KR20230138505A - 급성 covid-19 및 급성 covid-19 이후의 발병 위험을 평가하기 위한 바이오마커 - Google Patents

급성 covid-19 및 급성 covid-19 이후의 발병 위험을 평가하기 위한 바이오마커 Download PDF

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토마스 두들러
니콜라스 제임스 린치
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캐슬린 샤퍼
무네히사 야부키
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Abstract

본원에는 생물학적 유체, 예컨대 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체에서 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도를 결정하기 위한 조성물, 키트 및 방법이 개시된다. 또한 포유류 대상체에서 렉틴 경로 활성화 상태를 결정하고 그로써 SARS-CoV-2로 감염된 또는 감염되었던 대상체가 COVID-19 관련 ARDS 또는 다른 좋지 못한 결과를 발생시킬 위험을 평가하거나, 또는 MASP-2 억제제와 같은 보체 억제제로 필요로 하는 대상체의 치료에 대한 필요성 또는 치료의 효능을 결정하기 위한 상기 조성물, 방법 및 키트의 사용 방법이 개시된다.

Description

급성 COVID-19 및 급성 COVID-19 이후의 발병 위험을 평가하기 위한 바이오마커
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 서면 사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며 그로써 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 함유한 텍스트 파일의 명칭은 MP_1_0319_PCT_Sequence_Listing_20220131_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 147 KB이고; 2022년 2월 1일에 생성되었으며; 명세서의 출원과 함께 EFS-웹을 통해 제출되었다.
보체 시스템은 인간 및 다른 척추동물에서 미생물 감염 및 기타 급성 손상에 대한 면역 반응을 개시, 증폭 및 조정하기 위한 초기 작용 메커니즘을 제공한다(M.K.　Liszewski and J.P.　Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, edited by W.E.　Paul, Raven Press, Ltd., New York). 보체 활성화가 잠재적 병원체에 대해 귀중한 1차 방어선을 제공하지만, 보호 면역 반응을 촉진하는 보체의 활성이 또한 숙주에 대한 잠재적 치료를 나타낼 수 있다(K.R.　Kalli, et　al., Springer Semin. Immunopathol.　15:417-431, 1994; B.P.　Morgan, Eur.　J. Clinical Investig.　24:219-228, 1994). 예를 들어,　C3 및　C5 단백질 분해 생성물은 호중구를 모집하고 활성화한다. 숙주 방어를 위해 없어서는 안되는 것이지만, 활성화된 호중구는 파괴 효소를 무차별적으로 방출하고 장기 손상을 야기할 수 있다. 더불어, 보체 활성화는 미생물 표적에뿐만 아니라 인접한 숙주 세포 상에 용해성 보체 구성요소의 침착을 야기하여 숙주 세포 용해를 초래할 수 있다.
현재, 보체 시스템은 3개의 뚜렷한 경로: 고전적 경로, 렉틴 경로, 및 대체 경로를 통해 활성화될 수 있는 것으로 널리 받아들여진다. 고전적 경로는 대개 외래 입자(즉, 항원)에 결합된 숙주 항체로 구성된 복합체에 의해 촉발되며 따라서 특이적 항체 반응의 생성을 위해서는 항원에 대한 사전 노출을 필요로 한다. 고전적 경로의 활성화는 숙주에 의한 선행 적응 면역 반응에 좌우되기 때문에, 고전적 경로는 획득된 면역 체계의 일부이다. 대조적으로, 렉틴 및 대체 경로는 모두 적응 면역과 무관하며 선천성 면역 체계의 일부이다.
렉틴 경로는 나이브 숙주에서 감염에 대한 숙주 방어에서 주된 역할을 하는 것으로 널리 여겨진다. 숙주 방어에서 MBL의 개선에 대한 강력한 증거는 기능적 MBL의 혈청 수준이 감소된 환자의 분석으로부터 유래한다(Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). 그러한 환자는 재발성 박테리아 및 진균 감염에 대한 민감성을 나타낸다. 이들 증상은 대개 생애 초기에, 모체로부터 유래된 항체 역가가 약해짐에 따라 분명한 취약성 기간 동안, 그러나 항체 반응의 전체 레퍼토리가 발달하기 전에 분명하다. 이 증후군은 종종 MBL 올리고머의 적절한 형성을 간섭하는, MBL의 교원성 부분에서 여러 부분에서의 돌연변이로부터 비롯된다. 그러나, MBL이 보체와 무관한 옵소닌으로서 기능할 수 있기 때문에, 감염에 대해 증가된 취약성의 어느 정도가 손상된 보체 활성화로 인한 것인지는 알지 못한다.
3개의 모든 경로(즉, 고전적, 렉틴 및 대체)는 C5에서 수렴하는 것으로 여겨져 왔고, 그것은 절단되어 다수의 전염증 효과를 가진 생성물을 형성한다. 수렴된 경로는 말단 보체 경로로 언급되었다. C5a는 평활근 및 혈관 긴장도, 뿐만 아니라 혈관 투과도의 변경을 유도하는 가장 강력한 아나필라톡신이다. 그것은 또한 호중구와 단핵세포 둘 다의 강력한 케모탁신 및 활성제이다. C5a 매개 세포 활성화는 사이토카인, 가수분해 효소, 아라키돈산 대사산물, 및 반응성 산소 종을 포함한 다수의 추가 염증성 매개체의 방출을 유도함으로써 염증 반응을 상당히 증폭시킬 수 있다. C5 절단은 막 공격 복합체(MAC)로도 알려져 있는 C5b-9의 형성으로 이어진다. 이제 아용해성(sublytic) MAC 침착이 용해성 기공 형성 복합체로서의 역할 외에 염증에서 중요한 역할을 할 수 있다는 강력한 증거가 있다.
면역 방어에서의 본질적인 역할 외에, 보체 시스템은 많은 임상 조건에서 조직 손상에 기여한다. 비록 고전적 및 대체 보체 경로 모두가 비감염성 인간 질환의 병인에 있음을 암시하는 광범위한 증거가 있지만, 렉틴 경로의 역할은 이제 평가되기 시작하였다. 최근의 연구는 렉틴 경로의 활성화가 허혈/관류 손상에서 보체 활성화 및 관련된 염증의 원인일 수 있다는 증거를 제공한다. Collard　등(2000)은 산화 스트레스를 받은 배양된 내피 세포가 MBL에 결합하여 인간 혈청에 노출될 때 C3의 침착을 보인다고 보고하였다(Collard　et　al., Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000)). 더불어, 항-MBL 단클론성 항체 차단으로 인간 혈청의 치료는 MBL 결합 및 보체 활성화를 억제하였다. 이들 발견은 심근 허혈-재관류의 래트 모델로 확장되었는데, 래트 MBL에 대해 지시된 차단 항체로 처리된 래트가 관상 동맥의 폐쇄시 대조군 항체로 치료된 래트보다 상당히 더 적은 심근 손상을 보였다(Jordan　et　al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). 산화성 스트레스 후에 혈관 내피에 대한 MBL 결합의 분자상 메커니즘은 명확하지 않다; 최근 연구는 산화성 스트레스 후에 렉틴 경로의 활성화가 당콘쥬게이트에 대한 것이 아닌, 혈관 내피 사이토케라틴에 대한 MBL 결합에 의해 매개될 수 있음을 시사한다(Collard et　al., Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001)). 다른 연구는 허혈/재관류 손상의 병인에서 고전적 및 대체 경로를 함축하였고 이 질환에서 렉틴 경로의 역할은 여전히 논란의 여지가 있다(Riedermann, N.C.,　et　al., Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003).
섬유증(Fibrosis)은 일반적으로 손상 또는 부상에 대한 반응으로 장기 또는 조직에서 과도한 결합 조직의 형성이다. 섬유증의 특징은 국소적 외상에 이어 과도한 세포외 매트릭스의 생성이다. 손상에 대한 정상적인 생리적 반응은 결합 조직의 침착을 초래하지만, 이런 초기에 유익한 회복 과정은 지속적이고 병리적이 되어, 조직의 구조 및 기능을 변경시킬 수 있다. 세포 수준에서, 상피 세포 및 섬유모세포는 근섬유모세포로 증식하고 분화하여, 매트릭스 수축, 증가된 강직성, 미세혈관 압박, 및 저산소증(hypoxia)을 초래한다. 대식세포 및 림프구를 포함한 염증 세포의 유입은 사이토카인 방출을 초래하고 콜라겐, 피브로넥틴 및 섬유증의 기타 분자 마커의 침착을 증폭시킨다. 종래의 치료 접근법은 대부분 코르티코스테로이드 및 면역억제 약물을 사용하여 섬유증의 염증 과정을 표적으로 하였다. 유감스럽게도, 이들 항염증제는 거의 내지는 전혀 임상 효과를 나타내지 못하였다. 현재 섬유증에 대한 효과적인 치료 또는 치료법은 없지만, 동물 연구 및 일화성 인간 보고서는 섬유화 조직 손상이 반전될 수 있음을 시사한다(Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, Vol 10:226-237, 2014).
신장은 손상으로부터 회복 능력이 제한되어 있다. 다양한 신장 병리가 국소 염증을 초래하고 그것은 신장 조직의 반흔 및 섬유증을 유발한다. 염증 자극의 영구화는 세뇨관 간질 염증(tubulointerstitial inflammation) 및 섬유증 및 만성 신장 질환에서 진행성 신장 기능 손상을 구동시킨다. 말기 신부전(end-stage renal failure)으로의 진행은 상당한 이환율 및 사망률과 연관된다. 세뇨관 간질 섬유증(tubulointerstitial fibrosis)이 다수의 신장 병리의 공통된 종점이기 때문에, 그것은 신부전을 예방할 목적의 치료법에 대한 핵심 목표를 나타낸다. 원발성 신장 질환과 무관한 위험 요인(예컨대, 단백뇨(proteinuria))이 국소 염증을 유발함으로써 신장 섬유증의 발달 및 신정 배설 기능의 상실에 기여하고, 계속해서 질환 진행을 향상시킨다.
많은 질환 및 장애, 예컨대, 예를 들어, 만성 신장 질환으로 이어지는 세뇨관 간질 섬유증에서 섬유증의 역할의 관점에서, 섬유증에 의해 야기된 또는 악화된 질환 및 병태를 치료하기 위하여 치료적으로 효과적인 작용제를 개발할 필요가 있다는 압박감이 있다. 신장 질환의 염증성 섬유화 촉진 경로를 표적으로 하는 신규 및 기존의 치료의 부족을 추가로 고려하면, 신장 섬유증을 치료, 억제, 예방 및/또는 반전시키고 그로써 진행성 만성 신장 질환을 예방하기 위한 치료적으로 효과적인 작용제를 개발할 필요가 있다.
코로나바이러스(Coronavirus) 질환 2019(COVID-19)는 SARS 바이러스와 밀접하게 관련된 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome) 코로나바이러스 2(SARS 코로나바이러스 2 또는 SARS-CoV-2)에 의해 야기된 감염성 질환이다(World Health Organization, 2/11/2020, Novel Coronavirus Situation Report 22). COVID-19에 걸린 사람들은 열, 마른 기침, 피로 및 호흡 곤란을 나타낼 수 있다. 사례는 가장 취약한 사람들에서 폐렴(pneumonia), 중증 급성 호흡기 증후군, 사망을 포함한 호흡기 기능장애로 진행될 수 있다(예컨대, Hui D.S. et al., Int J Infect Dis 91:264-266, Jan 14, 2020 참고). 백신이나 특정 항바이러스 치료제는 없고, 증상의 치료 및 지지적인 돌봄을 포함한 관리가 있다.
인플루엔자(또한 "플루"로도 알려짐)는 RNA 인플루엔자 바이러스에 의해 야기된 감염성 질환이다. 인플루엔자 바이러스 감염의 증상은 경미한 것에서 중증까지일 수 있고, 고열, 콧물, 인후통, 근육 및 관절통, 두통, 기침 및 피로감이 포함된다. 이들 증상은 전형적으로 바이러스에 노출된 후 2일 후에 시작하여 대부분 1주 미만 동안 지속되지만, 기침은 2주를 초과하여 지속될 수 있다("Influenza Seasonal, World Health Organization 6 November 2018 참고). 인플루엔자의 합병증에는 바이러스성 폐렴, 급성 호흡기 장애 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 이차 세균성 폐렴, 부비동 감염(sinus infection) 및 천식(asthma) 또는 심부전(heart failure)과 같은 이전의 건강 문제의 악화가 포함될 수 있다("Key Facts About Influenza (Flu)" Centers for Disease Control and Prevention (CDC), September 9, 2014 참고). 인플루엔자의 효과는 일반 감기의 효과보다 훨씬 더 중증이고 더 오래 지속된다. 대부분의 사람은 약 1 내지 2주 내에 완전히 회복되겠지만, 다른 사람들은 폐렴과 같이 생명에 치명적인 합병증이 발병할 것이다. 그러므로, 인플루엔자는 특히 약자, 유아 및 고령자, 손상된 면역 체계를 가졌거나, 또는 만성 질환이 있는 사람들에게 치명적일 수 있다. 문헌[Hilleman MR, Vaccine.　20　(25-26): 3068-87 (2002)] 참고.
인플루엔자 바이러스의 4가지 유형 중 3개: A형, B형, 및 C형이 인간에게 영향을 미친다("Types of Influenza Viruses Seasonal Influenza (Flu), Centers for Disease Control and Prevention (CDC). 27 September 2017 참고). D형은 인간을 감염시키지 않는 것으로 나타났지만, 감염시킬 잠재력을 가진 것으로 여겨진다("Novel Influenza D virus: Epidemiology, pathology, evolution and biological characteristics", Virulence. 8 (8): 1580-91, 2017 참고). 인간에서 확인된 인플루엔자 A의 혈청형은: H1N1(1918년에 "스페인 독감" 및 2009년에 "돼지 독감"을 유발함); H2N2(1957년에 "아시아 독감"을 유발함), H3N2(1968년에 "홍콩 독감"을 유발함), H5N1(2004년에 "조류 독감"을 유발함), H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 및 H6N1이다. 문헌[세계보건기구(2006년 6월 30일). "Epidemiology of WHO-confirmed human cases of avian influenza A (H5N1) infection, Wkly Epidemiol Rec.　81　(26): 249-57.; Fouchier RA, et al. (2004) PNAS 101 　(5): 1356-61; Wkly Epidemiol Rec.　83　(46): 415-20, Asian Lineage Avian Influenza A(H7N9) Virus, Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 7 December 2018]을 참고한다.
열, 두통 및 피로와 같은 인플루엔자 바이러스(독감으로도 알려져 있음)의 공통적인 증상은 인플루엔자 감염 세포로부터 생성된 대량의 전염증성 사이토카인 및 케모카인(예컨대 인터페론 또는 종양 괴사 인자)의 결과이다. 문헌[Eccles R. 　et al., Lancet Infect Dis 5(11):718-25 (2005); Schmitz N, et al.,　Journal of Virology.　79　(10): 6441-8 (2005)]을 참고한다. 이런 대규모 면역 반응은 생명을 위협하는 사이토카인 폭풍을 초래할 수 있다. 이 효과는 H5N1 조류 인플루엔자,　및 1918 팬데믹 스트레인 둘 다의 비정상적인 치사율의 원인인 것으로 제안되었다. Cheung CY, et al., Lancet.　360　(9348): 1831-37 (2002); Kash JC, et al., Nature.　443　(7111): 578-81 (2006). 인플루엔자는 또한 프로그래밍된 세포 사멸(세포자멸사)를 촉발하는 것으로 여겨진다(Spiro SG, et al., Clinical Respiratory Medicine, Elsevier Health Sciences. p.　311 (2012) 참고).
그러므로, 코로나바이러스 유도 폐렴 및 급성 호흡기 장애 증후군 및 인플루엔자 바이러스 유도 폐렴 및 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제 및/또는 예방하기 위하여 치료적으로 효과적인 작용제를 개발할 긴급한 필요성이 있다.
더불어, COVID-19에 대해 사람들을 치료 및 보호하는 성공률을 최대화하기 위하여, 급성 COVID-19 및/또는 장기 질환(급성 COVID-19 이후, 달리 장기 COVID-19 증후군으로도 알려져 있음) 발병의 위험이 있는, 또는 보호 면역 반응 대비 COVID-19 질환 반응을 보인 그런 사람들을 확인하기 위한 바이오마커 및 고도로 정확한 테스트에 대한 긴급한 필요가 있다. 또한 장기 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체를 포함하여 SARS-CoV-2로 감염된 대상체에서 COVID-19 관련 합병증을 치료 및/또는 예방하기 위한 치료제의 효능을 결정하기 위한 테스트에 대한 필요가 있다.
본 요약은 아래의 상세한 설명에서 추가로 기술되는 개념의 선택을 간단한 형태로 소개하기 위해 제공된다. 본 요약은 청구된 주제의 핵심 특징을 확인하기 위해 의도된 것이 아니며, 또한 청구된 주제의 범주를 결정하는데 도움이 되기 위해 의도된 것이 아니다.
한 측면으로, 본 발명은 SARS-CoV-2로 감염된 포유류 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군, 폐렴 또는 일부 다른 폐 또는 COVID-19의 다른 급성 징후, 예컨대 혈전증(thrombosis)을 치료, 억제, 완화, 또는 예방하는 방법을 제공하며, 방법은 (i) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 결정하는 단계, 여기서 건강한 대조군 샘플 또는 다른 참조 표준과 비교하여 MASP-2/C1-INH 복합체의 증가된 수준은 COVID-19의 하나 이상의 급성 징후가 발생할 위험의 증가를 나타내는 것인 단계; 및 (ii) 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 호흡기 증후군을 앓고 있고 방법은 대상체에게 적어도 하나의 호흡기 증상을 개선하기 위해(즉, 호흡기 기능을 개선하기 위해) 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q 의존성 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 소분자, 예컨대 합성 또는 반합성 소분자이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 C3b 침착을 30 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 SARS-CoV-2로 감염된 포유류 대상체에서 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증을 치료, 개선, 예방 또는 발병할 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 (i) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 결정하는 단계, 여기서 건강한 대조군 샘플과 비교하여 MASP-2/C1-INH 복합체의 증가된 수준은 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증이 발생할 위험의 증가를 나타내는 것인 단계; 및 (ii) 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q 의존성 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 소분자, 예컨대 합성 또는 반합성 소분자이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 고전적 경로를 실질적으로 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 C3b 침착을 30 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 C1-INH와의 복합체에서 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체는 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체는 서열 번호:87로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:88로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 검출 가능한 모이어티, 예를 들어 본원에 추가로 기술된 면역검정에 사용하기에 적합한 검출 가능한 모이어티로 표지된다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 단편은 기질, 예컨대 면역검정, 예컨대 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하기 위한 면역검정에 사용하기에 적합한 기질 상에 고정된다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 C1-INH와의 복합체에서 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 제공하며, 항체는 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체는 서열 번호:97로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:98로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 검출 가능한 모이어티, 예를 들어 본원에 추가로 기술된 면역검정에 사용하기에 적합한 검출 가능한 모이어티로 표지된다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 단편은 기질, 예컨대 면역검정, 예컨대 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하기 위한 면역검정에 사용하기에 적합한 기질 상에 고정된다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 양을 측정하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 인간 대상체로부터 테스트용 생물학적 샘플을 제공하는 단계; (b) 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획 및 검출하는 단계를 포함하는 면역검정을 수행하는 단계, 여기서 MASP-2/C1-INH 복합체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체로 포획되고; MASP-2/C1-INH 복합체는 C1-INH에 특이적으로 결합하는 항체로 직접 또는 간접적으로 검출되는 것인 단계; 및 (c) (b)에 따라 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 미리 결정된 수준 또는 대조군 샘플과 비교하는 단계로, 테스트 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 나타내는 것인 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 대상체로부터의 유체 샘플이다. 일부 구체예에서, 인간 대상체는 현재 SARS-CoV-2로 감염되었거나, 또는 이전에 SARS-CoV-2로 감염되었다. 일부 구체예에서, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 일부 구체예에서, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체는 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 SARS-CoV-2로 감염 중이거나 또는 감염된 대상체의 COVID-19 관련 ARDS 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증의 발병 위험을 결정하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하는 단계, (c) 측정된 수준을 MASP-2/C1-INH 복합체의 미리 결정된 수준 또는 참조 표준과 비교하여 COVID-19 관련 ARDS 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증이 발병할 위험을 평가하는 단계; 및 (d) 대상체의 COVID-19 관련 ARDS 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증의 발병 위험을 결정하고 그 결과를 환자, 의사 또는 데이터베이스에 보고하는 단계; (e) 선택적으로, 급성 질환 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증 감염이 발병할 가능성이 있는 것으로 결정된 대상체에게 치료를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 면역검정으로 측정된다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 측정하기 위한 ELISA 검정과 같은 면역검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역검정은 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역검정은 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 필요로 하는 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로의 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량을 제1 시점에 포유류 대상체에게 투여하는 단계; (b) 단계 (a) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제1 수준을 평가하는 단계; (c) 제2 시점에, 대상체를 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로 치료하는 단계; (d) 단계 (c) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제2 수준을 평가하는 단계; 및 (e) 단계 (b)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 단계 (d)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준과 비교하여 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 COVID-19 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 인간 대상체이다. 일부 구체예에서, 대상체는 HSCT-TMA, IgAN, 루푸스 신염(Lupus Nephritis) 및 이식편대숙주병(Graft-versus-Host Disease) 또는 일부 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 인간 대상체이다. 일부 구체예에서, MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 면역검정으로 측정된다. 일부 구체예에서, 단계 (b)는 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 측정하기 위한 ELISA 검정과 같은 면역검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역검정은 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역검정은 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체의 사용을 포함한다.
본 발명의 전술한 측면 및 많은 수반되는 장점은 첨부된 도면과 함께 취해질 때 다음의 상세한 설명을 참조로 더 잘 이해됨에 따라 보다 쉽게 인정될 것이다:
도　1은 인간 MASP-2의 게놈 구조를 예시하는 다이아그램이다;
도　2A는 인간 MASP-2 단백질의 도메인 구조를 예시하는 개략도이다;
도　2B는 인간 MAp19 단백질의 도메인 구조를 예시하는 개략도이다;
도　3은 쥐과 MASP-2 녹아웃 전략을 예시하는 다이아그램이다;
도　4는 인간 MASP-2 미니유전자 구성물을 예시하는 다이아그램이다;
도　5A는 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 만난 상에서 C4b 침착의 결핍에 의해 측정되는 바 MASP-2 결핍이 렉틴 경로 매개 C4 활성화의 손실로 이어지는 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　5B는 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 지모산 상에서 C4b 침착의 결핍에 의해 측정되는 바 MASP-2 결핍이 렉틴 경로 매개 C4 활성화의 손실로 이어지는 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　5C는 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 만난 및 지모산 상에서 C4b 침착에 의해 측정되는 바 MASP-2+/-; MASP-2-/- 및 야생형 스트레인으로부터 얻어진 혈청 샘플의 상대적인 C4 활성화 수준을 입증하는 결과를 도시한다;
도　6은 실시예 2에서 기술되는 것과 같이, 만난 상에서 C4b 침착에 의해 측정되는 바, MASP-2-/- 혈청 샘플에 쥐과 재조합 MASP-2의 첨가가 단백질 농도 의존성 방식으로 렉틴 경로 매개 C4 활성화를 회복시키는 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　7은 실시예 8에서 기술되는 것과 같이, 고전적 경로가 MASP-2-/- 스트레인에서 기능적인 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　8A는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체　#11이 C3 전환효소 형성을 억제하는 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　8B는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #11이 천연 래트 MASP-2에 결합하는 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　8C는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, 항-MASP-2 Fab2 항체 #41이 C4 절단을 억제하는 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　9는 실시예 10에서 기술되는 것과 같이, C3 전환효소 형성을 억제한 모든 테스트된 항-MASP-2 Fab2 항체가 C4 절단을 억제하는 것으로 나타난 것을 입증하는 결과를 도시한다;
도　10은 실시예 11에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 차단 Fab2 항체의 에피토프 지도화에 사용된 래트 MASP-2로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드를 예시하는 다이아그램이다;
도　11은 실시예 11에서 기술되는 것과 같이, 래트 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 항-MASP-2 Fab2 #40 및 #60의 결합을 입증하는 결과를 도시한다;
도 12A는 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 인간 MASP-2 단클론성 항체(OMS646)가 대략 1 nM의 IC50 값으로 렉틴 매개 MAC 침착을 억제하는 것을 입증하는, 렉틴 경로 특정 검정 조건 하에서 OMS646의 존재 또는 부재 하의 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 12B는 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 인간 MASP-2 단클론성 항체(OMS646)가 고전적 경로 매개 MAC 침착을 억제하지 않는 것을 입증하는, 고전적 경로 특정 검정 조건 하에서 OMS646의 존재 또는 부재 하의 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 12C는 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 인간 MASP-2 단클론성 항체(OMS646)가 대체 경로 매개 MAC 침착을 억제하지 않는 것을 입증하는, 대체 경로 특정 검정 조건 하에서 OMS646의 존재 또는 부재 하의 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다;
도 13은 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 표시된 용량에서 투여 후 시간의 함수로서 인간 MASP-2 단클론성 항체(OMS646) 농도(그룹당 n=3마리 동물의 평균)를 보여주는, 마우스에서 OMS646의 약동학(PK) 프로파일을 그래프로 도시한다;
도 14A는 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 정맥내 투여 후 마우스에서 전신적 렉틴 경로 활성의 강하로서 측정된, 인간 MASP-2 단클론성 항체(OMS646)의 약력학(PD) 반응을 그래프로 도시한다;
도 14B는 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 피하 투여 후 마우스에서 전신적 렉틴 경로 활성의 강하로서 측정된, 인간 MASP-2 단클론성 항체(OMS646)의 약력학(PD) 반응을 그래프로 도시한다;
도 15는 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 조직 섹션은 일측성 요관 폐색(unilateral ureteric obstruction, UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어졌다;
도 16은 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, F4/80 대식세포-특이적 항체로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 조직 섹션은 일측성 요관 폐색(UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어졌다.
도 17은 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 일측성 요관 폐색(UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, 정량적 PCR(qPCR)에 의해 측정된 바, 콜라겐-4의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 18은 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 일측성 요관 폐색(UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, qPCR에 의해 측정된 바, 변형 성장 인자(TGFβ-1)의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 19는 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 일측성 요관 폐색(UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, qPCR에 의해 측정된 바, 인터류킨-6(IL-6)의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 20은 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 일측성 요관 폐색(UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서, qPCR에 의해 측정된 바, 인터페론-γ의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다.
도 21은 실시예 15에서 기술되는 것과 같이, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 여기서 조직 섹션은 MASP-2 억제 항체 및 아이소타입 대조군 항체로 치료된 야생형 마우스로부터 일측성 요관 폐색(UUO) 7일 후 얻어졌다.
도 22는 실시예 15에서 기술되는 것과 같이, IgG4 아이소타입 대조군으로 치료된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐색된 신장으로부터의 조직의 하이드록실 프롤린의 수준과 비교된, MASP-2 억제 항체로 치료된 야생형 마우스로부터 얻어진 일측성 요관 폐색(UUO) 후 7일에 수득된 신장으로부터의 하이드록실 프롤린 함량을 그래프로 도시한다.
도 23은 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 식염수만을 받은 야생형 대조군 마우스(n=2마리), BSA를 받은 야생형 마우스(n=6마리) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스(n=6마리)에서 단백질 과부하 연구의 15일차에 측정된 혈청 단백질의 총량(mg/ml)을 그래프로 도시한다.
도 24는 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 식염수만을 받은 야생형 대조군 마우스(n=2마리), BSA를 받은 야생형 마우스(n=6마리) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스(n=6마리)에서 단백질 과부하 연구의 15일차에 24시간 동안 수집된 소변에서 배설된 단백질의 총량(mg)을 그래프로 도시한다.
도 25는 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 단백질 과부하 연구의 15일차에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 신장 조직 섹션을 다음과 같이 도시한다: (패널 A) 야생형 대조군 마우스; (패널 B) MASP-2-/- 대조군 마우스, (패널 C) BSA로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 D) 소 혈청 알부민(BSA)으로 처리된 MASP-2-/- 마우스.
도 26은 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 대식세포 평균 염색 영역(%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 야생형 대조군 마우스(n=2마리), BSA로 처리된 야생형 마우스(n=6마리), 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)로부터 단백질 과부하 연구의 15일차에 얻어졌다.
도 27A는 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 대식세포 침윤 대비 24시간 샘플로부터의 소변에서 측정된 총 배설 단백질을 도표화함으로써(평균 염색 영역 %), BSA로 처리된 각각의 야생형 마우스(n=6마리)에서 대식세포의 존재-단백뇨 상관관계에 대한 분석을 그래프로 도시한다.
도 27B는 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 대식세포 침윤 대비 24시간 샘플의 소변에서 총 배설 단백질을 도표화함으로써(평균 염색 영역 %), BSA로 처리된 각각의 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)에서 대식세포의 존재-단백뇨 상관관계에 대한 분석을 그래프로 도시한다.
도 28은 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, BSA로 처리된 야생형 마우스(n=4마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TGFβ 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다.
도 29는 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, BSA로 처리된 야생형 마우스(n=4마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TNFα 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다.
도 30은 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 야생형 대조군 마우스, MASP-2-/- 대조군 마우스, BSA로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=7마리)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% IL-6 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다.
도 31은 실시예 16에서 기술되는 것과 같이, 야생형 대조군 마우스(n=1마리), MASP-2-/- 대조군 마우스(n=1마리), BSA로 처리된 야생형 마우스(n=6마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=7마리)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20 고전력장(HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸 세포의 빈도를 그래프로 도시한다.
도 32는 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, BSA로의 치료 후 15일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 식염수로 처리된 야생형 대조군 마우스, (패널 B) 아이소타입 항체 처리된 대조군 마우스 및 (패널 C) MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스.
도 33은 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, 식염수 대조군 및 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), 아이소타입 대조군 항체 및 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=8마리) 및 MASP-2 억제 항체 및 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=7마리마리)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20 고전력장(HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸 세포의 빈도를 그래프로 도시한다.
도 34는 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스(n=8마리)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TGFβ 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다.
도 35는 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스(n=8마리)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TNFα 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다.
도 36은 실시예 17에서 기술되는 것과 같이, BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스(n=8마리)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% IL-6 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다.
도 37은 실시예 18에서 기술되는 것과 같이, 아드리아마이신 또는 식염수 단독(대조군)으로 치료 후 14일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A-1, A-2, A-3) 식염수로만 처리된 야생형 대조군 마우스; (패널 B-1, B-2, B-3) 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 C-1, C-2, C-3) 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 마우스;
도 38은 실시예 18에서 기술되는 것과 같이, 아드리아마이신 또는 식염수 단독(야생형 대조군)으로 치료 후 14일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대식세포 평균 염색 영역(%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시한다: 식염수만으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수만으로 처리된 MASP-2-/- 마우스, 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스, 여기서 **p=0.007이다;
도 39는 실시예 18에서 기술되는 것과 같이, 아드리아마이신 또는 식염수 단독(야생형 대조군)으로 치료 후 14일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 콜라겐 침착 염색 영역(%)을 보여주는, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시한다: 식염수만으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수만으로 처리된 MASP-2-/- 마우스, 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스, 여기서 **p=0.005이다; 그리고
도 40은 실시예 19에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 억제 항체(OMS646)로 매주 치료하는 12주 연구 과정 동안 2명의 IgA 환자에서 소변 알부민/크레아티닌 비율(uACR)을 그래프로 도시한다.
도 41A는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, COVID-19 환자의 폐로부터의 중격 혈관의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지(H&E, 400x)를 도시한다.
도 41B는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, COVID-19 환자의 폐로부터의 중격 혈관의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지(H&E, 400x)를 도시한다.
도 41C는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, COVID-19 환자의 폐로부터의 중간 직경 폐 중격 혈관의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지를 도시한다.
도 41D는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, COVID-19 환자로부터의 간 실질의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지(H&E, 400x)를 도시한다.
도 42A는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 본 연구의 일부가 아닌 COVID-19 환자(n=33명)의 CEC/ml 카운트와 비교된 정상의 건강한 대조군(n=6명)의 말초혈 중의 순환 내피 세포(CEC)/ml 카운트를 그래프로 도시한다.
도 42B는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 전(기준선) 및 후에 이 연구를 위해 선택된 6명의 환자에서의 CEC/ml 카운트를 그래프로 도시하며, 박스는 1사분위수부터 3사분위수까지의 값을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며 수염은 최소 및 최대 값을 나타낸다.
도 43은 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 C 반응성 단백질(CRP)의 혈청 수준(중앙값; 사분위수 범위(IQR))을 그래프로 도시한다.
도 44는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 락테이트 탈수소효소(LDH)의 혈청 수준(중앙값; IQR)을 그래프로 도시한다.
도 45는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 인터류킨 6 (IL-6)의 혈청 수준(중앙값; 사분위수 범위(IQR))을 그래프로 도시한다.
도 46은 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 인터류킨 8 (IL-8)의 혈청 수준(중앙값; 사분위수 범위(IQR))을 그래프로 도시한다.
도 47A는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 등록 후(즉, 나르소플리맙으로 치료 후) 5일차에 환자 #4의 CT-스캔을 도시하며, 환자는 말초 및 중앙 영역 모두를 포함하는 미만성 간유리 음영(diffuse ground-glass opacity)을 갖는 중증 간질성 폐렴(interstitial pneumonia), 하부 엽, 특히 왼쪽 폐의 폐경화(consolidation), 및 간엽 및 분절 동맥의 충전 결함이 있는 대규모 양측 폐색전증(pulmonary embolism)(표시되지 않음)을 갖는 것으로 관찰된다.
도 47B는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 간유리 음영이 상당히 감소되고 실질 폐경화(parenchymal consolidation)의 거의 완전한 분해가 있는, 등록 후(즉, 나르소플리맙으로 치료 후) 16일차의 환자 #4의 CT-스캔을 도시한다.
도 48은 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료된 환자에서 기준선에서 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서(2 용량 후, 4 용량 후) IL-6의 혈청 수준(pg/mL)을 그래프로 도시하며, 박스는 1사분위수부터 3사분위수까지의 값을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며, 점은 모든 환자 값을 나타낸다.
도 49는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료된 환자에서 기준선에서 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서(2 용량 후, 4 용량 후) IL-8의 혈청 수준(pg/mL)을 그래프로 도시하며, 박스는 1사분위수부터 3사분위수까지의 값을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며, 점은 모든 환자 값을 나타낸다.
도 50은 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료된 6명의 COVID-19 감염 환자의 임상 결과를 그래프로 도시한다.
도 51A는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙 치료 전 및 후의 아스파테이트 아미노기전이효소(AST)(유닛/리터, U/L) 값의 혈청 수준을 그래프로 도시한다. 검은색 선은 중앙값 및 사분위수 범위(IQR)를 나타낸다. 적색 선은 정상 수준을 나타내고 점은 모든 환자 값을 나타낸다.
도 51B는 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료를 시작하기 전에 기준선 값을 이용할 수 있었던 4명의 환자에서 D-이량체 값의 혈청 수준(ng/ml)을 그래프로 도시한다. 검은색 원은 스테로이드 치료가 시작되었을 때를 나타낸다. 적색 선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52A는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙으로 치료 후 상이한 시점에서 나르소플리맙으로 치료된 7번째의 COVID-19 감염 환자(환자 #7)에서 D-이량체 값의 혈청 수준(ng/ml)을 그래프로 도시하며, 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시되고 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52B는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙으로 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 감염된 환자 #7에서 C 반응성 단백질(CRP)의 혈청 수준을 그래프로 도시하며, 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시되고 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52C는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 감염된 환자 #7에서 아스파테이트 아미노기전이효소(AST)의 혈청 수준(유닛/리터, U/L)을 그래프로 도시하며, 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시되고 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52D는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 감염된 환자 #7에서 알라닌 트랜스아미나제(ALT)의 혈청 수준(유닛/리터, U/L)을 그래프로 도시하며, 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시되고 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52E는 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙으로 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19 환자 #7에서 락테이트 탈수소효소(LDH)의 혈청 수준을 그래프로 도시하며, 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시되고 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 53은 실시예 22에서 기술되는 것과 같이, 시간 경과에 따른 환자 #7에서의 항-SARS-CoV-2 항체 역가를 그래프로 도시하며, 나르소플리맙으로의 치료가 적응선 면역 반응의 이펙터 기능을 방해하지 않은 것을 나타낸다.
도 54는 실시예 23에서 기술되는 것과 같이, BSA 대조군과 비교된, 재조합 MASP-2의 SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP2)에 대한 농도 의존성 결합을 그래프로 도시한다.
도 55는 실시예 23에서 기술되는 것과 같이, MASP-2가 NP에 직접 결합하고 C4를 절단하며 MASP-2 억제 항체 HG4의 첨가는 NP/MASP-2 매개 C4 절단을 억제하는 것을 보여주는 SDS-PAGE 웨스턴 블롯 겔을 도시한다.
도 56은 실시예 24에서 기술되는 것과 같이, 종단 연구에서 대상체의 다양한 집단에서의 CH50 값을 그래프로 도시하며, 그래프 상의 각각의 "x" 기호는 개별 대상체를 나타낸다.
도 57은 실시예 24에서 기술되는 것과 같이, 종단 연구에서 대상체의 다양한 집단으로부터 얻어진 혈장 샘플에서 C5a 수준(mg/ml)을 그래프로 도시하며, 그래프 상의 각각의 "x" 기호는 개별 대상체를 나타낸다.
도 58은 실시예 24에서 기술되는 것과 같이, 종단 연구에서 대상체의 다양한 집단으로부터 얻어진 혈장 중의 Bb 수준(μg/mL)을 그래프로 도시하며, 그래프 상의 각각의 "x" 기호는 개별 대상체를 나타낸다.
도 59는 실시예 25에서 기술되는 것과 같이, OD450 값을 토대로 한, 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 그래프로 도시하며, 다양한 농도의 활성화된 혈청에서 4개 후보 항-MASP-2 mAb(클론 C1, C7, D8 및 H1)의 각각이 도시된다.
도 60은 실시예 25에서 기술되는 것과 같이, 급성 COVID 환자(입원 후 14일 미만의 3명의 환자로부터의 16개 샘플), 회복기 환자(n=15명), 혈청 양성 직원(n=15명) 및 혈청 음성 직원(n=34명)으로부터의 5% 혈청에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하는 ELISA 검정의 결과를 그래프로 도시한다.
도 61은 실시예 25에서 기술되는 것과 같이, 병원에 입원했을 때 및 입원 후 최대 14일이 경과한 시점에서 3명의 급성 COVID-19 환자(#2, #3 및 #4)에 존재하는 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 그래프로 도시하며, 그래프 하단의 선은 모아진 정상 혈청 음성 의료 종사자에서 검출된 MASP-2/C1-INH의 양을 나타낸다.
도 62는 실시예 26에서 기술되는 것과 같이, 인간 혈청 또는 혈장으로부터 세린 프로테아제/C1-INH 복합체(즉, 분석물), 및 포획된 복합체를 검출하기 위한 검출 항체로서 항-C1INH 항체를 포획하기 위하여, 폴리스티렌 미소구체, 또는 자석 폴리스티렌 미소구체(즉, 비드) 상에 고정된 항-C1s 항체 또는 항-MASP-2 항체를 사용하는 비드 기반 면역형광 검정에 포함된 단계를 예시하는 개략도이다.
도 63은 실시예 26에서 기술되는 것과 같이, BSA 코팅 대조군 비드와 비교된, 포획 항체로서 항-MASP-2 mAb #C8을 사용하는 비드 기반 검정에서 급성 COVID-19 환자로부터의 모아진 인간 혈청에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 검출을 그래프로 도시한다.
도 64는 실시예 27에서 기술되는 것과 같이, 재조합 MASP-2/C1-INH 복합체의 SEC 정제 중에 얻어진 6 μg의 샘플이 로딩된 비환원 겔의 사진이다.
도 65는 실시예 28에서 기술되는 것과 같이, 이중 비드 기반 검정으로 결정된 바, 급성 COVID-19 환자에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 그래프로 도시한다.
도 66은 실시예 28에서 기술되는 것과 같이, 이중 비드 기반 검정으로 결정된 바, 급성 COVID-19 환자에서 C1s/C1-INH 복합체의 수준을 그래프로 도시한다.
도 67은 실시예 28에서 기술되는 것과 같이, 종단 연구에서 급성 COVID-19 환자, 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원의 CH50 값을 그래프로 도시한다.
도 68은 실시예 28에서 기술되는 것과 같이, 종단 연구에서 급성 COVID-19 환자, 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원의 C5a 값을 그래프로 도시한다.
도 69는 실시예 29에서 기술되는 것과 같이, 16명의 건강한 대조군과 비교된, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 3-4일; 7-8일, 퇴원까지 9일) 8명의 급성 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 그래프로 도시한다.
도 70A는 실시예 29에서 기술되는 것과 같이, 16명의 건강한 대조군과 비교된, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 3-4일; 7-8일, 퇴원까지 9일) 8명의 급성 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 CH50 값을 그래프로 도시한다.
도 70B는 실시예 29에서 기술되는 것과 같이, 16명의 건강한 대조군과 비교된, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 3-4일; 7-8일, 퇴원까지 9일) 8명의 급성 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 C5a 값을 그래프로 도시한다.
도 71은 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 9명의 COVID-19 환자(미치료 대조군)로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대조군 대상체의 풀(pool)(건강한 대조군)과 비교된, 입원시(0일, 나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 2-4일; 6-8일 및 퇴원까지 9일) 7명의 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 그래프로 도시한다.
도 72A는 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 9명의 COVID-19 환자(미치료 대조군)로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대조군 대상체의 풀(건강한 대조군)과 비교된, 입원시(0일, 나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 2-4일; 6-8일 및 퇴원까지 9일) 7명의 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 CH50 값을 그래프로 도시한다.
도 72B는 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 9명의 COVID-19 환자(미치료 대조군)로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대조군 대상체의 풀(건강한 대조군)과 비교된, 입원시(0일, 나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 2-4일; 6-8일 및 퇴원까지 9일) 7명의 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 C5a 값을 그래프로 도시한다.
도 73은 실시예 30에서 기술되는 것과 같이, 정상 건강한 혈청(NHS) 및 열 비활성화된 정상 건강한 혈청(HI-NHS)과 비교된, 나르소플리맙으로 치료되지 않은 COVID-19 환자로부터의 혈청과 비교된 나르소플리맙으로의 치료 전(치료 전) COVID-19 환자로부터의 헐청 및 나르소플리맙으로의 치료 후 COVID-19 환자의 혈청에서 인큐베이션 후 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)의 생존성 박테리아 카운트를 그래프로 도시한다.
서열 목록의 설명
서열 번호:1 인간 MAp19 cDNA
서열 번호:2 인간 MAp19 단백질(리더 포함)
서열 번호:3 인간 MAp19 단백질(성숙)
서열 번호:4 인간 MASP-2 cDNA
서열 번호:5 인간 MASP-2 단백질(리더 포함)
서열 번호:6 인간 MASP-2 단백질(성숙)
서열 번호:7 인간 MASP-2 gDNA(엑손 1-6)
항원: (MASP-2 성숙 단백질을 참조함)
서열 번호:8 CUBI 서열(aa 1-121)
서열 번호:9 CUBEGF 서열(aa 1-166)
서열 번호:10 CUBEGFCUBII(aa 1-293)
서열 번호:11 EGF 영역(aa 122-166)
서열 번호:12 세린 프로테아제 도메인(aa 429-671)
서열 번호:13 세린 프로테아제 도메인 비활성(Ser618에서 Ala로의 돌연변이가 있는 aa 610-625)
서열 번호:14 TPLGPKWPEPVFGRL(CUBI 펩타이드)
서열 번호:15 TAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCEYDFVKLSSGAKVLATLCGQ(CUBI 펩타이드)
서열 번호:16 TFRSDYSN(MBL 결합 영역 코어)
서열 번호:17 FYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGF(MBL 결합 영역)
서열 번호:18 IDECQVAPG(EGF 펩타이드)
서열 번호:19 ANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALV(세린 프로테아제 결합 코어)상세한 설명
펩타이드 억제제:
서열 번호:20 MBL 전장 cDNA
서열 번호:21 MBL 전장 단백질
서열 번호:22 OGK-X-GP(공통 결합)
서열 번호:23 OGKLG
서열 번호:24 GLR GLQ GPO GKL GPO G
서열 번호:25 GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GPO GPO
서열 번호:26 GKDGRDGTKGEKGEPGQGLRGLQGPOGKLGPOG
서열 번호:27 GAOGSOGEKGAOGPQGPOGPOGKMGPKGEOGDO(인간 h-피콜린)
서열 번호:28 GCOGLOGAOGDKGEAGTNGKRGERGPOGPOGKAGPOGPNGAOGEO(인간 피콜린 p35)
서열 번호:29 LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI(C4 절단 부위)
발현 억제제:
서열 번호:30 CUBI-EGF 도메인의 cDNA(서열 번호:4의 뉴클레오타이드 22-680)
서열 번호:31
5' CGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGC 3'
MASP-2 번역 시작 부위(센스)를 포함한 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 12-45
서열 번호:32
5'GACATTACCTTCCGCTCCGACTCCAACGAGAAG3'
MASP-2 MBL 결합 부위(센스)를 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 361-396
서열 번호:33
5'AGCAGCCCTGAATACCCACGGCCGTATCCCAAA3'
CUBII 도메인을 포함하는 영역을 암호화하는 서열 번호:4의 뉴클레오타이드 610-642
클로닝 프라이머:
서열 번호:34 CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC(CUB에 대한 5' PCR)
서열 번호:35 GGAATTCCTAGGCTGCATA(CUB에 대한 3' PCR)
서열 번호:36 GGAATTCCTACAGGGCGCT(CUBIEGF에 대한 3' PCR)
서열 번호:37 GGAATTCCTAGTAGTGGAT(CUBIEGFCUBII에 대한 3' PCR)
서열 번호:38-47은 인간화된 항체에 대한 클로닝 프라이머이다
서열 번호:48은 9 aa 펩타이드 결합이다
발현 벡터:
서열 번호:49는 MASP-2 미니유전자 삽입물이다
서열 번호: 50은 쥐과 MASP-2 cDNA이다
서열 번호: 51은 쥐과 MASP-2 단백질(w/리더)이다
서열 번호: 52는 성숙한 쥐과 MASP-2 단백질이다
서열 번호: 53은 래트 MASP-2 cDNA이다
서열 번호: 54는 래트 MASP-2 단백질(w/ 리더)이다
서열 번호: 55는 성숙한 래트 MASP-2 단백질이다
서열 번호: 56-59는 인간 MASP-2A를 생성하기 위하여 사용된 인간 MASP-2의 부위 지정 돌연변이생성을 위한 올리고뉴클레오타이드이다
서열 번호: 60-63은 쥐과 MASP-2A를 생성하기 위하여 사용된 쥐과 MASP-2의 부위 지정 돌연변이생성을 위한 올리고뉴클레오타이드이다
서열 번호: 64-65는 래트 MASP-2A를 생성하기 위해 사용된 래트 MASP-2의 부위 지정 돌연변이생성을 위한 올리고뉴클레오타이드이다
서열 번호: 66 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646) 중쇄 가변 영역(VH)(신호 펩타이드 없음)을 암호화하는 DNA
서열 번호: 67 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646) 중쇄 가변 영역(VH) 폴리펩타이드
서열 번호: 68 17N16mc 중쇄 가변 영역(VH) 폴리펩타이드
서열 번호: 69 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646) 경쇄 가변 영역(VL) 폴리펩타이드
서열 번호: 70 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646) 경쇄 가변 영역(VL)을 암호화하는 DNA
서열 번호: 71 17N16_dc17N9 경쇄 가변 영역(VL) 폴리펩타이드
서열 번호:72: SGMI-2L(전장)
서열 번호: 73: SGMI-2M(중간 절단 버전)
서열 번호:74: SGMI-2S(짧은 절단 버전)
서열 번호:75: VH-M2ab6-SGMI-2-N 및 힌지 돌연변이가 있는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
서열 번호:76: VH-M2ab6-SGMI-2-C 및 힌지 돌연변이가 있는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
서열 번호:77: VL-M2ab6-SGMI-2-N 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
서열 번호:78: VL-M2ab6-SGMI-2-C 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 성숙한 폴리펩타이드
서열 번호:79: 펩타이드 링커(10aa)
서열 번호:80: 펩타이드 링커(6aa)
서열 번호:81: 펩타이드 링커(4aa)
서열 번호:82: VH-M2ab6-SGMI-2-N 및 힌지 돌연변이가 있는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
서열 번호:83: VH-M2ab 6-SGMI-2-C 및 힌지 돌연변이가 있는 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
서열 번호:84: VL-M2ab6-SGMI-2-N 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
서열 번호:85: VL-M2ab6-SGMI-2-C 및 인간 Ig 람다 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
서열 번호:86: C1 억제제(C1-INH) 호모 사피엔스
서열 번호:87: MASP-2 mAb C7 중쇄 가변 영역
서열 번호:88: MASP-2 mAb C7 경쇄 가변 영역
서열 번호:89: MASP-2 mAb C7 HC-CDR1
서열 번호:90: MASP-2 mAb C7 HC-CDR2
서열 번호:91: MASP-2 mAb C7 HC-CDR3
서열 번호:92: MASP-2 mAb C7 LC-CDR1
서열 번호:93: MASP-2 mAb C7 LC-CDR2
서열 번호:94: MASP-2 mAb C7 LC-CDR3
서열 번호:95: 중쇄 가변 영역을 암호화하는 MASP-2 mAb C7 cDNA
서열 번호:96: 경쇄 가변 영역을 암호화하는 MASP-2 mAb C7 cDNA
서열 번호:97: MASP-2 mAb C8 중쇄 가변 영역
서열 번호:98: MASP-2 mAb C8 경쇄 가변 영역
상세한 설명
본원에서 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 혈액(예컨대, 혈청 및/또는 혈장) 중의 MASP-2/C1-INH의 농도가 중증 COVID-19 환자에서 및 이전에 COVID-19로 감염되었고 장기 후유증을 앓고 있는 대상체에서 비정상적으로 높은 것을 관찰하였다. 발명자들은 또한, 회복 후에, MASP-2/C1-INH 복합체의 농도가 대부분의 경우에 정상 수준으로 감소하는 것도 관찰하였다. 발명자들은 SARS-CoV-2로 감염된 환자를 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도 증가에 대해 모니터링하는 것이 환자를 급성 COVID-19에 걸렸거나, 또는 발병의 위험이 있는 것으로 진단하고, 또한 대상체를 급성 COVID-19 이후(또한 장기 COVID-19로도 언급됨)를 갖고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것으로 진단하며 선택적으로 그러한 위험을 갖고 있는 대상체를 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제로 치료하는데 유용하다고 믿는다. 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, MASP-2 억제제의 사용 또한 코로나바이러스, 예컨대 OVID-19로 감염된 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는데 유용하고, 또한 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에서 급성 호흡곤란을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는데 유용하다. 그러므로, MASP-2/C1-INH 복합체의 상태를 모니터링하는 것은 또한 COVID-19 환자가 MASP-2 억제제와 같은 보체 억제제를 사용한 치료법에 반응하는지를 결정하고 선택적으로 MASP-2/C1-INH 수준을 정상 범위로 가져오기 위해 필요에 따라 MASP-2 억제제의 투여량을 조정하는 데 유용할 수 있다.
본 개시는 또한 생물학적 샘플에서 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하는 검정 방법을 제공한다. 또한 생물학적 유체, 예컨대 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체 중의 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도를 조사하기 위한 조성물, 키트 및 방법이 제공된다.
I. 정의
본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 본 발명의 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람들에게 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 다음의 정의는 본 발명을 기술하기 위해 명세서 및 청구범위에서 사용되는 것과 같은 용어와 관련하여 명료성을 제공하기 위해 제공된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "MASP-2 의존성 보체 활성화"는 렉틴 경로의 MASP-2 의존성 활성화를 포함하며, 이것은 생리적 조건 하에(즉, Ca++의 존재 하에) 발생하여 렉틴 경로 C3 전환효소 C4b2a의 형성으로 이어지며 후속적으로 C3 절단 생성물 C3b의 축적시 C5 전환효소 C4b2a(C3b)n의 형성으로 이어지며, 이것은 주로 옵소닌화를 유발하는 것으로 결정되었다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "대체 경로"는, 예를 들어, 진균 및 효모 세포벽으로부터의 지모산, 그램 음성 외막, 및 토끼 적혈구로부터의 리포다당(LPS), 뿐만 아니라 많은 순수한 다당류, 토끼 적혈구, 바이러스, 박테리아, 동물 종양 세포, 기생충 및 손상된 세포로부터의 리포다당에 의해 촉발되는 보체 활성화를 지칭하며, 전통적으로 보체 인자 C3으로부터 C3b의 자발적인 단백질 가수분해성 생성으로부터 발생하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "렉틴 경로"는 만난 결합 렉틴(MBL), CL-11 및 피콜린(H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)을 포함한, 혈청 및 비혈청 탄수화물 결합 단백질의 특이적 결합을 통해 발생하는 보체 활성화를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "고전적 경로"는 외래 입자에 결합된 항체에 의해 촉발되고 인식 분자 C1q의 결합을 필요로 하는 보체 활성화를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "MASP-2 억제제"는 항-MASP-2 항체 및 그것의 MASP-2 결합 단편, 천연 및 합성 펩타이드, 소분자, 가용성 MASP-2 수용체, 발현 억제제 및 분리된 천연 억제제를 포함한, MASP-2에 결합하거나 또는 간접적으로 상호작용하고 MASP-2 의존성 보체 활성화를 효과적으로 억제하는 임의의 작용제를 지칭하며, 또한 렉틴 경로의 또 다른 인식 분자(예컨대, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)에 대한 결합에 대해 MASP-2와 경쟁하는 펩타이드를 포함하지만, 그러한 다른 인식 분자에 결합하는 항체를 포함하지는 않는다. 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 20%를 초과한 만큼, 예컨대 50%를 초과하여, 예컨대 90%를 초과한 만큼 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 90%를 초과한 만큼 감소시킨다(즉, 10% 이하만의 MASP-2 보체 활성화를 초래함).
본원에서 사용되는 바, 용어 "섬유증"은 장기 또는 조직에서 과도한 결합 조직의 형성 또는 존재를 지칭한다. 섬유증은 조직 손상 또는 염증과 같은 조직에 대한 복구 또는 대체 반응으로서 발생할 수 있다. 섬유증의 특징은 과도한 세포외 매트릭스의 생성이다. 손상에 대한 정상적인 생리적 반응은 치유 과정의 일부로서 결합 조직의 침착을 초래하지만, 이 결합 조직 침착은 지속적이고 병리적이 될 수 있어서, 조직의 구조 및 기능을 변경시킬 수 있다. 세포 수준에서, 상피 세포 및 섬유모세포는 증식하고 근섬유모세포로 분화되어 매트릭스 수축, 증가된 강직성, 미세혈관 압박, 및 저산소증을 초래한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "섬유증 및/또는 염증에 의해 유발되거나 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 포유류 대상체에서 섬유증을 치료하는 것"은 상기 포유류 대상체에서 섬유증을 반전, 완화, 개선, 또는 억제하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "단백뇨"는 인간 대상체로부터의 24시간 소변 수집에서 비정상적인 양으로, 예컨대 0.3 g 단백질을 초과하는 양으로, 또는 인간 대상체에서 리터당 1 g을 초과하는 농도로 존재하는 소변 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "단백뇨 개선" 또는 "단백뇨 감소"는 단백뇨를 앓고 있는 대상체에서 24시간 소변 단백질 배설을 MASP-2 억제제로의 치료 전 대상체에서의 기준선 24시간 소변 단백질 배설과 비교하여 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 50% 또는 그 이상 감소시키는 것을 지칭한다. 한 구체예에서, 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제로의 치료는 24시간 소변 단백질 배설의 20 퍼센트보다 큰 감소, 또는 예컨대 24시간 소변 단백질 배설의 30 퍼센트보다 큰 감소, 또는 예컨대 24시간 소변 단백질 배설의 40 퍼센트보다 큰 감소, 또는 예컨대 24시간 소변 단백질 배설의 50 퍼센트보다 큰 감소를 이루는 것과 같은, 인간 대상체에서 단백뇨를 감소시키는데 효과적이다
본원에서 사용되는 바, 용어 "소분자", "작은 유기 분자", 및 "작은 무기 분자"는 자연적으로 발생하거나 합성이며 약 50 Da을 초과하고 약 2500 Da 미만의 분자량을 가지는 분자(유기, 유기금속성, 또는 무기), 유기 분자, 및 무기 분자를 각각 지칭한다. 작은 유기(예를 들어) 분자는 약 2000 Da 미만, 약 100 Da 내지 약 1000 Da, 또는 약 100 내지 약 600 Da, 또는 약 200 내지 500 Da일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 임의의 항체 생성 포유류(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 및 인간을 포함한 영장류)로부터, 또는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현 또는 형질도입 동물(또는 항체 또는 항체 단편을 생성하는 다른 방법)로부터 유래되고, 표적 폴리펩타이드, 예컨대, 예를 들어, MASP-2, 폴리펩타이드 또는 그것의 일부에 특이적으로 결합하는 항체 및 그것의 항체 단편을 포함한다. 용어 "항체"는 항체 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식(예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질도입 동물, 펩타이드 합성, 등에 의한)과 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예시의 항체에는 다클론성, 단클론성 및 재조합 항체; pan 특이적, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체); 인간화된 항체; 쥐과 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 단클론성 항체; 및 항-이디오타입 항체가 포함되고, 임의의 온전한 항체 또는 그것의 단편일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 온전한 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라, 그것의 단편(예컨대 dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(ScFv), 그것의 합성 변이체, 자연적으로 발생하는 변이체, 항체 부분과 필요한 특이성의 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 항체, 키메라 항체, 및 필요한 특이성의 항원 결합 부위 또는 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다.
"단클론성 항체"는 단클론성 항체가 에피토프의 선택적 결합에 관여하는 아미노산(자연 발생적인 및 자연 발생적이지 않은)으로 구성되는 균일한 항체 집단을 지칭한다. 단클론성 항체는 표적 항원에 대해 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체뿐만 아니라, 그것의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 사슬(ScFv), 그것의 변이체, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 에피토프에 결합하기 위해 필요한 특이성 및 능력의 항원 결합 단편(에피토프 인식 부위)을 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식(예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질도입 동물, 펩타이드 합성, 등에 의한)과 관련하여 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 용어는 위에서 "항체"의 정의 하에 기술된 전체 면역글로불린과 또한 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체 단편"은 전장 항체, 예컨대, 예를 들어, 항-MASP-2 항체로부터 유래된 또는 관련된 부분을 지칭하며, 일반적으로 항원 결합 또는 그것의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예시적인 예로는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하며, 그것은 scFv가 항원 결합에 대한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다.
본원에서 사용되는 바, "키메라 항체"는 비인간 종(예컨대, 설치류) 항체로부터 유래된 가변 도메인 및 상보성 결정 영역을 함유하는 한편, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래되는 재조합 단백질이다.
본원에서 사용되는 바, "인간화된 항체"는 인간 항체 프레임워크로 번역되는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 특이적 상보성 결정 영역에 따르는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 인간화된 항체는 전형적으로 항체 상보성 결정 영역만이 비인간 기원의 것인 재조합 단백질이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "만난 결합 렉틴"("MBL")은 만난 결합 단백질("MBP")과 동등하다.
본원에서 사용되는 바, "막 공격 복합체"("MAC")는 막에 삽입되어 막을 파괴하는 말단의 5개의 보체 구성요소(C6, C7, C8 및 C-9와 조합된 C5b)의 복합체를 지칭한다(또한 C5b-9로도 지칭됨).
본원에서 사용되는 바, "대상체"는 제한 없이 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 양, 염소, 소, 토끼, 돼지 및 설치류를 포함한 모든 포유류를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 알라닌(Ala;A), 아스파라긴(Asn;N), 아스파르트산(Asp;D), 아르기닌(Arg;R), 시스테인(Cys;C), 글루탐산(Glu;E), 글루타민(Gln;Q), 글리신(Gly;G), 히스티딘(His;H), 이소류신(Ile;I), 류신(Leu;L), 리신(Lys;K), 메티오닌(Met;M), 페닐알라닌(Phe;F), 프롤린(Pro;P), 세린(Ser;S), 트레오닌(Thr;T), 트립토판(Trp;W), 티로신(Tyr;Y), 및 발린(Val;V).
가장 넓은 의미로, 자연적으로 발생하는 아미노산은 각각의 아미노산의 측쇄의 화학적 특성을 토대로 한 그룹들로 나누어질 수 있다. "소수성" 아미노산은 Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys 또는 Pro를 의미한다. "친수성" 아미노산은 Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg 또는 His를 의미한다. 아미노산의 이런 그룹은 다음과 같이 추가로 하위분류될 수 있다. "비전하 친수성" 아미노산은 Ser, Thr, Asn 또는 Gln을 의미한다. "산성" 아미노산은 Glu 또는 Asp를 의미한다. "염기성" 아미노산은 Lys, Arg 또는 His를 의미한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "보존성 아미노산 치환"은 다음의 각각의 그룹 내에서 아미노산 중에서의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 중합체 또는 그것의 모방물을 지칭한다. 이 용어는 또한 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드, 당 및 뉴클레오사이드(백본)간 공유 결합으로 구성된 올리고뉴클레오베이스뿐만 아니라 자연적으로 발생하지 않는 변형을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "에피토프"는 항체에 의해 결합되는 단백질(예컨대, 인간 MASP-2 단백질) 상의 부위를 지칭한다. "중첩하는 에피토프"는 선형 및 비선형 에피토프를 포함하여, 적어도 하나의(예컨대, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의) 공통 아미노산 잔기(들)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 길이 또는 번역 후 변형과 관계 없이 아미노산의 임의의 펩타이드 결합 사슬을 의미한다. 본원에 기술된 MASP-2 단백질은 야생형 단백질을 함유하거나 야생형 단백질이거나 또는 50개 이하(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 50개 이하)의 보존성 아미노산 치환을 가지는 변이체일 수 있다. 보존성 치환은 전형적으로 다음 그룹 내 치환을 포함한다: 글리신과 알라닌; 발린, 이소류신, 및 류신; 아스파르트산 및 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민, 세린 및 트레오닌; 리신, 히스티딘 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신.
일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질은 서열 번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖는 인간 MASP-2 단백질과 70%, 또는 그 이상(예컨대, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 펩타이드 단편은 적어도 6개(예컨대, 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 600개 또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 길이일 수 있다(예컨대, 서열 번호: 5의 적어도 6개의 연속적인 아미노산 잔기). 일부 구체예에서, 인간 MASP-2 단백질의 항원성 펩타이드 단편은 길이가 500개 미만(예컨대, 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 또는 6개 미만)의 아미노산 잔기이다(예컨대, 서열 번호: 5의 어느 하나에서 500개 미만의 연속적인 아미노산 잔기).
퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위하여 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후에 참조 서열의 아미노산과 동일한 후보 서열의 아미노산의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 서열 동일성을 결정할 목적의 정렬은 기술분야의 숙련된 기술 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하기 위한 적적한 매개변수는 알려져 있는 방법에 의해 결정될 수 있다.
II. 발명의 개요
본원에서 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 세뇨관 신장 병리학의 개시 및 질환 진행에서 렉틴 경로의 중심 역할을 확인하였고, 그로써 IgA 신장병(nephropathy), C3 사구체병증(glomerulopathy) 및 기타 사구체신염(glomerulonephritides)을 포함한 다양한 범위의 신장 질환의 병태생리학에서 렉틴 경로 활성화의 핵심 역할을 함축하였다. 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 발명자들은 보체 시스템의 렉틴 경로의 핵심 조절제인 만난 결합 렉틴 관련 세린 프로테아제-2(MASP-2)의 억제가 신장 섬유증의 일측성 요관 폐색(UUO) 모델, 단백질 과부하 모델 및 아드리아마이신 유도 신장학 모델을 포함한 섬유화 질환의 다양한 동물 모델에서 염증 및 섬유증을 상당히 감소시키는 것을 발견하였다. 그러므로, 발명자들은 MASP-2 매개 렉틴 경로 활성화의 억제가, 근본적인 원인과 관계 없이, 신장 섬유증, 예컨대, 세뇨관 간질 섬유증을 개선, 치료 또는 예방하기 위한 효과적인 치료적 접근법을 제공하는 것을 입증하였다. 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, MASP-2 억제제의 사용은 또한 코로나바이러스, 예컨대 COVID-19로 감염된 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기에 유용하다.
렉틴(MBL, M-피콜린, H-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 선천적 보체 시스템을 촉발시키는 특정 인식 분자이고 시스템은 렉틴 개시 경로 및 말단 보체 이펙터 분자의 렉틴 개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. C1q는 획득된 보체 시스템을 촉발시키는 특정 인식 분자이고 시스템은 고전적 개시 경로 및 말단 보체 이펙터 분자의 C1q 개시된 활성화를 증폭시키는 관련된 말단 경로 증폭 루프를 포함한다. 본 발명자들은 이들 두 주요 보체 활성화 시스템을 각각 렉틴 의존성 보체 시스템 및 C1q 의존성 보체 시스템으로 지칭한다.
면역 방어에서의 본질적인 역할 외에, 보체 시스템은 많은 임상 조건에서 조직 손상에 기여한다. 그러므로 이들 부작용을 예방하기 위하여 치료적으로 효과적인 보체 억제제를 개발할 긴박한 필요가 있다. 렉틴 매개 MASP-2 경로를 억제하는 한편 고전적 경로를 온전하게 남겨두는 것이 가능하다는 인식으로 보체의 면역 방어 가능성을 완전히 차단하지 않으면서 특정 병리를 유발하는 보체 활성화 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 매우 바람직할 것임을 인식하게 되었다. 예를 들어, 보체 활성화가 렉틴 의존성 보체 시스템에 의해 우선적으로 매개되는 질환 상태에서, 이 시스템만을 특이적으로 억제하는 것이 유리할 것이다. 이것은 면역 복합체 처리를 취급하고 감염에 대해 숙주 방어를 돕기 위해 시스템을 온전하게 남겨둘 것이다.
렉틴 의존성 보체 시스템을 특이적으로 억제하기 위한 치료제의 개발에서 표적에 대해 바람직한 단백질 구성요소는 MASP-2이다. 렉틴 의존성 보체 시스템의 알려져 있는 모든 단백질 구성요소(MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린, MASP-2, C2-C9, 인자 B, 인자 D, 및 프로퍼딘) 중에서, MASP-2만이 렉틴 의존성 보체 시스템에 대해 독특하고 기능을 위해 시스템에 필요하다. 렉틴(MBL, H-피콜린, M-피콜린, L-피콜린 및 CL-11)은 또한 렉틴 의존성 보체 시스템에서 독특한 구성요소이다. 그러나, 렉틴 구성요소 중 임의의 하나의 상실은 렉틴 반복성으로 인해 시스템의 활성화를 본질적으로 억제하지 못할 것이다. 렉틴 의존성 보체 활성화 시스템의 억제를 보장하기 위해서 5가지 모든 렉틴을 억제하는 것이 필요할 것이다. 나아가, MBL 및 피콜린이 또한 보체와 무관한 옵소닌 활성을 가진 것으로 알려져 있기 때문에, 렉틴 기능의 억제는 감염에 대한 유익한 숙주 방어 메커니즘의 손실을 초래할 것이다. 대조적으로, 이런 보체 의존성 렉틴 옵소닌 활성은 만약 MASP-2가 억제성 표적이었다면 온전하게 유지될 것이다. 렉틴 의존성 보체 활성화 시스템을 억제하기 위한 치료 표적으로서 MASP-2의 부가된 이익은 MASP-2의 혈장 농도가 임의의 보체 단백질 중에서 가장 낮다(약 500　ng/ml)는 것이다; 그러므로, MASP-2의 상당히 낮은 농도의 고친화성 억제제의 상당히 낮은 농도가 완전한 억제를 얻기에 충분할 것이다(Moller-Kristensen, M.,　et　al., J. Immunol 방법 282:159-167, 2003).
본원에서 실시예 14에서 기술되는 것과 같이, 섬유화 신장 질환(일측성 요관 폐색 UUO)의 동물 모델에서 MASP-2 유전자가 없는(MASP-2-/-) 마우스는 염증 세포 침윤(75% 감소) 및 콜라겐 침착과 같은 섬유증의 조직학적 마커(1/3 감소)에 의해 나타난 것과 같이, 야생형 대조군 동물과 비교하여 상당히 더 적은 신장 질환을 나타낸 것으로 결정되었다. 실시예 15에서 추가로 나타낸 것과 같이, 고전적 경로를 온전하게 남기면서 렉틴 경로를 선택적으로 차단하는 항-MASP-2 단클론성 항체로 전신적으로 처리된 야생형 마우스는, 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스와 비교하여 신장 섬유증으로부터 보호되었다. 이들 결과는 렉틴 경로가 신장 질환에 핵심 기여자인 것을 입증하며 렉틴 경로를 차단하는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 항체가 항섬유화제로서 효과적인 것을 추가로 입증한다. 실시예 16에서 추가로 나타낸 것과 같이, 단백질 과부하 모델에서, 소 혈청 알부민(BSA)으로 처리된 야생형 마우스는 단백뇨성 신장병이 발생된 반면, 동일한 수준의 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스는 신장 손상이 감소되었다. 실시예 17에서 추가로 나타낸 것과 같이, 고전적 경로를 온전하게 남기면서 렉틴 경로를 선택적으로 차단하는 항-MASP-2 단클론성 항체로 전신적으로 처리된 야생형 마우스는, 단백질 과부하 모델에서 단백질의 신장 손상으로부터 보호되었다. 실시예 18에서 기술되는 것과 같이, MASP-2-/- 마우스는 야생형 마우스와 비교하여 신장 섬유증의 아드리아마이신 유도 신장학 모델에서 더 적은 신장 염증 및 세뇨관 간질 손상을 나타냈다. 실시예 19에서 기술되는 것과 같이, 진행 중인 2상 개방 라벨 신장 시험에서, 항-MASP-2 항체로 처리된 IgA 신장병 환자는 시험 내내 소변 알부민 대 크레아티닌 비율(uACR)에서 임상적으로 의미있고 통계학적으로 유의미한 감소 및 24시간 소변 단백질 수준에서 기준선으로부터 치료 종점까지 감소를 입증하였다. 실시예 19에서 추가로 기술되는 것과 같이, 동일한 2상 신장 시험에서, 항-MASP-2 항체로 치료된 막 신장병 환자는 또한 치료 중에 uACR의 감소를 입증하였다.
전술한 설명에 따르면, 본 발명은 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 항섬유화제로서의 용도, 섬유화 병태의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 MASP-2 억제제의 용도, 및 필요로 하는 인간 대상체에서 섬유화 병태를 예방, 치료, 완화 또는 반전시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 MASP-2 억제제(예컨대, 항-MASP-2 항체)를 투여하는 단계를 포함한다.
실시예 20, 21, 및 22에서 기술되는 것과 같이, MASP-2 및 렉틴 경로 활성화를 억제하는 나르소플리맙으로의 치료 후에 COVID-19 관련 호흡 부전(respiratory failure)을 앓고 있는 환자에게서 임상적인 개선이 관찰되었다. 실시예 21에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료된 전부 6명의 COVID-19 환자가 임상적 개선을 입증하였다. 각각의 경우에, COVID-19 폐 손상은 나르소플리맙 치료 전에 ARDS로 진행되었고 모든 환자는 치료가 시작되었을 때 비침습성 기계식 환기를 받고 있었다. 후속(5-6개월) 데이터를 이용할 수 있는 나르소플리맙 치료된 COVID-19 환자는 장기간 후유증의 관찰된 임상적 또는 실험실 증거를 보이지 않는다. 실시예 22에서 추가로 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료된 추가 COVID-19 환자도 또한 임상적 개선을 입증하였다. 실시예 22에서 추가로 입증되는 것과 같이, 나르소플리맙 치료 환자는 적절하게 높은 항-SARS-Cov-2 항체 역가를 발생하였고, 이것은 나르소플리맙으로의 치료가 적응성 면역 반응의 이펙터 기능을 방해하지 않는 것을 나타낸다.
본원에서 실시예 24 내지 30에서 추가로 기술되는 것과 같이, 발명자들은 혈액(예컨대, 혈청 및/또는 혈장) 중의 MASP-2/C1-INH 농도가 중증 COVID-19 환자 및 이전에 COVID-19로 감염되었고 장기 후유증을 앓고 있는 대상체에서 비정상적으로 높은 것을 관찰하였다. 발명자들은 또한, 회복 후에, MASP-2/C1-INH 복합체의 농도가 대부분의 경우에 정상 수준으로 감소하는 것을 관찰하였다. 발명자들은 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도 증가에 대해 SARS-CoV-2로 감염된 환자를 모니터링하는 것이 급성 COVID-19를 갖고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 환자를 진단하는데 유용하며, 또한 급성 COVID-19 이후(또한 장기 COVID-19로도 언급됨)를 갖고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 환자를 진단하는데 및 선택적으로 그러한 위험을 가진 것으로 확인된 대상체를 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제로 치료하는 데 유용하다고 여긴다. 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, MASP-2 억제제의 사용은 또한 코로나바이러스, 예컨대 COVID-19로 감염된 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기에 유용하며 또한 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에서 급성 호흡 곤란을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기에 유용하다. 그러므로, MASP-2/C1-INH 복합체의 상태를 모니터링하는 것은 또한 COVID-19 환자가 MASP-2 억제제와 같은 보체 억제제를 사용한 치료법에 응답하는지의 여부를 결정하고 선택적으로 MASP-2/C1-INH의 수준을 정상 범위로 가져오기 위해 필요한 대로 MASP-2 억제제의 투여량을 조정하는 데 유용할 수 있다.
본 개시는 또한 생물학적 샘플에서 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하기 위한 검정 방법을 제공한다. 또한 생물학적 유체, 예컨대 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체 중의 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도를 조사하기 위한 조성물, 키트 및 방법이 제공된다.
따라서, 발명의 방법은 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 코로나바이러스, 예컨대 COVID-19, SARS 또는 MERS를 앓고 있는 인간 대상체에서 코로나바이러스 유도 폐렴 또는 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제, 완화, 예방, 또는 반전시키기 위해 사용될 수 있다. 발명의 방법은 또한 인플루엔자 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A형 바이러스 혈청형(H1N1(1918년에 "스페인 독감" 및 2009년에 "돼지 독감"을 유발함); H2N2(1957년에 "아시아 독감"을 유발함), H3N2(1968년에 "홍콩 독감"을 유발함), H5N1(2004년에 "조류 독감"을 유발함), H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 및 H6N1); 또는 인플루엔자 B형 바이러스, 또는 인플루엔자 C형 바이러스를 앓고 있는 인간 대상체에서 인플루엔자 바이러스 유도 폐렴 또는 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제, 완환, 예방, 또는 반전시키기 위해 사용될 수 있다.
III. 섬유증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 및 병태에서 MASP-2의 역할
섬유증은 일반적으로 손상 또는 부상에 대한 반응으로 장기 또는 조직에서 과도한 결합 조직의 형성 또는 존재이다. 섬유증의 특징은 손상 후의 과도한 세포외 매트릭스의 생성이다. 신장에서, 섬유증은 신장 실질 상의 진행성 유해한 결합 조직 침착으로서 특성화되며 그것은 불가피하게 원래의 신장 손상을 유발하는 원발성 신장 질환과 무관하게 신장 기능의 감쇠로 이어진다. 그로써 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)로 불리는, 세뇨관 상피 세포가 중간엽 섬유모세포로 변환되는 세포 특징의 변화는 신장 섬유증의 주요 메커니즘을 구성한다. 섬유증은 거의 모든 조직 및 장기 시스템에 영향을 미치며 조직 손상 또는 염증과 같은 자극에 대한 복구 또는 대체 반응으로서 발생할 수 있다. 손상에 대한 정상적인 생리적 반응은 결합 조직의 침착을 초래하지만, 이 과정이 병리적이 된다면, 흉터 결합 조직에 의한 고도로 분화된 세포의 대체는 조직의 구조 및 기능을 변경시킨다. 세포 수준에서, 상피 세포 및 섬유모세포는 증식하고 근섬유모세포로 분화되어 매트릭스 수축, 증가된 강직성, 미세혈관 압박, 및 저산소증을 초래한다. 현재 섬유증에 대한 효과적인 치료 또는 치료법은 없지만, 동물 연구 및 일화성 인간 보고서는 둘 다 섬유화 조직 손상이 반전될 수 있음을 시사한다(Tampe and Zeisberg, Nat Rev Nephrol, vol 10:226-237, 2014).
많은 질환이 신장 질환(예컨대, 만성 신장 질환, IgA 신장병, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염), 폐 질환(예컨대, 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 기관지확장증(bronchiectasis)), 간 질환(예컨대, 간경변(cirrhosis), 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease)), 심장 질환(예컨대, 심근 경색(myocardial infarction), 심방 섬유증(atrial fibrosis), 판막 섬유증(valvular fibrosis), 심내막심근 섬유증(endomyocardial fibrosis)), 뇌 질환(예컨대, 뇌졸중(stroke)), 피부 질환(예컨대, 과도한 상처 치유, 피부경화증(scleroderma), 전신 경화증(systemic sclerosis), 켈로이드(keloid)), 혈관 질환(예컨대, 죽상경화성 혈관 질환(aterosclerotic vascular disease)), 소장 질환(예컨대, 크론병(Crohn's disease)), 눈의 질환(예컨대, 전낭하 백내장(anterior subcapsular cataract), 후낭 혼탁(posterior capsule opacification)), 근골격 연조직 구조 질환(예컨대, 유착성 관절낭염(adhesive capsulitis), 듀피트렌 구축(Dupuytren's contracture), 골수섬유증(myelofibrosis)), 생식 기관 질환(예컨대, 자궁내막증(endometriosis), 페이로니병(Peyronie's disease)), 및 일부 감염성 질환(예컨대, 코로나바이러스, 알파 바이러스, C형 간염, B형 간염, 등)을 포함한 진행성 장기 부전을 유발하는 섬유증을 초래한다.
섬유증이 많은 조직 및 질환에서 발생하지만, 그것의 병리학에 대해서는 공통된 분자 및 세포 메커니즘이 있다. 섬유모세포에 의한 세포외 매트릭스의 침착에는 주로 단핵 세포인 면역 세포 침윤물이 수반된다(Wynn T., Nat Rev Immunol 4(8):583-594, 2004, 본원에 참조로 포함됨). 강력한 염증 반응은 성장 인자(TGF-베타, VEGF, 간세포 성장 인자, 결합 조직 성장 인자), 사이토카인 및 호르몬(엔도텔린, IL-4, IL-6, IL-13, 케모카인), 분해 효소(엘라스타제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 카텝신), 및 세포외 매트릭스 단백질(콜라겐, 피브로넥틴, 인테그린)의 발현을 초래한다.
더불어, 보체 시스템은 수많은 섬유화 질환에서 활성화된다. 막 공격 복합체를 포함한 보체 구성요소가 수많은 섬유화 조직 시편에서 확인되었다. 예를 들어, 렉틴 경로의 구성요소가 신장 질환의 섬유화 병변에서(Satomura et al., Nephron. 92(3):702-4 (2002); Sato et al., Lupus 20(13):1378-86 (2011); Liu et al., Clin Exp Immunol, 174(1):152-60 (2013)); 간 질환에서(Rensen et al., Hepatology 50(6): 1809-17 (2009)); 및 폐 질환에서(Olesen et al., Clin Immunol 121(3):324-31 (2006)) 발견되었다.
보체 활성화 오버슈팅(overshooting)은 면역 복합체 매개뿐만 아니라 항체 독립적 사구체신염에 대한 핵심 원인인 것으로 확립되었다. 그러나, 제어되지 않은 제자리 보체 활성화가 비사구체 질환에서 TI 섬유증의 병태생리학적 진행에 본질적으로 관여하는 것을 입증하는 강력한 증거가 있다(Quigg R.J, J Immunol 171:3319-3324, 2003, Naik A. et al., Semin Nephrol 33:575-585, 2013, Mathern D.R. et al., Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650, 2015). 국소 보체 활성화에 의해 촉발되는 강력한 전염증 신호는 근위 세뇨관으로 여과되고 후속해서 간질 공간으로 진입하는 보체 구성요소에 의해, 또는 세뇨관 또는 다른 상주성 및 침윤 세포에 의한 보체 구성요소의 비정상적인 합성에 의해, 또는 보체 조절 단백질의 신장 세포 상에서의 변경된 발현, 오는 보체 조절 구성요소의 기능 돌연변이를 위한 부재 또는 상실 또는 획득에 의해 개시될 수 있다(Mathern D.R. et al., Clin J Am Soc Nephrol 10:P1636-1650, 2015, Sheerin N.S., et al., FASEB J 22: 1065-1072, 2008). 마우스에서 예를 들어, 보체 조절 단백질 CR1 관련 유전자/단백질 y(Crry)의 결핍은 세뇨관 간질(TI) 보체 활성화를 초래하고 결과적으로 인간 TI 질환에서 볼 수 있는 손상에 전형적인 염증 및 섬유증을 유발한다(Naik A. et al., Semin Nephrol 33:575-585, 2013, Bao L. et al., J Am Soc Nephrol 18:811-822, 2007). 세뇨관 상피 세포의 아나필라톡신 C3a에 대한 노출은 상피가 중간엽으로 전이되는 결과를 초래한다(Tsang Z. et al., J Am Soc Nephrol 20:593-603, 2009). C3a 수용체 단독을 통한 C3a 신호전달의 차단은 최근에 단백뇨 및 비단백뇨 동물에서 신장 TI 섬유증을 경감시키는 것으로 나타났다(Tsang Z. et al., J Am Soc Nephrol 20:593-603, 2009, Bao L. et al., Kidney Int. 80: 524-534, 2011).
본원에서 기술된 것과 같이, 발명자들은 세뇨관 신장 병리의 개시 및 질환 진행에서 렉틴 경로의 중심 역할을 확인하였고, 그로써 IgA 신장병, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염(Endo M. et al., Nephrol Dialysis Transplant 13: 1984-1990, 1998; Hisano S. et al., Am J Kidney Dis 45:295-302, 2005; Roos A. et al., J Am Soc Nephrol 17: 1724-1734, 2006; Liu L.L. et al., Clin Exp. Immunol 174:152-160, 2013; Lhotta K. et al., Nephrol Dialysis Transplant 14:881-886, 1999; Pickering et al., Kidney International 84:1079-1089, 2013), 당뇨병성 신장병(diabetic nephropathy)(Hovind P. et al., Diabetes 54:1523-1527, 2005), 허혈성 재관류 손상(ischaemic reperfusion injury)(Asgari E. et al., FASEB J 28:3996-4003, 2014) 및 이식 거부반응(transplant rejection)(Berger S.P. et al., Am J Transplant 5:1361-1366, 2005)을 포함한 다양한 범위의 신장 질환의 병태병리학에서 렉틴 경로 활성화의 핵심 역할을 함축하였다.
본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 발명자들은 MASP-2 억제가 세뇨관 간질 질환의 마우스 모델에서 염증 및 섬유증을 감소시키는 것을 입증하였다. 그러므로, MASP-2 억제제는 세뇨관 간질 염증 및 섬유증, 단백뇨, IgA 신장병, C3 사구체병증 및 기타 사구체신염 및 신장 허혈 재관류 손상(schaemia reperfusion injury)을 포함한 신장 섬유증의 치료에 유용할 것으로 예상된다.
폐 질환
폐섬유증은 폐에서 과도한 섬유상 결합 조직의 형성 또는 발생으로, 정상적인 폐 조직은 섬유화 조직으로 대체된다. 이런 흉터는 폐의 경직 및 손상된 폐 구조 및 기능으로 이어진다. 인간에서, 폐섬유증은 폐의 아주 작은 공기 주머니(폐포) 내의 및 그 사이의 조직에 대한 반복적인 손상으로부터 비롯되는 것으로 여겨진다. 실험 설정에서, 다양한 동물 모델이 인간 질환의 측면을 복제하였다. 예를 들어, 블레오마이신, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 실리카, 또는 석면과 같은 외래 작용제가 동물의 기관지에 주입될 수 있다(Gharaee-Kermani et al., Animal Models of Pulmonary Fibrosis. Methods Mol. Med., 2005, 117:251-259).
따라서, 특정 구체예에서, 본 개시는 섬유증 및/또는 코로나바이러스 유도 ARDS와 같은 염증에 의해 유발되거나 악화된 폐 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체에서 폐섬유증을 억제하는 방법을 제공하며, 방법은 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 폐섬유증을 억제하고/거나, 폐섬유증을 감소시키고/거나, 폐 기능을 개선하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 폐 기능의 증상의 개선에는 폐 기능 및/또는 용량의 개선, 감소된 피로, 및 산소 포화의 개선이 포함된다.
MASP-2 억제 조성물은 수술 또는 국소 주사 중에, 직접적으로 또는 원격에 의해, 예를 들어, 카테터에 의해, 예컨대 조성물의 국소 적용에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 대상체에게 전신적으로 투여될 수 있다. 투여는 병태가 해소될 때까지 또는 제어될 때까지 위사에 의해 결정된 대로 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 근본적인 폐 질환 또는 병태에 대해 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양식과 조합되어 투여된다.
감염성 질환
코로나바이러스 및 C형 간염 및 B형 간염과 같은 만성 감염 질환과 같은 감염성 질환은 조직 염증 및 섬유증을 유발하고, 높은 렉틴 경로 활성은 유해할 수 있다. 그러한 질환에서, MASP-2의 억제제가 유익할 수 있다. 예를 들어, MBL 및 MASP-1 수준은 C형 간염 바이러스(HCV) 감염에서 간 섬유증의 중증도의 유의미한 예측요인인 것으로 발견된다(Brown et al., Clin Exp Immunol. 147(1):90-8, 2007; Saadanay et al., Arab J Gastroenterol. 12(2):68-73, 2011; Saeed et al., Clin Exp Immunol. 174(2):265-73, 2013). MASP-1은 이전에 MASP-2 및 렉틴 경로의 강력한 활성자인 것으로 나타났다(Megyeri et al., J Biol Chem. 29: 288(13):8922-34, 2013). 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus) 및 로스 리버 바이러스(Ross River virus)와 같은 알파바이러스는 강력한 숙주 염증 반응을 유도하여 관절염(arthritis) 및 근염(myositis)을 초래하며, 이 병리는 MBL 및 렉틴 경로에 의해 매개된다(Gunn et al., PLoS Pathog. 8(3):e1002586, 2012).
따라서, 특정 구체예에서, 본 개시는 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 및/또는 섬유증을 유발하는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스와 같은 감염성 질환을 앓고 있거나, 또는 이전에 앓았던 대상체에서 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 반전, 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다.
MASP-2 억제 조성물은 수술 또는 국소 주사 중에, 직접적으로 또는 원격에 의해, 예를 들어, 카테터에 의해, 예컨대 조성물의 국소 적용에 의해 섬유증 영역에 국소적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, MASP-2 억제제는, 예컨대 동맥내, 정맥내, 근육내, 흡입, 비강, 피하 또는 다른 비경구 투여에 의해, 또는 잠재적으로 비펩타이드성 작용제를 위한 경구 투여에 의해 대상체에게 전신적으로 투여될 수 있다. 투여는 병태가 해소될 때까지 또는 제어될 때까지 위사에 의해 결정된 대로 반복될 수 있다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 근본적인 감염성 질환에 대해 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양식과 조합되어 투여된다.
일부 구체예에서, 염증 및/또는 섬유증을 유발하는 감염성 질환은 코로나바이러스, 알파 바이러스, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 결핵(튜브rculosis), HIV 및 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2 억제 소분자 화합물)는 근본적인 질환 또는 장애에 대해 적절한 하나 이상의 작용제 또는 치료 양식과 조합되어 투여된다.
본원에 기술된 다양한 방법 및 제약학적 조성물 중 임의의 것의 특정 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 소분자 화합물은 고전적 경로를 온전하게 남겨두면서 렉틴 경로만 선택적으로 차단한다.
IV. MASP-2 억제제
다양한 측면으로, 본 발명은 MASP-2 억제제를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 섬유증 및/또는 염증의 부작용을 억제하는 방법을 제공한다. MASP-2 억제제는 살아있는 대상체에서 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다. 발명의 이 측면의 실시에서, 대표적인 MASP-2 억제제에는: MASP-2의 생물학적 활성을 억제하는 분자(예컨대 소분자 억제제, 항-MASP-2 항체(예컨대, MASP-2 억제 항체) 또는 MASP-2와 상호작용하거나 단백질-단백질 상호작용을 간섭하는 차단 펩타이드), 및 MASP-2의 발현을 감소시킴으로써 렉틴 보체 활성화가 렉틴 보체 경로를 활성화시키는 것을 예방하는 분자(예컨대 MASP-2 안티센스 핵산 분자, MASP-2 특이적 RNAi 분자 및 MASP-2 리보자임)가 포함된다. MASP-2 억제제는 일차 요법으로서 단독으로 또는 다른 의학적 치료의 치료적 이익을 향상시키기 위한 보조 요법으로서 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다.
MASP-2 의존성 보체 활성화의 억제는 발명의 방법에 따라 MASP-2의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 구성요소의 다음의 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2 의존성 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9(MAC)의 생성 또는 생산의 억제(예를 들어, 실시예 2에서 기술된 것과 같이 측정됨), C4 절단 및 C4b 침착의 감소(예를 들어 실시예 2에서 기술된 것과 같이 측정됨), 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소(예를 들어, 실시예 2에서 기술된 것과 같이 측정됨).
본 발명에 따르면, 코로나바이러스로 감염된 대상체에서 호흡 곤란을 억제하는데(또는 호흡 기능을 개선시키는, 진술된 또 다른 방법에) 효과적인 MASP-2 억제제가 사용된다.
호흡 기능의 평가는 주기적으로, 예컨대, 매시간, 매일, 매주, 또는 매월 수행될 수 있다. 이런 평가는 바람직하게는 주어진 대상체에 대하 여러 시점에서 또는 주어진 대상체 및 건강한 대조군에 대해 한 시점 또는 여러 시검에서 수행된다. 평가는 규칙적인 시간 간격으로, 예컨대 매시간, 매일, 매주, 또는 매월 수행될 수 있다. 하나의 평가가 호흡 곤란의 감소(즉, 호흡 기능의 증가)라는 소견으로 이어졌을 때, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 코로나바이러스 유도 급성 호흡기 장애 증후군을 앓고 있는 대상체를 치료하기에 효과적이라고 말할 수 있다.
발명의 이런 측면의 실시에 유용한 MASP-2 억제제로는, 예를 들어, MASP-2 항체 및 그것의 단편, MASP-2 억제 펩타이드, 소분자, MASP-2 가용성 수용체 및 발현 억제제를 들 수 있다. MASP-2 억제제는 MASP-2의 생물학적 기능을 차단함으로써 MASP-2 의존성 보체 활성화 시스템을 억제할 수 있다. 예를 들어, 억제제는 MASP-2 단백질-대-단백질 상호작용을 효과적으로 차단하거나, MASP-2 이량체화 또는 조립을 간섭하거나, Ca2+ 결합을 차단하거나, MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 간섭하거나, 또는 MASP-2 단백질 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 보체 활성화를 선택적으로 억제하여, C1q 의존성 보체 활성화 시스템을 기능상 온전하게 남겨둔다.
한 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 보체 시스템의 다른 항원에 대한 것보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 특이적으로 결합하는 특이적 MASP-2 억제제 이다. 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 보체 시스템의 다른 항원에 대한 것보다 적어도 100배 더 큰 결합 친화도로 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 (i) MASP-2의 CCP1-CCP2 도메인(서열 번호:6의 aa 300-431) 또는 세린 프로테아제 도메인(서열 번호:6의 aa 445-682) 중 적어도 하나에 특이적으로 결합하여 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. MASP-2 억제제의 결합 친화성은 적합한 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
MASP-2 폴리펩타이드는 C1 보체 시스템의 프로테아제인 MASP-1, MASP-3, 및 C1r 및 C1s에 유사한 분자 구조를 나타낸다. 서열 번호:4에 제시된 cDNA 분자는 MASP-2(서열 번호:5에 제시된 아미노산으로 이루어짐)의 대표적인 예를 암호화하고 분비 후에 절단되어 인간 MASP-2의 성숙한 형태(서열 번호:6)를 초래하는, 리더 서열(aa　1-15)이 있는 인간 MASP-2 폴리펩타이드를 제공한다. 도 2에서 나타낸 것과 같이, 인간 MASP　2 유전자는 12개의 엑손을 포함한다. 인간 MASP-2 cDNA는 엑손 B, C, D, F, G, H, I, J, K 및 L에 의해 암호화된다. 대체 스플라이스는 도 2에서 나타낸 것과 같이 엑손 B, C, D 및 E로부터 발생하는 (서열 번호:1)에 의해 암호화되는, MBL 관련 단백질 19("MAp19", 또한 "sMAP"로도 언급됨)(서열 번호:2)로 불리는 20　kDa 단백질을 초래한다. 서열 번호:50에 제시된 cDNA 분자는 쥐과 MASP-2(서열 번호:51에 제시된 아미노산 서열로 이루어짐)를 암호화하고 분비 후에 절단되어 쥐과 MASP-2의 성숙한 형태(서열 번호:52)를 초래하는, 리더 서열이 있는 쥐과 MASP-2 폴리펩타이드를 제공한다. 서열 번호:53에 제시된 cDNA 분자는 래트 MASP-2(서열 번호:54에 제시된 아미노산 서열로 이루어짐)를 암호화하며 분비 후에 절단되어 래트 MASP-2의 성숙한 형태(서열 번호:55)를 초래하는, 리더 서열이 있는 래트 MASP-2 폴리펩타이드를 제공한다.
기술분야에 숙련된 사람들은 서열 번호:4, 서열 번호:50 및 서열 번호:53에서 개시된 서열이 각각 인간, 쥐과 및 래트 MASP-2의 단일 대립유전자를 나타내며, 대립유전자 변이 및 대체 스플라이싱이 일어나는 것으로 예상되는 것을 인정할 것이다. 침묵 돌연변이 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 돌연변이를 함유한 것들을 포함하여 서열 번호:4, 서열 번호:50 및 서열 번호:53에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 대립유전자 변이체는 본 발명의 범주 내에 있다. MASP-2 서열의 대립유전자 변이체는 표준 과정에 따라 상이한 개체로부터의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다.
인간 MASP-2 단백질(서열 번호:6)의 도메인은 도 1 및 도 2A에 도시되며 N 말단 C1r/C1s/성게 Vegf/뼈 형태 형성 단백질(CUBI) 도메인(서열 번호:6의 aa　1-121), 표피 성장 인자 유사 도메인(aa　122-166), 제2 CUBI 도메인(aa　167-293), 뿐만 아니라 보체 제어 단백질 도메인 및 세린 프로테아제 도메인의 탠덤을 포함한다. MASP　2 유전자의 대체 스플라이싱은 도 1에 도시된 MAp19를 초래한다. MAp19는 도 1에서 나타낸 것과 같이 엑손 E로부터 유래된 4개의 추가 잔기(EQSL)가 있는 MASP-2의 N 말단 CUBI-EGF 영역을 함유하는 비효소적 단백질이다.
여러 단백질이 MASP-2에 결합하거나, 또는 단백질-대-단백질 상호작용을 통해 MASP-2와 상호작용하는 것으로 나타났다. 예를 들어, MASP-2는 렉틴 단백질 MBL, H-피콜린 및 L-피콜린에 결합하여 Ca2+ 의존성 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 각각의 MASP-2/렉틴 복합체는 단백질 C4 및 C2의 MASP-2 의존성 절단을 통해 보체를 활성화하는 것으로 나타났다(Ikeda, K., et　al., J. Biol. Chem.　262:7451-7454, 1987; Matsushita, M., et　al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M., et　al., J.　Immunol. 168:3502-3506, 2002). 연구 결과 MASP-2의 CUBI-EGF 도메인은 MASP-2의 MBL과의 회합에 필수적인 것으로 나타났다(Thielens, N.M., et　al., J.　Immunol. 166:5068, 2001). 또한 CUBIEGFCUBII 도메인은 활성 MBL 복합체의 형성에 필요한 MASP-2의 이량체화를 매개하는 것으로 나타났다(Wallis, R., et　al., J. Biol. Chem.　275:30962-30969, 2000). 그러므로, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화에 중요한 것으로 알려져 있는 MASP-2 표적 영역에 결합하거나 간섭하는 것으로 확인될 수 있다.
항-MASP-2 억제 항체
발명의 이 측면의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 항-MASP-2 항체를 포함한다. 발명의 이 측면에 유용한 항-MASP-2 항체에는 임의의 항체 생성 포유류로부터 유래된 다클론성, 단클론성 또는 재조합 항체가 포함되며 다중특이적, 키메라, 인간화된, 항-이디오타입, 및 항체 단편일 수 있다. 항체 단편에는 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 단편, scFv 단편 및 단일 사슬 항체가 포함된다.
MASP-2 항체는 MASP-2 의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 능력 및 항섬유화 활성 및/또는 단백뇨 또는 아드리아마이신 유도 신장병과 관련된 신장 손상을 억제하는 능력에 대해 본원에 기술된 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 여러 MASP-2 항체가 문헌에 기술되어 있고 일부는 새롭게 생성되었으며, 그 중 일부가 아래의 표 1에서 열거된다. 예를 들어, 본원의 실시예 10 및 11에서 기술된 것과 같이, MASP-2 의존성 보체 활성화를 차단하는 항-MASP-2 Fab2 항체가 확인되었다. 실시예 12에서 기술되는 것과 같이, 또한 본원에 참조로 포함된 WO2012/151481에서 기술되는 것과 같이, 전체 인간 MASP-2 scFv 항체(예컨대, OMS646)가 MASP-2 의존성 보체 활성화를 차단하는 것이 확인되었다. 실시예 13에서 기술되는 것과 같이, 또한 본원에 참조로 포함된 WO2014/144542에서 기술되는 것과 같이, SGMI-2 펩타이드 아미노산 서열(서열 번호:72, 73 또는 74)을 인간 MASP-2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노 또는 카르복시 발단에 융합시킴으로써 MASP-2 억제 활성을 가진 SGMI-2 펩타이드 포함 MASP-2 항체 및 그것의 단편이 생성되었다(예컨대, OMS646-SGMI-2).
따라서, 한 구체예에서, 발명의 방법에 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 항체 예컨대, 예를 들어 OMS646을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 청구된 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 MASP-2(서열 번호:6)로 이루어진 폴리펩타이드에 결합하는 인간 항체를 포함하며, 항체는: (I) (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:69의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:69의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:69의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 (II) 서열 번호:67에 대해 적어도 90% 동일성(예컨대, 서열 번호:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69에 대해 적어도 90% 동일성(예컨대, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 일정량을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식되는 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 발명의 방법에 사용하기 위한 MASP-2 억제제는 인간 항체 OMS646을 포함한다.
이펙터 기능이 감소된 항-MASP-2 항체
발명의 이 측면의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 고전적 보체 경로의 활성화로부터 발생할 수 있는 염증을 감소시키기 위해 감소된 이펙터 기능을 가진다. IgG 분자의 고전적 보체 경로 촉발 능력은 분자의 Fc 부분 내에 있는 것으로 나타났다(Duncan, A.R.,　et　al., Nature 332:738-740 1988). 분자의 Fc 부분이 효소적 절단에 의해 제거되어 있는 IgG 분자는 이 이펙터 기능이 없다(Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988 참고). 따라서, 이펙터 기능을 최소화하는 유전자 조작된 Fc 서열을 가짐으로써, 또는 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입의 것임으로써 이펙터 기능이 감소된 항체가 분자의 Fc 부분이 결핍된 결과로서 생성될 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체는 본원에 기술되고 문헌[Jolliffe et　al., Int'l Rev. Immunol.　10:241-250, 1993, 및 Rodrigues et　al., J. Immunol.　151:6954-6961, 1998]에서 기술된 것과 같이 IgG 중쇄의 Fc 부분의 표준 분자 생물학 조작에 의해 제조될 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체는 또한 보체를 활성화하고/거나 Fc 수용체와 상호작용하는 능력이 감소된 인간 IgG2 및 IgG4 아이소타입이 포함된다(Ravetch, J.V., et　al., Annu. Rev. Immunol.　9:457-492, 1991; Isaacs, J.D.,　et　al., J. Immunol. 148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et　al., Immunol. Today　14:215-221, 1993). IgG2 또는 IgG4 아이소타입으로 구성된 인간 MASP-2에 대해 특이적인 인간화된 또는 전체 인간 항체는 문헌[Vaughan, T.J., et　al., Nature Biotechnical　16:535-539, 1998]에 기술되어 있는 것과 같이, 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 여러 방법 중 하나에 의해 제조될 수 있다.
항-MASP-2 항체의 제조
항-MASP-2 항체는 MASP-2 폴리펩타이드(예컨대, 전장 MASP-2)를 사용하여 또는 항원성 MASP-2 에피토프 포함 펩타이드(예컨대, MASP-2 폴리펩타이드의 일부분)를 사용하여 제조될 수 있다. 면역원성 펩타이드는 5개 아미노산 잔기 정도로 작은 것일 수 있다. 예를 들어, 서열 번호:6의 전체 아미노산 서열을 포함하는 MASP-2 폴리펩타이드가 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 것으로 알려져 있는 특정 MASP-2 도메인, 예컨대 CUBI, 및 CUBIEGF 도메인, 뿐만 아니라 세린-프로테아제 활성 부위를 포함하고 있는 영역은 실시예 3에서 기술된 재조합 폴리펩타이드로서 발현될 수 있고 항원으로서 사용될 수 있다. 더불어, MASP-2 폴리펩타이드(서열 번호:6)의 적어도 6개의 아미노산 부분을 포함하는 펩타이드가 또한 MASP-2 항체를 유도하는데 유용하다. MASP-2 항체를 유도하는데 유용한 MASP-2 유래 항원의 추가 예는 아래의 표 2에서 제공된다. 항체를 발생시키기 위해 사용된 MASP-2 펩타이드 및 폴리펩타이드는, 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 천연 폴리펩타이드, 또는 재조합 또는 합성 펩타이드 및 촉매적으로 비활성인 재조합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2A로서 분리될 수 있다. 발명의 이 측면의 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 본원에서 기술된 형질전환 마우스 계통을 사용하여 얻어진다.
항-MASP-2 항체를 제조하기에 유용한 항원에는 또한 융합 폴리펩타이드, 예컨대 MASP-2 또는 그것의 일부분과 면역글로불린 폴리펩타이드와의 융합 또는 말토스 결합 단백질과의 융합이 포함된다. 폴리펩타이드 면역원은 전장 분자 또는 그것의 일부분일 수 있다. 만약 폴리펩타이드 부분이 합텐 유사한 것이면, 그러한 부분은 면역화를 위해 유리하게 거대분자 운반체(예컨대 키호울 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍 독소)에 결합되거나 연결될 수 있다.
다클론성 항체
MASP-2에 대한 다클론성 항체는 동물을 MASP-2 폴리펩타이드 또는 그것의 면역원성 부분으로 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et　al., "Production of Polyclonal Antisera", in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), page　105를 참고한다. MASP-2 폴리펩타이드의 면역원성은 미네랄 겔을 포함한 보조제, 예컨대 수산화 알루미늄 또는 프로인트 보조제(완전 또는 불완전), 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가 음이온, 오일 에멀션, 키호울 림펫 헤모시아닌 및 다이니트로페놀과 같은 표면 활성 물질의 사용을 통해 증가될 수 있다. 다클론성 항체는 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니아 피그, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 발생된다. 대안적으로, 본 발명에 유용한 항-MASP-2 항체는 또한 인간 이하의 영장류로부터 유래될 수 있다. 개코원숭이에서 진단적으로 및 치료적으로 유용한 항체를 발생시키기 위한 일반적인 기법은, 예를 들어, Goldenberg 등의 국제 특허 출원 공개 번호 WO　91/11465, 및 문헌[Losman, M.J., et　al., Int. J.　Cancer　46:310, 1990]에서 찾아볼 수 있다. 그런 후에 면역학적으로 활성인 항체를 함유한 혈청이 그렇게 면역화된 동물의 혈액으로부터 기술분야에 잘 알려져 있는 표준 과정을 사용하여 제조된다.
단클론성 항체
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 항-MASP-2 단클론성 항체이다. 항-MASP-2 단클론성 항체는 단일 MASP-2 에피토프에 대해 지정되는, 고도로 특이적이다. 본원에서 사용되는 바, 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어지는 것인 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 제조를 필요하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 단클론성 항체는 배양 중의 연속 세포주에 의해 항체 분자의 제조를 제공하는 임의의 기법, 예컨대 문헌[Kohler, G., et　al., Nature　256:495, 1975]에 기술된 하이브리도마 방법에 의해 얻어질 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법(예컨대, Cabilly의 미국 특허 제　4,816,567호 참고)에 의해 제조될 수 있다. 단클론성 항체는 또한 문헌에 기술된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다(Clackson, T., et　al., Nature　352:624-628, 1991, 및 Marks, J.D., et　al., J. Mol. Biol.　222:581-597, 1991). 그러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함한 임의의 면역글로불린 부류 및 그것의 임의의 하위부류의 것일 수 있다.
예를 들어, 단클론성 항체는 적합한 포유류(예컨대, BALB/c 마우스)를 MASP-2 폴리펩타이드 또는 그것의 일부를 포함하는 조성물로 주사함으로써 얻어질 수 있다. 미리 결정된 시간이 지난 후, 비장 세포가 마우스로부터 제거되고 세포 배양 배지에 현탁된다. 그런 후 비장 세포는 불멸 세포주와 융합되어 하이브리도마가 형성된다. 형성된 하이브리도마는 세포 배양에서 성장되고 MASP-2에 대한 단클론성 항체를 생성하는 능력에 대해 스크리닝된다. 항-MASP-2 단클론성 항체의 제조를 추가로 기술하는 실시예가 본원에 제공된다(또한 Current Protocols in Immunology, Vol.　1., John Wiley　& Sons, pages　2.5.1-2.6.7, 1991 참고).
인간 단클론성 항체는 항원성 도전에 대한 반응으로 특정 인간 항체를 제조하도록 조작된 형질도입 마우스의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 이런 기법에서, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소가 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유한 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스의 스트레인에 도입된다. 형질전환 마우스는 인간 항원, 예컨대 본원에 기술된 MASP-2 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이 종래의 쾰러-밀스타인(Kohler-Milstein) 기술을 사용하여 그러한 동물로부터의 B 세포를 적합한 골수종 세포주에 융합시킴으로써 인간 MASP-2 항체 분비 하이브리도마를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 인간 면역글로불린 게놈을 가진 형질전환 마우스는 상업적으로 이용 가능하다(예컨대,　Abgenix, Inc., Fremont, CA, 및 Medarex, Inc., Annandale, N.J.로부터). 형질전환 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은 예를 들어, 문헌에 기술되어 있다(Green, L.L., et　al., Nature Genet.　7:13, 1994; Lonberg, N., et　al., Nature 368:856, 1994; 및 Taylor, L.D., et　al., Int. Immun.　6 :579, 1994).
단클론성 항체는 하이브리도마 배양으로부터 잘 확립되어 있는 다양한 기법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 그러한 분리 기법에는 단백질-A 세파로스를 포함한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피가 포함된다(예를 들어, Coligan의 참고문헌, 페이지 2.7.1-2.7.12 및 페이지　2.9.1-2.9.3; Baines et　al., "Purification of Immunoglobulin　G (IgG)", in 방법 in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol.　10, pages　79-104, 1992 참고).
제조된 후에는, 다클론성, 단클론성 또는 파지 유래 항체는 먼저 특이적 MASP-2 결합에 대해 테스트된다. 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 다양한 검정이 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체를 검출하기 위해 활용될 수 있다. 예시의 검정에는 표준 방법에 의한 웨스턴 블롯 또는 면역침전 분석(예컨대, Ausubel 등의 문헌에서 기술됨), 면역전기영동, 효소 결합 면역흡착 검정, 돗트 블롯, 억제 또는 경합 검정 및 샌드위치 검정(Harlow and Land, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988에서 기술된 것과 같음). 항체가 MASP-2에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되면, 항-MASP-2 항체는, 예를 들어, 렉틴 특이적 C4 절단 검정(실시예 2에서 기술됨), C3b 침착 검정(실시예 2에서 기술됨) 또는 C4b 침착 검정(실시예 2에서 기술됨)과 같은 여러 검정 중 하나로 MASP-2 억제제로서의 기능하는 능력에 대해 테스트된다.
항-MASP-2 단클론성 항체의 친화성은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 쉽게 결정될 수 있다(예컨대, Scatchard, A., NY Acad. Sci.　51:660-672, 1949 참고). 한 구체예에서, 발명의 방법에 유용한 항-MASP-2 단클론성 항체는 <100　nM, 바람직하게는 <10　nM 및 가장 바람직하게는 <2　nM의 결합 친화도로 MASP-2에 결합한다.
키메라/인간화된 항체
발명의 방법에 유용한 단클론성 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동하는 한편, 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동하는 키메라 항체, 뿐만 아니라 그러한 항체의 단편이 포함된다(Cabilly의 미국 특허 제 4,816,567호; 및 Morrison, S.L., et　al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　81:6851-6855, 1984).
발명에 유용한 키메라 항체의 한 형태는 인간화된 단클론성 항-MASP-2 항체이다. 비인간(예컨대, 쥐과) 항체의 인간화된 형태는 키메라 항체로, 비인간 면역글로불린으로부터 유래돈 최소 서열을 함유한다. 인간화된 단클론성 항체는 비인간(예컨대, 마우스) 상보성 결정 영역(CDR)을, 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 가변 도메인으로 전달함으로써 생성된다. 전형적으로, 그런 후 인간 항체의 잔기는 비인간 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 나아가, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 Fv 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 그것이다. 인간화된 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 문헌[Jones, P.T., et　al., Nature　321:522-525, 1986; Reichmann, L., et　al., Nature　332:323-329, 1988; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.　2:593-596, 1992]을 참고한다.
발명에 유용한 인간화된 항체에는 적어도 MASP-2 결합 CDRH3 영역을 포함하는 인간 단클론성 항체가 포함된다. 더불어, Fc 부분은 IgA 또는 IgM뿐만 아니라 인간 IgG 항체를 생성하기 위하여 대체될 수 있다. 그러한 인간화된 항체는 인간 MASP-2를 특이적으로 인식하지만 항체 자체에 대해 인간에서 면역 반응을 일으키지는 않을 것이기 E때문에 특별한 임상적 유용성을 가질 것이다. 따라서, 그것은 특히 반복된 또는 장기 투여가 필요할 때 인간에서 생체내 투여에 더 낫게 적합하다.
쥐과 항-MASP-2 단클론성 항체로부터의 인간화된 항-MASP-2 항체의 제조의 예가 본원의 실시예 6에서 제공된다. 인간화된 단클론성 항체를 제조하는 기법은 또한, 예를 들어, 문헌에 기술되어 있다[Jones, P.T., et　al., Nature　321:522, 1986; Carter, P., et　al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA　89:4285, 1992; Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech.　12:437, 1992; Singer, I.I., et　al., J. Immun.　150:2844, 1993; Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., 1995; Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et　al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, 1996; 및 Queen에게 1997년도에 부여된 미국 특허 제 5,693,762호]. 더불어, 특정 쥐과 항체 영역으로부터 인간화된 항체를 합성할 상업적 단체, 예컨대 Protein Design Labs(Mountain View, CA)가 있다.
재조합 항체
항-MASP-2 항체는 또한 재조합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 항체는 인간 면역글로불린 발현 라이브러리(예를 들어, Stratagene, Corp.(La Jolla, CA)로부터 이용 가능함)를 사용하여 인간 항체의 단편(VH, VL, Fv, Fd, Fab 또는 F(ab')2)을 생성하도록 제조될 수 있다. 이들 단편은 그런 후 키메라 항체를 제조하는 것과 유사한 기법을 사용하여 전체 인간 항체를 구성하기 위해 사용된다.
항-이디오타입 항체
원하는 억제 활성을 갖는 항-MASP-2 항체가 확인되면, 이들 항체는 기술분야에 잘 알려져 있는 기법을 사용하여 MASP-2의 일부를 닮은 항-이디오타입 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌[Greenspan, N.S., et　al., FASEB　J.　7:437, 1993]을 참고한다. 예를 들어, MASP-2에 결합하고 보체 활성화에 필요한 MASP-2 단백질 상호작용을 억제하는 항체는 MASP-2 단백질 상의 MBL 결합 부위를 닮아서 예를 들어 MBL과 같은 MASP-2의 결합 리간드에 결합하여 중화하는 항-이디오타입을 생성하는데 사용될 수 있다.
면역글로불린 단편
발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제제는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한 잘 알려져 있는 단편, scFv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
기술분야에는 항체 분자의 작은 부분, 파라토프만이 항체의 에피토프에의 결합에 연루되는 것이 잘 알려져 있다(예컨대, Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986 참고). 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 고전적 보체 경로의 이펙터지만, 항원 결합에는 관여하지 않는다. pFc' 영역이 효소적으로 절단되었거나, 또는 pFc' 영역이 없이 제조된 항체는 F(ab')2 단편으로서 표시되고 온전한 항체의 항원 결합 부위를 둘 다 보유한다. 분리된 F(ab')2 단편은 그것의 두 항원 결합 부위로 인해 이가 단클론성 단편으로 언급된다. 유사하게, Fc 영역이 효소적으로 절단되었거나, 또는 Fc 영역이 없이 제조된 항체는 Fab 단편으로 표시되고, 온전한 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다.
항체 단편은 단백질 분해성 가수분해에 의해, 예컨대 종래 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신을 사용한 항체의 효소적 절단에 의해 생성되어 F(ab')2로 표시된 5S　단편이 제공된다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단되어 3.5S　Fab' 일가 단편이 생성된다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단으로부터 발생된 설프하이드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 펩신을 사용하는 효소적 절단으로 2개의 일가 Fab 단편 및 Fc 단편이 직접 생성된다. 이들 방법은, 예를 들어, Goldenberg의 미국 특허 제 4,331,647호; 문헌[Nisonoff, A., et　al., Arch. Biochem. Biophys.　89:230, 1960; Porter, R.R., Biochem. J.　73:119, 1959; Edelman, et　al., in Methods in Enzymology　1:422, Academic Press, 1967; 및 Coligan에 의한 참고문헌 페이지 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4]에서 기술된다.
일부 구체예에서, Fc 영역이 없는 항체 단편의 사용은 Fc가 Fcγ 수용체에 결합할 때 개시되는 고전적 보체 경로의 활성화를 피하기 위해 바람직하다. 당업자가 Fcγ 수용체 상호작용을 피하는 MoAb를 생성할 수 있는 여러 방법이 있다. 예를 들어, 단클론성 항체의 Fc 영역은 단백질 분해 효소에 의한 부분 소화(예컨대 피신 소화)를 사용하여 화학적으로 제거될 수 있고, 그로써, 예를 들어, Fab 또는 F(ab)2 단편과 같은 항원 결합 항체 단편이 생성될 수 있다((Mariani, M., et　al., Mol. Immunol.　28:69-71, 1991). 대안적으로, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 인간 γ4 IgG 아이소타입은 본원에 기술된 인간화된 항체의 구성 중에 사용될 수 있다. Fc 도메인이 없는 항체, 단일 사슬 항체 및 항원 결합 도메인은 또한 본원에 기술된 재조합 기법을 사용하여 조작될 수 있다.
단일 사슬 항체 단편
대안적으로, 당업자는 중쇄 및 경쇄 Fv 영역이 연결되어 있는 MASP-2에 특이적인 단일 펩타이드 사슬 결합 분자를 생성할 수 있다. Fv 단편은 펩타이드 링커에 의해 연결되어 단일 사슬 항원 결합 단백질(scFv)이 형성될 수 있다. 이들 단일 사슬 항원 결합 단백질은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결되는 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터에 삽입되고, 그것은 후속해서 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E.　coli)에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 V 도메인을 가교시키는 링커 펩타이드가 있는 단일 폴리펩타이드 사슬을 합성한다. scFv를 제조하는 방법은 예를 들어, 문헌[Whitlow, et　al., "방법: A Companion to 방법 in Enzymology" 2:97, 1991; Bird, et　al., Science　242:423, 1988; Ladner의 미국 특허 제　4,946,778호; Pack, P., et　al., Bio/Technology　11:1271, 1993]에 기술되어 있다.
예시적인 예로서, MASP-2 특이적 scFv는 림프구를 시험관내에서 MASP-2 폴리펩타이드에 노출시키고 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써(예를 들어, 고정된 또는 표지된 MASP-2 단백질 또는 펩타이드의 사용을 통해) 얻어질 수 있다. 잠재적 MASP-2 폴리펩타이드 결합 도메인을 가지는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 파지 상에 또는 이. 콜라이와 같은 박테리아 상에 표현된 랜덤 펩타이드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리는 MASP-2와 상호작용하는 펩타이드에 대한 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 그러한 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 기법은 기술분야에 잘 알려져 있고(Lardner의 미국 특허 제　5,223,409호; Lardner의 미국 특허 제　4,946,778호; Lardner의 미국 특허 제　5,403,484호; Lardner의 미국 특허 제　5,571,698호; 및 Kay et　al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) 무작위 펩타이드 디스플레이 라이브러리 및 키트는, 예를 들어 CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc.(San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc.(Ipswich, Mass.), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway, N.J.)로부터 상업적으로 이용 가능하다.
발명의 이 측면에 유용한 항-MASP-2 항체 단편의 또 다른 형태는 MASP-2 항원 상의 에피토프에 결합하고 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩타이드이다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위")는 관심의 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 그러한 유전자는, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 항체 생성 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성함으로써 제조된다(예를 들어, Larrick et　al., 방법: A Companion to 방법 in Enzymology　2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et　al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995; 및 Ward　et　al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et　al. (eds.), page　137, Wiley-Liss, Inc., 1995 참고).
본원에 기술된 MASP-2 항체는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 것을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 높은 친화성 인간 또는 인간화된 단클론성 항-MASP-2 이펙터 기능이 감소된 항체이다.
펩타이드 억제제
발명의 이 측면의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화 시스템을 억제하는 분리된 천연 펩타이드 억제제 및 합성 펩타이드 억제제를 포함하여, 분리된 MASP-2 펩타이드 억제제를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "분리된 MASP-2 펩타이드 억제제"는 MASP-2에 결합하여, 렉틴 경로의 또 다른 인식 분자(예컨대, MBL, H-피콜린, M-피콜린, 또는 L-피콜린)에 대한 결합에 대해 경합하고/거나, MASP-2와 직접 상호작용하여 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제함으로써 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는, 실질적으로 순수하고 본질적으로 의도된 용도에 대해 실제적이고 적절한 정도로 자연계에서 함께 발견될 수 있는 다른 물질이 없는 펩타이드를 지칭한다.
펩타이드 억제제는 단백질-단백질 상호작용 및 촉매 부위를 간섭하기 위해 생체내에서 성공적으로 사용되었다. 예를 들어, LFA-1에 구조적으로 관련된 부착 분자에 대한 펩타이드 억제제는 최근에 응고병증(coagulopathy)에서 임상 용도에 대해 승인되었다(Ohman, E.M.,　et　al., European Heart J.　16:50-55, 1995). 인테그린 의존성 부착을 방지하거나 간섭하는 짧은 선형 펩타이드(<30개 아미노산)가 기술되었다(Murayama, O., et　al., J. Biochem. 120:445-51, 1996). 25 내지 200개 아미노산 잔기 길이 범위의 긴 펩타이드가 또한 인테그린 의존성 부착을 차단하기 위해 성공적으로 사용되었다(Zhang, L., et　al., J. Biol. Chem.　271(47):29953-57, 1996). 일반적으로, 긴 펩타이드 억제제는 짧은 펩타이드보다 더 높은 친화도 및/또는 더 느린 오프 속도를 가지며 따라서 보다 강력한 억제제일 수 있다. 고리형 펩타이드 억제제가 또한 인간 염증성 질환의 치료를 위해 생체내에서 인테그린의 효과적인 억제제인 것으로 나타났다(Jackson, D.Y., et　al., J. Med. Chem.　40:3359-68, 1997). 고리형 펩타이드를 제조하는 한 가지 방법은 펩타이드의 말단 아미노산이 시스테인이고, 그로써 펩타이드가 이황화 결합에 의해 고리형 형태로 존재하는 것이 허용되는 펩타이드의 합성을 포함하며, 이것은 조혈 신생물의 치료를 위해 생체내 친화도 및 반감기를 개선하는 것으로 나타났다(예컨대, Larson의 미국 특허 제　6,649,592호).
합성 MASP-2 펩타이드 억제제
발명의 이 측면의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 기능에 중요한 표적 용역을 모방하는 아미노산 서열에 의해 예시된다. 발명의 방법의 실시에 유용한 억제 펩타이드는 크기가 약 5개 아미노산 내지 약 300개 아미노산 범위이다. 표 3은 본 발명의 이런 측면의 실시에 유용할 수 있는 예시의 억제 펩타이드의 목록을 제공한다. 후보 MASP-2 억제 펩타이드는 예를 들어, 렉틴 특이적 C4 절단 검정(실시예 2에서 기술됨), 및 C3b 침착 검정(실시예 2에서 기술됨)을 포함한 여러 검정 중 하나로 MASP-2 억제제로서 기능하는 능력에 대해 테스트될 수 있다.
일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2 폴리펩타이드로부터 유래되며 전장 성숙한 MASP-2 단백질(서열 번호:6)로부터, 또는 예를 들어, CUBI 도메인(서열 번호:8), CUBIEGF 도메인(서열 번호:9), EGF 도메인(서열 번호:11), 및 세린 프로테아제 도메인(서열 번호:12)과 같은 MASP-2 단백질의 특정 도메인으로부터 선택된다. 이전에 기술된 것과 같이, CUBEGFCUBII 영역은 이량체화 및 MBL과의 결합에 필요한 것으로 나타났다(Thielens　et　al., 위 참조). 특히, MASP-2의 CUBI 도메인의 펩타이드 서열 TFRSDYN(서열 번호:16)은 MBL 복합체로부터 MASP-2의 손실을 초래하는, Asp105에서 Gly105로의 동형접합성 돌연변이를 보유한 인간을 확인한 연구에서 MBL에 대한 결합에 관여하는 것으로 나타났다(Stengaard-Pedersen, K., et　al., New England J. Med.　349:554-560, 2003).
일부 구체예에서, MASP-2 억제 펩타이드는 MASP-2에 결합하고 렉틴 보체 경로에 관여하는 렉틴 단백질로부터 유래된다. 만난 결합 렉틴 (MBL), L-피콜린, M-피콜린 및 H-피콜린을 포함하여, 이 경로에 관여하는 여러 상이한 렉틴이 확인되었다(Ikeda, K.,　et　al., J.　Biol. Chem. 262:7451-7454, 1987; Matsushita, M.,　et　al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, 2000; Matsushita, M.,　et　al., J.　Immunol. 168:3502-3506, 2002). 이들 렉틴은 각각이 탄수화물 인식 도메인을 가진 N 말단 콜라겐 유사 섬유를 가지고 있는 단일삼량체 하위유닛의 올리고머로서 혈청에 존재한다. 이들 상이한 렉틴은 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났고, 렉틴/MASP-2 복합체는 단백질 C4 및 C2의 절단을 통해 보체를 활성화한다. H-피콜린은 24개 아미노산의 아미노 말단 영역, 11개의 Gly-Xaa-Yaa 반복부를 가진 콜라겐 유사 도메인, 12개 아미노산의 넥(neck) 도메인, 및 207개 아미노산의 피브리노겐 유사 도메인을 가지고 있다(Matsushita, M.,　et　al., J.　Immunol.　168:3502-3506, 2002). H-피콜린은 GlcNAc에 결합하여 살모넬라 타이피뮤리움(S.　typhimurium), 스타필로코커스 미네소타(S.　minnesota) 및 이. 콜라이로부터 유래된 LPS로 코팅된 인간 적혈구를 응집시킨다. H-피콜린은 MASP-2 및 MAp19와 회합하여 렉틴 경로를 활성화하는 것으로 나타났다. Id. L-피콜린/P35는 또한 GlcNAc에 결합하고 인간 혈청에서 MASP-2 및 MAp19와 회합되는 것으로 나타났고 이 복합체는 렉틴 경로를 활성화하는 것으로 나타났다(Matsushita, M.,　et　al., J.　Immunol. 164:2281, 2000). 따라서, 본 발명에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 MBL 단백질(서열 번호:21), H-피콜린 단백질(Genbank 수탁 번호 NM_173452), M-피콜린 단백질(Genbank 수탁 번호 O00602) 및 L-피콜린 단백질(Genbank 수탁 번호 NM_015838)로부터 선택된 적어도 5개 아미노산의 영역을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 과학자들은 MBP의 콜라겐 유사 도메인의 C 말단 부분에서 힌지와 넥 사이에 있는 12개의　Gly-X-Y 트리플렛 "GKD GRD GTK GEK GEP GQG LRG LQG POG KLG POG NOG PSG SOG PKG QKG DOG KS"(서열 번호:26) 내에 있는 MBL 상의 MASP-2 결합 부위를 확인하였다(Wallis,　R.,　et　al., J.　Biol. Chem. 279:14065, 2004). 이 MASP-2 결합 부위 영역은 또한 인간 H-피콜린 및 인간 L-피콜린에서 고도로 보존된다. 아미노산 서열 "OGK-X-GP"(서열 번호:22)를 포함하는 전부 3개의 렉틴 단백질에 존재하는 공통 결합 부위가 기술되었고, 여기서 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타내며 문자 "X"는 소수성 잔기를 나타낸다(Wallis　et　al., 2004, 위 참조). 따라서, 일부 구체예에서, 발명의 이 측면에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 길이가 적어도 6개 아미노산이며 서열 번호:22를 포함한다. 아미노산 서열 "GLR GLQ GPO GKL GPO G"(서열 번호:24)를 포함하는 MBL로부터 유래된 펩타이드는 시험관내에서 MASP-2에 결합하는 것으로 나타났다(Wallis,　et　al., 2004, 위 참조). MASP-2에 대한 결합을 향상시키기 위하여, 천연 MBL 단백질에서 발견되는 삼중 나선의 형성을 향상시키기 위해 각 단부에서 2개의 GPO 트리플렛이 측면에 있는 펩타이드("GPO GPO GLR GLQ GPO GKL GPO GGP OGP O" 서열 번호:25)가 합성될 수 있다(Wallis, R.,　et　al., J. Biol. Chem. 279:14065, 2004에서 추가로 기술됨).
MASP-2 억제 펩타이드는 또한 H-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역으로부터의 서열 "GAO GSO GEK GAO GPQ GPO GPO GKM GPK GEO GDO"(서열 번호:27)를 포함하는 인간 H-피콜린으롭터 유래될 수 있다. 또한 L-피콜린의 공통 MASP-2 결합 영역으로부터의 서열 "GCO GLO GAO GDK GEA GTN GKR GER GPO GPO GKA GPO GPN GAO GEO"(서열 번호:28)를 포함하는 인간 L-피콜린으로부터 유래된 펩타이드가 포함된다.
MASP-2 억제 펩타이드는 또한 항트롬빈 III의 C 말단 부분에 연결된 C4 절단 부위인 "LQRALEILPNRVTIKANRPFLVFI"(서열 번호:29)와 같은 C4 절단 부위로부터 유래될 수 있다(Glover, G.I.,　et　al., Mol. Immunol.　25:1261 (1988)).
주의: 문자 "O"는 하이드록시프롤린을 나타낸다. 문자 "X"는 소수성 잔기를 나타낸다.
C4　절단 부위로부터 유래된 펩타이드뿐만 아니라 MASP-2 세린 프로테아제 부위를 억제하는 다른 펩타이드는 그것들이 비가역성 프로테아제 억제제가 되도록 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 적절한 변형 방법은, 반드시 한정하는 것은 아니지만, C 말단, Asp 또는 Glu에서, 또는 기능성 측쇄에 부착된 할로메틸 케톤(Br, Cl, I, F); 아미노기 또는 다른 기능성 측쇄 상에 할로아세틸(또는 다른 α-할로아세틸) 기; 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능성 측쇄 상에 에폭시드 또는 이민 함유기; 또는 아미노 또는 카르복시 말단 또는 기능성 측쇄 상에 이미데이트 에스테르를 포함할 수 있다. 그러한 변형은 펩타이드의 공유 부착에 의해 효소를 영국적으로 억제하는 장점을 제공할 수 있다. 이것은 더 낮은 유효 용량 및/또는 펩타이드 억제제의 더 적은 빈도의 투여에 대한 필요성을 초래할 수 있을 것이다.
위에서 기술된 억제 펩타이드 외에, 발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드에는 본원에 기술된 것과 같이 얻어진 항-MASP-2 MoAb의 MASP-2 결합 CDRH3 영역을 함유하는 펩타이드가 포함된다. 펩타이드 합성에 사용하기 위한 CDR 영역의 서열은 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 결정될 수 있다. 중쇄 가변 영역은 일반적으로 길이가 100 내지 150개 아미노산 범위인 펩타이드이다. 경쇄 가변 영역은 일반적으로 길이가 80 내지 130개 아미노산 범위인 펩타이드이다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내 CDR 서열에는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 쉽게 서열분석될 수 있는 대략 3-25개 아미노산 서열만이 포함된다.
기술분야에 숙련된 사람은 위에서 기술된 MASP-2 억제 펩타이드의 실질적으로 상동성 변이가 또한 MASP-2 억제 활성을 나타낼 것임을 인식할 것이다. 예시의 변이에는, 반드시 한정하는 것은 아니지만, 삽입, 결실, 대체, 및/또는 대상 펩타이드의 카르복시 말단 또는 아미노 말단 부분에 추가 아미노산 및 이것들의 혼합을 가지고 있는 펩타이드가 포함된다. 따라서, MASP-2 억제 활성을 가진 그런 상동성 펩타이드는 본 발명의 방법에 유용한 것으로 여겨진다. 기술된 펩타이드에는 또한 모티프 복제 및 보존성 치환을 가진 다른 변형이 포함될 수 있다. 보존성 변이체는 본원의 다른 곳에서 기술되며, 유사한 전하, 크기 또는 소수성 등을 가진 또 다른 것에 대한 아미노산의 교환이 포함된다.
MASP-2 억제 펩타이드는 온전한 단백질의 분절을 더욱 밀접하게 닮기 위해 용해도를 증가시키고/거나 양전하 또는 음전하를 최대화하기 위해 변형될 수 있다. 유도체가 MASP-2 억제의 원하는 특성을 기능적으로 유지하는 한 유도체는 본원에 개시된 펩타이드의 정확한 일차 아미노산 구조를 가질 수 있거나 갖지 않을 수 있다. 변형에는 일반적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나로 또는 또 다른 아미노산으로의 아미노산 치환, 보조적인 바람직한 특징, 예컨대 효소적 분해에 대한 내성을 가진 유도된 또는 치환된 아미노산으로의 아미노산 치환 또는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적인 혹인 및 기능을 모방하는 탄수화물로의 아미노산 치환; 아미노산 결실; 일반적으로 알려져 있는 20개의 아미노산 중 하나로 또는 또 다른 아미노산으로의 아미노산 삽입, 보조적인 바람직한 특징, 예컨대 효소적 분해에 대한 내성을 가진 유도된 또는 치환된 아미노산으로의 아미노산 삽입 또는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 아미노산, 아미노산들 또는 펩타이드의 자연적인 혹인 및 기능을 모방하는 탄수화물로의 아미노산 삽입; 또는 또 다른 분자 또는 화합물, 예컨대 부모 펩타이드의 자연적인 입체형태, 전하 분포 및 기능을 모방하는 탄수화물로의 치환이 포함될 수 있다. 펩타이드는 또한 아세틸화 또는 아미드화에 의해 변형될 수 있다.
유도체 억제 펩타이드의 합성은 펩타이드 생합성, 탄수화물 생합성 등의 알려진 기법에 의존할 수 있다. 출발점으로서, 기술자는 관심의 펩타이드의 입체형태를 결정하기 위한 적절한 컴퓨터 프로그램에 의존할 수 있다. 본원에 개시된 펩타이드의 입체형태가 알려지면, 기술자는 부모 펩타이드의 기본적인 입체형태 및 전하 분포를 유지하지만 부모 펩타이드에서 존재하지 않거나 발견되는 것을 능가하여 향상된 특징을 가질 수 있는 유도체를 만들기 위해 합리적인 설계 양식으로 어떤 종류의 치환이 하나 이상의 부위에서 만들어질 수 있는지를 결정할 수 있다. 후보 유도체 분자가 확인된 후에, 유도체는 본원에 기술된 검정을 사용하여 그것이 MASP-2 억제제로서 기능하는지를 결정하기 위해 테스트될 수 있다.
MASP-2 억제 펩타이드에 대한 스크리닝
당업자는 또한 MASP-2의 핵심 결합 영역의 분자 구조를 모방하고 MASP-2의 보체 활성을 억제하는 펩타이드를 생성하고 그것에 대해 스크리닝하기 위해 분자 모델링 및 합리적인 분자 설계를 사용할 수 있다. 모델링에 사용된 분자 구조는 항-MASP-2 단클론성 항체의 CDR 영역뿐만 아니라, 이량체화에 필요한 영역을 포함하여 MASP-2 기능에 중요한 것으로 알려져 있는 표적 용역, MBL에 대한 결합에 관여하는 영역, 및 이전에 기술된 것과 같은 세리 프로테아제 활성 부위를 포함한다. 특정 표적에 결합하는 펩타이드를 확인하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 분자 각인이 특정 분자에 결합하는 펩타이드와 같은 거대분자 구조의 드노보 구성을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shea, K.J., "Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De　Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sties", TRIP　2(5) 1994]을 참고한다.
예시적인 예로서, MASP-2 결합 펩타이드의 모방물을 제조하는 한 가지 방법은 다음과 같다. 알려져 있는 MASP-2 결합 펩타이드의 기능성 단량체 또는 MASP-2 억제를 억제하는 항-MASP-2 항체의 결합 영역(주형)이 중합된다. 그런 후 주형은 제거되고, 이어서 주형에 의해 남겨진 보이드의 제2 부류의 단량체의 중합이 이어져, 주형과 유사한 하나 이상의 바람직한 특성을 나타내는 새로운 분자가 제공된다. 이런 방식으로 펩타이드를 제조하는 것 외에, 다당류, 뉴클레오사이드, 약물, 핵단백질, 리포단백질, 탄수화물, 당단백질, 스테로이드, 지질 및 기타 생물학적 활성 물질과 같은 MASP-2 억제제인 다른 MASP-2 결합 분자가 또한 제조될 수 있다. 이 방법은 자연적인 대응물보다 더 안정적인 광범위한 생물학적 모방물을 설계하는데 유용한데 그것이 전형적으로 기능 단량체의 유리 라디칼 중합에 의해 제조되어 비생분해성 백본을 가진 화합물을 초래하기 때문이다.
펩타이드 합성
MASP-2 억제 펩타이드는 기술분야에 잘 알려져 있는 기법, 예컨대 문헌[Merrifield, in J.　Amer. Chem. Soc.　85:2149-2154, 1963]에서 초기에 기술된 고상 합성 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 자동 합성은, 예를 들어, Applied Biosystems　431A 펩타이드 합성기(Foster City, Calif.)를, 제조사에 의해 제공된 지침을 따라 사용하여 달성될 수 있다. 다른 기법은, 예를 들어, 문헌[Bodanszky, M., et　al., Peptide Synthesis, second edition, John Wiley　& Sons, 1976], 및 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 다른 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
펩타이드는 또한 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 표준 유전자 조작 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 삽입하고, DNA를 발현시키고, DNA를 필요한 아미노산의 존재 하에 펩타이드로 번역함으로써 효소적으로 제조될 수 있다. 그런 후 펩타이드는 크로마토그래피 또는 전기영동 기법을 사용하여, 또는 운반체 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 펩타이드 암호화 서열과 함께 단계적으로 발현 벡터에 삽입함으로써 펩타이드에 융합될 수 있고, 후속해서 펩타이드로부터 절단될 수 있는 운반체 단백질에 의해 정제된다. 융합 단백질-펩타이드는 크로마토그래피, 전기영동 또는 면역학적 기법(예컨대 운반체 단백질에 대한 항체를 통해 수지에 결합)을 사용하여 분리될 수 있다. 펩타이드는 화학적 방법을 사용하여 또는, 예를 들어, 가수분해효소에 의해서와 같이 효소적으로 절단될 수 있다.
발명의 방법에 유용한 MASP-2 억제 펩타이드는 또한 종래 기법을 따라 재조합 숙주 세포에서 제조될 수 있다. MASP-2 억제 펩타이드 암호화 서열을 발현하기 위하여, 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사적 발현을 제어하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 후 숙주 세포에 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 외에, 발현 벡터에는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 운반하는 세포의 선택에 적합한 마커 유전자가 포함될 수 있다.
MASP-2 억제 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 포스포라미다이트 방법과 같은 프로토콜을 사용하는 "유전자 기계"로 합성될 수 있다. 만약 화학적으로 합성된 이중 가닥 DNA가 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 응용에 필요하다면, 각각의 상보적인 가닥이 별도로 만들어진다. 짧은 유전자(60 내지 80개 염기쌍)의 제조는 기술적으로 간단하며 상보적인 가닥을 합성한 후 그것을 어닐링함으로써 달성될 수 있다. 더 긴 유전자의 제조에 대해서는, 합성 유전자(이중 가닥)가 길이가 20 내지 100개 뉴클레오타이드인 단일 가닥 단편으로부터 모듈 형태로 조립된다. 폴리뉴클레오타이드 합성에 관한 리뷰에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Glick and Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA", ASM Press, 1994; Itakura, K., et　al., Annu. Rev. Biochem.　53:323, 1984; 및 Climie, S., et　al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA　87:633, 1990]을 참고한다.
MASP-2의 소분자 억제제
일부 구체예에서, MASP-2 억제제는 저분자량(예컨대, 50 내지 1000 Da)을 가지는 천연, 반합성, 및 합성 물질을 포함한 소분자 억제제, 예컨대 예를 들어, 펩타이드, 펩타이드 모방물, 및 비펩타이드 억제제(예컨대, 올리고뉴클레오타이드 및 유기 화합물)이다. MASP-2의 소분자 억제제는 항-MASP-2 항체의 가변 영역의 분자 구조를 토대로 생성될 수 있다.
소분자 억제제는 또한 MASP-2 결정 구조를 토대로 컴퓨터 약물 설계를 사용하여 설계 및 생성될 수 있다(Kuntz I.D., et　al., Science　257:1078, 1992). 래트 MASP-2의 결정 구조가 기술되어 있다(Feinberg, H., et　al., EMBO　J.　22:2348-2359, 2003). Kuntz 등에 의해 기술된 방법을 사용하여, MASP-2 결정 구조 좌표가 DOCK와 같은 컴퓨터 프로그램에 대한 입력으로서 사용되며, 프로그램은 MASP-2 에 결합할 것으로 예상되는 소분자 구조의 목록을 출력한다. 그러한 컴퓨터 프로그램의 사용은 기술분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, HIV-1 프로테아제 억제제의 결정 구조가 프로그램 DOCK를 사용하여 효소의 결합 부위에 대한 캠브리지 결정학 데이터베이스에서 찾아볼 수 있는 화합물의 피트를 평가함으로써 HIV-1 프로테아제 억제제인 독특한 비펩타이드 리간드를 확인하기 위해 사용되었다(Kuntz, I.D., et　al., J.　Mol. Biol.　161:269-288, 1982; DesJarlais, R.L.,　et　al., PNAS　87:6644-6648, 1990).
예시의 MASP-2 억제제로는, 한정하는 것은 아니지만, 미국 특허 출원 제 62/943,629호, 62/943,622호, 62/943,611호, 62/943,599호, 16/425,791호 및 PCT 출원 번호 PCT/US19/34220에서 개시된 화합물을 들 수 있고, 이들 문헌은 전체 내용이 참조로 본원에 포함된다.
일부 구체예에서, 소분자는 식 (I-1), (IIA), (IIB), (III) 또는 (IV)의 화합물 또는 그것의 염이다:
식에서:
Cy1A는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴 또는 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴이고; 여기서 Cy1A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; Cy1A를 형성하는 치환된 C6-10 아릴 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴은 각각 독립적으로 RCy1A, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, C(=NORa11)NRc11Rd11, C(=NOC(O)Rb11)NRc11Rd11, C(=NRe11)NRc11C(O)ORa11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되고;
각각의 RCy1A는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되며, RCy1A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자로 이루어지고, RCy1A를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며, RCy1A를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고;
R11은 H 또는 C1-6 알킬, C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬이며, R11을 형성하는 C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되고, R11을 형성하는 C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되며;
R12는 H 또는 C1-6 알킬이거나; 또는
R11 및 R12는, 그것들이 부착되는 기와 함께, 4-6-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고;
A11은 CR13R15 또는 N이며;
각각의 R13은 독립적으로 Cy1B, (CR13AR13B)n3Cy1B, (C1-6 알킬렌)Cy1B, (C2-6 알케닐렌)Cy1B, (C2-6 알키닐렌)Cy1B 또는 OCy1B이고, R13의 C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌, 또는 C2-6 알키닐렌 구성요소는 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되며;
각각의 R14는 H 및 C1-6 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
R15는 H, R13, C1-6 알킬 및 OH로부터 선택되며;
인접한 탄소 원자에 부착된 한 쌍의 R14 기, 또는 인접한 탄소 원자에 부착된 R14와 R15 기의 쌍은, R14의 다른 발생과 독립적으로, 인접한 탄소 원자가 이중 결합에 의해 연결되도록 한 쌍의 R14 기 또는 R14와 R15 기의 쌍이 부착되는 인접한 탄소 원자를 연결시키는 결합으로 함께 대체될 수 있거나; 또는
동일한 탄소 원자에 부착된 한 쌍의 R14 기, 또는 동일한 탄소 원자에 부착된 R13과 R15 기의 쌍은, R14의 다른 발생과 독립적으로, 및 한 쌍의 R14 기 또는 R13과 R15 기의 쌍이 함께 부착되는 탄소 원자와 함께 스피로 융합된 C3-10 사이클로알킬 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 형성된 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며, 형성된 스피로 융합된 C3-10 사이클로알킬 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리는 선택적으로 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 추가로 치환되거나; 또는
인접한 탄소 원자에 부착된 R14 기의 쌍, 또는 인접한 탄소 원자에 부착된 R14와 R15 기의 쌍은, R14의 다른 발생과 독립적으로, 한 쌍의 R14 기 또는 R14와 R15 기의 쌍이 부착되는 인접한 탄소 원자와 함께, 융합된 C3-10 사이클로알킬 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 형성된 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며, 형성된 융합된 C3-10 사이클로알킬 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리는 선택적으로 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 추가로 치환되거나; 또는
2개의 인접한 탄소 원자에 부착된 4개의 R14 기의 그룹, 또는 2개의 인접한 탄소 원자에 부착된 2개의 R14, 하나의 R13 및 하나의 R15 기의 그룹은, R14의 다른 발생과 독립적으로, 4개의 R14 기의 그룹 또는 2개의 R14, 하나의 R13 및 하나의 R15 기의 그룹이 부착되는 2개의 인접한 탄소 원자와 함께, 융합된 C6-10 아릴 또는 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하고, 형성된 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며, 형성된 융합된 C6-10 아릴 또는 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬 고리는 선택적으로 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 추가로 치환되고;
n1은 1 또는 2이며;
n2는 0, 1 또는 2이고;
단 n1과 n2의 합은 1, 2 또는 3이며;
단 n1 또는 n2가 0이면, A11은 CR13R15이고;
n3은 0, 1 또는 2이며;
각각의 R13A는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고;
각각의 R13B는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이거나; 또는
동일한 탄소 원자에 부착된 R13A 및 R13B는, 임의의 다른 R13A 및 R13B 기와 독립적으로, 함께 -(CH2)2-5-를 형성할 수 있어서, 3-6-원 사이클로알킬 고리를 형성하며;
Cy1B는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이고; Cy1B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; 그리고
Cy1B를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 치환된 C3-10 사이클로알킬 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy1B, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, C(=NORa11)NRc11Rd11, C(=NOC(O)Rb11)NRc11Rd11, C(=NRe11)NRc11C(O)ORa11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy1B는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy1B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; RCy1B를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고; RCy1B를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
R16은 H, Cy1C, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐이고, 여기서 R16을 형성하는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알킬은 비치환되거나 또는 Cy1C, 할로겐, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되며, 단 R16의 치환기 중 하나 이하는 Cy1C이고;
Cy1C는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이며; Cy1C를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; 및
Cy1C를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 치환된 C3-10 사이클로알킬 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy1C, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, C(=NORa11)NRc11Rd11, C(=NOC(O)Rb11)NRc11Rd11, C(=NRe11)NRc11C(O)ORa11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy1C는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy1C를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; RCy1C를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고; RCy1C를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa11, SRa11, C(O)Rb11, C(O)NRc11Rd11, C(O)ORa11, OC(O)Rb11, OC(O)NRc11Rd11, NRc11Rd11, NRc11C(O)Rb11, NRc11C(O)NRc11Rd11, NRc11C(O)ORa11, C(=NRe11)NRc11Rd11, NRc11C(=NRe11)NRc11Rd11, S(O)Rb11, S(O)NRc11Rd11, S(O)2Rb11, NRc11S(O)2Rb11, S(O)2NRc11Rd11 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
Ra11, Rb11, Rc11 및 Rd11은 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되고, Ra11, Rb11, Rc11 및 Rd11을 형성하는 상기 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 선택적으로 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa12, SRa12, C(O)Rb12, C(O)NRc12Rd12, C(O)ORa12, OC(O)Rb12, OC(O)NRc12Rd12, NRc12Rd12, NRc12C(O)Rb12, NRc12C(O)NRc12Rd12, NRc12C(O)ORa12, C(=NRe12)NRc12Rd12, NRc12C(=NRe12)NRc12Rd12, S(O)Rb12, S(O)NRc12Rd12, S(O)2Rb12, NRc12S(O)2Rb12, S(O)2NRc12Rd12 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부탁된 Rc11 및 Rd11은, 이것들 모두가 부착되는 N 원자와 함께, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하며, 이들 각각은 선택적으로 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa12, SRa12, C(O)Rb12, C(O)NRc12Rd12, C(O)ORa12, OC(O)Rb12, OC(O)NRc12Rd12, NRc12Rd12, NRc12C(O)Rb12, NRc12C(O)NRc12Rd12, NRc12C(O)ORa12, C(=NRe12)NRc12Rd12, NRc12C(=NRe12)NRc12Rd12, S(O)Rb12, S(O)NRc12Rd12, S(O)2Rb12, NRc12S(O)2Rb12, S(O)2NRc12Rd12 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고;
Ra12, Rb12, Rc12 및 Rd12는 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되며, Ra12, Rb12, Rc12 및 Rd12를 형성하는 상기 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 선택적으로 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc12 및 Rd12는, 이것들 모두가 부착되는 N 원자와 함께, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하고, 이들 각각은 비치환되거나 또는 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
Re11 및 Re12는 각각, 독립적으로, H, CN 또는 NO2이고;
Cy2A는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴 또는 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴이며; Cy2A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; Cy2A를 형성하는 치환된 C6-10 아릴 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴은 RCy2A, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, C(=NORa21)NRc21Rd21, C(=NOC(O)Rb21)NRc21Rd21, C(=NRe21)NRc21C(O)ORa21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy2A는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy2A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자로 이루어지며, RCy2A를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고, RCy2A를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
R21은 H 또는 C1-6 알킬, C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬이고, R21을 형성하는 C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되며, R21을 형성하는 C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되고;
R22는 H 또는 C1-6 알킬이거나; 또는
R21 및d R22는, 그것들이 부착되는 기와 함께, 4-6-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하며;
A23은 N 또는 NR23이고;
A24는 CR24; N 또는 NR24이며;
A26은 CR26 또는 S이고;
단
식 (IIA)에서 A23, A24 및 A26은 A23, A24 및 A26을 포함하는 고리가 헤테로아릴 고리이며 기호 가 방향족 고리(표준화된) 결합을 나타내도록 선택되며;
R23은 H 또는 C1-6 알킬이고;
R24는 H; C1-6 알킬 또는 페닐이며;
R25는 Cy2B, (CR25AR25B)n25Cy2B, (C1-6 알킬렌)Cy2B, (C2-6 알케닐렌)Cy2B, 또는 (C2-6 알키닐렌)Cy2B이고, R25의 C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌, 또는 C2-6 알키닐렌 구성요소는 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되며;
R26은 H 또는 C1-6 알킬이고;
각각의 R25A는 H 또는 C1-6 알킬이며;
각각의 R25B는 H 또는 C1-6 알킬이고;
n25는 0, 1 또는 2이며;
Cy2B는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이고; Cy2B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; 그리고
Cy2B를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 치환된 C3-10 사이클로알킬 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy2B, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, C(=NORa21)NRc21Rd21, C(=NOC(O)Rb21)NRc21Rd21, C(=NRe21)NRc21C(O)ORa21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되고;
각각의 RCy2B는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되며, RCy2B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; RCy2B를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며; RCy2B를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa21, SRa21, C(O)Rb21, C(O)NRc21Rd21, C(O)ORa21, OC(O)Rb21, OC(O)NRc21Rd21, NRc21Rd21, NRc21C(O)Rb21, NRc21C(O)NRc21Rd21, NRc21C(O)ORa21, C(=NRe21)NRc21Rd21, NRc21C(=NRe21)NRc21Rd21, S(O)Rb21, S(O)NRc21Rd21, S(O)2Rb21, NRc21S(O)2Rb21, S(O)2NRc21Rd21 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되고, Ra21, Rb21, Rc21 및 Rd21을 형성하는 상기 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa22, SRa22, C(O)Rb22, C(O)NRc22Rd22, C(O)ORa22, OC(O)Rb22, OC(O)NRc22Rd22, NRc22Rd22, NRc22C(O)Rb22, NRc22C(O)NRc22Rd22, NRc22C(O)ORa22, C(=NRe22)NRc22Rd22, NRc22C(=NRe22)NRc22Rd22, S(O)Rb22, S(O)NRc22Rd22, S(O)2Rb22, NRc22S(O)2Rb22, S(O)2NRc22Rd22 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 선택적으로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc21 및 Rd21은 그것들이 모두 부착되는 N 원자와 함께, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 함께 형성하며, 이들은 각각 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa22, SRa22, C(O)Rb22, C(O)NRc22Rd22, C(O)ORa22, OC(O)Rb22, OC(O)NRc22Rd22, NRc22Rd22, NRc22C(O)Rb22, NRc22C(O)NRc22Rd22, NRc22C(O)ORa22, C(=NRe22)NRc22Rd22, NRc22C(=NRe22)NRc22Rd22, S(O)Rb22, S(O)NRc22Rd22, S(O)2Rb22, NRc22S(O)2Rb22, S(O)2NRc22Rd22 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 선택적으로 치환되고;
Ra22, Rb22, Rc22 및 Rd22는 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되며, Ra22, Rb22, Rc22 및 Rd22를 형성하는 상기 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 선택적으로 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc22 및 Rd22는, 그것들이 모두 부착되는 N 원자와 함께, 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
Re21 및 Re22는 각각, 독립적으로, H, CN 또는 NO2이고;
Cy3A는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴 또는 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴이며; Cy3A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; Cy3A를 형성하는 치환된 C6-10 아릴 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴은 RCy3A, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, C(=NORa31)NRc31Rd31, C(=NOC(O)Rb31)NRc31Rd31, C(=NRe31)NRc31C(O)ORa31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy3A는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy3A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택되는 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자로 이루어지며, RCy3A를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고, RCy3A를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
R31은 H 또는 C1-6 알킬, C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬이고, R31을 형성하는 C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되며, R31을 형성하는 C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고;
R32는 H 또는 C1-6 알킬이거나; 또는
R31 및 R32는, 그것들이 부착되는 기와 함께, 4-6-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하며;
R33은 Cy3B, (CR33AR33B)n33Cy3B, (C1-6 알킬렌)Cy3B, (C2-6 알케닐렌)Cy3B, 또는 (C2-6 알키닐렌)Cy3B이고, R35의 C1-6 알킬렌, C2-6 알케닐렌, 또는 C2-6 알키닐렌 구성요소는 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되며;
각각의 R33A는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고;
각각의 R33B는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이거나; 또는
또는 동일한 탄소 원자에 부착된 R33A 및 R33B는 임의의 다른 R33A 및 R33B 기와는 독립적으로, 함께 -(CH2)2-5-를 형성함으로써, 3-6-원 사이클로알킬 고리를 형성하며;
n33은 0, 1, 2 또는 3이고;
Cy3B는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이며; Cy3B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; 그리고
Cy3B를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 치환된 C3-10 사이클로알킬 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy3B, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, C(=NORa31)NRc31Rd31, C(=NOC(O)Rb31)NRc31Rd31, C(=NRe31)NRc31C(O)ORa31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy3B는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy3B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; RCy3B를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고; RCy3B를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
R34는 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되고;
R35는 H, 비치환 또는 치환된 C1-6 알킬 및 Cy3C로부터 선택되며, R35를 형성하는 치환된 C1-6 알킬은 Cy3C, 할로겐, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되고; 단 R35의 치환기 중 하나 이하는 Cy3C이며;
Cy3C는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이고; Cy3C를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며;
Cy3C를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 치환된 C3-10 사이클로알킬 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy3C, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, C(=NORa31)NRc31Rd31, C(=NOC(O)Rb31)NRc31Rd31, C(=NRe31)NRc31C(O)ORa31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되고;
각각의 RCy3C는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되며, RCy3C를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; RCy3C를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며; RCy3C를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa31, SRa31, C(O)Rb31, C(O)NRc31Rd31, C(O)ORa31, OC(O)Rb31, OC(O)NRc31Rd31, NRc31Rd31, NRc31C(O)Rb31, NRc31C(O)NRc31Rd31, NRc31C(O)ORa31, C(=NRe31)NRc31Rd31, NRc31C(=NRe31)NRc31Rd31, S(O)Rb31, S(O)NRc31Rd31, S(O)2Rb31, NRc31S(O)2Rb31, S(O)2NRc31Rd31 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고;
R36은 H 및 C1-6 알킬로부터 선택되며;
Ra31, Rb31, Rc31 및 Rd31은 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되고, Ra31, Rb31, Rc31 및 Rd31을 형성하는 상기 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬 각각 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa32, SRa32, C(O)Rb32, C(O)NRc32Rd32, C(O)ORa32, OC(O)Rb32, OC(O)NRc32Rd32, NRc32Rd32, NRc32C(O)Rb32, NRc32C(O)NRc32Rd32, NRc32C(O)ORa32, C(=NRe32)NRc32Rd32, NRc32C(=NRe32)NRc32Rd32, S(O)Rb32, S(O)NRc32Rd32, S(O)2Rb32, NRc32S(O)2Rb32, S(O)2NRc32Rd32 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 선택적으로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc31 및 Rd31은, 둘 모두가 부착되는 N 원자와 함께 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하며, 이들 각각은 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa32, SRa32, C(O)Rb32, C(O)NRc32Rd32, C(O)ORa32, OC(O)Rb32, OC(O)NRc32Rd32, NRc32Rd32, NRc32C(O)Rb32, NRc32C(O)NRc32Rd32, NRc32C(O)ORa32, C(=NRe32)NRc32Rd32, NRc32C(=NRe32)NRc32Rd32, S(O)Rb32, S(O)NRc32Rd32, S(O)2Rb32, NRc32S(O)2Rb32, S(O)2NRc32Rd32 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 선택적으로 치환되고;
Ra32, Rb32, Rc32 및 Rd32는 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되며, Ra32, Rb32, Rc32 및 Rd32를 형성하는 상기 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 선택적으로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc32 및 Rd32는, 둘 모두가 부착되는 N 원자와 함께 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하고, 이들 각각은 비치환되거나 또는 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며; 그리고
Re31 및 Re32는 각각, 독립적으로, H, CN 또는 NO2이며;
Cy4A는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴 또는 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴이고; Cy4A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며; Cy4A를 형성하는 치환된 C6-10 아릴 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴은 RCy4A, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, C(=NORa41)NRc41Rd41, C(=NOC(O)Rb41)NRc41Rd41, C(=NRe41)NRc41C(O)ORa41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되고;
각각의 RCy4A는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되며, RCy4A를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자로 이루어지고, RCy4A를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며, RCy4A를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고;
R41은 H 또는 C1-6 알킬, C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬이며, R41을 형성하는 C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되고, R41을 형성하는 C6-10 아릴-C1-6 알킬 또는 5-10-원 헤테로아릴-C1-6 알킬은 비치환되거나 또는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기에 의해 치환되며;
R42는 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 또는 Cy4B이고; R42를 형성하는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐의 각각은 비치환되거나 또는 Cy4B, 할로겐, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되며; 단 치환기의 하나 이하는 Cy4B이고;
Cy4B는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이며; Cy4B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; Cy4B를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy4B, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, C(=NORa41)NRc41Rd41, C(=NOC(O)Rb41)NRc41Rd41, C(=NRe41)NRc41C(O)ORa41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy4B는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy4B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며, RCy4B를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고; 각각의 RCy4B를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되거나;
또는 R41 및 R42는, 이것들이 부착되는 원자 및 R41 및 R42가 부착되는 원자를 연결시키는 질소 원자와 함께 4-7-원 헤테로사이클로알킬 고리를 형성하며; 이것은 선택적으로 RCy4B, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, C(=NORa41)NRc41Rd41, C(=NOC(O)Rb41)NRc41Rd41, C(=NRe41)NRc41C(O)ORa41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 추가로 치환되고;
R43은 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 또는 Cy4C이며; R43을 형성하는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐의 각각은 비치환되거나 또는 Cy4C, 할로겐, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 선택된 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기에 의해 치환되며, 단 R43을 형성하는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐 중 하나 이하의 치환기는 Cy4C이고;
Cy4C는 비치환 또는 치환된 C6-10 아릴, 비치환 또는 치환된 5-10-원 헤테로아릴, 비치환 또는 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬이며; Cy4B를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 비치환 또는 치환된 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지고; Cy4C를 형성하는 치환된 C6-10 아릴, 치환된 5-10-원 헤테로아릴 치환된 C3-10 사이클로알킬, 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 RCy4C, 할로겐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, C(=NORa41)NRc41Rd41, C(=NOC(O)Rb41)NRc41Rd41, C(=NRe41)NRc41C(O)ORa41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 각각 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되며;
각각의 RCy4C는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고, RCy4C를 형성하는 5-10-원 헤테로아릴 또는 4-10-원 헤테로사이클로알킬의 고리 원자는 탄소 원자 및 O, N 및 S로부터 선택된 1, 2, 또는 3개의 헤테로원자로 이루어지며, RCy4C를 형성하는 각각의 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 또는 C2-6 알키닐은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고; 각각의 RCy4A를 형성하는 각각의 C6-10 아릴, 5-10-원 헤테로아릴, C3-10 사이클로알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 비치환되거나 또는 할로겐, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 할로알킬, CN, ORa41, SRa41, C(O)Rb41, C(O)NRc41Rd41, C(O)ORa41, OC(O)Rb41, OC(O)NRc41Rd41, NRc41Rd41, NRc41C(O)Rb41, NRc41C(O)NRc41Rd41, NRc41C(O)ORa41, C(=NRe41)NRc41Rd41, NRc41C(=NRe41)NRc41Rd41, S(O)Rb41, S(O)NRc41Rd41, S(O)2Rb41, NRc41S(O)2Rb41, S(O)2NRc41Rd41 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며;
Ra41, Rb41, Rc41 및 Rd41은 각각 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Ra41, Rb41, Rc41 및 Rd41을 형성하는 상기 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C6-10 아릴, C3-7 사이클로알킬, 5-10-원 헤테로아릴, 4-10-원 헤테로사이클로알킬, C6-10 아릴-C1-3 알킬, 5-10-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-10-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 선택적으로 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa42, SRa42, C(O)Rb42, C(O)NRc42Rd42, C(O)ORa42, OC(O)Rb42, OC(O)NRc42Rd42, NRc42Rd42, NRc42C(O)Rb42, NRc42C(O)NRc42Rd42, NRc42C(O)ORa42, C(=NRe42)NRc42Rd42, NRc42C(=NRe42)NRc42Rd42, S(O)Rb42, S(O)NRc42Rd42, S(O)2Rb42, NRc42S(O)2Rb42, S(O)2NRc42Rd42 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc41 및 Rd41은, 이것들이 모두 부착되는 N 원자와 함께 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하며, 이들은 각각 선택적으로 C1-6 알킬, 할로, CN, ORa42, SRa42, C(O)Rb42, C(O)NRc42Rd42, C(O)ORa42, OC(O)Rb42, OC(O)NRc42Rd42, NRc42Rd42, NRc42C(O)Rb42, NRc42C(O)NRc42Rd42, NRc42C(O)ORa42, C(=NRe42)NRc42Rd42, NRc42C(=NRe42)NRc42Rd42, S(O)Rb42, S(O)NRc42Rd42, S(O)2Rb42, NRc42S(O)2Rb42, S(O)2NRc42Rd42 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되고;
Ra42, Rb42, Rc42 및 Rd42는 각각 독립적으로 H, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬로부터 선택되며, Ra42, Rb42, Rc42 및 Rd42를 형성하는 상기 C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 페닐, C3-7 사이클로알킬, 5-6-원 헤테로아릴, 4-7-원 헤테로사이클로알킬, 페닐-C1-3 알킬, 5-6-원 헤테로아릴-C1-3 알킬, C3-7 사이클로알킬-C1-3 알킬 및 4-7-원 헤테로사이클로알킬-C1-3 알킬은 각각 선택적으로 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되거나;
또는 동일한 N 원자에 부착된 Rc42 및 Rd42는, 이것들이 모두 부착되는 N 원자와 함께 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클로알킬 기 또는 5-원 헤테로아릴 기를 형성하고, 이들은 각각 비치환되거나 또는 OH, CN, 아미노, NH(C1-6 알킬), N(C1-6 알킬)2, 할로, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알킬, C1-6 할로알콕시 및 옥소로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 치환되며; 그리고
Re41 및 Re42는 각각, 독립적으로, H, CN 또는 NO2이다.
일부 구체예에서, 소분자는 식 (VA) 또는 (VB)의 화합물:
또는 그것의 염이며;
식에서:
A1은 -(C=NH)-, -(C=NORa)-, -[C=NO(C=O)Ra]-, -[C=N[O(C=O)ZRb]-, 융합된 5- 또는 6-원 헤테로사이클릴, 및 융합된 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
A1이 -(C=NH)-일 때, Y1은 -NH2, -NH(C=O)Ra, 및 - NH(C=O)ZRb로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
A1이 -(C=NORa)-, -[C=NO(C=O)Ra]-, 또는 -{C=N[O(C=O)ZRb]}-일 때, Y1은 -NH2이고;
A1이 융합된 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴일 때, Y1은 -NH2 또는 할로이며, A1은 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
각각의 Ra 및 Rb는 C1-C6 알킬, C3-C10 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 및 C7-C12 아릴알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며; Ra는 C1-C6 알킬, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택된 m개의 치환기를 가지거나; 또는, 대안적으로, Ra 및 Rb는 결합하여 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택된 m개의 치환기를 가진 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
각각의 Z는 O 및 S로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
A2는 C3-C6 헤테로아릴, C6 아릴, 및 C2-C6 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
A2가 C3-C6 헤테로아릴일 때, Y2는 -NH2, - CH2NH2, 클로로, -(C=NH)NH2, -(C=NH)NH(C=O)Ra, -(C=NH)NH(C=O)ZRb, -(C=NORa)NH2, -[C=NO(C=O)Ra]NH2, 및 -{C=N[O(C=O)ZRb]}NH2로 이루어지는 군으로부터 선택되며; A2는 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
A2가 C6 아릴일 때, Y2는 아미노메틸, 하이드록시, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택되며, A2는 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
A2가 C2-C6 알킬일 때, Y2는 -NH(C=NH)NH2, -NH(C=NH)NH(C=O)Ra, 및 -NH(C=NH)NH(C=O)ZRb로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
각각의 R1은 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각각의 m 및 n은 0 내지 3으로부터 독립적으로 선택된 정수이며;
L은 -(O)p-(C(R2a)(R2b))q-이고,
각각의 R2a 또는 R2b는 수소 및 플루오로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이며;
p는 0 내지 1의 정수이고;
q는 1 내지 2의 정수이며;
R3은 수소, C1-C6 알킬, C1-C6 플루오로알킬, 및 카르복시(C1-C6 알킬)로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, R3 및 R4는 결합하여 아제티딘, 피롤리딘, 또는 피페리딘 고리를 형성하고;
R4는 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, R4 및 R3은 결합하여 아제티딘, 피롤리딘, 또는 피페리딘 고리를 형성하며;
R5는 C3-C7 사이클로알킬, C4-C8 사이클로알킬알킬, 헤테로아릴, 및 C7-C12 아릴알킬 또는 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 헤테로아릴알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, R5 및 R6은 결합하여 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 헤테로고리형 고리를 형성하고;
R6은 수소, C1-C6 알킬, C3-C7 사이클로알킬, 카르복시(C1-C6 알킬), C7-C12 아릴알킬 또는 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 헤테로아릴알킬, 아미노(C1-C8 알킬); 및 아미도(C1-C8 알킬)로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, R6 및 R5는 결합하여 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 헤테로고리형 고리를 형성하며; 그리고
각각의 R13은 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, (C6-C10 아릴)C1-C6 알킬, 카르복시(C1-C6 알킬옥시), 헤테로아릴, (C6-C10 헤테로아릴)C1-C6 알킬, 헤테로사이클릴, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 아미도, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, 2개의 R13 기가 결합하여 융합된 C6-C10 아릴, C6-C10 헤테로아릴, 또는 C5-C7 사이클로알킬 고리를 형성한다.
일부 구체예에서, 소분자는 식 (VIA) 또는 (VIB)의 화합물:
또는 그것의 염이며; 식에서:
A1은 -(C=NH)-, -(C=NORa)-, -[C=NO(C=O)Ra]-, -[C=N[O(C=O)ZRb]-, 융합된 5- 또는 6-원 헤테로사이클릴, 및 융합된 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
A1이 -(C=NH)-일 때, Y1은 -NH2, -NH(C=O)Ra, 및 - NH(C=O)ZRb로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
A1이 -(C=NORa)-, -[C=NO(C=O)Ra]-, 또는 -{C=N[O(C=O)ZRb]}-일 때, Y1은 -NH2이고;
A1이 융합된 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴일 때, Y1은 -NH2 또는 할로이며, A1은 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
각각의 Ra 및 Rb는 C1-C6 알킬, C3-C10 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 및 C7-C12 아릴알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며; Ra는 C1-C6 알킬, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택된 m개의 치환기를 가지거나; 또는, 대안적으로, Ra 및 Rb는 결합하여 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택된 치환기를 가진 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
각각의 Z는 O 및 S로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
A2는 C3-C6 헤테로아릴 및 C2-C6 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
A2가 C3-C6 헤테로아릴일 때, Y2는 -NH2, -CH2NH2, 클로로, -(C=NH)NH2, -(C=NH)NH(C=O)Ra, -(C=NH)NH(C=O)ZRb, -(C=NORa)NH2, -[C=NO(C=O)Ra]NH2, 및 -{C=N[O(C=O)ZRb]}NH2로 이루어지는 군으로부터 선택되며; A2는 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
A2가 C2-C6 알킬일 때, Y2는 -NH(C=NH)NH2, -NH(C=NH)NH(C=O)Ra, 및 -NH(C=NH)NH(C=O)ZRb로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
각각의 R1은 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이고;
각각의 m 및 n은 0 내지 3으로부터 독립적으로 선택된 정수이며;
X 및 X2는 각각 NR8, CH, 및 CR10으로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
각각의 R8은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이며;
각각의 R10은 C1-C6 알킬, 헤테로아릴 또는 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 C6-C10 아릴, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, 2개의 R10 기가 결합하여 융합된 C6 아릴, 헤테로아릴, 또는 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 C5-C7 사이클로알킬 고리를 형성하고;
r은 0 내지 4의 정수이며; 그리고
각각의 R13은 C1-C6 알킬, C6-C10 아릴, 카르복시(C1-C6 알킬옥시), 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 아미도, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, 2개의 R13 기가 결합하여 융합된 C6-C10 아릴, C6-C10 헤테로아릴, 또는 C5-C7 사이클로알킬 고리를 형성한다.
특정한 구체적인 구체예에서, 소분자는 식 (VIIA) 또는 (VIIB)의 화합물:
또는 그것의 염이며;
식에서:
A1은 -(C=NH)-, -(C=NORa)-, -[C=NO(C=O)Ra]-, -[C=N[O(C=O)ZRb]}-, 융합된 5- 또는 6-원 헤테로사이클릴, 및 융합된 5- 또는 6-원 헤테로아릴로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
A1이 -(C=NH)-일 때, Y1은 -NH2, -NH(C=O)Ra, 및 - NH(C=O)ZRb로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
A1이 -(C=NORa)-, -[C=NO(C=O)Ra]-, 또는 -{C=N[O(C=O)ZRb]}-일 때, Y1은 -NH2이고;
A1이 융합된 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴일 때, Y1은 -NH2 또는 할로이며, A1은 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
각각의 Ra 및 Rb는 C1-C6 알킬, C3-C10 사이클로알킬, C6-C10 아릴, 및 C7-C12 아릴알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며; Ra는 C1-C6 알킬, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택된 m개의 치환기를 가지거나; 또는, 대안적으로, Ra 및 Rb는 결합하여 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 선택된 m개의 치환기를 가진 헤테로사이클릴 고리를 형성하고;
각각의 Z는 O 및 S로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며;
A2는 C3-C6 헤테로아릴 및
C2-C6 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
A2가 C3-C6 헤테로아릴일 때, Y2는 -NH2, - CH2NH2, 클로로, -(C=NH)NH2, -(C=NH)NH(C=O)Ra, -(C=NH)NH(C=O)ZRb, -(C=NORa)NH2, -[C=NO(C=O)Ra]NH2, 및 -{C=N[O(C=O)ZRb]}NH2로 이루어지는 군으로부터 선택되며; A2는 m개의 추가 R1 기로 치환되고;
A2가 C2-C6 알킬일 때, Y2는 -NH(C=NH)NH2, -NH(C=NH)NH(C=O)Ra, 및 -NH(C=NH)NH(C=O)ZRb로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
각각의 R1은 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이고;
각각의 m 및 n은 0 내지 3으로부터 독립적으로 선택된 정수이며;
L은 -(O)p-(C(R2a)(R2b))q-이고,
각각의 R2a 또는 R2b는 수소 및 플루오로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이며;
p는 0 내지 1의 정수이고;
q는 1 내지 2의 정수이며;
R3은 수소, C1-C6 알킬, 및 카르복시(C1-C6 알킬)로 이루어지는 군으로부터 선택된 구성원이고;
각각의 R11은 C1-C6 알킬, 하이드록실, C1-C6 알콕시, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 할로, 및 (R14)(R14)N(CO)-로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, 2개의 R11 기가 결합하여 융합된 C6 아릴, 헤테로아릴, 또는 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 C5-C7 사이클로알킬 고리를 형성하며;
r은 0 내지 4의 정수이고; 그리고
각각의 Z는 O 및 NR8로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이며;
각각의 R8은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이고;
각각의 R12는 수소, C1-C6 알킬, 및 0 내지 3개의 R13 치환기를 가진 C7-C14 아릴알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이며;
각각의 R13은 C1-C6 알킬, 하이드록실, 하이드록실(C1-C6 알킬), C1-C6 알콕시, C2-C9 알콕시알킬, 아미노, C1-C6 알킬아미노, 및 할로로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, 2개의 R13 기가 결합하여 융합된 C6 아릴, 헤테로아릴, 또는 C5-C7 사이클로알킬 고리를 형성하고; 그리고
각각의 R14는 수소, C1-C6 알킬, C3-C7 사이클로알킬, C4-C8 사이클로알킬알킬, C7-C14 아릴알킬, 및 헤테로아릴(C1-C6 알킬)로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된 구성원이거나; 또는, 대안적으로, 2개의 R13 기가 결합하여 융합된 헤테로사이클릴 고리를 형성한다.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R1은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, R2h, R2i, 또는 R2j는 수소, 할로, C(=O)OR5, OC(=O)R5, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로알콕시, 시아노, 아미닐알킬, 카르복시알킬, NR5R6, C(=O)NR5R6, N(R5)C(=O)R6, NR5C(=O)NR6, S(O)t, SR5, 니트로, N(R5)C(O)OR6, C(=NR5)NR6R7, N(R5)C(=NR6)NR7R8, S(O)R5, S(O)NR5R6, S(O)2R5, N(R5)S(O)2R6, S(O)2NR5R6, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며, 단 R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, R2h, R2i, 또는 R2j의 적어도 하나의 발생은 수소가 아니고;
R3은 NR3aR3b이며;
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 사이클로알킬, (CH2)nC(=O)OR6, 또는 (CH2)nP(=O)(OR6)2이거나;
또는 R3a 및 R3b는, 이것들이 부착되는 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로아릴 또는 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하거나;
또는 R3a 및 R4는 이것들이 부착되는 질소 및 탄소와 함께, 각각, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R4는 n이 2, 3, 4, 5, 또는 6일 때 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이거나; 또는
R4는 n이 0 또는 1일 때 치환된 또는 비치환된 단환식 헤테로아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이며;
R5, R6, R7, 및 R8은, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬이고;
X는 직접 결합, -CR2eR2f-, 또는 -CR2eR2f-CR2gR2h-이며;
Y는 직접 결합 또는 -CR2iR2j-이고;
n은 0-6의 정수이며; 그리고
t는 1-3이다.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R1은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, R2h, R2i, 또는 R2j는 수소, 할로, OR5, C(=O)OR5, OC(=O)R5, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로알콕시, 시아노, 아미닐알킬, 카르복시알킬, NR5R6, C(=O)NR5R6, N(R5)C(=O)R6, NR5C(=O)NR6, S(O)t, SR5, 니트로, N(R5)C(O)OR6, C(=NR5)NR6R7, N(R5)C(=NR6)NR7R8, S(O)R5, S(O)NR5R6, S(O)2R5, N(R5)S(O)2R6, S(O)2NR5R6, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며, 단 R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, R2h, R2i, 또는 R2j 중 적어도 하나의 발생은 수소가 아니고;
R3은 NR3aR3b이며;
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, -CH2C(C=O)OH, -CH2C(=O)O알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 또는 사이클로알킬이고;
또는 R3a 및 R3b는, 이것들이 부착되는 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로아릴 또는 an 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R4는 n이 2, 3, 4, 5, 또는 6일 때 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이거나; 또는
R4는 n이 0 또는 1일 때 치환된 또는 비치환된 단환식 헤테로아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R5, R6, R7, 및 R8은, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬이며;
X는 직접 결합, -[C(R2e)R2f]-, 또는 -[C(R2e)R2f]-[C(R2g)R2h]-이고;
Y는 직접 결합 또는 -[C(R2i)R2j]-이며;
n은 0-6의 정수이고; 그리고
t는 1-3이며,
단:
a) R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, R2h, R2i, 또는 R2j 중 하나의 발생이 OH일 때, R1은 다음 구조를 갖지 않고:
;
b) R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, 또는 R2h 중 하나의 발생이 -OH일 때, n은 2-6의 정수이며; 그리고
c) R2a, R2b, R2c, R2d, R2e, R2f, R2g, R2h, R2i, 또는 R2j 중 하나의 발생이 비치환된 페닐일 때, R3a 및 R3b는 다음 구조를 갖지 않는다:
.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R17은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R18a, R18b, R18c, R18d, R18e, R18f, R18g, R18h, R18i, 또는 R18j는 수소, 할로, -OR21, C(=O)OR21, OC(=O)R21, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로알콕시, 시아노, 아미닐알킬, 카르복시알킬, NR21R22, C(=O)NR21R22, N(R21)C(=O)R22, NR21C(=O)NR22, S(O)t, SR21, 니트로, N(R21)C(O)OR22, C(=NR21)NR22R23, N(R21)C(=NR22)NR23R24, S(O)R21, S(O)NR21R22, S(O)2R21, N(R21)S(O)2R22, S(O)2NR21R22, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며, 단 R18a, R18b, R18c, R18d, R18e, R18f, R18g, R18h, R18i, 또는 R18j 중 적어도 하나의 발생은 수소가 아니고;
R19는 NR19aR19b이며;
R19a 및 R19b는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 사이클로알킬, (CH2)nC(=O)OR5, 또는 (CH2)nP(=O)(OR5)2이거나;
또는 R19a 및 R19b는, 이것들이 부착되는 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로아릴 또는 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R20은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이며;
R21, R22, R23, 및 R24는, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬이고;
X는 직접 결합, -CR2eR2f-, 또는 -CR2eR2f-CR2gR2h-이며;
Y는 직접 결합 또는 -CR2iR2j-이고;
Z는 O 또는 S이며;
m은 0-6의 정수이고; 그리고
t는 1-3이다.
특정한 구체적인 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R25는 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R26a, R26b, R26c, 또는 R26d는 수소, 할로, -OR29, C(=O)OR29, OC(=O)R29, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 할로알콕시, 시아노, 아미닐알킬, 카르복시알킬, NR29R30, C(=O)NR29R30, N(R29)C(=O)R30, NR29C(=O)NR30, S(O)t, SR29, 니트로, N(R29)C(O)OR30, C(=NR29)NR30R31, N(R29)C(=NR30)NR31R32, S(O)R29, S(O)NR29R30, S(O)2R30, N(R29)S(O)2R30, S(O)2NR29R30, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 및 옥소로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되며, 단 R26a, R26b, R26c, 또는 R26d 중 적어도 하나의 발생은 수소가 아니고;
R27은 NR27aR27b이며;
R27a 및 R27b는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로아릴알킬, 사이클로알킬, (CH2)nC(=O)OR29, 또는 (CH2)nP(=O)(OR29)2이거나;
또는 R27a 및 R27b는, 이것들이 부착되는 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로아릴 또는 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R28은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이며;
R29, R30, R31, 및 R32는, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 알콕시알킬, 카르복시알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬이고;
X는 직접 결합 또는 -CR26cR26d-이며;
p는 0-6의 정수이고; 그리고
t는 1-3이다.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R1은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 a 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R2는 수소, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 할로알콕시, 또는 사이클로알킬이며;
R3은 수소, 알킬, 할로알킬, 또는 사이클로알킬이고;
또는 R2 및 R3은, 이것들이 각각 부착되는 탄소 및 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R4는 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R5a는 수소, 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 포스폰알킬, (CH2)nC(=O)OR6, C(=O)R6, C(=O)OR6, 또는 C(=O)NR6R7이며;
R5b는 전자쌍 또는 알킬이고;
R6 및 R7은, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 또는 아릴알킬이며;
R8은 알킬, 할로알킬, 아미닐알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬이고; 그리고
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이며,
단,
A) R5a는 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 포스폰알킬, (CH2)nC(=O)OR6, C(=O)R6, C(=O)OR6, 또는 C(=O)NR6R7이거나 또는 R1은 치환된 헤테로아릴, C(=NH)NHC(=O)OR8, C(=NOC(=O)R8)NH2, C(=NOC(=O)OR8)NH2, 및 C(=NOH)NH2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되고; 그리고
B) R2 및 R3이, 이것들이 각각 부착되는 탄소 및 질소와 함께 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하지 않는 한, R5a가 알킬 또는 (CH2)nC(=O)OR6일 때, R1은 다음 구조를 갖지 않는다:
.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R1은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이며;
R2는 수소, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 할로알콕시, 또는 사이클로알킬이고;
R3은 수소, 알킬, 할로알킬, 또는 사이클로알킬이며;
또는 R2 및 R3은, 이것들이 각각 부척되는 탄소 및 질소와 함께 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하고;
R4는 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이며;
R5a는 수소, 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 포스폰알킬, (CH2)nC(=O)OR6, C(=O)R6, C(=O)OR6, 또는 C(=O)NR6R7이고;
R5b는 전자쌍 또는 알킬이며;
R6 및 R7은, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 또는 아릴알킬이고;
R8은 알킬, 할로알킬, 아미닐알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬이며; 그리고
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이고,
단,
A) R5a는 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 포스폰알킬, (CH2)nC(=O)OR6, C(=O)R6, C(=O)OR6, 또는 C(=O)NR6R7이거나 또는 R1은 치환된 헤테로아릴, C(=NH)NHC(=O)OR8, C(=NOC(=O)R8)NH2, C(=NOC(=O)OR8)NH2, 및 C(=NOH)NH2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되며; 그리고
B) 구조 (I)의 화합물은 다음 구조 중 하나를 갖지 않는다:
, .
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R1은 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 a 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R2는 수소, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 할로알콕시, 또는 사이클로알킬이며;
R3은 수소, 알킬, 할로알킬, 또는 사이클로알킬이고;
또는 R2 및 R3은, 이것들이 각각 부착되는 탄소 및 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R4는 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 a 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R5a 및 R5b는 각각의 발생시에, 독립적으로 다음 구조 중 하나를 가지거나:
또는 ;
또는 R5a 및 R5b는, 이것들이 부착되는 인과 함께 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R6a는 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클릴이고;
R6b는, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소 또는 알킬이며;
R7은, 각각의 발생시에, 독립적으로 알킬, 할로알킬, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 또는 헤테로사이클릴알킬이고;
R8은 아미노산 측쇄이며; 그리고
n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8이다.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
는 이중 또는 단일 결합을 나타내고;
R1은 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이며;
R2는 수소, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 하이드록시알킬, 할로알콕시, 또는 사이클로알킬이고;
R3은 수소, 알킬, 할로알킬, 또는 사이클로알킬이거나, 또는 R2 및 R3은, 이것들이 각각 부착되는 탄소 및 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-7-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R4는 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴이고;
R5는 수소, 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 포스폰알킬, (CH2)mC(=O)OR6, C(=O)R6, C(=O)OR6, (CH2)mNR6S(O)2R7, 또는 C(=O)NR6R7이며;
R6 및 R7은, 각각의 발생시에, 독립적으로 수소, 알킬, 할로알킬, 사이클로알킬, 또는 아릴알킬이고;
L1은 직접 결합, -CR8aR8b-, -S(O)t -, NR8c, 또는 -O-이며;
R8a 및 R8b는 각각 독립적으로 수소, 알킬이거나, 또는 R8a 및 R8b는, 이것들이 부착되는 탄소와 함께 선택적으로 치환된 3-6-원 사이클로알킬을 형성하고;
R8c는 수소, 알킬, 할로알킬, (C=O)알킬, (C=O)O알킬, (C=O)사이클로알킬, (C=O)O사이클로알킬, (C=O)아릴, (C=O)O아릴, (C=O)헤테로아릴, (C=O)O헤테로아릴, (C=O)헤테로사이클릴, (C=O)O 헤테로사이클릴, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬이며;
n은 1 또는 2이고;
m은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며; 그리고
t는 0, 1, 또는 2이다.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R1은 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이며;
R3은 수소 또는 알킬이고;
R4는 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 치환된 또는 비치환된 피리디닐로 이루어지는 군으로부터 선택된 치환기로 치환된 헤테로사이클릴이거나, 또는 R3 및 R4는, 이것들이 각각 부착되는 질소 및 탄소와 함게, 선택적으로 치환된 4-10-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R5a는 수소 또는 할로이고;
R5b는 수소, 알킬, 할로알킬, (C=O)알킬, (C=O)O알킬, (C=O)사이클로알킬, (C=O)O사이클로알킬, (C=O)아릴, (C=O)O아릴, (C=O)헤테로아릴, (C=O)O헤테로아릴, (C=O)헤테로사이클릴, (C=O)O헤테로사이클릴, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴알킬이며;
L1은 직접 결합, -CH2-, -S(O)t -, NR5b, -O-, -C=C-, 또는 -C≡C-이고; 그리고
t는 0, 1, 또는 2이며,
단:
A) R2는 다음 구조 중 하나를 갖지 않고:
또는 ;
B) R1은 다음 구조 중 하나를 갖지 않으며:
또는 ; 그리고
C) R2가 비치환된 페닐일 때, R1은 다음 구조 중 하나를 갖지 않는다:
.
특정한 보다 구체적인 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R6은 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 a 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R7은 알킬, -SR10 치환된 또는 비치환된 아릴, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이며;
R8은 수소, 알킬, 할로알킬, 또는 사이클로알킬이고;
R9는 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R8 및 R9는, 이것들이 부착되는 질소와 함께, 선택적으로 치환된 4-10-원 헤테로사이클릴을 형성하며;
R10은 수소, 알킬, 할로알킬, 또는 사이클로알킬이고;
단:
A) R7이 비치환된 페닐, 3-((메틸설포닐)아미노)페닐, 2-메틸페닐, 3-(다이메틸아미노)페닐, 3-(메틸아미노)페닐, 3-메틸페닐, 3-아미노메틸페닐, 3-아미노페닐, 비치환된 피리디닐, 3-(메틸아미노)-2-티에닐, 3,4-다이아미노-2-티에닐, 3-((메틸설포닐)아미노)-2-티에닐, 3-아미노-2-티에닐, 3-아미노-5-5(아미노카르보닐)페닐이거나, 또는 다음 구조:
또는
중 하나를 가질 때 R6은 다음 구조를 갖지 않으며:
; 그리고
B) R7이 비치환된 페닐일 때, R6은 다음 구조를 갖지 않는다:
.
일부 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R11은 다음 구조 중 하나를 가지며:
또는 ;
R12는 메틸 또는 할로이고;
R13은 치환된 또는 비치환된 아릴이며; 그리고
n은 1 또는 2이고,
단:
구조 (III)의 화합물은 다음 구조를 갖지 않는다:
.
일부 보다 구체적인 구체예에서, 소분자는 다음 구조를 갖는 화합물:
또는 그것의 입체 이성질체, 호변체, 또는 제약학적으로 허용 가능한 염이며, 식에서:
R14는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R15는 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬이며;
L2는 직접 결합, -C(=O), 또는 -S(=O)t-이고; 그리고
t는 0, 1, 또는 2이다.
MASP-2의 발현 억제제
발명의 이 측면의 또 다른 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제할 수 있는 MASP-2 발현 억제제이다. 발명의 이 측면의 실시에서, 대표적인 MASP-2 발현 억제제에는 MASP-2 안티센스 핵산 분자(예컨대 안티센스 mRNA, 안티센스 DNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드), MASP-2 리보자임 및 MASP-2 RNAi 분자가 포함된다.
항-센스 RNA 및 DNA 분자는 MASP-2 mRNA에 혼성화하여 MASP-2 단백질의 번역을 방지함으로써 MASP-2의 번역을 직접 차단하는 역할을 한다. 안티센스 핵산 분자는 MASP-2의 발현을 간섭할 수 있다면 여러 상이한 방식으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 MASP-2 cDNA(서열 번호:4)의 코딩 영역(또는 그것의 일부)을 그것의 정상적인 전사 방향에 대해 반전시켜서 그것의 보체의 전사를 허용함으로써 구성될 수 있다.
안티센스 핵산 분자는 일반적으로 표적 유전자 또는 유전자들의 적어도 일부와 실질적으로 동일하다. 그러나, 핵산은 발현을 억제하기 위해 완벽하게 동일할 필요는 없다. 일반적으로, 더 짧은 안티센스 핵산 분자의 사용을 상쇄하기 위해 더 높은 상동성이 사용될 수 있다. 최소 퍼센트 동일성은 전형적으로 약 65%보다 크지만, 더 높은 퍼센트의 동일성은 내인성 서열의 발현의 보다 효과적인 억제를 발휘할 수 있다. 약 80%보다 큰 실질적으로 더 큰 퍼센트의 동일성이 전형적으로 바람직하지만, 절대 동일성에 대해 약 95%가 전형적으로 가장 바람직하다.
안티센스 핵산 분자는 표적 유전자와 동일한 인트론 또는 엑손 패턴을 가질 필요가 없으며, 표적 유전자의 비코딩 분절은 코딩 분절과 같이 표적 유전자 발현의 안티센스 억제를 달성하는데 동등하게 효과적일 수 있다. 적어도 약　8개 정도의 뉴클레오타이드의 DNA 서열이 안티센스 핵산 분자로서 사용될 수 있지만, 더 긴 서열이 바람직하다. 본 발명에서, MASP-2의 유용한 억제제의 대표적인 예는 서열 번호:4에 제시된 핵산 서열로 이루어지는 MASP-2 cDNA의 보체에 적어도 90 퍼센트 동일한 안티센스 MASP-2 핵산 분자이다. 서열 번호:4에 제시된 핵산 서열은 서열 번호:5에 제시된 아미노산 서열로 이루어지는 MASP-2 단백질을 암호화한다.
MASP-2 mRNA에 결합하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적화는 MASP-2 단백질 합성의 수준을 감소시키기 위해 사용될 수 있는 또 다른 메커니즘이다. 예를 들어, 폴리갈락투로나제 및 무스카린 유형 2 아세틸콜린 수용체의 합성은 그것들의 각각의 mRNA 서열에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다(Cheng의 미국 특허 제　5,739,119호, 및 Shewmaker의 미국 특허 제　5,759,829호). 나아가, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약물 내성 유전자(MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA 수용체 및 인간 EGF를 사용하여 입증되었다(예컨대, Baracchini의 미국 특허 제　5,801,154호; Baker의 미국 특허 제　5,789,573호; Considine의 미국 특허 제　5,718,709호; 및 Reubenstein의 미국 특허 제　5,610,288호 참고).
통상적인 기술을 가진 사람이 올리고뉴클레오타이드가 발명에 유용한지의 여부를 결정하는 것을 허용하고, 전사체 내에서 서열의 접근성에 대한 인디케이터로서 RNAse H 절단을 사용하여 적합한 부위를 프로빙하는 것을 포함하는 시스템이 기술되어 있다. Scherr, M.,　et　al., Nucleic Acids Res.　26:5079-5085, 1998; Lloyd,　et　al., Nucleic Acids Res.　29:3665-3673, 2001. MASP-2 전사체의 특정 영역에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 혼합물이 MASP-2를 발현하는 세포 추출물, 예컨대 간세포에 첨가되고, 혼성화되어 RNAse H 취약성 부위가 생성된다. 이 방법은 이량체, 헤어핀, 또는 숙주 세포에서 mRNA를 표적화하기 위하여 특이적 결합을 감소 또는 금지시킬 다른 이차 구조를 형성하는 상대적 능력을 토대로 안티센스 조성물에 대한 최적의 서열 선택을 예측할 수 있는 컴퓨터 보조 서열 선택과 조합될 수 있다. 이들 이차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은 올리고 프라이머 분석 소프트웨어(Rychlik, I., 1997) 및 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어(Altschul, S.F.,　et　al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수 있다. 표적 서열에 대해 지시된 안티센스 화합물은 바람직하게 약 8　내지 약 50개　뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 약　9 내지 약　35개 정도의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 발명자들은 9 내지　35개 뉴클레오타이드 범위(즉, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는　35개 정도의 염기 길이의 뉴클레오타이드)의 모든 올리고뉴클레오타이드 조성물이 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 기반 방법의 실시에 매우 바람직하다고 여긴다. MASP-2 mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에 있거나 근처의 영역, 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보하는 서열, 예컨대, MASP-2 유전자 뉴클레오타이드 서열(서열 번호:4)의 -10 내지 +10 영역이다. 예시의 MASP-2 발현 억제제가 표 4에서 제공된다.
위에서 주지된 것과 같이, 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)의 올리고머 또는 중합체 또는 그것의 모방물을 지칭한다. 이 용어는 또한 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드, 당 및 공유 뉴클레오사이드간(백본) 결합뿐만 아니라 자연적으로 발생하지 않는 변형을 가진 올리고뉴클레오타이드로 구성된 올리고핵염기도 포함한다. 이들 변형은 당업자가 자연적으로 발생하는 올리고뉴클레오타이드를 통해 부여받지 못한 특정한 바람직한 특성, 예컨대 감소된 독성 특성, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 안정성 및 향상된 세포 흡수를 도입할 수 있게 한다. 예시적인 구체예에서, 발명의 안티센스 화합물은 포스페이트 치환기가 포스포로티오에이트에 의해 대체된 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 수명을 연장하기 위한 포스포다이에스테르 백본의 변형에 의해 천연 DNA와 상이하다. 마찬가지로, 올리고뉴클레오타이드의 한쪽 또는 양쪽 단부는 핵산 가닥 내의 인접한 염기쌍 사이에 끼워지는 하나 이상의 아크리딘 유도체에 의해 치환될 수 있다.
안티센스에 대한 또 다른 대안은 "RNA 간섭"(RNAi)의 사용이다. 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 포유류의 생체내에서 유전자 침묵을 촉발시킬 수 있다. RNAi의 자연적인 기능 및 공동 억제는 활성이 되었을 때 숙주 세포에서 비정상적인 RNA 또는 dsRNA를 생성하는 레트로트랜스포존 및 바이러스와 같은 이동성 유전자 요소에 의한 침입에 대해 게놈을 보호하는 것으로 나타난다(예컨대, Jensen,　J.,　et　al., Nat. Genet. 21:209-12, 1999 참고). 이중 가닥 RNA 분자는 각각 약 19 내지 25개 뉴클레오타이드(예컨대, 19-23　뉴클레오타이드)의 길이를 갖는, 이중 가닥 RNA 분자를 형성할 수 있는 2개의 RNA 가닥을 합성함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 발명의 방법에 유용한 dsRNA 분자는 표 4에 열거된 서열 및 그것의 보체에 상응하는 RNA를 포함할 수 있다. 바람직하게, RNA의 적어도 하나의 가닥은 1-5개　뉴클레오타이드의 3' 돌출부를 가진다. 합성된 RNA 가닥은 이중 가닥 분자를 형성하는 조건 하에서 조합된다. RNA 서열은 서열 번호:4의 적어도 8개 뉴클레오타이드 부분을 포함할 수 있고 총 길이는 25개 뉴클레오타이드 정도이다. 주어진 표적에 대한 siRNA의 설계는 기술분야에서 당업자의 통상적인 기술 내에 있다. siRNA 서열을 설계하고 발현의 적어도 70% 녹다운을 보장하는 상업적 서비스가 이용 가능하다(Qiagen, Valencia, Calif).
dsRNA는 알려져 있는 방법에 의해 제약학적 조성물로서 투여되고 수행될 수 있으며, 여기서 핵산이 원하는 표적 세포에 도입된다. 일반적으로 사용된 유전자 전달 방법에는 인산 칼슘, DEAE-덱스트란, 전기천공, 미세주입 및 바이러스 방법이 포함된다. 그러한 방법은 문헌[Ausubel　et　al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1993]에서 교시된다.
리보자임, 예컨대 MASP-2 mRNA를 표적으로 하는 리보자임이 또한 MASP-2의 양 및/또는 생물학적 활성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 리보자임은 리보자임의 서열에 완전히 또는 부분적으로 상동성인 서열을 갖는 핵산 분자를 절단할 수 있는 촉매 RNA 분자이다. 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 형성하고 특정 위치에서 포스포다이에스테르 백본을 절단함으로써, 표적 RNA를 기능적으로 비활성화시킬 수 있는 RNA 리보자임을 암호화하는 리보자임 도입유전자를 설계하는 것이 가능하다. 이런 절단을 수행할 때, 리보자임은 자체로는 변경되지 않으며, 따라서 재활용되어 다른 분자를 절단할 수 있다. 안티센스 RNA 내에서 리보자임 서열의 포함으로 RNA 절다 활성이 RNA에 부여됨으로써, 안티센스 구성물의 활성이 증가된다.
발명의 실시에 유용한 리보자임은 전형적으로 표적 MASP-2 mRNA의 적어도 일부에 대해 뉴클레오타이드 서열에서 상보적인 적어도 약 9개 뉴클레오타이드의 혼성화 영역, 및 표적 MASP-2 mRNA를 절단하기 위해 적응된 촉매 영역을 포함한다(일반적으로, EPA No.　0 321 201; WO88/04300; Haseloff, J.,　et　al., Nature　334:585-591, 1988; Fedor, M.J.,　et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA　87:1668-1672, 1990; Cech, T.R.,　et　al., Ann. Rev. Biochem. 55:599-629, 1986 참고).
리보자임은 리보자임 서열을 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드의 형태로 세포에 대해 직접 표적화되거나, 또는 원하는 리보자임 RNA를 암호화하는 발현 벡터로서 세포에 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대해 기술된 것과 거의 동일한 방식으로 사용되고 적용될 수 있다.
발명의 방법에 유용한 안티센스 RNA 및 DNA, 리보자임 및 RNAi 분자는 DNA 및 RNA 분자의 합성에 대해 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법에는 기술분야에 잘 알려져 있는, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 및 올리고리보뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하기 위한 기법, 예컨대 예를 들어 고상 포스포라미다이트 화학적 합성이 포함된다. 대안적으로, RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 암호화하는 DNA 서열의 시험관내 및 생체내 전사에 의해 생성될 수 있다. 그러한 DNA 서열은 T7 또는　SP6 중합효소 프로모터와 같은 적합한 RNA 중합효소 프로모터를 통합하는 광범위한 벡터에 통합될 수 있다. 대안적으로, 사용된 프로모터에 따라 안티센스 RNA를 구성적으로 또는 유도성으로 합성하는 안티센스 cDNA 구성물은 세포주에 안정적으로 도입될 수 있다.
DNA 분자의 다양한 잘 알려져 있는 변형이 안정성 및 반감기를 증가시키는 수단으로서 도입될 수 있다. 유용한 변형에는, 한정하는 것은 아니지만, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 플랭킹 서열의 분자의 5' 및/또는　3' 단부에의 첨가 또는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 백본 내에서 포스포다이에스테라제 결합보다는 포스포로티오에이트 또는 2'　O-메틸의 사용이 포함된다.
V. 제약학적 조성물 및 전달 방법
투약
또 다른 측면으로, 발명은 치료적으로 효과적인 양의 MASP-2 억제제 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 질환 또는 병태를 앓고 있는 대상체에서 MASP-2 의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하기 위한 조성물을 제공한다. MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화와 관련된 질환을 치료 또는 개선하기 위하여 치료적으로 효과적인 용량으로 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 치료적으로 효과적인 용량은 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선을 초래하기에 충분한 MASP-2 억제제의 양을 지칭한다.
MASP-2 억제제의 독성 및 치료 효능은 실험 동물 모델, 예컨대 실시예 1에서 기술된 인간 MASP-2 도입유전자를 발현하는 쥐과 MASP-2 -/- 마우스 모델을 사용하는 표준 제약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 그러한 동물 모델을 사용하여, NOAEL(관찰된 부작용 수준 없음) 및 MED(최소한으로 효과적인 용량)가 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. NOAEL과 MED 효과 사이의 용량비는 치료 비율이며, 비율 NOAEL/MED로서 표시된다. 큰 치료 비율 또는 지수를 나타내는 MASP-2 억제제가 대부분 바람직하다. 세포 조직 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투여량을 제제화하는데 사용될 수 있다. MASP-2 억제제의 투여량은 바람직하게 독성이 거의 또는 전혀 없는 MED를 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 활용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다.
일부 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 포유류 대상체에서 섬유증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기 위한 MASP-2 억제제의 치료적 효능은 다음 중 하나 이상에 의해 결정된다: 신장 조직에서 염증 및 반흔의 하나 이상의 마커(예컨대, TGFβ-1, CTFF, IL-6, 세포자멸사, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, EMT, 침윤 대식세포)의 감소; 염증 및 섬유화 신장 질환의 가용성 마커의 소변 및 혈장으로의 방출의 감소(예컨대, 신장 배설 기능의 측정에 의함).
임의의 화합물 제제에 대해, 치료적으로 효과적인 용량은 동물 모델을 사용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 MED를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 혈장 중의 MASP-2 억제제의 정량적 수준은 또한, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
독성 연구 외에, 효과적인 투여량은 또한 살아있는 대상체에 존재하는 MASP-2 단백질의 양 및 MASP-2 억제제의 결합 친화도를 토대로 추정될 수 있다. 정상적인 인간 대상체에서의 MASP-2 수준은 500　ng/ml의 범위로 저수준으로 혈청에 존재하며, 특정 대상체에서의 MASP-2 수준은 문헌[Moller-Kristensen M.,　et　al., J.　Immunol. 방법　282:159-167, 2003]에 기술된 MASP-2에 대한 정량적 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
일반적으로, 투여된 MASP-2 억제제를 포함하는 조성물의 투여량은 대상체의 연령, 체중, 신장, 성별, 일반적인 의학적 상태, 및 이전의 병력과 같은 요인에 따라 달라진다. 예로서, MASP-2 억제제, 예컨대 항-MASP-2 항체는 약　0.010 내지 10.0　mg/kg, 바람직하게는 0.010 내지　1.0　mg/kg, 보다 바람직하게는　0.010 내지 0.1　mg/kg의 대상체 체중의 투여량 범위로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서 조성물은 항-MASP-2 항체 및 MASP-2 억제 펩타이드의 조합을 포함한다.
주어진 대상체에서 본 발명의 MASP-2 억제 조성물 및 방법의 치료적 효능, 및 적절한 투여량은 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체는 수많은 특정 생성물을 생성한다. 지난 10년 동안, 민감하고 특이적인 검정이 개발되었고 작은 활성화 단편　C3a, C4a, 및　C5a 및 큰 활성화 단편 iC3b, C4d, Bb, 및　sC5b-9를 포함한, 대부분의 이들 활성화 생성물에 대해 상업적으로 이용 가능하다. 이들 검정의 대부분은 새로운 항원(네오항원)이 형성되는 천연 단백질 상에서가 아닌, 단편 상에 노출된 새로운 항원과 반응하여, 이들 검정을 매우 단순하고 특이적으로 만드는 단클론성 항체를 활용한다. 대부분은 ELISA 기술에 의존하지만, 방사성 면역검정은 여전히 때때로 C3a 및　C5a에 대해 사용된다. 이들 후자의 검정은 순환에서 발견되는 대부분의 형태인 프로세싱되지 않은 단편 및 그것의 'desArg' 단편을 측정한다. 프로세싱되지 않은 단편 및 C5adesArg는 세포 표면 수용체에의 결합에 의해 신속하게 제거되고 따라서 매우 낮은 농도로 존재하는 반면, C3adesArg는 세포에 결합하지 않고 혈장에 축적된다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감한, 경로 무관한 지표를 제공한다. 대체 경로 활성화는 Bb　단편을 측정함으로써 평가될 수 있다. 막 공격 경로 활성화의 유동상 생성물인 sC5b-9의 검출은 보체가 완성되기 위해 활성화되고 있는 증거를 제공한다. 렉틴 및 고전적 경로가 모두 동일한 활성화 생성물인 C4a 및　C4d를 생성하기 때문에, 이들 두 단편의 측정은 이들 두 경로 중 어느 것이 활성화 생성물을 생성하였는지에 대한 어떠한 정보도 제공하지 못한다.
MASP-2 의존성 보체 활성화의 억제는 발명의 방법에 따라 MASP-2 억제제의 투여의 결과로서 발생하는 보체 시스템의 구성요소의 다음 변화 중 적어도 하나를 특징으로 한다: MASP-2 의존성 보체 활성화 시스템 생성물 C4b, C3a, C5a 및/또는 C5b-9(MAC)의 생성 또는 생산의 억제(예를 들어, 실시예 2에서 기술된 것과 같이 측정됨), C4 절단 및 C4b 침착의 감소(예를 들어, 실시예 10에서 기술된 것과 같이 측정됨), 또는 C3 절단 및 C3b 침착의 감소(예를 들어, 실시예 10에서 기술된 것과 같이 측정됨).
추가 작용제
특정 구체예에서, 섬유증 및/또는 염증을 예방, 치료, 반전 및/또는 억제하는 방법은 치료 요법의 일부로서 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)를 섬유증 및/또는 염증을 억제하기 위한 하나 이상의 다른 약물, 생물학적 물질, 또는 치료적 개입과 함께 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 추가 약물, 생물학적 물질, 또는 치료적 개입은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애와 관련된 특정 증상에 적절하다. 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 하나 이상의 면역억제제, 예컨대 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 및 미코페놀레이트 모페틸과 함께 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 추가의 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 혈액 흐름을 증가시키기 위해 설계된 하나 이상의 작용제(예컨대, 니페디핀, 암로디핀, 딜티아젬, 펠로디핀, 또는 니카르디핀)와 함께 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 추가의 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 섬유증을 감소시키도록 의도된 하나 이상의 작용제, 예컨대 d-페니실아민, 콜히친, PUVA, 릴렉신, 사이클로스포린, TGF 베타 차단제 및/또는 p38 MAPK 차단제와 함께 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다. 추가의 예를 들면, MASP-2 억제 항체는 스테로이드 또는 기관지 확장제와 함께 치료 요법의 일부로서 투여될 수 있다.
MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)를 포함하는 조성물 및 방법은 MASP-2 억제제의 활성을 증대시킬 수 있거나 부가적 또는 상승적 양식으로 관련된 치료 기능을 제공하는 하나 이상의 추가 치료제를 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 맥락에서, 하나 이상의 MASP-2 억제제가 하나 이상의 추가 항섬유화제 및/또는 하나 이상의 항바이러스 및/또는 항염증성 및/또는 면역억제제와 조합되어) 투여될 수 있다(공동 투여를 포함함).
MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 일반적인 항바이러스 약물, 또는 코르티코스테로이드와 같은 면역억제 약물, 면역억제성 또는 세포독성제, 및/또는 항섬유화제와 조합되어 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2의 소분자 억제제)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스를 앓고 있는 대상체의 치료를 위해 단일요법으로서 사용된다. 본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2의 소분자 억제제)는 다른 치료제, 예컨대 항바이러스제, 치료 항체, 코르티코스테로이드 및/또는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스를 앓고 있는 대상체의 치료에 대해 효과가 있는 것으로 나타난 다른 작용제와 조합되어 사용된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2의 소분자 억제제) 및 항바이러스제(예컨대, 렘데시비르), MASP-2 이외의 표적에 대한 치료 항체, 코르티코스테로이드, 항응고제, 예컨대 저분자량 헤르파린(예컨대, 에녹사파린) 및 항생물질(예컨대, 아지트로마이신)과 같은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
그러한 병용 요법에서, MASP-2 억제제는 항바이러스제(예컨대, 렘데시비르), MASP-2 이외의 표적에 대한 치료 항체, 코르티코스테로이드, 또는 항응고제와 같은 하나 이상의 다른 원하는 COVID-19 치료제와 함께 제제화되거나 또는 동시에, 전에, 또는 후속해서 투여된다. 병용 요법의 각각의 구성요소는 기술분야에 알려져 있는 광범위한 방법으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, MASP-2 억제제 및 병용 요법의 이차 작용제는 함께 또는 별도로 제제화될 수 있다. MASP-2 억제제 및 추가 작용제는 COVID-19 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 적합하게 투여될 수 있다.
예시의 항바이러스제로는, 예를 들어 다루나비르(다루나비르 수준을 증가시키기 위해 리토나비르 또는 코비시스타트와 함께 사용될 수 있음), 파빌라비르, 로피나비르, 리토나비르, 렘데시비르, 갈리데시비르, 에바스틴, 다노프레비르, ASC09, 엠트리시타빈, 테노포비르, 우미프노비르, 발록사비르 마르복실, 아즈부딘 및/또는 ISR-50을 들 수 있다. 예시의 치료 항체로는, 예를 들어, 혈관 성장 인자 억제제(예컨대, 베바시주맙), PD-1 차단 항체(예컨대, 티모신, 캄렐리주맙), CCR5 길항물질(예컨대, 레론리맙), IL-6 수용체 길항물질(예컨대, 사릴루맙, 토실리주맙), IL-6 표적화된 억제제(예컨대, 실툭시맙), 항-GMCSF 항체(예컨대, 김실루맙, TJM2), GMCSF 수용체 알파 차단 항체(예컨대, 마브릴리무맙), 항-C5 항체(예컨대, 에쿨리주맙, 라불리주맙), 및/또는 항-C5a 항체(IFX-1)를 들 수 있다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체, 예컨대, OMS646, 또는 MASP-2의 소분자 억제제)는 COVID-19를 앓고 있는 대상체의 치료를 위해 렘데시비르와 같은 항바이러스제와 조합되어 사용된다.
코로나바이러스 및/또는 인플루엔자 바이러스의 치료에 효과적일 수 있는 다른 작용제로는, 예를 들어, 클로로퀸/하이드록시클로로퀸, 카모스타트 메실레이트, 룩솔리닙, 페그인터페론 알파-2b, 노바페론, 이펜프로딜, 재조합 ACE2, APN01, 브릴라시딘, BXT-25, BIO-11006, 핀골리모드, WP1122, 인터페론 베타-1a, 나파모스타트, 로사르탄 및/또는 알테플라제를 들 수 있다.
제약학적 담체 및 전달 비히클
일반적으로, 임의의 다른 선택된 치료제와 조합된 본 발명의 MASP-2 억제제 조성물은 제약학적으로 허용 가능한 담체에 적합하게 함유된다. 담체는 무독성, 생체부합하며 MASP-2 억제제(및 이것과 조합된 임의의 다른 치료제)의 생물학적 활성에 유해하게 영향을 미치지 않도록 선택된다. 펩타이드에 대한 예시의 제약학적으로 허용 가능한 담체는 Yamada의 미국 특허 제　5,211,657호에서 기술된다. 발명에 유용한 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 경구, 비경구 또는 외과적 투여를 허용하는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 데포, 흡입제 및 주사제와 같은 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 가스 형태의 조제물로 제제화될 수 있다. 발명은 또한 의료 장치를 코팅하는 등의 조성물의 국소 투여를 고려한다.
주사 가능한, 주입 또는 관주 및 국소 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체에는 증류수, 생리적 인산염 완충 식염수, 정상 또는 락테이트화된 링거액, 덱스트로스 용액, 행크 용액, 또는 프로판다이올이 포함된다. 더불어, 멸균된, 고정 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함한 임의의 생체부합성 오일이 사용될 수 있다. 더불어, 올레산과 같은 지방산이 주사 가능한 작용제의 제조에 사용된다. 담체 및 작용제는 액체, 현탁액, 중합 가능한 또는 중합 가능하지 않은 겔, 페이스트 또는 고약으로서 합성될 수 있다.
담체는 또한 작용제(들)의 전달을 지속(즉, 연장, 지연 또는 조절)하기 위하여 또는 치료제(들)의 전달, 흡수, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위하여 전달 비히클을 포함할 수 있다. 그러한 전달 비히클로는, 비제한적인 예로, 단백질로 구성된 미세입자, 미소구체, 나노스피어 또는 나노입자, 리포솜, 탄수화물, 합성 유기 화합물, 무기 화합물, 중합체 또는 공중합체 하이드로겔 및 중합체 미셸을 들 수 있다. 적합한 하이드로겔 및 미셸 전달 시스템에는 WO　2004/009664　A2에서 개시된 PEO:PHB:PEO 공중합체 및 공중합체/사이클로덱스트린 복합체 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0019369　A1에서 개시된 PEO 및 PEO/사이클로덱스트린 복합체가 포함된다. 그러한 하이드로겔은 의도된 작용 부위에 국소적으로 주사되거나, 또는 피하로 또는 근육내로 주사되어 지속적인 방출 데포를 형성할 수 있다.
관절내 전달의 경우, MASP-2 억제제는 위에서 기술된 주사 가능한 액체 또는 겔 담체, 위에서 기술된 주사 가능한 지속성 방출 전달 비히클, 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체로 운반될 수 있다.
비펩타이드성 작용제의 경구 투여의 경우, MASP-2 억제제는 수크로스, 옥수수 전분, 또는 셀룰로스와 같은 비활성 충전제 또는 희석제로 운반될 수 있다.
국소 투여의 경우, MASP-2 억제제는 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 또는 분말로, 또는 겔 또는 경피 패치를 통한 미소캡슐 전달 시스템으로 운반될 수 있다.
에어로졸, 정량 흡입기, 건조 분말 흡입기, 및 분무기를 포함한 다양한 비강 및 폐 전달 시스템이 개발 중에 있고 각각 에어로졸, 흡입제, 또는 분무된 전달 비히클로 본 발명의 전달을 위해 적합하게 적응될 수 있다.
척수강내(IT) 또는 뇌실내(ICV) 전달의 경우, 적절하게 멸균된 전달 시스템(예컨대, 액체; 겔, 현탁액 등)이 본 발명을 투여하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 또한 생체부합성 부형제, 예컨대 분산 또는 습윤제, 현탁제, 희석제, 완충제, 침투 강화제, 유화제, 결합제, 증점제, 향료(경구 투여용)가 포함될 수 있다.
항체 및 펩타이드를 위한 제약학적 담체
보다 구체적으로 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드와 관련하여, 예시의 제제가 물, 오일, 식염수, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 멸균된 액체일 수 있는 제약학적 담체를 가진 생리적으로 허용 가능한 희석제 중의 화합물의 용액 또는 현탁액의 주사 가능한 투여량으로서 비경구적으로 투여될 수 있다. 추가적으로, 습윤 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등과 같은 보조 물질이 항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 제약학적 조성물의 추가 구성요소에는 석유(예컨대 동물, 식물 또는 합성 기원의 것임), 예를 들어, 대두유 및 미네랄 오일이 포함된다. 일반적으로, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 주사 가능한 용액으로 바람직한 액체 담체이다.
항-MASP-2 항체 및 억제 펩타이드는 또한 활성제의 지속적인 또는 박동성 방출을 허용하기 위한 방식으로 제제화될 수 있는 데포 주사 또는 임플란트 조제물의 형태로 투여될 수 있다.
발현 억제제에 대한 제약학적으로 허용 가능한 담체
보다 구체적으로 발명의 방법에 유용한 발현 억제제와 관련하여, 위에서 기술된 발현 억제제 및 제약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 콜로이드 분산 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
발현 억제제를 포함하는 제약학적 조성물로는, 한정하는 것은 아니지만, 용액, 에멀션, 및 리포솜 함유 제제를 들 수 있다. 이들 조성물은 한정하는 것은 아니지만, 사전 형성된 액체, 자가 유화 고체 및 자가 유화 반고체를 포함한 다양한 구성요소로부터 생성될 수 있다. 그러한 조성물의 제조는 전형적으로 발현 억제제를 다음 중 하나 이상과 조합하는 것을 포함한다: 완충제, 항산화제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제. 중성 완충 식염수 또는 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 적합한 희석제의 예이다.
일부 구체예에서, 조성물은 전형적으로 액적 형태로 다른 액체에 분산된 한 액체의 이종성 시스템인 에멀션으로서 제조 및 제제화될 수 있다(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.　1, Rieger and Banker(eds.), Marcek Dekker, Inc., N.Y., 1988 참고). 에멀션 제제에 사용된 자연적으로 발생하는 유화제의 예에는 아카시아, 밀랍, 라놀린, 레시틴 및 포스파타이드가 포함된다.
한 구체예에서, 핵산을 포함하는 조성물은 마이크로에멀션으로서 제제화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 마이크로에멀션은 단일 광학 등방성 및 열역학적으로 안정적인 액체 용액인 물, 오일, 및 양친매성의 시스템을 지칭한다(Rosoff in Pharmaceutical Dosage Forms, Vol.　1 참고). 발명의 방법은 또한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 원하는 부위로의 이동 및 전달을 위해 리포솜을 사용할 수 있다.
국소 투여를 위한 발현 억제제의 제약학적 조성물 및 제제에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 종래의 제약학적 담체, 뿐만 아니라 수성, 분말 또는 유성 염기 및 증점제 등이 사용될 수 있다.
투여 방식
MASP-2 억제제를 포함하는 제약학적 조성물은 국소적 또는 전신적 투여 방식이 치료되고 있는 병태에 가장 적절한지에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 조성물은 조성물을 이식 가능한 의료 장치 상에 코팅하거나 안에 포함시킴으로써 전달될 수 있다.
전신적 전달
본원에서 사용되는 바, 용어 "전신적 전달" 및 "전신적 투여"에는 한정하는 것은 아니지만 근육내(IM), 피하, 정맥내(IV), 동맥내, 흡입, 혀밑, 볼, 국소, 경피, 비강, 직장, 질 및 의도된 치료 작용의 단일 또는 다수의 부위에 전달된 작용제의 분산을 효과적으로 초래하는 다른 투여 경로를 포함한 경구 및 비경구 경로가 포함된다. 본 조성물을 위한 바람직한 전신적 전달 경로에는 정맥내, 근육내, 피하 및 흡입이 포함된다. 특히 본 발명의 조성물에 활용된 선택된 작용제에 대한 정확한 전신적 투여 경로는 부분적으로는 주어진 투여 경로와 관련된 대사 변환 경로에 대한 작용제의 민감성을 고려하여 결정될 것이라는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 펩타이드성 작용제는 경구 이외의 경로에 의해 가장 적합하게 투여될 수 있다.
MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 임의의 적합한 수단에 의해 필요로 하는 대상체에게 전달될 수 있다. MASP-2 항체 및 폴리펩타이드의 전달 방법에는 경구, 폐, 비경구(예컨대, 근육내, 복강내, 정맥내(IV) 또는 피하 주사), 흡입(예컨대 미세 분말 제제를 통해서), 경피, 비강, 질, 직장, 또는 혀밑 투여 경로에 의한 투여가 포함되고, 각각의 투여 경로에 적절한 투여 형태로 제제화될 수 있다.
대표적인 예를 들면, MASP-2 억제 항체 및 펩타이드는 폴리펩타이드를 흡수할 수 있는 신체 막, 예를 들어 위장막 및 직장막에 적용됨으로써 살아있는 신체 내로 도입될 수 있다. 폴리펩타이드는 전형적으로 침투 강화제와 함께 흡수성 막에 적용된다(예컨대, Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.　5 :69, 1988; Lee, V.H.L., J.　Controlled Release 13:213, 1990; Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G.,　et　al., J.　Controlled Release　13 :241, 1990 참고). 예를 들어, STDHF는 담즙 염과 구조가 유사한 스테로이드성 계면활성제인 후시드산의 합성 유도체이고, 비강 전달을 위한 침투 강화제로서 사용되었다(Lee, W.A., Biopharm.　22, Nov./Dec. 1990).
MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 또 다른 분자, 예컨대 지질과 함께, 폴리펩타이드를 효소적 분해로부터 보호하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 공유 부착이 특정 단백질을 체내에서 효소적 가수분해로부터 보호하고 그로써 반감기를 연장시키기 위해 사용되어 왔다(Fuertges, F.,　et　al., J.　Controlled Release　11:139, 1990). 많은 중합체 시스템이 단백질 전달을 위해 보고되었다(Bae, Y.H.,　et　al., J.　Controlled Release　9:271, 1989; Hori, R.,　et　al., Pharm. Res.　6:813, 1989; Yamakawa, I.,　et　al., J. Pharm. Sci.　79:505, 1990; Yoshihiro, I.,　et　al., J.　Controlled Release　10:195, 1989; Asano, M.,　et　al., J.　Controlled Release　9:111, 1989; Rosenblatt, J., et　al., J.　Controlled Release　9:195, 1989; Makino, K., J.　Controlled Release　12:235, 1990; Takakura, Y., et　al., J.　Pharm. Sci.　78:117, 1989; Takakura, Y.,　et　al., J. Pharm. Sci.　78:219, 1989).
최근에, 혈청 안정성 및 순환 반감기가 개선된 리포솜이 개발되었다(예컨대, Webb의 미국 특허 제　5,741,516호 참고). 나아가, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 조제물의 다양한 방법이 리뷰되었다(예컨대, Szoka의 미국 특허 제　5,567,434호; Yagi의 미국 특허 제　5,552,157호; Nakamori의 미국 특허 제　5,565,213호; Shinkarenko의 미국 특허 제　5,738,868호; 및 Gao의 미국 특허 제　5,795,587호 참고).
경피 적용의 경우, MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 다른 적합한 성분, 예컨대 담체 및/또는 보조제와 조합될 수 있다. 그러한 다른 성분은 의도된 투여에 제약학적으로 허용 가능해야 하고, 조성물의 활성 성분의 활성을 저해시킬 수 없어야 하는 것을 제외하면, 다른 성분의 성질에 대한 제한은 없다. 적합한 비히클의 예로는 정제된 콜라겐이 있거나 없는 연고, 크림, 젤, 또는 현탁액을 들 수 있다. MASP-2 억제 항체 및 폴리펩타이드는 또한 경피 패치, 플라스터, 및 붕대에, 바람직하게는 액체 또는 반고체 형태로 함침될 수 있다.
본 발명의 조성물은 원하는 수준의 치료 효과를 유지하기 위해 결정된 간격으로 주기적 토대로 전신적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 예컨대 피하 주사에 의해 2주 내지 4주마다 또는 더 적은 빈도의 간격으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 작용제의 조합의 작용에 영향을 줄 수 있는 다양한 요인을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이다. 이들 요인에는 치료되는 병태의 진행 정도, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 다른 임상적 요인이 포함될 것이다. 각각의 개별 작용제에 대한 투여량은 조성물에 포함되는 MASP-2 억제제의 기능, 뿐만 아니라 임의의 약물 전달 비히클(예컨대, 지속적 방출 전달 비히클)의 존재 및 성질에 따라 달라질 것이다. 더불어, 투여량은 투여 빈도의 변동 및 전달된 작용제(들)의 약동학적 거동을 고려하여 조정될 수 있다.
국소 전달
본원에서 사용되는 바, 용어 "국소"는 의도된 국지화된 작용 부위에 또는 주변에 약물의 적용을 포함하며, 예를 들어 피부 또는 다른 영향을 받은 조직에의 국소 전달, 안과적 전달, 척수강내(IT), 관절내, 체강내, 두개내 또는 소포내 투여, 배치 또는 관주를 포함할 수 있다. 국소 투여는 저용량의 투여를 가능하게 하기 위해, 전신적 부작용을 피하기 위해, 그리고 국소 전달 부위에서 활성제의 전달 타이밍 및 농도의 보다 정확한 제어를 위해 바람직할 수 있다. 국소 투여는 대사, 혈류, 등의 환자간 가변성에 관계 없이, 표적 부위에서 공지의 농도를 제공한다. 직접 전달 방식에 의해 또한 개선된 투여량 제어가 제공된다.
MASP-2 억제제의 국소 전달은 예를 들어 수술과 같은 절차 동안과 같이 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 외과적 방법의 맥락에서 이루어질 수 있다.
치료 요법
예방적 적용에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2 억제 소분자 화합물)를 포함하는 제약학적 조성물은 코로나바이러스 유도 급성 호흡기 장애 증후군 또는 인플루엔자 바이러스 유도 급성 호흡기 장애 증후군에 민감한, 또는 그렇지 않으면 발병의 위험이 있는 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하고 그로써 호흡기 증후군의 증상을 감소, 제거 또는 발병의 위험을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다. 예방적 및 치료 요법 모두에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성되었을 때까지 여러 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 섬유증 및/또는 염증과 관련된 급성 병태의 치료를 위해 조성물의 단일 투여에 의해, 또는 제안된 순서의 투여에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 섬유증 및/또는 염증과 관련된 만성 병태의 치료를 위해 연장된 기간 동안 주기적 간격으로 투여될 수 있다.
예방적 및 치료 요법 모두에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성되었을 때까지 여러 투여량으로 투여될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체를 포함하며, 성인 환자(예컨대, 평균 체중 70 kg)에게 0.1 mg 내지 10,000 mg, 보다 적합하게는 1.0 mg 내지 5,000 mg, 보다 적합하게는 10.0 mg 내지 2,000 mg, 보다 적합하게는 10.0 mg 내지 1,000 mg 및 보다 더 적합하게는 50.0 mg 내지 500 mg의 투여량으로 적합하게 투여될 수 있다. 소아 환자의 경우, 투여량은 환자 체중에 비례하여 조정될 수 있다. 본 발명의 MASP-2 억제 조성물의 적용은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애을 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 대상체의 치료를 위해, 조성물의 단일 투여에 의해, 또는 제한된 순서의 투여에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 섬유증 및/또는 염증에 의해 유발된 또는 악화된 질환 또는 장애을 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 연장된 기간 동안 매일, 격일로, 주마다, 격주로, 매월 또는 2개월마다와 같이 주기적인 간격으로 투여될 수 있다.
예방적 및 치료 요법 모두에서, MASP-2 억제제를 포함하는 조성물은 대상체에서 충분한 치료 결과가 달성되었을 때까지 여러 투여량으로 투여될 수 있다.
VI. 중증 COVID-19에 대한 바이오마커로서 MASP-2/C1-INH 복합체의 사용
또 다른 측면으로, 개시는 MASP-2 매개 렉틴 경로 활성화에 대한 바이오마커, 즉 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체, COVID-19 감염과 관련된 급성 질환의 존재 또는 발병 위험, 하나 이상의 COVID-19와 관련된 장기 후유증 감염의 존재 또는 발병 위험, 및/또는 보체 억제제로의 COVID-19 감염의 임상적으로 의미있는 치료와 관련된 존재 및/또는 농도의 변화를 제공한다. 또한 생물학적 유체, 예컨대 COVID-19로 감염된 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체 중의 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도를 질문하기 위한 조성물, 키트 및 방법이 제공된다. 조성물 및 방법은, 무엇보다도, COVID-19와 관련된 급성 질환의 발병 위험을 평가하고, COVID-19 및/또는 COVID-19 유도 장기 후유증을 진단하고, COVID-19 관련 질환의 진행 또는 감소를 모니터링하고/거나, 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제로의 치료에 대한 반응을 모니터링하거나, 또는 그러한 치료를 최적화하기 위해 유용하다.
본원의 실시예 25 내지 30에서 기술되는 것과 같이, 렉틴 경로(LP) 이펙터 효소 인간 MASP-2(서열 번호:6으로서 제시됨)의 활성화 상태를 결정하기 위하여, MASP-2가 활성화된 후에 유사 기질로서 작용하는 인간 C1 억제제(C1-INH)(서열 번호:86으로서 제시됨)가 공유 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체를 형성한다는 사실의 장점을 취하는 특징이 활용되었다. 그러므로, 혈장 또는 혈청 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 최근 LP 활성화의 명확한 척도를 제공한다.
실시예 25 내지 30에서 기술되는 것과 같이, 발명자들은 혈액(예컨대, 혈청 및/또는 혈장) 중의 MASP-2/C1-INH의 농도가 중증 COVID-19 환자에서 비정상적으로 높고 또한 이전에 COVID-19로 감염되고 장기 후유증을 앓고 있는 대상체에서도 높은 것을 관찰하였다. 발명자들은 또한, 회복 후에, MASP-2/C1-INH 복합체의 농도가 대부분의 경우 정상 수준으로 감소하는 것을 관찰하였다. 실시예 29 및 30에서 추가로 기술되는 것과 같이, 발명자들은 급성 COVID-19를 앓고 있는 대상체가 나르소플리맙으로의 치료 전에 높은 수준의 MASP-2/C1-INH를 가졌고 나르소플리맙으로의 치료 후 급속이 감소된 것으로 결정하였다. 발명자들은 SARS-CoV-2로 감염된 환자를 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도 증가에 대해 모니터링하는 것이 환자를 급성 COVID-19를 가졌거나, 또는 발병의 위험이 있는 것으로 진단하는데 유용하며, 또한 대상체를 급성 COVID-19 이후(또한 장기 COVID-19로도 언급됨)를 가졌거나, 또는 발병의 위험이 있는 것으로 진단하고 선택적으로 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제로 그러한 위험을 가진 것으로 확인된 대상체를 치료하는데 유용한 것으로 여긴다. MASP-2/C1-INH 복합체의 상태를 모니터링하는 것은 또한 COVID-19 환자가 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제로의 치료법에 반응하는지의 여부를 결정하고, 선택적으로 MASP-2/C1-INH의 수준을 정상 범위로 가져오기 위해 필요에 따라 MASP-2 억제제의 투여량을 조정하는데 유용할 수 있다.
전술한 설명에 따르면, 한 구체예에서, 본 개시는, 무엇보다도, MASP-2 매개 렉틴 경로 활성화에 대한 바이오마커로서 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 측정하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공하며, 생물학적 유체에서 그것의 농도는 SARS-Cov2로의 감염과 관련된 급성 COVID-19 질환으로 영향을 받은 환자 및/또는 이전에 SARS-Cov2로 감염되고 장기 COVID-19 후유증을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체에서 비정상적으로 상승된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 MASP-2에 특이적으로 결합하고 C1-INH와의 복합체(또한 MASP-2/C1-INH 복합체로도 언급됨)에서 MASP-2에 결합할 수 있는 단클론성 항체(mAb C#7 또는 mAb C#8), 및 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 검출하는 방법에서 이 항체의 용도에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 선택적으로 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체(예컨대, 나르소플리맙)로의 치료 전 및 후에 렉틴 경로의 활성화 상태를 결정하기 위해 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로의 감염을 앓고 있거나 또는 감염의 위험이 있는 포유류 대상체에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 측정하기 위해 MASP-2 특이적 단클론성 항체 및 C1-INH 특이적 항체의 사용을 포함하는 면역검정에 관한 것이며, 여기서 MASP-2 억제 항체는 렉틴 경로를 억제할 수 있다.
한 구체예에서, MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양은 SARS-CoV-2로 감염된 대상체에서 중증 COVID-19 또는 장기 COVID-19의 존재 또는 발병의 위험을 결정하기 위한 바이오마커로서 유용하며, 정상의 감염되지 않은 대상체 또는 대상체의 모음, 또는 한계값과 비교하여 대상체에서 MASP-2/C1-INH의 더 높은 수준은 대상체가 중증 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 중증 COVID-19의 발병 위험이 더 높거나, 또는 장기 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 장기 COVID-19의 발병 위험이 더 높은 것을 나타낸다. 일부 구체예에서, 방법은 보체 억제제를 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 것으로 결정된 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제(예컨대, 나르소플리맙과 같은 MASP-2 억제 항체)의 효능을 결정하고/거나 대상체에서, 보체 억제제로의 치료가 진행되고 있는 대상체에서 투약을 모니터링하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체는 코로나바이러스, 예컨대 COVID-19 또는 인플루엔자 바이러스 또는 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애(예컨대, HSCT-TMA, IgAN, GvHD 또는 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애)를 앓고 있다.
A. 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하기 위한 고도로 민감한 ELISA 검정 및 비드 기반 검정에서 사용하기 위한 항-MASP-2 단클론성 항체
본원의 실시예 25 내지 30에서 기술되는 것과 같이, 발명자들은 본원에서 기술된 MASP-2/C1-INH 복합체에 대한 검출 검정 및 방법에서 사용하기에 적합한 항-MASP-2 항체 mAb 클론 #C7 및 #C8을 생성하였다.
실시예 25 및 26에서 기술되는 것과 같이, mAb 클론 #C7 및 mAb 클론 #C8의 가변 중쇄 및 경쇄 단편이 클로닝되고 서열분석되었다.
항-MASP-2 mAb 클론 #C7 및 클론 #C8의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 아래에서 제공된다.
서열 번호:87: mAb 클론 #C7 HC 가변 영역
서열 번호:88: mAb 클론 #C7 LC 가변 영역
서열 번호:97: mAb 클론 #C8 HC 가변 영역
서열 번호:98: mAb 클론 #C8 LC 가변 영역
따라서, 한 측면으로, 본 발명은 C1-INH와 복합체를 형성하면서 MASP-2에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR-2 및 HC-CDR3 및 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역 서열에 LC-CDR1, LC-CDR-2, LC-CDR-3 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR-2 및 HC-CDR3 및 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역 서열에 LC-CDR1, LC-CDR-2, LC-CDR-3을 포함한다. 한 구체예에서, 분리된 항체는 서열 번호:89를 포함하는 HC-CDR-1, 서열 번호:90을 포함하는 HC-CDR2 및 서열 번호:91을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:92를 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호:83을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호:94를 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서 항-MASP-2 항체는 인간화된, 키메라 또는 완전히 인간 항체이다. 한 구체예에서 항-MASP-2 항체 단편은 Fv, Fab, Fab', F(ab)2 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 단일 사슬 분자이다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 IgG1, IgG2 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG 분자이다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 본원에서 추가로 기술되는 면역검정에 사용하기에 적합한 검출 가능한 모이어티, 예를 들어 검출 가능한 모이어티로 표지화된다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 기질, 예컨대 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 면역검정에 사용하기에 적합한 기질 상에 고정된다.
한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편(즉, C1-INH와의 복합체의 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편)은 서열 번호:87을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3 및 서열 번호:88을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편(즉, C1-INH와의 복합체의 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편)은 서열 번호:97을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3 및 서열 번호:98을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 다음의 6개의 CDR을 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 아미노산 서열 서열 번호:89를 포함하는 HC-CDR1; (b) 아미노산 서열 서열 번호:90을 포함하는 HC-CDR2, (c) 아미노산 서열 서열 번호:91을 포함하는 HC-CDR3; (d) 아미노산 서열 서열 번호:92를 포함하는 LC-CDR1; (e) 아미노산 서열 서열 번호:93을 포함하는 LC-CDR2 및 (f) 아미노산 서열 서열 번호:94를 포함하는 LC-CDR3.
한 구체예에서 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:87 또는 서열 번호:97의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성(예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2-특이적 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:88의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성(예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:87을 포함하는 VH 및 서열 번호:88 또는 서열 번호:98을 포함하는 VL을 포함한다.
한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 다음의 6개의 CDR을 포함하는 결합 도메인을 포함한다: (a) 서열 번호:89를 포함하는 HC-CDR1, (b) 서열 번호:90을 포함하는 HC-CDR2; (c) 서열 번호: 91을 포함하는 HC-CDR3; (d) 서열 번호:92를 포함하는 LC-CDR1, (e) 서열 번호:93을 포함하는 LC-CDR2 및 (f) 서열 번호:94를 포함하는 LC-CDR3. 한 구체예에서 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:87의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성(예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:88의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성(예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성)을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:87을 포함하는 VH 및 서열 번호:88을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시는 C1-INH와 복합체를 이루는 동안 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 핵산을 제공하며, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:95로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 또 다른 구체예에서, 본 개시는 C1-INH와 복합체를 이루는 동안 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항-MASP-2 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 핵산을 제공하며, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:96으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
또 다른 구체예에서, 본 개시는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공하며, (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호:87로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:88로서 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (b) 중쇄 가변 영역은 서열 번호:97로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:98로서 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
또 다른 구체예에서, 본 개시는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)을 암호화하는 핵산을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 함유하는 세포를 제공하며, (a) 중쇄 가변 영역은 서열 번호:87로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호 NO:88로서 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 (b) 중쇄 가변 영역은 서열 번호:97로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고 및 경쇄 가변 영역은 서열 번호 NO:98로서 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
또 다른 구체예에서, 본 개시는 본원에 개시된 MASP-2 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 다를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 함유하는 세포를 배양하는 단계를 VHG마하는 항-MASP-2 항체의 제조 방법을 제공한다. 세포 또는 세포의 배양물은 핵산에 의해 암호화된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 세포(또는 세포 배양물)에 의한 발현을 허용하기에 충분한 조건 하에서 충분한 시간 동안 배양된다. 방법에는 또한 세포(또는 세포 배양물)로부터 또는 세포 또는 세포들이 배양되는 배지로부터 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 분리하는 단계가 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 본 개시는 본원에 개시된 항-MASP-2 항체, 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 본 개시는 본원에 개시된 항-MASP-2 항체, 또는 항원 결합 단편 중 적어도 하나 이상을 포함하는 면역검정에 사용하기 위한 기질을 제공한다.
한 구체예에서, 본 개시는 테스트 샘플, 예컨대 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 (a) 적어도 하나의 용기, 및 (b) 본원에 개시된 임의의 MASP-2 항체, 또는 항원 결합 단편 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR-2 및 HC-CDR3 및 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR-2, LC-CDR-3을 포함하거나, 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR-2 및 HC-CDR3 및 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR-2, LC-CDR-3을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 항-MASP-2 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 다음의 6개의 CDR을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 항-MASP-2 항체를 포함한다: (a) 서열 번호:89를 포함하는 HC-CDR1, (b) 서열 번호:90을 포함하는 HC-CDR2; (c) 서열 번호: 91을 포함하는 HC-CDR3; (d) 서열 번호:92를 포함하는 LC-CDR1, (e) 서열 번호:93을 포함하는 LC-CDR2 및 (f) 서열 번호:94를 포함하는 LC-CDR3. 일부 구체예에서, 키트는 C1-INH에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체를 추가로 포함한다.
검출 가능한 모이어티로 표지된 항-MASP-2 항체
또 다른 측면으로, 발명은 검출 가능한 모이어티(즉, 검출 및/또는 정량화를 허용하는 모이어티)로 표지된 항-MASP-2 항체(예컨대, mAb 클론 #C7 또는 mAb 클론 #C8)를 제공한다. 다양한 구체예에서, 본원에 기술된 항체는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 검출 가능한 표지에 콘쥬게이션된다. 이와 관련하여, 항체 "콘쥬게이트"는 검출 가능한 표지에 공유 연결된 항-MASP-2 항체를 지칭한다. 본 발명에서, 단클론성 항체, 그것의 항원 결합 단편, 및 그것의 항체 유도체, 예컨대 단일 사슬-가변성-단편 항체 또는 에피토프 태그된 항체는 모두 검출 가능한 표지에 공유 연결될 수 있다. "직접 검출"에서, 단지 나의 검출 가능한 항체, 즉, 일차 검출 가능한 항체가 사용된다. 그러므로, 직접 검출은 검출 가능한 표지에 콘쥬게이션된 항체가, 제2 항체(이차 항체)의 첨가에 대한 필요성 없이 그대로 검출될 수 있는 것을 의미한다.
"검출 가능한 표지"는 샘플 중의 표지의 존재 및/또는 농도를 나타내는 검출 가능한(예컨대 시각적으로, 전자적으로 또는 다르게) 신호를 생성할 수 있는 분자 또는 물질이다. 항체에 콘쥬게이션될 때, 검출 가능한 표지는 특이적 항체가 지시되는 표적을 찾아내고/거나 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 그로써, 샘플 중의 표적의 존재 및/또는 농도는 검출 가능한 표지에 의해 생성된 신호를 검출함으로써 검출될 수 있다. 검출 가능한 표지는 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있고, 상이한 특정 항체에 콘쥬게이션된 여러 상이한 검출 가능한 표지가 하나 이상의 표적을 검출하기 위해 함께 사용될 수 있다.
직접 검출될 수 있는 검출 가능한 표지의 예로는, 형광 염료 및 방사성 물질 및 금속 입자를 들 수 있다. 대조적으로, 간접 검출은 일차 항체의 적용 후, 하나 이상의 추가 항체, 즉, 이차 항체의 적용을 필요로 한다. 그러므로, 검출은 일차 검출 가능한 항체에 대한 이차 항체 또는 결합제의 결합의 검출에 의해 수행된다. 이차 결합제 또는 항체의 첨가를 필요로 하는 일차 검출 가능한 결합제 또는 항체의 예로는 효소적 검출 가능한 결합제 및 합텐 검출 가능한 결합제 또는 항체를 들 수 있다.
본 개시의 항체에 콘쥬게이션될 수 있는 검출 가능한 표지의 예로는 형광 표지, 효소 표지, 방사성 동위원소, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 생물발광 표지, 중합체, 중합체 입자, 금속 입자, 합텐, 및 염료를 들 수 있다.
형광 표지의 예로는 5-(및 6)-카르복시플루오레세인, 5- 또는 6-카르복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-(및 6)-카르복시아미도 헥산산, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸로다민, 및 Cy2, Cy3, 및 Cy5와 같은 염료, AMCA를 포함하는 선택적으로 치환된 쿠마린, PerCP, R-피코에리트린(RPE) 및 알로피코에리트린(APC)을 포함하는 피코빌리단백질, 텍사스 레드, 프린세톤 레드, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 그것의 유사체, 및 R-피코에리트린 또는 알로피코에리트린의 콘쥬게이트, 코팅된 CdSe 나노결정과 같이 반도체 물질을 기반으로 한 입자와 같은 무기 형광 표지를 들 수 있다.
중합체 입자 표지의 예로는 폴리스티렌의 마이크로 입자 또는 라텍스 입자, 형광 염료에 포매될 수 있는 PMMA 또는 실리카, 또는 염료, 효소 또는 기질을 함유하는 중합체 미셸 또는 캡슐을 들 수 있다.
금속 입자의 예로는 은 염색에 의해 전환될 수 있는 금 입자 및 코팅된 금 입자를 들 수 있다. 합텐의 예로는 DNP, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 비오틴, 및 디곡시게닌을 들 수 있다. 효소적 표지의 예로는 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리성 포스파타제(ALP 또는 AP), β-갈락토시다제(GAL), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, β-N-아세틸글루코사미니다제, β-글루쿠로니다제, 전환효소, 크산틴 산화효소, 반딧불 루시페라제 및 글루코스 산화효소(GO)를 들 수 있다. 양고추냉이 과산화효소에 대해 일반적으로 사용되는 기질의 예로는 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB), 니켈 강화된 다이아미노벤지딘, 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC), 벤지딘 2염산염(BDHC), 행커-예이츠(Hanker-Yates) 시약(HYR), 인도판 블루(IB), 테트라메틸벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(CN), .알파.-나프톨 피로닌(.알파.-NP), o-다이아니시딘(OD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), 2-(p-요오도페닐)-3-p-니트로페닐-5-페닐 테트라졸륨 클로라이드(INT), 테트라니트로 블루 테트라졸륨(TNBT), 5-브로모-4-클로로-3-인독실-베타-D-갈락토시드/페로-페리시안화물(BCIG/FF)을 들 수 있다.
알칼리성 포스파타제에 대해 일반적으로 사용되는 기질의 예로는 나프톨-AS-B 1-포스페이트/패스트 레드 TR(NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR(NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/- 패스트 레드 TR(NABP/FR), 나프톨-AS-MX-포스페이트/패스트 레드 TR(NAMP/FR), 나프톨-AS-B1-포스페이트/뉴 푹신(NABP/NF), 브로모클로로인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨(BCIP/NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-d-갈락토피라노시드(BCIG)를 들 수 있다.
발광 표지의 예로는 루미놀, 아이소루미놀, 아크리디늄 에스테르, 1,2-다이옥세탄 및 피리도피리다진을 들 수 있다. 전기화학발광 표지의 예로는 루테늄 유도체를 들 수 있다. 방사성 표지의 예로는 요오드, 코발트, 셀레늄, 삼중 수소, 탄소, 황 및 인의 방사성 동위원소를 들 수 있다.
검출 가능한 표지는 본원에서 기술된 항체(즉, 항-MASP-2 항체 또는 항-C1-INH 항체 중 임의의 것)에 또는 관심의 생물학적 마커에 특이적으로 결합하는 임의의 다른 분자, 예컨대, 항체, 핵산 프로브, 또는 중합체에 결합될 수 있다. 나아가, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 검출 가능한 표지가 또한 제2, 및/또는 제3, 및/또는 제4, 및/또는 제5 결합제 또는 항체, 등에 콘쥬게이션될 수 있음을 인정할 것이다. 더욱이, 통상적인 지식을 가진 사람은 관심의 생물학적 마커를 특성화하기 위해 사용된 각각의 추가 결합제 또는 항체가 신호 증폭 단계로서 작용할 수 있음을 인정할 것이다. 생물학적 마커는 예컨대, 검출 가능한 물질이 예를 들어 염료, 콜로이드 금 입자, 발광 시약인 광 현미경검사, 형광 현미경검사, 전자 현미경검사를 사용하여 시각적으로 검출될 수 있다. 생물학적 마커에 결합된 시각적으로 검출 가능한 물질은 또한 분광계를 사용하여 검출될 수 있다. 검출 가능한 물질이 방사성 동위원소인 경우에 검출은 자동방사선사진에 의해 시각적이거나, 또는 신틸레이션 카운터를 사용하여 비시각적일 수 있다. 예컨대, 문헌[Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice,(CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound(ed.)(Humana Press, Totowa, N.J.)] 참고.
또 다른 구체예에서, 항-MASP-2 항체(예컨대, mAb 클론 #C7, mAb 클론 #C8 또는 항-C1-INH 항체)는 표지되지 않고(즉, 네이키드임), 그것의 존재는 항-MASP-2 항체 또는 항-C1-INH 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
B. 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하기 위한 조성물 및 키트
조성물
또 다른 측면으로, 본 개시는 기질, 예컨대 본원에 개시된 고정된(또는 다르게는 침착된) 단클론성 항-MASP-2 항체(예컨대 C1-INH와의 복합체에서 MASP-2에 결합하는 항-MASP-2 항체, 예컨대 mAb 클론 #C7 또는 mAb 클론 #C8)를 포함하는 고체 지지체(예컨대, 불용성 기질, 예컨대 비수성 매트릭스, 예컨대 유리, 다당류(예컨대, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 플라스틱 또는 금속, 중합체 코팅 비드, 튜브, 또는 세라믹 또는 금속 칩으로 만들어진 플레이트 또는 슬라이드)를 제공한다. 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 별개의 위치(예컨대, 다중웰 플레이트의 웰에, 또는 바이오칩 상에서 어레이에 침착됨)에서 고정(또는 침착)된다. 일부 구체예에서, 항-MASP-2 항체를 포함하는 기질은 포유류 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하기 위한 키트의 일부일 수 있다.
키트
또 다른 측면으로, 본 개시는 본원에 개시된 하나 이상의 검정을 수행하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
한 구체예에서, 본 개시는 테스트 샘플, 예컨대 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 검출하기 위한 시약 및 지침을 가진 키트(즉, 미리 결정된 양의 시약의 포장된 조합)를 제공한다. 예시의 키트는 본원에 기술된 적어도 하나의 항-MASP-2 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편(즉, mAb 클론 #C7 또는 mA 클론 #C8) 및 적어도 하나의 항-C1-INH 항체를 함유할 수 있다. 항-MASP-2 항체 또는 항-C1-INH 항체가 검출 가능한 모이어티, 예컨대 효소로 표지되는 경우에, 키트에는 효소가 필요로 하는 기질 및 보조인자(예컨대, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)가 포함될 것이다. 더불어, 안정화제, 완충제(예컨대, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 검정의 민감도를 실질적으로 최적화하는, 시약 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 달라질 수 있다. 특히, 시약은 용해시 적절한 농도를 가지는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하여, 일반적으로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있다.
더불어, 키트에는 본 발명의 항체의 사용 수단(예컨대, MASP-2/C1-INH 복합체, 또는 그것의 부재의 검출을 위한)을 개시하는 지침 자료가 포함될 수 있다. 예를 들어, 키트는 추가적으로 표지(예컨대, 효소적 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지, 양 항-마우스-HRP 등과 같은 적절한 이차 표지를 검출하기 위한 필터 세트)를 검출하는 수단을 함유할 수 있다. 키트에는 추가적으로, 기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이 특정 면역검정의 실시를 위해 일상적으로 사용되는 완충제 및 다른 시약이 포함될 수 있다.
특정 구체예는 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 존재 또는 양을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 본원에서 기술된 적어도 하나의 항-MASP-2 항체, 예컨대 표 5에 제시된 클론 #C7로부터의 CDR을 포함하는 항체 또는 단편 또는 클론 #C8로부터의 CDR을 포함하는 항체 또는 그것의 단편을 함유한다. 특정 구체예에서, 키트는 완충제, 효소, 표지, 기질, 비드 또는 발명의 항체가 부착되는 다른 표면, 등, 및 사용 지침을 포함할 수 있다.
특정 구체예는 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 존재 또는 양을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 본원에 기술된 적어도 하나의 항-MASP-2 항체, 예컨대 표 5에 제시된 MASP-2 특이적 클론 mAb #C7로부터의 CDR을 포함하는 항체 또는 단편 또는 클론 #C8로부터의 CDR을 포함하는 항체 또는 그것의 단편을 함유한다. 대상체 항-MASP-2 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 임의의 적절한 검출 가능한 모이어티로 표지화될 수 있다. 특정 구체예에서, 키트는 완충제, 효소, 표지, 기질, 비드 또는 발명의 항체가 부착되는 다른 표면, 등, 및 사용 지침을 포함할 수 있다.
키트의 항목은 개별 포장되거나 더 큰 용기(예컨대, 골판지 또는 스티로폼 박스)에 함께 제공되는 개별 용기에 포장될 수 있다.
전술한 설명에 따르면, 한 구체예에서, 본 개시는 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 측정하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 면역검정에서 MASP-2에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 단클론성 항체 및 선택적으로 C1-INH에 특이적으로 결합하는 항-C1-INH 특이적 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2-특이적 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:87을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR-1, HC-CDR-2 및 HC-CDR-3을 포함하고 서열 번호:88을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR-1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 한 구체예에서, MASP-2-특이적 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:97을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR-1, HC-CDR-2 및 HC-CDR-3을 포함하고 서열 번호:98을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR-1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
일부 구체예에서, 키트는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 키트는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 수행하기 위한 것이다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 코팅 항체이다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 검출 항체이다. 한 구체예에서, C1-INH-특이적 항체 또는 그것의 단편은 코팅 항체이다. 한 구체예에서, C1-INH-특이적 항체 또는 그것의 단편은 검출 항체이다. 한 구체예에서, 항-MASP-2 항체는 코팅/포획 항체이고 (a) 서열 번호:87을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR-1, HC-CDR-2 및 HC-CDR-3을 포함하고 서열 번호:88을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR-1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하거나 또는 (b) 서열 번호:97을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR-1, HC-CDR-2 및 HC-CDR-3을 포함하고 서열 번호:98을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR-1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되고 기질, 예컨대 고체 지지체(예컨대, 불용성 기질, 예컨대 비수성 매트릭스, 예컨대 유리, 다당류(예컨대, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 플라스틱 또는 금속, 중합체 코팅 비드, 튜브, 또는 세라믹 또는 금속 칩으로 만들어진 플레이트 또는 슬라이드) 상에 고정된다.
일부 구체예에서, 키트는 면역형광 검정, 예컨대 Luminex 검정을 수행하기 위한 것이며 (i) 인간 혈청 또는 혈장으로부터 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획하기에 적합한 비드(예컨대 폴리스티렌 미소구체, 또는 자성 폴리스티렌 미소구체) 상에 고정된 적어도 하나의 항-MASP-2 항체, 예컨대 mAb #C7 또는 mAb #C8을 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 (ii) 포획된 복합체를 검출하기 위한 검출 항체로서 사용하기 위한 적어도 하나의 항-C1-INH 항체를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 키트는 (iii) 인간 혈청 또는 혈장으로부터 C1s/C1-INH 복합체를 포획하기에 적합한 항-C1s 항체를 추가로 포함한다.
발명의 키트의 다양한 구체예에서, 대상체 항체 및 그것의 항원 결합 단편은 본원에 기술된 임의의 적절한 검출 가능한 모이어티로 표지화될 수 있다. 특정 구체예에서, 키트는 완충제, 효소, 표지, 기질, 비드(예컨대 폴리스티렌 미소구체 또는 자성 폴리스티렌 미소구체) 또는 발명의 항체가 부착되는 다른 표면, 등, 및 사용 지침을 추가로 포함한다.
C. 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하는 방법
본원에서 기술되는 것과 같이, 발명자들은 생물학적 샘플, 예컨대 포유류 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 존재 및/또는 양을 검출하기 위한 면역검정에 사용하기에 적합한 항-MASP-2 항체를 생성하였다.
한 측면으로, 본 발명의 항-MASP-2 항체(예컨대, mAb 클론 #C7 또는 mAb 클론 #C8)는 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양에 대해 테스트 샘플, 예컨대 테스트 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플을 분석하기 위한 시험관내 면역검정에서 사용된다. 그러한 시험관내 면역검정에서, 항-MASP-2 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편은 본원에서 기술된 것과 같이, 네이키드이거나 검출 가능한 모이어티로 표지화될 수 있고, 아래에서 기술되는 것과 같이, 액상으로 활용되거나 또는 기질에 결합될 수 있다. 시험관내 검정의 목적에 대해, 고려해야 할 숙주 면역 반응이 없기 때문에, 쥐과, 키메라, 인간화된 또는 인간과 같은 임의의 유형의 항체가 활용될 수 있다.
본 개시의 항체는 임의의 알려져 있는 면역검정 방법, 예컨대 경합 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 측면류 검정(예컨대, 딥스틱 형식), 비드 기반 검정 및 면역침전 검정에 사용될 수 있다(예컨대, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press. Inc., 1987 참고).
샌드위치 검정은 각각이 검출될 MASP-2/C1-INH 복합체의 상이한 면역원성 부분에 결합할 수 있는 두 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 검정에서, 테스트 샘플 분석물은 고체 지지체(예컨대, 기질) 상에 고정된 제1 항체(예컨대, 항-MASP-2 항체, 예컨대 클론 #C7 또는 클론 #C8)에 의해 결합된 후, 제2 항체가 C1-INH에 결합함으로써, 불용성 3-부분 복합체를 형성한다. 제2 항체는 검출 가능한 모이어티로 자체 표지화되거나(직접 샌드위치 검정) 또는 검출 가능한 모이어티로 표지화된 항-면역글로불린 항체를 사용하여 측정될 수 있다(간접 샌드위치 검정).
예를 들어, 한 가지 바람직한 유형의 샌드위치 검정은 ELISA 검정이며, 이 경우 검출 가능한 모이어티는 효소이다. ELISA 검정은, 사용된 검출 시스템과 관계 없이, 일반적으로 항원 또는 항체의 기질(예컨대, 고체 지지체)에 대한 고정뿐만 아니라, 적절한 검출 시약의 사용을 포함한다. ELISA 검정에서, 단백질 항원-항체 반응은 기질(예컨대, 고체 지지체) 상에서, 전형적으로 미세역가 플레이트 상의 웰에서 일어난다. 항원 및 코팅 또는 포획 항체로도 불리는, 이 제1 항체는 반응하여 안정적인 복합체를 생성하고, 이것은 효소에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있는, 검출 항체로 불리는 제2 항체의 첨가에 의해 시각화될 수 있다. 그 효소에 대한 기질의 첨가는 광학적으로 측정될 수 있는 색 형성을 초래한다.
한 구체예에서, 발명의 항-MASP-2 항체(예컨대, 클론 #C7 또는 클론 #C8)는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재를 검출하기 위해 코팅/포획 항체로서 사용된다(예컨대, Gold et al. J Clin Oncol. 24:252-58, 2006 참고).
직접 경합 ELISA에서, 순수한 또는 반순수한 항원 조제물은 테스트되는 유체 또는 세포 추출물에서 불용성인 기질에 결합되고 기질 결합 항원과 표지된 항체 사이에 형성된 이원 복합체의 검출 및/또는 정량화를 허용하기 위해 검출 가능하게 표지된 가용성 항체의 양이 첨가된다.
대조적으로, "2 부위 ELISA" 또는 "샌드위치 검정"으로도 알려져 있는 "이중 결정기" ELISA는 소량의 항원을 필요로 하며 검정은 항원의 광범위한 정제를 필요로 하지 않는다. 그러므로, 이중 결정기 ELISA는 임상 샘플 중의 항원의 검출을 위한 직접 경합 ELISA보다 바람직하다. 예를 들어, 생검 표본에서 c-myc 종양 단백질의 정량화를 위한 이중 결정기 ELISA의 사용을 참고한다. [Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989); Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989)]. 이중 결정기 ELISA에서, 미표지 단클론성 항체 또는 항체 단편("포획 항체")의 양이 기질(예컨대, 고체 지지체)에 결합되며, 테스트 샘플은 포획 항체와 접촉하게 되고, 검출 가능하게 표지된 가용성 항체(또는 단편)의 양이 첨가되어 포획 항체, 항원, 및 표지된 항체 사이에 형성된 삼원 복합체의 검출 및/또는 정량화가 허용된다.
한 구체예에서, 기질(예컨대, 고체 지지체)에 결합된 포획 항체는 C1-INH와의 복합체에서 MASP-2에 결합하는 본원에 개시된 항-MASP-2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다. 한 구체예에서, 기질(예컨대, 고체 지지체)에 결합된 포획 항체는 본원에 개시된 MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다.
이중 결정기 ELISA를 수행하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989); Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989); 및 Moore et al., 방법 in Molecular Biology Vol 10:273-281 (The Humana Press, Inc. 1992)]을 참고한다.
이중 결정기 ELISA에서, 가용성 항체 또는 항체 단편은 포획 항체에 의해 인식된 에피토프와 구별되는 MASP-2/C1-INH 복합체 상의 에피토프에 결합하여야 한다. 이중 결정기 ELISA는 MASP-2/C1-INH 복합체가 테스트 생물학적 샘플, 예컨대 체액(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청) 또는 생검 샘플에 존재하는지의 여부를 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 검정은 체액의 임상 샘플에 존재하는 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 정량화하기 위하여 수행될 수 있다. 정량 검정은 MASP-2/C1-INH 복합체의 희석을 포함함으로써 수행될 수 있다.
적어도 하나의 MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 기질(예컨대, 고상 담체)에 결합되는 시험관내 면역검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, MASP-2 특이적 단클론성 항체 또는 그것의 단편은 중합체 코팅 비드, 플레이트, 튜브, 또는 세라믹 또는 금속 칩과 같은 불용성 기질에 단클론성 항체를 연결하기 위하여 중합체, 예컨대 아미노덱스트란에 부착될 수 있다. 한 구체예에서, 기질은 ELISA 방법에 사용하기에 적합하다(예컨대, 다중웰 미세역가 플레이트). 한 구체예에서, 기질은 비드 기반 면역형광 검정, 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 Luminex 검정에 사용하기 위한 비드(예컨대, 폴리스티렌 미소구체 또는 자성 폴리스티렌 미소구체)이다. 일부 구체예에서, 개시는 MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 한 세트의 비드에 결합되고 C1s 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 제2 세트의 비드에 결합되는, MASP-2/C1-INH 및 C1s/C1-INH 복합체 모두를 검출하기 위한 면역검정을 제공한다.
다른 적합한 시험관내 검정은 기술분야에 숙련된 사람들에게 쉽게 분명해질 것이다. 검출 가능하게 표지된 항-MASP-2 항체 또는 C1-INH 특이적 항체의 특정 농도, 인큐베이션 온도 및 시간, 뿐만 아니라 다른 검정 조건은 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 농도, 샘플의 성질, 등을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람들은 일상적인 실험을 사용함으로써 각각의 결정에 대한 작동 및 최적 검정을 결정할 수 있을 것이다.
MASP-2/C1-INH 복합체를 검출 및/또는 측정하기 위한 검정
전술한 설명에 따르면, 한 측면으로, 본 발명은 테스트 샘플, 예컨대 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 존재 또는 양을 결정하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 테스트 샘플을 시험관내 면역검정에서 MASP-2 특이적 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; (b) 테스트 샘플을 C1-INH 특이적 항체와 접촉시키는 단계 및 (c) 상기 C1-INH 항체의 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 결합의 존재는 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 나타낸다.
한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:87을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 단편은 표 5에서 제시된 것과 같이, MASP-2 특이적 클론 #C7로부터의 CDR을 포함하는 단클론성 항체이다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:97을 포함하는 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98을 포함하는 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 단계 (c)에 따라 검출된 MASP-2/C1-INH의 양을 참조 표준 또는 대조군 샘플과 비교하여 테스트 샘플 중의 MASP-2/C1-INH의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 대조군 샘플은 렉틴 경로 질환 또는 장애(예컨대, COVID-19, HSCT-TMA, IgAN, GvHD 또는 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애)를 앓고 있는 대상체의 개별 또는 모아진 샘플이다. 한 구체예에서, 대조군 샘플은 정상적인 건강한 지원자의 개별 또는 모아진 샘플이다. 한 구체예에서, 대조군 샘플은 보체 억제제(예컨대, MASP-2 억제제 또는 다른 보체 억제제)로의 치료 전의 대상체의 기준선 샘플이다. 한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 기질 상에 고정된다. 한 구체예에서, 면역검정은 ELISA 검정이다. 한 구체예에서, 면역검정은 Luminex 검정과 같은 비드 기반 검정이다.
한 구체예에서, MASP-2 특이적 항체는 검출 가능한 모이어티로 표지화되며 단계 (b)는 상기 검출 가능한 모이어티의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 네이키드이고(즉, 표지화되지 않음), MASP-2/C1-INH 복합체에 결합된 항체 또는 그것의 단편의 존재 또는 양은 MASP-2 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출된다. 한 구체예에서, 상기 MASP-2 특이적 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 기질 상에 고정되고(즉, 포획/코팅) 결합된 MASP-2/C1-INH 복합체는 본원에서 기술된 것과 같이 C1-INH에 결합하는 제2 항체로 검출된다.
한 구체예에서, 테스트 샘플은 포유류 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플이다. 다양한 구체예에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 양수, 뇌척수액, 세포 용해물, 복수, 소변, 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체 샘플이다. 한 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 일부 구체예에서, 검정 방법 및 키트는 낮은 혈청 농도(즉, 10% 미만 혈청, 예컨대 0.1% 내지 9%, 예컨대 0.5% 내지 8%, 예컨대 1% 내지 5%, 예컨대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 또는 9% 혈청)에서 MASP-2/C1-INH의 존재 및/또는 양을 측정하기에 적합하다.
한 구체예에서, 포유류 대상체(예컨대, 인간)는 SARS-CoV-2로 감염되고 중증 COVID-19 및/또는 장기 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있다.
한 구체예에서, 포유류 대상체(예컨대, 인간)는, 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, 보체 억제제, 예컨대 렉틴 경로 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제(예컨대 MASP-2 억제 항체, 예컨대 나르소플리맙)로 치료되었다.
한 구체예에서, 포유류 대상체(예컨대, 인간)는 렉틴 경로 질환 또는 장애(예컨대, COVID-19, HSCT-TMA, IgAN, GvHD 또는 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애를 앓고 있다.
본원에서 기술되는 것과 같이, 본 개시의 다양한 구체예에 따르는 MASP-2/C1-INH 복합체의 검출 또는 측정 방법은 약력학적 종점 또는 치료 한계값을 정의하기 위하여, 또는 대상체를 보체 억제제, 예컨대 렉틴 경로 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제,(예컨대, MASP-2 억제 항체, 예컨대, 나르소플리맙)으로 치료할 것인지의 여부를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
비록 면역검정의 세부사항은 사용된 특정 형식에 따라 달라질 수 있지만, 한 구체예에서, 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH를 검출하는 방법은 테스트 샘플을 MASP-2에 특이적으로 결합하는 포획 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. MASP-2 항체는 면역학적으로 반응성인 조건 하에서 샘플 중의 MASP-2/C1-INH에 결합되도록 허용되고, 결합된 항체의 존재는 직접 또는 간접적으로 항-C1-INH 항체로 검출된다. MASP-2 특이적 항체는, 예를 들어, MASP-2/C1-INH에 대한 ELISA 또는 비드 기반 검정의 포획 항체로서, 또는 C1-INH에 결합하는 포획 항체에 의해 포획된 MASP-2/C1-INH에 결합하기 위한 제2 항체로서 사용될 수 있다. 기술분야에서 알려져 있는 것과 같이, 제2 항체의 존재는 전형적으로 그런 후에 검출된다. 일부 구체예에서, 면역검정은 고체 지지체 상에서 수행된다. 일부 구체예에서, 면역검정은 ELISA 검정이다. 일부 구체예에서, 면역검정은 비드 기반 검정이다.
D. 급성 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있거나, 또는 장기 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체의 진단, 모니터링 및 치료 방법
발명의 항-MASP-2 항체, 방법, 시약 및 키트는 많은 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본 발명의 검정은 급성 COVID-19(즉, 급성 호흡기 장애 증후군, 폐렴 또는 일부 다른 폐 또는 COVID-19의 다른 급성 징후, 예컨대 혈전증)의 발병 위험, 또는 급성 COVID-19로부터의 회복 가능성, 및/또는 장기 COVID-19의 발병 가능성, 또는 존재(즉, 심혈관 합병증(cardiovascular complication), 신경학적 합병증(neurological complication), 신장 손상, 폐 합병증(pulmonary complication), 카와사키병(Kawasaki disease), 카와사키 유사 질환, 아동의 다기관 염증 증후군(multisystem inflammatory syndrome), 다기관 장기 부전(multi-system organ failure)과 같은 염증 상태, 극심한 피로, 근육 약화, 미열, 집중력 저하, 기억 상실(memory lapse), 기분 변화, 수면 장애, 팔다리의 바늘 통증, 설사 및 구토, 미각 및 후각 상실, 인후염(sore throat) 및 삼키기 어려움, 당뇨병(diabetes) 및 고혈압(고혈압)의 새로운 발병, 피부 발진(skin rash), 숨가쁨(shortness of breath), 흉통(chest pain) 및 심계항진(palpitations)으로 이루어진 군으로부터 선택된 COVID-19 관련 장기 후유증)를 결정하고/거나 보체 경로 억제제, 예컨대 렉틴 경로 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제(예컨대, 나르소플리맙과 같은 MASP-2 억제 항체)가 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 수준에 영향을 미치는 정도를 평가하고 그로써 상기 대상체에서 렉틴 경로 활성화 정도를 평가하기 위하여 SARS-CoV-2로 감염된 대상체에서 MASP-2/C1-INH의 수준을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 검정은 보체 경로 억제제(예컨대, MASP-2 억제제)가 생체내에서 렉틴 보체 경로 활성화를 감소시키는 정도를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 발명의 방법은 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 대해 수행된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 검정으로 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 적합한 참조 값과 비교된다. 참조 값은, 예컨대, 건강한 환자(또는 건강한 환자의 모음)로부터 얻어진 샘플로부터 측정된 값, 또는 중증 COVID-19를 앓고 있는 대상체로부터 얻어진 샘플 또는 샘플 모음으로부터 측정된 값, 또는 MASP-2 억제제로 치료가 진행 중인 COVID-19 환자로부터 얻어진(예컨대, 치료 전에 얻어진 또는 치료 순서 중의 시점에서 얻어진) 샘플로부터 측정된 값이거나, 또는 참조 값은 렉틴 경로를 활성화시키는 작용제로 활성화된 건강한 혈청으로부터 유래될 수 있거나(실시예 25 참고), 또는 참조 값은 미리 결정된 한계값일 수 있다. 한 구체예에서, 대조군 샘플은 급성 COVID-19를 앓고 있는 대상체의 개별적인 또는 모아진 샘플이다. 한 구체예에서, 대조군 샘플은 정상적인 건강한 지원자의 개별적인 또는 모아진 샘플이다. 한 구체예에서, 대조군 샘플은 보체 억제제(예컨대, MASP-2 억제제 또는 다른 보체 억제제)로 치료하기 전 대상체의 기준선 샘플이다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 본 개시의 다양한 구체예에 따르는 MASP-2/C1-INH 복합체 검출 방법은 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 평가하기 위해 사용될 수 있고 그로써 보체 억제제의 약력학적 종점 또는 치료 한계값을 정의하거나 또는 대상체를 보체 억제제, 예컨대 렉틴 경로 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체, 예컨대 나르소플리맙)로 치료할 것인지의 여부를 결정하기 위하여 사용될 수 있다.
E. 포유류 대상체에서 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 평가하는 방법
한 측면으로, 본 개시는 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획하고 검출하는 단계를 포함하는, 테스트 샘플에서 렉틴 경로 보체(APC) 활성화의 정도를 평가하고 면역검정을 수행하는 방법을 제공하며, 테스트 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 테스트 샘플 중의 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 나타낸다. 한 구체예에서, 테스트 샘플은 포유류 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플이고 방법은: (a) 포유류 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 본원에 기술된 발명의 방법을 따라 생물학적 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획하고 복합체의 수준을 검출하는 단계의 적어도 하나를 포함하는 면역검정을 수행함으로써 대상체에서 렉틴 경로 활성화의 정도를 평가하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 면역검정은 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획하고 검출하는 단계를 포함하며, MASP-2/C1-INH 복합체는 MASP-2 특이적 단클론성 항체로 포획되거나 검출된다. 다양한 구체예에서, 방법은 테스트 샘플(예컨대, 생물학적 샘플)에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 미리 결정된 수준 또는 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함하며, 테스트 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 테스트 샘플(예컨대, 생물학적 샘플) 중의 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 나타낸다. 일부 구체예에서, 방법은 비교 분석의 결과를 사용하여 생물학적 샘플이 얻어지는 포유류 대상체와 관련된 진단, 예측 또는 치료 관련 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 테스트 샘플은 현재 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어지고 방법은 상기 대상체가 급성 COVID-19 질환을 발병할 위험을 평가하기 위해 사용되며, 정상적인 건강한 대조군(예컨대, 건강하고 SARS-CoV-2로 감염되지 않은 대상체 또는 대상체 모음) 또는 대조군 참조 표준과 비교하여 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 3배 또는 그 이상의 MASP-2/C1-INH의 상승된 수준은 급성 COVID-19 질환 및/또는 장기 COVID-19 질환의 증가된 발병 위험 또는 급성 COVID-19를 앓고 있는 대상체의 회복 가능성을 나타낸다.
일부 구체예에서, 테스트 샘플은 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어지고 방법은 상기 대상체가 장기 COVID-19 질환을 발병할 위험을 평가하기 위해 사용되며, 정상적인 건강한 대조군과 비교하여 적어도 2배 이상의 MASP-2/C1-INH의 상승된 수준은 장기 COVID-19 질환의 증가된 발병 위험을 나타낸다.
일부 구체예에서, 본 개시는 생체내에서 렉틴 경로 보체 활성화에 미치는 인간 보체의 억제제의 영향을 평가하는 방법을 제공한다. 인간 보체 구성요소 중 임의의 것에 결합하거나 또는 그렇지 않으면 생성 및/또는 활성을 차단하는 임의의 화합물이 본 개시에 따라 활용될 수 있다. 예를 들어, 보체 억제제는, 예컨대, 소분자, 핵산 또는 핵산 유사체, 펩타이드 모방물, 또는 핵산 또는 단백질이 아닌 거대분자, 예컨대 항체, 또는 그것의 단편일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시는 생체내에서 대체 보체 경로 활성화에 미치는 인간 보체 구성요소에 특이적인 억제제(예컨대, 항체 또는 소분자), 예컨대, 예를 들어 C1(C1q, C1r, C1s), C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 인자 D, 인자 B, 인자 P, MBL, MASP-1, MASP-2, 및 MASP-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 보체 구성요소의 억제제의 영향을 평가하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 대체 경로 보체 활성화에 미치는 대체 보체 경로 억제제의 영향을 평가하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 개시는 렉틴 경로 보체 활성화에 미치는 MASP-2의 억제제의 영향을 평가하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 개시는 생체내에서 렉틴 경로 보체 활성화에 미치는, 포유류 대상체에게 투여된 MASP-2 억제제의 영향을 평가하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2의 소분자 억제제)는 포유류 대상체에게 투여되며, 생물학적 샘플이 후속해서 얻어진다. 그런 후 생물학적 샘플 중의 렉틴 경로 보체(LPC) 활성화 정도가, 본원에 기술된 발명의 방법에 따라 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획 및 검출하는 단계를 포함하는 면역검정을 수행함으로써 평가된다.
F. 포유류 대상체에서 MASP-2 억제제의 효능을 모니터링하는 방법
한 구체예에서, 본 개시는 포유류 대상체에서 MASP-2 억제제로의 치료 효능을 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 제1 시점에 MASP-2 억제제(즉 항체 또는 소분자)의 용량을 포유류 대상체에게 투여하는 단계; (b) 단계 (a) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제1 농도를 평가하는 단계; (c) 제2 시점에 대상체를 MASP-2 억제 항체로 치료하는 단계; (d) 단계 (c) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제2 농도를 평가하는 단계; 및 (e) 단계 (b)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 단계 (d)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준과 비교하여 포유류 대상체에서 MASP-2 억제제(항체 또는 소분자)의 효능을 결정하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체에서 렉틴 경로 활성화 정도는 면역검정으로 평가되며, 면역검정은 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 포획 및 검출하는 것을 포함한다. 선택적으로 생물학적 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 적합한 참조 값과 비교된다. 참조 값은, 예컨대, MASP-2 억제 항체의 투여 전에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플로부터 측정된 MASP-2/C1-INH 복합체의 값, 건강한 대조군 대상체 그룹으로부터 얻어진 샘플로부터 측정된 평균 값, 렉틴 경로 활성화의 원하는 정도(예컨대, 렉틴 경로 활성화의 90% 억제, 또는 렉틴 경로 활성화의 80% 억제, 또는 70% 억제, 또는 60% 억제에 상응하는 MASP-2/C1-INH의 수준)를 나타내는 값일 수 있다. 예를 들어, 제1 생물학적 샘플은 MASP-2 억제 항체의 투여 전에 대상체로부터 얻어지고 제2 생물학적 샘플은 MASP-2 억제 항체의 투여 후에 얻어지며 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 샘플에서 측정된다. 만약 제2 생물학적 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준이 제1 생물학적 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준보다 적거나, 또는 대조군 값(예컨대 렉틴 경로 활성화의 퍼센트 억제에 상응하는 한계값)보다 낮다면, MASP-2 억제 항체가 렉틴 경로 활성화를 원하는 정도로 억제하였다고 결론지을 수 있다. 대안적으로, 제2 생물학적 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준이 제1 생물학적 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준보다 높거나, 또는 대조군 값(예컨대, 렉틴 경로 활성화의 퍼센트 억제에 상응하는 한계값)보다 높다면, MASP-2 억제 항체(예컨대, 나르소플리맙)의 투여량이 증가되어야 하고, 선택적으로, 방법은 증가된 투여량의 MASP-2 억제 항체(예컨대, 나르소플리맙)를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다고 결론지을 수 있다. 일부 구체예에서, 만약 대상체가 증가된 용량의 MASP-2 억제 항체로 투여된다면, 각각의 대조군 또는 참조 표준과 비교하여 증가된 용량의 MASP-2 억제 항체가 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 원하는 수준으로 조정하기에 충분한지의 여부를 결정하기 위하여 단계 (b) 내지 (e)가 반복된다.
일부 구체예에서, 방법은 렉틴 경로 질환 또는 장애, 예컨대 렉틴 경로 질환 또는 장애가 급성 COVID-19 질환, 장기 COVID-19, 또는 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애(예컨대, HSCT-TMA, IgAN, GvHD 또는 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애)로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 인간 대상체에게 투여되는 MASP-2 억제 항체의 효능을 모니터링하기 위해 사용된다.
G. 중증 COVID-19 또는 장기 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체의 진단, 모니터링 및 치료 방법
한 구체예에서, 본 개시는 현재 SARS-CoV-2로 감염되었거나 SARS-CoV-2로 잠재적으로 감염된, 또는 중증 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 이전에 SARS-CoV-2로 감염된 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체의 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 결정하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 시험관내 면역검정에서 생물학적 유체의 테스트 샘플을 C1-INH와 복합화된 인간 MASP-2에 결합하는 항체와 접촉시키는 단계; (b) C1-INH와 결합하는 항체를 가진 MASP-2/C1-INH 복합체에 결합된 항체 또는 그것의 단편의 존재 또는 부재 또는 양을 검출하는 단계로, MASP-2/C1-INH의 존재 및/또는 양의 검출은 대상체에서의 MASP-2 매개 렉틴 경로 활성화를 나타내는 것인 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 개시는 SARS-CoV-2로 감염되었거나, SARS-CoV-2로 잠재적으로 감염된, 중증 COVID-19를 앓고 있거나 또는 이전에 SARS-CoV-2로 감염된 것으로 알려진 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체의 테스트 샘플에서 MASP-2 매개 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 평가하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) SARS-CoV-2로 감염되었거나, SARS-CoV-2로 잠재적으로 감염된, 중증 COVID-19를 앓고 있거나 또는 이전에 SARS-CoV-2로 감염된 것으로 알려진 대상체로부터 얻어진 생물학적 유체의 테스트 샘플을 제공하는 단계; (b) 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획 및 검출하는 것을 포함하는 면역검정을 수행하는 단계, 및 (c) 테스트 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH의 존재 및/또는 양을 참조 표준과 비교하는 단계를 포함하며, 참조 샘플과 비교하여 MASP-2/CI-INH의 존재 또는 증가된 양은 (i) 대상체가 현재 MASP-2 매개 COVID-19 질환을 앓고 있고 MASP-2 억제제(나르소플리맙과 같은 항-MASP-2 항체 또는 MASP-2의 소분자 억제제)와 같은 보체 억제제로의 치료로부터 혜택을 받을 가능성이 있거나 또는 (ii) 대상체가 COVID-19 관련 합병증을 발병할 위험이 증가되었거나, 또는 (iii) 대상체가 이전에 COVID-19로 감염되었고 하나 이상의 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 앓고 있거나, 또는 발병이 위험이 있거나, 또는 (iv) 대상체가 현재 급성 COVID-19를 앓고 있고 좋지 못한 결과, 예컨대 사망의 위험이 증가된 것을 나타내는 MASP-2 매개 보체 렉틴 경로의 증가를 대상체가 가진 것을 나타낸다. 일부 구체예에서, 방법은 증가된 양의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 COVID-19의 치료를 위한 치료제, 예컨대 보체 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체 또는 소분자, 예컨대 나르소플리맙을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, COVID-19 감염 대상체는 COVID-19의 증상을 나타낸다. 일부 구체예에서, COVID-19 감염 대상체는 무증상이다. 일부 구체예에서, 대상체는 이전에 COVID-19로 감염되었고 하나 이상의 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있다. 일부 구체예에서, 방법은 테스트 샘플에서 C1s/C1-INH 복합체의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 건강한 대조군과 비교하여 증가된 수준의 C1s/C1-INH 복합체(즉 적어도 2배 이상)는 COVID-19로부터의 증가된 회복 가능성을 나타내고 저수준의 C1s/C1-INH는 좋지 못한 결과의 증가된 가능성을 나타낸다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 하나 이상의 COVID-19 관련 합병증을 앓고 있는 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체로의 치료의 효능을 모니터링하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 제1 시점에 MASP-2 억제 항체의 용량을 포유류 대상체에게 투여하는 단계; (b) 단계 (a) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제1 농도를 평가하는 단계; (c) 제2 시점에 대상체를 MASP-2 억제 항체로 치료하는 단계; (d) 단계 (c) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제2 농도를 평가하는 단계; 및 (e) 단계 (b)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 단계 (d)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준과 비교하여 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체의 효능을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 개시는 만약 대상체가 (i) 대상체로부터 취한 하나 이상의 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 미리 결정된 수준과 비교하거나 하나 이상의 대조군 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준과 비교하여 더 높은 양의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가지는 것으로 결정되면 대상체에게 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함하는, COVID-19 관련 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 포유류 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
VII. 예시의 구체예
A. C1-INH와의 복합체(MASP-2/C1-INH 복합체)에서 MASP-2에 결합하는 MASP-2 특이적 mAb
1. C1-INH와의 복합체에서 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로, 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하거나, 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편.
2. 단락 1의 단클론성 항체로서, 상기 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:88로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 경쇄 가변 영역 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:98로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단클론성 항체.
3. 단락 1의 단클론성 항체로서, 상기 항체는 인간화된, 키메라 또는 완전히 인간 항체인 것인 단클론성 항체.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 것의 단클론성 항체 또는 그것의 단편으로서, 상기 항체 단편은 Fv, Fab, Fab', F(ab)2 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단클론성 항체 또는 그것의 단편.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 것의 단클론성 항체로서, 상기 항체는 단일 사슬 분자인 것인 단클론성 항체.
6. 단락 1 내지 4 중 어느 것의 단클론성 항체로서, 상기 항체는 IgG1, IgG2 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된 IgG 분자인 것인 단클론성 항체.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 것의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 인간 MASP-2에 10 nM 미만의 KD로 결합하는 것인 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
8. 단락 1 내지 7 중 어느 것의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서,, 상기 항체는 검출 가능한 모이어티로 표지화되는 것인 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
9. 단락 1 내지 8 중 어느 것의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그것의 단편은 기질 상에 고정되는 것인 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 단편.
10. 단락 1-7 중 어느 것에 제시된 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
11. 단락 10에 따르는 발명의 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
12. 단락 10 또는 단락 11에 따르는 발명의 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그것의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 적어도 하나 포함하는 세포.
13. 단락 1 내지 9 중 어느 것에 제시된 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그것의 단편을 포함하는 조성물.
14. 단락 1 내지 9 중 어느 것에 제시된 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체, 또는 그것의 단편을 포함하는, 면역검정에 사용하기 위한 기질.
15. 테스트 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 또는 양을 검출하기 위한 키트로서, 상기 키트는 (a) 적어도 하나의 용기, 및 (b) 단락 1 내지 9 중 어느 것에 제시된 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항체, 또는 그것의 단편을 포함하는, 키트.
16. 단락 15의 키트로서, MASP-2와의 복합체에서 C1-INH을 특이적으로 검출하는 적어도 하나의 항체, 또는 그것의 단편을 추가로 포함하는 것인 키트.
17. 단락 15 또는 16의 키트로서, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체는 기질(예컨대, 비드) 상에 고정되는 것인 키트.
18. 단락 16의 키트로서, C1-INH에 특이적으로 결합하는 항체는 검출 가능한 모이어티로 표지화되는 것인 키트.
19. 단락 15-18 중 어느 것의 키트로서, 키트는 면역검정에 사용하기 위한 것인 키트.
20. 단락 19의 키트로서, 면역검정은 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 비드 기반 검정인 것인 키트.
21. 단락 19 또는 20의 키트로서, MASP-2에 결합하는 항체 또는 그것의 단편은 코팅/포획 항체인 것인 키트.
22. 단락 19 또는 20의 키트로서, C1-INH에 결합하는 항체 또는 그것의 단편은 검출 항체인 것인 키트.
23. 단락 15-22 중 어느 것의 키트로서, 키트는 건강한 대조군 대상체 또는 건강한 인간 대상체 집단의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준에 상응하는 참조 표준을 추가로 포함하는 것인 키트.
24. 단락 15-23 중 어느 것의 키트로서, 키트는 중증 COVID-19를 앓고 있는 대상체, 또는 중증 COVID-19를 앓고 있는 대상체 집단에서의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준, 또는 중증 COVID-19를 앓고 있는 대상체에 상응하는 재조합 MASP-2/C1-INH 복합체의 양에 상응하는 참조 표준을 추가로 포함하는 것인 키트.
25. 단락 15-24 중 어느 것의 키트로서, 키트는 C1-INH와 복합체를 이루는 동안 C1s에 결합하는 항체 또는 그것의 단편을 추가로 포함하는 것인 키트.
26. 단락 25의 키트로서, C1s에 결합하는 항체는 포획 항체인 것인 키트.
27. 단락 25 또는 26의 키트로서, C1s-INH에 특이적으로 결합하는 항체는 기질(예컨대, 비드) 상에 고정되는 것인 키트.
B. 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 검출하는 방법
1. 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 양을 측정하는 방법으로서,
(a) 인간 대상체로부터 테스트 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
(b) 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획 및 검출하는 단계를 포함하는 면역검정을 수행하는 단계로, MASP-2/C1-INH 복합체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체로 포획되고; MASP-2/C1-INH 복합체는 C1-INH에 특이적으로 결합하는 항체로 직접 또는 간접적으로 검출되는 것인 단계; 및
(c) (b)에 따라 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 미리 결정된 수준 또는 대조군 샘플과 비교하는 단계로, 테스트 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 나타내는 것인 단계
를 포함하는 방법.
2. 단락 1의 방법으로서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체 샘플인 것인 방법.
3. 단락 1 또는 2의 방법으로서, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하거나, 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것인 방법.
4. 단락 1 또는 2의 방법으로서, 생물학적 샘플은 0.3 내지 5% 농도의 혈청 샘플인 것인 방법.
5. 단락 1 내지 4 중 어느 것의 방법으로서, 인간 대상체는 현재 SARS-CoV-2로 감염되었거나, 또는 이전에 SARS-CoV-2로 감염되었거나, 또는 대상체는 또 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애(예컨대, COVID-19, HSCT-TMA, IgAN, GvHD)를 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 것인 방법.
6. 단락 5의 방법으로서, 방법은 검출되는 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준이 미리 결정된 수준 또는 건강한 대상체로부터의 대조군 참조보다 더 높은(적어도 20% 더 높은, 예컨대 적어도 30% 더 높은, 또는 적어도 40% 더 높은, 또는 적어도 50% 더 높은, 또는 적어도 60% 더 높은, 또는 적어도 70% 더 높은 또는 적어도 80% 더 높은 또는 적어도 90% 더 높은, 또는 2배 더 높은) 것으로 결정된 것을 토대로 대상체가 중증 COVID-19 질환 또는 장기 COVID-19를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있다고 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
7. 단락 1 내지 6 중 어느 것의 방법으로서, 대상체는 MASP-2/C1-INH 복합체의 정상 수준보다 높은 수준을 가지는 것으로 결정되고 보체 억제제로의 치료에 대한 후보로서 확인되는 것인 방법.
8. 단락 1-7 중 어느 것의 방법으로서, 방법은 MASP-2/C1-INH 복합체의 정상 수준보다 더 높은 수준을 가진 것으로 확인된 대상체에게 보체 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
9. 단락 8의 방법으로서, 보체 억제제는 MASP-2 억제제(예컨대, 나르소플리맙과 같은 MASP-2 억제 항체 또는 MASP-2의 소분자 억제제)인 것인 방법.
10. 단락 1 내지 4 중 어느 것의 방법으로서, 포유류 대상체는 보체 억제제, 예컨대 렉틴 보체 경로 억제제, 예컨대 MASP-2 억제제(예컨대, 나르소플리맙과 같은 MASP-2 억제 항체)로 치료된 것인 방법.
11. 단락 10의 방법으로서, 대조군 샘플은 MASP-2 억제제로의 치료 전에 대상체로부터 취해진 샘플, 또는 MASP-2 억제제로의 치료 과정 중에 초기 시점에 취해진 샘플인 것인 방법.
12. 단락 10 또는 11의 방법으로서, MASP-2 억제제는 MASP-2 억제 항체인 것인 방법.
C. SARS-CoV-2로 감염된 대상체가 COVID-19 관련 ARDS 또는 급성 COVID-19로부터의 다른 좋지 못한 결과, 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 발병할 위험을 결정하는 방법
1. SARS-CoV-2로 감염된 대상체가 COVID-19 관련 ARDS 또는 급성 COVID-19로부터의 다른 좋지 못한 결과 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 발병할 위험을 결정하는 방법으로서,
(a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 측정하는 단계;
(c) 측정된 수준을 MASP-2/C1-INH 복합체의 미리 결정된 수준 또는 참조 표준과 비교하여 COVID-19 관련 ARDS 또는 급성 COVID-19로부터의 다른 좋지 못한 결과, 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증이 발병할 위험을 평가하는 단계; 및
(d) 대상체의 COVID-19 관련 ARDS 또는 급성 COVID-19로부터의 다른 좋지 못한 결과 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증의 발병 위험을 결정하고 환자, 의사 또는 데이터베이스에게 그 결과를 보고하는 단계;
(e) 선택적으로, 급성 질환 및/또는 급성 COVID-19로부터의 다른 좋지 못한 결과, 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증 감염이 발병할 가능성이 있는 것으로 결정된 대상체에게 치료를 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
2. 단락 1의 방법으로서, MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 면역검정으로 측정되는 것인 방법.
3. 단락 2의 방법으로서, 방법은 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 측정하기 위하여 면역검정을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
4. 단락 2 또는 단락 3의 방법으로서, 면역검정은 ELISA 검정 또는 비드 기반 검정인 것인 방법.
5. 단락 4의 방법으로서, 면역검정은 MASP-2에 특이적으로 결합하는 포획 항체를 포함하고 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하거나, 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것인 방법.
6. 단락 1-5 중 어느 것의 방법으로서, 방법은 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 C1s/C1-INH 복합체의 수준을 검정하거나 또는 그렇지 않으면 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
D. SARS-CoV-2로 감염되고 급성 COVID-19를 발병할 위험이 있는 포유류 대상체에서 급성 COVID-19를 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법
1. SARS-CoV-2로 감염되고 급성 COVID-19를 발병할 위험이 있는 포유류 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군, 폐렴 또는 일부 다른 폐 또는 COVID-19의 다른 급성 징후, 예컨대 혈전증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법으로서,
(i) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 결정하는 단계로서, 건강한 대조군 샘플과 비교하여 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체는 COVID-19의 하나 이상의 급성 징후가 발병할 위험이 증가된 것을 나타내는 것인 단계; 및
(ii) 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
2. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것인 방법.
3. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부분에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편인 것인 방법.
4. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 보체 시스템의 상이한 항원에 결합하는 것보다 10배 더 큰 친화도로 특이적으로 결합하는 것인 방법.
5. 단락 2의 방법으로서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
6. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q 의존성 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제하는 것인 방법.
7. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 소분자 MASP-2 억제 화합물인 것인 방법.
8. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제인 것인 방법.
9. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
10. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
11. 단락 1의 방법으로서, 단계 (i)은 단락 A1 내지 A24 중 어느 것에 따르는 항체, 키트 또는 조성물의 사용을 포함하는 것인 방법.
12. 단락 1의 방법으로서, 단계 (i)은 단락 B1-B11 중 어느 것에 따르는 방법을 포함하는 것인 방법.
13. 단락 1의 방법으로서, 단계 (i)은 단락 C1-C5 중 어느 것에 따르는 방법을 포함하는 것인 방법.
E. SARS-CoV-2로 감염되었고 장기 COVID-19의 발병 위험이 있는 포유류 대상체에서 장기 COVID-19를 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법
1. SARS-CoV-2로 감염된 포유류 대상체에서 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증의 발병 위험을 치료, 완화, 예방 또는 감소시키는 방법으로서,
(i) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 결정하는 단계로서, 건강한 대조군 샘플과 비교하여 MASP-2/C1-INH 복합체의 증가된 수준은 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증의 증가된 발병 위험을 나타내는 것인 단계; 및
(ii) 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
2. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것인 방법.
3. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부분에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편인 것인 방법.
4. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 보체 시스템의 상이한 항원에 결합하는 것보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 특이적으로 결합하는 것인 방법.
5. 단락 2의 방법으로서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
6. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q 의존성 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제하는 것인 방법.
7. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 소분자 MASP-2 억제 화합물인 것인 방법.
8. 단락 1의 방법으로서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제인 것인 방법.
9. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
10. 단락 2의 방법으로서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
11. 단락 1의 방법으로서, 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증은 심혈관 합병증(심근 손상(myocardial injury), 심근병증(cardiomyopathy), 심근염(myocarditis), 혈관내 응고, 뇌졸중, 정맥 및 동맥 합병증 및 폐 혈전증 포함); 신경학적 합병증(인지 장애(cognitive difficulties), 착란(confusion), "브레인 포그(brain fog)"로도 언급되는 기억 상실(memory loss), 두통(headache), 뇌졸중, 현기증(dizziness), 실신(syncope), 발작(seizure), 식욕부진(anorexia), 불면증(insomnia), 후각상실증(anosmia), 미각장애(ageusia), 간대성 근경련(myoclonus), 신경병성 통증(neuropathic pain), 근육통(myalgias), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 길랑 바레 증후군(Guillian Barre Syndrome), 밀러-피셔 증후군(Miller-Fisher Syndrome), 파킨슨병(Parkinson's disease)과 같은 신경학적 질환의 발병 포함); 신장 손상(예컨대 급성 신장 손상(AKI)); 폐 합병증(폐 섬유증, 호흡곤란(dyspnea), 폐색전증 포함), 카와사키병, 카와사키 유사 질환, 아동의 다기관 염증 증후군, 다기관 장기 부전과 같은 염증 상태, 극심한 피로, 근육 약화, 미열, 집중력 저하, 기억 상실, 기분 변화, 수면 장애, 팔다리의 바늘 통증, 설사 및 구토, 미각 및 후각 상실, 인후염 및 삼키기 어려움, 당뇨병 및 고혈압의 새로운 발병, 피부 발진, 숨가쁨, 흉통 및 심계항진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
12. 단락 1의 방법으로서, 단계 (i)은 단락 A1 내지 A24 중 어느 것에 따르는 항체, 키트 또는 조성물의 사용을 포함하는 것인 방법.
13. 단락 1의 방법으로서, 단계 (i)은 단락 B1-B11 중 어느 것에 따르는 방법을 포함하는 것인 방법.
14. 단락 1의 방법으로서, 단계 (i)은 단락 C1-C5 중 어느 것에 따르는 방법을 포함하는 것인 방법.
F. 필요로 하는 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로의 치료 효능을 모니터링하는 방법.
1. 필요로 하는 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로의 치료 효능을 모니터링하는 방법으로서,
(a) 제1 시점에 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량을 포유류 대상체에게 투여하는 단계;
(b) 단계 (a) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제1 수준을 평가하는 단계;
(c) 제2 시점에 대상체를 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로 치료하는 단계;
(d) 단계 (c) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제2 수준을 평가하는 단계; 및
(e) 단계 (b)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 단계 (d)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준과 비교하여 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 효능을 결정하는 단계
를 포함하는, 방법.
2. 단락 1의 방법으로서, 방법은 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량을 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
3. 단락 2의 방법으로서, 대상체에게 투여된 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량은 만약 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준이 대조군 또는 참조 표준보다 높다면 증가되는 것인 방법.
4. 단락 3의 방법으로서, 만약 대상체에게 증가된 용량의 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 투여된다면, 각각의 대조군 또는 참조 표준과 비교하여 증가된 용량이 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 원하는 수준으로 조정하기에 충분한지의 여부를 결정하기 위하여 단계 (b) 내지 (e)가 반복되는 것인 방법.
5. 단락 1의 방법으로서, 단계 (b) 및 (d)는 면역검정에서 생물학적 샘플 중의 MASP-2/CI-INH 복합체의 농도를 평가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
6. 단락 5의 방법으로서, 면역검정은 비드 기반 면역형광 검정인 것인 방법.
7. 단락 6의 방법으로서, 면역검정은 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, MASP-2에 특이적으로 결합하는 포획 항체의 사용을 포함하는 것인 방법.
8. 단락 6 또는 7의 방법으로서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장인 것인 방법.
9. 단락 8의 방법으로서, 생물학적 샘플은 1% 내지 5% 혈청 또는 혈장인 것인 방법.
10. 단락 1-9 중 어느 하나의 방법으로서, 포유류 대상체는 인간 대상체인 것인 방법.
11. 단락 10의 방법으로서, 인간 대상체는 HSCT-TMA, IgAN, 루푸스 신염 및 이식편대숙주병 또는 일부 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 렉틴 경로 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것인 방법.
12. 단락 1의 방법으로서, 인간 대상체는 COVID-19 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것인 방법.
13. 단락 1의 방법으로서, 제2 시점은 제1 시점 후 2 내지 14일인 것인 방법.
14. 단락 1의 방법으로서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 2 내지 7일 이내인 것인 방법.
15. 단락 1의 방법으로서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 2 내지 4일 이내인 것인 방법.
VIII. 실시예
다음의 실시예는 단지 이제 발명의 실시를 위해 고려된 최상의 방식을 예시하지만, 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원의 모든 인용은 분명하게 참조로 포함된다.
실시예　1
이 실시예는 MASP-2가 결핍되었지만(MASP-2-/-) MAp19는 충분한(MAp19+/+) 마우스 스트레인의 생성을 기술한다.
물질 및 방법: 도 3에서 나타낸 것과 같이, 세린 프로테아제 도메인을 암호화하는 엑손을 포함하여 쥐과 MASP-2의 C 말단부를 코딩하는 3개의 엑손을 파괴하도록 표적화 벡터 pKO-NTKV 1901을 설계하였다. PKO-NTKV　1901을 사용하여 쥐과 ES　세포주　E14.1a(SV129　Ola)를 형질감염시켰다. 네오마이신 내성 및 티미딘 키나제 민감성 클론을 선택하였다. 600개의　ES 클론을 스크리닝하고, 그 중에서 4개의 상이한 클론을 확인하였고 도 3에 도시된 것과 같이 서던 블롯에 의하여 예상된 선택적 표적화 및 재조합 사건을 함유한 것을 검증하였다. 이들 4개의 양성 클론으로부터 배아 전달에 의해 키메라를 생성하였다. 그런 후 키메라를 유전자 배경 C57/BL6에 역교배시켜서 형질전환 수컷을 생성하였다. 형질전환 수컷을 암컷과 교배시켜서 F1을 생성하였는데, 자손 중 50%는 파괴된 MASP-2 유전자에 대한 이형접합성을 나타냈다. 이형접합성 마우스를 이종교배하여 동형접합성 MASP-2 결핍 자손을 생성함으로써 이형접합성 및 야생형 마우스를 각각 1:2:1의 비율로 생성하였다.
결과 및 표현형: 결과적으로 생성된 동형접합성 MASP-2-/- 결핍 마우스는 생존 가능하고 생식력이 있는 것으로 나타났고 서던 블롯에 의하여 정확한 표적화 사건을 확인하고, 노던 블롯에 의하여 MASP-2 mRNA의 부재를 확인하고, 웨스턴 블롯에 의하여 MASP-2 단백질의 부재를 확인하여 MASP-2 결핍인 것을 검증하였다(데이터 미제시). MAp19 mRNA의 존재 및 MASP-2 mRNA의 부재를 LightCycler 기계 상에서의 시간 분해 RT-PCR을 사용하여 추가로 확인하였다. MASP-2-/- 마우스는 예상했던 것과 같이 MAp19, MASP-1, 및 MASP-3 mRNA 및 단백질을 계속해서 발현시켰다(데이터 미제시). MASP-2-/- 마우스에서 프로퍼딘, 인자 B, 인자 D, C4, C2, 및　C3에 대한 mRNA의 존재 및 부재를 LightCycler 분석에 의해 평가하였고 야생형 한배새끼 대조군의 것과 동일한 것으로 나타났다(데이터 미제시). 동형접합성 MASP-2-/- 마우스로부터의 혈장은 실시예 2에서 추가로 기술되는 것과 같이 렉틴-경로 매개 보체 활성화가 전체적으로 결핍된다.
순수한 C57BL6　배경에서 MASP-2-/- 스트레인의 생성: MASP-2-/- 마우스를 9 세대 동안 순수한 C57BL6 라인과 역교배시킨 후 MASP-2-/- 스트레인을 실험 동물 모델로서 사용한다.
쥐과 MASP-2-/-, MAp19+/+이고 인간 MASP-2 도입유전자를 발현하는 형질전환 마우스 스트레인(쥐과 MASP-2 녹아웃 및 인간 MASP-2 녹인)을 또한 다음과 같이 생성하였다:
물질 및 방법: 도 4에서 나타낸 것과 같이 처음 3개의　엑손(엑손　1 내지 엑손　3)과 이어서 다음 8개 엑손의 코딩 서열을 나타내는 cDNA 서열을 포함하여 인간 MASP 2 유전자의 프로모터 영역을 포함함으로써, 내인성 프로모터에 의해 구동된 전장 MASP-2 단백질을 암호화하는, "미니 hMASP-2"(서열 번호:49)로 불리는 인간 MASP-2를 암호화하는 미니유전자를 구성하였다. 미니 hMASP-2 구성물을 MASP-2-/-의 수정란에 주입하여 결핍된 쥐과 MASP 2 유전자를 형질전환에 의해 발현된 인간 MASP-2로 대체시켰다.
실시예 2
이 실시예는 MASP-2가 렉틴 경로를 통한 보체 활성화에 필요한 것을 입증한다.
방법 및 물질:
렉틴 경로 특이적 C4　절단 검정: L-피콜린에 결합하는, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 리포테이코산(LTA)으로부터 비롯된 렉틴 경로 활성화를 측정하는 C4　절단 검정은 문헌에 기술되어 있다[Petersen,　et　al., J.　Immunol. Methods　257:107 (2001)]. Petersen 등(2001)에 의해 기술된 검정을, 아래에서 기술되는 것과 같이 MASP-2 -/- 마우스로부터의 혈청을 첨가하기 전에 플레이트를 LPS 및 만난 또는 지모산으로 코팅함으로써 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하기 위해 적응시켰다. 검정을 또한 고전적 경로로 인한 C4 절단의 가능성을 제거하기 위하여 변형시켰다. 이것은 리간드에 대한 렉틴 경로 인식 구성요소의 고친화성 결합을 허용하지만 내인성 C4의 활성화를 방지함으로써, C1 복합체를 해리함으로써 고전적 경로의 참여를 배제하는, 1　M NaCl을 함유한 샘플 희석 완충액을 사용함으로써 달성하였다. 간단히 설명하면, 변형된 검정에서 혈청 샘플(고염(1 M NaCl) 완충액에 희석됨)을 리간드 코팅된 플레이트에 첨가한 후, 생리적 농도의 염이 있는 완충액 중의 일정량의 정제된 C4를 첨가한다. MASP-2를 함유한 결합된 인식 복합체는 C4를 절단하여 C4b 침착을 초래한다.
검정 방법:
1) Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트(MaxiSorb®, Nunc, Cat. No.　442404, Fisher Scientific)를 1　μg/ml 만난(M7504 Sigma) 또는 코팅 완충액(15　mM Na2CO3, 35　mM NaHCO3, pH 9.6)에 희석된 임의의 다른 리간드(예컨대, 아래에서 열거된 것과 같음)로 코팅하였다.
다음의 시약을 검정에 사용하였다:
a. 만난(100　μl 코팅 완충액 중의 1　μg/웰 만난(M7504 Sigma)):
b. 지모산(100　μl 코팅 완충액 중의 1　μg/웰 지모산(Sigma));
c. LTA(100　μl 코팅 완충액 중의 1 μg/웰 또는 20　μl 메탄올 중의 2　μg/웰)
d. 코팅 완충액 중의 1　μg의 H-피콜린 특이적 Mab 4H5
e. 에어로코쿠스 비리단스(Aerococcus viridans)로부터의 PSA(100　μl 코팅 완충액 중의 2　μg/웰)
f. 코팅 완충액 중의 100　μl/웰의 포르말린 고정 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233(OD550=0.5).
2) 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
3) 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 0.1% HSA-TBS 차단 완충액(10　mM Tris-CL, 140　mM NaCl, 1.5　mM NaN3, pH 7.4 중의 0.1%(중량/부피) HSA)과 함께 1-3시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+(0.05% Tween　20 및 5　mM CaCl2, 1　mM MgCl2, pH 7.4가 있는 TBS)로 3회 세척함으로써 잔류 단백질 결합 부위를 포화시켰다.
4) 테스트하려는 혈청 샘플을 MBL-결합 완충액(1　M NaCl)으로 희석하고 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 완충액만을 넣은 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다.
5) 밤새 4℃에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다. 인간 C4(BBS(4　mM 바르비탈, 145　mM NaCl, 2　mM CaCl2, 1　mM MgCl2, pH 7.4)에 희석된 100　μl/웰의 1　μg/ml)를 그런 후에 플레이트에 첨가하고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다.
6) 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이션된 닭 항-인간　C4c(희석된 1:1000 in TBS/tween/Ca2+)를 사용하여, 그것을 플레이트에 첨가하고 90분 동안 실온에서 인큐베이션하여 C4b　침착을 검출하였다. 그런 후 플레이트를 다시 TBS/tween/Ca2+로 3회 세척하였다.
7) 100　μl의 p-니트로페닐 포스페이트 기질 용액을 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고, 미세역가 플레이트 판독기에서 OD405를 판독함으로써 알칼리성 포스파타제를 검출하였다.
결과: 도　5A-B는 MASP-2+/+(십자형), MASP-2+/-(닫힌 원형) 및 MASP-2-/-(닫힌 삼각형)로부터의 혈청 희석에서 만난(도　5A) 및 지모산(도　5B) 상의 C4b 침착의 양을 도시한다. 도　5C는 야생형 혈청에 대해 표준화된 C4b 침착의 양의 측정을 토대로 한 야생형 마우스(n=5마리)에 대한 MASP-2-/+ 마우스(n=5마리) 및 MASP-2-/- 마우스(n=4마리)로부터의 지모산(흰색 막대) 또는 만난(음영 막대)으로 코팅된 플레이트 상에서의 상대적 C4 전환효소 활성을 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 도　5A-C에서 나타낸 것과 같이, MASP-2-/- 마우스로부터의 혈장은 만난 및 지모산 코팅된 플레이트 상에서 전체적으로 렉틴-경로 매개 보체 활성화가 결핍되어 있다. 이들 결과는 MASP-2가 렉틴 경로의 이펙터 구성요소인 것을 분명하게 입증한다.
재조합 MASP-2는 MASP-2-/- 마우스로부터의 혈청에서 렉틴 경로 의존성 C4 활성화를 재구성한다
MASP-2의 부재가 MASP-2-/- 마우스에서 렉틴 경로 의존성 C4 활성화의 상실의 직접적인 원인인 것을 확립하기 위하여, 재조합 MASP-2 단백질을 혈청 샘플에 첨가하는 효과를 위에서 기술된 C4 절단 검정으로 조사하였다. 기능적으로 활성인 쥐과 MASP-2 및 촉매적으로 비활성인 쥐과 MASP-2A(세린 프로테아제 도메인의 활성 부위 세린 잔기가 알라닌 잔기로 치환되어 있음) 재조합 단백질을 아래의 실시예　3에서 기술되는 것과 같이 생성하고 정제하였다. 4마리의 MASP-2 -/- 마우스로부터 모아진 혈청을 증가하는 단백질 농도의 재조합 쥐과 MASP-2 또는 비활성 재조합 쥐과 MASP-2A와 사전 인큐베이션하고 C4 전환효소 활성을 위에서 기술한 것과 같이 검정하였다.
결과: 도　6에서 나타낸 것과 같이, 기능적으로 활성인 쥐과 재조합 MASP-2 단백질(개방 삼각형으로 표시됨)의 MASP-2 -/- 마우스로부터 얻어진 혈청에의 첨가는 단백질 농도 의존성 방식으로 렉틴 경로 의존성 C4 활성화를 복구시킨 반면, 촉매적으로 비활성인 쥐과 MASP-2A 단백질(별표로 표시됨)은 C4 활성화를 복구시키지 못하였다. 도 6에 도시된 결과를 모아진 야생형 마우스 혈청으로 관찰된 C4 활성화(점선으로 표시됨)에 대해 표준화한다.
실시예 3
이 실시예는 재조합 전장 인간, 래트 및 쥐과 MASP-2, MASP-2 유래 폴리펩타이드, 및 MASP-2의 촉매적으로 비활성화된 돌연변이 형태의 재조합 발현 및 단백질 생성을 기술한다.
전장 인간, 쥐과 및 래트 MASP-2의 발현:
인간 MASP-2의 전장 cDNA 서열(서열 번호: 4)을 또한 CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에 진핵 발현을 구동시키는 포유류 발현 벡터 pCI-Neo(Promega)에 하위클로닝하였다(Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 기술됨). 전장 마우스 cDNA(서열 번호:50) 및 래트 MASP-2 cDNA(서열 번호:53)를 각각 pED 발현 벡터에 하위클로닝하였다. 그런 후 MASP-2 발현 벡터를 유착 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DXB1에 문헌[Maniatis　et　al., 1989]에 기술된 표준 칼슘 포스페이트 형질감염 과정을 사용하여 형질감염시켰다. 이들 구성물로 형질감염된 세포를 매우 느리게 성장하였고, 암호화된 프로테아제가 세포독성인 것을 암시하였다.
또 다른 접근법으로, 내인성 프로모터에 의해 구동된 MASP-2의 인간 cDNA를 함유한 미니유전자 구성물(서열 번호:49)을 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)에 일시적으로 형질감염시킨다. 인간 MASP-2 단백질은 배양 배지로 분비되고 아래에서 기술되는 것과 같이 분리한다.
전장 촉매적 비활성 MASP-2의 발현:
근거: MASP-2는 인식 하위구성요소 MBL 또는 피콜린(L-피콜린, H-피콜린 또는 M-피콜린)이 그것의 각각의 탄수화물 패턴에 결합한 후 자가촉매적 절단에 의해 활성화된다. MASP-2의 활성화를 초래하는 자가촉매적 절단은 종종 혈청으로부터 MASP-2의 분리 과정 중에, 또는 재조합 발현 후 정제 중에 일어난다. 항원으로서 사용하기 위한 보다 안정적인 단백질 조제물을 얻기 위해, 프로테아제 도메인의 촉매 삼잔기(triad)에 존재하는 세린 잔기를 래트에서(서열 번호:55 Ser617에서 Ala617로); 마우스에서(서열 번호:52 Ser617에서 Ala617로); 또는 인간에서(서열 번호:6 Ser618에서 Ala618로) 알라닌 잔기로 대체함으로써 MASP-2A로 설계된, MASP-2의 촉매적 비활성 형태를 생성하였다.
촉매적 비활성 인간 및 쥐과 MASP-2A 단백질을 생성하기 위하여, 부위 지정 돌연변이생성을 표 5에 제시된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행하였다. 표 5의 올리고뉴클레오타이드를, 효소적 활성 세린 및 올리고뉴클레오타이드를 암호화하는 인간 및 쥐과 cDNA의 영역이 세린 코돈을 알라닌 코돈으로 변경시키기 위하여 미스매치를 함유하도록 어닐링되도록 설계하였다. 예를 들어, PCR 올리고뉴클레오타이드 서열 번호:56-59를 인간 MASP-2 cDNA(서열 번호:4)와 함께 사용하여 영역을 출발 코돈으로부터 효소적 활성 세린까지 및 세린으로부터 중단 코돈까지 증폭시켜서 Ser618의 Ala618로의 돌연변일를 함유한 돌연변이된 MASP-2A의 완전한 오픈 리딩 프레임을 생성하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 밴드 제조 후에 정제하고 단일 아데노신 중첩을 표준 테일링 과정을 사용하여 생성하였다. 그런 후 아데노신이 달린 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하고, 이. 콜라이(E. coli)에 형질전환시켰다.
촉매적 비활성 래트 MASP-2A 단백질을 서열 번호:64 및 서열 번호:65를 이들 두 올리고뉴클레오타이드를 등몰량으로 조합하고, 100℃에서 2분 동안 가열하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 키네이싱(kinasing) 및 어닐링에 의해 생성하였다. 결과적으로 생성된 어닐링된 단편은 Pst1 및 Xba1 부합성 단부를 가지며 야생형 래트 MASP-2 cDNA(서열 번호:53)의 Pst1-Xba1 단편 대신 삽입하여 래트 MASP-2A를 생성하였다.
5 'GAGGTGACGCAGGAGGGGCATTAGTGTTT 3' (서열 번호:64)
5' CTAGAAACACTAATGCCCCTCCTGCGTCACCTCTGCA 3' (서열 번호:65)
인간, 쥐과 및 래트 MASP-2A를 각각 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 어느 하나에 추가로 하위클로닝하고 아래에서 기술되는 것과 같이 차이니즈 햄스터 난소 세포주 DXB1에 형질감염하였다.
또 다른 접근법으로, MASP-2의 촉매적 비활성 형태를 문헌[Chen　et　al., J. Biol. Chem., 276(28):25894-25902, 2001]에 기술된 방법을 사용하여 구성한다. 간단히 설명하면, 전장 인간 MASP-2 cDNA를 함유한 플라스미드(문헌[Thiel　et　al., Nature 386:506, 1997]에 기술됨)를 Xho1 및 EcoR1로 소화시키고 MASP-2 cDNA(본원에 서열 번호:4로서 기술됨)를 pFastBac1 배큘로바이러스 전달 벡터(Life Technologies, NY)의 상응하는 제한 부위에 클로닝한다. 그런 후 Ser618에 있는 MASP-2 세린 프로테아제 활성 부위를 펩타이드 영역 아미노산 610-625(서열 번호:13)를 암호화하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 천연 영역 아미노산 610 내지 625로 치환하여 Ala618로 변경시킴으로써 비활성 프로테아제 도메인을 가진 MASP-2 전장 폴리펩타이드를 생성한다.
인간 Masp-2로부터 유래된 폴리펩타이드 영역을 함유한 발현 플라스미드의 구성.
다음의 구성물을 MASP-2의 다양한 도메인을 분비하도록 MASP-2 신호 펩타이드(서열 번호:5의 잔기 1-15)를 사용하여 제조한다. 인간 MASP-2 CUBI 도메인(서열 번호:8)을 발현하는 구성물을 MASP-2(서열 번호:6)의 잔기 1-121(N 말단 CUBI 도메인에 상응함)을 암호화하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 제조한다. MASP-2 CUBIEGF 도메인(서열 번호:9)을 발현하는 구성물을 MASP-2(서열 번호:6)의 잔기 1-166(N 말단 CUBIEGF 도메인에 상응함)을 암호화하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 제조한다. 인간 MASP-2 CUBIEGFCUBII 도메인(서열 번호:10)을 발현하는 구성물을 MASP-2(서열 번호:6)의 잔기 1-293(N 말단 CUBIEGFCUBII 도메인에 상응함) 암호화하는 영역을 PCR 증폭시킴으로써 제조한다. 위에서 언급된 도메인을 VentR 중합효소 및 주형으로서 pBS-MASP-2를 사용하여, 확립된 PCR 방법에 의해 PCR에 의해 증폭시킨다. 센스 프라이머(5'-CGGGATCCATGAGGCTGCTGACCCTC-3' 서열 번호:34)의 5' 프라이머 서열은 BamHI 제한 부위(밑줄)를 PCR 구성물의 5' 단부에 도입한다. 아래의 표 5에 제시된, MASP-2 도메인의 각각에 대한 안티센스 프라이머를 중단 코돈(진하게 표시)과 이어서 EcoRI 부위(밑줄)를 각각의 PCR 생성물의 단부에 도입하도록 설계된다. 증폭된 후에는, DNA 단편을 BamHI 및 EcoRI로 소화시키고 pFastBac1 벡터의 상응하는 부위에 클로닝한다. 결과적으로 생성된 구성물을 제한 지도화에 의해 특성화하고 dsDNA 서열분석에 의해 확인한다.
MASP-2의 재조합 진핵 발현 및 촉매적 비활성 마우스, 래트, 및 인간 MASP-2A의 단백질 생성
위에서 기술된 MASP-2 및 MASP-2A 발현 구성물을 표준 칼슘 포스페이트 형질감염 과정을 사용하여 DXB1 세포에 형질감염시켰다(Maniatis　et　al., 1989). MASP-2A를 혈청 유리 배지에서 생성하여 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않은 것을 보장하였다. 배지를 2일마다 합류 세포로부터 수득하였다(총 4회). 재조합 MASP-2A의 수준은 3개 종 각각에 대해 대략 1.5　mg/배양 배지 리터로 평균화되었다.
MASP-2A 단백질 정제: MASP-2A(위에서 기술된 Ser-Ala 돌연변이체)를 MBP-A-아가로스 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 전략은 불필요한 태그의 사용 없이 신속한 정제를 가능하게 하였다. MASP-2A(동등한 부피의 로딩 완충액(50　mM Tris-Cl, pH 7.5, 150　mM NaCl 및 25　mM CaCl2를 함유함)으로 희석된 100-200　ml의 배지)를 10　ml의 로딩 완충액으로 사전 평형화되어 있는 MBP-아가로스 친화성 칼럼(4　ml) 위에 로딩하였다. 추가의 10 ml의 로딩 완충액으로 세척한 후, 단백질을 1.25 M NaCl 및 10　mM EDTA를 함유한 50　mM Tris-Cl, pH 7.5로 1 ml 분획으로 용출하였다. MASP-2A를 함유한 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 필요한 경우, MASP-2A를 MonoQ 칼럼(HR　5/5) 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 단백질을 50　mM NaCl을 함유한 50　mM Tris-Cl pH 7.5로 투석하고, 동일한 완충액으로 평형화되어 있는 칼럼 상에 로딩하였다. 세척 후, 결합된 MASP-2A를 10 ml에 걸친 0.05-1 M NaCl 구배로 용출하였다.
결과: 0.25-0.5　mg의 MASP-2A 단백질의 수율을 200　ml의 배지로부터 얻었다. MALDI-MS에 의해 결정된 77.5　kDa의 분자량은 글리코실화로 인해 미변형 폴리펩타이드(73.5　kDa)의 계산값보다 더 크다. 각각의 N-글리코실화 부위에서 글리칸의 부착이 관찰된 질량을 설명해주다. MASP-2A는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일 밴드로서 이동하여, 생합성 동안 단백질 가수분해로 처리되지 않은 것을 입증한다. 평형 초원심분리에 의해 결정된 중량 평균 분자량은 글리코실화된 폴리펩타이드의 단일이량체에 대한 계산값과 일치한다.
재조합 인간 Masp-2 폴리펩타이드의 제조
재조합 MASP-2 및 MASP2A 유래 폴리펩타이드의 또 다른 제조 방법은 문헌에 기술되어 있다[Thielens, N.M.,　et　al., J. Immunol. 166:5068-5077, 2001]. 간단히 설명하면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 곤충 세포(레디-플라크(Ready-Plaque) Sf9 세포, Novagen, Madison, WI로부터 얻음)를 50　IU/ml 페니실린 및 50　mg/ml 스트렙토마이신(Life Technologies)이 보충된 Sf900II 혈청 유리 배지(Life Technologies)에서 성장시키고 유지하였다. 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(High Five) 곤충 세포(Jadwiga Chroboczek, Institut de Biologie Structurale, Grenoble, France에서 제공됨)를 50　IU/ml 페니실린 및 50　mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 10% FCS(Dominique Dutscher, Brumath, France)를 함유한 TC100 배지(Life Technologies)에서 유지한다. 재조합 배큘로바이러스를 Bac-to-Bac system®(Life　Technologies)을 사용하여 생성한다. 백미드 DNA를 Qiagen 미니프렙 정제 시스템(Qiagen)을 사용하여 정제하고 Sf900　II SFM 배지(Life Technologies)에서 제조사의 프로토콜에 기술된 것과 같이 셀펙틴(cellfectin)을 사용하여 Sf9 곤충 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 재조합 바이러스 입자를 4일 후에 수집하고, 바이러스 플라크 검정에 의해 적정하고, 문헌에 기술된 것과 같이 증폭시킨다[King and Possee, in The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall Ltd., London, pp.　111-114, 1992].
High Five 세포(1.75　x　107 세포/175-cm2 조직 배양 플라스크)를 MASP-2 폴리펩타이드를 함유하고 있는 재조합 바이러스로 2의 감염 다중도로 Sf900 II SFM 배지에서 28℃에서 96시간 동안 감염시킨다. 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 다이아이소프로필 포스포로플루오리데이트를 1 mM의 최종 농도로 첨가한다.
MASP-2 폴리펩타이드는 배양 배지로 분비된다. 배양 상층액을 50　mM NaCl, 1　mM CaCl2, 50　mM 트라이에탄올아민 염산염, pH 8.1에 대해 투석하고, 동일한 완충액으로 평형화되어 있는 Q-세파로스 신속 흐름 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech)(2.8　x　12 cm) 상에 1.5　ml/분으로 로딩한다. 용출을 동일한 완충액 중의 350　mM NaCl까지 1.2 리터 선형 구배를 적용함으로써 수행한다. 재조합 MASP-2 폴리펩타이드를 함유한 분획을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하고, (NH4)2SO4를 60%(중량/부피)까지 첨가함으로써 침전시키고, 4℃에서 밤새 방치한다. 펠릿을 145　mM NaCl, 1　mM CaCl2, 50　mM 트라이에탄올아민 염산염, pH 7.4에 재현탁하여, 동일한 완충액으로 평형화되어 있는 TSK G3000 SWG 칼럼(7.5　x　600　mm)(Tosohaas, Montgomeryville, PA) 상에 적용한다. 그런 후 정제된 폴리펩타이드를 Microsep 미세농축기(분자량 컷오프　=　10,000)(Filtron, Karlstein, Germany) 상에서 한외여과함으로써 0.3　mg/ml로 농축한다.
실시예 4
이 실시예는 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 다클론성 항체의 제조 방법을 기술한다.
물질 및 방법:
MASP-2 항원: 다클론성 항-인간 MASP-2 항혈청을 다음의 분리된 MASP-2 폴리펩타이드로 토끼를 면역시킴으로써 제조한다: 혈청으로부터 분리된 인간 MASP-2(서열 번호:6); 재조합 인간 MASP-2(서열 번호:6), 실시예 3에서 기술된 것과 같이, 비활성 프로테아제 도메인(서열 번호:13)을 함유한 MASP-2A; 및 위의 실시예 3에서 기술된 것과 같이 발현된 재조합 CUBI(서열 번호:8), CUBEGFI(서열 번호:9), 및 CUBEGFCUBII(서열 번호:10).
다클론성 항체: BCG(바실러스 칼메트-게린(Calmette-Guerin) 백신)로 프라이밍된 생후 6주령의 토끼를, 100　μg의 MASP-2 폴리펩타이드를 멸균 식염수 용액 중의 100　μg/ml로 주사함으로써 면역화한다. 주사를 4주마다 실시하며, 항체 역가를 실시예 5에서 기술되는 것과 같이 ELISA 검정에 의해 모니터링한다. 배양 상층액을 단백질　A 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수집한다.
실시예 5
이 실시예는 래트 또는 인간 MASP-2 폴리펩타이드에 대한 쥐과 단클론성 항체를 제조하는 방법을 기술한다.
물질 및 방법:
생후 8-12주령의 수컷 A/J 마우스(Harlan, Houston, Tex.)를 200　μl의 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4 중의 완전 프로인트 보조제(Difco Laboratories, Detroit, Mich.) 중의 100　μg 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드(실시예 3에서 기술된 것과 같이 제조됨)로 피하 주사한다. 2주 간격으로 마우스를 불완전 프로인트 보조제 중의 50　μg의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드로 2회 피하 주사한다. 4주 째에 마우스를 PBS 중의 50　μg의 인간 또는 래트 rMASP-2 또는 rMASP-2A 폴리펩타이드로 주사하고 4일 후에 융합시킨다.
각각의 융합에 대해, 단일 세포 현탁액을 면역화된 마우스의 비장으로부터 제조하여 Sp2/0 골수종 세포와의 융합에 사용한다. 5x108의 Sp2/0 및 5x108 비장 세포를 50% 폴리에틸렌 글리콜(분자량　1450)(Kodak, Rochester, N.Y.) 및 5% 다이메틸설폭사이드(Sigma Chemical Co., St.　Louis, Mo.)를 함유한 배지에서 융합한다. 그런 후 세포를 10% 소 태아 혈청, 100　단위/ml의 페니실린, 100　μg/ml의 스트렙토마이신, 0.1　mM 하이포크산틴, 0.4　μM 아미노프테린 및 16　μM 티미딘으로 보충된 Iscove 배지(Gibco, Grand Island, N.Y.)에 현탁액 200 μl당 1.5x105 비장 세포의 농도로 조정한다. 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 약 20개의 96 웰 미소배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가한다. 약 10일 후 배양 상층액을 ELISA 검정으로 정제된 인자 MASP-2와의 반응성에 대해 스크리닝하기 위해 회수한다.
ELISA 검정: Immulon®　2(Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) 마이크로테스트 플레이트의 웰을 50　μl의 정제된 hMASP-2를 50　ng/ml로 또는 래트 rMASP-2(또는 rMASP-2A)를 밤새 실온에서 첨가함으로써 코팅한다. 코팅을 위한 저농도의 MASP-2는 고친화성 항체의 선택을 가능하게 한다. 플레이트를 튕겨서 코팅 용액을 제거한 후, PBS 중의 200　μl의 BLOTTO(무지방 분유)를 각 웰에 한 시간 동안 첨가하여 비특이적 부위를 차단한다. 한 시간 후, 웰을 완충액 PBST(0.05% Tween　20 함유 PBS)로 세척한다. 각각의 융합 웰로부터 50 마이크로리터의 배양 상층액을 수집하여 50　μl의 BLOTTO와 혼합한 후 마이크로테스트 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 1시간 인큐베이션 후, 웰을 PBST로 세척한다. 그런 후 결합된 쥐과 항체를 양고추냉이 과산화효소(HRP) 콘쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG(Fc 특이적)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)와의 반응에 의해 검출하고 BLOTTO에 1:2,000으로 희석한다. 0.1% 3,3,5,5 테트라메틸 벤지딘(Sigma, St.　Louis, Mo.) 및 0.0003% 과산화수소(Sigma)를 함유한 과산화효소 기질 용액을 색 발색을 위해 웰에 30분 동안 첨가한다. 반응을 웰당 50　μl의 2M H2SO4를 첨가함으로써 종료한다. 반응 혼합물의 450 nm에서의 광학 밀도를 BioTek® ELISA 판독기(BioTek® Instruments, Winooski, Vt.)로 판독한다.
MASP-2 결합 검정:
위에서 기술된 MASP-2 ELISA 검정에서 양성으로 테스트된 배양 상층액을 MASP-2 억제제가 MASP-2에 대해 가지는 결합 친화도를 결정하기 위해 결합 검정에서 테스트할 수 있다. 억제제가 보체 시스템의 다른 항원에 결합하는지를 결정하기 위해 유사한 검정을 또한 사용할 수 있다.
폴리스티렌 미세역가 플레이트 웰(96 웰 배지 결합 플레이트, Corning Costar, Cambridge, MA)을 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4에서 MASP-2(20　ng/100　μl/웰, Advanced Research Technology, San Diego, CA)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. MASP-2 용액을 흡인한 후, 웰을 1% 소 혈청 알부민(BSA; Sigma Chemical)을 함유한 PBS로 2시간 동안 실온에서 차단하였다. MASP-2 코팅이 없는 웰은 배경 대조군으로서 작용한다. 하이브리도마 상층액 또는 정제된 항-MASP-2 MoAb의 분취액을 차단 용액 중의 다양한 농도로 웰에 첨가한다. 실온에서 2시간 인큐베이션한 후, 웰을 PBS로 집중적으로 세청한다. MASP-2 결합 항-MASP-2 MoAb를 차단 용액 중의 과산화효소 콘쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG(Sigma Chemical)를 첨가하고, 그것을 1시간 동안 실온에 놓아둠으로써 검출한다. 플레이트를 다시 PBS로 철저하게 세정하고, 100　μl의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB) 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 첨가한다. TMB의 반응을 100　μl의 1 M 인산의 첨가에 의해 퀀칭하고, 플레이트를 마이크로플레이트 판독기(SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)에서 450 nm에서 판독한다.
그런 후 양성 웰로부터의 배양 상층액을 보체 활성화를 억제하는 능력에 대해 실시예 2에서 기술된 것과 같이 C4 절단 검정과 같은 기능성 검정으로 테스트한다. 양성 웰의 세포를 그런 후 제한 희석에 의해 클로닝한다. MoAb를 다시 위에서 기술한 것과 같이 ELISA 검정으로 hMASP-2와의 반응성에 대해 테스트한다. 선택된 하이브리도마를 스피너 플라스크에서 성장시키고 사용한 배양 상층액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제를 위해 수집한다.
실시예 6
이 실시예는 인간화된 쥐과 항-MASP-2 항체 및 항체 단편의 생성 및 제조를 기술한다.
쥐과 항-MASP-2 단클론성 항체를 실시예　5에서 기술한 것과 같이 수컷 A/J 마우스에서 생성한다. 그런 후 쥐과 항체를 아래에서 기술되는 것과 같이 인간화하여 쥐과 불변 영역을 그것의 인간 대응물로 대체함으로써 면역원성을 감소시켜서 본 발명에 따라 인간 대상체에서 MASP-2 의존성 보체 활성화의 부작용을 억제하는데 유용한 항체의 키메라 IgG 및 Fab 단편을 생성한다.
1. 쥐과 하이브리도마 세포로부터 항-MASP-2 가변 영역 유전자의 클로닝. 항-MASP-2 MoAb를 분비하는 하이브리도마 세포(실시예　7에서 기술되는 것과 같이 얻음)로부터 제조사의 프로토콜(Biotech, Houston, Tex.)을 따라 RNAzol을 사용하여 총 RNA를 분리한다. 제1 가닥 cDNA를 총 RNA로부터 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 합성한다. PCR을 면역글로불린 불변 C 영역 유래 3'　프라이머 및 리더 펩타이드로부터 유래된 축퇴성 프라이머 세트 또는 5' 프라이머로서 쥐과 VH 또는 VK 유전자의 제1 프레임워크 영역을 사용하여 수행한다. 고정된 PCR을 Chen과 Platsucas에 의해 기술된 것과 같이 수행한다(Chen, P.F., Scand. J. Immunol. 35:539-549, 1992). VK 유전자를 클로닝하기 위하여, 이중 가닥 cDNA를 Notl-MAK1 프라이머(5'-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3' 서열 번호:38)를 사용하여 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1(5'-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3' 서열 번호:39) 및 AD2(5'-TCCGAGAATAACGAGTG-3' 서열 번호:40)를 이중 가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 모두에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 소화에 의해 제거한다. 그런 후 소화된 생성물을, 5' 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 3' 프라이머로서 MAK2(5'-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3' 서열 번호:41)와 함께 PCR에서 주형으로서 사용한다. 대략 500 bp의 DNA 단편을 pUC19에 클로닝한다. 클로닝된 서열이 예상된 쥐과 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 것을 검증하기 위해 서열 분석을 위해 여러 개의 클론을 선택한다. Not1-MAK1 및 MAK2 올리고뉴클레오타이드는 VK 영역으로부터 유래되며 C 카파 유전자의 제1 염기쌍으로부터 하류로 각각 182 및 84　bp에 있다. 완전한 VK 및 리더 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.
VH 유전자를 클로닝하기 위하여, 이중 가닥 cDNA를 Not1 MAG1 프라이머(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3' 서열 번호:42)를 사용하여 제조한다. 어닐링된 어댑터 AD1 및 AD2를 이중 가닥 cDNA의 5' 및 3' 말단 모두에 결찰시킨다. 3' 단부의 어댑터를 Notl 소화에 의해 제거한다. 소화된 생성물을, 프라이머로서 AD1 올리고뉴클레오타이드 및 MAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-3' 서열 번호:43)와 함께 PCR에서 주형으로서 사용한다. 길이가 500 내지 600 bp인 DNA 단편을 pUC19에 클로닝한다. Not1-MAG1 및 MAG2 올리고뉴클레오타이드는 쥐과 Cg.7.1 영역으로부터 유래되며, 쥐과 Cg.7.1 유전자로부터 하류로, 각각 180 및 93　bp에 있다. 완전한 VH 및 리더 펩타이드를 포함하는 클론을 선택한다.
2. 키메라 MASP-2 IgG 및 Fab에 대한 발현 벡터의 구성. 위에서 기술된 클로닝된 VH 및 VK 유전자를 뉴클레오타이드 서열의 5' 단부에 Kozak 공통 서열을 첨가하고 3' 단부에 스플라이스 도너를 첨가하기 위하여 PCR 반응에서 주형으로서 사용한다. 서열을 분석하여 PCR 오류의 부재를 확인한 후, VH 및 VK 유전자를 인간 C.g1 및 C. 카파를 각각 함유하고 있는 발현 벡터 카세트에 삽입하여 pSV2neoVH-huCg1 및 pSV2neoV-huCg를 얻는다. 중쇄 및 경쇄 벡터의 CsCl 구배 정제 플라스미드 DNA를 사용하여 전기천공에 의해 COS 세포를 형질감염시킨다. 48시간 후, 배양 상층액을 ELISA에 의해 테스트하여 대략 200 ng/ml의 키메라 IgG의 존재를 확인한다. 세포를 수득하고 총 RNA를 준비한다. 제1 가닥 cDNA를 총 RNA로부터 프라이머로서 올리고 dT를 사용하여 합성한다. 이 cDNA를 PCR에서 주형으로서 사용하여 Fd 및 카파 DNA 단편을 생성한다. Fd 유전자의 경우, PCR을 5' 프라이머로서 5'-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3'(서열 번호:44) 및 CH1 유래 3' 프라이머(5'-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3' 서열 번호:45)를 사용하여 수행한다. DNA 서열을 인간 IgG1의 완전한 VH 및 CH1 도메인을 함유하는 것으로 확인한다. 적절한 효소로 소화시킨 후, Fd DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2dhfr-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2dhfrFd를 얻는다. pSV2 플라스미드는 상업적으로 이용 가능하며 다양한 공급원으로부터의 DNA 분절로 이루어진다: pBR322 DNA(가는 선)는 pBR322 DNA 복제 기원(pBR ori) 및 락타마제 암피실린 내성 유전자(Amp)를 함유하며; 더 넓은 사선 및 표시로 표시되는 SV40 DNA는 SV40 DNA 복제 기원(SV40 ori), 초기 프로모터(dhfr 및 네오 유전자에 대해 5'), 및 폴리아데닐화 신호(dhfr 및 네오 유전자에 대해 3')를 함유한다. SV40 유래 폴리아데닐화 신호(pA)는 또한 Fd 유전자의 3' 단부에 위치한다.
카파 유전자의 경우, PCR은 5' 프라이머로서 5'- AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3'(서열 번호:46) 및 CK 유래 3' 프라이머(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3' 서열 번호:47)를 사용하여 수행한다. DNA 서열은 완전한 VK 및 인간 CK 영역을 포함하는 것으로 확인된다. 적절한 제한 효소로의 소화 후, 카파 DNA 단편을 발현 벡터 카세트 pSV2neo-TUS의 HindIII 및 BamHI 제한 부위에 삽입하여 pSV2neoK를 얻는다. Fd 및 .카파 유전자 둘 다의 발현은 HCMV 유래 인핸서 및 프로모터 요소에 의해 구동된다. Fd 유전자가 사슬간 이황화 결합에 연루된 시스테인 아미노산 잔기를 포함하지 않기 때문에, 이 재조합 키메라 Fab는 비공유적으로 연결된 중쇄 및 경쇄를 함유한다. 이 키메라 Fab는 cFab로서 표시된다.
중쇄 및 경쇄간 이황화 결을 가진 재조합 Fab를 얻기 위하여, 위의 Fd 유전자는 인간 IgG1의 힌지 영역으로부터 추가의 9개 아미노산(EPKSCDKTH 서열 번호:48)에 대한 코딩 서열을 포함하도록 연장될 수 있다. Fd 유전자의 3' 단부의 30개 아미노산을 암호화하는 BstEII-BamHI DNA 분절은 연장된 Fd를 암호화하는 DNA 분절로 대체되어 pSV2dhfrFd/9aa를 얻을 수 있다..
3. 키메라 항-MASP-2 IgG의 발현 및 정제
키메라 항-MASP-2 IgG를 분비하는 세포주를 생성하기 위하여, NSO 세포를 pSV2neoVH-huC.g1 및 pSV2neoV-huC 카파의 정제된 플라스미드 DNA로 전기천공에 의해 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 0.7　mg/ml G418의 존재 하에 선택한다. 세포를 혈청 함유 배지를 사용하여 250 ml 스피너 플라스크에서 성장시킨다.
100 ml 스피너 배양의 배양 상층액을 10 ml PROSEP-A 칼럼(Bioprocessing, Inc., Princeton, N.J.) 상에 로딩한다. 칼럼을 10 베드 부피의 PBS로 세척한다. 결합된 항체를 50　mM 시트레이트 완충액, pH 3.0으로 용출한다. 동일한 부피의 1　M Hepes, pH 8.0을 정제된 항체가 함유되어 있는 분획에 첨가하여 pH를 7.0으로 조정한다. 잔류하는 염을 PBS로의 완충액 교환에 의해 Millipore 막 한외여과(분자량 컷오프: 3,000)에 의해 제거한다. 정제된 항체의 단백질 농도를 BCA 방법(Pierce)에 의해 결정한다.
4. 키메라 항-MASP-2 Fab의 발현 및 정제
키메라 항-MASP-2 Fab를 분비하는 세포주를 생성하기 위하여, CHO 세포를 pSV2dhfrFd(또는 pSV2dhfrFd/9aa) 및 pSV2neo카파의 정제된 플라스미드 DNA로, 전기천공에 의하여 형질감염시킨다. 형질감염된 세포를 G418 및 메토트렉세이트의 존재 하에 선택한다. 선택된 세포주를 증가하는 농도의 메토트렉세이트에서 증폭시킨다. 세포를 제한 희석에 의하여 단일 세포 하위클로닝한다. 고생산 단일 세포 하위클로닝된 세포주를 그런 후에 혈청 유리 배지를 사용하여 100　ml 스피너 배양으로 성장시킨다.
키메라 항-MASP-2 Fab를 MASP-2 MoAb에 대한 마우스 항-이디오타입 MoAb를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한다. 항-이디오타입 MASP-2 MoAb는 키호울 림펫 헤모시아닌(KLH)와 콘주게이션된 쥐과 항-MASP-2 MoAb로 면역화하고 인간 MASP-2와 경합할 수 있는 특정 MoAb 결합에 대해 스크리닝함으로써 만들어질 수 있다. 정제를 위해, cFab 또는 cFab/9aa를 생성하는 CHO 세포의 스피너 배양으로부터 100　ml의 상층액을 항-이디오타입 MASP-2 MoAb와 결합된 친화성 칼럼 위에 로딩한다. 그런 후 칼럼을 PBS로 철저하게 세척한 다음 결합된 Fab를 50　mM 다이에틸아민, pH 11.5로 용출한다. 잔류하는 염을 위에서 기술한 것과 같이 완충액 교환에 의해 제거한다. 정제된 Fab의 단백질 농도를 BCA 방법(Pierce)에 의해 결정한다.
키메라 MASP-2 IgG, cFab, 및 cFAb/9aa의 MASP-2 의존성 보체 경로 억제 능력을 실시예　2 또는 실시예 7에 기술된 억제 검정을 사용함으로써 결정할 수 있다.
실시예 7
이 실시예는 L-피콜린/P35, H-피콜린, M-피콜린 또는 만난을 통해 MASP-2 의존성 보체 활성화를 차단할 수 있는 MASP-2 억제제를 확인하기 위한 기능성 스크린으로서 사용된 시험관내 C4 절단 검정을 기술한다.
C4 절단 검정: C4 절단 검정은 문헌[Petersen, S.V.,　et　al., J.　Immunol. Methods 257:107, 2001]에 기술되어 있고, L-피콜린에 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스로부터의 리포테이코산(LTA)으로부터 비롯된 렉틴 경로 활성화를 측정한다.
시약: 포르말린 고정 스타필로코쿠스 아우레우스(DSM20233)를 다음과 같이 제조한다: 박테리아를 밤새 37℃에서 트립신 간장 혈액 배지에서 성장시키고, PBS로 3회 세척한 후, 1시간 동안 실온에서 PBS/0.5% 포르말린에서 고정시키고, PBS로 추가로 3회 세척한 후, 코팅 완충액(15　mM Na2Co3, 35　mM NaHCO3, pH 9.6)에 재현탁한다.
검정: Nunc MaxiSorb® 미세역가 플레이트(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)의 웰을: 코팅 완충액 중의 100　μl의 포르말린 고정 스타필로코쿠스 아우레우스 DSM20233(OD550　=　0.5), 코팅 완충액 중의 1　μg의 L-피콜린으로 코팅한다. 밤새 인큐베이션한 후, 웰을 TBS(10　mM Tris-HCl, 140　mM NaCl, pH 7.4) 중의 0.1% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 차단한 후, 0.05% Tween　20 및 5　mM CaCl2가 함유된 TBS(세척 완충액)으로 세척한다. 인간 혈청 샘플을 내인성 C4의 활성화를 방지하고 C1 복합체(C1q, C1r 및 C1s로 구성됨)를 분해하는, 20　mM Tris-HCl, 1　M NaCl, 10　mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4에 희석한다. 항-MASP-2 MoAb 및 억제 펩타이드를 포함한 MASP-2 억제제를 다양한 농도로 혈청 샘플에 첨가한다. 희석된 샘플을 플레이트에 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이션한다. 24시간 후, 플레이트를 세척 완충액으로 철저하게 세척한 후, 100　μl의 4　mM 바르비탈, 145　mM NaCl, 2　mM CaCl2, 1　mM MgCl2, pH 7.4 중의 0.1　μg의 정제된 인간 C4(문헌: Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993에서 기술된 것과 같이 얻어짐)를 각 웰에 첨가한다. 37℃에서 1.5시간 후, 플레이트를 다시 세척하고 C4b 침착을 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이션된 닭 항-인간 C4c(Immunsystem(Uppsala, Sweden)사로부터 얻음)를 사용하여 검출하고 비색 기질 ρ-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정한다.
만난 상의 C4 검정: 위에서 기술한 검정을 MBL을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하기 위하여 플레이트를 LSP 및 만난으로 코팅한 후 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 첨가함으로써 적용한다.
H-피콜린(Hakata Ag) 상의 검정: 위에서 기술한 검정을 H-피콜린을 통한 렉틴 경로 활성화를 측정하기 위하여 플레이트를 LSP 및 H-피콜린으로 코팅한 후 다양한 MASP-2 억제제와 혼합된 혈청을 첨가함으로써 적용한다.
실시예 8
다음의 검정은 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 고전적 경로 활성화의 존재를 입증한다.
방법: 면역 복합체를 미세역가 플레이트(MaxiSorb®, Nunc, cat. No.　442404, Fisher Scientific)를 10　mM Tris, 140　mM NaCl, pH 7.4 중의 0.1% 인간 혈청 알부민으로 1시간 동안 실온에서 코팅한 후 4℃에서 TBS/tween/Ca2+에 1:1000으로 희석된 양 항 전혈청 항혈청(Scottish Antibody Production Unit, Carluke, Scotland)과 함께 밤새 인큐베이션함으로써 제자리 생성하였다. 혈청 샘플을 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어 코팅된 플레이트에 첨가하였다. C1q이 야생형 및 MASP-2-/- 혈청 샘플로부터 고갈된 대조군 샘플을 제조하였다. C1q 고갈 마우스 혈청을 공급체의 지침에 따라, 토끼 항-인간 C1q IgG(Dako, Glostrup, Denmark)으로 코팅된 단백질-A 결합 DynaBeads®(Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 사용하여 제조하였다. 플레이트를 90분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 결합된 C3b를 1:1000으로 TBS/tw/ Ca++에 희석된 다클론성 항-인간-C3c 항체(Dako A 062)로 검출하였다. 이차 항체는 염소 항-토끼 IgG이다.
결과: 도　7은 야생형 혈청, MASP-2-/- 혈청, C1q 고갈 야생형 및 C1q 고갈 MASP-2-/- 혈청에서 IgG로 코팅된 플레이트 상에서의 상대적인 C3b 침착 수준을 도시한다. 이들 결과는 고전적 경로가 MASP-2-/- 마우스 스트레인에서 온전한 것을 입증한다.
실시예 9
다음의 검정을 사용하여 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 조건 하에서 MASP-2 억제제의 효과를 분석함으로써 MASP-2 억제제가 고전적 경로를 차단하는지를 테스트한다.
방법: 고전적 경로가 면역 복합체에 의해 개시되는 보체 활성화 조건에 미치는 MASP-2 억제제의 효과를 테스트하기 위하여, 90% NHS를 함유하는 삼중 50　μl 샘플을 37℃에서 10　μg/ml 면역 복합체(IC) 또는 PBS의 존재 하에 인큐베이션하고, 또한 200　nM 항-프로퍼딘 단클론성 항체를 함유한 병렬 삼중 샘플(+/-IC)을 37℃ 인큐베이션 중에 포함시킨다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후에, 13　mM EDTA를 모든 샘플에 첨가하여 추가의 보체 활성화를 중단시키고 샘플을 즉시 5℃로 냉각시킨다. 그런 후 샘플을 ELISA 키트(Quidel, Catalog Nos. A015 및 A009)를 제조사의 지침을 따라 사용하여 보체 활성화 생성물(C3a 및 sC5b-9)에 대해 검정하기 전에 -70℃에서 보관한다.
실시예 10
이 실시예는 MASP-2 활성을 차단하는 고친화성 항-MASP-2 Fab2 항체 단편의 확인을 기술한다.
배경 및 근거: MASP-2는 MBL 및 피콜린에 대한 결합 부위(들), 세린 프로테아제 촉매 부위, 분백질 분해성 기질 C2에 대한 결합 부위, 단백질 분해성 기질 C4에 대한 결합 부위, MASP-2 자이모겐의 자가활성화를 위한 MASP-2 절단 부위, 및 2개의 Ca++ 결합 부위를 포함한, 많은 별개의 기능성 도메인을 가진 복합체 단백질이다. MASP-2에 대해 고친화성으로 결합하는 Fab2 항체 단편을 확인하였고, 확인된 Fab2 단편을 그것이 MASP-2 기능적 활성을 차단할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여 기능성 검정으로 테스트하였다.
MASP-2 기능적 활성을 차단하기 위하여, 항체 또는 Fab2 항체 단편은 MASP-2 기능적 활성에 필요한 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하여 간섭하여야 한다. 그러므로, 많은 또는 모든 고친화성 결합 항-MASP-2 Fab2는 그것들이 MASP-2 기능적 활성에 직접적으로 관여하는 MASP-2 상의 구조적 에피토프에 결합하지 않는 한 MASP-2 기능적 활성을 억제하지 못할 수 있다.
렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 검정을 사용하여 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하였다. 렉틴 경로에서 MASP-2의 일차적인 생리적 역할은 렉틴 매개 보체 경로의 다음 기능적 구성요소, 즉 렉틴 경로 C3 전환효소를 생성하는 것으로 알려져 있다. 렉틴 경로 C3 전환효소는 C3을 C3a 및 C3b로 단백질 분해적으로 절단하는 중요한 효소 복합체(C4bC2a)이다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 전환효소(C4bC2a)의 구조적 구성요소가 아니다; 그러나, MASP-2 기능적 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 2개의 단백질 구성요소(C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 나아가, 위에서 열거된 MASP-2의 별개의 기능적 활성은 전부 MASP-2가 렉틴 경로 C3 전환효소를 생성하기 위해 필요한 것으로 여겨진다. 이들 이유로, 항-MASP-2 Fab2의 "차단 활성"을 평가하는데 사용하기에 바람직한 검정은 렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 검정인 것으로 여겨진다.
고친화성 Fab2의 생성: 관심의 선택된 리간드와 반응하는 Fab2를 확인하기 위한 인간 가변 경쇄 및 중쇄 항체 서열의 파지 디스플레이 라이브러리 및 자동화된 항체 선택 기술을 사용하여 래트 MASP-2 단백질(서열 번호:55)에 대한 고친화성 Fab2를 생성하였다. 공지된 양의 래트 MASP-2(약 1　mg, >85% 순수함) 단백질을 항체 스크리닝에 사용하였다. 최상의 친화성을 가진 항체의 선택에 3 라운드의 증폭을 활용하였다. 항체 단편을 발현하는 대략 250개의 상이한 히트를 ELISA 스크리닝을 위해 선택하였다. 고친화성 히트를 후속해서 서열분석하여 상이한 항체의 독특성을 결정하였다.
50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 정제하였고 250　μg의 각각의 정제된 Fab2 항체를, 아래에서 보다 상세하게 기술되는 것과 같이, MASP-2 결합 친화성의 특성화 및 보체 경로 기능적 테스트에 사용하였다.
항-MASP-2 Fab2의 억제(차단) 활성을 평가하기 위해 사용된 검정
1. 렉틴 경로 C3 전환효소의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정:
배경: 렉틴 경로 C3 전환효소는 C3을 2개의 강력한 전염증성 단편, 아나필라톡신 C3a 및 옵소닌성 C3b로 단백질 분해적으로 절단하는 효소 복합체(C4bC2a)이다. C3 전환효소의 형성은 염증을 매개하는 점에서 렉틴 경로의 핵심 단계인 것으로 나타난다. MASP-2는 렉틴 경로 C3 전환효소(C4bC2a)의 구조적 구성요소이다; 그러므로 항-MASP-2 항체(또는 Fab2)는 기존의 C3 전환효소의 활성을 직접 억제하지 않을 것이다. 그러나, MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 2개의 단백질 구성요소(C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 항-MASP-2 Fab2(즉, 차단 항-MASP-2 Fab2)는 렉틴 경로 C3 전환효소의 드노보 형성을 억제할 것이다. C3은 특이하고 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 구조의 일부로서 함유한다. 이 검정에서 C3 전환효소에 의한 C3의 절단시, C3b 상의 티오에스테르 기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 거대분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 공유 결합을 형성할 수 있음으로써, ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 알려져 있는 활성자이다. C3 전환효소의 형성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 30분 동안 37℃에서 희석된 래트 혈청과 함께 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화하였다. 그런 후 웰을 세척하고 웰 상에 고정된 C3b에 대해 표준 ELISA 방법을 사용하여 검정하였다. 이 검정으로 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 전환효소의 드노보 형성을 직접적으로 반영한다. 선택된 농도에서 항-MASP-2 Fab2를 C3 전환효소 형성 및 후속되는 C3b 생성을 억제하는 능력에 대해 이 검정으로 테스트하였다.
방법:
96 웰 Costar 배지 결합 플레이트를 50　mM 탄산염 완충액, pH 9.5로 희석된 1 μg/50 μL/웰의 만난과 함께 5℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 각각의 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 그런 후 웰을 PBS 중의 100 μL/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 그런 후 각각의 웰을 200 μL의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃의 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액(4.0　mM 바르비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl2, 2.0　mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)으로 선택된 농도로 희석하였다. 0.5% 래트 혈청을 위의 5℃의 샘플에 첨가하고 100 μL를 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃　수조에서 인큐베이션하여 보체 활성화를 허용하였다. 반응을 플레이트를 37℃ 수조로부터 빙수 혼합물을 함유한 용기로 옮김으로써 중단시켰다. 각각의 웰을 200 μL의 PBS-Tween　20(PBS 중의 0.05% Tween　20)으로 5회 세척한 후, 200 μL PBS로 2회 세척하였다. 100 μL/웰의 일차 항체(토끼 항-인간 C3c, DAKO A0062)의 1:10,000 희석을 2.0　mg/ml 소 혈청 알부민을 함유한 PBS에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 이차 항체(과산화효소 콘쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG, American Qualex A102PU)의 100 μL/웰의 1:10,000 희석을 2.0　mg/ml 소 혈청 알부민을 함유한 PBS에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 진동기 상에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL의 PBS로 5회 세척하였다. 100 μL/웰의 과산화효소 기질 TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 과산화효소 반응을 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가함으로써 중단시키고 OD450을 측정하였다.
2. MASP-2 의존성 C4 절단의 억제를 측정하기 위한 검정
배경: MASP-2의 세린 프로테아제 활성은 매우 특이적이고 MASP-2에 대해 2개의 단백질 기질만이 확인되어 있다; C2 및 C4. C4의 절단으로 C4a 및 C4b가 생성된다. 항-MASP-2 Fab2는 C4에 직접 관여하는 MASP-2 상의 구조적 에피토프(예컨대, C4에 대한 MASP-2 결합 부위; MASP-2 세린 프로테아제 촉매 부위)에 결합할 수 있어서 MASP-2의 C4 절단 기능적 활성을 억제할 수 있다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성자이다. MASP-2의 C4 절단 활성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 30분 동안 37℃에서 희석된 래트 혈청과 함께 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화하였다. 이 ELISA 검정에서 사용된 일차 항체가 인간 C4만을 인식하기 때문에, 희석된 래트 혈청을 또한 인간 C4(1.0 μg/ml)로 보충하였다. 그런 후 웰을 세척하고 웰 상에 고정된 인간 C4b에 대해 표준 ELISA 방법을 사용하여 검정하였다. 이 검정으로 생성된 C4b의 양은 MASP-2 의존적 C4 절단 활성의 척도이다. 선택된 농도에서 항-MASP-2 Fab2를 C4 절단을 억제하는 능력에 대해 이 검정으로 테스트하였다.
방법: 96 웰 Costar 배지 결합 플레이트를 50　mM 탄산염 완충액, pH 9.5로 희석된 1 μg/50 μL/웰의 만난과 함께 5℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 그런 후 웰을 PBS 중의 100 μL/웰의 1% 소 혈청 알부민으로 차단하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL의 PBS로 3회 세척하였다. 항-MASP-2 Fab2 샘플을 5℃의 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액(4.0　mM 바르비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl2, 2.0　mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)으로 선택된 농도로 희석하였다. 이들 샘플에는 또한 1.0 μg/ml 인간 C4(Quidel)가 포함되었다. 0.5% 래트 혈청을 위의 5℃의 샘플에 첨가하고 100 μL를 각 웰로 옮겼다. 플레이트를 덮고 30분 동안 37℃　수조에서 인큐베이션하여 보체 활성화를 허용하였다. 반응을 플레이트를 37℃ 수조로부터 빙수 혼합물을 함유한 용기로 옮김으로써 중단시켰다. 각각의 웰을 200 μL의 PBS-Tween　20(PBS 중의 0.05% Tween　20)으로 5회 세척한 후, 각각의 웰을 200 μL PBS로 2회 세척하였다. 100 μL/웰의 비오틴 콘주게이션된 닭 항-인간 C4c(Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)의 1:700 희석을 2.0　mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 100 μL/웰의 0.1 μg/ml의 과산화효소 콘쥬게이션된 스트렙트아비딘(Pierce Chemical #21126)을 2.0　mg/ml BSA를 함유한 PBS에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 진동기 상에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL의 PBS로 5회 세척하였다. 100 μL/웰의 과산화효소 기질 TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 16분 동안 인큐베이션하였다. 과산화효소 반응을 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가함으로써 중단시키고 OD450을 측정하였다.
3. 항-래트 MASP-2 Fab2의 '천연' 래트 MASP-2에의 결합 검정
배경: MASP-2는 일반적으로 특정 렉틴 분자(만노스 결합 단백질(MBL) 및 피콜린)를 또한 포함하는 MASP-2 이량체 복합체로서 혈장에 존재한다. 그러므로, 만약 당업자가 MASP-2의 생리적으로 관련된 형태에 대한 항-MASP-2 Fab2의 결합을 연구하는데 관심이 있다면, 정제된 재조합 MASP-2보다는 혈장의 '천연' MASP-2와 Fab2 사이의 상호작용이 사용되는 결합 검정을 개발하는 것이 중요하다. 이 결합 검정에서 10% 래트 혈청으로부터의 '천연' MASP-2-MBL 복합체를 먼저 만나 코팅 웰 상에 고정시켰다. 그런 후에 고정된 '천연' MASP-2에 대한 다양한 항-MASP-2 Fab2의 결합 친화성을 표준 ELISA 방법을 사용하여 연구하였다.
방법: 96 웰 Costar 하이 결합 플레이트를 50　mM 탄산염 완충액, pH 9.5로 희석된 1 μg/50 μL/웰의 만난과 함께 5℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 3회 세척하였다. 웰을 PBST(0.05% Tween　20이 있는 PBS) 중의 100 μL/웰의 무지방 분유로 차단하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 고염 결합 완충액(20　mM Tris, 1.0 M NaCl, 10　mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1%(중량/부피) 소 혈청 알부민, pH 7.4) 중의 10% 래트 혈청을 얼음에서 제조하였다. 100 μL/웰을 첨가하고 5℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 200 μL의 TBS/Tween/Ca++ 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 그런 후 웰을 200 μL PBS로 2회 세척하였다. Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액(4.0　mM 바르비탈, 141　mM NaCl, 1.0　mM MgCl2, 2.0　mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석된 100 μL /웰의 선택된 농도의 항-MASP-2 Fab2를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. PBS 중의 2.0　mg/ml 소 혈청 알부민에 희석된 100 μL/웰의 HRP 콘쥬게이션된 염소 항-Fab2(Biogenesis Cat No 0500-0099)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 웰을 200 μL PBS로 5회 세척하였다. 100 μL/웰의 과산화효소 기질 TMB(Kirkegaard　& Perry Laboratories)를 첨가하고 실온에서 70분 동안 인큐베이션하였다. 과산화효소 반응을 100 μL/웰의 1.0 M H3PO4를 첨가함으로써 중단시키고 OD450을 측정하였다.
결과:
래트 MASP-2 단백질에 고친화성으로 반응한 대략 250개의 상이한 Fab2를 ELISA 스크리닝을 위해 선택하였다. 이들 고친화성 Fab2를 상이한 항체의 독특성을 결정하기 위하여 서열분석하고, 50개의 독특한 항-MASP-2 항체를 추가 분석을 위해 정제하였다. 250　μg의 각각의 정제된 Fab2 항체를 MASP-2 결합 친화성의 특성화 및 보체 경로 기능성 테스트를 위해 사용하였다. 이 분석의 결과를 아래의 표 6에 제시한다.
위의 표 6에서 제시된 것과 같이, 테스트된 50개의 항-MASP-2 Fab2 중에서, 17개의 Fab2를 10　nM Fab2 이하의 IC50으로 C3 전환효소 형성을 억제하는 MASP-2 차단 Fab2로서 확인하였다(34% 양성 적중률). 17개의 Fab2 중 8개를 나노몰 미만 범위의 IC50을 가지는 것으로 확인하였다. 나아가, 표 6에 제시된 17개의 MASP-2 차단 Fab2는 모두 렉틴 경로 C3 전환효소 검정에서 본질적으로 완전한 C3 전환효소 형성 억제를 제공하였다. 도　8A는 테스트된 다른 Fab2 항체를 대표하는 Fab2 항체　#11에 대한 C3 전환효소 형성 검정의 결과를 그래프로 도시하며, 그 결과는 표 6에 제시된다. 이것은 이론적으로는 각각의 MASP-2 분자가 Fab2에 의해 결합되었을 때에도 "차단" Fab2가 MASP-2 기능만을 부분적으로 억제할 수 있는 것이 가능하기 때문에, 중요한 고려사항이다.
비록 만난이 렉틴 경로의 공지된 활성자이지만, 이론적으로는 래트 혈청 중의 항-만난 항체의 존재가 또한 고전적 경로를 활성화하고 고전적 경로 C3 전환효소를 통해 C3b를 생성하는 것이 가능하다. 그러나, 이 실시예에서 열거된 17개의 차단 항-MASP-2 Fab2는 각각 C3b 생성을 강력하게 억제하며(>95%), 따라서 렉틴 경로 C3 전환효소에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다.
결합 검정을 또한 17개의 차단 Fab2의 각각에 대한 외관상 Kd를 계산하기 위하여 17개 전부를 사용하여 수행하였다. 차단 Fab2에 대해 천연 래트 MASP-2에 대한 항-래트 MASP-2 Fab2의 결합 검정의 결과를 또한 표 6에 제시한다. 도 8B는 Fab2 항체 #11을 사용한 결합 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 유사한 결합 검정을 또한 다른 Fab2에 대해서도 수행하였고, 그 결과를 표 6에 제시한다. 일반적으로, '천연' MASP-2에 대한 6개의 Fab의 각각의 결합에 대해 얻어진 외관상 Kd는 C3 전환효소 기능성 검정에서 Fab2에 대한 IC50과 꽤 합리적으로 상응한다. 프로테아제 활성의 활성화시 MASP-2가 '비활성' 형태로부터 '활성' 형태로 형태적 변화를 진행한다는 증거가 있다(Feinberg　et　al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal　et　al., J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005)). C3 전환효소 형성 검정에 사용된 정상적인 래트 혈장에서, MASP-2는 '비활성' 지모산 형태로 주로 존재한다. 대조적으로, 결합 검정에서, MASP-2는 고정된 만난에 결합된 MBL과의 복합체의 일부로서 존재한다; 그러므로, MASP-2는 '활성' 형태로 존재할 것이다(Petersen　et　al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). 결과적으로, 당업자는 각각의 검정에서 Fab2가 MASP-2의 상이한 형태적 형태에 결합할 것이기 때문에, 이들 두 기능성 검정에서 테스트된 17개의 차단 Fab2의 각각에 대한 IC50과 Kd 사이에서 정확한 관련성을 반드시 예상하지는 못할 것이다. 그럼에도 불구하고, Fab2 #88을 예외로 하고, 두 검정에서 테스트된 다른 16개의 Fab2의 각각에 대해서는, IC50과 외관상 Kd 사이의 합리적으로 밀접한 관련성이 있는 것으로 나타난다(표 6 참고).
몇 개의 차단 Fab2를 C4의 MASP-2 매개 절단의 억제에 대해 평가하였다. 도 8C는 Fab2 #41로의 억제를 보이는 C4 절단 검정의 결과를 그래프로 도시하며, IC50=0.81　nM이다(표 6 참고). 도　9에서 나타낸 것과 같이, 테스트된 모든 Fab2는 C3 전환효소 검정에서 얻어진 것과 유사한 IC50으로 C4 절단을 억제하는 것으로 나타났다(표 6 참고).
비록 만난이 렉틴 경로의 공지된 활성자이지만, 이론적으로는 래트 혈청 중의 항-만난 항체의 존재가 또한 고전적 경로를 활성화함으로써 C4의 C1s 매개 절단에 의해 C4b를 생성하는 것이 가능하다. 그러나, 몇 개의 항-MASP-2 Fab2는 C4b 생성을 강력하게 억제하는 것으로 확인되었고(>95%), 따라서 MASP-2 매개 C4 절단에 대한 이 검정의 특이성을 입증한다. C3과 같이 C4는 특이하고 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 구조의 일부로서 함유한다. 이 검정에서 MASP-2에 의한 C4의 절단시, C4b 상의 티오에스테르 기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 거대분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 공유 결합을 형성할 수 있음으로써, ELISA 검정에서 C4b의 검출을 용이하게 한다.
이들 연구는 C4 및 C3 전환효소 활성을 둘 다 기능적으로 차단함으로써 렉틴 경로 활성화를 방지하는 래트 MASP-2 단백질에 대한 고친화성 Fab2의 생성을 분명하게 입증한다.
실시예 11
이 실시예는 실시예 10에서 기술된 것과 같이 생성된 항-래트 MASP-2 Fab2 항체를 차단하는 몇 개의 에 대한 에피토프 지도화를 기술한다.
방법:
도　10에서 나타낸 것과 같이, 모두 N 말단 6X His 태그를 가지고 있는 다음의 단백질을 pED4 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 발현시켰다:
래트 MASP-2A, 활성 센터에서 세린을 알라닌으로 변경시킴(S613A)으로써 비활성화된 전장 MASP-2 단백질;
래트 MASP-2K, 자가 활성화가 감소되도록 변경된(R424K) 전장 MASP-2 단백질;
CUBI-II, CUBI, EGF 유사 및 CUBII 도메인암을 함유하는 래트 MASP-2의 N 말단 단편; 및
CUBI/EGF 유사, CUBI 및 EGF 유사 도메인만을 함유하는 래트 MASP-2의 N 말단 단편.
이들 단백질을 이전에 기술된 것과 같이, 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 상층액으로부터 정제하였다(Chen　et　al., J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001)).
래트 MASP-2의 CCPII 및 세린 프로테아제 도메인를 함유한 C 말단 폴리펩타이드(CCPII-SP)를 이. 콜라이에서 pTrxFus(Invitrogen)를 사용하여 티오레독신 융합 단백질로서 발현하였다. 단백질을 티오결합 친화성 수지를 사용하여 세포 용해물로부터 정제하였다. 음성 대조군으로서 티오레독신 융합 파트너를 빈(empty) pTrxFus로부터 발현시켰다.
모든 재조합 단백질을 TBS 완충액에 투석하였고 ㄱ그그것의 농도를 280 nm에서 OD를 측정함으로써 결정하였다.
돗트 블롯 분석:
위에서 기술되고 도 10에 도시된 5개의 재조합 MASP-2 폴리펩타이드(및 CCPII-세린 프로테아제 폴리펩타이드에 대한 음성 대조군으로서 티오레독신 폴리펩타이드)를 니트로셀룰로스 막 위에 스폿팅하였다. 스폿팅된 단백질의 양은 100 ng 내지 6.4 pg까지, 5배 단계의 범위였다. 후기 실험에서, 스폿팅된 단백질의 양은 50 ng 내지 16 pg까지, 다시 5배 단계의 범위였다. 막을 TBS(차단 완충액) 중의 5% 탈지유 분말로 차단한 후 차단 완충액(5.0　mM Ca2+ 함유함) 중의 1.0 μg/ml 항-MASP-2 Fab2와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 Fab2를 HRP 콘쥬게이션된 항-인간 Fab(AbD/Serotec; 1/10,000으로 희석됨) 및 ECL 검출 키트(Amersham)를 사용하여 검출하였다. 한 개의 막을 양성 대조군으로서 다클론성 토끼-항 인간 MASP-2 Ab(Stover　et　al., J Immunol 163:6848-59 (1999)에서 기술됨)와 함께 인큐베이션하였다. 이 경우, 결합된 Ab를 HRP 콘쥬게이션된 염소 항-토끼 IgG(Dako; 1/2,000으로 희석됨)를 사용하여 검출하였다.
MASP-2 결합 검정
ELIS플레이트를 탄산염 완충액(pH　9.0) 중의 1.0 μg/웰의 재조합 MASP-2A 또는 CUBI-II 폴리펩타이드로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 웰을 PBS 중의 1% BSA로 차단한 후, 5.0　mM Ca2+를 함유한 TBS 중의 연속 희석된 항-MASP-2 Fab2를 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. TBS/tween/Ca2+로 3회 세척한 후, TBS/Ca2+에 1/10,000으로 희석된 HRP 콘쥬게이션된 항-인간 Fab(AbD/Serotec)를 첨가하고 플레이트를 추가로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 TMB 과산화효소 기질 키트(Biorad)를 사용하여 검출하였다.
결과:
Fab2의 다양한 MASP-2 폴리펩타이드와의 반응성을 입증하는 돗트 블롯 분석의 결과를 아래의 표 7에 제공한다. 표 7에 제공된 수치는 대략 최대 절반의 신호 강도를 제공하기 위해 필요한 스폿팅된 단백질의 양을 나타낸다. 제시된 것과 같이, 모든 폴리펩타이드(티오레독신 융합 파트너 단독은 예외임)는 양성 대조군 Ab(다클론성 항-인간 MASP-2 혈청, 토끼에서 생성됨)에 의해 인식되었다.
NR　=　반응 없음. 양성 대조군 항체는 토끼에서 생성된 다클론성 항-인간 MASP-2 혈청임.
모든 Fab2는 MASP-2A뿐만 아니라 MASP-2K와도 반응하였다(데이터 미제시). 대부분의 Fab2는 N 말단 단편이 아니라 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하였다. 2가지 예외는 Fab2 #60 및 Fab2 #57이다. Fab2 #60은 MASP-2A 및 CUBI-II 단편을 인식하지만, CUBI/EGF 유사 폴리펩타이드나 CCPII-SP 폴리펩타이드를 인식하지 못하며, 이것은 그것이 CUBII의 에피토프에 결합하거나, 또는 CUBII 및 EGF 유사 도메인에 걸쳐 있음을 시사한다. Fab2 # 57은 MASP-2A를 인식하지만 테스트된 MASP-2 단편은 어느 것도 인식하지 못하였으며, 이것은 이 Fab2가 CCP1의 에피토프를 인식하는 것을 가리킨다. Fab2 #40 및 #49는 완전한 MASP-2A에만 결합하였다. 도 11에 도시된 ELISA 결합 검정에서, Fab2 #60은 또한 외관상 친화도는 약간 더 낮지만, CUBI-II 폴리펩타이드에 결합하였다.
이들 결과는 MASP-2 단백질의 다수의 영역에 대한 독특한 차단 Fab2의 확인을 입증한다.
실시예 12
이 실시예는 파지 디스플레이를 사용하여, 면역 체계의 고전적(C1q 의존성) 경로 구성요소를 온전하게 남겨두면서 MASP-2에 결합하여 렉틴 매개 보체 활성화를 억제하는 전체 인간 scFv 항체의 확인을 기술한다.
개요 :
전체 인간, 고친화성 MASP-2 항체를 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인하였다. 항체의 가변 경쇄 및 중쇄 단편을 scFv 형식과 전장 IgG 형식 둘 다로 분리하였다. 인간 MASP-2 항체는 면역 체계의 고전적(C1q 의존성) 경로 구성요소를 온전하게 남겨두면서 렉틴 경로 매개 보체 경로 활성화와 관련된 세포 손상을 억제하는데 유용하다. 일부 구체예에서, 대상체 MASP-2 억제 항체는 다음의 특징을 갖는다: (a) 인간 MASP-2에 대한 고친화성(예컨대, 10 nM 이하의 KD), 및 (b) 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC50으로 MASP-2 의존성 보체 활성을 억제한다.
방법 :
전장 촉매적 비활성 MASP-2의 발현 :
리더 서열이 있는 인간 MASP-2 폴리펩타이드(서열 번호:5)를 암호화하는 인간 MASP-2(서열 번호: 4)의 전장 cDNA 서열을, CMV 인핸서/프로모터 영역의 제어 하에 진핵 발현을 구동시키는 포유류 발현 벡터 pCI-Neo(Promega)에 하위클로닝하였다(Kaufman R.J.　et　al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)에서 기술됨).
촉매적 비활성 인간 MASP-2A 단백질을 생성하기 위하여, 부위 지정 돌연변이생성을 본원에 참조로 포함된 US2007/0172483에서 기술된 것과 같이 수행하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동 및 밴드 제조 후에 정제하였고 단일 아데노신 중첩을 표준 테일링 과정을 사용하여 생성하였다. 그런 후 아데노신이 달린 MASP-2A를 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하고 이. 콜라이에 형질전환시켰다. 인간 MASP-2A를 포유류 발현 벡터 pED 또는 pCI-Neo 중 어느 하나에 추가로 하위클로닝하였다.
위에서 기술된 MASP-2A 발현 구성물을 표준 칼슘 포스페이트 형질감염 과정(Maniatis　et　al., 1989)을 사용하여 DXB1 세포에 형질감염시켰다. MASP-2A를 혈청 유리 배지에서 생성하여 조제물이 다른 혈청 단백질로 오염되지 않은 것을 보장하였다. 배지를 2일마다 합류 세포로부터 수득하였다(총 4회). 재조합 MASP-2A의 수준은 평균 대략 1.5　mg/배양 배지 리터였다. MASP-2A(위에서 기술된 Ser-Ala 돌연변이)를 MBP-A-아가로스 칼럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
패닝/scFv 전환 및 필터 스크리닝에 의해 확인된 ScFv 후보 클론에 대한 MASP-2A ELISA
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 항원 패닝 후 자동화된 항체 스크리닝 및 인간 MASP-2 단백질에 대한 고친화성 scFv 항체를 확인하기 위한 선택 과정에 적용하였다. HIS 태그 부착 또는 비오틴 태그 부착된 MASP-2A에 대해 scFv 파지 라이브러리를 패닝하는 3개 라운드를 수행하였다. 제3 라운드의 패닝을 먼저 MBL로 용출한 후 TEA(알칼리성)로 용출하였다. 표적 MASP-2A에 대해 scFv 단편을 나타내는 파지의 특정 풍부화를 모니터링하기 위해, 고정된 MASP-2A에 대한 다클론성 파지 ELISA를 수행하였다. 패닝 라운드 3으로부터의 scFv 유전자를 pHOG 발현 벡터에 클로닝하고 MASP-2A에 대한 특정 클론을 찾기 위해 소규모 필터 스크리닝에서 실행시켰다.
제3 라운드의 패닝으로부터 scFv 단편을 암호화하는 플라스미드를 함유한 박테리아 콜로니를 선택하고, 니트로셀룰로스 막 위에 그리딩하고 비유도 배지에서 밤새 성장시켜서 마스터 플레이트를 생성하였다. 제3 패닝 라운드로부터 총 18,000개 콜로니를, 절반은 경합 용출로부터 절반은 후속 TEA 용출로부터 선택하여 분석하였다. MASP-2A에 대한 scFv 파지미드 라이브러이의 패닝에 이어 scFv 전환 및 필터 스크리닝으로 137개의 양성 클론을 얻었다. 108/137개의 클론이 MASP-2 결합에 대한 ELISA 검정에서 양성이었고(데이터 미제시), 그 중 45개 클론을 정상 인간 혈청에서 MASP-2 활성을 차단하는 능력에 대해 추가로 분석하였다.
렉틴 경로 C3 전환효소의 형성의 억제를 측정하기 위한 검정
렉틴 경로 C3 전환효소 형성의 억제를 측정하는 기능성 검정을 사용하여 MASP-2 scFv 후보 클론의 "차단 활성"을 평가하였다. MASP-2 세린 프로테아제 활성은 렉틴 경로 C3 전환효소를 포함하는 두 단백질 구성요소(C4b, C2a)를 생성하기 위해 필요하다. 그러므로, MASP-2 기능적 활성을 억제하는 MASP-2 scFv(즉, 차단 MASP-2 scFv)는 렉틴 경로 C3 전환효소의 드노보 형성을 억제할 것이다. C3은 특이하고 고도로 반응성인 티오에스테르 기를 구조의 일부로서 함유한다. 이 검정에서 C3 전환효소에 의한 C3의 절단시, C3b 상의 티오에스테르 기는 플라스틱 웰의 바닥에 고정된 거대분자 상의 하이드록실 또는 아미노 기와 에스테르 또는 아미드 결합을 통해 공유 결합을 형성할 수 있음으로써, ELISA 검정에서 C3b의 검출을 용이하게 한다.
효모 만난은 렉틴 경로의 공지된 활성자이다. C3 전환효소의 형성을 측정하기 위한 다음의 방법에서, 만난으로 코팅된 플라스틱 웰을 희석된 인간 혈청과 함께 인큐베이션하여 렉틴 경로를 활성화하였다. 그런 후 웰을 세척하고 웰 상에 고정된 C3b에 대해 표준 ELISA 방법을 사용하여 검정하였다. 이 검정으로 생성된 C3b의 양은 렉틴 경로 C3 전환효소의 드노보 형성을 직접적으로 반영한다. 선택된 농도의 MASP-2 scFv 클론을 C3 전환효소 형성 및 후속 C3b 생성을 억제하는 능력에 대해 이 검정으로 테스트하였다.
방법 :
위에서 기술된 것과 같이 확인된 45개의 후보 클론을 발현시키고, 정제하고 동일한 스톡 농도로 희석하고, 그것을 다시 Ca++ 및 Mg++ 함유 GVB 완충액(4.0 mM 바르비탈, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% 젤라틴, pH 7.4)에 희석하여 모든 클론이 동일한 양의 완충액을 가진 것을 확실하게 하였다. scFv 클론을 각각 삼중으로 2 μg/mL의 농도에서 테스트하였다. 양성 대조군은 OMS100 Fab2였고 이것을 0.4 μg/mL에서 테스트하였다. C3c 형성을 scFv/IgG 클론의 존재 및 부재 하에 모니터링하였다.
만난을 50 mM 탄산염 완충액(15 mM Na2CO3 + 35 mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3), pH 9.5에서 20 μg/mL(1 μg/웰)의 농도로 희석하고 ELIS플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 만난 코팅된 플레이트를 200　μl PBS로 3회 세척하였다. 그런 후 100 μl의 1% HSA 차단 용액을 웰에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 200 μl PBS로 3회 세척하고, 샘플을 첨가할 때까지 200 μl PBS와 함께 얼음에서 보관하였다.
정상 인간 혈청을 CaMgGVB 완충액으로 0.5%로 희석하고, scFv 클론 또는 OMS100 Fab2 양성 대조군을 0.01 μg/mL에서 삼중으로 첨가하고; 1 μg/mL(OMS100 단독 대조군) 및 10 μg/mL을 이 완충액에 첨가하고 45분 동안 얼음에서 사전 인큐베이션한 후에 차단된 ELIS플레이트에 첨가하였다. 반응을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 개시하고 플레이트를 얼음 배스로 옮김으로써 중단시켰다. C3b 침착을 토끼 α-마우스 C3c 항체와 이어서 염소 α-토끼 HRP로 검출하였다. 음성 대조군은 항체가 없는 완충액(항체 없음 = 최대 C3b 침착)이었고, 양성 대조군은 EDTA가 있는 완충액(C3b 침착 없음)이었다. 배경을 웰이 만난이 없는 것을 제외하고 동일한 검정을 수행함으로써 결정하였다. 만난이 없는 플레이트에 대한 배경 신호를 만난 함유 웰의 신호로부터 뺐다. 컷오프 기준을 무관한 scFv 클론(VZV) 및 완충액 단독의 활성의 절반으로 설정하였다.
결과 : 컷오프 기준을 토대로, 총 13개의 클론이 MASP-2의 활성을 차단하는 것이 나타났다. 50%를 초과하는 경로 억제를 생성하는 13개의 클론 전부를 선택하고 서열분석하여 10개의 독특한 클론을 얻었다. 10개의 클론이 전부 동일한 경쇄 하위부류인 λ3, 그러나 3개의 상이한 중쇄 하위부류: VH2, VH3 및 VH6을 가지는 것으로 나타났다. 기능성 검정에서, 10개의 후보 scFv 클론 중 5개가 0.5% 인간 혈청을 사용하여 25 nM 표적 기준보다 낮은 IC50 nM 값을 제공하였다.
개선된 효능을 가진 항체를 확인하기 위하여, 위에서 기술된 것과 같이 확인된 3개의 모(mother) scFv 클론을, 경쇄 셔플링에 적용하였다. 이 과정은 6개의 건강한 도너로부터 유래된 나이브, 인간 람다 경쇄(VL)의 라이브러리와 쌍을 형성한 모 클론의 각각의 VH로 이루어지는 조합 라이브러리의 생성을 포함하였다. 그런 후 이 라이브러리를 개선된 결합 친화성 및/또는 기능성을 가진 scFv 클론에 대해 스크리닝하였다.
아래에서 위의 표 8에 제시한 모 클론 및 딸 클론에 대한 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 제시한다.
Kabat CDR(31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-107(H3))은 진하게 표시되고; Chothia CDR(26-32(H1), 52-56(H2) 및 95-101(H3))은 밑줄로 표시된다.
17D20_35VH-21N11VL 중쇄 가변 영역(VH)(서열 번호:67, 서열 번호:66에 의해 암호화됨)
d17N9 중쇄 가변 영역(VH)(서열 번호:68)
아래에서 위의 표 8에 제시한 모 클론 및 딸 클론에 대한 경쇄 가변 영역(VL) 서열을 제시한다.
Kabat CDR(24-34(L1); 50-56(L2); 및 89-97(L3))은 진하게 표시되고; Chothia CDR(24-34(L1); 50-56(L2) 및 89-97(L3))은 밑줄로 표시된다. 이들 영역은 Kabat 시스템에 의해 넘버링되든 Chothia 시스템에 의해 넘버링되든 동일하다.
17D20m_d3521N11 경쇄 가변 영역(VL)(서열 번호:69, 서열 번호:70에 의해 암호화됨)
17N16m_d17N9 경쇄 가변 영역(VL)(서열 번호:71)
고친화성으로 인간 MASP-2에 결합하고 기능적 보헤 활성을 차단하는 능력을 가진 것으로 입증된 MASP-2 항체 OMS100 및 MoAb_d3521N11VL(서열 번호:67로서 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 경쇄 가변 영역을 포함함, 또한 "OMS646" 및 "mAb6"로서 언급됨)을 돗트 블롯 분석에 의해 에피토프 결합과 관련하여 분석하였다. 결과는 OMS646 및 OMS100 항체가 MASP-2에 대해 고도로 특이적이며 MASP-1/3에 결합하지 않는 것을 보여준다. MAp19 또는 MASP-2 단편에 결합된 항체는 어느 것도 MASP-2의 CCP1 도메인을 함유하지 않았고, 결합 부위가 CCP1을 포함한다는 결론에 도달하였다.
MASP-2 항체 OMS646을 C1s, C1r 또는 MASP-1과 비교했을 때 >5000배 선택성으로 재조합 MASP-2에 강력하게 결합하는 것으로 결정하였다(Kd 60-250 pM)(아래의 표 9 참고):
* 평균±SD; n=12
OMS646은 말단 보체 구성요소의 렉틴 의존성 활성화를 특이적으로 차단한다
방법:
막 공격 복합체(MAC) 침착에 미치는 OMS646의 영향을 렉틴 경로, 고전적 경로 및 대체 경로에 대한 경로 특이적 조건을 사용하여 분석하였다. 이 목적에 대해, Wieslab Comp300 보체 스크리닝 키트(Wieslab, Lund, Sweden)를 제조사의 지침을 따라 사용하였다.
결과:
도 12A는 렉틴 경로 특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체(OMS646)의 존재 또는 부재 하에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 12B는 고전적 경로 특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체(OMS646)의 존재 또는 부재 하에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다. 도 12C는 대체 경로 특이적 검정 조건 하에 항-MASP-2 항체(OMS646)의 존재 또는 부재 하에 MAC 침착의 수준을 그래프로 도시한다.
도 12A에서 나타낸 것과 같이, OMS646은 대략 1 nM의 IC50 값으로 MAC 침착의 렉틴 경로 매개 활성화를 차단한다. 그러나, OMS646은 고전적 경로 매개 활성화(도 12B) 또는 대체 경로 매개 활성화(도 12C)로부터 생성된 MAC 침착에는 영향을 나타내지 않았다.
마우스에 대한 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 투여 후 OMS646의 약동학 및 약력학
OMS646의 약동학(PK) 및 약력학(PD)을 마우스에서 28일 단일 용량 PK/PD 연구로 평가하였다. 연구는 피하(SC)로 투여된 5 mg/kg 및 15 mg/kg의 OMS646의 용량 수준뿐만 아니라, 정맥내(IV)로 투여된 5mg/kg OMS646의 용량 수준을 테스트하였다.
OMS646의 PK 프로파일과 관련하여, 도 13은 표시된 용량에서 OMS646의 투여 후 시간의 함수로서 OMS646 농도(그룹당 n=3마리 동물의 평균)를. 그래프로 도시한다. 도 13에서 나타낸 것과 같이, 5 mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1-2일 후에 5-6 μg/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 5 mg/kg SC에서 OMS646의 생체이용률은 대략 60%였다. 도 13에서 추가로 도시된 것과 같이, 15 mg/kg SC에서, OMS646은 투약 후 대략 1 내지 2일 후에 10-12 μg/mL의 최대 혈장 농도에 도달하였다. 모든 그룹의 경우, OMS646은 대FIR 8-10일의 말단 반감기로 전신 순환으로부터 느리게 제거되었다. OMS646의 프로파일은 마우스에서 인간 항체에 전형적이다.
OMS646의 PD 활성은 도 14A 및 14B에서 그래프로 도시된다. 도 14A 및 14B는 5 mg/kg IV(도 14A) 및 5 mg/kg SC(도 14B) 그룹에서 각 마우스에 대한 PD 반응(전신적 렉틴 경로 활성의 강하)을 도시한다. 점선은 검정의 기준선을 나타낸다(최대 억제; 검정 전 과잉 OMS646으로 시험관내에서 스파이크된 나이브 마우스 혈청). 도 14A에서 나타낸 것과 같이, 5 mg/kg의 OMS646의 정맥내 투여 후에, 전신적 렉틴 경로 활성은 즉시 검출 가능하지 않은 수준 가까이로 떨어졌고, 렉틴 경로 활성은 28일의 관찰 기간 동안 중간 정도의 회복만을 나타냈다. 도 14B에서 나타낸 것과 같이, 5 mg/kg의 OMS646가 피하로 투여된 마우스에서, 렉틴 경로 활성의 시간 의존성 억제가 관찰되었다. 렉틴 경로 활성은 약물 투여 후 24시간 내에 검출 가능하지 않은 수준 가까이로 떨어졌고 적어도 7일 동안 저수준으로 유지되었다. 렉틴 경로 활성은 시간 경과에 따라 점차 증가하였지만, 28일 관찰 기간 내에 용량 전 수준으로 회복되지 못하였다. 15 mg/kg의 피하 투여 후 관찰된 시간 대비 렉틴 경로 활성 프로파일은 5 mg/kg SC 용량과 유사하였고(데이터 미제시), PD 종점의 포화를 나타냈다. 데이터는 정맥 내 또는 피하로 투여된 5 mg/kg의 OMS646의 주간 투여가 마우스에서 전신적 렉틴 경로 활성의 지속적인 억제를 달성하기에 충분한 것을 추가로 나타냈다.
실시예 13
이 실시예는 MASP-2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 CDR 및 적어도 하나의 SGMI 코어 펩타이드 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2를 억제하는 재조합 항체(또한 SGMI-펩타이드 포함 MASP-2 항체 또는 그것의 항원 결합 단편으로도 언급됨)의 생성을 기술한다.
배경/근거:
SGMI-2로 불리는, MASP-2의 특정 억제제의 생성은 문헌[Heja et al., J Biol Chem 287:20290 (2012) 및 Heja et al., PNAS 109:10498 (2012)]에 기술되어 있고, 이들 문헌은 각각 참조로 본원에 포함된다. SGMI-2는 프로테아제 결합 루프의 8개의 위치 중 6개가 완전히 랜덤화되어 있는 스키스토세르카 그레가리아(Schistocerca gregaria) 프로테아제 억제제 2의 변이체의 파지 라이브러리로부터 선택된 36개 아미노산 펩타이드이다. 후속 시험관내 진화로 한 자릿수 nM KI 값을 가지는 단일 특이적 억제제를 얻었다(Heja et al., J. Biol. Chem. 287:20290, 2012). 구조적 연구는 최적화된 프로테아제 결합 루프가 두 억제제의 특이성을 규정하는 일차 결합 부위를 형성한 것을 드러냈다. 연장된 이차 및 내부 결합 영역의 아미노산 서열은 두 억제제에 공통되며 접촉 인터페이스에 기여한다(Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290). 기계적으로, SGMI-2는 고전적 경로에 영향을 미치지 않으면서 보체 활성화의 보체 경로를 차단한다(Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498).
SGMI-2 억제제의 아미노산 서열을 아래에서 제시한다:
SGMI-2-전장: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ(서열 번호:72)
SGMI-2-중간: TCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ(서열 번호:73)
SGMI-2-짧은: ..TCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ(서열 번호:74)
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 그리고 또한 WO2014/144542에서 기술되는 것과 같이, SGMI-2 펩타이드를 포함하는 MASP-2 항체 및 그것의 단편을 SGMI-2 펩타이드 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호: 72, 73 또는 74)을 인간 MASP-2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합시킴으로써 생성하였다. SGMI-2 펩타이드 포함 MASP-2 항체 및 단편은, WO2014/144542에서 기술되는 것과 같이 인간 혈청을 사용하여 C3b 또는 C4b 침착 검정으로 측정될 때, SGMI-2 펩타이드 서열을 함유하지 않은 네이키드 MASP-2 스캐폴드 항체와 비교하여 향상된 억제 활성을 가지며, 또한 생체내에서 마우스 모델에서 측정될 때 네이키드 MASP-2 스캐폴드 항체와 비교하여 향상된 억제 활성을 가진다. SGMI-2 펩타이드 포함 MASP-2 항체의 생성 방법을 아래에서 기술한다.
방법:
SGMI-2 펩타이드가 대표적인 MASP-2 억제 항체 OMS646(실시예 12에서 기술된 것과 같이 생성됨)의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C 말단에 융합되어 있는, 4개의 예시의 SGMI-2 펩타이드 포함 MASP-2 항체를 암호화하기 위한 발현 구성물을 생성하였다.
표 10의 약어:
"H-N"= 종쇄의 아미노 말단
"H-C"= 중쇄의 카르복실 말단
"L-N"= 경쇄의 아미노 말단
"L-C"= 경쇄의 카르복실 말단
"M2"= MASP-2 ab 스캐폴드(대표적인 OMS646)
표 10에서 제시된 N 말단 융합의 경우, 펩타이드 링커('GTGGGSGSSS' 서열 번호: 79)를 SGMI-2 펩타이드와 가변 영역 사이에 첨가하였다.
표 10에서 제시된 C 말단 융합의 경우, 펩타이드 링커('AAGGSG' 서열 번호: 80)를 불변 영역과 SGMI-2 펩타이드 사이에 첨가하였고, 제2 펩타이드 "GSGA"(서열 번호: 81)를 C 말단 SGMI-2 펩타이드가 분해되는 것을 보호하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 C 말단부에 첨가하였다.
다음의 대표적인 MASP-2 항체/SGMI-2 융합에 대해 아미노산 서열을 아래에 제공한다:
H-M2ab6-SGMI-2-N(서열 번호:75, 서열 번호:82에 의해 암호화됨):
[491 aa 단백질, aa 1-36=SGMI-2(밑줄), aa37-46=링커(이탤릭체); aa47-164=MASP-2 ab#6의 중쇄 가변 영역(밑줄); aa165-491=힌지 돌연변이를 가진 IgG4 불변 영역.]
H-M2ab6-SGMI-2-C(서열 번호:76, encoded by 서열 번호:83):
[491aa 단백질, aa1-118=MASP-2 ab#6의 중쇄 가변 영역(밑줄); aa 119-445=힌지 돌연변이를 가진 IgG4 불변 영역; aa 446-451= 제1 링커(이탤릭체); aa 452-487=SGMI-2; aa488-491=제2 링커(이탤릭체).]
L-M2ab6-SGMI-2-N(서열 번호:77, 서열 번호:84에 의해 암호화됨):
[258aa 단백질, aa1-36=SGMI-2(밑줄); aa37-46=링커(이탤릭체); aa47-152=MASP-2 ab#6의 경쇄 가변 영역(밑줄); aa153-258=인간 Ig 람다 불변 영역]
L-M2ab6-SGMI-2-C(서열 번호:78, 서열 번호:85에 의해 암호화됨):
[258aa 단백질, aa1-106=MASP-2 ab#6의 경쇄 가변 영역(밑줄); aa 107-212=인간 Ig 람다 불변 영역; aa 213-218=제1 링커; aa219-254=SGMI-2; aa255-258=제2 링커]
기능성 검정:
4개의 MASP-2-SGMI-2 융합 항체 구성물을 Expi293F 세포(Invitrogen)에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, C3b 침착의 억제에 대해 아래에서 기술된 것과 같이 만난 코팅 비드 검정으로 10% 정상 인간 혈청에서 테스트하였다.
C3b 침착에 대해 만난 코팅 검정으로 MASP-2-SGMI-2 융합의 테스트
MASP-2-SGMI-2 융합 항체를 렉틴 경로 억제에 대해 만난 코팅 비드 상에서 C3b 침착의 검정으로 평가하였다. 유세포 분석에 의해 활성 정도를 결정하는 이 검정은 Wieslab® 검정보다 더 큰 해상도를 제공한다. 렉틴 경로 비드 검정을 다음과 같이 수행하였다: 만난을 4℃에서 밤새 탄산염-중탄산염 완충액(pH 9.6) 에서 7 μM 직경 폴리스티렌 비드(Bangs Laboratories; Fishers, IN, USA)에 흡수시켰다. 비드를 PBS로 세척하고 10% 인간 혈청, 또는 항체 또는 억제제와 사전 인큐베이션된 10% 혈청에 노출시켰다. 혈청-비드 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 혈청 인큐베이션 후에, 비드를 세척하고, 비드 상의 C3b 침착을 항-C3c 토끼 다클론성 항체(Dako North America; Carpinteria, CA, USA) 및 PE-Cy5 콘쥬게이션된 염소 항-토끼 이차 항체(Southern Biotech; Birmingham, AL, USA)로의 검출에 의해 측정하였다. 염색 과정 후에, 비드를 FACSCalibur 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 비드를 전방 및 측면 산란을 사용하여 균일한 집단으로서 모았고, C3b 침착은 FL3 양성 입자로서 나타났다(FL-3, 또는 "FL-3 채널"은 세포 분석기에서 제3 또는 적색 채널을 나타냄). 각 실험 조건에 대해 집단에 대한 기하학적 평균 형광 강도(MFI)를 항체/억제제 농도에 대해 상대적으로 플롯화하여 렉틴 경로 억제를 평가하였다.
IC50 값을 GraphPad PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 구체적으로, IC50 값을 가변적인 기울기(4개의 매개변수), 비선형 맞춤을 세포 계측 검정으로부터 얻은 평균 형광 강도 곡선 대비 로그(항체)에 적용함으로써 얻었다.
그 결과를 표 11에 제시한다.
결과:
대조군, 비SGMI 함유 MASP-2 "네이키드" 스캐폴드 항체(mAb#6)는 이 검정에서 ≥3.63 nM의 IC50 값으로 억제성이었고, 이것은 실시예 12에서 관찰된 억제 결과와 일치한다. 놀랍게도, 표 11에서 제시된 것과 같이, 테스트된 모든 SGMI-2-MASP-2 항체 융합은 이 검정에서 MASP-2 스캐폴드 항체의 효능을 개선시켰고, 이것은 증가된 결합가가 또한 C3b 침착의 억제에 유익할 수 있음을 시사한다.
10% 인간 혈청을 사용한 C4b 침착 검정에 대해 만난 코팅 비드 검정으로 MASP-2-SGMI-2 융합의 테스트
C4b 침착 검정을 다음을 변형시킨 C3b 침착 검정에 대해 위에서 기술된 것과 동일한 검정 조건을 사용하여 10% 인간 혈청으로 수행하였다. C4b 검출 및 유세포 분석을 유세포 분석 전에 침착 반응을 항-C4b 마우스 단클론성 항체(1:500, Quidel)로 염색하고 PE Cy5에 콘쥬게이션된(1:200, Southern Biotech) 이차 염소 항-마우스 F(ab')2로 염색함으로써 수행하였다.
결과:
SGMI-2 포함 MASP-2- N 말단 항체 융합(H-M2-SGMI-2-N: IC50=0.34 nM), L-M2-SGMI-2-N: IC50=0.41 nM))은 둘 다, MASP-2 스캐폴드 항체(HL-M2: IC50=0.78 nM)에 비교하여 증가된 효능을 가졌다.
유사하게, 단일 SGMI-2 포함 C 말단 MASP-2 항체 융합(H-M2-SGMI-2-C: IC500.45 nM 및 L-M2-SGMI-2C: IC50=0.47 nM)은 둘 다 MASP-2 스캐폴드 항체(HL-M2: IC50=1.2 nM)에 비교하여 증가된 효능을 가졌다.
마우스 혈청을 사용한 C3b 침착에 대한 만난 코팅 비드 검정으로 MASP-2-SGMI-2 융합의 테스트.
C3b 침착에 대한 만난 코팅 비드 검정을 10% 마우스 혈청을 사용하여 위에서 기술된 것과 같이 수행하였다. 인간 혈청에서 관찰된 결과와 유사하게, SGMI-2 포함 MASP-2 융합은 마우스 혈청에서 MASP-2 스캐폴드 항체에 비교하여 증가된 효능을 가진 것으로 결정되었다.
결과의 요약: 이 실시예의 결과는 테스트된 모든 SGMI-2-MASP-2 항체 융합이 MASP-2 스캐폴드 항체의 효능을 개선시켰음을 입증한다.
실시예 14
이 실시예는 신장 섬유증에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위하여 MASP-2 -/- 결핍 및 MASP-2 +/+ 충분한 마우스에서 신장 섬유증의 일측성 요관 폐색(UUO) 모델을 사용하여 생성된 결과를 제공한다.
배경/근거 :
신장 섬유증 및 염증은 말기 신장 질환의 두드러진 특징이다. 신장 세뇨관 간질 섬유증은 지속적인 세포 손상, 비정상적인 치요, 상주하고 침윤하는 신장 세포의 활성화, 사이토카인 방출, 염증 및 신장 세포의 표현형 활성화로 인한 세포외 매트릭스의 생성을 포함한 진행성 과정이다. 신장 세뇨관 간질(TI) 섬유증은 다수의 신장 병리학의 일반적인 종점이며 만성 신장 질환(CKD)에서 진행성 신장 기능 손상을 방지하는 것을 목적으로 하는 잠재적 치료법에 대한 핵심 목표를 나타낸다. 신장 TI 손상은 사구체 질환의 신장 기능의 감소와 밀접하게 연결되며(Risdon R.A. et al., Lancet 1: 363-366, 1968; Schainuck L.I. et al, Hum Pathol 1: 631-640, 1970; Nath K.A., Am J Kid Dis 20:1-17, 1992), 근섬유모세포가 축적되고, 세뇨관과 세뇨관 주위 모세혈관 사이의 잠재적 공각이 콜라겐 및 다른 프로테오글리칸으로 구성된 매트릭스에 의해 차지되는 CKD의 특징이다. TI 근섬유모세포의 기원은 여전히 격렬한 논란거리로 남아 있지만, 섬유증은 일반적으로 초기에는 T 림프구의 TI 축적 후에 대식세포에 의한 축적을 특징으로 하는 염증에 의해 진행된다(Liu Y. et al., Nat Rev Nephrol 7:684-696, 2011; Duffield J.S., J Clin Invest 124:2299-2306, 2014).
UUO의 설치류 모델은 사실상 모든 병인의 진행성 신장 질환의 특징인 진행성 신장 섬유증을 생성한다(Chevalier et al., Kidney International 75:1145-1152, 2009). 야생형 마우스에 비교하여 C3 유전자 발현이 UUO 후에 야생형 마우스에서 증가되었고, 콜라겐 침착이 UUO 후에 C3-/- 녹아웃 마우스에서 상당히 감소한 것으로 보고되었는데, 이것은 신장 섬유증에서 보체 활성화의 역할을 시사한다(Fearn et al., Mol Immunol 48:1666-1733, 2011). 또한 C5 결핍이 세뇨관 간질 손상의 모델에서 신장 섬유증의 주요 구성요소의 상당한 개선으로 이어진 것이 보고되었다(Boor P. et al., J of Am Soc of Nephrology: 18:1508-1515, 2007). 그러나, 본 발명자들에 의해 수행된 본원에 기술된 연구 전에, 신장 섬유증에 관여하는 특정 보체 구성요소는 잘 정의되어 있지 않았다. 그러므로, 일측성 요관 폐색(UUO) 모델에서 MASP-2(-/-) 및 MASP-2(+/+) 수컷 마우스를 평가하기 위하여 다음의 연구를 수행하였다.
방법:
MASP-2-/- 마우스를 실시예 1에서 기술한 것과 같이 생성하고 10 세대 동안 C57BL/6과 역교배시켰다. 수컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스, 및 C57BL/6 배경의 동형접합성 MASP-2 결핍(MASP-2-/-) 마우스를 12/12 주/야 주기의 표준화된 조건 하에 유지하였고, 표준 사료 펠릿을 공급하고 사료와 물에는 자유롭게 접근하도록 하였다. 그룹당 6마리의 생후 10주령의 마우스를 1.5 L/분 산소 중2.5% 아이소플루란으로 마취시켰다. 생후 10주령 수컷 C56/BL6 마우스의 두 그룹, 야생형 및 MASP-2-/-의 우측 요관을 외과적으로 결찰시켰다. 우측 신장을 1 cm 옆구리 절개를 통해 노출시켰다. 우측 요관을 6/0 폴리글락틴 봉합사를 사용하여 두 지점에서 완전히 폐색시켰다. 부프레노르핀 진통제를 통증 점수에 따라 최대 5 용량에 대해 수술 전후로 12시간마다 제공하였다. 국소 부피바카인 마취제를 수술 중에 1회 제공하였다.
마우스를 수술 후 7일 후에 희생시키고 신장 조직을 수집하고, 고정시키고 파라핀 블록에 포매시켰다. 혈액을 마취 하에 심장 천공에 의해 마우스로부터 수집하고, 마우스를 신장 절제술 후 출혈에 의해 도태시켰다. 혈액을 얼음에서 2시간 동안 응고시키고 혈청을 원심분리에 의해 분리하고 -80℃에서 분취액으로서 냉동 보관하였다.
신장 조직의 면역조직화학
콜라겐 침착에 의해 표시되는 신장 섬유증 정도를 측정하기 위하여, 5 마이크론 파라핀 포매된 신장 섹션을 문헌[Whittaker P. et al., Basic Res Cardiol 89:397-410, 1994]에서 기술된 것과 같이, 콜라겐 특이적 염색인 피크로시리우스 레드로 염색하였다. 간단히 기술하면, 신장 섹션을 탈파라핀화하고, 재수화하고 콜라겐을 1시간 동안 500 mL의 피크르산의 포화 수용액 중의 피크로시리우스 레드 수용액(0.5 gm 시리우스 레드, Sigma, Dorset UK)으로 1시간 동안 염색하였다. 슬라이드를 산성화된 물(증류수 중의 0.5% 빙초산)로 각각 5분 동안 2회 세척한 후, 탈수하고 장착시켰다.
대식세포 침윤에 의해 표시되는 염증 정도를 측정하기 위하여, 신장 섹션을 다음과 같이 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색하였다. 포르말린 고정되고, 파라핀 포매된, 5 마이크론 신장 섹션을 탈파라핀화하고 재수화하였다. 항원 회수를 95℃의 시트레이트 완충액에서 20분 동안 수행한 후 3% H2O2에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 내인성 과산화효소 활성을 퀀칭하였다. 조직 섹션을 차단 완충액(인산염 완충 식염수(PBS) 중의 1% 소 혈청 알부민과 함께 10% 열 비활성화된 정상 염소 혈청)에 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한 후 아비딘/비오틴으로 차단하였다. 조직 섹션을 각 단계 후에 5분 동안 PBS로 3회 세척하였다. 차단 완충액에 1:100으로 희석된 F4/80 대식세포 일차 항체(Santa Cruz, Dallas, TX, USA)를 1시간 동안 적용하였다. 그런 후 1:200으로 희석된 비오티닐화된 염소 항-래트 이차 항체를 30분 동안 적용한 후 양고추냉이 과산화효소(HRP) 콘쥬게이션된 효소를 30분 동안 적용하였다. 염색 색상을 다이아미노벤지딘(DAB) 기질(Vector Labs, Peterborough UK)을 사용하여 10분 동안 발색시키고 슬라이드를 물로 세척하고, 탈수시키고 대비 염색 없이 장착하여 컴퓨터 기반 분석을 용이하게 하였다.
이미지 분석
신장 피질 염색의 백분율을 문헌[Furness P. N. et al., J Clin Pathol 50:118-122, 1997]에서 기술된 것과 같이 결정하였다. 간단히 기술하면, 24 비트 색상 이미지를 신장 부분의 전체 주변 주위의 신장 캡슐 바로 아래에 있는 신장 피질의 순차적 비중첩 필드에서 포착하였다. 각각의 이미지 캡처 후 NIH 이미지를 사용하여 적색 채널을 8 비트 흑백 이미지로 추출하였다. 섹션이 없는 조명된 현미경 필드의 사전 기록된 이미지를 사용하여 배경 조명의 요철을 제거하였다. 염색 양성에 상응하는 이미지의 영역을 확인하기 위하여 고정된 한계값에 이미지를 적용하였다. 그런 후 블랙 픽셀의 백분율을 계산하고, 신장 주위의 모든 이미지를 이런 방식으로 측정한 후에 평균 백분율을 기록하여, 신장 섹션의 염색된 영역의 백분율에 상응하는 값을 제공하였다.
유전자 발현 분석
마우스 신장에서 신장 염증 및 섬유증에 관련된 여러 유전자의 발현을 다음과 같이 정량적 PCT(qPCR)에 의해 측정하였다. 총 RNA를 신장 피질로부터 Trizol®(ThermoFisher Scientific, Paisley, UK)을 제조사의 지침을 따라 사용하여 분리하였다. 추출된 RNA를 Turbo DNA 유리 키트(ThermoFisher Scientific)로 처리하여 DNA 오염을 제거한 후, 제1 가닥 cDNA를 AMV 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 합성하였다. cDNA 통합성을 TaqMan GAPDH 검정(Applied Biosystems, Paisley UK)을 사용하는 단일 qPCR 반응에 이어서 Custom TaqMan 어레이 96 웰 플레이트(Life Technologies, Paisley, UK)를 사용하는 qPCR 반응에 의하여 확인하였다.
12개의 유전자를 이 분석에서 연구하였다:
콜라겐 유형 IV 알파 1(col4α1; 검정 ID: Mm01210125_m1);
변형 성장 인자(TGFβ-1; 검정 ID: Mm01178820_m1);
카드헤린 1(Cdh1; 검정 ID: Mm01247357_m1);
피브로넥틴 1(Fn1; 검정 ID:Mm01256744_m1);
인터류킨 6(IL6; 검정 ID Mm00446191_m1);
인터류킨 10(IL10; 검정 ID Mm00439614_m1);
인터류킨 12a(IL12a; 검정 ID Mm00434165_m1);
비멘틴(Vim; 검정 ID Mm01333430_m1);
액티닌 알파 1(Actn1; 검정 ID Mm01304398_m1);
종양 괴사 인자-α(TNF-α; 검정 ID Mm00443260_g1)
보체 구성요소 3(C3; 검정 ID Mm00437838_m1);
인터페론 감마(Ifn-γ; 검정 ID Mm01168134)
다음의 하우스키핑 제어 유전자를 사용하였다:
글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH; 검정 ID Mm99999915_g1);
글루쿠로니다제 베타(Gusβ; 검정 ID Mm00446953_m1);
진핵 18S rRNA(18S; 검정 ID Hs99999901_s1);
하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT; 검정 ID Mm00446968_m1)
20 μL 반응을 TaqMan 신속 유니버셜 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 40 사이클 동안 증폭시켰다. 실시간 PCR 증폭 데이터를 Applied Biosystems 7000 SDS v1.4 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
결과:
일측성 요관 폐색(UUO) 후에, 폐색된 신장은 세뇨관 확장 및 근위 세뇨관 상피의 약화와 함께 콜라겐의 축적에 의해 입증되는 바와 같이 염증 세포, 특히 대식세포의 유입, 이어서 섬유증의 즉각적인 발생을 겪는다(Chevalier R. L. et al., Kidney Int 75:1145-1152, 2009 참고).
도 15는 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 요관 폐색(UUO) 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 또는 모의 수술된 대조군 마우스로부터 얻어졌다. 도 15에서 나타낸 것과 같이, 요관 폐색 후 7일 후 야생형 마우스의 신장 섹션은 MASP-2-/- 마우스에 비교하여 상당히 더 큰 콜라겐 침착을 보였다(p 값 = 0.0096). 야생형 및 MASP-2-/- 그룹의 UUO 수술 마우스에 대한 평균 값 ± 평균의 표준 오차는 각각 24.79±1.908(n=6마리) 및 16.58±1.3(n=6마리)이었다. 도 15에서 추가로 도시된 것과 같이, 모의 수술된 대조군 야생형 및 모의 수술된 대조군 MASP-2-/- 마우스로부터의 조직 섹션은 예상과 같이, 매우 낮은 수준의 콜라겐 염색을 보였다.
도 16은 F4/80 대식세포-특이적 항체로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 요관 폐색 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 또는 모의 수술된 대조군 마우스로부터 얻어졌다. 도 16에서 나타낸 것과 같이, 야생형 마우스와 비교하여, MASP-2-/- 마우스로부터 UUO 신장으로부터 얻어진 조직은 요관 폐색 7일 후에 상당히 더 적은 대식세포 침윤을 나타냈다(ET에서 염색된 % 대식세포: 2.23±0.4 대비 MASP-2-/-: 0.53±0.06, p=0.0035). 도 16에서 추가로 나타낸 것과 같이, 모의 수술된 야생형 및 모의 수술된 MASP-2-/- 마우스로부터의 조직 섹션은 검출 가능한 대식세포 염색을 보이지 않았다.
신장 염증 및 섬유증과 연결된 다양한 유전자의 유전자 발현 분석을 요관 폐색 7일 후의 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 야생형 및 MASP-2-/- 마우스로부터 얻은 신장 조직 섹션에서 수행하였다. 도 17-20에 도시된 데이터는 야생형 모의 수술 샘플에 대한 상대적 정량화의 Log10이고 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 섬유증 관련 유전자의 유전자 발현 분석의 결과와 관련하여, 도 17은 요관 폐색 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정된 바, 콜라겐 유형 IV 알파 1(콜라겐-4)의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 18은 요관 폐색 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정된 바, 변형 성장 인자(TGFβ-1)의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 17 및 18에서 나타낸 것과 같이, 야생형 마우스로부터의 폐색된 신장은 야생형 마우스의 모의 수술된 신장과 비교하여 콜라겐 유형 IV (도 17) 및 TGFβ-1(도 18)의 상당히 증가된 섬유증 관련 유전자의 발현을 입증하였고, 이것은 예상과 같이 이들 섬유증 관련 유전자가 야생형 마우스에서 UUO 손상 후에 유도된 것을 입증한다. 대조적으로, 도 17 및 18에서 추가로 나타낸 것과 같이, UUO 손상에 적용된 MASP-2-/-로부터의 폐색된 신장은 UUO 손상에 적용된 야생형 마우스와 비교하여, 콜라겐 유형 IV의 발현에서 상당한 감소(도 17, p=0.0388) 및 TGFβ-1의 발현에서 상당한 감소(도 18, p=0.0174)를 나타냈다.
염증 관련 유전자의 유전자 발현 분석의 결과와 관련하여, 도 19는 요관 폐색 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정된 바, 인터류킨-6(IL-6)의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 20은 요관 폐색 7일 후 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 및 모의 수술된 대조군 마우스로부터 얻어진 신장 조직 섹션에서 qPCR에 의해 측정된 바, 인터페론-γ의 상대적 mRNA 발현 수준을 그래프로 도시한다. 도 19 및 20에서 나타낸 것과 같이, 야생형 마우스로부터의 폐색된 신장은 야생형 마우스에서 모의 수술된 신장과 비교하여, 염증 관련 유전자 인터류킨-6(도 19) 및 인터페론-γ(도 20)의 상당히 증가된 발현을 입증하였고, 이것은 이들 염증 관련 유전자가 야생형 마우스에서 UUO 손상 후 유도된 것을 입증한다. 대조적으로, 도 19 및 20에서 추가로 나타낸 것과 같이, UUO 손상에 적용된 MASP-2-/-로부터의 폐색된 신장은 UUO 손상에 적용된 야생형 마우스와 비교하여 인터류킨-6(도 19, p=0.0109) 및 인터페론-γ(도 20, p=0.0182)의 발현에서 상당한 감소를 나타냈다.
Vim, Actn-1, TNFα, C3 및 IL-10에 대한 유전자 발현은 모두 야생형 및 MASP-2-/- 마우스 둘 다로부터 얻어진 UUO 신장에서 상당히 상향조절되는 것으로 나타났고, 야생형과 MASP-2-/- 마우스 사이에서 이들 특정 유전자의 발현 수준에 유의미한 차이는 없었다(데이터 미제시). Cdh-1 및 IL-12a의 유전자 발현 수준은 임의의 그룹의 동물로부터의 폐색된 신장에서 변화하지 않았다(데이터 미제시).
논의:
설치류에서 UUO 모델은 폐색 후 1 내지 2주 이내에 감소된 신장 혈액 흐름, 간질 염증 및 급속 섬유증이 있는 폐색된 신장에서 초기, 활성 및 현저한 손상을 유도하는 것으로 인식되며 신장에서 염증 및 섬유증의 일발적인 메커니즘 및 매개체를 이해하기 위하여 광범위하게 사용되어 왔다(예컨대, Chevalier R.L., Kidney Int 75:1145-1152, 2009; Yang H. et al., Drug Discov Today Dis Models 7:13-19, 2010 참고).
이 실시예에서 기술된 결과는 야생형(+/+) 대조군 마우스 대비 MASP-2(-/-) 마우스에서 UUO 수술 신장에서 콜라겐 침착 및 대식세포 침윤에 상당한 감소가 있음을 입증한다. MASP-2-/- 동물에서 조직학적 및 유전자 발현 수준 둘 다에서 신장 손상의 상당한 감소를 보인 예상치 못한 결과는 보체 활성화의 렉틴 경로가 폐색된 신장에서 염증 및 섬유증의 발생에 상당히 기여하는 것을 입증한다. 특정 이론에 매이기를 바라지는 않지만, 렉틴 경로는 세포 손상이 염증을 구동시키고 결국에는 추가의 세포 손상, 반흔 및 조직 상실을 유발하는 악순환을 지속시키는 전염증성 자극을 촉발시키고 유지함으로써 섬유화 질환의 병리에 결정적으로 기여하는 것으로 여겨진다. 이들 결과의 관점에서, 억제제로의 MASP-2의 억제 또는 차단이 신장 섬유증의 억제 또는 예방에, 및 일반적으로 섬유증의 억제 또는 예방을 위해(즉, 조직 또는 장기와 독립적으로) 예방 및/또는 치료 효과를 가질 것이라고 예상된다.
실시예 15
이 실시예는 일측성 요관 폐색(UUO) 모델, 신장 섬유증의 쥐과 모델에서의 효능에 대해 단클론성 MASP-2 억제 항체의 분석을 기술한다.
배경/근거:
다수의 신장 병리의 일반적인 종점인 신장 세뇨관 간질 섬유증의 개선은 진행성 신장 질환을 예방하는 것을 목적으로 하는 치료 전략에 대한 핵심 목표를 나타낸다. 신장 질환의 염증성 섬유화 촉진 경로를 표적으로 하는 신규 및 기존 치료법이 부족하다는 점을 고려하면, 새로운 치료법을 개발해야 할 절박한 필요성이 있습니다. 단백뇨성 신장 질환을 가진 많은 환자가 신장 기능 저하와 밀접하게 유사한 세뇨관 간질 염증 및 진행성 섬유증을 나타낸다. 단백뇨는 그 자체로 세뇨관 간질 염증 및 단백뇨성 신장병의 발생을 유도한다(Brunskill N.J. et al., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004). 일차 신장 질환과 무관하게, 세뇨관 간질 염증 및 섬유증은 점진적 신장 손상 환자에서 언제나 볼 수 있고 배설 기능 저하와 밀접하게 관련되어 있다(Risdon R.A. et al., Lancet 1:363-366, 1968; Schainuck L.I., et al., Hum Pathol 1: 631-640, 1970). 섬유증으로 이어지는 핵심적인 공통 세포 경로를 방해하는 잠재력을 가진 치료법이 신장 장애에 폭넓게 적용될 수 있는 가능성을 가지고 있다.
실시예 14에서 기술된 것과 같이, 비단백뇨성 신장 섬유증의 UUO 모델에서 MASP-2-/- 마우스는 염증성 세포 침윤물(75% 감소), 및 콜라겐과 같은 섬유증의 조직학적 마커(1/3 감소)에 의해 나타난 것과 같이, 야생형 대조군 마우스와 비교하여 상당히 더 적은 신장 섬유증 및 염증을 나타낸 것으로 결정되었고, 그로써 신장 섬유증에서 렉틴 경로의 핵심 역할을 확립하였다.
실시예 13에서 기술된 것과 같이, 마우스에서 또한 렉틴 경로를 차단하는 것으로 나타난 인간 렉틴 경로의 기능을 특이적으로 차단하는 단클론성 MASP-2 항체(OMS646의 중쇄의 C 말단에 융합된 SGMI-2 펩타이드를 포함하는 OMS646-SGMI-2 융합)를 생성하였다. 이 실시예에서, OMS646-SGMI-2를 야생형 마우스에서 신장 섬유증의 UUO 마우스 모델에서 분석하여 MASP-2의 특정 억제제가 신장 섬유증을 억제할 수 있는지의 여부를 결정하였다.
방법:
이 연구는 수컷 WT C57BL/6 마우스에서 인간 IgG4 아이소타입 대조군 항체(10 mg/kg ET904), 및 비히클 대조군과 비교하여 MASP-2 억제 항체(10 mg/kg OMS646-SGMI-2)의 효과를 평가하였다. 항체(10 mg/kg)를 9마리 마우스 그룹에 복강내(ip) 주사에 의해 UUO 수술 전 7일, 4일 및 1일 전과 다시 수술 후 2일차에 투여하였다. 혈액 샘플을 항체 투여 전과 실험이 끝났을 때 취하여서 렉틴 경로 기능적 활성을 평가하였다.
UUO 수술, 조직 수집 및 시리우스 레드 및 대식세포-특이적 항체 F4/80으로의 염색을 실시예 14에서 기술된 방법을 사용하여 수행하였다.
마우스 신장의 하이드록시프롤린 함량을 비색 검정 테스트 키트(Sigma)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 측정하였다.
마우스에서 MASP-2 억제 mAb의 약력학적 효과를 평가하기 위하여, 전신성 렉틴 경로 활성을 MASP-2 또는 대조군 mAb를 마우스에게 복강내 투여한 후 표시된 시간에 수집된 최소한으로 희석된 혈청 샘플에서 렉틴 유도 C3 활성화를 정량화함으로써 평가하였다. 간단히 설명하면, 7 μM 직경의 폴리스티렌 미소구체(Bangs Laboratories, Fisher IN, USA)를 중탄산 나트륨 완충액(pH 9.6)에서 30 μg/mL 만난(Sigma)과 함께 밤새 인큐베이션함으로써 만난으로 코팅한 후, 세척하고, PBS 중의 1% 소 태아 혈청으로 차단하고 PBS에 1x108 비드/mL의 최종 농도로 재현탁하였다. 보체 침착 반응을 2.5 μL의 만난 코팅 비드(약 250,000개 비드)를 50 μL의 최소한으로 희석된 마우스 혈청 샘플(90% 최종 혈청 농도)에 첨가함으로써 개시한 후, 40분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 250 μL의 빙냉 유세포 분석 완충액(FB: 0.1% 소 태아 혈청을 함유한 PBS)을 첨가함으로써 침착 반응을 종결시킨 후, 비드를 원심분리에 의해 수집하고 300 μL의 빙냉 FB로 2회 더 세척하였다.
렉틴 유도 C3 활성화를 정량화하기 위하여, 비드를 4℃에서 1시간 동안 FB에 희석된 50 μL의 토끼 항-인간 C3c 항체(Dako, Carpenteria, CA, USA)와 함께 인큐베이션하였다. FB로 2회 세척하여 미결합 물질을 제거한 후에, 비드를 4℃에서 30분 동안 FB에 희석된 PE-Cy5에 콘쥬게이션된 50 μL의 염소 항-토끼 항체(Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)와 함께 인큐베이션하였다. FB로 2회 세척하여 미결합 물질을 제거한 후에, 비드를 FB에 재현탁하고 FACS Calibur 세포계측기로 분석하였다. 비드를 전방 및 측면 산란을 사용하여 균일한 집단으로서 모으고, 각 샘플 중의 C3b 침착을 평균 형광 강도(MFI)로서 정량화하였다.
결과 :
콜라겐 침착의 평가:
도 21은 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 MASP-2 억제 항체 또는 아이소타입 대조군 항체로 치료된 야생형 마우스로부터 요관 폐색 7일 후에 얻어졌다. 도 21에서 나타낸 것과 같이, MASP-2 억제 항체로 치료된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐색(UUO) 후 7일 후에 수득된 신장으로부터의 조직 섹션은 IgG4 아이소타입 대조군으로 치료된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐색된 신장으로부터의 조직 섹션에서의 콜라겐 침착의 양과 비교하여 콜라겐 침착에서 상당한 감소(p=0.0477)를 보였다.
하이드록시 프롤린 함량의 평가:
신장 조직의 하이드록시 프롤린을 콜라겐 함량의 지표로서 측정하였다. 하이드록시 프롤린은 이 모델에서 유도된 질환의 병태생리학적 진행을 매우 잘 나타내는 매개변수이다.
도 22는 MASP-2 억제 항체 또는 아이소타입 대조군 항체로 치료된 야생형 마우스로부터 얻어진 폐색(UUO) 후 7일 후에 수득된 신장으로부터의 하이드록실 프롤린 함량을 그래프로 도시한다. 도 22에서 나타낸 것과 같이, MASP-2 억제 항체로 치료된 마우스로부터의 폐색된 신장 조직은 IgG4 아이소타입 대조군 mAb로 치료된 마우스로부터의 신장보다, 콜라겐 함량의 지표인, 상당히 더 적은 하이드록실 프롤린을 입증하였다(p=0.0439).
염증의 평가:
야생형, 아이소타입 대조군 항체 치료된 동물, 및 MASP-2 억제 항체로 치료된 야생형 동물로부터의 폐색된 신장은 대식세포의 활발한 침윤을 입증하였다. 세심한 정량화는 이들 두 그룹간에 염색된 대식세포 영역의 백분율에서 유의할만한 차이를 나타내지 않았다(데이터 미제시). 그러나, 침윤 대식세포의 동등한 수에도 불구하고, MASP-2 억제 항체를 주사한 동물로부터의 폐색된 신장은 아이소타입 대조군을 주사한 동물로부터의 폐색된 신장과 비교하여 시리우스 레드 염색에 의해 판단되는 바 상당히 더 적은 섬유증을 나타냈고, 이 결과는 MASP-2 억제 항체로 치료된 마우스로부터의 폐색된 신장 조직이 IgG4 아이소타입 대조군 mAb로 치료된 신장보다 상당히 더 적은 하이드록실 프롤린을 가진 결과와 일치한다.
논의
이 실시예에서 기술된 결과는 MASP-2 억제 항체의 사용이 UUO 모델에서 신장 섬유증에 대해 보호를 제공하며, 이것은 MASP-2-/- 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 UUO 모델에서 상당히 감소된 신장 섬유증 및 염증을 가진 것을 입증한 실시예 14에서 기술된 결과와 일치한다. 이 실시예의 결과는 MASP-2 억제 항체로 치료된 마우스에서 감소된 섬유증을 보인다. MASP-2 의존성 렉틴 경로 활성의 감소 또는 차단이 있는 동물에서 UUO 신장에서의 감소된 섬유증의 발견은 매우 중요한 신규한 발견이다. 함께 취합하면, 실시예 14 및 이 실시예에서 제공된 결과는 신장 세뇨관 간질 염증, 세뇨관 세포 손상, 섬유화 촉진 사이토카인 방출 및 반흔에 미치는 MASP-2 억제의 유익한 영향을 입증한다. 신장 섬유증의 완화는 신장 치료제의 핵심 목표로 남아 있다. UUO 모델은 가속화된 신장 섬유증의 중증 모델이고, 이 모델에서 섬유증을 감소시키는 개입, 예컨대 MASP-2 억제 항체의 사용은 신장 섬유증을 억제 또는 예방하기 위해 사용될 가능성이 있다. UUO 모델로부터의 결과는 사구체 및/또는 단백뇨성 세뇨관 손상을 특징으로 하는 신장 질환으로 옮겨갈 수 있는 가능성이 있다.
실시예 16
이 실시예는 단백뇨성 신장병에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위하여 MASP-2-/- 및 야생형 마우스에서 신장 섬유증, 염증 및 세뇨관 간질 손상의 단백질 과부하 단백뇨 모델을 사용하여 생성된 결과를 제공한다.
배경/근거:
단백뇨는 일차 신장 질환과 관계 없이 신장 섬유증의 발생 및 신장 배설 기능의 상실에 대한 위험 인자이다(Tryggvason K. et al., J Intern Med 254:216-224, 2003, Williams M., Am J. Nephrol 25:77-94, 2005). 단백뇨성 신장병의 개념은 손상된 사구체 투과선택성의 결과로서 근위 세뇨관에 유입되는 과잉 단백질의 독성 영향을 말한다(Brunskill N.J., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004, Baines R.J., Nature Rev Nephrol 7:177-180, 2011). 많은 사구체 질환에 공통적인 이 현상은 신장에서 전염증성 반흔 형성 환경을 초래하고 단백뇨성 세뇨관 유체에 의해 자극된 조절장애 신호전달 경료의 결과로서 근위 세뇨관 세포 성장, 세포자멸사, 유전자 전사 및 염증성 사이토카인 생성의 변경을 특징으로 한다. 단백뇨성 신장병은 일반적으로 다양한 일차 신정 병리에 공통된 점진적인 신장 손상에 대한 핵심 기여자인 것으로 인식된다.
만성 신장 질환은 미국에서 성인 인구의 15% 이상에게 영향을 미치며 매년 전세계적으로 대략 750,000건의 사망을 설명한다(Lozano R. et al., Lancet vol 380, Issue 9859:2095-2128, 2012). 단백뇨는 만성 신장 질환의 지표일뿐만 아니라 질환 진행을 촉진하는 인자이다. 많은 단백뇨성 신장 질환 환자가 신장 기능 저하와 밀접하게 유사한 세뇨관 간질 염증 및 진행성 섬유증을 나타낸다. 단백뇨는 그 자체로 세뇨관 간질 염증 및 단백뇨성 신장병의 발생을 유도한다(Brunskill N.J. et al., J Am Soc Nephrol 15:504-505, 2004). 단백뇨성 신장 질환에서, 과잉량의 알부민 및 다른 거대분자가 사구체를 통해 여과되고 근위 세뇨관 상피 세포에 의해 재흡수된다. 이것은 보체 활성화에 의해 매개된 염증성 악순환을 유발하여 사이토카인 및 백혈구 침윤으로 이어져 세뇨관-간질 손상 및 섬유증을 유발함으로써, 단백뇨를 악화시키고 신장 기능의 상실 및 궁극적으로는 말기 신부전으로의 진행으로 이어진다(예컨대, Clark et al., Canadian Medical Association Journal 178:173-175, 2008 참고). 이런 염증 및 단백뇨의 유해한 순환을 조절하는 치료법은 만성 신장 질환의 결과를 개선할 것으로 기대된다.
세뇨관간질 손상(tubulointerstital injury)의 UUO 모델에서 MASP-2 억제의 유익한 효과의 관점에서, MASP-2 억제가 단백질 과부하 모델에서 신장 손상을 감소시킬수 있는지를 결정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 이 연구는 문헌[Ishola et al., European Renal Association 21:591-597, 2006]에서 기술되는 것과 같이 단백뇨성 신장 질환을 유도하기 위하여 단백질 과부하를 사용하였다.
방법:
MASP-2-/- 마우스F,F 실시예 1에서 기술된 것과 같이 생성하고 10 세대 동안 BALB/c와 역교배시켰다. 본 연구는 단백질 과부하 단백뇨 모델에서 야생형 및 MASP-2-/- BALB/c 마우스의 결과를 다음과 같이 비교하였다.
실험 1주 전에, 마우스를 최적의 반응을 보기 위해 단백질 과부하 도전 전에 한쪽으로 신장 절제술을 하였다. 사용된 단백뇨 유도제는 다음의 용량으로 생리 식염수에 담아 WT(n=7마리) 및 MASP-2 -/- 마우스(n=7마리)에게 복강내로 제공한 낮은 내독소 소 혈청 알부민(BSA, Sigma)이었다: 2 mg BSA/gm, 4 mg BSA/gm, 6 mg BSA/gm, 8 mg BSA/gm, 10 mg BSA/gm 및 12 mg BSA/gm 체중의 각각의 1 용량, 및 15 mg BSA/gm 체중의 9 용량으로 총 15 용량을 15일의 기간에 걸쳐 복강내 투여하였다. 대조군 WT(n=4마리) 및 MASP-2-/-(n=4마리) 마우스에게는 식염수만을 복강내로 투여하였다. 마지막 용량의 투여 후, 동물을 별도로 대사 케이지에 24시간 동안 수용하여 소변을 수집하였다. 혈액을 마취 하에 심장 천공에 의해 수집하고, 혈액을 얼음에서 2시간 동안 응고시키고 혈청을 원심분리에 의해 분리하였다. 혈청 및 소변 샘플을 15일차에 실험이 끝났을 때 수집하고, 분석을 위해 보관 및 냉동하였다.
마우스를 15일 차에 마지막 BSA 투여 후 24시간 후에 희생시키고 다양한 조직을 분석을 위해 수집하였다. 신장을 수득하고 H&E 및 면역염색을 위해 처리하였다. 각 마우스로부터의 포르말린 고정되고, 파라핀 포매된 5 마이크론 신장 조직 섹션을 탈파라핀화하고 재수화하였다. 항원 회수를 95℃의 시트레이트 완충액에서 20분 동안 수행한 후 조직을 3% H2O2에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 조직을 10% 아비딘 용액과 함께 차단 완충액(PBS 중의 이차 항체가 생성된 종으로부터의 10% 혈청 및 1% BSA)에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 섹션을 각 단계 후에 각각 5분씩 PBS로 3회 세척하였다. 그런 후 일차 항체를 10% 비오틴이 있는 차단 완충액에 1시간 동안, 항체 F4/80(Santa Cruz cat# sc-25830), TGFβ(Santa Cruz cat# sc-7892), IL-6(Santa Cruz cat# sc-1265)의 경우 1:100의 농도로 및 TNFα 항체(Santa Cruz cat# sc-1348)의 경우 1:50의 농도로 적용하였다. 그런 후 비오티닐화된 이차 항체를 30분 동안 F4/80, TGFβ 및 IL-6 섹션의 경우 1:200의 농도로 및 TNFα 섹션의 경우 1:100의 농도로 적용한 후 HRP 콘쥬게이트 효소를 다시 30분 동안 적용하였다. 다이아미노벤지딘(DAB) 기질 키트(Vector labs)를 10분 동안 사용하여 색을 발색시키고 슬라이드를 물로 세척하고, 탈수시키고 대비 염색 없이 장착시켜서 컴퓨터 기반 이미지 분석을 용이하게 하였다. 신장 피질로부터의 염색된 조직 섹션을 디지털 이미지 캡처 후 자동화된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는 정량화에 의해 분석하였다.
세포자멸사를 다음과 같이 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 표지화(TUNEL)로 염색함으로써 조직 섹션에서 평가하였다. 신장 섹션의 세포자멸성 세포를 다음과 같이 ApopTag® 과산화효소 키트(Millipore)를 사용하여 염색하였다. 각 마우스로부터의 파라핀 포매되고, 포르말린 고정된 신장 섹션을 탈파라핀화하고, 재수화한 후 각 표본에 15분 동안 실온에서 적용한 단백질 분해효소 K(20 μg/mL)를 사용하여 단백질을 투과화하였다. 표본을 단계 사이에 PBS로 세척하였다. 조직을 3% H2O2에서 10분 동안 인큐베이션함으로써 내인성 과산화효소 활성을 퀀칭하였다. 그런 후 조직을 평형화 완퉁액에서 인큐베이션한 후 TdT 효소와 함께 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 중단/세척 완충액으로 10분 동안 세척한 후, 항-디곡시게닌 콘쥬게이트를 30분 동안 실온에서 적용한 후 세척하였다. DAB 기질 키트에서 4분 동안 색을 발색시킨 후 물로 세척하였다. 조직을 헤마톡실린으로 대비 염색하고 DBX에 장착하였다. TUNEL 염색된(갈색) 세포자멸성 세포의 빈도를 Leica DBXM 광현미경을 사용하여 피질로부터 연속적으로 선택된 20개의 고전력장에서 수동으로 계산하였다.
결과:
단백뇨의 평가
마우스에서 단백뇨의 존재를 확인하기 위하여, 혈청 중의 총 단백질을 15일 째에 분석하였고 소변 중의 총 배설 단백질을 연구의 15일차에 24시간 동안 수집한 소변 샘플에서 측정하였다.
도 23은 식염수만을 받은 야생형 대조군 마우스(n=2마리), BSA를 받은 야생형 마우스(n=6마리) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스(n=6마리)에서 15일 째에 측정된 혈청 단백질의 총량(mg/ml)을 그래프로 도시한다. 도 23에서 나타낸 것과 같이, BSA의 투여는 야생형 및 MASP-2-/- 그룹 모두에서 혈청 총 단백질 수준을 식염수만을 받은 대조군 그룹의 농도의 배 이상으로 증가시켰고, 처리된 그룹간에 유의미한 차이는 없었다.
도 24는 식염수만을 받은 야생형 대조군 마우스(n=2마리), BSA를 받은 야생형 마우스(n=6마리) 및 BSA를 받은 MASP-2-/- 마우스(n=6마리)로부터 연구의 15일 차에 24시간 동안 수집된 소변에서 배설된 단백질의 총량(mg)을 그래프로 도시한다. 도 24에서 나타낸 것과 같이, 연구의 15일 차에, 식염수만을 받은 모의 처리된 대조군 그룹과 비교하여 BSA 처리 그룹에서 소변 중의 총 배설 단백질에 대략 6배 증가가 있었다. 도 23 및 24에 도시된 결과는 단백뇨 모델이 예상과 같이 작동되었음을 입증한다.
신장에서 조직학적 변화의 평가
도 25는 단백질 과부하 연구의 15일차에 마우스의 다음 그룹으로부터 수득된 대표적인 H&E 염색 신장 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 야생형 대조군 마우스; (패널 B) MASP-2-/- 대조군 마우스, (패널 C) BSA로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 D) BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스. 도 25에서 나타낸 것과 같이, 동일한 수준의 단백질 과부하 도전에서 야생형 과부하 그룹(패널 C)과 비교하여 MASP-2-/- 과부하 그룹(패널 D)에서 훨씬 더 높은 정도로 조직이 보존된다. 예를 들어, BSA로 처리된 야생형 마우스(과부하)에서 바우만 캡슐(Bowman's capsule)은 야생형 대조군 그룹(패널 A)의 바우만 캡슐과 비교하여 크게 확장된 것으로 관찰되었다(패널 C). 대조적으로, 동일한 수준의 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(과부하)(패널 D)의 바우만 캡슐은 MASP-2-/- 대조군 마우스(패널 B) 및 야생형 대조군 마우스(패널 A)와 유사한 형태를 유지하였다. 도 25에서 추가로 나타낸 것과 같이, 큰 단백질 캐스트 구조는 야생형 신장 섹션(패널 C)의 근위 및 원위 세뇨관에 축적되었고, 그것은 MASP-2-/- 마우스(패널 D)와 비교하여 더 크고 더 풍부하다.
또한 투과 전자 현미경에 의한 이 연구로부터의 신장 섹션의 분석은 BSA로 처리된 마우스가 원위 및 근위 세뇨관 세포의 모세관 경계에 대해 전체적인 손상을 가졌으며, 세포 내용물 및 핵의 세뇨관 내강으로의 폭발이 있었음을 보여준 것이 주지된다. 대조적으로, 조직은 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스에서 보존되었다.
신장에서 대식세포 침윤의 평가
대식세포 침윤에 의해 표시되는 염증 정도를 측정하기 위하여, 수득된 신장의 조직 섹션을 또한 문헌[Boor et al., J of Am Soc of Nephrology 18:1508-1515, 2007]에서 기술되는 것과 같은 방법을 사용하여 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색하였다.
도 26은 대식세포 평균 염색 영역(%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시하며, 조직 섹션은 야생형 대조군 마우스(n=2마리), BSA로 처리된 야생형 마우스(n=6마리), 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)로부터 단백질 과부하 연구의 15일 째에 얻어졌다. 도 26에서 나타낸 것과 같이, F4/80 항-대식세포 항체로 염색된 신장 조직 섹션은 BSA로 처리된 두 그룹 모두 야생형 모의 대조군과 비교하여 신장 대식세포 침윤에 상당한 증가(% F4/80 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 보인 한편, BSA 처리된 야생형 마우스로부터의 조직 섹션에서의 대식세포 침윤과 비교하여 대식세포 침윤의 상당한 감소가 BSA 처리된 MASP-2-/- 마우스로부터의 조직 섹션에서 관찰되었다(p 값=0.0345).
도 27A는 대식세포 침윤 대비 24시간 샘플로부터의 소변에서 측정된 총 배설 단백질을 도표화함으로써(평균 염색 영역 %), BSA로 처리된 각각의 야생형 마우스(n=6마리)에서 대식세포의 존재-단백뇨 상관관계에 대한 분석을 그래프로 도시한다. 도 27A에서 나타낸 것과 같이, 야생형 신장으로부터의 대부분의 샘플은 존재하는 단백뇨 수준과 대식세포 침윤 정도 사이의 양성 상관관계를 보였다.
도 27B는 대식세포 침윤 대비 24시간 샘플의 소변에서 총 배설 단백질을 도표화함으로써(평균 염색 영역 %), BSA로 처리된 각각의 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)에서 대식세포의 존재-단백뇨 상관관계에 대한 분석을 그래프로 도시한다. 도 27B에서 나타낸 것과 같이, 야생형 마우스에서 관찰된 단백뇨 수준과 대식세포 침윤 정도 사이의 양성 상관관계(도 27A에서 제시됨)는 MASP-2-/- 마우스에서는 관찰되지 않았다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 이들 결과는 MASP-2-/- 마우스에서 높은 수준의 단백뇨에서 염증 제거 메커니즘의 존재를 나타낼 수 있다.
사이토카인 침윤의 평가
인터류킨 6(IL-6), 변환 성장 인자 베타(TGFβ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)는 단백뇨 모델에서 야생형 마우스의 근위 세뇨관에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있는 전염증성 사이토카인이다(Abbate M. et al., Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 17: 2974-2984, 2006; David S. et al., Nephrology, Didalysis, Transplantation, Official Publication of the European Dialysis and Transplant Association-European Renal Association 12: 51-56, 1997). 신장의 조직 섹션을 위에서 기술된 것과 같이 사이토카인 특이적 항체로 염색하였다.
도 28은 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=4마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TGFβ 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 28에서 나타낸 것과 같이, TGFβ의 염색의 상당한 증가가 MASP-2-/- BSA 처리(과부하) 그룹과 비교하여 야생형 BSA 처리(과부하) 그룹에서 관찰되었다(p=0.026).
도 29는 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=4마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=5마리)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TNFα 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 29에서 나타낸 것과 같이, TNFα 염색의 상당한 증가가 MASP-2-/- BSA 처리(과부하) 그룹과 비교하여 야생형 BSA 처리(과부하) 그룹에서 관찰되었다(p=0.0303).
도 30은 야생형 대조군 마우스, MASP-2-/- 대조군 마우스, BSA로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=7마리)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% IL-6 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 30에서 나타낸 것과 같이, IL-6의 염색의 상당한 증가가 MASP-2-/- BSA 처리 그룹과 비교하여 야생형 BSA 처리 그룹에서 관찰되었다(p=0.0016).
세포자멸사의 평가
세포자멸사를 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 표지화(TUNEL)로 염색함으로써 조직 섹션에서 평가하였고 TUNEL 염색된 세포자멸성 세포의 빈도를 피질로부터 연속적으로 선택된 20 고전력장(HPF)에서 계수하였다.
도 31은 야생형 대조군 마우스(n=1마리), MASP-2-/- 대조군 마우스(n=1마리), BSA로 처리된 야생형 마우스(n=6마리) 및 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스(n=7마리)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20 고전력장(HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸 세포의 빈도를 그래프로 도시한다. 도 31에서 나타낸 것과 같이, 피질에서 상당히 더 높은 비율의 세포자멸사가 BSA로 처리된 MASP-2-/- 마우스로부터 얻어진 신장과 비교하여 BSA로 처리된 야생형 마우스로부터 얻어진 신장에서 관찰되었다(p=0.0001).
결과의 전체 요약 및 결론:
이 실시예의 결과는 MASP-2-/- 마우스가 단백질 과부하 모델에서 감소된 신장 손상을 가졌음을 입증한다. 그러므로, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 염증 및 단백뇨의 유해한 순환을 억제 또는 예방하고 만성 신장 질환의 결과를 개선시키는 것으로 기대될 것이다.
실시예 17
이 실시예는 야생형 마우스의 마우스 단백질 과부하 단백뇨 모델에서 신장 염증 및 세뇨관 간질 손상을 감소 및/또는 예방하는 효능에 대한 단클론성 MASP-2 억제 항체의 분석을 기술한다.
배경/근거:
실시예 16에서 기술된 것과 같이, 단백뇨의 단백질 과부하 모델에서 MASP-2-/- 마우스는 야생형 마우스보다 상당히 더 나은 결과(예컨대, 적은 세뇨관 간질 손상 및 적은 신장 염증)를 나타냈고, 이것은 단백뇨성 신장 질환에서 렉틴 경로의 병원성 역할을 함축한다.
실시예 13에서 기술된 것과 같이, 인간 렉틴 경로의 기능을 특이적으로 차단하고 또한 마우스에서 렉틴 경로를 차단하는 것으로 나타난 단클론성 MASP-2 억제 항체(OMS646-SGMI-2)를 생성하였다. 이 실시예에서, MASP-2 억제 항체 OMS646-SGMI-2를 야생형 마우스에서 신장 염증을 감소시키고/거나 신장 염증 및 세뇨관 간질 손상을 예방하는 효능에 대해 마우스 단백질 과부하 단백뇨 모델에서 분석하였다.
방법:
이 연구는 인간 IgG4 아이소타입 대조군 항체, ET904(10 mg/kg), 및 식염수 대조표준에 비교한 MASP-2 억제 항체(10 mg/kg OMS646-SGMI-2)의 효과를 평가하였다.
실시예 16에서 기술된 연구와 유사하게, 이 연구는 단백뇨성 신장 질환을 유도하기 위하여 단백질 과부하를 사용하였다(Ishola et al., European Renal Association 21:591-597, 2006). 단백뇨를 실시예 16에서 기술된 것과 같이, 한쪽으로 신장절제술을 시행한 Balb/c 마우스에서 총 15일 동안 매일 증가하는 용량(2 g/kg 내지 15 g/kg)의 낮은 내독소 소 혈청 알부민(BSA)으로 복강내 주사함으로써 유도하였다.
항체 치료를 단백뇨 유도 전 7일 전부터 시작하여 격주로 복강내 주사함으로써 투여하였고 연구 기간 내내 지속하였다. 이 투약 계획을 이전의 PK/PD 및 지속적인 렉틴 경로 억제를 입증하는(데이터 미제시) 약물학 연구를 토대로 선택하였다. 마우스를 15일 차에 희생시키고 신장을 수득하고 H&E 및 면역염색을 위해 처리하였다. 신장 피질로부터의 염색된 조직 섹션을 디지털 이미지 캡처 후 자동화된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는 정량화에 의해 분석하였다.
면역조직화학 염색 및 세포자멸사 평가를 실시예 16에서 기술된 것과 같이 수행하였다.
결과:
단백뇨의 평가
마우스에서 단백뇨의 존재를 확인하기 위하여, 소변 중의 총 배설 단백질을 15일 째에(실험의 종료) 24시간 동안 수집한 소변 샘플에서 측정하였다. 소변 샘플은 BSA로 처리되지 않은 대조군 그룹에 비교하여 BSA로 처리된 그룹에서 총 단백질 수준에 평균 거의 6배 증가를 보인 것으로 결정되었고(데이터 미제시), 이것은 BSA로 처리된 마우스에서 단백뇨의 존재를 확인시켜준다. BSA 처리 그룹 사이에 단백질 수준에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
조직학적 변화의 평가
도 32는 BSA로의 치료 후 15일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A) 식염수로 처리된 야생형 대조군 마우스, (패널 B) 아이소타입 항체 처리된 대조군 마우스; 및 (패널 C) MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스.
도 32에서 나타낸 것과 같이, 동일한 수준의 단백질 과부하 도전에서 식염수로 처리된 야생형 그룹(패널 A) 또는 아이소타입 대조군(패널 B)과 비교하여 MASP-2 억제 항체로 처리된 그룹(패널 C)에서 훨씬 더 높은 정도의 조직 보존이 있다.
세포자멸사의 평가
세포자멸사를 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 표지화(TUNEL)로 염색함으로써 조직 섹션에서 평가하였고 TUNEL 염색된 세포자멸성 세포의 빈도를 피질로부터 연속적으로 선택된 20 고전력장(HPF)에서 계수하였다. 도 33은 식염수 대조군 및 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), 아이소타입 대조군 항체 및 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=8마리) 및 MASP-2 억제 항체 및 BSA로 처리된 야생형 마우스(n=7마리마리)에서 신장 피질로부터의 조직 섹션으로부터 연속적으로 선택된 20 고전력장(HPF)에서 계수된 TUNEL 세포자멸 세포의 빈도를 그래프로 도시한다. 도 33에서 나타낸 것과 같이, 피질에서 세포자멸사 비율의 매우 큰 감소가 식염수 및 아이소타입 대조군 처리 그룹과 비교하여 MASP-2 억제 항체 처리 그룹으로부터 얻어진 신장에서 관찰되었다(식염수 대조군 대 MASP-2 억제 항체의 경우 p=0.0002; 아이소타입 대조군 대 MASP-2 억제 항체의 경우 p=0.0052).
사이토카인 침윤의 평가
단백뇨 모델에서 야생형 마우스의 근위 세뇨관에서 상향 조절되는 것으로 알려져 있는 전염증성 사이토카인인 인터류킨 6(IL-6), 변환 성장 인자 베타(TGFβ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 이 연구에서 얻어진 신장 조직 섹션에서 평가하였다.
도 34는 BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스(n=8마리)에서 항-TGFβ 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TGFβ 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 34에서 나타낸 것과 같이, TGFβ 염색 영역의 정량화는 식염수 및 아이소타입 대조군 항체 처리 대조군 그룹과 비교하여 MASP-2 억제 항체 처리 마우스에서 TGFβ 수준의 상당한 감소를 보였다(p 값= 각각 0.0324 및 0.0349).
도 35는 BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스(n=8마리)에서 항-TNFα 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% TNFα 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 35에서 나타낸 것과 같이, 염색된 섹션의 분석은 식염수 대조군 그룹(p=0.011)뿐만 아니라 아이소타입 대조군 그룹(p=0.0285)과 비교하여 MASP-2 억제 항체 처리 그룹에서 TNFα 수준의 상당한 감소를 보였다.
도 36은 BSA 및 식염수로 처리된 야생형 마우스(n=8마리), BSA 및 아이소타입 대조군 항체로 처리된 야생형 마우스(n=7마리) 및 BSA 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 야생형 마우스(n=8마리)에서 항-IL-6 항체로 염색된 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석의 결과(% IL-6 항체 염색 영역으로서 측정됨)를 그래프로 도시한다. 도 36에서 나타낸 것과 같이, 염색된 섹션의 분석은 식염수 대조군 그룹(p=0.0269)뿐만 아니라 아이소타입 대조군 그룹(p=0.0445)과 비교하여 MASP-2 억제 항체 처리 그룹에서 IL-6 수준의 상당한 감소를 보였다.
결과의 전체 요약 및 결론:
이 실시예의 결과는 MASP-2 억제 항체가 단백질 과부하 모델에서 신장 손상에 대한 보호를 제공하는 것을 입증하며, 이것은 MASP-2-/- 마우스가 단백뇨 모델에서 감소된 신장 손상을 가졌음을 입증하는 실시예 16에서 기술된 결과와 일치한다.
실시예 18
이 실시예는 아드리아마이신 유도 신장병에서 렉틴 경로의 역할을 평가하기 위하여 MASP-2-/- 및 야생형 마우스에서 신장 섬유증, 염증 및 세뇨관 간질 손상의 아드리아마이신 유도 신장학 모델을 사용하여 생성된 결과를 제공한다.
배경/근거:
아드리아마이신은 혈액암(hematological malignancy), 연조직 육종(soft tissue sarcoma) 및 많은 유형의 암종을 포함한 광범위한 암의 치료에 사용된 안트라사이클린 항종양 항생물질이다. 아드리아마이신 유도 신장병은 만성 단백뇨의 진행에 대한 더 나은 이해를 가능하게 한 만성 신장 질환의 잘 확립된 설치류 모델이다(Lee and Harris, Nephrology, 16:30-38, 2011). 아드리아마이신 유도 신장병의 구조적 및 기능적 손상의 유형은 인간에서 만성 단백뇨성 신장의 그것과 매우 유사하다(Pippin et al., American Journal of Renal Physiology 296:F213-29, 2009).
아드리아마이신 유도 신장병은 사구체 경화증(glomerulosclerosis), 세뇨관 간질 염증 및 섬유증이 뒤따르는 족세포(podocyte)에 대한 손상을 특징으로 한다. 많은 연구에서 아드리아마이신 유도 신장병이 면역 및 비면역 유래 메커니즘 모두에 의해 조절되는 것으로 나타났다(Lee and Harris, Nephrology, 16:30-38, 2011). 아드리아마이신 유도 신장병은 신장 질환의 모델로서 여러 강점을 가지고 있다. 첫째, 그것은 고도로 재현 가능하고 예측 가능한 신장 손상 모델이다. 이것은 그것이 약물 투여 후 수일 이내에 신장 손상이 유도되는 것을 특징으로 하여, 손상 시기가 일관되기 때문에 용이한 실험 설계를 허용하기 때문이다. 그것은 또한 허용 가능한 사망률(<5%) 및 질병률(중량 손실)과 관련되면서 조직 손상 정도가 중증인 모델이다. 그러므로, 아드리아마이신 유도 신장병에서 신장 손상의 중증도 및 타이밍으로 인해, 그것은 신장 손상에 대해 보호하는 개입을 테스트하기에 적합한 모델이다.
실시예 16 및 17에서 기술된 것과 같이, 단백뇨의 단백질 과부하 모델에서 MASP-2-/- 마우스 및 MASP-2 억제 항체로 처리된 마우스는 야생형 마우스보다 상당히 더 나은 결과(예컨대, 적은 세뇨관 간질 손상, 및 적은 신장 염증)를 나타냈고, 이것은 단백뇨성 신장 질환에서 렉틴 경로에 대한 병원성 역할을 함축한다.
이 실시예에서, MASP-2 결핍이 아드리아마이신에 의해 유도된 신장 염증 및 세뇨관 간질 손상을 감소시키고/거나 예방하는지를 결정하기 위하여 MASP-2-/- 마우스를 아드리아마이신 유도 신장학 모델(AN)에서 야생형 마우스와 비교 분석하였다.
방법:
1. 투여량 및 시점 최적화
BALB/c 마우스가 치료적 개입을 테스트하기에 적합한 신장 염증의 수준을 발생시키는 아드리아마이신 용량 및 시점을 결정하기 위해 초기 실험을 수행하였다.
야생형 BALB/c 마우스(n=8마리)의 3개 그룹을 단일 용량의 아드리아마이신(10.5 mg/kg)으로 정맥내 주사로 투여하였다. 마우스를 3개 시점에서 도태시켰다: 아드리아마이신 투여 후 1주, 2주 및 4주 후. 대조군 마우스를 식염수만으로 주사하였다.
결과: 3개 그룹의 모든 마우스는 H&E 염색에 의해 결정된 바, 사구체 경화증 및 단백뇨의 징후를 보였고, 신장에서의 대식세포 침윤에 의해 측정된 바 조직 염증의 정도가 증분적으로 증가하였다(데이터 미제시). 조직 손상의 정도는 1주 그룹에서는 경미하였고, 2주 그룹에서는 보통이었으며 4주 그룹에서는 중증이었다(데이터 미제시). 나머지 연구를 위해 2주 시점을 선택하였다.
2. 야생형 및 MASP-2-/- 마우스에서 아드리아마이신 유도 신장학의 분석
아드리아마이신 유도 신장학에서 보체의 렉틴 경로의 역할을 설명하기 위하여, a group of MASP-2-/- 마우스(BALB/c)의 그룹을 동일 용량의 아드리아마이신에서 야생형 마우스(BALB/c)와 비교하였다. MASP-2-/- 마우스를 10 세대 동안 BALB/c 마우스와 역교배시켰다.
야생형(n=8마리) 및 MASP-2-/-(n=8마리)를 아드리아마이신(10.5 mg/kg)으로 정맥내 주사하고 각 스트레인의 3마리 마우스를 대조군으로서 식염수만을 주었다. 모든 마우스는 치료 후 2주 후에 도태되었고 조직을 수집하였다. 조직병리학적 손상 정도를 H&E 염색에 의해 평가하였다.
결과:
도 37은 아드리아마이신 또는 식염수 단독(대조군)으로 치료 후 14일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대표적인 H&E 염색된 조직 섹션을 도시한다: (패널 A-1, A-2, A-3) 식염수로만 처리된 야생형 대조군 마우스; (패널 B-1, B-2, B-3) 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 및 (패널 C-1, C-2, C-3) 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 마우스. 각각의 사진(예컨대, 패널 A-1, A-2, A-3)은 상이한 마우스를 나타낸다.
도 37에서 나타낸 것과 같이, 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 그룹에서 동일 용량의 아드리아마이신으로 처리된 야생형 그룹과 비교하여 훨씬 더 높은 정도로 조직이 보존된다.
도 38은 아드리아마이신 또는 식염수 단독(야생형 대조군)으로 치료 후 14일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 대식세포 평균 염색 영역(%)을 보여주는, 대식세포-특이적 항체 F4/80으로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시한다: 식염수만으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수만으로 처리된 MASP-2-/- 마우스, 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스. 도 38에서 나타낸 것과 같이, 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 마우스는 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스와 비교하여 대식세포 침윤이 감소하였다(**p=0.007).
도 39는 아드리아마이신 또는 식염수 단독(야생형 대조군)으로 치료 후 14일 째에 마우스의 다음 그룹으로부터의 콜라겐 침착 염색 영역(%)을 보여주는, 시리우스 레드로 염색된 신장 조직 섹션의 컴퓨터 기반 이미지 분석 결과를 그래프로 도시한다: 식염수만으로 처리된 야생형 대조군 마우스; 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스; 식염수만으로 처리된 MASP-2-/- 마우스, 및 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2 -/- 마우스. 도 39에서 나타낸 것과 같이, 아드리아마이신으로 처리된 MASP-2-/- 마우스는 아드리아마이신으로 처리된 야생형 마우스에 비교하여 콜라겐 침착이 감소하였다(**p=0.005).
전체 요약 및 결론:
신장 세뇨관 간질 염증의 개선은 신장 질환의 치료를 위한 핵심 목표이다. 여기서 제시된 결과는 보체 활성화의 렉틴 경로가 신장 세뇨관 간질 염증의 발생에 상당히 기여하는 것을 나타낸다. 여기서 추가로 입증되는 바, MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체는 단백뇨성 신장병, 아드리아마이신 신장병의 치료 및 신장 세뇨관 간질 염증의 개선에 새로운 치료적 접근법으로서 사용될 수 있다.
실시예 19
이 실시예는 스테로이드 의존성 면역글로불린 A 신장병(IgAN)을 가진 성인 및 스테로이드 의존성 막성 신장병(MN)을 가진 성인에서 전체적으로 인간 단클론성 MASP-2 억제 항체의 안전성 및 임상적 효능을 평가하기 위한 진행 중인 2상 임상 시험의 초기 결과를 기술한다.
배경:
만성 신장 질환은 미국에서 2천만명 이상의 사람들에게 영향을 미친다(Drawz P. et al., Ann Intern Med 162(11); ITC1-16, 2015). IgAN 및 MN을 포함한 사구체 신장병(Glomerulonephropathies, GN)은 사구체가 손상되고 자주 말기 신장 질환 및 투석으로 이어지는 신장 질환이다. 여러 유형의 일차 GN이 존재하는데, 가장 일반적인 것은 IgAN이다. 이들 환자 중 많은 환자가 지속적인 신장 염증 및 진행성 악화를 가지고 있다. 종종 이들 환자는 많은 심각한 장기 유해 결과를 가지고 있는 코르티코스테로이드 또는 면역억제제로 치료된다. 이들 치료에도 불구하고 많은 환자가 계속해서 악화된다. IgAN 또는 MN의 치료를 위해 승인된 치료는 없다.
IgA 신장병
면역글로불린 A 신장병(IgAN)은 신장내 염증 및 신장 손상을 초래하는 자가면역 신장 질환이다. IgAN은 전세계적으로 가장 일반적인 일차 사구체 질환이다. 연간 발생률은 대략 100,000명당 2.5로, 미국에서 1400명 중 1명이 IgAN이 발병할 것으로 추정된다. IgAN 환자의 40%나 많이 말기 신장 질환(ESRD)으로 진행될 것이다. 환자는 전형적으로 경미 내지 보통의 단백뇨와 함께 현미경적 혈뇨(microscopic hematuria) 및 가변적 수준의 신부전증(renal insufficiency)을 나타낸다(Wyatt R.J., et al., N Engl J Med 368(25):2402-14, 2013). 손상된 신장 기능, 지속적인 고혈압, 및 심한 단백뇨(1일당 1 g 초과)와 같은 임상 마커는 좋지 못한 예후와 관련된다(Goto M et al., Nephrol Dial Transplant 24(10):3068-74, 2009; Berthoux F. et al., J Am Soc Nephrol 22(4):752-61, 2011). 단백뇨는 다수의 대규모 관찰 연구 및 전향적 시험에서 다른 위험 요인과 독립적인 가장 강력한 예후 요인이다(Coppo R. et al., J Nephrol 18(5):503-12, 2005; Reich H. N., et al., J Am Soc Nephrol 18(12):3177-83, 2007). 환자 중 15-20%가 치료하지 않은 채로 방치되면 질환이 개시된 후 10년 이내에 ESRD에 도달한다(D'Amico G., Am J Kidney Dis 36(2):227-37, 2000).
IgAN의 진단적 특징은 사구체 메산지움에서 IgA 침착이 단독으로 또는 IgG, IgM, 또는 둘 다와 함께 우세하게 있다는 것이다. IgAN에서, 신장 생검은 보체 시스템의 렉틴 경로의 이펙터 효소인, MASP-2의 활성화를 위한 핵심 인식 분자인 만난 결합 렉틴(MBL)의 사구체 침착을 나타낸다. 일반적으로 IgA와 함께 공동 국지화되고 보체 활성화를 나타내는 사구체 MBL 침착, 및 고수준의 소변 MBL은 IgAN의 유리하지 않은 예후와 관련되며, 이들 환자는 MBL 침착 또는 고수준의 소변 MBL이 없는 환자보다 더 중증의 조직학적 변화 및 메산지움 증식을 입증한다(Matsuda M. et al., Nephron 80(4):408-13, 1998; Liu LL et al., Clin Exp Immunol 169(2):148-155, 2012; Roos A. et al., J Am Soc Nephrol 17(6):1724-34, 2006; Liu LL et al., Clin Exp Immunol 174(1):152-60, 2013). 관해 속도 또한 실질적으로 MBL 침착 환자의 경우 더 낮다(Liu LL et al., Clin Exp Immunol 174(1):152-60, 2013).
IgAN에 대한 현재의 치료법에는 혈압 제어 및, 빈번하게, 코르티코스테로이드 및/또는 다른 면역억제제, 예컨대 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 또는 중증 질환(예컨대, 반월상 IgAN)의 경우 미코페놀레이트 모페틸이 포함된다. 사구체신염에 대한 신장 질환 개선 종합 결과(KDIGO) 지침(Int. Soc of Nephrol 2(2):139-274, 2012)은 코르티코스테로이드는 1 g/일 이상의 단백뇨 환자에게 투여되어야 하고, 일반적인 치료 기간은 6개월인 것을 권장하고 있다. 그러나, 심각한 장기 후유증과 관련된 공격적 면역억제 치료에도, 일부 환자는 신장 기능이 점진적으로 악화된다. IgAN에 대해 승인된 치료는 없으며, 혈압을 제어하기 위한 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제 또는 안지오텐신 수용체 차단제(ARB)의 사용에도 불구하고, 일부 환자에서는 증가된 단백뇨가 지속된다. 이들 치료 중 어느 것도 질환이 급속도로 진행될 위험이 있는 환자에서 IgAN의 진행을 중단시키거나 심지어 둔화시키지 못하는 것으로 나타났다.
막성 신장병
막성 신장병(MN)의 연간 발생률은 1,000,000명당 대략 10-12이다. MN 환자는 가변적인 임상 과정을 가질 수 있지만, 대략 25%가 말기 신장 질환이 발병할 것이다.
막성 신장병은 면역 매개 사구체 질환이며 성인에서 신증후군(nephrotic syndrome)의 가장 일반적인 원인 중 하나이다. 질환은 사구체 기저막의 외측 상에서 면역 침착, 주로 IgG4의 형성을 특징으로 하며, 족세포 항원 및 그런 항원에 특이적인 항체를 함유하여 보체 활성화를 초래한다. MN의 초기 징후는 신증후군: 단백뇨, 저알부민혈증(hypoalbuminemia), 고지혈증(hyperlipidemia), 및 부종(edema)과 관련된다.
비록 MN이 치료 없이 자발적으로 없어지긴 하지만, 환자의 1/3 정도로 많은 환자가 신장 기능의 점진적 상실을 입증하고 진단 후 5년의 중앙값으로 ESRD로 진행된다. 종종, 코르티코스테로이드가 MN을 치료하기 위해 사용되며 대체 치료법을 개발할 필요성이 있다. 추가적으로, 단백뇨의 중증도를 토대로, 진행 위험이 보통인 것으로 결정된 환자는 사이클로포스파미드 또는 칼시뉴린 억제제와 함께 프레드니손으로 치료되며, 이들 두 치료는 함께 종종 중증의 전신성 부작용과 관련된다.
방법:
건강한 지원자에서 수행된 2개의 1상 임상 시험으로 MASP-2 억제 항체, OMS646의 정맥내 및 피하 투약이 모두 지속적인 렉틴 경로 억제을 초래한 것이 입증되었다.
이 실시예는 IgAN 및 MN을 가진 대상체에서 MASP-2 억제 항체인 OMS646의 진행 중인 2상, 비통제, 다기관 연구로부터의 중간 결과를 기술한다. 포함 기준은 이 연구의 모든 환자가, 신장 질환의 아형에 관계 없이, 연구 등록 전 적어도 12주 동안 안정적인 용량의 코르티코스테로이드로 유지되고 있었던 것을 필요로 한다9즉, 환자는 스테로이드 의존성임). 연구는 12주의 치료 및 6주의 추적 기간이 있는 단일 팔(single-arm) 파일럿이다.
질환당 대략 4명의 대상체를 등록하려고 계획한다. 연구를 OMS646가 IgAN 및 MN을 가진 대상체에서 신장 기능을 개선하고(예컨대, 단백뇨를 개선함) 코르티코스테로이드 필요를 감소시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위해 설계한다. 오늘까지, 2명의 IgA 신장병 환자 및 2명의 막성 신장병 환자가 이 연구에서 치료를 완료하였다.
연구 진입시 각 대상체는 안정적인 코르티코스테로이드 용량으로 치료가 진행 중이어도 소변에 고수준의 단백질을 가져야 한다. 이들 기준은 연구 기간 중에 자발적으로 개선될 가능성이 없는 환자를 선택한다.
대상체는 선별시 18세 이상이었고 다음 중 하나로 진단된 경우에만 포함되었다: 신장 생검에서 진단된 IgAN 또는 신장 생검에 대해 진단된 원발성 MN. 등록된 환자는 또한 다음의 포함 기준 전부를 충족시켜야 했다:
(1) 선별 기간 중 2회 방문의 각각의 방문 전에 연속적으로 및 매일 수집된 3개의 샘플로부터 >0.6의 평균 소변 알부민/크레아티닌 비율을 가져야 하고;
(2) 1차 선별 방문 전 적어도 12주 동안 ≥10 mg 또는 동등한 용량의 프레드니손을 투여받았으며;
(3) 만약 면역억제 치료(예컨대, 사이클로포스파미드, 미코페놀레이트 모페틸) 중이라면, 1차 선별 방문 전 적어도 2개월 동안에는 안정적인 용량을 받았고 연구 기간 동안에는 용량에 예상된 변화가 없어야 하고;
(4) MDRD 방정식1에 의해 계산된 ≥ 30 mL/분/1.73m2의 추정된 사구체 여과율(eGFR)을 가지며;
(5) 안지오텐신 전환 효소 억제제 억제제(ACEI) 및/또는 안지오텐신 수용체 차단제(ARB)를 사용하여 의사가 지시한 안정적인, 최적화된 치료를 받고 있고 휴식시 <150 mmHg의 수축기 혈압 및 <90 mmHg의 확장기 혈합을 가지며;
(6) 1차 선별 방문의 6개월 이내에 벨리무맙, 에쿨리주맙 또는 리투지맙을 사용한 적이 없었고; 그리고
(7) 신장 이식의 이력이 없어야 한다.
1MDRD 방정식: eGFR(mL/분/1.73m2) = 175 x (SCr)-1.154 x (Age)-0.203 x (여성이면 0.742) x (아프리카게 미국인이면 1.212). 주의: SCr=혈청 크레아티닌 측정은 mg/dL이어야 한다.
이 연구에서 사용된 단클론성 항체, OMS646는 인간 MASP-2에 결합하여 억제하는 전체적으로 인간 IgG4 단클론성 항체이다. MASP-2는 렉틴 경로의 이펙터 효소이다. 실시예 12에서 입증된 것과 같이, OMS646은 재조합 MASP-2에 강력하게 결합하고(외관상 평형 해리 상수는 100 pM의 범위임) 상동성 단백질 C1s, C1r, 및 MASP-1에 대해 5,000배를 넘는 선택성을 나타낸다. 기능성 검정에서, OMS646은 인간 렉틴 경로를 나노몰 효능(50% 억제 [IC50]로 이어지는 농도, 대략적으로 3 nM)으로 억제하지만 고전적 경로에 대해서는 유의미한 영향을 갖지 않는다. 마우스, 비인간 영장류, 및 인간에게 정맥내(IV) 또는 피하(SC) 주사에 의해 투여된 OMS646은 생체외 검정에서 렉틴 경로 활성화의 억제와 관련된 높은 혈장 농도를 초래하였다.
이 연구에서, OMS646 약물 물질을 100 mg/mL의 농도로 제공하였고, 정맥내 투여를 위해 추가로 희석하였다. OMS646의 적절하게 계산된 부피인 100 mg/mL 주사 용액을 용량 제조를 위해 주사기를 사용하여 바이알로부터 회수하였다. 주입 주머니는 제조 후 4시간 이내에 투여하였다.
연구는 아래의 연구 설계 계획에서 나타내는 것과 같이, 선별(28일), 치료(12주) 및 추적(6주) 기간으로 이루어진다.
연구 설계 계획
선별 기간 내에 및 제1 OMS646 용량 전에, 사전 동의한 대상체는 소변 알부민-대-크레아티닌 비율의 기준선 값을 확립하기 위하여 2번의 3일 연속 기간의 각각에 3개의 소변 샘플(매일 1회 수집함)을 제공하였다. 선별 기간 후에, 적격 대상체에게 4 mg/kg의 OMS646을 12주(치료 기간) 동안 주 1회로 정맥내로 제공하였다. 마지막 용량의 OMS646 후에 6주의 추적 기간이 있었다.
처음 4주의 OMS646으로의 치료 중에, 대상체는 코르티코스테로이드의 안정적인 연구전 용량을 유지하고 있었다. 12주 치료 기간의 처음 4주가 끝났을 때, 대상체는, 견딜 수 있다면, 4주 동안 코르티코스테로이드 감소를 겪었고(즉, 코르티코스테로이드 용량이 감소됨), 이후에 4주 동안 결과적인 코르티코스테로이드 용량을 유지하였다. 목표는 매일 6 mg 이하(또는 동등한 용량)까지의 프레드니손이었다. 이 기간이 지난 후, 연구자에 의해 결정된 바, 신장 기능이 악화된 대상체에서는 감소를 중단하였다. 대상체를 코르티코스테로이드 감소를 통해 전체 12주의 치료 동안 OMS646로 치료하였다. 그런 후 환자를 마지막 치료 후 추가로 6주 동안 추적하였다. 코르티코스테로이드의 감소 및 OMS646 치료는 OMS646이 안정적인 신장 기능을 유지하기 위해 필요한 코르티코스테로이드의 용량의 감소를 허용했는지의 여부에 대한 평가를 가능하게 하였다.
이 연구에서 핵심 효능 척도는 기준선으로부터 12주까지의 소변 알부민-대-크레아티닌 비율(uACR) 및 24시간 단백질 수준의 변화이다. 신장 개선 및 소변 단백질의 지속적인 높은 수준이 신장 질환 진행과 상관이 있는지를 평가하기 위하여 소변 단백질 또는 알부민의 측정을 일상적으로 사용한다. 단백뇨를 평가하기 위하여 uACR을 임상적으로 사용한다.
효능 분석
uACR에 대한 분석 값을 시점에 대해 얻어진 모든 값의 평균으로서 정의한다. uACR의 계획된 수는 계획된 각각의 시점에 3이다. uACR의 기준선 값을 2회의 선별 방문시 분석 값의 평균으로서 정의한다.
결과:
도 40은 4 mg/kg의 MASP-2 억제 항체(OMS646)로 매주 치료하는 12주 연구 과정 동안 2명의 IgAN 환자에서 uACR을 그래프로 도시한다. 도 40에서 나타낸 것과 같이, 기준선으로부터의 변화는 비변형 분석에 의해 시점 "a"(p0.003); 시점 "b"(p=0.007) 및 시점 "c"(p=0.033)에 통계학적으로 유의미하다.표 12는 OMS646로 치료된 2명의 IgAN 환자에 대한 24시간 소변-단백질 데이터를 제공한다.
도 40 및 표 12에서 나타낸 것과 같이, IgAN 환자는 연구 과정 동안 신장 기능에 임상적으로 및 통계학적으로 유의미한 개선을 입증하였다. uACR(도 40 참고) 및 24시간 소변 단백질 농도(표 12 참고) 모두에서 통계학적으로 유의미한 감소가 있었다. 도 40의 uACR 데이터에서 나타낸 것과 같이, 평균 기준선 uACR은 1264 mg/g이었고 치료가 끝났을 때 535 mg/g에 도달하였으며 추적 기간이 끝났을 때에는 128 mg/g으로 감소하였다. 도 40에서 추가로 나타낸 것과 같이, 치료 효과는 추적 기간 내내 유지되었다. 24시간 소변 단백질 배설 추적 uACR을 측정하였고, 평균 감소 시간은 3156 mg/24시간에서 1119 mg/24시간이었다(p=0.017). 2명의 환자에 대한 치료 효과는 매우 일치하였다. 두 환자 모두 대략 2000 mg/일의 감소를 경험하였고 둘 다 부분 관해를 달성하였다(부분 관해는 24시간 소변 단백질 배설의 50 퍼센트보다 큰 감소 및/또는 결과적으로 1000 mg/일 미만의 단백질 배설로 정의되고; 완전 관해는 300 mg/일 미만의 단백질 배설로 정의됨). 2명의 IgA 신장병 환자 모두에서 24시간 단백뇨 감소의 크기는 신장 생존의 개선과 관련된다. 2명의 IgA 신장병 환자 모두 또한 스테로이드를 실질적으로 감소시킬 수 있어서, 각각 ≤5 mg으로 일일 용량을 감소시켰다(60 mg에서 0 mg; 30 mg에서 5 mg).
2명의 MN 환자가 또한 OMS646으로의 치료 중에 uACR의 감소를 입증하였다. 한 명의 MN 환자는 1003 mg/g에서 69 mg/g으로 uACR의 감소가 있었고 이 낮은 수준을 추적 기간 내내 유지하였다. 다른 MN 환자는 1323 mg/g에서 673 mg/g으로 uACR이 감소하였고, 치료 후 과정은 가변적이었다. 제1 MN 환자는 24시간 소변 단백질 수준에 현저한 감소를 보였고(기준선에서 10,771 mg/24시간에서 85일 차에 325 mg/24시간), 부분 및 거의 완전한 관해를 달성한 한편, 다른 환자는 본절적으로 변화 없이 유지되었다(기준선에서 4272 mg/24시간에서 85일 차에 4502 mg/24). 두 MN 환자에서 스테로이드를 30 mg으로부터 15 mg으로 및 10 mg으로부터 5 mg으로 감소시켰다.
요약하면, 신장 기능의 일관된 개선이 MASP-2 억제 항체 OMS646으로 치료된 IgAN 및 MN 대상체에서 관찰되었다. IgAN 환자에서 OMS646 치료의 효과는 강력하고 일관되어서, 강력한 효능 신호를 시사한다. 이들 효과는 MN 환자에서의 결과에 의해 지지된다. 치료 동안 uACR 변화의 시간 과정 및 크기는 IgAN 및 MN을 가진 4명의 환자 전부에서 일관되었다. 유의할만한 안전성 문제는 관찰되지 않았다. 이 연구에서 환자는 치료가 어려운 그룹을 나타내며 이들 환자에서 치료 효과는 말기 신장 질환으로 급속히 진행될 위험이 있는 환자를 포함하여, IgAN 및 MN 환자, 예컨대 환자 스테로이드 의존성 IgAN 및 MN을 앓고 있는 환자(즉, MASP-2 억제 항체로의 치료 전에 안정적인 코르티코스테로이드 용량으로 치료를 받고 있는 환자)에서 MASP-2 억제 항체, 예컨대 OMS646의 효능을 예측하는 것으로 여겨진다.
전술한 설명에 따르면, 한 구체예에서, 발명은 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IgAN 또는 MN을 앓고 있는 인간 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 방법은 IgAN 또는 MN을 앓고 있는 인간 대상체에게 신장 기능을 개선(예컨대, 단백뇨를 개선)하기에 충분한 양의 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 스테로이드 의존성 IgAN을 앓고 있다. 한 구체예에서, 대상체는 스테로이드 의존성 MN을 앓고 있다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 스테로이드 의존성 IgAN 또는 스테로이드 의존성 MN을 앓고 있는 대상체에게 상기 대상체에서 신장 기능을 개선하고/거나 코르티코스테로이드 투여량을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
한 구체예에서, 방법은 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 전에 스테로이드 의존성 IgAN을 앓고 있는 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 전에 스테로이드 의존성 MN을 앓고 있는 인간 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 구체예 중 임의의 구체예를 따르면, MASP-2 억제 항체는 다음 특징 중 적어도 하나 이상을 나타낸다: 상기 항체는 인간 MASP-2에 10 nM 이하의 KD로 결합하고, 상기 항체는 MASP-2의 CCP1 도메인의 에피토프에 결합하며, 상기 항체는 시험관내 검정에서 1% 인간 혈청에서 10 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착을 억제하고, 상기 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착을 억제하며, 항체는 Fv, Fab, Fab', F(ab)2 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택된 항체 단편이고, 항체는 단일 사슬 분자이며, 상기 항체는 IgG2 분자이고, 상기 항체는 IgG1 분자이며, 상기 항체는 IgG4 분자이고, IgG4 분자는 S228P 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 MASP-2에 결합하고 렉틴 경로를 선택적으로 억제하며 고전적 경로는 실질적으로 억제하지 않는다(즉, 고전적 보체 경로를 온전하게 남겨두면서 렉틴 경로를 억제함).
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 적어도 하나의 이상의 임상 매개변수 관련 신장 기능을 개선, 예컨대 단백뇨의 개선(예컨대, uACR의 감소 및/또는 24시간 소변 단백질 농도의 감소, 예컨대 24시간 소변 단백질 배설에서 20 퍼센트보다 큰 감소, 또는 예컨대 24시간 소변 단백질 배설에서 30 퍼센트보다 큰 감소, 또는 예컨대 24시간 소변 단백질 배설에서 40 퍼센트보다 큰 감소, 또는 예컨대 24시간 소변 단백질 배설에서 50 퍼센트보다 큰 감소)에 효과적인 양으로 투여된다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 기간(예컨대, 적어도 1일 내지 1주 또는 2주 또는 3주 또는 4주 또는 그 이상) 동안 IgAN(예컨대 스테로이드 의존성 IgAN)을 앓고 있는 대상체에게 카테터를 통해(예컨대, 정맥내로) MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계에 이어서 제2 기간(예컨대, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성 단계) 동안 대상체에게 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 기간(예컨대, 적어도 1일 내지 1주 또는 2주 또는 3주 또는 4주 또는 그 이상) 동안 MN(예컨대 스테로이드 의존성 MN)을 앓고 있는 대상체에게 카테터를 통해(예컨대, 정맥내로) MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계에 이어서 제2 기간(예컨대, 적어도 2주 또는 그 이상의 만성 단계) 동안 대상체에게 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 IgAN(예컨대 스테로이드 의존성 IgAN) 또는 MN(예컨대 스테로이드 의존성 MN)을 앓고 있는 대상체에게 정맥내로, 근육내로, 또는 피하로 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 치료는 만성적이고 매일 내지 매달 투여될 수 있지만, 바람직하게는 적어도 2주마다, 또는 적어도 주 1회, 예컨대 주 2회 또는 주 3회일 수 있다.
한 구체예에서, 방법은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 일정량을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, IgAN(예컨대 스테로이드 의존성 IgAN) 또는 MN(예컨대 스테로이드 의존성 MN)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 (a) i) 서열 번호:67의 31-35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H1; 및 ii) 서열 번호:67의 50-65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H2; 및 iii) 서열 번호:67의 95-107의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 b) i) 서열 번호:69의 24-34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L1; 및 ii) 서열 번호:69의 50-56의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L2; 및 iii) 서열 번호:69의 89-97의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 (II) 서열 번호:67에 대해 적어도 90% 동일성(예컨대, 서열 번호:67에 대해 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69에 대해 적어도 90% 동일성(예컨대, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일성)을 가지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 그것의 변이체를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 일정량을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 서열 번호:67로 제시된 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로 제시된 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 OMS646에 의해 인식되는 인간 MASP-2 상의 에피토프의 적어도 일부를 특이적으로 인식하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 IgAN(예컨대 스테로이드 의존성 IgAN) 또는 MN(예컨대 스테로이드 의존성 MN)을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체에게 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 1 mg/kg 내지 10 mg/kg(즉, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 투여량으로 적어도 3주 동안, 또는 적어도 4주 동안, 또는 적어도 5주 동안, 또는 적어도 6주 동안, 또는 적어도 7주 동안, 또는 적어도 8주 동안, 또는 적어도 9주 동안, 또는 적어도 10주 동안, 또는 적어도 11주 동안, 또는 적어도 12주 동안 적어도 주 1회(예컨대 적어도 주 2회 또는 적어도 주 3회) 투여하는 단계를 포함한다.
실시예 20
이 실시예는 코로나바이러스 유도 급성 호흡기 장애 증후군을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 대상체의 치료에 MASP-2 억제 항체, OMS646을 사용하는 연구를 기술한다.
배경/근거:
급성 호흡기 장애 증후군은 코로나바이러스 감염의 중증 합병증이다. SARS-CoV는 2002년과 2003년도에 중국에서 동물 시장에서 유행하는 코로나바이러스로부터 출현하여, 전세계적으로 호흡기 질환의 발생으로 이어져, 8,000건이 넘는 인간 사례 및 10%의 사망률을 보였다(Rota P.A. et al., Science 300:1394-1999, 2003). 2012년에, 새로운 관련 코로나바이러스가 중동에서 확인되었고, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)로 지정되고, 35%를 넘는 사망률을 가진 중증 호흡기 질환을 유발하였다(Zaki A.M. et al., N Engl J Med 367:1814-1820, 2012). 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)는 2019년에 출현한 감염성 질환으로 SARS 바이러스와 밀접하게 관련된 바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS 코로나바이러스 2 또는 SARS-CoV-2)에 의해 유발된다(World Health Organization, 2/11/2020, Novel Coronavirus Situation Report 22). COVID-19, SARS-CoV 및 MERS-CoV는 모두 무증상 사례로부터 중증 급성 호흡기 장애 증후군(코로나바이러스 유도 ARDS) 및 호흡 부전에 이르기까지 다양한 질환을 유발한다. COVID-19에 영향을 받은 사람들은 열, 마른 기침, 피로 및 호흡 곤란을 나타낼 수 있다. 컴퓨터 단층촬영시 소견은 폐 간유리 불투명도와 양측의 고르지 못한 음영을 보일 수 있다. 사례들은 폐렴, 중증 급성 호흡기 장애 증후군을 포함한 호흡기 기능장애로 진행할 수 있고, 가장 취약한 사람에게서 다기관 부전 및 패혈증 쇼크, 및 사망으로 이어질 수 있다(예컨대, Hui D.S. et al., Int J Infect Dis 91:264-266, Jan 14, 2020 and Guan et al. OI:10.1056/NEJMoa2002032 참고). 백신 또는 특정 항바이러스 치료는 없으며, 관리는 증상의 치료 및 지원적인 돌봄을 포함한다. 그러므로, 코로나바이러스 유도 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제 및/또는 예방하기 위한 치료적으로 효과적인 작용제를 개발할 긴박한 필요가 있다.
보체 활성화는 코로나바이러스 유도 중증 급성 호흡기 증후군에 발병에 기여하는 것으로 관찰되었다. 보체 구성요소 3이 결핍된 SARS-CoV 감염 마우스(C3-/- 마우스)가 SARS-CoV 감염 C57BL/6J 대조군 마우스와 비교하여, 폐에 동등한 바이러스 부하가 있음에도 불구하고 상당히 더 적은 체중 손실과 더 적은 호흡기 기능장애를 나타낸 것으로 나타났다(Gralinski L.E. et al., mBio 9:e01753-18, 2018). 추가로 미감염 대조군 마우스에서보다 SARS-CoV 감염 C3-/- 마우스의 폐에서 상당히 더 적은 호중구 및 염증성 단핵세포뿐만 아니라 감염된 대조군 마우스에 비교하여 SARS-CoV 감염 C3-/- 마우스의 폐에서 감소된 폐 병리 및 더 낮은 사이토카인 및 케모카인 수준(예컨대, IL-5, IL-6)이 있었음이 관찰되었다(Gralinski L.E. et al., mBio 9:e01753-18, 2018).
연구는 또한 SARS-CoV 감염의 많은 생존자가 폐섬유증이 발병하고, 고령 환자에서 유병률이 더 높은 것을 보여주었다(Hui D.S. et al., Chest 128:2247-2261, 2005). 폐 섬유증, 예컨대 코로나바이러스 유도 섬유증을 치료하기 위한 선택권은 제한되어 있다. 전통적으로, 코르티코스테로이드는 ARDS 및 폐섬유증을 치료하기 위해 사용되지만, 그러나, 바이러스 감염 동안 , 이 치료는 면역 반응을 약화시키고 악화된 질환을 초래할 수 있다(Gross T.J. et al., N Engl J Med 345:517-525, 2001).
이전에 주지된 것과 같이, COVID-19에 효과적인 치료는 알려져 있지 않으며, 질환은 빠르게 확산되고 있다. 비록 사망률 평가가 여전히 초기 상태지만, 세계 보건 기구는 2020년 3월 초에 3.4%의 사망률을 보고하였다(worldwideweb.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19---3-march-2020). 중증 COVID-19 감염 환자에 대한 효과적인 치료가 필요하다.
본원에서 기술되는 것과 같이, 렉틴 경로는 보체의 3가지 활성화 경로 중 하나이다. 다른 경로는 고전적 경로 및 대체 경로이다. 모든 활성화 경로는 아나필라톡신 C3a 및 C5a의 생성을 초래하고 표적 세포 상에 C5b-9 또는 막 공격 복합체(MAC)의 생성을 초래한다.
렉틴 경로는 선천성 면역 체계의 일부이며 미생물 또는 손상된 세포에 의해 활성화된다. 미생물은 탄수화물 기반 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 표시하고 손상된 숙주 세포는 손상 관련 분자 패턴(DAMP)을 표시한다. DAMP는 건강한 세포 상에는 표시되지 않지만 세포 손상으로 노출된다.
순환 렉틴, 예컨대 만노스 결합 렉틴(MBL), 피콜린, 및 콜렉틴은 PAMP 및 DAMP을 인식하고 결합한다. PAMP 또는 DAMP에 대한 렉틴 결합은 세포막에 가까운 곳에 보체 활성화를 국지화한다. 이들 렉틴은 보체 인자 2 및 4를 절단하여 C3 전환효소를 생성하는 만난 결합 렉틴 회합된 세린 프로테아제 2(MASP-2)를 운반하고, C3 전환효소 자체는 그런 후에 C3을 절단하여 C5 전환효소를 형성한다. 렉틴 경로 활성화 외에, 대체 경로가 또한 활성화되어 보체 활성화를 증폭시킨다. 이것은 모두 MAC의 손상된 세포 막으로의 삽입으로 이어져, 더 많은 DAMP 노출로 추가로 세포를 손상시킨다. MASP-2를 운반하는 순환 렉틴은 DAMP를 인식하고 결합하여 추가의 렉틴 경로 활성화 및 추가의 세포 손상을 유발한다. 이런 방식으로, 렉틴 경로는 초기 보체 활성화에 의해 유발된 세포 손상을 확대시키고 악화시킬 수 있다.
본원에서 기술되는 것과 같이, OMS646(또한 OMS721 또는 나르소플리맙으로도 알려져 있음)은 MASP-2에 대해 지시된 조사되고 있는 인간 IgG4 단클론성 항체이다. 본원에서 추가로 기술되는 것과 같이, MASP-2를 차단함으로써, 렉틴 경로의 활성화가 억제된다. 이것은 위에서 기술된 보체 매개 세포 손상의 사이클을 깰 수 있다. 지금까지, OMS646은 대략 230명의 건강한 지원자, 혈전 미세혈관병증(thrombotic microangiopathis, TMA) 환자, 및 사구체 신장병(예컨대, 면역글로불린 A [IgA] 신장병) 환자에게 투여되었다.
렉틴 경로는 코로나바이러스 유도 ARDS의 보체 활성화를 개시하고 지속시키는데 핵심 역할을 할 수 있고, MASP-2 억제 항체 OMS646과 같은 MASP-2 억제제를 통한 렉틴 경로의 억제는 코로나바이러스 감염과 관련된 보체 매개 폐 손상을 해결할 수 있다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 발명자들은 보체 시스템의 렉틴 경로의 핵심 조절자인 만난 결합 렉틴 관련 세린 프로테아제-2(MASP-2)의 억제가 섬유화 질환의 다양한 동물 모델에서 염증 및 섬유증을 상당히 감소시키는 것을 발견하였다. 예를 들어, 본원의 실시예 14 및 15에서 제시된 결과는 신장 세뇨관 간질 염증, 세뇨관 세포 손상, 섬유화 촉진 사이토카인 방출 및 반흔 형성에 대한 MASP-2 억제의 유익한 영향을 입증한다. 실시예 17에서 기술된 것과 같이, 야생형 마우스의 마우스 단백질-과부하 단백뇨 모델에서 신장 염증 및 세뇨관 간질 손상을 유도 및/또는 예방하는 효능에 대한 단클론성 MASP-2 억제 항체의 분석에서, 도 36에서 나타낸 것과 같이, 식염수 대조군 그룹(p=0.0269)뿐만 아니라 그룹(p=0.0445)에 비교하여 MASP-2 억제 항체 처리 그룹에서 IL-6의 수준에 상당한 감소가 있는 것으로 결정되었다.
방법:
다음의 연구를 코로나바이러스(예컨대, COVID-19 바이러스) 감염을 앓고 있는 하나 이상의 환자의 치료에 OMS646의 사용을 분석하기 위해 상기 환자(들)에서 급성 호흡기 장애 증후군을 치료, 억제, 완화 또는 예방하기 위하여 OMS646의 효능을 측정하기 위해 수행한다.
방법은 진단 테스트, 예컨대 분자 테스트(예컨대, rRT-PCR) 또는 혈청학 테스트를 수행함으로써, 또는 그러한 정보를 함유한 데이터베이스를 참조하여 결정될 수 있는, 코로나바이러스, 예컨대 COVID-19, MERS-CoV 또는 SARS로 감염된 대상체를 확인하는 단계를 포함한다. COVID-19, MERS-CoV 및 SARS에 대한 예시의 테스트는 질병 관리 본부 웹사이트(world-wide-web.cdc.gov/coronavirus/mers/lab/lab-testing.html#molecular)에서 확인할 수 있다.
대상체는 COVID-19 유도 ARDS를 앓고 있거나, 또는 ARDS의 발병 위험이 있을 수 있고, 예컨대 대상체는 폐렴을 앓고 있다. 폐렴은 ARDS 발병의 가장 일반적인 위험 요인이다(Sweeney R.M. and McAuley, D.F., Lancet vol 388:2416-30, 2016).
COVID-19 유도 ARDS는 COVID-19로 감염된 후에 발병하고 베를린 정의(JAMA 307:2526, 2012)를 토대로 ARDS에 대한 하나 이상의 다음 기준을 충족시키는 임상 증후군으로서 정의된다(Sweeney R.M. and McAuley, D.F., Lancet vol 388:2416-30, 2016):
· 산소화(mm Hg): 경증(PaO2/FiO2 200-300); 보통(PaO2/Fi O2 100-199); 중증(PaO2/FiO2 <100)
· 호기말 양압(PEEP)(cm H2O): 최소 5 PEEP 필요
· 흉부 방사선 사진 상의 침윤: 정면 흉부 방사선 사진 또는 CT에서 2개 이상의 사분면을 포함하는 양측 침윤
· 심부전: 임상 상태로만 설명하기에 충분하지 않은 좌심실 부전
· 중증도: 산소화 기준을 토대로 함
치료 투여
COVID-19를 앓고 있고 하나 이상의 호흡기 증후군, 예컨대 위에서 열거된 기준을 경험하고 있는 대상체를 정맥내 주입을 통해 4 mg/kg의 OMS646을 투여하였다. 치료는 주 2회 투여한다. 투여 빈도는 치료법에 대한 환자 반응에 의해 결정된다. 만약 환자가 4주 동안 유지되는 임상적 개선을 보인다면, 용량은 주 1회 4 mg/kg으로 감소될 수 있다. 만약 환자가 4주 동안 주 1회 4 mg/kg을 받으면서 치료 반응을 유지한다면, 치료는 중단될 수 있다.
치료에 대한 양성 반응을 호흡기 기능에서, 예를 들어, 하나 이상의 호흡기 증후군에, 예컨대 ARDS에 대한 하나 이상의 기준에서 개선이 관찰될 때 결정한다.
전술한 설명에 따르면, 한 측면으로, 본 발명은 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제(즉, 렉틴 경로 활성화를 억제)하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스로 감염된 포유류 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군 또는 질환의 다른 징후를 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 호흡기 증후군을 앓고 있고 방법은 적어도 하나의 호흡기 증상을 개선(즉, 호흡기 기능을 개선)하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 COVID-19로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 SARS-CoV로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 MERS-CoV로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 MASP-2 억제제의 투여 전에 코로나바이러스(즉, COVID-19, SARS-CoV 또는 MERS-CoV)를 가진 것으로 확인된다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 소분자이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 C3b 침착을 30 nM 이하의 IC50으로 억제한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 코로나바이러스로 감염된 대상체에게 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 1 mg/kg 내지 10 mg/kg(즉, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 투여량으로 적어도 2주의 기간 동안(예컨대 적어도 3주 동안, 또는 적어도 4주 동안, 또는 적어도 5주 동안, 또는 적어도 6주 동안, 또는 적어도 7주 동안, 또는 적어도 8주 동안, 또는 적어도 9주 동안, 또는 적어도 10주 동안, 또는 적어도 11주 동안, 또는 적어도 12주 동안) 적어도 주 1회(예컨대 적어도 주 2회 또는 적어도 주 3회) 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 4 mg/kg(즉, 3.6 mg/kg 내지 4.4 mg/kg)이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 300 mg 내지 약 450 mg(즉, 약 300 mg 내지 약 400 mg, 또는 약 350 mg 내지 약 400 mg), 예컨대 약 300 mg, 약 305 mg, 약 310 mg, 약 315 mg, 약 320 mg, 약 325 mg, 약 330 mg, 약 335 mg, 약 340 mg, 약 345 mg, 약 350 mg, 약 355 mg, 약 360 mg, 약 365 mg, 약 370 mg, 약 375 mg, 약 380 mg, 약 385 mg, 약 390 mg, 약 395 mg, 약 400 mg, 약 405 mg, 약 410 mg, 약 415 mg, 약 420 mg, 약 425 mg, 약 430 mg, 약 435 mg, 약 440 mg, 약 445 mg 또는 약 450 mg의 고정된 용량이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 370 mg(±10%)의 고정된 용량이다.
한 구체예에서, 방법은 약 370 mg(±10%)으로 고정된 투여량의 MASP-2 억제 항체를 코로나바이러스로 감염된 대상체에게 적어도 8주의 치료 기간 동안 주 2회 정맥내로 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로 투여된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 경구로, 피하로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 또는 흡입제로서 투여된다.
실시예 21
COVID-19 환자에서 OMS646(나르소플리맙) 치료
이 실시예는 실시예 20에서 기술된 방법을 사용하여 COVID-19 감염 환자의 치료에 나르소플리맙(OMS646)을 사용하는 것을 기술한다. 이 실시예에서 기술된 결과는 실시예 20에서 기술된 COVID-19 환자에서 나르소플리맙의 효능을 확인시켜준다.
배경/근거:
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2; COVID-19)는 2019년 12월에 중국 후베이성에서 임상 증후군으로서 확인되었고 급속히 확산되었다(Zhou F, Yu T, Du R, et al. Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet, 395: 1054-62, 2020). 2020년 2월 말까지, 이탈리아 북부 롬바르디아 지역에서 빠르게 증가하는 COVID-19 사례가 진단되었다(Remuzzi A, Remuzzi G. COVID-19 and Italy: what next? The Lancet). COVID-19의 일차적인 사망 원인은 중증 호흡기 기능장애이다. COVID-19로 사망한 환자의 폐 조직은 고농도의 SARS-CoV RNA를 보이며(Wichmann D. et al., Ann Intern Med, 2020) 동일한 강한 염증 변화를 이전에 보고된 코로나바이러스 SARS-CoV(SARS) 및 MERS-CoV(MERS)에서 볼 수 있고, 항-염증 전략이 COVID-19 치료에 대해 평가되고 있다(Xu Z. et al., Lancet Respir Med, 8(4):420-2, 2020; Horby P. et al., medRxiv 2020: 2020.06.22.20137273; Gritti G. et al., medRxiv 2020: 2020.04.01.20048561). 혈전증이 또한 SARS 및 COVID-19 감염에서 보고되었다(Wichmann D. et al., Ann Intern Med 2020; Magro C. et al., Transl Res 2020; Ding Y. et al., J Pathol 200(3):28209, 2003). SARS 및 MERS와 같이, COVID-19는 생명을 위협하는 급성 호흡기 장애 증후군(ARDS)을 유발한다(Guan W.J, Ni Z.Y, Hu Y, et al. Clinical Characteristics of Coronavirus Disease 2019 in China. N Engl J Med 2020 [Epub ahead of print]).
COVID-19 및 삼출 단계의 ARDS의 중심 병리학적 구성 요소는 내피 손상 및 활성화이다(Varga Z. et al., Lancet 2020; Ackermann M. et al., N Engl J Med 2020; Green S. J. et al., Microbes Infect 22(4-5):149-50, 2020; Teuwen L.A. et al., Nat Rev Immunol 20(7):389-91, 2020; Goshua G. et al., Lancet Haematol 2020; Thompson B.T. et al., N Engl J Med 377(19):1904-5, 2017). ARDS에서 증가된 모세관 투과성 및 폐 부종의 기저 원인인 내피 손상은 또한 미세혈관병증(microvascular angiopathy) 및 혈전증을 유발할 수 있다. 내피 손상은 또한 미세혈관병증 및 혈전증을 유발할 수 있다. 내피 활성화는 국소 염증 환경을 추가로 향상시킨다. 중요하게, 인간에서 시험관내에서 및 동물 연구에서 입증되는 바, 내피 손상은 내피 세포 표면 상에서 보체의 렉틴 경로를 특이적으로 활성화한다(Collard CD, Vakeva A, Morrissey MA, et al. Complement Activation after Oxidative Stress: Role of the Lectin Complement Pathway. Am J Pathol 2000;156(5):1549-1556).
실시예 20에서 기술된 것과 같이, OMS646(또한 나르소플리맙으로서 알려져 있음), MASP-2에 결합하여 렉틴 경로 활성화를 차단하는 고친화성 단클론성 항체는 COVID-19 환자의 치료에 효과적인 것으로 기대되었다. 실시예 20에서의 설명과 일관되게, MASP-2는 동물 모델에서 코로나바이러스 감염의 폐 손상과 직접적으로 연결되어 있다. 문헌[Gao et al., medRxiv 3/30/2020]을 참고한다. MASP-2는 또한 응고 캐스케이드 및 접촉 시스템에 직접적으로 작용하여, 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단하고 피브린 응고를 형성한다. 나르소플리맙은 렉틴 경로 활성화를 억제할뿐만 아니라 미세혈관 손상 관련된 혈전 형성과 칼리크레인 및 인자 XII의 MASP-2 매개 활성화를 차단한다.
COVID-19의 치료에 효과적인 것으로 나타난 질환별 치료법은 없다. 이탈리아의 질환 부담이 크다는 점을 고려하여, 본 발명자들은 베르가모의 파파 조반니 23세(Papa Giovanni XXIII) 병원에서 동정적 사용 프로그램에 따라 중증 COVID-19 감염 및 ARDS 환자를 나소플리맙으로 치료하였다. 이것은 렉틴 경로 억제제가 COVID-19 환자를 치료하기 위해 사용된 최초의 사례를 나타낸다. 여기에 본 발명자들은 이 초기 임상 경험을 보고한다.
방법
연구 감독
이 실시예에서 기술된 연구를 이탈리아 베르가모의 파파 조반니 23세 병원 지역사회보건청에서 수행하였고 기관 윤리 위원회와 이탈리아 의약품청(Agenzia Italiana del Farmaco)의 승인을 받았다. 혈액 카운트, LDH, C 반응성 단백질(CRP)을 포함한 실험실 값을 표준 임상 실시에 따라 수집하였다. 나르소플리맙(OMS646)으로 치료한 모든 환자는 사전 동의서를 제공하였다. 이 연구를 아래에서 추가로 기술하는 것과 같이 실시예 20에서 기술된 방법을 사용하여 수행하였다.
조직병리학
표준 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E) 및 면역조직화학을 COVID-19 환자의 병리학적 부검으로부터 얻어진 포르말린 고정-파라핀 포매 샘플에 대해 수행하였다. H&E 염색 섹션을 2명의 병리학자에 의해 검토하였다. 인간 내피 세포 마커(CD34)의 진단 및 면역조직화학적 분석을 확인하기 위하여, 본드 중합체 정제 검출과 함께 사용하도록 특별히 최적화된 즉시 사용 가능한 제품인 본드 즉시 사용 가능한 항체 CD34(클론 QBEnd/10, Leica Biosystems, Germany)로 수행하였다. 검정을 자동화된 염색기 플랫폼(Leica Bond-3, Leica, Germany) 상에서 제조사(Bond Epitope)가 권장한 대로(20분 동안 회수 용액 2) 열 기반 항원 회수 기법을 사용하여 수행하였다. 폐포의 모세혈관의 내피의 세포질 염색은 양성 결과를 나타냈다.
순환 내피 세포(CEC) 확인 및 카운트
CEC를 EDTA로 수집된 말초혈 샘플에 대해 유세포 분석에 의해 테스트하였다. 적혈구 용해 단계 후에, 샘플을 다음의 단클론성 항체로 20분 동안 실온에서 표지화하였다: 항-CD45 V500(클론 2D1, Becton Dickinson, San Jose', CA), 항-CD34 PerCP-CY5.5(클론 8G12, Becton Dickinson, San Jose', CA), 항-CD146 PE(클론 P1H12BD, Pharmingen, CA). 총 백혈구 형태를 가진 적어도 1Х106 사건/샘플을 유세포 분석에 의해 획득하였다(FACSLyric, BD Biosciences). 작업자 유도 가변성을 감소시키기 위하여, 이 연구의 모든 샘플을 언제나 동일한 실험실 테크니션에 의해 분석하였다. CEC/ml 수를 이전에 보고된 대로 참조 집단으로서 림프구 하위세트를 사용하여 이중 플랫폼 카운팅 방법에 의해 계산하였다(Almici C. et al., Bone Marrow Transplant 52:1637-42, 2017).
사이토카인의 혈청 수준
인터류킨-8(IL-8), 인터류킨-1β(IL-1β), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-10(IL-10), 종양 괴사 인자(TNF), 및 인터류킨-12p70(IL-12p70)의 수준을 혈청의 단일 샘플에서 유세포 분석에 의해 분석하였다(BD CBA Human Inflammatory Cytokines Kit, Becton Dickinson, San Jose, CA).
환자
모든 나르소플리맙 치료 환자는 2020년 3월 11일과 3월 23일 사이에 병원에 입원하였다. 이 13일의 기간 동안, 병동에 입원한 일일 총 COVID-19 환자 수는 405 내지 542명 범위였다. 동일한 이 기간 동안, 하루 평균 140개의 헬멧 연속 수동 기도압박(CPAP) 장치가 활용되었으며, 중앙값 82명의 환자(66-91명 범위)가 매일 중환자실에서 관리되었다. 이들 ICU 환자 중에서, 2020년 3월 11일에는 61명이 ARDS에 대한 베를린 기준을 충족하였고(PaO2/FiO2 비율 <100이 중증 ARDS이고; 100 - 200은 중등도이며; >200 및 ≤300은 경증임)(Ferguson N.D et al., Intensive Care Med 38(10): 1573-82, 2012; Fagiuoli S. et al., N Engl J Med 382(21)e71, 2020) 2020년 3월 23일에는 80명이 충족하였다.
이 연구에서 치료된 모든 환자는 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄 반응 검정에 의해 진단된 실험실 확인 COVID-19 감염을 가졌다. 비강 및 호흡기 샘플로부터 GeneFinderTM Covid-19 플러스 RealAmp 키트(ELIThech Group, 92800 Puteaux, France) 및 AllplexTM 2019-nCoV 검정(Seegene Inc, Arrow Diagnostics S.r.l., Italy)을 포함한 상이한 분자 방법에 의해 SARS-CoV-2 게놈을 검출하였다. 임상 샘플로부터 바이러스 RNA의 정제, RdRp의 검출 후에, E 및 N 바이러스 유전자를 세계 보건 기구 프로토콜에 따라 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 얻었다(Corman V.M. et al., Euro Surveill 25, 2020). 나르소플리맙으로의 치료를 받을 자격이 있기 위해서는, COVID-19로 확인된 환자는 성인이고(18세를 초과하는 연령), 베를린 기준에 따라 ARDS를 가져야 하며(Ferguson ND, et al. Intensive Care 38(10):1573-1582, 2012; 또한 Sweeney R.M. and McAuley, D.F., Lancet vol 388:2416-30, 2016; JAMA 307:2526, 2012 참고) 호흡 지원에 대한 제도적 지침에 따라 연속 기도 양압(CPAP)에 의한 비침습성 기계식 환기를 필요로 해야 한다. 모든 등록된 환자가 경험적으로 매일 1회 500 mg의 아지트로마이신을 받았지만, 항미생물 요법이 필요한 활동성 전신 박테리아 또는 진균 감염 환자는 나르소플리맙 치료에 적합하지 않았다.
나르소플리맙 치료, 지원 요법 및 결과 평가
실시예 20에서 기술된 것과 같이, 나르소플리맙(OMS646)은 면역글로불린 감마 4(IgG4) 중쇄 및 람다 경쇄 불변 영역으로 구성된 전체적으로 인간 단클론성 항체이다. 그것은 나노몰 미만의 친화성으로 MASP-2에 결합하여 억제한다. 실시예 20에서 기술된 방법에 따라, 나르소플리맙을 COVID-19로 감염된 6명의 환자에게 4 mg/kg의 투여량으로 2 내지 4주 동안, 최대 6 내지 8 용량(2주, 3주 또는 4주 동안)으로 주 2회 정맥내로 투여하였다. 연구를 시작할 때, 투약 기간을 2주로 설정하였지만 나르소플리맙으로 치료된 제1 환자가 2주 째에 치료를 중단한 후 임상적 및 실험실 마커로 재발을 경험하고, 후속해서 1주간의 추가 투여로 해소되었을 때 경험적으로 연장하였다. 모든 환자는 병원 지침에 따라, 연구 시점에 예방용 에녹사파린(Clexane, Sanofi Aventis) 4,000 IU/0 4 mL, 아지트로마이신(Zitromax, Pfizer SpA, Italy) 1일 1회 500 mg, 하이드록시클로로퀸(Plaquenil, Sanofi Aventis) 1일 2회 200 mg, 다루나비르 및 코비시스타트(Rezolsta, Janssen-Cilag S.p.A., Italy) 1일 1회 800/150 mg을 포함한 표준 지원 돌봄을 받았다. 3월 27일에 시작하여, 엡데이트된 제도적 지침에 따라, 병원의 모든 COVID-19 환자는 1 mg/kg의 메틸프레드니솔론을 받았다. 따라서, 6명의 나르소플리맙 치료 환자 중 총 5명이 또한 나르소플리맙 치료를 시작한 후에 전신성 코르티코스테로이드(메틸프레드니솔론 1 mg/kg)을 받았다. 모든 호흡기 지원을 제도적 치료 알고리즘에 따라 제공하였다. 이들 6명의 환자의 임상적 특징을 아래의 표 13에 요약한다.
CEC 카운트 및 사이토카인 수준 외에, 혈액 카운트, LDH 및 C 반응성 단백질(CRP) 수준을 포함한 임상 및 실험실 측정을 모든 나르소플리맙 치료 환자에 대해 표준 임상 실시를 따라 수집하였다. 일상적인 혈액 조사를 각각의 나르소플리맙 용량 전 및 그 후에는 주 2회 수집하였다. 호흡기 기능을 매일 평가하였다. 흉부 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔을 병원 입원시 모든 환자에 대해 수행하여 전형적인 간질성 폐렴을 기록하고 임상적으로 표시된 경우 폐색전증을 기록하였다. 흉부 방사선촬영을 치료 과정 동안 임상적인 필요에 따라 수행하였다.
통계학적 분석
인구통계 및 임상 환자 데이터를 범주형 변수의 경우 백분율 빈도로 표시하고 연속형 변수의 경우 범위의 중앙값으로 표시한다. 정상 및 COVID-19 환자 사이의 CEC 값의 차이를 만-휘트니(Mann-Whitney) U 테스트로 평가하였다. 반복된 측정 분석을 수행하여 적절한 시점에서 나르소플리맙 치료 동안 CEC 및 사이토카인의 차이를 테스트하였다; 비모수 프리드만(Friedman) 테스트를 사용하였고, 쌍별 비교를 쌍을 이룬 윌콕슨(Wilcoxon) 부호 순위 테스트를 사용하여 수행하였다. 치료 동안 LDH 및 CRP 수준의 감소 동향을 관찰과 시간 사이의 비모수 스피어만(Spearman) 테스트로 평가하였다. 유의성을 5%로 고정하였다. 분석을 R 소프트웨어(버전 3·6·2)를 사용하여 수행하였다.
표 13은 6명의 나르소플리맙 치료 환자의 임상적 특징을 요약한 것이다.
ARDS: 급성 호흡기 장애 증후군; ICU: 집중치료실; CPAP: 연속 기도 양압.
*: 4명의 환자에게만 이용 가능한 데이터
**: 5명의 환자에게만 이용 가능한 데이터
# 몇몇 환자를 초기에 당뇨병을 가진 것으로 범주화하였지만, 나중에는 당뇨병은 없지만 과체중인 것으로 범주화하였음.
## 체온 >37.5℃로서 정의함
결과:
COVID-19 환자에서 혈전증 및 내피 세포 손상
베르가모 지역에서 COVID-19 발병이 극적으로 시작된 직후인 3월 13일부터 3월 16일까지, 병원 병리과에서는 사망한 환자 20명의 초기 그룹에 대한 부검을 시작하였다. 이들 환자는 모두, 사망 전에, 현재 연구에서 나소플리맙으로 치료받은 환자들과 마찬가지로 CPAP 또는 침습성 기계식 환기를 통한 고급 호흡 지원을 필요로 하였다. 빈번하게 치명적인 폐 혈전색전증의 임상 사진에 따라, 아래에서 기술되는 것과 같이 많은 환자의 폐와 간이 혈전증에 의해 광범위하게 영향을 받은 것으로 나타났다.
조직병리학적 수준에서 파괴적인 염증 과정에 의해 영향을 받지 않은 영역을 또한 포함한, C0VID-19 환자의 폐의 중격 혈관에서 혈전 과정에 의한 동맥 침범이 분명하였다. CD34(내피 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 도 41A-D에서 나타낸 것과 같이 세포 수축, 수성 세포질 퇴화 및 내피 표면 상의 림프구 부착으로 중증의 내피 손상을 입증하였다.
도 41A-D는 COVID-19 환자에서 혈관 손상을 보여주는, 이들 환자로부터 취한 조직 섹션의 면역조직화학적 분석의 대표적인 이미지를 도시한다.
도 41A는 COVID-19 환자의 폐로부터의 중격 혈관의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지를 도시한다. 도 41A에서 나타낸 것과 같이, 폐 중격 혈관의 혈전 과정에 의한 동맥 침범이 있다; 동맥 내강에 혈전의 초기 조직화에 유의한다(H&E, 400x).
도 41B는 COVID-19 환자의 폐로부터의 중격 혈관의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지를 도시한다. 도 41B에서 나타낸 것과 같이, 도 41A에서 나타난 것과 유사한 병리학적 특징이 파괴적 염증 과정에 의해 영향을 받지 않은 폐 영역의 대부분의 중격 혈관에서 광범위하게 주목할만하다(H&E, 400x).
도 41C는 COVID-19 환자로부터의 중간 직경 폐 중격 혈관의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지를 도시한다. 도 41C에서 나타낸 것과 같이, 완전 내강 혈전증이 있는 중간 직경의 폐 중격 혈관(원형); CD34(내피 마커)에 대한 면역조직화학적 갈색 염색은 세포 수축, 수성 세포질 퇴화(오른쪽 화살표 참고) 및 내피 표면 상의 림프구 부착(왼쪽 화살표 참고)으로 중증 내피 손상을 입증하였다.
도 41D는 COVID-19 환자로부터의 간 실질의 조직 섹션의 면역조직화학 분석의 대표적인 이미지를 도시한다. 도 41D에서 나타낸 것과 같이, 대 혈관 부분 내강 혈전증이 있는 간 실질에서 혈관 변화가 또한 관찰되었다(H&E, 400x).
순환 내피 세포(CEC) 확인 및 카운트
순환 내피 세포(CEC)를 내피 세포 기능장애에 대한 바이오마커로서 사용하였고(Farinacci M et al., Res Pract Thromb Haemost 3:49-58, 2019 참고), CEC 카운트가 ARDS가 없는 패혈증 환자와 비교하여 패혈증 관련 ARDS 환자에서 상승된 것으로 나타났다(Moussa M et al., Intensive Care Med 41(2):231-8, 2015). 결과는 또한 혈관 내피 세포의 면역 매개 공격이 혈관 벽으로부터의 그것의 탈착 및 혈류로의 이동으로 이어지는 급성 이식편대숙주병(GvHD)의 환경에서도 공개되었다(예컨대, Almici et al., Bone Marrow Transplant 52:1637-1642, 2017 참고).
급성 이식편대숙주병(GvHD)에서 이런 초기 관찰 및 공개된 소견을 토대로, 나르소플리맙을 사용한 연구를 시작하기 전에, 본 발명자들은 우리의 병원에서 무작위로 선택된 분자적으로 확인된 COVID-19 환자의 비연구 코호트에서 CEC 카운트를 측정하기 시작하였다. 이 33명의 COVID-19 환자의 비연구 코호트에서, 본 발명자들은 말초 혈액의 CEC/mL(중앙값 110, 범위 38-877)이, 도 42A에서 나타낸 것과 같이, 건강한 대조군(중앙값 7, 범위 0-37)과 비교하여 상당히 증가한 것을 발견하였다(P=0.0004).
이 연구에서, CEC/ml의 수를 나르소플리맙으로의 치료 전과 후에 COVID-19 환자에서 측정하였다. 위에서 주지된 것과 같이, 흥미롭게도, 말초 혈액의 CEC/mL의 수(중앙값 110, 범위 38-877)는 건강한 정상 대상체(중앙값 7, 범위 0-37)와 비교했을 때 COVID-19 환자의 독립 코호트에서 상당히 증가하였다(도 42A 참고). 증가된 수의 CEC/ml(중앙값 334, 범위 0-9315)은 또한 나르소플리맙으로의 치료를 위해 선택된 6명의 환자에서도 확인되었다. 나르소플리맙으로의 치료 후, CEC/ml의 수에서 급속 증가가, 도 42B에서 나타낸 것과 같이, 제1 2 용량 후에 기록되었고(중앙값 92 CEC/mL, 범위 18-460) 제4 용량 후에 확인되었다(중앙값 73, 범위 0-593). CEC/mL의 수는 또한 6 용량의 나르소플리맙 후에 감소된 것(중앙값 59, 범위 15-276)이 추가로 확인되었다(데이터는 도 42B에서는 제시되지 않음).
도 42A는 본 연구의 일부가 아닌 COVID-19 환자(n=33명)의 CEC/ml 카운트와 비교된 정상의 건강한 대조군(n=6명)의 CEC/ml 카운트를 그래프로 도시한다. 도 42A에서 나타낸 것과 같이, 건강한 정상 대상체와 비교했을 때, COVID-19 환자의 이 독립적 코호트에서 상당히 증가한 것으로 결정되었다.
도 42B는 나르소플리맙으로의 치료 전(기준선) 및 후에 이 연구를 위해 선택된 6명의 환자에서의 CEC/ml 카운트를 그래프로 도시하며, 박스는 제1 사분위수부터 제3 사분위수까지의 값을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며 수염은 최소 및 최대 값을 나타낸다. 도 42B에서 나타낸 것과 같이, 증가된 CEC/ml이 또한 또한 나르소플리맙으로의 치료를 위해 선택된 6명의 환자에서도 확인되었고, 나르소플리맙으로의 치료 후에 급속하게 감소하였다.
우리의 병원이 이 연구의 개시 후 16일 후에 COVID-19 환자에 대한 표준 스테로이드 사용을 실시하는 것을 지침으로 확립하였기 때문에, 나르소플리맙의 개시 후 2 내지 10일 후에 시작하여, 스테로이드 치료를 지원 요법의 일부로서 6명의 환자 중 5명에게 제공하였다. 이런 이유로, CEC/ml의 수를 또한 스테로이드만을 받은 4명의 환자의 별도 그룹(모두 여성, 중앙값 연령은 83세로 62세에서 90세까지의 범위이며, 3명은 마스크로 산소를 필요로 하고 1명은 CPAP 중임)에서 평가하였다. 이들 4명의 환자에서, 48시간 후에 평가한 CEC 카운트는 스테로이드 투여에 의해 영향을 받지 않은 것으로 나타났다(p=0·38). 스테로이드만을 받은 2명의 추가 환자에서, CEC 카운트를 기준선에서 및 스테로이드 포함 지원 치료의 4주 후에 평가하였다. 임상 과정이 점진적으로 악화된 제1 환자에서, CEC 카운트는 영향을 받지 않은 채로 유지되었지만(271/mL 대 247/mL), 제2 환자에서는, 임상적 개선이 동시에 CDE의 증가를 수반하였다(165 대 65/mL).
6명의 나르소플리맙 치료 환자에서, CEC/mL은 기준선에서 현저하게 증가하였다(중앙값 334, 범위 0-9315). 나르소플리맙으로, CEC 카운트는 제2 용량의 치료 후에(중앙값 92 CEC/mL, 범위 18-460), 제4 용량의 치료 후에(중앙값 72·5, 범위 0-593) 및 제6 용량의 치료 후에(중앙값 59, 범위 15-276) 급격히 감소하였다(p=0·01). 혈청 농도 of IL-6, IL-8, CRP 및 LDH의 혈청 농도 또한 아래에서 추가로 기술되는 것과 같이 나르소플리맙 치료로 현저하게 감소하였다.
C 반응성 단백질(CRP), 락테이트 탈수소효소(LDH) 및 사이토카인의 혈청 수준
도 43은 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 C 반응성 단백질(CRP)의 혈청 수준(중앙값; 사분위수 범위(IQR))을 그래프로 도시한다. 표 13에서 알 수 있는 것과 같이, 건강한 대상체에서 CRP의 혈청 수준은 (0.0-1.0 mg/dl)의 범위이고 치료 시작 전 6명의 COVID-19 환자에서 CRP의 중앙값 수준은 14 mg/dl였다. 도 43에서 나타낸 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 2주 후에, 6명의 COVID-19 환자에서 CRP의 수준은, 건강한 대상체의 정상 범위 내에 있는, 거의 0.0 mg/dl의 중앙값 수준으로 감소하였다.
도 44는 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 락테이트 탈수소효소(LDH)의 혈청 수준(중앙값; IQR)을 그래프로 도시한다. 표 13에서 알 수 있는 것과 같이, 건강한 대상체에서 LDH의 혈청 수준은 (120-246 U/l)의 범위이며 치료 시작 전 6명의 COVID-19 환자에서 LDH의 중앙값 수준은 518 U/l였다. 도 44에서 나타낸 것과 같이, 나르소플리맙으로의 치료 2주 후에, COVID-19 환자에서 LDH의 수준은, 건강한 대상체의 정상 범위 내에 있는, 약 200 U/l의 중앙값 수준으로 감소하였다.
도 45는 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 인터류킨 6 (IL-6) pg/mL의 혈청 수준(중앙값; 사분위수 범위(IQR))을 그래프로 도시한다. 도 45에서 나타낸 것과 같이, 치료 전 기준선에서 COVID-19 환자에서 IL-6의 중앙값 수준은 약 180 pg/mL이었다. 1 용량의 나르소플리맙 후(용량 2 전), COVID-19 환자에서 IL-6의 중앙값 수준은 약 40 pg/mL로 감소하였고 2 용량의 나르소플리맙 후(용량 3 전), COVID-19 환자에서 IL-6의 중앙값 수준은 약 10 pg/mL로 한층 더 감소하였다.
도 46은 나르소플리맙으로의 치료 전 기준선에서(0일) 및 치료 후 상이한 시점에서 6명의 COVID-19 환자에서 인터류킨 8 (IL-8) pg/mL의 혈청 수준(중앙값; 사분위수 범위(IQR))을 그래프로 도시한다. 나르소플리맙의 치료는 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일에 제공하였다. 도 46에서 나타낸 것과 같이, 치료 전 기준선에서 COVID-19 환자에서 IL-8의 중앙값 수준은 약 30 pg/mL이었다. 1 용량의 나르소플리맙 후(용량 2 전), COVID-19 환자에서 IL-8의 중앙값 수준은 약 20 pg/mL로 감소하였고 2 용량의 나르소플리맙 후(용량 3 전), COVID-19 환자에서 IL-8의 중앙값 수준은 약 15 pg/mL로 한층 더 감소하였다.
나르소플리맙으로의 치료 후 임상 결과
나르소플리맙으로의 치료를 위해 선택된 6명의 환자의 임상적 특징은 표 13에 요약되어 있다. 중앙값 연령은 56.5세였고 환자의 대부분은 남성이었다(83%). 모든 환자는 체질량 지수(BMI) ≥ 25 및 ≥ 30을토대로 각각 과체중이었거나 비만이었다. 등록시, 모든 환자는 CPAP를 필요로 하는 폐렴/ARDS를 가지고 있었고, 그 중 2명의 환자는 급격히 악화되어 등록 직후 삽관을 필요로 하였다. 나르소플리맙으로의 치료를 CPAP를 사용한 비침습성 환기를 시작하고 48시간 이내에 시작하였다. 나르소플리맙으로 치료된 이들 환자에서 관찰된 임상 결과의 요약을 아래의 표 14에 제공하며, 치료 후 환자 상태를 반영하기 위하여 업데이트된 것이다. 환자는 나르소플리맙 투여를 주 2회 받았다. 치료 후, 4명의 환자(67%)의 호흡 곤란이 개선되었고 그들은 중앙값 3(범위 2-3)의 나르소플리맙 용량 후 CPAP로부터 고유량 산소로 환기 지원이 감소되었다. 3명의 환자에서는 산소 지원을 그런 후에 감소시켜서 퇴원할 때까지 중단하였다. 대비 강화 CT 스캔에 의해 입증되는 바와 같이, 환자 #4는 치료 시작 후 4일 째에 대규모 폐색전증이 발병하였다. 이런 이유로, 저분자량 헤파린을 진행 중인 나르소플리맙의 상단에 첨가하였고 7일 후 임상 및 CT 스캔 사진에서 급격한 개선이 기록되었다. 마지막 두 환자(#5 및 #6)에서 중증 ARDS의 급속하고 점진적인 악화가 등록 직후에 기록되었다. 사례 #5에서 중증 ARDS(57의 PiO2/FiO2 값을 가짐)로 인해 환자는 4일 째에 삽관을 하여야 했다. 그럼에도 불구하고, 후속 임상 결과는 신속하게 유리해졌고 환자는 3일 후에 집중치료실로부터 나가게 되었다. CPAP 2일 후 그는 이제 안정되고 저유량 산소 지원을 받는다. 사례 #6에서, 중증 ARDS가 등록 후 4일 후에 발병하였고 환자는 삽관을 필요로 하였다. 이전 사례와 유사하게, 그녀는 다시 CPAP를 받았고 후속적으로 급격한 임상적 개선으로 인해 고유량 산소를 받았으며 나중에 퇴원하였다.
치료 관련 부작용은 이 연구에서 보고되지 않았다.
*, **, ***, **** 아래에서 기술되는 환자 3-6에 대한 업데이트 참고.
논의
이 연구에서의 발견은 내피 손상 및 혈전증이 COVID-19 관련 폐 환자의 병태생리학의 중심에 있음을 가리킨다. 중증 호흡 부전 환자는 CRP, LDH, IL-6 및 IL-8 뿐만 아니라 순환 내피 세포(CEC)의 현저하게 상승된 수준을 입증하였다. 이러한 새로운 관찰은 COVID-19 환자에서 뚜렷한 내피 손상 및 혈전증을 보인 폐 및 간에서 검출된 조직병리학적 소견과 일치한다. 다기관 미세혈관 조직병리학적 변화, 특히 미세혈관 혈전의 형성은 HSCT-TMA의 변화와 닮아서, COVID-19 관련 폐 손상에서 내피 손상의 역할을 추가로 지지한다. 내피 손상은 ARDS에 존재하는 보체 활성화의 병태생리학의 중심 구성요소인 것으로 알려진다(Thompson BT, et al., N Engl J Med, 377(6):562-572, 2017). 보체 활성화는 또한 SARS 및 MERS의 모델에서도 보고되었고 내피 손상을 특징으로 하는 다른 병태에서 중요하다. ARDS에서 증가된 모세혈관 투과도 및 폐 부종의 근본 원인인 내피 손상은 또한 미세혈관병증 및 혈전증을 유발할 수 있다.
보체 시스템은 면역 체계의 중요한 부분이다. 3가지의 경로: 고전적, 렉틴, 및 대체 경로가 별개의 개시 사건에 대한 반응으로 보체를 활성화한다. 보체의 렉틴 경로는 선천성 면역 반응의 일부분이다. 패턴 인식 시스템, 렉틴 경로의 활성화는 MASP 효소 패밀리의 구성원(MASP-1, MASP-2 및 MASP-3)에 의해 개시된다. 이들 프로테아제는 혈액에서 렉틴, 구체적으로 만난 결합 렉틴(MBL), 피콜린, 및 콜렉틴과 복합체를 형성하는 전구효소로서 합성된다. 이들 렉틴은 병원성 미생물 또는 손상된 숙주 세포 표면 상에서 발견된 탄수화물 패턴을 인식하고 결합하여, MASP를 그것의 작용 부위(들)로 표적화하고 활성화로 이어진다. 이런 방식으로, 렉틴 경로 활성화는 손상된 내피 세포 표면에서 일어난다. 실시예 20에서 기술된 것과 같이, 렉틴 경로 활성화는 COVID-19 관련 내피 손상의 환경에서 발생하는 것으로 예상되었다.
MASP-2는 렉틴 경로의 활성화를 담당하는 핵심 효소로, 활성화된 후에는, MASP-2는 보체 구성요소 2(C2) 및 C4를 절단하여 일련의 효소적 단계를 개시하여 C3 및 C5의 활성화를 초래함으로써, 아나필라톡신 C3a 및 C5a, 및 C5b-9(막 공격 복합체)의 형성을 유발한다. 전임상적으로, C3a 및 C5a는 내피 손상 및 전염증성 변화, 백혈구 모집, 및 내피 세포자멸사와 관련된 내피 활성화를 유도하였다. 막에 결합된 C5b-9는 또한 세포 용해를 유발할 수 있다. 용해 전일 때에도, C5b-9는 혈전성향 인자의 분비, 혈소판 활성화, 부착 분자의 상향조절, 및 내피의 기능장애성 형태 변화를 유도하는 추가의 세포 손상을 유발한다(Kerr H, Richards A. Immunobiology 217(2):195-203, 2012). 이들 보체 매개 활성은 내피 손상 및 기능장애를 증폭시켜서, 임상 상태를 유발하거나 또는 악화시킬 수 있다. Gao 등에 의한 최근의 공개는 동물 모델에서 SARS 및 MERS의 병태생리학에 MASP-2 및 렉틴 경로가 핵심적으로 포함되는 것을 보고한다. 렉틴 경로 활성화를 담당하는 핵심 효소인 MASP-2는 COVID-19 N 단백질에 결합하여 그것에 의한 활성화를 진행하며(Gao et al., medRxiv 2020, 2020.03.29.20041962) 중증 COVID-19 환자에서 폐 조직의 미세혈관구조에서 발견되었다(Magro C., et al., Transl Res 2020; doi.org/10.1016/j.trsl.2020.04.007). 활성화된 MASP-2는 아나필라톡신 C3a 및 C5a의 생성 및 전염증 반응을 유도하고 세포 용해 및 사멸을 유발할 수 있는 막 공격 복합체 C5b-9의 형성을 초래하는 일련의 효소적 단계를 개시한다(Dobo et al., Front Immunol 9:1851, 2018). MASP-2는 또한 C4 우회를 통해 C3을 직접 절단한다 (Yaseen S. et al., FASEB J 31(5):2210-9, 2017). 중요하게, MASP-2는 렉틴 경로의 상류에 위치함으로써, MASP-2의 억제는 고전적 경로의 용해성 측면(즉, C3 및 C5 전환효소의 C1r/C1s 구동 형성)을 간섭하지 않아, 감염에 대항하기 위해 필요한 적응 면역 반응이 보존된다(Schwaeble et al., Proc Natl Acad Sci 108(18):7523-8, 2011).
보체에서의 역할 외에, MASP-2는 응고 캐스케이드 및 접촉 시스템에 직접 작용하여, 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단하고 피브린 응고를 형성한다(Gulla K.C., Immunology 129(4):482-95, 2010; Krarup A. et al., PLoS One 2(7):e623, 2007). 나르소플리맙은 본원에 참조로 포함된 WO2019246367에서 기술된 것과 같이, 렉틴 경로 활성화를 억제할뿐만 아니라 미세혈관 손상 관련 혈전 형성 및 칼리크레인 및 인자 XII의 MASP-2 매개 활성화를 차단한다. 이들 활성은 미세혈관 혈전증을 억제함으로써 유익한 효과에 기여할 수 있으며, 이것은 나르소플리맙 치료 환자, 특히 대규모 폐 혈전증을 앓은 환자에서 중요한 치료적 역할을 담당할 수 있다. 나르소플리맙은 출혈 시간을 연장시키지 않으며 프로트롬빈 또는 활성화된 부분적인 트롬보플라스틴 시간에 영향을 미치지 않고, 나르소플리맙 치료 환자에서는 출혈이 관찰되지 않았다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 나르소플리맙은 세포외 매트릭스 관련 응고(인자 VII 구동됨)가 아니라 내피 손상으로부터 비롯된 응고(인자 XII 활성화와 관련됨)를 차단할 수 있는 것으로 여겨진다.
렉틴 경로 억제는 이전에는 COVID-19에 대한 치료로서 연구되지 않았다. 이 연구에서 모든 환자는 COVID-19 관련 호흡 부전을 가졌다. 본 연구에서, 나르소플리맙에 의한 MASP-2 및 렉틴 경로의 억제는 약물로 치료된 모든 COVID-19 환자에서 임상적 개선 및 생존과 관련되었다. MASP-2 억제제 나르소플리맙으로 치료 후에, 6명의 환자는 모두 회복되었고 병원에서 퇴원할 수 있었다. MASP-2 및 렉틴 경로 활성화를 억제하는 나르소플리맙으로 치료 후에 COVID-19 관련 호흡 부전을 앓고 있는 환자에서 관찰된 임상적 개선은 COVID-19 병태생리학에서 렉틴 경로의 중요한 역할을 추가로 지지한다. 이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 6명의 COVID-19 환자는 모두 나르소플리맙 치료 후에 임상적 개선을 입증하였다. 각각의 경우에, COVID-19 폐 손상은 나르소플리맙 치료 전의 ARDS로 진행되었고 모든 환자는 병원 입원시 각각에 대해 시작된 비침습성 기계식 환기를 받았다. 2명의 환자가 제1 용량의 나르소플리맙 후에 지속적인 악화를 경험하였고 침습성 기계식 환기를 필요로 하였다. 이들 환자는 둘 다 후속해서 지속된 나르소플리맙 치료로 완전하게 기계식 환기를 완전히 중단할 수 있었다. 2명의 환자(1명은 삽관하였고 다른 한 명은 CPAP를 받음)는 대규모 양측성 폐 혈전증을 경험하였고, 두 환자 모두 나르소플리맙으로 완전하게 회복되었는데, 약물의 항응고 효과로부터 혜택을 받았을 가능성이 있다. 실험실 마커의 시간적 패턴(CEC, IL-6, IL-8, CRP 및 LDH)은 관찰된 임상적 개선 및 나르소플리맙의 제안된 작용 메커니즘과 일치하였다. 특히, CEC 카운트는 이 질환의 내피 손상 및 치료 반응을 평가하기 위한 신뢰할만한 도구인 것으로 나타난다. 특히, IL-6 수준 및 IL-8 수준의 개선은 또한 나르소플리맙 치료와 시간적으로 상관관계가 있고, 이것은 렉틴 경로 활성화가 COVID-19의 사이토카인 폭풍 상승보다 앞설 수 있고 렉틴 경로 억제가 COVID-19 환자 감염에서 기술된 사이토카인 폭풍에 대해 잠재적인 유익한 효과를 가지는 것을 시사한다(Xiong Y, et al., Emerg Microbes Infect 9(1):761-770, 2020). 처음에 2주의 나르소플리맙 투약을 계획하였지만 투약을 처음 중단했을 때 환자 #1에서 CEC의 상승이 있은 후에 3 내지 4주로 증가시켰다. 반동성 폐 징후 및 증상은 3 내지 4주의 나르소플리맙 치료 후에 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 나르소플리맙 치료 환자에서 손상된 바이러스 방어의 증거를 보지 못하였고, 나르소플리맙 관련 부작용은 관찰되지 않았다. 특히, 나르소플리맙은 대체 또는 고전적 보체 경로를 억제하지 않으며 적응 면역 반응 또는 항원 항체 복합체화를 간섭하지 않는다. 나르소플리맙 관련 감염 위험의 증거는 임상 시험에서 관찰되지 않았다. 렉틴 경로 활성화를 억제하는 것 외에, 나르소플리맙은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 MASP-2 매개 절단(Krarup A, et al., PLoS One ;2(7):e623, 2007), 칼리크레인의 활성화, 및 인자 XII의 XIIa로의 자동 활성화를 차단하는 것으로 입증되었다. 이들 활성은 미세혈관 혈전증을 억제함으로써 유익한 효과에 기여할 수 있다. 나르소플리맙은 출혈 시간을 연장시키지 않으며 프로트롬빈 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간에 영향을 미치지 않는다(Krarup PLoS One 2007).
이 실시예에서 기술된 결과는 COVID-19 관련 폐 손상의 병태생리학에서 내피 손상에 의해 유발된 MASP-2 매개 렉틴 경로 활성화를 강력하게 암시한다. 나르소플리맙 치료 후 임상 상태 및 실험실 소견의 개선은 주목할만하다. 이들 소견은 약물의 작용 메커니즘 및 질환의 병태생리학과 관련된 지원적 증거로 의미있는 임상 효능을 강력하게 시사한다. 나르소플리맙에 의한 렉틴 경로 억제는 COVID-19 관련 폐 손상의 유망한 잠재적 치료인 것으로 나타난다.
이 실시예에서 기술된 임상 연구로부터의 보충 데이터
이 실시예에서 위에서 기술된 것과 같이, 실험실에서 확인된(베를린 기준에 따름) COVID-19 및 ARDS를 가진 6명의 환자를 나르소플리맙(4 mg/kg)으로 3 내지 4주 동안 주 2회 정맥내(IV) 투여로 치료하였다. 모든 환자는 예방적 에녹사파린(Clexane, Sanofi Aventis) 4,000 IU/0.4 mL, 아지트로마이신(Zitromax, Pfizer SpA, Italy) 1일 1회 500 mg, 하이드록시클로로퀸(Plaquenil, Sanofi Aventis) 1일2회 200 mg, 및 다루나비르 및 코비시스타트(Rezolsta, Janssen-Cilag S.p.A., Italy) 1일 1회 800/150 mg을 포함하여 표준 지원 돌봄을 받았다. 업데이트된 제도적 지침에 따라 3월 27일부터, 우리 병원의 모든 Covid-19 환자는 6명의 나르소플리맙 치료 환자 중 5명에게 투여된 메틸프레드니솔론(1 mg/kg)을 받았다.
나르소플리맙으로 치료되지 않은 사망한 COVID-19 환자에 대해 조직병리학적 평가를 수행하였다. 혈액 카운트, LDH 및 CRP 수준을 포함한 임상적 및 실험실 측정을 나르소플리맙 치료 및 나르소플리맙으로 치료되지 않은 환자에 대한 표준 실시에 따라 수집하였다. 일상적인 혈액 조사를 각각의 나르소플리맙 용량 전에 및 그 후에는 주 2회 수집하였다. 순환 내피 세포 카운트 및 IL-6 및 IL-8 수준을 유세포 분석에 의해 연속적으로 평가하였다. 호흡기 기능을 매일 평가하였다. 모든 환자는 병원 입원시 흉부 컴퓨터 단층촬영(CT)을 받아 간질성 폐렴을 기록하고, 입원 중에 임상적으로 표시된 경우, 폐색전증을 기록하였다. 흉부 방사선촬영을 또한 임상적인 필요에 따라 수행하였다.
데이터를 범주형 변수의 경우 백분율 빈도로 표시하고 연속형 변수의 경우 범위의 중앙값으로 표시한다. 시점 사이의 임상적 및 실험실 측정의 차이를 비모수 프리드만 테스트로 평가하였다. 쌍별 비교를 쌍을 이룬 윌콕슨 부호 순위 테스트를 사용하여 수행하였다. 유의성을 5%로 고정하였다. 분석을 R 소프트웨어(버전 3.6.2)를 사용하여 수행하였다.
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 부검을 20명의 사망한 COVID-19 환자의 초기 그룹에 대해 수행하였다. 빈번하게 치명적인 폐 혈전색전증의 임상 사진과 일관되게, 대부분의 환자의 폐와 간이 혈전증에 의해 광범위하게 영향을 받은 것으로 나타났다. 조직학적으로, 파괴적인 염증 과정에 의해 영향을 받지 않은 영역을 포함하여, 폐의 중격 혈관에서 동맥 혈전증은 분명하였다. CD34(내피 세포 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은, 도 41A-D에서 나타낸 것과 같이, 세포 수축, 수성 세포질 퇴화 및 내피 세포에 대한 림프구 부착으로 중증의 내피 손상을 입증하였다.
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 나르소플리맙에 의한 보체의 렉틴 경로의 억제는 이 연구에서 임상적 개선과 관련이 있었다. 나르소플리맙으로의 치료는 혈청 IL-6, IL-8, CRP 및 LDH의 수반된 감소와 병행된 빠르고 지속적인 CEC 감소와 관련이 있었다. 특히, CEC 카운트는 이 질환에서 내피 손상 및 치료 반응을 평가하기 위한 신뢰할만한 도구인 것으로 나타난다. 나르소플리맙 치료로 IL-6 및 IL-8의 일시적인 개선은 COVID-19 환자 감염에서 기술된 사이토카인 폭풍에 대한 잠재적인 유익한 효과를 시사한다((Xiong Y, et al., Emerg Microbes Infect 9(1):761-770, 2020). 이 연구의 발견은 내피 손상이 COVID-19 관련 폐 손상의 병태생리학의 중심에 있음을 가리킨다. 중증 호흡 부전 환자는 C 반응성 단백질(CRP) 및 락테이트 탈수소효소(LDH)뿐만 아니라, IL-6, IL-8 및 순환 내피 세포(CEC)의 현저하게 상승된 수준을 입증하였다. 이런 새로운 관찰은 COVID-19 환자에서 뚜렷한 내피 손상 및 혈전증을 보이는 폐 및 간의 조직병리학적 소견과 일치한다. 미세혈관의 조직병리학적 변화는 내피 손상 증후군 HSCT-TMA의 것과 매우 유사하여, COVID-19 관련 폐 손상에서 내피 손상의 역할을 추가로 지지한다.
처음에 2주 투약을 계획하였지만 투약을 처음 중단했을 때 환자 #1에서 CEC의 상승이 있은 후에 3 내지 4주로 증가시켰다. 제3주의 투약으로, 환자의 CEC 카운트는 다시 개선되었다. 반동성 폐 징후 및 증상은 4주의 나르소플리맙 치료 후에 관찰되지 않았다. 본 발명자들은 나르소플리맙 치료 환자에서 손상된 바이러스 방어의 증거를 보지 못하였다. 특히, 나르소플리맙은 대체 또는 고전적 보체 경로를 억제하지 않으며 적응 면역 반응 또는 항원 항체 복합체화를 간섭하지 않는다. 나르소플리맙 관련 감염 위험의 증거는 임상 시험에서 관찰되지 않았다. 렉틴 경로 활성화를 억제하는 것 외에, 나르소플리맙은 프로트롬빈의 트롬빈으로의 MASP-2 매개 절단, 칼리크레인의 활성화, 및 인자 XII의 XIIa로의 자동 활성화를 차단하는 것으로 나타났다. 이들 활성은 미세혈관 혈전증을 억제함으로써 유익한 효과에 기여할 수 있고, 이것은 특히 대규모 폐 혈전증으로 고생하는 환자에서 중요한 치료적 역할을 할 수 있었다. 나르소플리맙은 출혈 시간을 연장시키지 않으며 프로트롬빈 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간에 영향을 미치지 않고, 본 발명자들이 치료한 환자에서 출혈은 관찰되지 않았다.
본 발명자들의 발견은 Covid-19 관련 폐 손상의 병태생리학에서 내피 손상에 의해 유발된 렉틴 경로 활성화를 강력하게 암시한다. 나르소플리맙에 의한 보체의 렉틴 경로의 억제는 이 연구에서 모든 환자에서의 임상적 개선과 관련이 있었다. 나르소플리맙은 잘 허용되었고, 불리한 약물 반응은 보고되지 않았다. 모든 환자는 치료 동안 개선되었고 생존하였다. 나르소플리맙 치료 후 임상 상태 및 실험실 소견의 개선은 주목할만하다. 이들 소견은 약물의 작용 메커니즘 및 질환의 병태생리학과 관련된 지원적 증거로 의미있는 임상 효능을 강력하게 시사한다. 나르소플리맙에 의한 렉틴 경로 억제는 COVID-19 관련 폐 손상의 유망한 잠재적 치료인 것으로 나타난다.
추가 데이터가 이 실시예에서 기술된 임상 연구로부터 제공된다.
6명의 나르소플리맙 치료 환자의 임상적 특징은 표 13에서 요약된다. 나르소플리맙 4 mg/kg을 3 내지 4주 동안 정맥내로 주 2회 투여하였다. 치료 후에, 모든 환자는 임상적으로 개선되었다.
4명의 환자에서, 에녹사파린을 CT 스캔으로 기록된 폐색전증(환자 #4 및 #6), 의료적 결정(환자 #3) 및 삽관을 필요로 하는 급셕한 호흡 기능의 악화(환자 #5)로 인해 치료적 용량(100 IU/kg, 1일 2회)으로 투여하였다. 추적 중앙값은 27일(16-90일)이었고, 환자는 중앙값 8의 총 나르소플리맙 용량(범위 5-8)으로 주 2회 나르소플리맙을 투여받았다. 치료 후에, 모든 환자는 임상적으로 개선되었다. 4명의 환자(67%)가 중앙값 3의 나르소플리맙 용량(범위 2-3) 후에 환기 지원이 CPAP로부터 고유량 산소(비호흡기 또는 벤투리 산소 마스크)로 감소하였다.
도 50은 나르소플리맙으로 치료된 6명의 COVID-19 감염 환자의 임상 결과를 그래프로 도시한다.
도 50에서 나타낸 것과 같이, 이들 환자 중 3명에서, 산소 지원이 중단된 후 중단되었으며, 그들은 중앙값 6(5-8)의 총 나르소플리맙 용량 후 퇴원하였다.
환자 #4에서, 대규모 양측성 폐 색전증이 등록 후 4일 후에 대비 강화 CT 스캔으로 기록되었다. 에녹사파린을 진행 중인 나르소플리맙 투약에 첨가하였고, 신속한 임상적 및 방사선 그래프(반복된 CT 스캔) 상의 개선이 11일 후에 기록되었으며(도 47A 및 도 47B) 이후에 퇴원하였다.
2명의 나머지 환자(#5 및 #6)에서, 급격하고 점진적으로 악화된 중증 ARDS가 등록 직후에 기록되었다.
환자 #5에서, 중증 ARDS(55의 PaO2/FiO2)가 4일 째에 삽관으로 이어졌다. 그럼에도 불구하고, 후속된 임상 결과는 급격하게 유리하였고, 환자는 3일 후에 집중치료실로부터 나왔다. CPAP 2일 후에, 그는 저유량 산소 지원으로 안정화되었다. 그는 계속해서 산소를 필요로 하지 않았고 퇴원하였다.
환자 #6은 등록시 60의 PaO2/FiO2 및 중증 ARDS를 가졌으며 2일 후 삽관을 필요로 하였다. 그녀의 경과는 대규모 양측성 폐 혈전증 및 병원성 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(MRSA) 감염에 의해 복잡해졌다. 그녀의 상태는 개선되었고, 18일 후에, 그녀는 발관하였고(extubated), 기관절개술을 받았고(밀폐공포증으로 인함) 저유량 산소로 지원을 받았다. 그녀의 상태는 개선되었고, 산소 지원은 제거되었으며, 90일 째에 그녀는 퇴원하였다(33일부터 90일까지는 도 50에서 도시되지 않음).
이 연구에서 치료 관련 부작용을 보고되지 않았다.
위에서 기술된 것과 같이, 환자 #4에서, 등록 후 4일 후에 대규모 양측성 폐 색선증이 대비 강화 CT 스캔에 의해 기록되었다. 에녹사파린을 진행 중인 나르소플리맙 투약에 첨가하였고, 도 47A, B에서 나타낸 것과 같이, 신속한 임상적 및 방사선 그래프(반복된 CT 스캔) 상의 개선이 11일 후에 기록되었다.
도 47A 및 도 47B는 나르소플리맙으로 치료된 COVID-19 폐렴 환자 #4의 폐에서 촬영된 CT 스캔으로부터의 이미지이다.
도 47A는 등록 후(즉, 나르소플리맙으로 치료 후) 5일차에 환자 #4의 CT-스캔을 도시하며, 환자는 말초 및 중앙 영역 모두를 포함하는 미만성 간유리 음영(diffuse ground-glass opacity)을 갖는 중증 간질성 폐렴을 갖는 것으로 관찰된다. 하부 엽, 특히 왼쪽 폐의 폐경화. 간엽 및 분절 동맥의 충전 결함이 있는 대규모 양측 폐색전증(표시되지 않음).
도 47B는 간유리 음영이 상당히 감소되고 실질 폐경화의 거의 완전한 분해가 있는, 등록 후(즉, 나르소플리맙으로 치료 후) 16일차의 환자 #4의 CT-스캔을 도시한다. "고르지 못한 포장도로" 패턴이 말초 분포, 특히 하부 엽에서 관찰된다. 분명한 종격동기종(pneumomediastinum). 우측 폐의 하위 동맥에 최소 충전 결함(미도시).
도 48은 나르소플리맙으로 치료된 환자에서 기준선에서 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서(2 용량 후, 4 용량 후) IL-6의 혈청 수준(pg/mL)을 그래프로 도시한다. 박스는 제1 사분위수부터 제3 사분위수까지의 값을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며, 점은 모든 환자 값을 나타낸다. 도 48은 도 45에서 제시된 IL-6 데이터의 업데이트를 제공한다.
도 49는 나르소플리맙으로 치료된 환자에서 기준선에서 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서(2 용량 후, 4 용량 후) IL-8의 혈청 수준(pg/mL)을 그래프로 도시한다. 박스는 제1 사분위수부터 제3 사분위수까지의 값을 나타내고, 수평선은 중앙값을 나타내며, 점은 모든 환자 값을 나타낸다. 도 49는 도 46에서 제시된 IL-8 데이터의 업데이트를 제공한다.
도 50은 나르소플리맙으로 치료된 6명의 COVID-19 감염 환자의 임상 결과를 그래프로 도시한다. 막대 색상은 상이한 산소 지원을 나타낸다(CPAP: 황색; 삽관을 사용한 기계식 환기: 적색; 비호흡기 산소 마스크: 녹색; 비강 캐뉼라에 의한 저유량 산소: 연녹색; 실내 공기: 청색). 나르소플리맙 용량은 청색 화살표로 표시된다. 검은색 원형은 스테로이드 치료 시작을 나타낸다. 다이아몬드 기호는 TEP를 나타낸다. 별표(*)는 병원으로부터 퇴원을 나타낸다. CPAP=연속적인 기도 양압. NRM=비호흡기 산소 마스크. VM=벤투리 마스크. TEP=폐 혈전색전증.
도 51A는 나르소플리맙 치료 전 및 후의 아스파테이트 아미노기전이효소(AST)(유닛/리터, U/L) 값의 혈청 수준을 그래프로 도시한다. 검은색 선은 중앙값 및 사분위수 범위(IQR)를 나타낸다. 적색 선은 정상 수준을 나타내고 점은 모든 환자 값을 나타낸다.
도 51B는 나르소플리맙으로 치료를 시작하기 전에 기준선 값을 이용할 수 있었던 4명의 환자에서 D-이량체 값의 혈청 수준(ng/ml)을 그래프로 도시한다. 검은색 원은 스테로이드 치료가 시작되었을 때를 나타낸다. 적색 선은 정상 수준을 나타낸다.
요약하면, 이 연구에서, 처음으로 렉틴-경로 억제제를 사용하여 COVID-19를 치료하였는데, 연속적인 기도 양압(APCP) 또는 삽관을 필요로 하는 6명의 COVID-19 환자가 나르소플리맙을 받았다. 환자의 연령 중앙값은 57세(범위 47 - 63세)였고, 83 퍼센트가 남성이었으며, 모두 동반질환이 있었다. 기준선에서, 순환 내피 세포(CEC) 카운트 및 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-8(IL-8), C 반응성 단백질(CRP), 락테이트 탈수소효소(LDH), D-이량체 및 아스파테이트 아미노기전이효소(AST) - 모두 내피/세포 손상 및/또는 염증의 마커임 -의 혈청 수준이 상당히 상승되었다. 나르소플리맙 치료를 기계식 환기 후 48시간 이내에 시작하였다. 투약은 2 내지 4주 동안 주 2회였다.
연구 결과
· 모든 나르소플리맙 치료 환자는 완전하게 회복되었고, 생존하였으며 병원으로부터 퇴원하였다.
· 나르소플리맙 치료는 내피/세포 손상 및/또는 염증의 모든 평가된 마커 - CEC, IL-6, IL-8, CRP LDH, D-이량체 및 AST에 대한 신속하고 지속적인 감소/정상화와 관련이 있었다.
o 실험실 마커의 일시적인 패턴은 관찰된 임상적 개선과 일치하였다
o 특히, CEC 카운트는 이 질환에서 내피 손상 및 치료 반응을 평가하기 위한 신뢰할만한 도구인 것으로 나타난다
o 나르소플리맙 치료로 IL-6 및 IL-8의 일시적인 개선은 렉틴 경로 활성화가 COVID-19의 사이토카인 상승보다 선행할 수 있고 렉틴 경로 억제는 COVID-19 환자 감염에서 기술된 사이토카인 폭발에 대해 유익한 효과를 가지는 것을 시사한다
· 2명의 환자(1명은 삽관하였고 다른 한 명은 CPAP를 받음)의 경과는 대규모 양측성 폐 혈전증에 의해 한층 더 복잡해졌고, 두 환자 모두 나르소플리맙으로 완전하게 회복되었으며, 약물의 항응고 효과로부터 혜택을 받았을 가능성이 있다.
· 나르소플리맙은 이 연구에서 잘 허용되었고 불리한 약물 반응은 보고되지 않았다.
· 유사한 진입 기준 및 기준선 특징을 가진 2개의 대조군 그룹을 회고적 비교를 위해 사용하였는데, 두 그룹 모두 32 퍼센트 및 53 퍼센트의 실질적인 사망률을 보였다.
결론
이 실시예에서 입증된 것과 같이, 나르소플리맙으로 보체의 렉틴 경로를 억제하는 것은 Covid-19 관련 내피 세포 손상을 감소시키고 그로써 염증 상태 및 혈전형성 위험을 감소시킴으로써 Covid-19 환자에 대한 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 렉틴 경로 억제는 이전에는 COVID-19에 대한 치료로서 연구되지 않았었다. 이 연구에서 모든 환자는 COVID-19 관련 호흡 부전을 가졌다. MASP-2 억제제 나르소플리맙으로의 치료 후, 모든 환자는 회복되었고 병원에서 퇴원할 수 있었으며, COVID-19 병태생리학에서 렉틴 경로의 중요성을 추가로 지지하였다.
COVID-19에서 다른 보체 억제제의 사용이 보고되었다. 콤스타틴 기반 C3 억제제인 AMY-101(Mastaglio S. et al., Clin Immunol 215:108450, 2020)을 한 명의 환자에서 사용하였고 에쿨리주맙을 4명의 환자에세 항바이러스 및 항응고제 요법과 함께 투여하였다(Diurno F. et al., Eur Rev Med Pharmacol Sci 24(7):4040-7, 2020). 이들 5명의 환자는 CPAP 중이었고 생존하였다. 고유량 비강 산소 중인 2명의 COVID-19 환자는 스테로이드 치료 후에 항바이러스 요법을 포함한 지원 요법과 함께 C5a 항체를 받았고 이들 2명의 환자도 생존하였다. 종합적으로, 이들 보고는 나르소플리맙으을 사용하는 본 발명자들의 발견을 지지한다. 그러나, C3 및 C5 억제제와 달리, MASP-2 항체 나르소플리맙은 고전적 보체 경로 기능을 완전히 유지하며 적응 면역 반응 또는 항원-항체 복합체 매개 용해 반응을 간섭하지 않는다(Schwaeble W. et al., Proc Natl Acad Sci 108(18):7523-8, 2011). 나르소플리맙 관련 감염 위험의 증거는 나르소플리맙 임상 시험에서 관찰되지 않았다.
이것이 동정적 사용이고, 단일 측면 연구였지만, 2개의 상이한 대조군 그룹이 회고적 비교를 제공한다. 첫 번째는 최근에 공개된 문헌에서 Gritti 등에 의해 기술되었는데(medRxiv 2020:2020.04.01.20048561) COVID-19 환자에서 IL-6 억제제인 실툭시맙의 사용을 평가한 것이었다. 실툭시맙 연구 및 본 발명자들의 나르소플리맙 연구는 동일한 리드 수석 연구자(G.G. 및 A.R.), 진입 기준 및 환자 특징(즉, 인구통계, 증상, 동반질환, ARDS 중증도, 실험실 값 및 등록시 호흡기 지원)를 공유한다. 그 연구에서, 실툭시맙 치료 및 대조군 그룹의 사망률은 각각 33% 및 53%였다. 제2 회고적 비교기는 COVID-19 환자에서 CEC 측정의 생존성을 평가하기 위하여 본 병원에서 무작위로 선택된 33명의 환자에 의해 나타난다. 이들 33명의 환자 중에서, 22명이 나르소플리맙 치료 환자와 동일한 진입 기준을 충족하였고 유사한 기준산 특징을 가졌다. 그러나, 나르소플리맙 치료 그룹에서의 중앙값 기준선 CEC 카운트와 비교한 대조군 그룹의 그것은 각각 334/mL 대비 101/mL이었다. 흥미롭게도, 이들 22명의 환자 중 20명(91%)은 IL-6 억제제(토실리주맙 또는 실툭시맙) 및/또는 스테로이드로 치료되었고, 그룹은 32%의 전체 30일 사망률을 나타냈다. 사망률은 결과 분석을 나르소플리맙 치료 환자의 연령에 대해 매칭된(중앙값 58세, 범위 51-65세) 16명의 환자로 제한하였을 때에도 여전히 31%였다. 이 후자의 그룹에서, 94%가 IL-6 및/또는 스테로이드 요법을 받았고 55/mL의 중앙값 기준선 CEC 카운트는 나르소플리맙 치료 환자에서보다 6배 더 낮았다.
COVID-19에서 스테로이드의 사용은 뒤섞인 결과를 초래하였다(Veronese N. et al., Front Med(Lausanne) 7:170, 2020). 가장 최근에, COVID-19 요법의 무작위 평가(RECOVERY) 시험은 덱사메타손이 28일 사망률을 침습성 기계식 환기 중인 환자에서 28.7%(29.0% 대비 평상시 관리 시 40.7%), 침습성 기계식 환기 없이 산소 지원을 받고 있는 환자에서 14%(21.5% 대비 평상시 관리 시 25.0%) 감소시켰고 무작위로 호흡기 지원을 받지 않은 환자에서는 사망률에 영향을 미치지 않았음(17.0% 대비 평상시 관리 시 13.2%)을 입증하였다(Horby P. et al., medRxiv 2020:2020.06.22.20137273). 이들 데이터 및 본 발명자들의 병원에서의 경험을 기반으로, 본 발명자들은 스테로이드가 호흡기 기능장애가 있는 COVID-19 환자를 치료하는데 역할을 하여 염증 반응을 감소시키는 작용을 하였다고 믿는다. 나르소플리맙 치료 그룹에서, 6명의 환자 중 1명(환자 #1)은 스테로이드를 받지 않았다. 후속해서, 3월 말에, 제도적 지침이 업데이트되어, 본 발명자들의 병원의 모든 환자가 스테로이드를 받을 것을 필요로 하였다. 스테로이드를 받은 5명의 나르소플리맙 치료 환자 중에서, 2명(환자 #2 및 #3)이 이미 CPAP가 더 이상 필요하지 않을 정도로 개선된 후 스테로이드 투여를 시작하였거나 다음날 중단하였다. 이전에 기술된 것과 같이, 본 발명자들은 짧은 기간 동안 스테로이드만을 받은 4명의 환자의 별도 그룹에서 CEC 카운트를 평가하였고, 카운트는 스테로이드 투여에 의해 영향을 받지 않은 것으로 나타났다. 이것은 COVID-19 관련 내피 손상에 미치는 스테로이드의 임의의 유익한 효과가 지연될 수 있고 환자 #2 및 #3의 회복 과정에는 거의 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
결론적으로, 본 발명자들의 발견은 MASP-2 및 렉틴 경로의 내피 손상 유도 활성화가 COVID-19 관련 폐 손상의 병태생리학에서 중심 역할을 한다는 것을 강력하게 시사한다. 나르소플리맙 치료 후 임상 상태 및 실험실 소젼의 개선은 주목할만하다. 이들 발견은 의미있는 임상적 효능을 강력하게 시사하고 약물의 작용 메커니즘 및 질환의 병태생리학과 관련된 지원적 증거를 제공한다. 나르소플리맙에 의한 렉틴 경로 억제는 COVID-19 관련 폐 손상 및 내피 손상 관련 혈전증의 유망한 치료인 것으로 나타난다.
이 실시예에서 기술된 임상 연구로부터의 추가의 보충 데이터
이 실시예에서 위에서 기술된 것과 같이, 실험실에서 확인된 6명의 COVID-19 및 ARDS 환자(베를린 기준에 따름)를 나르소플리맙(4 mg/kg)으로 3 내지 4주 동안 주 2회 정맥내(IV)로 치료하였다. 이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 이 연구에서 6명의 모든 환자는 COVID-19 관련 호흡 부전을 가졌다. MASP-2 억제제 나르소플리맙으로의 치료 후, 모든 환자는 회복되었고 병원에서 퇴원할 수 있었다. 이들 환자를 병원에서 퇴원한 후에 모니터링하였따. 2020년 10월 22일 현재(나르소플리맙으로의 치료 후 5 내지 6개월), 6명의 모든 환자는 나르소플리맙으로 치료받지 않은 COVID-19 환자에서 보고되었던 임의의 장기 후유증의 증거 없이 임상적으로 정상이었다. 6명의 모든 환자에 대한 임상적 실험실 측정은 또한 D-이량체의 혈청 수준을 포함하여 2020년 10월 22일 현재 정상이고, 모두 정상 범위에 있는 것으로 나타났다(아래의 표 15 참고).
표 15는 나르소플리맙으로 치료 전인 입원시(기준선) 6명의 COVID-19 감염 환자로부터 취한 기준선 실험실 측정을, 5내지 6개월 후인 2020년 10월에 취한 실험실 측정과 비교하여 보여준다.
표 15는 기준선에서(치료 전, 또한 표 13 참고) 및 치료 후 5 내지 6개월 후인 2020년 10월에 측정된 6명의 나르소플리맙 치료 환자의 임상적 특징을 요약한 것이다.
이들 결과는 이들 6명의 환자에서 COVID-19 감염 환자의 나르소플리맙으로의 치료가 어떠한 장기 후유증의 증거 없이 이들 환자에서 완전한 회복으로 이어졌음을 입증한다.
광범위하게 보고된 것과 같이, 경미한 증상을 가진 환자뿐만 아니라 ARDS 및/또는 혈전증과 같은 중증 COVID-19 관련 폐 손상을 가진 환자를 포함한 많은 COVID-19 감염 환자가 COVID-19 감염으로부터 즉각적인 합병증뿐만 아니라 초기 감염으로부터 회복된 후에도 "장기 하울러(long-haulers)"로도 지칭되는 장기 후유증을 앓는다. 문헌[Marshall M., ("The lasting misery of coronavirus long-haulers", Nature Vol 585, 9/17/2020, page 339-341)]에서 기술된 것과 같이, 더 심각한 중증 COVID-19 감염을 가진 사람들이 그들의 폐, 심장, 면역 체계, 뇌, 중추신경계, 신장, 위 및 다른 장기에 장기 손상을 경험할 수 있고, 경미한 COVID-19 감염의 경우에도 만성 피로 증후군과 유사한 계속되는 불쾌감을 유발할 수 있다. 문헌[Marshall (2020)]에서 추가적으로 기술된 것과 같이, COVID-19 감염으로부터의 즉시 및 장기 후유증에는 심혈관 합병증(심근 손상, 심근병증, 심근염, 혈관내 응고, 뇌졸중, 정맥 및 동맥 합병증, 및 폐 혈전증 포함); 신경학적 합병증(인지 장애, 착란, "브레인 포그"로도 언급되는 기억 상실, 두통, 뇌졸중, 현기증, 실신, 발작, 식욕부진, 불면증, 후각상실증, 미각장애, 간대성 근경련, 신경병성 통증, 근육통; 알츠하이머병, 길랑 바레 증후군, 밀러-피셔 증후군, 파킨슨병과 같은 신경학적 질환의 발생 포함); 신장 손상(예컨대 급성 신장 손상(AKI)), 폐 합병증(폐 섬유증, 호흡곤란, 폐색전증 포함); 카와사키병, 카와사키 유사 질환, 아동의 다기관 염증 증후군; 및 다기관 장기 부전이 포함된다. 또한 문헌[Troyer A. et al., Brain, Behavior and Immunity 87:43-39, 2020; Babapoor-Farrokhram S. et al., Life Sciences 253:117723, 2020; 및 Heneka M. et al., Alzheimer's Research & Therapy, vol 12:69, 2020] 참고. 문헌[Yelin D. et al., Lancet Infect Dis 2020, 9/1/2020]에서 추가로 기술되는 것과 같이, 급성 COVID-19로부터회복된 사람들의 장기적인 불만에는: 극심한 피로, 근육 약화, 미열, 집중력 저하, 기억 상실, 기분 변화, 수면 장애, 팔다리의 바늘 통증, 설사 및 구토, 미각 및 후각 상실, 인후염 및 삼키기 어려움, 당뇨병 및 고혈압의 새로운 발병, 피부 발진, 숨가쁨, 흉통 및 심계항진이 포함된다.
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 이들 6명의 환자에서 COVID-19 감염 환자의 나르소플리맙으로의 치료는 COVID-19 감염으로부터의 어떠한 장기 후유증의 증거 없이 이들 환자에서 완전한 회복으로 이어졌다.
실시예 22
COVID-19 감염 환자 #7에서 OMS646(나르소플리맙) 치료
이 실시예는 일곱 번째 COVID-19 감염 환자(환자 #7)의 치료에서 실시예 20 및 실시예 21에서 기술된 방법을 사용하는 나르소플리맙(OMS646)의 사용을 기술한다. 이 실시예에서 기술된 결과는 실시예 21이세 6명의 COVID-19 감염 환자로 관찰된 결과와 일치하며 COVID-19 감염 환자의 치료에서 나르소플리맙의 효능을 추가로 학인시켜준다.
방법 및 결과:
환자 #7은 COVID-19 감염된 76세의 비만이고, 당뇨병이 있으며 오랜 흡연 이력 및 COPD를 가진 남성이고 또한 전립선암 수술을 받은 적이 있다(즉, COVID-19 관련 합병증에 대해 "고위험"으로 분류된 환자). 환자는 초기에 비강 캐뉼라에 의한 산소를 필요로 하면서 베르가모 병원에 들어왔다. 그의 호흡기 상태는 빠르게 악화되어, 처음에 마스크에 의한 산소를 필요로 한 후 연속적인 기도 양압으로 기계식 환기를 필요로 한 후 삽관을 필요로 하였다. 삽관 후, 면역글로불린 감마 4(IgG4) 중쇄 및 람다 경쇄 불변 영역으로 구성된 완전 인간 단클론성 항체인 나르소플리맙(OMS646)으로 치료를 시작하였다. 나르소플리맙은 나노몰 미만의 친화도로 MASP-2에 결합하여 억제한다. 환자 #7의 나르소플리맙으로의 치료를 실시예 20 및 실시예 21에서 기술된 방법에 따라 2 내지 4주 동안 주 2회 정맥내로 4 mg/kg을 투여하여 수행하였고, 이때 최대 6 내지 8 용량을 투여하였다(즉, 2주, 3주 또는 4주의 투약 기간). 지금까지, 환자 #7은 4 용량의 나르소플리맙을 받았다. 나르소플리맙으로의 치료 후 환자 #7은 습속도로 개선되었고 그는 제2 용량 후에는 발관하였다. 그의 실험실 소견을 도 52A-E에 도시하며, 아래에서 기술되는 것과 같이, 투약을 각각의 그래프 상에서 수직 화살표로 표시한다.
도 52A는 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙으로 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 위독한 상태의 환자 #7에서 D-이량체 값의 혈청 수준(ng/ml)을 그래프로 도시한다. 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시된다. 적색 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52B는 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙으로 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 위독한 상태의 환자 #7에서 C 반응성 단백질(CRP)의 혈청 수준을 그래프로 도시한다. 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시된다. 적색 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52C는 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 위독한 상태의 환자 #7에서 아스파테이트 아미노기전이효소(AST)의 혈청 수준(유닛/리터, U/L)을 그래프로 도시한다. 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시된다. 적색 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52D는 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙 치료 후 상이한 시점에서 COVID-19로 위독한 상태의 환자 #7에서 알라닌 트랜스아미나제(ALT)의 혈청 수준(유닛/리터, U/L)을 그래프로 도시한다. 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시된다. 적색 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
도 52E는 치료 전 기준선에서(0일) 및 나르소플리맙으로 치료 후 상이한 시점에서 중증 COVID-19 환자 #7에서 락테이트 탈수소효소(LDH)의 혈청 수준을 그래프로 도시한다. 나르소플리맙으로의 투약은 수직 화살표로 표시된다. 적색 수평선은 정상 수준을 나타낸다.
결과의 요약:
도 52A 내지 52E에서 나타낸 것과 같이, 병원 입원시 및 나르소플리맙으로의 치료 전에, 환자 #7은 D-이량체(COVID-19의 응고 가능성의 최고의 마커로 여겨짐)의 높은 혈청 수준, C 반응성 단백질(염증 마커)의 높은 혈청 수준, 아스파테이트 아미노기전이효소(위독한 상태의 COVID-19의 효소 마커)의 높은 혈청 수준, 알라닌 트랜스아미나제(간 기능의 마커)의 높은 혈청 수준, 및 락테이트 탈수소효소(세포 사멸의 마커)의 높은 혈청 수준을 가졌다. 도 52A 내지 52E에서 추가로 나타낸 것과 같이, 환자 #7은 제1 용량의 나르소플리맙 후에 개선되어, 의의 모든 실험실 측정이 제4 용량 후에 정상 수준 가까이 또는 정상 수준으로 떨어졌다. 그는 제2 용량의 나르소플리맙 후에 발관하였다. 집중치료실 직원은 나르소플리맙으로의 치료 후에 그의 신속한 개선을 놀라워했다. 이 실시예에서 보고된 환자 #7의 신속한 개선은 실시예 21에서 기술된 것과 같이 나르소플리맙으로의 치료 후 COVID-19 감염 환자 #1-6의 회복과 일치한다.
추가 데이터가 이 실시예에서 기술된 임상 연구로부터 제공된다:
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 환자 #7은 제1 용량의 나르소플리맙 후에 개선되었고, 제2 용량 후에 발관하였고, 모든 위의 실험실 측정이 제4 용량 후에 정상 수준 가까이 또는 정상 수준으로 떨어졌다. 업데이트로서, 환자 #7은 총 6의 나르소플리맙 용량을 받았고 병원에서 퇴원하였다. 도 53에서 나타낸 것과 같이, 시간 경과에 따른 환자 #7로부터의 혈청학 데이터는 나르소플리맙으로의 치료 동안 적절하게 높은 역가의 항-SARS-CoV-2 항체가 생성되었음을 나타냈고, 이것은 나르소플리맙이 적응 면역 반응의 이펙터 기능을 방해하지 않음을 나타낸다.
본원에서 기술된 환자 #1-7 외에, ARDS를 앓고 있는 수많은 추가의 COVID-19 환자를 실시예 20 및 실시예 21에 기술된 방법에 따라 동정적 사용 하에 4 mg/kg의 투여량으로 2주 내지 4주 또는 5주 동안 주 2회, 최대 4 내지 10 용량(2주, 3주, 4주 또는 5주 동안)으로 정맥내로 투여하여 나르소플리맙으로 치료하였다. 이 실시예에서 기술된 추가 환자는 모두 치료 전에 COVID-19 관련 ARDS로 위독한 상태였고, 모두 삽관하였으며, 대다수가 삽관 후 수일 후에 나르소플리맙을 시작하였고 나르소플리맙을 시작하기 전에는 다른 치료법은 모두 실패하였다. 놀랍게도 본원에서 기술된 환자 #1-7로 관찰된 결과와 유사한 양성 결과가 나르소플리맙으로 치료된 대부분의 환자에서 관차되었다. 나르소플리맙으로 치료된 대부분의 COVID-19 환자는 임상적 결과 및 실험실 값에서 신속하고 뚜렷한 개선을 보였고 후속해서 병원에서 퇴원하였다. 중요하게, 추적 데이터(나르소플리맙 치료 중단 후 5-6개월 후)를 이용할 수 있는 나르소플리맙 치료 COVID-19 환자는 관찰된 장기 후유증의 임상적 또는 실험실 증거를 보이지 않는다. 또한 생존한, 나르소플리맙으로 치료된 COVID-19 환자는 환자 #7에 대해 위에서 기술된 것과 같이 적절하게 높은 항-SARS-CoV-2 항체를 발생하였다. 이들 결과는 렉틴 경로를 특이적으로 억제하고 보체의 대체 경로 및 고전적 경로는 완전히 기능적으로 유지하는 나르소플리맙으로의 치료가 적응 면역 반응의 감염에 대항하는 이펙터 기능을 보존하며 바이러스 감염 세포를 사멸시키는데 중요한 역할을 하는 항원-항체 복합체 매개 용해 반응을 유지하는 것을 입증한다.
이탈리아 베르가모에서 나르소플리맙으로 치료된 위독한 상태의 COVID-19 환자 #8-15 및 미국에서 나르소플리맙으로 치료된 환자 #1-4의 치료 과정의 간단한 설명을 아래에 제공한다:
환자 #8(이탈리아 베르가모)
환자 #8은 울혈성 심부전(congestive heart failure), 고혈압, 이상지질혈증(dyslipidemia) 및 중증 COVID-19를 가진 76세의 비만한 남성이었다. 그는 삽관 후 3일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였고 제3 용량 후 기존의 심근병증의 합병증으로 사망하였다. 그의 D-이량체 및 LDH 수준은 1 내지 2 용량의 나르소플리맙 후에 개선되었다. 혈청학 데이터는 그가 고역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하지 못했음을 나타낸다.
환자 #9(이탈리아 베르가모)
환자 #9는 중증 COVID-19를 가진 41세의 과체중 남성이다. 그는 삽관 후 2일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였고 제2 용량 후에 발관하였다. 그는 총 6 용량을 받았고 병원에서 퇴원하였다. 그의 D-이량체 수준 및 LDH 수준은 1 내지 2 용량의 나르소플리맙 후에 개선되었다. 혈청학 데이터는 그가 나르소플리맙으로의 치료 과정 동안 적절하게 높은 역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하였음을 나타낸다.
환자 #10(이탈리아 베르가모)
환자 #10은 중증 COVID-19를 가진 65세의 과체중 남성이다. 그는 삽관 후 3일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였고 제4 용량 후에 발관하였다. 그는 총 9 용량의 나르소플리맙을 받았고 병원에서 퇴원하였다. 그의 D-이량체 수준 및 LDH 수준은 1 내지 2 용량의 나르소플리맙 후에 개선되었다. 혈청학 데이터는 그가 나르소플리맙으로의 치료 과정 동안 적절하게 높은 역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하였음을 나타낸다.
환자 #11(이탈리아 베르가모)
환자 #11은 고혈압, 이상지질혈증 및 중증 COVID-19를 가진 68세의 과체중 남성이었다. 그는 삽관 후 13일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였다. 그는 총 7 용량을 받았고 다기관 부전으로 사망하였다. 혈청학 데이터는 그가 고역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하지 못했음을 나타낸다.
환자 #12(이탈리아 베르가모)
환자 #12는 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증 및 중증 COVID-19를 가진 62세의 과체중 남성이다. 그는 삽관 후 2일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였다. 그는 재삽관 후 기관절개술을 필요로 하는 병원내 감염이 발생하였다. 그는 총 6 용량의 나르소플리맙을 받았고 재활 시설로 퇴원하였다. 혈청학 데이터는 그가 나르소플리맙으로의 치료 과정 동안 적절하게 높은 역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하였음을 나타낸다.
환자 #13(이탈리아 베르가모)
환자 #13은 고혈압 및 중증 COVID-19를 가진 62세의 남성이다. 그는 삽관 후 3일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였고 7 용량 후에 발관하였다. 그는 총 8 용량의 나르소플리맙을 받았고 자발적으로 호흡한다. 혈청학 데이터는 그가 나르소플리맙으로의 치료 과정 동안 적절하게 높은 역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하였음을 나타낸다.
환자 #14(이탈리아 베르가모)
환자 #14는 COVID-19 감염된 64세의 고혈합을 가진 남성이다. 그는 삽관 후 6일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였고 7 용량 후에 발관하였다. 그는 총 8 용량의 나르소플리맙을 받았고, 자발적으로 호흡하기 시작하였으며 재활 시설로 퇴원하였다. 혈청학 데이터는 그가 나르소플리맙으로의 치료 과정 동안 적절하게 높은 역가의 항-SARS-CoV-2 항체를 생성하였음을 나타낸다.
환자 #15(이탈리아 베르가모)
환자 #15는 고혈압 및 중증 COVID-19를 가진 79세 남성이다. 그는 삽관 후 3일 후에 나르소플리맙 치료를 시작하였다. 그는 3 용량의 나르소플리맙 후에 발관하였고 계속해서 개선되고 있다. 혈청학 데이터는 아직은 활용할 수 없다.
환자 #1(미국)
환자 #1은 렘데시비르, 토실리주맙, 초기 스테로이드 요법 및 회복기 혈장을 포함한 다른 치료법을 실패한 후 약 2주 동안 삽관되었던 중증 COVID-19를 가진 53세 암성이다. 그는 나르소플리맙으로 치료를 시작하였고 동시에 에녹사파린 및 메틸프레드니솔론을 받았다. 그는 빠르게 반응하였고 제5 용량의 나르소플리맙 직후에 발관하였다. 그는 물리 치료를 위해 재활 시설로 퇴원하였고, 계속해서 개선되어 지난 달에 직장으로 복귀하였다. 그는 COVID-19의 장기 후유증이 없는 것으로 알려졌다.
환자 #2(미국)
환자 #2는 중증 COVID-19의 결과로서 호흡기 기능이 급격하게 악화되고 있는 55세의 아프리카계 미국인 여성이다. 그녀는 삽관 후 수일 후에 나르소플리맙으로 치료를 시작하였다. 그녀의 산소 요구는 성공적으로 줄어들었지만, 마스크 부적응으로 인해 저수준 산소 지원을 위해 기관절개술을 배치하고 영양 공급 튜브를 삽입하였다. 그녀는 응급 치료 시설로 퇴원한 후 집으로 돌아갔다. 기관절개술 및 영양 공급 튜브를 제거하였고 그녀는 장기 임상 후유증의 증거 없이 잘 지내고 있는 것으로 알려졌다.
환자 #3(미국)
환자 #3은 중증 COVID-19를 가진 80세의 남성이었다. 그는 삽관 후 수일 후에 나르소플리맙으로 치료를 시작하였다. 그는 제3 또는 제4 용량의 나르소플리맙 후에 사망하였다. 그의 사망은 압력상해(barotrauma) 및 기계적 환기에 따른 이차적 합병증과 관련이 있는 것으로 알려졌다. 그의 가족은 종교적인 이유로 체외막 산소공급장치(ECMO) 치료를 거절하였다.
환자 #4(미국)
환자 #4는 고혈압 및 중증 COVID-19를 가진 61세 남성이다. 나르소플리맙 치료를 시작하기 전에, 그는 8일 동안 삽관하였고 ECMO를 진행하였다. 그는 렘데시비르, 바르시티닙 및 고용량 스테로이드를 사용한 치료에는 실패하였다. 그는 지금까지 여러 용량의 나르소플리맙을 받았고 그의 임상 상태는 안정적으로 유지된다.
인플루엔자 바이러스
실시예 20, 21 및 22에서 기술된 것과 같이, 렉틴 경로는 COVID-19 감염에서 폐 손상에 기여하고 대표적인 MASP-2 억제 항체인 나르소플리맙이 COVID-19 감염 환자에서 폐 증상을 완화시키는데 효과적인 것으로 입증되었다. 보체 활성화가 또한 인플루엔자 H5N1 바이러스 감염의 모델에서 폐 손상에 기여하는 것으로 입증되었다. 폐의 조직병리학적 변화는 H5N1 감염 및 SARS-CoV 감염 환자에서 매우 유사하다. H5N1 쥐과 모델에서, MASP-2 RNA, C3a 수용체 RNA 및 C5a 수용체 RNA의 발현은 모두 감염 후 첫째 날에 증가하였다. C3aR 길항물질 또는 코브라 독 인자의 사용으로 인한 보체 억제는 폐 손상 및 임상 징후를 약화시켰다. 생존율 또한 증가되었다(Sun et al., Am J Respir Cell Mol Biol 49(2):221-30, 2013 참고). 따라서, MASP-2 억제제가 또한 인플루엔자 바이러스로 감염된 포유로 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군 또는 질환의 다른 징후를 치료, 억제, 완화 또는 예방하기 위한 방법에 사용하기에 효과적일 것으로 예상된다.
전술한 설명에 따르면, 한 측면으로, 본 발명은 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는(즉, 렉틴 경로 활성화를 억제하는)데 효과적인 MASP-2 억제제의 일정량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 포유류 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군 또는 질환의 다른 징후, 예컨대 혈전증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 호흡기 증후군 및/또는 혈전증을 앓고 있고 방법은 대상체에게 적어도 하나의 호흡기 증상을 개선(즉, 호흡기 기능을 개선)하고/거나 혈전증을 완화시키기에 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 COVID-19로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 SARS-CoV로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 MERS-CoV로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 MASP-2 억제제의 투여 전에 코로나바이러스(즉, COVID-19, SARS-CoV 또는 MERS-CoV)를 가진 것으로 확인된다. 한 구체예에서, 대상체는 COVID-19로 감염된 것으로 확인되고 보충 산소를 필요로 하며 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체, 예컨대, 예를 들어, 나르소플리맙이 보충 산소에 대한 필요를 제거하기에 효과적인 투여량으로 효과적인 시간 동안 대상체에게 투여된다.
한 구체예에서, 대상체는 COVID-19을 가진 것으로 확인되고 COVID-19 유도 혈전증을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있으며 방법은 MASP-2 억제제(예컨대, 나르소플리맙과 같은 MASP-2 억제 항체)를 포함하는 조성물을 상기 대상체에서 응고 또는 혈전증을 치료, 예방 또는 중증도를 감소시키기에 치료적으로 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 발명의 방법은 지혈에 영향을 주지 않으면서 항응고 및/또는 항혈전증 및/또는 항혈전생성을 제공한다. 한 구체예에서, D-이량체의 수준은 상기 대상체에서 혈전증의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여 COVID-19를 앓고 있는 대상체에서 측정되며, 표준 범위보다 높은 D-이량체 수준은 혈전증의 존재를 나타내고 대상체는 상기 대상체에서 응고 또는 혈전증을 치료, 예방 또는 중증도를 감소시키기에 치료적으로 효과적인 양의 MASP-2 억제제(예컨대, 나르소플리맙과 같은 MASP-2 억제 항체)로 치료되며, 그것은 예를 들어, D-이량체 수준의 건강한 대상체의 정상 범위로의 감소에 의해 측정될 수 있다.
한 구체예에서, 방법은 인플루엔자 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A 바이러스(H1N1(1918년에 "스페인 독감" 및 2009년에 "돼지 독감"을 유발함); H2N2(1957년에 "아시아 독감"을 유발함), H3N2(1968년에 "홍콩 독감"을 유발함), H5N1(2004년에 "조류 독감"을 유발함), H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 및 H6N1); 또는 인플루엔자 B 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스 C 바이러스로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 MASP-2 억제제의 투여 전에 인플루엔자 바이러스를 가진 것으로 확인된다.
한 구체예에서, 대상체는 대조군 건강한 대상체 또는 집단의 순환 내피 세포의 수준과 비교하여 MASP-2 억제제로의 치료 전 대상체로부터 얻어진 혈액 샘플에서 증가된 순환 내피 세포 수준을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구체예에서, 방법은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에서 순환 내피 세포의 수를 감소시키기에 충분한 양으로 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 소분자이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착을 억제한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 적어도 2주의 기간 동안(예컨대 적어도 3주 동안, 또는 적어도 4주 동안, 또는 적어도 5주 동안, 또는 적어도 6주 동안, 또는 적어도 7주 동안, 또는 적어도 8주 동안, 또는 적어도 9주 동안, 또는 적어도 10주 동안, 또는 적어도 11주 동안, 또는 적어도 12주 동안) 적어도 주 1회(예컨대 적어도 주 2회 또는 적어도 주 3회) 1 mg/kg 내지 10 mg/kg(즉, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 투여량으로 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 4 mg/kg(즉, 3.6 mg/kg 내지 4.4 mg/kg)이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체(예컨대, 나르소플리맙)의 투여량은 COVID-19를 앓고 있는 대상체에게 적어도 2주, 또는 적어도 3주, 또는 적어도 4주(예컨대, 2주 내지 4주)의 기간 동안 적어도 주 2회 약 4 mg/kg(즉, 3.6 mg/kg 내지 4.4 mg/kg)의 투여량으로 투여된다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 300 mg 내지 약 450 mg(즉, 약 300 mg 내지 약 400 mg, 또는 약 350 mg 내지 약 400 mg), 예컨대 약 300 mg, 약 305 mg, 약 310 mg, 약 315 mg, 약 320 mg, 약 325 mg, 약 330 mg, 약 335 mg, 약 340 mg, 약 345 mg, 약 350 mg, 약 355 mg, 약 360 mg, 약 365 mg, 약 370 mg, 약 375 mg, 약 380 mg, 약 385 mg, 약 390 mg, 약 395 mg, 약 400 mg, 약 405 mg, 약 410 mg, 약 415 mg, 약 420 mg, 약 425 mg, 약 430 mg, 약 435 mg, 약 440 mg, 약 445 mg 또는 약 450 mg의 고정된 용량이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 370 mg(±10%)의 고정된 용량이다.
한 구체예에서, 방법은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 적어도 8주의 치료 기간 동안 정맥내로 주 2회 약 370 mg(±10%)의 고정된 투여량의 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로 전달된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 경구로, 피하로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 또는 흡입제로서 투여된다.
한 구체예에서, 대상체는 COVID-19 유도 폐렴 또는 ARDS를 앓고 있고 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 폐렴 또는 ARDS의 하나 이상의 증상을 완화시키기에 충분한 시간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 기계식 환기장치를 사용 중이며 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기계식 환기에 대한 필요를 중단시키기에 충분한 투여량으로 충분한 시간 동안 투여된다. 한 구체예에서 대상체는 침습성 기계식 환기장치를 사용 중이다. 한 구체예에서, 대상체는 비침습성 기계식 환기장치를 사용 중이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 보충 산소의 사용을 중단시키기에 충분한 투여량으로 충분한 시간 동안 투여된다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 단일요법으로서 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제와 함께, 예컨대 MASP-2 억제제 및 하나 이상의 항바이러스제, 또는 하나 이상의 항응고제, 또는 하나 이상의 치료 항체 또는 하나 이상의 치료 소분자 화합물을 포함하는 제약학적 조성물로 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 투여되고, 대상체는 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 하나 이상의 항바이러스제 또는 하나 이상의 항응고제, 또는 하나 이상의 치료 항체 또는 하나 이상의 치료 소분자 화합물로 치료가 진행 중이다.
전술한 설명에 따르면, 또 다른 측면으로, 본 발명은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 포유류 대상체에서 하나 이상의 장기 후유증을 치료, 개선, 예방 또는 발병의 위험을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는(즉, 렉틴 경로 활성화를 억제하는)데 효과적인 MASP-2 억제제의 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 호흡기 증후군 및/또는 혈전증을 앓고 있고 방법은 대상체에게 적어도 하나의 호흡기 증상을 개선(즉, 호흡기 기능을 개선)시키고/거나 혈전증을 완화시키기에 효과적인 MASP-2 억제제 의 양을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 COVID-19로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 SARS-CoV로 감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 MERS-CoV감염된 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대상체는 MASP-2 억제제의 투여 전에 코로나바이러스(즉, COVID-19, SARS-CoV 또는 MERS-CoV)를 가진 것으로 확인된다. 한 구체예에서, 대상체는 COVID-19로 감염된 것으로 확인되고 보충 산소를 필요로 하며 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체, 예컨대, 예를 들어, 나르소플리맙이 보충 산소에 대한 필요를 제거하기에 효과적인 투여량으로 효과적인 시간 동안 대상체에게 투여된다.
한 구체예에서, 대상체는 COVID-19로 감염된 것으로서 확인되고 경미한 증상을 겪고 있으며 MASP-2 억제제, 예컨대 MASP-2 억제 항체, 예컨대, 예를 들어, 나르소플리맙이 대상체에게 상기 대상체에서 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증을 치료, 개선, 예방 또는 발병 위험을 감소시키기에 효과적인 투여량으로 및 효과적인 기간 동안 투여된다. 일부 구체예에서, 방법은 COVID-19을 앓고 있거나, 또는 이전에 감염된 대상체에서 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증을 치료, 개선, 예방 또는 발병 위험을 감소시키는데 유용하며, 장기 후유증은 심혈관 합병증(심근 손상, 심근병증, 심근염, 혈관내 응고, 뇌졸중, 정맥 및 동맥 합병증, 및 폐 혈전증 포함); 신경학적 합병증(인지 장애, 착란, "브레인 포그"로도 언급되는 기억 상실, 두통, 뇌졸중, 현기증, 실신, 발작, 식욕부진, 불면증, 후각상실증, 미각장애, 간대성 근경련, 신경병성 통증, 근육통; 알츠하이머병, 길랑 바레 증후군, 밀러-피셔 증후군, 파킨슨병과 같은 신경학적 질환의 발생 포함); 신장 손상(예컨대 급성 신장 손상(AKI)); 폐 합병증(폐 섬유증, 호흡곤란, 폐색전증 포함) 및 카와사키병, 카와사키 유사 질환, 아동의 다기관 염증 증후군(MIS-C) 및 COVID-19로 감염되었던 대상체에서의 다기관 장기 부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 최근 공개된 데이터는 아동에서의 SARS-CoV-2 감염이, 임상 중증도와 독립적으로, 높은 발생률의 TMA를 초래하는 것을 보여준다(Diorio C. et al., Blood Advances vol 4(23), Dec 8, 2020 참고). 또한 아동에서의 SARS-CoV-2 감염은 다기관 염증 증후군(MIS-C)을 초래할 수 있는 것으로 보고되었다(Radia T. et al., Paediatr Respri Rev Aug 11, 2020 참고).
최근에 다수의 국제적인 그룹이 "회복된" COVID-19 환자의 60%를 넘는 환자가 인지/중추신경계, 폐, 심장, 간 및 다른 비정상을 포함하여 심각한 후유증을 가진다는 보고서를 공개하였다(예컨대, Bonow et al., JAMA Cardiology vol 5(7) July 2020; Del Rio et al., JAMA vol 324 (17), November 2020; Lindner et al., JAMA Cardiology vol 5(11), November 2020; Marchiano S. et al., bioRxiv, August 30, 2020; Puntmann V. et al., JAMA Cardiology vol 5 (11), November 2020; Xiong Q. et al., Clin Microbial Infect 2020 참고). 예를 들어, 문헌[Yelin D. et al., Lancet Infect Dis 2020, 9/1/2020]에서 기술된 것과 같이, 급성 COVID-19로부터 회복되는 사람들의 장기적인 불만에는: 극심한 피로, 근육 약화, 미열, 집중력 저하, 기억 상실, 기분 변화, 수면 장애, 팔다리의 바늘 통증, 설사 및 구토, 미각 및 후각 상실, 인후염 및 삼키기 어려움, 당뇨병 및 고혈압의 새로운 발병, 피부 발진, 숨가쁨, 흉통 및 심계항진이 포함된다. 현저하게, 본원의 실시예 21 및 22에서 기술된 것과 같이, 나르소플리맙으로 치료된 초기 6명의 베르가모 연구 COVID-19 환자에 대한 5- 내지 6개월의 추적은 장기 COVID-19 후유증의 임상적 또는 실험실 증거가 없는 것을 보여주었다.
한 구체예에서, 대상체는 대조군 건강한 대상체 또는 집단의 순환 내피 세포의 수준과 비교하여 MASP-2 억제제로의 치료 전 대상체로부터 얻어진 혈액 샘플에서 증가된 순환 내피 세포 수준을 갖는 것으로 결정된다. 일부 구체예에서, 방법은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에서 순환 내피 세포의 수를 감소시키기에 충분한 양으로 MASP-2 억제제의 양을 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하는 소분자이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 단편이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 실질적으로 고전적 경로를 억제하지 않는다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체는 90% 인간 혈청에서 30 nM 이하의 IC50으로 C3b 침착을 억제한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 적어도 2주의 기간 동안(예컨대 적어도 3주 동안, 또는 적어도 4주 동안, 또는 적어도 5주 동안, 또는 적어도 6주 동안, 또는 적어도 7주 동안, 또는 적어도 8주 동안, 또는 적어도 9주 동안, 또는 적어도 10주 동안, 또는 적어도 11주 동안, 또는 적어도 12주 동안) 적어도 주 1회(예컨대 적어도 주 2회 또는 적어도 주 3회) 1 mg/kg 내지 10 mg/kg(즉, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 투여량으로 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 4 mg/kg(즉, 3.6 mg/kg 내지 4.4 mg/kg)이다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체(예컨대, 나르소플리맙)의 투여량은 COVID-19를 앓고 있는 대상체에게 적어도 2주, 또는 적어도 3주, 또는 적어도 4주 또는 적어도 5주 또는 적어도 6주 또는 적어도 7주 또는 적어도 8주(예컨대, 2주 내지 4주, 또는 2주 내지 5주 또는 2 내지 6주 또는 2주 내지 7주 또는 2주 내지 8주)의 기간 동안 적어도 주 2회 약 4 mg/kg(즉, 3.6 mg/kg 내지 4.4 mg/kg)의 투여량으로 투여된다.
한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 300 mg 내지 약 450 mg(즉, 약 300 mg 내지 약 400 mg, 또는 약 350 mg 내지 약 400 mg), 예컨대 약 300 mg, 약 305 mg, 약 310 mg, 약 315 mg, 약 320 mg, 약 325 mg, 약 330 mg, 약 335 mg, 약 340 mg, 약 345 mg, 약 350 mg, 약 355 mg, 약 360 mg, 약 365 mg, 약 370 mg, 약 375 mg, 약 380 mg, 약 385 mg, 약 390 mg, 약 395 mg, 약 400 mg, 약 405 mg, 약 410 mg, 약 415 mg, 약 420 mg, 약 425 mg, 약 430 mg, 약 435 mg, 약 440 mg, 약 445 mg 또는 약 450 mg의 고정된 용량이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제 항체의 투여량은 약 370 mg(±10%)의 고정된 용량이다.
한 구체예에서, 방법은 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 적어도 8주의 치료 기간 동안 정맥내로 주 2회 약 370 mg(±10%)의 고정된 투여량의 MASP-2 억제 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제는 대상체에게 전신적으로 전달된다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제는 경구로, 피하로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 또는 흡입제로서 투여된다.
한 구체예에서, 대상체는 COVID-19 유도 폐렴 또는 ARDS를 앓고 있고 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 폐렴 또는 ARDS의 하나 이상의 증상을 완화시키고 COVID-19 관련 장기 후유증을 완화 또는 예방하기에 충분한 시간 동안 투여된다. 한 구체예에서, 대상체는 기계식 환기장치를 사용 중이며 MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 기계식 환기에 대한 필요를 중단시키기에 충분한 투여량으로 충분한 시간 동안 투여된다. 한 구체예에서 대상체는 침습성 기계식 환기장치를 사용 중이다. 한 구체예에서, 대상체는 비침습성 기계식 환기장치를 사용 중이다. 한 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 보충 산소의 사용을 중단시키기에 충분한 투여량으로 충분한 시간 동안 투여된다.
한 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 단일요법으로서 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 하나 이상의 추가 치료제와 함께, 예컨대 MASP-2 억제제 및 하나 이상의 항바이러스제, 또는 하나 이상의 항응고제, 또는 하나 이상의 치료 항체 또는 하나 이상의 치료 소분자 화합물을 포함하는 제약학적 조성물로 투여된다. 일부 구체예에서, MASP-2 억제제(예컨대, MASP-2 억제 항체)는 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스로 감염된 대상체에게 투여되고, 대상체는 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 하나 이상의 항바이러스제 또는 하나 이상의 항응고제, 또는 하나 이상의 치료 항체 또는 하나 이상의 치료 소분자 화합물로 치료가 진행 중이다.
실시예 23
SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질은 MASP-2에 결합하여 보체 C4를 활성화하고 대표적인 MASP-2 억제 항체 HG4는 이 활성화를 억제한다.
배경/근거:
실시예 21 및 22에서 기술된 것과 같이, ARDS를 앓고 있는 COVID-19 환자의 MASP-2 억제 항체 나르소플리맙으로의 치료는 신속한 개선을 초래하였다. 이 실시예는 SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드(N) 단백질이 MASP-2에 결합하여 보체 C4를 활성화하고 대표적인 MASP-2 억제 항체 HG4가 이 활성화를 억제하는 것을 입증하며, MASP-2 매개 렉틴 경로가 SARS-Cov-2로의 감염 후에 활성화되는 것을 추가로 확인시켜준다.
1. SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드 단백질은 MASP-2에 결합한다
방법:
미세역가 플레이트를 1 μg/웰의 재조합 SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP2) 또는 대조군 기질(BSA)로 코팅하였다. 나머지 결합 부위를 1% BSA를 사용하여 차단하였다. 재조합 MASP-2(rMASP-2)의 연속 희석을 첨가하고 결합을 항-MASP-2 mAb를 사용하여 검출하였다.
결과:
도 54는 BSA 대조군과 비교하여 재조합 MASP-2의 SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP2)에 대한 농도 의존성 결합을 그래프로 도시한다.
2. MASP-2는 SARS-Cov-2 N-단백질에 직접 결합하고 보체 C4 활성화를 매개한다
방법:
미세역가 플레이트를 2.5 μg/웰 SARS-Cov-2 재조합 뉴클레오캡시드 단백질(NP2)로 코팅하였다. 나머지 결합 부위를 1% BSA를 사용하여 차단하였다. 바르비탈 완충 식염수(BBS) 중의 rMASP-2(1 μg)를 첨가하였다. 대조군 웰에는 완충액만을 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후, 웰을 TBS/Tween으로 세척하였다. 정제된 인간 C4(1 μg)를 각 웰에 첨가하였다. MASP-2 억제 항체 HG4(0.1 μM)(또한 실시예 13에서 기술된 것과 같이 OMS646-SGMI-2로도 언급됨)를 rMASP-2 및 C4를 함유한 NP2로 코팅된 특정 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후, 상층액을 흡인하고 SDS-PAGE 상에서 환원 조건 하에 분리하고 다음과 같이 웨스턴 블롯 상에 로딩하였다:
레인 1: C4 대조군 단독
레인 2: NP2 플러스 rMASP-2 플러스 C4:
레인 3: NP2 플러스 rMASP-2 플러스 C4 플러스 HG4(0.1 mM)
레인 4: NP2 플러스 C4
레인 5: BSA 플러스 rMASP-2 플러스 C4
결과:
도 55는 SDS-PAGE 웨스턴 블롯 겔을 도시하는 것으로, 레인 1은 대조군으로서 정제된 C4를 함유하고 C4α, C4β 및 C4γ에 상응하는 밴드를 보여준다. 레인 2는 NP2 플러스 rMASP-2 플러스 C4를 함유하며, C4α, C4β, C4γ 및 C4'α에 상응하는 새로운 밴드를 보여주고, 이것은 MASP-2가 NP2에 직접 결합하고 C4를 절단하는 것을 나타낸다. 레인 3은 NP2 플러스 rMASP-2 플러스 C4 플러스 HG4(0.1 μM)를 함유하며, MASP-2 억제 항체 HG4의 첨가가 NP2/MASP-2 매개 C4 절단을 억제하였음을 보여준다. 레인 4는 NP2 플러스 C4를 함유하며 MASP-2의 부재 시 C4 절단이 없음을 나타낸다. 레인 5는 BSA 플러스 MASP-2 플러스 C4를 함유하며 NP2의 부재 시 C4 절단이 없음을 보여준다.
논의
이 실시예는 SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP2)이 MASP-2에 결합하여 보체 C4를 활성화하고 대표적인 MASP-2 억제 항체 HG4가 이 활성화를 억제하는 것을 입증하며, MASP-2 매개 렉틴 경로가 SARS-Cov-2로의 감염 후에 활성화되는 것을 추가로 확인시켜준다.
실시예 24
건강한 지원자와 비교하여 급성 COVID-19 환자에서 보체 활성화를 측정하기 위한 종단 연구
배경/근거:
코로나바이러스의 신규 스트레인인 SARS-CoV-2로의 감염은 대개 증상 없이 또는 경미한 질환 악화로 지나간다. 그러나, 감염된 사람들의 소수에서, SARS-CoV-2는 중증 내지 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있고, 경증부터 중증의 장기 이병률 및 사망률을 보일 수 있다. 중증 악화에 대한 민감성을 결정하는 것은 완전히 이해되지 않았으며, 동반질환 외에도 유전적 요인, 후성유전적 현상, 및 연령 및 성별 차이가 중증 또는 치명적인 병리학이 발생할 위험에 영향을 미칠 수 있는 것으로 간주된다. 본원에서 제공되고 문헌[Rambaldi A. et al., Immunobiology 225(6):152001, 2020] 및 다른 곳에서 보고된 실험적 증거는 보체 시스템이 급성 COVID-19의 내피 병리학의 개시 및 유지 둘 다에서 염증 반응의 핵심 구동요인인 것을 분명하게 해준다. 본원의 실시예 21 및 22 및 문헌[Rambaldi A. et al., Immunobiology 225(6):152001, 2020]에서 기술되는 것과 같이, 중증의 COVID-19 환자의 MASP-2 억제 항체인 나르소플리맙으로의 치료로, 주입 후 질환 징후의 신속한 개선이 있는 치료적 돌파구를 달성하였다. 나르소플리맙의 치료적 효능과 일치하는 실시예 23에서 추가로 기술되는 것과 같이, SARS-Cov-2 뉴클레오캡시드 단백질(NP2)은 MASP-2에 직접 결합하여 MASP-2 항체 HG4에 의해 차단되는 C4 절단을 초래하는 것이 입증되었다.
이 실시예에서, 3개의 보체 활성화 경로 각각에 대한 추가 연구를 COVID-19의 정의된 단계 및 중증도의 기증자에서 조사하여 치료를 위한 치료적 기회의 창을 확인할뿐만 아니라 추가로 급성 COVID-19를 유발하는 분자 사건에 대한 더 깊은 통찰을 위해 급성 COVID-19에 대한 임상적 및 예후적 마커를 확인하였다. 결과는 또한 질환 중증도 및 장기 COVID-19 증후군의 바람직하지 못한 결과로 이어지는 진행 중인 전염증성 사건에 대한 예측성 임상 마커를 전달할 수 있다.
방법:
이 실시예는 다음과 같이 다양한 범주의 기증자로부터 종단 혈장 및 혈청 샘플을 채취한 다양한 범주의 대상체에서 보체 활성화를 측정하기 위해 진행된 연구의 초기 결과를 기술한다:
범주:
(1) 급성 또는 급성 COVID-19 이후(또는 장기 COVID-19로도 언급됨)를 가진 기증자,
급성 환자: 병원 입원 후 15일 이내(0-4일; 5-10일 및 11-15일)에 취한 COVID-19 환자로부터의 샘플.
회복된/회복기 환자: 급성 COVID-19로부터 회복 후 3개월된 대상체(즉, 급성 COVID에 생존하였고 병원에서 퇴원한 환자).
(2) SARS-CoV-2에 대해 양성으로 테스트되고 무증상이거나 경미한 증상이 있지만 입원을 필요로 하지 않는 기증자.
(3) 감염되지 않은 의료 종사자(HCW)(즉 SARS-CoV-2에 대해 혈청 음성)
보체 검정(CH50, C5a, Bb)
보체 활성화는 대체 경로 활성화의 마커인 인자 Bb와 함께 전염증성 아나필라톡신 C5a의 방출을 초래하며, 그것을 아래에 기술된 것과 같이 대상체의 다양한 집단에서 측정하였다.
CH50 검정
CH50 검정은 항-양 적혈구 항체로 코팅된 양 적혈구의 총 보체 용혈을 측정한다.
도 56은 종단 연구에서 대상체의 다양한 집단으로부터 얻어진 CH50 값을 그래프로 도시하며, 그래프 상의 각각의 "x" 기호는 개별 대상체를 나타낸다.
도 56에서 나타낸 것과 같이, 회복기 환자(병원에서 퇴원 후 2-3개월); SARS-Cov-2 양성 직원; 및 혈청 음성 직원(즉, SARS-Cov-2 음성)으로부터의 CH50 값에 비교된 병원 입원 후 0-4일; 병원 입원 후 5-10일 후; 및 병원 입원 후 11-15일 후의 급성 COVID-19 환자에서 매우 낮은 CH50 값에 의해 증명되는 바, 총 보체 용혈은 SARS-CoV-2 감염에서 초기에 보체의 소비에 의해 손상된다. 도 56에서 추가로 나타낸 것과 같이, 대부분의 회복기 환자는 정상 범위로 되돌아간 CH50 값의 증가를 보인다.
C5a 검정
C5a 검정은 3개의 모든 보체 경로 사이에서 공유된 전염증성 보체 활성화 생성물 C5a를 측정한다. 검정은 R&D systems로부터 상업적으로 이용 가능한 샌드위치 ELISA(cat #DY2037)이다.
도 57은 종단 연구에서 대상체의 다양한 집단으로부터 얻어진 혈장 샘플에서 C5a 수준(mg/ml)을 그래프로 도시하며, 그래프 상의 각각의 "x" 기호는 개별 대상체를 나타낸다.
도 57에서 나타낸 것과 같이, 병원 입원 후 0-4일 후(n=16명); 병원 입원 후 5-10일 후(n=12명) 및 병원 입원 후 11-15일 후(n=12명)의 급성 COVID-19 환자로부터 얻어진 혈장의 C5a 수준은 회복기 환자(n=36명), 혈청 양성 직원(n=30명) 및 혈청 음성 직원(n=26명)으로부터 얻어진 혈장의 C5a 수준보다 상당히 더 높다.
Bb 검정
대체 경로(AP)의 활성화 상태를 AP의 Bb 활성화 생성물의 네오에피토프를 검출하는 상업적으로 이용 가능한 샌드위치 ELISA를 사용하여 검출하였다(Quidel MicroVue Bb 플러스 EIA).
도 58은 종단 연구에서 대상체의 다양한 집단으로부터 얻어진 혈장 중의 Bb 수준(μg/mL)을 그래프로 도시하며, 그래프 상의 각각의 "x" 기호는 개별 대상체를 나타낸다.
도 58에서 나타낸 것과 같이, 병원 입원 후 0-4일 후; 병원 입원 후 5-10일 후(n=12명) 및 병원 입원 후 11-15일 후(n=12명)의 급성 COVID-19 환자로부터 얻어진 혈장의 Bb 수준은 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원으로부터 얻어진 혈장의 Bb 수준보다 상당히 더 높다. 도 58에서 추가로 나타낸 것과 같이, 회복된 환자의 Bb 수준은 정상적인 건강한 대조군(혈청 음성 직원)의 범위 내에 있다.
결과:
도 56, 57 및 58에서 나타낸 것과 같이, 보체 활성화는 회복기 환자 및 건강한 대조군과 비교하여 병원 입원 후 15일 이내의 급성 환자에서의 낮은 CH50(도 56), 높은 C5a 수준(도 57) 및 높은 Bb 수준(도 58)에 의해 증명되는 바, 급성 COVID-19를 앓고 있는 대상체에서 초기에 발생한다. AP는 병원 입원 후 15일 이내에 급성 환자에서 매우 높은 Bb 수준에 의해 증명되는 바와 같이, 감염 초기에 활성화되고 회복 후 정상 수준으로 복귀되는 것이 추가로 입증된다(도 58 참고).
실시예 25
C1-INH/MASP-2 복합체의 높은 수준은 급성 COVID-19와 상관이 있다
배경/근거:
SARS-Cov2는 중증의 내피 질환과 호흡기 증후군을 가진 사람에서 매우 높은 감염력 및 사망 위험을 가진 신흥 바이러스이다. 이 질환에 대해 사람들을 보호하는 성공률을 최대화하기 위하여, 급성 및/또는 장기 질환(급성 COVID-19 이후, 달리 장기 COVID-19 증후군으로도 알려져 있음)의 발병 위험이 있거나, 또는 COVID-19 질환 반응에 대비한 보호 면역 반응이 발생한 사람들을 확인하기 위한 바이오마커 및 고도로 정확한 테스트에 대한 긴박한 필요가 있다. 또한 장기 COVID-19을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 사람들을 포함하여, COVID-19 관련 합병증을 치료 및/또는 예방하기 위한 치료제의 효능을 결정하기 위한 테스트에 대한 필요가 있다.
실시예 24에서 기술된 것과 같이, 보체 활성화는 건강한 대조군과 비교하여 병원 입원 후 14일 이내의 급성 환자에서의 낮은 CH50(도 56), 높은 C5a 수준(도 57) 및 높은 Bb 수준(도 58)에 의해 증명되는 바, 급성 COVID-19를 앓고 있는 대상체에서 초기에 발생한다. 대체 경로(AP)는 병원 입원 후 15일 이내에 급성 COVID-19 환자에서 매우 높은 Bb 수준에 의해 증명되는 바와 같이, 감염 초기에 활성화되고 회복 후 정상 수준으로 복귀되는 것이 추가로 입증되었다(도 58 참고).
이 실시예는 인간 혈청 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 검출할 수 있는 민감한 샌드위치 ELISA 검정의 개발을 기술한다. 이 실시예는 다양한 그룹의 대상체(즉, 급성 COVID-19, 회복기 환자 및 건강한 대조군 대상체)에서 이들 대상체로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 유동상 MASP-2/CI-INH 복합체의 수준을 측정함으로써 렉틴 경로(LP)의 활성화 상태를 묻기 위해 이 민감한 샌드위치 ELISA 검정의 사용을 추가로 기술한다.
방법:
1. MASP-2/C1-INH 복합체 ELISA 검정
MASP-2는 여러 렉틴 경로(LP) 패턴 인식 분자 중 하나와 관련된 자이모겐으로서 혈장에서 발견된다. 자이모겐 형태는 세린 프로테아제 억제제, C1-INH에 느슨하게 결합되어 있다. 충분한 LP 인식 분자가 활성화 표면 상에서 근접하게 결합할 때, 자이모겐 MASP-2는 MASP-2의 또 다른 분자에 의해, 또는 MASP-1에 의해 2개의 이황화 연결 사슬로 절단된다. 절단된 MASP-2는 효소의 활성 형태이며, 그것의 기질인 하류 보체 구성요소 C4 및 C2를 절단한다. MASP-2의 활성은 활성화된 MASP-2에 단단하게 결합하여 안정적인 1:1 복합체를 형성하는 C1-INH에 의해 조절된다.
LP 이펙터 효소 MASP-2의 활성화 상태를 결정하기 위하여, MASP-2가 활성화된 후, C1 억제제(C1-INH)가 유사 기질로서 작용하여 공유 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체를 형성한다는 사실의 장점을 취하는 특징을 활용하였다. 그러므로, 혈장 또는 혈청의 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 최근의 LP 활성화의 분명한 측정을 제공한다.
인간 MASP-2 단백질(성숙한 형태)은 서열 번호:6으로서 제시된다.
인간 C1 에스테라제 억제제(C1-INH), Genbank CAA38358을 아래에서 서열 번호:86으로서 제시한다(aa 1-21 신호 펩타이드, 성숙한 단백질 aa 22-500)
Kajdacsi 등은 문헌[Front Immunol vol 11, 2020]에서 건강한 인간 및 유전성 혈관부종(HAE) 환자에서 10% 혈청 농도에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하기 위한 포획 항체로서 Hycult Biotech(mAb 8B5)로부터의 항-인간 MASP-2 단클론성 래트 IgG1을 사용하였다. Hansen 등은 문헌[J of Immunol 195:3596-3604, 2015]에서 또한 HAE 환자에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하기 위한 ELISA 검정에 Hycult Biotech(mAb 8B5)로부터의 항-인간 MASP-2 단클론성 래트 IgG1을 사용하였다. Hansen 등은 MASP-1/C1-INH 복합체에 비교하여 MASP-2/C1-INH 복합체가 매우 높은 인간 혈청 농도(20%이상)로만 검출된 것을 관찰하였고 이것이 MASP-1과 비교하여 MASP-2의 훨씬 더 낮은 혈청 농도로 인한 것이거나 상업적으로 이용 가능한 MASP-2 mAb8B5가 그들의 연구에서 사용된 MASP-1 mAb와 비교하여 검정 Ab로서 덜 적용될 수 있다는 사실에 기인한 것으로 여겼다(Hansen et al. page 3602-3603, 연결 단락 참고).
MASP-2/C1-INH 복합체의 존재 및/또는 양에 대해 10% 미만의 혈청 농도(즉, 0.3% 내지 8% 혈청, 예컨대 0.3% 내지 7% 혈청, 예컨대 0.3% 내지 6% 혈청, 예컨대 0.3% 내지 5% 혈청)에서 개별 환자 샘플을 스크리닝하기에 적합한 민감성 ELISA 검정을 개발하기 위하여, MASP-2에 결합하는 것으로 알려져 있는 단클론성 항체(클론 C1, C7, D8 및 H1)의 패널을 포획 항체로서 테스트하였다. 이들 mAb(클론 C1, C7, D8 및 H1)는 면역화된 MASP-2 KO 마우스로부터 얻어진 하이브리도마로부터 생성되었고 MASP-2에 결합하지만 MASP-2 기능적 활성을 억제할 수는 없는 것으로 나타났다(데이터 미제시).
항-MASP-2 mAb: C1, C7, D8, H1을 ELISA 검정 형식에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하기 위한 후보 포획 항체로서 다음과 같이 테스트하였다.
(i). Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트를 탄산염 완충액(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 중의 100 μl의 항-MASP-2 후보 포획 Ab 클론 #C1, #C7, #D8 및 #H1(2 μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 미세역가 플레이트를 TBS 완충액 중의 280 μl/웰의 1%(중량/부피) BSA로 1시간 동안 실온에서 차단하였다.
(ii) 모아진 정상 인간 혈청(NHS)을 5 mM Ca2+가 포함된 Tris 완충 식염수(TBS; 10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, pH 7.4) 중에 20% 부피/부피로 희석함으로써 활성화된 대조군 혈청을 제조하였다. 만난-아가로스(100 uL, Sigma cat. M9917)를 5 부피의 TBS/Ca2+로 2회 세척하고, 동일한 완충액에 100 μl로 재현탁하였다. 500 μl의 20% 혈청을 100 μl의 만난-아가로스에 첨가하고 실온(RT)에서 부드럽게 흔들어주면서 또는 회전시키면서 30분 동안 인쿠베이션하였다. 그런 후 EDTA를 10 nM의 최종 농도로 첨가하고 추가로 2분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 아가로스를 회전시키고 활성화된 혈청을 흡인하여 -20℃에서 보관하였다.
(iii) 연속 희석을 0.1% 내지 20%의 범위의 활성화된 대조군 혈청으로부터 TBS/Ca2+로 제조하였다. 차단 완충액을 버리고 100 ul/웰의 샘플 또는 대조군 혈청을 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 후 플레이트를 280 μl의 TBS/Ca2+/0.05% Tween 20(세척 완충액)으로 3회 세척하였다.
(iv) 100 μl/웰의 항-C1-INH 검출 Ab(친화성 정제된 토끼 다클론성 항-C1-INH,　Proteintech cat. 12259-1-AP, TBS/Ca2+에 1:2000으로 희석됨)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
(v) 그런 후 플레이트를 위에서 기술한 것과 같이 3회 세척하였다. 100 μl/웰 항-토끼 HRP(Sigma, 1:5000)를 첨가하고 추가로 45분 동안 인큐베이션하였다.
(vi) 그런 후 플레이트를 위에서 기술한 것과 같이 3회 세척하고 100 μl/웰 TMB 기질을 첨가하였다. 청색이 나타났을 때, 50 μl/웰 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 중단하고 OD450nm에서 측정하였다.
결과:
도 59는 OD450 값을 토대로 한, 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 그래프로 도시하며, 활성화된 혈청의 다양한 농도에서 4개 후보 항-MASP-2 mAb(클론 C1, C7, D8 및 H1)의 각각이 도시된다. 정상적인, 비활성화된 혈청 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 양이 기준선이 될 것임에 유의한다(데이터 미제시).
도 59에서 나타낸 것과 같이, mAb #C7이 ELISA 검정으로 MASP-2/C1-INH에 대해 포획 항체로서 사용하기 위해 테스트된 다른 항-MASP-2 항체보다 훨씬 우수하였다. 도 59에서 나타낸 것과 같이, mAb #7은 활성화된 인간 혈청에서 5% 미만(즉, 0.3% 내지 5%)의 희석 범위에서 MASP-2/CI-INH 복합체를 검출할 수 있었다. Hycult로부터 상업적으로 이용 가능한 항체(클론 8B5 및 클론 6G12)를 또한 이 검정 형식에서 후보 포획 항체로서 테스트하였고 그 결과는 mAb C1 및 D8와 유사하였음(즉, 민감성 ELISA 검정에서 사용할 수 없음)에 유의한다. mAb#C7을 고도의 민감성 ELISA 검정에 사용하기 위해 선택하였고 아래에서 기술한다.
항-MASP-2 mAb #C7:(Kabat 넘버링 시스템을 토대로 한 CDR은 밑줄로 표시됨)
중쇄 가변 영역: (서열 번호:87)
경쇄 가변 영역: (서열 번호:88)
항-MASP-2 mAb #C7 CDR
HC-CDR1(서열 번호:89): SYLMS
HC-CDR2(서열 번호:90): TISGGGGNTYHPDSMKG
HC-CDR3(서열 번호:91): HGDFGNYFDY
LC-CDR1(서열 번호:92): KSSQSLLNSGTQKNYLA
LC-CDR2(서열 번호:93): WASTRES
LC-CDR3(서열 번호:94): KQSYNLFT
#C7_VH(서열 번호:95)
#C7_VK(서열 번호:96)
2. 종단 COVID-19 연구에서 대상체로부터 얻어진 혈청 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 측정
대상체: 실시예 24에서 기술된 것과 같이, 다음과 같이 다양한 범주의 기증자로부터 종단 혈장 및 혈청 샘플을 채취한 다양한 범주의 대상체에서 보체 활성화를 측정하기 위한 연구가 진행 중이다:
범주:
(1) 급성 또는 급성 COVID-19 이후(또는 장기 COVID-19로도 언급됨)를 가진 기증자,
급성 환자: 병원 입원 후 15일 이내(0-4일; 5-10일 및 11-15일)에 취한 COVID-19 환자로부터의 샘플.
회복된/회복기 환자: 급성 COVID-19로부터 회복 후 3개월된 대상체(즉, 급성 COVID에 생존하였고 병원에서 퇴원한 환자).
(2) SARS-CoV-2에 대해 양성으로 테스트되고 무증상이거나 경미한 증상이 있지만 입원을 필요로 하지 않는 기증자.
(3) 감염되지 않은 의료 종사자(HCW)(즉 SARS-CoV-2에 대해 혈청 음성)
아래에서 기술된 검정은 위에서 기술된 항-MASP-2 mAb #C7을 사용하며, 그것을 인간 혈청 또는 혈장으로부터 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획하기 위하여 미세역가 플레이트 상에 고정시키고, 포획된 복합체를 검출하기 위해 항-C1-INH 항체를 고정시켰다. 이 검정에 대한 양성 대조군을, 정상 인간 혈청(NHS)을 LP를 만난-아가로스와 함께 인큐베이션하고, LP를 인공적으로 활성화하고 MASP-2/C1-INH를 샘플로 방출시킴으로써 제조할 수 있다. 양성 대조군의 연속 희석을 ELISA 검정에 대한 교정기/참조 표준으로서 사용할 수 있다. 또한 예를 들어, MASP-2가 활성화되는 것으로 알려져 있는 COVID-19 환자 모음 또는 다른 환자 그룹으로부터 자연적으로 활성화된 혈청을 교정기/참조 표준으로서 사용하는 것도 가능하다.
방법:
(i). Nunc Maxisorb 미세역가 플레이트를 탄산염 완충액(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 중의 100 μl의 항-MASP-2 포획 Ab 클론 #C7(2 μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 미세역가 플레이트를 TBS 완충액 중의 280 μl/웰의 1%(중량/부피) BSA로 1시간 동안 실온에서 차단하였다.
(ii) 모아진 정상 인간 혈청(NHS)을 5 mM Ca2+가 포함된 Tris 완충 식염수(TBS; 10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, pH 7.4) 중에 20% 부피/부피로 희석함으로써 활성화된 대조군 혈청을 제조하였다. 만난-아가로스(100 uL, Sigma cat. M9917)를 5 부피의 TBS/Ca2+로 2회 세척하고, 동일한 완충액에 100 μl로 재현탁하였다. 500 μl의 20% 혈청을 100 μl의 만난-아가로스에 첨가하고 실온(RT)에서 부드럽게 흔들어주면서 또는 회전시키면서 30분 동안 인쿠베이션하였다. 그런 후 EDTA를 10 nM의 최종 농도로 첨가하고 추가로 2분 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 아가로스를 회전시키고 활성화된 혈청을 흡인하여 -20℃에서 보관하였다.
(iii) 연속 희석을 TBS/Ca2+ 중의 활성화된 대조군 혈청(20%에서 시작함) 및 샘플 혈청(5%)으로부터 제조하였다. 차단 완충액을 버리고 100 ul/웰의 샘플 또는 대조군 혈청을 플레이트에 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 후 플레이트를 280 μl의 TBS/Ca2+/0.05% Tween 20(세척 완충액)으로 3회 세척하였다.
(iv) 100 μl/웰의 항-C1-INH 검출 Ab(친화성 정제된 토끼 다클론성 항-C1-INH,　Proteintech cat. 12259-1-AP, TBS/Ca2+에 1:2000으로 희석됨)를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
(v) 그런 후 플레이트를 위에서 기술한 것과 같이 3회 세척하였다. 100 μl/웰 항-토끼 HRP(Sigma, 1:5000)를 첨가하고 추가로 45분 동안 인큐베이션하였다.
(vi) 그런 후 플레이트를 위에서 기술한 것과 같이 3회 세척하고 100 μl/웰 TMB 기질을 첨가하였다. 청색이 나타났을 때, 50 μl/웰 2 N H2SO4를 첨가하여 반응을 중단하고 OD450nm에서 측정하였다.
결과:
도 60은 급성 COVID 환자(입원 후 14일 미만의 3명의 환자로부터의 16개 샘플), 회복기 환자(n=15명), 혈청 양성 직원(n=15명) 및 혈청 음성 직원(n=34명)으로부터의 5% 혈청에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하는 ELISA 검정의 결과를 그래프로 도시한다. 결과는 인공적으로 활성화된 대조군 혈청에서 볼 수 있는 백분율로서, MASP-2/Cl-INH 복합체의 양으로서 측정된 렉틴 경로의 활성화를 보여준다. 도 60에서 나타낸 것과 같이, 상당히 더 높은 양의 MASP-2/C1-INH 복합체(2-3배 더 높음)를 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원과 비교하여 급성 COVID-19 환자(병원 입원 후 14일 미만)의 혈청에서 관찰하였다(p<0.0001, Dunnett의 사후 검정을 사용한 분산분석).
도 61은 병원에 입원했을 때 및 입원 후 최대 14일이 경과한 시점에서 3명의 급성 COVID-19 환자(#2, #3 및 #4)에 존재하는 MASP-2/C1-INH 복합체의 양을 그래프로 도시한다. 그래프 하단의 적색 선은 모아진 정상 혈청 음성 의료 종사자에서 검출된 MASP-2/C1-INH의 양을 나타낸다.
위에서 기술된 것과 같이, 렉틴 경로(LP)의 활성화는 유동상 MASP-2/C1-INH 복합체의 생성으로 이어진다. 도 60 및 61에서 나타낸 것과 같이, 급성 COVID-19 환자에서 LP 활성화는 병원에 입원한 후 14-15일까지 높게 유지된다.
실시예 26
MASP-2/C1-INH 및 C1s/C1-INH 복합체를 측정하기 위한 비드기반 면역검정
배경/근거:
보체 시스템 세린 프로테아제 C1s 및 만난 결합 렉틴 회합 세린 프로테아제-2(MASP-2)는 자이모겐으로서 혈장에서 순환한다. C1s는 또 다른 세린 프로테아제, C1r, 및 인식 구성요소 C1q와 함께 고전적 경로(CP) C1 복합체의 일부분이다. MASP-2는 여러 렉틴 경로(LP) 패턴 인식 분자 중 하나와 회합된다. 두 경우에 모두, 다이모겐 형태는 세린 프로테아제 억제제, C1-INH에 느슨하게 결합된다. CP 또는 LP가 활성화될 때, 자이모겐은 2개의 이황화 결합 사슬로 절단된다. 절단된 C1s 및 MASP-2는 효소의 활성 형태로, 하류 보체 구성요소 C4 및 C2를 절단한다. 활성화된 MASP-2 및 C1s는 세린 프로테아제와 안정적인 1:1 복합체를 형성하는 C1-INH에 의해 조절된다. 그러므로, 샘플 중의 C1s/C1-INH 복합체 및 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 각각 최근 CP 또는 LP 활성화의 분명한 척도를 제공한다.
실시예 25에서 기술된 것과 같이, 급성 COVID 환자, 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원으로부터의 5% 혈청에서 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 측정한 ELISA 검정에서, 상당히 더 높은 양의 MASP-2/C1-INH 복합체(2-3배 더 높음)가 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원과 비교하여 급성 COVID-19 환자(병원 입원 후 14일 미만)의 혈청에서 관찰된 것으로 결정되었다(p<0.0001, Dunnett의 사후 검정을 사용한 분산분석).
이 실시예는 MASP-2/C1-INH 복합체 및 C1s/C1-INH 복합체의 존재 및/또는 양에 대해 10% 미만(즉, 1% 내지 5%)의 혈청 농도에서 개별 환자 샘플을 스크리닝하기에 적합한 민감성 검정의 개발을 기술하며, 그것은 Luminex 플랫폼을 사용하여 샌드위치 검정을 비드 기반 형광 형식으로 이동하고 다중화하는 것을 포함하였다.
방법:
이 실시예는 Luminex xMAP(다중 분석물 프로파일링) 기술을 사용하여 수행된 고처리량 비드 기반 면역형광 검정을 사용하여 급성 COVID-19 환자, 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원으로부터의 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준의 추가의 분석 및 또한 C1s/C1-INH 복합체 수준의 분석을 제공한다.
MASP-2/C1-INH 및 C1s/C1-INH 복합체에 대한 Luminex 검정
본원에서 기술되는 것과 같이, MASP-2/C1-INH 및 C1s/C1-INH 복합체는 각각 렉틴 및 고전적 경로의 활성화의 특정 바이오마커이다. 이들 바이오마커를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 포획 항체(비드에 결합됨)가 세린 프로테아제에 대해 지시되고, 검출 항체가 C1-INH에 대해 지시되는 멀티플렉스 비드 기반 형광 샌드위치 검정을 고안하였다.
도 62에서 도시된 것과 같이, 멀티플렉스 비드 기반 면역형광 검정은 폴리스티렌 미소구체, 또는 자성 폴리스티렌 미소구체(즉, 비드) 상에 고정된 항-C1s 항체 또는 항-MASP-2 항체를 사용하여, 인간 혈청 또는 혈장으로부터 세린 프로테아제/C1-INH 복합체(즉, 분석물)를 포획하고, 검출 항체로서 항-C1-INH 항체가 포획된 복합체를 검출하기 위해 고정된다.
이 실시예에서 기술된 검정이 Luminex xMAP(다중 분석물 프로파일링) 기술을 토대로 한 것이지만, 기술분야에 숙련된 사람들에게는 대체 비드 기반 면역형광 검정이 청구된 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
비드 기반 검정은 한 세트의 형광 비드를 항-MASP-2 단클론성 항체(mAb)로 코팅하고, 상이한 형광 스펙트럼을 가진 또 다른 것은 항-C1s 단클론성 항체(mAb)로 코팅함으로써 멀티플렉스화될 수 있다.
MASP-2/C1-INH 복합체에 대한 양성 대조군 참조 표준을, 포획 항체로서 mAb C8 항-MASP-2로 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출하는 도 63에서 제시된 표준 곡선에서 나타낸 것과 같이, 급성 COVID-19 환자로부터 모아진 표준 혈청 또는 혈장을 사용하여 제조하였다. 도 63에서 나타낸 것과 같이, 비드 기반 검정은 급성 COVID-19 환자로부터의 10% 미만의 혈장 또는 혈청(즉, 0.1% 내지 10% 혈장 또는 혈청, 예컨대 0.5% 내지 8%, 또는 0.5% 내지 7.5%, 예컨대 1% 내지 5% 혈청 또는 혈장)에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 검출할 수 있다.
대안적으로, MASP-2/C1-INH 복합체에 대한 양성 대조군을, 정상 인간 혈청(NHS)을 만난-아가로스와 함께 인큐베이션하고, 렉틴 경로(LP)를 인공적으로 활성화하고 MASP-2/C1-INH 복합체를 샘플로 방출시킴으로써 제조할 수 있다. 마찬가지로, C1s/C1-INH 복합체에 대한 양성 대조군을, 정상 인간 혈청을 면역 복합체와 함께 인큐베이션하고, CP를 인공적으로 활성화하고 C1s/C1-INH 복합체를 샘플로 방출시킴으로써 제조할 수 있다. 양성 대조군의 연속 희석을 교정기로서 사용할 수 있다.
또 다른 대안으로서, 표준 및 양성 대조군을, 재조합 C1-INH와 재조합 C1s 또는 재조합 MASP-2를 화학양론적 양으로 혼합하고, 결과적으로 생성된 C1s/C1-INH 또는 MASP-2/C1-INH 복합체를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제하고 그것을 겔 전기용동 및/또는 브래드포드(Bradford) 검정 또는 실시예 27에서 추가로 기술되는 것과 같이 280 nm에서의 광학 흡광도의 측정에 의해 정량화함으로써 제조할 수 있다.
비드 기반 검정 방법 :
항체 코팅 자성 비드 : MASP-2 및 C1s에 결합하는 것으로 알려져 있는 단클론성 항체의 패널을 포획 항체로서 테스트하였다. 항체를 인산염 완충 식염수(PBS)에 50 μg/ml로 희석하고, Luminex(xMAP) Cookbook(4차 편집)에서 기술된 것과 같이, 카르보다이이미드 커플링에 의해 MagPlex 자성 폴리스티렌 미소구체(Luminex) 상에, xMAP 항체 커플링 키트를 사용하여 고정시켰다. 커플링 후에, 비드 상의 임의의 남아 있는 반응성 부위를 0.05% TWEEN 20, pH 7.4를 함유한 PBS(PBS TBN)와의 인큐베이션에 의해 차단하였다. BSA 코팅 비드를 음성 대조군으로서 준비하였다. 상이한 방출 스펙트럼을 가진 MagPlex 비드를 항-C1s, 항-MASP-2 및 BSA 코팅 비드에 대해 사용하여, 검정이 멀티플렉스화되도록 하였다.
검정 과정: 항체 및 BSA 커플링된 MagPlex 비드를 PBS-TBN 검정 완충액에 50 미소구체/μL의 각 유형의 비드의 최종 농도로 희석하였다. 50 μL의 이 혼합물을 96 웰 플레이트의 각 웰로 분취하였다. PBS-TBN에 희석된 동일한 부피의 혈장 또는 혈청을 각 웰에 첨가하고, 혼합하고 실온에서 30분 동안 쉐이커 상에서 인큐베이션하였다. 비드를 자성 분리기와 함께 보유하고, 상층액을 흡인하고 100 μL의 새로운 PBS-TBN 검정 완충액을 첨가함으로써 검정 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 비드를 50 μL의 검정 완충액에 재현탁하고 결합된 리간드를 PBS-TBN 검정 완충액에 1:1000으로 희석된 비오티닐화된 항-C1-INH 다클론성 항체(R&D Systems, BAF2488)를 첨가함으로써 검출하였다. 비드를 검출 항체와 함께 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후에, 위에서 기술한 것과 같이 3회 세척하였다. 스트렙트아비딘 R-피코에리트린(SAPE; Thermo Fisher Scientific)을 검정 완충액에 1 μg/mL로 희석하고, 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 혼합하여 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 위에서와 같이 세척한 후에, 50-75 μL의 각 반응을 Luminex 분석기 상에서 시스템 매뉴얼에 따라 분석하였다.
항체 선택 : 포획 및 검출 항체의 쌍을 테스트하기 위해 설계한 예비 실험에서, 본 발명자들은 정상 인간 혈청을 만난-아가로스와 함께 인큐베이션하고, LP를 인공적으로 활성화하고 MASP-2/C1-INH 복합체를 샘플로 방출시킴으로써 MASP-2/C1-INH 검정을 위한 대조군 혈청을 준비하였다. 마찬가지로, C1s/C1-INH 복합체에 대한 양성 대조군을, 정상 인간 혈청을 양 항-HSA와 함께 인큐베이션하고, CP를 인공적으로 활성화하기 위하여 면역 복합체를 제자리 생성시키고 C1s/C1-INH를 샘플로 방출시킴으로써 제조하였다. 1:10 내지 1:1280 범위의 이들 혈청의 연속 희석을 위에서 기술된 것과 같이 검정하였다. 대조군은: 비활성화된 NHS, BSA 코팅 비드, 혈청 없는(완충액 단독) 반응, 및 검출 항체가 생략된 혼합물이었다. 다음의 mAb가 포획 Ab로서 작용하는 것으로 나타났다.
- 항-MASP-2 인간화된 마우스 mAb #C8
- 항-C1s 친화성 정제된 다클론성, Proteintech(14554-1-AP)
이들 포획 항체는 1:10으로부터 1:640까지의 샘플 희석에서 샘플 농도와 형광 강도 사이에 간단한 로그/선형 관계를 제공하였고, 신호는 1:1280에서 배경 수준으로 떨어졌다. 이전에 샌드위치 ELISA에서 성공적으로 사용한 항-MASP-2 mAb 클론 8B5(Hycult Biotech)은 Luminex 검정에서는 좋지 못한 민감도 및 낮은 신호 대 잡음 비율로 제대로 수행되지 못하였다.
예시의 검정 프로토콜
(i) 250 μL의 폴리스티렌, 또는 자성 폴리스티렌, 마이크로비드(예컨대, Magplex 비드)를 250 μL의 인산염 완충 식염수 중의 12.5 μg의 포획 항체로, xMAP 항체 커플링 키트를 제조사의 설명(Luminex(xMAP) 4차 편집본 참고)을 따라 사용하여 코팅한다. 다음의 단클론성 항체가 포획 항체로서 작용하는 것으로 나타났다.
- 항-MASP-2 포획 Ab 클론 #C8
- 항-C1s 친화성 정제된 다클론성, cat 번호 14554-1-AP, Proteintech
포획 항체는 각 항체에 대해 하나씩 별도의 비드 세트에 결합되어야 한다.
(ii) 활성화된 대조군 혈청을 제조하기 위하여, 모아진 정상 인간 혈청을 20% 부피/부피 5 mM Ca2+가 포함된 Tris 완충 식염수(TBS; 10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, pH 7.4)로 희석한다. 100 μl의 만난-아가로스(Sigma cat. M9917)를 5배 부피의 TBS/Ca2+로 2회 세척하고 100 μl의 동일한 완충액에 재현탁한다. 500 μL의 20% 혈청을 100 μL의 만난-아가로스에 첨가하고, 실온(RT)에서 부드럽게 흔들어주면서 30분 동안 인큐베이션한다. EDTA를 10 nM의 최종 농도로 첨가하고 추가로 2분 동안 인큐베이션한 후 아가로스를 회전시켜서 활성화된 혈청을 흡인 제거한다. -20℃에서 보관한다.
(iii) 적절한 항체 커플링된 미소구체 세트를 선택하고 다음과 같이 검정을 수행한다:
· 미소구체를 와류 혼합 및 초음파처리에 의해 재현탁한다.
· 작업 미소구체 혼합물을 커플링된 미소구체 스톡을 각 세트의 50 미소구체/μL 검정 완충액(TBS)의 최종 농도로 희석함으로써 제조한다.
· 50 μL의 작업 미소구체 혼합물을 96 웰 플레이트의 적절한 웰에 분취한다.
· 50 μL의 검정 완충액(TBS)을 각 배경 웰에 첨가한다.
· 50 μL의 표준 또는 샘플을 적절한 웰에 첨가한다.
· 반응을 다중 채널 피펫터로 위아래로 여러 번 피펫팅함으로써 부드럽게 혼합한다.
· 플레이트를 덮고 대략 800 rpm으로 설정된 쉐이커 상에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
· 플레이트를 자성 분리기에 배치하고 30-60초 동안 분리되도록 한다.
· 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
· 플레이트를 다음의 세척 단계를 위해 자성 분리기에 남겨둔다:
o 100 μL의 검정 완충액을 각 웰에 첨가한다.
o 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
· 플레이트를 자성 분리기로부터 제거하고 다중 채널 피펫터를 사용하여 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅함으로써 미소구체를 50 μL의 검정 완충액에 재현탁한다.
· 비오티닐화된 검출 항체를 검정 완충액으로 희석한다. 적합한 항체는 1:1000으로 희석된 R&D system 항-C1-INH 친화성 정제된 다클론성, cat. No BAF2488이다.
· 50 μL의 희석된 검출 항체를 각 웰에 첨가한다.
· 반응을 다중 채널 피펫터로 위아래로 여러 번 피펫팅함으로써 부드럽게 혼합한다.
· 플레이트를 덮고 대략 800 rpm으로 설정된 쉐이커 상에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
· 플레이트를 자성 분리기에 배치하고 30-60초 동안 분리되도록 한다.
· 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
· 플레이트를 다음의 세척 단계를 위해 자성 분리기에 남겨둔다:
o 100 μL의 검정 완충액을 각 웰에 첨가한다.
o 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
· 플레이트를 자성 분리기로부터 제거하고 다중 채널 피펫터를 사용하여 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅함으로써 미소구체를 50 μL의 검정 완충액에 재현탁한다.
· 스트렙트아비딘, R-피코에리트린 콘쥬게이트(SAPE) 리포터를 검정 완충액에 1 μg/mL로 희석한다.
· 50 μL의 희석된 SAPE를 각 웰에 첨가한다.
· 반응을 다중 채널 피펫터로 위아래로 여러 번 피펫팅함으로써 부드럽게 혼합한다.
· 플레이트를 덮고 대략 800 rpm으로 설정된 플레이트 쉐이커 상에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
· 플레이트를 자성 분리기에 배치하고 30-60초 동안 분리되도록 한다.
· 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
· 플레이트를 다음의 세척 단계를 위해 자성 분리기에 남겨둔다:
o 100 μL의 검정 완충액을 각 웰에 첨가한다.
o 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
· 플레이트를 자성 분리기로부터 제거하고 다중 채널 피펫터로 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅함으로써 미소구체를 100 μL의 검정 완충액에 재현탁한다.
· 50-75 μL를 Luminex 분석기 상에서 시스템 매뉴얼에 따라 분석한다.
항-MASP-2 mAb #C8
mAb #C8 VH(서열 번호:97)
mAb #C8 VL(서열 번호:98)
결과:
도 63은 BSA 코팅 대조군 비드와 비교된, 포획 항체로서 항-MASP-2 mAb #C8을 사용하는 비드 기반 검정에서 급성 COVID-19 환자로부터의 모아진 인간 혈청에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 검출을 그래프로 도시한다.
실시예 27
참조 표준으로서 사용하기 위한 MASP-2/C1-INH 복합체의 생성 방법
방법:
1. 인간 MASP-2 CCP1/CCP2/SP6His(분자량 43,740)를 C1 에스테라제 억제제(Sigma E0518(인간 혈장으로부터 유래됨) 분자량 105,000과 1:1.5 몰비의 MASP-2:C1 억제제(총 300 μg)로 혼합한다.
2. 에펜도르프 튜브에서 400 rpm에서 60분 동안 37℃에서 진동시킨다.
3. 밤새 냉장한다.
4. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제한다.
피크 1 및 피크 2를 SEC로부터 수집하여 비환원 겔 상에서 대조군 MASP-2 CCP1/CCP2/SP6HIS(분자량 43,740) 및 C1 에스테라제 억제제(분자량 105,000)와 함께 이동시켰다.
결과:
도 64는 재조합 MASP-2/C1-INH 복합체의 SEC 정제 중에 얻어진 6 μg의 샘플이 로딩된 비환원 겔의 사진이다. 사진에서: 레인 1: 피크 1 통과 흐름; 레인 2: 피크 1 농축됨; 레인 3: 피크 2 통과 흐름; 레인 4: 피크 2 농축됨; 레인 5: 미정제 혼합물; 레인 6: MASP-2 CCP1/2/SP(43,740 KD); 레인 7: C1-억제제(100KD).
도 64에서 나타낸 것과 같이, 정제된 MASP-2/C1-INH 복합체는 농축된 피크 1로서 존재한다. 이 재조합 복합체는 실시예 26에서 기술된 것과 같은 비드 기반 검정에서 참조 표준으로서 사용할 수 있다.
실시예 28
MASP-2/C1-INH 및 C1s/CI-INH 복합체의 수준에 대해 테스트된 급성 COVID-19 환자
방법:
실시예 24 및 25에서 기술된 것과 같이, 다양한 범주의 COVID-19 환자 및 건강한 지원자로부터 취한 종단 혈장 및 혈청 샘플에서 보체 활성화를 측정하기 위한 연구가 진행 중이다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 급성 COVID-19 감염은 보체 활성화, 탈보체화 및 보체 활성화 생성물, 예컨대, C5a의 방출로 이어진다.
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 이 진행 중인 종단 연구의 일부로서, 40명의 중증 급성 COVID-19 환자를 MASP-2/C1-INH 복합체 형성 및 C1s/C1-INH 복합체 형성의 생산에 대해 실시예 26에서 기술된 비드 기반 검정을 사용하여 테스트하였다.
이 실시예에서 분석된 40명(40)의 중증 급성 COVID-19 환자를 영국의 로열 팝워스 병원(Royal Papworth Hospital)에서 모집하였다. 이들 환자에 대한 WHO 임상 점수의 범위는 3-7이었고, 그들 중 19명이 체외막 산소 공급(ECMO)을 필요로 하였다. 환자 중 19명이 생존하였고, 퇴원 후 추적 3개월에 대해 소환되었으며; 21명이 질환에 걸렸다. COVID-19에 대해 양성으로 테스트되었지만, 입원은 하지 않은 30명의 정상 의료 종사자(HCW), 및 30명의 미감염 HCW를 대조군으로서 활용하였다.
표시된 시간(제시된 시간은 병원 입원으로부터임)에 다양한 대상체로부터 취한 혈장 샘플을 1:50으로 희석하고 실시예 26에서 기술된 것과 같이 MASP-2/C1-INH 복합체 및 C1s/C1-INH 복합체 수준에 대해 Luminex 검정과 이중의 비드 기반으로 분석하였다.
보체 용혈의 측정(CH50)
양 적혈구(SE)의 항체 구동 보체 용해를 다음과 같이 토끼 항-양 IgG 코팅 SE를 사용하여 측정하였다. 양 적혈구(Oxoid)를 10 mM EDTA를 함유한 GVB 완충액(10 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 0.1% 중량/부피 젤라틴)을 사용하여 3회 세척하였다. RBC의 최종 농도를 1x109/ml로 조정하였다. RBC를 항-양 RBC(Sigma S1389, 1:200으로 희석됨)와 함께 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 30분 동안 인큐베이션함으로써 감작시켰다. 마지막으로, RBC를 2 mM Ca2+ 및 1 mM Mg2+(GVB++)를 함유한 GVB 완충액으로 세척하였다. 혈청 샘플을 96 웰 플레이트에서 100 μl GVB++ 완충액에 연속적으로 희석하고 동일한 부피의 GVB++ 중의 107 RBC를 각 웰에 첨가하였다. 완충액만을 함유한 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다. 완충액/혈장 대신 물을 함유한 웰을 양성 대조군으로서 사용하였다(명목상 100% 용해). 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 원심분리하고, 100 μl의 상층액을 흡인하고 방출된 헤모글로빈을 405 nm에서 OD를 측정함으로써 결정하였다. 용혈 백분율을 계산하고 혈장 희석에 대해 도표화하여 CH50을 결정하였다.
순환 C5a를 R&D systems(Cat. No. DY2037)에 의해 공급된 독점 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다.
결과:
도 65는 본원에 기술된 이중 비드 기반 검정으로 결정된 급성 COVID-19 환자에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 그래프로 도시한다. 도 65에서 나타낸 것과 같이, MASP-2/C1-INH 복합체 수준은 건강한 대조군과 비교하여, 질환의 급성 단계 전반에 상승하였고, 이것은 급성 COVID-19에서의 렉틴 경로 활성화를 나타낸다. 도 65에서 추가로 나타낸 것과 같이, 감소된, 그러나 정상은 아닌 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 병원에서 퇴원 후 3개월 후에 생존자에서 관찰하였다. 대조적으로, 경증 COVID-19 질환을 가진 사람(혈청양성 의료 종사자(HCW))은 MASP-2/C1-INH 수준의 상승을 보이지 않았다. 입원 환자의 경우 N=40명, 비입원 COVID-19 사례의 경우 30명, 건강한 대조군의 경우 30명. 다중 비교를 위해 Dunnett의 수정이 있는 일원분산분석에 의해 분석됨.
도 66은 본원에 기술된 이중 비드 기반 검정으로 결정된 급성 COVID-19 환자에서 C1s/C1-INH 복합체의 수준을 그래프로 도시한다. 도 66에서 나타낸 것과 같이, C1s/C1-INH 복합체 수준은 건강한 대조군과 비교하여, 질환의 급성 단계 전반에 상승하였고, 이것은 급성 COVID-19에서의 고전적 경로 활성화를 나타낸다. 도 66에서 추가로 나타낸 것과 같이, 감소된, 그러나 정상은 아닌 수준의 C1s/C1-INH 복합체를 병원에서 퇴원 후 3개월 후에 생존자에서 관찰하였다. 대조적으로, 경증 COVID-19 질환을 가진 사람(혈청양성 의료 종사자(HCW))은 C1s/C1-INH 수준의 상승을 보이지 않았다. 입원 환자의 경우 N=40명, 비입원 COVID-19 사례의 경우 30명, 건강한 대조군의 경우 30명. 다중 비교를 위해 Dunnett의 수정이 있는 일원분산분석에 의해 분석됨. C1s/C1inh 복합체 수준은 항-COVID-19 항체 역가 및 항체 의존성 보체 침착(ADCD)과 상관이 있음을 유의한다(데이터 미제시).
도 67은 이 실시예에서 기술된 종단 연구에서 급성 COVID-19 환자, 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원의 CH50 값을 그래프로 도시한다. 도 67에서 나타낸 것과 같이, CH50 값은 건강한 대조군과 비교하여 질환의 급성 단계에서 더 낮고, 이것은 보체 소비 및 활성화를 나타낸다.
도 68은 이 실시예에서 기술된 종단 연구에서 급성 COVID-19 환자, 회복기 환자, 혈청 양성 직원 및 혈청 음성 직원의 C5a 값을 그래프로 도시한다. 도 68에서 나타낸 것과 같이, C5a 값은 건강한 대조군과 비교하여 질환의 급성 단계에서 더 높고, 이것은 보체 활성화를 나타낸다.
함께 취하면, 결과는 보체 소비 및 활성화가 항-COVID-19 항체가 없을 때에서 COVID-19의 초기 급성 단계에서 발생하는 것을 입증한다.
도 65 및 66에서 나타낸 것과 같이, MASP-2/C1-INH 복합체 및 C1s/C1-INH 복합체의 수준은 입원한 모든 급성 COVID-19 환자에서 상당히 상승하였다. 생존한 환자에서, 세린 프로테아제/C1-INH 복합체의 수준은 퇴원 후 3개월 후에는 정상을 향한 경향이 있었지만, 환자의 하위세트는 여전히 상승된 수준을 가졌고, 대조군보다 값이 올라가고, 진행 중인 보체 활성화를 나타냈다.
검정 성능: 요약
본원에서 기술되는 것과 같이, 급성 COVID-19 감염은 보체 활성화, 탈보체화 및 보체 활성화 생성물, 예컨대, C3a 및 C5a의 방출로 이어진다. 본 발명자들은 영국의 로열 팝워스 병원에서 모집한 40명의 중증 급성 COVID-19 환자로부터의 혈장을 사용하여 비드 기반 C1-INH 복합체 검정을 테스트하였다. 환자에 대한 WHO 임상 점수의 범위는 3-7이었고, 그들 중 19명이 체외막 산소 공급(ECMO)을 필요로 하였다. 환자 중 19명이 생존하였고; 21명이 질환에 걸렸다. 30명의 미감염 의료 종사자(HCW)를 대조군으로서 활용하였다. 모아진 급성 단계 혈장의 연속 희석을 표준에 대해 사용하였다(범위 1:10-1:1280). 개별 샘플을 검정 완충액에 1:50으로 희석하였다. 플레이트 내 및 플레이트 간 변동을 결정하기 위해 각 플레이트 상의 3개의 별도 위치에서 높은 표준과 낮은 표준(모아진 급성 및 NHS)을 포함시켰다.
두 검정에 대한 표준 곡선은 간단한 로그/선형 관계였고, 사용 가능한 혈장 희석 범위는 1:20 내지 1:640이었다. C1s/C1-INH 복합체에 대한 절대 형광 신호는 MASP-2/C1-INH 복합체에 대한 것보다 대략 10배 더 높고, 이것은 아마도 MASP-2와 C1s 사이의 혈청 농도의 차이를 반영한다.
MASP-2/C1-INH 복합체 및 C1s/C1-INH 복합체는 건강한 대조군에 비교하여 모든 입원한 급성 COVID-19 환자에서 상당히 상승하였고, 이것은 LP 및 CP 둘 다의 활성화를 나타낸다.
실시예 29
나르소플리맙의 치료는 COVID-19에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 감소시키고 더 나은 임상 결과로 이어진다.
배경/근거:
실시예 20, 21 및 22에서 기술된 것과 같이, 렉틴 경로가 급성 COVID-19와 관련된 폐 손상에 기여하고 대표적인 MASP-2 억제 항체인 나르소플리맙이 급성 COVID-19 환자의 폐 증상을 완화시키는데 효과적인 것이 입증되었다. 이 실시예에서는, 실시예 20, 21 및 22에서 기술된 것과 같이 나르소플리맙으로 치료된 급성 COVID-19 환자를 분석하여 MASP-2/C1-INH 복합체 수준에 미치는 나르소플리맙의 효과를 결정하였다.
방법:
급성 COVID-19를 앓고 있는 8명의 환자를 이탈리아의 베르가모에 있는 ITU에 입원시키고, 4 mg/kg의 투여량의 나르소플리맙으로 주 2회 치료하였다. 샘플을 병원 입원시(나르소플리맙으로의 치료 전)에 취한 후, 나르소플리맙으로 치료 후 경과일을 카운트하여, 샘플을 3-4일, 7-8일, 및 9일 째에 취하고 퇴원하였다. 16명의 건강한 대조군 대상체를 동시에 모집하였다.
샘플을 실시예 26에서 기술된 비드 기반 검정을 사용하여 CH50, C5a 및 MASP-2/C1-INH 복합체에 대해 분석하였다.
결과:
도 69는 16명의 건강한 대조군과 비교된, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 3-4일; 7-8일, 퇴원까지 9일) 8명의 급성 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 그래프로 도시한다. 도 69에서 나타낸 것과 같이, MASP-2/C1-INH 복합체 수준은 건강한 대상체와 비교하여 병원 입원시(나르소플리맙 치료 전) 급성 COVID 환자에서 상승하였다. 도 69에서 추가로 나타낸 것과 같이, 3-4 나르소플리맙 치료 후 3-4일 째에 건강한 대조군에서 관찰된 것과 비슷하게 MASP-2/C1-INH 복합체 수준의 극적인 감소가 있었고, 퇴원할 때까지 지속되었다. 대조적으로, 나르소플리맙으로 치료되지 않은 실시예 28에서 기술된 종단 연구로부터의 급성 COVID-19 환자에서는, 도 65에서 나타낸 것과 같이, MASP-2/C1-INH 복합체의 상승된 수준이 0-4일, 5-10일 및 11일-퇴원시에 관찰되었고, MASP-2/C1-INH 복합체 수준의 감소된 수준은 3개월 추적시에 발생하였고 그것은 정상적인 건강한 대조군보다 여전히 높았다.
도 70A는 16명의 건강한 대조군과 비교된, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 3-4일; 7-8일, 퇴원까지 9일) 8명의 급성 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 CH50 값을 그래프로 도시한다.
도 70A에서 나타낸 것과 같이, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 급성 COVID-19 환자의 CH50 값은 건강한 대조군보다 낮았다. 도 70A에서 추가로 나타낸 것과 같이, 나르소플리맙 치료 후 3-4일 째에 정상 범위에 들어가는 CH50의 증가가 있었고 그것은 7-8일까지 계속 증가하였고 9일째 퇴원시까지 정상 범위를 유지하였다. 대조적으로, 나르소플리맙으로 치료되지 않은 실시예 28에서 기술된 종단 연구로부터의 급성 COVID-19 환자에서는, 도 67에서 나타낸 것과 같이, 0-4일에 혈청음성 직원과 비교하여 더 낮은 CH50 값이 관찰되었고, 이 낮은 수준은 5-10일 및 11-15일에 내내 지속되었으며 결국 회복기 환자에서 증가하였고 3개월 추적시에는 정상 수준으로 증가하였다.
도 70B는 16명의 건강한 대조군과 비교된, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 3-4일; 7-8일, 퇴원까지 9일) 8명의 급성 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 C5a 값을 그래프로 도시한다.
도 70B에서 나타낸 것과 같이, 입원시(나르소플리맙 치료 전) 급성 COVID-19 환자의 C5a 값은 건강한 대조군 대상체보다 상당히 더 높았다. 도 70B에서 추가로 나타낸 것과 같이, C5a 값은 나르소플리맙 치료 후 3-4일까지 극적으로 감소하였고 7-8일째에 계속 감소하였으며 9일-퇴원시에는 거의 정상 수준까지 감소하였다. 대조적으로, 나르소플리맙으로 치료되지 않은 실시예 28에서 기술된 종단 연구로부터의 급성 COVID-19 환자에서는, 도 68에서 나타낸 것과 같이, 혈청음성 직원과 비교하여 상당히 상승된 C5a 값이 0-4일 째에 관찰되었고, 시간이 경과함에 따라 감소하였지만, 5-10일 및 11-15일 째에 정상보다 더 높게 유지된 후, 결국에는 3개월 추적시가지 정상 수준으로 감소하였다(회복기 환자).
함께 취하면, 이들 결과는 급성 COVID-19 환자가 병원 입원시 보체 활성화 및 소비를 가지며 나르소플리맙으로의 치료가 보체 활성화 및 소비를 신속하게 감소시킨다는 것을 입증한다. 추가로 MASP-2/C1-INH 복합체 수준은 COVID-19 환자에서 병원 입원시 높고 나르소플리맙으로의 치료 시 신속하게 감소하는 보체 활성화 상태를 나타내는 것이 입증된다. 그러므로, MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 나르소플리맙으로의 치료에 대한 필요성을 결정하기 위한 방법으로서 사용될 수 있고 또한 나르소플리맙 치료의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
논의:
이 실시예에서 기술되는 것과 같이, 본 발명자들은 급성 COVID-19 동안 보체 활성화에 미치는 나르소플리맙 치료의 효과를 조사하였다. 보체 활성화 및 고갈의 마커를 급성 COVID-19(WHO 점수 3-7)로 입원한 8명의 환자로부터 취한 종단 혈장 샘플에서 분석하였다. 건강한 의료 종사자로부터 취한 샘플을 대조군으로서 활용하였다.
치료 직전에, 모든 환자는 탈보체화되었고(낮은 CH50), 대체 경로 활성화의 증거 및 아나필라톡신 생성(Bb 및 C5a 생성)을 보였다. 본원에 기술된 새로운 비드 기반 형광 면역검정을 사용하여 각각 고전적 및 렉틴 경로 활성화의 특정 마커인 C1s/C1-INH 및 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하였고, 본 발명자들은 치료 전 모든 환자에서 상당히 상승된 수준의 두 복합체 모두를 발견하였다. 나르소플리맙 치료는 MASP-2/C1Inh 복합체의 신속하고 지속적인 감소, 및 C5a 생성의 상응하는 감소를 초래하였다. C1s/C1Inh 수준은 급성 단계 내내 높게 유지되었다.
이전의 임상 결과와 함께 취하면, 이들 발견은 렉틴 경로를 나르소플리맙으로 표적화하는 것이, 진행 중인 고전적 경로 활성화가 존재하는 경우에도, 보체 활성화 및 아나필라톡신 감소를 ARDS를 유지하기 위한 한계값 미만으로 감소시키기에 충분할 수 있음을 시사한다.
이들 데이터는, 중증 COVID-19의 매우 초기에, 렉틴 경로 활성화가 엄청나게 높은 것을 입증한다. 이 과도한 렉틴 경로 활성화는 렉틴 경로와 고전적 경로 사이에 공유된 보체 구성요소의 소비를 유발하여, 고전적 경로 기능을 손상시킨다. 베르가모 시험으로부터의 혈액 샘플의 평가는 나르소플리맙을 통한 렉틴 경로 억제가 렉틴 경로의 과활성화를 통한 제어되지 못한 소비에 의해 유발된 고전적 경로 기능적 활성의 상실을 복구시킬 수 있음을 보여준다. 이들 결과는 MASP-2/C1-INH 복합체가 중증 COVID-19의 초기 지표로서 유용하며 치료가 진행 중인 COVID-19 환자에서 치료 반응을 평가하기 위한 수단으로서 유용한 것을 입증한다.
실시예 30
나르소플리맙으로의 치료가 COVID-19에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 감소시키고 더 나은 임상 결과를 이어진다는 추가의 증거.
배경/근거:
실시예 20, 21, 22 및 23에서 기술된 것과 같이, 렉틴 경로가 급성 COVID-19와 관련된 폐 손상에 기여하고 대표적인 MASP-2 억제 항체인 나르소플리맙이 급성 COVID-19 환자의 폐 증상을 완화시키는데 효과적인 것이 입증되었다. 이 실시예에서는, 실시예 20, 21 및 22에서 기술된 것과 같이 나르소플리맙으로 치료된 급성 COVID-19를 앓고 있는 환자를 분석하여 MASP-2/C1-INH 복합체 수준에 미치는 나르소플리맙의 효과를 결정하였다. 실시예 29에서 기술된 것과 같이, 급성 COVID-19 환자는 병원 입원시 보체 활성화 및 소비를 가지며 나르소플리맙으로의 치료는 보체 활성화 및 소비를 신속하게 감소시키는 것으로 결정되었다. MASP-2/C1-INH 복합체 수준은 병원 입원시 높고 나르소플리맙으로의 치료시 신속하게 감소하는 것으로 나타난, COVID-19 환자에서의 보체 활성화 상태를 나타내는 것이 추가로 입증되었다. 이 실시예는 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 베르가모 병원에 입원했던 급성 COVID-19를 앓고 있는 대상체(미치료 그룹)로부터 얻어진 종단 샘플과 비교하여 나르소플리맙으로 치료된 급성 COVID-19를 앓고 있는 급성 대상체(치료 그룹)로부터 얻어진 종단 샘플의 추가 분석을 기술하며, 샘플을 실시예 26에서 기술된 비드 기반 면역검정을 사용하여 CH50, C5a 및 MASP-2/C1-INH 복합체에 대해 분석하였다.
방법:
이 연구에 포함된 환자 및 대조군
본 발명자들은 16명의 중등도 및 중증으로 아픈 COVID-19 환자로부터의 종단 혈장 샘플을 분석하였다; 7명은 나르소플리맙으로 치료되었고(모두 회복되었고 치료 후 퇴원하였음) 9명은 미치료 대조군이었으며, 모두 2020년 4분기 동안 이탈리아 베르가모에 있는 파파 조반니 23세 병원의 집중치료실에 입원하였다. 모든 환자는 SARS-CoV-2에 대해 PCR 양성이었고, ARDS가 있었고(베를린 기준(Ferguson N.D et al., Intensive Care Med 38(10): 1573-82, 2012)에 따름), 최소 CPAP(연속식 기도 양압)를 필요로 하였다. 대부분의 중증 환자를 나르소플리맙으로의 치료에 선택하였다. 모든 환자는 에녹사파린, 덱사메타손 및 500 mg의 아지트로마이신을 매일 받았지만, 활성 상태의 전신성 박테리아 또는 진균 감염 환자는 추가로 나르소플리맙 치료에는 적격이 아닌 항미생물 치료를 필요로 하였다.
치료된 코호트에서, 나르소플리맙(4 mg/kg)을 2-4주 동안 주 2회 정맥내로 투여하였다. 혈액을 각각의 나르소플리맙 용량 전과후에 주 2회 수집하였다. 시트레이트 혈장을 준비하여 분석할 때까지 -80℃에서 냉동하였다. 이와 나란히, 샘플을 나르소플리맙을 받지 않은 COVID-19 환자로부터 수집하였다. 마찬가지로, 정상 대조군 혈장을 17명의 혈청음성 지원자(의료 종사자)로부터 수집하였다. 샘플을 실시예 26에서 기술된 비드 기반 검정을 사용하여 CH50, C5a 및 MASP-2/C1-INH 복합체에 대해 분석하였다.
Measurement of 보체 용혈의 측정(CH 50 )
양 적혈구(SE)의 항체 구동 보체 용해를 다음과 같이 토끼 항-양 IgG 코팅 SE를 사용하여 측정하였다. 양 적혈구(Oxoid)를 10 mM EDTA를 함유한 GVB 완충액(10 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 0.1% 중량/부피 젤라틴)을 사용하여 3회 세척하였다. RBC의 최종 농도를 1x109/ml로 조정하였다. RBC를 항-양 RBC(Sigma S1389, 1:200으로 희석됨)와 함께 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 30분 동안 인큐베이션함으로써 감작시켰다. 마지막으로, RBC를 2 mM Ca2+ 및 1 mM Mg2+(GVB++)를 함유한 GVB 완충액으로 세척하였다. 혈청 샘플을 96 웰 플레이트에서 100 μl GVB++ 완충액에 연속적으로 희석하고 동일한 부피의 GVB++ 중의 107 RBC를 각 웰에 첨가하였다. 완충액만을 함유한 웰을 음성 대조군으로서 사용하였다. 완충액/혈장 대신 물을 함유한 웰을 양성 대조군으로서 사용하였다(명목상 100% 용해). 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 원심분리하고, 100 μl의 상층액을 흡인하고 방출된 헤모글로빈을 405 nm에서 OD를 측정함으로써 결정하였다. 용혈 백분율을 계산하고 혈장 희석에 대해 도표화하여 CH50을 결정하였다.
C5a ELISA
순환 C5a를 R&D systems(Cat. No. DY2037)에 의해 공급된 독점 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다.
혈청 박테리아 검정(SBA)
클레브시엘라 뉴모니아(K. pneumoniae) 분리물을 37℃의 영양 브로스에서 밤새 부드럽게 흔들어주면서 성장시켰다. 다음날, 10 mL의 새로운 영양 브로스를 100 μL의 밤샘 박테리아 배양으로 시딩하고 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 중간 로그 단계가 될 때까지 인큐베이션하였다. 박테리아 배양을 수집하여, BBS(4 mM 바르비탈, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4)로 2회 세척한 후 1Х107 CFU mL-1의 최종 농도로 조정하였다. 1Х105 CFU를 BBC 중의 HCW로부터의 50% 혈청 또는 나르소플리맙 치료 전과 후의 급성 COVID-19 환자로부터의 혈청과 함께 37℃에서 부드럽게 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 2시간 후, 샘플을 취하여 영양 아가 플레이트 상에 밤새 37℃에서 플레이팅하였다. 환자로부터의 혈청을 점액질 클레브시엘라 뉴모니아(ATCC 43816)와 함께 120분 동안 인큐베이션하고 열비활성화된 정상 인간 혈청(HI-NHS)과 비교하여 각각의 혈청과 함께 2시간 인큐베이션한 후 회수된 생존성 박테리아 카운트의 감소를 측정함으로써 회수 가능한 생존성 박테리아 콜로니를 계산하였다.
MASP-2/C1Inh 및 C1s/C1Inh 복합체에 대한 Luminex 검정
MASP-2/C1-INH 및 C1s/C1-INH 복합체는 각각 렉틴 및 고전적 경로의 활성화의 특이적 마커이다. 이들 마커를 측정하기 위하여, 본 발명자들은 실시예 26에서 기술된 것과 같은 멀티플렉스 비드 기반 형광 샌드위치 검정을 사용하였다.
결과:
이 연구에서 7명의 중증 COVID-19 환자를 나르소플리맙으로 치료하였고(최종 농도 4 mg/kg 체중으로 주 2회 정맥내 주입을 통해 투여됨) 모두 치료 후에 회복하였다. 비교를 위해, 종단 혈액 샘플을 동일한 기간 동안 나르소플리맙을 받지 않았고 집중치료실에 있었던 9명의 COVID-19 환자의 대조군 그룹(미치료 그룹)으로부터 수집하였다.
나르소플리맙 치료는 COVID-19 환자에서의 렉틴 경로 활성화의 고도로 상승된 수준을 건강한 대조군에서 볼 수 있는 수준으로 감소시킨다.
본 발명자들은 COVID-19 환자의 혈청/혈장에서 MASP-2/C1-INH 및 C1s/C1-INH 복합체의 검출을 통해 렉틴 경로(LP) 및 고전적 경로(CP)의 활성화 상태를 모니터링하기 위해 본 발명자들이 개발한, 실시예 26에서 기술된 비드 기반 형광 검정을 사용하였다.
도 71은 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 9명의 COVID-19 환자(미치료 대조군)로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대조군 대상체의 풀(pool)(건강한 대조군)과 비교된, 입원시(0일, 나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 2-4일; 6-8일 및 퇴원까지 9일) 7명의 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 그래프로 도시한다. 도 71에서 나타낸 것과 같이, 연구를 시작할 때, 모든 환자는 렉틴 경로 활성화를 나타내는 의 높은 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가졌다. 나르소플리맙 치료는 제1 용량 후에 직접적으로 MASP-2/C1-INH를 정상 수준으로 감소시켰다. 미치료 그룹에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 연구의 나머지 동안 치료 그룹에서보다 유의미하게(p<0.001) 높았다. 결과를 일원분산분석을 사용하여 분석하였다. 대조적으로, 나르소플리맙은 고전적 경로 구동된 C1s/C1-INH 복합체의 생성에 영향을 미치지 않았고, 연구 기간 내내 두 환자 그룹 모두에서 높게 유지되었다(데이터 미제시).
나르소플리맙 치료는 급성 COVID 19에서 저보체혈증(hypocomplementemia)을 개선시킨다
도 72A는 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 9명의 COVID-19 환자(미치료 대조군)로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대조군 대상체의 풀(건강한 대조군)과 비교된, 입원시(0일, 나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 2-4일; 6-8일 및 퇴원까지 9일) 7명의 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 CH50 값을 그래프로 도시한다.
도 72B는 동일한 기간 동안 나르소플리맙으로 치료되지 않은 9명의 COVID-19 환자(미치료 대조군)로부터 얻어진 샘플 및 건강한 대조군 대상체의 풀(건강한 대조군)과 비교된, 입원시(0일, 나르소플리맙 치료 전) 및 나르소플리맙 치료 후(치료 시작 후 2-4일; 6-8일 및 퇴원까지 9일) 7명의 COVID-19 환자로부터의 샘플 중의 C5a 값을 그래프로 도시한다.
도 72A에서 나타낸 것과 같이, 연구를 시작할 때, 16명의 모든 COVID-19 환자로부터의 혈장은 낮은 CH50 값에 의해 결정된 바 중증의 저보체혈증을 가지고 있었다. 도 72A에서 추가로 나타낸 것과 같이, 나르소플리맙 치료는 CH50 값의 즉각적인 개선을 초래하였고, 이것은 보체 활성화의 복원을 나타낸다. 대조적으로, 미치료 대조군 COVID-19 환자는 연구의 처음 9일 동안 상당히 낮은 CH50 값(p=0.0093)을 가졌고, 방출 직전에서야 정상적인 보체 활성화로 회복되기 시작하였다. 도 72B에서 나타낸 것과 같이, 집중치료실에 들어갈 때, 모든 COVID-19 환자는 그들의 혈청에 높은 수준의 아나필라톡신 C5a를 가졌고 이것은 보체 활성화가 일어난 것을 반영한다. 도 72B에서 추가로 나타낸 것과 같이, 나르소플리맙 치료는 제1 용량 후 3일까지 C5a 혈장 수준을 정상 수준으로 감소시켰고, 연구 기간 동안 정상을 유지하였다.
요약하면, 나르소플리맙 치료 그룹에서,두 CH50 및 C5a는 모두 제1 용량 후 3일 까지 정상으로 복구되었고 연구 기간 동안 정상으로 유지되었다. 미치료 그룹에서, 연구의 나머지를 통해 치료 그룹에서보다 CH50 값은 상당히 낮았으며(p=0.0093), C5a 수준은 상당히 높았다(p=0.023). 결과를 일원분산분석을 사용하여 분석하였다.
나르소플리맙 치료는 렉틴 경로 매개 보체 활성화를 억제하여, 고전적 경로 활성 및 항체 매개 살균 활성의 회복을 허용한다
보체 매개 박테리아 용해는 미생물 감염, 특히 그램 음성균에 대한 방어에서 중요한 역할을 한다. 중증 COVID-19에 의해 유도된 저보체혈증은 혈청이 COVID-19의 주요 이차 동반질환인 클레브시엘레 뉴모니아를 옵소닌화하거나 사멸시키는 능력을 심각하게 손상시킨다. 나르소플리맙이 이 기능의 상실을 반전시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 클레브시엘레 뉴모니아에 대한 치료 및 미치료 환자로부터의 혈청의 혈청 살균 활성(SBA)을 측정하였다.
도 73은 정상 건강한 혈청(NHS) 및 열 비활성화된 정상 건강한 혈청(HI-NHS)과 비교된, 나르소플리맙으로 치료되지 않은 COVID-19 환자로부터의 혈청과 비교된 나르소플리맙으로의 치료 전(치료 전) COVID-19 환자로부터의 헐청 및 나르소플리맙으로의 치료 후 COVID-19 환자의 혈청에서 인큐베이션 후 클레브시엘라 뉴모니아의 생존성 박테리아 카운트를 그래프로 도시한다. 도 73에서 나타낸 것과 같이, 치료 전에 취한 혈청과 비교하여 나르소플리맙으로의 치료 후 환자로부터의 혈청을 사용할 때 상당히 낮은 박테리아 카운트가 관찰되었다. 클레브시엘라 뉴모니아의 C3b로의 옵소닌화는 또는 급성 COVID-19 환자로부터의 모아진 혈청(n=6)에서 인큐베이션하였을 때 손상되었다. 나르소플리맙 투여 후, 동일한 환자의 모아진 혈청(n=6)은 클레브시엘라 뉴모니아를 C3b로 모아진 정상 건강한 대조군과 유사한 정도로 옵소닌화하엿다. 열 비활성화된 정상 건강한 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 결과를 다중 비교를 위해 Dunnett의 수정이 있는 일원분산분석을 사용하여 분석하였다.
결과의 전체 요약:
본원에서 기술되고 문헌[Rambaldi A. et al., Immunobiology 225(6):152001, 2020]에서 보고되는 것과 같이, 렉틴 경로(LP)를 억제하는 MASP-2 억제 항체인 나르소플리맙으로 중증 COVID-19 환자의 치료는 주입 후 질환 징후가 신속하게 개선되는 치료적 돌파구를 달성하였다.
이 실시예에서 본 발명자들은 급성 COVID-19 동안 보체 활성화에 미치는 나르소플리맙 치료의 효과를 조사하였다. 보체 활성화 고갈의 마커를 급성 COVID-19(WHO 점수 3-7)로 입원하고 나르소플리맙으로 치료된 7명의 환자로부터 취한 종단 혈장 샘플에서 분석하였고, 환자는 모두 회복되었고 퇴원하엿다. 건강한 의료 종사자 및 미치료 COVID-19로부터 취한 샘플을 대조군으로서 활용하였다.
치료 전에, 모든 환자 혈장은 3개의 모든 보체 활성화 경로를 통해 보체 활성화를 나타내는 마커인 낮은 CH50 및 높은 C5a 아나필라톡신 수준을 나타냈다. 각각 고전적 및 렉틴 경로 활성화의 특정 마커인 C1s/C1-INH 및 MASP-2/C1-INH 복합체를 측정하기 위하여, 신규의 비드 기반 형광 면역검정을 사용하여 본 발명자들은 치료 전 모든 환자에서 두 복합체의 상당히 상승된 수준을 발견하였다. 나르소플리맙 치료는 MASP-2/C1-INH 복합체의 신속하고 지속적인 감소, 및 C5a 생성의 상응하는 감소를 초래하였다. C1s/C1-INH 수준은 급성 단계 내내 높게 유지되었다. 그램 음성균에 대한 살균 활성 또한 복원되었다.
이전의 임상 결과와 함께 취하면, 이들 발견은 나르소플리맙으로 렉틴 경로를 표적화하는 것이, 진행 중인 고전적 경로 활성화가 존재하는 경우에도, 보체 활성화 및 아나필라톡신 감소를 ARDS를 유지하기 위한 한계값 미만으로 감소시키고, 기회주의적인 이차 감염에 대한 성공적인 방어에 필요한 SBA를 복원시키기에 충분할 수 있다는 추가 증거를 제공한다.
다른 구체예
본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 및 특허는 본원에 참조로 포함된다.
발명의 기술된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변동은 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 기술분야에 숙련된 사람들에게 분명할 것이다. 비록 발명이 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 발명은 그러한 특정 구체예에 과도하게 제한되지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다.
예시적인 구체예가 예시되고 기술되었지만, 다양한 변화가 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본원에서 이루어질 수 있는 것이 인정될 것이다.
배타적인 재산 또는 특권이 주장되는 본 발명의 구체예는 다음과 같이 정의된다.
SEQUENCE LISTING <110> Omeros Corporation Demopulos, Gregory A. Dudler, Thomas Lynch, Nicholas James Schwaeble, Hans-Wilhelm Shaffer, Kathleen A. Yabuki, Munehisa <120> Biomarker for Assessing the Risk of Developing Acute Covid-19 and Post-Acute Covid-19 <130> MP.1.0319.PCT <150> 63/146,479 <151> 2021-02-05 <150> 63/277,361 <151> 2021-11-09 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 725 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (27)..(584) <400> 1 ggccaggcca gctggacggg cacacc atg agg ctg ctg acc ctc ctg ggc ctt 53 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu 1 5 ctg tgt ggc tcg gtg gcc acc ccc ttg ggc ccg aag tgg cct gaa cct 101 Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro 10 15 20 25 gtg ttc ggg cgc ctg gca tcc ccc ggc ttt cca ggg gag tat gcc aat 149 Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn 30 35 40 gac cag gag cgg cgc tgg acc ctg act gca ccc ccc ggc tac cgc ctg 197 Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu 45 50 55 cgc ctc tac ttc acc cac ttc gac ctg gag ctc tcc cac ctc tgc gag 245 Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu 60 65 70 tac 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Ile Ser Leu Glu 205 210 215 gag ggg ttc agt gtc att ctg gac ttt gtg gag tcc ttc gat gtg gag 723 Glu Gly Phe Ser Val Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu 220 225 230 aca cac cct gaa acc ctg tgt ccc tac gac ttt ctc aag att caa aca 771 Thr His Pro Glu Thr Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr 235 240 245 250 gac aga gaa gaa cat ggc cca ttc tgt ggg aag aca ttg ccc cac agg 819 Asp Arg Glu Glu His Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg 255 260 265 att gaa aca aaa agc aac acg gtg acc atc acc ttt gtc aca gat gaa 867 Ile Glu Thr Lys Ser Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu 270 275 280 tca gga gac cac aca ggc tgg aag atc cac tac acg agc aca gcg cag 915 Ser Gly Asp His Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln 285 290 295 cct tgc cct tat ccg atg gcg cca cct aat ggc cac gtt tca cct gtg 963 Pro Cys Pro Tyr Pro Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val 300 305 310 caa gcc aaa tac atc ctg aaa gac agc ttc tcc atc ttt tgc gag act 1011 Gln Ala Lys Tyr Ile Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr 315 320 325 330 ggc tat gag ctt ctg caa ggt cac ttg ccc ctg aaa tcc ttt act gca 1059 Gly Tyr Glu Leu Leu Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala 335 340 345 gtt tgt cag aaa gat gga tct tgg gac cgg cca atg ccc gcg tgc agc 1107 Val Cys Gln Lys Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser 350 355 360 att gtt gac tgt ggc cct cct gat gat cta ccc agt ggc cga gtg gag 1155 Ile Val Asp Cys Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu 365 370 375 tac atc aca ggt cct gga gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac 1203 Tyr Ile Thr Gly Pro Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr 380 385 390 agc tgt gaa gag acc ttc tac aca atg aaa gtg aat gat ggt aaa tat 1251 Ser Cys Glu Glu Thr Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr 395 400 405 410 gtg tgt gag gct gat gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tca 1299 Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser 415 420 425 ctc cca gtc tgt gag cct gtt tgt gga cta tca gcc cgc aca aca gga 1347 Leu Pro Val Cys Glu Pro Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly 430 435 440 ggg cgt ata tat gga ggg caa aag gca aaa cct ggt gat ttt cct tgg 1395 Gly Arg Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp 445 450 455 caa gtc ctg ata tta ggt gga acc aca gca gca ggt gca ctt tta tat 1443 Gln Val Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr 460 465 470 gac aac tgg gtc cta aca gct gct cat gcc gtc tat gag caa aaa cat 1491 Asp Asn Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His 475 480 485 490 gat gca tcc gcc ctg gac att cga atg ggc acc ctg aaa aga cta tca 1539 Asp Ala Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser 495 500 505 cct cat tat aca caa gcc tgg tct gaa gct gtt ttt ata cat gaa ggt 1587 Pro His Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly 510 515 520 tat act cat gat gct ggc ttt gac aat gac ata gca ctg att aaa ttg 1635 Tyr Thr His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu 525 530 535 aat aac aaa gtt gta atc aat agc aac atc acg cct att tgt ctg 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tgt ggg gaa gca ggt cag tat 2019 Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr 655 660 665 gga gtc tac aca aaa gtt att aac tat att ccc tgg atc gag aac ata 2067 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile 670 675 680 att agt gat ttt taa cttgcgtgtc tgcagtcaag gattcttcat ttttagaaat 2122 Ile Ser Asp Phe 685 gcctgtgaag accttggcag cgacgtggct cgagaagcat tcatcattac tgtggacatg 2182 gcagttgttg ctccacccaa aaaaacagac tccaggtgag gctgctgtca tttctccact 2242 tgccagttta attccagcct tacccattga ctcaagggga cataaaccac gagagtgaca 2302 gtcatctttg cccacccagt gtaatgtcac tgctcaaatt acatttcatt accttaaaaa 2362 gccagtctct tttcatactg gctgttggca tttctgtaaa ctgcctgtcc atgctctttg 2422 tttttaaact tgttcttatt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 2460 <210> 5 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gln Arg 180 185 190 Ser Gly Glu Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr Leu 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro Met 290 295 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile Leu 305 310 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly Pro 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro Gly 370 375 380 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 385 390 395 400 Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 405 410 415 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Glu Pro 420 425 430 Val Cys Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Gly Gly Arg Ile Tyr Gly Gly 435 440 445 Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Ile Leu Gly 450 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Arg Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Thr Tyr Ser Ile Ser Leu Glu Glu Gly Phe Ser Val 195 200 205 Ile Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Thr His Pro Glu Thr 210 215 220 Leu Cys Pro Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser 245 250 255 Asn Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Tyr Pro 275 280 285 Met Ala Pro Pro Asn Gly His Val Ser Pro Val Gln Ala Lys Tyr Ile 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Ile Phe Cys Glu Thr Gly Tyr Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly His Leu Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Met Pro Ala Cys Ser Ile Val Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Ser Gly Arg Val Glu Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Lys Val Asn Asp Gly Lys Tyr Val 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Gly Leu Glu Ser 595 600 605 Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe 610 615 620 Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp 625 630 635 640 Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys 645 650 655 Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser Asp Phe 660 665 670 <210> 7 <211> 4900 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cctgtcctgc ctgcctggaa ctctgagcag gctggagtca tggagtcgat tcccagaatc 60 ccagagtcag ggaggctggg ggcaggggca ggtcactgga caaacagatc aaaggtgaga 120 ccagcgtagg actgcagacc aggccaggcc agctggacgg gcacaccatg aggtaggtgg 180 gcgccacagc ctccctgcag ggtgtggggt gggagcacag gcctgggcct caccgcccct 240 gccctgccca taggctgctg accctcctgg gccttctgtg tggctcggtg gccaccccct 300 taggcccgaa gtggcctgaa cctgtgttcg ggcgcctggc atcccccggc tttccagggg 360 agtatgccaa tgaccaggag cggcgctgga ccctgactgc accccccggc taccgcctgc 420 gcctctactt cacccacttc gacctggagc tctcccacct ctgcgagtac gacttcgtca 480 aggtgccgtc agacgggagg gctggggttt ctcagggtcg gggggtcccc aaggagtagc 540 cagggttcag ggacacctgg gagcaggggc caggcttggc caggagggag atcaggcctg 600 ggtcttgcct tcactccctg tgacacctga ccccacagct gagctcgggg gccaaggtgc 660 tggccacgct gtgcgggcag gagagcacag acacggagcg ggcccctggc aaggacactt 720 tctactcgct gggctccagc ctggacatta ccttccgctc cgactactcc aacgagaagc 780 cgttcacggg gttcgaggcc ttctatgcag ccgagggtga gccaagaggg gtcctgcaac 840 atctcagtct gcgcagctgg ctgtgggggt aactctgtct taggccaggc agccctgcct 900 tcagtttccc cacctttccc agggcagggg agaggcctct ggcctgacat catccacaat 960 gcaaagacca aaacagccgt gacctccatt cacatgggct gagtgccaac tctgagccag 1020 ggatctgagg acagcatcgc ctcaagtgac gcagggactg gccgggcgcg gcagctcacg 1080 cctgtaattc cagcactttg ggaggccgag gctggcttga taatttgagg gtcaggagtt 1140 caaggccagc cagggcaaca cggtgaaact ctatctccac taaaactaca aaaattagct 1200 gggcgtggtg gtgcgcacct ggaatcccag ctactaggga ggctgaggca ggagaattgc 1260 ttgaacctgc gaggtggagg ctgcagtgaa cagagattgc accactacac tccacctggg 1320 cgacagacta gactccgtct caaaaaacaa aaaacaaaaa ccacgcaggg ccgagggccc 1380 atttacaagc tgacaaagtg ggccctgcca gcgggagcgc tgcaggatgt ttgattttca 1440 gatcccagtc cctgcagaga ccaactgtgt gacctctggc aagtggctca atttctctgc 1500 tccttagaag ctgctgcaag ggttcagcgc tgtagccccg ccccctgggt ttgattgact 1560 cccctcatta gctgggtgac ctcggccgga cactgaaact cccactggtt taacagaggt 1620 gatgtttgca tctttctccc agcgctgctg ggagcttgca gcgaccctag gcctgtaagg 1680 tgattggccc ggcaccagtc ccgcacccta gacaggacct aggcctcctc tgaggtccac 1740 tctgaggtca tggatctcct gggaggagtc caggctggat cccgcctctt tccctcctga 1800 cggcctgcct ggccctgcct ctcccccaga cattgacgag tgccaggtgg ccccgggaga 1860 ggcgcccacc tgcgaccacc actgccacaa ccacctgggc ggtttctact gctcctgccg 1920 cgcaggctac gtcctgcacc gtaacaagcg cacctgctca ggtgagggag gctgcctggg 1980 ccccaacgca ccctctcctg ggatacccgg ggctcctcag ggccattgct gctctgccca 2040 ggggtgcgga gggcctgggc ctggacactg ggtgcttcta ggccctgctg cctccagctc 2100 cccttctcag ccctgcttcc cctctcagca gccaggctca tcagtgccac cctgccctag 2160 cactgagact aattctaaca tcccactgtg tacctggttc cacctgggct ctgggaaccc 2220 ctcatgtagc cacgggagag tcggggtatc taccctcgtt ccttggactg ggttcctgtt 2280 ccctgcactg ggggacgggc cagtgctctg gggcgtgggc agccccaccc tgtggcgctg 2340 accctgctcc cccgactcgg tttctcctct cggggtctct ccttgcctct ctgatctctc 2400 ttccagagca gagcctctag cctcccctgg agctccggct gcccagcagg tcagaagcca 2460 gagccaggct gctggcctca gctccgggtt gggctgagat gctgtgcccc aactcccatt 2520 cacccaccat ggacccaata ataaacctgg ccccacccca cctgctgccg cgtgtctctg 2580 gggtgggagg gtcgggaggc ggtggggcgc gctcctctct gcctaccctc ctcacagcct 2640 catgaacccc aggtctgtgg gagcctcctc catggggcca cacggtcctt ggcctcaccc 2700 cctgttttga agatggggca ctgaggccgg agaggggtaa ggcctcgctc gagtccaggt 2760 ccccagaggc tgagcccaga gtaatcttga accaccccca ttcagggtct ggcctggagg 2820 agcctgaccc acagaggaga caccctggga gatattcatt gaggggtaat ctggtccccc 2880 gcaaatccag gggtgattcc cactgcccca taggcacagc cacgtggaag aaggcaggca 2940 atgttggggc tcctcacttc ctagaggcct cacaactcaa atgcccccca ctgcagctgg 3000 gggtggggtg gtggtatggg atggggacca agccttcctt gaaggataga gcccagccca 3060 acaccccgcc ccgtggcagc agcatcacgt gttccagcga ggaaggagag caccagactc 3120 agtcatgatc actgttgcct tgaacttcca agaacagccc cagggcaagg gtcaaaacag 3180 gggaaagggg gtgatgagag atccttcttc cggatgttcc tccaggaacc agggggctgg 3240 ctggtcttgg ctgggttcgg gtaggagacc catgatgaat aaacttggga atcactgggg 3300 tggctgtaag ggaatttagg ggagctccga aggggccctt aggctcgagg agatgctcct 3360 ctcttttccc gaattcccag ggacccagga gagtgtccct tcttcctctt cctgtgtgtc 3420 catccacccc cgccccccgc cctggcagag ctggtggaac tcagtgctct agcccctacc 3480 ctggggttgc gactctggct caggacacca ccacgctccc tgggggtgtg agtgagggcc 3540 tgtgcgctcc atcccgagtg ctgcctgttt cagctaaagc ctcaaagcaa gagaaacccc 3600 ctctctaagc ggcccctcag ccatcgggtg ggtcgtttgg tttctgggta ggcctcaggg 3660 gctggccacc tgcagggccc agcccaaccc agggatgcag atgtcccagc cacatccctg 3720 tcccagtttc ctgctcccca aggcatccac cctgctgttg gtgcgagggc tgatagaggg 3780 cacgccaagt cactcccctg cccttccctc cttccagccc tgtgctccgg ccaggtcttc 3840 acccagaggt ctggggagct cagcagccct gaatacccac ggccgtatcc caaactctcc 3900 agttgcactt acagcatcag cctggaggag gggttcagtg tcattctgga ctttgtggag 3960 tccttcgatg tggagacaca ccctgaaacc ctgtgtccct acgactttct caaggtctgg 4020 ctcctgggcc cctcatcttg tcccagatcc tcccccttca gcccagctgc accccctact 4080 tcctgcagca tggcccccac cacgttcccg tcaccctcgg tgaccccacc tcttcaggtg 4140 ctctatggag gtcaaggctg gggcttcgag tacaagtgtg ggaggcagag tggggagggg 4200 caccccaatc catggcctgg gttggcctca ttggctgtcc ctgaaatgct gaggaggtgg 4260 gttacttccc tccgcccagg ccagacccag gcagctgctc cccagctttc atgagcttct 4320 ttctcagatt caaacagaca gagaagaaca tggcccattc tgtgggaaga cattgcccca 4380 caggattgaa acaaaaagca acacggtgac catcaccttt gtcacagatg aatcaggaga 4440 ccacacaggc tggaagatcc actacacgag cacagtgagc aagtgggctc agatccttgg 4500 tggaagcgca gagctgcctc tctctggagt gcaaggagct gtagagtgta gggctcttct 4560 gggcaggact aggaagggac accaggttta gtggtgctga ggtctgaggc agcagcttct 4620 aaggggaagc acccgtgccc tcctcagcag cacccagcat cttcaccact cattcttcaa 4680 ccacccattc acccatcact catcttttac ccacccaccc tttgccactc atccttctgt 4740 ccctcatcct tccaaccatt catcaatcac ccacccatcc atcctttgcc acacaaccat 4800 ccacccattc ttctacctac ccatcctatc catccatcct tctatcagca tccttctacc 4860 acccatcctt cgttcggtca tccatcatca tccatccatc 4900 <210> 8 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala 130 135 <210> 9 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 25 30 Pro Gly Phe Pro Gly Glu Tyr Ala Asn Asp Gln Glu Arg Arg Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Lys Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser 100 105 110 Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val 130 135 140 Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys Asp His His Cys His Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn 165 170 175 Lys Arg Thr Cys Ser 180 <210> 10 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Arg Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Gly Ser Val Ala Thr 1 5 10 15 Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Ala Ser 20 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Tyr Asp Phe Leu Lys Ile Gln Thr Asp Arg Glu Glu His Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro His Arg Ile Glu Thr Lys Ser Asn 260 265 270 Thr Val Thr Ile Thr Phe Val Thr Asp Glu Ser Gly Asp His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr 290 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly Glu Ala Pro Thr Cys 1 5 10 15 Asp His His Cys His Asn His Leu Gly Gly Phe Tyr Cys Ser Cys Arg 20 25 30 Ala Gly Tyr Val Leu His Arg Asn Lys 35 40 <210> 12 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Tyr Gly Gly Gln Lys Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Ile Leu Gly Gly Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Asn 20 25 30 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Glu Gln Lys His Asp Ala 35 40 45 Ser Ala Leu Asp Ile Arg Met Gly Thr Leu Lys Arg Leu Ser Pro His 50 55 60 Tyr Thr Gln Ala Trp Ser Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr 65 70 75 80 His Asp Ala Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Asn Asn 85 90 95 Lys Val Val Ile Asn Ser Asn Ile Thr Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys 100 105 110 Glu Ala Glu Ser Phe Met Arg Thr Asp Asp Ile Gly Thr Ala Ser Gly 115 120 125 Trp Gly Leu Thr Gln Arg Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Tyr Val 130 135 140 Asp Ile Pro Ile Val Asp His Gln Lys Cys Thr Ala Ala Tyr Glu Lys 145 150 155 160 Pro Pro Tyr Pro Arg Gly Ser Val Thr Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala 180 185 190 Leu Val Phe Leu Asp Ser Glu Thr Glu Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile 195 200 205 Val Ser Trp Gly Ser Met Asn Cys Gly Glu Ala Gly Gln Tyr Gly Val 210 215 220 Tyr Thr Lys Val Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Ser 225 230 235 240 Asp Phe <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ala Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 Thr Pro Leu Gly Pro Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu 1 5 10 15 <210> 15 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 Thr Ala Pro Pro Gly Tyr Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe Asp 1 5 10 15 Leu Glu Leu Ser His Leu Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Ala Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln 35 40 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Thr Phe Arg Ser Asp Tyr Ser Asn 1 5 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 Phe Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Leu Asp Ile Thr Phe Arg Ser Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr Gly Phe 20 25 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 Ile Asp Glu Cys Gln Val Ala Pro Gly 1 5 <210> 19 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Ala Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Ser Cys 1 5 10 15 Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val 20 25 <210> 20 <211> 960 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (51)..(797) <400> 20 attaactgag attaaccttc cctgagtttt ctcacaccaa ggtgaggacc atg tcc 56 Met Ser 1 ctg ttt cca tca ctc cct ctc ctt ctc ctg agt atg gtg gca gcg tct 104 Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala Ala Ser 5 10 15 tac tca gaa act gtg acc tgt gag gat gcc caa aag acc tgc cct gca 152 Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala 20 25 30 gtg att gcc tgt agc tct cca ggc atc aac ggc ttc cca ggc aaa gat 200 Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp 35 40 45 50 ggg cgt gat ggc acc aag gga gaa aag ggg gaa cca ggc caa ggg ctc 248 Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly Leu 55 60 65 aga ggc tta cag ggc ccc cct gga aag ttg ggg cct cca gga aat cca 296 Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly Asn Pro 70 75 80 ggg cct tct ggg tca cca gga cca aag ggc caa aaa gga gac cct gga 344 Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp Pro Gly 85 90 95 aaa agt ccg gat ggt gat agt agc ctg gct gcc tca gaa aga aaa gct 392 Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Ala 100 105 110 ctg caa aca gaa atg gca cgt atc aaa aag tgg ctc acc ttc tct ctg 440 Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe Ser Leu 115 120 125 130 ggc aaa caa gtt ggg aac aag ttc ttc ctg acc aat ggt gaa ata atg 488 Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu Ile Met 135 140 145 acc ttt gaa aaa gtg aag gcc ttg tgt gtc aag ttc cag gcc tct gtg 536 Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala Ser Val 150 155 160 gcc acc ccc agg aat gct gca gag aat gga gcc att cag aat ctc atc 584 Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile 165 170 175 aag gag gaa gcc ttc ctg ggc atc act gat gag aag aca gaa ggg cag 632 Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln 180 185 190 ttt gtg gat ctg aca gga aat aga ctg acc tac aca aac tgg aac gag 680 Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu 195 200 205 210 ggt gaa ccc aac aat gct ggt tct gat gaa gat tgt gta ttg cta ctg 728 Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu 215 220 225 aaa aat ggc cag tgg aat gac gtc ccc tgc tcc acc tcc cat ctg gcc 776 Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala 230 235 240 gtc tgt gag ttc cct atc tga agggtcatat cactcaggcc ctccttgtct 827 Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 ttttactgca acccacaggc ccacagtatg cttgaaaaga taaattatat caatttcctc 887 atatccagta ttgttccttt tgtgggcaat cactaaaaat gatcactaac agcaccaaca 947 aagcaataat agt 960 <210> 21 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Ser Leu Phe Pro Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ser Met Val Ala 1 5 10 15 Ala Ser Tyr Ser Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys 20 25 30 Pro Ala Val Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly 35 40 45 Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln 50 55 60 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly 65 70 75 80 Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Asp 85 90 95 Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser Glu Arg 100 105 110 Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp Leu Thr Phe 115 120 125 Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu Thr Asn Gly Glu 130 135 140 Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys Val Lys Phe Gln Ala 145 150 155 160 Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu Asn Gly Ala Ile Gln Asn 165 170 175 Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu 180 185 190 Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp 195 200 205 Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu 210 215 220 Leu Leu Lys Asn Gly Gln Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His 225 230 235 240 Leu Ala Val Cys Glu Phe Pro Ile 245 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X at position 1 represents hydroxyproline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Wherein X at position 4 represents hydrophobic residue <400> 22 Xaa Gly Lys Xaa Gly Pro 1 5 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Wherein X represents hydroxyproline <400> 23 Xaa Gly Lys Leu Gly 1 5 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(15) <223> Wherein X at positions 9 and 15 represents hydroxyproline <400> 24 Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(27) <223> Wherein X at positions 3, 6, 15, 21, 24, 27 represents hydroxyproline <400> 25 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Lys Leu Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 25 <210> 26 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Gly Lys Asp Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gly Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Xaa Gly Lys Leu Gly Pro Xaa 20 25 30 Gly Asn Xaa Gly Pro Ser Gly Ser Xaa Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly 35 40 45 Asp Xaa Gly Lys Ser 50 <210> 27 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(33) <223> Wherein X at positions 3, 6, 12, 18, 21, 30, 33 represents hydroxyproline <400> 27 Gly Ala Xaa Gly Ser Xaa Gly Glu Lys Gly Ala Xaa Gly Pro Gln Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys Met Gly Pro Lys Gly Glu Xaa Gly Asp 20 25 30 Xaa <210> 28 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(45) <223> Wherein X at positions 3, 6, 9, 27, 30, 36, 42, 45 represents hydroxyproline <400> 28 Gly Cys Xaa Gly Leu Xaa Gly Ala Xaa Gly Asp Lys Gly Glu Ala Gly 1 5 10 15 Thr Asn Gly Lys Arg Gly Glu Arg Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Lys 20 25 30 Ala Gly Pro Xaa Gly Pro Asn Gly Ala Xaa Gly Glu Xaa 35 40 45 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Pro Asn Arg Val Thr Ile Lys Ala 1 5 10 15 Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile 20 <210> 30 <211> 559 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgaggctgc tgaccctcct gggccttctg tgtggctcgg tggccacccc cttgggcccg 60 aagtggcctg aacctgtgtt cgggcgcctg gcatcccccg gctttccagg ggagtatgcc 120 aatgaccagg agcggcgctg gaccctgact gcaccccccg gctaccgcct gcgcctctac 180 ttcacccact tcgacctgga gctctcccac ctctgcgagt acgacttcgt caagctgagc 240 tcgggggcca aggtgctggc cacgctgtgc gggcaggaga gcacagacac ggagcgggcc 300 cctggcaagg acactttcta ctcgctgggc tccagcctgg acattacctt ccgctccgac 360 tactccaacg agaagccgtt cacggggttc gaggccttct atgcagccga ggacattgac 420 gagtgccagg tggccccggg agaggcgccc acctgcgacc accactgcca caaccacctg 480 ggcggtttct actgctcctg ccgcgcaggc tacgtcctgc accgtaacaa gcgcacctgc 540 tcagccctgt gctccggcc 559 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 cgggcacacc atgaggctgc tgaccctcct gggc 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 gacattacct tccgctccga ctccaacgag aag 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 agcagccctg aatacccacg gccgtatccc aaa 33 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 cgggatccat gaggctgctg accctc 26 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 ggaattccta ggctgcata 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 ggaattccta cagggcgct 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 ggaattccta gtagtggat 19 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 tgcggccgct gtaggtgctg tcttt 25 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 ggaattcact cgttattctc gga 23 <210> 40 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 tccgagaata acgagtg 17 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 cattgaaagc tttggggtag aagttgttc 29 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 cgcggccgca gctgctcaga gtgtaga 27 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 cggtaagctt cactggctca gggaaata 28 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 aagaagcttg ccgccaccat ggattggctg tggaact 37 <210> 45 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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ctgcaacctc cgcctcccag gctcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 480 gagtagctgg gattataagt gcgcgctgcc acacctggat gatttttgta tttttagtag 540 agatgggatt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctcaaact cccaacctcg tgatccaccc 600 accttggcct cccaaagtgc tgggattaca ggtataagcc accgagccca gccaaaagcg 660 acttctaagc ctgcaaggga atcgggaatt ggtggcacca ggtccttctg acagggttta 720 agaaattagc cagcctgagg ctgggcacgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg 780 gaggctaagg caggtggatc acctgagggc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg 840 agaaacccca tccctaccaa aaataaaaaa ttagccaggt gtggtggtgc tcgcctgtaa 900 tcccagctac ttgggaggct gaggtgggag gattgcttga acacaggaag tagaggctgc 960 agtgagctat gattgcagca ctgcactgaa gccggggcaa cagaacaaga tccaaaaaaa 1020 agggaggggt gaggggcaga gccaggattt gtttccaggc tgttgttacc taggtccgac 1080 tcctggctcc cagagcagcc tgtcctgcct gcctggaact ctgagcaggc tggagtcatg 1140 gagtcgattc ccagaatccc agagtcaggg aggctggggg caggggcagg tcactggaca 1200 aacagatcaa aggtgagacc agcgtagggc tgcagaccag gccaggccag ctggacgggc 1260 acaccatgag gtaggtgggc 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Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 625 630 635 640 Ser Ile Asn Cys Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Ile Asn Tyr Ile Pro Trp Asn Glu Asn Ile Ile Ser Asn Phe 660 665 670 <210> 53 <211> 2091 <212> DNA <213> Rat <220> <221> CDS <222> (10)..(2067) <400> 53 tggcacaca atg agg cta ctg atc gtc ctg ggt ctg ctt tgg agt ttg gtg 51 Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val 1 5 10 gcc aca ctt ttg ggc tcc aag tgg cct gag cct gta ttc ggg cgc ctg 99 Ala Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu 15 20 25 30 gtg tcc ctg gcc ttc cca gag aag tat ggc aac cat cag gat cga tcc 147 Val Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser 35 40 45 tgg acg ctg act gca ccc cct ggc ttc cgc ctg cgc ctc tac ttc acc 195 Trp Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr 50 55 60 cac ttc aac ctg gaa ctc tct tac cgc tgc gag tat gac ttt gtc aag 243 His Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys 65 70 75 ttg acc tca ggg acc aag gtg cta gcc acg ctg tgt ggg cag gag agt 291 Leu Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser 80 85 90 aca gat act gag cgg gca cct ggc aat gac acc ttc tac tca ctg ggt 339 Thr Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly 95 100 105 110 ccc agc cta aag gtc acc ttc cac tcc gac tac tcc aat gag aag cca 387 Pro Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro 115 120 125 ttc aca gga ttt gag gcc ttc tat gca gcg gag gat gtg gat gaa tgc 435 Phe Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 aga aca tcc ctg gga gac tca gtc cct tgt gac cat tat tgc cac aac 483 Arg Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn 145 150 155 tac ctg ggc ggc tac tac tgc tcc tgc cga gtg ggc tac att ctg cac 531 Tyr Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His 160 165 170 cag aac aag cat acc tgc tca gcc ctt tgt tca ggc cag gtg ttc act 579 Gln Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr 175 180 185 190 ggg agg tct ggc ttt ctc agt agc cct gag tac cca cag cca tac ccc 627 Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro 195 200 205 aaa ctc tcc agc tgc gcc tac aac atc cgc ctg gag gaa ggc ttc agt 675 Lys Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser 210 215 220 atc acc ctg gac ttc gtg gag tcc ttt gat gtg gag atg cac cct gaa 723 Ile Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu 225 230 235 gcc cag tgc ccc tac gac tcc ctc aag att caa aca gac aag agg gaa 771 Ala Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu 240 245 250 tac ggc ccg ttt tgt ggg aag acg ctg ccc ccc agg att gaa act gac 819 Tyr Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp 255 260 265 270 agc aac aag gtg acc att acc ttt acc acc gac gag tca ggg aac cac 867 Ser Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His 275 280 285 aca ggc tgg aag ata cac tac aca agc aca gca cag ccc tgc cct gat 915 Thr Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp 290 295 300 cca acg gcg cca cct aat ggt cac att tca cct gtg caa gcc acg tat 963 Pro Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr 305 310 315 gtc ctg aag gac agc ttt tct gtc ttc tgc aag act ggc ttc gag ctt 1011 Val Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu 320 325 330 ctg caa ggt tct gtc ccc ctg aag tca ttc act gct gtc tgt cag aaa 1059 Leu Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys 335 340 345 350 gat gga tct tgg gac cgg ccg ata cca gag tgc agc att att gac tgt 1107 Asp Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys 355 360 365 ggc cct ccc gat gac cta ccc aat ggc cac gtg gac tat atc aca ggc 1155 Gly Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly 370 375 380 cct gaa gtg acc acc tac aaa gct gtg att cag tac agc tgt gaa gag 1203 Pro Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu 385 390 395 act ttc tac aca atg agc agc aat ggt aaa tat gtg tgt gag gct gat 1251 Thr Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp 400 405 410 gga ttc tgg acg agc tcc aaa gga gaa aaa tcc ctc ccg gtt tgc aag 1299 Gly Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys 415 420 425 430 cct gtc tgt gga ctg tcc aca cac act tca gga ggc cgt ata att gga 1347 Pro Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly 435 440 445 gga cag cct gca aag cct ggt gac ttt cct tgg caa gtc ttg tta ctg 1395 Gly Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu 450 455 460 ggt gaa act aca gca gca ggt gct ctt ata cat gac gac tgg gtc cta 1443 Gly Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu 465 470 475 aca gcg gct cat gct gta tat ggg aaa aca gag gcg atg tcc tcc ctg 1491 Thr Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu 480 485 490 gac atc cgc atg ggc atc ctc aaa agg ctc tcc ctc att tac act caa 1539 Asp Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln 495 500 505 510 gcc tgg cca gag gct gtc ttt atc cat gaa ggc tac act cac gga gct 1587 Ala Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala 515 520 525 ggt ttt gac aat gat ata gca ctg att aaa ctc aag aac aaa gtc aca 1635 Gly Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr 530 535 540 atc aac aga aac atc atg ccg att tgt cta cca aga aaa gaa gct gca 1683 Ile Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala 545 550 555 tcc tta atg aaa aca gac ttc gtt gga act gtg gct ggc tgg ggg tta 1731 Ser Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu 560 565 570 acc cag aag ggg ttt ctt gct aga aac cta atg ttt gtg gac ata cca 1779 Thr Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro 575 580 585 590 att gtt gac cac caa aaa tgt gct act gcg tat aca aag cag ccc tac 1827 Ile Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr 595 600 605 cca gga gca aaa gtg act gtt aac atg ctc tgt gct ggc cta gac cgc 1875 Pro Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg 610 615 620 ggt ggc aag gac agc tgc aga ggt gac agc gga ggg gca tta gtg ttt 1923 Gly Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe 625 630 635 cta gac aat gaa aca cag aga tgg ttt gtg gga gga ata gtt tcc tgg 1971 Leu Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp 640 645 650 ggt tct att aac tgt ggg ggg tca gaa cag tat ggg gtc tac acg aaa 2019 Gly Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys 655 660 665 670 gtc acg aac tat att ccc tgg att gag aac ata ata aat aat ttc taa 2067 Val Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2091 <210> 54 <211> 685 <212> PRT <213> Rat <400> 54 Met Arg Leu Leu Ile Val Leu Gly Leu Leu Trp Ser Leu Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val Ser 20 25 30 Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp Thr 35 40 45 Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His Phe 50 55 60 Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu Thr 65 70 75 80 Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro Ser 100 105 110 Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe Thr 115 120 125 Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg Thr 130 135 140 Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr Leu 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln Asn 165 170 175 Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly Arg 180 185 190 Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile Thr 210 215 220 Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala Gln 225 230 235 240 Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr Gly 245 250 255 Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser Asn 260 265 270 Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr Gly 275 280 285 Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro Thr 290 295 300 Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val Leu 305 310 315 320 Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu Gln 325 330 335 Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp Gly 340 345 350 Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly Pro 355 360 365 Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro Glu 370 375 380 Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr Phe 385 390 395 400 Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly Phe 405 410 415 Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro Val 420 425 430 Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gln 435 440 445 Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly Glu 450 455 460 Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr Ala 465 470 475 480 Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp Ile 485 490 495 Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala Trp 500 505 510 Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly Phe 515 520 525 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile Asn 530 535 540 Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser Leu 545 550 555 560 Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr Gln 565 570 575 Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile Val 580 585 590 Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro Gly 595 600 605 Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly Gly 610 615 620 Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu Asp 625 630 635 640 Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser 645 650 655 Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr 660 665 670 Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 675 680 685 <210> 55 <211> 670 <212> PRT <213> Rat <400> 55 Thr Leu Leu Gly Ser Lys Trp Pro Glu Pro Val Phe Gly Arg Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Ala Phe Pro Glu Lys Tyr Gly Asn His Gln Asp Arg Ser Trp 20 25 30 Thr Leu Thr Ala Pro Pro Gly Phe Arg Leu Arg Leu Tyr Phe Thr His 35 40 45 Phe Asn Leu Glu Leu Ser Tyr Arg Cys Glu Tyr Asp Phe Val Lys Leu 50 55 60 Thr Ser Gly Thr Lys Val Leu Ala Thr Leu Cys Gly Gln Glu Ser Thr 65 70 75 80 Asp Thr Glu Arg Ala Pro Gly Asn Asp Thr Phe Tyr Ser Leu Gly Pro 85 90 95 Ser Leu Lys Val Thr Phe His Ser Asp Tyr Ser Asn Glu Lys Pro Phe 100 105 110 Thr Gly Phe Glu Ala Phe Tyr Ala Ala Glu Asp Val Asp Glu Cys Arg 115 120 125 Thr Ser Leu Gly Asp Ser Val Pro Cys Asp His Tyr Cys His Asn Tyr 130 135 140 Leu Gly Gly Tyr Tyr Cys Ser Cys Arg Val Gly Tyr Ile Leu His Gln 145 150 155 160 Asn Lys His Thr Cys Ser Ala Leu Cys Ser Gly Gln Val Phe Thr Gly 165 170 175 Arg Ser Gly Phe Leu Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Gln Pro Tyr Pro Lys 180 185 190 Leu Ser Ser Cys Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Glu Glu Gly Phe Ser Ile 195 200 205 Thr Leu Asp Phe Val Glu Ser Phe Asp Val Glu Met His Pro Glu Ala 210 215 220 Gln Cys Pro Tyr Asp Ser Leu Lys Ile Gln Thr Asp Lys Arg Glu Tyr 225 230 235 240 Gly Pro Phe Cys Gly Lys Thr Leu Pro Pro Arg Ile Glu Thr Asp Ser 245 250 255 Asn Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Gly Asn His Thr 260 265 270 Gly Trp Lys Ile His Tyr Thr Ser Thr Ala Gln Pro Cys Pro Asp Pro 275 280 285 Thr Ala Pro Pro Asn Gly His Ile Ser Pro Val Gln Ala Thr Tyr Val 290 295 300 Leu Lys Asp Ser Phe Ser Val Phe Cys Lys Thr Gly Phe Glu Leu Leu 305 310 315 320 Gln Gly Ser Val Pro Leu Lys Ser Phe Thr Ala Val Cys Gln Lys Asp 325 330 335 Gly Ser Trp Asp Arg Pro Ile Pro Glu Cys Ser Ile Ile Asp Cys Gly 340 345 350 Pro Pro Asp Asp Leu Pro Asn Gly His Val Asp Tyr Ile Thr Gly Pro 355 360 365 Glu Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Ile Gln Tyr Ser Cys Glu Glu Thr 370 375 380 Phe Tyr Thr Met Ser Ser Asn Gly Lys Tyr Val Cys Glu Ala Asp Gly 385 390 395 400 Phe Trp Thr Ser Ser Lys Gly Glu Lys Ser Leu Pro Val Cys Lys Pro 405 410 415 Val Cys Gly Leu Ser Thr His Thr Ser Gly Gly Arg Ile Ile Gly Gly 420 425 430 Gln Pro Ala Lys Pro Gly Asp Phe Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Gly 435 440 445 Glu Thr Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ile His Asp Asp Trp Val Leu Thr 450 455 460 Ala Ala His Ala Val Tyr Gly Lys Thr Glu Ala Met Ser Ser Leu Asp 465 470 475 480 Ile Arg Met Gly Ile Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Thr Gln Ala 485 490 495 Trp Pro Glu Ala Val Phe Ile His Glu Gly Tyr Thr His Gly Ala Gly 500 505 510 Phe Asp Asn Asp Ile Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Val Thr Ile 515 520 525 Asn Arg Asn Ile Met Pro Ile Cys Leu Pro Arg Lys Glu Ala Ala Ser 530 535 540 Leu Met Lys Thr Asp Phe Val Gly Thr Val Ala Gly Trp Gly Leu Thr 545 550 555 560 Gln Lys Gly Phe Leu Ala Arg Asn Leu Met Phe Val Asp Ile Pro Ile 565 570 575 Val Asp His Gln Lys Cys Ala Thr Ala Tyr Thr Lys Gln Pro Tyr Pro 580 585 590 Gly Ala Lys Val Thr Val Asn Met Leu Cys Ala Gly Leu Asp Arg Gly 595 600 605 Gly Lys Asp Ser Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Ala Leu Val Phe Leu 610 615 620 Asp Asn Glu Thr Gln Arg Trp Phe Val Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly 625 630 635 640 Ser Ile Asn Cys Gly Gly Ser Glu Gln Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val 645 650 655 Thr Asn Tyr Ile Pro Trp Ile Glu Asn Ile Ile Asn Asn Phe 660 665 670 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 56 atgaggctgc tgaccctcct gggccttc 28 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 57 gtgcccctcc tgcgtcacct ctg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 58 cagaggtgac gcaggagggg cac 23 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 59 ttaaaatcac taattatgtt ctcgatc 27 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 60 atgaggctac tcatcttcct gg 22 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 61 ctgcagaggt gacgcagggg ggg 23 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 62 ccccccctgc gtcacctctg cag 23 <210> 63 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine <400> 63 ttagaaatta cttattatgt tctcaatcc 29 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat <400> 64 gaggtgacgc aggaggggca ttagtgttt 29 <210> 65 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat <400> 65 ctagaaacac taatgcccct cctgcgtcac ctctgca 37 <210> 66 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60 acctgcaccg tctctgggtt ctcactcagc aggggtaaaa tgggtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacacattt tttcgagtga cgaaaaatcc 180 tacaggacat cgctgaagag caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 cgacgtggag gaattgacta ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 67 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr 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180 ttctctgcct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcactagggg cgaagccggg 240 gatgaggccg actattattg tcaggtgtgg gacattgcta ctgatcatgt ggtcttcggc 300 ggagggacca agctcaccgt ccta 324 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ala Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Arg Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Arg Gly Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Ala Thr Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Gly 100 105 110 Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 115 120 <210> 72 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 Leu Glu Val Thr Cys Glu Pro Gly Thr Thr Phe Lys Asp Lys Cys Asn 1 5 10 15 Thr Cys Arg Cys Gly 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cctggtcact 540 gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcc gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 600 acctccgaga gcacagccgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 660 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 720 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 780 acgaagacct acacctgcaa cgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 840 gttgagtcca aatatggtcc cccatgccca ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga 900 ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct 960 gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 1020 tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 1080 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 1140 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc 1200 aaagccaaag ggcagccccg agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag 1260 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1320 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1380 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg 1440 caggagggga atgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca 1500 cagaagagcc tctccctgtc tctcgggaaa tga 1533 <210> 83 <211> 1533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 atgatgtcct ttgtctctct gctcctggtt ggcatcctat tccatgccac ccaggcccag 60 gtcaccttga aggagtctgg tcctgtgctg gtgaaaccca cagagaccct cacgctgacc 120 tgcaccgtct ctgggttctc actcagcagg ggtaaaatgg gtgtgagctg gatccgtcag 180 cccccaggga aggccctgga gtggcttgca cacatttttt cgagtgacga aaaatcctac 240 aggacatcgc tgaagagcag gctcaccatc tccaaggaca cctccaaaaa ccaggtggtc 300 cttacaatga ccaacatgga ccctgtggac acagccacgt attactgtgc acggatacga 360 cgtggaggaa ttgactactg gggccaggga accctggtca ctgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat ccgtcttccc cctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660 aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720 cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780 cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840 gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020 tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080 cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260 ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380 tctctcggga aagccgctgg tggtagtggt ttggaagtga cgtgtgagcc cggaacgaca 1440 ttcaaagaca agtgcaatac ttgtcggtgc 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150 155 160 Lys Lys Val Glu Thr Asn Met Ala Phe Ser Pro Phe Ser Ile Ala Ser 165 170 175 Leu Leu Thr Gln Val Leu Leu Gly Ala Gly Glu Asn Thr Lys Thr Asn 180 185 190 Leu Glu Ser Ile Leu Ser Tyr Pro Lys Asp Phe Thr Cys Val His Gln 195 200 205 Ala Leu Lys Gly Phe Thr Thr Lys Gly Val Thr Ser Val Ser Gln Ile 210 215 220 Phe His Ser Pro Asp Leu Ala Ile Arg Asp Thr Phe Val Asn Ala Ser 225 230 235 240 Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Ser Pro Arg Val Leu Ser Asn Asn Ser Asp 245 250 255 Ala Asn Leu Glu Leu Ile Asn Thr Trp Val Ala Lys Asn Thr Asn Asn 260 265 270 Lys Ile Ser Arg Leu Leu Asp Ser Leu Pro Ser Asp Thr Arg Leu Val 275 280 285 Leu Leu Asn Ala Ile Tyr Leu Ser Ala Lys Trp Lys Thr Thr Phe Asp 290 295 300 Pro Lys Lys Thr Arg Met Glu Pro Phe His Phe Lys Asn Ser Val Ile 305 310 315 320 Lys Val Pro Met Met Asn Ser Lys Lys Tyr Pro Val Ala His Phe Ile 325 330 335 Asp Gln Thr Leu Lys Ala Lys Val Gly Gln Leu Gln Leu Ser His Asn 340 345 350 Leu Ser Leu Val Ile Leu Val Pro Gln Asn Leu Lys His Arg Leu Glu 355 360 365 Asp Met Glu Gln Ala Leu Ser Pro Ser Val Phe Lys Ala Ile Met Glu 370 375 380 Lys Leu Glu Met Ser Lys Phe Gln Pro Thr Leu Leu Thr Leu Pro Arg 385 390 395 400 Ile Lys Val Thr Thr Ser Gln Asp Met Leu Ser Ile Met Glu Lys Leu 405 410 415 Glu Phe Phe Asp Phe Ser Tyr Asp Leu Asn Leu Cys Gly Leu Thr Glu 420 425 430 Asp Pro Asp Leu Gln Val Ser Ala Met Gln His Gln Thr Val Leu Glu 435 440 445 Leu Thr Glu Thr Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ile Ser Val 450 455 460 Ala Arg Thr Leu Leu Val Phe Glu Val Gln Gln Pro Phe Leu Phe Val 465 470 475 480 Leu Trp Asp Gln Gln His Lys Phe Pro Val Phe Met Gly Arg Val Tyr 485 490 495 Asp Pro Arg Ala 500 <210> 87 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr His Pro Asp Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Asp Phe Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 88 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Thr Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 89 Ser Tyr Leu Met Ser 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 90 Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Tyr His Pro Asp Ser Met Lys 1 5 10 15 Gly <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 91 His Gly Asp Phe Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 92 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Thr Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 93 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 94 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 94 Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr 1 5 <210> 95 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgaagc ctggagggtc cctaaaactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt agttatctta tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacttaccat 180 ccagacagta tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacatggg 300 gactttggta actacttcga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 96 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcgggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtggaa cccaaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 ttcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgg 339 <210> 97 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 97 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ala Thr 20 25 30 Tyr Trp Gly Val Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Ser Asp Glu Lys Ser Tyr Arg Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Arg Arg Gly Gly Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 98 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 98 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr 35 40 45 Gln Asp Lys Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

Claims (55)

  1. SARS-CoV-2로 감염된 포유류 대상체에서 급성 호흡기 장애 증후군, 폐렴 또는 일부 다른 폐 또는 COVID-19의 다른 급성 징후, 예컨대 혈전증을 치료, 억제, 완화 또는 예방하는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 결정하는 단계로, 건강한 대조군 샘플과 비교하여 MASP-2/C1-INH 복합체의 증가된 수준은 COVID-19의 하나 이상의 급성 징후가 발생할 위험의 증가를 나타내는 것인 단계; 및
    (ii) 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계로, 선택적으로 상기 MASP-2 억제제의 양은 MASP-2/C1-INH의 수준을 대조군 수준 또는 참조 표준으로 감소시키기에 충분한 것인 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부분에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 보체 시스템의 상이한 항원에 결합하는 것보다 적어도 10배 더 큰 친화도로 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q 의존성 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, MASP-2 억제제는 소분자 MASP-2 억제 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, MASP-2 억제 화합물은 합성 또는 반합성 소분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, MASP-2 억제제는 피하로, 복강내로, 근육내로, 동맥내로, 정맥내로, 경구로, 또는 흡입제로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제2항에 있어서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제2항에 있어서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. SARS-CoV-2로 감염된 포유류 대상체에서 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증을 치료, 개선, 예방 또는 발병할 위험을 감소시키는 방법으로서,
    (i) 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 결정하는 단계로, 건강한 대조군 샘플과 비교하여 MASP-2/C1-INH 복합체의 증가된 수준은 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증이 발생할 위험의 증가를 나타내는 것인 단계; 및
    (ii) 증가된 수준의 MASP-2/C1-INH 복합체를 가진 대상체에게 MASP-2 의존성 보체 활성화를 억제하기에 효과적인 양의 MASP-2 억제제를 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2 항체 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, MASP-2 억제제는 서열 번호:6의 일부분에 특이적으로 결합하는 MASP-2 단클론성 항체, 또는 그것의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, MASP-2 항체 또는 그것의 단편은 서열 번호:6을 포함하는 폴리펩타이드에 보체 시스템의 상이한 항원에 결합하는 것보다 10배 더 큰 친화도로 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 재조합 항체, 감소된 이펙터 기능을 가진 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, MASP-2 억제제는 실질적으로 C1q 의존성 보체 활성화를 억제하지 않으면서 렉틴 경로 보체 활성화를 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, MASP-2 억제제는 소분자 MASP-2 억제 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, MASP-2 억제 화합물은 합성 또는 반합성 소분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항에 있어서, MASP-2 억제제는 MASP-2의 발현 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제14항에 있어서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69로서 제시된 아미노산 서열의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제14항에 있어서, MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 서열 번호:67을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:69를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제13항에 있어서, 하나 이상의 COVID-19 관련 장기 후유증은 심혈관 합병증(심근 손상, 심근병증, 심근염, 혈관내 응고, 뇌졸중, 정맥 및 동맥 합병증, 및 폐 혈전증 포함); 신경학적 합병증(인지 장애, 착란, "브레인 포그"로도 언급되는 기억 상실, 두통, 뇌졸중, 현기증, 실신, 발작, 식욕부진, 불면증, 후각상실증, 미각장애, 간대성 근경련, 신경병성 통증, 근육통, 알츠하이머병, 길랑 바레 증후군, 밀러-피셔 증후군, 파킨슨병과 같은 신경학적 질환의 발생 포함); 신장 손상(예컨대 급성 신장 손상(AKI)); 폐 합병증(폐 섬유증, 호흡곤란, 폐색전증 포함); 카와사키병, 카와사키 유사 질환, 아동의 다기관 염증 증후군, 다기관 장기 부전과 같은 염증 상태, 극심한 피로, 근육 약화, 미열, 집중력 저하, 기억 상실, 기분 변화, 수면 장애, 팔다리의 바늘 통증, 설사 및 구토, 미각 및 후각 상실, 인후염 및 삼키기 어려움, 당뇨병 및 고혈압의 새로운 발병, 피부 발진, 숨가쁨, 흉통 및 심계항진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. C1-INH와의 복합체에서 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로서, 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하거나, 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것인 단클론성 항체 또는 단편.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호:87로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:88로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 경쇄 가변 영역; 또는 서열 번호:97로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 중쇄 가변 영역 및 서열 번호:98로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 가진 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론성 항체.
  27. 제25항에 있어서, 상기 항체는 인간화된, 키메라 또는 완전히 인간 항체인 것을 특징으로 하는 단클론성 항체.
  28. 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH의 양을 측정하는 방법으로서,
    (a) 인간 대상체로부터 테스트 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 테스트 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체를 포획 및 검출하는 단계를 포함하는 면역검정을 수행하는 단계로, MASP-2/C1-INH 복합체는 인간 MASP-2에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체로 포획되고; MASP-2/C1-INH 복합체는 C1-INH에 특이적으로 결합하는 항체로 직접 또는 간접적으로 검출되는 것인 단계; 및
    (c) (b)에 따라 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준을 미리 결정된 수준 또는 대조군 샘플과 비교하는 단계로, 테스트 샘플에서 검출된 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 렉틴 경로 보체 활성화의 정도를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 유체 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제28항에 있어서, MASP-2에 특이적으로 결합하는 항체는 (a) 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하거나, 또는 (b) 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 인간 대상체는 현재 SARS-CoV-2로 감염되었거나, 또는 이전에 SARS-CoV-2로 감염되었거나, 또는 대상체는 또 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애(예컨대, COVID-19, HSCT-TMA, IgAN, GvHD)를 앓고 있거나 또는 발병의 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. SARS-CoV-2로 감염된 또는 감염되었던 대상체가 COVID-19 관련 ARDS 또는 다른 좋지 못한 결과, 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 발병할 위험을 결정하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    (b) 샘플 중의 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (c) 측정된 수준을 MASP-2/C1-INH 복합체의 미리 결정된 수준 또는 참조 표준과 비교하여 COVID-19 관련 ARDS 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증이 발병할 위험을 평가하는 단계; 및
    (d) 대상체의 COVID-19 관련 ARDS 또는 다른 좋지 못한 결과 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증의 발병 위험을 결정하고 그 결과를 환자, 의사 또는 데이터베이스에게 보고하는 단계;
    (e) 선택적으로, 급성 질환 및/또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증 감염이 발병할 가능성이 있는 것으로 결정된 대상체에게 치료를 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, MASP-2/C1-INH 복합체의 수준은 면역검정으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 방법은 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 측정하기 위하여 면역검정을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 면역검정은 ELISA 검정 또는 비드 기반 검정인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 면역검정은 MASP-2에 특이적으로 결합하는 포획 항체의 사용을 포함하며 항체는 서열 번호:87로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:88로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 면역검정은 비드 기반 면역형광 검정인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 면역검정은 MASP-2에 특이적으로 결합하는 포획 항체의 사용을 포함하며 항체는 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 생물학적 샘플은 1% 내지 5% 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 필요로 하는 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로의 치료 효능을 모니터링하는 방법으로서,
    (a) 제1 시점에 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량을 포유류 대상체에게 투여하는 단계;
    (b) 단계 (a) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제1 수준을 평가하는 단계;
    (c) 제2 시점에 대상체를 MASP-2 억제 항체, 또는 그것의 항원 결합 단편으로 치료하는 단계;
    (d) 단계 (c) 후에 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 MASP-2/C1-INH 복합체의 제2 수준을 평가하는 단계; 및
    (e) 단계 (b)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 단계 (d)에서 평가된 MASP-2/C1-INH 복합체 수준과 비교하여 포유류 대상체에서 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 효능을 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 방법은 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량을 조정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 대상체에게 투여된 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편의 용량은 만약 MASP-2/C1-INH 복합체의 수준이 대조군 또는 참조 표준보다 높다면 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 만약 대상체에게 증가된 용량의 MASP-2 억제 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이 투여된다면, 각각의 대조군 또는 참조 표준과 비교하여 증가된 용량이 MASP-2/C1-INH 복합체 수준을 원하는 수준으로 조정하기에 충분한지의 여부를 결정하기 위하여 단계 (b) 내지 (e)가 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제41항에 있어서, 단계 (b) 및 (d)는 면역검정에서 생물학적 샘플 중의 MASP-2/CI-INH 복합체의 농도를 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 면역검정은 비드 기반 면역형광 검정인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 면역검정은 MASP-2에 특이적으로 결합하는 포획 항체의 사용을 포함하고 항체는 서열 번호:97로서 제시된 중쇄 가변 영역에 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하고 서열 번호:98로서 제시된 경쇄 가변 영역에 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 생물학적 샘플은 1% 내지 5% 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 대상체는 인간 대상체인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 인간 대상체는 HSCT-TMA, IgAN, 루푸스 신염 및 이식편대숙주병 또는 일부 다른 렉틴 경로 질환 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 렉틴 경로 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제41항에 있어서, 인간 대상체는 COVID-19 또는 COVID-19와 관련된 장기 후유증을 앓고 있거나, 또는 발병의 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제41항에 있어서, 제2 시점은 제1 시점 후 2 내지 14일인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제41항에 있어서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 2 내지 7일 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제41항에 있어서, 제2 시점은 제1 시점으로부터 2 내지 4일 이내인 것을 특징으로 하는 방법.
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