KR100585473B1

KR100585473B1 - 혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR100585473B1
Application number: KR1019997007803A
Authority: KR
Inventors: 힝 씨. 웡; 진-안 쟈오; 에스페란자 릴리아나 니브스; 로렌스 렙쉔
Original assignee: 타녹스 인코퍼레이티드
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1998-03-10
Publication date: 2006-06-02
Also published as: CN100383163C; US7824677B2; JP2001516214A; US20020168357A1; EP0975672B1; US6555319B2; JP4281852B2; US20050271664A1; US20030082636A1; CN101298479A; ATE540976T1; PT975672E; CA2283746C; EP0975672A4; ES2380452T3; CN1252810A; KR20060015702A; WO1998040408A1; EP0975672A1; US20090041766A1

Abstract

본 발명은 친화도 및 특이성이 높게 천연 인간 TF를 결합시킴으로써 뛰어난 항-응고 활성을 제공하는 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 단독으로 또는 TF:VIIa 복합체로 존재하는 천연 인간 TF과 결합하여 인자 X의 TF 또는 이 복합체로의 결합을 효과적으로 방지함으로써 혈액 응고를 감소시킨다. 본 발명의 바람직한 항체는 천연 인간 TF에 우세한 형태학적 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이 에피토프는 예기치 않게 강력한 항체 결합 부위를 제공한다.

조직 인자, 항응고제, 혈전증

Description

혈액 응고를 억제하기 위한 항체 및 그의 사용 방법{Antibodies for Inhibiting Blood Coagulation and Methods of Use Thereof}

본 발명은 혈액 응고를 억제하기 위한 신규 항체 및 이 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 친화도가 높게 천연 인간 조직 인자에 특이적으로 결합할 수 있는 신규의 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 다양하게 응용되어, 특히 생체내 혈액 응고를 감소시키는데 유용하다.

혈액 응고는 혈액 손실을 최소함으로써 항상성을 보조한다. 일반적으로, 혈액 응고는 혈관 손상, 혈소판 응집, 응고 인자 및 섬유소용해의 억제를 필요로 한다. 이 응고인자들은 혈관 손상에 관계되는 케스케이드를 통하여 작용하여 혈액 응괴를 형성시킨다[전반적으로, L. Stryer, Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman Co., New York; and A.G. Gilman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, McGrawhill Inc., New York, pp. 1311-1331 참조].

인자 X(FX)의 Xa(FXa)로의 활성화는 혈액 응고 과정에서 중요한 단계라는데 일반적으로 합치되고 있다. 일반적으로, FX는 "조직 인자"(TF)를 포함하는 촉매적으로 활성인 복합체에 결합됨으로써 FXa로 전환된다. TF는 인자 VII/VIIa를 결합시켜 촉매적으로 활성인 복합체 (TF:VIIa)를 생성하는 조절가능하게-발현되는 세포막 단백질이다. 혈액 응괴 다음에는 FXa-매개된 프로트롬빈의 활성화가 뒤따른다. 혈액 응고는 TF:VIIa 복합체를 최적으로 생성할 수 없는 비-천연형으로 FT를 불활성화시킴으로써 최소화시킬 수 있다. 과도한 FXa의 형성은 협착증을 포함한 다양한 혈전증에 기여하는 것으로 믿어진다.

혈전증은 심장 수술(혈관성형술), 복강 수술, 동맥 수술, 삽입물의 배치(스텐트 또는 카테테르) 또는 동맥내막 절제술 등의 침투성 의료 절차에 관련될 수 있다. 또, 혈전증은 각각 폐 색전증(예, 색전형성이 있는 동맥 세동) 및 산재성 혈관내 응고 등의 다양한 혈색증 장해 및 응고장해를 수반할 수 있다. 체액의 조작 또한 바람직하지 못한 혈전, 특히 혈액 수혈 또는 체액 채취 등 뿐만 아니라 체외 순환(예, 심폐 우회 수술) 및 투석 등을 수반하는 절차에서 그러하다.

항응고제는 혈전증과 관련된 혈액 응괴를 경감시키거나 피하기 위해 빈번히 사용된다. 혈액 응고는 간혹 하나 이상의 코우마린 유도체(예, 와르핀 및 디쿠마롤) 또는 하전 폴리머(예, 헤파린, 히루딘 또는 히루록) 중 하나 이상을 포함하는 적합한 항응고제 또는 이들의 혼합물을 투여함으로써 최소화 또는 제거시킬 수 있다. 문헌[Gilman et al., 상기함, R.J. Beigering et al., Ann. Hemathol., 72:177 (1996); J.D. Willerson, Circulation, 94:866(1996] 참조.

그러나, 항응고제의 사용은 간혹 용혈, 재폐색, "백색-응괴" 증후, 자극, 출생 결함, 혈소판감소증 및 간기능이상 등의 부작용과 관련된다. 항응고제의 장기간 투여는 특히 생명을 위협하는 질병의 위험성을 증가시킬 수 있다[참조, Gilman et al., 상기함].

항혈소판 활성을 가진 특정 항체도 또한 다양한 혈전증을 완화시키는데 사용되어 왔다. 예를 들면, ReoPro™은 혈관성형술, 심근 경색, 불안정 협심증 및 관상 동맥 협착증으로 부터 유발된 것 등의 다양한 혈색증의 질환을 완화시키기 위해 통상적으로 투여되는 치료용 항체이다. 또한 ReoPro™은 심근 경색 및 협착증의 위험성을 감소시키기 위한 예방제로서 사용될 수 있다[참조, J. T. Willerson, Circulation, 94:866 (1996); M.L. Simmons et al., Circulation, 89:596(1994)].

특정 항응고 항체도 역시 알려져 있다. 특히 특정 TF-결합 항체들은 추정하기로는 촉매적으로 활성인 TF:VIIa 복합체의 어셈블리를 방해함으로써, 혈액 응고를 억제하는 것으로 보고되고 있다[참조, Jeske et al., SEM in THROM. and HEMO, 22:213 (1996); Ragni et al., Circulation, 93:1913 (1996); European Patent No. 0420 937 B1; W. Ruf et al., Throm. Haemosp., 66:529 (1991); M.M. Fiorie et al., Blood, 8:3127 (1992)].

그러나, 현재의 TF-결합 항체들은 항응고제로서 이들의 적합성을 최소화할 수 있다는 중대한 결점을 나타낸다. 예를 들면, 현재의 TF-결합 항체들은 최적 항응고 작용을 위한 충분한 결합 활성을 나타내지 못한다. 따라서, 많은 혈전 질병에 대하여 그러한 비효율적인 결합 활성을 보상하기 위하여, 받아들이기 어려운 농도이 항체를 투여하여 혈액 응고를 최소해야 한다. 또, 현재의 TF-결합 항체는 천연 TF 및 비천연 형의 TF를 효율적으로 분간하지 못하는데, 즉 현재의 항체는 충분한 결합 활성을 나타내지 못한다. 게다가, 현재의 TF-결합 항체는 FX가 TF 및(또는) TF:VIIa 복합체에 결합하는 것을 방지할 수 없다.

따라서, 천연 인간 TF와 고친화도 및 선택성이 있게 결합하여 바람직하지 못한 혈액 응고 및 혈액 응괴의 형성을 억제할 수 있는 항응고 항체를 갖는 것이 바람직하다. 인자 X의 TF/VIIa 복합체로의 결합을 방지하는 항응고 항체를 제공하는 것이 더욱 요망되고 있다.

본 발명자들은 친화도 및 특이성이 높게 천연 인간 TF에 결합함으로써 뛰어난 항응고 활성을 제공하는 항체를 발견하기에 이르렀다. 본 발명의 항체는 생체내에서 혈액 응고를 효율적으로 억제할 수 있다. 본 발명의 항체들은 단독으로 또는 TF:VIIa 복합체로 존재하는 천연 인간 TF에 결합하여 인자 X의 TF 또는 그 복합체로의 결합을 억제함으로써 혈액 응고를 방지한다.

본 발명의 바람직한 항체들은 단일클론이며 천연 인간 TF에 우세한 형태학적 에피토프에 특이적으로 결합하고 이 에피토프는 예상밖의 강력한 항체 결합 부위를 제공한다. 실제로, 본 발명의 바람직한 항체들은 천연 인간 TF에 적어도 약 5배 이상 결합하고, 더욱 대표적으로는 종래 기술의 항응고제 항체에 의해 나타난 결합 친화도에 적어도 약 10배 이상으로 결합한다. 추가로 본 발명의 바람직한 항체는 천연 인간 TF에 대해 선택적이며, 실질적으로 비-인간 또는 변성 TF에 결합하지 않는다. H36.D2.B7(하이브리도마 ATCC HB-12255에 의해 분비됨)은 본 발명의 특히 바람직한 항체이다.

본 발명의 바람직한 항체들은 TF에 결합하여 FX가 TF/인자 VIIa 복합체에 효과적으로 결합하지 못함으로써 FX는 그의 활성화된 형태(FXa)로 효율적으로 전환되지 못한다. 본 발명의 바람직한 항체는 FX 결합 또는 TF 분자에 접근을 효과적으로 차단함으로써 TF 기능을 억제할 수 있다. 예컨대 이후의 실시예 3의 결과를 참조하기 바람.

본 발명의 바람직한 항체는 또한 FX 이외의 물질들에 관련하여 TF 및 인자 VIIa 사이의 상호작용 또는 결합을 유의하게 억제하지 않거나 또는 TF: 인자 VIIa 복합체의 활성을 억제한다. 예컨대 후술하는 실시예 4의 결과를 참조하기 바람.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산을 제공한다. H36.D2.B7의 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열들(서열 확인 번호 1-4)는 도면의 도 1A 및 1B에 나타냈다.

바람직한 일면에 있어서, 본 발명은 혈액 응고 및 혈액 응괴 형성을 억제하기 위한 방법 및 인간 TF 레벨을 감소시키기 위한 방법을 제공한다.

일반적으로 본 발명의 항체들은 궁극적으로 상기한 혈액 응고, 염증 및 기타 질병들을 포함하는 FX의 TF 또는 TF:VIIa 복합체에의 결합에 의해 매개되는 임의의 생물학적 응답을 조절하는데 유용할 것이다.

본 발명의 항체들은 특히 다양한 혈전증을 경감시키는데, 특히 협착증 또는 동맥 또는 심장 수술(예, 혈관성형술) 등의 침입성 의과적 절차 후의 기타 혈전증을 예방하거나 억제하는데 유용하다. 본 발명의 항체는 또한 의료용 삽입물(예, 카테테르, 스텐트 또는 기타 의료 장치)의 사용에 기인한 혈액 응고를 감소시키거나 또는 효율적으로 제거하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체들은 많은 항응고제, 항혈소판제 및 혈전용해 조성물과 혼화성이어서 조합 포맷으로의 투여를 허용하여 혈액 응고의 억제를 촉진시키거나 연장시킨다.

본 발명의 항체는 또한 포유류, 특히 인간 개체의 최외 순환에서 항응고제로서 사용될 수도 있다. 그러한 방법에 있어서, 본 발명의 하나 이상의 항체는 심폐 우회 수술, 기관 이식 수술 또는 기타 지속되는 수술로 일어날 수 있는 체외 순환 동안 또는 이에 앞서 혈액 응고를 억제하는데 충분한 양으로 포유류에 투여한다.

본 발명의 항체는 약물용 담체, 특히 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA) 또는 유로키나제 등의 혈액 응괴와 상호작용을 위해 목표를 정한 제약용 담체로서 또한 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 항체는 적절한 독소를 항체에 접합시킴으로써 세포독성제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체의 접합체는 또한 보체-고정 능력 및 항체 의존성 세포-매개 세포독성을 제공하기에 충분한 양의 세포 독소 또는 효과기 분자에 공유결합된 본 발명의 항체를 포유류에 투여함으로써 항체 접합체가 조직 인자를 발현하는 세포에 접촉하여 포유류에서 조직 인자 레벨을 감소시키는 포유류, 특히 인간에서 조직 인자 레벨을 감소시키는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체들은 또한 천연 인간 TF의 생체내 진단용 이미징을 포함하는 생체내 진단 방법에 이용될 수도 있다.

본 발명의 항체들은 또한 체액(예, 혈장 또는 혈청) 또는 조직(예, 생검 시료)를 포함하는 생물학적 시료에서 천연 TF를 검출하기 위한 시험관내 분석에 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 이종 및 동종의 면역분석을 경쟁적 또는 비경쟁적 포맷으로 생물학적 시료에서 TF의 존재 및 바람직하게는 양을 검출할 수 있다.

본 발명의 그러한 분석은 혈액 응고 또는 혈액 응괴의 존재 또는 가능성이 있는 환자를 결정하는데 아주 유용하다. 즉 혈액 응고는 통상 맥관구조에 인접한 세포들 등의 세포 표면에서 TF 발현에 의해 수반된다. 혈액 응고의 부재시, TF는 통상적으로 발현되지 않는다. 따라서, 본 발명의 분석에 의한 체액 시료에서 TF의 검출은 혈액 응고의 지표이다.

본 발명의 항체는 또한 생물학적 시료로부터 실질적으로 순수한 천연의 TF, 특히 천연 인간 TF를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 천연 TF를 발현하는 세포를 검출하고 정제하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체들은 또한 진단용 키트, 예컨대 생물학적 시료에서 천연 TF를 탐지 및 바람직하게는 정량화하기 위한 키트의 성분으로서 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 관점들은 이후 설명한다.

도 1A 및 1B는 초가변 영역(CDR 또는 보체능(complementarity) 결정 영역)이 밑줄그어진 (단일 밑줄은 핵산 서열이고 이중 밑줄은 아미노산 서열임) H36.D2.B7의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 핵산 서열(서열 확인 번호 1 및 3) 및 아미노산(서열 확인 번호 2 및 4)를 나타낸다.

도 2는 ELISA 또는 BiaCore 분석에 의해 결정된 항조직 인자 항체의 결합(K_a) 및 해리(K_d) 상수를 나타낸다.

도 3은 항조직 인자 항체로 예비배양에 의한 TF:VIIa 복합체 매개 FX 활성화의 억제를 나타낸다.

도 4는 항-조직 인자 항체에 의한 FVII-특이성 기질 S-2288에 대한 TF/VIIa 활성의 억제를 나타낸다.

도 5는 H36 항체의 TF-항체 응집 분석에 있어서 프로트롬빈 시간(PT)를 증가시키는 능력을 나타낸다.

도 6A 및 6B는 FXa 형성 및 H.36.D2 항체 및 rHTF의 몰비 사이의 관계를 나타내는 그라프도이다. 도 6A: H36.D2를 FX를 첨가하기 전에 FT:VIIa 복합체로 예비배양시켰다. 도 6B: H36.D2, TF:VIIa 및 FX를 동시에 첨가하였다.

도 7은 J-82 세포 활성 분석에 있어서 H.36.D2 항체에 의한 TF:VIIa 활성의 억제를 나타낸다.

도 8A 및 8B는 H.36.D2 항체가 rhTF 상의 형태학적 에피토프와 결합하는 것을 나타내는 돗 블롯을 나타낸다. 레인 1-천연 rHTF, 레인 2: 8M 우레아로 처리된 천연 rhTF, 레인 3: 8M 우레아 및 5mM DTT로 처리된 천연 rHTP. 도 8A에 있어서, 블롯은 약 40초 동안 노출시킨 반면, 도 8B에서 블롯은 120초 동안 노출시켰다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 항체들은 천연 인간 TF에 대하여 실질적인 친화도를 나타낸다. 특히, 본 발명의 바람직한 항체들은 표면 플라스몬 분석(특히, 후술하는 실시예 1의 절차에 따른 BIACore 분석법)에 의해 측정된 바의 적어도 약 1 x 10⁸의 천연 인간 TF에 대한 결합 상수(K_a, M^-1), 더욱 바람직하게는 표면 플라스몬 분석에 의해 측정된 바의 적어도 약 5 x 10⁸, 더욱 더 바람직하게는 표면 플라스몬 분석에 의해 측정된 바의 적어도 약 1 x 10¹⁰의 천연 인간 TF에 대한 결합 상수(K_a, M^-1)를 나타낸다. 본 발명의 그러한 실질적인 결합 친화도는 이전에 보고된 훨씬 낮은 결합 친화도보다는 예리하게 대조되는 것이다.

이에 관련하여, 본 발명의 항체의 아주 낮은 유효 농도가 사용가능한데, 즉 상대적으로 낮은 농도의 항체를 사용하여 후술하는 실시예 3에서 기술된 바와 같은 시험관내 분석에서 바람직한 바의 TF 기능을 억제할 수 있다(즉, 적어도 95, 98 또는 99% 억제).

바람직한 항체들은 또한 천연 인간 TF에 대해 고도로 특이성이며, 바람직하게는 비-천연 TF와 실질적으로 결합하지 않는다. 바람직한 항체들은 표준 돗 블롯 분석에 의해 측정된 바 비-인간 TF 또는 기타의 면역학적으로 관련되지 않은 분자에 실질적으로 결합하지 않는다(즉, 그러한 돗 블롯 분석에 의해 가시적으로 검출되는 비-천연 TF에 대해 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않음). 용어 "비-천연 TF"는 TF가 변성되도록 카오트로픽제로 처리된 천연 발생 또는 재조합 인간 TF를 의미한다. 대표적인 카오트로픽제는 세제(예, SDS), 디티오트레오톨 또는 β-머캅토에탄올과 혼합된 우레아; 구아니딘 하이드로클로라이드 등을 포함한다. H36, H36.D2 또는 H36.D2.B7 항체는 실질적으로 그러한 비-천연 TF에 결합하지 않는다. 예를 들면 후술하는 실시예 8의 돗 블롯 분석의 결과를 참조하기 바람.

상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 항체들은 또한 TF와 결합하여 FX가 TF/인자 VIIa 복합체에 효율적으로 결합하지 못하게 함으로써 FX가 그의 활성 화된 형태(FXa)로 효율적으로 전환되지 못한다. 본 발명의 특히 바람직한 항체들은 TF/인자 VIIa 복합체에 대한 FX의 활성을 강하게 억제할 것이며, 즉 후술하는 실시예 3 등의 표준 시험관내 결합 분석에 의해 측정된 바, 1.0 nM TF 이하의 낮은 TF 농도에서, 또는 심지어는 약 0.20 nM 또는 0.10 nM TF의 농도에서 조차도, 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 약 80%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 95%의 억제를 나타낼 것이며, 본 발명의 항체의 존재(즉, 실험 시료) 및 부재(즉, 대조 시료) 하에서 FX와 TF:인자 VIIa 복합체 모두에 접촉하며 실험 및 대조 시료 사이의 FX의 FXa로의 전환의 상이%를 결정함을 포함한다.

본 발명의 항체들은 방법 및 분석에 사용되었을 때 바람직하게는 실질적으로 순수한 것이 좋다. 용어 "실질적으로 순수한"이란 용어는 천연적으로 그에 수반하는 성분으로부터 분리된 항체 또는 단백질을 의미한다. 예를 들면 표준 면역친화 또는 단백질 A 친화 정제 공정을 이용함으로써, 본 발명의 항체는 항원 또는 단백질 A 수지로서 천연 TF를 사용함으로써 하이브리도마 배양물로부터 정제될 수 있다. 마찬가지로, 천연 TF는 표준 면역친화 정제 기술에 의해 본 발명의 항체를 사용함으로써 실질적으로 순순한 형태로 얻을 수 있다. 특히, 항체 또는 단백질은 전체 단백질의 적어도 50%(주어진 시료의 총단백질의 중량%)가 본 발명의 항체 또는 단백질일 때 실질적으로 순수하다. 바람직하게는 항체 또는 단백질은 총 단백질의 적어도 60중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 75 중량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90 중량%, 가장 바람직하게는 총 물질의 적어도 98 중량%가 좋다. 순도는 SDS(PAGE) 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피(예, 친화 크로마토그래피) 또는 HPLC 분석 등의 공지의 방법에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

본 발명의 바람직한 항체, H36.D2.B7의 핵산(서열 확인 번호: 1 및 3) 및 아미노산(서열 확인 번호 2 및 4) 서열은 도면의 도 1A 및 도 1B에 나타냈다. 서열 확인 번호 1 및 2는 경쇄 가변 영역의 각각의 핵산 및 아미노산이고 서열 확인 번호 3 및 4는 중쇄 가변 영역의 각각의 핵산 및 아미노산 서열로서, 초가변 영역(CDR 또는 상보성 결정 영역)은 그러한 모든 서열에서 밑줄 그었다.

본 발명의 추가의 바람직한 항체들은 도면 1A 및 1B에 나타낸 경쇄 또는 중쇄 서열 중 하나 또는 모두에 대해 실질적인 서열 동일성을 가질 것이다. 더욱 구체적으로 바람직한 항체들은 서열 확인 번호 2 및(또는) 4에 대해 적어도 약 70% 상동성, 더욱 바람직하게는 서열 확인 번호 2 및(또는) 4에 대해 약 80% 이상의 상동성, 더욱 더 바람직하게는 서열 확인 번호 2 및(또는) 4에 대해 약 85, 90 또는 95% 이상의 상동성을 가질 것이다.

본 발명의 바람직한 항체는 서열 확인 번호 2 및 4의 초가변 영역(도 1A 및 1B에서 이중 밑줄로 나타냄)에 대해 높은 서열 동일성을 가질 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 항체들은 H36.D2.B7의 경쇄 가변 영역의 대응하는 초가변 영역의 하나, 둘 또는 3개와 동일하거나 또는 이들에 대해 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 서열 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역의 하나, 둘 또는 세개의 초가변 영역을 가질 것이다[도 1A에서 밑줄로 표시한 초가변 영역으로서 다음의 것들임; 1) LASQTID(서열확인 번호: 5); 2) AATNLAD (서열 확인 번호: 6) 및 3) QQVYSSPFT (서열 확인 번호: 7)].

본 발명의 특히 바람직한 항체들은 H36.D2.B7의 중쇄 가변 영역의 대응하는 초가변 영역의 하나, 둘 또는 3개와 동일하거나 또는 이들에 대해 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 서열 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역의 하나, 둘 또는 세개의 초가변 영역을 가질 것이다[도 1B에서 밑줄로 표시한 초가변 영역으로서 다음의 것들임; 1) TDYNVY (서열확인 번호: 8); 2) YIDPYNGITIYDQNFKG (서열 확인 번호: 9) 및 3) DVTTALDF (서열 확인 번호: 10)].

본 발명의 핵산은 바람직하게는 다음의 온건한 긴축 조건(이하, "정상 긴축" 조건 이라함)에서 서열확인 번호 1 및(또는) 서열 확인 번호 3의 서열에 결합하기에 충분한 길이(바람직하게는 적어도 약 100, 200 또는 300 염기쌍)를 가진 것이다: 37℃의 온도에서 0.8 M 염수/0.08 M 시트르산나트륨(SSC) 중의 20% 포름아마이드를 포함하는 혼성화 완충액의 사용 및 37℃에서 SSC로 1회 세척했을 때 나머지가 결합됨.

더욱 바람직하게는 본 발명의 핵산(바람직하게는 적어도 약 100, 200 또는 250 염기쌍)은 다음의 고긴축 조건(이하, "고긴축" 조건 이라함)에서 서열확인 번호 1 및(또는) 서열 확인 번호 3의 서열에 결합할 것이다: 42℃의 온도에서 0.9 M 염수/0.09 M 시트르산나트륨(SSC) 중의 20% 포름아마이드를 포함하는 혼성화 완충액의 사용 및 42℃에서 SSC로 1회 세척했을 때 나머지가 결합됨.

본 발명의 핵산은 바람직하게는 적어도 20 염기쌍, 바람직하게는 적어도 약 50염기쌍 이상을 포함하는 것이 좋으며, 더욱 더 바람직한 본 발명의 핵산은 적어도 약 100, 200, 250 또는 300 염기쌍을 포함하는 것이 좋다.

일반적으로 본 발명의 바람직한 핵산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 바람직한 결합 친화도 및 기타 특성을 나타내는 본 발명의 항체를 발현할 것이다.

본 발명의 바람직한 핵산은 또한 서열 확인 번호 1 및(또는) 3에 대해 적어도 약 70% 상동성(서열 동일성), 더욱 바람직하게는 서열 확인 번호 1 및(또는) 3에 대해 약 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 서열 확인 번호 1 및(또는) 3에 대해 약 85, 90 또는 95% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함할 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 핵산 서열은 서열 확인 번호 1 및 3의 초가변 영역(도 1A 및 1B에서 밑줄로 나타냄)에 대해 높은 서열 동일성을 가질 것이다. 특히 바람직한 핵산은 항체 경쇄 가변 영역을 코드하고 초가변 영역을 코드하는 하나, 둘 또는 세개의 서열을 가지며 H36.D2.B7의 대응하는 초가변 영역을 코드하는 하나, 둘 또는 3개와 동일하거나 또는 이들에 대해 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 서열 동일성)을 가질 것이다[도 1A에서 밑줄로 표시한 초가변 영역으로서 다음의 것들임; 1) CTGGCAAGTC AGACCATTGA T (서열확인 번호: 11); 2) GCTGCCACCA ACTTGGCAGA T (서열 확인 번호: 12) 및 3) CAACAAGTTT ACAGTTCTCC ATTCACGT (서열 확인 번호: 13)].

특히 바람직한 핵산은 항체 중쇄 가변 영역을 코드하고 초가변 영역을 코드하는 하나, 둘 또는 세개의 서열을 가지며, H36.D2.B7의 대응하는 초가변 영역을 코드하는 하나, 둘 또는 3개와 동일하거나 또는 이들에 대해 높은 서열 동일성(적어도 90% 또는 95% 서열 동일성)을 가질 것이다[도 1B에서 밑줄로 표시한 초가변 영역으로서 다음의 것들임; 1) ACTGACTACA ACGTGTAC (서열확인 번호: 14); 2) TATATTGATC CTTACAATGG TATTACTATC TACGACCAGA ACTTCAAGGG C (서열 확인 번호: 15) 및 3) GATGTGACTA CGGCCCTTGA CTTC (서열 확인 번호: 16)].

본 발명의 핵산은 단리되며, 이는 주어진 핵산이 통상 주어진 분획에 존재하는 전체 핵산의 중량을 기준으로 적어도 약 0.5%, 바람직하게는 적어도 약 2% 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 5%를 구성함을 의미한다. 특히 순수한 핵산은 주어진 분획에 존재하는 전체 핵산의 중량을 기준으로 적어도 약 30% 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 60 중량%를 구성한다. 순수한 핵산은 주어진 분획에 존재하는 전체 핵산의 중량의 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90% 및 더욱 바람직하게는 95%을 구성한다.

본 발명의 항체는 당업계에 일반적으로 공지된 기술에 의해 제조할 수 있으며 이들은 대표적으로 천연 TF, 대표적으로 천연 인간 TF, 바람직하게는 재조합 인간 조직 인자(rhTF)의 정제된 시료로 생성될 것이다. 절두 재조합 인간 조직 인자 또는 "rhTF"(243 아미노산으로 구성되고 세포질 도메인이 결핍됨)은 본 발명의 항체를 생성하기에 특히 바람직하다. 이 항체는 또한 비-천연 TF에 의해 나타나지 않은 천연 TF의 하나 이상의 에피토프로 이루어지는 면역원성 펩티드로부터 생성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바의 "천연 TF"는 rhTF를 비롯한 TF 시료를 포함한다. 상기한 바와 같이, 폴리클로날 항체도 역시 사용될 수 있으나 단일클론 항체들은 전반적으로 바람직하다.

더욱 바람직하게는 항체들은 천연 인간 TF의 정제된 시료 또는 상기한 바의 면역원성 펩티드로 포유류를 단독으로 또는 담체와 혼합하여 면역화시킴으로써 제 조될 수 있다. 적합한 포유류는 양, 염소, 토끼, 기니아 피그, 쥐 및 마우스 등의 통상적인 실험실 동물들을 포함한다. 토끼 및 마우스, 특히 마우스가 단일클론 항체를 얻기에 바람직하다. 항원은 피하, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하 주사 등의 적합한 다수의 경로중 하나에 의해 투여될 수 있다. 최적 면역화 간격, 면역화 용량 등은 넓은 범위 이내에서 상당히 다양할 것이며, 이들 개시물에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있을 것이다. 대표적인 절차들로는 수개월에 걸쳐 항원을 수회 주사하는 것을 포함한다. 항체들은 표준 방법에 의해 면역화된 동물의 혈청으로부터 수집하고 스크리닝하여 천연 인간 TF에 대해 특이성인 항체를 발견한다. 단일 클론 항체는 항체를 생산하는 세포들에서 생성되며, 그러한 세포들을 사용하여 하이브리도마 세포를 생산하기 위한 표준 융합 기술을 사용함으로써 단일 클론 항체를 생산한다. 참조 문헌[G. Kohler et al., Nature, 256:456 (1975)]. 대표적으로 이는 항체 생산 세포와 골수종 세포 등의 불멸화 세포의 융합을 수반하여 하이브리드 세포를 생산한다. 별법으로, 단일클론 항체는 문헌[Huse, et al., Science, 256:1275 (1986)에 의해 생성된다.

한 적합한 프로토컬은 약 2 내지 7 개월의 기간에 걸쳐서 행해진 정제된 rhTF 복합체를 포함한 조성물을 사용한 마우스를 복강내 면역화하는 것을 포함한다. 이어서, 비장을 면역화된 마우스로부터 제거한다. 면역화된 마우스로부터의 혈청을 비장을 절개하기 전에 rhTF에 특이적인 항체의 역가에 대하여 분석한다. 이어서 절개된 마우스 비장을 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(HGPRT) 또는 티미딘 키나아제 결핍(TK^-) 등의 마커를 가진 적절한 동종 또는 이종(동종이 바람직함) 임파구 세포주에 융합시킨다. 골수종 세포를 임파구 세포주로 사용하는 것이 바람직하다. 골수종 세포 및 비장 세포를 예컨대 1 대 4의 골수종 세포 대 비장 세포의 비율로 함께 혼합한다. 세포들을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 법에 의해 융합시킬 수 있다. 참조 문헌[G. Kohler et al., 상기함]. 이와 같이 클로닝된 하이브리도마는 배양 배지, 예컨대 RPMI-1640에서 성장시킨다. 참조 문헌[G. E. More, et al., Journal of American Medical Association, 199:549 (1967). 융합 절차 후 성장시킨 하이브리도마는 정제된 rhTF에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 정제된 rhTF에 결합하지만 비-천연 TF에는 결합하지 않는 항체의 분비에 대한 방사 효소 면역 분석 또는 효소면역 분석 등에 의해 스크리닝한다. 바람직하게는 ELISA가 스크리닝에 사용된다. 그러한 스크리닝 결과 양성의 결과를 나타내는 하이브리도마를 팽창시켜 제한 희석법에 의해 클로닝시킨다. 추가의 스크리닝을 수행하여 용액 뿐만아니라 인간 체액 시료에서 rhTF에 결합할 수 있는 항체를 선별하는 것이 바람직하다. 단리된 항체는 친화 크로마토그래피를 포함하는 임의의 적합한 면역학적 기술에 의해 추가로 정제할 수 있다. 특정의 바람직한 H36.D2.B7 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 미국 MD 10852, 로크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 하이브리도마 배양물은 1997년 1월 8일에 ATCC에 기탁되었으며, 기탁번호 ATCC HB-12255를 부여받았다.

인체 치료에 응용하기 위해, 키메라 항체 유도체, 예컨대 비-인간 동물 가변 영역 및 인간 불변 영역을 조합한 분자를 생성시킴으로서 대응 비-키메라 항체에 비하여 인간 개체에서 덜 면역원성인 항체를 부여하는 것이 바람직할 수도 있다. 다양한 타입의 그러한 키메라 항체들을 제조할 수 있으며, 예를 들면 일부의 가변 영역, 특히 항원-결합 도메인의 보존된 영역이 인간 유래이고 단지 초가변 영역이 비-인간 유래인 인간 가변 영역 키메라를 생산함으로써 제조될 수 있다. 문헌[S.L. Morrison, Science, 229:1202-1208 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4:214 (1986); Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 9:3-16 (1982)]에 기술된 인간화된 키메라 항체 및 이들의 제조 방법에 대한 논의를 참조하기 바람. 추가로 트랜스제닉 마우스를 사용할 수도 있다. 예를 들면 인간 항체 레퍼토리를 가지는 트랜스제닉 마우스를 창제하고 이것을 천연 인간 TF로 면역화시킬 수 있다. 이어서 그러한 면역화된 트랜스제닉 마우스의 비장을 사용하여 상기한 바의 천연 인간 TF와 특이적으로 반응하는 인간 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 창제할 수 있다. 참조 문헌[N. Lonberg et al., Nature, 368:856-859 (1994); L.L. Green et al., Nature Genet., 7:13-21 (1994); S.L. Morrison, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:6851-6855 (1994)].

본 발명의 항체의 핵산은 또한 폴리머라제 연쇄 반응(후술하는 실시예 1에 기재된 프라이머 참조)에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecuar Cloning (2d ed. 1989)] 참조. 그러한 핵산은 또한 공지의 방법, 예컨대 포스페이트 트리에스터 방법[참조, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press(M.J. Gait, ed., 1984)] 또는 상업상 입수 가능한 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기 에 의해 합성할 수 있다. 본 발명의 그러한 제조된 핵산은 공지의 방법에 의해 본 발명의 항체를 발현하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체를 코드하는 핵산은 제한 효소를 사용하여 구조물의 삽입을 위한 백터내에 절단부를 형성한 다음 연결하는 등의 공지의 방법에 의해 적합한 벡터내에 혼입시킬 수 있다. 적합하게는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 삽입된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 이어서 발현용 숙주내에 도입시킨다. 일반적으로 상기한 문헌[Sambrook et al.,]을 참조하기 바람. 적합한 벡터의 선택은 클로닝 프로토컬에 관련된 인자들에 기초하여 경험적으로 행할 수 있다. 예를 들면, 벡터는 사용되는 숙주세포에 대하여 혼화성이어야 하고 이 숙주의 적절한 리플리콘을 가져야 한다. 또 벡터는 삽입된 핵산 서열을 수용할 수 있어야 한다. 적합한 숙주는 다양한 진핵 또는 대장균 등의 원핵 세포를 포함한다.

본 발명의 항체의 분자량은 의도한 용도 및 항체가 접합 또는 재조합에 의해 융합된 독소, 제약학적 또는 검출 가능한 표지 등을 포함하는가 등의 몇가지 요인에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 대략 20 내지 150 kDa의 분자량을 가질 것이다. 그러한 분자량은 SDS-PAGE 겔 전기영동에 이어 단백질 염색 또는 웨스턴 블롯 분석 등의 분자 사이징 방법에 의해 쉽게 결정할 수 있다.

"본 발명의 항체" 또는 기타 유사한 용어는 천연 TF에 결합하는 전 면역글로불린 뿐만아니라 면역학적으로 활성인 단편들을 의미한다. 그의 면역 글로불린 및 면역학적으로 활성인 단편은 예를 들면 Fab, F(v), Fab', F(ab')₂ 단편, 면역글로불린의 이황화 결합을 환원시킴으로써 유도된 "반분자", 단일 쇄 면역글로불린, 또는 기타 적합한 항원 결합 단편들을 포함한다. 참조 문헌[Bird et al., Science, pp. 242-424 (1988); Huston et al., PNAS, (USA), 85:5879 (1988); Webber et al., Mol. Immunol., 32:249 (1995)]. 항체 또는 면역학적으로 활성인 그의 분획은 동물(예컨대 마우스 또는 쥐 등의 설치류) 또는 키메라 형(참조, Morrison et al., PNAS, 81:6851 (1984); Jones et al., Nature, pp.321, 522 (1986)의 것일 수 있다. 본 발명의 단일쇄 항체가 바람직할 수도 있다.

마찬가지로 "본 발명의 핵산"은 발현되어 그 용어가 바로 앞서 정의된 바의 본 발명의 항체를 생성하는 서열을 의미한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 항체들은 멸균수 또는 염소, 폴리에틸렌글리콜 등의 글리콜류, 식물 기원의 오일 등의 대표적으로는 하나 이상의 제약학상 허용되는 비독성 담체를 포함하는 조성물로서, 포유류, 바람직하게는 인간 등의 영장류에 투여하여 협착증 등의 혈전증을 방지하거나 감소시킨다. 특히, 생체내적합성, 생분해성 락티드 폴리머, 락티드 글리콜리드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌글리콜, 폴리옥시프로필렌 코폴리머 등은 본 명세서에 기재된 항체-함유 조성물의 방출을 제어하는 유용한 부형제들일 수 있다. 기타의 잠재적으로 유용한 투여 시스템은 에틸렌 비닐 아세테이트 코폴리머 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템 및 리포좀을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 항응고 조성물은 용액 또는 현탁제의 형태일 것이며 바람직하게는 본 발명의 항체를 대략 0.01% 내지 10%(w/w), 바람직하게는 항체를 0.01% 내지 5%(w/w)로 포함할 것이다. 이 항체는 조성물 중에 단독의 유효 성분으로서 또는 하나 이상의 기타 항-응고제(예, 헤파린, 히루딘 또는 히루로그), 항혈소판제(예, ReoPro) 또는 혈전용해제(예, 조직 플라스미노겐 활성제, 또는 스트렙토키나제 및 유로키나제)를 포함하는 칵테일로서 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 하나 이상의 항-응고제, 항-혈소판제 또는 혈전용해제의 투여전 또는 후에 투여하여 목적하는 항-응고 활성을 촉진하거나 또는 연장시킬 수 있다.

상기한 바와 같이 본 발명의 항체는 의료용 이식물, 예컨대 카테테르, 스텐트 등의 삽입 기구의 사용으로 부터 기인하는 잠재적인 혈액 응고를 감소시키는데 사용될 수 있다. 한 바람직한 방법에 있어서, 이식물은 체액과 접촉하기에 앞서 본 발명의 항체(예컨대, 1 mg/ml 식염 용액으로서)로 처리할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로 본 발명의 항체는 혈액 응고를 최소화하기에 충분한 양으로 체액과 혼합시킬 수 있다.

본 발명에 따른 치료학적 항-응고제 조성물은 비경구 또는 정맥내 투여, 특히 액제의 형태로 사용하기에 적합하다. 그러한 조성물은 단위 투여용량으로 편리하게 투여될 수 있으며 제약 업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 참조 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co., Easton PA (1980)]. 용어, "단위 투여량"은 각 단위가 필요한 희석제 또는 담체와 결합되어 바람직한 치료 효과를 나타내도록 계산된 예정된 양의 유효 물질을 포함하는 인간 등의 영장류에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위로 사용되는 본 발명의 치료 조성물을 의미한다. 단위 투여량은 치료할 혈전의 유형 및 심도, 항체를 이용하는 개체의 혈액 응고 시스템의 용량 및 목적하는 FX 활성화의 억제 또는 중화도를 포함한 다양한 인자에 의해 다를 것이다. 투여되는 항체의 정확한 양은 대표적으로 개업의의 판단에 의해 좌우될 것이나, 단위 투여량은 일반적으로 투여 경로에 의존할 것이며 일일 10 ng/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 더욱 대표적으로는 일일 100 ng/kg 체중 내지 10 mg/kg의 범위일 것이다. 부스터 숏(booster shot)에서 처음의 투여에 적합한 식이요법도 또한 다양하나 처음 투여에 이어 후속적인 주사 또는 기타 투여에 의한 1시간 이상의 간격으로 반복된 투여에 의해 정형화될 것이다. 별법으로, 연속적인 또는 간헐적인 정맥내 주입을 혈액중의 항체의 적어도 약 10 나노몰 내지 10 마이크로몰의 농도를 유지하기에 충분한 양으로 수행한다.

일부 경우에 있어서, 본 발명의 항체를 변형하여 이것에 바람직한 생물학적, 화학적 또는 물리학적 특성을 부여할 수 있다. 더욱 구체적으로, 항체를 제약학적 제제, 예컨대 t-PA, 스트렙토키나제, 또는 유로키나제 등의 섬유소용해약에 접합(즉, 공유적으로 결합)시켜 섬유소 용해 활성을 제공하는 것이 유용할 수 있다. 그러한 결합은 혼성이기능성(heterobifunctional) 단백질 가교제, 예컨대 SPDP, 카르보디이미드 등의 결합 분자를 사용하는 것을 포함하는 몇가지 방법 또는 재조합적 방법에 의해 성취할 수 있다.

섬유소용해제 등의 제약 이외에, 본 발명의 항체는 디프테리아 독소(즉, DT), 시가 독소, 아브린, 콜레라 독소, 리신, 사포린, 슈도모나스 외독소(PE), 미국 자라공 항바이러스 독소 또는 겔로닌 등의 예컨대 식물 또는 세균 유래의 독소에 접합시킬 수 있다. 생물학적으로 활성인 그러한 독소의 단편은 당업계에 잘 알려져 있으며, DT A 체인 및 리친(ricin) A 체인을 포함한다. 독소는 또한 포스포리 파아제류(예, 포스포리파아제 C) 등의 세포 표면에서 활성인 시약일 수 있다. 또다른 예로서, 독소는 예컨대 벤데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 블레오마이신 또는 시스플라틴 등의 화학요법약일 수 있으며 독소는 예컨대 이오딘-131, 이트리늄-90, 레늄-188 또는 비스무스-212 등의 라디오뉴클리드 일 수 있다. [참조, 일반적으로 Moskaug et al., J. Biol. Chem., 264:15709 (1989); I. Pastan et al., Cell, 47:641 (1986); Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem., 61:331 (1992); Chimeric Toxins Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25:355 (1982); 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 94/29350; 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 94/04689; 및 미국 특허 제 5,620,939호]. 또한, 상기한 바와 같이, 독소외에 본 발명의 항체는 효과기 분자(예, IgG1 또는 IgG3)에 접합되어 포유류에 투여시 보체-고정 능력 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 제공할 수 있다.

그러한 항체/세포독소 또는 효과기 분자 접합체는 포유류가 종양 세포, 면역계 또는 TF를 발현할 수 있는 내피를 가지거나 또는 가지는 것으로 추정되는 경우의 포유류, 바람직하게는 인간 등의 영장류에 치료학상 유효량으로 투여될 수 있다. 그러한 종양 세포, 면역 시스템 세포 및 내피세포의 예로는 유방 및 폐의 종양, 단핵구 및 맥관 내피를 포함한다.

본 발명의 항체는 상기한 바의 것들 외에 예컨대 약물, 효소, 호르몬, 라디오뉴클리드를 결합시킬 수 있는 킬레이트제 뿐만 아니라 질병의 진단 및 치료에 유용한 기타의 단백질 및 폴리펩티드 등의 다양한 기타 약제에 접합시킬 수 있다. 진 단 목적으로, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표지되거나 비표지되어 사용할 수 있다. 예를들면, 다양한 범위의 표지를 적합하게 사용하여 항체를 검출 가능하게 표지시킬 수 있으며, 예로는 라디오뉴클리드, 플루오르류, 효소류, 효소 기질류, 효소 보인자, 효소 억제제, 합텐 등의 리간드류를 포함한다.

생체내 진단 이미징[참조, A.K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology, pg. 328 (W.B. Saunders Co. 1991)]을 포함하는 진단법이 제공된다. 대부분의 생체내 이미징 적용을 위해, 본 발명의 항체는 예컨대 ¹²⁵I, ³²P, ⁹⁹Tc 또는 기타의 검출 가능한 태그에 검출가능하게 표지되고 후속적으로 항체가 목적하는 표적에 접촉하기에 충분한 예정 시간 동안 포유류, 특히 인간에 투여한다. 이어서 개체를 신티그래픽 카메라 분석 등의 공지의 방법에 의해 스캐닝하여 항체의 결합을 검출한다. 이 분석은 본 명세서에 구체적으로 기재한 다수의 혈전증의 진단 및 치료를 보조한다. 이 방법은 심장 수술, 특히 혈관성형술 또는 바람직하지 못한 혈액 응괴의 형성이 일어나는 기타의 외과적 절차에 연관되어 사용되어 혈액 응괴의 발전 또는 이동을 가시화할 때 특히 유용하다.

본 발명의 항체는 또한 혈액 시료로 부터 실질적으로 순수한(예컨대, 적어도 약 90% 순도, 바람직하게는 적어도 약 96% 또는 97% 순도) 천연 TF, 특히 천연 인간 TF를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 천연 TF는 상기한 바와 같이 얻을 수 있고[참조, L.V.M. Rao et al., Thrombosis Res., 56:109 (1989)], 용액을 항체를 포함하는 고상 지지체와 혼합시켜 커플링 반응 혼합물을 형성함으로써 정제할 수 있다. 예시적인 고상 지지체는 마이크로타이터 플레이트 등의 플레이트의 벽 뿐 만아니라 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, Sephadex™(Pharmacia Fine Chemicals)등의 가교 덱스트란, 아가로스, 폴리스티렌 비드(Abott Laboratories), 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 가교된 형태의 폴리아크릴아마이드, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 등을 포함하는 지지체들을 포함한다. 이어서 TF는 표준 면역학적 기술에 따라 실질적으로 순순한 형태로 고상 지지체로부터 단리시킨다. 참조 문헌[일반적으로, Harlow and Lane in Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, New York (1988) and Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)].

상기한 바와 같이, 본 발명의 항체는 생물학적 시료에서 천연 인간 TF, 특히 혈액 응괴와 결합된 천연 TF를 검출하는데 사용될 수 있다. 예시적인 혈액 시료는 혈장, 혈청, 타액선, 뇨, 대변, 질분비물, 담즘, 림프, 안액, 뇌척수액, 세포 배양 배지 및 조직, 특히 심장 조직 등의 혈관 조직을 포함한다. 시료는 적합하게는 혈전증, 바람직하게는 예컨대 심폐 우회 수술 등의 침투성 의료 행위; 심근 경색증, 심근증, 심장 판막증, 불안정 협심증 또는 색전에 관련된 동맥의 섬유소 용해 등의 심장병; 산재성 혈관내 응고, 스텐트 또는 카테테르 등의 삽입물의 배치; 쇼크(패혈성 쇼크 증후), 혈관 외상, 간 질병, 심장 발작, 악성 종양(췌장, 난소 또는 소폐 세포 암종), 홍반, 경련, 혈관주변 폐색 질환 및 신장 질환에 관계된 협착증으로 부터 고통을 받거나 또는 고통을 받는 것으로 추정되는 포유류로부터 얻는다.

그러한 분석을 위해, 본 발명의 항체는 공지의 방법에 따라 β-갈락토시다제 또는 호스래디쉬 퍼록시다아제 또는 형광 태그(예, 플루오레세인 또는 로다민)에 부착된 항-아이디오타이픽 항체 등의 검출가능한 생성물을 생성할 수 있는 적합한 원자 또는 분자, 예컨대 방사성 요오드, 트리티움, 바이오틴 또는 시약으로 검출가능하게 표지시킬 수 있다. 생물학적 시료를 검출가능하게 표지된 항체와 접촉시킨 후, 임의의 미반응 항체는 생물학적 시료로부터 제거하고, 표지(또는 생성물)을 항체 포획 분석, 항체 샌드위치 분석, RIA, ELISA, 면역 침전법, 면역흡수 법 등의 통상의 면역학적 방법에 의해 검출할 수 있다[참조, Harlow and Lane, 상기함; Ausubel et al. 상기함]. 적합한 대조 시료 중에서 검출되는 과량의 임의의 표지는 생물학적 시료 중의 천연 TF, 특히 혈액 응괴의 지표이다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 검출가능하게 표지되어 항체 포획 분석, ELISA, 항체 샌드위치법, RIA, 면역침전 또는 면역흡수법 등의 표준 면역학적 기술에 따라서 천연 TF를 검출 및 바람직하게는 정량화할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 특히 조직이 사용될 때, 면역학적 기술은 단백질 형태를 실질적으로 유지하는 것으로 알려진 시약(예, 희석 포름알데히드)을 사용하여 조직 고정화하는 것을 포함한다. 참조 문헌[일반적으로, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, (1989); Harlow and Lane in Antibodies: A laboratory Manual, CSH Publications, NY (1998)].

본 발명의 항체는 또한 섬유아세포, 뇌세포, 면역 세포(예, 단핵구), 상피 뿐만 아니라 특정 악성 세포를 포함하는 TF를 발현하는 세포를 검출하고 정제하는데에 사용될 수 있다. 세포들을 검출하고 정제하는 바람직한 방법은 통상의 면역학적 방법(예, FACS 등의 플로우 사이토메트리법 및 이뮤노패닝)를 포함한다. 천연 TF를 발현하는 세포의 실질적으로 순수한 집단은 임상 및 연구 셋팅, 즉 TF-결합 항체를 스크리닝하기 위한 배양 세포와 같은 세포를 확립하는데 유용하다.

본 발명은 또한 천연 TF, 특히 천연 인간 TF를 시험 시료에서, 특히 혈액, 혈장 등 또는 상기한 조직 등에서 검출하기 위한 시험 및 진단 키트를 제공한다. 바람직한 키트는 본 발명의 검출가능하게 표지된 항체를 포함한다. 이 진단 키트는 ELISA 포맷 등의 허용 가능한 면역학적 포맷으로 사용되어 생물학적 시료에서 천연 TF의 존재 및 양을 검출할 수 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 서류들은 이들 전부를 참고로 인용한다.

다음의 비제한적인 실시예는 본 발명을 설명하는 것이다. 다음의 실시예 및 기타의 기재에 있어서 항체 H36 및 H36.D2를 언급한다. 이들 항체는 H36.D2.B7과 동일한 것이나, H36은 모 클론으로부터 유도하였고, H36.D2는 첫번째 클론으로부터 얻은 반면, H36.D2.B7은 두번째 클론으로부터 얻었다. TF를 억제하기 위한 능력 및 기타의 물리적 특성에 관련하여 이들 세 클론사이에는 아무런 차이가 관찰되지 않았다.

실시예 1: 항-rhTF 모노클론 항체의 제조 및 클로닝

rhTF에 대한 단일클론 항체를 다음과 같이 제조하였다.

A. 면역화 및 부스트(boosts)

5마리의 암컷 BALB/c 마우스들을 지질화한, 정제된 rhTF 각각 10㎍으로 면역 화시켰다. 마우스들을 처음에는 Hunter's Titermax 보조제를 사용하여 복강내로 감작시켰다. 3개의 최종 부스트들을 0.85% NaCl에 투여하였다. 부스트들은 최초 감작 후 2, 5.5 및 6.5개월이었다. 모든 부스트들을 첫번째를 피하투여한 것을 제외하고는 복강내에 주입하였다. 최종 부스트들은 융합전 3일에 주입하고 20㎍을 투여하였다.

B. 마우스 비장 임파구와 마우스 골수종 세포의 융합

한 rhTF 면역화된 Balb/c 마우스의 비장으로부터의 임파구를 X63-Ag8.653 마우스 골수종 세포에 PEG 1500을 사용하여 융합시켰다. PEG에 노출후 세포들을 열 불활성화시킨 태아 송아지 혈청 중에서 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 융합된 세포들을 RPMI 1640 중에 현탁시키고 10% CO₂로 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세포들을 RPMI 1640을 사용하여 다음날 플레이팅시키고 마크로파지 배양물 상층액을 보충하였다.

C. ELISA 전개

ELISA 분석을 위한 플레이트들을 탄산염 기재 완충액 중의 재조합 조직 인자(0.25 ㎍/㎖) 100 마이크로리터로 코팅시켰다. 모든 단계들을 실온에서 수행하였다. 플레이트들을 BSA로 차단시키고, 세척하고 이어서 시험 시료들 및 대조군들을 첨가하였다. 항원/항체 결합을 플레이트들을 양 항-마우스 HRP 접합체와 인큐베이션시킨 후(Jackson ImmunoReserch Laboratories) ABTS 퍼록시다제 기질 시스템(Kirkegaad and Perry Laboratories)을 사용하여 검출하였다. 흡광도는 405 nm의 파장에서 자동 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.

D. rhTF 하이브리도마 세포주의 안정화

융합후 2주후에, 특이적 rhTF ELISA에 의한 하이브리도마 세포의 스크리닝을 시작하였다. 새로운 콜로니에 대한 스크리닝은 3 주 동안 계속하였다. 양성의 클론들을 15개의 안정된 클론들이 동결될 때까지 연속된 항체 생산에 대해 매 1 내지 2 주동안 시험하였다.

E. 1차 및 2차 클로닝

제한 희석 클로닝을 각각의 양성의 안정된 하이브리도마에 대해 수행하여 1차 클론을 얻었다. 세포들을 해동시키고, 단시간 동안 성장시키고 이어서 10 세포/웰 내지 0.1 세포/웰로 희석시켰다. 일차 클론들을 항-rhTF ELISA에 의해 시험하고 5 내지 6개의 양성 클론들을 팽창시킨 후 동결시켰다.

항-rhTF 항체, H36.D2.B37의 2차 클론을 상기한 바와 같이 1차 클론, H36.D2으로부터 얻고, 제조하고 액체 질소에 저장하였다. 일차 클론의 4개의 상이한 희석물, 5 세포/웰, 2 세포/웰, 1 세포/웰, 0.5 세포/웰들을 96-웰 플레이트 마이크로타이터 플레이트에서 제조하여 2차 클로닝을 개시하였다. 세포들을 다음의 첨가물을 포함하는 IMDM 조직 배양 배지 중에 희석시켰다: 20% 태아 송아지 혈청(FBS), 2ml L-글루타민, 페니실린 100 단위/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 1% GMS-S, 0.075% NaHCO₃. 항-rhTF 항체를 분비하는 클론을 결정하기 위하여, 0.2 세포/웰 마이크로타이터 플레이트의 5개의 개별 웰로부터의 상층액을 성장의 2 주후에 회수하여 상기한 바의 ELISA 분석에 의해 항-rhTF 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 모든 5개의 클론들은 ELISA 분석에서 양성의 결과를 나타냈으며, H36.D2.B7이 최고의 항체 생산자이었다. 모든 5개의 클론들을 채택하고 다음의 첨가물을 함유한 RPMI 배지 중에서 팽창시켰다: 10% FBS, 2ml L-글루타민, 페니실린 100 단위/ml, 스트렙토마이신 100 ㎍/ml, 1% GMS-S, 0.075% NaHCO₃ 및 옥살아세트산 0.013 mg/ml. 세포 배양물의 상층액으로부터 H36.D2.B7을 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 정제하고 FX 활성화 분석으로 TF:VIIa를 억제하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 그 결과 H36.D2.B7이 H36.D2 항체와 동일한 억제를 가졌다. 모든 세포들을 액체 질소 중에 보관하였다.

F. H36.D2.B7 항체로부터 전체 RNA의 단리

전체 RNA 269㎍을 2.7 x 10⁵ H36.D2.B7 하이브리도마 세포로부터 단리하였다. 전체 RNA의 단리는 Quigen으로부터의 RNeasy Midi Kits 프로토컬에 기술된 바대로 수행하였다. RNA 시료들을 필요할 때까지 -20℃에 저장하였다.

G. H36.D2.B7 유전자의 가변 영역의 cDNA 합성 및 클로닝

cDNA의 제 1 가닥을 얻기 위하여, 상기와 같이 단리된 총 RNA의 5 ㎍, 중쇄(HC)용 백(back) 프라이머 JS300(모든 프라이머는 이후 확인된다) 및 경쇄(LC)용 OKA, RN아제 억제제, dNTP's, DTT, 및 슈퍼스크립트(superscript) II 역 전사효소를 함유하는 반응 혼합물을 제조하여 42℃에서 1 시간동안 인큐베이션 했다. 이어서, 전사를 멈추기위하여 반응 튜브를 65℃에서 15분 동안 인큐베이션했다. 냉각후, 이어서 RNase H의 5 단위를 첨가하고, 반응물을 37℃에서 20분간 인큐베이션시켰다. cDNA 시료을 필요할 때까지 -70℃로 저장하였다.

상기와 같이 만들어진 cDNA로부터의 항-rhTF, H36.D2.B7의 HC 및 LC의 가변 영역(도 1A 및 1B에 기술된 HC 및 LC의 가변 영역의 핵산 및 아미노산 서열)을 클로닝시키기 위하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 별개로 수행하였다.

3 라운드(round)의 PCR을 수행하였다. 라운드 1: HC에 대한 프론트(front) 프라이머 JS002 및 백 프라이머 JS300을 사용하여 96℃, 53℃ 및 72℃에서 35 사이클 동안 PCR을 수행하였다. LC를 위하여, 프론트 프라이머 JS009 및 백 프라이머 OKA 57을 사용하여, PCR을 96℃, 63℃ 및 72℃에서 35사이클 동안 수행하였다. 라운드 2: pMC-18을 HC 프론트 프라이머로 사용하고, pMC-15를 LC 프론트 프라이머로 사용한 것 이외에는 라운드 1에서 처럼 HC 및 LC의 PCR을 수행하였다. 라운드 3: HC경우 H36HCF 및 H36HCR 프라이머를 사용하여 96℃, 60-65℃ 및 72℃에서 30사이클 동안 PCR을 수행하였다. LC경우, H36LCF 및 H36LCR 프라이머를 사용하여 96℃, 58℃ 및 72℃에서 30 사이클동안 PCR을 수행하였다.

다음의 프라이머들을 HC 및 LC의 H36.D2.B7 가변 영역의 클로닝에 사용하였다.

OKA 57:

5'-GCACCTCCAG ATGTTAACTG CTC-3' (서열확인 번호 17)

JS300:

5'-GAARTAVCCC TTGACCAGGC-3' (서열확인 번호 18)

JS009:

5'-GGAGGCGGCG GTTCTGACAT TGTGMTGWCM CARTC-3' (서열확인 번호 19)

JS002:

5'-ATTTCAGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGARGT YCARCTKCAR CARYC-3' (서열확인 번호 20)

pMC15:

5'-CCCGGGCCAC CATGKCCCCW RCTCAGYTYC TKG-3' (서열확인 번호 21)

pMC18:

5'-CCCGGGCCAC CATGGRATGS AGCTGKGTMA TSCTC-3' (서열확인 번호 22)

H36HCF:

5'-ATATACTCGC GACAGCTACA GGTGTCCACT CCGAGATCCA GCTGCAGCAG TC-3' (서열확인 번호 23)

H36HCR:

5'-GACCTGAATT CTAAGGAGAC TGTGAGAGTG G-3' (서열확인 번호 24)

H36LCF:

5'-TTAATTGATA TCCAGATGAC CCAGTCTCC-3' (서열확인 번호 25)

H36LCR:

5'-TAATCGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTCA GCTCCAGCTT GGTCC-3' (서열확인 번호 26)

상기 서열 확인 번호 17 내지 26에 있어서, K는 G 또는 T이고; M은 A 또는 C이며; R은 A 또는 G이고; S는 C 또는 G이며; V는 A, C 또는 G이고; W는 A 또는 T이며; Y는 C 또는 T이다.

실시예 2: 본 발명의 Mab의 결합 활성

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 Mab를 이용하였다. rhTF 분자를 대장균에서 발현시키고 표준 방법(참조, 상기 Harlow 및 Lane, 상기 Ausubel 등)에 따라 면역친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Mab 결합(K_a) 및 분리(K_d) 상수를 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명(즉, BIACore) 분석(참조, 상기 Harlow 및 Lane; 상기 Ausubel 등; Altschuh 등, Biochem., 31:6298(1992); Pharmacia Biosensor에 기술된 BIAcore 방법)에 의해 측정하였다. BiACore 분석 경우, rhTF를 제조자의 지시에 따라 바이오센서 칩에 고정화시켰다. 각 Mab에 대한 상수는 4개의 항체 농도(0.125 nM, 0.25 nM, 0.5 nM, 및 1 nM)에서 측정하였다.

단백질 농도는 표준으로서 소 혈청 알부민 및 시판되는 염색 시약(Bio-Red)을 사용하여 표준 방법(M.M. Bradford, Anal. Biochem., 72:248(1976))에 의해 측정하였다.

도 2는 각 항-rhTF Mab에 대한 결합 및 분리 상수를 보여준다. Mab H36은 시험된 항-rhTF의 가장 높은 결합률(K_a=3.1×10¹⁰M^-1) 및 가장 낮은 분리율(K_d=3.2×10^-11)을 나타냈다.

실시예 3-FXa-특이적 기질 분석

일반적으로, 본 명세서에서 기술된 실험은 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)중에서 70/30 w/w의 비로 포스파티딜콜린(0.07 mg/ml) 및 포스파티딜 세린(0.03 mg/ml)으로 37℃에서 30분간 지질화된 rhTF를 사용하여 수행하였다. 형성된 TF:VIIa 복합체의 저장 용액은 지질화된 rhTF 5 nM 및 FVIIa 5 nM를 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 만들었다. TF:VIIa 복합체를 분취하여 필요할 때 까지 -70℃에서 저장하였다. 정제된 인간 인자 VII, VIIa 및 FX를 엔자임 리서치 레보러토리즈, 인크.로 부터 입수하였다. 하기 완충액가 모든 FXa 및 FVIIa 분석에 사용되었다: 25 mM Hepes-NaOH, 5 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, pH 7.5.

Mab를 FX의 FXa로의 TF:VIIa-매개 활성화를 차단하는 능력에 대해 스크리닝했다. FX 활성화는 두개의 불연속적인 단계로 결정하였다. 첫번째 단계에서(FX 활성화), FXa로의 FX의 전환은 Ca⁺²의 존재하에서 분석하였다. 두번째 단계에서(FXa 활성 분석), FX 활성화를 EDTA에 의해서 억제하고, FXa의 형성을 FXa-특이적 크로모겐성 기질(S-2222)을 사용하여 결정하였다. S-2222 및 S-2288(하기 참조) 크로모겐을 크로모지닉스(chromogenix)(Pharmacia Hepar Inc.에 의해 분배)로부터 수득하였다. FX 활성화는 항-rhTF 항체 또는 완충액 대조군과 미리 인큐베이션된 0.08 nM TF:VIIa와 반응물을 인큐베이팅하여 1.5 ml 마이크로퓨지 튜브에서 수행하였다. 이어서, 반응물을 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서 30 nM FX를 첨가하고, 37℃에서 추가의 인큐베이션을 하였다. FXa 활성은 96-웰 타이터 플레이트에서 측정하였다. 20 마이크로리터의 시료을 단계 1로부터 회수하여 각 웰중에서 동 부피의 EDTA(500 mM)과 혼합하고, 완충액 0.144 ml 및 0.016 ml 의 5 mM S-2222 기질을 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 추가의 15-30분간 인큐베이션했다. 이어서 반응을 50% 아세트산 0.05 ml로 억제하고, 그후 405 nm에서의 흡광도를 각 반응에 대해 기록하였다. TF:VIIa 활성의 억제를 실험 시료(플러스 항체) 및 대조군 시료(항체 없음)에서의 OD_405nm 값으로부터 계산하였다. 몇몇 실험에서, 항-hTF 항체, TF/VIIa, 및 FX를 결합 경쟁을 검출하기 위하여 각각 동시에 첨가하였다. 도 3은 H36.D2MAb(볼드체)가 시험된 다른 항-rHTF Mab보다 유의적으로 큰정도(95%)로 FX에 대한 TF:/VIIa 활성을 억제한다는 것을 보여준다.

실시예 4-FVIIa-특이적 기질 분석

Mab를 FVIIa 특이적 분석에 의해 추가로 스크리닝했다. 이 분석에서, 5 nM 지질화된 rhTF를 96-웰 타이터 플레이트에서 37℃에서 30분간 완충액(대조군) 또는 50 nM 항체(실험적)와 함께 먼저 인큐베이션하고, 이어서 5 nM 정제된 인간 FVIIa(V_T=0.192 ml)와 혼합하고 37℃에서 30분간 인큐베이션했다. FVIIa 특이적 기질 S-2288의 20 mM 저장 용액중 8마이크로리터를 각 웰에 첨가하였다(최종 농도, 0.8 mM). 이어서, 반응을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서 405 nm에서의 흡광도를 50% 아세트산 0.06 ml로 억제하고 측정하였다. TF/VIIa 활성의 억제 퍼센트를 실험 및 대조군 시료로부터의 OD_405nm로부터 계산하였다.

도 4는 H36 항체가 TF와 예비 인큐베이션되거나(VIIa 첨가전) VIIa와 함께 TF 예비-인큐베이션된 TF(항체를 첨가하기 전)에 첨가됐을 때, 이 항체는 S-2288에 대한 TF/VIIa 활성을 유의적으로 차단하지 않는다는것을 보여준다. 이는 H36이 TF 와 FVIIa사이의 상호작용(결합)을 방해하지 않는다는 것, 및 H36이 또한 펩타이드 기질에 대한 TF:VIIa 활성을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5-프로트롬빈 시간(PT) 분석

석회화된 혈액 혈장은 "프로트롬빈 시간"(PT)이라 불리는 현상인 트롬플라스틴(TF)의 첨가후 수초안에 응고될 것이다. 연장된 PT는 전형적으로 항-응고 활성의 유용한 지표이다(참조, 예, 상기 Gilman et al.).

H36.D2 항체를 시판되는 인간 혈장(Ci-Trol 대조군, Baxter Diagnosis Inc.로 부터 입수된 Level I)을 사용하는 표준 방법에 따라 PT에 영향을 미치는 능력에 대해 조사하였다. 응혈 반응을 Ca⁺⁺의 존재하에서 지질화된 rhTF를 첨가하여 개시하였다. 응혈 시간은 자동화된 응고 타이머(MLA Electra 800)에 의해 추적하였다. PT 분석을 0.2 ml의 지질화된 rhTF(0.1% BSA, 14.6 mM CaCl₂, 0.07 mg/ml 포스파티딜콜린, 및 0.03 mg/ml의 포스파티딜세린을 함유하는 50 mM Tris-HCl, pH 7.5의 완충액 중)를 플라스틱 트윈-웰 큐베트에 주입하여 시작하였다. 큐베트는 각각 0.01 ml의 완충액(대조군 시료) 또는 항체(실험 시료)와 1-2분 동안 예비 인큐베이션된 플리즈마 0.1 ml를 함유하였다. H36.D2 항체에 의한 TF-매개 응고의 억제는 로그[TF]를 로그 응혈 시간에 대해 플로팅한 TF 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.

도 5는 H36.D2 항체가 인간 혈장에서 TF-개시된 응고를 실질적으로 억제한다는 것을 보여준다. H36.D2 항체가 PT 시간을 유의적으로 증가시켜, 항체가 TF-개시된 응고의 효과적인 억제자란 것을 보여준다(대략 99% 억제).

실시예 6-FX와 H36.D2 항체는 TF:VIIa 복합체에 결합하기 위하여 경쟁한다.

경쟁 실험을 TF/VIIa, FX 및 H36.D2 항체 사이에 수행하였다. 도 6A는 미리 형성된 TF/VIIa 복합체(0.08 nM)를 각각 0.02 nm, 0.04nm, 0.08 nm 및 0.16 nm의 H36.D2 모노클로날 항체를 포함하는 완충액중에서 37℃에서 30분간 예비-인큐베이션시켰다. 이어서, FX(30 nM)를 TF/VIIa 및 H36.D2 항체 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 추가로 10분 동안 인큐베이션했다. FX 활성화를 상기 기술된 바와 같이 EDTA로 억제했다. 이렇게 생성된 FXa는 상기 실시예 3에서 기술된 FXa-특이적 분석에 의해 측정하였다.

도 6B는 H36.D2 항체, 예비형성된 TF:VIIa, 및 FX가 FX 활성화 분석을 시작하기 위하여 동시에 첨가되었다는 이외에는 상기 기술된 라인에 따라 수행된 실험의 결과를 보여준다.

도 6A 및 6B에 기술된 데이타는 H36.D2 항체 및 FX가 예비-형성된 TF/VIIa 복합체에 결합하기 위하여 경쟁한다는 것을 보여준다.

실시예 7-세포 배양물에서 TF 활성의 억제

J-82는 세포 표면 단백질로서의 천연 인간 TF를 풍부하게 억제하는 인간 방광 암종 세포주(ATCC로 부터 입수 가능)이다. H36.D2 항체가 세포 표면상에 나타난 천연 TF에 FX가 결합하는 것을 방지할 수 있는 가를 알아보기 위하여, FVII의 존재하에서 마이크로타이터 플레이트에서 J-82 FX 활성 분석을 수행하였다(참조, D.S. Fair et al., J. Biol. Chem., 262:11692(1987)). 각 웰에 2 × 10⁵개의 세포를 첨가하고, 37℃에서 2 시간동안 50 ng FVII, 완충액(대조군 시료) 또는 항-TF 항체(실험 시료)과 함께 인큐베이션시켰다. 나중에, 각 웰을 완충액로 온화하게 세정하고, FX(0.05 mg/ml)의 0.3 ml를 각 웰에 실온에서 30분간 첨가하였다. 몇몇 경우에, 천연 TF에 대한 결합 경쟁을 검출하기 위하여 FX와 동시에 첨가하였다. 그후, 0.05 ml의 분취량을 제거하여 0.025 ml의 100 mM EDTA를 함유하는 96-웰 타이터 플레이트 중의 새로운 웰들에 첨가하였다. FXa 활성을 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 FXa-특이적 분석에 의해 측정하였다. J-82 세포의 표면상의 TF 활성의 억제는 항체의 부재하(대조군 시료) 및 존재하(실험 시료)에서의 OD_405nm로부터 계산하였다.

도 7은 H36.D2 항체가 J-82 세포막상에 발현된 천연 TF와 결합하고, FX의 TF-매개 활성화를 억제한다는 것을 보여준다. 이들 결과는 항체가 세포 표면상에 나타난 천연 TF에 결합하기 위하여 FX와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 하기 실시예 8의 데이타를 취했을 때, 그 결과는 또한 H36.D2 항체가 세포막 안의 천연 TF상의 형태학적 에피토프와 결합할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 8 - 천연 rhTF에 H36.D2 항체의 특이적 결합

천연 및 비-천연 rhTF에 대한 H36.D2의 결합을 평가했다. 구체적으로, rhTF를 하기 세개의 완충액의 각각에서 30 ㎍/ml로 희석시켰다: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 8 M 우레아; 및 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 8 M 우레아 및 5 mM 디티오트레이톨. Tris 완충액중의 인큐베이션은 rhTF를 천연 형태로 유지하고, 반면에 8M 우레아 및 5nM 디티오트레이톨로 처리하면 비-천연(변성된) rhTF를 생성했다. 각 시료을 실온에서 24 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베 이션후, Millipore Immobilon(7×7 cm 섹션) 막을 메탄올로, 이어서 20% 메탄올을 포함하는 25 mM Tris, pH 10.4로 미리 적셨다. 막을 공기 건조시킨후, 각 시료(30 ㎍/ml)의 대략 0.5 ㎕, 1㎕, 및 2 ㎕를 막에 가하고 공기 건조시켰다. 막을 5%(w/v) 탈지유 및 5%(v/v) NP-40을 함유하는 PBS로 차단한후, 막을 H36.D2 항체로 탐침시킨후, 염소 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 콘주게이트(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.로부터 입수)와 함께 인큐베이션시켰다. 제조자의 지시에 따라(Amersham) ECL 웨스턴 블로팅 시약과 함께 인큐베이션시킨후, 막을 플라스틱 필름(Saran Wrap)으로 싸서 다양한 시간동안 X-레이 필름에 노출시켰다.

도 8A는 H36.D2 Mab가 Tris 완충액 또는 8M 우레아를 갖는 Tris 완충액(레인 1 및 2)의 존재하에서 천연 TF상의 형태학적 에피토프와 결합한다는 것을 보여준다. 오토라디오그램에 40초동안 노출시켰다. 그러나, 천연 TF가 8M 우레아 및 5mM DTT로 변성되었을 때, H36.D2 결합은 유의적으로 감소되거나 제거되었다(레인 3). 도 8B는 비-천연 (변성된) rhTF에 대한 H36.D2 항체의 잔류 결합을 보여주는 과-노출된 오토라디오그램을 보여준다. 과노출은 대략 120초 동안이었다. 8M 우레아 단독으로 처리하는 것은 천연 rhTF의 단지 부분적의 변성을 초래하였다. 그이유는 TF중의 두개의 이황화 결합이 환원되지 않았기 때문일 것이다. 부분적으로 변성된 TF는 우레아가 제거되었을 때, 후의 블로팅 공정동안 천연 형태학적로 재접힐 수 있는 가능성이 있다. 이들 결과는 형태학적 에피토프에 선택적으로 결합하지 않고 변성된 TF에 결합하는 앞서 보고된 항체(참조, 미합중국 특허 제 5,437,864 호, 여기에서, 도 18에서 웨스턴 블로트 분석은 SDS에 의해 변성된 TF에 결합하는 것을 보여준다)로부터 변성된 TF와 결합하지않는 본 발명의 바람직한 항체를 분명히 구별시킨다.

본 발명은 바람직한 실시형태를 참고로 상세히 기술되었다. 그러나, 본 분야에 숙련된자가 개시를 고려하여 본 발명의 취지 및 범위안에서 변형과 개선을 할수 있음이 이해될 것이다.

<110> JIAO, JIN-AN WONG, HING C. WEN, JING HAI <120> ANTIBODIES FOR INHIBITING BLOOD COAGULATION AND METHODS OF USE THEREOF <130> 46943-CIP3 (71758) <140> 10-1999-7007803 <141> 1999-08-26 <150> 10/293,417 <151> 2002-11-12 <150> 09/293,854 <151> 1999-04-16 <150> 08/814,806 <151> 1997-03-10 <160> 26 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 1 gac att cag atg acc cag tct cct gcc tcc cag tct gca tct ctg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa agt gtc acc atc aca tgc ctg gca agt cag acc att gat aca tgg 96 Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa tct cct cag ctc ctg att 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 tat gct gcc acc aac ttg gca gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggc aca aaa ttt tct ttc aag atc agc agc cta cag 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115 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe 65 70 75 80 Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Thr Asp Tyr Asn Val Tyr 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe 1 5 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctggcaagtc agaccattga t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gctgccacca acttggcaga t 21 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 caacaagttt acagttctcc attcacgt 28 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 actgactaca acgtgtac 18 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tatattgatc cttacaatgg tattactatc tacgaccaga acttcaaggg c 51 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gatgtgacta cggcccttga cttc 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 17 gcacctccag atgttaactg ctc 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 18 gaartavccc ttgaccaggc 20 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 19 ggaggcggcg gttctgacat tgtgmtgwcm cartc 35 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 20 atttcaggcc cagccggcca tggccgargt ycarctkcar caryc 45 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 21 cccgggccac catgkccccw rctcagytyc tkg 33 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 22 cccgggccac catggratgs agctgkgtma tsctc 35 <210> 23 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 23 atatactcgc gacagctaca ggtgtccact ccgagatcca gctgcagcag tc 52 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 24 gacctgaatt ctaaggagac tgtgagagtg g 31 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 25 ttaattgata tccagatgac ccagtctcc 29 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 26 taatcgttcg aaaagtgtac ttacgtttca gctccagctt ggtcc 45

Claims

서열 확인 번호 5 내지 10으로 나타내어지는 초가변 영역을 포함하고, 인자 X가 인간 조직 인자에 결합하는 것을 저해하는 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체가 H36.D2.B7[ATCC HB-12255]에 동등하거나 더 큰 천연 인간 조직 인자에 대한 결합 특이성을 갖는 항체.
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제1항에 있어서, 항체가 H36.D2.B7[ATCC HB-12255]인 항체.
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제1항에 있어서, 항체가 단일클론 항체인 항체.
제1항에 있어서, 항체가 키메라 항체인 항체.
제8항에 있어서, 인간 유래의 불변 영역을 포함하는 항체.
제1항에 있어서, 단일쇄 항체인 항체.
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서열 확인 번호 2 또는 서열 확인 번호 4로 나타내어지는 가변영역을 포함하고, 인자 X가 인간 조직 인자에 결합하는 것을 저해하는 항체.
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제 1항 또는 제 12항에 따른 항체를 코드하는 서열로 구성되는 단리된 핵산.
제15항에 있어서, 단일 클론 항체가 H36.D2.B7[ATCC HB-12255]인 핵산.
제15항에 있어서, 항체의 가변영역을 코드하는 서열이 서열 확인 번호 1 또는 서열 확인 번호 3의 서열인 핵산.
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벡터가 천연 인간 조직 인자에 결합되는 항체의 적어도 일부를 발현할 수 있는 제15항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제23항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1항 또는 제 12항에 따른 치료학적 유효량의 항체를 포함하는 포유동물에서의 혈액 응고 저해용 조성물.
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제25항에 있어서, 포유류가 인간인 조성물.
제27항에 있어서, 인간이 혈전증으로 고통을 겪거나 또는 이것을 가진 것으로 의심되는 것인 조성물.
제27항에 있어서, 인간이 침투성 의료 절차와 관련된 협착증으로 고통을 겪거나 또는 이것에 민감한 것인 조성물.
제29항에 있어서, 상기 침투성 의료 절차가 혈관성형술, 동맥내막 절제술, 스텐트의 배치, 카테테르의 사용, 조직 이식 또는 동정맥류 단락의 사용인 조성물.
제27항에 있어서, 인간이 심장혈관 질환, 감염성 질환, 신생물 질환 또는 혈전용해제의 사용과 관련된 혈색증 질환으로부터 고통을 겪는 것인 조성물.
제25항에 있어서, 추가로 항-혈소판 조성물, 혈전용해 조성물 또는 항-응고제 조성물을 포함하는 조성물.
제25항에 있어서, 항체가 H36.D2.B7[ATCC HB-12255]인 조성물.
항체가 세포 독소 또는 효과기 분자에 공유적으로 결합되어 보체-고정화 능력 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 제공하는 제 1항 또는 제 12항에 따른 치료학적 유효량의 항체를 포함하는, 포유류에서 조직 인자 레벨을 감소시키는 조성물.
제34항에 있어서, 조직 인자를 발현하는 세포 상에서 조직 인자 수준을 감소시키는 조성물.
생물학적 시료를 제1항의 단일클론 항체와 접촉시키고, 생물학적 시료 중의 조직 인자의 존재에 대하여 생물학적 시료 및 단일클론 항체를 분석하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 조직 인자를 검출하는 방법.
제 12항에 있어서, 항체의 가변영역이 서열 확인 번호 1 또는 서열 확인 번호 3에 의해 코드되는 항체.
조직 인자를 제 1항 또는 제 12항에 따른 유효량의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 인자 X의 조직 인자-의존성 활성화를 차단하거나 저해하는 방법.
제 1항 또는 제 12항에 따른 유효량의 항체를 포함하는 인자 X의 조직 인자-의존성 활성화를 차단하거나 저해하기 위한 조성물.