PT91808B

PT91808B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais hibridos e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT91808B
Application number: PT91808A
Authority: PT
Inventors: Suaumu Iwasa; Tomofumi Kurorawa; Yukio Toyoda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1988-09-27
Filing date: 1989-09-26
Publication date: 1995-05-31
Also published as: DK474189A; NO893818L; IL91649A0; KR900004351A; US5506135A; FI894551A0; DE68926899T2; DE68926899D1; NO893818D0; PT91808A; FI894551A; IL91649A; HUT55445A; DK474189D0; AU4174789A; ATE140930T1; EP0363712A3; AR242832A1; EP0363712A2; AU628857B2

Description

Descrição

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal híbrido. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal híbrido (a par tir daqui referido também simplesmente como AcMo híbrido) cujas duas especificidades são respectivamente contra fibrina e contra substâncias trombolíticas e a um polidoma que produz o referido anticorpo.

A presente invenção refere-se também a um agente trombolítico constituído pelo AcMo híbrido acima mencionado e por uma substância trombolítica imunologicamente acoplada a esse AcMo.

A terapia trombolítica tem sido desde há muito tempo utilizada para tratar afecções trombóticas tais como enfarte do miocárdio, embolias arteriais e enfartes cerebrais; de início foram clinicamente aplicados a estreptoquinase (daqui em diante também designada abreviadamente

por SK), a uroquinase (daqui em diante também designada abreviadamente por UK), etc. como agentes trombolíticos eficientes. Em particular a UK tem sido utilizada de uma forma relativamente habitual uma vez que a sua acção fibronolítica é forte; no entanto falha na medida em que a sua selectividade para a fibrina é baixa e que actua igualmente sobre o fibrinogénio causando assim uma tendência para hemorragias nos pacientes tratados. Em vista desta desvantagem, passou-se a utilizar o activador de plasminogénio de tecido (daqui em diante designado abreviadamente por TPA) e a pró-uroquinase (daqui em diante designada abreviadamente por ProUK) como agentes trombolíticos de segunda geração. Uma vez que possuíam uma selectividade mais elevada para a fibrina em comparação com a UK, esperava-se que estes agentes mitigassem o efeito adverso, isto é, uma tendência para provocar hemorragias, da UK; desde então têm sido levadas a cabo numerosas investigações. Nos anos mais recentes tem vindo a crescer o número de tentativas para aplicar estes agentes em situações clínicas uma vez que a sua produção em massa se tomou pêssível graças ao uso da tecnologia de recombinação genética (European Cooperative Study Group for Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator: The Lancet, 842 (1985)).

Estas tentativas na aplicação clínica revelaram, no entanto, que o TPA, etc. possui também algumas desvantagens; por exemplo (1) o TPA possui um período de semi-vida médio muito curto (2 a 3 minutos), exigindo assim uma administração em grandes quantidades por um longo período para terapia trombolítica e (2) tais terapias com doses elevadas nem sempre proporcionam um efeito diminuidor da tendência para a hemorragia.

Nestas condições foram investigados e desen volvidos agentes trombolíticos mais eficazes; foram produzidos TPA modificado, proteínas híbridas UK-TPA ou ProUK-TPA, etc.. No que se refere a TPA modificado, preparou-se por engenharia genética uma muteína de TPA a que falta parte da estrutura da cadeia de açúcar, que é considerada uma causa da diminuição do período de semi-vida, de maneira que a cap2

tura do TPA por receptores da cadeia de açúcar dos hepatócitos é evitada para melhorar a cinética do TPA no sangue. No que se refere à proteína híbrida UK-TPA, a forte acção trombolítica da UK e a afinidade em relação à fihrina do TPA são utilizados em combinação para reduzir a quantidade administrada. Apesar de de se esperar que estes agentes tromboliticos diminuam ligeiramente a tendência para a hemorragia em comparação com os agentes tromboliticos convencionais ainda falta alcançar melhoramentos significativos em pesquisas e desenvolvimentos futuros.

Mais tarde surgirain como terceira geração de agentes tromholiticos constituídos por complexos proteicos baseados no direccionamento específico por meio de anticorpos. Quer dizer, agentes tromholiticos que lisam somente a fibrina sem lisar o fibrinogénio foram desenvolvidos por ligação química de um anticorpo que não reage sushtancialmen te sobre o fibrinogénio e que possui uma alta afinidade para com a fihrina isolada a UK (C. Bode et al.: Science, 229,

765 (1985)) ou a TPA (M.S. Punge et al.: Proceedings of the National Academy of Science, USA, 84, 7659 (1987)). Sabe-se que todos estes agentes tromholiticos que visam anticorpos exibem um efeito 5 a 100 vezes mais forte do que a UK ou 0 TPA isolados em experiências in vitro ou in vivo. Estes complexos proteicos, no entanto, possuem todos desvantagens devidas â ligação quimica de um anticorpo e de uma enzima trombolítica; por exemplo, (1) a actividade do anticorpo e a actividade enzimática diminuem durante o processo de ligação química, (2) é dificil obter-se um complexo proteico de um anticorpo com uma enzima numa razão de 1 para 1, ou (5) a desnaturação da proteica acelera 0 metabolismo do agente no corpo do paciente em tratamento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Eig. 1 mostra a curva de diluição dos anticorpos específicos anti-TPA, TPA 1-41 e TPA 1-70 preparados pelo processo EIA descrito no Exemplo de referência 2 (ver Exemplo 2).

A Fig. 2 mostra a curva de diluição dos anticorpos específicos anti-UK, UK 1-3 e UK 1-78 preparados pelo processo EIA descrito nò Exemplo de referência 3 (ver Exemplo 3).

A Fig. 3 mostra a curva de diluição do anticorpo bi-específico anti-TPA-anti-fibrina-humana ET 2-14 preparado pelo processo EIA descrito no Exemplo de rèferênci a 8 (ver Exemplo 4).

A Eig. 4 mostra a curva de diluição do anticorpo bi-especifico anti-uK-anti-fibrina-humana EU 1-74 preparado pelo processo EIA descrito no Exemplo de referênci a 9 (ver Exemplo 5).

A Fig. 5 mostra a quantidade de anticorpo bi-especifico ET 2-14 preparado no Exemplo 4-(3) ligado a um disco de papel acoplado com fibrina. Na Eig. 5 o simbolo mostra os resultados obtidos na presença de fibrinogenio (3 mg/m ); o simbolo mostra os resultados obtidos na ausên cia do fibrinogénio (ver Exemplo 6).

A Fig. 6 mostra os resultados de comparação da actividade enzimatica entre o imunocomplexo ( · ) de TEA e o anticorpo bi-especifico ET 2-14 preparado no Exemplo 4-(3) e TEA simples (o ) (ver Exemplo 7).

A Fig. 7 mostra a capacidade de fibrinólise de TEA em grãos de Cellulofine ligados a fibrina pré-tratados com o anticorpo bi-específico ET 2-14 preparado no Exemplo 4-(3) (TEA/FT 2-14) e em grãos de Cellulofine ligados a fibrina não tratados (TEA) (ver Exemplo 8).

A Eig. 8 mostra a capacidade de fibrinólise de UK simples, do imunocomplexo de UK e do anticorpo bi-específico ET 2-14 preparado no Exemplo 5-(3) (ver Exemplo 9).

A Eig. 9 mostra a capacidade fibronolítica obtida quando se usa ο 1EA isolado ou TEA e ET 2-14, o anticorpo bi-específico preparado no Exemplo 4-(3) em combinação (O) e a capacidade fibronolí tica obtida quando se utiliza UK isolado ou UK e FU 1-74, o anticorpo bi-específico preparado no Exemplo 5-(3) combinados (·) (ver Exemplo 10).

A Fig. 10 mostra os resultados da intensi4 ficação da capacidade trombolítica do TPA por FT 2-14, o anticorpo bi-específico preparado no Exemplo 4-(3), no modelo de trombo da veia jugular do coelho (ver Exemplo 11).

A Fig. 11 mostra a curva de diluição do sobrenadante da cultura de FU 2-16, o hibridoma de rato que produz o anticorpo bi-específico anti-uK anti-fibrina-humana e que foi preparado no Exemplo 13 (ver Exemplo 13).

A Fig. 12 mostra as curvas de diluição respectivamente de uK 1-3, 1-87 e 1-6, preparados pelo processo de EIA descrito nos Exemplos de referência 3 e 10 (ver Exemplos 3, 12 e 14). A Fig. 12 (A) mostra a reactividade em relação a UK; A Fig. 12 (B) mostra a reactividade em relação a uK de baixa molecular.

A Fig. 13 mostra as curvas de inibição da actividade enzimática dos anticorpos monoclonais anti-UK respectivamente UK 1-3, 1-87 e 1-6 obtidas pelo teste de neutralização de actividade enzimática de UK descrito no Exemplo de referência 11 (ver Exemplos 3, 12 e 15).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Com o objectivo de resolver os problemas acima mencionados relacionados com o metabolismo in vivo, com a afinidade para com a fibrina, com a capacidade trombolítica, etc. e tendo em atenção a nova tecnologia recentemente desenvolvida de anticorpos monoclonais híbridos bi-específicos, os autores da presente invenção prepararam um imunocomplexo de anticorpos monoclonais híbridos bi-específicos e de substâncias trombolíticas numa razão de 1 para 1 isento de degradação da sua actividade de anticorpo e da actividade trombolítica através de uma acoplamento imunológico de uma substância trombolítica ao anticorpo monoclonal híbrido bi-específico, desenvolvendo assim um agente trombolítico específico de fibrina sem quaisquer efeitos adversos. Deste modo, a presente invenção proporciona um AcMo híbrido específico cujas duas especificidades são respectivamente contra fibrina e contra substância trombolítica e um polido5

ma que produz este anticorpo.

A presente invenção proporciona também um agente trombolítico constituído pelo anticorpo monoclonal híbrido bi-específico acima mencionado e por uma substância trombolítica que é imunologicamente acoplada ao referido anticorpo.

Qaulquer hibridoma produtor de anticorpos anti-fibrina pode ser utilizado para a presente invenção desde que produza um AcMo específico de fibrina que não se ligue substancialmente com fibrinogénio. Por exemplo, é preparado um anticorpo específico de fibrina usando como imunogénio um peptídeo fragmentário N-terminal da cadeia x ou de um peptídeo fragmentário N-terminal da cadeia B da fibrina resultante da fibrinólise (K. Y. Hui et al.: Science, 222, 1129 (1983) ou a publicação de patente japonesa não examinada N. 938U0/1988;. Não obstante o facto de qualquer fibrina ser aceitável, desde que seja de origem animal, é preferida a fibrina humana; é especialmente preferível utilizar um peptídeo correspondente à porção de fibrina humana N-terminal da cadeia B. 0 anticorpo especifico de fibrina obtido por este processo é acoplado com uma proteína suporte e em seguida imuniza-se um animal (p.ex. coelho, ratazana, rato, cobaiaj para se obterem células produtoras de anticorpos.

As células produtoras de anticorpos, tais como esplenócitos ou células dos gânglios de linfáticos, são em seguida recolhidas do animal imunizado e fundidas com células de mieloma. As células de hibridoma obtidas por este processo são sujeitas a selecção para separação das células produtoras de anticorpos que não reagem substancialmente com fibrinogénio e que se ligam especificamente com fibrina. JÉ preferível que ⁰ peptídeo N-terminal da cadeia B da fibrina humana tenha a seguinte sequência de ácidos aminados:

H-Gly-His-Arg-Bro-Leu-Asp-hys-R-Cys-OH onde R representa um peptídeo representado por Lys-Arg-Glu-Glu ou uma parte deste peptídeo. u Cys C-terminal é utilizado para a porção de adaptação para a ligação química com a proteína de suporte. Lesta maneira é possível para ligar qui

micamente o peptideo a uma proteína de suporte pelo grupo SH da Cys C-terminal do peptideo introduzindo previamente um grupo maleimida por reacção da proteína de suporte com N-(£-maleimidobutiriloxisuccinimida) (daqui em diante também designada abreviadamente por GMBS) ou introduzindo um grupo ditiopiridilo por reacção com a proteína de suporte com 3-(2-piridilditio)-propionato de N-hidroxisuccinimida (daqui em diante também designada abreviadamente por SPDP).

Qualquer substância trombolítica pode ser utilizada para a presente invenção, desde que seja uma proteína capaz de trombólise ou uma substância que promove trombólise. Exemplos de tais substâncias incluem proteases ou um seu percursor e promotores de trombólise (p.ex. TPA, UK, ProUK, SK, tripsina, plasmina, proteína G e proteína S). É' preferível’ utilizar uma protease; TPA, UK, etc. são especialmente preferidos. Não interessa se o TPA é de cadeia simples ou dupla. Quanto à UK pode-se utilizar UK, proUK, etc., de baixa massa molecular de cadeia simples ou dupla (E. Haber et al.: Science, 243,51 (1989)). Para a preparação de hibridomas produtores de anticorpos é utilizável o método no qual um animal é imunizado com a proteína acima mencionada de acordo com um método normal e as células produtoras de anticorpos resultantes são fundidas com células de mieloma ou outras células. Especialmente, como método para a produção de hibridomas produtores de anticorpos, é preferível utilizar células produtoras de anticorpos obtidas através da imunização de animais com UK de baixa massa molecular. Pode-se utilizar um procedimento análogo ao método para a produção de hibridomas produtores de anticorpos anti-fibrina atra vés da imunização de um animal seguida de fusão das células produtoras de anticorpos com células de mieloma ou outras células na obtenção de hibridomas que produzem um anticorpo contra substâncias trombolíticas.

Exemplos de animais utilizados para a imunizaçãoincluem coelhos, ratazanas, ratos e cobaias. ϋ especialmente preferível a utilização de ratos no caso da produção de AcMo. A inoculação pode ser levada a cabo de acordo

com um método normal; por exemplo, inoculam-se por via subcutânea ou intraperitoneal no dosro ou no abdómen 3 a 6 vezes com intervalos de 2 a 3 semanas 1 a 100 Pg, de preferência 10 a 25 pg de proteína imunogénica em emulsão em quantidades iguais (0,1 nuC) de solução salina fisiológica e de adjuvante completo de Preund.

Lestes animais imunizados, p.ex. ratos, seleccionam-se os indivíduos com alto grau de concentração de anticorpos; são recolhidos o baço e/ou gânglios linfáticos nos 3 a 5 dias seguintes â imunização final; as células produtoras de anticorpos contidas nos órgãos retirados são fundidas com células de mieloma. Esta fusão pode ser alançada de acordo com o procedimento de um método conhecido. Os exemplos do fusogénio incluem polietileno-glicol (daqui em diante também designado abreviadamente por PEG) e vírus Sendai. É preferível utilizar-se PEG. Exemplos de estripes de células de mieloma que podem ser utilizadas incluem NS-1, P3U1 e SP2/0; é preferível utilizar-se P3U1. A proporção entre por exemplo os esplenócitos e as células de mieloma é de preferência de entre 1 e 10 dos primeiros para 1 das últimas. Recomenda-se que seja adicionado PEG com um peso molecular de 1000 a 6000 â mistura para se alcançar uma concentração de 10 a 80% e que a incubação seja levada a cabo a uma temperatura de 20 a 37°C, de preferência 30 a 37°C durante 3 a 10 minutos.

Podem ser utilizados diversos métodos para a selecção de hibridomas produtores de anticorpos anti-fibrina. Por exemplo, após a adsorção de fibrinogénio numa microplaca o fibrinogénio é convertido em fibrina pela acção da trombina. Em seguida é adicionado o sobrenadante da cultura de hibridomas â microplaca de imobilizado de fibrina em presença de excesso de fibrinogénio, seguido da determinação do titulo de anticorpos no sobrenadante da cultura por análise enzimática imunológica (daqui em diante também designada abreviadamente por EIA) para anticorpos específico anti-fibrina ligados a placas. Os hibridomas que se verifica serem positivos em relação ao título de anticorpos são seleccic

nados e alimentados utilizando um meio suplementado com nAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) e são imediatamente sujeitos a clonagem o que normalmente é facilmente conseguido por análise de diluição limitante, etc.. 0 hibridoma produtor de anticorpos monoclonais específicos anti-fibrina desejados pode ser obtido através da determinação do título de anticorpos do sobrenadante da cultura de hibridomas clonada pelo método acima descrito e da selecção de um hibridoma que produz de uma maneira estável um anticorpo com um título mais alto.

Exemplos de hibridomas produtores de anticorpos anti-fibrina preparados de acordo com o método de produção acima descrito incluem PIB 1-11 e PIB 2-11, ambos descritos no Exemplo 1 apresentado seguidamente.

A selecção de hibridomas que produzem um anticorpo contra substâncias trombolíticas pode ser facilmente obtida por EIA utilizando uma microplaca na qual foi adsorvida a substância trombolitica. A clonagem pode ser conduzida de acordo com o método normal descrito acima para se obter o hibridoma produtor de anticorpos desejado.

Exemplos de hibridomas produtores de anticorpos anti-TPA preparados de acordo com o método de produção acima mencionado incluem TPA 1-41, TPA 1-70 e TPA 2-14 descritos no Exemplo 2 apresentado seguidamente. Os exemplos de hibridomas produtores de anticorpos anti-ϋΚ incluem UK

1-5, UK 1-87, ambos descritos no Exemplo 5 apresentado seguidamènte e UK 1-6 descrito no Exemplo 12.

Existem ao dispor alguns métodos para a preparação de um polidoma que produz o AcMo híbrido bi-especifico da presente invenção (p.ex. Hiroshi Aramoto et al:. Protein, Eucleic Acid and Enzyme, 55» 217 (1988j). Apesar de qualquer um destes métodos poder ser utilizado pode-se fazer menção (1; ao método em que o hibridoma resistente a nAT acima mencionado que produz um anticorpo contra a substância trombolitica é aclimatizado passo a passo a um meio de cultura suplementado com 5-bromodesoxiuridina (daqui em diante também designada abreviadamente por BrdU), efectuando em se-

guida a clonagem da estirpe deficiente em quinase de timidina para a tornar sensível a HAT; de modo semelhante um hibridoma produtor de anticorpos específicos anti-fibrina resistente a HAT é tornado resistente a 8-azaguanina (daqui em diante também designada abreviadamente por AZG), efectuando em seguida a clonagem de uma estirpe deficiente em transferase de hipoxantina-guanina-fosforrilbosilo para a tornar sensível a HAT; os tetraomas obtidos pela fusão destes dois hibridomas clonados de acordo com o método normal são submetidos a selecção utilizando um meio suplementado com HAT para um tetraoma que segrega um AcMo híbrido capaz de se ligar tanto â fibrina como à substância trombolítica o qual é em seguida cionado; e (2) o método no qual um hibridoma produtor de anticorpos específicos anti-fibrina é marcado com isocianato de fluoresceína (daqui em diante designado abreviadamente por FITC) e outro hibridoma que produz um anticorpo contra substâncias trombolíticas é rotulado com isotiocianato de tetrametil-rodamina (daqui em diante designado abreviadamente por TRITC), efectuando em seguida a fusão destes dois hibridomas de acordo com um método normal; a suspensão de células obtida é aplicada a um classificador de células activadas com fluoresceína (daqui em diante designadas abreviadamente por FACS) para seleccionar e clonar o tetraoma contendo tanto a fluorescência verde do FITC como a fluorescência vermelha do TRITC. Também é possível utilizar marcadores das duas estirpes progenitoras ao contrário para se seleccionar e clonar o tetraoma.

Na fusão de célula utilizando estes procedimentos podem ser empregues um fusogénio tal como vírus Sendai ou PEG, estimulação eléctrica ou outros meios. í preferível utilizar-se FEG. Mais adiante é apresentado um exemplo, o qual no entento não deve ser interpretado como limitativo. Normalmente e utilizado PEG com um grau de polimerização de cerca de 1 000 a 6 000 numa concentração de cerca de 10 a 80% para um tempo de tratamento de cerca de 0,5 a 30 minutos. Pode-se obter uma fusão eficiente sob condiçbes preferenciais, por exemplo, mantendo 35 a 55% de PEG 6 000

em contacto com as células a 37°C durante cerca de 4 a 10 minutos.

A selecção do polidoma pode ser conseguida utilizando o meio suplementado com HAT etc. acima mencionado Com este fim é conduzida uma aclimatização química utilizando 8-AZG, 6-tioguanina (6-TG) ou 5-BrdU para se obterem estirpes resistentes aos respectivos agentes químicos. Podem ser usados diversos meios de selecção através da introdução de um novo marcador em células fundidas. Exemplos destes meios de selecção incluem meio suplementado com neomicina e meio suplementado com higromicina B (B. Sugden et al.: Molecular and Cellular Biology, 5, 410 (1985)).

Existe ainda outro método no qual dois hibridomas marcados com pigmentos fluorescentes diferentes são fundidos conjuntamente efectuando-se em seguida a separação de um hibridoma híbrido duplamente marcado utilizando EACS (L. Karawajew et al.: Journal of Immnnological Methods, 96, 265 (1987)).

Podem ser utilizados diversos métodos para a selecção de polidomas produtores de anticorpos. Por exemplo é possível utilizar-se na combinação apropriada os métodos seguintes ou as suas modoficaçOes: (1) combinação dos procedimentos EIA acima mencionados respectivamente para a selecção de hibridomas produtores de anticorpos específicos anti-fibrina e para a selecção de hibridomas que produzem uma anticorpo contra substâncias trombolíticas, (2) EIA para a detecção de anticorpos híbridos bi-específicos através da adição do sobrenadante da cultura em questão a uma micro-placa contendo fibrina acoplada e depois adicionando uma substância trombolítica rotulada com HEP e, quando se utilizar um anticorpo contra uma substância trombolítica que pertença a uma subclasse diferente do anticorpo específico anti· -fibrina, (5) EIA para a detecção de um anticorpo bi-específico através da adição do sobrenadante da cultura submetido a uma micro-placa contendo fibrina acoplada e depois adicionando-se o anticorpo específico parara subclasse IgG anti-rato marcado com HEP.

Os polidomas que se verificou serem positivos para a actividade de anticorpos híbridos são imediatamente submetidos a clonagem, o que normalmente é facilmente alcançável através de análise de diluição limitante etc.. O polidoma produtor de anticorpos híbridos monoclonais pode ser obtido por meio da determinação do título em anticorpos do sobrenadante da cultura de polidoma clonado pelo método acima descrito e seleccionado um polidoma que produza de forma estável um anticorpo com alto título.

polidoma acima mencionado da presente invenção pode normalmente ser cultivado em meio líquido ou na cavidade intraperitoneal de animais (p.ex. mamíferos tai£ como ratos) através de um método conhecido. Podem ser utilizadas técnicas bioquímicas conhecidas em combinação para purificar o anticorpo no caldo de cultura e no fluído ascítico. Por exemplo o caldo de cultura celular ou fluído ascítico é centrifugado; o sobrenadante resultante é tomado e submetido a precipitação por aumento da concentração de sais (normalmente utilizando-se sulfato de amónia ou sulfato de sodio). U precipitado proteico resultante é dissolvido numa solução apropriada e dialisado seguido de uma cromatografia em coluna (coluna de permuta de ibes, coluna de gel de filtração, coluna de proteína A, coluna de hidroxiapatite, etc.; para separar e purificar o anticorpo pretendido. Exte procedimento de purificação e separação dá cerca de 1 a 5 mg de AcMo híbrido com uma pureza de cerca de 80% numa razão por peso proteico de 1 de sobrenadante da cultura, por exemplo. 0 mesmo anticorpo pode ser obtido com um rendimento de 3 a 10 mg a partir de 20 ml de fluído ascítico.

AcMo híbrido obtido deste modo é uma proteína homogénea; o tratamento desta proteína com protease (p.ex. pepsinaj etc. dá E(ab’j2 ou outro fragmento capaz de ser ligado tanto a fibrina:como a substância trombolíti— ca, podendo qualquer das referidas substâncias ser utilizada para o mesmo fim com o AcMo híbrido da presente invenção.

Exemplos do polidoma produtor de anticor12

pos híbrido preparado de acordo com o método de produção acima mencionado incluem os tetraomas descritos nos Exemplos 4, 5 e 13 apresentados em seguida.

Para além dos tetraomas formados entre um hibridoma produtor de AcMo anti-fibrina e outro hibridoma que produz um anticorpo contra a substância trombolítica, mencionados acima como exemplos dos polidomas que produzem o AcMo híbrido da presente invenção, podem-se utilizar triomas formados entre um hibridoma que produz um AcMo e uma célula que produz outro AcMo, os hibridomas obtidos através da fusão de células que produzem o respectivo AcMo após terem sido imortalizadas com vírus de Epstein-Barr' etc. e outros hibridomas com o mesmo objectivo desde que produzam o AcMo híbrido da presente invenção.

Quando estes polidomas produzem AcMo de IgG de rato é possível preparar um anticorpo quimérico rato-humano através da obtenção de um ADN que codifica para uma região variável ou hiper-variável contendo o local de reconhecimento antigénico para este AcMo híbrido bi-específico e em seguida ligando um gene que codifica para a região constante de IgG humana a este ADN utilizando uma técnica de manipulação genética (Z. Steplewski et al.: Proceedings of the National Academy of Science, USA, 85, 4852 (1988)). Este anticorpo quimérico é de preferência utilizado por causa da sua antigenicidade baixa na administração em seres humanos.

Existem ao dispor alguns métodos para a terapia trombolítica utilizando o AcMo híbrido bi-específicc da presente invenção ou um complexo proteico trombolítico selectivo preparado a partir de uma substância trombolítica e do AcMo híbrido bi-específico incluindo (1) o método no qual o AcMo híbrido da presente invenção é previamente administrado ao paciente que sofre da afecção trombótica após decorrer o tempo suficiente para permitir a ligação com o trombo formado no corpo do paciente é administrada uma substância trombolítica tal como TPA ou UK, (2) o método no miai o AcMo híbrido e uma substância trimbolítica são administra- 13

dos ao paciente que sofre da afecção trombótica de uma só vez e (3) o método no qual o AcMo híbrido e a substância trombolítica são feitos reagir previamente e, depois da separação da porção não reagida da substância trombolítica, o complexo proteico trombolítico selectivo obtido é administrado ao paciente da afecção trombótica.

agente trombolítico, AcMo híbrido ou substância trombolítica da presente invenção, pode ser preparado sob a forma de uma injecção etc. directamente ou em mistura com um veículo farmacologicamente aceitável apropriado, com excipientes, diluentes, etc. após remoção dos microorganismos por filtração através de um filtro de menbrana etc., conforme for necessário, e pode ser administrado a mamíferos (p.ex. ratos, ratazanas, gatos, cães, porcos, bois, macacos, seres humanos) com o objectivo de tratamento de afecções trombóticas ou obstrutivas tais como enfarte do miocárdio, obstrução arteriovenosa periférica, obstrução arteriovenosa da retina, enfarte cerebral e embolisa, digo, embolia pulmonar.

Se bem que dependa do tipo da doença visada, dos seus sintomas e da via de administração, a dose diária do agente trombolítico da presente invenção em administração intravenosa em pacientes de enfarte do miocárdio adultos, por exemplo,é normalmente cerca de 0,02 a 1 mg/ kg, de preferência cerca de 0,04 a 0,4 mg/kg como AcMo híbrido e, para substâncias trombolíticas, cerca de 0,01 a 0,5 mg/kg, de preferência cerca de 0,02 a 0,2 mg/kg como TFA e cerca de 0,01 a 0,5 ^mê/2:g, de preferência cerca de 0,02 a 0,2 mg/kg de UK.

AcMo híbrido da presente invenção é capaz de se ligar especificamente a fibrina, embora não reaja substancialmente com fibrinogénio, e liga-se especificamente a uma substancia trombolítica sem prejudicar a sua capacidade de fibrinólise. É portanto possível preparar-se facilmente um imunocomplexo 1:1 do AcMo híbrido com uma substância trombolítica; o seu uso em combinação permite a lise ou a remoção selectiva e eficiente do trombo.

método descrito anteriormente permite a lise e a remoção selectiva e eficiente do trombo através do uso do AcMo híbrido da presente invenção, o qual é capaz de se ligar especificamente ao local do trombo visado e não se liga especificamente com fibrinogénio, em combinação com uma substância trombolítica.

EXEMPLOS

A presente invenção é seguidamente descrita em mais pormenor por meio dos exemplos de referência e de exemplos de trabalho que se seguem; estes exemplos não devem ser interpretados como limitativos do objectivo da presente invenção.

As linhas de células utilizadas nos exem-

pios foram deposil segue.	;ados tal	como se mostra no	quadro que se
linha de células	(IEO)	(FRI)
animal		IEO NS.	PERM NS.
Hibridoma de rato	EIB 1-11	50174	BP-2081
Hibridoma de rato	EIB 2-11	5017 5	BP-2U82
hibridoma de rato	TPA 1-41	50178	BP-2085
Hibridoma de rato	TPA 1-70	50179	BP-2086
hibridoma de rato	TPA 2-14	50194	BP-2519
hibridoma de rato	UK 1-5	50176	BP-2085
Hibridoma de rato	UK 1-87	50177	BP-2084
Hibridoma de rato	UK 1-6	50208	BP-2548
hibridoma híbrido	de rato
(tetraoma) FT2-14		50180	BP-2158
hibridoma híbrido	de rato
(tetraoma) FU1-74		50185	BP-2554
hibridoma híbrido	de rato
(tetraoma) EU 2-16		50207	BP-2547

IFO: Institute for Fermentation, Osaka

FRI: Fermentation Research Institute, Ministry of International Trade and Industry

Na especificação presente os ácidos aminados e os peptídeos são representados por abreviaturas baseadas no sistema de abreviaturas adoptado pela IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CNB); sãô dadaS abaixo abreviaturas exemplo. Note-se que quando há uma possibilidade da existência de um isómero óptico nos ácidos aminados determinado, etc., deverá considerar-se o isómero 1 a não ser quando especificado em contrário.

Gin:	residuo	de	glutamina
Asp :	resíduo	de	ácido aspártico
Pro :	resíduo	de	prolina
Tyr:	resíduo	de	tirosina
Vai:	resíduo	de	valina
Dys :	resíduo	de	lisina
Glu:	res íduo	de	ácido glutâmico
Ala:	resíduo	de	alanina
Asn:	res íduo	de	asparagina
leu:	resíduo	de	leucina
Phe:	resíduo	de	fenil alanina
Gly:	resíduo	de	glicina
His :	resíduo	de	histidina
S er:	resíduo	de	serina
Thr:	resíduo	de	treonina
Ile:	res íduo	de	isoleucina
Trp :	resíduo	de	triptofano
Arg:	resíduo	de	arginina
Met:	resíduo	de	metionina
Cys:	resíduo	de	cisteína
Exemplo de	Referência 1

(EIA para medição do anticorpo anti_fibrina)

Depositou-se numa microplaca de 96 alvéo- 16 -

los uma solução de monómero de fibrina humana de 1 mg/m£ numa solução de tampão de fosfato (PBS, pH 7,3) contendo ureia 3,3 M e 0,01% de ELTA a 50 \iQ> por alvéolo. Após deixar esta microplaca a 4°C de um dis para o outro adicionaram-se lbu de PBS contendo 2% de caseína e u,ul% de timerosal a fim de se preparar uma placa sensível. Misturou-se em seguida uma solução de fibrinigénio humano a 10 mg/mJ2 em PBS contendo 100 unidades/m£ de heparina e fluoride de fenilmetilsulfonilo 3 mM com uma quantidade igual do hibridoma em questão. Após reacção a temperatura ambiente durante 30 minutos adicionaram-se 100 Ρ-β da mistura & placa sensibilizada por fibrina acima mencionada, fazendo-se reagir em seguida à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem cuidadosa da placa com PBS contendo 0,5% de Tween 20 (PBS-TW) adicionou-se um anticorpo de coelho anti-IgG de rato marcado com peroxidase de rábano-bastardo (HEP) e em seguida deixou-se reagir a temperatura ambiente durante 2 horas.

Após a lavagem da placa, adicionou-se a cada alvéolo uma solução de tampão de citrato 0,1 M contendo ortofenilenodiamina e -^02 ^como substratos enzimáticos, efectuando-se em seguida a reacção enzimática á temperatura ambiente. Após o fim da reacção por adição de ácido sulfúrico 1 N o pigmento colorodi foi quantificado num comprimento de onda de 492 nm utilizando um Multiscan (produzido por Elow Co).

Exemplo de Referência 2 (EIA para a medição do anticorpo anti-TPA)

Depositou-se uma solução de 5 pg/m-? de TPA numa microplaca de 96 alvéolos a 100 yQ por alvéolo e deixou-se em repouso a 4°C de um dia para o outro, adocionando-se em seguida 150 de PBS contendo 2% de caseína e 0,01% de timerosal para preparar uma placa sensível. Após remoção da solução acima mencionada e lavagem da placa com PBS-TW adicionaram-se 100 μ-í? do sobrenadante da cultura do hibridoma em questão e em seguida deixou-se reagir à tempe- 17 ratura ambiente durante 2 horas. Em seguida levou-se a cabo a reacção enzimática pelo método do Exemplo de refereência e determinou-se o título em anticorpo.

Exemplo de Referência 3 (EIA para a medição de anticorpos anti-UK)

Após, se ter preparado uma placa sensibilizada por UK, da mesma maneira que no Exemplo de referênci mas utilizando UK em lugar do TPA, determinou-se o título em anticorpos anti-UK do mesmo modo.

Exemplo de Eeferência 4 (EIA para a medição de anticorpo híbrido anti-fibrina-anti-TPA (1))

Adicionou-se a uma placa sensibilizada com fibrina, preparada de modo análogo ao descrito no Exemplo de referência 1, o sobrenadante da cultura do hibridoma em questão e em seguida deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a lavagem da placa com PBS-TW adicionou-se TPA marcado com biotina e deixou-se reagir a temperatura ambiente durante 2 horas. Adicionou-se em seguida um complexo avidina-HEP e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 1 hora; a actividade do HEP ligado à fase sólida foi determinada pelo método do Exemplo de referência 1.

Exemplo de Eeferência 5 (EIA para a medição de anticorpo híbrido anti-fibrina-anti-UK (1))

Seguiu-se o procedimento do Exemplo de referência 4 com _a diferença de que se utilizou-se UK marcada com biotina em vez de TPA marcado com biotina. Em seguida determinou—se o título em anticorpo híbrido anti—fibrina-anti-UK de modo idêntico.

(Ensaio de neutralisação da fibrinólise)

Adicionou-se a uma solução de TPA (concentração final 20 ng/nU?) ou a uma solução de UK (concentração final 25 ng/m^j uma diluição do sobrenadante da cultura do hibridoma em questão e em seguida deixou-se reagir a 37°C durante 1 hora. A mistura reaccional foi em seguida depositada numa placa de fibrina-agarose a 5 P-é’ por alvéolo e em seguida deixou-se em incubação a 37°C durante 2 a 6 horas. Mediu-se o diâmetro da placa de fihrinólise resul tante para determinar a capacidade do AcMo no sobrenadante da cultura do hibridoma para neutralizar a actividade enzi mática do TPA ou da UK.

Exemplo de Referência 7 (EIA para a medição de anticorpo híbrido anti-fihrina-anti-TPA (2))

Numa placa sensibilizada com TPA, preparada como descrito no exemplo de referência 2, adicionou-se a solução em questão contendo 0 anticorpo híbrido e em seguidaçdeixou-se reagir â temperatura ambiente durante 2 horas. Após a lavagem da placa com PBS-TW adicionou-se um anticorpo (cadeia específica ϊ1) anti-IgGl de rato marcado com hEP (disponível comercialmente de Cosmo-Bio K.K.) e em seguida deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem cuidadosa com PBS-TW determinou-se a actividade da HEP ligada â fase sólida pelo método do Exemplo de referência 1.

Exemplo de Eeferência 8 (EIA para a medição de anticorpo híbrido anti-fibrina-anti-TPA (3))

Adicionou-se a uma placa sensibilizada com TPA, preparada como descrito no Exemplo de referência 2

a solução em questão contendo o anticorpo híbrido e em seguida deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a lavagem da placa com PBS-TW adicionou-se o complexo da cadeia B de fibrina humana com o peptídeo N-terminal (l-ll)-BSA, descrito no exemplo 1-(1), marcado com biotina e em seguida deixou-se reagir â temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida adicionou-se um complexo de avidina-HEP e deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 1 hora; determinou-se a actividade da HRP ligada à fase sólida pelo método do Exemplo de referência 1.

Exemplo de Referência 9 (EIA para a medição de anticorpo híbrido anti-fibrina-anti-uK (2))

Adicionou-se a uma placa sensibilizada com uK, preparada como descrito no Exemplo de referência 3> a solução em questão contendo o anticorpo híbrido e em seguida deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a lavagem da placa com PBS-TW adicionou-se o complexo da cadeia B de fibrina humana com o peptídeo N-terminal (l-ll)-BSA, descrito no exemplo l-(l), marcado com biotina e em seguida deixou-se reagir à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida adicionou-se um complexo de avidina-HRP e deixou-se reagir â temperatura ambiente durante 1 hora; determinou-se a actividade da HRP ligada â fase sólida pelo método do Exemplo de referência 1.

Exemplo de Referência 10 (EIA para a determinação do título de anticorpos anti-uK de baixo peso molecular)

Após preparação de uma placa sensibilizada com UK de peso molecular baixo (uK de peso molecular baixo de cadeia dupla, comercializada por JCR Co.) em vez do TPA descrito no Exemplo de referência 2, determinou-se o título de anticorpos anti-UK de baixo peso molecular pelo mesmo processo.

Exemplo de Referência 11 (Ensaio de neutralização da actividade enzimática de UK)

Adicionou-se a uma solução de UK (concentração final 1,7 jug/m^⁷) uma solução do anticorpo 'em questão e levou-se a cabo a reacção à temperatura ambiente durante 30 minutos. A mistura de reacção adicionou-se substrato de peptídeo sintético S-2444 (paranitroanil ida de piroglutamil-glicil-arginilo 1 mM, produzido por Kabi Co.). Após reacção a 37°C durante 15 minutos determinou-se a paranitroanilida libertada (absorvência a 405 nm).

Exemplo 1 (Preparação de bibridomas que produzem anticorpos monoclonais anti-fibrina humana) (1) Preparação de imunogene

A uma solução aquosa de 12 mg/2 de albumina de soro de bovino (BSA), previamente submetida a maleimidação com GMBS (os grupos maleimido foram introduzidos a 15 moles por mole de BSA), foram adicionados 3,3 mg de um peptídeo N-terminal de cadeia B de fibrina humana (1-11)-Cys, preparado pelo método de síntese de fase sólida conhecido utilizando um sintetizador de peptídeos (modelo 430A, Applied System Co.), seguido de reacção a 30°C durante 1 hora para se obter um complexo (1-11)BSA de peptídeo N-terminal de cadeia B de fihrina humana. Após 3 fases de diálise com uma solução salina fisiológica (3 & x 3), este complexo foi guardado sob condiçOes de congelamento e depois utilizado como imunogene.

(2) Imunização

A uma solução de complexo peptídeo-BSA a 1 nig/nr^ em solução salina fisiológica adicionou-se umà quantidade igual de adjuvante de Ereund completo e em seguida

procedeu-se a imunização subcutânea de ratos (·?, n=10:0,l mg/0,2 m^/rato no dorso e no abdómen. Efectuou-se uma imunização adicional através da inoculação do imunogene em combinação com uma quantidade igual de adjuvante de Freund incompleto por vezes digo 5 vezes com intervalos de 2 a 3 s emanas.

(3) Fusão celular dias após a imunização final, retirara» -se os baços e preparou-se uma suspensão de esplenócitos segundo um método normal (cerca de 10 células). Após adição de 2 x 10⁷ células de mieloma de rato (P3U1), efectuou -se a fusão celular de acordo com o método de Kohler e Mils tein (Nature, 265, 495 (19750) utilizando PEG 6000.

Após terminar a fusão, a mistura celular foi suspensa em meio HAT, que contém hipoxantina, aminopterina e timidina, e em seguida cultivou-se durante 10 dias. Imediatamente após terminar a selecção das células progenitoras o meio HAT foi substituído por meio HT, no qual não existe amipterina, continuando-se depois a cultura.

(4) Selecção e clonagem dos hibridomas título do sobrenadante da cultura de Hibridoma em anticorpos foi determinado pelo processo de EIA descrito no Exemplo de referência 1, o qual utiliza uma microplaca que contém, adsorvido monómero da fibrina humana como fase sólida. 10 a 20 dias após a fusão apareceram os hibridomas e detectou-se um anticorpo que se liga de modo específico à fibrina humana. Submeteram-se a clonagem através de análise de diluição limitante os hibridomas que se verificou terem uma avidez especialmente forte.

sobrenadante da cultura dos hibridomas clonados foi submetido _a selecção por EIA; os hibridomas com forte avidez em relação â fibrina humana foram seleccio nados.

Como resultado obtiveram-se hibridomas de rato FIB 1-11 e FIB 2-11 produzindo ambos um AcMo que se liga dé forma especifica a fibrina na presença de altas con centrações de fibrinogénio. Os anticorpos FIB 1-11 e FIB

2-11 produzidos respectivamente por estes dois hibridomas foram ambos identificados como IgG^ em classe e subclasse de imunoglobulina pelo método de Ouchterlony.

Estes anticorpos específicos anti-fibrina-humana EIB 1-11 e EIB 2-11 foram determinados na presença e na ausência de fibrinogénio pelo procedimento de EIA descrito no Exemplo de referência 1. Os resultados são apresentados no Quadro 1. Notar que o anticorpo anti fibrinogénio humano EIB 2-162 foi utilizado como comparação.

Quadro 1 EIA para a medição de anticorpos anti-fibrina

Absorvância óptica (492 nm)

Anticorpo monoclonal na ausência de fibrinogénio na presença de fibrinogénio '

EIB 1-11 FIB 2-11 EIB 2-162

0,50 0,20

0,51 0,16

0,32 0,01

1) ; EIA descrito no Exemplo de referência 1.

2) : Concentração final 5 mg/m-£

Exemplo 2 (Preparação de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais anti-TPA de rato) (1) Imunização

Adicionou-se a uma solução de 200 pg/mf de TPA de cadeia simples disponível cpmercialmente (obtido de Chuo Kagaku Kogyo K.K.) em solução salina fisiológica uma quantidade igual de adjuvante de Ereund. Esta emulsão foi administrada por via subsutânea a ratos BALB/c ($, 20 pg/0,2 m-fyrato) no dorso e no abdómen e em seguida procedeu-se a imunização de reforço a intervalos de 2 a 3 semanas. Adminis· trou-se por via intravenosa uma solução de antigene TPA (50 Pê/θ,Ι m-6 de solução de salina fisiológica/ rato) a animais

que tinham o título máximo em anticorpos no soro nos dez dias a seguir ás três vezes, da imunização de reforço.

(2) Fusão celular

A fusão celular, das células, foi conduzida de acordo com ométodo descrito no Exemplo l-(3)· (3) Selecção e clonagem de hibridomas

Os hibridomas foram separados pelo processo EIA descrito no Exemplo 2 de referência, que usa uma micrOplaca contendo TPA ligado. Em seguida, procedeu-se de acordo com o processo do Exemplo l-(4) para obter hibridomas que produzem AcMo-anti-TPA. Além desses hibridomas foram obtidos um hibridoma TPA 1-41 de rato, que produz um AcMo de anti-TPA, que se liga especificamente ao TPA sem prejudicar a capacidade de fibrinólise, um hibridoma TPA 1-70 de rato, que produz um anticorpo que neutraliza o TPA, e um hibridoma TPA 2-14 de rato que produz um anticorpo que não neutraliza 0 TPA e que se liga a TPA com o inibidor activador de plasminogénio (PAI) de modo competitivo. Us anticorpos TPA 1-41, TPA 1-70 e TPA 2-14 produzidos respectivamente por estes três hibridomas foram identificados respectivamente como IgG2b, IgG^ e IgG^ na classe e subclasse de imunolobulina pelo método de Ouchterlony.

A Fig. 1 mostra os resultados de determinações destes anticorpos anti-TPA específicos TPA 1-41 (-·-) e TPA 1-7U (->-) pelo processo EIA descrito no Exemplo de referência 2.

Exemplo 3 (Preparação de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais anti-UK de rato) (1) Imunização

A imunização dos ratos foi conduzida exactamente da mesma maneira que no Exemplo 2-(l) mas usou-se UK (produzida por Nippon Seiyaku) em vez de TPA descrito no Exemplo 2-(l).

(2) Fusão de célula

A fusão das células foi realizada de acordo com o processo descrito no Exemplo l-(3)· (3) Selecção e clonagem de hibridomas

Os hibridomas foram separados pelo processo EIA descrito no Exemplo de referência 3, que utiliza uma microplaca que contém UK ligada. Seguidamente seguiu-se o processo do Exemplo l-(4) para obter hibridomas que produzem AcMo-anti-UK. Além destes hibridomas obtiveram-se hibridomas uK 1-3 è UK 1-87 de rato, os quais produzem ambos um AcMo anti-UK que se liga especificamente a UK sem prejudicar a sua capacidade de fibrinólise. Os anticorpos UK 1-3 e UK 1-87 produzidos respectivamente por estes dois hibridomas' foram identificados respectivamente como IgG₁ e IgG₂b na classe e subclasse de imunoglobulina pelo método de Ouchterlony.

A Figura 2 mostra os resultados de determinações destes anticorpos anti-UK específicos UK 1-3 (-·-) e UK 1-87 (-<-) pelo processo EIA' descrito no Exemplo de referência 3·

Exemplo 4(Frodução de anticorpo monoclonal híbrido que possui bi-especificidade anti-TPA-anti-fibrina humana) (1) Fusão celular

O hibridoma FIB 1-11 obtido no Exemplo 1, que produz anticorpo de fibrina anti-humana, e o hibridoma TPA 1-41 obtido no Exemplo 2, que produz anticorpo anti-TPA, foram ambos incubados num meio Iscove-Ham F-12 que contém FITC a 0,5 pg/m-C e TRITC a 1,5 pg/m-f a 37°C para coloração fluorescente. Adicionou-se então uma solução de ISM (comercialmente disponível de Wako Pure Chemical Industries ltd.) e removeram-se as células mortas. Estes dois hibridomas foram então misturados juntos numa proporção de 1 para 1 e em seguida procedeu-se â fusão das células pelo processo descri to no Exemplo l-(3) usando PEG 6000.

ras, a mistura das células foi aplicada a FACS , tendo-se corado duplamente 25 000 células por fluorasceína-rodamina. Estas células coradas duplamente foram inoculadas e cultivadas numa microplaca de 96 alvéolos com 10 células por alvéolo, tendo a microplaca sido inoculada previamente com timócitos de rato com 5 x 10^? células/alvéolo como células de alimentação.

(.2) Selecção e clonagem de hibridomas híbridos

Os sobrenadantes da cultura dos alvéolos nos quais ocorre a proliferação das células em duas ou três semanas depois da fusão foram submetidos separadamente aos processos descritos nos Exemplos de referência 1, 2, 7 e 8 para determinar a actividade dos anticorpos. A actividade dos anticorpos dos sobrenadantes de cultura dos hibridomas FIB 1-11 e TPA 1-41 respectivamente obtidos nos Exemplos l-(4) e (2)-3, como amostras de comparação, foi deteiminada da'mesma maneira. Os resultados são apresentados no Quadro

2.

Os alvéolos que exibem um título em anticorpos híbridos elevado foram submetidos a clonagem por análise de diluição limitante; obteve-se o desejado híbrido ma híbrido de rato que produz anticorpo bi-específico (tetraoma) FT 2-14.

Quadro 2 Especificidade de Anticorpos Produzidos por Hibridomas híbridos

1) :	Hibridoma 4-(2).	Híbrido	obtido no	Exemplo
2) :	Hibridoma	obtido	no Exemplo	1-(.4).
3) :	Hibridoma	obtido	no Exemplo	2-(3).

Título em anticorpos por EIA

Sobrenadante da	Anti-	Anti-	Anti-TPA	Peptideo
cultura de hibri- d ornas	fibrina^	-TPA	antiI_gSl ⁷’ de rato	N-termi- nal de cadeia B anti-TPA anti-fi- brina
Hibridoma híbrido A^	0,66	0,99	1,90	2,45
Hibridoma híbrido	0,30	0,60	0,51	2,19
FIB l-ll²)	0,29	0,00	0,01	0,00
TPA 1-41³	0,01	1,01	0,01	0,00
4); Expresso em	absorvância	óptica	a 492 nm

(ver Exemplo de referência 1)

5) :	EIA	descrito	no	Exemplo	de	referência	1.
6) :	EIA	des crito	no	Exemplo	de	referência	2.
7);	EIA	descrito	no	Exemplo	de	referência	7.
8) :	EIA	descrito	no	Exemplo	de	referência	8.

(3) Purificação de anticorpos de híbridos

Inoculou-se por via intraperitoneal o hibridoma de híbrido de rato (tetraomaj FT 2-14 a 5 x ΙΟθ células/ rato a seis ratos BALB/c que receberam previamente por administração intraperitoneal 0,5 m-f de óleo mineral. Cerca de 10 dias a 20 dias mais tarde recolheram-se 20 mde fluídos ascíticos e submeteram-se a precipitação com sul fato de amónio saturado para dar uma fracção de IgG. Depois de diálise contra PBS a 20 mM (pH 7,5), a fracção de IgG fo aplicada a uma coluna de Cellulofine com fibrina acoplada e foi eluída com uma solução tampão de glicina 0,2 M-HC1 de ph 2,9. Depois da diálise contra PBS, a fracção eluída por ácido foi aplicada a uma coluna de Sepharose 4B com TPA acoplado e eluiu-se com uma solução tampão de glicina a 0,2 M-HC1 de ph 2,3. 0 eluído foi dializado contra PBS para dar

9,4 mg de anticorpo hi-específico FT-2-14.

anticorpo obtido foi submetido ao proces so descrito no Exemplo de referência β; desenhou-se a curva de diluição do anticorpo bi-específico. Os resultados são apresentados na Eig. 3· A partir da Eig. 3 é evidente que o anticorpo obtido exibe forte avidez quer para TPA quer para fibrina.

Exemplo 5 (Produção dum anticorpo monoclonal híbrido que possui bi-especificidade anti-UK-anti-fibrina humana (1)) (1) Fusão celular

De acordo com o método descrito no Exemplo 4-(1), o hibridoma'EIB 1-11 obtido no Exemplo 1, que produz anticorpo anti-fibriha humana, e o hibridoma UK 1-3 obtido no Exemplo 3, que produz anticorpo anti-uK, foram ambos submetidos a coloração por fluorescência com EITC e TRITC, seguida de fusão celular usando PEG 6000. A mistura de células foi aplicada a FACS; seleccionaram-se células duplamente coradas e cultivaram-se.

(2) Selecção e clonagem de hibridomas híbridos

Os sobrenadantes de cultura dos alvéolos nos quais ocorreu a proliferação das células a uma ou duas semanas a seguir á fusão foram submetidos cada um ao processo EIA descrito nos Exemplos de referência 1, 3 e 9 para determinar a sua actividade de anticorpo. A actividade de anticorpo do sobrenadante de cultura de hibridomas EIB 1-11 e uK 1-3 respectivamente obtidos nos Exemplos l-(4) e 3-(3), como amostras de comparação, foi determinada da mesma maneira.

U alvéolo que apresentou a actividade de anticorpo híbrido máxima foi submetida a clonagem por análise de diluição limitante para obter o desejado hibridoma de rato que produz anticorpo bi-específico EU 1-74.

(3) Purificação do anticorpo híbrido

Recolheu-se fluído ascítico de acordo com o método descrito no Exemplo 4-(3), seguido de precipitação

com sulfato de amónio e cromatografia de imunoafinidade usando uma coluna com fibrina acoplada e uma coluna com UK acoplada; obtiveram-se 14 mg de FU 1-74, o anticorpo bi-específico anti UK-anti-fibrina humana da presente invenção, a partir de cerca de 20 mQ. de fluído ascítico.

anticorpo obtido foi submetido ao processo EIA descrito no Exemplo de referência 9; desenhou-se a curva'de diluição do anticorpo bi-específico. Os resultados são apresentados na Fig. 4. A partir da Fig. 4 é evidente que o anticorpo obtido FU 1-74 tem forte avidez quer para a UK quer para a fibrina.

Exemplo 6 (Propriedades (1) do anticorpo bi-específico anti-TPA-anti-fibrina humana FT 2-14)

Fez-se imergir um disco de papel de 9,5 mm de diâmetro numa solução de fibrinogénio humano a 2 mg/ m(? e em seguida adicionou-se trombina humana (50 unidades NIH/m^) para formar um coágulo no disco de papel. Depois de lavagem cuidadosa, este disco de papel com fibrina’acoplada foi imerso numa solução do anticorpo bi-específico FT 2-14 obtido no Exemplo 4-(3) na presença de fibrinogénio (3 mg/ m^). A quantidade de anticorpo ligada ao disco de papel foi determinada usando anticorpo anti-IgC^^ de rato marcado por HEP. Os resultados são apresentados na Fig. 5.

A avidez de fibrina obtida na presença de fibrinogénio (3 mg/mi⁷) () foi aproximadamente igual â obtida na ausência de fibrinogénio (q); foi demonstrado que o anticorpo FT 2-14 da presente invenção é específico em relação â fibrina.

Exemplo 7 (Propriedades (2) do anticorpo bi-específico anti-TPA-anti-fibrina humana FT 2-14)

Fez-se reagir TPA a várias concentração

com uma solução de anti-corpo bi-específico FT 2-14 obtido no Exemplo 4-(3) numa concentração molar de 4,3 vezes a do TPA a 37°C durante 30 minutos para dar um imunocomplexo de TPA e anticorpo FT 2-14 (anticorpo TPA/FT 2-14) e em seguida da adicionou-se subtrato de síntese de peptideo S-2288 (produzido por Kavi Co.) e deixou-se reagir a 37°G durante duas horas. A absorvância óptica da para-nitroanilina libertada foi determinada a 405 nm; a actividade enzimática do complexo referido de TPA-anticorpo FT 2-14 foi comparada com a do TPA simples. Os resultados são apresentados na Fig. 6.

Na Fig. 6, · representa a actividade enzimática do complexo de anticorpos; o mostra a actividade enzimática do TPA simples. Demonstrou-se que o TPA não reduz em absoluto a sua actividade enzimática mesmo quando se liga com o anticorpo bi-específico FT 2-14 da presente invenção .

Exemplo 8 (Propriedades (3) do anticorpo bi-específico anti-TPA-anti-fibrina humana FT 2-14)

Insolubilizou-se fibrinogénio humano ligando-o a grãos de Cellulofine (disponível comercialmente por Seikagaku Kogyo K.K.) de acordo com um método conhecido (Etsuko Ebisui’ et al.:' Seikagaku, 54, 732(1982), depois do que se converteu em fibrina pela adição de trombina humana. Adicionou-se a 0,2 g deste complexo de fibrina com grãos de Cellulofine uma solução de anticorpo de FT 2-14 a 10 jJg/500 e em seguida deixou-se reagir a 37°C durante 90 minutos. Depois de lavagem completa fez-se reagir a mistura reaccional com 100 ng de TPA a 37°C durante 40 minutos. Após lavagem, fez-se reagir amistura reaccional com plasminogénio que se adicionou (3 unidades/mí2) a 37°C durante 1 hora. 0 peptídeo (produto da degradação da fibrina: FDP) que se libertou no sobrenadante foi quantificado usando o conjunto de análise FDP-EIA ( produzido por American Diagnostics Co.).

Os resultados são apresentados na Fig. 7. 0 TPA tem um efeito mais forte nos grãos de fibrina-Cellulofine pré-tratada com o anticorpo bi-específico PT 2-14 do que nos grãos não-tratados; a capacidade do TPA para provocar a fibrinólise foi reforçada pelo anticorpo.

Exemplo 9 (Propriedades (1) do anticorpo bi-especifico anti-UK-anti-fibrina humana FU 1-74)

Injectaram-se num alvéolo de placa de fibrina-agarose descrita no Exemplo de referência 6 volumes de

2,5 de cada uma das soluções de UK (25 ng/nU?) e de uma solução (40 ng/np£ ou 160 ng/mú’) do anticorpo bi-específico PU-174 obtido no Exemplo 5-(5) e em seguida deixou-se reagir à 57°C durante 4 horas. Em seguida analisou-se a placa de fibrinólise resultante e comparou-se com a placa de fibrinólise obtida com a UK simples. Os resultados são apresentados na Pig. 8. Em comparação com a uK simples, a coexistência do anticorpo PU 1-74 causou um aumento de 5 a 5 vezes na capacidade de provocar fibrinólise.

Exemplo 10 (Reforço da capacidade fibrinolítica ni vitro do anticorpo bi-específico anti TPA-anti-fibrina humana FT2-14 e do anticorpo bi-específico anti UK-anti-fibrina humana FUI-74)

As colunas cheias com grãos de fibrina-Cellulofine obtidas no Exemplo 8 foram respectivamente acopladas com FT2-14 (0 a 100 >jg/mJ2; obtido no Exemplo 4-(5) e FU1-74 (0 a 50 pg/m^) obtido no Exemplo 5-(5) e em seguida foram lavadas com PBS que continha Triton x-lUO (PBS-T). Uma solução de TPA foi injectada nas colunas tratadas com'FT2-14 e uma solução de UK nas colunas tratadas com FU1-74 a 200 pig/m-β a um caudal de 240 m^/h. Depois das lavagens das colunas com PBS-T, os grãos de Cellúlofine de suporte foram

transferidos para tubos de ensaio e feitos reagir com plasminogénio que foi adicionada (4,5 unidades/1,5 a 37°C durante 2 horas. Depois da adição de uma quantidade igual de fluoreto de para-amidinofenilmetanossulfonilo a 6 mM, os Produtos de Degradação da Fibrina (PDF) libertados dos grãos de Cellulofine foram analisados usando um conjunto de análise por EIA (produzido por American Diagnostica Co.). Os resultados'são apresentados na Fig.9. Foi verificado um reforço da capacidade fibrinolítica em 3,8 vezes em FT2-14 a 100 pg/rnJ^ tratado com grãos de fibrinã-Cellulofine ‘(0) e um reforço em 8,5 vezes em FU1-74 tratado com grãos defíbrina-Cellulofine (·), em comparação com a capacidade fibrinolítica do TPA (0) e da UK (·) nos grãos de fibrina-Cellulofine não tratados com anticorpo.

Exemplo 11 (Reforço da capacidade -trombolítica in vivo do anticorpo bi-específico anti-TPA-anti-fibrina humana FT2-14) (1) Preparação dum modelo de trombo na veia jugular de coelho

Depois de anestesiar coelhos machos (2,5 a 3,5 Kg) por meio'de injecção intraperitoneal de pentobarbital (.90 mg/1,5 m^/coelho) e uretano (1,5 mg/3 m^/coelho), inseriu-se uma cânula de colheita de sangue na veia femural direita e introduziu-se uma cânula de injecção de sangue e um pedaço de tecido de lã na veia jugular esquerda. A veia jugular foi pinçada para bloquear o fluxo de sangue numa porção de cerca de 3 cm de extensão e esta operação foi seguida por lavagem do interior do vaso com adição sequencial de salina fisiológica e depois de 0,2 de uma solução de OaC^ contendo 10 U de trombina/mj2. Ao vaso lavado foi injectado 0,2 de autosangue colhido através da veia femural. As cânulas foram imediatamente removidas; as aberturas resultantes foram ligadas. 0 animal foi depois mantido deitado durante 30 minutos para deixar o sangue coagular.

(2) Injecção da substância em estudo

Injectou-se heparina por via intraperitoneal (250 U/Kg) e por via subcutânea (500 U/Kg) aos coelhos utilizados para o ensaio de modelo de trombo'; a pinça foi removida da veia jugular. Inseriu-se uma agulha de injecção na veia da orelha no lado oposto e em seguida procedeu-se a uma injecção intravenosa da solução da substância em estudo numa quantidade de 10% do volume da dose completa para 2 mJ^/coelho e depois a uma injecção contínua dos restantes 90% do volume a um caudal de 6 mJ^/h durante um período de 4 horas. Quatro horas mais tarde, o trombo que aderiu ao tecido de'lã introduzido foi retirado e pesado numa base húmida. As soluçbes da substância em estudo foram uma salina fisiológica de comparação, soluçOes de TPA (0,25 mg/Kg e 1,0 mg/Kg) , solução de anticorpo PT2-14'(1,2 mg/Kg) e solução de complexo de anticorpo TPA/PT2-14 (0,25 mg/Kg TPA+1,2 mg/Kg FT2-14) obtido no exemplo 4-(3). 0s resultados são apresentados na Pig.10.

Quando se injectou TPA a 0,25 mg/Kg continuamente durante um período de 4 horas 0 peso húmido do trombo diminuiu de 61,5+7,2 mg (n=4) no grupo de comparação para 31,7+10,1 mg (n=6). No grupo que recebeu 0,25 mg/Kg TPA e 1,2 mg/Kg PT2-14 em combinação numa proporção molar de 1 de TPA para 2 de anticorpo específico (ACbe), 0 peso húmido tornou-se 19,6+6,5 mg (n=7), isto é, a capacidade trombolítica foi reforçada numa medida que era quase igual ao peso húmido do trombo no grupo de TPA 1,0 mg/Kg, 15,5+5,0 ^mê (n=3). No grupo PT2-14 1,2 mg/Kg, 0 peso húmido do trombo era 41,5 mg (n=l).

Exemplo 12 (Preparação de um hibridoma que produz anticorpo monoclonal anti-UK de baixo peso molecular de rato) (1) Imunização

A imunização dos ratos foi conduzida exactamente do mesmo modo que no Exemplo 2-(l) mas usou-se UK de baixo peso molecular de duas cadeias comercialmente dispo-

nível (fornecido por JCR Co.) no lugar do TPA descrito no Exemplo 2-(l).

(2) Fusão celular

A fusão celular foi conduzida de acordo com o método descrito no Exemplo l-(3)· (3) Selecção e clonagem dos hibridomas

Os hibridomas foram separados pelo processo descrito no Exemplo de referência 10 usando uma microplaca com uK de baixo peso molecular ligada e foram submetidos ao mesmo procedimento que no Exemplo l-(4) para obter hibridomas que produzem AcMo anti-UK de baixo peso molecular. Para além destes hibridomas seleccionou-se o hibridoma de rato uK 1-6, que produz um AcMo anti-UK de baixo peso molecular' que se liga especificamente a uK sem prejudicar a capacidade fibrinolítica da UK. A classe e subclasse de imunoglobulina do anticorpo UK 1-6 produzido pelo hibridoma assim obtido foram identificadas como IgG^ (cadeia K) pelo método de Ouchterlony.

Exemplo 13 (Produção (2) de anticorpo híbrido monoclonal que possui bi-especificidade anti-uK e anti-fibrina humana) (1) Fusão celular

Submeteram-se FIE 1-11, o hibridoma que produz anticorpo anti-fibrina humana e que foi obtido no Exemplo 1, e uK 1-6, o hibridoma que produz anti-corpo anti—UK de baixo peso molecular e que foi obtido no Exemplo 12, a coloração fluorescente respectivamente com FITC e TRITC de acordo com o método descrito no Exemplo 4-(1), e em segui da submeteu-se a fusão celular usando PEG 6000. As células foram então aplicadas a FACS para seleccionar células duplamente coradas, as quais foram cultivadas.

(2) Selecção e clonagem do hibridoma híbrido

Os sohrenadantes da cultura obtidos dos alvéolos em que ocorreu a proliferação das células foram submetidos cada um 1 a 2 semanas depois da fusão da célula

ao processo EIA descrito nos Exemplos de referência 1, 9 e 10 para determinar a sua actividade de anticorpo.

U conteúdo do alvéolo que apresentou a actividade de anticorpo híbrido máxima foi submetido a cionagem por análise de diluição limitante e obteve-se o desejado hibridoma híbrido de rato EU 2-16, que produz o anticorpo bi-específico.

sobrenadante da cultura do hibridoma híbrido EU 2-16 foi analisado pelo processo EIA descrito no Exemplo de referência 5. Us resultados são apresentados na Fig. 11.

(.5) Purificação do anticorpo híbrido fluído ascítico foi recolhido pelo método descrito no Exemplo 4-(5) e submetido a precipitação por sulfato de amónio e cromatografia de imunoafinidade usando uma coluna cim fibrina acoplada e uma coluna com UK acoplada para dar cerca de 25 mg de FU 2-6, o anticorpo bi-específico anti-UK anti-fibrina humana da presente invenção, a partir de cerca de 20 m de fluído ascítico.

Exemplo 14 (Propriedades (1) do anticorpo monoclonal de anti-uK)

Submeteram-se os anticorpos monoclonais anti-uK UK 1-5, 1-87 e 1-6 obtidos nos Exemplos 5 e 12 aos procedimentos EIA usando respectivamente uma microplaca com UK de baixo peso molecular ligada (descrito nos Exemplos de referência 5 θ 10, respectivamente) e compararam-se no que se refere à avidez para uK (Fig. 12(A)) e para UK de baixo peso molecular (Fig. 12(B)). Os resultados são apresentados na Fig. 12.

anticorpo UK 1-5 não se ligou a UK de baixo peso molecular, enquanto que os anticorpos UK 1-87 e uK 1-6 apresentavam ambos reactividade equivalente' em relação à UK e à UK de baixo peso molecular.

Exemplo 15 (Propriedade (2) do anticorpo monoclonal de anti-uK)

Os anticorpos monoclonais anti-uK UK 1-3,

1-87 e 1-6 obtidos nos Exemplos 3 e 12 foram submetidos ao ensaio de neutralização de actividade usando o substrato de peptideo sintético S-2444 descrito no Exemplo de referência 11. Os resultados são apresentados na Fig. 13·

Nenhum destes anticorpos monoclonais anti-ÚK inibiram a actividade enzimática da UK.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lê Processo para a preparação de um polidoma que produz um anticorpo monoclonal híbrido bi-específico cujas especificidades são respectivamente contra a fibrina e contra uma substância trombolítica caracterizado por compreender uma fase de fundir um hibridoma ou uma célula que produz um anticorpo anti-fibrina e um hibridoma ou uma célula que produz um anticorpo contra uma substância trombolítica.

- 2ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida substância trombolítica ser uma protease.

- 36 Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida protease ser o activador de plasminogénio tecidular.

Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida protease ser a uroquinase.

_ 5ê Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido polidoma ser um tetraoma obtido por fusão de um hibridoma que produz um anticorpo anti-fibrina e de um hibridoma que produz um anticorpo contra o activador de plasminogénio tecidular e produzir um anticorpo monoclonal híbrido bi-específico capaz de se ligar tanto a fibrina como ao activador de plasminogénio tecidular na mesma molécula.

- 66 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido polidoma ser um tetraoma obtido por fusão de um hibridoma que produz um anticorpo anti-fibrina e de um hibridoma que produz um anticorpo anti-uroquinase e produzir um anticorpo monoclonal híbrido bi-específico capaz de se ligar tanto à fibrina como à uroqui nase na mesma molécula.

- 76 Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal híbrido bi-específico cujas duas especificida des são respectivamente contra a fibrina e contra uma substância trombolítica caracterizado por compreender as fases de cultivar um polidoma obtido de acordo com a reivindicação 1 num meio líquido ou na cavidade peritoneal de animais e de recolher o referido anticorpo a partir do sobrenadante da cultura ou do líquido ascítico.

UOenH.

Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida substância trombolítica ser uma protease.

- gs caracterizado plasminogénio caracterizado

Processo de acordo com a reivindicação por a referida protease ser o activador de tecidular.

Processo de acordo com a reivindicação por a referida protease ser a uroquinase.

8,

8,

Processo para a preparação de um agente trombolítico caracterizado por se acoplar imunológicamente um anticorpo preparado de acordo com a reivindicação 7 e uma substância trombolítica.

- 126 Processo de acordo coma reivindicação 11, caracterizado por a referida substância trombolítica ser uma protease.

- 13^ô Processo de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a referida protease ser o activador de plasminogénio tecidular.

- 146 38 - 14®

Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a referida protease ser a uroquinase.

- 15® Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para a lise ou para a remoção de trombos num mamífero caracterizado por se incorporarem como substâncias activas uma quantidade eficaz de um anticorpo quando obtido de acordo com a reivindicação 7 e uma substância trombolítica.