CN112638417A - 用于治疗各种血栓性疾病和病症的抑制masp-2的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗各种血栓性疾病和病症的抑制masp-2的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

一方面，本发明提供用于预防、减轻和/或治疗与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病、病症或病况的组合物和方法，其包括将治疗量的MASP‑2抑制性抗体给予有需要的受试者。在一些实施方案中，本发明的方法提供抗凝血和/或抗血栓形成和/或抗血栓生成而不影响止血。在本发明这一方面的一个实施方案中，所述组合物和方法可用于治疗患有与由纤维蛋白或活化血小板引发的补体相关炎症、过度凝血或接触系统活化相关的疾病、病症或病况或有风险发展所述疾病、病症或病况的受试者。

Description

用于治疗各种血栓性疾病和病症的抑制MASP-2的组合物和 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月22日提交的美国临时申请号62/688,611的权益，其通过引用整体结合于此。
关于序列表的声明
本申请随附的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并由此通过引用结合到本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为MP_1_0252_PCT_Sequence_Listing_20190620.txt；文本文件为26 KB；创建于2019年6月20日；和经过EFS-Web随本说明书的申请一起提交。
背景
补体系统提供在人和其它脊椎动物中起始、扩大和协调对微生物感染和其它急性损伤的免疫反应的早期作用机制(M.K. Liszewski和J.P. Atkinson, 1993, Fundamental Immunology, 第三版, 由W.E. Paul编辑, Raven Press, Ltd., New York)。尽管补体活化对潜在的病原体提供重要的第一线防御，但促进防护性免疫反应的补体活性也可代表对宿主的潜在威胁(K.R. Kalli等, Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994;B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例如，C3和C5蛋白水解产物募集和活化中性粒细胞。尽管对宿主防御是必不可少的，但活化的中性粒细胞无差别地释放破坏性的酶并可导致器官损伤。另外，补体活化可引起溶解的补体组分沉积在邻近的宿主细胞上以及微生物靶上，导致宿主细胞溶解。
目前，广为接受的是，补体系统可通过三个不同的途径活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常通过包含与外来颗粒(即，抗原)结合的宿主抗体的复合物触发，并因此需要在先暴露于抗原以产生特异性抗体反应。因为经典途径的活化依赖于通过宿主的在先的适应性免疫反应，因此经典途径是获得性免疫系统的一部分。相比之下，凝集素和替代途径两者均不依赖于适应性免疫，并且是先天性免疫系统的一部分。
广泛认为在首次感染的宿主中，凝集素途径在宿主防御感染方面具有重要作用。MBL参与宿主防御的有力证据来自功能MBL的血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick,Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002))。这样的患者显示对复发细菌和真菌感染的易感性。在生命的早期，因为母体来源的抗体滴度减弱，在易损性的表观窗口期间，但在抗体反应的完全库发展之前，这些症状通常是明显的。该综合征经常因为MBL的胶原部分的数个位点的突变导致，其干扰MBL寡聚体的正确形成。然而，因为MBL可起不依赖于补体的调理素的作用，尚不清楚对感染的易感性增加归因于受损的补体活化的程度。
除了其在免疫防御中的基本作用之外，在许多临床条件下补体系统还有助于组织损伤。因此，对开发治疗上有效的补体抑制剂以预防这些不良作用存在迫切的需要。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种预防、减轻和/或治疗与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括将治疗量的MASP-2抑制性抗体给予有需要的受试者。在一些实施方案中，本发明的方法提供抗凝血和/或抗血栓形成和/或抗血栓生成而不影响止血。在本发明这一方面的一个实施方案中，所述方法可用于治疗患有与由纤维蛋白或活化血小板引发的补体相关炎症、过度凝血或接触系统活化相关的疾病、病症或病况或有风险发展所述疾病、病症或病况的受试者。在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有选自以下的疾病、病症或病况的受试者：动脉血栓形成、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、手术后血栓形成、冠状动脉旁路移植术和/或介入性心血管手术(例如血管成形术或支架置换)后的再狭窄、动脉粥样硬化、斑块破裂、斑块不稳定、再狭窄、低血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、弥散性血管内凝血(DIC)、静脉闭塞性疾病(VOD)、镰状细胞病、血栓性微血管病、狼疮性肾炎、浅表性血栓性静脉炎、因子V Leiden突变、缺血/再灌注损伤、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、正在接受激素替代疗法(HRT)、阿尔茨海默氏病和/或患有高凝状态，例如其中所述受试者由于以下中的至少一种或多种而患有获得性高凝状态或有风险发展获得性高凝状态：正在进行用选自5-FU、GM-CSF、顺铂、肝素、COX-2抑制剂、造影剂、皮质类固醇和抗精神病药的药物的疗法；静脉淤滞(由于固定、手术等引起的)、抗磷脂综合征、癌症(早幼粒细胞白血病、肺、乳腺、前列腺、胰腺、胃和结肠肿瘤)；由于创伤或手术而引起的组织损伤、中央静脉中存在导管、参与血凝块形成的蛋白(例如蛋白C)的获得性缺乏、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、同型半胱氨酸水平升高、心力衰竭、机械瓣膜存在、伴原位血栓形成的肺动脉高压、心房颤动、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、肝素诱发的血小板减少症和血栓形成(HITT)、伴原位血栓的川崎病、伴原位血栓的Takayasu动脉炎、转移性癌症的血栓形成倾向、因子VIII水平升高、妊娠和炎性肠病(IBD)。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病、病症或病况，例如其中所述适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病或病症选自遗传性血管性水肿、糖尿病性黄斑水肿和在心肺分流术期间的出血。在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病、病症或病况，例如其中所述适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症选自动脉血栓形成、静脉血栓形成、肺栓塞、心房颤动、肝素诱发的血小板减少症、从一种抗凝剂转换为另一种抗凝剂、以及用于危重HIT患者(维持)的连续肾脏替代疗法(CRRT)的体外循环通畅的标签外使用。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定先前已经经历、当前患有、或有风险发展心房颤动的受试者，和以足以降低所述受试者中风风险的量给予MASP-2抑制性抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展适于用因子XII抑制剂治疗的疾病、病症或病况，例如其中所述适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症选自深静脉血栓形成(一级预防和扩展疗法两者)、肺栓塞、非瓣膜性心房颤动、在伴有或没有心房颤动的受试者中急性冠状动脉综合征后复发性缺血的预防、终末期肾脏疾病、脑缺血、心绞痛、减少或防止与植入医疗设备(例如瓣膜、小口径移植物等)和/或体外循环相关的血凝块。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定先前已经经历、当前患有、或有风险发展非瓣膜性心房颤动的受试者，和以足以降低所述受试者中风和/或栓塞风险的量给予MASP-2抑制性抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗被确定具有引起或增加发展高凝状态的遗传缺陷的受试者，例如其中遗传缺陷选自凝血酶原20210基因突变、MTHFR突变、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、蛋白A缺乏、蛋白Z缺乏、抗凝血酶缺乏症和导致血栓形成倾向的遗传病症。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有增加血栓栓塞倾向的获得性疾病、病症或病况的受试者，例如其中所述增加血栓栓塞倾向的获得性疾病或病症选自动脉粥样硬化、抗磷脂抗体、癌症(例如早幼粒细胞白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌或结肠癌)、高同型半胱氨酸血症、感染、组织损伤、静脉淤滞(例如由于手术、骨科或麻痹性固定、心力衰竭、妊娠或肥胖)以及服用含有雌激素的口服避孕药的受试者。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于在需要抗凝疗法的受试者中提供标准抗凝疗法例如华法林的替代，例如其中受试者患有通常禁止标准抗凝疗法的病况(例如CNS淀粉样血管病)，或其中在否则用标准抗凝疗法的受试者中所述MASP-2抑制性抗体作为桥接剂在围手术期给予。
根据本文描述的本发明的方法的任何实施方案，MASP-2抑制性抗体优选是MASP-2单克隆抗体或其片段，其特异性结合SEQ ID NO: 5的一部分。在一些实施方案中，MASP-2抗体是嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是选自Fv、Fab、Fab'，F(ab)2和F(ab')2的抗体片段。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是单链分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体选自IgG1分子、IgG2和IgG4分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是包含S228P突变的IgG4分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一些实施方案中，MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含：i)重链CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 6的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 6的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR-H3，其包含SEQ IDNO: 6的95-107的氨基酸序列，以及(b)轻链可变区，其包含：i) 轻链CDR-L1，其包含SEQ IDNO: 7的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 7的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 7的89-97的氨基酸序列。在一些实施方案中，MASP-2抑制性单克隆抗体包含SEQ ID NO: 6所示的重链可变区和SEQ ID NO: 7所示的轻链可变区。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段特异性地识别由参考抗体识别的表位的至少一部分，所述参考抗体包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQID NO:7所示的轻链可变区。
在参考以下详细描述和附图时，本文描述的发明的这些和其它方面以及实施方案将变得明显。本说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用全文并入本文，就好像它们各自单独并入一样。
附图说明
当结合附图时，本发明的前述方面和许多附带的优势将变得更易理解，如同参考下面的详细描述将变得更好理解一样，其中：
图1是由Yongqing等, BBA 1824:253 (2012)修改的改编自Schwaeble等,Immunobiol 205:455-466 (2002)的示意图，说明MASP-2和MAp19蛋白结构域以及编码所述结构域的外显子；
图2A图示说明在酵母聚糖包被的微量滴定板上的凝集素途径特异的C4b沉积，这是在皮下给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后的各个时间点从小鼠(n = 3只小鼠/组)取得的未稀释血清样品中离体测得的，如实施例6中所述的；
图2B图示说明在小鼠中以0.6mg/kg单次腹膜内给予小鼠MASP-2 MoAb后三周中凝集素途径恢复的时间过程，如实施例6中所述的；
图3A和3B表示在正常大鼠血清中给予MASP-2 Fab2抗体(H1)后，抑制C4b沉积(图3A)和抑制凝血酶活化的剂量反应曲线，如实施例8中所述的；
图4A和4B表示在弥散性血管内凝血的局部Schwartzman反应模型中，与在未处理的野生型小鼠和其中补体途径被耗尽剂眼镜蛇毒因子(CVF)和末端途径抑制剂(C5aR拮抗剂)抑制的野生型小鼠中(图4A)的血小板聚集相比，在MASP-2 (-/-)小鼠中(图4B)测量的血小板聚集(表示为聚集面积)，如实施例9中所述的；
图5说明蛋白质印迹分析的结果，表明由a'链的存在所证明的通过凝血酶底物FXIa和FXa的人C3的活化，如实施例10中所述的；
图6图示说明在LPS注射MASP-2 -/-和WT小鼠后，微血管阻塞起始的时间，显示经60分钟测量的具有血栓形成的小鼠的百分比，证明在15分钟后在WT小鼠中检出血栓形成，多达80%的WT小鼠证实了在60分钟时血栓形成；相比之下，在60分钟期间没有MASP-2 -/-小鼠显示任何血栓形成(对数秩：p=0.0005)，如实施例11中所述的；
图7图示说明，作为损伤诱导后的时间的函数，在注射FITC/葡聚糖之前16小时和1小时通过给予同种型对照或人MASP-2抗体mAbH6 (10mg/kg)处理后在FITC/葡聚糖UV模型中具有微血管阻塞的小鼠的百分比，如实施例12中所述的；
图8图示说明用人MASP-2抗体(mAbH6)和同种型对照抗体处理的小鼠的阻塞时间(分钟)，其中数据报告为散点，带有平均值(水平条)和标准误差条(垂直条)。用于分析的统计学检验是非配对t检验；其中符号“*”表示p=0.0129，如实施例12中所述的；
图9图示说明在用低光强度(800-1500)的FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤血栓形成模型中，对于野生型小鼠、MASP-2 KO小鼠和诱导血栓形成之前16小时和再次在之前1小时通过i.p.给予10mg/kg人MASP-2抗体(mAbH6)预处理的野生型小鼠的直到阻塞的时间(分钟)，如实施例12中所述的；
图10A图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由MASP-2-抗凝血酶复合物形成(MASP-2-ATIII)测定的MASP-2活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断MASP-2活化，而对照抗体则无作用，如实施例14中所述的；
图10B图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由MASP-2-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物形成(MASP-2-C1-INH)测定的MASP-2活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断MASP-2活化，而对照抗体则无作用，如实施例14中所述的；
图11A图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由激肽释放酶-抗凝血酶复合物形成(KK-ATIII)测定的激肽释放酶活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断激肽释放酶活化，而溶媒对照则无作用，如实施例14中所述的；
图11B图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由激肽释放酶-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物形成(KK-C1-INH)测定的激肽释放酶活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断激肽释放酶活化，而溶媒对照则无作用，如实施例14中所述的；
图12A图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由因子XII-抗凝血酶复合物形成(FXIIa-ATIII)测定的因子XII活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断因子XII活化，而对照抗体则无作用，如实施例14中所述的；
图12B图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由因子XII-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物形成(FXIIa-C1-INH)测定的因子XII活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断因子XII活化，而对照抗体则无作用，如实施例14中所述的。
序列表说明
SEQ ID NO: 1人MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 2人MASP-2蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO: 3人MASP-2蛋白(成熟)
SEQ ID NO: 4大鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO: 5大鼠MASP-2蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:6 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:7 17D20_dc21N11VL (OMS646) 轻链可变区(VL)多肽
详细说明
I.定义
除非本文明确定义，否则本文使用的所有术语具有与本发明技术领域的普通技术人员所理解的相同的含义。当术语用于说明书和权利要求书中以描述本发明时，为提供关于术语的清楚性，提供以下定义。
如本文所用的，术语“MASP-2-依赖性补体活化”包括MASP-2凝集素依赖性活化，其在Ca++存在的情况下发生，导致形成凝集素途径C3转化酶C4b2a和在C3裂解产物C3b积聚时，随后形成C5转化酶C4b2a(C3b)n，其已经确定引起调理素作用和/或裂解。
如本文所用的，术语"凝集素途径"是指补体活化，其经过血清和非-血清糖结合蛋白的特异性结合发生，所述糖结合蛋白包括甘露聚糖-结合凝集素(MBL)、CL-11和纤维胶凝蛋白(ficolin) (H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)。如本文所述的，凝集素途径是MASP-2依赖性的。如本文所用的，使用含Ca++的缓冲液评估凝集素途径的活化。
如本文所用的，术语"经典途径"是指补体活化，其通过与外来颗粒结合的抗体触发并且需要结合识别分子C1q。
如本文所用的，术语"MASP-2抑制性抗体"是指与MASP-2结合或直接相互作用并抑制MASP-2-依赖性补体活化的任何抗体，包括MASP-2抗体和其MASP-2抗原结合片段。可用于本发明的方法的MASP-2抑制性抗体可减少MASP-2-依赖性补体活化超过10%，例如超过20%，超过50%，或超过90%。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体减少MASP-2-依赖性补体活化超过90% (即，导致仅10%或更小的MASP-2补体活化)。直接的MASP-2抑制性抗体的实例是MASP-2特异性抑制性抗体，例如以至少为补体系统中的其它组分10倍的结合亲和力特异性结合MASP-2 (SEQ ID NO: 2)的一部分的MASP-2抑制性抗体。
如本文所用的，术语"抗体"包括源自任何产生抗体的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔和灵长类动物包括人)或杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达或转基因动物(或产生抗体或抗体片段的其它方法)的抗体和其抗体片段，其特异性地结合靶多肽，例如MASP-多肽或其部分。术语“抗体”不意欲受限于抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物、肽合成等)。示例性的抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；泛-特异性、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体)；人源化的抗体；鼠抗体；嵌合的小鼠-人、小鼠-灵长类动物、灵长类动物-人单克隆抗体；和抗独特型抗体，和可以是任何完整的抗体或其片段。如本文所用的，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体、包括具有所需特异性的抗原-结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化的抗体、嵌合抗体和包括具有所需特异性的抗原-结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。
“单克隆抗体"是指同质抗体群，其中所述单克隆抗体包括参与表位的选择性结合的氨基酸(天然存在和非天然存在的)。单克隆抗体对靶抗原具有高度特异性。术语"单克隆抗体"不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原-结合部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合的单克隆抗体和包括具有所需特异性和结合表位的能力的抗原-结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。不意欲限制抗体的来源或其制备方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体筛选、重组表达、转基因动物等)。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上述在"抗体"的定义下的片段等。
如本文所用的，术语"抗体片段"是指源自全长抗体例如MASP-2抗体或与全长抗体例如MASP-2抗体有关的部分，通常包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的，"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。一般而言，Fv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够使scFv形成抗原结合所需的结构。
如本文所用的，"嵌合抗体"是包含源自非人物种(例如，啮齿动物)抗体的可变结构域和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的其余部分源自人抗体。
如本文所用的，"人源化的抗体"是嵌合抗体，其包括符合源自移植到人抗体框架中的非人免疫球蛋白的特异性互补决定区的最小序列。人源化的抗体通常是重组蛋白，其中仅抗体互补决定区具有非人来源(包括从噬菌体展示或酵母产生的抗体)。
如本文所用的，术语"甘露聚糖-结合凝集素" ("MBL")等同于甘露聚糖-结合蛋白("MBP")。
如本文所用的，"膜攻击复合物" ("MAC")是指插入到膜中并破坏膜的末端5种补体组分(C5b与C6、C7、C8和C9组合)的复合物(亦称为C5b-9)。
如本文所用的，"受试者"包括所有哺乳动物，包括而不限于人、非-人灵长类动物、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。
如本文所用的，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala;A)、天冬酰胺(Asn;N)、天冬氨酸(Asp;D)、精氨酸(Arg;R)、半胱氨酸(Cys;C)、谷氨酸(Glu;E)、谷氨酰胺(Gln;Q)、甘氨酸(Gly;G)、组氨酸(His;H)、异亮氨酸(Ile;I)、亮氨酸(Leu;L)、赖氨酸(Lys;K)、甲硫氨酸(Met;M)、苯丙氨酸(Phe;F)、脯氨酸(Pro;P)、丝氨酸(Ser;S)、苏氨酸(Thr;T)、色氨酸(Trp;W)、酪氨酸(Tyr;Y)和缬氨酸(Val;V)。
在最广泛的意义上，根据各个氨基酸的侧链的化学性质，天然存在的氨基酸可分成多个组。"疏水"氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。"亲水"氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的这种分组可进一步如下细分。"不带电荷亲水"氨基酸是指Ser、Thr、Asn或Gln。"酸性"氨基酸是指Glu或Asp。"碱性"氨基酸是指Lys、Arg或His。
如本文所用的，术语"保守氨基酸置换"通过在以下各组内的氨基酸中置换来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
如本文所用的术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。该术语还涵盖了包含天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(主链)键以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸的那些寡核苷碱基。
如本文所用的，"表位"是指抗体所结合的蛋白(例如，人MASP-2蛋白)上的位点。"重叠表位"包括至少一个(例如，2、3、4、5或6个)共同氨基酸残基，包括线性和非线性表位。
如本文所用的，术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"可互换使用，意指任何肽-连接的氨基酸链，无论长度或翻译后修饰如何。本文所述的MASP-2蛋白可包含或可以是野生型蛋白，或可以是具有不超过50个(例如，不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个)保守氨基酸置换的变体。保守置换通常包括在以下组内的置换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。
本文所述的人MASP-2蛋白(如SEQ ID NO: 2所示)还包括所述蛋白的“肽片段”，其比全长和/或未成熟的(前-原)MASP-2蛋白短，包括MASP-2蛋白的肽片段，包括该蛋白的末端以及内部缺失变体。缺失变体可以缺少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸区段(2个或更多个氨基酸的区段)或不连续的单个氨基酸。
在一些实施方案中，人MASP-2蛋白可具有这样的氨基酸序列，其与具有SEQ IDNO: 2中所示的氨基酸序列的人MASP-2蛋白具有等于或大于70 (例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100)%同一性。
在一些实施方案中，肽片段可以是至少6个(例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500或600个或更多个)氨基酸残基长度(例如，SEQ ID NO: 2或3的至少6个连续的氨基酸残基)。在一些实施方案中，人MASP-2蛋白的抗原肽片段少于500个(例如，少于450、400、350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个)氨基酸残基长度(例如，SEQ ID NO:2或3的任一个中少于500个连续的氨基酸残基)。
在一些实施方案中，在产生结合MASP-2的抗体的情况下，肽片段是抗原性的并且保留全长蛋白在哺乳动物中诱导抗原性反应的能力的至少10％(例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％或更多)(请参见下文“生产抗体的方法”下的内容)。
百分比(%)氨基酸序列同一性定义为在比对序列和引入缺口(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性后，在候选序列中与参比序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为确定百分比序列同一性的目的，比对可以本领域技术内的各种方法实现，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。用于测量比对的合适参数，包括在待比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法，可通过已知的方法确定。
在代表性的实施方案中，人MASP-2蛋白(SEQ ID NO: 2)由SEQ ID NO: 1所示的cDNA序列编码。本领域技术人员将认识到，SEQ ID NO: 1中公开的cDNA序列代表人MASP-2的单个等位基因，并且预期发生等位基因变异和可变剪接。SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的等位基因变体，包括含有沉默突变的那些和其中突变导致氨基酸序列改变的那些，均在本发明的范围内。MASP-2序列的等位基因变体可以根据标准程序通过探查来自不同个体的cDNA或基因组文库而克隆，或者可以通过包含此类信息的数据库的同源性比较检索(例如BLAST检索)来鉴定。
凝集素途径
MASP-2在识别组分与其各自模式结合后被激活，并且也可以被MASP-1激活，随后将补体组分C4裂解为C4a和C4b。在裂解产物C4b与血浆C2结合后，C4b结合的C2成为第二个MASP-2介导的裂解步骤的底物，该步骤将C4b结合的C2转化为酶活性复合物C4bC2a和小的C2b裂解片段。C4b2a是凝集素途径的C3转化性C3转化酶，将丰富的血浆组分C3转化为C3a和C3b。C3b通过硫酯键与任何紧密邻近的表面结合。如果几个C3b片段紧密邻近结合C3转化酶复合物C4b2a，则此转化酶改变其特异性，将C5转化为C5b和C5a，形成C5转化酶复合物C4b2a(C3b)n。尽管此C5转化酶可以启动MAC的形成，但据认为该过程不足以凭自身有效促进裂解。而是，由凝集素途径产生的初始C3b调理素形成核，以供形成新的替代途径C3转化酶和C5转化酶位点，这最终导致大量的MAC形成和裂解。在不存在C4的情况下，还有一条依赖MASP-2的C4旁路活化途径可激活C3，这在缺血再灌注损伤的病理生理中起着重要作用，因为C4缺陷小鼠不受缺血再灌注损伤的保护而MASP-2缺陷小鼠受此保护(Schwaeble等，PNAS，2011，同上)。如本文所述，MASP-2依赖性补体活化也与凝血途径相关，涉及凝血酶原裂解为凝血酶(普通途径)以及因子XII(Hageman因子)的裂解以转化为其酶活性形式XIIa。因子XIIa进而将因子XI裂解为XIa(内在途径)。凝血级联的内在途径活化导致纤维蛋白形成，这对于血栓形成至关重要。
MASP-2依赖性活化途径，导致形成凝集素途径C3转化酶C4b2a和在C3裂解产物C3b积聚时，随后形成C5转化酶C4b2a(C3b)n。在缺乏补体C4的情况下，MASP-2可以形成涉及C2和凝血因子XI的替代C3转化酶复合物。如本文实施例14所证明的，凝集素途径经由MASP-2的活化触发凝血和接触系统的活化。预期这将导致额外的凝血，从而驱动反馈循环，导致过多且不受控制的血凝块形成。该反馈循环预期促进血栓性病症。如本文进一步证明的，MASP-2形成这种串扰(cross-talk)的纽带，并且MASP-2抑制性抗体对MASP-2的抑制作用阻断因子XII活化和激肽释放酶活化，从而表明MASP-2抑制性抗体的治疗性用途预期减少凝血和接触级联的过度活化。
除了其在裂解中的作用外，MASP-2驱动的活化途径在细菌调理作用中也起着重要作用，导致微生物被共价结合的C3b及其裂解产物(即iC3b和C3dg)包被，这些将被靶向以被含C3受体的吞噬细胞(例如粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、小胶质细胞和网状内皮系统)摄取和杀伤。这是清除对补体裂解有抵抗力的细菌和微生物的最有效途径。这些包括大多数革兰氏阳性细菌。
MASP-2的背景
目前已知三种甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶(MASP-1、MASP-2和MASP-3)在人血清中与甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关。甘露聚糖结合凝集素在最近的文献中也称为“甘露糖结合蛋白”或“甘露糖结合凝集素”。MBL-MASP-2复合物通过MBL与多种微生物中存在的碳水化合物结构的结合，在先天免疫中起重要作用。MBL与特定系列的碳水化合物结构的相互作用导致MASP酶原的激活，进而通过裂解补体组分C4和C2形成C3转化酶C4b2b来激活补体(Kawasaki等，J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176:1497-1502 (1992); Ji等, J. Immunol 150:571-578 (1993))。
直到最近，MBL-MASP酶原复合物仍被认为仅包含一种蛋白酶(MASP-1)，但现在清楚的是，还有另外两种不同的与MBL相关的蛋白酶(即MASP-2和MASP-3) (Thiel等，Nature386:506-510 (1997); Dahl等, Immunity 15:127-135 (2001))，以及19 kDa的另外的血清蛋白，称为“MAp19”或“sMAP”(Stover等，J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover等, J. Immunol 163:6848-6859 (1999); Takahashi等，Int. Immunol 11:859-63(1999))。
MAp19是MASP-2结构基因的可变剪接的基因产物，缺少MASP-2的四个C端结构域，包括丝氨酸内肽酶结构域。编码MAp19的大量表达的截短的mRNA转录物由MASP-2基因的可变剪接/聚腺苷酸化事件产生。通过类似的机制，MASP-1/3基因产生三种主要的基因产物，两种丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-3以及称为“MAp44”的44kDa的截短基因产物(Degn等，J. Immunol 183(11):7371-8 (2009); Skjoedt等, J Biol Chem 285:8234-43 (2010))。
MASP-1首先被描述为血清Ra反应因子的P-100蛋白酶组分，现在被认为是由MBL和MASP组成的复合物(Matsushita等，Collectins and Innate Immunity, (1996); Ji等, J Immunol 150:571-578 (1993)。MBL-MASP复合物中MBL相关的内肽酶以明显与经典补体途径的C1q–(Clr)2–(Cls)2复合物中的C1s酶相同的方式作用于补体组分C4和C2的能力，表明存在MBL–MASP复合物，其功能类似于C1q–(C1r)2–(C1s)2复合物。C1q–(C1r)2–(C1s)2复合物通过C1q与免疫复合物中存在的抗体IgG或IgM的Fc区相互作用而被激活。这引起C1r酶原的自激活，进而激活C1s酶原，其然后作用于补体组分C4和C2。
MBL-MASP复合物的化学计量不同于对C1q–(C1r)2–(C1s)2复合物所发现的化学计量，因为不同的MBL低聚物看起来与不同比例的MASP-1/MAp19或MASP-2/MASP-3相关(Dahl等，Immunity 15:127-135 (2001)。血清中发现的大多数MASP和MAp19不与MBL复合(Thiel等，J Immunol 165:878-887 (2000))，并且可能与纤维胶凝蛋白部分缔合，纤维胶凝蛋白是最近描述的一组凝集素，其具有能够与微生物表面上的N-乙酰氨基葡糖残基结合的纤维蛋白原样结构域(Le等，FEBS Lett 425:367 (1998); Sugimoto等，J. Biol Chem 273:20721 (1998))。其中，人L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白和M-纤维胶凝蛋白与MASP以及与MAp19缔合，并可在与纤维胶凝蛋白识别的特定碳水化合物结构结合后激活凝集素途径(Matsushita等，J Immunol 164:2281-2284 (2000); Matsushita等，J Immunol 168:3502-3506 (2002))。除了纤维胶凝蛋白和MBL之外，称为CL-11的MBL样凝集素收集素，已被鉴定为凝集素途径识别分子(Hansen等，J Immunol 185:6096-6104 (2010); Schwaeble等PNAS 108:7523-7528 (2011))。有大量证据强调这些替代的碳水化合物识别分子的生理重要性，因此重要的是要了解MBL不是凝集素活化途径的唯一识别组分，并且MBL缺陷不应被误认为是凝集素途径缺陷。在结构上与MBL相关的可能一系列替代性碳水化合物识别复合物的存在可拓宽微生物结构的范围，所述微生物结构通过补体的活化而引发先天免疫系统的直接反应。
所有凝集素途径识别分子的特征在于在其胶原同源茎区域内的特定MASP结合基序(Wallis等，J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004))。MBL、CL-11和纤维胶凝蛋白中的MASP结合位点的特征在于该结构域内的独特基序：Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Pro，其中Hyp是羟基脯氨酸，和Xaa通常是脂肪族残基。该序列中的点突变破坏MASP结合。
图1是说明MASP-2多肽(SEQ ID NO: 2)和MAp19多肽的结构域结构以及编码它们的外显子的示意图。如图1所示，丝氨酸蛋白酶MASP-2由如在C1r和C1s中发现那样排列的六个不同的结构域组成；即(I)N端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形态发生蛋白(或CUBI)结构域；(II)表皮生长因子(EGF)样结构域；(III)第二CUB结构域(CUBII)；(IV和V)两个补体控制蛋白(CCP1和CCP2)结构域；(VI)丝氨酸蛋白酶(SP)结构域。
人和小鼠MASP-1(Sato等，Int Immunol 6:665-669 (1994); Takada等，Biochem Biophys Res Commun 196:1003-1009 (1993); Takayama等，J. Immunol 152:2308-2316(1994))，人、小鼠和大鼠MASP-2 (Thiel等，Nature 386:506-510 (1997); Endo等，J Immunol 161:4924-30 (1998); Stover等，J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover等，J. Immunol 163:6848-6859 (1999))；以及人MASP-3 (Dahl等，Immunity 15:127-135(2001))的cDNA来源的氨基酸序列表明这些蛋白酶是丝氨酸肽酶，在其推定的催化结构域内具有His、Asp和Ser残基的特征性三联体(Genbank登录号：人MASP-1: BAA04477.1; 小鼠MASP-1: BAA03944; 大鼠MASP-1: AJ457084; 人MASP-3:AAK84071; 小鼠MASP-3:AB049755，2012年2月15日在Genbank上访问，其各自在此通过引用并入本文)。
如图1进一步所示，在酶原转化为活性形式后，重链(α链或A链)和轻链(β链或B链)裂开，产生二硫键连接的A链和代表丝氨酸蛋白酶结构域的较小的B链。
人MASP-2基因位于染色体1p36.3-2上(Stover等，Cytogenet and Cell Genet84: 148-149(1999)，并且包含十二个外显子，如图1所示。MASP-2 (SEQ ID NO: 2)和MAp19由通过可变剪接/聚腺苷酸化产生的单个结构基因的转录物编码(Stover等，Genes and Immunity 2: 119-127(2001))。人MASP-2 cDNA(SEQ ID NO: 1)由外显子2、3、4、6、7、8、9、10、11和12编码。称为MBL相关蛋白19(“MAp19”、也称为“sMAP”)的20kDa蛋白来自外显子2、3、4和5。MAp19是一种非酶蛋白，包含MASP 2的N端CUB1-EGF区，并带有来源于外显子5的四个额外残基(EQSL)，如图1所示。
MASP-2多肽(SEQ ID NO: 2)具有686个氨基酸残基，其包括15个残基的前导肽，在分泌后被切割掉，得到人MASP-2(SEQ ID NO: 3)的成熟形式。如图1所示，MASP-2氨基酸序列不包含任何N-连接的糖基化位点。MASP-2多肽显示出类似于MASP 1、MASP 3和C1r和C1s(C1补体系统的蛋白酶)的分子结构。人MASP-2蛋白的结构域(参考SEQ ID NO: 2编号)在图1中显示，并包括N端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形态发生蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO: 2的氨基酸24-136)、表皮生长因子样结构域(SEQ ID NO: 2的氨基酸138-180)、第二CUB结构域(CUBII)(SEQ ID NO: 2的氨基酸184-295)以及串联的补体控制蛋白(SEQ ID NO: 2的CCP1氨基酸300-359和CCP2氨基酸364-431)结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO: 2的氨基酸445-682)。
如图1所示，MASP-2多肽具有含有CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2结构域的α链(重链)(α链：SEQ ID NO: 2的氨基酸1-443)和含有丝氨酸蛋白酶结构域的β链(轻链)(β链：氨基酸444-686)。二聚化需要CUB-1、EGF和CUB-2结构域，而CUB-1、EGF、CUB-2和CCP-1结构域包含MBP的结合位点。如Wallis等，J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004)中所述，每个MASP-2二聚体结合两个MBL亚单位。
MBL/纤维胶凝蛋白-MASP复合物在先天免疫中的作用是通过C型凝集素结构域(存在于MBL分子中)与酵母、细菌、病毒和真菌上存在的碳水化合物结构的钙依赖性结合或通过纤维蛋白原样结构域(存在于纤维胶凝蛋白中)与酵母、细菌、病毒和真菌上存在的碳水化合物结构的结合而介导的。这个识别阶段导致酶原MASP-2的活化，然后通过裂解C4和C2形成C3转化酶C4b2b来模拟C1q–(C1r)2–(C1s)2复合物中激活C1s的作用。这允许C4b和C3b沉积在目标病原体上，从而通过吞噬作用促进杀伤和清除。
最近文献中的证据表明，凝集素途径活化复合物仅需要MASP-2的活性以裂解C4和C2：i)使用重组MBL和重组表达的MASP-2重建最小的凝集素-途径活化复合物看起来足以有效地在体外裂解C4和C2两者(Vorup-Jensen等，J. Immunol 165:2093-2100 (2000);Rossi等, J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus等，J Immunol 170:1374-1382(2003); Gál等，J Biol Chem 280:33435-33444 (2005))；同时ii)具有基因靶向MASP-2缺陷的小鼠的血清缺乏任何凝集素途径的功能活性(Schwaeble等，PNAS 108:7523-7528(2011))。最近，描述了MASP-2的遗传确定的缺陷(Stengaard-Pedersen等，New Eng. J. Med. 349:554-560, (2003))。单个核苷酸的突变导致CUB1结构域中的Asp-Gly交换，并使MASP-2不能与MBL结合。
本文提供的数据证明，MASP-2依赖性凝集素途径补体活化提供了凝集素依赖性补体活化和凝血之间的联系。因此，鉴于以上所述，预期MASP-2抑制剂在治疗患有本文所述的凝血和血栓性病症的受试者中具有治疗益处。
根据前述内容，本发明的一个方面因此提供一种在有需要的受试者中抑制MASP-2依赖性补体活化以治疗、预防本文所公开的凝血和血栓性病症或降低其严重性的方法，所述方法包括将在药用载体中包含治疗有效量的MASP-2抑制性抗体的组合物给予有需要的受试者。MASP-2抑制性组合物可经系统地给予至所述受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、吸入、经鼻、皮下或其它胃肠外给予，或可能通过口服给予非肽能药物。给予可按医师确定重复进行，直到病况已被解决或得到控制。为了治疗或预防继发于创伤或其它急性事件的血栓性或凝血性疾病或病症，可以在创伤性损伤后立即给予MASP-2抑制性组合物，或预防性地在导致创伤的损伤或被认为有风险的患者中的情况例如手术之前、期间、之后立即或一至七天或更长的时间内例如24小时至72小时内给予。在一些实施方案中，MASP-2抑制剂组合物可以以速效剂型适当地给予，例如通过静脉内或动脉内递送包含MASP-2抑制剂组合物的溶液的推注。
本发明的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物，或有限顺序给予进行，用于治疗、预防有需要的受试者的凝血或血栓形成或降低其严重性。或者，组合物可在长期的一段时间内以定期间隔给予，例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次，用于治疗正在经历或有风险发展血栓或凝血病症、疾病或病况的受试者。
XVII. MASP-2抑制剂
MASP-2抑制性抗体可有效阻断MASP-2蛋白质与蛋白质的相互作用，干扰MASP-2的二聚化或组装，阻断Ca++结合或干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶的活性位点，从而阻止MASP-2激活凝集素途径。MASP-2抑制性抗体可以单独用作主要疗法，或与其它疗法结合用作辅助疗法，以增强其它药物治疗的治疗益处，如本文进一步所述。
在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体以至少为补体系统中的其它抗原10倍的结合亲和力特异性结合MASP-2(SEQ ID NO: 2)的一部分。在另一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体以至少为补体系统中的其它抗原100倍的结合亲和力特异性结合MASP-2(SEQ IDNO: 2)的一部分。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体特异性结合(i)CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO: 2的氨基酸300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO: 2的氨基酸445-682)中的至少一个，并抑制MASP-2依赖性补体活化，条件是所述抑制性抗体不结合MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域，并且不结合MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域。在一个实施方案中，MASP-2抑制性抗体是特异性结合MASP-2的MASP-2单克隆抗体或其抗原结合片段。
MASP-2抑制性抗体的结合亲和力可以使用合适的结合测定法来测定。
MASP-2依赖性补体活化的抑制的特征在于，由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制性抗体而发生的补体系统组分的至少以下变化之一：MASP-2依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b9(MAC)的产生或生产的抑制(例如，如美国专利号7,919,094的实施例2所述测量)，C4裂解和C4b沉积的减少(例如，如实施例1或实施例2所述测量)，或C3裂解和C3b沉积的减少(例如，如实施例4所述测量)。
在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体选择性抑制MASP-2补体活化，而使C1q依赖性补体活化系统功能完整。
MASP-2抗体
可用于本发明这一方面的MASP-2抗体包括衍生自任何产生抗体的哺乳动物的多克隆、单克隆或重组抗体，并且可以是多特异性的(即双特异性或三特异性的)、嵌合的、人源化的、完全人的、抗独特型和抗体片段。抗体片段包括如本文进一步描述的Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体。
例如，如本文实施例4-6中所述，已经鉴定出阻断MASP-2依赖性补体活化的抗大鼠MASP-2 Fab2抗体。如实施例7中进一步描述的，已经鉴定出阻断MASP-2依赖性补体活化的完全人MASP-2 scFv抗体。
表1：MASP-2特异性抗体
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具有降低的效应子功能的MASP-2抗体
在本发明的该方面的一些实施方案中，本文描述的MASP-2抗体具有降低的效应子功能，以减少可自经典补体途径的活化产生的炎症。已经显示IgG分子触发经典补体途径的能力位于该分子的Fc部分内(Duncan, A.R.等, Nature332:738-740 (1988))。其中分子的Fc部分已通过酶裂解被除去的IgG分子没有该效应子功能(参见Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)。因此，具有降低的效应子功能的抗体可因为通过具有使效应子功能最小化的基因工程改造的Fc序列而缺少分子的Fc部分，或属于人IgG2或IgG4同种型而产生。
具有降低的效应子功能的抗体可通过IgG重链的Fc部分的标准分子生物学操作产生，如Jolliffe等, Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, (1993)和Rodrigues等, J. Immunol. 151:6954-6961, (1998)所述。具有降低的效应子功能的抗体还包括人IgG2和IgG4同种型，其激活补体和/或与Fc受体相互作用的能力降低(Ravetch, J.V.等, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, (1991); Isaacs, J.D.等, J. Immunol.148:3062-3071,(1992); van de Winkel, J.G.等, Immunol. Today 14:215-221, (1993))。对人MASP-MASP-2具有特异性的人源化的或全人抗体，包括IgG2或IgG4同种型，可通过本领域普通技术人员已知的数种方法之一产生，如描述于Vaughan, T.J.等, Nature Biotechnical 16:535-539, (1998)。
MASP-2抗体的制备
MASP-2抗体可使用MASP-2多肽(例如，全长MASP-2)或使用带有抗原性MASP-2表位的肽(例如，MASP-2多肽的一部分)制备。免疫原性肽可以小至5个氨基酸残基。例如，包括SEQ ID NO:2的全部氨基酸序列的MASP-2多肽可用于诱导用于本发明方法的MASP-2抗体。已知参与蛋白-蛋白相互作用的特定MASP-2结构域，例如CUBI和CUBI-EGF结构域，以及包括丝氨酸-蛋白酶活性位点的区域，可使用本领域众所周知的方法作为重组多肽表达并用作抗原。另外，包括MASP-2多肽(SEQ ID NO:2)的至少6个氨基酸的部分的肽亦可用于诱导MASP-2抗体。用于产生抗体的MASP-2肽和多肽可作为天然多肽、或重组或合成肽和催化失活的重组多肽分离。用于产生MASP-2抗体的抗原还包括融合多肽，例如MASP-2多肽或其一部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖-结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其一部分。如果多肽部分是半抗原-样，所述部分可有利地与大分子载体(例如匙孔
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血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
多克隆抗体
针对MASP-2的多克隆抗体可通过使用本领域普通技术人员众所周知的方法用MASP-2多肽或其免疫原部分免疫动物制备。参见例如，Green等, "Production ofPolyclonal Antisera,"载于Immunochemical Protocols (Manson编辑)。MASP-2多肽的免疫原性可通过使用佐剂，包括无机凝胶例如氢氧化铝或弗氏佐剂(完全或不完全)、表面活性物质例如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、多聚阴离子、油乳剂、KLH和二硝基苯酚而增加。多克隆抗体通常在动物例如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊中产生。或者，用于本发明的MASP-2抗体也可源自低于人类的灵长类动物。用于在狒狒中产生诊断和治疗上有用的抗体的一般性技术可见于例如，Goldenberg等, International PatentPublication No. WO 91/11465和Losman, M.J.等, Int. J. Cancer 46:310, (1990)。然后使用本领域众所周知的标准程序自这样免疫的动物的血液中产生包含免疫活性抗体的血清。
单克隆抗体
在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是MASP-2单克隆抗体。如上所述，在一些实施方案中，MASP-2单克隆抗体具有高度的特异性，针对单一MASP-2表位。如本文所用的，修饰词"单克隆"表示获自基本上均质抗体群的抗体的特征，和不应解释为要求通过任何特定的方法制备抗体。单克隆抗体可使用提供通过连续细胞系培养产生抗体分子的任何技术获得，例如描述于Kohler, G.等, Nature 256:495, (1975)中的杂交瘤方法，或它们可通过重组DNA方法制备(参见例如，Cabilly的美国专利号4,816,567)。单克隆抗体也可使用描述于Clackson, T.等, Nature 352:624-628, (1991)和Marks, J.D.等, J. Mol. Biol. 222:581-597, (1991)中的技术自噬菌体抗体库分离。这样的抗体可属于任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚型。
例如，单克隆抗体可通过用包括MASP-2多肽或其部分的组合物注射合适的哺乳动物(例如，BALB/c小鼠)获得。在预定一段时间后，从小鼠取出脾细胞和悬浮在细胞培养基中。然后将脾细胞与永生细胞系融合，形成杂交瘤。将形成的杂交瘤在细胞培养中生长，并筛选它们产生针对MASP-2的单克隆抗体的能力。(亦参见Current Protocols in Immunology, Vol. 1., John Wiley & Sons, 第2.5.1-2.6.7页, 1991)。
人单克隆抗体可通过使用转基因小鼠获得，所述小鼠已被工程改造以在响应抗原攻击时产生特异性人抗体。在该技术中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因座的元件引入源自胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述干细胞系包含内源免疫球蛋白重链和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可合成对人抗原具有特异性的人抗体，所述抗原例如本文描述的MASP-2抗原，和所述小鼠可用于使用常规的Kohler-Milstein技术，通过融合来自所述动物的B-细胞与合适的骨髓瘤细胞系，产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤。用于自转基因小鼠获得人抗体的方法描述于例如，Green, L.L.等, Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg, N.等,Nature 368:856, 1994;和Taylor, L.D.等, Int. Immun. 6:579, 1994。
单克隆抗体可通过各种充分建立的技术自杂交瘤培养物分离和纯化。这样的分离技术包括用蛋白-A Sepharose的亲和色谱、大小排阻色谱和离子交换色谱(参见例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页; Baines等, "Purification ofImmunoglobulin G (IgG)"，于Methods in Molecular Biology, The humana Press,Inc., Vol. 10, 第79-104页, 1992)。
一旦产生，首先测试多克隆、单克隆或噬菌体来源的抗体的特异性MASP-2结合。确定抗体是否结合蛋白质抗原和/或抗体对蛋白质抗原的亲和力的方法是本领域已知的。例如，可以使用多种技术来检测和/或定量抗体与蛋白质抗原的结合，例如但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、等离振子表面共振法(例如BIAcore系统; Pharmacia Biosensor AB,Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)，或酶联免疫吸附测定(ELISA). 参见，例如Harlow和Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Benny K. C. Lo (2004) "AntibodyEngineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921);Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman和Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 第2版, Oxford UniversityPress, NY, Oxford; Johne等(1993), Immunol. Meth. 160:191-198; Jonsson等(1993)Ann. Biol. Clin. 51: 19-26；和Jonsson等(1991) Biotechniques 11:620-627。还参见美国专利号6,355,245。
MASP-2单克隆抗体的亲和力可通过本领域普通技术人员容易地确定(参见例如，Scatchard, A., NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)。在一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-2单克隆抗体结合MASP-2，其结合亲和力为<100 nM，优选地<10 nM和最优选地<2nM。
一旦鉴定出与MASP-2特异性结合的抗体，就在几种功能测定法之一中测试MASP-2抗体用作MASP-2抑制性抗体的能力。例如，在几种测定法之一中，例如(例如，凝集素特异性C4裂解测定法(例如实施例1或实施例2中所述的测定法)或C3b沉积法(例如实施例4中所述的测定法))，测试鉴定出与MASP-2特异性结合的抗体用作MASP-2抑制性抗体的能力。
嵌合/人源化抗体
用于本发明方法的单克隆抗体包括嵌合抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体的相应序列相同或同源；以及这样的抗体的片段(Cabilly的美国专利号4,816,567;和Morrison, S.L.等, Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 81:6851-6855, (1984))。
用于本发明的一种形式的嵌合抗体是人源化的单克隆MASP-2抗体。人源化形式的非-人(例如，鼠)抗体是嵌合抗体，其包含源自非-人免疫球蛋白的最小序列。人源化的单克隆抗体通过转移来自小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链的非-人(例如，小鼠)互补决定区(CDR)至人可变结构域产生。通常，然后将人抗体的残基置换到非-人对应物的框架区。此外，人源化的抗体可包括在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可进行这些修饰以进一步精修抗体性能。通常，人源化的抗体将包括基本上所有的至少一个和通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非-人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的Fv框架区为人免疫球蛋白序列的那些。人源化的抗体任选还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步的细节，参见Jones, P.T.等, Nature 321:522-525, (1986); Reichmann, L., 等, Nature 332:323-329,(1988);和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, (1992)。
用于本发明的人源化抗体包括包含至少MASP-2结合CDR3区的人单克隆抗体。另外，Fc部分可经替换以产生IgA或IgM以及人IgG抗体。这样的人源化抗体将具有特定的临床用处，因为它们将特异性识别人MASP-2，但在人中不针对抗体本身引发免疫反应。因此，它们更好地适合于在人中体内给予，尤其是当需要重复或长期给予时。
用于产生人源化的单克隆抗体的技术还描述于例如，Jones, P.T.等, Nature 321:522, (1986); Carter, P., 等, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, (1992);Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, (1992); Singer, I.I.等, J. Immun. 150:2844, (1993); Sudhir (编辑)，Antibody Engineering Protocols, Humana Press,Inc., (1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies"，于Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland等(编辑), John Wiley & Sons,Inc., 第399-434页, (1996);和Queen的美国专利号5,693,762, 1997。另外，存在从特异性鼠抗体区合成人源化抗体的商业机构，例如Protein Design Labs (Mountain View,CA)。
重组抗体
MASP-2抗体还可使用重组方法制备。例如，人抗体可使用人免疫球蛋白表达文库(可获自例如，Stratagene, Corp., La Jolla, CA)制备，以产生人抗体的片段(VH、VL、Fv、因子D、Fab或F(ab')2)。这些片段然后用于使用类似于用于产生嵌合抗体的技术，构建完整的人抗体。
抗独特型抗体
一旦MASP-2抗体经鉴定具有所需的抑制活性，这些抗体可用于使用本领域众所周知的技术产生抗独特型抗体，其模拟MASP-2的一部分。参见例如，Greenspan, N.S.等,FASEB J. 7:437, (1993)。例如，结合MASP-2和竞争抑制补体活化所需的MASP-2蛋白相互作用的抗体可用于产生抗独特型，其模拟在MASP-2蛋白上的MBL结合位点，因此结合并中和MASP-2的结合配体，例如MBL。
免疫球蛋白片段
用于本发明方法的MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段不仅包括完整的免疫球蛋白分子，而且包括众所周知的片段，包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性(例如双特异性和三特异性)抗体。
本领域众所周知，仅抗体分子的一小部分(互补位)参与抗体与其表位的结合(参见例如，Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley& Sons, Inc., NY, 1986)。抗体的pFc'和Fc区是经典补体途径的效应器，但不参与抗原结合。pFc'区从其经过酶裂解的抗体或没有pFc'区而产生的抗体，被称为F(ab')2片段和保留完整抗体的两个抗原结合位点。分离的F(ab')2片段因为其两个抗原结合位点而被称为二价单克隆片段。类似地，Fc区从其经过酶裂解的抗体或没有Fc区而产生的抗体，被称为Fab片段和保留完整抗体分子的一个抗原结合位点。
抗体片段可通过蛋白水解获得，例如通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体。例如，抗体片段可通过用胃蛋白酶经酶裂解抗体得到称为F(ab')2的5S片段产生。该片段可使用巯基还原剂进一步裂解以产生3.5S Fab'单价片段。任选地，裂解反应可使用二硫键裂解产生的巯基的封闭基团进行。或者，使用胃蛋白酶经酶裂解直接产生两个单价Fab片段和Fc片段。这些方法描述于例如，Goldenberg的美国专利号4,331,647;Nisonoff, A.等, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, (1960); Porter, R.R.,Biochem. J. 73:119, (1959); Edelman等, 于Methods in Enzymology 1:422,Academic Press, (1967);和Coligan第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页.
在一些实施方案中，优选使用缺少Fc区的抗体片段，以避免经典补体途径的活化，经典补体途径在Fc与Fcγ受体结合时起始。存在数种可产生避免Fcγ受体相互作用的单克隆抗体的方法。例如，单克隆抗体的Fc区可使用蛋白水解酶部分消化(例如无花果蛋白酶消化)经化学除去，从而产生例如，抗原-结合抗体片段例如Fab或F(ab)2片段(Mariani, M.等, Mol. Immunol. 28:69-71, (1991))。或者，人γ4 IgG同种型，其不结合Fcγ受体，可在构建人源化抗体期间使用，如本文所述。缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和抗原-结合结构域也可使用本文描述的重组技术经工程改造。
单链抗体片段
或者，可创建对MASP-2具有特异性的单一肽链结合分子，其中连接重链和轻链Fv区。Fv片段可通过肽接头连接以形成单链抗原结合蛋白(scFv)。这些单链抗原结合蛋白通过构建包括通过寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因制备。结构基因插入到表达载体，其随后引入至宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单一多肽链。用于产生scFvs的方法描述于例如，Whitlow等, "Methods:A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, (1991); Bird等, Science 242:423,(1988); 美国专利号4,946,778, 授予Ladner; Pack, P., 等, Bio/Technology 11:1271, (1993)。
作为说明性的实例，MASP-2特异性scFv可通过将淋巴细胞体外暴露于MASP-2多肽，和在噬菌体或类似的载体中选择抗体展示文库获得(例如，通过使用固定的或标记的MASP-2蛋白或肽)。编码具有潜在的MASP-2多肽结合结构域的多肽的基因可通过筛选展示在噬菌体或细菌例如大肠杆菌上的随机肽文库获得。这些随机肽展示文库可用于筛选与MASP-2相互作用的肽。用于产生和筛选这样的随机肽展示文库的技术是本领域众所周知的(Lardner的美国专利号5,223,409; Ladner的美国专利号4,946,778; Lardner的美国专利号5,403,484; Lardner的美国专利号5,571,698;和Kay等, Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)，随机肽展示文库和用于筛选这样的文库的试剂盒可市售获得，例如得自CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.)、Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc. (Beverly,Mass.)和Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, N.J.)。
用于本发明的该方面的另一种形式的MASP-2抗体片段是编码结合MASP-2抗原上的表位和抑制MASP-2-依赖性补体活化(即凝集素途径)的单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽("最小识别单位")可通过构建编码目的抗体的CDR的基因获得。这样的基因，例如，通过使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区制备(参见例如，Larrick等,Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies"，于Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter等(编辑), 第166页,Cambridge University Press, (1995);和Ward等"Genetic Manipulation andExpression of Antibodies", 于Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch等(编辑), 第137页, Wiley-Liss, Inc., 1995)。
将本文描述的MASP-2抗体给予有需要的受试者以抑制MASP-2-依赖性补体活化。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是高-亲和力人或人源化的单克隆MASP-2抗体，具有降低的效应子功能。
药物组合物和递送方法
给药
在另一方面，本发明提供用于在患有或有风险发展与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病或病症的受试者中抑制MASP-2依赖性补体活化的不良作用的组合物，其中所述组合物包含足以在有需要的受试者中抑制MASP-2依赖性补体活化的治疗量的MASP-2抑制性抗体和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明的方法提供抗凝血和/或抗血栓形成和/或抗血栓生成而不影响止血。
MASP-2抑制性抗体的毒性和治疗功效可通过标准药学程序，使用实验动物模型测定。使用这样的动物模型，NOAEL (未观察到不良作用水平)和MED (最小有效剂量)可使用标准方法测定。NOAEL和MED效果之间的剂量比率是治疗比，其表示为比率NOAEL/MED。显示大的治疗比或指数的MASP-2抑制性抗体是最优选的。获自细胞培养测定法和动物研究的数据可用于配制人用剂量范围。MASP-2抑制性抗体的剂量优选地在循环浓度的范围内，其包括几乎没有或没有毒性的MED。剂量可在该范围内改变，取决于使用的剂型和使用的给药途径。
对于任何化合物制剂，治疗有效剂量可使用动物模型进行评估。例如，剂量可在动物模型中配制以实现包括MED的循环血浆浓度范围。MASP-2抑制性抗体在血浆中的定量水平还可例如通过高效液相色谱测量。
除了毒性研究之外，有效剂量还可基于存在于活的受试者中的靶MASP-2蛋白的量和MASP-2抑制性抗体的结合亲和力估算。
已经显示，在正常人受试者中MASP-2水平以范围为500 ng/ml的低水平存在于血清中，和在具体的受试者中的MASP-2水平可使用用于MASP-2的定量测定法测定，其描述于Moller-Kristensen M.,等，J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003)和Csuka等，Mol. Immunol. 54:271 (2013)。
通常，给予的包括MASP-2抑制性抗体的组合物的剂量根据以下因素而改变，例如所述受试者的年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和之前的病史。作为示例，MASP-2抑制性抗体可以约0.010至100.0mg/kg，优选0.010至10mg/kg，优选0.010至1.0mg/kg，更优选0.010至0.1mg/kg的受试者体重的剂量范围给予。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体以约优选0.010至10mg/kg，优选0.010至1.0mg/kg，更优选0.010至0.1mg/kg的受试者体重的剂量范围给予。本发明的MASP-2抑制性组合物和方法在给定受试者中的治疗功效和合适的剂量可根据本领域技术人员众所周知的补体测定法测定。补体产生许多特异性产物。在近十年来，已经开发了灵敏和特异的测定法，并且对于大多数这些活化产物，包括小活化片段C3a、C4a和C5a和大活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9，这些测定法为市售可得的。大多数这些测定法利用与在所述片段上，而不是在它们从其中形成的天然蛋白上暴露的新抗原(neoantigen)反应的单克隆抗体，这使得这些测定法非常简单和特异。大多数依赖于ELISA技术，尽管放射免疫测定法有时仍用于C3a和C5a。这些后来的测定法测量未处理的片段和它们的“脱Arg”片段，其是循环中存在的主要形式。未处理的片段和C5a脱Arg通过结合细胞表面受体被快速清除，因此以非常低的浓度存在，而C3a脱Arg不结合细胞和在血浆中积聚。C3a的测量提供补体活化的灵敏的、途径-非依赖性的指示剂。替代途径活化可通过测量Bb片段和/或测量因子D激活进行评价。膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9的检测，提供补体被激活至完成的证据。因为凝集素和经典途径两者均产生相同的活化产物C4a和C4d，因此这两个片段的测量不提供关于这两个途径中哪一个产生所述活化产物的任何信息。
MASP-2-依赖性补体活化的抑制的特征为由于根据本发明的方法给予MASP-2抑制性抗体而出现的在补体系统的组分中的以下变化的至少一个：MASP-2-依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)的形成或产生的抑制(例如按美国专利号7,919,094的实施例2中所述测量)、C4裂解和C4b沉积减少(例如按实施例1或实施例2中所述测量)或C3裂解和C3b沉积减少(例如按实施例4中所述测量)。
药用载体和递送媒介
通常，本发明的MASP-2抑制剂组合物可与任何其它选择的治疗剂组合，合适地包含在药学上可接受的载体中。所述载体是无毒的、生物相容的和经选择使得不会有害地影响MASP-2抑制剂(和与其组合的任何其它治疗剂)的生物活性。对于肽的示例性的药学上可接受的载体描述于Yamada的美国专利号5,211,657。本文所述的用于本发明的MASP-2抗体可配制成呈固体、半固体、凝胶、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、贮库制剂、吸入剂和注射剂，其允许口服、胃肠外或手术给予。本发明还考虑了通过包覆医学装置等局部给予组合物。
用于通过注射、输注或灌洗的胃肠外递送和局部递送的合适载体包括蒸馏水、生理学磷酸盐缓冲盐水、正常或乳酸林格溶液、葡萄糖溶液、Hank溶液或丙二醇。另外，无菌的固定油可用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可使用任何生物相容的油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸可用于制备注射剂。可将载体和试剂混合为液体、混悬液、聚合或非聚合凝胶、糊剂或油膏。
载体还可包括递送媒介以维持(即，延长、延迟或调节)试剂的递送或增强治疗剂的递送、摄取、稳定性或药代动力学。通过非限制性实例的方式，这样的递送介质可包括包含蛋白的微粒、微球、纳米球或纳米粒；脂质体、碳水化合物、合成的有机化合物、无机化合物、聚合或共聚水凝胶和聚合胶束。合适的水凝胶和胶束递送系统包括WO 2004/009664 A2中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物，和美国专利申请号2002/0019369A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。这样的水凝胶可局部注射在预期作用的部位处，或经皮下或肌内注射形成延迟释放贮库。
本发明的组合物可以配制成用于皮下、肌内、静脉内、动脉内或作为吸入剂递送。
对于关节内递送，MASP-2抑制性抗体可包含在上述可注射的液体或凝胶载体、上述可注射的持续释放递送媒介或透明质酸或透明质酸衍生物中。
对于局部给予，MASP-2抑制性抗体可载于软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体或粉剂中，或通过经皮贴剂载于凝胶或微胶囊递送系统中。
各种经鼻和肺递送系统，包括气雾剂、计量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，正在开发和可经合适改变用于分别在气雾剂、吸入剂或喷雾递送媒介中进行本发明的递送。
对于鞘内(IT)或脑室内(ICV)递送，合适的无菌递送系统(例如，液体、凝胶、混悬剂等)可用于给予本发明。
本发明的组合物还可包括生物相容的赋形剂，例如分散剂或湿润剂、助悬剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、矫味剂(用于口服给予)。
用于抗体和肽的药用载体
关于本文所述的MASP-2抗体更特别的是，示例性的制剂可在含有药用载体的生理学可接受的稀释剂中作为注射剂量的化合物溶液或混悬液经胃肠外给予，所述载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于包含MASP-2抗体的组合物中。药物组合物的其它组分包括油(例如动物、植物或合成来源)，例如，大豆油和矿物油。通常，二醇例如丙二醇或聚乙二醇是用于注射溶液的优选的液体载体。
MASP-2抗体还可以贮库注射剂或植入制剂的形式给予，其可以允许活性剂的持续或脉动释放的方式配制。
给药方式
可以多种方式给予包含MASP-2抑制性抗体的药物组合物，这取决于是局部还是全身性给药方式最适于待治疗的病况。此外，本发明的组合物可通过将组合物涂布或掺入可植入的医疗装置上面或里面而递送。
系统递送
如本文所用，术语“系统递送”和“系统给药”意图包括但不限于口服和胃肠外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、经皮、经鼻、直肠、阴道和其它给药途径，这将所递送的药物有效地分散到预期治疗作用的一个或多个部位。用于本发明组合物的系统递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下、动脉内和吸入。应当理解，对于用于本发明具体组合物中所选用的药物，确切的系统给药途径将部分地考虑药物对与指定给药途径相关的代谢转化途径的敏感性加以确定。例如，肽能药物可能最适于通过口服以外的途径给药。
可通过任何合适的方法将本文所述的MASP-2抑制性抗体递送到有需要的受试者中。递送MASP-2抗体和多肽的方法包括经口服、肺部、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(例如经由微细粉制剂)、经皮、经鼻、阴道、直肠或者舌下给药途径给予，并且可将其配制成适于各种给药途径的剂型。
通过代表性实例的方式，可以通过将MASP-2抑制性抗体应用到能够吸收多肽的身体膜例如鼻膜、胃肠膜和直肠膜上，而将其引入活体内。通常将多肽和渗透促进剂一起应用到可吸收膜上(参见例如Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69,(1988)；Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, (1990)；Lee, V.H.L.主编,Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991)；DeBoer,A.G.,等人, J. Controlled Release 13:241, (1990)。例如，STDHF是梭链孢酸的合成衍生物，是结构上类似于胆盐的甾类表面活性剂，已被用作经鼻递送的渗透促进剂(Lee,W.A., Biopharm. 22, 1990年11/12月)。
可以联合另一分子(例如脂质)引入本文所述的MASP-2抑制性抗体，以保护多肽不被酶降解。例如，共价连接聚合物、尤其是聚乙二醇(PEG)已被用来保护某些蛋白质不被体内的酶水解，从而延长半寿期(Fuertges, F.,等人, J. Controlled Release 11:139,(1990))。已经报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae, Y.H.,等人, J. Controlled Release 9:271, (1989)；Hori, R.,等人, Pharm. Res. 6:813, (1989)；Yamakawa, I.,等人, J. Pharm. Sci. 79:505, (1990)；Yoshihiro, I.,等人, J. Controlled Release 10:195, (1989)；Asano, M.,等人, J. Controlled Release 9:111, (1989)；Rosenblatt, J.,等人, J. Controlled Release 9:195, (1989)；Makino,K., J. Controlled Release 12:235, (1990)；Takakura, Y.,等人, J. Pharm. Sci.78:117, (1989)；Takakura, Y.,等人, J. Pharm. Sci. 78:219, (1989))。
最近，开发出血清稳定性和循环半寿期得到改进的脂质体(参见例如Webb的美国专利号5,741,516)。而且，对脂质体和脂质体样制备物作为可能的药物载体的各种方法进行了综述(参见例如Szoka的美国专利号5,567,434；Yagi的美国专利号5,552,157；Nakamori的美国专利号5,565,213；Shinkarenko的美国专利号5,738,868以及Gao的美国专利号5,795,587)。
对于经皮应用，可将本文所述的MASP-2抑制性抗体与其它合适的成分(例如载体和/或佐剂)混合。对这些其它成分的性质没有限制，只是对于其预期给药来说必须是药学上可接受的，并且不能降低组合物中活性成分的活性。合适媒介的实例包括含或不含纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或混悬液。MASP-2抑制性抗体还可被浸渍到经皮贴剂、膏药和绷带中，优选以液体或半液体形式。
可以在为维持治疗效果所需水平而确定的间隔的周期性基础上，系统给予本发明的组合物。例如，可按每2-4周或者以更低频率的间隔给予组合物(例如经皮下注射)。给药方案将由医师考虑可能影响药物联用的作用的各种因素来确定。这些因素包括待治疗疾病的进展程度、患者的年龄、性别和体重和其它临床因素。各独立药物的剂量将随组合物中所包含的MASP-2抑制性抗体以及任何递送媒介(例如缓释递送媒介)的存在和性质而变化。此外，可在考虑给药频率和所递送药物的药代动力学行为的变化后对剂量进行调整。
局部递送
本文所用术语“局部”包括药物在预期局部化作用部位上或其周围的应用，可包括例如局部递送到皮肤或其它受累组织；眼部递药；鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或肺泡内给药、安置或冲洗。可优选能够给予较低剂量的局部给药以避免全身性不良作用，以及更精确地控制递药时间和局部递药部位的活性剂浓度。不论患者之间在新陈代谢、血流等方面的变化，局部给药都在目标部位提供已知的浓度。通过直接递药方式亦提供改进的剂量控制。
MASP-2抑制性抗体的局部递送可在手术方法的情况下实现以治疗疾病或病况，例如在动脉旁路术、经皮腔内斑块旋切术、激光手术、超声波手术、气囊血管成形术以及支架安置等手术期间。例如，可将MASP-2抑制性抗体与气囊血管成形手术结合起来给予受试者。气囊血管成形手术包括将带有已排气的气囊的导管插入动脉内。将已排气的气囊置于动脉粥样硬化斑块附近，给气囊充气使得斑块向血管壁挤压。结果，气囊表面与血管表面的血管内皮细胞层接触。可以按允许药物在动脉粥样硬化斑块部位释放的方式，将MASP-2抑制性抗体附着到气囊血管成形术导管上。可按照本领域已知标准程序将药物附着在气囊导管上。例如，可将药物保存在气囊导管的隔室中直到气囊充气，此时药物被释放到局部环境中。或者，可将药物浸渍在气囊表面，使得当气囊充气时，药物就接触到动脉壁的细胞。还可在多孔气囊导管中递送药物，例如Flugelman, M.Y.,等人, Circulation 85:1110-1117,(1992)中公开的那些。另见已公开的PCT申请WO 95/23161中对于将治疗性蛋白附着到气囊血管成形术导管上的示例性程序。同样地，可将MASP-2抑制性抗体包括在应用于支架上的凝胶或聚合涂层中，或者可将其掺入支架材料中，使得支架在血管安置之后将MASP-2抑制性抗体洗脱出来。
治疗方案
在预防性应用中，将药物组合物以足以消除或减少发展病况的症状的风险的量给予易感或另外有风险患有本文所述的与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病或病症的受试者。在治疗性应用中，将药物组合物以足以减轻或至少部分减少病况的症状的治疗有效量给予怀疑患有或已经患有本文所述的与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病或病症的受试者。
在用于治疗、预防本文所述的与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病或病症或减少其严重性的预防性和治疗性方案两者中，药物组合物可以以几个剂量给予直至在受试者中获得足够的治疗结果。在本发明的一个实施方案中，可以将MASP-2抑制性抗体以0.1mg至10,000mg，更合适地1.0mg至5,000mg，更合适地10.0mg至2,000mg，更合适地10.0mg至1,000mg，并且再更合适地50.0mg至500mg，或10至200mg的剂量给予成人患者(例如，平均成人体重为70kg)。对于小儿患者，可以与患者体重成比例调整剂量。
本发明的治疗性组合物的施用可通过单次给予组合物(例如，包含MASP-2抑制性抗体的单个组合物)或有限顺序给予进行。或者，组合物可在长期的一段时间内以定期间隔给予，例如每日一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次或每两月一次，持续由医师确定以获得最佳治疗效果的时间。
根据前述，本发明的特征在于以下实施方案：
1. 一种预防、减轻和/或治疗与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括将治疗量的MASP-2抑制性抗体给予有需要的受试者。
2. 根据段落1所述的方法，其中所述有需要的受试者患有与由纤维蛋白或活化血小板引发的补体相关炎症、过度凝血或接触系统活化相关的疾病、病症或病况或有风险发展所述疾病、病症或病况。
3. 根据段落2所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病症：动脉血栓形成、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、手术后血栓形成、冠状动脉旁路移植术和/或介入性心血管手术(例如血管成形术或支架置换)后的再狭窄、动脉粥样硬化、斑块破裂、斑块不稳定、再狭窄、低血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、弥散性血管内凝血(DIC)、静脉闭塞性疾病(VOD)、镰状细胞病、血栓性微血管病、狼疮性肾炎、浅表性血栓性静脉炎、因子V Leiden突变、缺血/再灌注损伤、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、正在接受激素替代疗法(HRT)、阿尔茨海默氏病和/或患有高凝状态。
4. 根据段落3所述的方法，其中所述受试者由于以下至少中的一种或多种而患有或有风险发展获得性高凝状态：正在进行用选自5-FU、GM-CSF、顺铂、肝素、COX-2抑制剂、造影剂、皮质类固醇和抗精神病药的药物的疗法；静脉淤滞(固定、手术等)、抗磷脂综合征、癌症(早幼粒细胞白血病、肺、乳腺、前列腺、胰腺、胃和结肠肿瘤)；由于创伤或手术而引起的组织损伤、中央静脉中存在导管、参与血凝块形成的蛋白(例如蛋白C)的获得性缺乏、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、同型半胱氨酸水平升高、心力衰竭、机械瓣膜存在、伴原位血栓形成的肺动脉高压、心房颤动、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、肝素诱发的血小板减少症和血栓形成(HITT)、伴原位血栓的川崎病、伴原位血栓的Takayasu动脉炎、转移性癌症的血栓形成倾向、因子VIII水平升高、妊娠和炎性肠病(IBD)。
5. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病或病症。
6. 根据段落5所述的方法，其中所述适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病或病症选自遗传性血管性水肿、糖尿病性黄斑水肿和在心肺分流术期间的出血。
7. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症。
8. 根据段落7所述的方法，其中所述适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症选自动脉血栓形成、静脉血栓形成、肺栓塞、心房颤动、肝素诱发的血小板减少症、从一种抗凝剂转换为另一种抗凝剂、以及用于危重HIT患者(维持)的连续肾脏替代疗法(CRRT)的体外循环通畅的标签外使用。
9. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者先前已经经历、当前患有、或有风险发展心房颤动，并且所述MASP-2抑制性抗体以足以降低所述受试者的中风风险的量给予。
10. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症。
11. 根据段落10所述的方法，其中适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症选自深静脉血栓形成(一级预防和扩展疗法两者)、肺栓塞、非瓣膜性心房颤动、在伴有或没有心房颤动的受试者中急性冠状动脉综合征后复发性缺血的预防、终末期肾脏疾病、脑缺血、心绞痛、减少或防止与医疗设备(例如瓣膜、小口径移植物等)和/或体外循环相关的血凝块。
12. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者先前已经经历、当前患有、或有风险发展非瓣膜性心房颤动，并且所述MASP-2抑制性抗体以足以降低所述受试者的中风和/或栓塞风险的量给予。
13. 根据段落3所述的方法，其中所述受试者具有遗传缺陷，所述遗传缺陷引起或增加发展高凝状态的风险。
14. 根据段落13所述的方法，其中所述遗传缺陷选自凝血酶原20210基因突变、MTHFR突变、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、蛋白A缺乏、蛋白Z缺乏、抗凝血酶缺乏症和导致血栓形成倾向的遗传病症。
15. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者患有增加血栓栓塞倾向的获得性疾病、病症或病况。
16. 根据段落15所述的方法，其中所述增加血栓栓塞倾向的获得性疾病或病症选自动脉粥样硬化、抗磷脂抗体、癌症、高同型半胱氨酸血症、感染、组织损伤、静脉淤滞(例如由于手术、骨科或麻痹性固定、心力衰竭、妊娠或肥胖)以及服用含有雌激素的口服避孕药的受试者。
17. 根据段落16所述的方法，其中所述癌症选自早幼粒细胞白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结肠癌。
18. 根据段落1所述的方法，其中所述受试者需要抗凝疗法，并且所述MASP-2抑制性抗体被用作标准抗凝疗法(例如，华法林)的替代。
19. 根据段落18所述的方法，其中所述受试者患有通常禁止标准抗凝疗法的病况，例如CNS淀粉样血管病。
20. 根据段落18所述的方法，其中在否则用标准抗凝疗法的受试者中所述MASP-2抑制性抗体作为桥接剂在围手术期给予。
21. 根据段落1-20中任一个所述的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2单克隆抗体或其片段，其特异性结合SEQ ID NO:5的一部分。
22. 根据段21所述的方法，其中所述MASP-2抗体是嵌合、人源化或人抗体。
23. 根据段落21所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab') 2的抗体片段。
24. 根据段落21所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体是单链分子。
25. 根据段落21所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选自IgG1分子、IgG2和IgG4分子。
26. 根据根据段落25所述的方法，其中所述IgG4分子包含S228P突变。
27. 根据段落1-26中任一个所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。
28. 根据段落1-27中任一个所述的方法，其中所述MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含：i)重链CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 6的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 6的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 6的95-107的氨基酸序列，和
(b)轻链可变区，其包含：i)轻链CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 7的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 7的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 7的89-97的氨基酸序列。
29. 根据段落1-28中任一个所述的方法，其中所述MASP-2抑制性单克隆抗体包含SEQ ID NO: 6所示的重链可变区和SEQ ID NO: 7所示的轻链可变区。
30. 根据段落1-27中任一个所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段特异性地识别由参考抗体识别的表位的至少一部分，所述参考抗体包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区。
XXI. 实施例
以下实施例仅说明目前预期实施本发明的最佳模式，而不应解释为限制本发明。本文的所有文献引述通过引用明确地予以结合。
实施例1
本实施例描述用于产生针对人MASP-2多肽的鼠单克隆抗体的方法。
1. 用于产生MASP-2抗体的方法：
雄性A/J小鼠(Harlan, Houston, Tex.)，8-12周龄，用在200 μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4中在完全弗氏佐剂(Difco Laboratories, Detroit, Mich)中的100 μg人全长多肽：rMASP-2(SEQ ID NO: 2)或其抗原片段皮下注射。两周后，小鼠用在不完全弗氏佐剂中的50 μg的相同人多肽皮下注射。在第六周，小鼠用在PBS中的50 μg的相同人多肽注射和4天后融合。
对于各融合，自免疫小鼠的脾制备单细胞悬浮液和用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。5x108个Sp2/0和5x108个脾细胞在包含50%聚乙二醇(M.W. 1450) (Kodak, Rochester,N.Y.)和5%二甲基亚砜(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)的培养基中融合。然后在添加有10%胎牛血清、100个单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、0.1 mM次黄嘌呤、0.4 μM氨基蝶呤和16 μM胸苷的Iscove培养基(Gibco, Grand Island, N.Y.)中将细胞调整至1.5x105个脾细胞/200 μl悬浮液的浓度。将200微升的细胞悬浮液加入至包含在大约20个96-孔微量培养板中的各孔。在大约10天后，吸出培养上清液用于在ELISA测定法中筛选与靶纯化的MASP-2或抗原片段的反应性。
ELISA测定法：Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)微量测试板的各孔通过加入50 μl的50 ng/ml的纯化hMASP-2在室温下包被过夜。用于包被的低浓度的MASP-2能够选择高-亲和力抗体。在包被溶液通过轻弹板除去后，将200 μl含BLOTTO (脱脂奶粉)的PBS加入至各孔中1小时，以封闭非-特异性位点。在1小时后，然后用缓冲液PBST(包含0.05% Tween 20的PBS)洗涤各孔。自各融合孔(50 μl)的培养上清液与50 μl的BLOTTO混合，然后加入至微量测试板的各个MASP-2包被孔中。在1小时孵育后，各孔用PBST洗涤，并且结合MASP-2的抗体通过添加辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG (Fc特异性) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)而检测。将HRP缀合抗小鼠IgG在BLOTTO中适当稀释，以提供适当的信噪比，并添加到每个包含样品的孔中。洗涤后，结合的HRP缀合的抗体用过氧化物酶底物溶液检测。将包含0.1% 3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma, St. Louis, Mo.)和0.0003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加入至各孔用于显色30分钟。通过每孔加入50 μl的2M H2SO4终止反应，并且反应混合物在450 nm的光密度用BioTek ELISA Reader (BioTek Instruments, Winooski, Vt.)测量。
结合测定法：
在上述的MASP-2 ELISA测定法中测试阳性的培养上清液可在结合测定法中测试，以测定MASP-2抑制性抗体对MASP-2具有的结合亲和力。类似的测定法也可用于测定抑制剂是否结合在补体系统中的其它抗原。
聚苯乙烯微量滴定板的各孔(96-孔培养基结合板, Corning Costar,Cambridge, MA)用在磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4中的MASP-2 (20 ng/100 μl/孔,Advanced Research Technology, San Diego, CA)在4℃包被过夜。在吸出MASP-2溶液后，各孔用包含1%牛血清白蛋白(BSA; Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭2小时。没有MASP-2包被的各孔用作背景对照。将在BSA PBS封闭溶液中各种浓度的杂交瘤上清液或纯化的MASP-2 MoAb的等分试样加入至各孔。在室温孵育2小时后，各孔用PBS充分漂洗。MASP-2-结合的MASP-2 MoAb通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG (SigmaChemical)，使其在室温下孵育1小时而检测。再次用PBS充分漂洗板，和加入100 μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg,MD)。TMB的反应通过加入100 μl的1M磷酸淬灭，和在微板阅读器(SPECTRA MAX 250,Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中在450 nm读出板。
然后在功能测定法例如本文所述(实施例2)的C4裂解测定法中测试来自阳性孔的培养上清液抑制补体活化的能力。然后通过有限稀释而克隆阳性孔中的细胞。在上述ELISA测定法中再次测试MoAb与hMASP-2的反应性。将选择的杂交瘤在旋转瓶中生长，和收集耗尽的培养上清液用于通过蛋白A亲和色谱进行抗体纯化。
可以在C4裂解测定法中测定MASP-2抗体的凝集素途径抑制活性，例如如实施例2中所述。
实施例2
本实施例描述了体外C4裂解测定，用作功能性筛选，以鉴定能够经由L-纤维胶凝蛋白/P35、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或甘露聚糖而阻断MASP-2-依赖性补体活化的MASP-2抑制剂。
C4裂解测定：C4裂解测定已经描述于Petersen, S.V.,等人, J. Immunol. Methods 257:107, 2001，其检测了由结合L-纤维胶凝蛋白的金黄色葡萄球菌上的脂磷壁酸(LTA)所致的凝集素途径活化。
试剂：福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(DSM20233)制备如下：将细菌在胰胨大豆血培养基(tryptic Soy blood medium)中于37℃培养过夜，用PBS洗涤3次，然后在室温下在PBS / 0.5%福尔马林中固定1小时，再用PBS洗涤3次后，重悬浮于包被缓冲液(15 mMNa2CO3、35 mM NaHCO3, pH 9.6)中。
测定：Nunc MaxiSorb微量滴定板(Nalgene Nunc International, Rochester,NY)的各孔用以下成分包被：100 μl福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233 (OD550=0.5)的包被缓冲液与1 μg L-纤维胶凝蛋白的包被缓冲液。孵育过夜后，各孔用0.1%人血清白蛋白(HSA)的TBS溶液(10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4)封闭，然后用含有0.05%Tween 20和5mM CaCl2的TBS溶液(洗涤缓冲液)洗涤。将人血清样品稀释于20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4中，这防止了内源C4的活化，并使Cl复合物(由Clq、Clr和Cls组成)解离。将不同浓度的MASP-2抑制剂(包括MASP-2 MoAb)加到血清样品中。将稀释的样品加到板中，在4℃下孵育过夜。24小时后，各板用洗涤缓冲液充分洗涤，然后向各孔中加入0.1μg经纯化的人C4 (按照Dodds, A.W.,Methods Enzymol. 223:46, 1993所述获得)/100μl 4 mM 巴比妥、145 mM NaCl, 2 mMCaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4。在37℃ 1.5小时后，各板再次经洗涤，使用碱性磷酸酶-缀合的鸡抗人C4c (获自Immunsystem, Uppsala, Sweden)，检测C4b沉积，并使用比色底物磷酸对硝基苯酯进行测定。
在甘露聚糖上的C4测定：在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和甘露聚糖包被测定板，修改上述测定法以测定经由MBL的凝集素途径活化。
在H-纤维胶凝蛋白(Hakata Ag)上的C4测定：在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和H-纤维胶凝蛋白包被测定板，修改上述测定法以测定经由H-纤维胶凝蛋白的凝集素途径活化。
实施例3
下面的测定法用来通过在经典途径被免疫复合物启动的条件下分析MASP-2抑制性抗体的作用，从而检测MASP-2抑制性抗体是否阻断了经典途径。
方法：为了测试MASP-2抑制性抗体对补体活化条件(其中经典途径被免疫复合物启动)的影响，在10 μg/mL免疫复合物或PBS存在时，将一式三份的含有90% NHS的50 μl样品在37℃孵育，并且还包括平行的一式三份的样品(+/-免疫复合物)，其在37℃孵育期间含有200 nM抗备解素单克隆抗体。在37℃孵育2小时后，将13 mM EDTA加到所有样品中以终止进一步的补体活化，并立即将样品冷却到5℃。再将样品保存于-70℃，然后按照生产商的说明书，使用ELISA试剂盒(Quidel，目录号A015和A009)进行补体活化产物(C3a和sC5b-9)的测定。
实施例4
本实施例描述了阻断MASP-2活性的高亲和性MASP-2 Fab2抗体片段的鉴定。
背景和原理：MASP-2是具有许多独立功能结构域的复杂蛋白质，包括：MBL和纤维胶凝蛋白的结合位点、丝氨酸蛋白酶催化位点、蛋白水解底物C2的结合位点、蛋白水解底物C4的结合位点、MASP-2酶原自身活化的MASP-2裂解位点和两个Ca++结合位点。鉴定出与MASP-2高亲和性结合的Fab2抗体片段，并在功能测定法中测定所鉴定的Fab2片段，以确定它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
为了阻断MASP-2功能活性，抗体或Fab2抗体片段必须结合并干扰MASP-2功能活性所需要的MASP-2上的结构表位。因此，许多或所有的高亲和性结合MASP-2 Fab2可能不能抑制MASP-2功能活性，除非它们结合直接参与MASP-2功能活性的MASP-2上的结构表位。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法被用来评价MASP-2 Fab2的“阻断活性”。已知MASP-2在凝集素途径中的主要生理作用是产生凝集素介导的补体途径的下一个功能成分，即凝集素途径C3转化酶。凝集素途径C3转化酶是蛋白水解裂解C3成为C3a和C3b的关键酶复合物(C4bC2a)。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；然而，需要MASP-2功能活性以产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)。此外，为了使MASP-2产生凝集素途径C3转化酶，似乎需要所有上述MASP-2的独立功能活性。出于这些原因，认为用于评价MASP-2 Fab2的“阻断活性”优选的测定法是测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法。
高亲和性Fab2的产生：应用人可变轻链和重链抗体序列的噬菌体展示文库以及用于鉴定与所选出的目标配体反应的Fab2的自动抗体筛选技术，来产生抗大鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO: 5)的高亲和性Fab2。利用已知量的大鼠MASP-2 (~1 mg，纯度>85%)蛋白进行抗体筛选。利用三轮扩增以选出具有最高亲和性的抗体。挑选约250个不同的表达抗体片段的目标(hit)用于ELISA筛选。随后对高亲和性目标进行测序以确定不同抗体的独特性。
将50个独特的MASP-2抗体纯化，将250μg各经纯化的Fab2抗体用于表征MASP-2结合亲和性和补体途径功能测定，更详述如下。
用于评价MASP-2 Fab2的抑制(阻断)活性的测定法
1. 测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法：
背景：凝集素途径C3转化酶是蛋白水解裂解C3成为两个有效促炎片段过敏毒素C3a和调理素C3b的酶复合物(C4bC2a)。C3转化酶的形成似乎是在介导炎症方面的凝集素途径中的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；因此，MASP-2抗体(或Fab2)不会直接抑制之前已存在的C3转化酶的活性。然而，为了产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)，MASP-2丝氨酸蛋白酶活性是必需的。因此，抑制MASP-2功能活性的MASP-2 Fab2 (即阻断性MASP-2 Fab2)抑制凝集素途径C3转化酶从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构的部分。在该测定法中当C3转化酶裂解C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的MASP-2 Fab2抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1μg/50 µl/孔在5℃下孵育过夜。过夜孵育后，各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，在室温下孵育1小时并温和搅动。然后各孔用200µlPBS洗涤3次。在5℃，将MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB 缓冲液(4.0 mM 巴比妥，141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)至选定浓度。在5℃，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔用200μl PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，再用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl/孔的1: 10,000稀释的第一抗体(兔抗人C3c，DAKO A0062)，该抗体溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的1:10,000稀释的第二抗体(过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG,American Qualex A102PU)，该抗体溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育10分钟。通过加入100 μl/孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，测定OD450。
2. 测量抑制MASP-2-依赖性C4裂解的测定法
背景：MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性是高度特异性的，仅鉴定出用于MASP-2的两种蛋白质底物：C2和C4。C4裂解产生C4a和C4b。MASP-2 Fab2可结合直接参与C4裂解的MASP-2的结构表位(例如C4的MASP-2结合位点；MASP-2丝氨酸蛋白酶催化位点)，从而抑制MASP-2的C4裂解功能活性。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定MASP-2的C4裂解活性的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。因为用于该ELISA测定法中的第一抗体仅识别人C4，所以稀释的大鼠血清还补充了人C4(1.0 µg/mL)。然后洗涤各孔，采用标准ELISA方法测定固定到孔中的人C4b。在该测定法中所产生的C4b的量可衡量MASP-2-依赖性C4裂解活性。在该测定法中，测试选定浓度的MASP-2 Fab2抑制C4裂解的能力。
方法：将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 µl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤3次。在5℃，将MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB 缓冲液(4.0 mM 巴比妥，141mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)至选定浓度。1.0 µg/mL人C4(Quidel)也包括在这些样品中。在5℃，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移至装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔用200 μl PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，然后各孔再用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl /孔的1:700稀释的生物素-缀合的鸡抗人C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)，该抗体溶于含有2.0mg/ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的0.1 µg/mL过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素(Pierce Chemical #21126)，其溶于含有2.0mg/ml BSA的PBS中，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育16分钟。通过加入100 μl /孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，并测定OD450。
3. 抗大鼠MASP-2 Fab2与“天然”大鼠MASP-2的结合测定法
背景：MASP-2通常作为还包括特异性凝集素分子(甘露糖-结合蛋白(MBL)和纤维胶凝蛋白)的MASP-2二聚体复合物存在于血浆中。因此，如果有兴趣研究MASP-2 Fab2与MASP-2生理学相关形式的结合，则重要的是开发出结合测定法，其中利用Fab2与血浆中的“天然”MASP-2之间，而不是利用与纯化的重组MASP-2之间的相互作用。在该结合测定法中，先将得自10%大鼠血清的“天然”MASP-2-MBL复合物固定在甘露聚糖包被的孔内。然后采用标准ELISA方法，对各种MASP-2 Fab2与固定化“天然”MASP-2的结合亲和性进行了研究。
方法：将96孔Costar高结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 µl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的含0.5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween 20的PBS)封闭，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 µl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液(Tris-缓冲盐水, 0.05% Tween 20, 含有5.0mM CaCl2, pH 7.4)洗涤3次。在冰上制备含10%大鼠血清的高盐结合缓冲液(20 mM Tris,1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v)牛血清白蛋白, pH 7.4)。加入100 µl/孔并在5℃孵育过夜。各孔用200 µl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液洗涤3次。然后，各孔用200 μl PBS洗涤2次。加入100 µl/孔的稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)的选定浓度的MASP-2 Fab2，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入在2.0mg/mL牛血清白蛋白的PBS中1:5000稀释的100 µl/孔的HRP-缀合的山羊抗Fab2(Biogenesis Cat No 0500-0099)，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 µl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温下孵育70分钟。通过加入100 μl /孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，并测定OD450。
结果：
挑选了与大鼠MASP-2蛋白进行高亲和性反应的约250个不同的Fab2用于ELISA筛选。对这些高亲和性Fab2进行了测序以确定不同抗体的独特性，对50个独特的MASP-2抗体进行纯化，用于进一步分析。250 μg各经纯化的Fab2抗体用来表征MASP-2结合亲和性及补体途径功能测定。该分析的结果见下表2。
表2：阻断凝集素途径补体活化的MASP-2 FAB2
Fab2抗体# C3转化酶(IC<sub>50</sub> (nM) Kd (nM) C4裂解IC<sub>50</sub> (nM)
88 0.32 4.1 ND
41 0.35 0.30 0.81
11 0.46 0.86 <2 nM
86 0.53 1.4 ND
81 0.54 2.0 ND
66 0.92 4.5 ND
57 0.95 3.6 <2 nM
40 1.1 7.2 0.68
58 1.3 2.6 ND
60 1.6 3.1 ND
52 1.6 5.8 <2 nM
63 2.0 6.6 ND
49 2.8 8.5 <2 nM
89 3.0 2.5 ND
71 3.0 10.5 ND
87 6.0 2.5 ND
67 10.0 7.7 ND
如上表2所示，在所测的50个MASP-2 Fab2中，17个Fab2被鉴定为MASP-2-阻断性Fab2，其有效抑制C3转化酶形成，IC50等于或小于10 nM Fab2 (34%阳性命中率)。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50范围为纳摩尔以下。此外，表2中所示的所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。这是重要的考虑因素，因为理论上可能的是，甚至当各MASP-2分子被Fab2结合时，“阻断性”Fab2可能仅微弱地抑制MASP-2功能。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是在大鼠血清中存在的抗甘露聚糖抗体也可能激活经典途径，并且通过经典途径C3转化酶产生C3b，这在理论上是可能的。然而，在本实施例所列的17个阻断性MASP-2 Fab2中的每一个都有效地抑制了C3b产生(>95%)，因此证明了该测定法对于凝集素途径C3转化酶的特异性。
为了计算各个Fab2的表观Kd，对所有17个阻断性Fab2都进行结合测定。对于6个阻断性Fab2，抗大鼠MASP-2 Fab2与天然大鼠MASP-2的结合测定的结果也见表2。对于其它Fab2也进行了类似的结合测定，其结果见表2。一般而言，对于6个Fab2的每一个结合“天然”MASP-2所获得的表观Kd与在C3转化酶功能测定中Fab2的IC50恰好适当对应。有证据表明，在激活其蛋白酶活性时，MASP-2经历了从“无活性”到“活性”形式的构象变化(Feinberg等人,EMBO J 22:2348-59 (2003)；Gal等人, J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005))。在用于C3转化酶形成测定法的正常大鼠血浆中，MASP-2主要以“无活性”酶原构象存在。相比之下，在结合测定法中，MASP-2作为与MBL (其结合到固定化甘露聚糖)的复合物的部分而存在；因此，MASP-2可能为“活性”构象(Petersen等人, J. Immunol Methods 257:107-16,2001)。因此，对于这两个功能测定法中所测定的17个阻断性Fab2的每一个，不必预期IC50和Kd之间确切的对应性，因为在各个测定法中，Fab2可结合不同构象形式的MASP-2。尽管如此，除了Fab2#88以外，对于两种测定法中所测的其它16个Fab2的每一个，IC50和表观Kd之间显示出相当密切的对应性(参见表2)。
评价若干阻断性Fab2对于MASP-2-介导的C4裂解的抑制。如表2所示，发现所有测试的Fab2都抑制C4裂解，IC50类似于C3转化酶测定法中所获得的IC50。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是大鼠血清中抗甘露聚糖抗体的存在理论上也可能激活经典途径，从而通过C1s介导的C4裂解而产生C4b。然而，已经鉴定出有效抑制C4b产生(>95%)的若干MASP-2 Fab2，因此证明了该测定法对于MASP-2-介导的C4裂解的特异性。C4，如同C3一样，含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当通过MASP-2裂解C4时，C4b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上羟基或氨基形成共价键，因此有利于在ELISA测定法中检测C4b。
这些研究清楚表明，大鼠MASP-2蛋白的高亲和性FAB2的产生，功能性地阻断C4和C3转化酶活性，从而防止了凝集素途径活化。
实施例5
本实施例描述了对若干按照实施例4所述方法产生的阻断性抗大鼠MASP-2 Fab2抗体进行的表位作图。
方法：
使用pED4载体，在CHO细胞中表达下列所有具有N端6个His标签的蛋白质：
大鼠MASP-2A，一种全长MASP-2蛋白，通过活性中心上的丝氨酸改变为丙氨酸(S613A)而失活；
大鼠MASP-2K，经改变降低了自身活化的全长MASP-2蛋白(R424K)；
CUBI-II，一种仅含有CUB1、EGF样和CUBII结构域的大鼠MASP-2的N端片段；和
CUBI/EGF样，一种仅含有CUBI和EGF样结构域的大鼠MASP-2的N端片段。
如前所述，将这些蛋白质通过镍-亲和层析从培养上清液中纯化(Chen等人, J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001))。
采用pTrxFus (Invitrogen)，使含有CCPII和大鼠MASP-2丝氨酸蛋白酶结构域的C端多肽(CCPII-SP)，在大肠杆菌中表达成为硫氧还蛋白融合蛋白。用Thiobond亲和树脂将蛋白质从细胞裂解物中纯化。硫氧还蛋白融合配偶体由pTrxFus空载体表达作为阴性对照。
将所有重组蛋白透析到TBS缓冲液中，通过测量OD (280nm)，测得其浓度。
斑点印迹分析:
将上述的连续稀释的5种重组MASP-2多肽(以及硫氧还蛋白多肽作为CCPII-丝氨酸蛋白酶多肽的阴性对照)点在硝酸纤维素膜上。蛋白质的点样量在5重步骤中的范围为100 ng至6.4 pg。在稍后的实验中，蛋白质的点样量再次在5重步骤中的范围由50 ng降至16 pg。该膜用含5%脱脂奶粉的TBS溶液(封闭缓冲液)封闭，然后与含1.0 μg/mL MASP-2Fab2的封闭缓冲液(含有5.0 mM Ca++)一起温育。用HRP-缀合的抗人Fab (AbD /Serotec ；1/10,000稀释)和ECL检测试剂盒(Amersham)检测结合的Fab2。一块膜与作为阳性对照的多克隆兔抗人MASP-2 Ab (参见Stover等人, J Immunol 163:6848-59 (1999))一起温育。在这种情况下，用HRP-缀合的山羊抗兔IgG (Dako；1/2,000稀释)，检测结合的Ab。
MASP-2结合测定法:
ELISA板用含1.0 μg /孔的重组MASP-2A或CUBI-II多肽的碳酸盐缓冲液(pH9.0)在4℃下包被过夜。各孔用含1% BSA的TBS溶液封闭，然后加入含连续稀释的MASP-2 Fab2的TBS溶液(含有5.0mM Ca++)。将各板在室温下孵育1小时。用TBS /Tween/ Ca++洗涤3次后，加入按1/10,000稀释于TBS/Ca++的HRP-缀合的抗人Fab (AbD/Serotec)，将各板再次在室温下孵育1小时。用TMB过氧化物酶底物试剂盒(Biorad)检测结合的抗体。
结果：
表明了Fab2与各种MASP-2多肽的反应性的斑点印迹分析的结果提供于下表3中。表3提供的数值表明，所需要的蛋白质点样量提供大约最大信号强度的一半。如表所示，所有多肽(仅硫氧还蛋白融合配偶体除外)均被阳性对照Ab (多克隆抗人MASP-2血清，在兔中产生)识别。
表3：斑点印迹法中与不同重组大鼠MASP-2多肽的反应性
Fab2抗体# MASP-2A CUBI-II CUBI/EGF-样 CCPII-SP 硫氧还蛋白
40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
49 0.16 ng NR NR >20 ng NR
52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
57 0.032 ng NR NR NR NR
58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR
63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
86 0.4 ng NR NR 10 ng NR
87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
阳性对照 <0.032 ng 0.16 ng 0.16 ng <0.032 ng NR
NR =无反应。阳性对照抗体是在兔中产生的多克隆抗人MASP-2血清。
所有Fab2均与MASP-2A以及MASP-2K反应(数据未显示)。大多数Fab2识别CCPII-SP多肽但不识别N端片段。Fab2 #60和Fab2 #57是两个例外。Fab2 #60识别MASP-2A和CUBI-II片段，但不识别CUBI/EGF样多肽或CCPII-SP多肽，提示它结合CUBII的表位，或者跨越CUBII和EGF样结构域。Fab2 #57识别MASP-2A但不识别任何所测试的MASP-2片段，可能表明该Fab2识别CCP1的表位。Fab2 #40和#49仅结合完整的MASP-2A。在ELISA结合测定法中，Fab2#60还结合CUBI-II多肽，虽然只具有略微较低的表观亲和性(数据未显示)。
这些发现表明对于MASP-2蛋白多个区域的独特阻断性Fab2的鉴定。
实施例6
本实施例描述了如实施例4所述而鉴定的代表性的高亲和性MASP-2 Fab2抗体的药效动力学分析。
背景/原理：
如实施例4所述，为了鉴定阻断大鼠凝集素途径的高亲和性抗体，大鼠MASP-2蛋白用于淘选噬菌体展示文库。该文库经设计以提供高免疫多样化，并使用完整人免疫球蛋白基因序列来构建。如实施例4所示，通过ELISA筛选鉴定了大约250个单个噬菌体克隆，其以高亲和性与大鼠MASP-2蛋白结合。对这些克隆测序，鉴定了50个编码独特MASP-2抗体的噬菌体。从这些克隆中表达Fab2蛋白，纯化并分析MASP-2结合亲和性和凝集素补体途径功能性抑制。
如实施例4表2所示，该分析的结果是鉴定了17个具有功能阻断活性的MASP-2Fab2 (34%命中率，对于阻断性抗体)。Fab2对凝集素补体途径的功能性抑制在C4沉积水平上是明显的，其是MASP-2对C4裂解的直接度量。重要的是，当评价C3转化酶活性时，抑制同样明显，表明凝集素补体途径的功能性阻断。如实施例4所述鉴定的17个MASP-2阻断性Fab2有效抑制C3转化酶形成，IC50等于或小于10 nM。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50值的范围为纳摩尔以下。此外，如实施例4表2所概述，所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。此外，表2所示的17个阻断性MASP-2 Fab2的每一个有效抑制C3b产生(>95%)，因此证明了该测定法对凝集素途径C3转化酶的特异性。
大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全长抗体同种型变体衍生自Fab2 #11。本实施例描述了在体内对这些同种型的药效动力学参数的表征。
方法：
如实施例4所述，大鼠MASP-2蛋白用于淘选Fab噬菌体展示文库，从中鉴定出Fab2#11。大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全长抗体同种型变体衍生自Fab2 #11。如下在体内表征了大鼠IgG2c和小鼠IgG2a两者全长抗体同种型的药效动力学参数。
在小鼠中的体内研究：
在小鼠中进行药效动力学研究，以研究MASP-2抗体给药在体内对血浆凝集素途径活性的作用。在本研究中，在凝集素途径测定法中，在经皮下(sc)和腹膜内(ip)给予0.3mg/kg或1.0 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb (衍生自Fab2#11的小鼠IgG2a全长抗体同种型)之后的不同时间点，离体测定C4沉积。
图2A图示了在经皮下给药0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后的不同时间点，采自小鼠(n=3小鼠/组)的未稀释的血清样品中离体测定的酵母聚糖包被的微量滴定板上的凝集素途径特异性C4b沉积。在给药抗体前采自小鼠的血清样品作为阴性对照(100%活性)，在体外补充100 nM所述相同阻断性MASP-2抗体的血清用作阳性对照(0%活性)。
图2A所示的结果表明在经皮下给予1.0 mg/kg剂量的小鼠MASP-2 MoAb后对C4b沉积的快速和完全的抑制。在经皮下给予0.3 mg/kg剂量的小鼠MASP-2 MoAb后，见到对C4b沉积的部分抑制。
在小鼠中，在单次ip给予0.6 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后，追踪检查了凝集素途径恢复的时间过程达3周。如图2B所示，在给药抗体后，发生凝集素途径活性的急剧下降，接着是在i.p.给予后持续大约7天的完全的凝集素途径抑制。在第2周和第3周内观察到凝集素途径活性的缓慢恢复，且小鼠中凝集素途径在MASP-2 MoAb给予后17天之前完全恢复。
这些结果证明当系统性递送时，衍生自Fab2 #11的小鼠MASP-2 Moab以剂量-反应方式抑制小鼠的凝集素途径。
实施例7
本实施例描述使用噬菌体展示鉴定结合MASP-2和抑制凝集素-介导的补体活化，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整的完全人scFv抗体。
概述：
完全人高-亲和力MASP-2抗体通过筛选噬菌体展示文库进行鉴定。抗体的可变轻链和重链片段以scFv形式和全长IgG形式分离。人MASP-2抗体可用于抑制与凝集素途径-介导的替代补体途径活化有关的细胞损伤，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性)途径组分完整。在一些实施方案中，本发明的MASP-2 抑制性抗体具有以下特征：(a)对人MASP-2的高亲和力(例如，KD为10 nM或更小)；和(b)在90%人血清中抑制MASP-2-依赖性补体活性，其IC50为30 nM或更小。
方法：
全长催化失活的MASP-2的表达：
编码具有前导序列的人MASP-2多肽(SEQ ID NO:2)的人MASP-2的全长cDNA序列(SEQ ID NO: 1)，被亚克隆至哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)，其在CMV增强子/启动子区的控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J. 等, Nucleic Acids Research19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991))。
为了产生催化失活的人MASP-2A蛋白，按在此通过引用并入本文中的US2007/0172483中所述进行定点诱变。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后纯化，和使用标准加尾程序产生单个腺苷重叠。然后将腺苷加尾的MASP-2A克隆至pGEM-T easy载体中和转化到大肠杆菌。将人MASP-2A进一步亚克隆至哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo。
将上述MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞，使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis等人, 1989)。在无血清培养基中产生MASP-2A，以确保制备物不被其它血清蛋白污染。每隔一天从汇集细胞中收获培养基(共4次)。重组MASP-2A水平平均为大约1.5 mg/升培养基。MASP-2A (上述Ser-Ala突变体)通过亲和色谱在MBP-A-琼脂糖柱上纯化。
在经淘选/scFv转化和过滤筛选而鉴定的ScFv侯选克隆的MASP-2A ELISA
对人免疫球蛋白轻链-和重链-可变区序列的噬菌体展示文库进行抗原淘选，接着经过自动化抗体筛选和选择，以鉴定针对人MASP-2蛋白的高亲和性scFv抗体。进行了针对HIS-标记的或生物素标记的MASP-2A的scFv噬菌体文库的三轮淘选。第三轮淘选先用MBL洗脱，再用TEA (碱性)洗脱。为了监测噬菌体展示scFv片段对靶MASP-2A的特异性富集，进行了针对固定化MASP-2A的多克隆噬菌体ELISA。将来自3轮淘选的scFv基因克隆到pHOG表达载体中并进行小规模过滤筛选，以寻找针对MASP-2A的特定克隆。
挑出含有编码来自第三轮淘选的scFv片段的质粒的细菌菌落，点在硝基纤维素膜上并在非诱导性培养基中培养过夜以产生母板。从第三轮淘选中总共挑出并分析了18,000个菌落，半数来自竞争性洗脱，半数来自随后的TEA洗脱。淘选针对MASP-2A的scFv噬菌粒文库，接着scFv转化和过滤筛选，得到137个阳性克隆。108/137克隆在ELISA测定法中对MASP-2结合呈阳性(数据未显示)，其中进一步分析了其中的45个克隆在正常人血清中阻断MASP-2活性的能力。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法用于评价MASP-2 scFv候选克隆的“阻断活性”。为了产生包含凝集素途径C3转化酶的两种蛋白成分(C4b、C2a)，需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性。因此，抑制MASP-2功能活性的MASP-2 scFv (即阻断性MASP-2 scFv)将抑制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当C3转化酶裂解C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的人血清孵育以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的MASP-2 scFv克隆抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将如上所述地鉴定的45个候选克隆表达、纯化并稀释至相同的储液浓度，再将其稀释在含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM 巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mMCaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)中，以确保所有克隆都具有相同量的缓冲液。以一式三份，测定浓度为2 μg/mL的每个scFv克隆。阳性对照是OMS100 Fab2并以0.4 μg/mL测定。在有和没有scFv/IgG克隆存在时监测C3c形成。
将甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3,pH 9.5)中稀释至浓度20 μg/mL (1 μg/孔)并包被在ELISA板上，在4℃过夜。次日，将甘露聚糖-包被的板用200 μl PBS洗涤3次。再将100 μl 1% HSA封闭溶液加入各孔并在室温下孵育1小时。将各板用200 μl PBS洗涤3次，并利用200 μl PBS贮存在冰上，直到加入样品。
将正常人血清在CaMgGVB缓冲液中稀释至0.5%，并以一式三份，向该缓冲液中加入scFv克隆或OMS100 Fab2阳性对照，浓度为0.01 μg/mL、1 μg/mL (仅OMS100对照)和10 μg/mL，并在冰上预孵育45分钟，然后加入到封闭的ELISA板上。通过在37℃孵育1小时启动反应，并通过将各板移至冰浴而终止反应。用兔α-小鼠C3c抗体，接着是山羊α-兔HRP来检测C3b沉积。阴性对照是无抗体缓冲液(无抗体= 最大C3b沉积)，阳性对照是含EDTA的缓冲液(无C3b沉积)。通过进行同样的测定法来检测背景，除了各孔中无甘露聚糖之外。将无甘露聚糖板的背景信号从含甘露聚糖的孔的信号中减去。截止标准设置为仅无关scFv克隆(VZV)和缓冲液的活性的一半。
结果：基于截止标准，发现共13个克隆阻断MASP-2的活性。选择所有产生> 50%途径抑制的13个克隆并测序，获得10个独特的克隆。发现所有10个克隆具有相同的轻链亚类λ3，但有三个不同的重链亚类VH2、VH3和VH6。在功能测定法中，使用0.5%人血清，10个候选scFv克隆中有5个的IC50 nM值小于25 nM目标标准。
为了鉴定具有改善的效力的抗体，对如上所述鉴定的3个母scFv克隆进行轻链重排(shuffling)。此过程涉及由与源自六个健康供体的首次用于实验的人类λ轻链(VL)的文库配对的每个母克隆的VH组成的组合文库的生成。然后筛选此文库中具有改善的结合亲和性和/或功能性的scFv克隆。
表4：前导子克隆和它们各自的母克隆(都以scFv形式)的IC50 (nM)的功能效力的比较
Figure DEST_PATH_IMAGE007
以下给出的是上表4所示的母克隆和子克隆的重链可变区(VH)序列。
Kabat CDR (31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-107 (H3))以粗体表示；Chothia CDR(26-32 (H1)、52-56 (H2)和95-101 (H3))以下划线表示。
17D20_35VH-21N11VL(OMS646)重链可变区(VH) (SEQ ID NO:6)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS
以下给出的是母克隆和子克隆的轻链可变区(VL)序列。
Kabat CDR (24-34 (L1)；50-56 (L2)；和89-97 (L3)以粗体表示；Chothia CDR(24-34 (L1)；50-56 (L2)和89-97 (L3)以下划线表示。这些区域是相同的，无论按照Kabat还是Chothia系统编号。
17D20m_d3521N11(OMS646)轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:7)
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL
通过斑点印迹分析，对于表位结合，分析了MASP-2抗体OMS100和MoAb_d3521N11VL(OMS646)，这两者已被证明以高亲和性与人MASP-2结合并具有阻断功能性补体活性的能力。结果表明d3521N11和OMS100抗体对MASP-2是高特异性，而不与MASP-1/3结合。抗体既不与MAp19结合，也不与不含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段结合，得到以下结论：结合位点包含CCP1。
因此，在一个实施方案中，用于所要求保护的发明的组合物和方法中的MASP-2抑制剂包含结合由人MASP-2(SEQ ID NO: 2)组成的多肽的人抗体，其中所述抗体包含：
I)a)重链可变区，其包含：i)重链CDR1，其包含SEQ ID NO: 6的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR2，其包含SEQ ID NO: 6的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR3，其包含SEQ ID NO: 6的95-107的氨基酸序列；和
b)轻链可变区，其包含：i)轻链CDR1，其包含SEQ ID NO: 7的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR2，其包含SEQ ID NO: 7的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR3，其包含SEQID NO: 7的89-97的氨基酸序列，其中所述抗体抑制MASP-2依赖性补体活化。
实施例8
本实施例表明，凝血酶活化可在凝集素途径活化后在下列生理条件下发生，并表明MASP-2参与的程度。在正常大鼠血清中，凝集素途径活化导致与补体活化(评估为C4沉积)并发的凝血酶活化(评估为凝血酶沉积)。如从图3A和3B可看到，本系统中凝血酶活化由MASP-2阻断抗体H1(Fab2形式)抑制，表现出抑制浓度-反应曲线(图3B)，其与对于补体活化的抑制浓度-反应曲线(图3A)类似。这些数据表明，凝集素途径的活化，当它发生在创伤中时，将导致在完全依赖于MASP-2的过程中补体和凝血系统两者活化。因此，预期MASP-2阻断抗体将证明有效减轻过度的全身凝血例如弥散性血管内凝血的情况，弥散性血管内凝血是严重创伤病例中导致死亡的标志之一。
实施例9
本实施例提供了在MASP-2 (-/-)和WT (+/+)小鼠中使用弥散性血管内凝血(“DIC”)的局部Schwarztman反应模型产生的结果以评估凝集素途径在DIC中的作用。
背景/原理：
如上文所述，阻断MASP-2抑制了凝集素途径激活和减少了过敏毒素C3a和C5a两者的产生。C3a过敏毒素可以显示是体外有效的血小板聚合剂，但它们的体内参与还不太明确，在伤口修复中血小板物质和纤溶酶的释放可能仅次要涉及补体C3。在本实施例中，在MASP-2 (-/-)和WT (+/+)小鼠中分析凝集素途径的作用以解决以下问题：是否需要C3活化的延长升高而产生弥散性血管内凝血。
方法：
如在此通过引用并入本文的US 7,919,094的实施例1中所述产生用于本研究的MASP-2敲除小鼠(MASP-2 -/-小鼠)。
在此实验中采用局部Schwarztman反应(LSR)模型。LSR是脂多糖(LPS)诱导的反应，其具有来自先天免疫系统的细胞和体液成分的充分表征的作用。LSR对补体的依赖已经充分确立(Polak, L.等, Nature 223:738-739 (1969); Fong J.S.等, J Exp Med 134:642-655 (1971))。在LSR模型中，提供TNFα给小鼠4小时(500 ng，阴囊内)，然后将小鼠麻醉，并准备用于提睾肌的活体显微术。选定具有良好血流量(1-4 mm/s)的毛细血管后静脉(15-60 µm直径)网络用于观察。动物用荧光抗体处理以选择性标记中性粒细胞或血小板。依次扫描血管网络并数字记录所有血管图像供以后分析。记录微循环的基础状态后，小鼠接受单次静脉内注射LPS(100 µg)，无论是单独还是与以下列出的药剂一起。然后每10分钟扫描同一血管网络达1小时。通过减去背景荧光而确定荧光团的具体累积，并通过使图像阈值化而增强。反应幅度根据记录的图像进行测定。LSR的主要量度是聚集数据。
该研究比较了暴露于已知补体途径耗尽剂眼镜蛇毒因子(CVF)或终端途径抑制剂(C5aR拮抗剂)的WT (+/+)小鼠。结果(图4A)表明，CVF以及C5aR拮抗剂均防止聚集体在脉管中出现。另外，MASP-2 (-/-)小鼠(图4B)还表现出局部Schwarztman反应的完全抑制，支持凝集素途径的参与。这些结果清楚地表明MASP-2在DIC生成的作用，并支持使用MASP-2抑制剂治疗和预防DIC。
实施例10
本实施例描述了在WT(+/+)、MASP-2(-/-)、F11(-/-)、F11/C4(-/-)和C4(-/-)小鼠中通过凝血酶底物活化C3和在甘露聚糖上的C3沉积。
原理：
如实施例8中描述的，确定凝血酶活化可在生理条件下在凝集素途径活化后发生，并表明了MASP-2参与的程度。C3在补体系统的活化中起中心作用。经典和替代补体活化途径均需要C3活化。进行实验，以确定C3是否由凝血酶底物活化。
方法：
通过凝血酶底物进行的C3活化
在下列活化形式的凝血酶底物存在的情况下测定C3活化：人FXIa、人FVIIa、牛FXa、人FXa、人活化蛋白C和人凝血酶。将C3与各种凝血酶底物孵育，然后在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上在还原条件下分离。使用纤维素膜的电泳转移后，将膜与单克隆生物素-偶联的大鼠抗小鼠C3孵育，用链霉抗生物素-HRP试剂盒检测和使用ECL试剂显影。
结果：
C3的活化涉及完整a-链裂解成截短a'链和可溶的C3a。图5示出了对通过凝血酶底物对人C3的活化的蛋白质印迹分析的结果，其中未裂解的C3 α链和活化产物a'链用箭头示出。如图5所示，C3与活化形式的人凝血因子XI和因子X，以及活化的牛凝血因子X孵育，可以在没有任何补体蛋白酶的情况下在体外裂解C3。
讨论：
在本实施例中描述的数据表明，在全血清的生理情况下，凝集素途径可以激活凝血级联的组分。因此证明存在涉及MASP-2的补体和凝血之间的串扰。
实施例11
本研究探讨MASP-2-缺乏在LPS(脂多糖)诱导的血栓形成的小鼠模型中的作用。
原理：
由产志贺毒素的大肠杆菌感染引起的溶血性尿毒症综合征(HUS)是儿童中急性肾衰竭的首要原因。在此实施例中，在MASP-2 (-/-)小鼠中进行LPS诱导的血栓形成(微血管凝血)的Schwarztman模型，以确定MASP-2抑制是否有效抑制或阻止血管内血栓的形成。
方法：
在LPS诱导的血栓形成(微血管凝血)的Schwarztman模型中分析了MASP-2 (-/-)(n=9)和WT(n=10)小鼠。将沙雷氏菌LPS给予小鼠并监测随时间的血栓形成。对微血栓和LPS诱导的微血管凝血的发生率进行比较。
结果：
值得注意的是，在沙雷氏菌LPS给予后，所有所测试的MASP-2 -/-小鼠(9/9)没有形成血管内血栓。相比之下，在平行测试的10只WT小鼠中，在7只中检测到微血栓(p=0.0031，Fischer’s exact)。如图6所示，在MASP-2 (-/-)和WT小鼠中测定至LPS感染后微血管阻塞发作的时间，显示了经60分钟测定的具有血栓形成的WT小鼠的百分比，其中早在约15分钟时检测到血栓形成。高达80％的WT小鼠在60分钟时出现血栓形成。相比之下，如图6所示，在60分钟时，MASP-2 (-/-)无一具有血栓形成(对数秩：p =0.0005)。
这些结果表明，在HUS模型中，MASP-2的抑制针对血管内血栓的发生具有防护作用。
实施例12
该实施例描述了MASP-2缺乏和MASP-2抑制在鼠FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中的作用。
背景/原理：
进行下面的实验以分析血栓性微血管病(TMA)的异硫氰酸荧光素(FITC)葡聚糖诱导的内皮细胞损伤模型中MASP-2缺乏和MASP-2抑制的作用，以进一步证明MASP-2抑制剂治疗HUS、aHUS、TTP和具有其他病因的TMA的益处。
方法：
活体内显微术
如Frommhold等, BMC Immunology 12:56-68, 2011所述，制备用于活体内显微术的小鼠。简言之，将小鼠用腹膜内(i.p.)注射氯胺酮(125 mg/kg体重, Ketanest, PfitzerGmbH, Karlsruhe, Germany)和赛拉嗪(12.5 mg/kg体重; Rompun，Bayer, Leverkusen,Germany)而麻醉，并放置在加热垫上以保持体温在37℃。用盐水浸泡目镜(SW 40/0.75数值孔径, Zeiss, Jena, Germany)在直立显微镜(Leica, Wetzlar, Germany)上进行活体内显微术。为了缓解呼吸，小鼠采用PE 90管(Becton Dickson and Company, Sparks, MD,USA)插管。左颈动脉用PE10管(Becton Dickson and Company, Sparks, MD, USA)插管进行血液取样和系统性单克隆抗体(mAb)给药。
提睾肌的准备
如Sperandio等, Blood, 97:3812-3819, 2001所述进行提睾肌手术准备，用于活体内显微术。简言之，打开阴囊和使提睾肌松动。在纵行切开肌肉并将其伸展在盖玻片上后，移动附睾和睾丸并将其固定到一边，充分显微观察提睾肌微循环。在Panasonic S-VHS录像机上通过CCD摄像机(CF8/1; Kappa, Gleichen, Germany)记录提睾肌小静脉。如先前由Frommhold等, BMC Immunology 12:56-68, 20112011所述，用热控制的(35℃碳酸氢盐缓冲盐水)表面灌流提睾肌。
光激发FITC葡聚糖损伤模型
通过光毒性(FITC)-葡聚糖(Cat. No. FD150S, Sigma Aldrich, Poole, U.K.)的光激发诱导提睾肌小静脉和小动脉内皮中受控的光剂量依赖性血管损伤。该程序启动局部血栓形成。作为光毒性试剂，将60µL 10％w/v FITC-葡聚糖溶液通过左颈动脉入口注入并使其均匀分布在整个循环血液10分钟。在选定良好灌注的小静脉后，将低到中范围强度(800-1500)卤素光聚焦于目的血管以对内皮表面诱导FITC-葡聚糖荧光和轻度至中度光毒性，以便以可再现的受控方式刺激血栓形成。使用卤素灯(12V, 100W, Zeiss,Oberkochen, Germany)产生激发FITC-葡聚糖必需的光毒性光强度。由荧光的光致激发而产生的光毒性需要光强度阈值和/或照明持续时间，并且通过内皮表面直接加热或通过产生活性氧自由基引起，如Steinbauer等, Langenbecks Arch Surg 385:290-298, 2000所述。
施加到各血管的光强度通过用于低功率测量的波长校正二极管检测器(Labmaster LM-2, Coherent, Auburn, USA)测量，以便调节。视频扫描的离线分析借助计算机辅助微循环分析系统(CAMAS, Dr. Zeintl, Heidelberg)进行，并如Zeintl等, Int J Microcirc Clin Exp, 8(3):293-302, 2000所述，测定红细胞速度。
在诱导血栓形成前，施用单克隆抗人MASP-2抑制性抗体(mAbH6)和溶媒对照
采用盲法研究设计，在活体内显微术的提睾肌模型中，在光毒性诱导血栓形成前16小时，将MASP-2功能活性的抑制剂即重组单克隆人MASP-2抗体(mAbH6)(以10mg/kg体重的终浓度给予)或等量的同种型对照抗体(无MASP-2抑制活性) i.p.注射给予9周龄雄性C57BL/6 WT同窝小鼠。在诱导血栓形成前1小时，给予第二剂量的mAbH6或对照抗体。也在该模型中评价MASP-2敲除(KO)小鼠。
mAbH6 (针对重组人MASP-2建立)是人MASP-2功能活性的有效抑制剂，其与小鼠MASP-2交叉反应，与之结合并抑制小鼠MASP-2，但由于其物种特异性，亲和力较低(数据未示出)。为了弥补mAbH6对于小鼠MASP-2的较低亲和力，以高浓度(10mg/kg体重)给予mAbH6，以克服物种特异性变化和对于小鼠MASP-2的较低亲和力，从而在体内条件下提供鼠MASP-2功能活性的有效阻断。
在该盲法研究中，记录各个受试小静脉完全阻塞所需要的时间(选择标准是通过可比的直径和血流速度)。
经60分钟观察期，使用活体内显微术录像记录，评价具有微血管阻塞的小鼠百分比、发病时间和至阻塞的时间。
结果：
图7图示了，作为损伤诱导后时间的函数，在FITC/葡聚糖UV模型中，在注射FITC/葡聚糖之前16小时和1小时给予同种型对照或人MASP-2抗体mAbH6 (10mg/kg)处理后，具有微血管阻塞的小鼠的百分比。如图7所示，85％的接受同种型对照抗体的野生型小鼠在30分钟或更短时间内阻塞，而只有19％的经人MASP-2抗体(mAbH6)预处理的野生型小鼠在同一时间内阻塞，并且在人MASP-2抗体处理组中的确最终阻塞的小鼠中至阻塞的时间延迟。进一步注意的是，3只经MASP-2 mAbH6处理的小鼠在60分钟观察期间内完全没有阻塞(即，被保护免于血栓阻塞)。
图8图示了对于经人MASP-2抗体(mAbH6)和同种型对照抗体处理的小鼠以分钟计的阻塞时间。数据报告为散点图，具有平均值(水平条)和标准误差条(垂直条)。该图示出了可观察到阻塞的小鼠中的阻塞时间。因此，在60分钟观察期间没有阻塞的3只MASP-2抗体处理的小鼠并没有包括在本分析(没有未阻塞的对照处理的小鼠)。用于分析的统计检验是非配对t检验；其中符号“*”表示p值=0.0129。如示于图8中，在采用低光强度(800-1500)的FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中，在阻塞的4只MASP-2抗体(mAbH6)处理的小鼠中，与同种型对照抗体处理的小鼠相比，用MASP-2抗体处理显著增加了静脉阻塞时间。同种型对照的完全阻塞时间平均为19.75分钟，而MASP-2抗体处理组的完全阻塞时间平均为32.5分钟。
图9图示了在采用低光强度(800-1500)的FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中，对于野生型小鼠、MASP-2 KO小鼠和用人MASP-2抗体(mAbH6)预处理(在诱导血栓形成前16小时以10mg/kg i.p.给药，然后在诱导血栓形成前1小时再次i.v给药)的野生型小鼠，以分钟计的阻塞时间。仅阻塞的动物被包括在图9中；对于接受同种型对照抗体的野生型小鼠，n = 2；对于MASP-2 KO，n =2；和对于接受人MASP-2抗体(mAbH6)的野生型小鼠，n =4。符号“*”表示p<0.01。如示于图9，在采用低光强度(800-1500)的FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中，MASP-2缺乏和MASP-2抑制(10mg/kg的mAbH6)增加静脉阻塞时间。
结论：
本实施例的结果进一步证明，在TMA的小鼠模型中，阻断凝集素途径的MASP-2抑制剂(例如，阻断MASP-2功能的抗体)抑制微血管凝血和血栓形成，微血管凝血和血栓形成是多种微血管病症的标志。因此，预期在患有HUS、aHUS、TTP或其他微血管病症的患者中，给予MASP-2抑制剂例如MASP-2抑制性抗体将是一种有效疗法，并提供保护而免于微血管凝血和血栓形成。
实施例13
本实施例描述了一项研究，表明人MASP-2抑制性抗体(mAbH6)在富含血小板的人血浆中对血小板功能没有影响。
背景/原理：如实施例12中描述的，证明在FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中，用人MASP-2抑制性抗体(mAbH6)抑制MASP-2增加了静脉阻塞时间。进行以下实验，以确定MASP-2抑制性抗体(mAbH6)是否对血小板功能具有影响。
方法：如下对血小板的ADP诱导的聚集测试人mAbH6 MASP-2抗体的作用。将40 µL溶液中1 µg/ml或0.1 µg/ml浓度的人MASP-2 mAbH6加入360 µL新鲜制备的富血小板的人血浆中。同种型对照抗体被用作阴性对照。在将抗体加入血浆中后，血小板活化通过添加2µM终浓度的ADP而诱导。该测定通过用小磁体在1 mL反应杯中搅拌溶液而开始。血小板聚集在双通道Chrono-log Platelet Aggregometer Model 700 Whole Blood/Optical Lumi-Aggregometer中测定。
结果：
在5分钟时间段内测定溶液中的聚集百分比。其结果示于下表5。
表5：在5分钟时间段内的血小板聚集。
抗体 幅度(聚集百分比) 斜率(随时间变化的聚集百分比)
MASP-2抗体(mAbH6) (1 µg/ml) 46% 59
同种型对照抗体(1 µg/ml) 49% 64
MASP-2抗体(mAbH6) (0.1 µg/ml) 52% 63
同种型对照抗体(0.1 µg/ml) 46% 59
如上表5所示，用对照抗体或MASP-2 mAbH6抗体处理的ADP诱发的血小板聚集之间没有观察到显著差异。这些结果表明，人MASP-2抗体(mAbH6)对血小板功能没有影响。因此，实施例12中描述的结果表明在FITC-葡聚糖/光诱导的内皮细胞损伤的血栓形成模型中，用人MASP-2抑制性抗体(mAbH6)抑制MASP-2增加了静脉阻塞时间，该结果并非由于mAbH6对血小板功能的影响。因此，MASP-2抑制防止血栓形成，而不直接影响血小板功能，揭示出与现有抗血栓形成剂不同的治疗机制
实施例14
背景/原理：
本实施例描述了经进行以检查凝集素途径与凝血/接触系统之间的串扰的研究。
方法：
将水蛭素抗凝的人血浆(约90％)与各种浓度的以下MASP-2抑制性抗体预孵育：OMS646(如实施例7中所述产生)和NimoAb101(如表1中所述，并如WO2004/106384中所述产生)。对照抗体ET-904(Eureka Therapeutics)也用作阴性对照。
通过添加纤维蛋白(20 µg/mL)刺激样品。通过用于检测MASP-2和丝氨酸蛋白酶抑制剂C1抑制剂(C1-INH)或抗凝血酶III(ATIII)之间的复合物的夹心ELISA测定法评估上清液中的丝氨酸蛋白酶活化终点，以特异性检测和定量MASP-2的活化形式，如Kozarcanin H.等，Journal of Thrombosis and Haemostasis 14:531-545, 2016(其在此通过引用整体并入本文)中描述的。
结果：
图10A图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由MASP-2-抗凝血酶复合物形成(MASP-2-ATIII)测定的MASP-2活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断MASP-2活化，而对照抗体则无作用。
图10B图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由MASP-2-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物形成(MASP-2-C1-INH)测定的MASP-2活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断MASP-2活化，而对照抗体则无作用。
图11A图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由激肽释放酶-抗凝血酶复合物形成(KK-ATIII)测定的激肽释放酶活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断激肽释放酶活化，而溶媒对照则无作用。
图11B图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由激肽释放酶-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物形成(KK-C1-INH)测定的激肽释放酶活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断激肽释放酶活化，而溶媒对照则无作用。
图12A图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由因子XII-抗凝血酶复合物形成(FXIIa-ATIII)测定的因子XII活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断因子XII活化，而对照抗体则无作用。
图12B图示说明在递增浓度的MASP-2抑制性抗体mAb＃1(NimoAb101)和mAb＃2(OMS646)存在下，在纤维蛋白刺激的人血浆中，由因子XII-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物形成(FXIIa-C1-INH)测定的因子XII活化，以吸光度单位(AU)表示，证明MASP-2抑制性抗体以剂量依赖性方式阻断因子XII活化，而对照抗体则无作用。
如图10A、11A和12A所示，MASP-2抑制性抗体抑制纤维蛋白诱导的活化和蛋白酶-ATIII复合物的形成。
如图10B、11B和12B进一步所示，虽然IC50值倾向于更高，但是蛋白酶-C1 INH复合物的活化也被MASP-2抗体抑制。
阴性对照单克隆抗体ET-904在任何测定法中均未显示作用，如图10A、10B、11A、11B、12A和12B进一步所示。
讨论：
本实施例中描述的数据证明，补体级联的凝集素途径(其效应酶为MASP-2)与凝血和接触系统之间存在广泛的双向串扰。如Kozarcanin等，et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 14:531-545, 2016中所述，已确定纤维蛋白血凝块(凝血事件的产物)活化凝集素途径。如本文所证明，凝集素途径经由MASP-2的活化随后触发凝血和接触系统的活化。预期这将导致额外的凝血，从而驱动反馈循环，导致过多且不受控制的血凝块形成。该反馈循环预期促进血栓性病症。如本文进一步证明的，MASP-2形成这种串扰的纽带，并且MASP-2抑制性抗体对MASP-2的抑制作用阻断因子XII活化和激肽释放酶活化，从而表明MASP-2抑制性抗体的治疗性用途预期减少凝血和接触级联的过度活化。
因此，在一个方面，本发明提供一种预防、减轻和/或治疗与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括将治疗量的MASP-2抑制性抗体给予有需要的受试者。在一些实施方案中，本发明的方法提供抗凝血和/或抗血栓形成和/或抗血栓生成而不影响止血。
在本发明这一方面的一个实施方案中，所述方法可用于治疗患有与由纤维蛋白或活化血小板引发的补体相关炎症、过度凝血或接触系统活化相关的疾病、病症或病况或有风险发展所述疾病、病症或病况的受试者。在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有选自以下的疾病、病症或病况的受试者：动脉血栓形成、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、手术后血栓形成、冠状动脉旁路移植术和/或介入性心血管手术(例如血管成形术或支架置换)后的再狭窄、动脉粥样硬化、斑块破裂、斑块不稳定、再狭窄、低血压、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、弥散性血管内凝血(DIC)、静脉闭塞性疾病(VOD)、镰状细胞病、血栓性微血管病、狼疮性肾炎、浅表性血栓性静脉炎、因子V Leiden突变、缺血/再灌注损伤、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、正在接受激素替代疗法(HRT)、阿尔茨海默氏病和/或患有高凝状态，例如其中所述受试者由于以下中的至少一种或多种而患有获得性高凝状态或有风险发展获得性高凝状态：正在进行用选自5-FU、GM-CSF、顺铂、肝素、COX-2抑制剂、造影剂、皮质类固醇和抗精神病药的药物的药物疗法；静脉淤滞(由于固定、手术等引起的)、抗磷脂综合征(产生狼疮抗凝剂或心磷脂抗体)、癌症(早幼粒细胞白血病、肺、乳腺、前列腺、胰腺、胃和结肠肿瘤：通过(i)分泌活化因子X的蛋白酶；(ii)通过在膜表面上表达/暴露组织因子，或两者活化凝血；(iii)可导致DIC；和(iv)癌症治疗可增加过度凝血风险)、由于创伤或手术而引起的组织损伤、中央静脉中存在导管(血液流动中断可导致血凝块形成)、参与血凝块形成的蛋白质(例如蛋白质C)的获得性缺乏、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、同型半胱氨酸水平升高、心力衰竭(导致血流缓慢、淤滞)、机械瓣膜、伴原位血栓形成的肺动脉高压、心房颤动、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、肝素诱发的血小板减少症和血栓形成(HITT)、伴原位血栓的川崎病、伴原位血栓的Takayasu动脉炎、转移性癌症的血栓形成倾向、因子VIII水平升高、妊娠和炎性肠病(IBD)。参见例如J.L. Moake,“Overview of Thrombotic Disorders,” Merck Manual专业版，2018年4月，其在此通过引用并入本文。还参见Xu T., 等，Activated platelets contribute importantly tomyocardial reperfusion injury, Am J Physiol Heart Circ Physiol 290:H692-H699,2006; Banz Y. 等，Role of complement and perspectives for intervention inischemia-reperfusion damage, Ann Med. 44:205-217, 2012; Cortes-Canteli M 等，Fibrinogen and altered hemostasis in Alzheimer’s disease, J Alzheimer’s Dis32(3):599-608, 2012。关于可诱导高凝状态和机制的药物，请参见Ramot Y. 等，Drug-induced thrombosis-experimental, clinical and mechanistic considerations,Toxicol Pathol 35(2):208-25，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展镰状细胞病相关的一种或多种症状的受试者，包括减轻至少一种与镰状细胞病有关的症状，例如静脉闭塞性危象相关的疼痛(急性或慢性)、疲劳、血栓栓塞性事件(例如与静脉闭塞性危象相关的中风(缺血、剧烈疼痛、坏死)、脾隔离危象、急性胸综合症、溶血性危象和频繁感染。镰状细胞病(SCD)是涉及血小板活化的遗传性血管闭塞性病症。镰状细胞病源于β-珠蛋白基因内的错义突变，导致珠蛋白分子外表面的谷氨酸被缬氨酸置换。该氨基酸置换使镰状细胞血红蛋白(“HbS”)溶解性降低，并且在脱氧时易于聚合。因此，带有聚合的HbS的红细胞不易变形，并且可能阻塞微血管。这种血管性闭塞(血管闭塞)产生组织缺血和梗塞，这代表SCD患者中发病率和死亡率的主要原因(Frenette和Atweh, J Clin Invest.117:850-858,2007; Steinberg等，Scientific World Journal 8:1295-1324, 2008)。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病、病症或病况，例如其中所述适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病或病症选自遗传性血管性水肿(目前已获得FDA批准的适应症)、糖尿病性黄斑水肿(KalVistaPharmaceutical的称为KVD001的血浆激肽释放酶抑制剂目前处于2期试验)和在心肺分流术期间的出血(正在进行的试验，参见Kolte等，Plasma Kallikrein Inhibitors inCardiovascular Disease, Cardiol Rev 24(3):99-109, 2016)。亦参见world-wide-web.drugs.com/condition/thrombotic-thromboembolic-disorder，于2018年6月20日访问。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症，例如其中所述适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症选自动脉血栓形成(尤其是急性冠状动脉综合征)、静脉血栓形成、肺栓塞、降低心房颤动患者中风的风险、肝素诱发的血小板减少症(参见例如阿加曲班/Lexicomp包装说明书)、从一种抗凝剂转换为另一种抗凝剂(参见例如达比加群酯(dabigatran etexilate)/Pradaxa包装说明书，例如从口服达比加群转化为胃肠外抗凝剂)和用于危重HIT患者(维持)的连续肾脏替代疗法(CRRT)的体外循环通畅的标签外使用。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定先前已经经历、当前患有、或有风险发展心房颤动的受试者，和以足以降低所述受试者中风风险的量给予MASP-2抑制性抗体。参见例如world-wide-web.drugs.com/condition/thrombotic-thromboembolic-disorder，于2018年6月20日访问。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有或有风险发展适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症，例如其中所述适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症选自深静脉血栓形成(一级预防和扩展疗法两者)、肺栓塞、非瓣膜性心房颤动、在伴有或没有心房颤动的受试者中急性冠状动脉综合征后复发性缺血的预防、终末期肾脏疾病、脑缺血、心绞痛、医疗设备(用于减少与医疗设备例如瓣膜、小口径移植物等相关的血凝块的用途，预计比目前的疗法更有效)和体外循环。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定先前已经经历、当前患有、或有风险发展非瓣膜性心房颤动的受试者，和以足以降低所述受试者中风和/或栓塞风险的量给予MASP-2抑制性抗体。参见例如world-wide-web.drugs.com/condition/thrombotic-thromboembolic-disorder，于2018年6月20日访问；world-wide-web.askhematologist.com/thrombotic-disorders，于2018年6月20日访问以及Weitz J.等，Front Med (Lausanne) 4:19, 2017，其在此通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗被确定具有引起高凝状态或增加发展高凝状态的风险的遗传缺陷的受试者，例如其中遗传缺陷选自凝血酶原20210基因突变、MTHFR突变(此基因中的突变可导致易感高水平的同型半胱氨酸，这可增加过度凝血的风险)、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、蛋白A缺乏、蛋白Z缺乏、抗凝血酶缺乏症和导致血栓形成倾向的遗传病症。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于在需要抗凝疗法的受试者中提供标准抗凝疗法例如华法林的替代，例如其中受试者患有通常禁止标准抗凝疗法的病况(例如CNS淀粉样血管病)，或其中在否则用标准抗凝疗法的受试者中所述MASP-2抑制性抗体作为桥接剂在围手术期给予。
在一个实施方案中，本发明的方法可用于治疗患有增加血栓栓塞倾向的获得性疾病、病症或病况的受试者，例如其中所述增加血栓栓塞倾向的获得性疾病或病症选自动脉粥样硬化、抗磷脂抗体、癌症(例如早幼粒细胞白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌或结肠癌)、高同型半胱氨酸血症、感染、组织损伤、静脉淤滞(例如由于手术、骨科或麻痹性固定、心力衰竭、妊娠或肥胖)以及服用含有雌激素的口服避孕药的受试者。
关于抗磷脂抗体，已知这是一种自身免疫性病症，其中静脉或动脉血栓风险增加，并且在已有狭窄的患者中存在更高的血栓栓塞风险。
关于动脉粥样硬化，当动脉粥样硬化斑块破裂时，它们暴露或释放组织因子，活化凝血，引发局部血小板粘附和聚集，从而引起血栓形成。
关于患有癌症，并且特别是早幼粒细胞白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌或结肠癌的患者，这些肿瘤类型可以通过分泌活化因子X的蛋白酶或通过在膜表面表达/暴露组织因子，或两者来活化凝血。
关于感染，严重感染(例如败血症)增加单核细胞和巨噬细胞的组织因子的表达/暴露，并减少活化蛋白C的形成。
关于含有雌激素的口服避孕药的使用，在具有导致易感各种血栓栓塞的遗传异常的患者以及吸烟的女性中，其风险较高。
根据本文描述的本发明的方法的任何实施方案，MASP-2抑制性抗体优选是MASP-2单克隆抗体或其片段，其特异性结合SEQ ID NO: 5的一部分。在一些实施方案中，MASP-2抗体是嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是选自Fv、Fab、Fab'，F(ab)2和F(ab')2的抗体片段。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是单链分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体选自IgG1分子、IgG2和IgG4分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体是包含S228P突变的IgG4分子。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。在一些实施方案中，MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(a)重链可变区，其包含：i)重链CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 6的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 6的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR-H3，其包含SEQ IDNO: 6的95-107的氨基酸序列，以及(b)轻链可变区，其包含：i) 轻链CDR-L1，其包含SEQ IDNO: 7的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 7的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 7的89-97的氨基酸序列。在一些实施方案中，MASP-2抑制性单克隆抗体包含SEQ ID NO: 6所示的重链可变区和SEQ ID NO: 7所示的轻链可变区。在一些实施方案中，MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段特异性地识别由参考抗体识别的表位的至少一部分，所述参考抗体包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQID NO:7所示的轻链可变区。
尽管已经例举和描述了本发明的优选实施方案，但应理解，可在其中进行各种变化而不背离本发明的精神和范围。
Figure IDA0002848204480000011
Figure IDA0002848204480000021
Figure IDA0002848204480000031
Figure IDA0002848204480000041
Figure IDA0002848204480000051
Figure IDA0002848204480000061
Figure IDA0002848204480000071
Figure IDA0002848204480000081
Figure IDA0002848204480000091
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Figure IDA0002848204480000111
Figure IDA0002848204480000121
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Claims (28)

1.一种预防、减轻和/或治疗与纤维蛋白诱导的补体系统活化以及伴随的凝血和/或接触系统活化相关的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括将治疗量的MASP-2抑制性抗体给予有需要的受试者，其中所述MASP-2抑制剂是特异性结合SEQ ID NO:5的一部分的MASP-2单克隆抗体或其片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有需要的受试者患有与由纤维蛋白或活化血小板引发的补体相关炎症、过度凝血或接触系统活化相关的疾病、病症或病况或有风险发展所述疾病、病症或病况。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病症：动脉血栓形成、静脉血栓形成、深静脉血栓形成、手术后血栓形成、动脉粥样硬化斑块破裂和/或斑块不稳定、镰状细胞病、低血压、浅表性血栓性静脉炎、因子V Leiden突变，正在进行激素替代疗法(HRT)和/或患有获得性高凝状态。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病症：冠状动脉旁路移植术和/或介入性心血管手术例如血管成形术或支架置换后的再狭窄；动脉粥样硬化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、全身性炎症反应综合征(SIRS)、弥散性血管内凝血(DIC)、静脉闭塞性疾病(VOD)、血栓性微血管病、狼疮性肾炎、缺血/再灌注损伤、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染和阿尔茨海默氏病。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者由于以下中的至少一种或多种而患有或有风险发展获得性高凝状态：正在进行用选自5-FU、GM-CSF、顺铂、肝素、COX-2抑制剂、造影剂、皮质类固醇和抗精神病药的药物的疗法；由固定和/或手术引起的静脉淤滞、参与血凝块形成的蛋白(例如蛋白C)的获得性缺乏、同型半胱氨酸水平升高、心力衰竭、机械瓣膜存在、伴原位血栓形成的肺动脉高压、心房颤动、肝素诱发的血小板减少症(HIT)、肝素诱发的血小板减少症和血栓形成(HITT)、伴原位血栓的川崎病、伴原位血栓的Takayasu动脉炎、转移性癌症的血栓形成倾向、因子VIII水平升高或妊娠。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者由于以下中的至少一种或多种而患有或有风险发展获得性高凝状态：患有抗磷脂综合征、癌症(早幼粒细胞白血病、肺、乳腺、前列腺、胰腺、胃和结肠肿瘤)；由于创伤或手术而引起的组织损伤、中央静脉中存在导管、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)或炎性肠病(IBD)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展适于用激肽释放酶抑制剂治疗的疾病或病症例如遗传性血管性水肿或在心肺分流术期间的出血。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展糖尿病性黄斑水肿。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症，例如其中适于用凝血酶抑制剂治疗的疾病或病症选自肺栓塞、从一种抗凝剂转换为另一种抗凝剂、以及用于危重HIT患者(维持)的连续肾脏替代疗法(CRRT)的体外循环通畅的标签外使用。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已经经历、当前患有、或有风险发展心房颤动，并且所述MASP-2抑制性抗体以足以降低所述受试者的中风风险的量给予。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有或有风险发展适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症，例如其中适于用因子XII抑制剂治疗的疾病或病症选自深静脉血栓形成(一级预防和扩展疗法两者)、非瓣膜性心房颤动、在伴有或没有心房颤动的受试者中急性冠状动脉综合征后复发性缺血的预防、终末期肾脏疾病、脑缺血、心绞痛、减少或防止与医疗设备(例如瓣膜、小口径移植物等)和/或体外循环相关的血凝块。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已经经历、当前患有、或有风险发展非瓣膜性心房颤动，并且所述MASP-2抑制性抗体以足以降低所述受试者的中风和/或栓塞风险的量给予。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者具有遗传缺陷，所述遗传缺陷引起或增加发展高凝状态的风险。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述遗传缺陷选自凝血酶原20210基因突变、MTHFR突变、蛋白C缺乏、蛋白S缺乏、蛋白A缺乏、蛋白Z缺乏、抗凝血酶缺乏症和导致血栓形成倾向的遗传病症。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有增加血栓栓塞倾向的获得性疾病、病症或病况，例如其中所述增加血栓栓塞倾向的获得性疾病或病症选自动脉粥样硬化、抗磷脂抗体、癌症、高同型半胱氨酸血症、感染、组织损伤、静脉淤滞(例如由于手术、骨科或麻痹性固定、心力衰竭、妊娠或肥胖)以及服用含有雌激素的口服避孕药的受试者。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述癌症选自早幼粒细胞白血病、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和结肠癌。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者需要抗凝疗法，并且所述MASP-2抑制性抗体被用作标准抗凝疗法(例如，华法林)的替代。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者患有通常禁止标准抗凝疗法的病况，例如CNS淀粉样血管病。
19.根据权利要求17所述的方法，其中在否则用标准抗凝疗法的受试者中所述MASP-2抑制性抗体作为桥接剂在围手术期给予。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抗体是嵌合、人源化或人抗体。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体是选自Fv、Fab、Fab'、F(ab)2和F(ab') 2的抗体片段。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体是单链分子。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体选自IgG1分子、IgG2和IgG4分子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述IgG4分子包含S228P突变。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体基本上不抑制经典途径。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含：i)重链CDR-H1，其包含SEQ ID NO: 6的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR-H2，其包含SEQ ID NO: 6的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR-H3，其包含SEQ ID NO: 6的95-107的氨基酸序列，和
(b)轻链可变区，其包含：i)轻链CDR-L1，其包含SEQ ID NO: 7的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR-L2，其包含SEQ ID NO: 7的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR-L3，其包含SEQ ID NO: 7的89-97的氨基酸序列。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性单克隆抗体包含SEQ ID NO: 6所示的重链可变区和SEQ ID NO: 7所示的轻链可变区。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述MASP-2抑制性抗体或其抗原结合片段特异性地识别由参考抗体识别的表位的至少一部分，所述参考抗体包含SEQ ID NO:6所示的重链可变区和SEQ ID NO:7所示的轻链可变区。
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