JP2021527698A - 様々な血栓性の疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−２を阻害する組成物および方法 - Google Patents

様々な血栓性の疾患および障害の治療のためのｍａｓｐ−２を阻害する組成物および方法 Download PDF

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Abstract

1つの局面において、本発明は、補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患、障害、または状態を予防、軽減、ならびに／または治療するための組成物ならびに方法であって、治療量のMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、該組成物ならびに方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、止血に影響することなく、抗凝固および／または抗血栓症および／または抗血栓形成を提供する。本発明のこの局面の1つの態様において、該組成物および方法は、補体関連性炎症、フィブリンもしくは活性化血小板によって開始される過度な凝固もしくは接触系活性化と関連する、疾患、障害、もしくは状態を患っている対象、または該疾患、障害、もしくは状態を発症する危険を有する対象を治療するのに有用である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、2018年6月22日に出願された米国特許仮出願第62/688,611号の恩典を主張する。
配列表に関する記載
本出願に付随する配列表は、ハードコピーではなくテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称はMP_1_0252_PCT_Sequence_Listing_20l90620.txtであり；このテキストファイルは、サイズが26KBであり、2019年6月20に作成され；本出願の提出とともにEFS-Webを介して提出されている。
背景
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において微生物感染および他の急性傷害に対する免疫応答を開始、増幅、および組織化するための初期作用機構を提供する(M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York（非特許文献1）)。補体活性化は潜在的な病原体に対する有益な第一線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は宿主にとって潜在的な脅威となることもある(K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15：417-431, 1994（非特許文献2）； B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24：219-228, 1994（非特許文献3）)。例えば、C3およびC5タンパク質分解産物は好中球を動員および活性化する。活性化好中球は宿主防御に不可欠であるが見境なく破壊酵素を放出し、臓器損傷を引き起こすことがある。さらに、補体活性化によって、近くの宿主細胞ならびに微生物標的の表面に溶解性補体成分が沈着し、その結果、宿主細胞が溶解することがある。
現在、補体系は3つの異なる経路：古典経路、レクチン経路、および第二経路を介して活性化され得ることが広く認められている。古典経路は、通常、外来粒子(すなわち、抗原)に結合した宿主抗体からなる複合体によって誘発され、従って、特異的抗体反応を発生させるために抗原への前曝露を必要とする。古典経路の活性化は宿主による以前の獲得免疫応答に左右されるので、古典経路は後天免疫系の一部である。対照的に、レクチン経路および第二経路はいずれも獲得免疫とは無関係であり、自然免疫系の一部である。
レクチン経路は、ナイーブな宿主における感染からの宿主防御において主な役割を有すると広く考えられている。宿主防御においてMBLが関与する強力な証拠が機能的MBLの血清中レベルが低い患者の分析から得られた(Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572：401-413, (2002)（非特許文献4）)。このような患者は反復性の細菌感染および真菌感染に対して感受性を示す。これらの症状は、通常、若年期に、母由来抗体価が減少している時であるが、抗体反応の全レパートリーが発達する前の見かけの(apparent)脆弱期間に現れる。この症候群は、多くの場合、MBLオリゴマーの適切な形成を妨害する、MBLコラーゲン部分にある、いくつかの部位の変異に起因する。しかしながら、MBLは補体に関係なくオプソニンとして機能することができるので、感染に対する感受性の増大がどの程度まで補体活性化の障害によるものであるかは分かっていない。
補体系は、免疫防御における必須の役割に加えて、多くの臨床状態における組織損傷の一因となる。従って、これらの副作用を阻止するために治療上有効な補体阻害因子を開発する差し迫った必要性がある。
M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15：417-431, 1994 B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24：219-228, 1994 Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572：401-413, (2002)
概要
1つの局面において、本発明は、補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患、障害、または状態を予防、軽減、ならびに／または治療する方法であって、治療量のMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、止血に影響することなく、抗凝固および／または抗血栓症および／または抗血栓形成を提供する。本発明のこの局面の1つの態様において、方法は、補体関連性炎症、フィブリンもしくは活性化血小板によって開始される過度な凝固もしくは接触系活性化と関連する、疾患、障害、もしくは状態を患っている対象、または該疾患、障害、もしくは状態を発症する危険を有する対象を治療するのに有用である。1つの態様において、本発明の方法は、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植および／もしくは介入的心血管処置（たとえば血管形成術もしくはステント留置）後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂、プラーク不安定、再狭窄、低血圧症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、全身性炎症反応症候群（SIRS）、播種性血管内凝固症候群（DIC）、静脈閉塞症（VOD）、鎌状赤血球症、血栓性微小血管障害、ループス腎炎、表在性血栓性静脈炎、第V因子ライデン変異、虚血／再灌流障害、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ホルモン補充療法（HRT）を受けていること、アルツハイマー病からなる群より選択される疾患、障害、もしくは状態を患っている対象、ならびに／または凝固亢進状態を患っている対象を治療するのに有用であり、たとえば、対象は、5-FU、GM-CSF、シスプラチン、ヘパリン、COX-2阻害因子、造影剤、コルチコステロイド、および抗精神病薬からなる群より選択される薬物による治療を受けていること、静脈うっ血（不動化、手術などによる）、抗リン脂質症候群、がん（前骨髄球性白血病、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、および結腸腫瘍）、外傷もしくは手術による組織損傷、中央静脈中のカテーテルの存在、凝血塊形成に関与するタンパク質（たとえばプロテインC）の後天性欠損、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、ホモシステインレベルの上昇、心不全、機械弁の存在、インサイチュ血栓を伴う肺高血圧症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少症（heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis; HITT）、インサイチュ血栓を伴う川崎病、インサイチュ血栓を伴う高安動脈炎、転移性がんのトロンボフィリア、第VIII因子レベルの上昇、妊娠、および炎症性腸疾患（IBD）のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する。
1つの態様において、本発明の方法は、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患、障害、または状態を患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに有用であり、たとえば、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患または障害は、遺伝性血管浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および心肺バイパス術中の出血からなる群より選択される。1つの態様において、本発明の方法は、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患、障害、または状態を患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに有用であり、たとえば、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患または障害は、動脈血栓症、静脈血栓症、肺塞栓症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症、ある抗凝固薬から別の抗凝固薬への切り替え、および重症HIT患者における体外循環回路開存性のための持続的腎代替療法（CRRT）の適応外使用（維持）からなる群より選択される。1つの態様において、方法は、心房細動を以前に経験したことがある対象、現在それを患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を識別する工程、および該対象における発作の危険を減らすのに十分な量のMASP-2阻害抗体を投与する工程を含む。
1つの態様において、本発明の方法は、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患、障害、または状態を患っている対象またはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに、心房細動を有するまたは有さない対象における急性冠症候群後の再発性虚血の予防に、末期腎臓病に、脳虚血に、狭心症に有用であり、埋め込まれた医療機器（たとえば弁、微小口径移植片など）および／または体外循環回路と関連する凝固を減少させるかまたは防止し、たとえば、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患または障害は、深部静脈血栓症（一次予防と長期治療の両方）、肺塞栓症、非弁膜症性心房細動からなる群より選択される。1つの態様において、方法は、非弁膜症性心房細動を以前に経験したことがある対象、現在それ患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を識別する工程、ならびに該対象における発作および／または塞栓形成の危険を減らすのに十分な量のMASP-2阻害抗体を投与する工程を含む。
1つの態様において、本発明の方法は、凝固亢進状態を生じさせる遺伝子異常、またはそれを発症する危険を高める遺伝子異常を有すると判定された対象を治療するのに有用であり、たとえば、遺伝子異常は、プロトロンビン20210遺伝子変異、MTHFR変異、プロテインCの欠損、プロテインSの欠損、プロテインAの欠損、プロテインZの欠損、アンチトロンビン欠損、およびトロンボフィリアを生じさせる遺伝子障害からなる群より選択される。
1つの態様において、本発明の方法は、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患、障害、または状態を有する対象を治療するのに有用であり、たとえば、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、抗リン脂質抗体、がん（たとえば前骨髄球性白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、または結腸がん）、高ホモシステイン血症、感染症、組織損傷、静脈うっ血（手術、整形外科的もしくは麻痺的不動化、心不全、妊娠、または肥満による）、および、対象がエストロゲン含有経口避妊薬を服用することからなる群より選択される。
1つの態様において、本発明の方法は、抗凝固薬療法を必要とする対象においてワーファリンなどの標準的な抗凝固薬療法の代替法を提供するのに有用であり、たとえば、対象は、標準的な抗凝固薬療法を通常禁じる状態（たとえばCNSアミロイド血管症）を有するか、またはMASP-2阻害抗体は、そうでなければ標準的な抗凝固療法を受けている対象にブリッジング剤として術前投与される。
本明細書に記載される発明の方法の態様のいずれかにしたがって、MASP-2阻害抗体は、好ましくは、SEQ ID NO:5の一部分に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。いくつかの態様において、MASP-2抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される抗体断片である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は一本鎖分子である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、IgG1分子、IgG2分子、およびIgG4分子からなる群より選択される。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、S228P変異を含むIgG4分子である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は古典的経路を実質的に阻害しない。いくつかの態様において、MASP-2阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、（a）（i）SEQ ID NO:6の31〜35位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1；および（ii）SEQ ID NO:6の50〜65位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2；および（iii）SEQ ID NO:6の95〜107位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域と；（b）（i）SEQ ID NO:7の24〜34位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1；および（ii）SEQ ID NO:7の50〜56位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2；および（iii）SEQ ID NO:7の89〜97位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域とを含む。いくつかの態様において、MASP-2阻害モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:6として記載される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:7として記載される軽鎖可変領域とを含む。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:6に記載される重鎖可変領域とSEQ ID NO:7に記載される軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する。
本明細書に記載される発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになると考えられる。本明細書において引用される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて参照により、それぞれが個々に組み入れられるごとく、全体として本明細書に組み入れられる。
本発明の前記の局面および付随する利点の多くは、以下の詳細な説明を添付図面と合わせて参照することにより、さらに容易に理解されると考えられる。
MASP-2およびMAp19タンパク質ドメインならびにそれらをコードするエキソンを示す、Schwaeble et al., Immunobiol 205：455-466 (2002)からの図をYongqing et al., BBA 1824：253 (2012)によって修飾した模式図である。 図2Aは、実施例6に記載されるように、マウスMASP-2 MoAb 0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのいずれかの皮下投与後の様々な時点でマウス（n=3マウス/群）から採取された非希釈血清試料中、エクスビボで測定された、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のレクチン経路特異的C4b沈着をグラフによって示す。図2Bは、実施例6に記載されるように、マウスにおけるマウスMASP-2 MoAb 0.6mg/kgの1回の腹腔内投与ののち3週間にわたるレクチン経路回復の時間経過をグラフによって示す。 図3Aおよび3Bは、実施例8に記載されるように、正常ラット血清中、MASP-2 Fab2抗体（H1）投与後のC4b沈着の阻害（図3A）およびトロンビン活性化の阻害の用量反応曲線を提示する。 図4Aおよび4Bは、実施例9に記載されるように、播種性血管内凝固の限局性シュワルツマン反応モデルにおける、未処置の野生型マウスおよび枯渇物質コブラ毒因子（CVF）および終末経路阻害因子（C5aRアンタゴニスト）によって補体経路が阻害されている野生型マウス（図4A）中の血小板凝集に比べた、MASP-2（-/-）マウス（図4B）中の測定された血小板凝集（凝集面積として表示）を提示する。 実施例10に記載されるように、トロンビン基質FXIaおよびFXaによる、a'鎖の存在によって示されるヒトC3の活性化を示すウェスタンブロット分析の結果を示す。 実施例11に記載されるように、MASP-2-/-およびWTマウスへのLPS注射後の微小血管閉塞の発生までの時間をグラフによって示し、60分にわたり測定された血栓形成を示したマウスの割合を示し、WTマウスにおいては15分後に血栓形成が検出され、WTマウスの80％までが60分で血栓形成を示し、対照的に、MASP-2-/-マウスのいずれも60分の期間中に血栓形成を示さなかったことを実証する（ログランク：p=0.0005）。 実施例12に記載されるように、FITC/デキストラン注射の16時間前および1時間前に投与されたアイソタイプ対照またはヒトMASP-2抗体mAbH6（10mg/kg）による処置後、FITC/デキストランUVモデルにおいて微小血管閉塞を起こしたマウスの割合を損傷誘発後の時間の関数としてグラフによって示す。 ヒトMASP-2抗体（mAbH6）およびアイソタイプ対照抗体で処置されたマウスに関する分単位の閉塞時間をグラフによって示す。データは、分散ドットとして平均値（水平バー）および標準誤差バー（垂直バー）とともに報告されている。実施例12に記載されるように、分析に使用した統計検定は、対応のないt検定であった。「*」という記号はp=0.0129を示す。 実施例12に記載されるように、低い光強度（800〜1500）を用いる血栓症のFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞損傷モデルにおいて野生型マウス、MASP-2 KOマウスおよび血栓誘発の16時間前および再度1時間前にヒトMASP-2抗体（mAbH6）10mg/kgの腹腔内投与で前処置された野生型マウスに関する、閉塞に至るまで時間を分単位でグラフによって示す。 図10Aは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、MASP-2-アンチトロンビン複合体形成（MASP-2-ATIII）によって測定されたMASP-2活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、実施例14に記載するように、MASP-2阻害抗体がMASP-2活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。図10Bは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、MASP-2-セルピン複合体形成（MASP-2-C1-INH）によって測定されたMASP-2活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、実施例14に記載するように、MASP-2阻害抗体がMASP-2活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。 図11Aは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、カリクレイン−アンチトロンビン複合体形成（KK-ATIII）によって測定されたカリクレイン活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、実施例14に記載するように、MASP-2阻害抗体がカリクレイン活性化を用量依存的に阻止するが、溶媒対照は効果を有しないことを実証する。図11Bは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、カリクレイン−セルピン複合体形成（KK-C1-INH）によって測定されたカリクレイン活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、実施例14に記載するように、MASP-2阻害抗体がカリクレイン活性化を用量依存的に阻止するが、溶媒対照は効果を有しないことを実証する。 図12Aは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、第XII因子−アンチトロンビン複合体形成（FXIIa-ATIII）によって測定された第XII因子活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、実施例14に記載するように、MASP-2阻害抗体が第XII因子活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。図12Bは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、第XII因子−セルピン複合体形成（FXIIa-C1-INH）によって測定された第XII因子活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、実施例14に記載するように、MASP-2阻害抗体が第XII因子活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。
配列表の説明
SEQ ID NO:1 ヒトMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:2 ヒトMASP-2タンパク質（リーダーあり）
SEQ ID NO:3 ヒトMASP-2タンパク質（成熟）
SEQ ID NO:4 ラットMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 ラットMASP-2タンパク質（リーダーあり）
SEQ ID NO:6 17D20_dc35VH21N11VL（OMS646）重鎖可変領域（VH）ポリペプチド
SEQ ID NO:7 17D20_dc21N11VL（OMS646）軽鎖可変領域（VL）ポリペプチド
詳細な説明
I. 定義
本明細書において別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、本発明の技術分野の当業者によって理解される意味と同じ意味を有する。以下の定義は本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲において使用される用語に関して明確さを提供するために提供される。
本明細書において使用される「MASP-2依存性補体活性化」という用語は、Ca++の存在下で起こるMASP-2レクチン依存性活性化を含み、MASP-2レクチン依存性活性化は、レクチン経路C3コンバターゼC4b2aの形成を招き、次いで、C3切断産物C3bが蓄積するとC5コンバターゼC4b2a(C3b)nの形成を招き、C3切断産物C3bの蓄積はオプソニン化および／または溶解を生じさせることがわかっている。
本明細書において使用される「レクチン経路」という用語とは、マンナン結合レクチン（MBL）、CL-11およびフィコリン（H-フィコリン、M-フィコリン、またはL-フィコリン）を含む血清および非血清炭水化物結合タンパク質の特異的結合を介して起こる補体活性化をいう。本明細書に記載されるように、レクチン経路はMASP-2依存性である。本明細書において使用されるように、レクチン経路の活性化はCa++含有バッファーを使用して評価される。
本明細書において使用される「古典的経路」という用語とは、異物粒子に結合した抗体によって発動され、認識分子C1qの結合を必要とする補体活性化をいう。
本明細書において使用される「MASP-2阻害抗体」という用語とは、MASP-2に結合するかまたはMASP-2と直接相互作用し、MASP-2依存性補体活性化を阻害する、MASP-2抗体およびそのMASP-2抗原結合断片を含む任意の抗体をいう。本発明の方法に有用なMASP-2阻害抗体は、MASP-2依存性補体活性化を、10％よりも大きく、たとえば20％よりも大きく、50％よりも大きく、または90％よりも大きく減少させ得る。1つの態様において、MASP-2阻害抗体は、MASP-2依存性補体活性化を90％よりも大きく減少させる（すなわち、10％またはそれ未満のMASP-2補体活性化しか生じさせない）。直接MASP-2阻害抗体の例が、MASP-2特異的阻害抗体、たとえば、補体系の他の成分に対する場合よりも少なくとも10倍の大きさの結合親和性でMASP-2（SEQ ID NO:2）の一部分に特異的に結合するMASP-2阻害抗体である。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、MASPポリペプチドまたはその一部などの標的ポリペプチドに特異的に結合する、任意の抗体産生哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトを含む霊長類)に由来する、あるいはハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、またはトランスジェニック動物(または抗体もしくは抗体断片を産生する他の方法)に由来する抗体およびその抗体断片を包含する。「抗体」という用語は、抗体源、または抗体が作られるやり方の点で(例えば、ハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、トランスジェニック動物、ペプチド合成などによって)限定されることが意図されない。例示的な抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体；汎(pan)特異性抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体)；ヒト化抗体：マウス抗体；キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトモノクローナル抗体；および抗イディオタイプ抗体を含み、任意のインタクトな抗体またはその断片でもよい。本明細書で使用する「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片(例えば、dAb、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv)、単鎖(ScFv)、その合成変種、天然変種、抗体部分と、必要とされる特異性の抗原結合断片を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性の抗原結合部位または断片(エピトープ認識部位)を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構成も包含する。
「モノクローナル抗体」は均質な抗体集団を指す。ここで、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸(天然および非天然)からなる。モノクローナル抗体は標的抗原に対して高度に特異的である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体だけでなく、その断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv)、単鎖(ScFv)、その変種、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープに結合する能力の抗原結合断片(エピトープ認識部位)を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された構成も包含する。この用語は、抗体源、または抗体が作られるやり方の点で(例えば、ハイブリドーマ、ファージセレクション、組換え発現、トランスジェニック動物などによって)限定されることが意図されない。この用語は、「抗体」の定義で前述された免疫グロブリン全体および断片などを含む。
本明細書で使用する「抗体断片」という用語は、完全長抗体、例えば、MASP-2抗体に由来するかまたはこれに関連する、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を含む、部分を指す。抗体断片の例示的な例には、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
本明細書で使用する「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメインまたはVLドメインを含む。これらのドメインは1本のポリペプチド鎖で存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このためにscFvは抗原結合のために望ましい構造を形成することができる。
本明細書で使用する「キメラ抗体」は、非ヒト種(例えば、げっ歯類)抗体に由来する可変ドメインおよび相補性決定領域を含有するが、抗体分子の残りはヒト抗体に由来する、組換えタンパク質である。
本明細書で使用する「ヒト化抗体」は、ヒト抗体フレームワークに移植された、非ヒト免疫グロブリンに由来する特異的な相補性決定領域に一致する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、典型的には、抗体相補性決定領域のみが非ヒトに由来する（ファージディスプレイまたは酵母から作製された抗体を含む）組換えタンパク質である。
本明細書で使用する「マンナン結合レクチン」(「MBL」)という用語は、マンナン結合タンパク質(「MBP」)と同義である。
本明細書で使用する「膜侵襲複合体」(「MAC」)は、膜に入り込み、膜を破壊する、5種類の終末補体成分の複合体(C5bとC6、C7、C8、およびC9との組み合わせ)(C5b-9とも呼ばれる)を指す。
本明細書で使用する「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、およびげっ歯類を含むが、それに限定されるわけではない、全ての哺乳動物を含む。
本明細書で使用するアミノ酸残基の略語は以下の通りである：アラニン(Ala；A)、アスパラギン(Asn；N)、アスパラギン酸(Asp；D)、アルギニン(Arg；R)、システイン(Cys；C)、グルタミン酸(Glu；E)、グルタミン(Gln；Q)、グリシン(Gly；G)、ヒスチジン(His；H)、イソロイシン(Ile；I)、ロイシン(Leu；L)、リジン(Lys；K)、メチオニン(Met；M)、フェニルアラニン(Phe；F)、プロリン(Pro；P)、セリン(Ser；S)、スレオニン(Thr；T)、トリプトファン(Trp；W)、チロシン(Tyr；Y)、およびバリン(Val；V)。
最も広い意味では、天然アミノ酸は、それぞれのアミノ酸の側鎖の化学特性に基づいてグループに分けることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、CysまたはProを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg、またはHisを意味する。このアミノ酸グループは、以下のように、さらにサブグループに分けることができる。「無電荷親水性」アミノ酸とは、Ser、Thr、Asn、またはGlnを意味する。「酸性」アミノ酸とはGluまたはAspを意味する。「塩基性」アミノ酸とはLys、Arg、またはHisを意味する。
本明細書で使用する「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下のグループ：(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびスレオニン、(4)アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5)グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6)リジン、アルギニンおよびヒスチジンのそれぞれの中でのアミノ酸間の置換によって例示される。
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)もしくはデオキシリボ核酸(DNA)またはその模倣物のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然のヌクレオチド、糖、およびヌクレオシド間(バックボーン)共有結合からなるオリゴヌクレオ塩基(oligonucleobase)、ならびに非天然改変を有するオリゴヌクレオチドもカバーする。
本明細書で使用する「エピトープ」は、抗体が結合する、タンパク質(例えば、ヒトMASP-3タンパク質)上の部位を指す。「重複エピトープ」は、直鎖エピトープおよび非直鎖エピトープを含む、少なくとも1個(例えば、2個、3個、4個、5個、または6個)の共通アミノ酸残基を含む。
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義に用いられ、長さにも翻訳後修飾に関係なく任意のペプチド結合アミノ酸鎖を意味する。本明細書に記載のMASP-2タンパク質は野生型タンパク質を含有してもよく、野生型タンパク質でもよく、50個以下(例えば、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下、10個以下、12個以下、15個以下、20個以下、25個以下、30個以下、35個以下、40個以下、または50個以下)の保存的アミノ酸置換を有する変種でもよい。保存的置換は、典型的には、以下のグループ；グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、およびスレオニン；リジン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンの中での置換を含む。
本明細書に記載されるヒトMASP-2タンパク質（SEQ ID NO：2と表記される）はまた、タンパク質の末端および内部欠失変異体を含むMASP-2タンパク質のペプチド断片を含む、完全長および/または未成熟（pre-pro）MASP-2タンパク質よりも短いタンパク質の「ペプチド断片」を含む。欠失変異体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸セグメント（2個またはそれ以上のアミノ酸の）または非隣接単一アミノ酸を欠失していることができる。
一部の態様において、ヒトMASP-2タンパク質は、SEQ ID NO：2に記載されたアミノ酸配列を有するヒトMASP-2タンパク質と70（例えば71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100）％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有することができる。
一部の態様において、ペプチド断片は、長さが少なくとも6個（例えば、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、もしくは600個またはそれ以上)のアミノ酸残基（例えば、SEQ ID NO：2または3の少なくとも6個の連続したアミノ酸残基)であることができる。一部の態様において、ヒトMASP-2タンパク質の抗原性ペプチド断片は、長さが500個未満（例えば、450個未満、400個未満、350個未満、325個未満、300個未満、275個未満、250個未満、225個未満、200個未満、190個未満、180個未満、170個未満、160個未満、150個未満、140個未満、130個未満、120個未満、110個未満、100個未満、95個未満、90個未満、85個未満、80個未満、75個未満、70個未満、65個未満、60個未満、55個未満、50個未満、49個未満、48個未満、47個未満、46個未満、45個未満、44個未満、43個未満、42個未満、41個未満、40個未満、39個未満、38個未満、37個未満、36個未満、35個未満、34個未満、33個未満、32個未満、31個未満、30個未満、29個未満、28個未満、27個未満、26個未満、25個未満、24個未満、23個未満、22個未満、21個未満、20個未満、19個未満、18個未満、17個未満、16個未満、15個未満、14個未満、13個未満、12個未満、11個未満、10個未満、9個未満、8個未満、7個未満または6個未満）のアミノ酸残基（例えば、SEQ ID NO：2または3のいずれか一方の500個未満の連続したアミノ酸残基）である。
一部の態様においては、MASP-2に結合する抗体を生成することに関して、ペプチド断片は抗原性であり、完全長タンパク質が哺乳動物において抗原応答を誘発する能力の少なくとも10％（例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％または100％もしくはそれ以上）を保持する（下記の「抗体を製造するための方法」を参照されたい）。
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最大の配列同一性％を達成するために配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸と同一である候補配列中のアミノ酸の割合と定義される。配列同一性％を決定するためのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内の様々なやり方で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用して達成することができる。比較される配列の完全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは公知の方法によって決定することができる。
代表的な態様において、ヒトMASP-2タンパク質（SEQ ID NO:2）は、SEQ ID NO:1として記載されるcDNA配列によってコードされる。当業者は、SEQ ID NO:1に開示されたcDNA配列が、ヒトMASP-2の単一アレルを表し、アレル変異および選択的スプライシングが起こることが予想されることを認識するであろう。SEQ ID NO:1に示されるヌクレオチド配列のアレル変異体は、沈黙変異を含むもの、および変異がアミノ酸配列変化を生じさせるものを含め、本発明の範囲内である。MASP-2配列のアレル変異体は、標準的な手法にしたがって異なる個体由来のcDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーをプロービングすることによってクローニングすることもできるし、そのような情報を含むデータベースの相同性比較サーチ（たとえばBLASTサーチ)によって同定してもよい。
レクチン経路
MASP-2は、それぞれのパターンへの認識成分の結合と同時に活性化され、また、MASP-1によって活性化される場合もあり、その後、補体成分C4をC4aおよびC4bへと切断する。切断産物C4bが血漿C2に結合したのち、C4b結合C2は、C4b結合C2を酵素的に活性な複合体C4bC2aおよび小さなC2b切断片へと転換する第二のMASP-2媒介性切断工程の基質になる。C4b2aは、レクチンの経路のC3転換C3コンバターゼであり、豊富な血漿成分C3をC3aおよびC3bへと転換する。C3bは、チオエステル結合を介してすぐ近くにある任意の表面に結合する。C3コンバターゼ複合体C4b2aのすぐ近くにあるいくつかのC3b断片が結合するならば、このコンバターゼはその特異性を変化させてC5をC5bおよびC5aへと転換して、C5コンバターゼ複合体C4b2a(C3b)nを形成する。このC5コンバターゼはMACの形成を開始させることができるが、このプロセスは、それ自体では溶解を促進する効果が不十分であると考えられる。むしろ、レクチン経路によって産生される初期C3bオプソニンが、新たな代替経路C3コンバターゼおよびC5コンバターゼ部位の形成のための核を形成し、それが最終的に豊富なMAC形成および溶解につながる。また、C4欠損マウスは虚血再灌流障害から保護されないが、MASP-2欠損マウスは保護される（Schwaeble et al., PNAS, 2011上記）ため、虚血再灌流障害の病態生理において重要な役割を果たす、C4の非存在下でC3を活性化するためのMASP-2依存性C4バイパス活性化ルートがある。本明細書に記載されるように、MASP-2依存性補体活性化はまた、プロトロンビンのトロンビンへの切断（共通経路）および第XII因子（ハーゲマン因子）をその酵素的に活性の形態XIIaに転換するための切断を含む凝固経路と関係がある。第XIIa因子は他方で、第XI因子をXIaへと切断する（内因性経路）。凝固カスケードの内因性経路活性化は、血栓形成にきわめて重要であるフィブリン形成を招く。
MASP-2依存性活性化ルートは、レクチン経路C3コンバターゼC4b2aの形成を招き、次いで、C3切断産物C3bが蓄積すると、C5コンバターゼC4b2a(C3b)nの形成を招く。補体C4の非存在下、MASP-2は、C2および凝固第XI因子を含む代替C3コンバターゼ複合体を形成することができる。本明細書において実施例14で実証されるように、MASP-2を介するレクチン経路活性化は凝固および接触系の活性化を発動する。これが、さらなる凝固を生じさせ、それにより、歯止めがきかない過度な凝血塊形成を生じさせるフィードバックサイクルを駆動すると予想される。このフィードバックサイクルが血栓性障害を促進すると予想される。本明細書においてさらに実証されるように、MASP-2はこのクロストークのネクサスを形成し、MASP-2阻害抗体によるMASP-2の阻害が第XII因子活性化およびカリクレイン活性化を阻止し、それにより、MASP-2阻害抗体の治療的使用が凝固および接触のカスケードの過度な活性化を減少させると予想されることを示した。
溶解におけるその役割に加えて、MASP-2駆動型活性化ルートは、微生物が共有結合C3bおよびその切断産物（すなわちiC3bおよびC3dg）でコーティングされることにつながる細菌オプソニン化において重要な役割を果たし、それは、C3レセプターを有する食細胞、例えば顆粒球、マクロファージ、単球、小グリア細胞、および細網内皮系による取込みおよび死滅の標的となる。これは、補体溶解に耐性である細菌および微生物のクリアランスに最も効果的なルートである。これらはグラム陽性細菌の大部分を含む。
MASP-2の背景
現在、3つのマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ（MASP-1、MASP-2、およびMASP-3）がヒト血清中でマンナン結合レクチン（MBL）と関連していることが公知である。マンナン結合レクチンはまた、最近の文献においては、「マンノース結合タンパク質」または「マンノース結合レクチン」とも呼ばれている。MBL-MASP-2複合体は、多様な微生物上に存在する糖質構造へのMBLの結合のおかげで、先天性免疫において重要な役割を果たす。MBLと糖質構造の特定のアレイとの相互作用がMASP酵素前駆体の活性化を生じさせ、それが他方で、補体成分C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することによって補体を活性化する（Kawasaki et al., J. Biochem 106：483-489 (1989)； Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176：1497-1502 (1992)； Ji et al., J. Immunol. 150：571-578 (1993)）。
MBL-MASP酵素前駆体複合体は、最近まで、1つのタイプのプロテアーゼ（MASP-1）しか含まないと考えられていたが、今や、MBLと関連する他2つの別々のプロテアーゼ（すなわち、MASP-2およびMASP-3）（Thiel et al., Nature 386：506-510 (1997)； Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)）および「MAp19」または「sMAP」と呼ばれる19kDaのさらなる血清タンパク質（Stover et al., J. Immunol. 162：3481-3490 (1999)； Stover et al., J. Immunol. 163：6848-6859 (1999)； Takahashi et al., Int. Immunol 11：859-63 (1999)）があることが明らかである。
MAp19は、MASP-2の構造遺伝子の選択的スプライシングされた遺伝子産物であり、かつセリンエンドペプチダーゼドメインを含むMASP-2の4つのC末端ドメインを欠く。MAp19をコードする豊富に発現した切断型mRNA転写物は、MASP-2遺伝子の選択的スプライシング/ポリアデニル化事象によって生成される。類似した機構により、MASP-1/3遺伝子は、3つの主要な遺伝子産物、すなわち2つのセリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3ならびに「MAp44」と呼ばれる44kDaの切断型遺伝子産物を生じさせる（Degn et al., J. Immunol 183(11)：7371-8 (2009)； Skjoedt et al., J Biol Chem 285：8234-43 (2010)）。
MASP-1は、当初、血清Ra反応性因子のP-100プロテアーゼ成分と記載されていたが、それが今や、MBLに加えてMASPで構成された複合体であると認識されている（Matsushita et al., Collectins and Innate Immunity, (1996)； Ji et al., J Immunol 150：571-578 (1993)。補体の古典経路のC1q-(C1r)2-(C1s)2複合体内のC1s酵素と明らかに同一のやり方で補体成分C4およびC2に作用するMBL-MASP複合体内のMBL関連エンドペプチダーゼの能力は、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体に機能的に類似するMBL-MASP複合体が存在することを示唆する。C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体は、C1qと免疫複合体中に存在する抗体IgGまたはIgMのFc領域との相互作用によって活性化される。これがC1r酵素前駆体の自己活性化を生じさせ、それが他方でC1s酵素前駆体を活性化し、次いでC1s酵素前駆体が補体成分C4およびC2に作用する。
MBL-MASP複合体の化学量論は、様々なMBLオリゴマーがMASP-1/MAp19またはMASP-2/MASP-3の様々な割合と関連するように見える点で、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体に見られる化学量論とは異なる（Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)。血清中に見られるMASPおよびMAp19の大部分は、MBLとは複合化しておらず（Thiel et al., J Immunol 165：878-887 (2000)）、かつ部分的に、微生物面上のN-アセチルグルコサミン残基に結合することができるフィブリノゲン様ドメインを有する最近記載されたレクチンの群であるフィコリンと関連し得る（Le et al., FEBS Lett 425：367 (1998)； Sugimoto et al., J. Biol Chem 273：20721 (1998)）。これらのうち、ヒトL-フィコリン、H-フィコリン、およびM-フィコリンはMASPおよびMAp19と関連し、かつフィコリンによって認識される特定の糖質構造に結合すると、レクチン経路を活性化し得る（Matsushita et al., J Immunol 164：2281-2284 (2000)； Matsushita et al., J Immunol 168：3502-3506 (2002)）。フィコリンおよびMBLに加えて、CL-11と呼ばれるMBL様レクチンであるコレクチンがレクチン経路認識分子として同定されている（Hansen et al. J Immunol 185：6096-6104 (2010)； Schwaeble et al. PNAS 108：7523-7528 (2011)）。これらの代替糖質認識分子の生理学的重要性を強調する圧倒的な証拠があり、したがって、MBLがレクチン活性化経路の唯一の認識成分ではなく、MBL欠損がレクチン経路欠損と誤解されてはならないことを理解することが重要である。おそらくは、MBLに構造的に関連した代替糖質認識複合体のアレイの存在は、補体の活性化によって先天性免疫系の直接応答を開始させる微生物構造のスペクトルを広げ得る。
すべてのレクチン経路認識分子は、それらのコラーゲン相同性茎領域内の特定のMASP結合モチーフを特徴とする（Wallis et al. J. Biol Chem 279：14065-14073 (2004)）。MBL、CL-11およびフィコリン中のMASP結合部位は、このドメイン内の別個のモチーフ：Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Proを特徴とし、Hypはヒドロキシプロリンであり、Xaaは概して脂肪族残基である。この配列中の点突然変異がMASP結合を分断する。
図1は、MASP-2ポリペプチド（SEQ ID NO：2）およびMAp19ポリペプチドならびにそれらをコードするエキソンのドメイン構造を示す略図である。図1に示すように、セリンプロテアーゼMASP-2は、C1rおよびC1sに見られるように配置された6つの別々ドメイン；すなわち（I）N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形成タンパク質（またはCUBI）ドメイン；（II）上皮成長因子（EGF)様ドメイン；（III）第二のCUBドメイン（CUBII）；（IVおよびV）2つの補体制御タンパク質（CCP1およびCCP2）ドメイン；および（VI）セリンプロテアーゼ（SP）ドメインからなる。
ヒトおよびマウスMASP-1（Sato et al., Int Immunol 6：665-669 (1994)； Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196：1003-1009 (1993)； Takayama et al., J. Immunol. 152：2308-2316 (1994)）、ヒト、マウス、およびラットMASP-2（Thiel et al., Nature 386：506-510 (1997)； Endo et al., J Immunol 161：4924-30 (1998)； Stover et al., J. Immunol. 162：3481-3490 (1999)； Stover et al., J. Immunol. 163：6848-6859 (1999)）ならびにヒトMASP-3（Dahl et al., Immunity 15：127-135 (2001)）のcDNA由来アミノ酸配列は、これらのプロテアーゼが、それらの推定触媒ドメイン内にHis、AspおよびSer残基の特徴的な三連構造を有するセリンペプチダーゼであることを示す（2012年2月15日にGenbankにアクセスした場合、Genbankアクセッション番号：ヒトMASP-1：BAA04477.1；マウスMASP-1：BAA03944；ラットMASP-1：AJ457084；ヒトMASP-3：AAK84071；マウスMASP-3：AB049755。それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。
図1にさらに示すように、酵素前駆体が活性形態へと転換されると、重鎖（アルファまたはA鎖）および軽鎖（ベータまたはB鎖）が分割されて、ジスルフィド結合したA鎖と、セリンプロテアーゼドメインに相当するより小さなB鎖とを生じさせる。
ヒトMASP-2遺伝子は染色体1p36.3-2上に位置し（Stover et al., Cytogenet and Cell Genet. 84：148-149 (1999)）、図1に示すように、12個のエキソンを包含する。MASP-2（SEQ ID NO：2）およびMAp19は、選択的スプライシング/ポリアデニル化によって生成される単一の構造遺伝子の転写物によってコードされる（Stover et al., Genes and Immunity 2：119-127 (2001)）。ヒトMASP-2 cDNA（SEQ ID NO：1）はエキソン2、3、4、6、7、8、9、10、11、および12によってコードされる。MBL関連タンパク質19（「MAp19」、「sMAP」とも呼ばれる）と呼ばれる20kDaタンパク質がエキソン2、3、4、および5から生じる。MAp19は、図1に示すようにエキソン5に由来する4つのさらなる残基（EQSL）を有するMASP-2のN末端CUB1-EGF領域を含む非酵素的タンパク質である。
MASP-2ポリペプチド（SEQ ID NO：2）は686個のアミノ酸残基を有し、それが15の残基のリーダーペプチドを含み、このリーダーペプチドが分泌後に切断されて、成熟形態のヒトMASP-2（SEQ ID NO：3)を生じさせる。図1に示すように、MASP-2アミノ酸配列は任意のN結合グリコシル化部位を含まない。MASP-2ポリペプチドは、MASP-1、MASP-3ならびにC1rおよびC1s、すなわちC1補体系のプロテアーゼに類似した分子構造を示す。ヒトMASP-2タンパク質（SEQ ID NO：2を参照して番号を付した）のドメインが図1に示され、かつN末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形成タンパク質（CUBI）ドメイン（SEQ ID NO：2のaa24〜136）、上皮成長因子様ドメイン（SEQ ID NO：2のaa138〜180)、第二のCUBドメイン（CUBII)（SEQ ID NO：2のaa184〜295)ならびに補体制御タンパク質ドメインのタンデム（SEQ ID NO：2のCCP1 aa300〜359およびCCP2 aa364〜431）およびセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO：2のaa445〜682）を含む。
図1に示すように、MASP-2ポリペプチドは、CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2ドメインを含むアルファ鎖（重鎖）（アルファ鎖：SEQ ID NO：2のaa1〜443)と、セリンプロテアーゼドメインを含むベータ鎖（軽鎖）（ベータ鎖：aa444〜686）とを有する。CUB-1、EGFおよびCUB-2ドメインは二量体化のために必要であり、CUB-1、EGF、CUB-2およびCCP-1ドメインはMBPのための結合部位を含む。Wallis et al., J. Biol Chem 279：14065-14073 (2004)に記載されているように、各MASP-2二量体が2つのMBLサブユニットに結合する。
先天性免疫におけるMBL/フィコリン-MASP複合体の役割は、C型レクチンドメイン（MBL分子中に存在)のカルシウム依存性結合によって、または酵母、細菌、ウイルス、および真菌において見られる糖質構造へのフィブリノゲン様ドメイン（フィコリン分子中に存在）の結合によって媒介される。この認識段階が酵素前駆体MASP-2の活性化をもたらし、その後それが、C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することにより、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体内の活性化されたC1の作用を模倣する。これが、標的病原体上のC4bおよびC3bの沈着を可能にし、ひいては、食作用による死滅およびクリアランスを促進する。
最近の文献における証拠は、レクチン経路活性化複合体が、C4およびC2を切断するためにMASP-2の活性のみを必要とすることを暗示している：(i）組換えMBLおよび組換え的に発現したMASP-2を使用する最小レクチン経路活性化複合体の再構成が、インビトロでC4およびC2の両方を効果的に切断するのに十分であると考えられ（Vorup-Jensen et al., J. Immunol. 165：2093-2100 (2000)； Rossi et al., J Biol Chem 276：40880-40887 (2001)； Ambrus et al., J Immunol 170：1374-1382 (2003)； Gal et al, J Biol Chem 280：33435-33444 (2005))；さらに(ii）MASP-2の遺伝子標的化欠損を有するマウスの血清は任意のレクチン経路機能活性を欠く（Schwaeble et al., PNAS 108：7523-7528 (2011)）。最近、遺伝的に判定されたMASP-2の欠損が記載された（Stengaard-Pedersen et al., New Eng. J. Med. 349：554-560, (2003)）。1つのヌクレオチドの突然変異がCUB1ドメイン中のAsp-Gly交換を生じさせ、MASP-2がMBLに結合することを不可能にする。
本明細書に提供されるデータは、MASP-2依存性レクチン経路補体活性化がレクチン依存性補体活性化と凝固との間のリンクを提供することを実証する。したがって、上記を鑑みて、MASP-2阻害因子は、本明細書に記載されるような凝固および血栓性障害を患っている対象の治療において治療ベネフィットを有すると予想される。
したがって、前記により、本発明の局面は、それを必要とする対象おける、本明細書に開示される凝固および血栓性障害を治療するため、それを予防するため、またはその重症度を下げるためにMASP-2依存性補体活性化を阻害するための方法であって、治療有効量のMASP-2阻害抗体を薬学的担体中に含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。MASP-2阻害組成物は、対象に対し、全身的に、たとえば動脈内、静脈内、筋肉内、吸入、経鼻、皮下、もしくは他の非経口投与によって投与されてもよいか、または、非ペプチド作動性物質の場合には潜在的に経口投与によって投与されてもよい。投与は、状態が消散するまたは制御されるまで、医師の判断よって繰り返され得る。外傷または他の急性事象に続発する血栓性または凝固疾患または障害の治療または予防の場合、MASP-2阻害組成物は、外傷の直後に投与されてもよいか、あるいは、危険を有すると考えられる患者における外傷誘発性の創傷もしくは状況、たとえば手術の前、その最中、その直後、またはその後1日〜7日以内、たとえば24時間〜72時間以内に予防的に投与されてもよい。いくつかの態様において、MASP-2阻害組成物は、好適には、速効性の剤形で、たとえばMASP-2阻害物質組成物を含有する溶液のボーラスの静脈内または動脈内送達によって投与され得る。
本発明のMASP-2阻害組成物の適用は、それを必要とする対象における凝固または血栓症を治療するため、予防するため、またはその重症度を下げるために、組成物の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。あるいはまた、組成物は、血栓性または凝固の障害、疾患、または状態を患っている対象、または発症する危険を有する対象の治療のために、長期間にわたり一定の間隔で、たとえば毎日、週二回、毎週、隔週、毎月、または隔月、投与されてもよい。
XVII. MASP-2阻害物質
MASP-2阻害抗体は効果的に、MASP-2タンパク質-タンパク質相互作用を遮断し得るか、MASP-2二量体化またはアセンブリを妨害し得るか、Ca++結合を阻止し得るか、またはMASP-2セリンプロテアーゼ活性部位を妨害し得て、MASP-2がレクチン経路を活性化することを防止し得る。MASP-2阻害抗体は、一次療法として単独で使用することもできるか、または本明細書にさらに記載されるように、他の医学的治療の治療有益性を高めるために、他の治療と組み合わせて補助療法として使用することもできる。
一態様において、MASP-2阻害抗体は、補体系中の他の抗原に対する場合よりも少なくとも10倍大きい結合親和性でMASP-2（SEQ ID NO：2）の一部に特異的に結合する。別の態様において、MASP-2阻害抗体は、補体系中の他の抗原に対する場合よりも少なくとも100倍大きい結合親和性でMASP-2（SEQ ID NO：2）の一部に特異的に結合する。一態様において、MASP-2阻害抗体は、（i）CCP1-CCP2ドメイン（SEQ ID NO：2のaa300〜431）またはMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO：2のaa445〜682）のうちの少なくとも1つに特異的に結合し、かつMASP-2依存性補体活性化を阻害する。ただし、該阻害抗体は、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインには結合せず、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合しない。一態様において、MASP-2阻害抗体は、MASP-2モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、その断片はMASP-2に特異的に結合する。
MASP-2阻害抗体の結合親和性は、適切な結合アッセイ法を使用して測定することができる。
MASP-2依存性補体活性化の阻害は、本発明の方法によるMASP-2阻害抗体の投与の結果として起こる補体系の成分における以下の変化のうちの少なくとも1つを特徴とする：MASP-2依存性補体活性化系産物C4b、C3a、C5a、および/またはC5b-9（MAC）の生成または産生の阻害（例えば米国特許第7,919,094号の実施例2に記載されているように測定）、C4切断およびC4b沈着の減少（例えば実施例1または実施例2に記載されるように測定）またはC3切断およびC3b沈着の減少（例えば実施例4に記載されるように測定）。
一部の態様において、MASP-2阻害抗体はMASP-2補体活性化を選択的に阻害して、C1q依存性補体活性化系を機能的にインタクトのままにしておく。
MASP抗体
本発明のこの局面において有用なMASP-2抗体は、任意の抗体産生哺乳動物由来のポリクローナル、モノクローナルまたは組換え抗体を含み、かつ、多重特異性（すなわち、二重特異性または三重特異性）、キメラ、ヒト化、完全ヒト、抗イディオタイプ、および抗体断片であり得る。抗体断片としては、本明細書にさらに説明するFab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv断片、scFv断片および単鎖抗体がある。
例えば、本明細書の実施例4〜6に記載されるように、MASP-2依存性補体活性化を遮断する抗ラットMASP-2 Fab2抗体が同定されている。実施例7にさらに記載されるように、MASP-2依存性補体活性化を遮断する完全ヒトMASP-2 scFv抗体が同定されている。
（表１）MASP-2特異性抗体
Figure 2021527698
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エフェクター機能が低下したMASP-2抗体
本発明のこの局面の一部の態様において、古典的補体経路の活性化から生じ得る炎症を減少させるために、本明細書記載のMASP-2抗体はエフェクター機能が低下している。IgG分子が古典的補体経路を誘発する能力は、この分子のFc部分の中にあることが示されている(Duncan, A.R.. et al., Nature 332：738-740 (1988))。この分子のFc部分が酵素切断によって除去されているIgG分子には、このエフェクター機能がない(Harlow, Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。従って、エフェクター機能を最小化する遺伝子操作Fc配列を有することによって、またはヒトIgG2もしくはIgG4アイソタイプにすることによって、この分子のFc部分を欠いた結果としてエフェクター機能が低下した抗体を作製することができる。
エフェクター機能が低下した抗体は、Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol. 10：241-250 (1993)およびRodrigues et al., J. Immunol. 151：6954-6961 (1998)に記載のように、IgG重鎖のFc部分の標準的な分子生物学的操作によって作製することができる。エフェクター機能が低下した抗体はまた、補体を活性化する、および/またはFc受容体と相互作用する能力が低下したヒトIgG2およびIgG4アイソタイプも含む(Ravetch, J. V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9：457-492 (1991)； Isaacs, J.D., et al., J. Immunol. 148：3062-3071, 1992； van de Winkel, J.G., et al., Immunol Today 14：215-221 (1993))。IgG2またはIgG4アイソタイプからなる、ヒトMASP-2に特異的なヒト化抗体または完全ヒト抗体(二重抗体、汎抗体、二重特異性抗体、または三重特異性抗体を含む)は、Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16：535-539 (1998)に記載のように当業者に公知のいくつかの方法の1つによって作製することができる。
MASP-2抗体の作製
MASP-2抗体は、MASP-2ポリペプチド(例えば、完全長のMASP-2)を用いてまたは抗原性MASP-2エピトープ含有ペプチド(例えば、MASP-2ポリペプチドの一部)を用いて作製することができる。免疫原性ペプチドは5アミノ酸残基と小さくてもよい。例えば、本発明の方法において有用なMASP-2抗体を誘導するために、SEQ ID NO：2の全アミノ酸配列を含むMASP-2ポリペプチドが用いられてもよい。タンパク質-タンパク質間相互作用に関与することが公知の特定のMASP-2ドメイン、例えば、CUBIおよびCUBI-EGFドメイン、ならびにセリン-プロテアーゼ活性部位を含む領域が、当技術分野で周知の方法を用いて組換えポリペプチドとして発現され、抗原として用いられてもよい。さらに、MASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO：2)の少なくとも6アミノ酸の部分を含むペプチドもまた、MASP-2抗体を誘導するのに有用である。抗体を産生させるのに用いられるMASP-2のペプチドおよびポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチドとして単離されてもよい。MASP-2抗体の作製において有用な抗原はまた、融合ポリペプチド、例えば、MASP-2ポリペプチドまたはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合も含む。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分がハプテン様であれば、このような部分は、免疫のために、都合よく、巨大分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイド)に接続または連結されてもよい。
ポリクローナル抗体
MASP-2に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて、動物をMASP-2ポリペプチドまたはその免疫原性部分で免疫することによって調製することができる。例えば、Green et al.,「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols(Manson, ed.)を参照されたい。MASP-2ポリペプチドの免疫原性は、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント(完全もしくは不完全)、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、KLHおよびジニトロフェノールを含むアジュバントを用いて高まることができる。ポリクローナル抗体は、典型的には、動物、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジにおいて産生される。または、本発明において有用なMASP-2抗体はまた、ヒトに近い霊長類に由来してもよい。ヒヒにおいて診断および治療に有用な抗体を産生するための一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.,国際特許公報WO91/11465、およびLosman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46：310 (1990)において見られ得る。次いで、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当技術分野において周知の標準的な手順を用いて、このような免疫動物の血液から生成される。
モノクローナル抗体
一部の態様において、MASP-2阻害抗体はMASP-2モノクローナル抗体である。上記のように、一部の態様において、MASP-2モノクローナル抗体は、単一のMASP-2エピトープに対して作られているので高度に特異的である。本明細書で使用する「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技法、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256：495 (1975)に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。または、モノクローナル抗体は、組換えDNA法(例えば、Cabillyに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作られてもよい。モノクローナル抗体は、Clackson, T., et al., Nature 352：624-628 (1991)、およびMarks, J.D., et al., J. Mol Biol. 222：581-597 (1991)に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスの抗体でよい。
例えば、モノクローナル抗体は、適切な哺乳動物(例えば、BALB/cマウス)に、MASP-2ポリペプチドまたはその一部を含む組成物を注射することによって得ることができる。予め決められた期間の後に、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞培地に懸濁する。次いで、脾臓細胞を不死細胞株と融合して、ハイブリドーマを形成する。形成されたハイブリドーマを細胞培養において増殖させ、MASP-2に対するモノクローナルを産生する能力についてスクリーニングする(Current Protocols in Immunology, Vol.1., John Wiley & Sons, 2.5.1-2.6.7頁, 1991も参照されたい)。
抗原曝露に反応して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニックマウスを用いて、ヒトモノクローナル抗体を得ることができる。この技法では、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の要素を、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系統に導入する。このトランスジェニックマウスは、ヒト抗原、例えば、本明細書に記載のMASP-2抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、従来のケーラー・ミルステイン技術を用いて、このような動物に由来するB細胞を適切なミエローマ細胞株と融合することによってヒトMASP-2抗体分泌ハイブリドーマを作製するのに使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、例えば、Green, L.L., et al., Nature Genet. 7：13, 1994； Lonberg, N., et al., Nature 368：856, 1994；およびTaylor, L.D., et al., Int. Immun. 6：579, 3994によって述べられている。
モノクローナル抗体は、十分に確立した様々な技法によってハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離法には、プロテインA Sepharoseを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる(例えば、Coliganの2.7.1-2.7.12頁および2.9.1-2.9.3頁； Baines et al., 「Purification of Immunoglobulin G(IgG)」, Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol.10, 79-104頁, 1992を参照されたい)。
ポリクローナル、モノクローナル、またはファージ由来抗体は、製造されたら、まず、MASP-2特異的結合に関して試験される。抗体がタンパク質抗原に結合するかどうかおよび/またはタンパク質抗原に対する抗体の親和性を決定するための方法は当技術分野において公知である。例えば、タンパク質抗原への抗体の結合は、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIAcore system； Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)または酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を含むが、これらに限定されない多種多様な技術を使用して検出および/または定量化することができる。例えば、Harlow and Lane (1988) "Antibodies：A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering： Methods and Protocols," Humana Press (ISBN：1588290921)； Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY； Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford； Johne et al. (1993), Immunol. Meth. 160：191-198； Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51：19-26；およびJonsson et al. (1991) Biotechniques 11：620-627を参照されたい。また、米国特許第6,355,245号も参照されたい。
MASP-2モノクローナル抗体の親和性は、当業者が容易に決定することができる(例えば、Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51：660-672, 1949を参照されたい)。一態様において、本発明の方法に有用なMASP-2モノクローナル抗体は、<100nM、好ましくは<10nMおよび最も好ましくは<2nMの結合親和性でMASP-2に結合する。
MASP-2に特異的に結合する抗体が同定されたら、いくつかの機能アッセイ法の1つにおいて、MASP-2阻害抗体として機能する能力に関してMASP-2抗体を試験する。例えば、MASP-2に特異的に結合する同定された抗体を、（例えば、レクチン特異性C4切断アッセイ法（例えば実施例1または実施例2に記載されるアッセイ法）またはC3b沈着アッセイ法（実施例4に記載されるアッセイ法））などのいくつかのアッセイ法の1つにおいて、MASP-2阻害抗体として機能する能力に関して試験する。
キメラ/ヒト化抗体
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびにこのような抗体の断片が含まれる(Cabillyに対する米国特許第4,816,567号；およびMorrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81：6851-6855, (1984))。
本発明において有用なキメラ抗体の一形態は、ヒト化モノクローナルMASP-2抗体である。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来する非ヒト(例えば、マウス)相補性決定領域(CDR)をヒト可変ドメインに導入することによって作製される。次いで、典型的に、非ヒト対応物のフレームワーク領域においてヒト抗体残基が代用される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能にさらに磨きをかけるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、Fvフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFvフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones, P.T, et al., Nature 321：522-525 (1986)； Reichmann, L., et al., Nature 332：323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2：593-596 (1992)を参照されたい。
本発明において有用なヒト化抗体には、少なくともMASP-2結合CDR3領域を含むヒトモノクローナル抗体が含まれる。さらに、IgA抗体またはIgM抗体ならびにヒトIgG抗体を作製するためにFc部分が交換されてもよい。このようなヒト化抗体は、ヒトMASP-2を特異的に認識するが、ヒトにおいて抗体それ自体に対する免疫応答を惹起しないので特に臨床において有用であると考えられる。その結果、このようなヒト化抗体は、ヒトでのインビボ投与に、特に、反復投与または長期投与が必要な場合により適している。
ヒト化モノクローナル抗体を作製するための技法は、例えば、Jones, P.T, et al., Nature 321：522, (1986)； Carter, P., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89：4285, 1992； Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12：437, (1992)； Singer, I.I., et al., J. Immun. 150：2844, (1993)； Sudhir(ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995)； Kelley, 「Engineering Therapeutic Antibodies」, Protein Engineering：Principles and Practice, Cleland et al.(eds.), John Wiley & Sons, Inc., 399-434頁, (1996)；およびQueen, (1997)に対する米国特許第5,693,762号にも記載されている。さらに、Protein Design Labs (Mountain View, CA)などの特定のマウス抗体領域からヒト化抗体を合成する事業実体がある。
組換え抗体
MASP-2抗体は組換え法を用いて作ることもできる。例えば、ヒト抗体断片(VH、VL、Fv、D因子、Fab、またはF(ab') 2)を作製するようにヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(例えば、Stratagene, Corp., La Jolla, CAから入手可能)を用いてヒト抗体を作ることができる。次いで、キメラ抗体の作製法に類似した技法を用いて、これらの断片を用いてヒト抗体全体を構築する。
抗イディオタイプ抗体
望ましい阻害活性を有するMASP-2抗体が同定されたら、これらの抗体を用いて、当技術分野において周知の技法を用いてMASP-2の一部に似ている抗イディオタイプ抗体を生成することができる。例えば、Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7：437 (1993)を参照されたい。例えば、MASP-2に結合し、補体活性化に必要とされるMASP-2タンパク質相互作用を完全に阻害する抗体を用いて、MASP-2タンパク質上のMBL結合部位に似ている、従って、MASP-2の結合リガンド、例えば、MBLに結合し、これを中和する抗イディオタイプを生成することができる。
免疫グロブリン断片
本発明の方法において有用なMASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、抗体断片から形成された、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体および三重特異性抗体)を含む周知の断片も包含する。
抗体とそのエピトープの結合には抗体分子の小さな部分であるパラトープしか関与しないことは当技術分野において周知である(例えば、Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986を参照されたい)。抗体のpFc'およびFc領域は古典的補体経路のエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。pFc'領域が酵素切断されている抗体、またはpFc'領域なしで作製されている抗体はF(ab')2断片と呼ばれ、インタクトな抗体の抗原結合部位を両方とも保持する。単離されたF(ab') 2断片は、その2つの抗原結合部位のために二価モノクローナル断片と呼ばれる。同様に、Fc領域が酵素切断されている抗体、またはFc領域なしで作製されている抗体はFab断片と呼ばれ、インタクトな抗体分子の抗原結合部位のうちの1つを保持する。
抗体断片は、従来の方法による抗体全体のタンパク質加水分解、例えば、ペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素切断して、F(ab') 2と呼ばれる5S断片を得ることによって作製することができる。この断片は、3.5S Fab'一価断片を生じるチオール還元剤を用いてさらに切断することができる。任意で、ジスルフィド結合を切断する、スルフヒドリル基のブロック基を用いて、切断反応を行うことができる。代替として、ペプシンを用いた酵素切断によって、2つの一価Fab断片および1つのFc断片が直接、生成される。これらの方法は、例えば、Goldenbergに対する米国特許第4,331,647号； Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 89：230 (1960)； Porter, R.R., Biochem, J. 73：119, (1959)； Edelman, et al., Methods in Enzymology 1：422, Academic Press (1967)；ならびにColiganの2.8.1-2.8.10頁および2.10.-2.10.4頁に記載されている。
一部の態様において、FcとFcγ受容体が結合すると開始する古典的補体経路の活性化を回避するためには、Fc領域の無い抗体断片を使用することが好ましい。Fcγ受容体相互作用を回避するモノクローナル抗体を作製することができる、いくつかの方法がある。例えば、モノクローナル抗体のFc領域をタンパク質分解酵素による部分消化(例えば、フィシン消化)を用いて化学的に除去し、それによって、例えば、抗原結合抗体断片、例えば、Fab断片またはF(ab) 2断片を生成することができる(Mariani, M., et al., Mol. Immunol. 28：69-71 (1991))。または、Fcγ受容体に結合しないヒトγ4 IgGアイソタイプを、本明細書に記載のようにヒト化抗体の構築中に使用することができる。Fcドメインの無い抗体、単鎖抗体、および抗原結合ドメインはまた、本明細書に記載の組換え法を用いて操作することもできる。
単鎖抗体断片
または、重鎖Fv領域および軽鎖Fv領域が連結されている、MASP-2に特異的なペプチド単鎖結合分子を作製することができる。Fv断片は、単鎖抗原結合タンパク質(scFv)を形成するようにペプチドリンカーで連結されてもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドで連結された、VHドメインをコードするDNAおよびVLドメインをコードするDNAを含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後に、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する1本のポリペプチド 鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow, et al.,「Methods：A Companion to Methods in Enzymology」2：97 (1991)； Bird, et al., Science 242：423 (1988)； Ladnerに対する米国特許第4,946,778号； Pack, P., et al., Bio/Technology 11：1271 (1993)に記載されている。
例示的な例として、MASP-2特異的scFvは、インビトロでリンパ球をMASP-2ポリペプチドに曝露し、(例えば、固定化または標識されたMASP-2タンパク質またはペプチドを使用することによって)ファージベクターまたは類似ベクターの中にある抗体ディスプレイライブラリーを選択することによって得ることができる。潜在的なMASP-2ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージまたは細菌、例えば、大腸菌にディスプレイされたランダムペプチドライブラリーをスクリーニングによって得ることができる。これらのランダムペプチドディスプレイライブラリーを用いて、MASP-2と相互作用するペプチドをスクリーニングすることができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするための技法は当技術分野において周知である(Lardnerに対する米国特許第5,223,409号； Ladnerに対する米国特許第4,946,778号； Ladnerに対する米国特許第5,403,484号； Ladnerに対する米国特許第5,571,698号；およびKay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)。このようなライブラリーをスクリーニングするためのランダムペプチドディスプレイライブラリーおよびキットは、例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, Calif.)、Invitrogen Inc.(San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc.(Beverly, Mass.)、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway, N.J.)から市販されている。
本発明のこの局面において有用なMASP-2抗体断片の別の形態が、MASP-2抗原上のエピトープに結合し、MASP-2依存性補体活性化（すなわちレクチン経路）を阻害する単一の相補性決定領域（CDR）をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、関心対象の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成することによって調製される（たとえば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991)；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, (1995)およびWard et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995を参照）。
本明細書に記載されるMASP-2抗体は、MASP-2依存性補体活性化を阻害するために、それを必要とする対象に投与される。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、エフェクター機能を低下させた高親和性ヒトまたはヒト化モノクローナルMASP-2抗体である。
薬学的組成物および送達法
投薬
別の局面において、本発明は、補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患または障害を患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象におけるMASP-2依存性補体活性化の有害作用を阻害するための組成物であって、それを必要とする対象におけるMASP-2依存性補体活性化を阻害するのに十分な治療量のMASP-2阻害抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、止血に影響することなく、抗凝固および／または抗血栓症および／または抗血栓形成を提供する。
MASP-2阻害抗体の毒性および治療有効性は、実験動物モデルを用いる標準的な薬学的手法によって決定することができる。このような動物モデルを使用して、NOAEL（無毒性量）およびMED（最小有効量）を標準的方法によって決定することができる。NOAEL効果とMED効果との用量比が治療可能比であり、比NOAEL/MEDとして表される。大きな治療可能比または指数を示すMASP-2阻害抗体がもっとも好ましい。細胞培養アッセイ法および動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための範囲の投与量を処方する際に使用することができる。MASP-2阻害抗体の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないMEDを含む循環濃度の範囲に入る。投与量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に依存して、この範囲内で変動し得る。
任意の複合製剤の場合、動物モデルを使用して治療有効量を推定することができる。たとえば、MEDを含む循環血漿濃度範囲を達成するための用量を動物モデルにおいて処方し得る。また、たとえば高速液クロマトグラフィーにより、血漿中のMASP-2阻害抗体の定量レベルを測定し得る。
また、毒性研究に加えて、生きた対象中に存在する標的MASP-2タンパク質の量およびMASP-2阻害抗体の結合親和性に基づいて有効投与量を推定し得る。
正常なヒト対象中のMASP-2レベルは、血清中、500ng/mLの範囲の低いレベルで存在することが示されており、特定の対象中のMASP-2レベルは、Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003)およびCsuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013)に記載されている、MASP-2のための定量アッセイ法を使用して測定することができる。
一般に、MASP-2阻害抗体を含む、投与される組成物の投与量は、対象の年齢、体重、身長、性別、一般的病状および既往歴などの要因に依存して異なる。例示として、MASP-2阻害抗体は、対象体重1kgあたり約0.010〜100.0mg、好ましくは0.010〜10mg、好ましくは0.010〜1.0mg、より好ましくは0.010〜0.1mgの投与量範囲で投与することができる。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、対象体重1kgあたり好ましくは約0.010〜10mg、好ましくは0.010〜1.0mg、より好ましくは0.010〜0.1mgの投与量範囲で投与される。所与の対象における本発明のMASP-2阻害組成物および方法の治療有効性ならびに適切な投与量は、当業者に周知の補体アッセイ法にしたがって決定することができる。補体は非常に多くの特異的産物を生成する。過去十年間に、小さな活性化断片C3a、C4a、およびC5aならびに大きな活性化断片iC3b、C4d、Bb、およびsC5b-9を含む、これらの活性化産物の大部分に関して高感度の特異的アッセイ法が開発され、かつ市販されている。これらのアッセイ法の大部分は、新たな抗原（ネオ抗原）と反応するモノクローナル抗体を用い、新たな抗原は、断片上に露出しているが、それが形成される天然タンパク質の上には露出していないものであり、このことがこれらのアッセイ法を非常に簡単かつ特異的にする。大部分はELISA技術に頼るが、C3aおよびC5aの場合、まだラジオイムノアッセイ法が使用されることもある。これらの後者のアッセイ法は、処理されていない断片、および循環中に見られる主な形態である、それらの「desArg」断片の両方を測定する。処理されていない断片およびC5adesArgは、細胞表面レセプターに結合することによって迅速に掃去され、したがって、非常に低い濃度でしか存在しないが、C3adesArgは細胞に結合せず、血漿中に蓄積する。C3aの測定は、高感度の経路非依存的な補体活性化指標を提供する。第二経路活性化は、Bb断片の測定および/またはD因子活性化の測定によって評価することができる。膜侵襲経路活性化の液相産物sC5b-9の検出が、補体が完全に活性化されているという証拠を提供する。レクチン経路および古典経路はいずれも同じ活性化産物C4aおよびC4dを生成するため、これらの2つの断片の測定は、これらの2つの経路のどちらが活性化産物を生成したかに関する任意の情報を提供しない。
MASP-2依存性補体活性化の阻害は、本発明の方法によるMASP-2阻害抗体の投与の結果として生じる補体系の成分における以下の変化のうちの少なくとも1つを特徴とする：MASP-2依存性補体活性化系の産物C4b、C3a、C5a、および/またはC5b-9（MAC）の生成または産生の阻害（例えば、米国特許第7,919,094号の実施例2に記載されているように測定）、C4切断およびC4b沈着の減少（例えば、実施例1または実施例2に記載されるように測定）またはC3切断およびC3b沈着の減少（例えば、実施例4に記載されるように測定）。
薬学的担体および送達ビヒクル
一般的に、本発明のMASP-2阻害物質組成物は、他の任意の選択された治療剤と組み合わされてもよく、適宜、薬学的に許容される担体中に含まれる。担体は、無毒で、生体適合性があり、MASP-2阻害物質(およびMASP-2阻害物質と組み合わされた他の任意の治療剤)の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaに対する米国特許第5,211,657号に記載されている。本明細書に記載される、本発明において有用なMASP-2抗体は、経口投与、非経口投与、または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形をした調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ(depository)、吸入剤、および注射剤に処方されてもよい。本発明はまた、医療装置などをコーティングすることによる組成物の局所投与も意図する。
注射、注入、または灌注、および局部送達を介した非経口送達に適した担体には、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、通常のリンガー液もしくは乳酸加リンガー液、デキストロース液、ハンクス液、またはプロパンジオールが含まれる。さらに、溶媒または分散媒として滅菌不揮発性油が使用されることもある。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の生体適合性油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸が注射液の調製において有用である。担体および作用物質は、液体、懸濁液、重合可能もしくは重合不可能なゲル、ペースト、または軟膏として配合されてもよい。
前記担体はまた、作用物質の送達を持続(すなわち、延長、遅延、もしくは調節)するために、または治療剤の送達、取り込み、安定性、もしくは薬物動態を増強するために送達ビヒクルを含んでもよい。このような送達ビヒクルは、非限定的な例として、タンパク質、リポソーム、炭水化物、合成有機化合物、無機化合物、ポリマーまたはコポリマーのヒドロゲル、およびポリマーミセルからなる、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよい。適切なヒドロゲルおよびミセル送達系には、WO2004/009664A2に開示されるPEO：PHB：PEOコポリマーおよびコポリマー/シクロデキストリン複合体、ならびに米国特許出願公開第2002/0019369A1号に開示されるPEOおよびPEO/シクロデキストリン複合体が含まれる。このようなヒドロゲルは目的の作用部位に局所に注射されてもよく、持効性デポーを形成するように皮下または筋肉内に注射されてもよい。
本発明の組成物は、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または吸入剤として送達されるために製剤化されてもよい。
関節内送達の場合、MASP-2阻害抗体は、注射可能な前記の液体担体もしくはゲル担体、注射可能な前記の持効性送達ビヒクル、またはヒアルロン酸もしくはヒアルロン酸誘導体の中に入れて運ばれてもよい。
局部投与の場合、MASP-2阻害抗体は、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、点眼薬、坐剤、スプレー、液体、もしくは粉末の中に入れて運ばれてもよく、ゲルまたはマイクロカプセル送達系の中に入れて経皮パッチを介して運ばれてもよい。
エアゾール剤、定量吸入器、ドライパウダー吸入器、およびネブライザーを含む様々な鼻送達系および肺送達系が開発中であり、それぞれ、エアゾール剤、吸入剤、または噴霧送達ビヒクルの中に入れて本発明の送達用に適切に適合化させることができる。
くも膜下腔内(IT)送達または脳室内(ICV)送達の場合、適切に滅菌した送達系(例えば、液体；ゲル、懸濁液など)を用いて、本発明の組成物を投与することができる。
本発明の組成物はまた、生体適合性の賦形剤、例えば、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、希釈剤、緩衝液、浸透促進剤、乳化剤、結合剤、増粘剤、調味料(経口投与の場合)を含んでもよい。
抗体およびペプチドのための薬学的担体
本明細書に記載されるMASP-2抗体に関してより具体的には、例示的な製剤を、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤に溶解した化合物の注射投与量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、MASP-2抗体を含む組成物中には、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。薬学的組成物のさらなる成分には、石油(例えば、動物由来、野菜由来、または合成由来の石油)、例えば、ダイズ油および鉱油が含まれる。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが注射液に好ましい液体担体である。
MASP-2抗体はまた、活性物質を徐放または拍動放出(pulsatile release)するように処方することができるデポー注射剤または移植片調製物の形で投与することができる。
投与の方法
MASP-2阻害抗体を含む薬学的組成物は、局所投与方法または全身投与方法が、治療されている状態に最も適しているかどうかに応じて多くのやり方で投与することができる。さらに、本発明の組成物を移植可能な医療装置の表面に、または移植可能な医療装置の中にコーティングまたは組み込むことによって、本発明の組成物を送達することができる。
全身送達
本明細書で使用する「全身送達」および「全身投与」という用語は、筋肉内(IM)投与経路、皮下投与経路、静脈内(IV)投与経路、動脈内投与経路、吸入投与経路、舌下投与経路、頬投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、鼻投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、および送達作用物質を1つまたは複数の目的の治療作用部位に効果的に分散させる他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むが、これに限定されないことが意図される。本組成物の好ましい全身送達経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、動脈内経路、および吸入経路が含まれる。本発明の特定の組成物において用いられる選択された作用物質の正確な全身投与経路は、一つには、ある特定の投与経路に関連した代謝変換経路に対する作用物質感受性を説明するように決定されることが理解されると考えられる。例えば、ペプチド物質は最も適切には、経口以外の経路によって投与することができる。
本明細書に記載されるMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に任意の適切な手段によって送達することができる。MASP-2抗体およびポリペプチドの送達方法は、経口投与経路、肺投与経路、非経口投与経路(例えば、筋肉内投与経路、腹腔内投与経路、静脈内(IV)投与経路、もしくは皮下注射投与経路)、吸入投与経路(例えば、細粉製剤を介した吸入投与経路)、経皮投与経路、鼻投与経路、腟投与経路、直腸投与経路、または舌下投与経路を含み、それぞれの投与経路に適した剤形で処方することができる。
代表的な例として、ポリペプチドを吸収することができる身体の膜、例えば、鼻、胃腸、および直腸の膜に適用することによって、MASP-2阻害抗体を生体内に導入することができる。ポリペプチドは典型的には浸透促進剤と共に吸収性の膜に適用される(例えば、Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5：69 (1988)； Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13：213 (1990)； Lee, V.H.L,, Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York(1991)； DeBoer, A.G., et al., J. Controlled Release 13：241 (1990)を参照されたい)。例えば、STDHFは、胆汁塩と構造が類似し、鼻送達用の浸透促進剤として用いられてきたステロイド性界面活性剤であるフシジン酸合成誘導体である(Lee, W.A., Biopharm. 22, Nov./Dec. 1990)。
酵素分解からポリペプチドを保護するために、本明細書に記載されるMASP-2阻害抗体を脂質などの別の分子と結合させて導入することができる。例えば、ある特定のタンパク質を体内の酵素加水分解から保護し、従って、半減期を延長するために、ポリマー、特にポリエチレングリコール(PEG)の共有結合が用いられてきた(Fuertges, P., et al., J. Controlled Release 11：139 (1990))。タンパク質送達のための多くのポリマー系が報告されている(Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9：271 (1989)； Hori, R., et al., Pharm. Res. 6：813 (1989)：Yamakawa, L, et al., J. Pharm. Sci. 79：505 (1990)； Yoshihiro, I., et al., Controlled Release 10：195 (1989)； Asano, M., et al., J. Controlled Release 9：111 (1989)； Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9：195 (1989)； Makino, K., J. Controlled Release 12：235 (1990)； Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78：117 (1989)； Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci. 78：219 (1989))。
最近、血清安定性および循環半減期が改善したリポソームが開発された(例えば、Webbに対する米国特許第5,741,516号を参照されたい)。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製の様々な方法が詳しく調べられている(例えば、Szokaに対する米国特許第5,567,434号；Yagiに対する米国特許第5,552,157号；Nakamoriに対する米国特許第5,565,213号；Shinkarenkoに対する米国特許第5,738,868号；およびGaoに対する米国特許第5,795,587号を参照されたい)。
経皮適用の場合、本明細書に記載されるMASP-2阻害抗体は担体および/またはアジュバントなどの他の適切な成分と組み合わされてもよい。目的の投与のために薬学的に許容されなければならなず、組成物の活性成分の活性を分解することができないことを除けば、このような他の成分がどういったものかには制限はない。適切なビヒクルの例には、精製コラーゲンを含む、または含まない、軟膏、クリーム、ゲル、または懸濁液が含まれる。MASP-2阻害抗体はまた、好ましくは、液体または半液体の形で、経皮パッチ、硬膏、および包帯に含浸されてもよい。
本発明の組成物は、望ましいレベルの治療効果を維持するよう決定された間隔で定期的に全身投与されてもよい。例えば、組成物は、例えば皮下注射によって、2〜4週間ごとにまたはそれより少ない頻度で、投与されてもよい。投与レジメンは、作用物質の組み合わせの作用に影響を及ぼし得る様々な要因を考慮して医師によって決定されると考えられる。これらの要因は、治療されている状態の進行の程度、患者の年齢、性別、および体重、ならびに他の臨床要因を含むと考えられる。それぞれの個々の作用物質の投与量は、組成物に含まれるMASP-2阻害抗体、ならびに任意の薬物送達ビヒクル(例えば、持効性送達ビヒクル)の存在および内容の関数として変化すると考えられる。さらに、送達作用物質の投与頻度および薬物動態学的挙動における変動の原因となるように投与量を調節することができる。
局所送達
本明細書で使用する「局所」という用語は、目的の限局作用の部位の中に、または目的の限局作用の部位の周囲に薬物を適用することを包含し、例えば、皮膚または他の患部組織への局部送達、眼送達、くも膜下腔内(IT)、脳室内(ICV)、関節内、洞内、頭蓋内、もしくは小胞内の投与、留置、または灌注を含んでもよい。局所投与は、低用量の投与が全身副作用を回避するために、ならびに局所送達部位に活性物質を送達および濃縮するタイミングをより正確に制御するために好ましい場合がある。局所投与は、代謝、血流などの患者間のばらつきに関係なく標的部位において既知濃度を供給する。改善された投与量制御は直接的な送達方法によっても提供される。
MASP-2阻害抗体の局所送達は、疾患または状態を治療するための外科的方法の状況において、例えば、動脈バイパス手術、アテレクトミー、レーザー処置、超音波処置、バルーン血管形成術、およびステント留置などの処置中に実現することができる。例えば、バルーン血管形成術と共にMASP-2阻害抗体を対象に投与することができる。バルーン血管形成術は、収縮したバルーンを有するカテーテルを動脈に挿入することを伴う。収縮したバルーンはアテローム性動脈硬化巣の近くに配置され、プラークが血管壁に押しつけられるように膨張される。結果として、バルーン表面は血管の表面にある血管内皮細胞の層と接触する。MASP-2阻害抗体は、アテローム性動脈硬化巣の部位に該物質を放出できるようにバルーン血管形成術カテーテルに取り付けられてもよい。該物質は、当技術分野において公知の標準的な手順に従ってバルーンカテーテルに取り付けることができる。例えば、バルーンが膨張されるまで、該物質はバルーンカテーテルの一区画に保管されてもよく、膨張時に該物質は局所環境に放出される。または、バルーンが膨張された場合に、該物質は動脈壁細胞と接触するようにバルーン表面に含浸されてもよい。該物質はまた、穴のあいたバルーンカテーテル、例えば、Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85：1110-1117 (1992)に開示される穴のあいたバルーンカテーテルの中に入れて送達されてもよい。治療用タンパク質をバルーン血管形成術カテーテルに取り付けるための例示的な手順については、公開されたPCT出願WO95/23161も参照されたい。同様に、MASP-2阻害抗体は、ステントに適用されるゲルまたはポリマーコーティングの中に含まれてもよく、血管留置後にステントがMASP-2阻害抗体を溶出するようにステント材料に組み込まれてもよい。
治療レジメン
予防的用途において、薬学的組成物は、本明細書に記載される補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患または障害に罹りやすい対象またはそうでなければそれの危険を有する対象に対し、前記状態の症状を発症する危険を除くのにまたは減らすのに十分な量で投与される。治療的用途において、薬学的組成物は、本明細書に記載される補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／または接触系の関連する活性化と関連する疾患または障害が疑われる対象、またはすでにそれを患っている対象に対し、該状態の症状を軽減するのにまたは少なくとも部分的に緩和するのに十分な治療有効量で投与される。
補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患または障害の治療、予防、またはその重症度の軽減のための予防レジメンと治療レジメンの両方において、薬学的組成物は、対象において十分な治療結果が達成されるまで、いくつかの投与量で投与され得る。本発明の1つの態様において、MASP-2阻害抗体は、成人患者（たとえば体重70kgの平均的成人）に対し、0.1mg〜10,000mg、より好適には1.0mg〜5,000mg、より好適には10.0mg〜2,000mg、より好適には10.0mg〜1,000mg、さらに好適には50.0mg〜500mgまたは10〜200mgの投与量で投与され得る。小児患者の場合、投与量は、患者の体重に比例して調節することができる。
本発明の治療組成物の適用は、組成物（たとえば、MASP-2阻害抗体を含む単一の組成物）の単回投与または限られた回数の連続投与によって実施され得る。あるいはまた、組成物は、最適な治療効果のために、医師による決定にしたがって、長期間にわたり一定の間隔で、たとえば毎日、週二回、毎週、隔週、毎月、または隔月、投与されてもよい。
前記にしたがって、本発明は以下の態様を特徴とする。
1. 補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患、障害、または状態を予防、軽減、ならびに／または治療する方法であって、治療量のMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、該方法。
2. 前記それを必要とする対象が、
補体関連性炎症、フィブリンもしくは活性化血小板によって開始される過度な凝固もしくは接触系活性化と関連する、疾患、障害、もしくは状態を患っているか、または
該疾患、障害、もしくは状態を発症する危険を有する、
項目1の方法。
3. 前記対象が、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植および／もしくは介入的心血管処置（たとえば血管形成術もしくはステント留置）後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂、プラーク不安定、再狭窄、低血圧症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、全身性炎症反応症候群（SIRS）、播種性血管内凝固症候群（DIC）、静脈閉塞症（VOD）、鎌状赤血球症、血栓性微小血管障害、ループス腎炎、表在性血栓性静脈炎、第V因子ライデン変異、虚血／再灌流障害、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ホルモン補充量療法（HRT）を受けていること、アルツハイマー病からなる群より選択される疾患または障害を患っており、かつ／または凝固亢進状態を患っている、項目2の方法。
4. 前記対象が、5-FU、GM-CSF、シスプラチン、ヘパリン、COX-2阻害因子、造影剤、コルチコステロイド、および抗精神病薬からなる群より選択される薬物による治療を受けていること、静脈うっ血（不動化、手術など）、抗リン脂質症候群、がん（前骨髄球性白血病、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、および結腸腫瘍）、外傷もしくは手術による組織損傷、中央静脈中のカテーテルの存在、凝血塊形成に関与するタンパク質（たとえばプロテインC）の後天性欠損、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、ホモシステインレベルの上昇、心不全、機械弁の存在、インサイチュ血栓を伴う肺高血圧症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少症（HITT）、インサイチュ血栓を伴う川崎病、インサイチュ血栓を伴う高安動脈炎、転移性がんのトロンボフィリア、第VIII因子レベルの上昇、妊娠、ならびに炎症性腸疾患（IBD）のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、項目3の方法。
5. 前記対象が、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、項目1の方法。
6. カリクレイン阻害因子による治療に適している前記疾患または障害が、遺伝性血管浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および心肺バイパス術中の出血からなる群より選択される、項目5の方法。
7. 前記対象が、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患または障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、項目1の方法。
8. トロンビン阻害因子による治療に適している前記疾患または障害が、動脈血栓症、静脈血栓症、肺塞栓症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症、ある抗凝固薬から別の抗凝固薬への切り替え、および重篤HIT患者における体外循環回路開存性のための持続的腎代替療法（CRRT）の適応外使用（維持）からなる群より選択される、項目7の方法。
9. 前記対象が、心房細動を以前に経験したことがあるか、それを現在患っているか、またはそれを発症する危険を有し、かつ前記MASP-2阻害抗体が、該対象における発作の危険を減らすのに十分な量で投与される、項目1の方法。
10. 前記対象が、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、項目1の方法。
11. 第XII因子阻害因子による治療に適している前記疾患または障害が、深部静脈血栓症（一次予防と長期治療の両方）、肺塞栓症、非弁膜症性心房細動、心房細動を有するまたは有さない対象における急性冠症候群後の再発性虚血の予防、末期腎臓病、脳虚血、狭心症からなる群より選択され、医療機器（たとえば弁、微小口径移植片など）および／または体外循環回路と関連する凝固を減少させるかまたは防止する、項目10の方法。
12. 前記対象が、非弁膜症性心房細動を以前に経験したことがあるか、現在それを患っているか、またはそれを発症する危険を有し、かつ前記MASP-2阻害抗体が、該対象における発作および／または塞栓形成の危険を減らすのに十分な量で投与される、項目1の方法。
13. 前記対象が、凝固亢進状態を生じさせる遺伝子異常、またはそれを発症する危険を高める遺伝子異常を有する、項目3の方法。
14. 前記遺伝子異常が、プロトロンビン20210遺伝子変異、MTHFR変異、プロテインCの欠損、プロテインSの欠損、プロテインAの欠損、プロテインZの欠損、アンチトロンビン欠損、およびトロンボフィリアを生じさせる遺伝子障害からなる群より選択される、項目13の方法。
15. 前記対象が、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患、障害、または状態を有する、項目1の方法。
16. 前記血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、抗リン脂質抗体、がん、高ホモシステイン血症、感染症、組織損傷、静脈うっ血（たとえば、手術、整形外科的もしくは麻痺的不動化、心不全、妊娠、または肥満による）、および、対象がエストロゲン含有経口避妊薬を服用することからなる群より選択される、項目15の方法。
17. 前記がんが、前骨髄球性白血病、肺、乳房、前立腺、膵臓、胃、および結腸からなる群より選択される、項目16の方法。
18. 前記対象が抗凝固薬療法を必要とし、かつ前記MASP-2阻害抗体が、標準的な抗凝固薬療法（たとえばワーファリン）の代替法として使用される、項目1の方法。
19. 前記対象が、標準的な抗凝固薬療法を通常禁じる状態、たとえばCNSアミロイド血管症を有する、項目18の方法。
20. 前記MASP-2阻害抗体が、そうでなければ標準的な抗凝固療法を受けている対象にブリッジング剤として術前投与される、項目18の方法。
21. 前記MASP-2阻害物質が、SEQ ID NO: 5の一部分に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、項目1〜20のいずれかの方法。
22. 前記MASP-2抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、項目21の方法。
23. 前記MASP-2阻害抗体が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される抗体断片である、項目21の方法。
24. 前記MASP-2阻害抗体が一本鎖分子である、項目21の方法。
25. 前記MASP-2阻害抗体が、IgG1分子、IgG2分子、およびIgG4分子からなる群より選択される、項目21の方法。
26. 前記IgG4分子がS228P変異を含む、項目25の方法。
27.前記MASP-2阻害抗体が古典的経路を実質的に阻害しない、項目1〜26のいずれかの方法。
28. MASP-2阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、
（a）（i）SEQ ID NO:6の31〜35位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1；および（ii）SEQ ID NO:6の50〜65位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2；および（iii）SEQ ID NO:6の95〜107位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域と、
（b）（i）SEQ ID NO:7の24〜34位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1；および（ii）SEQ ID NO:7の50〜56位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2；および（iii）SEQ ID NO:7の89〜97位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域と
を含む、項目1〜27のいずれかの方法。
29. MASP-2阻害モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:6として記載される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:7として記載される軽鎖可変領域とを含む、項目1〜28のいずれかの方法。
30. 前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:6に記載される重鎖可変領域とSEQ ID NO:7に記載される軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、項目1〜27のいずれかの方法。
XXI. 実施例
以下の実施例は、本発明の実施について意図された最良の態様(best mode)の単なる例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書中の全ての文献引用が明確に参照により組み入れられる。
実施例1
本実施例は、ヒトMASP-2ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を生成するための例示的方法を記載する。
1. MASP-2抗体を生成するための方法
8〜12週齢のオスA/Jマウス（Harlan, Houston, Tex.）に、pH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)200μl中、完全フロイントアジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Mich.）中のヒト完全長ポリペプチド：rMASP-2（SEQ ID NO：2）またはその抗原断片100μgを皮下注射する。2週間後、不完全フロイントアジュバント中の同じヒトポリペプチド50μgをマウスに皮下注射する。6週目、PBS中の同じヒトポリペプチド50μgをマウスに注射し、4日後に融合させる。
各融合について、免疫化マウスの脾臓から単細胞懸濁液を調製し、Sp2/0ミエローマ細胞との融合に使用する。50％ポリエチレングリコール（M.W.1450）（Kodak, Rochester, N.Y.）および5％ジメチルスルホキシド（Sigma Chemical Co., St. Louis. Mo.）を含有する培地中、5×108個のSp2/0および5×108個の脾臓細胞を融合させる。次いで、10％ウシ胎児血清、100単位/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、0.1mMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリンおよび16μMチミジンで補充したIscove培地（Gibco, Grand Island, N.Y.）中、細胞を懸濁液200μlあたり脾臓細胞1.5×105個の濃度まで調節する。細胞懸濁液200マイクロリットルを、約20の96ウェルマイクロ培養プレートに含まれた各ウェルに加える。約10日後、精製した標的MASP-2または抗原断片との反応性に関してELISAアッセイ法においてスクリーニングするために培養上清を回収する。
ELISAアッセイ法：50ng/mLの精製hMASP-2 50μlを室温で一晩加えることによってImmulon 2（Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.）マイクロテストプレートのウェルをコーティングする。コーティングに使用されるMASP-2の低い濃度が高親和性抗体の選択を可能にする。プレートを軽くたたくことによってコーティング溶液を除去したのち、非特異的部位をブロッキングするために、PBS中BLOTTO（無脂肪ドライミルク）200μlを各ウェルに1時間加える。次いで、1時間後、ウェルを緩衝液PBST（0.05％ Tween20を含有するPBS）で洗浄する。各融合ウェルからの培養上清（50uL）をBLOTTO 50μlと混合したのち、マイクロテストプレートの個々のMASP-2コーティングされたウェルに加える。1時間のインキュベーションののち、ウェルをPBSTで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG（Fc特異的）（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.）を加えることによってMASP-2に結合する抗体を検出する。HRPコンジュゲート化抗マウスIgGは、適切なSN比を提供するようにBLOTTO中で適切に希釈し、各試料含有ウェルに加える。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液を用いて結合HRPコンジュゲート化抗体を検出する。発色のために、0.1％ 3,3,5,5テトラメチルベンジジン（Sigma, St. Louis, Mo.）および0.0003％過酸化水素(Sigma)を含有するペルオキシダーゼ基質溶液を30分間ウェルに加える。1ウェルあたり50μlの2M H2SO4を加えることによって反応を停止させ、反応混合物の450nmでの光学密度をBioTek ELISA Reader（BioTek Instruments, Winooski, Vt.）によって測定する。
結合アッセイ法：
前記のMASP-2 ELISAアッセイ法の試験において陽性と判定された培養上清を、MASP-2に対してMASP-2阻害抗体が有する結合親和性を決定するために結合アッセイ法において試験することができる。阻害物質が補体系の他の抗原に結合するかどうか判定するために類似アッセイ法も使用することができる。
ポリスチレンマイクロタイタープレートウェル(96ウェル培地結合プレート, Corning Costar, Cambridge, MA)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)pH7.4に溶解したMASP-2(20ng/100μl/ウェル, Advanced Research Technology, San Diego, CA)で4℃において一晩コーティングする。MASP-2溶液を吸引した後に、ウェルを、1％ウシ血清アルブミン(BSA； Sigma Chemical)を含有するPBSで室温において2時間ブロッキングする。MASP-2コーティングのないウェルはバックグラウンド対照として役立つ。BSA PBSブロッキング溶液に溶解した様々な濃度のハイブリドーマ上清または精製MASP-2 MoAbのアリコートをウェルに添加する。室温で2時間のインキュベーション後に、ウェルをPBSで大規模にリンスする。ブロッキング溶液に溶解したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Sigma Chemical)を添加し、室温で1時間インキュベートすることによって、MASP-2に結合したMASP-2 MoAbを検出する。プレートをPBSで徹底的に再度リンスし、100μlの3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)を添加する。TMBの反応を、100μlの1Mリン酸を添加することによってクエンチし、プレートをマイクロプレートリーダー(SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)において450nmで読み取る。
次いで、陽性ウェルからの培養上清を、機能アッセイ法、例えば、本明細書に記載されるC4切断アッセイ法(実施例2)において補体活性化を阻害する能力について試験する。次いで、陽性ウェル中の細胞を限界希釈によってクローニングする。MoAbを、前記のようにELISAアッセイ法においてhMASP-2との反応性について再試験する。選択されたハイブリドーマをスピナーフラスコの中で増殖させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる抗体精製のために、使用済みの培養上清を収集する。
MASP-2抗体は、例えば実施例2に記載されるようなC4切断アッセイ法において、レクチン経路阻害活性に関してアッセイされ得る。
実施例2
本実施例は、L-フィコリン/P35、H-フィコリン、M-フィコリン、またはマンナンを介したMASP-2依存性補体活性化を遮断することができるMASP-2阻害物質を同定するための機能スクリーニングとして用いられるインビトロC4切断アッセイ法について述べる。
C4切断アッセイ法：C4切断アッセイ法は、Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257：107, 2001によって述べられており、L-フィコリンに結合する黄色ブドウ球菌におけるリポテイコ酸(LTA)に起因するレクチン経路活性化を測定する。
試薬：ホルマリン固定黄色ブドウ球菌(DSM20233)を以下のように調製する。細菌をトリプティックソイ血液培地中で37℃において一晩増殖させ、PBSで3回洗浄し、次いで、PBS/0.5％ホルマリン中で室温において1時間固定し、PBSでさらに3回洗浄した後に、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH9.6)に再懸濁する。
アッセイ法：Nunc MaxiSorbマイクロタイタープレート(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)のウェルを、コーティング緩衝液に溶解した1μgのL-フィコリンと共に、コーティング緩衝液に溶解した100μlのホルマリン固定黄色ブドウ球菌DSM20233(OD550=0.5)でコーティングする。一晩のインキュベーション後、ウェルを、TBS(10mM Tris-HCl、140mM NaCl pH7.4)に溶解した0.1％ヒト血清アルブミン(HSA)でブロッキングし、次いで、0.05％Tween20および5mM CaCl2を含有するTBS(洗浄液緩衝液)で洗浄する。ヒト血清試料を、内因性C4の活性化を阻止し、C1複合体(C1q、C1r、およびC1sからなる)を解離する、20mM Tris-HCl、1M NaCl、10mM CaCl2、0.05％Triton X-100、0.1％HSA、pH7.4で希釈する。MASP-2 MoAbを含むMASP-2阻害物質を様々な濃度で血清試料に添加する。希釈試料をプレートに添加し、4℃で一晩インキュベートする。24時間後、プレートを洗浄緩衝液で徹底的に洗浄する。次いで、100μlの4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH7.4に溶解した、0.1μgの精製ヒトC4(Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223：46, 1993に記載のように入手した)を各ウェルに添加する。37℃で1.5時間後に、プレートを再洗浄し、C4b沈着をアルカリホスファターゼ結合ニワトリ抗ヒトC4c(Immunsystem, Uppsala, Swedenから入手した)を用いて検出し、比色分析基質ρ-ニトロフェニルリン酸を用いて測定する。
マンナン上でのC4アッセイ法：MBLを介したレクチン経路活性化を測定するために、プレートをLSPおよびマンナンでコーティングした後に、様々なMASP-2阻害物質と混合した血清を添加することによって、前記のアッセイ法を適合化させる。
H-フィコリン(Hakata Ag)上でのC4アッセイ法：H-フィコリンを介したレクチン経路活性化を測定するために、プレートをLSPおよびH-フィコリンでコーティングした後に、様々なMASP-2阻害物質と混合した血清を添加することによって、前記のアッセイ法を適合化させる。
実施例3
以下のアッセイ法を用いて、免疫複合体によって古典経路が開始する条件下でMASP-2阻害抗体の効果を分析することによって、MASP-2阻害抗体が古典経路を遮断するかどうか試験する。
方法：免疫複合体によって古典経路が開始する補体活性化の状態に対するMASP-2阻害抗体の効果を試験するために、90％NHSを含有する3つ組の試料50μlを、10μg/mL免疫複合体またはPBSの存在下で37℃においてインキュベートする。37℃でのインキュベーション中に、200nM抗プロペルジンモノクローナル抗体を含有する3つ組の対応する試料(+/-免疫複合体)も含める。37℃で2時間のインキュベーション後に、さらなる補体活性化を止めるために、13mM EDTAを全ての試料に添加し、すぐに、試料を5℃まで冷却する。次いで、試料を-70℃で保管した後に、ELISAキット(Quidelカタログ番号A015およびA009)を用いて製造業者の説明書に従って補体活性化産物(C3aおよびsC5b-9)をアッセイする。
実施例4
本実施例は、MASP-2活性を遮断する高親和性MASP-2 Fab2抗体断片の同定について述べる。
背景および原理：MASP-2は、MBLおよびフィコリンの結合部位、セリンプロテアーゼ触媒部位、タンパク質分解基質C2の結合部位、タンパク質分解基質C4の結合部位、MASP-2酵素前駆体自己活性化のためのMASP-2切断部位、ならびに2つのCa++結合部位を含む、多くの別個の機能ドメインを有する複合タンパク質である。高親和性でMASP-2に結合するFab2抗体断片を同定し、同定されたFab2断片がMASP-2機能活性を遮断できるかどうか判定するために機能アッセイ法において試験した。
MASP-2機能活性を遮断するためには、抗体またはFab2抗体断片は、MASP-2機能活性に必要とされるMASP-2上の構造エピトープに結合しかつこれを妨害しなければならない。従って、MASP-2機能活性に直接関与するMASP-2上の構造エピトープに結合しないのでなければ、高親和性結合MASP-2 Fab2の多くまたは全てがMASP-2機能活性を阻害しない可能性がある。
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を用いて、MASP-2 Fab2の「遮断活性」を評価した。レクチン経路におけるMASP-2の最も重要な生理学的役割は、レクチンによって媒介される補体経路の次の機能成分、すなわち、レクチン経路C3コンバターゼを生成することであることが公知である。レクチン経路C3コンバターゼは、C3をC3aおよびC3bにタンパク分解によって切断する重要な酵素複合体(C4bC2a)である。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2の機能活性が必要とされる。さらに、MASP-2がレクチン経路C3コンバターゼを生成するためには、前記で列挙されたMASP-2の別個の機能活性の全てが必要であるように見える。これらの理由で、MASP-2 Fab2の「遮断活性」の評価において使用するための好ましいアッセイ法は、レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法だと考えられる。
高親和性Fab2の生成：ヒト軽鎖抗体可変配列および重鎖抗体可変配列のファージディスプレイライブラリー、ならびに関心対象の選択されたリガンドと反応するFab2を同定するための自動抗体選択技術を用いて、ラットMASP-2タンパク質(SEQ ID NO：5)に対する高親和性Fab2を作製した。抗体スクリーニングのために、既知量のラットMASP-2(約1mg、＞85％純粋)タンパク質を用いた。親和性が最も高い抗体を選択するために3回の増幅を用いた。ELISAスクリーニングのために、抗体断片を発現する約250種類の異なるヒットを選んだ。この後に、異なる抗体のユニークさ(uniqueness)を決定するために高親和性ヒットを配列決定した。
50個のユニークなMASP-2抗体を精製し、それぞれの精製Fab2抗体250μgを、以下でさらに詳述するように、MASP-2結合親和性の特徴決定および補体経路の機能試験に使用した。
MASP-2 Fab2の阻害(遮断)活性の評価に用いられるアッセイ法
1. レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法：
背景：レクチン経路C3コンバターゼは、C3を2つの強力な炎症誘発断片であるアナフィラトキシンC3aおよびオプソニンC3bにタンパク分解によって切断する酵素複合体(C4bC2a)である。C3コンバターゼの形成は、炎症を媒介する点でレクチン経路の重要な段階であると考えられる。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。従って、MASP-2抗体(またはFab2)は、既にあるC3コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要とされる。従って、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 Fab2(すなわち、遮断MASP-2 Fab2)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法ではC3がC3コンバターゼによって切断されると、C3b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出が容易になる。
酵母マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子である。C3コンバターゼ形成を測定する以下の方法では、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを希釈ラット血清と37℃で30分間インキュベートして、レクチン経路を活性化した。次いで、ウェルを洗浄し、標準的なELISA法を用いて、ウェル上に固定化されたC3bについてアッセイした。このアッセイ法において生成されたC3bの量は、レクチン経路C3コンバターゼの新規形成を直接反映するものである。このアッセイ法では、選択された濃度のMASP-2 Fab2がC3コンバターゼ形成を阻害し、その結果として起きるC3b生成を阻害する能力を試験した。
方法：
96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、200μl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100μl/ウェルの1％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。MASP-2 Fab2試料を、5℃で、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。0.5％ラット血清を5℃で前記試料に添加し、100μlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体活性化を可能にするために37℃水浴中で30分間インキュベートした。37℃水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05％Tween20を含むPBS)で200μlで5回洗浄し、次いで、200μlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した100μl/ウェルの一次抗体(ウサギ抗ヒトC3c、DAKO A0062)1：10,000希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを5回200μlのPBSで洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルの二次抗体(ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG, American Qualex A102PU)1：10,000希釈液を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルをPBSで200μlで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で10分間インキュベートした。100Tl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
2. MASP-2依存性C4切断の阻害を測定するためのアッセイ法：
背景：MASP-2のセリンプロテアーゼ活性は高度に特異的であり、MASP-2のタンパク質基質はC2およびC4の2種類しか同定されていない。C4の切断によってC4aおよびC4bが生成される。MASP-2 Fab2は、C4切断に直接関与するMASP-2上の構造エピトープ(例えば、C4のMASP-2結合部位；MASP-2セリンプロテアーゼ触媒部位)に結合し、それによって、MASP-2のC4切断機能活性を阻害する可能性がある。
酵母マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子である。MASP-2のC4切断活性を測定する以下の方法では、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを希釈ラット血清と37℃で30分間インキュベートして、レクチン経路を活性化した。このELISA法において用いられる一次抗体はヒトC4しか認識しないので、希釈ラット血清にヒトC4(1.0μg/mL)も補充した。次いで、ウェルを洗浄し、標準的なELISA方法を用いて、ウェルに固定化されたヒトC4bについてアッセイした。このアッセイ法において生成されたC4bの量はMASP-2依存性C4切断活性の尺度である。このアッセイ法では、選択された濃度のMASP-2 Fab2がC4切断を阻害する能力を試験した。
方法：96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1.0Tg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。200μl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100μl/ウェルの1％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。MASP-2 Fab2試料を、5℃で、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。これらの試料に1.0μg/mL/ヒトC4(Quidel)も含めた。前記試料に0.5％ラット血清を5℃で添加し、100μlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体を活性化するために37℃水浴中で30分間インキュベートした。37℃水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05％Tween20を含むPBS)で200μlで5回洗浄した。次いで、各ウェルを200μlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルのビオチン結合ニワトリ抗ヒトC4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)1：700希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。2.0mg/mL BSAを含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルの0.1μg/mLのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(Pierce Chemical#21126)を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で16分間インキュベートした。100μl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
3. 抗ラットMASP-2 Fab2と「天然」ラットMASP-2との結合アッセイ法
背景：MASP-2は、通常、特異的レクチン分子(マンノース結合タンパク質(MBL)およびフィコリン)も含むMASP-2二量体複合体として血漿中に存在する。従って、MASP-2 Fab2と生理学的に関連する形態のMASP-2との結合の研究に興味があるのであれば、精製組換えMASP-2ではなく、Fab2と血漿中の「天然」MASP-2との相互作用が用いられる結合アッセイ法を開発することが重要である。この結合アッセイ法では、最初に、10％ラット血清に由来する「天然」MASP-2-MBL複合体をマンナンコーティングウェルに固定化した。次いで、標準的なELISA法を用いて、固定化「天然」MASP-2に対する様々なMASP-2 Fab2の結合親和性を研究した。
方法：96ウェルCostar High Bindingプレートを、1μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。200μlのPBSで各ウェルを3回洗浄した。ウェルを100μl/ウェルの、PBST(0.05％Tween20を含むPBS)に溶解した0.5％無脂肪ドライミルクでブロッキングし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのTBS/Tween/Ca++洗浄緩衝液(5.0mM CaCl2を含有するTris緩衝食塩水、0.05％Tween20、pH7.4)で3回洗浄した。High Salt Binding Buffer(20mM Tris、1.0M NaCl、10mM CaCl2、0.05％Triton-X100、0.1％(w/v)ウシ血清アルブミン、pH7.4)に溶解した10％ラット血清を氷上で調製した。100μl/ウェルを添加し、5℃で一晩インキュベートした。ウェルを200μlのTBS/Tween/Ca++洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、ウェルを200μlのPBSで2回洗浄した。Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)で希釈した100μl/ウェルの選択された濃度のMASP-2 Fab2を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含むPBSで1：5000に希釈した100μl/ウェルのHRP結合ヤギ抗Fab2(Biogenesisカタログ番号0500-0099)を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを200μlのPBSで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で70分間インキュベートした。100μl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
結果：
ELISAスクリーニングのために、高親和性でラットMASP-2タンパク質と反応した約250個の異なるFab2を選んだ。異なる抗体のユニークさを決定するために、これらの高親和性Fab2を配列決定した。さらなる分析のために、50個のユニークなMASP-2抗体を精製した。それぞれの精製Fab2抗体250μgを、MASP-2結合親和性の特徴決定および補体経路の機能試験に使用した。この分析の結果を以下の表2に示した。
（表２）レクチン経路補体活性化を遮断するMASP-2 FAB2
Figure 2021527698
表2に示したように、試験した50個のMASP-2 Fab2のうち17個が、10nM Fab2に等しいかまたは10nM Fab2未満のIC50でC3コンバターゼ形成を強力に阻害するMASP-2遮断Fab2であると同定された(34％の陽性ヒット率)。17個のFab2のうち8個のIC50はnM以下の範囲である。さらに、表2に示したMASP-2遮断Fab2のうち17個全てが、レクチン経路C3コンバターゼアッセイ法においてC3コンバターゼ形成の本質的に完全な阻害を示した。それぞれのMASP-2分子がFab2に結合している場合でも、「遮断」Fab2がMASP-2機能をほんのわずかにしか阻害しない場合があるのは理論上可能なので、これは重要な考慮事項である。
マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子であるが、ラット血清中に抗マンナン抗体が存在することでも古典経路が活性化し、古典経路C3コンバターゼを介してC3bが生成され得ることも理論上可能である。しかしながら、本実施例において列挙された17個の遮断MASP-2 Fab2はそれぞれC3b生成を強力に阻害する(＞95％)。従って、このことから、レクチン経路C3コンバターゼに対する、このアッセイ法の特異性が証明される。
それぞれの遮断Fab2の見かけのKdを算出するために、17個全ての遮断Fab2を用いて結合アッセイ法も行った。これらの遮断Fab2のうちの6個を対象にした、天然ラットMASP-2に対する抗ラットMASP-2 Fab2の結合アッセイ法の結果も表2に示した。他のFab2についても同様の結合アッセイ法を行った。この結果を表2に示した。一般的に、6個のFab2のそれぞれと「天然」MASP-2の結合について得られた見かけのKdは、C3コンバターゼ機能アッセイ法におけるFab2のIC50と妥当によく一致する。MASP-2はそのプロテアーゼ活性が活性化されると「不活性」型から「活性」型へとコンフォメーション変化を受けるという証拠がある(Feinberg et al., EMBO J 22：2348-59(2003)； Gal et al., J. Biol.Chem. 250：33435-44(2005))。C3コンバターゼ形成アッセイ法において用いられる正常ラット血漿中には、MASP-2は主に「不活性な」酵素前駆体コンフォメーションの状態で存在する。対照的に、結合アッセイ法では、MASP-2は、固定化マンナンと結合したMBLとの複合体の一部として存在する。従って、MASP-2は「活性」コンフォメーション状態にあると考えられる(Petersen et al., J. Immunol Methods 257：107-16, 2001)。その結果、これらの2つの機能アッセイ法において試験された17個の遮断Fab2のそれぞれについてIC50とKdの間に厳密な対応関係が予想されるとは限らないと考えられる。なぜなら、それぞれのアッセイ法において、Fab2は異なるコンフォメーション型のMASP-2を結合するからである。にもかかわらず、Fab2#88を除いて、2つのアッセイ法において試験された他の16個のFab2のそれぞれについてIC50と見かけのKdの間に妥当に密接な対応関係があると考えられる(表2を参照されたい)。
MASP-2によって媒介されるC4切断の阻害について遮断Fab2のいくつかを評価した。表2に示したように、試験されたFab2の全てが、C3コンバターゼアッセイ法において得られたIC50とほぼ同じIC50でC4切断を阻害することが見出された。
マンナンはレクチン経路の公知の活性化因子であるが、ラット血清中に抗マンナン抗体が存在することでも古典経路が活性化し、それによって、C1sを介したC4切断によってC4bが生成され得ることも理論上可能である。しかしながら、いくつかのMASP-2 Fab2がC4b生成を強力に阻害する(＞95％)ことが同定されている。従って、このことから、MASP-2によって媒介されるC4切断に対する、このアッセイ法の特異性が証明される。C4はC3と同様に、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法においてC4がMASP-2によって切断されると、C4b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISA法におけるC4bの検出が容易になる。
これらの結果から、C4およびC3コンバターゼ活性を両方とも機能的に遮断する、ラットMASP-2タンパク質に対する高親和性FAB2が生成され、それによって、レクチン経路活性化が阻止されることがはっきりと証明される。
実施例5
本実施例は、実施例4に記載のように生成された遮断抗ラットMASP-2 Fab2抗体のいくつかのエピトープマッピングについて述べる。
方法：
全てN末端6XHisタグを有する以下のタンパク質を、pED4ベクターを用いてCHO細胞において発現させた：
ラットMASP-2A、活性中心にあるセリンをアラニンに変えることによって不活性化された完全長MASP-2タンパク質(S613A)；
ラットMASP-2K、自己活性化を減少させるように変えられた完全長MASP-2タンパク質(R424K)；
CUBI-II、CUBIドメインとEGF様ドメインとCUBIIドメインとのみを含むラットMASP-2 N末端断片；ならびに
CUBI/EGF様、CUBIドメインとEGF様ドメインとのみを含むラットMASP-2 N末端断片。
以前に述べられたように(Chen et al., J. Biol. Chem. 276：25894-02(2001))、これらのタンパク質をニッケル-アフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製した。
ラットMASP-2のCCPIIおよびセリンプロテアーゼドメインを含有するC末端ポリペプチド(CCPII-SP)を、pTrxFus(Invitrogen)を用いてチオレドキシン融合タンパク質として大腸菌において発現させた。タンパク質を、Thiobondアフィニティー樹脂を用いて細胞溶解産物から精製した。チオレドキシン融合パートナーを陰性対照として空のpTrxFusから発現させた。
全ての組換えタンパク質をTBS緩衝液で透析し、280nmのODを測定することによって濃度を求めた。
ドットブロット分析：
前述した5個の組換えMASP-2ポリペプチドの段階希釈液(ならびにCCPII-セリンプロテアーゼポリペプチドの陰性対照としてチオレドキシンポリペプチド)をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットされたタンパク質の量は5倍段階で100ng〜6.4pgであった。後の実験において、スポットされたタンパク質の量は、再度、5倍段階で50ng〜16pgであった。膜を、TBS(ブロッキング緩衝液)に溶解した5％スキムミルク粉末でブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液(5.0mM Ca++を含有する)に溶解した1.0μg/mLの抗MASP-2 Fab2とインキュベートした。結合しているFab2を、HRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec；1/10,000に希釈した)およびECL検出キット(Amersham)を用いて検出した。1枚の膜を、陽性対照としてポリクローナルウサギ抗ヒトMASP-2 Ab(Stover et al., J Immunol 163：6848-59(1999)に記載)とインキュベートした。この場合、結合しているAbを、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dako； 1/2,000に希釈した)を用いて検出した。
MASP-2結合アッセイ法：
ELISAプレートを、炭酸緩衝液(pH9.0)に溶解した1.0μg/ウェルの組換えMASP-2AまたはCUBI-IIポリペプチドで4℃において一晩コーティングした。ウェルを、TBSに溶解した1％BSAでブロッキングし、次いで、5.0mM Ca++を含有するTBSに溶解したMASP-2 Fab2の段階希釈液を添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。TBS/tween/Ca++で3回洗浄した後、TBS/Ca++で1/10,000に希釈したHRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec)を添加し、プレートを室温でさらに1時間インキュベートした。結合している抗体を、TMBペルオキシダーゼ基質キット(Biorad)を用いて検出した。
結果：
Fab2と様々なMASP-2ポリペプチドとの反応性を証明したドットブロット分析の結果を以下の表3に示した。表3に示した数値は、ほぼ最大半量のシグナル強度を得るのに必要とされる、スポットされたタンパク質の量を示す。示したように、(チオレドキシン融合パートナー単独を除く)全てのポリペプチドが、陽性対照Ab(ポリクローナル抗ヒトMASP-2血清、ウサギにおいて産生された)によって認識された。
（表３）ドットブロットにおける様々な組換えラットMASP-2ポリペプチドとの反応性
Figure 2021527698
NR=反応なし。陽性対照抗体は、ウサギにおいて産生されたポリクローナル抗ヒトMASP-2血清である。
全てのFab2がMASP-2AならびにMASP-2Kと反応した(データ示さず)。Fab2の大半はCCPII-SPポリペプチドを認識したが、N末端断片を認識しなかった。2つの例外はFab2#60およびFab2#57である。Fab2#60はMASP-2AおよびCUBI-II断片を認識するが、CUBI/EGF様ポリペプチドもCCPII-SPポリペプチドも認識しない。このことから、Fab2#60は、CUBIIにあるエピトープに、またはCUBIIとEGF様ドメインにまたがるエピトープに結合することが示唆される。Fab2#57がMASP-2Aを認識するが、試験されたいかなるMASP-2断片も認識しないことから、おそらくこのFab2がCCP1にあるエピトープを認識することを示している。Fab2#40および#49は完全なMASP-2Aにしか結合しなかった。ELISA結合アッセイ法において、Fab2#60は、わずかに低い見かけの親和性ではあるがCUBI-IIポリペプチドにも結合した(データ示さず)。
これらの知見から、MASP-2タンパク質の複数の領域に対するユニークな遮断Fab2が同定されたことが証明される。
実施例6
本実施例は、実施例4に記載のように同定された代表的な高親和性抗MASP-2 Fab2抗体の薬力学的分析について述べる。
背景/原理：
実施例4に記載のように、ラットレクチン経路を遮断する高親和性抗体を同定するために、ラットMASP-2タンパク質を用いてファージディスプレイライブラリーをパンニングした。このライブラリーは大きな免疫学的多様性を提供するように設計され、完全ヒトイムノグロビン(immunoglobin)遺伝子配列を用いて構築された。実施例4に示したように、ラットMASP-2タンパク質と高親和性で結合する約250個の個々のファージクローンをELISAスクリーニングによって同定した。これらのクローンの配列決定によって、50個のユニークなMASP-2抗体コードファージが同定された。これらのクローンからFab2タンパク質を発現させ、精製し、MASP-2結合親和性およびレクチン補体経路機能阻害について分析した。
実施例4の表2に示したように、この分析の結果として、機能遮断活性を有する17個のMASP-2 Fab2を同定した(遮断抗体については34％のヒット率)。Fab2によるレクチン補体経路の機能阻害は、MASP-2によるC4切断の直接の尺度であるC4沈着のレベルにおいて明らかであった。重要なことに、C3コンバターゼ活性を評価した場合に、阻害は同じように明らかであった。このことから、レクチン補体経路の機能遮断が証明される。実施例4に記載のように同定された17個のMASP-2遮断Fab2は、10nMに等しい、または10nM未満のIC50値でC3コンバターゼ形成を強力に阻害する。同定された17個のFab2のうち8個のIC50はnM以下の範囲である。さらに、実施例4の表2にまとめたように、MASP-2遮断Fab2のうち17個全てがレクチン経路C3コンバターゼアッセイ法においてC3コンバターゼ形成の本質的に完全な阻害を示した。さらに、表2に示した17個の遮断MASP-2 Fab2はそれぞれC3b生成を強力に阻害する(＞95％)。従って、レクチン経路C3コンバターゼを対象としたこのアッセイ法の特異性が証明される。
ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ変種はFab2#11から得られた。本実施例は、薬力学パラメータについての、これらのアイソタイプのインビボ特徴決定について述べる。
方法：
実施例4に記載のように、ラットMASP-2タンパク質を用いてFabファージディスプレイライブラリーをパンニングした。これから、Fab2#11を同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ変種はFab2#11から得られた。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプを、以下の通り薬力学パラメータについてインビボで特徴決定した。
マウスにおけるインビボ研究：
インビボでの血漿レクチン経路活性に対するMASP-2抗体投与の効果を調べるために、マウスにおいて薬力学的研究を行った。この研究では、0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのマウスMASP-2 MoAb(Fab2#11に由来するマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ)の皮下(sc)投与後および腹腔内(ip)投与後の様々な時点で、C4沈着をレクチン経路アッセイ法においてエクスビボで測定した。
図2Aは、0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのマウス抗MASP-2 MoAbの皮下投与後の様々な時点でマウス(n=3マウス/群)から採取された未希釈血清試料においてエクスビボで測定された、ザイモサンコーティングマイクロタイタープレートにおけるレクチン経路特異的C4b沈着を図示する。抗体投与前に収集されたマウス由来の血清試料は陰性対照(100％活性)として役立ったのに対して、100nMの同じ遮断MASP-2抗体をインビトロで補充した血清を陽性対照(0％活性)として使用した。
図2Aに示した結果から、1.0mg/kg用量のマウスMASP-2 MoAbの皮下投与後に迅速かつ完全なC4b沈着阻害が証明される。0.3mg/kgのマウスMASP-2 MoAbの用量の皮下投与後にC4b沈着の部分阻害が見られた。
0.6mg/kgのマウスMASP-2 MoAbをマウスに単回ip投与した後、レクチン経路回復の時間経過が3週間続いた。図2Bに示したように、抗体投与後に、レクチン経路活性が急激に低下し、それに続いて、i.p.投与後、約7日続く完全なレクチン経路阻害が生じた。2週目および3週目にわたってレクチン経路活性のゆっくりとした回復が観察された。MASP-2 MoAb投与後17日までにマウスのレクチン経路が完全に回復した。
これらの結果から、Fab2#11に由来するマウス抗MASP-2 Moabは全身送達された場合に、マウスのレクチン経路を用量反応の様式で阻害することが証明される。
実施例7
本実施例は、ファージディスプレイを使用して、MASP-2に結合し、かつレクチン媒介性補体活性化を阻害しながらも免疫系の古典（C1q依存性）経路成分をインタクトなままにしておく完全ヒトscFv抗体の同定を記載する。
概略：
ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって完全ヒト高親和性MASP-2抗体を同定した。scFvフォーマットおよび完全長IgGフォーマットの両方において抗体の可変軽鎖および重鎖断片を単離した。ヒトMASP-2抗体は、レクチン経路媒介性第二補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害しながらも免疫系の古典（C1q依存性）経路成分をインタクトなままにしておく場合に有用である。一部の態様において、対象MASP-2阻害抗体は、以下の特徴を有する：（a）ヒトMASP-2に関する高い親和性（例えば10nMまたはそれ未満のKD）および（b）90％ヒト血清中のMASP-2依存性補体活性化を30nMまたはそれ未満のIC50で阻害すること。
方法：
完全長の触媒的に不活性なMASP-2の発現：
リーダー配列（SEQ ID NO：2）を有するヒトMASP-2ポリペプチドをコードするヒトMASP-2の完全長cDNA配列（SEQ ID NO：1）を、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下で真核性発現を駆動する哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)中にサブクローニングした（Kaufman R. J. et al., Nucleic Acids Research 19：4485-90, 1991； Kaufman, Methods in Enzymology, 185：537-66 (1991)に記載）。
触媒的に不活性なヒトMASP-2Aタンパク質を生成するために、参照により本明細書に組み入れられるUS2007/0172483に記載されているとおりに部位指向性変異誘発を実施した。アガロースゲル電気泳動およびバンド調製ののちPCR産物を精製し、標準的なテーリング手法を使用して単一アデノシン重複を生成した。次いで、アデノシンテールのあるMASP-2AをpGEM-T easyベクターにクローニングし、大腸菌へと形質転換した。ヒトMASP-2Aをさらに哺乳動物発現ベクターpEDまたはpCI-Neoのいずれかにサブクローニングした。
標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法（Maniatis et al., 1989）を使用して、上記MASP-2A発現構築物をDXB1細胞にトランスフェクトした。調製物が他の血清タンパク質で汚染されないことを保証するために、MASP-2Aを無血清培地中で産生した。1日おきに培地をコンフルエント細胞から収穫した（計4回）。組換えMASP-2Aレベルは、培地1リットルあたり平均で約1.5mgであった。MASP-2A（上記Ser-Ala変異体）をMBP-Aアガロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
パンニング/scFv転換およびフィルタースクリーニングによって同定されたScFv候補クローンにおけるMASP-2A ELISA
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域配列のファージディスプレイライブラリーを抗原パンニングに供したのち、自動化抗体スクリーニングおよび選択によってヒトMASP-2タンパク質に対する高親和性scFv抗体を同定した。HISタグ標識またはビオチンタグ標識MASP-2Aに対して3回のscFvファージライブラリーパンニングを実施した。3回目のパンニングは、まずMBLで溶出させ、次いでTEA（アルカリ性）で溶出させた。標的MASP-2Aに対してscFv断片を表示するファージの特異的濃縮をモニターするために、固定化MASP-2Aに対するポリクローナルファージELISAを実施した。3回目のパンニングからのscFv遺伝子をpHOG発現ベクターにクローニングし、小規模フィルタースクリーニングに通して、MASP-2Aに対する特異性クローンを捜した。
3回目のパンニングからのscFv断片をコードするプラスミドを含む細菌コロニーを選択し、ニトロセルロース膜に固定化し、非誘発性培地上で一晩増殖させてマスタープレートを製造した。3回目のパンニングから合計18,000個のコロニーを、半分は競合的溶出から、もう半分はその後のTEA溶出から選択し、分析した。MASP-2Aに対するscFvファージミドライブラリーのパンニング、その後のscFv転換およびフィルタースクリーニングが137の陽性クローンを生み出した。108/137クローンが、ELISAアッセイ法においてMASP-2結合に関して陽性であり（データ示さず）、そのうち45のクローンを、正常ヒト血清中のMASP-2活性を遮断する能力に関してさらに分析した。
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を使用して、MASP-2 scFV候補クローンの「ブロッキング活性」を評価した。レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分（C4b、C2a）を生成するためには、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要である。したがって、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 scFv（すなわち、遮断性MASP-2 scFv）はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、異例な高反応性チオエステル基をその構造の一部として含む。このアッセイ法においてC3コンバターゼによってC3が切断されると、C3b上のチオエステル基が、プラスチックウェルの底に固定化された高分子上のヒドロキシルまたはアミノ基とエステルまたはアミド結合による共有結合を形成し、それにより、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出を容易にすることができる。
酵母マンナンは既知のレクチン経路アクチベーターである。以下の方法においては、C3コンバターゼの形成を測定するために、マンナンでコーティングされたプラスチックウェルを希釈ヒト血清とともにインキュベートしてレクチン経路を活性化した。次いで、ウェルを洗浄し、ウェル上に固定化されたC3bに関して、標準的なELISA法を使用してアッセイした。このアッセイ法において生成されたC3bの量が、レクチン経路C3コンバターゼの新規形成を直接反映するものである。このアッセイ法においては、選択された濃度におけるMASP-2 scFvクローンを、C3コンバターゼ形成およびその後のC3b生成を阻害するそれらの能力に関して試験した。
方法：
上記のように同定した45個の候補クローンを発現させ、精製し、同じ保存濃度まで希釈し、それを、すべてのクローンが同じ量の緩衝液を有することを保証するために、Ca++およびMg++含有GVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1％ゼラチン、pH7.4)中で再び希釈した。scFvクローンをそれぞれ2μg/mLの濃度において三つ組で試験した。陽性対照はOMS100 Fab2であり、かつ0.4μg/mLで試験した。scFv/IgGクローンの存在および非存在においてC3c形成をモニターした。
マンナンを50mM炭酸緩衝液（15mM Na2CO3+35mM NaHCO3+1.5mM NaN3）中pH9.5で20μg/mL（1μg/ウェル）の濃度まで希釈し、4℃で一晩ELISAプレートにコーティングした。翌日、マンナンコーティングされたプレートをPBS 200μlで3回洗浄した。次いで、1％ HSAブロッキング溶液100μlをウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS 200μlで3回洗浄し、試料の添加まで、PBS 200μlとともに氷上に貯蔵した。
正常ヒト血清をCaMgGVB緩衝液中0.5％に希釈し、scFvクローンまたはOMS100 Fab2陽性対照を0.01μg/mL；1μg/mL（OMS100対照のみ）および10μg/mLの三つ組でこの緩衝液に加え、氷上で45分間プレインキュベートしたのち、ブロッキングされたELISAプレートに加えた。37℃で1時間のインキュベートによって反応を開始させ、プレートを氷槽に移すことによって反応を停止させた。ウサギα-マウスC3c抗体、次いでヤギα-ウサギHRPを用いてC3b沈着を検出した。陰性対照は抗体なしの緩衝液であり(抗体なし=最大C3b沈着)、陽性対照はEDTAを含む緩衝液であった（C3b沈着なし）。ウェルがマンナンフリーであったことを除き同じアッセイ法を実施することによってバックグラウンドを測定した。マンナンなしのプレートに対するバックグラウンドシグナルをマンナン含有ウェルにおけるシグナルから差し引いた。カットオフ基準は、無関係のscFvクローン（VZV）および緩衝液のみの活性の半分に設定した。
結果：カットオフ基準に基づき、合計13のクローンがMASP-2の活性を遮断することがわかった。>50％の経路抑制を生じさせた13のクローンすべてを選択し、配列決定して、10のユニークなクローンを得た。10のクローンすべてが、同じ軽鎖サブクラスλ3ならびに3つの異なる重鎖サブクラス：VH2、VH3、およびVH6を有することがわかった。機能アッセイ法において、0.5％ヒト血清を使用した場合、10の候補scFvクローンのうち5つが、目標基準25nM未満のIC50nM値を出した。
改善された有効性を有する抗体を同定するために、上記のように同定した3つの母scFvクローンを軽鎖シャッフリングに供した。このプロセスは、6名の健康なドナーに由来するナイーブなヒトラムダ軽鎖(VL)のライブラリーと対合した各母クローンのVHからなるコンビナトリアルライブラリーの生成を含むものであった。次いで、このライブラリーを、改善された結合親和性および/または機能的を有するscFvクローンに関してスクリーニングした。
（表４）リード娘クローンおよびそれらのそれぞれの母クローン(すべてscFvフォーマット)のIC50(nM)における機能的有効性の比較
Figure 2021527698
表4に示す母クローンおよび娘クローンの重鎖可変領域(VH)配列を以下に提示する。
Kabat CDR（31〜35位（H1）、50〜65位（H2）、および95〜107位（H3））は太字で示し、Chothia CDR（26〜32位（H1）、52〜56位（H2）、および95〜101位（H3））は下線で示す。
17D20_35VH-21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)(SEQ ID NO：6)
Figure 2021527698
母クローンおよび娘クローンの軽鎖可変領域（VL）配列を以下に提示する。
Kabat CDR（24〜34位（L1）、50〜56位（L2）、および89〜97位（L3））は太字で示し、Chothia CDR（24〜34位（L1）、50〜56位（L2）、および89〜97位（L3）は下線で示す。これらの領域は、Kabat系によって番号付けしてもChothia系によって番号付けしても同じである。
17D20m_d3521N11(OMS646)軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO：7）
Figure 2021527698
いずれも高い親和性でヒトMASP-2に結合し、かつ機能的補体活性を遮断する能力を有することが実証されているMASP-2抗体OMS100およびMoAb_d3521N11VL(OMS646)を、エピトープ結合に関してドットブロット分析によって分析した。結果は、d3521N11およびOMS100抗体がMASP-2に関して高い特異性を有し、かつMASP-1/3には結合しないことを示す。いずれの抗体も、MASP-2のCCP1ドメインを含まないMAp19またはMASP-2断片には結合せず、結合部位がCCP1を包含するという結論に至った。
したがって、一態様において、請求項に係わる発明の組成物および方法において使用するためのMASP-2阻害物質は、ヒトMASP-2(SEQ ID NO：2)からなるポリペプチドに結合するヒト抗体を含み、該抗体は、
(I）(a）(i）SEQ ID NO：6の31〜35位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1；および(ii）SEQ ID NO：6の50〜65位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2；および(iii）SEQ ID NO：6の95〜107位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む、重鎖可変領域；ならびに
(b）(i）SEQ ID NO：7の24〜34位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1；および(ii）SEQ ID NO：7の50〜56位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2；および(iii）SEQ ID NO：7の89〜97位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、軽鎖可変領域を含み、該抗体がMASP-2依存性補体活性化を阻害する。
実施例8
本実施例は、トロンビン活性化が、生理学的条件下、レクチン経路活性化ののちに起こることができることを実証し、MASP-2関与の程度を実証する。正常ラット血清中、レクチン経路の活性化は、補体活性化（C4沈着として評価）と同時並行的なトロンビン活性化（トロンビン沈着として評価）を招く。図3Aおよび3Bに見てとれるように、この系におけるトロンビン活性化は、MASP-2遮断抗体H1（Fab2フォーマット）によって阻害され、補体活性化の場合のそれ（図3A）に匹敵する阻害濃度応答曲線（図3B）を示す。これらのデータは、外傷において起こるようなレクチン経路の活性化が、MASP-2に完全に依存するプロセスにおいて補体系および凝固系の両方の活性化を招くことを示唆する。そのため、MASP-2阻害抗体が、大きな外傷の症例において死亡につながる顕著な特徴の1つである過度な全身性凝固、例えば播種性血管内凝固の症例を軽減するのに有効であることを証明しているということが予想される。
実施例9
本実施例は、播種性血管内凝固（「DIC」）におけるレクチン経路の役割を評価するために、MASP-2（-/-）およびWT（+/+）マウスにおけるDICの限局性シュワルツマン反応モデルを使用して生成された結果を提供する。
背景/理論：
上述したように、MASP-2の遮断は、レクチン経路活性化を阻害し、両アナフィラトキシンC3aおよびC5a両方の生成を減少させる。C3aアナフィラトキシンは、インビトロで強力な血小板凝集因子であることが示されることができるが、インビボにおけるそれらの関与はそれほど十分には確定されておらず、創傷修復における血小板物質およびプラスミンの放出が二次的に補体C3を関与させるだけである可能性がある。この例においては、播種性血管内凝固を生じさせるためにC3活性化の長期的上昇が必要であるかどうかを検討するために、MASP-2（-/-）およびWT（+/+）マウスにおいてレクチン経路の役割を分析した。
方法：
本明細書において参照により組み込まれるUS 7,919,094の実施例1に記載されるように、この実験に使用されるMASP-2ノックアウトマウス（MASP-2 -/-マウス）を作製した。
限局性シュワルツマン反応（LSR）モデルをこの実験に使用した。LSRは、リポ多糖（LPS）誘発応答であり、先天免疫系の細胞性および体液性要素からの十分に特性決定された寄与を示す。補体へのLSRの依存は十分に立証されている（Polak, L., et al., Nature 223:738-739 （1969）; Fong J.S. et al., J Exp Med 134:642-655 (1971)）。LSRモデルにおいて、マウスをTNFアルファ（500ng、陰嚢内）で4時間プライミングしたのち、マウスを麻酔し、精巣挙筋の生体内顕微鏡検査のために準備した。良好な血流量（1〜4mm/s）を示す後毛細血管細静脈（直径15〜60μm）のネットワークを観察に選択した。マウスを蛍光抗体で処置して、好中球または血小板を選択的に標識した。血管のネットワークを順次にスキャンし、すべての血管の画像を後の分析のためにデジタル的に記録した。微小循環の基底状態を記録したのち、LPS（100μg）を、単独で、または以下に記載する作用物質のいずれかとともに、マウスに単回静脈内注射した。次いで、同じ血管ネットワークを1時間にわたり10分ごとにスキャンした。バックグラウンド蛍光の減法によって蛍光体の特異的蓄積を識別し、画像を二値化することによって強調した。記録された画像から反応の大きさを測定した。LSRの主な測度は凝集塊データであった。
これらの研究は、既知の補体経路枯渇物質、コブラ毒因子（CVF）または終末経路阻害因子（C5aRアンタゴニスト）のいずれかに曝露されたWT（+/+）マウスを比較した。結果（図4A）は、CVFおよびC5aRアンタゴニストの両方が血管系中の凝集塊の出現を防いだことを実証する。加えて、MASP-2（-/-）マウス（図4B）もまた、限局性シュワルツマン反応の完全な阻害を実証し、レクチン経路関与を裏付けた。これらの結果は、DIC発生におけるMASP-2の役割を明確に実証し、DICの治療および予防のためのMASP-2阻害因子の使用を裏付ける。
実施例10
本実施例は、WT（+/+）、MASP-2（-/-）、F11（-/-）、F11/C4（-/-）、およびC4（-/-）マウスにおけるトロンビン基質によるC3の活性化およびマンナンへのC3沈着を記載する。
理論：
実施例8に記載したように、トロンビン活性化は、生理学的条件下、レクチン経路活性化ののちに起こることができ、MASP-2関与の程度を示すと判断された。C3は、補体系の活性化において中心的役割を果たす。C3活性化は古典補体活性経路および第二補体活性化経路の両方に求められる。C3がトロンビン基質によって活性化されるかどうかを決定するための実験を実施した。
方法：
トロンビン基質によるC3活性化
以下の活性化形態のトロンビン基質：ヒトFXIa、ヒトFVIIa、ウシFXa、ヒトFXa、ヒト活性化プロテインCおよびヒトトロンビンの存在においてC3の活性化を測定した。C3を様々なトロンビン基質ともにインキュベートしたのち、10％ SDS-ポリアクリルアミドゲル上、還元条件下で分離した。セルロース膜を使用する電気泳動的転写ののち、膜を、モノクローナルビオチン結合ラット抗マウスC3とともにインキュベートし、ストレプトアビジン-HRPキットによって検出し、ECL試薬を使用して現像した。
結果：
C3の活性化は、インタクトなa鎖を切断型a'鎖および可溶性C3aへと切断することを含む。図5は、トロンビン基質によるヒトC3の活性化に関するウェスタンブロット分析の結果を示し、非切断C3アルファ鎖および活性化産物a'鎖が矢印によって示されている。図5に示すように、活性化形態のヒト凝固因子XIおよび因子Xならびに活性化ウシ凝固因子XとのC3のインキュベーションは、任意の補体プロテアーゼの非存在においてもインビトロでC3を切断することができる。
考察：
本実施例に記載されたデータはまた、全血清の生理学的情況においてレクチン経路が凝固カスケードの成分を活性化することができることを示す。したがって、補体と凝固との間に、MASP-2を伴うクロストークがあることが実証される。
実施例11
この研究は、LPS（リポ多糖）誘発性血栓症のマウスモデルにおけるMASP-2欠損の効果を研究する。
理論：
志賀毒素産生性大腸菌感染によって生じる溶血性尿毒症症候群（HUS）は子供における急性腎不全の主要原因である。本実施例においては、MASP-2阻害が血管内血栓の形成を阻害または防止するのに有効であるかどうかを決定するために、MASP-2（-/-）マウスにおいてLPS誘発性血栓症（微小血管凝固）のシュワルツマンモデルを実施した。
方法：
LPS誘発性血栓症（微小血管凝固）のシュワルツマンモデルにおいてMASP-2（-/-）（n=9）およびWT（n=10）マウスを分析した。マウスにセラチアLPSを投与し、血栓形成を経時的にモニターした。微小血栓およびLPS誘発性微小血管凝固の発生率の比較を実施した。
結果：
注目すべきことに、試験したすべてのMASP-2-/-マウス（9/9）がセラチアLPS投与後に血管内血栓を形成しなかった。対照的に、同時並行的に試験されたWTマウス10匹のうち7匹において微小血栓が検出された（p=0.0031、フィッシャーの直接確率検定）。図6に示すように、LPS感染後、微小血管閉塞の発生までの時間をMASP-2（-/-）およびWTマウスにおいて測定し、60分間の測定で血栓形成を示したWTマウスの割合を示し、血栓形成は早くも約15分で検出された。WTマウスの80％までが60分で血栓形成を実証した。対照的に、図6に示すように、MASP-2（-/-）のいずれも60分では血栓形成を示さなかった（ログランク：p=0.0005）。
これらの結果は、MASP-2阻害がHUSモデルにおける血管内血栓症の発症に対して保護的であることを実証する。
実施例12
本実施例は、血栓症のマウスFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞損傷モデルにおけるMASP-2欠損およびMASP-2阻害の効果を記載する。
背景／理論：
HUS、aHUS、TTP、および他の病因のTMAを治療する場合のMASP-2阻害因子の有益性をさらに実証するために、以下の実験を実施して、血栓性微小血管症（TMA）のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストラン誘発性内皮細胞損傷モデルにおけるMASP-2欠損およびMASP-2阻害の効果を分析した。
方法：
生体内顕微鏡検査
Frommholdら、BMC Immunology 12:56-68, 2011によって記載されているように、マウスを生体内顕微鏡検査のために準備した。簡潔にいうと、マウスを、ケタミン（125mg/kg体重、Ketanest, Pfitzer GmbH, Karlsruhe, Germany）およびキシラジン（12.5mg/kg体重、Rompun, Bayer, Leverkusen, Germany）の腹腔内（i.p.）注射によって麻酔し、体温を37℃に維持するための加熱パッドに載せた。食塩水浸漬対物レンズ（SW 40/0.75開口数、Zeiss, Jena, Germany）を有する正立顕微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）で生体内顕微鏡検査を実施した。呼吸しやすくするために、マウスにPE90チューブ（Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA）を挿入した。採血およびモノクローナル抗体（mAb）全身投与のために、左頚動脈にPE10チューブ（Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA）を挿入した。
精巣挙筋標本作製
Sperandioら、Blood, 97:3812-3819, 2001によって記載されているとおりに、生体内顕微鏡検査のための精巣挙筋の外科標本作製を実施した。簡潔にいうと、陰嚢を切開し、精巣挙筋を可動化した。筋肉の縦方向切開およびカバーガラス上での延展ののち、精巣上体および精巣を横にずらし、ピン留めして、精巣挙筋微小循環への完全な顕微鏡アクセスを可能にした。精巣挙筋細静脈をCCDカメラ（CF8/1、Kappa, Gleichen, Germany）によってPanasonic S-VHSレコーダに記録した。Frommholdら、BMC Immunology 12:56-68, 20112011によって以前に記載されているとおりに、精巣挙筋を温度調整（35℃）重炭酸緩衝食塩水で表面灌流した。
光励起FITCデキストラン傷害モデル
光毒性（FITC）-デキストラン（Cat. No. FD150S、Sigma Aldrich, Poole, U.K.）の光励起によって精巣挙筋細静脈および動脈の内皮の制御された光用量依存性血管損傷を誘発した。この手順が限局性血栓症を開始させる。光毒性試薬として、FITC-デキストランの10％w/v溶液60μLを左頸動脈アクセスに通して注入し、10分間循環血液全体に均一に延展させた。十分に灌流された細静脈を選択したのち、再現可能な制御されたやり方で血栓症を刺激するために、低強度からミッドレンジ強度まで（800〜1500）のハロゲン光を対象の血管に合焦させて、内皮表面にFITC-デキストラン蛍光および軽度〜中等度の光毒性を誘発した。ハロゲンランプ（12V、100W、Zeiss, Oberkochen, Germany）を使用して、FITC-デキストランの励起のために必要な光毒性光強度を生成した。Steinbauerら、Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000によって記載されるように、蛍光色素の光誘発励起から生じた光毒性は、光強度および/または照射時間のしきい値を必要とし、内皮表面の直接加熱または反応性酸素ラジカルの生成のいずれかによって生じる。
低電力測定のための波長補正性ダイオード検出器（Labmaster LM-2、Coherent, Auburn, USA）により、各血管に適用される光の強度を測定して調節した。コンピュータ援用微小循環分析システム（CAMAS、Dr. Zeintl, Heidelberg）によってビデオスキャンのオフライン解析を実施し、Zeintlら、Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000によって記載されているように赤血球速度を測定した。
血栓誘発前のモノクローナル抗ヒトMASP-2阻害抗体（mAbH6）およびビヒクル対照の適用
盲検試験設計を使用して、生体内顕微鏡検査の精巣挙筋モデルにおける血栓の光毒性誘発の16時間前、9週齢雄C57BL/6 WT同腹仔マウスに、MASP-2機能活性の阻害因子である組換えモノクローナルヒトMASP-2抗体（mAbH6）（最終濃度10mg/kg体重で投与）または同じ量のアイソタイプ対照抗体（MASP-2阻害活性なし）の腹腔内注射を実施した。血栓誘発の1時間前、mAbH6または対照抗体のいずれかの第二の投与を実施した。また、MASP-2ノックアウト（KO）マウスをこのモデルにおいて評価した。
mAbH6（組換えヒトMASP-2に対して樹立）はヒトMASP-2機能活性の強力な阻害因子であるが、その種特異性のせいで、より低い親和性でマウスMASP-2と交差反応し、それに結合し、それを阻害する（データ示さず）。マウスMASP-2に対するmAbH6のより低い親和性を補うために、mAbH6を、種特異性における変化およびマウスMASP-2に対するより低い親和性を克服するために高い濃度（10mg/kg体重）で投与して、インビボ条件下、マウスMASP-2機能活性の有効な遮断を提供した。
この盲検試験において、試験した各個々の小静脈が完全に閉塞するのに要した時間を記録した（選択基準は匹敵しうる直径および血流速度であった）。
生体内顕微鏡検査のビデオ録画を使用して、60分の観察期間にわたり、微小血管閉塞を有するマウスの割合、発症の時間および閉塞までの時間を評価した。
結果：
図7は、FITC/デキストラン注射の16時間前および1時間前に投与されたアイソタイプ対照またはヒトMASP-2抗体mAbH6（10mg/kg）による処置後、FITC/デキストランUVモデルにおいて微小血管閉塞を起こしたマウスの割合を損傷誘発後の時間の関数としてグラフによって示す。図7に示すように、アイソタイプ対照抗体の投与を受けた野生型マウスは、85％が30分以内またはそれ未満内に閉塞を起こしたが、一方、ヒトMASP-2抗体（mAbH6）で前処置された野生型マウスは、同じ期間内では19％しか閉塞を起こさず、ヒトMASP-2抗体処置群においては、最終的に閉塞を起こしたマウスにおいては閉塞までの時間が延びた。さらに、MASP-2 mAbH6処置マウスのうち3匹は60分の観察期間中に全く閉塞を起こさなかった（すなわち、血栓性閉塞から保護された）ことが注目される。
図8は、ヒトMASP-2抗体（mAbH6）およびアイソタイプ対照抗体で処置されたマウスに関する分単位の閉塞時間をグラフによって示す。データは、分散ドットとして平均値（水平バー）および標準誤差バー（垂直バー）とともに報告されている。この図は、閉塞が認められたマウスにおける閉塞時間を示す。したがって、60分の観察期間中に閉塞を起こさなかった3匹のMASP-2抗体処置マウスはこの分析には含めなかった（閉塞を起こさなかった対照処置マウスはなかった）。分析に使用した統計検定は対応のないt検定であった。「*」という記号はp=0.0129を示す。図8に示すように、閉塞を起こした4匹のMASP-2抗体（mAbH6）処置マウスにおいて、MASP-2抗体による処置は、アイソタイプ対照抗体で処置されたマウスに比べて、低い光強度（800〜1500）による血栓症のFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞傷害モデルにおける静脈閉塞時間を有意に増加させた。アイソタイプ対照の完全閉塞時間の平均は19.75分であったが、一方、MASP-2抗体処置群の場合の完全閉塞時間の平均は32.5分であった。
図9は、低い光強度（800〜1500）を用いる血栓症のFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞損傷モデルにおいて野生型マウス、MASP-2 KOマウスおよび血栓症誘発の16時間前、次いで1時間前にヒトMASP-2抗体（mAbH6）10mg/kgの腹腔内投与で前処置された野生型マウスに関する、閉塞に至るまでの分単位時間をグラフによって示す。閉塞を起こしたマウスだけが図9に含まれている。アイソタイプ対照抗体の投与を受けた野生型マウスの場合、n=2、MASP-2 KOの場合、n=2、およびヒトMASP-2抗体（mAbH6）の投与を受けた野生型マウスの場合、n=4。「*」という記号はp<0.01を示す。図9に示すように、MASP-2欠損およびMASP-2阻害（mAbH6、10mg/kg）は、血栓症のFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞傷害モデルにおいて、低い光強度（800〜1500）で静脈閉塞時間を増大させた。
結論：
本実施例の結果はさらに、TMAのマウスモデルにおいて、レクチン経路を遮断するMASP-2阻害物質（例えば、MASP-2機能を遮断する抗体）が、複数の微小血管障害の特徴である微小血管凝固および血栓を阻害することを実証する。したがって、MASP-2阻害抗体のようなMASP-2阻害物質の投与は、HUS、aHUS、TTPまたは他の微小血管障害を患っている患者において有効な治療であり、かつ微小血管凝固および血栓からの保護を提供すると予想される。
実施例13
本実施例は、ヒトMASP-2阻害抗体（mAbH6）が、血小板を豊富に含むヒト血漿中の血小板機能に影響を及ぼさないことを実証する研究を記載する。
背景／理論：実施例12に記載したように、ヒトMASP-2阻害抗体（mAbH6）によるMASP-2阻害が血栓症のFITC-デキストラン/光誘発性内皮細胞傷害モデルにおいて静脈閉塞時間を増大させることが実証された。以下の実験は、MASP-2阻害抗体（mAbH6）が血小板機能に影響を及ぼすかどうかを判定するために実施した。
方法：以下のとおりに、血小板のADP誘発性凝集に対するヒトmAbH6 MASP-2抗体の効果を試験した。1μg/mlまたは0.1μg/mlの濃度のヒトMASP-2 mAbH6を、40μL溶液として、新たに調製した血小板を豊富に含むヒト血漿360μLに加えた。アイソタイプ対照抗体を負の対照として使用した。抗体を血漿に加えたのち、ADPを最終濃度2μMで加えることによって血小板活性化を誘発した。1mLキュベット中、小さな磁石で溶液をかく拌することによってアッセイ法を開始した。2チャンネルChrono-log Platelet Aggregometer Model 700 Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer中で血小板凝集を測定した。
結果：
5分間にわたり溶液中の凝集率%を測定した。結果を以下の表5に示す。
（表５）5分間にわたる血漿凝集
Figure 2021527698
上記表22に示すように、対照抗体またはMASP-2 mAbH6抗体で処置されたADP誘発性血小板凝集の間に有意な差は認められなかった。これらの結果は、ヒトMASP-2抗体（mAbH6）が血小板機能に影響を及ぼさないことを実証する。したがって、血栓症のFITC-デキストラン／光誘発性内皮細胞傷害モデルにおけるヒトMASP-2阻害抗体（mAbH6）によるMASP-2阻害が静脈閉塞時間を増大させることを実証した実施例12に記載された結果は、血小板機能に対するmAbH6の効果のせいではなかった。したがって、MASP-2阻害は、血小板機能に直接影響することなく血栓症を予防し、既存の抗血栓剤とは異なる治療機序を明らかにする。
実施例14
背景／理論
本実施例は、レクチン経路と凝固／接触系との間のクロストークを調べるために実施された研究を記載する。
方法：
ヒルジン抗凝固化ヒト血漿（約90％）を、変化する濃度の以下のMASP-2阻害抗体：OMS646（実施例7に記載したように生成）およびNimoAb101（表1に記載され、W02004/106384に記載されているように生成）とともにプレインキュベートした。また、対照抗体ET-904（Eureka Therapeutics）を陰性対照として使用した。
フィブリンの添加（20μg/mL）によって試料を刺激した。全体として参照により本明細書に組み入れられるKozarcanin H. et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 14:531-545, 2016に記載されているように、セリンプロテアーゼ活性化終端に関し、MASP-2とセルピンC1阻害因子（C1-INH）またはアンチトロンビンIII（ATIII）との間の複合体の検出のためのサンドイッチELISAアッセイ法によって上清を評価して、MASP-2の活性化形態を特異的に検出し、定量化した。
結果：
図10Aは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、MASP-2-アンチトロンビン複合体形成（MASP-2-ATIII）によって測定されたMASP-2活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、MASP-2阻害抗体がMASP-2活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。
図10Bは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、MASP-2-セルピン複合体形成（MASP-2-C1-INH）によって測定されたMASP-2活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、MASP-2阻害抗体がMASP-2活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。
図11Aは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、カリクレイン−アンチトロンビン複合体形成（KK-ATIII）によって測定されたカリクレイン活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、MASP-2阻害抗体がカリクレイン活性化を用量依存的に阻止するが、溶媒対照は効果を有しないことを実証する。
図11Bは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、カリクレイン−セルピン複合体形成（KK-C1-INH）によって測定されたカリクレイン活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、MASP-2阻害抗体がカリクレイン活性化を用量依存的に阻止するが、溶媒対照は効果を有しないことを実証する。
図12Aは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、第XII因子−アンチトロンビン複合体形成（FXIIa-ATIII）によって測定された第XII因子活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、MASP-2阻害抗体が第XII因子活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。
図12Bは、フィブリンによって刺激されたヒト血漿中、増大する濃度のMASP-2阻害抗体mAb#1（NimoAb101）およびmAb#2（OMS646）の存在下、第XII因子−セルピン複合体形成（FXIIa-C1-INH）によって測定された第XII因子活性化を吸光度単位（AU）でグラフによって示し、MASP-2阻害抗体が第XII因子活性化を用量依存的に阻止するが、対照抗体は効果を有しないことを実証する。
図10A、11A、および12Aに示すように、MASP-2阻害抗体は、フィブリン誘導活性化およびプロテアーゼ−ATIII複合体形成を阻害した。
また、図10B、11B、および12Bにさらに示すように、プロテアーゼ−C1 INH複合体の活性化がMASP-2抗体によって阻害されたが、IC50値は高めの傾向であった。
図10A、10B、11A、11B、12A、および12Bにさらに示すように、陰性対照モノクローナル抗体ET-904は、アッセイ法のいずれにおいても効果を示さなかった。
考察：
本実施例に記載されるデータは、エフェクター酵素がMASP-2である補体カスケードのレクチン経路と、凝固および接触系との間の、広範な双方向クロストークの存在を実証する。Kozarcanin et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 14:531-545, 2016に記載されているように、凝固事象の産物であるフィブリン凝血塊がレクチン経路を活性化すると判定された。本明細書において実証されるように、MASP-2を介するレクチン経路活性化は、その後、凝固および接触系の活性化を発動する。これが、さらなる凝固を生じさせ、それにより、歯止めがきかない過度な凝血塊形成を生じさせるフィードバックサイクルを駆動すると予想される。このフィードバックサイクルが血栓性障害を促進すると予想される。本明細書においてさらに実証されるように、MASP-2はこのクロストークのネクサスを形成し、MASP-2阻害抗体によるMASP-2の阻害が第XII因子活性化およびカリクレイン活性化を阻止し、それにより、MASP-2阻害抗体の治療的使用が凝固および接触のカスケードの過度な活性化を減少させると予想されることを示した。
したがって、1つの局面において、本発明は、補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患、障害、または状態を予防、軽減、ならびに／または治療する方法であって、治療量のMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、止血に影響することなく、抗凝固および／または抗血栓症および／または抗血栓形成を提供する。
本発明のこの局面の1つの態様において、方法は、補体関連性炎症、フィブリンもしくは活性化血小板によって開始される過度な凝固もしくは接触系活性化と関連する、疾患、障害、もしくは状態を患っている対象、または該疾患、障害、もしくは状態を発症する危険を有する対象を治療するのに有用である。1つの態様において、本発明の方法は、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植および／もしくは介入的心血管処置（たとえば血管形成術もしくはステント留置）後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂、プラーク不安定、再狭窄、低血圧症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、全身性炎症反応症候群（SIRS）、播種性血管内凝固症候群（DIC）、静脈閉塞症（VOD）、鎌状赤血球症、血栓性微小血管障害、ループス腎炎、表在性血栓性静脈炎、第V因子ライデン変異、虚血／再灌流障害、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ホルモン補充量療法（HRT）を受けていること、アルツハイマー病からなる群より選択される疾患、障害、または状態を患っている対象、および／または凝固亢進状態を患っている対象を治療するのに有用であり、たとえば、対象は、5-FU、GM-CSF、シスプラチン、ヘパリン、COX-2阻害因子、造影剤、コルチコステロイド、および抗精神病薬からなる群より選択される薬物による薬物治療を受けていること、静脈うっ血（不動化、手術などによる）、抗リン脂質症候群（ループスアンチコアグラントまたはカルジオリピン抗体を発生する）、がん（前骨髄球性白血病、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、および結腸腫瘍：（i）第X因子活性化プロテアーゼを分泌すること；（ii）膜表面上に組織因子を発現／露出すること、または両方；（iii）DICを生じさせ得ること；および（iv）がん治療によって過度な凝固が増大し得ること、によって凝固を活性化する、外傷もしくは手術による組織損傷、中央静脈中のカテーテルの存在（血流の乱れが血餅を形成させることができる）、凝血塊形成に関与するタンパク質（たとえばプロテインC）の後天性欠損、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、ホモシステインレベルの上昇、心不全（血流の減速、うっ血を生じさせる）、機械弁、インサイチュ血栓を伴う肺高血圧症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少症（HITT）、インサイチュ血栓を伴う川崎病、インサイチュ血栓を伴う高安動脈炎、転移性がんのトロンボフィリア、第VIII因子レベルの上昇、妊娠、および炎症性腸疾患（IBD）のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する。たとえば、参照により本明細書に組み入れられるJ.L. Moake, "Overview of Thrombotic Disorders," Merck Manual Profession Version, April 2018を参照されたい。また、Xu T., et al., Activated platelets contribute importantly to myocardial reperfusion injury, Am J Physiol Heart Circ Physiol 290:H692-H699, 2006；Banz Y. et al., Role of complement and perspectives for intervention in ischemia-reperfusion damage, Ann Med. 44:205-217, 2012；Cortes-Canteli M et al., Fibrinogen and altered hemostasis in Alzheimer's disease, J Alzheimer's Dis 32(3): 599-608, 2012を参照されたい。凝固亢進状態および機構を誘導することができる薬物に関しては、全体として参照により本明細書に組み入れられるRamot Y. et al., Drug-induced thrombosis-experimental, clinical and mechanistic considerations, Toxicol Pathol 35(2):208-25を参照されたい。
1つの態様において、本発明の方法は、鎌状赤血球症と関連する少なくとも1つの症状、たとえば、静脈閉塞クリーゼと関連する痛み（急性もしくは慢性）、疲労、血栓塞栓性事象、たとえば静脈閉塞クリーゼと関連する発作（虚血、激しい痛み、壊死）、脾臓血球貯留クリーゼ、急性胸部症候群、溶血クリーゼ、および頻繁な感染症を改善することを含めて、鎌状赤血球症と関連する1つもしくは複数の症状を患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに、有用である。鎌状赤血球症（SCD）は、血小板の活性化を伴う遺伝性血管閉塞性障害である。鎌状赤血球症は、グロビン分子の外面におけるグルタミン酸のバリンによる置換を招く、β-グロビン遺伝子内のミスセンス変異から生じる。このアミノ酸置換が鎌状赤血球ヘモグロビン（「HbS」）の可溶性を低下させ、脱酸素時に重合しやすくする。したがって、重合したHbSを運ぶ赤血球は変形しにくく、微小血管を閉塞するおそれがある。この血管閉塞（vascular occlusion）（血管閉塞（vaso-occlusion））が組織虚血および梗塞を生じさせ、SCD患者における罹患および死亡の主な原因となる（Frenette and Atweh, J Clin Invest. 117:850-858. 2007；Steinberg et al., Scientific World Journal 8: 1295-1324, 2008）。
1つの態様において、本発明の方法は、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患、障害、もしくは状態を患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに有用であり、たとえば、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患または障害は、遺伝性血管浮腫（現在、FDA承認適応症）、糖尿病性黄斑浮腫（KVD001として知られるKalVista Pharmaceuticalの血漿カリクレイン阻害因子は現在、フェーズ2治験段階にある）、および心肺バイパス術中の出血（治験進行中。たとえばKobe et al., Plasma Kallikrein Inhibitors in Cardiovascular Disease, Cardiol Rev 24(3):99-l09, 2016を参照）からなる群より選択される。また、world-wide-web.drugs.com/condition/thrombotic-thromboembolic-disorder（2018年6月20日アクセス時点）を参照されたい。
1つの態様において、本発明の方法は、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患または障害を患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに有用であり、たとえば、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患または障害は、動脈血栓症（特に急性冠症候群）、静脈血栓症、肺塞栓症、心房細動を有する患者における発作の危険の低減、ヘパリン起因性血小板減少症（たとえば、アルガトロバン／Lexicompパッケージ挿入物を参照）、ある抗凝固薬から別の抗凝固薬への切り替え（たとえば、ダビガトランエテキシラート／Pradaxaパッケージ挿入物を参照、たとえば経口ダビガトランから非経口抗凝固薬への切り替え）、および重篤HIT患者における体外循環回路開存性のための持続的腎代替療法（CRRT）の適応外使用（維持）からなる群より選択される。1つの態様において、方法は、心房細動を以前に経験したことがある対象、現在それを患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を識別する工程、および該対象における発作の危険を減らすのに十分な量のMASP-2阻害抗体を投与する工程を含む。たとえば、world-wide-web.drugs.com/condition/thrombotic-thromboembolic-disorder（2018年6月20日アクセス時点）を参照されたい。
1つの態様において、本発明の方法は、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っている対象もしくはそれを発症する危険を有する対象を治療するのに、心房細動を有するもしくは有さない対象における急性冠症候群後の再発性虚血の予防に、末期腎臓病に、脳虚血に、狭心症に、医療機器（医療機器、たとえば弁、微小口径移植片などと関連する凝固を減少させるための使用が、現在の治療よりも効果的であると予想される）に、および／または体外循環回路に有用であり、たとえば、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患または障害は、深部静脈血栓症（一次予防と長期治療の両方）、肺塞栓症、非弁膜症性心房細動からなる群より選択される。1つの態様において、方法は、非弁膜症性心房細動を以前に経験したことがある対象、現在それを患っている対象、またはそれを発症する危険を有する対象を識別する工程、ならびに該対象における発作および／または塞栓形成の危険を減らすのに十分な量のMASP-2阻害抗体を投与する工程を含む。たとえば、world-wide-web.drugs.com/condition/thrombotic-thromboembolic-disorder（2018年6月20日アクセス時点）；world-wide-web.askhematologist.com/thrombotic-disorders（2018年6月20日アクセス時点）および全体として参照により本明細書に組み入れられるWeitz J. et al., Front Med (Lausanne) 4: 19, 2017を参照されたい。
1つの態様において、本発明の方法は、凝固亢進状態を生じさせる遺伝子異常、またはそれを発症する危険を高める遺伝子異常を有すると判定された対象を治療するのに有用であり、たとえば、遺伝子異常は、プロトロンビン20210遺伝子変異、MTHFR変異（この遺伝子の変異が、過度な凝固の危険を高めることができる高レベルのホモシステインの素因となり得る）、プロテインCの欠損、プロテインSの欠損、プロテインAの欠損、プロテインZの欠損、アンチトロンビン欠損、およびトロンボフィリアを生じさせる遺伝子障害からなる群より選択される。
1つの態様において、本発明の方法は、抗凝固薬療法を必要とする対象において、ワーファリンなどの標準的な抗凝固薬療法の代替法を提供するのに有用であり、たとえば、対象は、標準的な抗凝固薬療法を通常禁じる状態（たとえばCNSアミロイド血管症）を有するか、またはMASP-2阻害抗体は、そうでなければ標準的な抗凝固療法を受けている対象にブリッジング剤として術前投与される。
1つの態様において、本発明の方法は、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患、障害、または状態を有する対象を治療するのに有用であり、たとえば、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患または障害は、アテローム性動脈硬化症、抗リン脂質抗体、がん（たとえば前骨髄球性白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、または結腸がん）、高ホモシステイン血症、感染症、組織損傷、静脈うっ血（手術、整形外科的もしくは麻痺的不動化、心不全、妊娠、または肥満による）、および、対象がエストロゲン含有経口避妊薬を服用することからなる群より選択される。
抗リン脂質抗体に関して、これは、静脈血栓または動脈血栓の危険が高い自己免疫障害であることが知られており、既存の狭窄のある患者においてはより高い血栓塞栓症の危険が存在する。
アテローム性動脈硬化症に関して、アテローム性プラークが破裂すると、プラークは組織因子を露出または放出し、凝固を活性化し、局所的な血小板接着および凝集を開始し、それによって血栓症を引き起こす。
がん、特に前骨髄球性白血病、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、または結腸がんを患っている患者に関して、これらの腫瘍タイプは、第X因子活性化プロテアーゼを分泌することにより、または膜表面上に組織因子を発現／露出することにより、または両方により、凝固を活性化し得る。
感染症に関して、重度の感染症（たとえば敗血症）は、単球およびマクロファージによる組織因子の発現／露出を増大させ、活性化プロテインCの形成を減少させる。
エストロゲン含有経口避妊薬の使用に関して、危険は、様々な血栓塞栓症の素因となる遺伝的異常を有する患者および喫煙する女性においてより高い。
本明細書に記載される発明の方法の態様のいずれかにしたがって、MASP-2阻害抗体は、好ましくは、SEQ ID NO: 5の一部分に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である。いくつかの態様において、MASP-2抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される抗体断片である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は一本鎖分子である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、IgG1分子、IgG2分子、およびIgG4分子からなる群より選択される。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は、S228P変異を含むIgG4分子である。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体は古典的経路を実質的に阻害しない。いくつかの態様において、MASP-2阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、（a）（i）SEQ ID NO:6の31〜35位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1；および（ii）SEQ ID NO:6の50〜65位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2；および（iii）SEQ ID NO:6の95〜107位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域と；（b）（i）SEQ ID NO:7の24〜34位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1；および（ii）SEQ ID NO:7の50〜56位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2；および（iii）SEQ ID NO:7の89〜97位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域とを含む。いくつかの態様において、MASP-2阻害モノクローナル抗体は、SEQ ID NO:6として記載される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:7として記載される軽鎖可変領域とを含む。いくつかの態様において、MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:6に記載される重鎖可変領域とSEQ ID NO:7に記載される軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する。
本発明の好ましい態様が例示され、説明されたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、その中で様々な変更を加えることができることが理解されよう。
排他的所有権または特権が主張される本発明の態様は以下のように規定される。
本明細書に記載される発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになると考えられる。本明細書において引用される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて参照により、それぞれが個々に組み入れられるごとく、全体として本明細書に組み入れられる。
[本発明1001]
補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患、障害、または状態を予防、軽減、ならびに／または治療する方法であって、治療量のMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質が、SEQ ID NO:5の一部分に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、該方法。
[本発明1002]
前記それを必要とする対象が、
補体関連性炎症、フィブリンもしくは活性化血小板によって開始される過度な凝固もしくは接触系活性化と関連する、疾患、障害、もしくは状態を患っているか、または
該疾患、障害、もしくは状態を発症する危険を有する、
本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記対象が、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、術後血栓症、アテローム性動脈硬化プラーク破裂、および／もしくはプラーク不安定、鎌状赤血球症、低血圧症、表在性血栓性静脈炎、第V因子ライデン変異、ホルモン補充量療法（HRT）を受けていることからなる群より選択される疾患または障害を患っており、かつ／または後天性凝固亢進状態を患っている、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記対象が、冠動脈バイパス移植後および／または介入的心血管処置後、たとえば血管形成術後またはステント再留置後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、全身性炎症反応症候群（SIRS）、播種性血管内凝固症候群（DIC）、静脈閉塞症（VOD）、血栓性微小血管障害、ループス腎炎、虚血／再灌流障害、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ならびにアルツハイマー病からなる群より選択される疾患または障害を患っている、本発明1002の方法。
[本発明1005]
前記対象が、5-FU、GM-CSF、シスプラチン、ヘパリン、COX-2阻害因子、造影剤、コルチコステロイド、および抗精神病薬からなる群より選択される薬物による治療を受けていること、不動化および／もしくは手術による静脈うっ血、凝血塊形成に関与するタンパク質（たとえばプロテインC）の後天性欠損、ホモシステインレベルの上昇、心不全、機械弁の存在、インサイチュ血栓を伴う肺高血圧症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少症（heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis; HITT）、インサイチュ血栓を伴う川崎病、インサイチュ血栓を伴う高安動脈炎、転移性がんのトロンボフィリア、第VIII因子レベルの上昇、または妊娠のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、本発明1003の方法。
[本発明1006]
前記対象が、抗リン脂質症候群、がん（前骨髄球性白血病、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、および結腸腫瘍）、外傷もしくは手術による組織損傷、中央静脈中のカテーテルの存在、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、または炎症性腸疾患（IBD）のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、本発明1003の方法。
[本発明1007]
前記対象が、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害、たとえば遺伝性血管浮腫もしくは心肺バイパス術中の出血を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記対象が、糖尿病性黄斑浮腫を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記対象が、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有し、たとえば、トロンビン阻害因子による治療に適している該疾患または障害が、肺塞栓症、ある抗凝固薬から別の抗凝固薬への切り替え、および重篤HIT患者における体外循環回路開存性のための持続的腎代替療法（CRRT）の適応外使用（維持）からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記対象が、心房細動を以前に経験したことがあるか、それを現在患っているか、またはそれを発症する危険を有し、かつ前記MASP-2阻害抗体が、該対象における発作の危険を減らすのに十分な量で投与される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記対象が、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有し、たとえば、第XII因子阻害因子による治療に適している該疾患または障害が、深部静脈血栓症（一次予防と長期治療の両方）、非弁膜症性心房細動、心房細動を有するまたは有さない対象における急性冠症候群後の再発性虚血の予防、末期腎臓病、脳虚血、狭心症からなる群より選択され、医療機器（たとえば弁、微小口径移植片など）および／または体外循環回路と関連する凝固を減少させるかまたは防止する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記対象が、非弁膜症性心房細動を以前に経験したことがあるか、それを現在患っているか、またはそれを発症する危険を有し、かつ前記MASP-2阻害抗体が、該対象における発作および／または塞栓形成の危険を減らすのに十分な量で投与される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記対象が、凝固亢進状態を生じさせる遺伝子異常、またはそれを発症する危険を高める遺伝子異常を有する、本発明1003の方法。
[本発明1014]
前記遺伝子異常が、プロトロンビン20210遺伝子変異、MTHFR変異、プロテインCの欠損、プロテインSの欠損、プロテインAの欠損、プロテインZの欠損、アンチトロンビン欠損、およびトロンボフィリアを生じさせる遺伝子障害からなる群より選択される、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記対象が、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患、障害、または状態を有し、たとえば、血栓塞栓の傾向を高める該後天性の疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、抗リン脂質抗体、がん、高ホモシステイン血症、感染症、組織損傷、静脈うっ血（たとえば手術、整形外科的もしくは麻痺的不動化、心不全、妊娠、または肥満による）、および、対象がエストロゲン含有経口避妊薬を服用することからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記がんが、前骨髄球性白血病、肺、乳房、前立腺、膵臓、胃、および結腸からなる群より選択される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記対象が抗凝固薬療法を必要とし、かつ前記MASP-2阻害抗体が、標準的な抗凝固薬療法（たとえばワーファリン）の代替法として使用される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記対象が、標準的な抗凝固薬療法を通常禁じる状態、たとえばCNSアミロイド血管症を有する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記MASP-2阻害抗体が、そうでなければ標準的な抗凝固療法を受けている対象にブリッジング剤として術前投与される、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記MASP-2抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記MASP-2阻害抗体が、Fv、Fab、Fab'、F(ab) 2 、およびF(ab') 2 からなる群より選択される抗体断片である、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記MASP-2阻害抗体が一本鎖分子である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記MASP-2阻害抗体が、IgG1分子、IgG2分子、およびIgG4分子からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1024]
前記IgG4分子がS228P変異を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記MASP-2阻害抗体が古典的経路を実質的に阻害しない、本発明1001の方法。
[本発明1026]
MASP-2阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、
（a）（i）SEQ ID NO:6の31〜35位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1；および（ii）SEQ ID NO:6の50〜65位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2；および（iii）SEQ ID NO:6の95〜107位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域と、
（b）（i）SEQ ID NO:7の24〜34位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1；および（ii）SEQ ID NO:7の50〜56位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2；および（iii）SEQ ID NO:7の89〜97位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域と
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1027]
MASP-2阻害モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:6として記載される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:7として記載される軽鎖可変領域とを含む、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:6に記載される重鎖可変領域とSEQ ID NO:7に記載される軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、本発明1001の方法。

Claims (28)

  1. 補体系のフィブリン誘導活性化ならびに凝固および／もしくは接触系の関連する活性化と関連する疾患、障害、または状態を予防、軽減、ならびに／または治療する方法であって、治療量のMASP-2阻害抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、該MASP-2阻害物質が、SEQ ID NO:5の一部分に特異的に結合するMASP-2モノクローナル抗体またはその断片である、該方法。
  2. 前記それを必要とする対象が、
    補体関連性炎症、フィブリンもしくは活性化血小板によって開始される過度な凝固もしくは接触系活性化と関連する、疾患、障害、もしくは状態を患っているか、または
    該疾患、障害、もしくは状態を発症する危険を有する、
    請求項1記載の方法。
  3. 前記対象が、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、術後血栓症、アテローム性動脈硬化プラーク破裂、および／もしくはプラーク不安定、鎌状赤血球症、低血圧症、表在性血栓性静脈炎、第V因子ライデン変異、ホルモン補充量療法（HRT）を受けていることからなる群より選択される疾患または障害を患っており、かつ／または後天性凝固亢進状態を患っている、請求項2記載の方法。
  4. 前記対象が、冠動脈バイパス移植後および／または介入的心血管処置後、たとえば血管形成術後またはステント再留置後の再狭窄、アテローム性動脈硬化症、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、全身性炎症反応症候群（SIRS）、播種性血管内凝固症候群（DIC）、静脈閉塞症（VOD）、血栓性微小血管障害、ループス腎炎、虚血／再灌流障害、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、ならびにアルツハイマー病からなる群より選択される疾患または障害を患っている、請求項2記載の方法。
  5. 前記対象が、5-FU、GM-CSF、シスプラチン、ヘパリン、COX-2阻害因子、造影剤、コルチコステロイド、および抗精神病薬からなる群より選択される薬物による治療を受けていること、不動化および／もしくは手術による静脈うっ血、凝血塊形成に関与するタンパク質（たとえばプロテインC）の後天性欠損、ホモシステインレベルの上昇、心不全、機械弁の存在、インサイチュ血栓を伴う肺高血圧症、心房細動、ヘパリン起因性血小板減少症（HIT）、血栓症を伴うヘパリン起因性血小板減少症（heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis; HITT）、インサイチュ血栓を伴う川崎病、インサイチュ血栓を伴う高安動脈炎、転移性がんのトロンボフィリア、第VIII因子レベルの上昇、または妊娠のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、請求項3記載の方法。
  6. 前記対象が、抗リン脂質症候群、がん（前骨髄球性白血病、肺腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍、胃腫瘍、および結腸腫瘍）、外傷もしくは手術による組織損傷、中央静脈中のカテーテルの存在、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、または炎症性腸疾患（IBD）のうちの少なくとも1つまたは複数による後天性凝固亢進状態を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、請求項3記載の方法。
  7. 前記対象が、カリクレイン阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害、たとえば遺伝性血管浮腫もしくは心肺バイパス術中の出血を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、請求項1記載の方法。
  8. 前記対象が、糖尿病性黄斑浮腫を患っているか、またはそれを発症する危険を有する、請求項1記載の方法。
  9. 前記対象が、トロンビン阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有し、たとえば、トロンビン阻害因子による治療に適している該疾患または障害が、肺塞栓症、ある抗凝固薬から別の抗凝固薬への切り替え、および重篤HIT患者における体外循環回路開存性のための持続的腎代替療法（CRRT）の適応外使用（維持）からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  10. 前記対象が、心房細動を以前に経験したことがあるか、それを現在患っているか、またはそれを発症する危険を有し、かつ前記MASP-2阻害抗体が、該対象における発作の危険を減らすのに十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
  11. 前記対象が、第XII因子阻害因子による治療に適している疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症する危険を有し、たとえば、第XII因子阻害因子による治療に適している該疾患または障害が、深部静脈血栓症（一次予防と長期治療の両方）、非弁膜症性心房細動、心房細動を有するまたは有さない対象における急性冠症候群後の再発性虚血の予防、末期腎臓病、脳虚血、狭心症からなる群より選択され、医療機器（たとえば弁、微小口径移植片など）および／または体外循環回路と関連する凝固を減少させるかまたは防止する、請求項1記載の方法。
  12. 前記対象が、非弁膜症性心房細動を以前に経験したことがあるか、それを現在患っているか、またはそれを発症する危険を有し、かつ前記MASP-2阻害抗体が、該対象における発作および／または塞栓形成の危険を減らすのに十分な量で投与される、請求項1記載の方法。
  13. 前記対象が、凝固亢進状態を生じさせる遺伝子異常、またはそれを発症する危険を高める遺伝子異常を有する、請求項3記載の方法。
  14. 前記遺伝子異常が、プロトロンビン20210遺伝子変異、MTHFR変異、プロテインCの欠損、プロテインSの欠損、プロテインAの欠損、プロテインZの欠損、アンチトロンビン欠損、およびトロンボフィリアを生じさせる遺伝子障害からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
  15. 前記対象が、血栓塞栓の傾向を高める後天性の疾患、障害、または状態を有し、たとえば、血栓塞栓の傾向を高める該後天性の疾患または障害が、アテローム性動脈硬化症、抗リン脂質抗体、がん、高ホモシステイン血症、感染症、組織損傷、静脈うっ血（たとえば手術、整形外科的もしくは麻痺的不動化、心不全、妊娠、または肥満による）、および、対象がエストロゲン含有経口避妊薬を服用することからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  16. 前記がんが、前骨髄球性白血病、肺、乳房、前立腺、膵臓、胃、および結腸からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
  17. 前記対象が抗凝固薬療法を必要とし、かつ前記MASP-2阻害抗体が、標準的な抗凝固薬療法（たとえばワーファリン）の代替法として使用される、請求項1記載の方法。
  18. 前記対象が、標準的な抗凝固薬療法を通常禁じる状態、たとえばCNSアミロイド血管症を有する、請求項17記載の方法。
  19. 前記MASP-2阻害抗体が、そうでなければ標準的な抗凝固療法を受けている対象にブリッジング剤として術前投与される、請求項17記載の方法。
  20. 前記MASP-2抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項1記載の方法。
  21. 前記MASP-2阻害抗体が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される抗体断片である、請求項1記載の方法。
  22. 前記MASP-2阻害抗体が一本鎖分子である、請求項1記載の方法。
  23. 前記MASP-2阻害抗体が、IgG1分子、IgG2分子、およびIgG4分子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  24. 前記IgG4分子がS228P変異を含む、請求項23記載の方法。
  25. 前記MASP-2阻害抗体が古典的経路を実質的に阻害しない、請求項1記載の方法。
  26. MASP-2阻害モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、
    （a）（i）SEQ ID NO:6の31〜35位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H1；および（ii）SEQ ID NO:6の50〜65位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H2；および（iii）SEQ ID NO:6の95〜107位からのアミノ酸配列を含む重鎖CDR-H3を含む、重鎖可変領域と、
    （b）（i）SEQ ID NO:7の24〜34位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L1；および（ii）SEQ ID NO:7の50〜56位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L2；および（iii）SEQ ID NO:7の89〜97位からのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR-L3を含む、軽鎖可変領域と
    を含む、請求項1記載の方法。
  27. MASP-2阻害モノクローナル抗体が、SEQ ID NO:6として記載される重鎖可変領域と、SEQ ID NO:7として記載される軽鎖可変領域とを含む、請求項1記載の方法。
  28. 前記MASP-2阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO:6に記載される重鎖可変領域とSEQ ID NO:7に記載される軽鎖可変領域とを含む参照抗体によって認識されるエピトープの少なくとも一部を特異的に認識する、請求項1記載の方法。
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