはＢ７Ｈ３、ＣＡ９、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、ＨＥＲ２、ＬｙＰＤ３及びＴｒｏｐ２からなる群から選択される異なるＴＴＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１の及び／または第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、本明細書に開示される任意のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡであり得る。
配列番号２８８（Ｐｒｏ５６５）、配列番号２８９（Ｐｒｏ５６６）、配列番号２９０（Ｐｒｏ５６７）、配列番号２９２（Ｐｒｏ７２７）、配列番号２９３（Ｐｒｏ７２８）、配列番号２９４（Ｐｒｏ７２９）、配列番号２９５（Ｐｒｏ７３０）、配列番号２９６（Ｐｒｏ７３１）、配列番号２９７（Ｐｒｏ６７６）、配列番号２９８（Ｐｒｏ６７７）、配列番号２９９（Ｐｒｏ６７８）、配列番号３００（Ｐｒｏ６７９）、配列番号３０１（Ｐｒｏ８０８）、配列番号３０２（Ｐｒｏ８１９）、配列番号３０４（Ｐｒｏ６２１）、配列番号３０５（Ｐｒｏ６２２）、配列番号３０６（Ｐｒｏ６４０）、配列番号３０７（Ｐｒｏ６４１）、配列番号３０８（Ｐｒｏ６４２）、配列番号３０９（Ｐｒｏ６４３）、配列番号３１０（Ｐｒｏ７４４）、配列番号３１１（Ｐｒｏ７４６）、配列番号３１２（Ｐｒｏ１０８）、配列番号３１３（Ｐｒｏ１０９）、配列番号３１４（Ｐｒｏ３９６）、配列番号３１５（Ｐｒｏ４７６）、配列番号３１６（Ｐｒｏ７０６）、配列番号３１７（Ｐｒｏ７０９）、配列番号３１８（Ｐｒｏ４７０）、配列番号３１９（Ｐｒｏ４７１）、配列番号３２０（Ｐｒｏ５５１）、配列番号３２１（Ｐｒｏ５５２）、配列番号３２２（Ｐｒｏ６２３）、配列番号３２３（Ｐｒｏ６２４）、配列番号３２４（Ｐｒｏ６９８）、配列番号３２５（Ｐｒｏ６５５）、配列番号３２６（Ｐｒｏ６５６）、配列番号３２７（Ｐｒｏ６５７）、配列番号３２８（Ｐｒｏ６５８）、配列番号３２９（Ｐｒｏ５１６）、配列番号３３０（Ｐｒｏ５１７）、配列番号３３１（Ｐｒｏ５１８）、配列番号３３２（Ｐｒｏ５１９）、配列番号３３３（Ｐｒｏ５１３）、配列番号３３６（Ｐｒｏ２２５）、配列番号３３８（Ｐｒｏ８１７）、配列番号４１６（Ｐｒｏ３１１）、配列番号４１７（Ｐｒｏ３１２）、配列番号４１８（Ｐｒｏ３１３）、配列番号４１９（Ｐｒｏ２４６）、配列番号４２０（Ｐｒｏ２５６）、配列番号４２１（Ｐｒｏ４２０）、配列番号４２２（Ｐｒｏ４２１）、配列番号４８７（Ｐｒｏ７５１）、配列番号４８８（Ｐｒｏ７５２）、配列番号４８９（Ｐｒｏ８２４）、及び配列番号４９０（Ｐｒｏ８２６）、配列番号５２２（Ｐｒｏ６０１）、配列番号５２３（Ｐｒｏ６０２）、配列番号５２４（Ｖ３）、配列番号５２５（Ｖ４）、配列番号５２６（Ｐｒｏ６６４）、配列番号５２７（Ｐｒｏ６６５）、配列番号５２８（Ｐｒｏ６６７）、配列番号５２９（Ｐｒｏ６９４）、配列番号５３０（Ｐｒｏ６９５）及び配列番号５３１（Ｐｒｏ５６５）からなる群から選択されるいずれか１つからなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質。
更なる態様において、本発明は、プロドラッグ対の第１のタンパク質メンバーをコードする第１の核酸及び対の第２のタンパク質メンバーをコードする第２の核酸、ならびに発現ベクター及び核酸を含有する宿主細胞を含む核酸組成物を提供する。
実施例１：プロ構築物の構築及び精製
トランスフェクション
各タンパク質（例えば、形式１、形式２及び形式４については単一タンパク質）または構築物の対（形式３）を、別個の発現ベクター（ｐｃｄｎａ３．４誘導体）から発現させた。半ｃｏｂｒａまたは単鎖構築物の対をコードした等量のプラスミドＤＮＡを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ×２５’）及び濾過（０．２ｕＭフィルタ）によって、トランスフェクションの５日後に採取した。タンパク質発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。構築物を精製し、最終緩衝液組成物は、２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース、ｐＨ７であった。最終調製物を－８０°Ｃで保存した。
トランスフェクション
各タンパク質（例えば、形式１、形式２及び形式４については単一タンパク質）または構築物の対（形式３）を、別個の発現ベクター（ｐｃｄｎａ３．４誘導体）から発現させた。半ｃｏｂｒａまたは単鎖構築物の対をコードした等量のプラスミドＤＮＡを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ×２５’）及び濾過（０．２ｕＭフィルタ）によって、トランスフェクションの５日後に採取した。タンパク質発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。構築物を精製し、最終緩衝液組成物は、２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース、ｐＨ７であった。最終調製物を－８０°Ｃで保存した。
ＭＭＰ９の活性化
組み換えヒト（ｒｈ）ＭＭＰ９を以下のプロトコルに従って活性化した。組み換えヒトＭＭＰ－９（Ｒ＆Ｄ＃９１１－ＭＰ－０１０）は、０．４４ｍｇ／ｍＬ（４．７ｕＭ）であった。酢酸ｐ－アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ－３５である。
組み換えヒト（ｒｈ）ＭＭＰ９を以下のプロトコルに従って活性化した。組み換えヒトＭＭＰ－９（Ｒ＆Ｄ＃９１１－ＭＰ－０１０）は、０．４４ｍｇ／ｍＬ（４．７ｕＭ）であった。酢酸ｐ－アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ－３５である。
－ｒｈＭＭＰ９をアッセイ緩衝液で約１００ｕｇ／ｍＬに希釈する（２５ｕＬのｈＭＭＰ９＋７５ｕＬのアッセイ緩衝液）
－ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックからの酢酸ｐ－アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を、１ｍＭ（１ｕＬ～１００ｕＬ）の最終濃度になるように添加する
－３７℃で２４時間インキュベートする
－ＭＭＰ９を１０ｎｇ／ｕＬに希釈する（９００ｕＬのアッセイ緩衝液を１００ｕＬの活性化溶液に添加する）
活性化ｒｈＭＭＰ９の濃度は、約１００ｎＭである。
ＴＤＣＣアッセイのための構築物の開裂
構築物を開裂するために、製剤緩衝液（２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ－アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース）中１ｍｇ／ｍＬの濃度（１０．５ｕＭ）の１００ｕＬのタンパク質試料に、最大１０ｍＭのＣａＣｌ２を供給した。活性化ｒｈＭＭＰ９を２０～３５ｎＭの濃度になるまで添加した。試料を室温で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。開裂の完全性を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（１０～２０％ＴＧ、ＴＧ泳動用緩衝液、２００ｖ、１時間）を使用して検証した。試料を典型的には９８％開裂した。
構築物を開裂するために、製剤緩衝液（２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ－アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース）中１ｍｇ／ｍＬの濃度（１０．５ｕＭ）の１００ｕＬのタンパク質試料に、最大１０ｍＭのＣａＣｌ２を供給した。活性化ｒｈＭＭＰ９を２０～３５ｎＭの濃度になるまで添加した。試料を室温で一晩（１６～２０時間）インキュベートした。開裂の完全性を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（１０～２０％ＴＧ、ＴＧ泳動用緩衝液、２００ｖ、１時間）を使用して検証した。試料を典型的には９８％開裂した。
実施例２：Ｔ細胞依存性細胞障害（ＴＤＣＣ）アッセイ
ホタルルシフェラーゼ形質導入ＨＴ－２９細胞を約８０％密集度まで成長させ、Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＰＢＳ－Ｃａ－Ｍｇ中０．４８ｍＭのＥＤＴＡ）で分離した。細胞を遠心分離し、ＴＤＣＣ培地（ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及びβ－メルカプトエタノールを有するＲＰＭＩ１６４０中の５％熱失活ＦＢＳ）中に再懸濁した。精製したヒトＰａｎ－Ｔ細胞を解凍、遠心分離、及びＴＤＣＣ培地中に再懸濁した。
ホタルルシフェラーゼ形質導入ＨＴ－２９細胞を約８０％密集度まで成長させ、Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＰＢＳ－Ｃａ－Ｍｇ中０．４８ｍＭのＥＤＴＡ）で分離した。細胞を遠心分離し、ＴＤＣＣ培地（ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及びβ－メルカプトエタノールを有するＲＰＭＩ１６４０中の５％熱失活ＦＢＳ）中に再懸濁した。精製したヒトＰａｎ－Ｔ細胞を解凍、遠心分離、及びＴＤＣＣ培地中に再懸濁した。
ＨＴ－２９＿Ｌｕｃ細胞及びＴ細胞の共培養を３８４ウェル細胞培養プレートに添加した。その後、連続的に希釈したＣＯＢＲＡを共培養に加え、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、等量のＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、２０分間インキュベートした。プレートはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎで０．１秒／ウェルの露光時間で読み取った。全ルミネセンスを記録し、データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７またはＶｅｒｓｉｏｎ８．３．１（タイミングによる）で解析した。
実施例３：Ｉｎ Ｖｉｖｏ養子Ｔ細胞移入有効性モデルの一般的なプロトコル設計
これらのプロトコルを図面の実験の多くで使用した。
これらのプロトコルを図面の実験の多くで使用した。
プロトコル１：
腫瘍細胞をＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号００５５５７）の右脇腹に皮下移植（ＳＣ）し、約２００ｍｍ３の平均体積を有する確立された腫瘍が達成されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、約１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、各々に２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を越える体積に到達するまで、または研究は終了するまで更に２～３週間投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
腫瘍細胞をＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号００５５５７）の右脇腹に皮下移植（ＳＣ）し、約２００ｍｍ３の平均体積を有する確立された腫瘍が達成されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、約１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、各々に２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を越える体積に到達するまで、または研究は終了するまで更に２～３週間投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
ヒトＰＢＭＣ移植モデルのプロトコル２
ＮＳＧ－β２Ｍ－／－マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に、ヒトＰＢＭＣをｉ．ｖ．で移植した。移植後３日目に、マウスに腫瘍細胞株を皮下移植した。腫瘍の成長を確認したら、腫瘍の体積に基づいてマウスを無作為化し、試験物質を示されているようにｉ．ｖ．投与した。腫瘍体積はキャリパー測定により評価した。サイトカインレベル（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）及び肝酵素の上昇を評価するために、投与の４時間後に血漿を採取した。
ＮＳＧ－β２Ｍ－／－マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に、ヒトＰＢＭＣをｉ．ｖ．で移植した。移植後３日目に、マウスに腫瘍細胞株を皮下移植した。腫瘍の成長を確認したら、腫瘍の体積に基づいてマウスを無作為化し、試験物質を示されているようにｉ．ｖ．投与した。腫瘍体積はキャリパー測定により評価した。サイトカインレベル（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）及び肝酵素の上昇を評価するために、投与の４時間後に血漿を採取した。
２つのプロトコルの主な違いは、ヒトＴ細胞が最初のＣＯＢＲＡ投与と同時に注入されることだが、プロトコル２ではヒトＰＢＭＣが腫瘍細胞と同時に注入され、ＣＯＢＲＡ注入が約１０日後に開始されることに留意されたい。
実施例４：ＥＧＦＲ／ＭＭＰ９半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３を用いたｉｎ ｖｉｖｏ活性
５×１０６のＬｏＶｏ細胞または５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、それぞれに２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５、及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．２ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．５ｍｐｋの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）×ＣＤ３ ｂｓＡｂ Ｐｒｏ９８、０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーのそれぞれ、または０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７４及びＰｒｏ７２を含有する非開裂性（ＮＣＬ）リンカーのそれぞれを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
５×１０６のＬｏＶｏ細胞または５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、それぞれに２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５、及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．２ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．５ｍｐｋの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）×ＣＤ３ ｂｓＡｂ Ｐｒｏ９８、０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーのそれぞれ、または０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７４及びＰｒｏ７２を含有する非開裂性（ＮＣＬ）リンカーのそれぞれを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
実施例５：ＥＧＦＲ／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１４０を用いたｉｎ ｖｉｖｏ活性。
５×１０６のＬｏＶｏ細胞または５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、それぞれに２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．２ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．５ｍｐｋの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）×ＣＤ３ ｂｓＡｂ Ｐｒｏ９８、または０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１４０を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
５×１０６のＬｏＶｏ細胞または５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、それぞれに２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．２ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．５ｍｐｋの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）×ＣＤ３ ｂｓＡｂ Ｐｒｏ９８、または０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１４０を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
実施例６：ＥＧＦＲ／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１８６を用いたｉｎ ｖｉｖｏ活性。
５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、それぞれに２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ２１４を含有する非開裂性（ＮＣＬ）対照リンカー、０．１もしくは０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１４０を含有するＭＭＰ９開裂性リンカー、または０．１もしくは０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１８６を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ－Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２－メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ－２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより実験の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、それぞれに２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を超える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ２１４を含有する非開裂性（ＮＣＬ）対照リンカー、０．１もしくは０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１４０を含有するＭＭＰ９開裂性リンカー、または０．１もしくは０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ ＣＯＢＲＡ Ｐｒｏ１８６を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
実施例７Ａ：抗ＥＧＦＲ配列のヒト化の成功
結果を以下に示す。
結果を以下に示す。
これらの結果は、ＥＧＦＲ結合ドメインのヒト化が成功したこと、及び２つの結合部位が分子上に存在するときに標的ＥＧＦＲに対して強力な結合力があることの両方を示す。
実施例７Ｂ：ＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤの成功したヒト化
結果を以下に示す。
結果を以下に示す。
これらの結果は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインのヒト化が成功したことの両方を示す。
実施例８：ＣＯＢＲＡ（商標）：マウスの確立された固形腫瘍を退行させる新規の条件付きで活性な二重特異性抗体－単一特異性及びヘテロ特異性ＣＯＢＲＡ
血液悪性腫瘍を標的とする二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）（例えば、ブリナツモマブ、ＣＤ１９×ＣＤ３ ｂｓＡｂ）の臨床的成功にもかかわらず、固形腫瘍の徴候における有効性は依然として大きな課題である。Ｔ細胞再方向付け化ｂｓＡｂは非常に強力であるため、正常組織での細胞表面標的抗原の発現レベルが非常に低い場合でも、すぐに安全上の問題となり、患者で達成できる用量レベルが厳しく制限される可能性がある。これにより、有効な濃度に達する可能性が制限され、これらの高活性分子の治療可能性が低下する。更に、正常組織ではなく腫瘍で独自に発現する「クリーンな」標的抗原を特定することは、どうひいき目にみても非常に困難である。
血液悪性腫瘍を標的とする二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）（例えば、ブリナツモマブ、ＣＤ１９×ＣＤ３ ｂｓＡｂ）の臨床的成功にもかかわらず、固形腫瘍の徴候における有効性は依然として大きな課題である。Ｔ細胞再方向付け化ｂｓＡｂは非常に強力であるため、正常組織での細胞表面標的抗原の発現レベルが非常に低い場合でも、すぐに安全上の問題となり、患者で達成できる用量レベルが厳しく制限される可能性がある。これにより、有効な濃度に達する可能性が制限され、これらの高活性分子の治療可能性が低下する。更に、正常組織ではなく腫瘍で独自に発現する「クリーンな」標的抗原を特定することは、どうひいき目にみても非常に困難である。
これらの課題を克服するために、ＣＯＢＲＡ（商標）（条件付き二重特異性再方向付け活性化）と称される新規の組み換えｂｓＡｂプラットフォームを開発した。ＣＯＢＲＡは、腫瘍微小環境内でのＴ細胞の関与に焦点を当てることにより、より広く発現されかつ検証された腫瘍細胞表面抗原の標的化を可能にするように設計されている。ＣＯＢＲＡ分子は標的抗原に結合するように設計されており、腫瘍細胞と正常細胞の両方に発現し得、腫瘍では一般的だが正常な健康な組織では見られないタンパク質分解微小環境に曝露されない限り、Ｔ細胞には会合しない。腫瘍標的抗原に結合すると、プロテアーゼ依存性リンカー開裂により、ＣＯＢＲＡは不活性な抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを活性な抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ結合ドメインに変換できる。変換すると、ＣＯＢＲＡはＴ細胞と標的抗原を同時に会合させることができ、腫瘍細胞に対する強力な細胞溶解性Ｔ細胞応答をもたらす。更に、ＣＯＢＲＡは、タンパク質分解開裂時に活性分子から除去される半減期延長部分を使用して設計されている。これにより、腫瘍標的が結合する前に不活性ＣＯＢＲＡが循環中に持続的に存在し、未結合の活性ＣＯＢＲＡ分子がより迅速に除去され、それによって正常組織における細胞毒性活性の可能性が減少する。
ここで、ＣＯＢＲＡ分子の新規の設計を明らかにし、ＣＤ３及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に会合して、Ｔ細胞培養及びヒトＴ細胞移植腫瘍を有するマウスで強力な細胞障害活性を誘発する能力を実証した。本出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで低からサブピコモルのＴ細胞活性化と細胞毒性、及びｉｎ ｖｉｖｏでＮＳＧマウスにおける確立された固形腫瘍異種移植片のＣＯＢＲＡリンカー開裂依存性Ｔ細胞媒介退縮を報告した。
図１１のＡ～Ｃは、ＣＯＢＲＡの設計と予想される折り畳みメカニズムを示している。図１１のＡは、ＰＲＯ１８６ ＣＯＢＲＡの概略図を示している。図１１のＢは、予測されるＣＯＢＲＡの折り畳みを示している。ＣＯＢＲＡには、抗ＣＤ３ ＶＨ及びＶＬドメインと対になった不活性ＶＨ及びＶＬが含まれる。非開裂性ＰＲＯ１８６ ＣＯＢＲＡはＥＧＦＲに結合し、ＣＤ３結合が損なわれ、血清アルブミンに結合する。図１１のＣは、ＰＲＯ１８６の分析サイズ排除クロマトグラムを示している。データは、非開裂性ＰＲＯ１８６が単一構造に折り畳まれていることを示している。
図１１のＡ～Ｄは、ＣＯＢＲＡの設計及び予想される折り畳みメカニズムを示し、左には非開裂性分子の予想される構造が示されている。これは更に腫瘍抗原（ＭＶＣ－１０１の場合はＥＧＦＲ）に結合し、ＣＤ３結合が損なわれ、ヒト血清アルブミンに結合する。中央は予測された開裂産物を示し、左側は活性二量体を示す。
図１２のＡ～Ｑは、本発明のいくつかのＣＯＢＲＡの更なる配列を示す。
図１３は、本発明の形式２構築物が、開裂され二量体化されると、注入されたマウスから迅速に除去されることを示す。
図１４は、Ｐｒｏ２２５の結合動態を示す。
図１５のＡ～Ｂは、形式２構築物、この場合Ｐｒｏ２２５が、マウスの確立された固形腫瘍を退行させることを示す。
図１６のＡ～Ｂは、本発明の形式２構築物、この場合はＰｒｏ２２５が、本質的に活性なＴ細胞エンゲージャーと比較して増加した耐容性を示すことを示している。図１６のＣ及びＤは、Ｐｒｏ２２５での処置が、本質的に活性な二重特異性と比較して、マウスのより低いサイトカイン放出をもたらすことを示す。Ｐｒｏ２２５は、本質的に活性なＴ細胞エンゲージャーと比較して、ＮＨＰではＩＬ２、ＴＮＦａ及びＩＬ１０を誘導せず、マウスではマウスＩＬ６を誘導しない。
図１７は、実施例２で概説されるように、Ｔ細胞依存性細胞障害（ＴＤＣＣ）アッセイにおける本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ２３３は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥＧＦＲ構築物である。Ｐｒｏ５６５は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥｐＣＡＭ（ｈ６６４）構築物である。Ｐｒｏ５６６は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥｐＣＡＭ（ｈ６６５）構築物である。Ｐｒｏ６２３は、ａＥＧＦＲとａＥｐＣＡＭ（ｈ６６４）のヘテロＣＯＢＲＡ及びＭＭＰ９部位である。Ｐｒｏ６２４は、ａＥＧＦＲとａＥｐＣＡＭ（ｈ６６５）のヘテロＣＯＢＲＡ及びＭＭＰ９部位である。
図１８は、実施例２で概説したＴＤＣＣアッセイにおける本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ２３３は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥＧＦＲ構築物である。Ｐｒｏ３１１は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＦＯＬＲ１構築物である。Ｐｒｏ４２１は、ａＥＧＦＲとａＦＯＬＲ１のヘテロＣＯＢＲＡ及びＭＭＰ９部位である。
図１９は、実施例２で概説したＴＤＣＣアッセイにおける本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ２２５は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＢ７Ｈ３構築物である。Ｐｒｏ５６６は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥｐＣＡＭ構築物である。Ｐｒｏ６５６は、ａＢ７Ｈ３とａＥｐＣＡＭのヘテロＣＯＢＲＡ及びＭＭＰ９部位である。Ｐｒｏ６５８は、ａＥｐＣＡＭとａＢ７Ｈ３のヘテロＣＯＢＲＡ及びＭＭＰ９部位である。
図２０は、２つの異なる細胞株に対する実施例２で概説したＴＤＣＣアッセイにおける、本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ２２５は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＢ７Ｈ３構築物である。Ｐｒｏ５６６は、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥｐＣＡＭ構築物である。Ｐｒｏ６５６は、ａＢ７Ｈ３とａＥｐＣＡＭのヘテロＣＯＢＲＡ及びＭＭＰ９部位である。ＨＴ２９は、Ｒａｊｉ細胞株とは異なり、マウスに良好な異種移植を行う上皮細胞株である。ＨＴ２９は両方の標的遺伝子（Ｂ７Ｈ３及びＥｐＣＡＭ）を発現し、この場合、Ｂ７Ｈ３発現はＣＲＩＳＰＲを使用してノックアウトされた。したがって、ヘテロＣＯＢＲＡとＥｐＣＡＭ単一標的ＣＯＢＲＡは両方を殺傷したが、Ｂ７Ｈ３単一標的ＣＯＢＲＡは殺傷しなかった。
図２１は、高ＥｐＣＡＭ発現及び低Ｔｒｏｐ２発現を有するＨＴ２９細胞株に対する、実施例２で概説したＴＤＣＣアッセイにおける本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ８２４は、ＭＭＰ９リンカーへテロＣＯＢＲＡを有するａＥｐＣＡＭ×ａＴｒｏｐ２である。Ｐｒｏ８２５は、ＮＣＬヘテロＣＯＢＲＡ（非開裂性対照）を有するａＥｐＣＡＭ×ａＴｒｏｐ２である。Ｐｒｏ８２６は、ＭＭＰ９リンカーを有するａＴｒｏｐ２×ａＥｐＣＡＭへテロＣＯＢＲＡである。Ｐｒｏ８２７は、ＮＣＬヘテロＣＯＢＲＡ（非開裂性対照）を有するａＴｒｏｐ２×ａＥｐＣＡＭである。Ｐｒｏ６７７はａＴｒｏｐ２／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡであり、Ｐｒｏ５６６はａＥｐＣＡＭ／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡである。２つの抗原のレベルが変化するにつれて、ヘテロＣＯＢＲＡは良好な殺傷を維持するが、単一特異性ＣＯＢＲＡによる殺傷は変化する。単一特異性ＣＯＢＲＡは、特定の抗原（この場合はＴｒｏｐ２）の発現レベルが低下すると、同様に殺傷しない。同じことが図２２及び図２３にも当てはまる。
図２２は、高ＥｐＣＡＭ発現及び非常に低いＴｒｏｐ２発現を有するＨＴ１１６細胞株に対する、実施例２で概説したＴＤＣＣアッセイにおける本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ８２４は、ＭＭＰ９リンカーへテロＣＯＢＲＡを有するａＥｐＣＡＭ×ａＴｒｏｐ２である。Ｐｒｏ８２５は、ＮＣＬヘテロＣＯＢＲＡ（非開裂性対照）を有するａＥｐＣＡＭ×ａＴｒｏｐ２である。Ｐｒｏ８２６は、ＭＭＰ９リンカーを有するａＴｒｏｐ２×ａＥｐＣＡＭへテロＣＯＢＲＡである。Ｐｒｏ８２７は、ＮＣＬヘテロＣＯＢＲＡ（非開裂性対照）を有するａＴｒｏｐ２×ａＥｐＣＡＭである。Ｐｒｏ６７７はａＴｒｏｐ２／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡであり、Ｐｒｏ５６６はａＥｐＣＡＭ／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡである。
図２３は、中程度のＥｐＣＡＭ発現及び高Ｔｒｏｐ２発現を有するＢＸＰＣ３細胞株に対する、実施例２で概説したＴＤＣＣアッセイにおける本発明の多数の形式２構築物の有効性を示す。Ｐｒｏ８２４は、ＭＭＰ９リンカーへテロＣＯＢＲＡを有するａＥｐＣＡＭ×ａＴｒｏｐ２である。Ｐｒｏ８２５は、ＮＣＬヘテロＣＯＢＲＡ（非開裂性対照）を有するａＥｐＣＡＭ×ａＴｒｏｐ２である。Ｐｒｏ８２６は、ＭＭＰ９リンカーを有するａＴｒｏｐ２×ａＥｐＣＡＭへテロＣＯＢＲＡである。Ｐｒｏ８２７は、ＮＣＬヘテロＣＯＢＲＡ（非開裂性対照）を有するａＴｒｏｐ２×ａＥｐＣＡＭである。Ｐｒｏ６７７はａＴｒｏｐ２／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡであり、Ｐｒｏ５６６はａＥｐＣＡＭ／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡである。
図２４は、実施例３のプロトコル２を用いた、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＥｐＣＡＭ ＣＯＢＲＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。Ｐｒｏ５６６は、ＬｏＶｏ腫瘍、ならびにＨＴ２９、ＢｘＰＣ３及びＳＷ４０３腫瘍異種移植片に対して有効性を示した。
図２５は、実施例３のプロトコル２を用いた、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＴｒｏｐ２ ＣＯＢＲＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。Ｐｒｏ６７７は、ＢｘＰＣ３腫瘍及びＨＣＣ８２７腫瘍異種移植片に対して有効性を示した。
図２６は、実施例３のプロトコル３を用いた、ＭＭＰ９開裂部位を有するａＢ７Ｈ３ ＣＯＢＲＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。Ｐｒｏ２２５は、Ａ５４９腫瘍に対して有効性を示した。
結論：本出願人は、多価ｓｄＡｂ二重特異性抗体融合を設計し、これは、タンパク質分解作用により、非常に強力な二重特異性再方向付けＴ細胞治療薬に変換される。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、プロテアーゼ依存性リンカー開裂がＴ細胞媒介殺傷の効力を２００倍増加させ、したがってサブピコモル効力を有する治療薬をもたらすことを実証した。確立された異種移植片を有するマウスにおけるＰＲＯ１８６（Ｐｒｏ１８６）の投与は、複数の腫瘍モデルにおいてプロテアーゼ開裂依存性Ｔ細胞媒介性腫瘍退縮をもたらした。ＰＲＯ１８６は、（１）投与時のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期の延長、及び（２）タンパク質分解活性化後の迅速なクリアランスを示し、それによってＰＲＯ１８６が従来のＴ細胞再方向付け二重特異性よりも改善された安全性プロファイルを備えた治療薬であることを示している。
実施例９：ＴＤＣＣ実験で条件付きで腫瘍細胞株を殺傷する抗ＨＥＲ２単一特異性ＣＯＢＲＡ
実施例９：ＴＤＣＣ実験で条件付きで腫瘍細胞株を殺傷する抗ＨＥＲ２単一特異性ＣＯＢＲＡ
ヒトＨＥＲ２－Ｒａｊｉ細胞、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＨＥＲ２－Ｒａｊｉ細胞、ＳＫＯＶ３細胞（低発現ＨＥＲ２細胞）、Ｒａｊｉ－親細胞、ＨＴ２９細胞（高発現ＨＥＲ２細胞）を、様々な融合タンパク質：Ｐｒｏ１１２３ ＮＣＬ、Ｐｒｏ１１１７ ＭＭＰ９ 、Ｐｒｏ １１１７ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ１０６０ Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ１０６９ ＡＤ（図２７のＡ～Ｅ）；Ｐｒｏ１１１０ ＮＣＬ、Ｐｒｏ１１０９ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ １１０９ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ １０６２ Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ１０７１ ＡＤ（図２８のＡ～Ｅ）；Ｐｒｏ１１１２ ＮＣＬ、Ｐｒｏ１１１１ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ １１１１ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ１０６４ Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ１０７３ ＡＤ（図２９のＡ～Ｅ）；Ｐｒｏ１１２４ ＮＣＬ、Ｐｒｏ１１１８ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ １１１８ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ１０６１ Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ１０６９ ＡＤ（図３０のＡ～Ｅ）で試験した。結果は、ａＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ（ａＨｅｒ２ ｈ１１３９、ｈ１１５９、ｈ１１６２及びｈ１１５６）を含む単一特異性ＣＯＢＲＡが、ＴＤＣＣアッセイで条件付きで腫瘍細胞株を殺傷することができることを示した。
Ｐｒｏ５１形式のａＨＥＲ２融合タンパク質で、ＶＩＢ１１３９ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１１５６ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１１５９ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤまたはＶＩＢ１１６２ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤのいずれかなどの１つのａＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤを含むものは、ＴＤＣＣ実験でヒトに対する良好な活性とカニクイザルとの交差反応性を示した（図３１のＡ～Ｃ）。更に、形式２のａＨＥＲ２単一特異性ＣＯＢＲＡで、ＭＭＰ９開裂リンカーを含む（ＨＥＲ２／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡ）ものは、確立された腫瘍異種移植片を退行させることができた（図３２）。特に、Ｐｒｏ１１１８は、１００ｕｇ／ｋｇの用量でマウスに投与された。図３３は、ＭＭＰ９開裂性リンカーを含む単一特異性ＨＥＲ２ ＣＯＢＲＡのマウスＰＫデータを示すグラフを表す。結果は、Ｐｒｏ１１１１活性がマウスＨＥＲ２結合と一致することを示す。
様々なＨＥＲ２ ｓｄＡｂのエピトープビニング実験は、当業者であれば理解するように実施した。１００ｎＭの競合抗体を３３３ｎＭの飽和抗体で試験した。試験した競合抗体は、Ｐｒｏ１１１８、Ｐｒｏ１１１１、トラスツズマブ及びペルツズマブであった。飽和試験抗体は、ＶＩＢ１１２１ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１１３９ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１０５８ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１０９７ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、トラスツズマブ、ＶＩＢ１１５６ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１１６０ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ、ＶＩＢ１１５９ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤ及びＶＩＢ１１６２ ＨＥＲ２ ｓｄＡＢＤであった（図３４）。
様々なＨＥＲ２ ｓｄＡｂのエピトープビニング実験は、当業者であれば認識するように実施した。１００ｎＭの競合抗体を３３３ｎＭの飽和抗体で試験した。試験した抗体は、Ｐｒｏ１１１８、Ｐｒｏ１１１１、トラスツズマブ及びペルツズマブであった。「Ｂ」は競合するＡｂの結合を示し、「ＮＢ」は競合するＡｂが結合しないことを示す（図３５）。
ＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１５６（Ｐｒｏ１０６１）及びＨＥＲ２ ｓｄＡｂ ｈ１１６２（Ｐｒｏ１０６４）のエピトープマッピング分析からのアミノ酸位置及び配列は、ＨＤＸ（水素－重水素交換）を使用して同定され、当業者によって認識されるように実施した（図３６）。
Ｐｒｏ５１形式のＨＥＲ２ ｓｄＡｂの結合親和性を決定した。様々なｓｄＡｂと融合タンパク質の組み合わせが、ヒト、カニクイザル及びマウスからの標的で評価された。組み合わせは以下のとおり：１０５５とＰｒｏ１０３６、１０５８とＰｒｏ１０３７、１０５９とＰｒｏ１０３８、１０９１とＰｒｏ１０３９、１０９２とＰｒｏ１０４０、１０９７とＰｒｏ１０４１、１１２１とＰｒｏ１０４２、１１３９とＰｒｏ１０４３、１１５６とＰｒｏ１０４４、１１５９とＰｒｏ１０４５、１１６０とＰｒｏ１０４６、１１６２とＰｒｏ１０４７、ｈ１０５８とＰｒｏ１０５６、ｈ１０９２とＰｒｏ１０５７、ｈ１０９７とＰｒｏ１０５８、ｈ１１２１とＰｒｏ１０５９、ｈ１１３９とＰｒｏ１０６０、ｈ１１５６とＰｒｏ１０６１、ｈ１１５９とＰｒｏ１０６２、ｈ１１６０とＰｒｏ１０６３及びｈ１１６２とＰｒｏ１０６４（図３７）。
実施例１０：ＴＤＣＣ実験で条件付きで腫瘍細胞株を殺傷する抗ＣＡ９単一特異性ＣＯＢＲＡ
ヒトＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞、ｃｙｎｏ ＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞及びＨＴ２９親細胞を、様々な融合タンパク質： Ｐｒｏ５１４ ＮＣＬ、Ｐｒｏ５１８ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ５１８ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ５１１ Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ５２１ ＡＤで試験した（図３８のＡ～Ｃ）。ａＣＡ９ ｓｄＡＢＤ（ａＣＡ９ ｈ４０７）を含むものなどＣＡ９を標的とする単一特異性ＣＯＢＲＡは、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＡ９発現腫瘍細胞株を条件付きで殺傷することができた。
ヒトＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞、ｃｙｎｏ ＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞及びＨＴ２９親細胞を、様々な融合タンパク質： Ｐｒｏ５１４ ＮＣＬ、Ｐｒｏ５１８ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ５１８ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ５１１ Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ５２１ ＡＤで試験した（図３８のＡ～Ｃ）。ａＣＡ９ ｓｄＡＢＤ（ａＣＡ９ ｈ４０７）を含むものなどＣＡ９を標的とする単一特異性ＣＯＢＲＡは、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＡ９発現腫瘍細胞株を条件付きで殺傷することができた。
ヒトＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞、ｃｙｎｏ ＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞及びＨＴ２９親細胞を、様々な融合タンパク質： Ｐｒｏ５１５ ＮＣＬ、Ｐｒｏ５１９ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ５１９ ＭＭＰ９ｃｌ及びＰｒｏ５１２ Ｐｒｏ５１で試験した。ａＣＡ９ ｓｄＡＢＤ（ａＣＡ９ ｈ４４５）を含むものなどＣＡ９を標的とする単一特異性ＣＯＢＲＡは、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＡ９発現腫瘍細胞株を条件付きで殺傷することができた（図３９のＡ～Ｃ）。
ヒトＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞、ｃｙｎｏ ＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞及びＨＴ２９親細胞を、様々な融合タンパク質： Ｐｒｏ１０９５ ＮＣＬ、Ｐｒｏ５１６ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ５１６ ＭＭＰ９ｃｌ及びＰｒｏ５０９ Ｐｒｏ５１で試験した。ａＣＡ９ ｓｄＡＢＤ（ａＣＡ９ ｈ４５６）を含むものなどＣＡ９を標的とする単一特異性ＣＯＢＲＡは、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＡ９発現腫瘍細胞株を条件付きで殺傷することができた（図４０のＡ～Ｃ）。
ヒトＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞、ｃｙｎｏ ＣＡ９－Ｒａｊｉ細胞及びＨＴ２９親細胞を、様々な融合タンパク質： Ｐｒｏ５１３ ＮＣＬ、Ｐｒｏ５１７ ＭＭＰ９、Ｐｒｏ５１７ ＭＭＰ９ｃｌ、Ｐｒｏ５２０ ＡＤ及びＰｒｏ５１０ Ｐｒｏ５１で試験した。ａＣＡ９ ｓｄＡＢＤ（ａＣＡ９ ｈ４）を含むものなどＣＡ９を標的とする単一特異性ＣＯＢＲＡは、ヒトまたはｃｙｎｏ ＣＡ９発現腫瘍細胞株を条件付きで殺傷することができた（図４１のＡ～Ｃ）。
図４２は、Ｐｒｏ５１形式でのＣＡ９ ｓｄＡｂの結合親和性を示す表である。様々なｓｄＡｂ及びｓｄＡｂと融合タンパク質の組み合わせが、ヒト、ｃｙｎｏ及びマウスで評価された。ｓｄＡｂは、４０７、４４５、４５６、４７２及び４７６であり、組み合わせは、ｈ４４５とＰｒｏ５１２、ｈ４５６とＰｒｏ５０９及びｈ４７６とＰｒｏ５１０であった。
ＭＭＰ９開裂リンカーを含む、形式２のＣＡ９単一特異性ＣＯＢＲＡ（ＣＡ９／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡ）は、確立された腫瘍異種移植片を退行させることができた。図４３のＡ～Ｂは、ＣＡ９／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡが、確立された腫瘍異種移植モデルを退行させたことを実証する一連のグラフである。Ｐｒｏ５１３、Ｐｒｏ５１７及びＰｒｏ５１８の存在下の腫瘍ＳＮＵ－１６であり、すべて用量３００ｕｇ／ｋｇであった。Ｐｒｏ５１３及びＰｒｏ５１７の存在下での腫瘍７８６－Ｏであり、すべて用量１００ｕｇ／ｋｇであった。図４４はＣＡ９／ＭＭＰ９ ＣＯＢＲＡのマウスのＰＫデータを示すグラフであり、これは、Ｐｒｏ５１６についてマウスの標的結合と一致する。Ｐｒｏ５１７及びＰｒｏ５１６は、用量１００ｕｇ／ｋｇで使用した。
実施例１１：ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭを発現する細胞のＴＤＣＣを誘発するＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡ
Ｒａｊｉ親細胞（図４５のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥＧＦＲ細胞（図４５のＢ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図４５のＣ）及びＲａｊｉ－ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ細胞（図４５のＤ）を、単一特異性ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ２３３ ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）で、及びヘテロＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ６２４ ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ）とＰｒｏ６９８（ＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲ）で試験した。結果は、ＥＧＦＲとＥｐＣＡＭの両方を標的とするヘテロ特異性ＣＯＢＲＡが、一方または両方の抗原（例えば、ＥＧＦＲのみ、ＥｐＣＡＭのみまたはＥＧＦＲとＥｐＣＡＭの両方）を発現するＲａｊｉ細胞でＴＤＣＣを誘発したことを示した。
Ｒａｊｉ親細胞（図４５のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥＧＦＲ細胞（図４５のＢ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図４５のＣ）及びＲａｊｉ－ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ細胞（図４５のＤ）を、単一特異性ＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ２３３ ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）で、及びヘテロＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ６２４ ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭ）とＰｒｏ６９８（ＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲ）で試験した。結果は、ＥＧＦＲとＥｐＣＡＭの両方を標的とするヘテロ特異性ＣＯＢＲＡが、一方または両方の抗原（例えば、ＥＧＦＲのみ、ＥｐＣＡＭのみまたはＥＧＦＲとＥｐＣＡＭの両方）を発現するＲａｊｉ細胞でＴＤＣＣを誘発したことを示した。
Ｐｒｏ６２４は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。Ｐｒｏ６９８は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡは、一方または両方の抗原を発現するＨＴ２９細胞でＴＤＣＣを誘発することもできた。
ａＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ（ａＥＧＦＲ ｈＤ１２）及びａＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤ（ａＥｐＣＡＭ ｈ６４４）を含むＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡを、Ｐｒｏ６２３ ＭＭＰ９、開裂したＰｒｏ６２３、Ｐｒｏ６２５ ＮＣＬで試験した（図４６のＡ）。Ｐｒｏ６２３は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。
ａＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ（ａＥＧＦＲ ｈＤ１２）及びａＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤ（ａＥｐＣＡＭ ｈ６６５）を含むＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡを、Ｐｒｏ６９８ ＭＭＰ９、開裂したＰｒｏ６９８、６９９ ＮＣＬで試験した（図４６のＢ）。Ｐｒｏ６９９は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ）－ＮＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。ａＥＧＦＲ ｓｄＡＢＤ（ａＥＧＦＲ ｈＤ１２）及びａＥｐＣＡＭ ｓｄＡＢＤ（ａＥｐＣＡＭ ｈ６６５）を含むＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡを、Ｐｒｏ６２４ ＭＭＰ９、開裂したＰｒｏ６２４、Ｐｒｏ６９９ ＮＣＬで試験した（図４６のＣ）。ＥＧＦＲ／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡは、一方または両方の抗原を発現する様々な細胞でＴＤＣＣを誘発することもできた。
実施例１２：ＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１を発現する細胞のＴＤＣＣを誘発するＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ヘテロＣＯＢＲＡ
実施例１２：ＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１を発現する細胞のＴＤＣＣを誘発するＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ヘテロＣＯＢＲＡ
Ｒａｊｉ－ＥＧＦＲ細胞（図４７のＡ）、Ｒａｊｉ－ＦＯＬＲ１細胞（図４７のＢ）、Ｒａｊｉ－ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１細胞（図４７のＣ）は、ＥＧＦＲまたはＦＯＬＲ１のいずれかを標的とする単一特異性ＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ２３３（ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）とＰｒｏ３１１（ＦＯＬＲ１／ＦＯＬＲ１）で、及びＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１の両方を標的とするヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ４２１（ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１）とＰｒｏ４２０（ＦＯＬＲ１／ＥＧＦＲ）で試験した。Ｐｒｏ４２１は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。Ｐｒｏ４２０は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１）－ドメインリンカー－ａＶＨ－ＣＮＣＬ－ａＶＬ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ）－ＣＬ－ｉＶＬ－ＣＮＣＬ－ｉＶＨ－ドメインリンカー－（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）を含む。これらの実験の結果は、ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ヘテロＣＯＢＲＡ（Ｐｒｏ４２１など）が、一方または両方の抗原を発現するＲａｊｉ細胞でＴＤＣＣを誘発したことを実証した。
図４８のＡ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ２１４ ＮＣＬ（ＥＧＦＲ ｈＤ１２）、Ｐｒｏ１８６ ＭＭＰ９（ＥＧＦＲ ｈＤ１２）及びＰｒｏ１８６ ＭＭＰ９ｃ１（ＥＧＦＲ ｈＤ１２）で試験した。図４８のＢ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ３０３ ＮＣＬ（ＦＯＬＲ１ ｈ５９－３）、Ｐｒｏ３１２ ＭＭＰ９（ＦＯＬＲ１ ｈ５９－３）及びＰｒｏ３１２ ＭＭＰ９ｃｌ（ＦＯＬＲ１ ｈ５９－３）で試験した。図４８のＣ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ５５０ ＮＣＬ（ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ ｈ５９－３）、Ｐｒｏ５５１ ＭＭＰ９（ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ ｈ５９－３）及びＰｒｏ５５１ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ ｈ５９－３）で試験した。これらの実験の結果は、ａＦＯＬＲ１（ｈ５９－３）／ａＥＧＦＲ（Ｄ１２）が、条件付きでＦＯＬＲ１とＥＧＦＲの両方を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができたことを実証した。
図４９のＡ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ６００ ＮＣＬ ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ、Ｐｒｏ２３３ ＭＭＰ９ ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ及びＰｒｏ２３３ ＭＭＰ９ｃｌ ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲで試験した。図４９のＢ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ２９９ ＮＣＬ ＦＯＬＲ１／ＦＯＬＲ１、Ｐｒｏ３１１ ＭＭＰ９ ＦＯＬＲ１／ＦＯＬＲ１及びＰｒｏ３１１ ＭＭＰ９ｃｌ ＦＯＬＲ１／ＦＯＬＲ１で試験した。図４９のＣ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ４２０ ＭＭＰ９ ＦＯＬＲ１／ＥＧＦＲ及びＰｒｏ４２０ ＭＭＰ９ｃｌ ＦＯＬＲ１／ＥＧＦＲで試験した。図４９のＤ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ４２１ ＭＭＰ９ ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１及びＰｒｏ４２１ ＭＭＰ９ｃｌ ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１で試験した。これらの実験の結果は、ａＦＯＬＲ１（ｈ７７－２またはｈ５７－３）／ａＥＧＦＲ（ｈＤ１２）が、条件付きでＦＯＬＲ１とＥＧＦＲの両方を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができたことを実証した。
ＥＧＦＲ／ＦＯＬＲ１ヘテロＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ５１形式の分子の親和性を評価し、図５０に列挙した。
実施例１３：Ｔｒｏｐ２及びＥｐＣＡＭを発現する細胞のＴＤＣＣを誘発するＴｒｏｐ２／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡ
Ｒａｊｉ－Ｔｒｏｐ２細胞（図５１のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５１のＢ）、ＳＫＯＶ３細胞（図５１のＣ）及びＨＴ２９細胞（図５１のＤ）はすべて、Ｐｒｏ５６６及びＰｒｏ５６６ｃｌで試験した。これらの実験は、Ｐｒｏ５６６ ａＥｐＣＡＭ（ｈ６６４）が、ＥｐＣＡＭを発現するようにトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞、及び条件付きでＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを実証した。
Ｒａｊｉ－Ｔｒｏｐ２細胞（図５１のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５１のＢ）、ＳＫＯＶ３細胞（図５１のＣ）及びＨＴ２９細胞（図５１のＤ）はすべて、Ｐｒｏ５６６及びＰｒｏ５６６ｃｌで試験した。これらの実験は、Ｐｒｏ５６６ ａＥｐＣＡＭ（ｈ６６４）が、ＥｐＣＡＭを発現するようにトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞、及び条件付きでＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを実証した。
Ｒａｊｉ－Ｔｒｏｐ２細胞（図５２のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５２のＢ）、ＳＫＯＶ３細胞（図５２のＣ）及びＨＴ９細胞（図５２のＤ）はすべて、Ｐｒｏ６７７及び開裂された Ｐｒｏ６７７（Ｐｒｏ６７７ｃｌ）で試験した。これらの実験は、Ｐｒｏ６７７（ａＴｒｏｐ２ ｈ５５７）が、Ｔｒｏｐ２を発現するようにトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞、及び条件付きでＴｒｏｐ２を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを実証した。
Ｒａｊｉ－Ｔｒｏｐ２細胞（図５３のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５３のＢ）、ＳＫＯＶ３細胞（図５３のＣ）及びＨＴ２９細胞（図５３のＤ）はすべて、Ｐｒｏ８２４及び開裂されたＰｒｏ８２４（Ｐｒｏ８２４ｃｌ）で試験した。これらの実験は、Ｐｒｏ８２４（ａＥｐＣＡＭ ｈ６６４／ａＴｒｏｐ２ ｈ５５７）が、ＥｐＣＡＭまたはＴｒｏｐ２のいずれかを発現するようにトランスフェクトされたＲａｊｉ、及びＥｐＣＡＭとＴｒｏｐ２の両方を条件付きで発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを実証した。
Ｒａｊｉ－Ｔｒｏｐ２細胞（図５４のＡ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５４のＢ）、ＳＫＯＶ３細胞（図５４のＣ）及びＨＴ２９細胞（図５４のＤ）はすべて、Ｐｒｏ８２６及び開裂されたＰｒｏ８２６（Ｐｒｏ８２６ｃｌ）で試験した。これらの実験は、Ｐｒｏ８２６（ａＴＲＯＰ２ ｈ５５７／ａＥｐＣＡＭ ｈ６６４）が、Ｔｒｏｐ２またはＥｐＣＡＭのいずれかを発現するようにトランスフェクトされたＲａｊｉ、及びＴｒｏｐ２とＥｐＣＡＭの両方を条件付きで発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを実証した。
図５５のＡ：ＢＸＰＣ３細胞（ヒト膵臓癌細胞株）をＰｒｏ５６９、Ｐｒｏ５６６及びＰｒｏ５６６ｃｌで試験した。図５５のＢ：ＢＸＰＣ３細胞をＰｒｏ６８１、Ｐｒｏ６７７及びＰｒｏ６７７ｃｌで試験した。図５５のＣ：ＢＸＰＣ３細胞をＰｒｏ８２５、Ｐｒｏ８２４及びＰｒｏ８２４ｃｌで試験した。図５５のＤ：ＢＸＰＣ３細胞をＰｒｏ８２７、Ｐｒｏ８２６及びＰｒｏ８２６ｃｌで試験した。これらの実験は、ＥｐＣＡＭ単一特異性ＣＯＢＲＡ、Ｔｒｏｐ２単一特異性ＣＯＢＲＡ及びＴｒｏｐ２／ＥｐＣＡＭヘテロ特異性ＣＯＢＲＡはすべて、条件付きでＢＸＰＣ３細胞を殺傷するのにうまく機能することを実証した。
図５６のＡ：ＨＣＴ１１６細胞（ヒト結腸癌細胞株）をＰｒｏ５６９、Ｐｒｏ５６６及びＰｒｏ５６６ｃｌで試験した。図５６のＢ：ＨＣＴ１１６細胞をＰｒｏ６８１ ＮＣＬ、Ｐｒｏ６７７ ＭＭＰ９及びＰｒｏ６７７ ＭＭＰ９ｃｌで試験した。図５６のＣ：ＨＣＴ１１６細胞をＰｒｏ８２５、Ｐｒｏ８２４及びＰｒｏ８２４ｃｌで試験した。図５６のＤ：ＨＣＴ１１６細胞をＰｒｏ８２７、Ｐｒｏ８２６及びＰｒｏ８２６ｃｌで試験した。これらの実験は、ＥｐＣＡＭ単一特異性ＣＯＢＲＡ、Ｔｒｏｐ２単一特異性ＣＯＢＲＡ及びＴｒｏｐ２／ＥｐＣＡＭヘテロ特異性ＣＯＢＲＡはすべて、条件付きでＨＣＴ１１６細胞を殺傷するのにうまく機能することを実証した。
図５７のＡ：ＳＣＣ２５細胞（ヒト扁平上皮癌細胞株）をＰｒｏ５６９、Ｐｒｏ５６６及びＰｒｏ５６６ｃｌで試験した。図５７のＢ：ＳＣＣ２５細胞をＰｒｏ６８１、Ｐｒｏ６７７及びＰｒｏ６７７ｃｌで試験した。図５７のＣ：ＳＣＣ２５細胞をＰｒｏ８２５、Ｐｒｏ８２４及びＰｒｏ８２４ｃｌで試験した。図５７のＤ：ＳＣＣ２５細胞をＰｒｏ８２７、Ｐｒｏ８２６及びＰｒｏ８２６ｃｌで試験した。これらの実験は、ＥｐＣＡＭ単一特異性ＣＯＢＲＡ、Ｔｒｏｐ２単一特異性ＣＯＢＲＡ及びＴｒｏｐ２／ＥｐＣＡＭヘテロ特異性ＣＯＢＲＡはすべて、条件付きでＳＣＣ２５細胞を殺傷するのにうまく機能することを実証した。
実施例１４：Ｂ７Ｈ３及びＥｐＣＡＭを発現する細胞のＴＤＣＣを誘発するＢ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡ
Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡは、一方または両方の抗原を発現する細胞でＴＤＣＣを誘発することが示された。Ｒａｊｉ親細胞（図５８のＡ）、Ｒａｊｉ－Ｂ７Ｈ３細胞（図５８のＢ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５８のＣ）及びＲａｊｉ－Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ細胞（図５８のＤ）を、単一特異性ＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ２２５（Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）で、及びヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ）とＰｒｏ６５８（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３）で試験した。
Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡは、一方または両方の抗原を発現する細胞でＴＤＣＣを誘発することが示された。Ｒａｊｉ親細胞（図５８のＡ）、Ｒａｊｉ－Ｂ７Ｈ３細胞（図５８のＢ）、Ｒａｊｉ－ＥｐＣＡＭ細胞（図５８のＣ）及びＲａｊｉ－Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ細胞（図５８のＤ）を、単一特異性ＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ２２５（Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）で、及びヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ）とＰｒｏ６５８（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３）で試験した。
実験はＣＲＩＳＰＲノックアウト株で行った。ＨＴ２９細胞（図５９のＡ）、ＨＴ２９－Ｂ７Ｈ３ ＫＯ細胞（図５９のＢ）、ＨＴ２９－ＥｐＣＡＭ ＫＯ細胞（図５９のＣ）及びＨＴ２９－Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ＫＯ細胞（図５９のＤ）はすべて、単一特異性ＣＯＢＲＡ： Ｐｒｏ２２５ Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３とＰｒｏ５６６ ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭで、及びヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６ Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭで試験した。すべてのＣＯＢＲＡは事前に開裂されていた。
図６０のＡ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ２９５ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）、Ｐｒｏ２２５ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）及びＰｒｏ２２５ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）で試験した。図６０のＢ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ５６８ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）、Ｐｒｏ５６５ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）及びＰｒｏ５６５ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）で試験した。図６０のＣ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ６５９ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７／ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）、Ｐｒｏ６５５ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７／ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）及びＰｒｏ６５５ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７／ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）で試験した。図６０のＤ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ６６１ ＮＣ （ＥｐＣＡＭ ｈ６６４／Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）、Ｐｒｏ６５７ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４／Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）及びＰｒｏ６５７ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４／Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）で試験した。結果は、ａＥｐＣＡＭ（ａＥｐＣＡＭｈ６６４）／ａＢ７Ｈ３（ａＢ７Ｈ３ ｈＦ７）ヘテロＣＯＢＲＡが、条件付きでＥｐＣＡＭとＢ７Ｈ３の両方を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを示した。
図６１のＡ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ２９５ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）、Ｐｒｏ２２５ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）及びＰｒｏ２２５ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）で試験した。図６１のＢ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ５６９ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）、Ｐｒｏ５６６ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）及びＰｒｏ５６６ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）で試験した。図６１のＣ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ６６０ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）、Ｐｒｏ６５６ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）及びＰｒｏ６５６ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）で試験した 。図６１のＤ：ＩＧＲＯＶ細胞を、Ｐｒｏ６６２ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５／Ｂ７Ｈ３）、Ｐｒｏ６５８ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５／Ｂ７Ｈ３）及びＰｒｏ６５８（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５／Ｂ７Ｈ３）で試験した。結果は、ａＥｐＣＡＭ（ａＥｐＣＡＭｈ６６５）／ａＢ７Ｈ３（ａＢ７Ｈ３ ｈＦ７）が、条件付きでＥｐＣＡＭとＢ７Ｈ３の両方を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを示した。
図６２のＡ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ２９５ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）、Ｐｒｏ２２５ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）及びＰｒｏ２２５ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）で試験した。図６２のＢ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ５６８ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）、Ｐｒｏ５６５ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）及びＰｒｏ５６５ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）で試験した。図６２のＣ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ６５９ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）、Ｐｒｏ６５５ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）及びＰｒｏ６５５ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６４）で試験した。図６２のＤ：Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ６６１ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４／Ｂ７Ｈ３）、Ｐｒｏ６５７ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４／Ｂ７Ｈ３）及びＰｒｏ６５７ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６４／Ｂ７Ｈ３）で試験した。結果は、ａＥｐＣＡＭ（ａＥｐＣＡＭｈ６６４）／ａＢ７Ｈ３（ａＢ７Ｈ３ ｈＦ７）ヘテロＣＯＢＲＡが、条件付きでＥｐＣＡＭとＢ７Ｈ３の両方を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを示した。
Ｈ２９２細胞を、Ｐｒｏ２９５ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）、Ｐｒｏ２２５ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７） 及びＰｒｏ２２５ ＭＭＰ９ｃ１（Ｂ７Ｈ３ ｈＦ７）（図６３のＡ）；Ｐｒｏ５６９ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）、Ｐｒｏ５６６ ＭＭＰ９ （ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）及びＰｒｏ５６６ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）（図６３のＢ）；Ｐｒｏ６６０ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）、Ｐｒｏ６５６ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）及びＰｒｏ６５６ ＭＭＰ９ｃｌ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ ｈ６６５）（図６３のＣ）；ならびにＰｒｏ６６２ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５／Ｂ７Ｈ３）、Ｐｒｏ６５８ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５／Ｂ７Ｈ３）及びＰｒｏ６５８ ＭＭＰ９ｃｌ（ＥｐＣＡＭ ｈ６６５／Ｂ７Ｈ３）（図６３のＤ）で試験した。結果は、ａＥｐＣＡＭ（ａＥｐＣＡＭ ｈ６６５）／ａＢ７Ｈ３（ａＢ７Ｈ３ ｈＦ７）ヘテロＣＯＢＲＡが、条件付きでＥｐＣＡＭとＢ７Ｈ３の両方を発現する腫瘍細胞株を殺傷することができることを示した。
ＨＴ２９細胞（図６４のＡ）、Ｕ８７－ＭＧ（ＥｐＣＡＭ陰性）細胞（図６４のＢ）、Ｃａｐａｎ２細胞（図６４のＣ）及びＶＣＡＰ細胞（図６４のＤ）はすべて、単一特異性ＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ２２５（Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）で、及びヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ）とＰｒｏ６５８（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３）で試験し、腫瘍細胞株に対するＴＤＣＣの効果を示した。
ＨＴ２９細胞の存在下でのＴ細胞活性化は、当業者であれば既知の標準的なＪｕｒｋａｔルシフェラーゼアッセイを使用して決定された。ＨＴ２９細胞は、単一特異性ＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ２２５（Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）及びヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ）とＰｒｏ６５８（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３）で試験した（図６５）。
Ｊｕｒｋａｔ活性化アッセイにおけるヘテロＣＯＢＲＡの活性は、ＨＴ２９細胞の単一特異性ＣＯＢＲＡよりも可溶性抗原による阻害に対する感受性が低いことが示された。細胞は、可溶性ＥｐＣＡＭ、可溶性Ｂ７Ｈ３ ４Ｉｇで、ならびに単一特異性ＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ２２５（Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３）（図６６のＡ）とＰｒｏ５６６（ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）（図６６のＢ）と共に、及びヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ）（図６６のＣ）とＰｒｏ６５８（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３）（図６６のＤ）と共に抗原なし（対照）でアッセイされた。種々の濃度の可溶性抗原の存在下で、予め開裂されたＣＯＢＲＡを各ＣＯＢＲＡにＥＣ９０で添加した。Ｊｕｒｋａｔ活性化のより強い阻害は、単一特異性ＣＯＢＲＡで検出された。
ｈｕＥｐＣＡＭを有する抗原ｈｕＢ７Ｈ３－４Ｉｇ、ｈｕＥｐＣＡＭ及びｈｕＢ７Ｈ３－４Ｉｇを、ヘテロＣＯＢＲＡ：Ｐｒｏ６５６ Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭとＰｒｏ６５８ ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３でアッセイし、図６７は、Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡの親和性のリストを示す。
Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡの薬物動態（図６８）は、ＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂがマウスＢ７Ｈ３に結合しないことを示した。２つのＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂを含むＰｒｏ５６６（Ｐｒｏ ５６６ ＥｐＣＡＭ／ＥｐＣＡＭ）は、最高の循環濃度を示した。マウスＢ７Ｈ３タンパク質及び２つのＢ７Ｈ３ ｓｄＡｂを含むＰｒｏ２２５（Ｐｒｏ２２５ Ｂ７Ｈ３／Ｂ７Ｈ３）に結合したＢ７Ｈ３ ｓｄＡｂは、組織媒介性薬物動態により、循環中の曝露が最も低かった。１つのＢ７Ｈ３ ｓｄＡＢと１つのＥｐＣＡＭ ｓｄＡｂ（Ｐｒｏ６５６ Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭとＰｒｏ６５８ ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３）は、２つの親の単一特異性ＣＯＢＲＡ間で曝露を示した。
ヘテロＣＯＢＲＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性は、マウスのＨＴ２９細胞株異種移植モデルで測定された。ヘテロＣＯＢＲＡ は次の用量：Ｐｒｏ６６０ ＮＣＬ（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ；０．３ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｒｏ６５６ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ；０．０１ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｒｏ６５６ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ；０．０３ｍｇ／ｋｇ）及びＰｒｏ６５６ ＭＭＰ９（Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭ；０．１ｍｇ／ｋｇ）で投与された。Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡはマウスで活性であった（図６９）。
追加のヘテロＣＯＢＲＡをＨＴ２９細胞株異種移植モデルで試験し、次の用量：Ｐｒｏ６６２ ＮＣＬ（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３；０．１ｍｇ／ｋｇ）及びＰｒｏ６５８ ＭＭＰ９（ＥｐＣＡＭ／Ｂ７Ｈ３；０．１ｍｇ／ｋｇ）で投与した。Ｂ７Ｈ３／ＥｐＣＡＭヘテロＣＯＢＲＡはマウスで活性であった（図７０）。
Claims (52)
- 融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、
ａ）ＨＥＲ２に結合する第１のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２）と、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、
ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）ならびに
ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインを含む制約性Ｆｖドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２と、
ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、
ｇ）ｉ）第１の疑似可変軽ドメイン、
ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）及び
ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインを含む制約性疑似Ｆｖドメインと、
ｈ）第３のドメインリンカーと、
ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）と、を含み、
ここで、前記制約性Ｆｖドメインの前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、前記制約性疑似ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、
前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の疑似可変重ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記融合タンパク質。 - 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及び／または前記第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、
ａ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、
ｃ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、
ｄ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、
ｅ）配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３、
ｆ）配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３、
ｇ）配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５２のｓｄＣＤＲ３、
ｈ）配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３、
ｉ）配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３、
ｊ）配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３、
ｋ）配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３、
ｌ）配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３、
ｍ）配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３、
ｎ）配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３、
ｏ）配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３、
ｐ）配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３、
ｑ）配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３、
ｒ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、
ｓ）配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３、
ｔ）配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３、
ｕ）配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３、
ｖ）配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３、
ｗ）配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３、
ｘ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、
ｙ）配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３、
ｚ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、
ａａ）配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３、
ａｂ）配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３、
ａｃ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、
ａｄ）配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３、
ａｅ）配列番号５００のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０２のｓｄＣＤＲ３、
ａｆ）配列番号５０４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０６のｓｄＣＤＲ３、
ａｇ）配列番号５０８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１０のｓｄＣＤＲ３、及び、
ａｈ）配列番号５１２のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセットを含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。 - 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及び／または前記第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、配列番号１９３、配列番号２１７、配列番号２２５、配列番号２３７、配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２２１、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２４１、配列番号４９９、配列番号５０３、配列番号５０７及び配列番号５１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は同じである、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は異なる、請求項１または３に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変重ドメインは前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変軽ドメインは前記疑似可変重ドメインのＮ末端にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変重ドメインは前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変重ドメインは前記疑似可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変軽ドメインは前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変軽ドメインは前記疑似可変重ドメインのＮ末端にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変軽ドメインは前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変重ドメインは前記疑似可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ＨＳＡに結合する前記第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）は、
（ａ）（ｉ）配列番号２４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４８のｓｄＣＤＲ３ならびに（ｉｉ）配列番号２５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２５２のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセット、または、
（ｂ）配列番号２４５及び配列番号２４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記開裂性リンカーは、配列番号３３９～４０８及び配列番号５３２～５３５からなる群から選択される開裂ドメイン配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリンＡ、メプリンＢ、カテプシンＳ、カプテプシンＫ、カプテシンＬ、グランザイムＢ、ｕＰＡ、カレクリエイン７、マトリプターゼ及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、配列番号４５９～４８４及び配列番号４９１～４９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項１５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- （ｉ）融合タンパク質が発現される条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収することと、を含む、前記融合タンパク質を作製する方法。
- 対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、前記方法。
- ヒトＨＥＲ２に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２）であって、前記ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、
（ｉ）配列番号１４１、配列番号１４５、配列番号１４９、配列番号１５３、配列番号１５７、配列番号１６１、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７３、配列番号１７７、配列番号１８１、配列番号１８５、配列番号１８９、配列番号１９３、配列番号１９７、配列番号２０１、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２１、配列番号２２５、配列番号２２９、配列番号２３３、配列番号２３７、配列番号２４１、配列番号４９９、配列番号５０３、配列番号５０７及び配列番号５１１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または、
（ｉｉ）ａ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、
ｃ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、
ｄ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、
ｅ）配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３、
ｆ）配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３、
ｇ）配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５２のｓｄＣＤＲ３、
ｈ）配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３、
ｉ）配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３、
ｊ）配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３、
ｋ）配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３、
ｌ）配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３、
ｍ）配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３、
ｎ）配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３、
ｏ）配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３、
ｐ）配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３、
ｑ）配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３、
ｒ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３、
ｓ）配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３、
ｔ）配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３、
ｕ）配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３、
ｖ）配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３、
ｗ）配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３、
ｘ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３、
ｙ）配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３、
ｚ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３、
ａａ）配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３、
ａｂ）配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３、
ａｃ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３、
ａｄ）配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３、
ａｅ）配列番号５００のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０２のｓｄＣＤＲ３、
ａｆ）配列番号５０４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５０６のｓｄＣＤＲ３、
ａｇ）配列番号５０８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５０９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１０のｓｄＣＤＲ３、及び、
ａｈ）配列番号５１２のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５１４のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセットを含むアミノ酸配列を含む、前記ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２。 - 融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、
ａ）腫瘍標的抗原に結合する第１のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ）と、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、
ｉｉ）制約性非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）ならびに
ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメインを含む制約性Ｆｖドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡと、
ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、
ｇ）ｉ）第１の疑似可変軽ドメイン、
ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）及び
ｉｉｉ）第１の疑似可変重ドメインを含む制約性疑似Ｆｖドメインと、
ｈ）第３のドメインリンカーと、
ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤ（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）と、を含み、
ここで、前記制約性Ｆｖドメインの前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインはヒトＣＤ３に結合することができるが、前記制約性疑似ＦｖドメインはＣＤ３に結合せず、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の疑似可変軽ドメインは分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の疑似可変重ドメインは分子内で会合して不活性なＦｖを形成し、
（１）前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２もしくはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３であり、前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択されるか、または（２）前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２もしくはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である、のいずれかである、前記融合タンパク質。 - 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡ及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはそれぞれｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＬＰＹＤ３及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＬＰＹＤ３は同じである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
- 前記第１のｓｄＡＢＤ－ＬＰＹＤ３及び前記第２のｓｄＡＢＤ－ＬＰＹＤ３は異なる、請求項２１に記載の融合タンパク質。
- （ａ）前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２であり、前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択されるか、
（ｂ）前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３であり、前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択されるか、
（ｃ）前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、前記第２のＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２であるか、または、
（ｄ）前記第１のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡは、ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３、ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９、ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲ、ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭ、ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１、ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３及びｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２からなる群から選択され、前記第２のｓｄＡＢＤ－ＴＴＡはｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３である、請求項２０に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－ＨＥＲ２は、
（ａ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｂ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｃ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｄ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｅ）配列番号１４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｆ）配列番号１４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｇ）配列番号１５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｈ）配列番号１５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１５６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｉ）配列番号１５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｊ）配列番号１６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｋ）配列番号１６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｌ）配列番号１７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｍ）配列番号１７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１７６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｎ）配列番号１７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｏ）配列番号１８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｐ）配列番号１８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１８８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｑ）配列番号１９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｒ）配列番号１９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１９６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｓ）配列番号１９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２００のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｔ）配列番号２０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｕ）配列番号２０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０３のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｖ）配列番号２１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｗ）配列番号２１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２１６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｘ）配列番号２１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｙ）配列番号２２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｚ）配列番号２２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ａａ）配列番号２３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ａｂ）配列番号２３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２３６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ａｃ）配列番号２３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、ならびに
（ａｄ）配列番号２４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ａｅ）配列番号１４１、（ａｆ）配列番号１４５、（ａｇ）配列番号１４９、（ａｈ）配列番号１５３、（ａｉ）配列番号１５７、（ａｊ）配列番号１６１、（ａｋ）配列番号１６５、（ａｌ）配列番号１６９、（ａｍ）配列番号１７３、（ａｎ）配列番号１７７、（ａｏ）配列番号１８１、（ａｐ）配列番号１８５、（ａｑ）配列番号１８９、（ａｒ）配列番号１９３、（ａｓ）配列番号１９７、（ａｔ）配列番号２０１、（ａｕ）配列番号２０５、（ａｖ）配列番号２０９、（ａｗ）配列番号２１３、（ａｘ）配列番号２１７、（ａｙ）配列番号２２１、（ａｚ）配列番号２２５、（ｂａ）配列番号２２９、（ｂｂ）配列番号２３３、（ｂｃ）配列番号２３７、ならびに（ｂｄ）配列番号２４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０または２４に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３は、
（ａ）配列番号１１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｂ）配列番号１２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｃ）配列番号１２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｄ）配列番号１３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｅ）配列番号１３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｆ）配列番号１３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、
（ｇ）配列番号１１７、（ｈ）配列番号１２１、（ｉ）配列番号１２５、（ｊ）配列番号１２９、（ｋ）配列番号１３３、ならびに（ｌ）配列番号１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－Ｂ７Ｈ３は、
（ｉ）配列番号３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号３６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号４２のｓｄＣＤＲ１、配列番号４３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号５４のｓｄＣＤＲ１、配列番号５５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号５６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉｉ）配列番号５８のｓｄＣＤＲ１、配列番号５９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｘ）配列番号３３、（ｘ）配列番号３７、（ｘｉ）配列番号４１、（ｘｉｉ）配列番号４５、（ｘｉｉｉ）配列番号４９、（ｘｉｖ）配列番号５３、ならびに（ｘｖ）配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０及び２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－ＣＡ９は、
（ｉ）配列番号１０２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１０３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１０４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号１０６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１０７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１０８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号１１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１１２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号１１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１１６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号１０１、（ｖｉ）配列番号１０５、（ｖｉｉ）配列番号１０９、ならびに（ｖｉｉｉ）配列番号１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０及び２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－ＥＧＦＲは、
（ｉ）配列番号２のｓｄＣＤＲ１、配列番号３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号６のｓｄＣＤＲ１、配列番号７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号１０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号１４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号１、（ｖｉｉ）配列番号５、（ｖｉｉｉ）配列番号９、（ｉｘ）配列番号１３、ならびに（ｘ）配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０及び２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－ＥｐＣＡＭは、
（ｉ）配列番号６２のｓｄＣＤＲ１、配列番号６３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号６６のｓｄＣＤＲ１、配列番号６７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号６８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号７０のｓｄＣＤＲ１、配列番号７１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号７２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号７４のｓｄＣＤＲ１、配列番号７５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号７６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号４９６のｓｄＣＤＲ１、配列番号４９７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号４９８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号６１、（ｖｉｉ）配列番号６５、（ｖｉｉｉ）配列番号６９、（ｉｘ）配列番号７３、ならびに（ｘ）配列番号４９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０及び２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－ＦＯＬＲ１は、
（ｉ）配列番号２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号３２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号２１、（ｖ）配列番号２５、ならびに（ｖｉ）配列番号２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０及び２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記ｓｄＡＢＤ－Ｔｒｏｐ２は、
（ｉ）配列番号７８のｓｄＣＤＲ１、配列番号７９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８０のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉ）配列番号８２のｓｄＣＤＲ１、配列番号８３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８４のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｉｉ）配列番号８６のｓｄＣＤＲ１、配列番号８７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号８８のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｉｖ）配列番号９０のｓｄＣＤＲ１、配列番号９１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号９２のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖ）配列番号９４のｓｄＣＤＲ１、配列番号９５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号９６のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉ）配列番号９８のｓｄＣＤＲ１、配列番号９９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１００のｓｄＣＤＲ３を含むＣＤＲのセット、（ｖｉｉ）配列番号７７、（ｖｉｉｉ）配列番号８１、（ｉｘ）配列番号８５、（ｘ）配列番号８９、（ｘｉ）配列番号９３、ならびに（ｘｉｉ）配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０及び２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。 - 前記第１の可変重ドメインは前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変軽ドメインは前記疑似可変重ドメインのＮ末端にある、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変重ドメインは前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変重ドメインは前記疑似可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変軽ドメインは前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変軽ドメインは前記疑似可変重ドメインのＮ末端にある、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第１の可変軽ドメインは前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記疑似可変重ドメインは前記疑似可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- ＨＳＡに結合する前記第３のｓｄＡＢＤは、（ａ）（ｉ）配列番号２４６のｓｄＣＤＲ１、配列番号２４７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２４８のｓｄＣＤＲ３ならびに（ｉｉ）配列番号２５０のｓｄＣＤＲ１、配列番号２５１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号２５２のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセット、または（ｂ）配列番号２４５及び配列番号２４９からなる群から選択されるアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する、請求項２０～３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記開裂性リンカーは、配列番号３３９～４０８及び配列番号５３２～５３５からなる群から選択される開裂ドメイン配列を含む、請求項２０～３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記開裂性リンカーは、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、メプリンＡ、メプリンＢ、カテプシンＳ、カプテプシンＫ、カプテシンＬ、グランザイムＢ、ｕＰＡ、カレクリエイン７、マトリプターゼ及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号４５３、配列番号４５４、配列番号４５５、配列番号４５６、配列番号４５７及び配列番号４５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項２０～４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
- 請求項４１に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項４２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- （ｉ）融合タンパク質が発現される条件下で請求項４３に記載の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）前記融合タンパク質を回収することと、を含む、前記融合タンパク質を作製する方法。
- （ｉ）配列番号１１７、配列番号１２１、配列番号１２５、配列番号１２９、配列番号１３３及び配列番号１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または（ｉｉ）（ａ）配列番号１１８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１１９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２０のｓｄＣＤＲ３、（ｂ）配列番号１２２のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２３のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２４のｓｄＣＤＲ３、（ｃ）配列番号１２６のｓｄＣＤＲ１、配列番号１２７のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１２８のｓｄＣＤＲ３、（ｄ）配列番号１３０のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３１のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３２のｓｄＣＤＲ３、（ｅ）配列番号１３４のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３５のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１３６のｓｄＣＤＲ３、ならびに（ｆ）配列番号１３８のｓｄＣＤＲ１、配列番号１３９のｓｄＣＤＲ２及び配列番号１４０のｓｄＣＤＲ３からなる群から選択されるＣＤＲのセットを含むアミノ酸配列を含む、ヒトＬｙＰＤ３と結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ－ＬｙＰＤ３）。
- 請求項１９または４５に記載の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）をコードする核酸。
- 請求項４６に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- （ａ）単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）が発現される条件下で請求項４８に記載の宿主細胞を培養することと、（ｂ）前記ｓｄＡＢＤを回収することとを含む、前記単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）を作製する方法。
- 請求項１～１３及び２０～４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項１９もしくは４５に記載の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）を含む医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体または賦形剤を更に含む、請求項５０に記載の医薬組成物。
- 請求項１～１３及び２０～４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１９もしくは４５に記載の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）、または請求項５０もしくは５１に記載の医薬組成物を投与することを含む、対象のがんを治療する方法。
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