CZ2004454A3

CZ2004454A3 - Protilátky lidského tkáňového faktoru

Info

Publication number: CZ2004454A3
Application number: CZ2004454A
Authority: CZ
Inventors: Per-Ola Freskgaard; Jes Thorn Clausen; Brit Binow Sorensen; Marianne Kjalke
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 2001-10-02
Filing date: 2002-09-30
Publication date: 2004-09-15
Also published as: ZA200402303B; WO2003029295A1; EP1434802A1; PL368989A1; RU2004113373A; CA2460917A1; BR0213046A; JP2005512970A; CN1575302A; IL160998A0; MXPA04003051A; HUP0401658A2; NO20041802L; KR20040045478A

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká izolovaných protilátek, u kterých dochází k imunitní reakci s tkáňovým faktorem (TF) , čímž se inhibuje vazba koagulačního faktoru Vila (FVIIa), a tak imunoterapeutického způsobu použití lidských protilátek proti TF k inhibici tvorby sražené krve při operačním zákroku, mikrooperačním zákroku, angioplastii nebo poranění nebo k inhibici tvorby sražené krve a dalších funkcích TF při nenormálních hemostatických stavech souvisejících s onemocněními jako je žilní trombóza, roztroušená nitrocévní koagulace (DIC), onemocnění koronární tepny, sepse, zánět, ateroskleróza nebo rakovina. Také je zde popsán způsob přípravy protilátek stejně jako buněčných linií pro přípravu lidských monoklonálních protilátek.

Dosavadní stav techniky

Srážení krve je proces sestávající z komplexní interakce různých krevních složek nebo faktorů, které nakonec vedou ke vzniku fibrinové sraženiny. Obecně krevní složky, které se účastní v tom, co se označuje jako srážecí „kaskáda, jsou proenzymy nebo zymogeny, enzymaticky neaktivní proteiny, které se přeměňují na proteolytické enzymy působením aktivátoru, který je sám o sobě aktivován faktorem srážení. Faktory srážení, které podléhají takové přeměně se obecně označují jako „aktivní faktory a označují se přidáním malého písmena „a na konec označení (např. Faktor Vila).

Aktivovaný faktor X („Xa) je nutný pro přeměnu protrombinu na trombin, který pak přeměňuje fibrinogen na fibrin jako konečné stadium tvorby fibrinové sraženiny.

Existují dva systémy nebo cesty, které podporují aktivaci • · · · • · ·

Faktoru X. „Vnitřní způsob označuje takové reakce, které vedou ke vzniku trombinu s využitím faktorů přítomných pouze v plasmě. Série proteasou zprostředkovaných aktivací nakonec vytvoří Faktor IXa, který spolu s Faktorem Vila štěpí Faktor X na Faktor Xa. Stejnou proteolýzu provádí FVIIa a jeho kofaktor, TF, při „zevním způsobu srážení krve. TF je protein vázaný k membráně a normálně necirkuluje v plasmě v aktivní formě. Po narušení cévy se ale TF komplexuje s FVIIa, a tak katalyzuje aktivaci Faktoru X nebo Faktoru IX v přítomnosti Ca²⁺ a fosfolipidu. Ačkoliv relativní důležitost dvou způsobů srážení při zástavě krvácení není jasná, bylo zjištěno, že Faktor VII a TF hrají zásadní roli ve vyvolání srážení krve.

Často je nutné u pacienta selektivně blokovat srážecí kaskádu. Lze použít antikoagulanty jako je heparin, kumarin, deriváty kumarinu, deriváty indandionu nebo jiná činidla, například během ledvinové dialýzy nebo pro léčení hluboké žilni trombózy, roztroušené nitrocévni koagulace (DIC) a množství dalších zdravotních poruch. Například lze léčení heparinem nebo mimotělní léčení citrátovými ionty použití při dialýze, aby se zabránilo srážení během léčení. Heparin se také požívá pro prevenci hluboké žilní trombózy u pacientů, kteří prodělali operaci.

Léčení heparinem a dalšími antikoagulanty ale může mít nežádoucí vedlejší účinky. Dostupné antikoagulanty obecně působí spíše v celém těle než, aby působily konkrétně v místě poranění. Například heparin může způsobit těžké krvácení. Navíc s poločasem života kolem 80 minut se heparin z těla rychle odbourává což vyžaduje časté opětovné podávání. Protože heparin působí jako kofaktor antitrombinu III (ATIII) a ATIII je rychle spotřebováván při léčení DIC, je často obtížné udržovat odpovídající hladinu heparinu, což vyžaduje nepřetržité sledování množství ATIII a heparinu. Heparin je často neúčinný v případech, kdy je vyčerpání ATIII vysoké. Dále dlouhodobé užívání heparinu může případně také zvýšit • · · · • · • · · · agregaci destiček a snížit počet destiček a tím způsobit vznik heparinem vyvolané trombocytopenie. Deriváty indandionu případně také mohou mít toxické vedlejší účinky. Kromě antikoagulantů stručně popsaných výše, bylo zjištěno, že některé přirozené proteiny mají antikoagulační aktivitu. Také ATIII byl navržen jako terapeuticky antikoagulant.

Mezinárodní přihláška WO 92/15 686 se týká deaktivovaného Faktoru Vila určeného pro inhibici srážení krve.

Protilátky jsou specifické imunoglobulinové (Ig) polypeptidy produkované imunitním systémem obratlovců v reakci na cizí proteiny, glykoproteiny, buňky nebo jiné antigenní cizorodé látky. Sekvence událostí, které umožňují organismu překonat invazi cizích buněk nebo vyčistit systém od cizích látek je nyní alespoň částečně známý. Důležitou součástí tohoto procesu je vznik protilátek, které se váží specificky ke konkrétní cizí látce. Vazebná specifita takových polypeptidů ke konkrétnímu antigenu je vysoce přesně definovaná a množství specifit, které dokáže jednotlivý obratlovec vyvolat, je ve své komplexnosti a proměnnosti pozoruhodný. Milióny antigenů jsou schopné vyvolat reakci protilátky, přičemž každá protilátka je téměř exkluzivně směrovaná na konkrétní antigen, který ji vyvolává.

V současnosti jsou používány dva hlavní zdroje protilátek obratlovců, generování in šitu savčími B lymfocyty a generování v buněčné kultuře B buněčnými hybridy. Protilátky jsou generovány in šitu jako důsledek diferenciace nedozrálých B lymfocytů do plasmových buněk, ke které dojde v reakci na stimulaci specifickými antigeny. V případě nediferenciovaných B buněk jsou části DNA kódující ruzne imunoglobulinových řetězců v genomové DNA odděleny, jsou sestavovány oblasti

Sekvence

Výsledný postupně před exprimováním.

uspořádaný gen je schopen exprese ve zralých B lymfocytech, čímž dochází k produkci požadované protilátky. Nicméně, dokonce i když je konkrétní savec vystaven pouze jedinému • · · · • · · · • · • · · · antigenu není výsledkem jednotná populace protilátek. Imunitní reakce in šitu na jakýkoliv konkrétní antigen je definována řadou reakcí na různé determinanty přítomné na antigenu. Každá podmnožina homologních protilátek je produkována jedinou populací B buněk, a proto generování protilátek in šitu je „polyklonální.

Tato omezená, ale neodmyslitelná heterogenita byla překonána v různých konkrétních případech použitím hybridomové technologie pro vytvoření „monoklonálních protilátek v buněčných kulturách pomocí hybridomů B buněk.

V tomto postupu se relativně krátce žijící nebo smrtelné splenocyty nebo lymfocyty ze savce, kterému byl injikován antigen, spojují s nesmrtelnou nádorovou buněčnou linií, čímž vzniknou hybridové buňky nebo „hybridomy, které jsou nesmrtelné a schopné produkovat geneticky kódované protilátky B buněk. Takto vytvořené hybridy jsou rozděleny do jednotlivých genetických kmenů selekcí, ředěním a opětovnou kultivací tak, že každý kmen takto představuje jedinou genetickou linii. Proto pak produkují protilátky, u kterých je zaručeno, že jsou homogenní proti požadovanému antigenu. Tyto protilátky jsou s ohledem na jejich čistý genetický původ nazývány „monoklonální.

Monoklonální protilátky s mono-specifitou silně ovlivňují imunologii a jejich použitelnost již byla prokázána v takových vědách jako je biologie, farmakologie, biochemie a další. Takové monoklonální protilátky nalezly širokou škálu použití nejen jako diagnostická činidla, ale také jako terapeutická činidla (viz například Ritz a Schlossman, Blood, 59: 1 až 11 (1982) ) .

Monoklonální protilátky produkované hybridomy, navzdory jejich účinnosti, která byla diskutována výše, a jejich jasné výhodnosti v porovnání s polyklonálními protilátkami z důvodu jejich specifity, trpí podstatnou nevýhodou. V mnoha aplikacích je použití monoklonálních protilátek produkovaných • · • · A A • ·

AAAA

v živočiších jiných než v lidech přísně omezeno v případě, že by tyto monoklonální protilátky měly být použity pro lidi. Opakované injekce „cizích protilátek, jako jsou myší protilátky, do lidí může vést ke škodlivým hypersenzitivním reakcím. Takové protilátky odvozené z jiných savců než z lidí po injikování do lidí způsobují anti-nelidskou protilátkovou reakci.

Terapeutické použití myšího Mabs proti TF je známo z US patentu č. 6 001 978 a 5 223 427.

Mezinárodní přihláška č. WO 99/51 743 popisuje lidské/myší chimérické monoklonální protilátky směřované proti lidskému TF.

Evropská patentová přihláška č. 833 911 popisuje CDR-roubované protilátky proti lidskému TF.

Publikace L. Presta a kol., Thrombosis and Haemostasis, sv. 85 (3) , str. 379 až 389 (2001) popisuje lidské protilátky proti TF.

Stále v dané problematice přetrvává potřeba zlepšených prostředků, které mají antikoagulační aktivitu, které lze podávat v relativně nízkých dávkách a nevyvolávají nežádoucí vedlejší účinky jako v případě tradičních antikoagulačních prostředků. Předkládaný vynález splňuje tuto potřebu tím, že poskytuje antikoagulanty, které nemají vedlejší účinky spojené s tradičními protilátkami se sekvencemi jiných savců než lidí, působí specificky v místech poranění a dále poskytují další související výhody. Dále předkládaný vynález poskytuje sloučeniny, které působí tak, že inhibují buněčné funkce TF, které jsou způsobeny podmínkami jako je sepse, zánět, ateroskleróza, restenóza nebo rakovina.

Podstata vynálezu

Popis vynálezu • · · · • · • · · ··· ··· ·· · ····· · · · • · ··· · ··· ···

Předkládaný vynález se týká neimunogenních lidských protilátek proti lidskému TF s vysokou afinitou, které inhibují vazbu koagulačního faktoru VlI/VIIa a způsobů výběru terapeuticky účinných lidských protilátek proti lidskému TF.

V prvním aspektu se předkládaný vynález týká izolované lidské protilátky, která vyvolává imunitní reakci s epitopem přítomným na lidském TF.

Pojem „lidský tkáňový faktor nebo „lidský TF tak jak se používá v předkládaném vynálezu, označuje polypeptidový receptor plné délky obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 263 přirozeného lidského tkáňového faktoru.

Pojem „protilátka, tak jak se používá v předkládaném vynálezu, označuje imunoglobulinové molekuly a jejich fragmenty, které mají schopnost specificky se vázat na antigen (např. lidský TF). Protilátka plné délky obsahuje čtyři polypeptidové řetězce, dva těžké (H) řetězce a dva lehké (L) řetězce, které jsou vzájemně propojeny disulfidovými vazbami. Každý těžký řetězec obsahuje proměnnou oblast těžkého řetězce (zde zkracovanou jako HCVR nebo VH) a konstantní oblast těžkého řetězce. Konstantní oblast těžkého řetězce obsahuje tři domény, CH1, CH2 a CH3. Každý lehký řetězec obsahuje proměnnou oblast lehkého řetězce (zde zkracovanou jako LCVR nebo VL) a konstantní oblast lehkého řetězce. Konstantní oblast lehkého řetězce obsahuje jednu doménu CL. Oblasti VH a VL lze dále rozdělit do oblastí hypervariability nazývaných jako oblasti určující komplementaritu (CRD), prokládaných oblastmi, které jsou konzervovanější, označovanými jako úseky základní struktury (FR). Každé VH a VL je složeno ze tří CDR a čtyř FR uspořádaných od amino-konce ke karboxy-konci v následujícím pořadí: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Tak je v definici protilátky také jeden nebo více fragmentů protilátky, které udržují schopnost se specificky vázat k antigenu (např. lidskému TF) . Bylo prokázáno, že funkci vazby k antigenu dokáží provádět fragmenty protilátky plné • · délky. Příklady vazebných fragmentů zahrnutých pod pojem „protilátka zahrnují (i) Fab fragment, jednovazný fragment skládající se z VL, VH, CL a CH I domén; (ii) F(ab)₂ a F(ab')₂fragmentů dvojvazného fragmentu obsahujícího dva Fab fragmenty spojené disulfidovým můstkem v pantové oblasti; (iii) Fd fragment sestávající z VH a CH1 domén; (iv) Fv fragment sestávající z VL a VH domén jediného ramene protilátky; (v) dAb fragment (Ward a kol. (1989) Nátuře 341: 544 až 546), který sestává z VH domény; a (vi) izolovaná komplementaritu určující oblast (CDR). Dále, ačkoliv dvě domény Fv fragmentu, VL a VH jsou kódovány oddělenými geny, lze je spojit za použití rekombinantních postupů syntetickou spojkou, která jim umožňuje být ve formě jediného proteinového řetězce, ve kterém se VL a VH oblasti párují tak, že tvoří jednovazné molekuly (známé jako Fv (scFv) s jediným řetězcem; viz například Bird a kol. (1988) Science 242: 423 až 426; a Huston a kol. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85: 5879 až 5883). Takové protilátky s jediným řetězcem také spadají pod pojem „protilátka. Sem spadají také další formy protilátek s jediným řetězcem, jako jsou dia-látky. Dia-látky jsou dvojvazné, bispecifické protilátky, ve kterých jsou domény VH a VL exprimovány na jediném polypeptidovém řetězci, ale za použití spojky, která je příliš krátká, aby umožnila párování mezi dvěma doménami stejného řetězce, čímž se vynutí, aby se domény párovaly s komplementárními doménami jiného řetězce a vytvoří se dvě antigen vážící místa (viz např. P. Holliger a kol. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci USA 90: 6444 až 6448; R.J. Poljak a kol. (1994) Structure 2: 1121 až 1123). Je zřejmé, že lidský TF má případně jeden nebo dva antigenní determinanty obsahující (1) peptidové antigenní determinanty, které sestávají z jediného peptidového řetězce v lidském TF, (2) konformačně antigenní determinanty, které sestávají z více než jednoho z prostorově přiléhajících peptidových řetězců jejichž konkrétní aminokyselinové sekvence jsou umístěny nesouvisle podél polypeptidové sekvence lidského TF; a (3) post-translační antigenní determinanty, které sestávají, buď v celku nebo po částech, z molekulových struktur kovalentně připojených k lidskému TF po translaci, jako jsou cukerné skupiny a podobně.

Pojmy „lidská protilátka, „lidské protilátka, „lidská TF protilátka a „lidské TF protilátky, tak jak se používají v předkládaném vynálezu zahrnují protilátky, které mají proměnné a konstantní oblasti odvozené od lidských zárodečných imunoglobulinových sekvencí. Lidské protilátky podle předkládaného vynálezu případně zahrnují aminokyselinové zbytky nekódované lidskými zárodečnými imunoglobulinovými sekvencemi (např. mutace zavedené náhodnou nebo místně směřovanou mutagenezí in vitro nebo somatickou mutací in vivo), například CDR a konkrétně CDR3. Nicméně pojem „lidská protilátka, tak jak se používá v předkládaném vynálezu nezahrnuje protilátky, ve kterých CDR sekvence odvozené od zárodku jiného savčího druhu, jako je myš, byly naroubovány na lidské základní sekvence, např. tak zvané humanizované protilátky nebo lidské/myší chimérické protilátky.

„Izolovaná lidská protilátka, tak jak se používá v předkládaném vynálezu zahrnuje lidskou protilátku, která v podstatě neobsahuje jiné protilátky, antigenní specifity (např. izolovaná specificky váže lidský TF v podstatě neobsahuje protilátky, které specificky váží jiné antigeny než lidský TF) . Izolovaná protilátka, která specificky váže lidský TF, nicméně může zkříženě reagovat s jinými antigeny, jako jsou molekuly TF z jiných druhů (což bude podrobněji diskutováno dále). Navíc je izolovaná protilátka případně v podstatě bez jiného buněčného materiálu a/nebo chemikálií.

Pojem „epitop, tak jak se používá v předkládaném vynálezu zahrnuje jakýkoliv antigenní determinant nebo antigen, ke kterému se protilátka váže. Epitopické determinanty obvykle které mají protilátka, j íne která • · • · strukturní nábojové sestávají z chemicky aktivních povrchových seskupení molekul, jako jsou aminokyselinové nebo cukerné postranní řetězce a obvykle mají specifické trojrozměrné charakteristiky stejně jako specifické charakteristiky.

Pojem „imunoreagující, tak jak se používá v předkládaném vynálezu znamená jakoukoliv vazbu protilátky k jejímu epitopu

10'’ M.

Poj em s disociační konstantou K_d nižší než „imunoreagující se používá na místech, kde je to vhodné, zaměnitelně s pojmem „specifická vazba.

Pojem „inhibující, tak jak se používá v předkládaném vynálezu znamená jakékoliv snížení v porovnání s referencí. Jako příklad protilátka, která inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF, označuje jakoukoliv protilátku, která snižuje schopnost lidského koagulačního faktoru Vila vázat lidský TF v porovnání se schopností lidského koagulačního faktoru Vila vázat lidský TF bez přítomnosti protilátky.

Pojem „afinita, tak jak se používá v předkládaném vynálezu znamená sílu vazby protilátky k epitopu. Afinita protilátky se měří disociační konstantou K_d definovanou jako [Ab] x [Ag] / [Ab - Ag] , kde [Ab - Ag] je molární koncentrace komplexu protilátka - antigen, [Ab] je molární koncentrace nevázané protilátky a [Ag] je molární koncentrace nevázaného antigenu. Konstanta afinity K_a je definována jako l/Ka. Preferované způsoby pro stanovení Mabs specifity a afinity kompetitivní inhibici lze nalézt v knihách Harlow a kol., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprign Harbor, N.Y., 1988), Colligan a kol., editoři, Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. a Wiley Interscience, N.Y., 1992, 1993, a článku Muller, Meth. Enzymol. 92: 589 až 601 (1983), které jsou zde celé zahrnuty jako reference.

• · · · «

V druhém aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího terapeuticky účinné množství lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF.

Pojem „terapeuticky účinné množství je účinná dávka, kterou stanovuje kvalifikovaný praktický lékař, který může zvyšovat dávky tak, aby se dosáhlo požadované reakce. Faktory, které je třeba brát v potaz při stanovení dávkování, zahrnují účinnost, biodostupnost, požadované farmakokinetické / farmakodynamické profily, léčený stav (např. poranění, zánět, septický šok), faktory související s pacientem (např. hmotnost, zdravotní stav, věk, atd.), přítomnost souběžně podávaných léků, čas podávání nebo jiné faktory, které praktický lékař zná. Dávkování lidské protilátky proti TF podávané pacientovi závisí na typu a stavu, který je třeba léčit, ale obecně je v rozsahu 0,1 až 5,0 mg na kilogram tělesné hmotnosti.

Pojem „jedinec, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakéhokoliv živočicha, zejména savce, jako je člověk a používá se na místech, kde je to vhodné, zaměnitelně s pojmem „pacient.

Ve třetím aspektu se předkládaný vynález týká prostředku obsahujícího lidskou protilátku, která imunoeraguje s epitopem přítomným na lidském TF.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká způsobu léčení nemocí souvisejících s FVIIa/TF u lidí, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF, člověku.

„Léčení znamená podávání účinného množství terapeuticky aktivní sloučeniny podle předkládaného vynálezu za účelem prevence jakýchkoliv příznaků nebo stavů nemoci, které se již rozvinuly. Pojem „léčení v tomto významu také zahrnuje profylaktické léčení.

·· ···· ·· ···· *· « • « · · · e « ♦ · • · · · · · · s · * * · • · · · · · · · · · · · ·

Pojmy „porucha související s FVIIa/TF, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje nemoc nebo poruchu, při které se účastní TF a FVIIa. Sem spadají trombotické nebo koagulopatické nemoci nebo poruchy včetně zánětlivé reakce a chronických tromboembolických onemocnění nebo poruch souvisejících s tvorbou fibrinu včetně vaskulárních poruch, jako je hluboká žilní trombóza, arteriální trombóza, trombóza po chirurgickém zákroku, štěp pro bypass koronární artérie (CABG), koronární angioplastie provedená skrz kůži (PTCA), mrtvice, růst nádoru, nádor ve stádiu metastází, angiogeneze, trombolýza, arterioskleróza a restenóza po angioplastii, akutní a chronické příznaky jako je zánět, septický šok, septikémie, nízký tlak, syndrom obtížného dýchání u dospělých (ARDS) , roztroušená nitrocévní koagulopatie (DIC), plicní embólie, usazování destiček, infarkt myokardu nebo profylaktické léčení savců s aterosklerotickými cévami s rizikem trombózy a dalších nemocí a poruch. Poruchy související s FVIIa/TF nejsou omezeny na in vivo koagulopatické poruchy jako jsou ty, které byly uvedeny výše, ale zahrnuje i ex vivo procesy související s FVIIa/TF, jako je srážení, ke kterému může dojít při mimotělním oběhu krve, včetně odebrané přímo z pacienta při takových postupech, jako je dialýza, filtrace krve nebo krevní přemostění během operace.

Pojem „Faktor Vila nebo „FVIIa znamená „dvoj řetězový aktivovaný koagulační faktor VII štěpený specifickým rozštěpením peptidové vazby Arg 152-IIe 153. FVIIa je případně vyčištěn od krve nebo je vyroben rekombinantními prostředky. Je zřejmé, že praktické provedení způsobů popsaných v předkládaném vynálezu je nezávislé na tom jak byl čištěný faktor Vila získán, a proto předkládaný vynález zahrnuje použití jakékoliv přípravy faktoru Vila vhodné pro použití v předkládaném vynálezu. Preferované jsou lidské FVIIa.

• · • · · · • · ·

Pojem „FVII znamená „jednořetězcový koagulační faktor VII.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká způsobu přípravy lidské protilátky, přičemž tento způsob zahrnuje

a) přípravu lidských protilátek proti lidskému TF,

b) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než 1 nM, jako je hodnota nižší než 500 pM, s výhodou nižší než 200 pM, s výhodou nižší než 100 pM, s výhodou nižší než 50 pM, s výhodou nižší než 10 pM a ještě výhodněji nižší než 5 pM, nebo testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 0,1 nM) , jako je hodnota nižší než 10 nM, s výhodou nižší než 5 nM, s výhodou nižší než 1 nM a ještě výhodněji nižší než 0,1 nM, nebo testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběru lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 10 nM), jako je hodnota nižší než 40 nM, s výhodou nižší než 20 nM a ještě výhodněji nižší než 10 nM, nebo testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa, nebo testování protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která váže lidský TF.

Je třeba chápat, že konkrétní hodnoty IC₅₀ vztahující se k testu srážení vyvolaného TF platí v případě použití normální lidské plasmy.

a) přípravu lidských protilátek proti lidskému TF,

b) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny • · · · • · • · · · v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 1 nM, jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 500 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 200 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 100 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 50 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než

a + 100 nM	(s použitím	0,1 nM FVIIa
l nižší	než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa +
\Z X» nizsi	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa +
nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa +
nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa +
ίi hodnota	nižší	než	hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběru lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 0,1 nM FVIIa v testu), jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa, nebo testováni protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která imunoreaguje s lidským TF.

• · · · • ·

Pojem „test srážení vyvolaného TF, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv test, při kterém se měří doba srážení ve vzorku obsahujícím krevní plasmu a TF. Příklad testu srážení vyvolaného TF je popsán v příkladu 1, test 7.

Pojem „test tvorby FXa, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv test, při kterém se aktivace FX měří ve vzorku obsahujícím TF, FVIIa, FX, vápník a fosfolipidy. Příklad testu tvorby FXa je popsán v příkladu 1, test 5.

Pojem „FVIIa/TF amidolytický test, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv test, při kterém se amidolytická aktivita, tj. štěpení malých peptidových substrátů, FVIIa měří v přítomnosti TF. Příklad FVIIa/TF amidolytického testu je popsán v příkladu 1, test 4.

Pojem „TF ELISA test, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv ELISA test zahrnující TF a protilátky proti TF. Příklady TF ELISA testů jsou přímé a nepřímé TF ELISA testy popsané v příkladu 1, test 1 a 2.

Pojem „přímý TF ELISA test, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv TF ELISA test zahrnující imobilizovaný TF. Příklad nepřímého TF ELISA testu je popsán v příkladu 1, test 1.

Pojem „nepřímý TF ELISA test, tak jak se používá v předkládaném vynálezu označuje jakýkoliv TF ELISA test, ve kterém TF je v roztoku. Příklad přímého TF ELISA testu je popsán v příkladu 1, test 2.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF, získatelné způsobem zahrnujícím

a) přípravu lidských protilátek proti lidskému TF,

b) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny • · · · • · • · · · v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než 1 nM, jako je hodnota nižší než 500 pM, s výhodou nižší než 200 pM, s výhodou nižší než 100 pM, s výhodou nižší než 50 pM, s výhodou nižší než 10 pM a ještě výhodněji nižší než 5 pM, nebo testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 0,1 nM) , jako je hodnota nižší než 10 nM, s výhodou nižší než 5 nM, s výhodou nižší než 1 nM a ještě výhodněji nižší než 0,1 nM, nebo testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběru lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 10 nM) , jako je hodnota nižší než 40 nM, s výhodou nižší než 20 nM a ještě výhodněji nižší než 10 nM, nebo testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa, nebo testováni protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která váže lidský TF.

a) přípravu lidských protilátek proti lidskému TF,

b) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa	+	1 nM,	jako je hodnota nižší	než	hodnota	ic₅₀
FFR-rFVIIa	+	500 pm,	s výhodou hodnota nižší	než	hodnota	ic₅₀
FFR-rFVIIa	+	200 pm,	s výhodou hodnota nižší	než	hodnota	IC₅₀
FFR-rFVIIa	+	100 pm,	s výhodou hodnota nižší	než	hodnota	ic₅₀

• ·

FFR-rFVIIa + 50 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než

a + 100 nM	(s použitím	0,1 nM FVIIa
. nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+
nižší	než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa	+
nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+
nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+
\|i hodnota	nižší	než	hodnota IC	50

FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběru lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 0,1 nM FVIIa v testu), jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa, nebo testování protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která imunoreaguje s lidským TF.

V jednom provedení způsob podle předkládaného vynálezu, při kterém jsou produkovány lidské protilátky proti lidskému TF, zahrnuje imunizaci savce lidským TF a izolaci protilátek produkovaných imunizovaným savcem. V preferovaném provedení je savec myš. Je třeba chápat, že imunizovaný savec nebo myš je schopen produkovat lidské protilátky.

a) imunizaci myši lidským TF,

b) izolaci buněk z imunizované myši produkujících protilátku a přípravu nesmrtelných buněk pro vylučování lidských protilátek,

c) izolaci kultivačního prostředí z nesmrtelných buněk obsahujícího protilátky,

d) testování protilátek v nepřímém TF ELISA testu obsahujícím TF v roztoku a výběr lidských protilátek, které váži lidský TF v roztoku,

e) testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidských protilátek, které soutěží s vazbou FVIIa,

f) testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidských protilátek, které inhibují amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 10 nM), jako je hodnota nižší než 40 nM, s výhodou nižší než 20 nM a ještě výhodněji nižší než 10 nM,

g) testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidských protilátek, které inhibují tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 0,1 nM) , jako je hodnota nižší než 10 nM, s výhodou nižší než 5 nM, s výhodou nižší než 1 nM a ještě výhodněji nižší než 0,1 nM,

h) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než 1 nM, jako je hodnota nižší než 500 pM, s výhodou nižší než 200 pM, s výhodou nižší než 100 pM, s výhodou nižší než 50 pM, s výhodou nižší než 10 pM a ještě výhodněji nižší než 5 pM, • · • · ····· · • ··· · · · · • · · · · · ·

i) výběr a kultivaci ve vhodném kultivačním médiu nesmrtelných buněk produkujících vybranou protilátku podle kroků d) až h),

j) izolaci vybrané protilátky z kultivačního média vybraných nesmrtelných buněk.

a) imunizaci myši lidským TF,

d) testování protilátek v nepřímém TF ELISA testu obsahujícím TF v roztoku a výběr lidských protilátek, které imunoreagují s lidským TF v roztoku,

f) testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 10 nM FVIIa v testu) , jako je

hodnota	nižší	než hodnota IC₅₀	FFR-rFVIIa +	40	nm,	s	výhodou
hodnota	nižší	než hodnota IC₅₀	FFR-rFVIIa +	20	nm,	s	výhodou
hodnota	nižší	než hodnota IC	50 FFR-rFVIIa	+	10	nm,	ještě

výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa,

g) testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 0,1 nM FVIIa v testu), jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa +

	19	• · · · • · • · • · • · · • · ·	·· ·· ···· • · · · • · · · · · • · · · · · • · · · • · · · · ·	• · · • · · • · · · • · · · · • · · • · ·
10 nm,	s výhodou hodnota nižší než hodnota	IC_5O	FFR-rFVIIa	+
5 nm,	s výhodou hodnota nižší než hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa	+
1 nm,	výhodněji hodnota nižší než hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+
0,1 nm	a ještě výhodněji hodnota nižší	než	hodnota IC	'50

FFR-rFVIIa,

h) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidských protilátek, které inhibují tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 1 nM, jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa	+	500	pm,	s	výhodou	hodnota	nižší	než	hodnota	IC₅₀
FFR-rFVIIa	+	200	pm,	s	výhodou	hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀
FFR-rFVIIa	+	100	pm,	s	výhodou	hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀
FFR-rFVIIa	+	50	pm,	s	výhodou	hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀
FFR-rFVIIa	+	10	pm,	výhodněj i	hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀

FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa,

Pojem „buňka produkující protilátku, tak jak se používá v předkládaném vynálezu znamená jakoukoliv buňku, která dokáže produkovat protilátku. Spadají sem hybridomy, transfekované buněčné linie a relativně krátce žijící nebo smrtelné splenocyty nebo lymfocyty ze savce, kterému byl injikován antigen.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském • · · · · «

TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF, získatelné způsobem zahrnujícím:

a) imunizaci myši lidským TF,

d) testování protilátek v nepřímém TF ELISA testu obsahujícím TF v roztoku a výběr lidských protilátek, které váží lidský TF v roztoku,

f) testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidských protilátek, které inhibuji amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 10 nM), jako je hodnota nižší než 40 nM, s výhodou nižší než 20 nM a ještě výhodněji nižší než 10 nM,

g) testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidských protilátek, které inhibují tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀nižší než 100 nM (v testu s koncentraci FVIIa 0,1 nM) , jako je hodnota nižší než 10 nM, s výhodou nižší než 5 nM, s výhodou nižší než 1 nM a ještě výhodněji nižší než 0,1 nM,

h) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC_S0 nižší než 1 nM, jako je hodnota nižší než 500 pM, s výhodou nižší než 200 pM, s výhodou nižší než 100 pM, s výhodou nižší než 50 pM, s výhodou nižší než 10 pM a ještě výhodněji nižší než 5 pM,

i) výběr a kultivaci ve vhodném kultivačním médiu nesmrtelných buněk produkujících vybranou protilátku podle kroků d) až h) ,

• · · · · · · • » · · • · · · · · · • · · · · · · · • · · · ·· · ·· ·

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF, získatelné způsobem zahrnujícím:

a) imunizaci myši lidským TF,

f) testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 10 nM FVIIa v testu) , jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅o FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa,

g) testováni protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 0,1 nM FVIIa v testu), jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + • · • · • · · ♦

5	nm,	s výhodou	hodnota nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa +
1	nm,	výhodněj i	hodnota nižší	než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa +
o,	1 nm	a ještě	výhodněji hodnota	nižší	než	hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa,

Je třeba chápat, že konkrétní hodnoty IC₅₀ vztahující se k testu srážení vyvolaného TF platí v případě použiti normální lidské plasmy.

V jednom provedení předkládaného vynálezu nesmrtelná buňka je hybridomová buňka.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká buňky produkující lidské protilátky, které imunoreaguji s epitopem přítomným na lidském TF a inhibují vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF.

V jednom provedení buňka je izolovaná lymfoidní buňka.

V dalším provedení buňka je izolovaná z myši.

V dalším provedení buňka je hybridomová buňka. V jednom provedení se hybridomová buňka získává fúzí protilátku • · · • · produkující lymfoidní buňky s nesmrtelnou buňkou, čímž se získá protilátku produkující hybridomová buňka.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka je monoklonální protilátka.

Pojem „monoklonální protilátka, tak jak se používá v předkládaném vynálezu, označuje homogenní populaci imunoglobulinů, tj. jednotlivé molekuly populace protilátek jsou stejné s výjimkou přirozeně se vyskytujících mutací. Protilátky jsou normálně připravovány lymfoidními buňkami odvozenými z B lymfocytů z kostní dřeně. Lymfocyty odvozené ze stejného klonu produkují imunoglobulin s jedinou aminokyselinovou sekvencí. Lymfocyty nelze přímo kultivovat po delší dobu, aby vyprodukovaly podstatné množství své specifické protilátky. Nicméně Kohler a kol., 1975, Nátuře, 256: 495, prokázal, že postup fúze somatické buňky, zejména mezi lymfocytovou a k hybridomovým buňkám, specifickou protilátku může vést a produkují protilátka.

myelomovou buňkou, které rostou v kultuře zvanou „monoklonální

Myelomové buňky jsou lymfocytové tumorové buňky, které, v závislosti na kmenu buněk, často samy o sobě produkují protilátku, ačkoliv jsou známé i „neprodukující kmeny.

V dalším provedení vynálezu izolovaná lidská protilátka je rekombinantní protilátka.

Pojem „rekombinantní protilátka, tak jak se používá v předkládaném vynálezu, zahrnuje všechny lidské protilátky, které jsou připravovány, exprimovány, tvořeny nebo izolovány rekombinantními prostředky, jako jsou protilátky exprimované za použití rekombinantního expresního vektoru transfekovaného do hostitelské buňky (podrobněji popsáno dále v části II), protilátky izolované z rekombinantní, kombinatoriální lidské protilátkové knihovny (podrobněji popsáno dále v části II),

protilátky izolované ze zvířete (např. myši), které je transgenní pro lidské imunoglobulinové geny (viz např. L.D. Taylor a kol. (1992), Nucl. Acids Res., 20: 6287 až 6295) nebo protilátky připravené, exprimované, vytvořené nebo izolované jakýmikoliv dalšími prostředky, které zahrnují připojování sekvencí lidského imunoglobulinového genu k jiným DNA sekvencím. Takové rekombinantní lidské protilátky mají proměnné a konstantní oblasti odvozené z lidských zárodečných imunoglobulinových sekvencí. V některých provedeních jsou nicméně takové rekombinantní lidské protilátky podrobeny in vitro mutagenezi (nebo v případě, že je použito zvíře transgenní pro lidské Ig sekvence, in vivo somatické mutagenezi), a tak aminokyselinové sekvence VH a VL oblastí rekombinantních protilátek jsou sekvence, které, i když jsou odvozeny z a jsou příbuzné s lidskými zárodečnými VH a VL sekvencemi, nemusí přirozeně existovat v lidském protilátkovém zárodečném repertoáru in vivo.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka je Fab fragment.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka je F(ab)₂ fragment.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka je F(ab')₂ fragment.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka je Fv fragment s jediným řetězcem.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF v rozsahu 10’¹⁵ až 10~⁸ M. Je třeba chápat, že K_d pro vazbu lidské protilátky k lidskému TF, na kterou se odkazujeme, se stanovuje v testu, ve kterém je lidská protilátka imobilizovaná (viz test 6) .

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF v rozsahu 10¹⁵ až 1_O-¹⁰

M.

• · • · · · • ·

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má K_d pro vazbu k lidskému TF nižší než 10’⁸.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než ICk⁹.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než lCt¹⁰.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10'¹¹.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10¹².

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10’¹³.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10“¹⁴.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10’¹⁵.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než 1 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 500 pM.

V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 200 pM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 100 pM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 50 pM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 10 pM. V dalším provedení je hodnota IC_S0 nižší než 5 pM.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší

než	je hodnota	IC₅₀ FFR-rFVIIa + 1 nM,		j ako j e	hodnota	nižší
než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa	+	500 pm,	s	výhodou	hodnota	nižší
než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa	+	200 pm,	s	výhodou	hodnota	nižší
než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa	+	100 pm,	s	výhodou	hodnota	• V v nizsi

·* ·»· » * · · · ·

než	hodnota	IC50	FFR-rFVIIa	+	50 pm,	s výhodou	hodnota	nižší
než	hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa	+	10 pm,	výhodněj i	hodnota	nižší
než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+	5 pm a	ještě výhodněji hodnota

nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 0,1 nM). V dalším provedení je hodnota IC₅₀nižší než 10 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 5 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 1 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 0,1 nM.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 0,1 nM FVIIa v testu), jako je

hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+	10	nm,	s výhodou
hodnota	nižší	než	hodnota	IC_SO	FFR-rFVIIa	+	5	nm,	s výhodou
hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+	1	nm,	výhodněj i
hodnota	nižší	než	hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa	+	0	, 1 nm	a ještě

výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než 100 nM (v testu s koncentrací FVIIa 10 nM) . V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 4 0 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 10 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅o nižší než 5 nM.

« V ··· · ► * · » · » » * · 9

I · · · • · ·· ·

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM (s použitím 10 nM FVIIa v testu), jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která váže lidský TF.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v přímém testu TF ELISA zahrnujícím imobilizovaný TF a výběr lidské protilátky, která váže imobilizovaný lidský TF.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v nepřímém testu TF ELISA zahrnujícím TF v roztoku a výběr lidské protilátky, která váže lidský TF v roztoku.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu tvorby FXa na TF exprimující buňce výběr lidských protilátek, které inhibuji tvorbu FXa na TF exprimující buňce s hodnotou IC₅o nižší než 500 nM (v testu s koncentrací FVIIa 1 nM) . V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 100 nM.

V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 50 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 10 nM. V dalším provedení je hodnota IC₅₀ nižší než 5 nM.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu tvorby FXa na TF exprimující buňce a výběr lidských protilátek, které inhibují tvorbu FXa na TF exprimující buňce s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 500 nM (s

použitím	1	nM FVIIa v testu),	j ako j e	hodnota	nižší	než
hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa + 50 nm,	s výhodou	hodnota	nižší	než
hodnota	ic₅₀	FFR-rFVIIa + 10 nm,	s výhodou	hodnota	nižší	než
hodnota	IC₅₀	FFR-rFVIIa + 5 nm,	výhodněj i	hodnota	nižší	než

hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

Pojem „TF exprimující buňka zahrnuje jakoukoliv savčí buňku, která exprimuje lidský TF. V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu vazby TF na celé buňce a výběr lidských protilátek, které soutěží s FVIIa vazbou k lidskému TF exprimovanému na buněčném povrchu celých buněk.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v biosenzorovém testu a výběr lidských protilátek s hodnotou Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 100 nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10 nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 5 nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 1 nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 0,5 nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10^_1° nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10'¹¹ nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než ΙΟ'¹² nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10~¹³ nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než ΙΟ¹⁴ nM. V dalším provedení je hodnota Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 10'¹⁵ nM.

způsob pro protilátek vynálezu testování

V dalším provedení předkládaného přípravu lidské protilátky zahrnuje v MAPK signálním testu a výběr lidských protilátek, které inhibují aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa. V jednom provedení lidská protilátka inhibuje aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa na 98 %. V jednom provedení lidská protilátka inhibuje aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa na 90 %. V jednom provedení lidská protilátka inhibuje aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa na 70 %. V jednom provedení lidská protilátka inhibuje aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa na 50 %. V jednom provedení lidská protilátka inhibuje aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa na 30 %.

Pojem „MAPK signalizace znamená kaskádu intracelulárních pochodů, které zprostředkovávají aktivaci mitogenem aktivované protein kinasy (MAPK) nebo jejích homologů v reakci na různé extracelulární podněty. V savčích buňkách byly identifikovány tři odlišné skupiny MAP kinas: 1) extracelulárně regulovaná kinasa (Erkl/2 nebo p44/42), 2) c-Jun N-koncová kinasa (JNK) a 3) p38 kinasa. Erkl/2 cesta zahrnuje fosforylaci Erk 1 (p 44) a/nebo Erk 2 (p 42). Aktivované MAP kinasy např. p44/42 MAPK se dokáží přemístit do jádra, kde dokáží fosforylovat a aktivovat transkripční faktory včetně (Elk 1) a přenašečů signálu a aktivátorů transkripce (Stát). Erkl/2 také může fosforylovat kinasu p90RSK v cytoplasmě nebo v jádře a p90RSK pak dokáže aktivovat některé transkripční faktory.

Pojem „protein kinasa označuje enzym, který je schopen fosforylovat serin a/nebo threonin a/nebo tyrosin v peptidech a/nebo proteinech.

Pojem „aktivace MAPK signalizace vyvolaná FVIIa znamená, že FVIIa se váže k TF v savčí buňce a tím vyvolává MAPK signalizaci.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu genové expresní analýzy (test 15) a výběr lidských • · • · · · , · · · « • · · · · · · protilátek, které inhibují pomocí FVIIa směrem vzhůru vyvolanou regulaci genů nezávisle vybraných ze seznamu obsahujícího Fra-1, Id2 a Cyr61.

Je třeba chápat, že protilátky proti TF, které inhibují aktivitu TF, případně váží různé epitopy přítomné na TF a případně inhibují jak vazbu FVIIa nebo vazbu FX nebo FXa k lidskému TF. Předmětem předkládaného vynálezu je výběr protilátek, které inhibují vazbu FVIIa k lidskému TF a tím intracelulární signalizaci vyvolanou FVIIa.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu lidské rakoviny (test 13) a výběr lidských protilátek, které inhibují růst nebo metastáze lidské rakoviny.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka inhibuje pomocí FVIIa směrem vzhůru vyvolanou regulaci genů nezávisle vybraných ze seznamu obsahujícího Fra-1, Id2 a Cyr61.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka neinhibuje vazbu FX nebo FXa k lidskému TF.

V dalším provedení předkládaného vynálezu izolovaná lidská protilátka inhibuje intracelulární aktivitu TF.

V dalším provedení předkládaného vynálezu způsob pro přípravu lidské protilátky zahrnuje testování protilátek v testu mapování epitopu a výběr lidských protilátek, které se váží na preferované epitopy na TF. V jednom provedení preferovaný epitop zahrnuje jeden nebo více zbytků Trp45,

Lys4 6	a Tyr94.	. V j ednom	provedení	preferovaný	epitop	zahrnuj e
zbytek	Trp45.	V j ednom	provedení	preferovaný	epitop	zahrnuj e
zbytek	Lys46.	V j ednom	provedení	preferovaný	epitop	zahrnuj e
zbytek	Tyr94.
V	dalším	provedení	předkládaného vynálezu se	izolovaná
lidská	protilátka váže k	epitopu na rozhraní mezi TF a	FVIIa.

Zbytky v TF, které jsou odpovědné za interakci mezi proteasovou doménou FVIIa a TF stanovenou z rentgenografické • ♦ • · · strukturní analýzy (Banner a kol., 1996 Nátuře, 380: 41 až

46), jsou Ser39, Gly43, Trp45, Ser47, Phe50, Arg74, Phe76, Tyr94, Pro92. Toto rozhraní mezi proteasovou doménou FVIIa a TF je charakterizováno jako komplexní rozhraní obsahující mnoho mezimolekulových vodíkových vazeb umožňujících mnoho jemných kontaktů mezi TF a FVIIa, čímž se dosáhne vysoké specifity v procesu vazby FVIIa.

Předkládaný vynález se také týká lidských monoklonálních protilátek s vysokou afinitou k TF. Povrch TF obsahující kontaktní rozhraní pro proteasovou doménu FVIIa si udržuje specifickou topologii, která je náchylná k reakci tak, že vytvoří interakce proteinu s proteinem, ve kterých tvorba komplexu mezi protilátkou a proteinovým ligandem je dalším typem interakce proteinu s proteinem. Proto monoklonální protilátky směrované proti tomuto epitopu na lidském TF poskytují Mabs s vysokou afinitou.

Jedním aspektem předkládaného vynálezu monoklonální protilátky s vysokou afinitou, imunoreaktivní s kontaktním rozhraním pro proteasovou doménu FVIIa.

jsou lidské které jsou

Lidské TF protilátky podle předkládaného vynálezu působí jako antagonisté pro vyvolání koagulace zprostředkované pomocí TF, čímž inhibují vazbu koagulujícího FVIIa k TF a tím blokují produkci thrombinu a následné ukládání fibrinu. Lidské TF protilátky jsou zejména použitelné pro podávání lidem při léčení různých stavů zahrnujících vnitrocévní koagulaci. Jako takové jsou lidské TF protilátky případně použitelné pro inhibici aktivity TF, která vede například k inhibici srážení krve, trombózy nebo ukládání destiček. Dále jsou lidské TF protilátky podle předkládaného vynálezu, které působí tak, že inhibují buněčné funkce TF, signalizační funkce TF, případně použitelné při stavech jako je sepse, zánět, ateroskleróza, restenóza nebo rakovina.

• · • · · ·

Lidské protilátky jsou případně použitelné při různých nemocech. Spadají sem thrombotické nebo koagulopathické nemoci nebo poruchy včetně zánětlivé reakce a chronických thromboembolických onemocnění nebo poruch souvisejících s tvorbou fibrinu včetně vaskulárních poruch, jako je hluboká žilní trombóza, arteriální trombóza, trombóza po chirurgickém zákroku, štěp pro bypass koronární artérie (CABG), koronární angioplastie provedená skrz kůži (PTCA), mrtvice, růst nádoru, nádor ve stádiu metastázi, angiogeneze, trombolýza, arterioskleróza a restenóza po angioplastii, akutní a chronické příznaky jako je zánět, septický šok, septikémie, nízký tlak, syndrom obtížného dýchání u dospělých (ARDS), syndrom systemické zánětlivé reakce (SIRS) , roztroušená nitrocévni koagulopatie (DIC), plicní embólie, patologické usazování destiček, infarkt myokardu nebo profylaktické léčení savců s aterosklerotickými cévami s rizikem trombózy, venookluzní onemocnění po transplantaci původních buněk periferní krve (PBPC), hemolytický uremický syndrom (HUS), trombotická trombocytopenická purpura (TTP) a další onemocnění nebo poruchy. Lidské TF protilátky lze použít pro prevenci výskytu tromboembolických komplikací u pacientů s vysokým rizikem, jako jsou ti, kteří absolvují chirurgický zákrok nebo srdečním selháním. Lidské TF zejména použitelné pro léčení intimální hyperplasie nebo restenosy způsobené akutním cévním poraněním. Akutní cévní poranění jsou taková, ke kterým dochází náhle (tj. během hodin až měsíců v porovnání s chronickými cévními poraněními (např. ateroskleróza), která se rozvíjejí během celého života. Akutní cévní poranění jsou často důsledkem chirurgických postupů, jako je rekonstrukce cév, při kterých se používají techniky angioplastie, endarterektomie, aterektomie, náhrady cévního štěpu a podobně. Jako opožděný následek v reakci na například náhradu štěpu nebo transplantaci orgánu se případně může objevit ti, kteří trpí městnavým protilátky jsou případně • · hyperplasie. Protože lidské TF protilátky jsou selektivnější než heparin, váži pouze TF, který je v místě poranění, a protože lidské TF protilátky nenarušují ani neinhibují ostatní koagulační proteiny, budou účinnější a mnohem méně budou způsobovat poruchy krvácení než v případě heparinu, který se používá profylakticky pro prevenci hluboké žilní trombózy.

Jak je uvedeno dále v příkladech provedení vynálezu, lidské TF protilátky podle předkládaného vynálezu jsou schopné se vázat selektivně k TF na povrchu buňky a inhibovat jeho funkční aktivitu tím, že inhibuji vazbu koagulace FVIIa k TF. Lidské TF protilátky, které udržují vazbu k TF, inhibují akumulaci destiček v místě cévního poranění tím, že blokují produkci trombinu a následné ukládání fibrinu.

Díky schopnosti lidských TF protilátek blokovat tvorbu trombinu a omezovat ukládání destiček v místech akutního cévního poranění, lidské TF protilátky, které udržují vazbu k TF, a tak inhibují vazbu FVIIa, lze použít pro inhibici cévní restenosy.

Prostředky obsahující lidské TF protilátky jsou zejména použitelné ve způsobech léčení pacientů pokud jsou upraveny do formy farmaceutických prostředků, které lze podávat jednotlivcům trpícím různými nemocemi, aby se léčily stavy související se srážením krve. Takové lidské TF protilátky schopné vázat TF a inhibovat vazbu FVIIa k TF případně mají delší poločas života v plasmě a tím i odpovídající delší dobu antikoagulační aktivity v porovnání s jinými antikoagulanty. Mezi lékařské příznaky, na které se používají tyto prostředky patří ty, které se obecně léčí antikoagulanty, jako je například hluboká žilní trombóza, plicní embólie, mrtvice, roztroušená nitrocévní koagulace (DIC), usazování fibrinu v plicích a ledvinách související se sepsí, antifosfolipidový syndrom (APS), ateroskleróza a infarkt myokardu. Prostředky lze použít pro inhibici cévní restenosy, ke které dochází po mechanickém poranění cévy, jako je poranění způsobené • · chirurgickým zákrokem, mikrochirurgií, balónkovou angioplastií, endarterektomií, reduktivní aterektomií, umístěním stentu, laserovou terapií nebo rotablací nebo se objevuje sekundárně při štěpech cév, stentech, štěpech pro bypass nebo transplantacích orgánů. Prostředky tak lze použít pro inhibici ukládání destiček a souvisejících onemocnění. Tak způsob inhibice srážení, cévní restenosy nebo ukládání destiček například zahrnuje podávání prostředku obsahujícího lidské TF protilátky pacientovi v množství postačujícím pro účinnou inhibici srážení, cévní restenosy nebo ukládání destiček. Způsoby také nalézají použití při léčení akutního uzavření koronární artérie u jedince (např. akutní infarkt myokardu), což zahrnuje podávání lidských TF protilátek v kombinaci s tkáňovým plasminogenovým aktivátorem nebo streptokinasou a případně urychlují trombolýzu vyvolanou tPA. Lidské TF protilátky jsou podávány před, zároveň s nebo těsně po podání trombolytického činidla, jako je tkáňový plasminogenový aktivátor.

Lidské monoklonální protilátky proti lidskému TF podle předkládaného vynálezu lze případně produkovat imunizací transgenních myší (získaných od firmy Medarex) nesoucích část lidského imunitního systému namísto myšího systému s lidským TF. Splenocyty z těchto transgenních myší se používají pro produkci hybridomů, které vylučují lidské monoklonální protilátky způsobem, který již byl popsán (viz např. Wood a kol., Mezinárodní přihláška WO 91/00 906; Kuchrlapati a kol., PCT publikace WO 91/10 741; Lonberg a kol., Mezinárodní přihláška WO 92/03 918; Kay a kol. Mezinárodní přihláška 92/03 917; N. Lonberg a kol., 1994, Nátuře 368: 856 až 859; L.L. Green a kol., 1994, Nátuře Genet. 7: 13 až 21; S.L. Morrison a kol., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851 až 6855; Bruggeman a kol., 1993, Year Immunol., 7: 33 až 40; Tuaillon a kol., 1993, PNAS 90: 3720 až 3724; Bruggeman a kol., 1991, Eur. J. Immunol., 21: 1323 až 1326).

• · · · • · • · · ·

Lidské monoklonální protilátky směrované proti lidskému TF jsou také případně produkovány fágovou expozicí. Knihovny lidských protilátek lze zkonstruovat z imunizovaných osob a umístit je na povrchu filamentózniho fágu. Fragmenty lidských protilátek s vysokou afinitou s jediným řetězcem Fv (ScFv) a Fab byly v mnohých případech izolovány z takových knihoven za použití vyhledávacích technik, při kterých antigen, který nás zajímá, je imobilizován na pevném povrchu, tj. destičkách nebo kuličkách (C.F. Barbas, III mikrotitračních a D.R. Burton,

Trends. Biotechnol. , 1996, 14: 230 až 234; L. Aujame a kol., Hum. Antibodies, 1997, 8: 155 až 168). Fágová expozice s velkými přirozenými knihovnami také umožnila izolovat lidské protilátky přímo bez imunizace (H.J. DeHaard a kol., Biol. Chem., 1999, 18218 až 18230).

Stručný popis obrázků

Předkládaný vynález je podrobněji popsán v příkladech provedení vynálezu s odkazem na přiložené obrázky, na kterých je

Obrázek 1

Schématická prezentace třídicího testu pro výběr lidských monoklonálních protilátek proti TF s vysokou afinitou uvedeného v příkladu.

Obrázek 2

Podrobná schématická reprezentace třídicích testů 1 až 3, které jsou popsány v příkladu 1.

Obrázek 3

Podrobná schématická reprezentace třídicích testů 4 až 7, které jsou popsány v příkladu 1.

• · • · • · · ·

Obrázek 4

Podrobná schématická reprezentace třídicích testů 8 až 10, které jsou popsány v příkladu 1.

Obrázek 5

Příklad třídění protilátek testem číslo 4. Inhibice sTF/FVIIa amidolytické aktivity pomocí FFR-rFVIIa (plná kolečka) a lidské anti TF monoklonální protilátky HuTF-31F2 (prázdná kolečka).

Obrázek 6

Příklad třídění protilátek testem číslo 5. Inhibice tvorby faktoru Xa pomocí FFR-rFVIIa (plná kolečka) a lidské anti TF monoklonální protilátky HuTF-31F2 (prázdná kolečka).

Obrázek 7

Příklad třídění protilátek testem číslo 7. Inhibice srážení vyvolaného lidským TF pomocí FFR-rFVIIa (plná kolečka) a lidské anti TF monoklonální protilátky HuTF-31F2 (prázdná kolečka).

Obrázek 8

Příklad třídění protilátek testem číslo 10. Pouze anti-TF monoklonální protilátky brání vazbě FVIIa inhibující signalizaci zprostředkovanou pomocí TF/FVIIa.

Obrázek 9

Lidská anti TF Mab inhibuje fosforylaci p44/42 MAPK vyvolanou FVIIa (test číslo 10). BHK buňky transfekované TF byla ponechána po dobu 2 hodin bez séra, čímž byly buňky uvedeny do klidu. Protilátky HuMab 30F5 (500 nM) a HuMab 31F2 (500 nM) byly přidány k buňkám 15 minut před přidáním FVIIa (15 nM). Buňky byly lýzovány a proteiny byly odděleny na SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózu elektroblotací. Western

	37	• · · · · · • · · • · · • · · • · · · • · · ·	·· ···· ·· · • * · · · · • ···· · ♦· • · · ··· ·· • · · · · • · · · · · ·
blot analýza byla provedena	za	použití polyklonálních
fosfo-specifických protilátek	na	p42/44 MAPK.	Sekundární
protilátky byly anti-králičí	IgG	konj ugované	ke křenové

peroxidase. Detekce chemiluminiscence byla provedena za použiti chlazené CCD kamery. Pásy na digitalizovaném obrázku byly kvantifikovány a pás získaný s FVIIa byl nastaven jako 100 %. Když byly buňky předem inkubovány s HuMab 30F5 (500 nM) , bylo pozorováno 50% snížení fosforylováného pásu a když byly buňky předem inkubovány s HuMab 31F2 (500 nM) , bylo pozorováno 25% snížení. Závěrem tento experiment ukázal, že lidské protilátky proti TF (30F5 a 31F2) částečně inhibují fosforylaci p44/42 MAPK vyvolanou FVIIa. Podobné výsledky byly získány za použití 50 nM FVIIa.

Obrázek 10

Příklad třídění protilátek testem číslo

16. Obrázek ukazuje inhibici TF vnitrobuněčné aktivity v TF exprimujících buňkách monoklonálními protilátkami proti TF. Anti TF Mab B inhibuje TF vnitrobuněčnou aktivitu, zatímco Anti-TF Mab A nikoliv.

Obrázek 11

Příklad třídění protilátek testem číslo 12. Rychlostní profil tromboelastogramů získaných s 0,5 nM FFR-rFVIIa a lidské anti-TF protilátky HuTF-312.

Předkládaný vynález je dále ilustrován následujícími příklady provedení vynálezu, které nicméně nejsou zamýšleny jako omezení rámce ochrany. Rysy popsané v předcházejícím popisu a v následujících příkladech jsou jak odděleně, tak v jakékoliv jejich kombinaci materiálem pro realizaci vynálezu ve všech jeho formách.

• · • · • · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava lidských Mab imunospecifických na lidský TF

Činidla

Lidský TF lze izolovat z lidského mozku jak je popsáno v L.V.M. Rao, Thrombosis Research, 51: 373 až 384, 1988.

Lipidovaný rekombinantní lidský TF (Dade Innovin, Baxter) lze také použít jako lidské thromboplastinové činidlo. Krysí, králičí, kočkodanový a prasečí thromboplastin byly připraveny z mozkové tkáně. Dva objemy 0,9% NaCl o teplotě 45 °C byly přidány k mozkové tkáni a tkáň byla homogenizována ručním skleněným homogenizátorem. Po 30 minutách inkubace při teplotě 45 °C s příležitostným protřepáním byly vzorky odstředěny 20 minut při 2000 x g. Usazenina byla odstraněna a tekutina nad usazeninou byla rozdělena a skladována při teplotě -80 °C až do použití.

Relipidovaný TF lze získat rekonstitucí rekombinantního lidského TF plné délky (America Diagnostica č. 4500) do fosfolipidových vesikulů (PC/PS 75/25).

Biotinylovaný lidský TF se vyrábí následujícím způsobem: Biotin-NHS (N-sukcinimido biotin, Sigma H-1759) byl rozpuštěn v DMF (dimethylformamid) na koncentraci 1,7 mg/ml, pak bylo přidáno 1 mg/ml lidského TF v 0,1 M NaHCO₃ pufru k 60 pl roztoku biotin-NHS a vše bylo ponecháno reagovat po dobu 4 hodin za laboratorní teplotu. Reakční roztok obsahující biotinylovaný TF byl dialyzován proti PBS-pufru přes noc.

Použitý FVIIa je rekombinantní lidský FVIIa připravený postupem popsaným v práci L. Thim a kol., Biochem. 27: 7785 až 7793, 1988.

sTF: Rekombinantní lidský rozpustný TFx-209 exprimovaný v E. coli a čištěný přesně stejným postupem, který byl popsán v práci P.-O. Freskgárd a kol., Protein Sci., 5, 1531 až 1540 (1996).

S2288: Rekonstituovaný v H₂O na koncentraci 17,24 mg/ml (Chromogenix).

FX: Čištěný lidský plasmový FX (HFX, Enzyme Research

Laboratories Ltd.)

FXa: Čištěný lidský plasmový FX aktivovaný jedem zmije řetízkové (HFXa, Enzyme Research Laboratories Ltd.).

Chromozom X: Rozpuštěný v H₂O na koncentraci 1,2 5 mg/ml (Boehringer Mannheim).

¹²⁵I-FVIIa byl získán standardními postupy radioaktivního značení.

FFR-rFVIIa: FVIIa blokovaný v aktivním centru

D-Phe-L-Phe-L-Arg-chlormethylketonem. Připravený postupem popsaným v práci B.B. Sorensen a kol., J. Biol. Chem., 272:

11863 až 11868, 1997.

Imunizace

Lidský TF je emulgovatelný ve Frenudově kompletním adjuvans. HuMab myším nebo jejich hybridům (Medarex) byla podána 40 pg subkutánní injekce. Po 14 a 28 dnech a případně vícekrát v intervalech 14 dnů byla myším podána podobná injekce 20 pg TF v nekompletním Freundově adjuvans. Deset dnů po poslední injekci byl odebrán vzorek krve a sérum bylo testováno na lidské TF specifické protilátky pomocí TF ELISA (Test 1 a 2) .

Fúze

Myším s pozitivním testem séra z testů 1 až 3 bylo podáno 20 pg lidského TF intravenózní injekcí a po třech dnech byly usmrceny. Asepticky byly vyjmuta slezina a dispergována na suspenzi jednotlivých buněk.

Buňky Foxova myelomu byly pěstovány v CD hybridomovém médiu (Gibco 11279-023) .

• ·

Fúze buněk sleziny a buněk myelomu (P3x63 Ag8.653, ATCC CRL-1580) a myelomových buněčných linií Sp2/0 (ATCC CRL-1581) pro naše fúze byly provedeny PEG postupy (G. Kóhler a C. Milstein (1976), European J. Immunology, 6: 511 až 519) .

Buňky byly nasazeny na mikrotitrační destičky a inkubovány při 37 °C. Médium bylo vyměněno třikrát během příštích dvou týdnů. Z každé jamky bylo odebráno 100 μΐ tekutiny nad hybridomovými buňkami a testováno na TF specifické protilátky v TF ELISA (Test 1 a 2) .

Příklad 2

Třídění

Různé testy použité pro třídění tekutin ze séra a kultur na jejich specifitu k vybraným protilátkám jsou následující:

Přímý TF ELISA test (Test 1):

Nunc imunodesky byly pokryty přes noc při 4 °C 1 pg/ml lidského sTF v PBS. Desky byly blokovány blokovacím pufrem (TBS s 5 mM CaCl₂ a 2% BSA) a promyty TBS + 0,05 % Tween 20 a pak byla přidána tekutina z hybridomových buněk. Po inkubaci po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty byly desky promyty a byl přidán anti-lidský IgG značený křenovou peroxidasou (HRPO). Po další hodině inkubace byly desky promyty a vyvinuty TMB-substrátem (Kem-EN-Tec) postupem popsaným od výrobce. Absorbance při 450 nm byla měřena ELISA-snímačem.

Nepřímý TF ELISA test (Test 2) :

Nunc imunodesky byly pokryty 0,5 pg/ml kozího anti-lidského IgG (Southern Biotechnology Associates, katalogové číslo 2040-1) v PBS a inkubovány přes noc při 4 °C. Desky byly blokovány blokovacím pufrem (TBS s 5 nM CaCl₂ a 2% BSA) a promyty TBS + 5 mM CaCl₂ + 0,05 % Tween 20. Pak byla přidána tekutina nad kulturou z hybridomových buněk a desky byly inkubovány po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty. Po • · · · »· · • · · · • · · · · · dalším promytí byl přidán biotinylovaný lidský sTF v koncentraci 1 pg/ml a inkubován po dobu 1 hodiny. Po promytí bylo přidáno 100 μΐ roztoku Streptavidin-HRPO a vše bylo inkubováno po dobu 1 hodiny. Desky byly vyvinuty s TMB-substrátem stejným postupem, který byl popsán v testu 1.

Test soutěžení s FVIIa (Test 3):

Nunc imunodesky byly inkubovány s lidským sTF (koncentrace 5 pg/ml v PBS) přes noc při 4 °C. Desky byly promyty a blokovány po dobu 2 hodin. Pak byly přidány anti-lidské TF Mab a desky byly inkubovány po dobu 2 hodin. Před přidáním biotinylovaného lidského FVIIa (1 pg/ml v TBS pufru s 5 mM CaCl₂ a 2 % BSA) byly desky promyty a pak byly inkubovány po dobu 1 hodiny. Před přidáním HRPO značeného Streptavidinu byly desky promyty a pak byly inkubovány po dobu 45 minut. Desky byly opět promyty před vyvinutím s TMB substrátem (Kem-EN-Tec) postupem popsaným od výrobce.

zvyšuj ících koncentrace

Inhibice amidolytické aktivity FVIIa/TF (Test 4):

Inhibice FVIIA-TF katalyzované amidolytické aktivity anti-lidskými TF Mab byla testována za použití rozpustného lidského TF (10 nM) , rekombinantního lidského FVIIa (10 nM) a se koncentrací Mab (0,0122 až 50 nM) . Různé anti-lidských TF Mab nebo FFR-rFVIIa jsou předinkubovány s 10 nM sTF a 10 nM FVIIa v BSA pufru (50 mM HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ a 1 mg/ml BSA) po dobu 60 minut za laboratorní teploty před přidáním substrátu S2288 (1,2 mM, Chromogenix). Rozvoj bazvy byl měřen nepřetržitě po dobu 30 minut při 405 nm. Amidolytická aktivita je perzentována jako mOD za minutu. Hodnoty IC₅₀ pro inhibici FVIIa/TF amidolytické aktivity pomocí Mab byly vypočteny. Hodnota IC₅₀ pro FFR-rFVIIa v tomto testu je 7 +/- 3 nM.

Inhibice tvorby FXa (Test 5):

Lipidovaný TF (10 pM) , FVIIa (100 pM) a anti-TF Mab nebo FFR-rFVIIa (0 až 50 nM) v BSA pufru (viz test 4) byly inkubovány po dobu 60 minut za laboratorní teploty před přidáním FX (50 nM) . Reakce byla zastavena po dalších 10 minutách přidáním polovičního objemu zastavovacího pufru (50 mM HEPES, pH 7,4, vytvořeného FXa bylo (0,6 mM, Chromogenix)

100 mM NaCl, 20 mM EDTA). Množství stanoveno přidáním substrátu S2765 a měřením absorbance při 405 nM nepřetržitě po dobu 10 minut. Lze vypočítat hodnoty IC₅₀ pro Mab inhibici FVIIa/lipidovaným TF zprostředkované aktivace FX. Hodnota IC₅₀ pro FFR-rFVIIa v tomto testu je 51 +/- 26 nM.

Biosenzorový test (Test 6):

Protilátky byly testovány na zařízení Biacore průchodem standardního roztoku anti-lidského TF Mab přes destičku s imobilizovanou protilátkou na lidský IgG. Pak následovaly různé koncentrace sTF v 10 mM HEPES, pH 7,4 obsahujícím 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂ a 0,0003 % polysorbátu 20. Hodnoty K_D byly vypočteny ze sensorgramů za použití integrovaného vyhodnocovacího programu Biacore.

Test srážení závislého na TF (Test 7):

Test se provádí na zařízení pro srážení ACL300 Research (ILS Laboratories). Roztoky anti-1idských TF Mab v 50 mM imidazolu, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA byly smíchány s 25 mM CaCl₂ v poměrech 2 až 5 a přidány do vzorkových nádob ve srážecím zařízení. Thromboplastin z člověka, krysy, králíka, paviána nebo prasete zředěný imidazolovým pufrem tak, že poskytuje dobu srážení 30 sekund ve vzorcích bez protilátky byl umístěn do reakčního zásobníku 2, a plasma z člověka, krysy, králíka, paviána nebo prasete do reakčního zásobníku 3. Během analýzy bylo 70 μΐ směsi protilátky a CaCl₂ přeneseno do 25 μΐ thromboplastinového činidla a předinkubováno po dobu ·· 9999

900 sekund před přidáním 60 μΐ plasmy a měřením doby srážení. Maximální doba srážení je 400 sekund. Ředění thromboplastinu bylo použito jako standardní křivka pro převedení srážecích časů na aktivitu TF relativně ke kontrole bez anti-TF Mab nebo přidaného FFR-FVIIa. Hodnota IC₅₀ pro FFR-rFVIIa v tomto testu je 4,4 +/- 0,4 pM.

Inhibice FVIIa/TF na buněčném povrchu katalyzované aktivace FX pomocí Mab (Test 8):

Monovrstvy buněk exprimujících lidský TF, např. lidské plicní fibroblasty WI-38 (ATTC číslo CCL-75), buněčná linie J82 lidského karcinomu močového měchýře (ATTC číslo HTB-1), buněčná linie CCD 1102KerTr lidského keratinocytu (ATCC číslo CRL-2310), buněčná linie U87 lidského glioblastomu nebo buněčná linie MDA-MB231 lidské rakoviny prsu, byly použity jako zdroj TF v FVIIa/TF katalyzované aktivaci FX. Splývající buněčné monovrstvy ve 24-, 48- nebo 96- jamkových destičkách byly promyty jednou pufrem A (10 mM HEPES, pH 7,45, 150 mM

NaCI, 4 mM KC1 a 11 mM glukosa) a jednou pufrem B (pufr A doplněný 1 mg/ml BSA a 5 mM Ca²⁺) . FVIIa (1 nM) , FX (135 nM a různé koncentrace Mab (nebo FFR-rFVIIa) v pufru B byly současně přidány k buňkám. Alternativně byly buňky předinkubovány po dobu 15 minut s anti-TF Mab nebo FR-rFVIIa ještě před přidáním rFVIIa a FX. Tvorba FXa je umožněna po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Z každé jamky byly odebrány 50 μΐ podíly a bylo přidáno 50 μΐ zastavovacího pufru (pufr A doplněný 10 mM EDTA a 1 mg/ml BSA) . Množství vytvořeného FXa bylo stanoveno přenesením 50 μΐ výše popsané směsi do jamky mikrotitrační destičky a přidáním 25 μΐ Chromozymu X (konečná koncentrace 0,6 mM) do jamek. Absorbance při 405 nm byla měřena nepřetržitě a výchozí rychlosti vzniku zabarvení byly převedeny na koncentrace FXa za použití FXa standardní křivky. Hodnota IC_5Q pro FFR-rFVIIa v tomto testu je 1,5 nM.

·« ····

Inhibice ¹²⁵I-FVIIa vazby k TF na buněčném povrchu pomocí Mab (Test 9) :

Vazebné studie byly provedeny za použití buněk exprimujících lidský TF, např. lidské plicní fibroblasty WI-38 (ATTC číslo CCL-75), buněčná linie J82 lidského karcinomu močového měchýře (ATTC číslo HTB-1), buněčná linie CCD 1102KerTr lidského keratinocytu (ATCC číslo CRL-2310), buněčná linie U87 lidského glioblastomu nebo buněčná linie MDA-MB231 lidské rakoviny prsu. Splývající buněčné monovrstvy ve 24jamkových kultivačních destičkách byly promyty jednou pufrem A (viz test 8) a jednou pufrem B (viz test 8) . Monovrstvy byly předinkubovány po dobu 2 minut se 100 μΐ studeného pufru B. Různé koncentrace Mab (nebo FFR-rFVIIa) a radioaktivně značeného FVIIa (0,5 nM ¹²⁵I-FVIIa) byly současně přidány k buňkám (finální objem 200 μΐ) . Destičky byly inkubovány po dobu 2 hodin při teplotě 4 °C. Na konci inkubace byl nenavázaný materiál odstraněn a buňky byly promyty čtyřikrát ledově chladným pufrem B a lýzovány s 300 ml lýzovacího pufru (200 mM NaOH, 1 % SDS a 10 mM EDTA). Radioaktivita byla měřena gama čítačem (Cobra Packard Instruments) . Vazebná data byla analyzována a křivka byla proložena pomocí GraFit4 (Erithacus Sotware, Ltd., (Velká Británie). Hodnota IC₅₀ pro FFR-rFVIIa v tomto testu je 4 nM.

Inhibice FVIIa/TF vyvolané p44/42 MAPK aktivace pomocí Mab (Test 10) :

Množství fosforylovaného p44/42 MAPK a/nebo Akt a/nebo p90RSK bylo stanoveno kvantitativní detekcí chemiluminiscence (Fujifilm LAS-1000) z Western blot analýzy. Buňky exprimující lidský TF, např. CCD1102KerTr, NHEK P166, buněčná linie U87 lidského glioblastomu nebo buněčná linie MDA-MB231 lidské rakoviny prsu, byly kultivovány v médiu s 0 až 0,1 % FCS po dobu 24 nebo 48 hodin před experimentem, aby se buňky uvedly do stavu klidu. V den experimentu musí být buňky ze 70 až 80 % • · • · · · • · splynuté. Experiment se provádí předinkubací buněk s přebytkem Mab nebo FFR-rFVIIa v médiu bez séra po dobu 30 minut při 37 °C před přidáním 10 až 100 nM FVIIa a inkubací po dobu 10 minut. Jako pozitivní kontrola buněčné signalizace byly buňky upraveny 10 % FCS po dobu 10 minut. Buňky byly promyty dvakrát v ledově chladném PBS před lýzováním buněk v lýzovacím pufru (20 mM Tris, 0,1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, mM fluorid sodný, 10 mM β-glycerofosfát sodný, 5 mM pyrofosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH 7,5 obsahující 0,1 mM 4- (2-aminoethyl)benzensulfonylfluoridu (AEBSF) a benzamidinu. Těsně před použitím orthovanadičnanu sodného, 5 pg/ml aprotininu). Lyzáty byly smíchány s SDS vzorkovacím pufrem a naneseny na SDS-polyakrylamidový gel. Standardní biotinylovaná proteinová značka byla nanesena na každý gel. Proteiny oddělené na SDS polyakrylamidovém gelu byly přeneseny na nitrocelulosu elektroblotováním a kinasy p44/42 MAPK, Akt a p90RSK byly vizualizovány imunoblotováním s fosfospecifickými protilátkami a chemiluminiscence byla kvantitativně vyhodnocena pomocí Fujifilm LAS1000.

mM mM bylo přidáno:

leupeptinu, 10 pg/ml

Test mapování epitopu (Test 11) :

Příprava rozpustných TF (sTF) variantů.

sTF varianty (I22C, W45C, K46C, Y94C, F140C, W158C, K201C) byly zkonstruovány za použití inverzní PCR (QuikChange, Stratagene, La Jolla, CA, USA) za použití plasmidu přirozeného typu (Freskgárd a kol., Protein Sci., 5, 1531 až 1540, 1996) jako templátu. Přirozený typ a varianty byly exprimovány a čištěny v E. coli postupem, který již byl popsán dříve (Freskgárd a kol., Protein Sci., 5, 1531 až 1540, 1996), s určitými úpravami. Buněčná lýze byla provedena technikou X-press (Biox, Švédsko) v 10 mM Tris-HCl pufru, pH 7,5 a následně bylo vše resuspendováno ve stejném pufru s přídavkem 1 mg DNAsy. roztok byl odstřeďován při 11 000 x g po dobu • · · · minut při 4 °C a inkluzní tělíska byla denaturována v 75 ml 6 M GuHCl, 0,5 NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Opětovného složení se dosáhne po jedné hodině inkubace za laboratorní teploty postupným ředěním a denaturováním proteinu do 11 roztoku obsahujícího 50 mM Tris-HCl, 0,25 M NaCl, pH 8,0 za opatrného míchání po dobu 2 hodin. Čištění bylo provedeno za použití Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsal, Švédsko) a FVIIa) afinitní chromatografie způsobem, který popsal Freskgárd a kol. (1996). Homogenita proteinu byl ověřena pomocí SDS-PAGE. Koncentrace byla měřena při A_280nni a stanovena za použití vypočteného extinkčního koeficientu (Gill a von Hippel, 1989) .

MaxiSorp destičky (Nunc-Immuno) byly přirozeného typu a varianty (10 pg/ml v TBS blokovacím pufrem (TBS s 0,1 % Tween 20 a 0,5

440 Μλίνν pokryty sTF a blokovány ; BSA) . Desky byly promyty promývacím pufrem (TBS a 0,1 % Tween 20). Anti-lidské TF Mab byly naneseny v koncentraci 1 ng/ml v blokovacím pufru a inkubovány po dobu 1 hodiny. Desky pak byly promyty (6 x) za použití promývacího pufru. Vazba protilátky pak byla detekována za použití anti-lidského IgG (Helica Biosystems, lne.)

HPR-značeného při zředění : 2000 v blokovacím pufru za použití TMB_pi_us-substrátu (Kem ;od

450-620^

Tech katalogové číslo 4390A). Výsledný ELISA signál byl použit jako měřítko vazby každé protilátky ke všem sTF variantům.

Thromboelastografie (Test 12):

Lidský thromboplastin (např. Innovin, Dade Behring, konečné zředění 50 000 krát) byl smíchán s CaCl₂ (výsledná koncentrace 16,7 mM) a anti-TF Mab a byl inkubován po dobu 15 minut za laboratorní teploty. Citrátem stabilizovaná lidská celková krev (280 μΐ) byla přidána do RoTEG vzorkových nádobek (Pentapharm) a předehřátá na teplotu 37°C na dobu 5 minut před přidáním 40 pg směsi thromboplastin/CaCl₂/anti-TF směsi

Mab.

• ·

• ···· · · · · ··· · · · · ·····

Thromboelastografie byla prováděna po dobu následující hodiny v zařízení Ro-TEG (Pentapharm). Rychlostní profily byly získány z thrombogramů za použití software CoagPro™ (MedScience, Árhus, Dánsko).

Příklad 3

Test lidské rakoviny. Průzkum vlivů léčení lidskými anti-TF Mab na růst a metastázování lidských rakovin na myším modelu (Test 13)

Léčení:

Lidské anti-TF Mab podané injekcí intravenózně v množství 10 mg/kg = 0,1 mg/10 g; objem injekce byl 0,1 ml na 10 g myši jednoho ze tří léčivých roztoků:

A. Kontrola - nosič

B. 1 mg/ml lidského FFR-rFVIIa

C. 1 mg/ml anti-TF Mab

Popis modelů:

I. Primární růst a jaterní metastázy rakoviny tlustého střeva

Byly použity zdravé samice athymických myší (nu/nu) ve věku 7 až 8 týdnů. Aby se zničila zbytková imunorezistence nahých myší k implantaci lidských buněk, myši byly rutinně ozařovány dávkou 5 Gy dva dny před naroubováním lidského nádoru (Vogel a kol., 1997). Myši byly exponovány tumoru naroubováním LS174T buněk karcinomu lidského tlustého střeva (ATCC CCL 188) kultivovaných v RPMI 1640 s 15 % fetálního telecího séra (FCS) způsobem, který již byl popsán dříve (Li a kol., Human Gene Therapy, 10: 3045 až 3053, 1999). Stručně shrnuto byly buňky sklizeny směsí trypsin-EDTA, dvakrát promyty a resuspendovány v RPMI bez séra doplněném roztokem heparinátu sodného (1 U/ml) . U myší pak byl v anestézi • · · · • · • · · · · · · · « · · · • · ··· · · · · ···· proveden malý řez vlevo pod žebry a 3 3 106 LS174T buňky v ml fosfátového pufru ve fyziologickém roztoku (PBS) byly injikovány do sleziny. Po třech až pěti minutách byly slezinové cévy podvázány a slezina byla chirurgicky vyjmuta. Tato procedura vedla ke stabilnímu výskytu jaterních metastáz (více než 95 %) . Léčení pomocí anti-TF Mab začalo ihned po implantaci a trvalo po zbytek celé studie. Ve dnech 15 a 30 po inokulaci tumorových buněk byly myši utraceny, játra byla vyjmuta a zvážena a počet viditelných tumorových uzlíků na povrchu jater byly spočítány. Vzorky jater byly fixovány přes noc v AFA (5 % kyseliny octové, 75 % ethanolu, 2 % formalin, 18 % voda), přeneseny do 100% ethanolu a zapuštěny do parafinu a 5 mm části byly připraveny pro histologické vyhodnocení metastatických uzlíků, pro imunohistochemii a vyhodnocení apoptosy.

Studie 1-1:

Cíl: Otestovat vliv anti-TF Mab podaných intravenózní injekcí v množství 10 mg/kg na makroskopický růst a jaterní metastáze LS174T tumorů tlustého střeva u nahých myší.

Myši: 60 homozygotních nu/nu NMRI myších samců stáří týdnů.

Skupiny: Myši byly náhodně umístěny do čtyř skupin po patnácti a léčeny roztoky A, B nebo C.

Ukončení: Při ztrátě hmotnosti více než 20 % nebo jiných objektivních známkách prudké toxicity bylo zvíře utraceno.

Parametry: Velikost tumoru ve dvou kolmých průměrech byla zaznamenávána denně během růstové fáze. Tělesná hmotnost byla zaznamenána na počátku a pak dvakrát až třikrát týdně, úmrtí byla stanovena tvorba metastáz v játrech.

Po • ·

II, Primární růst a plicní metastázy rakoviny prsu

Buňky lidské rakoviny prsu MDA-MB-231 (ATCC HTB26) byly kultivovány v Eaglově médiu upraveném podle Dulbecca (DMEM) doplněném 10% fetálním telecím sérem (FCS). Buňky MDA-MB-213 (3 3 106) byly injikovány podkožně do nahých myší (samice myší stáří sedm až osm týdnů) . Primární růst tumoru a metastázy byly vyhodnoceny způsobem, který již byl popsán dříve (Li a kol., Human Gene Therapy, 12: 515 až 526, 2001).

Studie II-l:

Cíl: Otestovat vliv anti-TF Mab podaných intravenózní injekcí v množství 10 mg/kg na makroskopický růst a plicní metastáze MDA-MB-231 prsních tumorů u nahých myší.

Myši: 60 homozygotních nu/nu NMRI myších samců stáří týdnů.

Parametry: Velikost tumoru ve dvou kolmých průměrech byla zaznamenávána denně během růstové fáze. Tělesná hmotnost byla zaznamenána na počátku a pak dvakrát až třikrát týdně. Po úmrtí byla stanovena tvorba metastáz v plicích.

III. Primární růst xenograftů gliomového tumoru

Tumorová buněčná linie MG U373 je multiformní buněčná linie lidského glioblastomu s vysokou angiogenní aktivitou, vysokou cévní hustotou a rychlým růstem v nahých myších. Tumory byly inokulovány do boků standardními postupy (viz přiložené protokoly pro experimentální plán). Myši byly pozorovány dvakrát denně z hlediska známek toxicity a tumory byly měřeny denně ve dvou kolmých průměrech.

• · · · • · · ·

5Q ·· ·· ·· ··· «

Tumory byly transplantovány do boků nu/nu homozygotních nahých myší s NMRI pozadím. Myši byly samci stáří sedm týdnů získané od M&B (ry, Dánsko). Zvířata byla udržována v gnotobiotickém prostředí a dostávala sterilní krmné granule a pitnou vodu podle libosti.

S modelem gliomového tumoru byly provedeny tři studie:

Studie III-1 :

Cil: Otestovat vliv anti-TF Mab podaných intravenózní injekcí v množství 10 mg/kg na makroskopický růst tumorů U373 u nahých myší.

Myši: 60 homozygotních nu/nu NMRI myších samců stáří týdnů.

Parametry: Velikost tumoru ve dvou kolmých průměrech byla zaznamenávána denně během růstové fáze. Tělesná hmotnost byla zaznamenána na počátku a pak dvakrát až třikrát týdně.

Studie III-2 :

Cíl: Otestovat vliv anti-TF Mab podaných intravenózní injekcí v množství 10 mg/kg na makroskopický růst tumorů U373 u nahých myší, poté co byl ustaven předterapeutický růst tumoru.

Myši: 60 homozygotních nu/nu NMRI myších samců stáří týdnů.

Skupiny: Myši byly náhodně umístěny do čtyř skupin po patnácti a léčeny roztoky A, B nebo C. Léčení začalo když měření během šesti následujících dnů ukázala Gompertzianův růst. To odpovídá 100 až 200 mm³.

• · · · • · · ·

• · • · ···· · · · · ··· · · · · ····

Ukončení: Léčení trvalo dokud tumory nedorostly maximální velikosti přibližně 1,0 cm³, tj . žádný průměr tumoru větší než 15 mm nebo dokud nebyl zjištěn Gompertzianův opětovný růst během šesti po sobě následujících měření. V době ukončení byly tumory z každé skupiny vyříznuty pro histologické a imunochemické vyhodnocení. Při ztrátě hmotnosti více než 20 % nebo jiných objektivních známkách prudké toxicity bylo zvíře utraceno.

Parametry: Velikost tumoru ve dvou kolmých průměrech byla zaznamenávána denně během růstové fáze. Tělesná hmotnost byla zaznamenána na počátku a pak dvakrát týdně.

Studie III-3 :

Cíl: Otestovat vliv anti-TF Mab na růst nitrolebečních tumorů U373 u nahých myší.

Myši: 60 homozygotních nu/nu NMRI myších samců stáří týdnů.

Tumor: U373 implantovaný orthotopicky do pravé hemisféry standardními postupy.

Ukončení: Myši se známkami chronického neurologického poškození byly utraceny.

Parametry: Přežití (tj. doba do neurologického poškození) bylo kvantifikováno statistickým způsobem podle Kaplana a Mayera.

Příklad 4 (Test 14)

U myší, ve kterých byl TF gen odstraněn a lidský gen TF vložen (myši mTF-KO/hTF-KI), byla podkožně na břiše umístěna

0,5 ml matrigelová vložka. V matrigelu byl obsažen b-FGF (5 ng) a o týden později byl vznik nových průchodných cév kvantifikován měřením obsahu hemoglobinu (angiogeneze).

• ·

Inhibiční kapacita (% inhibice anti-Mab byla vyhodnocena po parenterálním podávání proteinů.

obsahu hemoglobinu) lidského jediném nebo po opakovaném

Příklad 5 (Test 15)

Test analýzy exprese genu pro rozlišování protilátek, které brání vazbě FVIIa k TF, a protilátek, které brání vazbě FX k TF.

V cDNA analýzách byla pozorována specifická regulace tří genů v buňkách BHK-TF léčených FVIIa směrem vzhůru. Tyto geny zahrnují: Fra-1, gen kódující antigen 1 příbuzný Fos, Id2, gen kódující člen skupiny proteinů helix-smyčka-helix a Cyr61 kódující extracelulární matricový signalizační protein. Následující test byl navržen pro vytřídění anti-Mab, které brání regulaci Fra-1, Id2 nebo Cyr61 směrem vzhůru vyvolané FVIIa.

Buněčná kultura

Pokud není uvedeno jinak, byla činidla koupena od GIBCO-BRL Life Technologies.

Buňky BHK-TF vytvořené postupem popsaným v práci L.K. Poulsen a kol., J. Biol. Chem., 273, 6228 až 6232, 1998 byly kultivovány v Eaglově médiu upraveném podle Dulbecca obsahujícím 10 % FCS, 100 IU/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu tak, že bylo dosaženo 95% až 100% splývání, pak byly promyty a kultivovány po dobu dalších 16 až 18 hodin v médiu bez obsahu FCS. Buňky byly opět promyty a vystaveny médiu bez obsahu FCS obsahujícím 100 nM FVIIa.

Pro klonování fragmentů pro Norther blot analýzu byly buňky upraveny následujícím způsobem. Buňky BHK-TF byly kultivovány v Eaglově médiu upraveném podle Dulbecca obsahujícím 10 % FCS, 100 IU/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu tak, že bylo dosaženo 95% až 100% splývání, pak byly promyty a kultivovány po dobu dalších 16 až 18 hodin • · · • · · · v médiu bez obsahu FCS. Buňky byly opět promyty a vystaveny médiu bez obsahu FCS obsahujícím 100 nM FVIIa na dobu 1 hodiny. Buňky CRL2091 (ATCC) byly kultivovány v Dulbeccově médiu upraveném podle Iscovy obsahujícím 10 % FBS, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu tak, že bylo dosaženo 95% až 100% splývání. Pak byly buňky ponechány po dobu 16 až 18 hodin bez séra a upraveny médiem bez FBS obsahujícím 100 nM FVIIa po dobu 6 hodin. Myší buňky 3T3-L1 (ATCC) byly kultivovány v Eaglově médiu upraveném podle Dulbecca doplněném 10 % fetálním hovězím sérem, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Buňky byly kultivovány do splynutí a indukovány médiem obsahujícím 1 μΜ dexamethasonu (Sigma), 10 pg/ml lidského inzulínu (Novo Nordisk A/S) a 1 μΜ BRL49653 (Novo Nordisk A/S) po dobu 1 hodiny.

Klonování fragmentů pro Northern blot analýzu

Fra-1 byl klonován reversní transkripční PCR z RNA izolované z buněk 3T3-L1 upravovaných po dobu 1 hodiny dexamethasonem, insulinem a BRL49653 za použití sady Superscript II (Life Technologies) postupem podle návodu výrobce. Id2 a Cyr6 byly klonovány reversní transkripční PCR z RNA izolované z buněk BHK-TF upravovaných po dobu 1 hodiny FVIIa a z buněk CRL2091 upravovaných po dobu 6 hodin FVIIa. Posměrné a protisměrné primery byly:

5'-GCGGCCGCCATGTACCGAGACTACGGGGAACCG-3' a

5'-GCGGCCGCTCACAAAGCCAGGAGTGTAGG-3' pro Fra-1,

5'-CAGCATGAAAGCCTTCAGTC-3' a 5'-CTCTGGTGATGCAGGCTGAC-3' pro Id2, 5'-CGTCACCCTTCTCCACTTGA-3' a 5'-CTTGGTCTTGCTGCATTTCT-3' pro Cyr61. Parametry pro PCR jsou jeden cyklus denaturace při 94 °C po dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 65 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 72 °C po dobu 1,5 minuty, jeden cyklus denaturace při 94 °C po dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 64 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 72 °C po dobu 1,5 minuty, jeden cyklus denaturace při 94 °C po

— . · » » · » — — W » W dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 63 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 72 °C po dobu 1,5 minuty, jeden cyklus denaturace při 94 °C po dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 62 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 72 °C po dobu 1,5 minuty, jeden cyklus denaturace při 94 °C po dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 61 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 72 °C po dobu 1,5 minuty, jeden cyklus denaturace při 94 °C po dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 60 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 72 °C po dobu 1,5 minuty, čtyřicet cyklů denaturace při 94 °C po dobu 10 sekund, teplotní hybridizace při 55 °C po dobu 15 sekund a prodloužení při 7 2 °C po dobu 1,5 minuty. Všechny fragmenty byly klonovány do TOPO 2.1 (Invitrogen) a sekvenovány za použití sekvenátoru Megabase.

Northern blot analýza

Celková RNA byla izolována z buněk BHK-TF inkubovaných s FVIIa, FX, ASIS, 1F44A1 nebo TF8-5G9 za použití TriZol podle instrukci prodejce. 20 pg RNA bylo velikostně rozděleno v denaturačním gelu obsahujícím 1 % agarosy, 20 mM MOPS, 5 mM NaOAc, 6 % formaldehydu a 1 mM EDTA, přeneseno na membránu Hybond N⁺ (Amersham) kapilárním blotováním a imobilizováno UV zesíťováním. cDNA kódující Fra-1, Id2 nebo Cyr61 byla označena pomoci sady Prime It (Stratagene) za použití [a-³²P] ČLATP (Amersham) a hybridizována za použití Express Hyb (Clontech) postupem podle výrobce a výsledky byly vizualizovány autoradiografií.

Příklad 6 (Test 16)

MAPK test přes Elkl traskripční faktor / reportér luciferasy (PathDetect)

Buňky HeLa byly nasazeny na 40% splynutí v nádobě T-80 jeden den před transfekcí. Buňky byly transfekovány 150 ng • · · · • · · · • · pFA-Elkl (Stratagene), 3 pg pFR-Luc (Stratagene, 3 pg lidského TF/pcDNA3 a 3 pg myšího proteasou aktivovaného receptoru 2/pcDNA3,l+ za použití 36 pl FuGene (Roche) postupem popsaným v návodu. Následující den byly buňky uvolněny pomocí Versene™ (Invitrogen) a nasazeny do černých 96 jamkových pozorovacích destiček (Packard) s hustotou buněk 20 000 buněk na jamku. Po opětovném připojení buněk k destičce bylo médium nahrazeno 160 pl Eagiova média upraveného podle Dulbecca bez séra (Invitrogen) v každé jamce a po dobu 16 hodin byla prováděna inkubace.

Buňky byly předinkubovány po dobu 1 hodiny buď s 20 pl média bez séra (kontrola), 20 pl 2,5 pM FFR-rFVIIa (kontrola), 20 pl 2,5 pM anti TF Mab B nebo 20 pl 2,5 pM anti Mab A. Do poloviny jamek bylo přidáno 20 pl 0,5 pM FVIIa a do druhé poloviny bylo přidáno médium. Po následujících čtyřech hodinách inkubace byly buňky podrobeny testu na luciferasový gen. LucLite (Packard) činidlo bylo přidáno k buňkám postupem popsaným výrobcem. Úroveň exprese luciferasy byla odečtena na TopCount Microplate Scintillation (Packard).

Průmyslová využitelnost

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné pro výrobu léčiv.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná lidská protilátka, vyznačuj ící se t í m, že imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském

TF.

2. Izolovaná lidská protilátka podle nároku 1, vyznačující se tím, že inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF.

3. Izolovaná lidská protilátka 1 až 2, vyznačující s monoklonální protilátku.

4. Izolovaná lidská protilátka 1 až 3, vyznačující s rekombinantní protilátku.

5. Izolovaná lidská protilátka 1 až 4, vyznačující s ( Fab fragment.

6. Izolovaná lidská protilátka 1 až 4, vyznačující se F(ab)₂ fragment.

7. Izolovaná lidská protilátka 1 až 4, vyznačující se F(ab')2 fragment.

8. Izolovaná lidská protilátka 1 až 4, vyznačuj ící Fv fragment s jediným řetězcem.

podle kteréhokoliv z nároků e t í m, že se jedná o podle kteréhokoliv z nároků e t í m, že se jedná o podle kteréhokoliv z nároků : t £ m, že protilátka je podle kteréhokoliv z nároků ; t í m, že protilátka je podle kteréhokoliv z nároků : t £ m, že protilátka je podle kteréhokoliv z nároků tím, že protilátka je s e ·· · · · · · · · • · · · ···· · ··· • · ··· · · · · · · · · ’··* **·* *.....*

9. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z nároků až 8, vyznačující se tím, že tato protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF v rozsahu 10'¹⁵ až 10'⁸ M.

10. Izolovaná lidská protilátka podle kteréhokoliv z

nároků 1 až 9, v y z n a č u j i c i s e tím, že tato protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF v rozsahu 10¹⁵ až ΙΟ¹⁰ M. 11. Farmaceutický prostředek, v y z nač u j i c i se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství lidské

protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF.

12. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF, přičemž tato protilátka je protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

13. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF.

14. Prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF, přičemž tato protilátka je protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.

15. Způsob léčení nemoci související s FVIIa/TF u lidí, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství lidské protilátky, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF, člověku.

• · • · • · ·· · · ··· · · ·

16. Způsob léčení nemoci související s FVIIa/TF u lidí, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, člověku.

17. Způsob přípravy lidské protilátky, vyznačující se tím, že zahrnuje

a) přípravu lidských protilátek proti lidskému TF,

b) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 1 nM, jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 500 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 200 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 100 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 50 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 0,1 nM FVIIa;

ako j e hodnota nižší než hodnota IC50 FFR-rFVIIa + 10 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 5 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 1 nm,

výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 0,1 nm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 10 nM FVIIa v testu; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou • * * hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu soutěžení s FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa, nebo testování protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která imunoreaguje s lidským TF.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že lidské protilátky proti lidskému TF jsou produkovány způsobem zahrnujícím

a) imunizaci savce lidským TF

b) izolaci protilátek produkovaných imunizovaným savcem.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že savec je myš.

20,

Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 az

19, vyznačuj íci tím, že zahrnuje testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny v tomto testu

s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC 50 FFR-rFVIIa + 1 nM, jako je hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 500 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 200 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 100 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 50 pm, s výhodou hodnota • SZ ν’ mzsi než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněj i hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 5 pm a

ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že zahrnuje testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 0,1 nM FVIIa; jako je hodnota • · · · • · · · · ' ··· • · · «···· · · · • · · · · · · · · ···

nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 5 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 1 nm, výhodněj i hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 0,1 nm a ještě výhodněji

hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 21, vyznačující se tím, že zahrnuje testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 10 nM FVIIa v testu; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 22, vyznačující se tím, že zahrnuje testování protilátek v testu soutěžení s FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa.

24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 17 až 23, vyznačující se tím, že zahrnuje testování protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která imunoreaguje s lidským TF.

25. Lidská protilátka, vyznačující se tím, že imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF, získatelná způsobem zahrnujícím

a) přípravu lidských protilátek proti lidskému TF,

b) testování protilátek v testu srážení vyvolaného TF a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu sraženiny • A • · A A A » AAA

A A A A AAAA A · · A

A A AAA · AAA A A · · ·

61 AA AA ·· AAA A A v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 1 nM, j ako je hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 500 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 200 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 50 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněji hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo

testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC_5Q nižší než

je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 0,1 nM FVIIa v testu; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ICso FFR-rFVIIa + 5 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 1 nm, výhodněji hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 0,1 nm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀

FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 10 nM FVIIa; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa, nebo testování protilátek v testu soutěžení FVIIa a výběr lidské protilátky, která soutěží s vazbou FVIIa, nebo testování protilátek v testu TF ELISA zahrnujícím TF a výběr lidské protilátky, která imunoreaguje s lidským TF.

26. Způsob přípravy lidské protilátky, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje

a) imunizaci myši lidským TF, • »

99ti « · • · · · • · • · · · ···· · * · · • · ··· · · · · ·····

f) testování protilátek v FVIIa/TF amidolytickém testu a výběr lidské protilátky, která inhibuje amidolytickou aktivitu FVIIa vyvolanou TF, s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 10 nM FVIIa v testu; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 40 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 20 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa,

g) testování protilátek v testu tvorby FXa a výběr lidské protilátky, která inhibuje tvorbu FXa s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 nM; s použitím 0,1 nM FVIIa v testu; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + nm, výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa +

0,1 nm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa,

FFR-rFVIIa + 500 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀ FFR-rFVIIa + 200 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 100 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota ic₅₀

• 9 ·»*· • · · ·

• · • · · • · • · * ♦ • · · · · • · · · · • » · • » » < • · · · * · 63 • · · · • · · · * • · · FFR-rFVIIa + 5 0 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC_5O FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota

IC₅₀ FFR-rFVIIa,

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje testování protilátek v přímém testu TF ELISA zahrnujícím imobilizovaný TF a výběr lidských protilátek, které imunoreagují s imobilizovaným lidským TF.

28. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 26 až 27, vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje testování protilátek v testu tvorby FXa na TF exprimující buňce a výběr lidských protilátek, které inhibují tvorbu FXa na TF exprimující buňce s hodnotou IC₅₀ nižší než je

hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 500 nM; s použitím 1 nM FVIIa v testu; jako je hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 5 0 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 nm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa +

nm, výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa.

29. Způsob podle kteréhokoliv z nároků vyznačující se tím, že tento zahrnuje testování protilátek v testu vazby TF na celé buňce a výběr lidských protilátek, které soutěží s FVIIa vazbou k lidskému TF exprimovanému na buněčném povrchu celých buněk.

až 28, způsob dále ·* 9999 ·9 9999 ·1 · # » « · · * ···

9 · 9 9 9 99 · * - · > 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 999

9 9 9 99 999 9 9 9

30. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 26 až 29, vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje testování protilátek v biosenzorovém testu a výběr lidských protilátek s hodnotou Ka pro vazbu k lidskému TF nižší než 100 nM, jako je nižší než 10 nM, s výhodou nižší než 5 nM, s výhodou nižší než 1 nM a ještě výhodněji nižší než 0,5 nM.

31. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 26 až 30, vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje testování protilátek v MAPK signálním testu a výběr lidských protilátek, které inhibují aktivaci MAPK signalizace vyvolanou FVIIa.

32. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 26 až 31, vyznačující se tím, že tento způsob dále zahrnuje testování protilátek v testu mapování epitopu a výběr lidských protilátek, které imunoreaguji s preferovanými epitopy na TF.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že preferovaný epitop obsahuje zbytky Trp45, Lys46 a

Tyr94.

34 . Způsob podle kteréhokoliv z nároků 26 až 33, vyznačuj i c i se tím, že nesmrtelná buňka je hybridomová buňka. 35 . Lidská protilátka, v y z n a č u j i c i se

tím, že imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF, získatelné způsobem zahrnujícím:

a) imunizaci myši lidským TF, ·· ···« ·· ···· ·· · • W · · » ► · · * • · · · ···· · * » « · · · · ·«· ««·«· • · * · ·· · · · « ·· ·· ·· ··· »k t

0,1 nm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀FFR-rFVIIa,

h) testování protilátek v testu sráženi vyvolaného TF a výběr lidských protilátek, které inhibují tvorbu sraženiny v tomto testu s hodnotou IC₅₀ nižší než je hodnota IC₅₀

• · • · · · • ·

FFR-rFVIIa + 50 pm, s výhodou hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 10 pm, výhodněj i hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa + 5 pm a ještě výhodněji hodnota nižší než hodnota IC₅₀ FFR-rFVIIa,

i) výběr a kultivaci ve vhodném kultivačním médiu nesmrtelných buněk produkuj icích vybráno u protilátku podle kroků d) až h), j) izolaci vybrané protilátky z kultivačního média vybraných nesmrtelných buněk. 36. Lidská protilátka, v y z n a č u j í c £ s e

tím, že imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF produkovaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 26 až 34.

37. Buňka produkující lidskou protilátku, která imunoreaguje s epitopem přítomným na lidském TF a inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF.

38. Buňka podle nároku 37, kterou je izolovaná lymfoidní buňka.

39. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 38, která je izolovaná z myši.

40. Buňka podle nároku 37, kterou je hybridomová buňka.

41. Buňka podle nároku 40, přičemž tato hybridomová buňka je získána fúzí protilátku produkující lymfoidní buňky s nesmrtelnou buňkou, čímž se získá protilátku produkující hybridomová buňka.

• · • ·

42. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 41, ve které protilátka inhibuje vazbu lidského koagulačního faktoru Vila k lidskému TF.

43. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 42, ve které protilátka imunoreaguje s trojrozměrným povrchem zahrnujícím

všechny zbytky Trp4 2, Lys46 a Tyr94. 44. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 43, ve které protilátka je Fab fragment. 45. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 44, ve které protilátka je : F(ab)2 fragment. 46. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 44, ve které protilátka je : F (ab') 2 fragment. 47. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 44, ve které protilátka je i scFv fragment. 4 8. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 47, ve které protilátka má Kj pro vazbu k lidskému TF v rozsahu 10 ¹⁵ až 10'⁸ M. 49. Buňka podle kteréhokoliv z nároků 37 až 48, ve které protilátka má Ka pro vazbu k lidskému TF v rozsahu 10’¹⁵ až

ΙΟ¹⁰ M.

• · · · · · <

1/11 • · · · · « • · ⁴• · ·