HUT55445A - Process for producing hibride monoclonal antibodies - Google Patents
Process for producing hibride monoclonal antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- HUT55445A HUT55445A HU895091A HU509189A HUT55445A HU T55445 A HUT55445 A HU T55445A HU 895091 A HU895091 A HU 895091A HU 509189 A HU509189 A HU 509189A HU T55445 A HUT55445 A HU T55445A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- fibrin
- producing
- hybridoma
- protease
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6815—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
- A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
A találmány tárgya hibrid monoklonális antitest. Pontosabban a jelen találmány tárgya olyan hibrid monoklonális antitest (a továbbiakban egyszerűen csak hibrid MoAb néven említjük), amely két specifitassa! rendelkezik, fibrin és trombolitikus anyagokkal szemben, valamint az említett antitestet termeld polidoma.
A jelen találmány tárgya továbbá a fenti hibrid MoAb-ot és immunológiailag hozzákapcsolt trombolitikus hatóanyagot tartalmazó trombolitikus ágens.
A trombolitikus terápiát régen alkalmazzák trombotikus megbetegedések, úgymint szívinfarktus, artériás embólia és agyinfarktus kezelésére; először a sztreptokinázt (a továbbiakban a rövidítése GK), urokinázt (a továbbiakban a rövidítése UK), stb. használtak a klinikai gyakorlatban hatékony trombolitikus anyagokként. Különösen az UK--t használták viszonylag gyakran, mivel a fibrinolítikus aktivitása erős; a probléma vele az, hogy viszonylag kevéssé szelektív a fibrinre, és íj fibrinogénre is hat, ezért egyes betegekben vérzésre való hajlamot okoz. Ennek a hátránynak a fényében a szöveti plazminogén aktivátort (a továbbiakban a rövidítése TPA) és a prourokinázt (a továbbiakban a rövidítése ProUK) használták második generációs trombolitikus anyagokként. Mivel az UK-hoz viszonyítva nagyobb szelektivitással rendelkeznek a fibrinhez, ezért ezektől az anyagoktól várták, hogy kisebb káros hatással, azaz a vérzésre való csekélyebb hajlamosífással rendelkeznek mint az UK; eddig számos vizsgálatot végeztek. Az utóbbi években növekvő számú kísérletet, tettek arra, hogy ezeket az anyagokat klinikai helyzetben felhasználják, mivel nagymennyiségben való előállításuk a rekombináns DNS technológia alkalmazásával lehetővé vált [European Cooperative Study Group fór Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator: The Láncét, 842 (1985)1.
Ezek a próbálkozások a klinikai alkalmazásra azonban felfedték, hogy a TPA és a többi anyag is rendelkezik hátrányokkal; például
1) a TPA felezési ideje nagyon rövid (2-3 perc), ezért a trombolízishez nagy mennyiségnek hosszabb ideig való alkalmazása szükséges, és
2) az ilyan magas dózisú terápia nem mindig adja azt az eredményt, hogy csökken a vérzésre való hajlam.
Ilyen körülmények között hatékonyabb trombolítikus anyagokat vizsgáltak és fejlesztettek ki; módosított. TPA-t, UK-TPA vagy ProUK-TPA hibrid fehérjéket, stb. állítottak elő. Ami a módosított TPA-t illeti, géntechnológiai módszerekkel egy olyan TPA muteint állítottak elő, amelyről hiányzik a cukor-lánc egy része, amit a felezési idő csökkenése okának tekintenek, így a hepatocita cukor-lánc receptorok nem kötik meg a a TPA-t, ezzel megjavítják a TPA kinetikáját a vérben. Ami az UK-TPA hibrid fehérjét illeti, az UK erős trombolítikus hatását és a TPA erős fibrin affinitását kombinálják, hogy csökkentsék a beadandó mennyiséget. Jóllehet ezekről a trombolítikus anyagokról feltételezik, hogy enyhén csökkentik a vérzésre való hajlamot a konvencionális trombolítikus anyagokhoz viszonyítva, a jelentős előrehaladáshoz további kutatásra és fejlesztésre van szükség. A későbbiekben az antitest irányítású fehérje-komplexek jelentek meg mint harmadik generációs trombolítikus anyagok. Azaz olyan trombolítikus anyagokat fejlesztettek ki, amelyek csak a »
« fibrint lizálják anélkül hogy a fibrinogént lizálnák, olymódon, hogy egy antitestet, amely nem reagál a fibrinogénnel, affinitással rendelkezik a fibrinhez kémiai módszerekkel az
UK--hoz kötik [C.Bode et al , Science
22Ώ, 765 (1985)] vagy a
Proceedings of the National Acadtemy of
Science, USA, ÜLI, 7659 (1987)]. Ezekről trombo.litikus anyagok mindegyikéről azt jelentették, hogy in vitro és in vivő kísérletekben egyaránt
3-100-szór erősebb hatással rendelkeznek mint az UK vagy
TPA egyedül.
fehérje-komp 1.exek azonban és a trombolitikus enzim között létrehozott kémiai kötés miatt bizonyos hátrányokkal rendelkeznek;
pé lilául a kémiai kötés kialakítása során az antitest aktivitása és az
2) arányú fehérje komplexet létrehozni, vagy
3) a fehérje denaturálása felgyorsítja az anyag metabolizálódását a beteg szervezetében.
AZ ABRAK RÖVID LEIKASA
Az 1. ábrán az anti-TPA specifikus 1-41 TPA antitest és a 2. referencia példában (lásd 2. példa) leírt EIA eljárással készült
1- 70 TPA higítási görbéjét láthatjuk.
A 2. ábrán az anti-UK specifikus UK 1-3 antitest és a 3. referencia példában (lásd 3. példa) leírt EIA eljárással készített UK 1-87 higítási görbéjét láthatjuk.
A 3. ábrán a 8. referencia példában (lásd 4. példa) leírt EIA eljárással készült anti-TPA-anti-humán-fibrin bispecifikus FT
2- 14 antitest higítási görbéjét, látjuk.
-4Α 4. ábrán a 9. referencia példában (lásd 5. példa) leírt EIA eljárással készült FU 1-74 anti-UK-anti· humán-fibrin bispecifikus antitest higítási görbéjét látjuk.
Az 5. ábrán a 4-(3) példa szerint előállított, fibrinnel kapcsolt papirkoronghoz kötődő FT 2-14 bispecifikus antitest mennyiségét láthatjuk. Az 5. ábrán jelzi a fibrinogén (3 mg/ml) jelenlétében kapott eredményeket; O jelzi a fibrin jelenléte nélkül kapott eredményeket, (lásd 6. példa).
A 6. ábrán A TPA-ból és a 4-(3) példában előállított bispecifikus FT 2-14 antitest-bői álló immunokomplex enzim-aktivitásának (·) és a TPA (lásd 7. példa) (o) enzimaktivitásának összehasonlítását látjuk,
A 7. ábrán a TPA fibrinolitikus képességét látjuk olyan fibrinnel kapcsolt. Cellulofine szemcséken amelyeket a 4-(3) példa szerint előállított bispecifikus FT 2-14 antitesttel előkezeltünk (TPA/FT 2-14), valamint kezeletlen fibrinhez kötött Cellulofine szemcséken (TPA) (lásd 8. példa).
A 8. ábrán az UK valamint az UK és az 5-(3) példátlan (lásd 9. példa) előállított bispecifikus FU 1-74 bispecifikus antitest immunokomplexének fibrinolítikus képességét látjuk. 1
A 9. ábrán az akkor kapott fibrinolitikus kapacitást látjuk, ha a TPA-t egyedül használjuk, vagy együtt a TPA-t és az FT
2-14-ef a 4-(3) példában előállított bispecifikus antitestet (o) és az úgy kapott fibrinolitikus kapacitást, ha az UK-t· egyedül használjuk, vagy együtt az UK-t és az 5-(3) példa szerint (lásd
10. példa) előállított FU 1-74 bispecifikus antitestet (·).
A 10. ábrán a TPA trombolitikus aktivitásának FT 2-14-gyel, a 4-(3) példában előállított bispecifikus antitestté] való javulását látjuk nyúl nyaki ér trombus modellen (lásd 11. példa).
• · • · ·· ···« • · · · · · • · · · · · · ··· • ····· · · ·
A 11. ábrán az FU 2-16 egér hibrid hibridóma tenyészet felíllúszójának hígítóéi görbéjét látjuk. A sejtek anti-UK anti-humán-fibrin bispecifikus antitestet termelnek, amelyet a
13. példa szerint állítunk elő (lásd 13. példa).
A 12. ábrán az UK 1-3, 1-87 és 1-6 higítási görbéjét látjuk, amelyeket a 3. és 10. referencia példa szerint, (lásd 3, 12 és 14 példák) állítunk elő. A 12(A) példa az UK reaktivitását mutatja; a 12(B) példa az alacsony molekulatömegü UK reaktivitását mutatja.
A 13. ábrán az UK 1-3, 1-87 és 1-6 anti-UK monoklonális antitestek enzim-aktivitást gátló görbéit látjuk, amelyeket a 11 referencia példában (lásd 3., 12. és 15. példa) leírt UK enzimaktivitás semlegesítő teszttel kapunk.
RÉSZLETES LEÍRÁS
Azzal a céllal, hogy a fenti, az in vivő metabolizmushoz, fibrin affinitáshoz, trombolitikus aktivitáshoz, stb. kapcsolódó problémákat megoldják, és figyelembe véve az újonnan kifejlesztett bispecifikus hibrid monoklonális antitest technikát, a feltalálók olyan immunokomplexet állítottak elő, amelyben a bispecifikus hibrid monoklonális antitest és a trombolitikus anyag 1:1 arányban van, mentes az antitest aktivitás és trombolltikus aktivitás leromlásától, olymódon, hogy immunológiailag kapcsolták a trombolitikus anyagot a bispecifikus hibrid monoklonális antitesthez, így egy káros hatástól mentes fibrin-specifikus trombolitikus anyagot fejlesztettek ki. Tehát a jelen találmány tárgya olyan bispecifikus hibrid MoAb, amelynek a két. cpecifitása egyrészt a fibrin, másrészt a trombolitikus anyag ellen irányul, valamint az antitestet termelő po1 idoma.
A találmány tárgya továbbá trombolitikus ágens, amely az említett bispecifikus monoklonális antitestet és egy hozzá immunológiai módszerekkel kapcsolt trombolitikus anyagot tartalmaz.
Bármely anti-fibrin antitestet termelő hibridóma használható a jelen találmány céljaira, mindaddig amíg olyan fibrin specifikus MoAb-t termel, amely lényegében nem kapcsolódik a fibrinogénhez. Ilyen fibrin-specifikus antitestet például úgy állíthatunk elő, hogy immunogén ágensként a fibrin fibrinolízisböl származó a--lánc N-terminális fragment peptidjét használjuk, vagy a jó-lánc N-terminális fragment peptidjét [K.Y. Hűi et al., Science, 222, 1129 (1983); vagy a még nem vizsgált japán szabadalmi publikációt, No. 93800/1988]. Jóllehet bármely fibrin elfogadható mindaddig amíg állati eredetű, a humán fibrint részesítjük előnyben; különösen előnyös a humán fibrin 13 lánca N-terminális részének használata. Az így kapott fibrin-specifikus antitestet hordozó-fehérjéhez kötjük, majd egy állatot immunizálunk vele (például nyulat, patkányt, egeret, aranyhörcsögöt), így kapunk antitest-termelő sejteket. Az antitest-termelő sejteket, úgymint a splenocitákat vagy a nyirokcsomó sejteket ezután kinyerjük az immunizált állatból és mielóma sejtekkel fúziónáltatjuk. Az így kapott hibridóma sejteket átvizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e olyan antitestet termelő sejteket, amelyek lényegében nem reagálnak a fibrinogénnel és specifikusan kötődnek fibrinhez. Előnyös, ha a humán fibrin 13-lánc N-terminális peptidje a következő aminosav-, szekvenciával rendelkezik:
···· • · · · · · • · · ··· · ··· ······ ·· · « • · · · ·· · ··
H-Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys-R-Gys-OH ahol R jelentése egy Lys-Arg-Glu-Glu összetételű peptid, vagy annak egy része. A C-terminális Cys-t használjuk, linkerként a hordozó fehérjével való kémiai kapcsolat létrehozásánál. Tehát lehetséges a peptidet kémiailag a hordozó fehérjéhez kötni a peptid C--terminális Cys aminosava SH csoportján keresztül, előzőleg a hordozó fehérje maleinimid származékát állítva elő N- (j--maleimidobutiril--oxiszukcinimid) -dél (a továbbiakban GMBSnek rövidítjük), vagy a hordozó fehérje dihidropiridil-származékát állítva elő N-szukcinimid.il-3-(2-piridiltio)-prop.ionáttal (a továbbiakban tíPDP-nek rövidítjük).
Bármely trombolitikus anyagot használhatjuk a jelen találmány céljaira, mindaddig amíg a fehérje képes a trombolisisre, vagy elősegíti a trombolízist. Az ilyen anyagok közé tartoznak például a proteázok vagy prekurzoraik és a trornbolizis promoterek (például a TPA, UK, ProUK, SK, tripszin, plazmin, protein C, protein S). Előnyös a proteázok használata; a TPA, UK, stb. különösen előnyösek. Az nem számit, hogy a TPA egy vagy kétláncú. Ami az UK-t illeti, egy vagy kétláncú alacsony molekulatömegü UK, ProUK, stb. [E.Haber et al. , Science, 2_4H, 51 (1989)] használható. Az antitestet termelő hibridómák előállításánál az a módszer használható, amely során egy állatot immunizálunk az említett fehérjével a standard módszerek alkalmazásával., majd a kapott antitest-termelő sejteket mielóma sejtekkel vagy más sejtekkel fuzionálhatjuk. Az antitest-termelő hibridómák előállításánál előnyös az olyan antitest-termelő sejtek használata, amelyeket állatok alacsony molekulatömegü UK-val való immunizálásával állítottunk elő. Ugyanazt a módszert, mint amit
az anti-fibrin-antitestet termelő hibridómák előállításánál használtunk, azaz az állatok immunizálását követően a kapott antitest-termelő sejteket mielóma sejtekkel vagy más sejtekkel fuzionáltatjük, használhatjuk a trombolítikus anyagokkal szembeni antitestet termelő hibridómák előállítására.
A használt állat lehet például nyúl, patkány, egér és aranyhörcsög. A MoAb előállításánál különösen előnyős az egerek alkalmazása. Az oltást a szokásos módszerekkel végezhetjük; például 1-100 ug, előnyösen 10-25 ug immunogén fehérjét, azonos mennyiségű (0.1 ml) fiziológiás sóoldat és komplett Freund adjuváns elegyében szuszpendálva bőr alá vagy intraperit.oneálisan inokuláljuk a hátba vagy a hasba 2-3 héten át 3-6 alkalommal.
Ezekből az immunizált állatokból, például egerekből, olyan egyebeket szelektálunk amelyek magas antitest titerrel rendelkeznek; a lépeket és/vagy a nyirokcsomókat a végső immunizálás után
3-5 nappal összegyűjtjük; a bennük levő antitest-termelő sejteket mielóma sejtekkel fúzionáltatjuk. A fúziót ismert módszerekkel hajthatjuk végre. Λ fuzogén anyagok közé tartozik például a polietilén-glikol (a továbbiakban PEG- nek rövidítjük) és a Sendai vírus. A PEG használata az előnyös. A használható mielóma sejtek közé tartozik például, az NS-1, P3U1 és az SP2/0; a P3U1 használata az előnyős. Az arány például a splenociták és a mielóma sejtek között 1-10 az előbbi és 1 az utóbbi között. Javasolt, hogy a reakcióelegyhez 1000-6000 molekulatömegü PEG-et. adjunk 10- 80% koncentrációban, és az inkubálást 20-37eC-on végezzük, előnyösen 30-37C-on 3-10 percig.
Különböző módszerek használhatók az anti-fibrin-antitestet termelő hibridómák átvizsgálására. Például a fibrinogén mikrotiber lemezre való adszorpciója után a fibrinogén trombin ·« ···· ·« hatására fibrinné alakul át. Ezután egy hibridóma tenyészet felülúszóját adjuk a fibrin-immobilizált mikrotiter lemezekhez feleslegben levő fibrinogén jelenlétében, majd enzim immunesszével (rövidítése a továbbiakban ElA) meghatározzuk az antitest titert a tenyészet felülúszójában a lemezhez kötött anti-fibrin specifikus antitesttel szemben. Az antitest titerre pozitívnak talált hibridómákat kiválasztjuk és elszaporltjuk HAT-tal (hipoxantin-aminopterin-tiinidin) kiegészített táptalajon, majd azonnal tovább klónozzuk, ami egyszerűen,pl.
határhigifással, stb. érhető el. A keresett monoklonális anti-fibrin-specifikus antitesteket termelő hibridómákat úgy kaphatjuk meg, hogy a fenti módszerrel meghatározzuk a klónozott hibridóma antitest titerét, és kiválasztjuk azt a hibridómát, amely stabilan termeli az antitestet nagy mennyiségben.
A fenti módszerrel előállított anti-fibrin-antitestet termelő hibridómák közé tartozik például a FIB 1-11 és a FIB 2-11, mindegyiket az alábbiakban ismertetett 1. példában írjuk le.
Egy trombolitikus anyag elleni antitestet termelő hibridóma szelekcióját könnyen elvégezhetjük EIA-val, olyan mikrotiter lemezt használva, amelyre adszorbeáltuk a trombolitikus anyagot. A klónozást a fentiekben leírt standard módszerekkel végezhetjük a keresett antitest-termelő hibridóma előállítására.
A fenti módszerrel előállított anti-TPA-antitestet termelő hibridómák közé tartozik például a TPA 1-41, TPA 1-70 és a TPA
2-14, amelyeket az alábbi, 2. példában írunk le. Az anti-UK antitestet termelő hibridóma sejtek közé tartozik például az UK.
1-3 és az UK 1-87, ezeket a 3. példában írjuk le, valamint a 12. példában leírt UK 1.....6.
«
Ismert néhány módszer a találmány szerinti bispecifikus hibrid MoAb-ot termelő polidóma előállítására [például Hiroshi Aramoto et al.. Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 33, 217 (1988)]. Jóllehet ezek közül a módszerek közül bármelyiket használhatjuk, a következőket említhetjük meg:
1) az a módszer, amely során a trombolitikus anyag elleni antitestet termelő fenti HAT--rezisztens hibridómát. lépésenként olyan táptalajhoz szoktatjuk, amely 5-bróm -dezoxi-uridint tartalmaz (a továbbiakban BrdU-nak rövidítjük), ezt követően a timidin-kináz deficiens törzset klónozzuk, hogy HAT érzékennyé tegyük; hasonlóan, egy HAT rezisztens, anti-fibrin-
-- specifikus antitestet termelő hibridómát 8-azaguaninra teszünk rezisztenssé (a továbbiakban AZG-nek rövidítjük), ezt követően egy h i pox a n t i n - gu an i n - f o s z f o r 1 b o z i 1 -1 r a η o f e r a z törzset klónozunk, így tesszük HAT-ra érzékennyé; ezt a két klónozott hibridómát az ismert módszerekkel fúzióra I tatva kapott tetraómákat vizsgáljuk át HAT-·tál kiegészített táptalajt használva, olyan tetraómát keresve, amely olyan hibrid MoAb-ot termel, amely képes mind a fibrinhez, mind a trombolitikus anyaghoz kapcsolódni, majd ezt klónozzuk; ezután
2) az a módszer, amely során egy anti-fibrin- , specifikus antitestet termelő hibridómát fluoreszcein-izotiocianáttal jelölünk (a továbbiakban FITC-nek rövidítjük), majd egy ♦ · · · ·* ·
-n•♦ · · ··· · • · * ··· • ·♦· · ·· ♦ · · · ·· * <
másik hibridómát, amely trombolitikus anyaggal szembeni antitestet termel, tetrametil-rodamin-izotiocianáttal jelölünk (a továbbiakban TKITC-nek rövidítjük), ezt kővetően ezt a két hibridómát standard módszerekkel fúzionáltatjuk; a kapott sejt-szusspenziót egy fluoreszceinnel aktivá 11 sejt-osztályozó berendezésbe juttatjuk (a továbbiakban FACS.....nak rövidítjük). hogy kiválasszuk és klónozzuk azt a tetraomát, amely mind, a FITC zöld fluoreszcenciájával, mind a TRITC vörös fluoreszcenciájával rendelkezik. A markereket fordítva is használhatjuk a két szülő törzsnél a tetraoma szelektálására és klónozására.
Az ezeket az eljárásokat használó sejt-fúzióban használhatunk egy fuzogén ágenst, például Sendai vírust vagy PEG-et, elektromos stimulálást, vagy más módszereket. Előnyős a PEG használata. Az alábbiakban ismertetünk egy példát, de ez nem tekinthető korlátozó jellegűnek. Körülbelül .1000-6000-es molekulatőmegü PEG-et használunk általában körülbelül 10-80 százalékos koncentrációban, körülbelül 0.5-30 perces kezelési idővel. Hatékony fúzió érhető el előnyös körülmények között, például ha a PEG 6000-et 35--55 %-os koncentrációban tartjuk kontaktusban a sejtekkel 370C-on körülbelül 4-10 percig.
A polidoma szelekciót az előzőkben említett HAT--tál kiegészített táptalajjal, stb. érhetjük el. Ebből, a célból kémiai akklimatizálást végzünk 8-AZG-vel, 6-tioguaninnal (6-TG) vagy
5-Brdü-nal, hogy az adott vegyszerekre rezisztens törzseket kapjunk. Különböző szelekciós táptalajokat használhatunk, ha a ♦ · ·· ···» ·· ·· · · « · • · · ♦ ·· · ·«« • «···· « « 4 *· · · ·· ♦ ·» fúzionált sejtekbe új markereket juttatunk be. Az ilyen szelekciós táptalajra példa lehet a neomicinnel kiegészített táptalaj, valamint a higromicin B-vei kiegészített táptalaj [B.Sugden et al. , Molecular and Cellular Biology,£>, 4.10 (1985)].
Másik módszer is használható, amely során két különböző fluoreszcens festékkel jelzett két hibridomát fuzionálhatunk, majd ezt követően a kétszeresen jelzett hibrid hibridómákat FACS-szal szelektáljuk [L.Karawajew et al., Journal of Immunological Methods, llü, 265 (1987)].
Különböző módszerek használhatók a hibrid antitesteket termelő polidómák kiszűrésére. Például lehetséges a kővetkező módszerek vagy módosításuk alkalmazása a megfelelő kombinációban:
1) az előzőkben említett ElA eljárások kombinációinak alkalmazása anti-fibrin-specifikus antitestet termelő hibridómák és troinbolitikus anyaggal szemben antitestet termelő hibridómák kiválasztására,
2) EIA a bispecifikus hibrid antitest detektálására, olymódon, hogy a kiválasztott tenyészet felüiúszóját fibrinnel borított mikrotiter lemezhez adjuk, majd egy HRP-vel jelzett troinbolitikus anyagot adunk hozzá, és ha a troinbolitikus anyaggal özemben olyan antitestet használunk, amely az anti-fibrinspecifikus antitesttől eltérő alosztályhoz tartozik,
3) EIA a bispecifikus antitest detektálására, olymódon, hogy a kiválasztott tenyészet ·· ···· 99 • 9 9 • ··· · • · · ·
999
999 ·
• · felülúszőját fibrinnnel. borított mikrotiter lemezhez adjuk, majd a HRP-vel jelzett an t i - e gé r-1 gG- a 1 o sz t á ly specifikus antitestet adjuk hozzá.
A hibrid antitest aktivitás szempontjából pozitívnak talált polidőmákat azonnal klónozzuk, amit általában határhigításős analízissel, stb. érhetünk el. A keresett monoklonális hibrid antitestet termelő polidómát úgy állíthatjuk elő, hogy a fenti módszerrel meghatározzuk a klónozott polidóma tenyészet felülúszójának az antitest titerét, és egy olyan polidómát választunk, amely stabilan termeli magas titőrrel az antitestet.
A jelen találmány szerinti, előzőkben említett polidomát egyszerűen tenyészthetjük folyadék táptalajon, vagy állatok hasüregében (például emlősök, úgymint egér) ismert módszerekkel. Ismert biokémiai technikákat kombinálhatunk a tenyészlében és aszcitesz folyadékban levő antitest tisztítására. Például a sejttenyészetet vagy aszcitesz folyadékot lecentrifugáljuk; a kapott felülúszót kisózásnak vetjük alá (rendszerint ammónium-szulfátot vagy nátrium-szulfátot használunk). A kapott fehérje-csapadékot megfelelő oldatban oldjuk és dializáljuk, ezt kővetően oszlopkromatografáljuk (ioncserélő oszlop, gélfiltrációs oszlop, protein A oszlop, hidroxi-apatit oszlop, stb.), hogy a kívánt antitestet elválasszuk és megtisztítsuk. Ezzel a tisztítási eljárással körülbelül 1.-5 mg hibrid MoAb-ot kapunk 1 liter tenyészet felülúszóból, fehérjére számítva 80%-os tisztaságban. Ugyanezt az antitestet 3-10 mg mennyiségben állíthatjuk elő 20 ml aszcitesz folyadékból.
Az igy kapott MoAb egy homogén fehérje; proteázzal vagy mással (például pepszinnel) kezelve, olyan F(ab')2 vagy más
-14fragmentet kapunk, amely képes mind a fibrint mind a trombolítikus anyagot megkötni, amelyeket mind ugynarra a célra lehet használni, mint a jelen találmány szerinti MoAb-ot.
A fenti előállítási módszerrel készített hibrid antitest-termelő polidómák közé tartoznak például a 4., 5. és 13. példában leírt tetraómák.
Egy anti-fibriη-MoAb-ot termelő hibridóma és egy másik, trombolítikus anyag elleni antitestet termelő hibridóma között létrejövő tetraómák mellett, amelyeket az előzőkben a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-okra példaként említettünk, olyan triómák is használhatók, amelyek egy MoAb-ot termc?lö hibridóma és egy másik MoAb-ot termelő sejt között jönnek létre, hibridőmák kaphatók úgy, hogy Epstein-Barr vírussal immortalizált, megfelelő MoAb-ot termelő sejteket és más hibridóniákat fúziónál tatunk ugyanezzel a céllal, mindaddig, amíg a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-ot termelnek.
Ha ezek a polidómák egér IgG MoAb-ot termelnek, lehetséges egér-humán kiméra antitestek előállítása olyan DNS segítségével, amely a bispecifikus hibrid MoAb antigén-felismerő helyét tartalmazó hiper-variábilis régiónak egy változatát kódolja, majd gén-manipulációs technikával egy olyan gént kapcsolunk ehhez a DNS-hez, amely a humán IgG konstans régióját kódolja [Z.Steplewski et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, fíh, 4852 (1988)]. Előnyösen ezt a kiméra antitestet használjuk a humán terápiában alacsony antigenicitása miatt.
Ismert néhány módszer a trombolítikus terápiában amely a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-ot vagy olyan szelektív trombolítikus protein komplexet használ, amelyet egy trombolí.tikus anyagból, és a bispecifikus hibrid MoAb-ból
-15• · r ··· • e ·♦·· ·»·· ·» • · · ··· 9 ··« • · · · · • ·· · ·» állítanak elő, beleértve
1) azt a módszert, amelyben a jelen találmány szerinti hibrid MoAb-ot adják be először a trombotikue betegségben szenvedő betegnek, majd elegendő idő elteltével egy trombolítikus anyagot, például TPA-t vagy UK-t adunk be, hogy lehetővé tegyük a beteg testében levő trombusokhoz való kapcsolódást,
2) azt a módszert, amelyben a hibrid MoAb-ot és egy trombolitikus anyagot egyszerre adjuk be a trombol.iti.kus betegségben szenvedőnek, és
3) azt a módszert, amelyben a hibrid MoAb-ot és a troinbolítikus anyagot előzőleg reagáltakjuk, majd a trombolitikus anyag reagálatlan részének eltávolítása után ά kapott szelektív
t. rumbο 1 í t i ku s f eb é r j e - komρ 1 e xe t a t romb o t i ku s betegségben szenvedőnek adjuk be.
A jelen találmány szerinti troinbolítikus anyagot, vagy hibrid MoAb-ot előállíthatjuk például injekció formájában, közvetlenül vagy megfelelő gyógyászati hordozóval, hígítóval, stb. elkeverve, miután a fertőző csírákat eltávolítottuk membránszürön, stb. való átszüréssel ahogy szükséges, és emlősöknek beadjuk (például egereknek, patkányoknak, kutyáknak, macskáknak, sertésnek, szarvasmarhának, majmoknak, embereknek) trombotikue vagy eltömödéses betegségek, például miokardiá1ie infarktus, perifériális urteriovenális trombózis, retinális arteriovenális . trombózis, agy-infarktus és tüdöembólia kezelése céljából.
Jóllehet függ a megcélzott, betegségtől, annak tüneteitől és az adagolás módjától, a jelen találmány szerinti trombolitikus • ·
-16anyag napi dózisa intravénás adagolás esetén felnőtt iniokardiálisin fark tusban szenvedő betegnek általában 0,02- 1,0 mg/kg, előnyösen körülbelül 0,04-0,4 mg/kg hibrid MoAb-ként, és trombolítikus anyagként körülbelül 0,01-0,5 mg/kg, előnyösen körülbelül 0,02-0,2 mg/kg mint TPA, és körülbelül 0,02-05 mg/kg, előnyösen körülbelül 0,02-0,2 mg/kg mint UK.
A jelen találmány szerinti hibrid MoAb képes specifikusan kötődni a fibrinhez, miközben lényegében nem reagál a fibrinigénnel és specifikusan kötődik egy trombolítikus anyaghoz, anélkül, hogy bántaná fibrinolítikus képességét. Ennélfogva könnyedén lehetséges 1:1 arányú immunokomplexet előállítani a hibrid MoAb és egy trombolítikus anyag között; használatuk kombinációban szelektív és hatékony lízist tesz lehetővé, vagy a trombus eltávolítását.
Az előzőkben ismertetett módszer a trombusok szelektív és hatékony lízisét és eltávolítását teszi lehetővé a jelen találmány szerinti hibrid MoAb használatával, amely képes specifikusan kapcsolódni a megcélzott trombus-heLyhez és amely lényegében nem reagál fibrinogénneln egy trombolítikus anyaggal kombinác. i óban.
PÉLDÁK
A jelen találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük a kővetkező referencia-példákkal és munka-példákkal; ezek a példák nem bírnak korlátozó jelleggel a jelen találmányra.
A Izoldákban használt állati, se j tvonaJ ak letétbe vannak helyezve, a következő táblázat szerint.
| Állati aejtvonal | (IFO) IFO No. | (FRI) FERM No. | |
| FIB 1-11 | egér hibridóma | 50174 | BP-2081 |
| FIB 2-11 | egér hibridóma | 50175 | BP-2082 |
| TPA 1-41 | egér hibridóma | 50178 | BP-2085 |
| TPA 1-70 | egér hibridóma | 50179 | BP-2086 |
| TPA 2-14 | egér hibridóma | 50194 | BP-2519 |
| UK 1-3 | egér hibridóma | 50176 | BP-2083 |
| UK 1-87 | egér hibridóma | 50177 | BP-2084 |
| UK 1-6 | egér hibridóma | 50208 | BP-2548 |
| FT2-14 egér hibrid-hibridóma (tetraóma) | 50180 | BP-2158 | |
| FU1-74 | egér hibrid- | 50185 | BP-2334 |
-hibridóma (tetraóma)
FU2-16 egér hibrid-hibridóma (tetraóma)
50207
BP-2547 • · ·
-18IFO: Institute of Fermentation, Osaka
FRI: Fermentation Research Institute, Ministry of International
Trade and Industry
A jelen specifikációban az aminosavakat és peptideket a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN) által elfogadott rövidítés! rendszeren alapuló rövidítéssel adjuk meg; a rövidítésekre az alábbi példákat adjuk meg. Megjegyzendő, hogy ha egy adott aminosavnál lehetséges optikai izomer előfordulása, akkor, ha külön nem jelöljük, az L-variánst értjük alatta.
| Gin: | Glutamin |
| Asp: | Aszparaginsav |
| Pro: | Prolin |
| Tyr: | Tirozin |
| Val: | Valin |
| Lys: | Lizin |
| Glu: | Glutaminsav |
| Alá: | Alanin |
| Asn: | Aszparagin |
| Leu: | Leucin |
| Phe: | Fenilalanin |
| Gly: | Glicin |
| His: | Hisztidin |
| Ser: | Szerin |
| Thr: | Treonin |
| He: | Izoleucin |
| Trp: | Triptofán |
| Arg: | Arginin |
»
Met:
Cys:
Metionin
Cisztein (EIA az anti-fibrin antitest méréshez)
Egy 96 helyes mikrotiter lemezbe 50-50 pl/luk mennyiségben 1 mg/ml koncentrációjú fibrin monomer oldatot juttatunk olyan foszfát, puffer oldatban (PBS, pH~7,3), amely 3.3 M karbamidot és 0,01 % EDTA-t tartalmaz. A lemezt éjszakán át 4°C-on hagyjuk, majd érzékenyitett lemez előállítása céljából 150-150 pl PBS- t adunk hozzá, amely 2% kazeint és 0,01% t-himerosal-t tartalmaz. Ezután 10 mg/ml humán fibrinogén 100 egység/ml heparint és 3 mmól/1 fonil-metil--szulfonil-fluoridot tartalmazó PBS oldatát elegyítjük azonos mennyiségű, szóbanforgó hibridoma tenyészet felülúszóval. A 30 perces, szobahőmérsékleten lejátszódó reakció után az elégyből 100 pl-t adunk a fenti fibrin-érzékenyített lemezhez, majd a reakciót szobahőmérsékletéül 2 órán át hagyjuk lejátszódni. Miután alaposan mostuk a lemezt. 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBS oldattal (PB3-TW), torma-peroxidázzal Jelzett nyúl anti-egér-IgG antitestet adunk az elegyhez, és további két órán át hagyjuk lejátszódni a reakciót.
A lemez mosáséi után orto-feni.lén-diamint és enzimszubsztrátként hidregénperoxidot tartalmazó 0,1 mól/l-es citrát.
puffer oldatot, adunk minden egyes lukhoz, majd az enzim-reakciót szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni. Λ reakciót 1 N kénsavval leállítjuk, majd a keletkezett színes anyagot 492 nm-en mérjük
Multiscan felhasználásával (gyártja a Flow Co.).
« ·
(EIA az anti-TPA antitest méréséhez)
Egy 5 ug/ml koncentrációjú TPA oldatot 100-100 μΐ-enként szétmérünk egy 96 lukas mikrotiter lemezen, éjszakán át 4’C-on hagyjuk állni, majd érzékenyített lemez előállítása céljából 150-190 μΐ, 2% kazeint és 0.01% thimerosalt tartalmazó PBS-t adunk a lukakhoz. Az oldat eltávolítása után a lemezt PBS-TW-vel mossuk, majd 100 μΐ szóbanforgó hibridóma tenyészet felülúszót adunk hozzá és 2 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk a reakciót lejátszódni. Ezután az 1. referencia példa szerint enzimreakciót hajtunk végre, és meghatározzuk az antitest titert.
(EIA az anti-UK antitest meghatározására)
Miután a 2. referencia példa szerint előállítottunk egy
UK-érzékenyített lemezt, azzal a különbséggel hogy TPA helyett UK-t használunk, azonos módon meghatározzuk az anti-UK antitest titert.
.eranaia.
(EIA anti-fibrin-anti-TPA hibrid antitest mérésére)
Az 1. referencia példa szerint előállított fibrin-érzékenyített lemezhez hozzáadjuk a szóbanforgó hibridóma tenyészet felülúszót, majd a reakciót hagyjuk 2 órán át szobahőmérsékleten lejátszódni. Miután a lemezt PBS-TW-vel
-21mostuk, biotinnal jelzett TPA-t adunk hozzá, majd a reakciót
egy avidin-HRP komplexet adunk hozzá, és ismét hagyjuk a reakciót szobahőmérsékleten lejátszódni egy óra hosszat; a szilárd fázishoz kapcsolódó HRP aktivitását az 1. referencia példában leírt módszerrel határozzuk meg.
(EIA anti-fibrin-anti-UK hibrid antitest mérésére)
A 4. referencia példában leírt eljárást követjük, azzal az eltéréssel, hogy a biotinnal jelzett TPA helyett biotinnal jelzett UK-t használunk.
(Fibrinolízis neutralizációs teszt) ng/ml végkoncentrációjú TPA oldathoz vagy 25 ng/ml végkoncentrációjú UK oldathoz a szóbanforgó hibridóma oldat felülúszójának hígítását adjuk, majd a reakciót hagyjuk egy óra hosszat lejátszódni 37°C-on. A reakcióelegyet. ezután 5 pl/luk mennyiségben fibrin-agaróz lemezen osztjuk szét, majd 2-6 órán át 37°C-on inkubáljuk. A kapott fibrinolízis tarfoltokat mérve határozzuk meg a hibridóma tenyészet felülúszójában levő MoAb-nak a TPA vagy az UK enzimaktivitását semlegesítő hatását.
Egy a 2. referencia példa szerint előállított TPA- érzékeny!tett lemezhez adjuk a hibrid antitestet tartalmazó oldatot, majd a reakciót 2 órán át heigyjuk lejátszódni szobahöI mérsékleten. Miután a lemezt PBS-TW-vel mostuk, egy HRP-vel jelzett ant-i-egér-IgGl (/1-láric specifikus) antitestet adunk (kereskedelmi forgalomban van, a Cosmo-Bio K.K. árulja), majd a reakciót 2 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni. Miután a lemezt alaposan mostuk PBS-TW-vel, a szilárd fázishoz kötődő HRP mennyiségét az 1. referencia példában leírt módon meghatározzuk.
(EIA az anti-fibrin-anti-TPA hibrid antitest mérésére (3))
A 2. referencia példa szerint előállított TPA-értékenyített lemezhez adjuk a hibrid antitestet tartalmazó oldatot, majd a reakciót hagyjuk 2 órán át szobahőmérsékleten lejátszódni.
Miután a lemezt PBS-TWA-val mostuk, az 1-(1) példában leírt biotinnal jelzett humán fibrin 13-lánc N-terminális peptid (l-ll)-BSA komplexet adjuk hozzá, majd a reakciót hagyjuk szobahőmérsékleten 2 órán át lejátszódni. Egy avidin-HRP komplexet adunk hozzá, majd a reakciót 1 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni; a szilárd fázishoz kötődő HRP aktivitását az 1. referencia példában leírt, módon határozzuk meg.
··
-23• ·· · ·· • · • ··« £L._JiQ.f.ereiic.iíL!iáL-la (EIA az anti-fibrin-anti-UK hibrid antitest mérésére (2))
A 3. referencia példa szerint előállított UK-érzékenyített lemezhez adjuk a hibrid antitestet tartalmazó oldatot, majd a reakciót hagyjuk 2 órán át szobahőmérsékleten lejátszódni.
Miután a lemezt PBE-TWA-vaL mostuk, az 1—(1) példában leírt biotinnal jelzett humán fibrin 13-lánc N-terminális peptid (l-ll)-BSA komplexet adjuk hozzá, majd a reakciót hagyjuk szobahőmérsékleten 2 órán át lejátszódni. Egy avidin-HRP komplexet adunk hozzá, majd a reakciót 1 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk lejátszódni; a szilárd fázishoz kötődő HRP aktivitását az 1. referencia példában leírt módon határozzuk meg.
1ÍL_R£Ííi£jeii£tLíL_pá Ida (EIA az anti-kismólsúlyú-UK antitest titer meghatározására)
Miután az alacsony mólsúlyú UK-val (kétláncú alacsony mőlsúlyú UK, kapható a JCR Co. cégtől) érzékenyített lemezt a 2. referencia példában leírt módon TPA helyett UK-t használva előállítottuk, az anti-kismólsúlyú-UK antitest titerét azonos móúdszerrel határozzuk meg.
(UK enzimaktivitás neutralizációs teszt)
1,7 pg/ml végkoncentrációjú UK oldathoz adjuk a szóbanforgó antitest oldatot, majd a reakciót 30 percig szobahőmérsékleten • ·
999 9 ·9 hagyjuk lejátszódni. A reakcióelegyhez hozzáadjuk a szintetikus
S-2444 peptid-szubsztrátot (1 inM, piroglutamil-glicil-arginil-paranit.roan.il id, gyártja Kabi Co.). 15 perces, 37°C-on lejátszódó reakció után a felszabaduló paranitroanilidet. mérjük (405 nm-ee elnyelés).
(Eljárás egér anti-humán-fibrin monoklonális antitest előállítására) (1) Az immunogén előállítása mg/ml koncentrációjú borjú szérum albumin (BSA) vizes oldatához, amelyet előzőleg GMBS-sel maleimideztunk (a maleinimido csoportokat .1.3 mól per mól BSA koncentrációnál építettük be), 3,3 mg humán fíbrin Í3-Iánc N-terminális pepiidet ((l-ll)-Cys) adunk, amelyet peptid szintetizátorral (Model 430A, Applied Systein Co. ) , az ismert szilárd fázisú szintézissel állítunk elő, majd a reakciót egy órán át 30’C-on hagyjuk lejátszódni, így kapjuk a humán fibrin β-lánc N-terminális peptid (l-ll)-BSA komplexet. Miután háromszor dializáltuk fiziológiás sóoldattal (3 1 x 3), ezt a komplexet fagyasztva tároljuk és immunogénként használjuk.
(2) Immunizálás
Fiziológiás sóoldatban levő 1 mg/ml peptid-BSA komplex oldatához azonos mennyiségű Freund komplett adjuvánst adunk, majd ezt követően szubkután immunizáltunk egereket (hím, n~10:0,l mg/C),2inl/egér) a hátukon és a hasukon. A további immunizálást úgy végezzük, hogy az immunogént azonos mennyiségű Freund inkomplett • · · · · · • ♦ · · · · · · · · »«···· ·· · · ··· · · t · ·· ·« ···· ·· adjuvánssal kombinálva oltjuk be Ötször egymás után, 2-3 hetenként.
(3) Sejtfúzió
A végső immunizálást kővető harmadik napon a 1épeket kivágjuk, és az ismert módszerekkel splenocita szuszpenziót készítünk (körülbelül 10® sejt). Körülbelül 2 :·: IO'7 egér mielóma sejt (P3IJ.1) hozzáadása után a sejtfúziót Köhler és Milstein módszerével hajtjuk végre [Natúré, 49b (1975)], PEG 6000 felhasználásával.
A fúzió teljes lejátszódása után a sejtkeveréket HAT táptalajban szuszpendáljuk, amely hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmaz, majd 10 napon keresztül tenyésztjük. Közvetlenül a szülő-sejtek szelekciója után a HAT táptalajt HT táptalajjal helyettesítjük,amelyből hiányzik az aminopterin, és tovább tenyésztjük.
(4) A hibridómák klónozása és szelekciója
A hibridóma tenyészet felülúszójának antitest, titerét az .1referencia példában leírt EIA eljárással határozzuk meg, amely szilárd fázisként a mikrotiter lemezhez adszorbeált humán fibrin monomert, tartalmaz. A fúzió után 10-20 nappal hibridómák tűnnek fel, és a humán fibrinhez specifikusan kötődő antitest detektálható. A különösen erős aviditást mutató hibridómákat tovább klónozzuk a határhigítás módszerével.
A klónozott hibridómák tenyészetének felülúszőját EIA-val vizsgáljuk át; a humán fibrinhez erős aviditást mutató hibridómákat szelektáljuk.
A fentiek eredményeként a FIB 1-11 és FIB 2-11 egér hibridőmákat kapjuk, mindegyik olyan MoAb-ot termel, amely nagy koncentrációjú fibrinogén jelenlétében specifikusan kötődik a fibrinhez. A két említett hibridoma által termelt FIB 1-11 és FIB
2-11 antitesteket az Ouchterlony módszerrel az IgGl immunoglobulin osztályba és alosztályba tartozónak azonosítottuk.
A FIB 1-11 és FIB 2-11 anti- humán-fibrin specifikus antitesteket, fibrinogén jelenlétében valamint távollétében mérjük az 1. referencia példában leírt EIA módszerrel. Az eredmények az
1. táblázatban láthatók. Megjegyzendő, hogy kontrollként a FIB
2-162 anti-humán-fibrinogén antitestet, használjuk.
1. Táblázat
EIA anti-fibrin antitest mérésére3-)
Optikai abszorpció (492 nm)
| Monoklonális antitest | Fibrinogén nélkül | Fibrinogén jelenlétében2 > |
| FIB 1-11 | 0,50 | 0,20 |
| FIB 2-11 | 0,51 | 0,16 |
| FIB 2-162 | 0,32 | 0,01 |
x>: az 1. referencia példában leírt EIA 2) ; 5 mg/ml végkoncentráció ·· · · · · • · · ··· · ··· • ···· · · · · · ··« « ♦· ♦ ·· —
·· ···· ·· (Egér anti-TPA monoklonális antitestet termelő hibridőmák előállítása) (1) Immuni zá1á s
Kereskedelmi forgalomban levő egyláncú TPA (kapható a Chuo Kagaku Kogyo K.K.-tól) 200 mg/ml fiziológiás sóoldatban levő oldatához azonos mennyiségű Freund adjuvánst adunk. Ezt az emulziót szubkután BALB/c egereknek adjuk be (nőstény, 20 ug/0,2 ml/egér) a hasukon és hátukon, majd ezt követően 2-3 hetenként újra immunizáljuk az állatokat. Egy TPA antigén oldatot (50 pg/0,1 ml fiziológiás sóoldat/egér) adunk be intravénásán azoknak az állatoknak, amelyek maximális antitest titert értek el a 10. napon, és még háromszor immunizáljuk őket.
(2) Sejtfúzió
A sejtfúziót az 1—(3) példában leírt módon hajtjuk végre.
(3) A hibridómák szelekciója és klónozása
A hibridómákat a 2. referencia példában leírt EIA eljárással vizsgáljuk át, amely TPA-val borított mikrotiter lemezt· használ. Ezután az l-(4) példa eljárását követjük az anti-TPA-MoAb termelő hibridómák előállítására. Ezek között a hibridómák között található a TPA 1-41 egér hibridóma, amely olyan anti-TPA MoAb-ot termel, amely specifikusan kapcsolódik a TPA-hoz anélkül, hogy zavarná fibrinolizáló képességét, a TPA 1-70 egér hibridóma, amely egy olyan TPA-t nem semlegesítő antitestet termel, amely a plazininogén aktivátor inhibitorral (PAI) kompétitíven kötődik a TPA-hoz. Az említett három hibridóma által termelt TPA 1-41, TPA ·· ·· • · ···· • ···· · · · · · ··· · ··· ♦·
1-70 és TPA 2-14 antitesteket az Ouchterlony módszerrel az immunoglobulin osztályban és alosztályban IgGsb, IgGi és IgGi-nek határoztuk meg.
Az 1. ábrán láthatjuk ezeknek az anti-TPA specifikus antitesteknek a mérési eredményeit a 2. referencia példában leírt EIA eljárással. [TPA 1-41 ( -·- ) és TPA 1-70 ( -A- )].
3. Példa (Egér anti-UK monoklonális antitestet termelő hibridómák elöá11ítása) (1) Immunizálás '
Az egér immunizálást pontosan úgy hajtjuk végre mint a 2-- (1) példában, csak a 2-(1) példában használt TPA helyett UK-t használunk (e1 ί5á1111,ja a Nippon Seiyaku).
I (2) Sejtfúzió
A sejtfúziót az l-(3) példában leírt triódon hajtjuk végre.
(3) A hibridómák szelekciója és klónozása
A híbridómákat a 3. referencia példában leírt EIA eljárással vizsgáljuk át, amely UK-val borított mikrotiter lemezt használ. Ezután az l-(4) példa eljárását követve kapjuk az anti-UK-MoAb-ot termelő hibridómákat. Ezek közül a hibridómák közül, kapjuk az UK
1-3 és UK 1-87 egér hibridómákat, amelyek olyan anti-UK MoAb-ot termelnek, amely anélkül kötődik az UK-hoz, hogy megzavarná a » fibrinolizáló képességét. A két említett hibridóma által termelt UK 1-3 és UK 1-87 antitesteket az Ouchterlony módszerrel az immunoglobulin osztályban és alosztályban IgGi illetve IgGab-kónt «· · · · · ······ · »·· « · ·· · · · · · · ·*··♦♦* ·· azonosítjuk.
A 2. ábrán látjuk ezeknek az anti-UK specifikus antitesteknek a 3. referencia példában ismertetett EIA eljárással kapott mérési eredményeit [UK 1-3 ( - · - ) és UK 1-Θ7 ( - A - )].
(Anti-TPA-anti-humán fibrin bi-'spccifitással rendelkező hibrid monoklonális antitest előállítása) (1) Sejtfúzió
Mind az 1. példában előállított FIB 1-11 hibridómát, amely az anti-humán fibrin antitestet termeli, mind a 2. példában előállított TPA 1-41 hibridómát, amely anti-TPA antitestet termel, 0,5 pg/ml FITC-et és 1,5 pg/nil TRITC-et tartalmazó Iscove-Ham F--12 táptalajon tenyésztjük 30 percig fluoreszcens festés céljából. Egy LSM oldatot adunk hozzá (kereskedelmi^ forgalomban van, előállítja fi Wako Pure Chemical Industries Ltd.), és az elpusztult sejteket eltávolítjuk. Ezt a két hibridómát azután összekeverjük 1:1 arányban, majd a sejteket fúzionáltatjuk PEG 6000-rel, az l-(3) példában leírt módszerrel.
Miután két órán át 37°C-on inkubáltuk, a sejtszuszpenziót egy FACS berendezésre visszük és 25000 fluoreszcein--rodamin duplán festett sejtet kapunk. Ezeket a duplán festett sejteket ezután 10 sejt/luk koncentrációban olyan 96 lukas mikrotiter lemezen tenyésztjük, amelyet előzőleg tápláló sejtekként 5 x 10e sejt/luk koncentrációban egér timocitákkal borítottunk.
(2) A hibrid hibridómák szelekciója és klónozása
Azokból a lukakból, amelyekben a fúzió után egy-két héttel sejt.szaporodás volt, a tenyészet felülúszóját EIA eljárásnak ·* ···« *4 vetjük alá az 1., 2„ 7. és 8. referencia példákban leírtak szerint, az antitest aktivitás meghatározására. Kontrollként az 1—(4) és
2-(3) példákban előállított FIB 1-11 és TPA 1-41 hibridómák tenyészete felülúozójának antitest aktivitását, is meghatározzuk, ugyanazzal a módszerrel. Az eredményeket a 2. ábrán mutatjuk be.
A magas antitest-ti tért mutató lukakból származó sejteket határáig!tással klónozzuk; így kapjuk a. keresett bi-speci fikus antitestet termelő egér FT 2-14 hibrid hibridómát (tetraóma).
2. Táblásat x>: A 4-(2) példában előállított hibrid hibridóma 2>: As l-(4) példában előállított hibridóma 3): A 2-(3) példában előállított hibridóma
EIA antitest titer4>
Anti-TPA-
| Hibridóma tenyészet | Anti-TPA | >- anti-fibrin | ||
| felülúszó | Anti- | Anti-TPA6> anti | β -lánc | |
| fibrin3> | egér- | N-terminális | ||
| IgGi7> | peptid®> | |||
| Hibrid hibridóma A1^ | 0,66 | 0,99 | 1,90 | 2,45 |
| Hibrid hibridóma B1> | 0,30 | 0,60 | 0,51 | 2,19 |
| FIB 1-123> | 0,29 | 0,00 | 0,01 | 0,00 |
| TPA 1-413> | 0,01 | 1,01 | 0,01 | 0,00 |
| 4 >:492 | mn-en mért | optikai | elnyelésben | kifejezve |
| (1 | ásd 1. referencia | példa) |
| 5 ) ; | EIA | az | ; 1 | . referencia | i példa szerint | • |
| 6 > : | EIA | a | o | referencia | példa szerint | |
| EIA | a | 7. | referencia | példa szerint | ||
| - > : | EIA | a | 8. | referencia | példa szerint |
« ·
• ··· • · * (3) A hibrid antitest tisztítása
Az egér FT 2-14 hibrid hibridómát (tetraóma) 5 x 10ö sejt/egér mennyiségben intraperitonálisan adjuk be hat BALB/c egérnek, amelyek előzőleg 0.5 ml ásványolajat kaptak peritonális adagolással. Körülbelül 10-20 nappal később a keletkezett aszcitesz-folyadékból 20 ml-t összegyűjtünk, majd 50%-ig telített ammóniuin-szulfáttal kisózva kapjuk az IgG frakciót. Dializáljuk 20 mmól/l-es PBS-sel (pH-7,5) szemben, majd az IgG frakciót fibrinnel kapcsolt C-ellulofine oszlopra visszük és 0.2 mól/l-es glicin-HCl pufferrel (pH-2,9) eluáljuk. Miután PBS-sel. szemben dializáltuk, a savas elúciós frakciót TPA-val kapcsolt Sepharose 4B oszlopra visszük és 0,2 mól/l-es glicin-HCl pufferrel szemben eluáljuk (pH-2.3). Az eluátumot PBS-sel szemben dializáljuk, így kapunk 9,4 mg bi-specifikus FT 2-14 antitestet.
A kapott antitestet a 8. referencia példában leírt EIA eljárásnak vetjük alá; meghúzzuk a bi-specifikus .antitest higítási görbéjét. Az eredményeket a 3. ábrán mutatjuk be. A 3. ábráról nyilvánvaló, hogy a kapott antitest erős affinitást mutatott mind a TPA-hoz mind a fibrinhez.
(Anti-UK-anti-humán fibrin bi-specifitással rendelkező hibrid monoklonális antitest (1) előállítása):
(1) Sejtfúzió
A 4-(l) példában leírt módszer alapján az 1. példában kapott
FIB 1-11 hibridómát, .amely anti humán fibrin antitestet termel,
-33valamint a 3. példában kapott UK 1-3 hibridómát, amely anti-UK antitestet termel, FITC és TRITC felhasználásával fluoreszcens festésnek vetjük alá, majd PEG 6000-rel fúzionáltatjuk. A sejt-keveréket FACS-ra visszük; A duplán festett sejteket kiválasztjuk és szaporítjuk.
I (2) A hibrid hibridómák szelekciója és klónozása j
A fúzió után 1-2 héttel sejtszaporodást mutató lukakból származó tenyészet--felülúszókat az 1., 3. és 9. referencia példában leírt módon EIA eljárásnak vetjük alá, hogy meghatározzuk antitest aktivitásukat. Kontrollként az 1-(4) példában kapott FIB
1-11 és a 3-(3) példában kapott UK 1-3 hibridómák tenyészetének felülúszójának antitest aktivitását is meghatározzuk ugyanazzal a módszerrel.
A maximális hibrid antitest aktivitással· rendelkező tenyészeteket határhigítással klónozzuk, így kapjuk a keresett bi-specifikus antitestet termelő FU 1-74 egér hibridómát.
(3) A hibrid antitest tisztítása
A 4-(3) példában leírt módon összegyűjtött aszcitesz folyadékot ammőnium-szulfáttal kicsapjuk, majd immun-affinitás kromatográfiának vetjük alá fibrin-kapcsolt. oszlopot és egy UK-kapcsolt oszlopot használva; 14 mg FU 1-74-et, a jelen találmány szerinti anti-UK-anti-humán fibrin bi-specifikus antitestet kapunk körülbelül 20 ml aszcitesz folyadékból.
A kapott antitestet a 9. referencia példában leírt EIA eljárásnak vetjük alá; a bi-spéciiikus antitest higítási görbéjét meghúzzuk. Az eredményei; a 4. ábrán láthatók. A 4. ábráról nyilvánvaló, hogy a kapott FU 1-74 antitest erős affinitással rendelkezik mind a;; UK-hoz mind a fibrinhez.
φ « «· ···· ·· ·· · V · · φ · » ···> · ··· • ···· · · * · · ·»· · ·· · ··
-34(Az FT 2-14 anti-TPA-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest tulajdonságai (1))
Egy körülbelül 9.5 mm íitinéröju papírkorongot 2 mg/ml koncentrációjú humán fibrinogén oldatba merítjük, majd humán trombint adunk hozzá (50 NIH egység/ml), így trombin-rögöket hozunk létre a papírkorongon. Alapos mosást kővetően ezt a fibrinnel kapcsolt papírkorongot a 4-(3) példában előállított FT
2-14 bi-specifikus antitest oldatába merítjük fibrinogén “ jelenlétében (3 mg/ml). Λ papírkoronghoz kötődő antitest mennyiségét HRP-vel jelölt anti-egér-IgGzu antitesttel merjük. Az eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be.
A fibrinogén jelenlétében (3 mg/ml) mért fibrin affinitás () közel azonos a fibrinogén nélkül mért affinitással (O); ez azt mutatja, hogy a jelen találmány szerinti FT 2-14 antitest fibrinre specifikus.
7..,...Rá Ida (Az FT 2-14 anti-TPA-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest tulajdonságai (2))
Különböző koncentrációjú TPA-t reagáltatunk a 4-(3) példában előállított FT 2-14 bi-specifikus antitesttel a TPA-nál 4,3-szor nagyobb moláris koncentrációban 37°C-on 30 percig, így állítjuk elő a TPA és az FT 2-14 antitest immunkomplexét (TPA/FT 2-14 antitest), majd hozzáadunk 3 mmól/1 S-2288 peptid-szintézis szubsstrátot (előállítja a Kavi Co.), és 2 órán át 37’C-on reagálta!juk. A felszabaduló para-nitro-ani1 in optikai elnyelését
| • ·· | ···♦ | ·· | |
| ·· | • · | • | • |
| • | • · ··· | ||
| • | ···· » · | • | • r |
| ··« | • | • | ·· |
405 nm-en mérjük; az előállított TPA-FT 2-14 antitest-komplex enzim-aktivitását a TPÁ-éhoz hasonlítjuk. Az eredmények a 6. ábrán láthatók.
A 6.ábrán · mutatja a TPA/FT 2-14 antitest komplex enzimaktivitását; O mutatja a TPA enzimaktivitását. Igazoltuk, hogy a TPA enzimaktivitása nem csökken, még akkor sem, ha a találmány szerinti FT 2-14 bi-specifikus antitesthez kötődik.
(Az FT 2-14 anti-TPA-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest tulajdonságai (3))
Humán fibrinogént Cellulofine szemcsékhez kötve inszolubilizálunk (kereskedelmi forgalomban kapható a Seikagaku Kogyo K.K. cégtől) az ismert módszer szerint [Etsuko Ebisui et al. : Seikagaku, 5.4 732 (1982)1, majd humán trombin hozzáadásával fibrinné alakítjuk. 0,2 g ilyen fibrin-Cellulofiné szemcse komplexhez 10 iag/500 pl koncentrációjú FT 2-14 antitest oldatot, majd 90 percig 37°C-on reagálta!juk. Alap>os mosást kővetően a reakcióelegyet 40 percig 37C-on reagálhatjuk 100 ng TPA-val. Mosás után a reakcióelegyet. hozzáadott plazminogénnel reagálhatjuk (3 egység/m.l) 37°C-on egy órán át. A felülúszóba felszabaduló peptidct (fibrin degradációs termék: FDP) FDP-EIA kittel mérjük (a kitet az American Diagnostic Co. állítja elő).
Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be.
A TPA-nak erősebb hatása van az FT 2-14 bi-specifikus antitesttel előkezelt, fibrin-Cellulofin szemcsékre? mint a kezeletlen fibrin-Cellulofin szemcsékre; a TPA fibrinolitikus ü' hatását erősíti az antitest.
. .. Pálda (Az FU 1-74 anti-UK-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest, tulajdonságai (1))
Egy 25 ng/ml koncentrációjú (JK oldatból 2,5 pl-t és egy, a
5-(3) példában előállított. 40 ng/ml vagy 160 ng/ml koncentrációjú FU 1-74 bi-specifikus antitest oldatból is 2,5 μΐ-t injektálunk a
6. referencia példában leírt fibrin-agaróz lemez egy lukéba, majd 4 órán át 37’C-on reagáltatjuk. Ezután mérjük a kapott fibrinolízis tarfoltokat., és az UK-val kapott tarfoltokhoz hasonlítjuk. Az eredmények a 8. ábrán láthatók. Az UK-val összehasonlítva, az FU 1-74 antitesttel való kapcsolat 3-5szörösére növelte az UK fibrinolíttikus kapacitását.
(As FT2--14 anti-TPA-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest és az FU1-74 anti-UK-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest in vitro fibrinolitikus kapacitásának növelése)
A 8. példa szerint előállított fibrin-CelLulofin szemcsékkel töltött oszlopokat, reagáltatunk a. 4-(3) példában FT2-14 (0-100 ng/ml) illetve az 5-(3) példában előállított. FU1-74 (0-50 ng/ml) antitesttel, majd 0?01% Triton-X-et tartalmazó PBS-sel (PBS-T) mossuk. TPA oldatot juttatunk az FT2-14-gyel kezelt oszlopra és UK oldatot az FUl-74-gyel kezelt oszlopra 200 pg/400 ml koncentrációban, 240 ml/óra áramlási sebességgel. Miután az oszlopokat mostuk PBS-T-vel, a hordozó Cellulofine szemcséket kémcsőbe tesszük át, és hozzáadott plazminogénnel (4,5 egység/1,5 • · · · • · ml) reagálhatjuk 37°C-on 2 órán át. Azonos mennyiségű 6 mmől/l-es para- amidinofenil-metánszulfonol-fluorid hozzáadása után a Cellulofin szemcsékről felszabaduló Fibrin Degradációs Termékeket (FDP) egy EIA kittel mérjük ( a kitet az Ainerican Diagnostica Co.) állítja elő. Az eredmények a 9. ábrán láthatók. 3,8-szoros fibrinolitikus kapacitás-növekedés figyelhető meg a 100 pg/ml FT2-14-gyel kezelt fibrin-Cellulofin szemcséknél ( O ) és
8,5-szeres fibrinolítikus kapacitás-növekedés figyelhető meg az 50 ug/ml FUl-74-gyel kezelt fibrin-Cellulofin szemcséknél, (·) az antitesttel nem kezelt fibrin-Cellulofiné szemcséken mért TPA ( O ) és UK ( 0 ) fibrinolítikus kapacitásával összehasonlítva.
(Az FT2-14 anti-TPA-anti-humán fibrin bi-specifikus antitest in vivő trombolitikus hatásának növelése) (1) A nyúl nyaki ér troinbus modell beállítása
Miután hím nyulakat (2,5-3,5 kg) intraperi.tonális pentobarbital (90 mg/1,5 ml/ nyúl) és uretán (1,5 mg/3 ml/ nyúl) injekcióval elérzéstelenítünk, vérmintavevö kanült juttatunk a jobboldali combcsonti vénába és egy vér-injektáló kanült valamint egy darab gyapjúcérnát a baloldali nyaki vénába. A nyaki vénát egy szorítóval elzárjuk, hogy a vér áramlását egy körülbelül 3 cm széles szakaszon blokkoljuk, az eret belülről kimossuk, majd fiziológiás sóoldatot juttatunk bele és 0,2 ml 12 mM-os CaCla oldatot, amely 10 egység/ml trombint tartalmaz. A mosott érbe 0^2 ml, a combcsonti vénából gyűjtött saját vért juttatunk. A kanült azonnal eltávolítjuk; a kapott nyílást lezárjuk. Az állatot 30 percig állni hagyjuk, hogy a vér koagulálni tudjon.
• · • · · · · · • ·· · · · · ··· • ····· · · · · • ·· * ·· · ·· (2) A vizsgált hatóanyag oldatának injektálása
A trombus-modell nyulakba intraperitonáiisan (250 egység/kg) és szubkután (500 egység/kg) heparint injekciózunk; a szőritót eltávolítjuk a nyaki érből. Ezután a másik oldalon egy injekcióstüt juttatunk a fül vénájába, majd a vizsgált hatóanyag oldíitának a teljes dózis 10%-át kitevő mennyiségét (2 ml/nyúl) intravénásán beadjuk a nyúlnak, majd a megmaradó 90% térfogatot 6 ml/óra áramlási sebességgel 4 óra alatt folyamatosan beinjekciózzuk. Négy órával később a gyapjúszálhoz tapadó trombust kivesszők és nedves tömegét megmérjük. A vizsgált hatóanyag oldat volt egy kontroll fiziológiás sóoidat, TPA oldatok (0,25 mg/kg és 1,0 mg/kg), az FT2-14 antitest oldat (1,2 mg/kg) és a 4--(3) példában előállított TPA/FT2-14 antitest komplex oldat (0,25 mg/kg TPA + 1,2 mg/kg FT2-14). Az eredmények a 10. ábrán láthatók.
Héi 0,25 mg/kg TPA-t injektálunk négy óra alatt folyamatosan, akkor a trombus nedves tömege a kontroll csoportban 61,5 ± 7,2 mg-ról (n=4) 31,7 ± 10,1 mg-ra csökkent. (n~6). Abban a csoportban, amely 0,25 mg/kg TPA-t és 1,2 mg/kg FT214--et kapott kombinációban (a mólarány 1 TPA 2 bi-specifikus antitest (bs AB)), a nedves tömeg 19,6 ± 6,5 mg lett (n=7), azaz a trombolitikus kapacitás olyan mértékban megnőtt, hogy majdnem azonos volt az 1,0 mg/kg TPA csoportban mért trombus nedves tömeggel 15,5 1 5. mg (n-3). Az 1,2 mg/kg FT2-14 csoportban a trombus nedves tömege 41,5 mg (n=l). «
lZuu—Eélda (Egér anti-alacsony molékulatömegü monoklonális antitestet termelő hibridóma előállítása) (1) Immunizálás
Az egér immunizálást pontosan ugyanúgy végezzük mint a 2-(l) példában, azzal a különbséggel, hogy a 2—(1) példában leírt TPA helyett kereskedelmi forgalomban levő kétláncú alacsony molekulatömegü UK-t használunk (gyártja a JCR Co.).
(2) Sejtfúzió
A sejtfúziót pontosan az l-(3) példában leírt módszerrel hajtjuk végre.
(3) Hibridóma szelekció és klónozás
A hibridómákat a 10. referencia példában leírt EIA eljárással screeneljük, olyan mikrotiter lemezeket használva, amelyekhez alacsony molekulatömegü UK-t kötöttünk, és ugyanannak az eljárásnak vetjük alá mint az l-(4) példában, hogy anti-alacsony molekulatömegü UK MoAb-ot termelő hibridómákat kapjunk. Ezek közül a hibridómák közül az egér UK 1-6 hibridómát választjuk ki, amely olyan anti-alacsony molekulatömegü UK MoAb-ot termel, amely specifikusan az UK-hoz kötődik anélkül hogy csökkentené az UK fibrinolítikus kapacitását. Az így kapott hibridóma által termelt UK 1-6 antitest imrnunoglobulin osztálya és alosztálya IgGi (k lánc) az Ouchterlony- módszerrel.
• · • · · · · • · • ·· • · · • · • · • · *
-40··« • ·
13. Példa (Anti-UK és anti-humán fibrin bi-specifikus aktivitással rendelkező monoklonális antitest előállítása (2)) (1) Sejtfúzió
Az 1. példa szerint előállított FIB-li hibridómát, amely anti-humán fibrin antitestet termel, valamint a 12. példa szerint előállított UK-16 hibridómát, amely anti-kismolekulatömegü UK antitestet termel FITC illetve TRITC fluoreszcens festésnek vetjük alá a 4-(l) példában leírtak szerint, majd PEG 6000-rel fúzináltatjuk a sejteket. A sejteket ezután FACS berendezésre yisszük a duplán festödött sejtek kiválasztására, amelyeket utána elszaporítunk.
(2) Hibrid hibridóma szelekció és klónozás
Azokból a lukakból, amelyekben a sejtfúzió után 1-2 héttel sejtszaporodást látunk, a tenyészetek felülúszóját egyenként EIA eljárásnak vetjük alá az 1., 9. és 10. referencia példában leírtak szerint, hogy meghatározzuk antitest aktivitásukat.
A maximális hibrid antitest aktivitást mutató lukból a sejteket határhigífással klónozzuk, így a keresett FU 2-16 egér hibrid hibridómát kapjuk, amely bispecifikus antitestet termel.
Az FU 2-16 hibrid hibridóma tenyészetének felúlúszóját az 5. referencia példában leírt EIA eljárással vizsgáljuk. Az eredmények a 11. ábrán láthatók.
(3) A hibrid antitest tisztítása
A 4-(3) példában leírt módon aszcitesz folyadékot gyűjtünk és ammóniumszulfátos kisózásnak vetjük alá, majd immunaffinitáskromatográfiának, amely során fibrinnel kapcsolt oszlopot és ···
UK-val kapcsolt oszlopot használunk. így kapunk körülbelül 20 ml aszcitesz folyadékból 23 mg FU 2-6-ot, a .jelen találmány szerinti anti-UK anti-humán fibrin bi-specifikus antitestet.
Példa (Az anti-UK monoklonális antitest tulajdonságai (1))
A 3. és 12. példában előállított. UK 1-3, 1-87 és 1-6 anti-UK monoklonális antitesteket EIA eljárásnak vetjük alá, UK-val fedett mikrotiter lemezt illetve alacsony molekulatömegü UK-val kapcsolt mikrotiter lemezt használva ( leírásuk a 3. és 10. referencia példában), majd összehasonlítjuk az UK affinitásukat [12(A). ábra] és alacsony molekulatömegü UK affinitásukat [12(B). ábra]. Az eredmények a 12. ábrán láthatók.
Az UK 1-3 antitest nem kötődik az alacsony molekulatömegü UK-hoz, míg az UK 1-87 és UK 1-6 antitestek ekvivalens reaktivitást mutattak mind az UK mind az alacsony molekulatömegü UK felé.
1,5. Példa (Az anti-UK monoklonális antitest tulajdonságai (2))
A 3. és 12 példában előállított UK 1-3, 1-87 és 1-6 anti-UK monoklonális antitesteket UK enzinaktivitás neutrálisáéiós tesztnek vetjük alá a 11. referencia példában leírt módon, S-2444 szintetikus peptid-szubsztrátot használva. Az eredményeket a 13. ábrán láthatjuk. .
Ezek közül az anti-UK monoklonális antitestek közül egyik sem gátolja az UK enzimaktivitását.
Claims (25)
1. Bi-specifikus hibrid monoklonális antitestet termelő polidóma, azzal jellemezve, hogy a két specifitás fibrin illetve trombolítikus anyag ellen irányul.
2. Az 1. igénypont szerinti polidóma, azzal jellemezve, hogy az említett trombolítikus anyag egy proteáz.
3. A 2. igénypont szerinti polidóma, azzal jellemezve, hogy az említett proteáz a szöveti plazminogén aktivátor.
4. A 2. igénypont szerinti polidóma, azzal jellemezve, hogy az említett proteáz urokináz.
5. Egy anti-fibrin-antitestet termelő hibridóma és egy aritiszöveti-plazminogén aktivator-antitestet termelő hibridóma fúziójával előállított tetraóma, amely mind a fibrinhez, mind a szöveti plazminogén aktivátorhoz kötődni képes bi-specifikus hibrid monoklonális antitestet termel.
6. Egy anti-fibrin-antitestet termelő hibridóma és egy antiurokináz-antitestet termelő hibridóma fiiziójával előállított, tetraóma, amely mind a fibrinhez, mind az urokinázhoz kötődni képes bi-specifikus hibrid monoklonális antitestet termel.
7. Bi-specifikus hibrid, monoklonális antitest, azzal jellemezve hogy a két spccifitása fibrin és egy trombolítikus anyag ellen irányul.
8. A 7. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az említett trombolítikus anyag egy proteáz.
9. A 8. igénypont szerinti antitest, azzal Jellemezve, hogy az . említett proteáz szöveti plazminogén aktivátor
10. A 8. igénypont szerinti antitest, azzal jellemezve, hogy az • · · · · · ······ · ··· • ····· · · · · ··· · ·· · ··
-Γ
--43 emlitett proteáz urokináz.
11. A 7. igénypont szerinti tromblitikus anyag, azzal jellemezve, hogy az antitestet és az immunolögiailag hozzácsatolt trombolitikus anyagot tartalmazza.
12. A 11. igénypont szerinti trombolitikus anyag, azzal jellemezve, hogy az említett trombolitikus anyag egy proteáz.
13. A 12. igénypont szerinti trombolitikus anyag, azzal jellemezve, hogy az említett proteáz szöveti plazminogén aktívától'.
14. A 12. igénypont szerinti trombolitikus anyag, azzal jellemezve, hogy az említett proteáz urokináz.
15. Eljárás bi-specifikus hibrid monoklonális antitestet termelő polidóma előállítására, amely antitest két specifitása fibrin illetve egy trombolitikus anyag ellen irányul, azzal jellemezve, hogy egy anti-fibrin-antitestet-termelö hibridómát vagy sejtet és egy trombolitikus anyag elleni antitestet termelő hibridómát vagy sejtet fúzionáltatunk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett trombolitikus anyagként egy proteázt alkalmazunk.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteázként szöveti plazminogén aktivátort alkalmazunk.
13. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteázként urokinázt alkalmazunk.
19. A 15. igénypont szerinti eljárás, amelynek során az említett polidómaként egy olyan tetraómát állítunk elő, amely mind fibrin mind szöveti plazminogén aktivátor megkötésére képes bi-specifikus hibrid monoklonális antitestet termel, azzal jellemezve, hogy egy anti-fibrin-antitestet termelő hibridómát és egy anti- szöveti-plazminogén-aktivátor-arititestet termelő hibridómát fúzionáltatunk.
20. A 15. igénypont szerinti eljárás, amelynek során az említett, polidómaként egy olyan tetraómát állítunk elő, amely mind fibrin mind urokináz megkötésére képes bi-specifikus hibrid monoklonális antitestet termel,azzal jellemezve,hogy egy anti-fibrin-antitestet termelő hibridömát és egy anti-urokináz-antitestet termelő hibridömát fúzionáltatunk.
21. Eljárás bi-specifikus hibrid monoklonális antitest előállítására, amely két specifitás fibrin, illetve egy trombolítikus anyag ellen irányul, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti polidóinát folyékony táptalajon vagy állat 'hasüregében szaporítjuk, és az említett antitestet a tenyészet felülúszójából vagy az aszcitesz folyadékból nyerjük ki.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett trombolítikus anyagként egy proteázt használunk.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteázként szöveti plazminogén aktivátort használunk.
24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteázként urokinázt használunk.
25. Eljárás vérrögök feloldására vagy eltávolítására emlős szervezetben, azzal jellemezve, hogy az említett emlősnek a 7. igénypont szerinti antitest hatásos mennyiségét adjuk be a trombolítikus anyaggal kombinálva.
26. A 7. igénypont szerinti antitest alkalmazása a trombolítikus anyaggal kombinálva vérrög feloldására vagy eltávolítására.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24354488 | 1988-09-27 | ||
| JP30192588 | 1988-11-28 | ||
| JP6294089 | 1989-03-14 | ||
| JP16487389 | 1989-06-27 | ||
| JP20893689A JP3177776B2 (ja) | 1988-09-27 | 1989-08-11 | ハイブリッドモノクローナル抗体，抗体産生ポリドーマおよび抗体含有薬剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT55445A true HUT55445A (en) | 1991-05-28 |
Family
ID=27523741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU895091A HUT55445A (en) | 1988-09-27 | 1989-09-27 | Process for producing hibride monoclonal antibodies |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5506135A (hu) |
| EP (1) | EP0363712B1 (hu) |
| JP (1) | JP3177776B2 (hu) |
| KR (1) | KR900004351A (hu) |
| CN (1) | CN1041783A (hu) |
| AR (1) | AR242832A1 (hu) |
| AT (1) | ATE140930T1 (hu) |
| AU (1) | AU628857B2 (hu) |
| DE (1) | DE68926899T2 (hu) |
| DK (1) | DK474189A (hu) |
| FI (1) | FI894551A (hu) |
| HU (1) | HUT55445A (hu) |
| IL (1) | IL91649A (hu) |
| NO (1) | NO893818L (hu) |
| PT (1) | PT91808B (hu) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030068322A1 (en) * | 1988-04-18 | 2003-04-10 | Immunomedics, Inc. | Methods of antibody-directed enzyme-prodrug therapy |
| TW212184B (hu) * | 1990-04-02 | 1993-09-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| JPH0576385A (ja) * | 1990-12-18 | 1993-03-30 | Takeda Chem Ind Ltd | キメラ抗体およびその用途 |
| AP257A (en) * | 1991-04-26 | 1993-06-03 | Surface Active Ltd | A method of releasing an antigen from an antibody and methods for their use in diagnosis and therapy. |
| WO2015053381A1 (ja) * | 2013-10-10 | 2015-04-16 | 幸成 加藤 | 抗ポドプラニン抗体 |
| SG11201910113PA (en) * | 2017-05-02 | 2019-11-28 | Nat Cancer Center Japan | Plasmin-cleavable anti-insoluble fibrin antibody-drug conjugate |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4474893A (en) * | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4714681A (en) * | 1981-07-01 | 1987-12-22 | The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center | Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same |
| ES8504461A1 (es) * | 1982-04-12 | 1985-04-16 | Hybritech Inc | Un procedimiento para obtener un polidoma. |
| US4916070A (en) * | 1986-04-14 | 1990-04-10 | The General Hospital Corporation | Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies |
| EP0241907A3 (en) * | 1986-04-14 | 1989-09-13 | The General Hospital Corporation | Heterobifunctional antibodies and method of use |
-
1989
- 1989-08-11 JP JP20893689A patent/JP3177776B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-15 IL IL9164989A patent/IL91649A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-09-23 EP EP89117622A patent/EP0363712B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-23 AT AT89117622T patent/ATE140930T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-09-23 DE DE68926899T patent/DE68926899T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-25 AR AR89314993A patent/AR242832A1/es active
- 1989-09-25 AU AU41747/89A patent/AU628857B2/en not_active Ceased
- 1989-09-26 DK DK474189A patent/DK474189A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-09-26 PT PT91808A patent/PT91808B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-09-26 NO NO89893818A patent/NO893818L/no unknown
- 1989-09-26 FI FI894551A patent/FI894551A/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-09-27 CN CN89107488A patent/CN1041783A/zh active Pending
- 1989-09-27 KR KR1019890013907A patent/KR900004351A/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-09-27 HU HU895091A patent/HUT55445A/hu unknown
-
1994
- 1994-12-29 US US08/366,366 patent/US5506135A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK474189A (da) | 1990-03-28 |
| NO893818L (no) | 1990-03-28 |
| IL91649A0 (en) | 1990-04-29 |
| KR900004351A (ko) | 1990-04-12 |
| US5506135A (en) | 1996-04-09 |
| FI894551A0 (fi) | 1989-09-26 |
| DE68926899T2 (de) | 1997-01-02 |
| DE68926899D1 (de) | 1996-09-05 |
| NO893818D0 (no) | 1989-09-26 |
| PT91808A (pt) | 1990-03-30 |
| FI894551A (fi) | 1990-03-28 |
| IL91649A (en) | 1994-10-21 |
| DK474189D0 (da) | 1989-09-26 |
| AU4174789A (en) | 1990-04-05 |
| ATE140930T1 (de) | 1996-08-15 |
| EP0363712A3 (en) | 1990-08-16 |
| AR242832A1 (es) | 1993-05-31 |
| EP0363712A2 (en) | 1990-04-18 |
| AU628857B2 (en) | 1992-09-24 |
| JP3177776B2 (ja) | 2001-06-18 |
| JPH03103175A (ja) | 1991-04-30 |
| PT91808B (pt) | 1995-05-31 |
| EP0363712B1 (en) | 1996-07-31 |
| CN1041783A (zh) | 1990-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0450479B1 (en) | Bispecific monoclonal anti-bodies, their production and use | |
| CA1315716C (en) | Monoclonal antibodies to the light chain region of human factor xii and methods of preparing and using the same | |
| JPS60231624A (ja) | ヒト‐レニンに対するモノクローナル抗体及びその使用 | |
| KR20000075734A (ko) | 혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 그의 사용 방법 | |
| JPH05304992A (ja) | ハイブリッド・モノクローナル抗体および抗体含有薬剤 | |
| HUT55445A (en) | Process for producing hibride monoclonal antibodies | |
| EP0159025B1 (en) | Monoclonal antibody specific to human alpha2-plasmin | |
| US5620688A (en) | Methods of inhibiting the activation of Factor XIII | |
| EP0139447B1 (en) | A process for preparing urokinase zymogen | |
| IE65660B1 (en) | Monoclonal antibodies specific for thrombin hirudin | |
| EP0347959B1 (en) | Antibodies against fibrin, immunogen used in their preparation, process for determining fibrin and pharmaceutical preparation based on the antibodies | |
| JPH09235300A (ja) | ヒトｔｉｍｐ−３及び抗ヒトｔｉｍｐ−３モノクローナル抗体並びにその用途 | |
| CN113474374A (zh) | 抗FXI/FXIa抗体及其用途 | |
| EP0354408A1 (en) | Anti-urokinase monoclonal antibodies | |
| EP0513778A2 (en) | Hybrid monoclonal antibodies and compositions containing them | |
| EP0396188A1 (en) | Antibodies against fibrin; immunogenic peptides suitable for preparing the antibodies, method for determining fibrin and pharmaceutical preparation based on the antibodies | |
| EP0491351A2 (en) | Chimeric antibodies and their use | |
| CN115991785A (zh) | 一种双特异性抗体、制备方法和用途 | |
| JPH0575394B2 (hu) | ||
| JPS61186399A (ja) | 抗ヒトアンジオテンシン変換酵素抗体 | |
| JPS633795A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPS61181964A (ja) | 人正常細胞由来の組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対するモノクロナル抗体を用いる免疫学的測定試薬 | |
| JPH04218389A (ja) | 二重特異性抗体および抗体含有薬剤 | |
| JPH054076B2 (hu) | ||
| JPH0995500A (ja) | モノクローナル抗体および血栓溶解促進剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |