JP2015514117A - 発作性夜間血色素尿症の治療のためにmasp−1、masp−2および/またはmasp−3を阻害する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年4月6日に出願された米国特許仮出願第621,461号の恩典を主張するものである。
本願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名前は、MP_1_0146_PCT_Sequence_20130327_ST25.txtである。このテキストファイルは85 KBであり、2013年4月1日に作成され、本明細書の出願と共にEFS-Webを介して提出されている。
補体系は、ヒトおよび他の脊椎動物において微生物感染および他の急性傷害に対する免疫応答を開始、増幅、および組織化するための初期作用機構を提供する(M.K. Liszewski and J. P. Atkinson, 1993, in Fundamental Immunology, Third Edition, W.E, Paul編, Raven Press, Ltd., New York)。補体活性化は潜在的な病原体に対する有益な第一線の防御を提供するが、防御免疫応答を促進する補体の活性は宿主にとって潜在的な脅威となることもある(K.R, Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol. 15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig. 24:219-228, 1994)。例えば、C3およびC5タンパク質分解産物は好中球を動員および活性化する。活性化好中球は宿主防御に不可欠であるが見境なく破壊酵素を放出し、臓器損傷を引き起こすことがある。さらに、補体活性化によって、近くの宿主細胞ならびに微生物標的の表面に溶解性補体成分が沈着し、その結果、宿主細胞が溶解することがある。
一局面において、本発明は、発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法を提供する。方法は、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程を含む。一部の態様において、方法は、MASP-2阻害物質を含む組成物を対象に投与する工程をさらに含む。
SEQ ID NO:1 ヒトMAp19 cDNA
SEQ ID NO:2 ヒトMAp19タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:3 ヒトMAp19タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:4 ヒトMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5 ヒトMASP-2タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:6 ヒトMASP-2タンパク質(成熟)
SEQ ID NO:7 ヒトMASP-3 cDNA
SEQ ID NO:8 ヒトMASP-3タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:9 ヒトMASP-1 cDNA
SEQ ID NO:10 ヒトMASP-1タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:11 ヒトMAp44タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:12 ラットMASP-2 cDNA
SEQ ID NO:13 ラットMASP-2タンパク質(リーダーあり)
SEQ ID NO:14 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)をコードするDNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:15 17D20_dc35VH21N11VL(OMS646)重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:16 17N16mc重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:17 17D20_dc21N11VL(OMS644)軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:18 17N16_dc17N9(OMS641)軽鎖可変領域(VL)をコードするDNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:19 17N16_dc17N9(OMS641)軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:20 scFv娘クローン17N16m_d17N9完全長ポリペプチド
SEQ ID NO:21 scFv娘クローン17D20m_d3521N11完全長ポリペプチド
SEQ ID NO:22 完全長ポリペプチドをコードするscFv娘クローン17N16m_d17N9 DNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:23 完全長ポリペプチドをコードするscFv娘クローン17D20m_d3521N11 DNA(シグナルペプチドなし)
SEQ ID NO:24 親DTLacO重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:25 MASP-3特異性クローンM3J5重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:26 MASP-3特異性クローンM3M1重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:27 親DTLacO軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:28 MASP-3特異性クローンM3J5軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:29 MASP-3特異性クローンM3M1軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:30 MASP-3クローンD14重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:31 MASP-3クローンD14軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:32 MASP-1クローン1E10重鎖可変領域(VH)ポリペプチド
SEQ ID NO:33 MASP-1クローン1E10軽鎖可変領域(VL)ポリペプチド
SEQ ID NO:34 SGMI-1ペプチド
SEQ ID NO:35 SGMI-2ペプチド
SEQ ID NO:36 ヒトIgG1-Fcポリペプチド
SEQ ID NO:37 ペプチドリンカー#1(12aa)
SEQ ID NO:38 ペプチドリンカー#2(10aa)
SEQ ID NO:39 ヒトIL-2-シグナル配列、SGMI-1、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチド融合体をコードする核酸
SEQ ID NO:40 SGMI-1、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含む成熟ポリペプチド融合体(SGMI-1Fc)
SEQ ID NO:41 ヒトIL-2-シグナル配列、SGMI-2、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含むポリペプチド融合体をコードする核酸
SEQ ID NO:42 SGMI-2、リンカー#1およびヒトIgG1-Fcを含む成熟ポリペプチド融合体(SGMI-2Fc)
I. 定義
本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本発明の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲において使用される用語を明確にするために、以下の定義を提供する。
i. 概略;レクチン経路は定義し直された
本明細書に記載されるように、本発明者らは、補体のレクチン経路が、いずれも糖質認識成分(MBL、CL-11およびフィコリン)で形成されたレクチン経路活性化複合体によって駆動される、補体を活性化するための2つのエフェクターアーム:(i)「レクチン経路エフェクターアーム1」または「LEA-1」と呼ばれる、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3によって形成されたエフェクターアーム;ならびに(ii)本明細書では「レクチン経路エフェクターアーム2」または「LEA-2」と呼ばれるMASP-2駆動型活性化エフェクターアームを有するという驚くべき発見を達成した。LEA-1およびLEA-2はいずれも溶解および/またはオプソニン化を実施することができる。
レクチン経路の第一のエフェクターアーム、すなわちLEA-1は、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-1およびMASP-3によって形成される。本明細書に記載されるように、本発明者らは今、MASP-3の非存在かつMASP-1の存在において、第二経路が面構造上で実質的に活性化されないことを示した。これらの結果は、MASP-3が、第二経路を開始させることにおいて、これまで開示されたことがない役割を果たすことを実証し、これは、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にする突然変異を有する珍しい3MC常染色体劣性障害の患者から採取されたMASP-3欠損3MC血清を使用して確認されている(Rooryck C, et al., Nat Genet. 43(3):197-203 (2011))。これらの新規な発見に基づき、従来から定義されるような第二経路を伴う補体活性化はMASP-3依存性であると予想される。事実、MASP-3およびそのLEA-1活性化は、これまでわかりにくかった第二経路のイニシエーターを表し得る。
レクチン経路の第二のエフェクターアーム、すなわちLEA-2は、レクチン経路関連セリンプロテアーゼMASP-2によって形成される。MASP-2は、認識成分がそれぞれのパターンに結合した場合に活性化され、かつまた、MASP-1によっても活性化され得、その後、補体成分C4をC4aおよびC4bへと切断する。切断産物C4bが血漿C2に結合したのち、C4b結合C2は、C4b結合C2を酵素的に活性な複合体C4bC2aおよび小さなC2b切断断片へと転換する第二のMASP-2媒介性切断工程の基質になる。C4b2aは、豊富な血漿成分C3をC3aおよびC3bへと転換する、レクチン経路のC3転換C3コンバターゼである。C3bは、チオエステル結合を介して、近接する任意の面に結合する。いくつかのC3b断片がC3コンバターゼ複合体C4b2aに近接して結合するならば、このコンバターゼは、C5をC5bおよびC5aへと転換するようにその特異性を変化させて、C5コンバターゼ複合体C4b2a(C3b)nを形成する。このC5コンバターゼはMACの形成を開始することができるが、このプロセスは、それだけで溶解を促進するのには効果が不十分であると考えられる。むしろ、LEA-2によって産生される初期のC3bオプソニンが新たな第二経路C3コンバターゼおよびC5コンバターゼ部位の形成のための核を形成し、それが最終的に豊富なMAC形成および溶解を生じさせる。後者の事象は、LEA-2形成C3bと関連するB因子のD因子活性化によって媒介され、したがって、D因子の成熟におけるMASP-1の本質的役割のおかげでLEA-1に依存する。また、C4欠損マウスは虚血再灌流傷害から保護されないが、一方、MASP-2欠損マウスは保護されることから(前記Schwaeble et al., PNAS, 2011)、虚血再灌流傷害の病態生理学において重要な役割を果たす、C4の非存在においてC3を活性化するためのMASP-2依存性C4バイパス活性化経路がある。LEA-2はまた、プロトロンビンからトロンビンへの切断(共通経路)およびXII因子(ハーゲマン因子)をその酵素的に活性な形態XIIaへと転換するための切断を含む凝固経路に結び付いている。XIIa因子は他方で、XI因子をXIaに切断する(内因性経路)。凝固カスケードの内因性経路活性化は、血栓形成にとってきわめて重要であるフィブリン形成を生じさせる。
現在、3つのマンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ(MASP-1、MASP-2、およびMASP-3)がヒト血清中でマンナン結合レクチン(MBL)と関連していることが公知である。マンナン結合レクチンはまた、最近の文献においては、「マンノース結合タンパク質」または「マンノース結合レクチン」とも呼ばれている。MBL-MASP複合体は、多様な微生物上に存在する糖質構造へのMBLの結合のおかげで、先天性免疫において重要な役割を果たす。MBLと糖質構造の特定のアレイとの相互作用がMASP酵素前駆体の活性化を生じさせ、それが他方で、補体成分C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することによって補体を活性化する(Kawasaki et al., J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176:1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol. 150:571-578 (1993))。
図2は、MASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO:5)およびMAp19ポリペプチド(SEQ ID NO:2)ならびにそれらをコードするエキソンのドメイン構造を示す略図である。図3は、MASP-1ポリペプチド(SEQ ID NO:10)、MASP-3ポリペプチド(SEQ ID NO:8)およびMAp44ポリペプチド(SEQ ID NO:11)ならびにそれらをコードするエキソンのドメイン構造を示す略図である。図2および3に示すように、セリンプロテアーゼMASP-1、MASP-2、およびMASP-3は、C1rおよびC1sに見られるように配置された6つの別々ドメイン;すなわち(I)N末端C1r/C1s/ウニVEGF/骨形成タンパク質(またはCUBI)ドメイン;(II)上皮成長因子(EGF)様ドメイン;(III)第二のCUBドメイン(CUBII);(IVおよびV)2つの補体制御タンパク質(CCP1およびCCP2)ドメイン;および(VI)セリンプロテアーゼ(SP)ドメインからなる。
ヒトMASP-1ポリペプチド(SEQ ID NO:10)およびMASP-3ポリペプチド(SEQ ID NO:8)は1つの構造遺伝子から生じ(Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)、その遺伝子は3番染色体の長腕の3q27〜28領域にマッピングされている(Takada et al., Genomics 25:757-759 (1995))。MASP-3およびMASP-1 mRNA転写物は一次転写物から選択的スプライシング/ポリアデニル化プロセスによって生成される。MASP-3翻訳産物は、MASP-1およびMASP-3の両方に共通であるアルファ鎖と、MASP-3に固有であるベータ鎖(セリンプロテアーゼドメイン)と構成される。図3に示すように、ヒトMASP-1遺伝子は18のエキソンを包含する。ヒトMASP-1 cDNA(SEQ ID NO:9と表記される)はエキソン2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、16、17、および18によってコードされる。図3にさらに示すように、ヒトMASP 3遺伝子は12のエキソンを包含する。ヒトMASP-3 cDNA(SEQ ID NO:7と表記される)はエキソン2、3、4、5、6、7、8、10、11、および12によってコードされる。選択的スプライシングが、エキソン2、3、4、5、6、7、8、および9から生じる、MBL関連タンパク質44(「MAp44」)(SEQ ID NO:11と表記される)と呼ばれるタンパク質を生じさせる。
ヒトMASP-2遺伝子は染色体1p36.3-2上に位置し(Stover et al., Cytogenet and Cell Genet. 84:148-149 (1999))、図2に示すように、12のエキソンを包含する。MASP-2(SEQ ID NO:5)およびMAp19(SEQ ID NO:2)は、選択的スプライシング/ポリアデニル化によって生成される単一の構造遺伝子の転写物によってコードされる(Stover et al., Genes and Immunity 2:119-127 (2001))。ヒトMASP-2 cDNA(SEQ ID NO:4)はエキソン2、3、4、6、7、8、9、10、11、および12によってコードされる。(SEQ ID NO:1)によってコードされる、MBL関連タンパク質19(「MAp19」、「sMAP」とも呼ばれる)と呼ばれる20kDaタンパク質(SEQ ID NO:2)がエキソン2、3、4、および5から生じる。MAp19は、図2に示すようにエキソン5に由来する4つのさらなる残基(EQSL)を有するMASP-2のN末端CUB1-EGF領域を含む非酵素的タンパク質である。
図4は、CUBI、EGF、CUBII、CCP1、CCP2ドメインおよびセリンプロテアーゼ(SP)ドメイン中の保存された触媒三連構造残基(H、D、S)を示す、MASP-1(SEQ ID NO:10)、MASP-2(SEQ ID NO:6)およびMASP-3(SEQ ID NO:8)のタンパク質配列のアミノ酸アライメントである。記号「.」は同一のアミノ酸配列を示す。
先天性免疫におけるMBL/フィコリン-MASP複合体の役割は、C型レクチンドメイン(MBL分子中に存在)のカルシウム依存性結合によって、または酵母、細菌、ウイルスおよび真菌において見られる糖質構造へのフィブリノゲン様ドメイン(フィコリン分子中に存在)の結合によって媒介される。この認識段階が酵素前駆体MASP-2の活性化をもたらし、その後それが、C4およびC2を切断してC3コンバターゼC4b2bを形成することにより、C1q-(C1r)2-(C1s)2複合体内の活性化されたC1の作用を模倣する。これが、標的病原体上のC4bおよびC3bの沈着を可能にし、ひいては、食作用による死滅およびクリアランスを促進する。
補体のレクチン経路活性化ルートが、2つの独立したエフェクター機構:(i)LEA-2:補体駆動型オプソニン化、走化性(Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011))および細胞溶解を媒介するMASP-2駆動型経路、ならびに(ii)LEA-1:アクチベーター表面上のB因子の切断および活性化によって第二経路コンバターゼC3bBbを生成することによって補体活性化を開始し、次いでそれがC3b沈着および第二経路コンバターゼC3bBbの形成を触媒し、それが結果として細胞溶解および微生物オプソニン化を生じさせることができる新規なMASP-3依存性活性化ルートを介して、補体を活性化するという結論を指摘する、いくつかの独立した線の強力な実験的証拠が本明細書に提供される。加えて、本明細書に記載されるように、MASP-1、MASP-3もしくはHTRA-1またはこれら3つのいずれかの組み合わせによるB因子および/またはD因子の別々のレクチン非依存性活性化が、第二経路を介する補体活性化を生じさせることもできる。
i. PNHの概略
発作性夜間血色素尿症(PNH)は、時としてマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれるか、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。症例の大半は一次PNHである。PNHは、補体誘導性の赤血球破壊(溶血)、少ない赤血球数(貧血)、血栓症、および骨髄機能不全を特徴とする。実験室におけるPNHの所見は、考えられる原因として自己反応性RBC結合抗体の非存在下で、血管内溶血性貧血:低ヘモグロビン、多量の乳酸デヒドロゲナーゼ、多数の網状赤血球数(破壊された細胞を交換するために未熟血球が骨髄によって放出される)、高ビリルビン(ヘモグロビンの破壊産物)と一致する変化を示す。
PNHにおける負の補体制御因子CD55およびCD59の不完全な表面発現の間の因果関係と、血管内溶血の阻止におけるエクリズマブの有効性の組み合わせから、PNHは、補体系によって媒介される状態であるとはっきりと定義される。このパラダイムは広く受け入れられているが、補体活性化を開始する事象、および関与する補体活性化経路がどういったものであるかは未解決のままである。CD55およびCD59は、全ての補体開始経路に共通する補体カスケード中の終末増幅段階を負に調節するので、補体活性化がレクチン経路によって開始されるか、古典経路によって開始されるか、第二経路の自発的代謝回転によって開始されるかに関係なく、これらの分子が欠損すると膜侵襲複合体の形成と膜組込みが悪化する。従って、PNH患者では、RBC表面上でのC3b沈着につながる、全ての補体活性化事象が、その後の増幅ならびに病理学的溶血(血管内溶血および/または血管外溶血)を誘発し、溶血発作を突然引き起こすことができる。PNH患者における溶血発作を誘発する分子事象のはっきりとした機構理解はまだなされていない。溶血発作を起こしているPNH患者における補体開始事象はまったく明らになってないので、PNHにおける補体活性化は低レベルの第二経路「アイドリング」活性化により自然発生する可能性があり、その後に、CD55およびCD59の欠如による不適切な終末補体活性化制御によって増大するというのが主流となっている見解である。
このセクションは、PNHのインビトロモデルにおける溶血に対するLEA-2およびLEA-1遮断の阻害効果を記載する。この発見は、PNHの1つまたは複数の局面に罹患している患者を治療するためのLEA-2遮断物質(MASP-2に結合し、かつその機能を遮断する抗体を含むが、それに限定されない)およびLEA-1遮断物質(MASP-3、MASP-3または両方に結合し、かつそのMASP-1媒介性活性化の機能を遮断する抗体を含むが、それに限定されない)の有用性、ならびにエクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けるPNH患者においてC3断片媒介血管外溶血の効果を緩和するためののLEA-2および/またはLEA-1および/またはMASP-3依存性レクチン非依存性補体活性化の阻害因子(MASP-2阻害因子、MASP-3阻害因子、およびMASP-2/MASP-3またはMASP-1/MASP-2二重または二重特異性阻害因子、ならびに、汎特異性MASP-1/MASP-2/MASP-3阻害因子を含む)の使用を裏付ける。
上に詳述したように、PNH患者は、循環からのRBCクリアランスの2つの別々の機構:膜侵襲複合体(MAC)の活性化による血管内溶血、ならびにC3bによるオプソニン化後の血管外溶血およびその後の細網内皮系による補体レセプター結合および取込み後のクリアランスにより、貧血になる。血管内溶血は、患者がエクリズマブで治療された場合に概ね予防される。エクリズマブは、補体開始活性化事象およびその後のオプソニン化の両方よりも下流で起こる終末溶解エフェクター機構を遮断するため、エクリズマブは血管外溶血を遮断しない(Risitano A.M. et. al., Blood 113:4094-100(2009))。その代わり、未治療PNH患者においては溶血を起こしたと考えられるRBCが、今や、活性化されたC3bタンパク質をその表面に蓄積できることができ、それが、細網内皮系による取込みを増強し、その血管外溶血を増強する。したがって、エクリズマブ治療は、実質的に、RBCの性質を血管内溶血から潜在的な血管外溶血に変える。結果として、エクリズマブで治療される一部のPNH患者は依然として貧血のままである。したがって、上流で補体活性化を遮断し、かつPNH RBCのオプソニン化を阻止する作用物質は、エクリズマブを用いてときおり見られる血管外溶血を遮断するのに特に適していることができるということになる。
PNHのインビトロモデルを使用して、本発明者らは、PNHにおける補体活性化および結果的な溶血が実際にLEA-2および/またはLEA-1活性化によって開始され、それが、第二経路の独立した機能ではないことを実証した。これらの研究は、Crry欠損マウスからのRBC(マウスにおける終末補体経路の重要な負の調節物質)およびPNH患者には存在しない同じ補体調節物質を欠くCD55/CD59欠損マウスからのRBCをはじめとする様々なマウス系統のマンナン感作RBCを使用した。マンナン感作Crry欠損RBCを補体充分なヒト血清に曝露すると、RBCは、3%の血清濃度で実質的に溶血したが(図21および22)、一方、補体欠損血清(HI:熱不活化)は溶血性ではなかった。驚いたことに、MASP-2抗体の添加によってLEA-2が遮断された補体充分な血清は溶血活性が低下しており、効果的な溶血のためには6%血清が必要であった。CD55/CD59欠損RBCを試験した場合にも同様な観察結果が得られた(図24)。MASP-2モノクローナル抗体で補充された補体充分なヒト血清(すなわち、LEA-2が抑制された血清)は、溶血の支持において未処理の血清よりも効果が約2倍の低さであった。さらに、未処理の血清に比べて未処理のWT RBCの効果的な溶血を促進するためには、より高濃度のLEA-2遮断血清(すなわち、抗MASP-2モノクローナル抗体で処理された)が必要であった(図23)。
本明細書に提示されるデータは、PNHにおける貧血に関して以下の病原性機構を示唆する。主としてであるがただし排他的でなくLEA-1によって開始される、終末補体成分の調節されない活性化およびMACの形成によるRBCの溶解による血管内溶血、ならびに、主としてLEA-2によって開始されると考えられる、C3bによるRBCのオプソニン化によって生じる血管外溶血。補体活性化を開始し、MAC形成および溶血を促進することにおけるLEA-2の認められる役割は明らかであるが、このプロセスは、溶血を生じさせるLEA-1開始補体活性化よりも効果が実質的に低いと考えられる。したがって、LEA-2遮断物質は、PNH患者における血管内溶血を有意に減少させると予想されるが、この治療活性は部分的でしかないと予想される。比較により、LEA-1遮断物質の場合に、PNH患者における血管内溶血のより実質的な減少が予想される。
本明細書に提示されるデータは、別々のクラスの治療剤によって別々に、または組み合わせて標的化することができる、PNHにおけるRBCクリアランスおよび貧血の以下の2つの病原性機構を明示する:主としてであるがただし排他的でなくLEA-1によって開始され、したがって、LEA-1遮断物質によって効果的に予防されると予想される血管内溶血、および主としてLEA-2によって駆動され、したがってLEA-2遮断物質によって効果的に予防されるC3bオプソニン化による血管外溶血。
上に詳述したように、個々にLEA-1およびLEA-2を遮断し、ひいては組み合わさって、血管内溶血および血管外溶血を媒介するすべての補体活性化事象を遮断する薬理学的物質の組み合わせの使用は、PNH患者にとって最良の臨床転帰を提供すると予想される。この転帰は、例えば、LEA-1遮断活性を有する抗体と、LEA-2遮断活性を有する抗体との同時投与によって達成することができる。一部の態様において、LEA-1遮断活性およびLEA-2遮断活性が単一の分子実体に組み合わされ、LEA-1およびLEA-2複合遮断活性を有するそのような実体は、血管内溶血および血管外溶血を効果的に阻止し、PNHにおける貧血を予防する。そのような実体は、1つの抗原結合部位がMASP-1を特異的に認識し、LEA-1を遮断し、LEA-2を減少させ、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、さらにLEA-2を遮断する二重特異性抗体を含み得るか、またはそれからなり得る。あるいはまた、そのような実体は二重特異性モノクローナル抗体からなり得、1つの抗原結合部位がMASP-3を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、LEA-2を遮断する。そのような実体は最適には二重特異性モノクローナル抗体からなり得、1つの抗原結合部位がMASP-1およびMASP-3の両方を特異的に認識し、ひいてはLEA-1を遮断し、LEA-2を減少させ、その上、第二の抗原結合部位がMASP-2を特異的に認識し、さらにLEA-2を遮断する。また、タンパク質配列およびアーキテクチャ全体の類似性に基づき、機能的にMASP-1、MASP-2、およびMASP-3に特異的に結合し、ひいてはLEA-1およびLEA-2の機能的遮断を達成する、2つの同一の結合部位を有する従来の抗体を開発することができると考えることができる。汎MASP阻害活性を有するそのような抗体は、血管内溶血および血管外溶血の両方を阻止し、ひいてはPNH患者における貧血を効果的に治療すると予想される。
補体のレクチン経路が2つの主要な補体活性化アームLEA-1およびLEA-2で構成され、また、レクチン非依存性補体活性化アームがあるという認識の上で、補体の免疫防御能力を完全には停止させることなく(すなわち、古典経路を完全なままにしておいて)、PNHと関連する病状を生じさせるこれらのエフェクターアームの1つまたは複数を特異的に阻害することが非常に望ましいと理解される。これは、免疫複合体処理を取り扱い、感染に対する宿主防御を支援するために、C1q依存性補体活性化系を完全なままにさせておくと考えられる。
本明細書に記載されるように、本発明者らは、溶解を生じさせるLEA-1の活性化がMASP-3依存性であることを予想外に発見した。本明細書にさらに記載されるように、生理学的条件下、MASP-3依存性LEA-1活性化はオプソニン化にも寄与し、それにより、LEA-2媒介性補体活性化との付加的効果を提供する。実施例7に実証されるように、Ca++の存在においては、MASP-3がD因子-/-血清中でLEA-1の活性化を駆動することができるため、D因子は必要とされない。MASP-3、MASP-1およびHTRA-1は、プロD因子を活性D因子へと転換することができる。同様に、MASP-3(MASP-1およびMASP-2とは対照的に)は、自己活性化酵素ではなく、MASP-1の支援なしにはその活性形態へと転換されることができないため、MASP-3活性化は、多くの場合、MASP-1に依存すると考えられる(Zundel, S. et al., J. Immunol. 172:4342-4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol. Chem. 288:8922-8934 (2013)。MASP-3は自己活性化せず、多くの場合、MASP-1の活性がその酵素的に活性な形態へと転換されることを必要とするため、第二経路C3コンバターゼC3BbのMASP-3媒介性活性化は、MASP-3酵素前駆体もしくはすでに活性化されたMASP-3を標的化すること、またはMASP-3のMASP-1媒介性活性化を標的化すること、またはその両方により、阻害することができる。理由は、多くの場合、MASP-1機能活性の非存在においては、MASP-3はその酵素前駆体形態にとどまり、第二経路C3コンバターゼ(C3bBb)の直接形成を通してLEA-1を駆動することができないからである。
本明細書に記載されるように、LEA-2媒介性補体活性化はMASP-2依存性であり、オプソニン化および/または溶解を生じさせる。したがって、LEA-2レクチン依存性補体系を特異的に阻害するための治療剤の開発において標的化するのに好ましいタンパク質成分はMASP-2である。いくつかのタンパク質が、タンパク質-タンパク質相互作用を介してMASP-2に結合またはMASP-2と相互作用することが示されている。例えば、MASP-2は、レクチンタンパク質MBL、H-フィコリンおよびL-フィコリンならびにコレクチン-11に結合し、それらと一緒にカルシウム依存性複合体を形成することが知られている。Ma Y., et al., J Innate Immun. Epub Dec. 4 (2012)。各MASP-2/レクチン複合体は、タンパク質C4およびC2のMASP-2依存性切断によって補体を活性化することが示されている(Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987); Matsushita, M., et al., J. Exp. Med. 176:1497-2284, (2000); Matsushita, M., et al., J. Immunol. 168:3502-3506, (2002))。研究は、MASP-2のCUB1-EGFドメインがMBLとのMASP-2の関連に不可欠であることを示している(Thielens, N. M., et al., J. Immunol. 166:5068, (2001))。また、CUB1EGFCUBIIドメインが、活性MBL複合体の形成に必要であるMASP-2の二量体化を媒介することが示されている(Wallis, R., et al., J. Biol. Chem. 275:30962-30969, 2000)。したがって、MASP-2依存性補体活性化にとって重要であることが知られているMASP-2標的領域に結合するかまたはそれを妨害するMASP-2阻害物質を同定することができる。
別の局面において、本発明は、PNHの1つまたは複数の局面に罹患しているか、またはPNHを発症する危険のある、対象においてLEA-1の有害作用を阻害し、LEA-2の有害作用を阻害するための方法を提供する。
*表2に記載されている交差反応性の列に関して、指定されたMASP阻害因子は、「結合しない」と記されている他の補体成分(すなわち、ポリペプチドまたはその断片)に対する場合よりも少なくとも10倍(例えば少なくとも20倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍)大きい結合親和性で阻害因子結合ドメインに結合する。
本発明のこの局面のいくつかの態様において、MASP阻害物質は、LEA-1および/またはLEA-2補体活性化経路の少なくとも1つを阻害するMASP抗体(例えば、MASP-1、MASP-2またはMASP-3抗体)を含む。本発明のこの局面において有用なMASP抗体は、任意の抗体産生哺乳動物由来のポリクローナル、モノクローナルまたは組換え抗体を含み、かつ、多重特異性(すなわち、二重特異性または三重特異性)、キメラ、ヒト化、完全ヒト、抗イディオタイプ、および抗体断片であり得る。抗体断片としては、本明細書にさらに説明するFab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv断片、scFv断片および単鎖抗体がある。
本発明のこの局面の一部の態様において、古典的補体経路の活性化から生じ得る炎症を減少させるために、本明細書記載のMASP抗体はエフェクター機能が低下している。IgG分子が古典的補体経路を誘発する能力は、この分子のFc部分の中にあることが示されている(Duncan, A.R.. et al., Nature 332:738-740 (1988))。この分子のFc部分が酵素切断によって除去されているIgG分子には、このエフェクター機能がない(Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988を参照されたい)。従って、エフェクター機能を最小化する遺伝子操作Fc配列を有することによって、またはヒトIgG2もしくはIgG4アイソタイプにすることによって、この分子のFc部分を欠いた結果としてエフェクター機能が低下した抗体を作製することができる。
MASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体は、MASP-1、MASP-2、もしくはMASP-3ポリペプチド(例えば、完全長のMASP-1、MASP-2、もしくはMASP-3)を用いてまたは抗原性MASP-1、MASP-2、もしくはMASP-3エピトープ含有ペプチド(例えば、MASP-2ポリペプチドの一部)を用いて作製することができる。免疫原性ペプチドは5アミノ酸残基と小さくてもよい。例えば、本発明の方法において有用なMASP-2抗体を誘導するために、SEQ ID NO:5の全アミノ酸配列を含むMASP-2ポリペプチドが用いられてもよい。例えば表2に示される、タンパク質-タンパク質間相互作用に関与することが公知の特定のMASPドメイン、例えば、CUBIおよびCUBI-EGFドメイン、ならびにセリン-プロテアーゼ活性部位を含む領域が、当技術分野で周知の方法を用いて組換えポリペプチドとして発現され、抗原として用いられてもよい。さらに、MASP-1ポリペプチド(SEQ ID NO:10)またはMASP-2ポリペプチド(SEQ ID NO:5)またはMASP-3ポリペプチド(SEQ ID NO:8)の少なくとも6アミノ酸の部分を含むペプチドもまた、それぞれMASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体を誘導するのに有用である。抗体を産生させるのに用いられるMASPのペプチドおよびポリペプチドは、天然ポリペプチドまたは組換えペプチドもしくは合成ペプチドおよび触媒的に不活性な組換えポリペプチドとして単離されてもよい。MASP抗体の作製において有用な抗原はまた、融合ポリペプチド、例えば、MASPポリペプチドまたはその一部と免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質との融合も含む。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分がハプテン様であれば、このような部分は、免疫のために、都合よく、巨大分子担体(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風トキソイド)に接続または連結されてもよい。
MASP-1、MASP-2、またはMASP-3に対するポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法を用いて、動物をMASP-1、MASP-2、またはMASP-3ポリペプチドまたはその免疫原性部分で免疫することによって調製することができる。例えば、Green et al.,「Production of Polyclonal Antisera」, Immunochemical Protocols(Manson, ed.)を参照されたい。MASPポリペプチドの免疫原性は、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウムまたはフロイントアジュバント(完全もしくは不完全)、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、KLHおよびジニトロフェノールを含むアジュバントを用いて高まることができる。ポリクローナル抗体は、典型的には、動物、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギ、またはヒツジにおいて産生される。または、本発明において有用なMASP抗体はまた、ヒトに近い霊長類に由来してもよい。ヒヒにおいて診断および治療に有用な抗体を産生するための一般的な技法は、例えば、Goldenberg et al.,国際特許公報WO91/11465、およびLosman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)において見られ得る。次いで、免疫学的に活性な抗体を含有する血清が、当技術分野において周知の標準的な手順を用いて、このような免疫動物の血液から生成される。
一部の態様において、LEA-2阻害物質はMASP-2モノクローナル抗体であり、かつ/またはLEA-1阻害物質はMASP-3モノクローナル抗体またはMASP-1モノクローナル抗体である。上記のように、一部の態様において、MASP-1、MASP-2、またはMASP-3モノクローナル抗体は、単一のMASP-1、MASP-2、またはMASP-3エピトープに対して作られているので高度に特異的である。本明細書で使用する「モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均一な抗体集団から得られているという特徴を示し、特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈してはならない。モノクローナル抗体は、連続培養細胞株による抗体分子の作製を提供する任意の技法、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256:495 (1975)に記載のハイブリドーマ法を用いて得ることができる。または、モノクローナル抗体は、組換えDNA法(例えば、Cabillyに対する米国特許第4,816,567号を参照されたい)によって作られてもよい。モノクローナル抗体は、Clackson, T., et al., Nature 352:624-628 (1991)、およびMarks, J.D., et al., J. Mol Biol. 222:581-597 (1991)に記載の技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含む任意の免疫グロブリンクラスおよびその任意のサブクラスの抗体でよい。
本発明の方法において有用なモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるキメラ抗体、ならびにこのような抗体の断片が含まれる(Cabillyに対する米国特許第4,816,567号;およびMorrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, (1984))。
MASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体は組換え法を用いて作ることもできる。例えば、ヒト抗体断片(VH、VL、Fv、D因子、Fab、またはF(ab') 2)を作製するようにヒト免疫グロブリン発現ライブラリー(例えば、Stratagene, Corp., La Jolla, CAから入手可能)を用いてヒト抗体を作ることができる。次いで、キメラ抗体の作製法に類似した技法を用いて、これらの断片を用いてヒト抗体全体を構築する。
望ましい阻害活性を有するMASP-1、MASP-2、またはMASP-3抗体が同定されたら、これらの抗体を用いて、当技術分野において周知の技法を用いてMASP-1、MASP-2、またはMASP-3の一部に似ている抗イディオタイプ抗体を生成することができる。例えば、Greenspan, N.S., et al., FASEB J. 7:437 (1993)を参照されたい。例えば、MASP-2に結合し、補体活性化に必要とされるMASP-2タンパク質相互作用を完全に阻害する抗体を用いて、MASP-2タンパク質上のMBL結合部位に似ている、従って、MASP-2の結合リガンド、例えば、MBLに結合し、これを中和する抗イディオタイプを生成することができる。
本発明の方法において有用なMASP-2およびMASP-3阻害物質は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、抗体断片から形成された、Fab、Fab'、F(ab) 2、F(ab') 2、およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子、ならびに多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体および三重特異性抗体)を含む周知の断片も包含する。
または、重鎖Fv領域および軽鎖Fv領域が連結されている、MASP-1、MASP-2、またはMASP-3に特異的なペプチド単鎖結合分子を作製することができる。Fv断片は、単鎖抗原結合タンパク質(scFv)を形成するようにペプチドリンカーで連結されてもよい。これらの単鎖抗原結合タンパク質は、オリゴヌクレオチドで連結された、VHドメインをコードするDNAおよびVLドメインをコードするDNAを含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、その後に、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカーペプチドを有する1本のポリペプチド 鎖を合成する。scFvを作製するための方法は、例えば、Whitlow, et al.,「Methods:A Companion to Methods in Enzymology」2:97 (1991); Bird, et al., Science 242:423 (1988); Ladnerに対する米国特許第4,946,778号; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)に記載されている。
本発明の方法において有用なMASP-2およびMASP-3阻害物質は、多重特異性(すなわち、二重特異性および三重特異性)抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原への結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。上述され、かつ表2に示されているように、一態様において、方法は、MASP-2への結合特異性(例えば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つへの結合)およびMASP-3への結合特異性(例えば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合)を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-1への結合特異性(例えば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合)およびMASP-2への結合特異性(例えば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つへの結合)を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-1への結合特異性(例えば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合)およびMASP-3への結合特異性(例えば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合)を含む二重特異性抗体の使用を含む。別の態様において、方法は、MASP-1への結合特異性(例えば、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインへの結合)、MASP-2への結合特異性(例えば、MASP-2のCCP1-CCP2またはセリンプロテアーゼドメインの少なくとも1つへの結合)およびMASP-3への結合特異性(例えば、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインへの結合)を含む三重特異性抗体の使用を含む。
一部の態様において、MASP-3またはMASP-2阻害物質は、MASP-3もしくはMASP-2もしくはMASP-1阻害ペプチドまたはMASP-3もしくはMASP-2もしくはMASP-1の非ペプチド阻害因子である。非ペプチドMASP阻害物質は、例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、皮下もしくは他の非経口投与または経口投与によって対象に全身投与され得る。MASP阻害物質は、慢性状態の治療または抑制のために長期にわたって定期的に投与され得るし、急性外傷または傷害の前、期間中または後の期間中に単回または反復投与され得る。
投薬
別の局面において、本発明は、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を対象に投与することを含む、PNHのような溶血性疾患に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化の有害作用を阻害するための組成物を提供する。一部の態様において、方法は、MASP-2阻害物質を含む組成物を投与する工程をさらに含む。MASP-3およびMASP-2阻害物質は、MASP-3依存性補体活性化(LEA-1)とおよびまた任意でMASP-2依存性補体活性化(LEA-2)と関連する状態を治療または寛解するための治療的に有効な用量で、それを必要とする対象に投与することができる。治療的に有効な用量とは、状態の症候の寛解を生じさせるのに十分な、MASP-3阻害物質またはMASP-3阻害物質とMASP-2阻害物質との組み合わせの量を指す。
一般的に、本発明のMASP-3阻害物質組成物およびMASP-2阻害物質組成物、または、MASP-2阻害物質とMASP-3阻害物質の組み合わせを含む組成物は、他の任意の選択された治療剤と組み合わされてもよく、適宜、薬学的に許容される担体中に含まれる。担体は、無毒で、生体適合性があり、MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質(およびMASP-2阻害物質と組み合わされた他の任意の治療剤)の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように選択される。ペプチド用の例示的な薬学的に許容される担体は、Yamadaに対する米国特許第5,211,657号に記載されている。本明細書に記載される、本発明において有用なMASP抗体は、経口投与、非経口投与、または外科的投与を可能にする、固体、半固体、ゲル、液体、または気体の形をした調製物、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、デポジトリ(depository)、吸入剤、および注射剤に処方されてもよい。本発明はまた、医療装置などをコーティングすることによる組成物の局所投与も意図する。
本明細書に記載されるMASP抗体に関してより具体的には、例示的な製剤を、水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールなどの滅菌液体でもよい薬学的担体と共に、生理学的に許容される希釈剤に溶解した化合物の注射投与量の溶液または懸濁液として非経口投与することができる。さらに、MASP抗体を含む組成物中には、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。薬学的組成物のさらなる成分には、石油(例えば、動物由来、野菜由来、または合成由来の石油)、例えば、ダイズ油および鉱油が含まれる。一般的に、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが注射液に好ましい液体担体である。
MASP-3阻害物質またはMASP-2阻害物質を含む薬学的組成物は、局所投与方法または全身投与方法が、治療されている状態に最も適しているかどうかに応じて多くのやり方で投与することができる。さらに、本発明の組成物を移植可能な医療装置の表面に、または移植可能な医療装置の中にコーティングまたは組み込むことによって、本発明の組成物を送達することができる。
本明細書で使用する「全身送達」および「全身投与」という用語は、筋肉内(IM)投与経路、皮下投与経路、静脈内(IV)投与経路、動脈内投与経路、吸入投与経路、舌下投与経路、頬投与経路、局部投与経路、経皮投与経路、鼻投与経路、直腸投与経路、腟投与経路、および送達作用物質を1つまたは複数の目的の治療作用部位に効果的に分散させる他の投与経路を含む、経口経路および非経口経路を含むが、これに限定されないことが意図される。本組成物の好ましい全身送達経路には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、動脈内経路、および吸入経路が含まれる。本発明の特定の組成物において用いられる選択された作用物質の正確な全身投与経路は、一つには、ある特定の投与経路に関連した代謝変換経路に対する作用物質感受性を説明するように決定されることが理解されると考えられる。例えば、ペプチド物質は、最も適切には、経口以外の経路によって投与することができる。
本明細書で使用する「局所」という用語は、目的の限局作用の部位の中に、または目的の限局作用の部位の周囲に薬物を適用することを包含し、例えば、皮膚または他の患部組織への局部送達、眼送達、くも膜下腔内(IT)、脳室内(ICV)、関節内、洞内、頭蓋内、もしくは小胞内の投与、留置、または灌注を含んでもよい。局所投与は、低用量の投与が全身副作用を回避するために、ならびに局所送達部位に活性物質を送達および濃縮するタイミングをより正確に制御するために好ましい場合がある。局所投与は、代謝、血流などの患者間のばらつきに関係なく標的部位において既知濃度を供給する。改善された投与量制御は直接的な送達方法によっても提供される。
予防用途では、薬学的組成物は、PNHにかかりやすいか、またはそうでなければPNHを発症するリスクのある対象に、状態の症状を発症するリスクを排除するかまたは低下させるのに十分な量で投与される。治療用途では、薬学的組成物は、PNHに罹患していると疑われるか、またはPNHに既に罹患している対象に、状態の症状を軽減するかまたは少なくとも部分的に低下させるのに十分な治療的有効量で投与される。
以下の実施例は、本発明の実施について意図された最良の態様(best mode)の単なる例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本明細書中の全ての文献引用が明確に参照により組み入れられる。
本実施例は、MASP-2欠損マウスが、髄膜炎菌血清群Aまたは髄膜炎菌血清群Bのどちらかに感染した後に髄膜炎菌誘導死から保護されることを証明する。
MASP-2ノックアウトマウス(MASP-2 KOマウス)を、本明細書に参照として組み入れられるUS 7,919,094の実施例1に記載のように生成した。100μl体積で投与量2.6×107CFUの髄膜炎菌血清群A Z2491を腹腔内(i.p.)注射することによって、10週齢MASP-2 KOマウス(n=10)および野生型(WT)C57/BL6マウス(n=10)に接種した。感染用量を、最終濃度400mg/kgの鉄デキストランと一緒にマウスに投与した。72時間の期間にわたって感染後のマウスの生存をモニタリングした。
図8は、感染用量2.6×107cfuの髄膜炎菌血清群A Z2491を投与させた後のMASP-2 KOマウスおよびWTマウスの生存率(%)を図示したカプラン・マイヤープロットである。図8に示したように、感染後72時間の期間全体を通じて100%のMASP-2 KOマウスが生存した。対照的に、感染24時間後、WTマウスの80%しか生存しておらず(p=0.012)、感染72時間後、WTマウスの50%しか生存していなかった。これらの結果から、MASP-2欠損マウスは髄膜炎菌血清群A Z2491誘導死から保護されることが証明される。
本実施例は、髄膜炎菌感染後のMASP-2抗体の投与が髄膜炎菌感染マウスの生存率を増加させることを実証する。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,919,094号の実施例24に記載されているように、ラットMASP-2タンパク質を使用してFabファージディスプレイライブラリーをパンニングし、そこからFab2#11を機能的に活性な抗体として同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2aアイソタイプの完全長抗体をFab2#11から生成した。マウスIgG2aアイソタイプの完全長MASP-2抗体を薬力学的パラメータに関して特徴決定した(米国特許第7,919,094号の実施例38に記載されているとおり)。
上記のように生成したFab2#11由来のマウスIgG2a完全長MASP-2抗体アイソタイプを、以下のように、髄膜炎菌感染マウスモデルにおいて試験した。
9週齢C57/BL6チャールズリバーマウスを、高用量(4×106cfu)の髄膜炎菌血清型B株MC58の腹腔内注射から3時間後、阻害性マウスMASP-2抗体(1.0mg/kg)(n=12)または対照アイソタイプ抗体(n=10)で処理した。
図12は、感染量4×106cfuの髄膜炎菌血清群B株MC58の投与ののち、阻害性MASP-2抗体(1.0mg/kg)または対照アイソタイプ抗体のいずれかを感染後3時間で投与したマウスの%生存率をグラフで示すカプラン・マイヤー(Kaplan-Meyer)プロットである。図12に示すように、MASP-2抗体で処理されたマウスは、90%が感染後72時間を通して生存した。対照的に、アイソタイプ抗体で処理されたマウスは、50%しか感染後72時間を通して生存しなかった。「*」という記号は、2つの生存曲線の比較によって決定されたp=0.0301を示す。
本実施例は、ヒト血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3依存性であることを実証する。
機能的MBLの血清レベルが低下した患者は、再発性の細菌および真菌感染への罹患性の増大を示す(Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002))。髄膜炎菌がMBLによって認識されることは公知であり、MBL欠損血清が髄膜炎菌を溶解しないことが示されている。
1. 様々な補体欠損ヒト血清におけるおよびヒトMASP-2抗体で処理されたヒト血清における血清殺菌活性
この実験には、以下の補体欠損ヒト血清および対照ヒト血清を使用した。
図13は、表5に示すヒト血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。表6は、図13のスチューデントt検定の結果を提示する。
この実験には、以下の補体欠損ヒト血清および対照ヒト血清を使用した。
注記:試料DにおけるMASP-3-/-(MASP-1+)血清は、特徴が重なるCarnevale症候群、Mingarelli症候群、Malpuech症候群およびMichels症候群の統一用語である3MC症候群の対象から採取したものである。実施例4にさらに記載されるように、MASP-1/3遺伝子のエキソン12の突然変異は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にするが、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインを機能不全にしない。また、D因子は3MC血清中では完全であることが公知である。
図14は、表7に示すヒト血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。図14に示すように、WT(NHS)血清が、髄膜炎菌に関して最高レベルの殺菌活性を有する。対照的に、MBL-/-およびMASP-3-/-(MASP-1充分である)ヒト血清は任意の殺菌活性を有しない。これらの結果は、ヒト20%(v/v)血清中の髄膜炎菌の補体依存性死滅がMASP-3およびMBL依存性であることを示す。表8は図14のスチューデントt検定の結果を提示する。
この実験には、以下の補体欠損マウス血清および対照マウス血清を使用した。
図15は、表9に示すマウス血清試料中、様々な時点で回収された髄膜炎菌血清群B-MC58の生菌数のlog cfu/mLをグラフで示す。図15に示すように、MASP-2-/-マウス血清は、WTマウス血清よりも髄膜炎菌に関して高いレベルの殺菌活性を有する。対照的に、MASP-1/3-/-マウス血清は任意の殺菌活性を有しない。記号「**」はp=0.0058を示し、記号「***」はp=0.001を示す。表10は、図15のスチューデントt検定の結果を提示する。
本実施例は、実施例1〜3に記載されるような、MASP-2 KOマウスにおいて認められた髄膜炎菌感染に対するMASP-3依存性抵抗の機構を決定するために実施された一連の実験を記載する。
以下のように、MASP-2 KOマウスにおいて認められた髄膜炎菌感染に対するMASP-3依存性抵抗の機構(上記実施例1〜3に記載)を決定するために一連の実験を実施した。
方法:
MASP-1/3欠損マウスがレクチン経路機能活性(「LEA-2」とも呼ばれる)を欠損しているかどうかを判定するために、参照により本明細書に組み入れられるSchwaeble W. et al., PNAS vol 108(18):7523-7528 (2011)に記載されているとおりに、レクチン活性化経路特異的アッセイ条件下(1%血漿)、試験される様々な補体欠損マウス系統からの血漿中のC3コンバターゼ活性の動態を測定するためのアッセイ法を実施した。
レクチン経路特異的条件下のC3活性化の動態(1%血清を有するマンナンコーティングされたプレート上のC3b沈着によって測定)を図16に示す。MASP-2-/-血漿中にはC3切断は見られなかった。B因子-/-(B因子-/-)血漿は、おそらくは増幅ループの損失のせいで、WT血漿の半分の速度でC3を切断した。C4-/-(T1/2=33分)およびMASP-1/3-/-欠損血漿(T1/2=49分)においてC3からC3bへのレクチン経路依存性転換の有意な遅延が見られた。MASP-1/3-/-血漿におけるC3活性化のこの遅延は、MASP-3依存性ではなくMASP-1依存性であることが示されている(Takahashi M. et al., J Immunol 180:6132-6138 (2008)を参照されたい)。これらの結果は、MASP-1/3-欠損マウスがレクチン経路機能活性(「LEA-2」とも呼ばれる)を欠損していないことを実証する。
原理:
MASP-3のセリンプロテアーゼをコードするエキソン中のフレームシフト突然変異によって生じる3MC症候群を有するMASP-3欠損患者の血清を試験することにより、第二経路活性化に対する遺伝性MASP-3欠損の影響を判定した。3MC症候群とは、特徴が重なるCarnevale症候群、Mingarelli症候群、Malpuech症候群およびMichels症候群の統一用語である。この珍しい常染色体劣性障害は、特徴的な顔面異形症、口唇裂および/または口蓋裂、頭蓋骨癒合症、学習障害ならびに性器、四肢および膀胱直腸異常を含む一連の発達的特徴を示す。Rooryck et al., Nature Genetics 43:197-203 (2011)は、3MC症候群の11家族を研究し、突然変異した2つの遺伝子COLEC11およびMASP-1を特定した。MASP-1遺伝子の突然変異は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にするが、MASP-1のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にはしない。したがって、MASP-3のセリンプロテアーゼをコードするエキソン中に突然変異を有する3MC患者は、MASP-3を欠損しているが、MASP-1を充分に有する。
MASP-3欠損血清は、3MC患者、その3MC患者の母親および父親(両親とも、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルに関してヘテロ接合性)ならびにC4欠損患者(両方のヒトC4遺伝子を欠損している)およびMBL欠損対象から得た。Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11:291-295 (1981))に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、0.5〜25%の範囲の血清濃度で第二経路アッセイ法を実施し、時間の経過とともにC3b沈着を測定した。
図17は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上の第二経路駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損、C4欠損およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図17に示すように、MASP-3欠損患者の血清は、高い血清濃度(25%、12.5%、6.25%血清濃度)で残留第二経路(AP)活性を有するが、有意に高いAP50(すなわち、最大C3沈着の50%を達成するために必要な血清の9.8%)を有する。
方法:
MASP-2-/-、MASP-1/3-/-およびWTマウスから採取された0%〜20%の範囲のマウス血清濃度を使用して、マンナン、ザイモサンおよび肺炎連鎖球菌D39でコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着を測定した。「従来の」第二経路特異的条件下(すなわちCa++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(すなわちBBS/Mg++/Ca++)、C3b沈着アッセイ法を実施した。
図19Aは、従来の第二経路特異的条件下(すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++)、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスから採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図19Bは、従来のAP特異的条件下(すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスからの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図19Cは、従来のAP特異的条件下(すなわち、Ca++なしのBBS/EGTA/Mg++)またはレクチン経路および第二経路の両方が機能することを可能にする生理学的条件下(BBS/Mg++/Ca++)、肺炎連鎖球菌D39コーティングされたマイクロタイタープレート上のC3b沈着のレベルを、WT、MASP-2欠損およびMASP-1/3欠損マウスからの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。
この実施例に記載された結果は、MASP-2阻害因子(またはMASP-2 KO)が、MASP-3駆動型第二経路活性化を促進することにより、髄膜炎菌感染からの有意な保護を提供することを実証する。マウス血清溶菌アッセイ法およびヒト血清溶菌アッセイ法の結果はさらに、髄膜炎菌に対する血清殺菌活性をモニターすることにより、髄膜炎菌に対する殺菌活性がMBL欠損(マウスMBL AおよびMBL C二重欠損血清およびヒトMBL欠損血清)中には存在しないことを示す。
本実施例は、発作性夜間血色素尿症(PNH)のマウスモデルから得られた血液試料に由来する赤血球の溶解に対するMASP-2欠損および/またはMASP-3欠損の阻害作用を証明する。
発作性夜間血色素尿症(PNH)はマルキアファーヴァ・ミケーリ症候群とも呼ばれ、補体誘導性の血管内溶血性貧血を特徴とする、後天的な、潜在的に命にかかわる血液疾患である。PNHの顕著な特徴は、補体制御因子CD55およびCD59がPNH赤血球上に存在しないために補体第二経路が無秩序に活性化した結果である慢性的な補体媒介性血管内溶血と、その後に起こるヘモグロビン尿症および貧血である。Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11)(2010)、Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535(2011)。PNHにおける貧血は血流中の赤血球の破壊が原因である。PNHの症状には、尿中のヘモグロビンの出現による赤色尿、背部痛、疲労、息切れ、および血栓症が含まれる。PNHは自然発症することがあり、これは「一次PNH」と呼ばれるか、または再生不良性貧血などの他の骨髄障害の状況では「二次PNH」と呼ばれる。PNHの治療には、貧血の場合は輸血、血栓症の場合は血液凝固阻止、および補体系を阻害することによって免疫破壊から血球を保護するモノクローナル抗体エクリズマブ(Soliris(登録商標))の使用(Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med. 350(6) 552-9(2004))が含まれる。エクリズマブ(Soliris(登録商標))は、補体成分C5を標的とし、C5コンバターゼによるC5切断を遮断し、それによって、C5aの産生およびMACの集合を阻止するヒト化モノクローナル抗体である。エクリズマブによるPNH患者の治療は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって測定されるように血管内溶血を減少させ、そのため、患者の約半分におけるヘモグロビン安定化および輸血非依存性につながった(Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol11(6)(2011))。エクリズマブ療法を受けているほぼ全員の患者においてLDHレベルが正常またはほぼ正常になったが(血管内溶血の管理のため)、患者の約1/3しかヘモグロビン値 約11gr/dLに達せず、エクリズマブを服用した残りの患者は中程度から重度の(すなわち、輸血依存性)貧血をほぼ同じ割合で示し続ける(Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100(2009))。Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535(2011)に記載のように、エクリズマブを服用しているPNH患者は、PNH赤血球のかなりの部分に結合しているC3断片を含んだ(が、未治療患者は含んでいなかった)ことが証明された。このことから、膜に結合しているC3はPNH赤血球に対してオプソニンとして働き、その結果、特異的C3受容体を介して細網内皮細胞内に閉じ込められ、その後に、血管外溶血が起こるという結論が導かれた。従って、C3断片を介した血管外溶血を発症している患者は赤血球輸血を必要とし続けるので、これらの患者には、エクリズマブの使用の他に治療方針が必要とされる。
PNH動物モデル:
CrryおよびC3を欠損した(Crry/C3-/-)遺伝子標的化マウスおよびCD55/CD59欠損マウスから血液試料を採取した。これらのマウスは、赤血球上のそれぞれの表面補体制御因子を欠き、したがって、これらの赤血球はPNHヒト血球と同様に自発的に補体自己溶解を受けやすい。
1日目、マウスRBC(±マンナンコーティング)の調製
材料は以下を含むものであった:新鮮なマウス血液、BBS/Mg++/Ca++(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++)、塩化クロム、CrCl3・6H2O(BBS/Mg++/Ca++中0.5mg/mL)、およびマンナン、BBS/Mg++/Ca++中100μg/mL。
材料は、BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++(上記)、試験血清、96ウェル丸底および平底プレートならびに410〜414nmで96ウェルプレートを読み取る分光光度計を含むものであった。
上記プロトコールに詳述したように、CD55/CD59二重欠損マウスおよびCrry/C3二重欠損マウスから新鮮な血液を採取し、赤血球を調製した。赤血球を分割し、赤血球の半分をマンナンでコーティングし、他方の半分を未処理のままにし、最終濃度を108/mLに調節し、そのうち100μlを、上記のように実施した溶血アッセイ法に使用した。
最初の実験において、コーティングなしのWTマウス赤血球が任意のマウス血清中で溶解しないことがわかった。さらに、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、WTマウス血清中ではゆっくりと溶解するが(37度で3時間超)、MBLヌル血清中では溶解しないことがわかった(データ示さず)。
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球は、MBLを含む高希釈ヒト血清中では非常に良好に溶解するが、MBLを含まない高希釈ヒト血清中ではそうはならない。試験した各血清濃度での効率的な溶解は、第二経路がこの溶解に関与せず、または必要とされないことを暗示する。MBL欠損マウス血清およびヒト血清がマンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球を溶解できないことは、古典経路もまた、観察された溶解とは関係がないことを示す。レクチン経路認識分子(すなわちMBL)が必要とされるため、この溶解はレクチン経路によって媒介される。
Crry/C3およびCD55/CD59二重欠損マウスから新鮮な血を採取し、マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球を、上記のような溶血アッセイ法において、以下のヒト血清:MASP-3-/-;MBLヌル;WT;ヒトMASP-2抗体で前処理されたNHS;および対照としての熱不活化NHSの存在において分析した。
マンナンコーティングされたCrry-/-マウス赤血球とともにNHSを、1/640まで(すなわち、1/40、1/80、1/160、1/320および1/640)希釈された希釈物、ヒトMBL-/-血清、ヒトMASP-3欠損血清(3MC患者からのもの)およびMASP-2mAbで前処理されたNHSおよび対照として熱不活化NHSの中でインキュベートした。
Crry/C3およびCD55/CD59二重欠損マウスからの新鮮な血液から採取されたコーティングなしのCrry-/-マウス赤血球を、上記のような溶血アッセイ法において、以下の血清:MASP-3-/-;MBL-/-;WT血清;ヒトMASP-2抗体で前処理されたNHSおよび対照として熱不活化NHSの存在において分析した。
図23は、3MC(MASP-3-/-)患者、熱不活化(HI)NHS、MBL-/-、MASP-2抗体で前処理されたNHSおよびNHS対照からのヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、コーティングなしのマウス赤血球の溶血(上清への溶解WTマウス赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図23に示し、表12にまとめているように、MASP-3の阻害が非感作WTマウス赤血球の補体媒介性溶解を阻害することが実証される。
本実施例は、WTまたはMASP-1/3-/-マウス血清の存在における溶解に関してマンナンコーティングされたウサギ赤血球を試験する溶血アッセイ法を記載する。
1. マウスMASP-1-3欠損血清およびWT対照血清におけるウサギRBC(マンナンコーティングされた)の溶血アッセイ法
1日目、ウサギRBCの調製
材料は以下を含むものであった:新鮮なウサギ血液、BBS/Mg++/Ca++(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++)、0.1%ゼラチンを含むBBS/Mg++/Ca++、緩衝液に含まれた塩化クロム、すなわちCrCl3.6H2O(BBS/Mg++/Ca++中0.5mg/mL)およびマンナン、BBS/Mg++/Ca++中100μg/mL。
1. ウサギ全血(2mL)を、2つの1.5mLエッペンドルフ管に分割し、4℃の冷却エッペンドルフ遠心分離機中、80000rpm(約5.9rcf)で3分間遠心処理した。氷冷BBS/Mg++/Ca++中に再懸濁させたのち、RBCペレットを3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。このアリコート2mLを、コーティングなし対照として使用するために、15mLファルコンチューブに加えた。残り2mLのRBCアリコートをCrC13緩衝液2mL中に希釈し、マンナン溶液2mLを添加し、懸濁液を穏やかに混合しながら室温で5分間インキュベートした。BBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++7.5mLを混合物に加えることによって反応を停止させた。上記のように赤血球をペレット化し、RBCをBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++で2回洗浄した。RBC懸濁液をBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++中、4℃で貯蔵した。
2. 懸濁させたRBC100μlを水1.4mLで希釈し、8000rpm(約5.9rcf)で3分間スピンダウンし、上清のODを541nmで0.7に調節した(541nmで0.7のODは赤血球約109個/mLに相当)。
3. 再懸濁させたRBCをBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++で108個/mLの濃度まで希釈した。
4. 試験血清の希釈物を氷冷BBS/ゼラチン/Mg++/Ca++中に調製し、各血清希釈物100μlを丸底プレートの対応するウェルにピペットで移した。適切に希釈したRBC100μl(108/mL)を各ウェルに加えた。完全な溶解のための対照として、精製水(100μL)を希釈RBC(100μL)と混合して100%溶解を生じさせ、一方、血清なしのBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++(100μL)を陰性対照として使用した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。
5. 丸底プレートを3250rpmで5分間遠心処理した。各ウェルからの上清(100μL)を平底プレートの対応するウェルに移し、ELISAリーダー中、415〜490nmでODを読み取った。結果を、490nmでのODに対する415nmでのODの比として報告する。
図25は、MASP-1/3-/-およびWT対照からの血清中の一定範囲の血清濃度にわたり、マウス血清によるマンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血(上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図25に示すように、MASP-3の阻害が、マンナンコーティングされたWTウサギ赤血球の補体媒介性溶解を阻止することが実証される。これらの結果はさらに、実施例5に記載されたようなPNHの1つまたは複数の局面の治療のためのMASP-3阻害因子の使用を裏付ける。
本実施例は、D因子欠損血清中、Ca++の存在において第二経路が活性化されることを実証する。
方法:
第二経路特異的条件下(BBS/EGTA/Mg++、Ca++なし)、以下のマウス血清:D因子-/-;MASP- -/-;およびWTの希釈度を高めながら使用して、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上でC3b沈着アッセイ法を実施した。
図26は、第二経路特異的条件下で実施されたC3沈着アッセイ法におけるC3b沈着(OD 405nm)のレベルを、D因子-/-、MASP-2-/-;およびWTマウス血清からの血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図26に示すように、これらの条件下、D因子-/-マウス血清はC3をまったく活性化せず、第二経路は作用していない。MASP-2-/-血清は、WT血清と同様な速度で第二経路活性化を示す。これらの結果は、Ca++の非存在においては、C3b沈着のためにD因子が必要とされることを確認させる。これは、MASP-1、MASP-3活性化酵素およびMASP-3とそれぞれの糖質認識成分との相互作用がCa++依存性であるため、これらの条件下ではMASP-3をその酵素的に活性な形態へと転換することができないという証拠と合致している。
方法:
生理学的条件下(BBS/Ca++/Mg++)(LPおよびAPの両方が機能することを可能にする)、以下のマウス血清:D因子-/-;MASP-2-/-;およびWTの希釈度を高めながら使用して、C3b沈着アッセイ法を実施した。
図27は、生理学的条件下(Ca++の存在下)で実施されたC3b沈着アッセイ法におけるC3b沈着(OD 405nm)のレベルを、D因子-/-;MASP-2-/-;およびWTマウスからの血清の試料を使用する血清濃度の関数としてグラフで示す。図27に示すように、D因子-/-マウス血清は、指示された血清希釈度を通して、WT血清に比べて差なく、レクチン経路および第二経路の両方を介してC3を活性化する。MASP- -/-血清は、第二経路(すなわちMASP-3駆動型第二経路活性化)のみによって、より低い血清希釈度でC3のターンオーバーを示す。これらの結果は、Ca++の存在においては、MASP-3が第二経路活性化を駆動することができるという条件で、D因子が必要とされないことを示す。
方法:
以下のとおりに、生理学的条件下(BBS/Ca++/Mg++)、マンナンコーティングされたマイクロタイタープレート上でC3b沈着アッセイ法を実施した。
1. マイクロタイターELISAプレートを、コーティング緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCo3、0.02%アジ化ナトリウム、pH9.6)中のマンナン(1μg/mL)で4℃において一晩コーティングした。
2. 翌日、BBS(4mMバルビタール、145mM NaCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、pH 7.4)中0.1% HSAを250μl/ウェルで用いて残留タンパク質結合部位を室温で2時間ブロッキングした。
3. プレートを洗浄緩衝液(0.05% Tween 20および5mM CaCl2を含むTBS)で3回洗浄した。
4. BBS中1:10希釈血清試料を指定の時点でウェルに加えた。緩衝液のみを入れたウェルを陰性対照として使用した。プレートを37℃で40分間インキュベートした。
5. 次いで、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した。
6. 次いで、洗浄緩衝液中で1:5000に希釈したウサギ抗ヒトC3c(Dako)100μlをウェルに加え、プレートを37℃で90分間インキュベートした。
7. 洗浄緩衝液で3時間洗浄したのち、洗浄緩衝液中で1:5000に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲート化抗ウサギ100μlをウェルに加え、その後、室温で90分間インキュベートした。
8. 洗浄後、基質溶液100μlを加えることによってアルカリホスファターゼを検出した。
9. 15分間インキュベートしたのち、光学密度をOD 405nmで測定した。
図28は、MASP-2 mAbの存在または非存在におけるD因子-/-またはB因子-/-マウスから採取されたマウス血清中、生理学的条件下(Ca++の存在下)で実施されたC3b沈着アッセイ法におけるC3b沈着(OD 405nm)のレベルを血清インキュベーション時間(分)の関数としてグラフで示す。図28に示すように、WTおよびD因子-/-血清におけるC3b沈着の量に差はなく、D因子の非存在でさえ、MASP-3が第二経路活性化を開始させることができるという結論の強力な支持を提供する。観察されたシグナルは、レクチン経路活性化および第二経路活性化の両方によるものと考えられる。図28にさらに示すように、D因子-/-+MASP-2 mAbはMASP-3-媒介第二経路活性化のみを示す。B因子-/-+MASP-2 mAbはバックグラウンドのみであった(データ示さず)。熱不活化血清をバックグラウンド対照値として使用すると、それは、MASP-2とのD因子-/-およびB因子-/-と同一であった(データ示さず)。
本実施例は、ヒトMASP-1、MASP-2またはMASP-3ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を製造し、二重、二重特異性、または汎特異性MASP抗体を生成する例示的方法を記載する。
8〜12週齢のオスA/Jマウス(Harlan, Houston, Tex.)に、pH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)200μl中、完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)中のヒト完全長ポリペプチド:rMASP-1(SEQ ID NO:10)、rMASP-2(SEQ ID NO:5)もしくはrMASP-3(SEQ ID NO:8)または例えば表2に記載したようなそれらの抗原断片100μgを皮下注射する。2週間後、不完全フロイントアジュバント中の同じヒトポリペプチド50μgをマウスに皮下注射する。6週目、PBS中の同じヒトポリペプチド50μgをマウスに注射し、4日後に融合させる。
50ng/mLの精製hMASP-2 50μlを室温で一晩加えることによってImmulon 2(Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)マイクロテストプレートのウェルをコーティングする。コーティングに使用されるMASP-2の低い濃度が高親和性抗体の選択を可能にする。プレートを軽くたたくことによってコーティング溶液を除去したのち、非特異的部位をブロッキングするために、PBS中BLOTTO(無脂肪ドライミルク)200μlを各ウェルに1時間加える。次いで、1時間後、ウェルを緩衝液PBST(0.05% Tween20を含有するPBS)で洗浄する。各融合ウェルからの培養上清(50uL)をBLOTTO 50μlと混合したのち、マイクロテストプレートの個々のMASP-2コーティングされたウェルに加える。1時間のインキュベーションののち、ウェルをPBSTで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG(Fc特異的)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)を加えることによってMASP-2に結合する抗体を検出する。HRPコンジュゲート化抗マウスIgGは、適切なSN比を提供するようにBLOTTO中で適切に希釈し、各試料含有ウェルに加える。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質溶液を用いて結合HRPコンジュゲート化抗体を検出する。発色のために、0.1% 3,3,5,5テトラメチルベンジジン(Sigma, St. Louis, Mo.)および0.0003%過酸化水素(Sigma)を含有するペルオキシダーゼ基質溶液を30分間ウェルに加える。1ウェルあたり50μlの2M H2SO4を加えることによって反応を停止させ、反応混合物の450nmでの光学密度をBioTek ELISA Reader(BioTek Instruments, Winooski, Vt.)によって測定する。
前記のMASP-2 ELISAアッセイ法の試験において陽性と判定された培養上清を、MASP-2に対してMASP-2阻害物質が有する結合親和性を決定するために結合アッセイ法において試験することができる。阻害物質が補体系の他の抗原に結合するかどうか判定するために類似アッセイ法も使用することができる。
MASP-2/3二重阻害抗体:図4、6、および7Cに示すように、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:8のベータ鎖によってコードされた、セリンプロテアーゼドメイン中のMASP-2とMASP-3との間で保存された領域がある。したがって、二重MASP-2/3抗体は、MASP-2(またはMASP-3)のセリンプロテアーゼドメイン、例えばSEQ ID NO:5(またはSEQ ID NO:8)のベータ鎖を含む、またはそれからなる抗原を使用して、上記のようにモノクローナル抗体を生成することによって生成することもできるし、あるいはまた、これらの抗原を使用して、これらの抗原に特異的に結合するクローンに関してファージライブラリーをスクリーニングし、その後、MASP-3(またはMASP-1)への二重結合に関してスクリーニングし得る。次いで、二重MASP-2/3抗体を、例えば表2に記載されるように、機能アッセイ法において阻害活性に関してスクリーニングする。
アルファ鎖:MASP-2とMASP-1/3との間の同一性の数多くの部分は、MASP-1/3およびMASP-2に結合するモノクローナル抗体を生成することが可能であり得ることを示唆する。特に、同一性の大部分は、図5に示すようにCUB1-EGF-CUB2ドメイン内にある。図5に示す様々なドメインは、Yongqing, et al., Biochemica et Biophysica Acta 1824:253-262 (2012); Teillet et al., J. Biol. Chem. 283:25715-25724 (2008);およびMarchler-Bauer et al., Nucleic Acids Res. 39:D225-229 (2011)に従って同定されたものである。
汎特異性MASP阻害抗体(すなわち、MASP-1、2および3活性を阻害する抗体)は以下のとおりに生成される。
1. MASP-1/3およびMASP-2アルファ鎖CUB1-EGF-CUB2ドメインに対してライブラリーをスクリーニングし、MASP-1/3およびMASP-2の両方と交差反応するクローンを選択する。
2. 例えば表2に記載されるような機能活性を阻害する能力に関してクローンをスクリーニングする。
3. DTLacO親和性/機能的成熟技術(Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))を使用して、3つすべてのタンパク質への結合および阻害機能を最適化する。
4. 表2に記載されるように、汎MASP阻害因子を使用してLEA-1-およびLEA-2媒介性補体活性化を阻害することができる。
二重特異性MASP-2/3阻害抗体は以下のとおりに生成される。
1. 実施例11〜14に記載されるように、CCP1ドメインに結合し、かつMASP-2依存性補体活性化を阻害する例示的なMASP-2特異性阻害抗体は同定されている。
2. MASP-3特異性阻害抗体は、実施例15に記載されるようにMASP-3ポリペプチドに対してライブラリーをスクリーニングし、かつMASP-3抗体を同定したのち、例えば表2に記載されるように機能アッセイ法においてLEA-1阻害活性に関して抗体をアッセイすることによって生成される。例示的なMASP-3抗体は実施例15に記載される。
3. MASP-2およびMASP-3に特異的な抗原結合領域をフレームワークにクローニングして二重特異性抗体を生成する。免疫グロブリンG様フォーマットならびに様々な融合タンパク質および単鎖可変断片構成を含む数多くの二重特異性抗体フォーマットが記載されている(Holmes, Nature Reviews, Drug Discovery 10:798-800 (2011), Muller and Kontermann, Biodrugs 24:89-98 (2010))。一例において、二重特異性抗体は、2つの別々の抗原に対する抗体を発現する2つのハイブリドーマを融合して、様々な重鎖および軽鎖対合を生じさせることによって生成することができ、該対合の一定の割合が、一方の抗原に特異的な重鎖および軽鎖と対合した他方の抗原に特異的な重鎖および軽鎖を含む(Milstein and Cuello, Nature 305:537-539 (1983))。2つの重鎖が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対を同時発現させることにより、同様な二重特異性抗体を組換え的に生成し得る。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)(例えば、実施例11〜14に記載されるようなMASP-2抗体、実施例15に記載されるようなMASP-3抗体)を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。免疫グロブリン重鎖融合物および所望の場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物中に同時トランスフェクトする。
一態様において、二重特異性抗体が提供され、該二重特異性抗体が、ヒトMASP-2およびヒトMASP-3に結合し、かつ、
(I)以下:(a)(i) SEQ ID NO:21の31〜35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii) SEQ ID NO:21の50〜65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:21の95〜102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む、重鎖可変領域、の少なくとも1つまたは複数;および/または以下:(b)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの24〜34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの50〜56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの89〜97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、軽鎖可変領域、の少なくとも1つまたは複数を含む、MASP-2特異的結合領域;ならびに
(II)MASP-3特異的結合領域、任意で、以下の少なくとも1つを含むMASP-3特異的結合領域:(a)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:26の31〜35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:26の50〜65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:26の95〜102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む、重鎖可変領域;および
(b)(i)SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29いずれかの24〜34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29いずれかの50〜56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29いずれかの89〜97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、軽鎖可変領域
を含む。
一態様において、二重特異性抗体が提供され、該二重特異性抗体が、ヒトMASP-1およびヒトMASP-2に結合し、かつ、
(I)以下:(a)(i)SEQ ID NO:21の31〜35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:21の50〜65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:21の95〜102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む、重鎖可変領域、の少なくとも1つまたは複数;および/または以下:(b)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの24〜34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの50〜56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの89〜97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、軽鎖可変領域、の少なくとも1つまたは複数を含む、MASP-2特異的結合領域;ならびに
(II)MASP-1特異的結合領域
を含む。
本実施例は、L-フィコリン/P35、H-フィコリン、M-フィコリン、またはマンナンを介したMASP-2依存性補体活性化を遮断することができるMASP-2阻害物質を同定するための機能スクリーニングとして用いられるインビトロC4切断アッセイ法について述べる。
以下のアッセイ法を用いて、免疫複合体によって古典経路が開始する条件下でMASP阻害物質の効果を分析することによって、MASP阻害物質が古典経路を遮断するかどうか試験する。
免疫複合体によって古典経路が開始する補体活性化の状態に対するMASP阻害物質の効果を試験するために、90%NHSを含有する3つ組の試料50μlを、10μg/mL免疫複合体またはPBSの存在下で37℃においてインキュベートする。37℃でのインキュベーション中に、200nM抗プロペルジンモノクローナル抗体を含有する3つ組の対応する試料(+/-免疫複合体)も含める。37℃で2時間のインキュベーション後に、さらなる補体活性化を止めるために、13mM EDTAを全ての試料に添加し、すぐに、試料を5℃まで冷却する。次いで、試料を-70℃で保管した後に、ELISAキット(Quidelカタログ番号A015およびA009)を用いて製造業者の説明書に従って補体活性化産物(C3aおよびsC5b-9)をアッセイする。
本実施例は、MASP-2活性を遮断する高親和性MASP-2 Fab2抗体断片の同定について述べる。
1.レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定するためのアッセイ法:
背景:レクチン経路C3コンバターゼは、C3を2つの強力な炎症誘発断片であるアナフィラトキシンC3aおよびオプソニンC3bにタンパク分解によって切断する酵素複合体(C4bC2a)である。C3コンバターゼの形成は、炎症を媒介する点でレクチン経路の重要な段階であると考えられる。MASP-2はレクチン経路C3コンバターゼ(C4bC2a)の構造成分ではない。従って、MASP-2抗体(またはFab2)は、既にあるC3コンバターゼの活性を直接阻害しない。しかしながら、レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するために、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要とされる。従って、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 Fab2(すなわち、遮断MASP-2 Fab2)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、その構造の一部として、珍しく、かつ高反応性のチオエステル基を含有する。このアッセイ法ではC3がC3コンバターゼによって切断されると、C3b上のチオエステル基は、エステル結合またはアミド結合を介してプラスチックウェルの底に固定化された巨大分子上のヒドロキシル基またはアミノ基と共有結合を形成することができ、従って、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出が容易になる。
96ウェルCostar Medium Bindingプレートを、1μg/50μl/ウェルで、50mM炭酸緩衝液、pH9.5で希釈したマンナンと5℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、200μl PBSで各ウェルを3回洗浄した。次いで、ウェルを、PBSに溶解した100μl/ウェルの1%ウシ血清アルブミンでブロッキングし、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。MASP-2 Fab2試料を、5℃で、Ca++およびMg++を含有するGVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)で選択された濃度まで希釈した。0.5%ラット血清を5℃で前記試料に添加し、100μlを各ウェルに移した。プレートに蓋をし、補体活性化を可能にするために37℃水浴中で30分間インキュベートした。37℃水浴から、氷と水の混合物を含む容器にプレートを移すことによって、反応を止めた。各ウェルを、PBS-Tween20(0.05%Tween20を含むPBS)で200μlで5回洗浄し、次いで、200μlのPBSで2回洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した100μl/ウェルの一次抗体(ウサギ抗ヒトC3c、DAKO A0062)1:10,000希釈液を添加し、穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルを5回200μlのPBSで洗浄した。2.0mg/mLウシ血清アルブミンを含有するPBSに溶解した、100μl/ウェルの二次抗体(ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG, American Qualex A102PU)1:10,000希釈液を添加し、シェーカーに載せて穏やかに混合しながら室温で1時間インキュベートした。各ウェルをPBSで200μlで5回洗浄した。100μl/ウェルのペルオキシダーゼ基質TMB(Kirkegaard & Perry Laboratories)を添加し、室温で10分間インキュベートした。100Tl/ウェルの1.0M H3PO4を添加することによってペルオキシダーゼ反応を止め、OD450を測定した。
背景:MASP-2のセリンプロテアーゼ活性は高度に特異的であり、MASP-2のタンパク質基質はC2およびC4の2種類しか同定されていない。C4の切断によってC4aおよびC4bが生成される。MASP-2 Fab2は、C4切断に直接関与するMASP-2上の構造エピトープ(例えば、C4のMASP-2結合部位;MASP-2セリンプロテアーゼ触媒部位)に結合し、それによって、MASP-2のC4切断機能活性を阻害する可能性がある。
背景:MASP-2は、通常、特異的レクチン分子(マンノース結合タンパク質(MBL)およびフィコリン)も含むMASP-2二量体複合体として血漿中に存在する。従って、MASP-2 Fab2と生理学的に関連する形態のMASP-2との結合の研究に興味があるのであれば、精製組換えMASP-2ではなく、Fab2と血漿中の「天然」MASP-2との相互作用が用いられる結合アッセイ法を開発することが重要である。この結合アッセイ法では、最初に、10%ラット血清に由来する「天然」MASP-2-MBL複合体をマンナンコーティングウェルに固定化した。次いで、標準的なELISA法を用いて、固定化「天然」MASP-2に対する様々なMASP-2 Fab2の結合親和性を研究した。
ELISAスクリーニングのために、高親和性でラットMASP-2タンパク質と反応した約250個の異なるFab2を選んだ。異なる抗体のユニークさを決定するために、これらの高親和性Fab2を配列決定した。さらなる分析のために、50個のユニークなMASP-2抗体を精製した。それぞれの精製Fab2抗体250μgを、MASP-2結合親和性の特徴決定および補体経路の機能試験に使用した。この分析の結果を以下の表13に示した。
本実施例は、実施例11に記載のように生成された遮断抗ラットMASP-2 Fab2抗体のいくつかのエピトープマッピングについて述べる。
全てN末端6XHisタグを有する以下のタンパク質を、pED4ベクターを用いてCHO細胞において発現させた:
ラットMASP-2A、活性中心にあるセリンをアラニンに変えることによって不活性化された完全長MASP-2タンパク質(S613A);
ラットMASP-2K、自己活性化を減少させるように変えられた完全長MASP-2タンパク質(R424K);
CUBI-II、CUBIドメイン、EGF様ドメイン、およびCUBIIドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片;ならびに
CUBI/EGF様、CUBIドメインおよびEGF様ドメインしか含まないラットMASP-2 N末端断片。
前述した5個の組換えMASP-2ポリペプチドの段階希釈液(ならびにCCPII-セリンプロテアーゼポリペプチドの陰性対照としてチオレドキシンポリペプチド)をニトロセルロース膜上にスポットした。スポットされたタンパク質の量は5倍段階で100ng〜6.4pgであった。後の実験において、スポットされたタンパク質の量は、再度、5倍段階で50ng〜16pgであった。膜を、TBS(ブロッキング緩衝液)に溶解した5%スキムミルク粉末でブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液(5.0mM Ca++を含有する)に溶解した1.0μg/mLの抗MASP-2 Fab2とインキュベートした。結合しているFab2を、HRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec;1/10,000に希釈した)およびECL検出キット(Amersham)を用いて検出した。1枚の膜を、陽性対照としてポリクローナルウサギ抗ヒトMASP-2 Ab(Stover et al., J Immunol 163:6848-59(1999)に記載)とインキュベートした。この場合、結合しているAbを、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(Dako; 1/2,000に希釈した)を用いて検出した。
ELISAプレートを、炭酸緩衝液(pH9.0)に溶解した1.0μg/ウェルの組換えMASP-2AまたはCUBI-IIポリペプチドで4℃において一晩コーティングした。ウェルを、TBSに溶解した1%BSAでブロッキングし、次いで、5.0mM Ca++を含有するTBSに溶解したMASP-2 Fab2の段階希釈液を添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。TBS/tween/Ca++で3回洗浄した後、TBS/Ca++で1/10,000に希釈したHRP結合抗ヒトFab(AbD/Serotec)を添加し、プレートを室温でさらに1時間インキュベートした。結合している抗体を、TMBペルオキシダーゼ基質キット(Biorad)を用いて検出した。
Fab2と様々なMASP-2ポリペプチドとの反応性を証明したドットブロット分析の結果を以下の表14に示した。表14に示した数値は、ほぼ最大半量のシグナル強度を得るのに必要とされる、スポットされたタンパク質の量を示す。示したように、(チオレドキシン融合パートナー単独を除く)全てのポリペプチドが、陽性対照Ab(ポリクローナル抗ヒトMASP-2血清、ウサギにおいて産生された)によって認識された。
本実施例は、実施例11に記載のように同定された代表的な高親和性抗MASP-2 Fab2抗体の薬力学的分析について述べる。
実施例11に記載のように、ラットレクチン経路を遮断する高親和性抗体を同定するために、ラットMASP-2タンパク質を用いてファージディスプレイライブラリーをパンニングした。このライブラリーは大きな免疫学的多様性を提供するように設計され、完全ヒトイムノグロビン(immunoglobin)遺伝子配列を用いて構築された。実施例11に示したように、ラットMASP-2タンパク質と高親和性で結合する約250個の個々のファージクローンをELISAスクリーニングによって同定した。これらのクローンの配列決定によって、50個のユニークなMASP-2抗体コードファージが同定された。これらのクローンからFab2タンパク質を発現させ、精製し、MASP-2結合親和性およびレクチン補体経路機能阻害について分析した。
実施例11に記載のように、ラットMASP-2タンパク質を用いてFabファージディスプレイライブラリーをパンニングした。これから、Fab2#11を同定した。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ変種はFab2#11から得られた。ラットIgG2cおよびマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプを、以下の通り薬力学パラメータについてインビボで特徴決定した。
インビボでの血漿レクチン経路活性に対するMASP-2抗体投与の効果を調べるために、マウスにおいて薬力学的研究を行った。この研究では、0.3mg/kgまたは1.0mg/kgのマウスMASP-2 MoAb(Fab2#11に由来するマウスIgG2a完全長抗体アイソタイプ)の皮下(sc)投与後および腹腔内(ip)投与後の様々な時点で、C4沈着をレクチン経路アッセイ法においてエクスビボで測定した。
本実施例は、ファージディスプレイを使用して、MASP-2に結合し、かつレクチン媒介補体活性化(LEA-2)を阻害しながらも免疫系の古典(C1q依存性)経路成分を完全なままにしておく完全ヒトscFv抗体の同定を記載する。
ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって完全ヒト高親和性MASP-2抗体を同定した。scFvフォーマットおよび完全長IgGフォーマットの両方において抗体の可変軽鎖および重鎖断片を単離した。ヒトMASP-2抗体は、レクチン経路媒介第二補体経路活性化に関連する細胞傷害を阻害しながらも免疫系の古典(C1q依存性)経路成分を完全なままにしておく場合に有用である。一部の態様において、対象MASP-2阻害抗体は、以下の特徴を有する:(a)ヒトMASP-2に関する高い親和性(例えば10nMまたはそれ未満のKD)および(b)90%ヒト血清中のMASP-2依存性補体活性化を30nMまたはそれ未満のIC50で阻害すること。
完全長の触媒的に不活性なMASP-2の発現:
リーダー配列(SEQ ID NO:5)を有するヒトMASP-2ポリペプチドをコードするヒトMASP-2の完全長cDNA配列(SEQ ID NO:4)を、CMVエンハンサー/プロモーター領域の制御下で真核性発現を駆動する哺乳動物発現ベクターpCI-Neo(Promega)中にサブクローニングした(Kaufman R. J. et al., Nucleic Acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991)に記載)。
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域配列のファージディスプレイライブラリーを抗原パンニングに供したのち、自動化抗体スクリーニングおよび選択によってヒトMASP-2タンパク質に対する高親和性scFv抗体を同定した。HIS標識またはビオチン標識MASP-2Aに対して3回のscFvファージライブラリーパンニングを実施した。3回目のパンニングは、まずMBLで溶出させ、次いでTEA(アルカリ性)で溶出させた。標的MASP-2Aに対してscFv断片を表示するファージの特異的濃縮をモニターするために、固定化MASP-2Aに対するポリクローナルファージELISAを実施した。3回目のパンニングからのscFv遺伝子をpHOG発現ベクターにクローニングし、小規模フィルタースクリーニングに通して、MASP-2Aに対する特異性クローンを捜した。
レクチン経路C3コンバターゼ形成の阻害を測定する機能アッセイ法を使用して、MASP-2 scFV候補クローンの「ブロッキング活性」を評価した。レクチン経路C3コンバターゼを構成する2つのタンパク質成分(C4b、C2a)を生成するためには、MASP-2セリンプロテアーゼ活性が必要である。したがって、MASP-2機能活性を阻害するMASP-2 scFv(すなわち、遮断性MASP-2 scFv)はレクチン経路C3コンバターゼの新規形成を阻害する。C3は、異例な高反応性チオエステル基をその構造の一部として含む。このアッセイ法においてC3コンバターゼによってC3が切断されると、C3b上のチオエステル基が、プラスチックウェルの底に固定化された高分子上のヒドロキシルまたはアミノ基とエステルまたはアミド結合による共有結合を形成し、それにより、ELISAアッセイ法におけるC3bの検出を容易にすることができる。
上記のように同定した45個の候補クローンを発現させ、精製し、同じ保存濃度まで希釈し、それを、すべてのクローンが同じ量の緩衝液を有することを保証するために、Ca++およびMg++含有GVB緩衝液(4.0mMバルビタール、141mM NaCl、1.0mM MgCl2、2.0mM CaCl2、0.1%ゼラチン、pH7.4)中で再び希釈した。scFvクローンをそれぞれ2μg/mLの濃度において三つ組で試験した。陽性対照はOMS100 Fab2であり、かつ0.4μg/mLで試験した。scFv/IgGクローンの存在および非存在においてC3c形成をモニターした。
(表16A)重鎖(aa1〜20)
(表16B)重鎖(aa21〜40)
(表16C)重鎖(aa41〜60)
(表16D)重鎖(aa61〜80)
(表16E)重鎖(aa81〜100)
(表16F)重鎖(aa101〜118)
(表17B)軽鎖(aa21〜40)
(表17C)軽鎖(aa41〜60)
(表17D)軽鎖(aa61〜80)
(表17E)軽鎖(aa81〜100)
(表17F)軽鎖(aa101〜120)
(I)(a)(i)SEQ ID NO:21の31〜35のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:21の50〜65のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:21の95〜102のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む、重鎖可変領域;ならびに
(b)(i)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの24〜34のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1;および(ii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの50〜56のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2;および(iii)SEQ ID NO:25またはSEQ ID NO:27いずれかの89〜97のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む、軽鎖可変領域;または(II)該重鎖可変領域の該CDR領域内の合計6つまでのアミノ酸置換および該軽鎖可変領域の該CDR領域内の合計6つまでのアミノ酸置換を除く、他の点では該可変ドメインと同一であるそれらの変異体を含み、該抗体またはその変異体がMASP-2依存性補体活性化を阻害する。
本実施例は、改変されたDT40細胞株DTLacOを使用するインビトロ系を使用する、MASP-1およびMASP-3モノクローナル抗体の生成を記載する。
WO2009029315およびUS2010093033にさらに記載されているように、特定のポリペプチドの可逆性多様化誘発を可能にする改変されたDT40細胞株DTLacOを含むインビトロ系を使用して、ヒトMASP-1およびMASP-3に対する抗体を生成した。DT40は、培養中にその重鎖および軽鎖免疫グロブリン(Ig)遺伝子を構成性突然変異させることが知られているニワトリB細胞株である。他のB細胞と同様に、この構成性突然変異誘発は、Ig遺伝子のV領域への突然変異、ひいては発現した抗体分子のCDRを標的化する。DT40細胞中の構成性突然変異誘発は、各機能的V領域よりも上流に位置する非機能的V遺伝子セグメント(疑似V遺伝子;ΨV)のアレイをドナー配列として使用する遺伝子変換によって起こる。ΨV領域の欠失は、以前、ヒトB細胞において一般に認められる機構である、多様化の機構における遺伝子転換から体細胞超変異への切替えを生じさせることが知られていた。DT40ニワトリB細胞リンパ腫系が、エクスビボでの抗体進化のための有望な出発点であることが示されている(Cumbers, S. J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005))。DT40細胞は培養中、8〜10時間の倍加時間(ヒトB細胞系の場合の20〜24時間に比べて)で強く増殖し、非常に効率的な相同遺伝子標的化を支援する(Buerstedde, J. M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990))。DT40細胞は、多様化のための2つの別々の生理学的経路、それぞれ鋳型化突然変異および非鋳型化突然変異を創製する遺伝子転換および体細胞超変異にアクセスすることができることを条件に、非常に大きな潜在的V領域配列多様性を命令する(Maizels, N. Annu Rev Genet. 39, 23-46 (2005))。多様化した重鎖および軽鎖免疫グロブリン(Ig)は細胞表面表示IgMの形態で発現する。表面IgMは、構造的にIgG分子に似る二価形態を有する。特定の抗原への特異性をもってIgMを表示する細胞は、抗原の固定化可溶性バージョンまたは膜表示バージョンに結合させることによって単離することができる。しかし、抗体進化のためのDT40細胞の利用は実際には限られている。理由は、他の形質転換B細胞株と同様、多様化が生理学的速度の1%未満の速度でしか起こらないからである。
MASP-1およびMASP-3抗原結合についての選択
遺伝子標的化によって多様化させたDTLacO集団を、ヒトMASP-1(SEQ ID NO:10)およびMASP-3抗原(SEQ ID NO:8)と複合化したビーズに結合することによって最初の選択を実施し、その後、FACSにより、蛍光標識可溶性抗原を使用して選択した(Cumbers, S. J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)。MASP-1とMASP-3との間で共有されるアルファ鎖中の保存されたアミノ酸配列(図5に示す)および別々のベータ鎖配列(図6に示す)のせいで、MASP-1およびMASP-3へのバインダのための別々の平行スクリーニングを実施して、MASP-1特異性mAb、MASP-3特異性mAbならびにMASP-1およびMASP-3の両方に結合することができる(二重特異性)mAbを同定した。2つの形態の抗原を使用して、バインダを選択し、スクリーニングした。まず、Fcドメインに融合した、完全長または断片のいずれかの組換えMASP-1またはMASP-3をDynal磁性プロテインGビーズに結合させるか、または、PECy5標識抗ヒトIgG(Fc)二次抗体を使用してFACSベースの選択に使用した。あるいはまた、MASP-1またはMASP-3タンパク質の組換えバージョンをDylight fluorで直接標識し、選択およびスクリーニングに使用した。
PCR増幅V領域を293F細胞中のヒトIgG1の発現を支持するベクターにクローニングすることによって組換え抗体を生成した(Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))。MASP-1またはMASP-3を様々な濃度の蛍光標識可溶性抗原と結合させる抗体を発現するDTLacO細胞を染色することによって飽和結合反応速度を測定した。MASP-3依存性C3b沈着およびMASP-3依存性D因子切断を含むMASP-3特異性活性に関する機能アッセイ法を、それぞれ実施例17および18に記載するように実施した。MASP-1特異性活性、すなわちMASP-1依存性C3b沈着の阻害に関する機能アッセイ法を以下に記載するように実施した。
上記方法を使用して、数多くのMASP-1およびMASP-3結合抗体を生成した。FACS分析によって実証された結合を、MASP-3バインダのスクリーニングにおいて単離された代表的なクローンM3J5およびM3M1に関して記載する。
図32Aは、親DTLacO(SEQ ID NO:24)、MASP-3結合クローンM3J5(SEQ ID NO:25)およびM3M1(SEQ ID NO:26)ならびにMASP-1/MASP-3二重結合クローンD14(SEQ ID NO:30)および1E10に関する重鎖可変領域(VH)配列のアミノ酸アライメントを示す。
図32Bは、親DTLacO(SEQ ID NO:27)ならびにMASP-3結合クローンM3J5(SEQ ID NO:28)およびM3M1(SEQ ID NO:29)ならびにMASP-1/MASP-3二重結合クローンD14(SEQ ID NO:31)および1E10(SEQ ID NO:33)に関する軽鎖可変領域(VL)配列のアミノ酸アライメントを示す。
MASP-1は、MASP-2を活性化するその能力を介してLEA-2に寄与する(図1を参照されたい)。Wieslab(登録商標)補体システムスクリーニングMBLアッセイ法(Euro Diagnostica, Malmo, Sweden)は、LEA-2依存活性化(すなわち、従来のレクチン経路活性化)を単離する条件下、C5b-C9沈着を測定する。製造者の取り扱い指示に従って、代表的なクローン1E10を400nMの最終濃度で試験してアッセイ法を実施した。
上記結果は、DTLacOプラットフォームが、LEA-1(以下、図17および18に示す)およびLEA-2(この実施例に示す)に対する阻害性を有するMASP-1およびMASP-3モノクローナル抗体の迅速なエクスビボ発見を可能にすることを示した。
本実施例はMASP-1およびMASP-2のポリペプチド阻害因子の生成を記載する。
それぞれSGMI-1およびSGMI-2と呼ばれる、MASP-1およびMASP-2の特異性阻害因子の生成が、いずれも参照により本明細書に組み入れられるHeja et al., J Biol Chem 287:20290(2012)およびHeja et al., PNAS 109:10498 (2012)に記載されている。SGMI-1およびSGMI-2は、いずれも、プロテアーゼ結合ループの8つの位置のうち6つが完全にランダム化されたサバクトビバッタ(Schistocerca gregaria)プロテアーゼ阻害因子2の変異体のファージライブラリーから選択された36アミノ酸ペプチドである。その後のインビトロ進化が、一桁nMのKI値の一特異性阻害因子を生じさせた(Heja et al., J. Biol. Chem. 287:20290, 2012)。構造的研究が、最適化されたプロテアーゼ結合ループが、2つの阻害因子の特異性を決定する一次結合部位を形成することを明らかにした。延長した二次および内部結合領域のアミノ酸配列は2つの阻害因子に共通であり、接触界面に寄与する(Heja et al., 2012. J. Biol. Chem. 287:20290)。機械的に、SGMI-1およびSGMI-2はいずれも、古典経路または第二経路に影響することなく補体活性化のレクチン経路を遮断する(Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498)。
SGMI-IgG1 Fc融合タンパク質を発現させるために、SGMI-1(SEQ ID NO:34)およびSGMI-2(SEQ ID NO:35)ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成し(DNA 2.0)、発現ベクターpFUSE-hIgG1-Fc2(InvivoGen)中、IL-2シグナル配列およびヒトIgG1Fc領域(SEQ ID NO:36)をコードするヌクレオチド配列の間に挿入した。フレキシブルなポリペプチドリンカー(例えば、SEQ ID NO:37またはSEQ ID NO:38)をSGMIペプチドとIgG1 Fc領域との間に含めた。
Freestyle 293-FまたはExpi293F細胞(Invitrogen)を、供給者のプロトコールに従って、2つの発現プラスミド(pFUSE-SGMI-1Fc(SEQ ID NO:39)およびpFUSE-SGMI-2Fc(SEQ ID NO:41)の1つと過渡的にトランスフェクトした。37℃で4日間のインキュベーションののち、培地を収穫した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによってFc融合タンパク質を精製した。
レクチン経路活性化の尺度である、1%血清からマンナンコーティングされた96ウェルプレートへのC3bの沈着を阻害する能力に関してSGMI-1FcおよびSGMI-2Fc融合タンパク質を試験した。SGMI-1FcおよびSGMI-2Fcを1%正常ヒト血清とともに氷上で1時間プレインキュベートしたのち、マンナンでコーティングされたウェルに加えた(2μg/ウェル)。Schwaeble et al. PNAS 108:7523, 2011に記載されているようにELISAによってC3b沈着を測定した。
黄色ブドウ球菌を有する3MC血清中の補体経路の分析
背景/原理:
MASP-3は、正常ヒト血清の存在または非存在において非固定化流体相マンナン、ザイモサンAまたはN-アセチルシステインへの曝露を経ても活性化されないことがわかった。しかし、組換えおよび天然のMASP-3は正常ヒト血清(NHS)または熱不活化ヒト血清(HIS)の存在および非存在において熱不活化黄色ブドウ球菌の表面で活性化されることがわかった(データ示さず)。また、正常ヒト血清の存在において黄色ブドウ球菌の表面でC3b沈着が起こり、フローサイトメーターを使用してその沈着をモニターすることができることがわかった。したがって、LEA-1に対するMASP-3の寄与を評価する手段として、この実施例に記載するように、黄色ブドウ球菌に対する第二経路(AP)応答を測定した。
組換えMASP-3:完全長組換えヒトMASP-3をコードするポリヌクレオチド配列、MASP-3の切断型セリンプロテアーゼ(SP)活性バージョン(CCP1-CCP2-SP)およびSP不活化形態のMASP-3(S679A)をpTriEx7哺乳動物発現ベクター(Invivogen)にクローニングした。得られた発現構築物は完全長MASP-3またはCCP1-CCP2-SP断片をアミノ末端Streptagおよびカルボキシ末端His6タグによってコードする。発現構築物を製造者によって提供されるプロトコールに従ってFreestyle 293-FまたはExpi293F細胞(Invitrogen)中にトランスフェクトした。5% CO2中37℃で3〜4日間の培養ののち、Streptactinアフィニティークロマトグラフィーを使用して組換えタンパク質を精製した。
最初の実験は、フローサイトメトリーアッセイ法がAP駆動型C3b沈着(AP-C3b)の存在または非存在を検出することができることを実証するために、以下のように実施した。以下の血清:正常ヒト血清、B因子(B因子)枯渇ヒト血清、D因子枯渇ヒト血清およびプロパージン枯渇ヒト血清(Complement Technology, Tyler, Texas., USAから入手)の5%を、Mg++/EGTA緩衝液またはEDTA中、試験抗体と4℃で一晩混合した。加熱殺菌黄色ブドウ球菌(108個/反応)を100μLの全量まで各混合物に加え、37℃で40分間回転流動させた。細菌を洗浄緩衝液中で洗浄し、細菌ペレットを洗浄緩衝液中に再懸濁させ、細菌表面のC3b沈着に関して各サンプルの80μLアリコートを分析し、それを、フローサイトメトリーを使用して、抗ヒトC3c(DAko, UK)で検出した。
1. 5%正常ヒト血清+EDTA
2. 5%正常ヒト血清+Mg/EGTA
3. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTA
4. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて活性完全長rMASP-3
5. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて切断型活性rMASP-3(CCP1/CCP2/SP)
6. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて不活性rMASP-3(S679A)
7. 5%ヒト3MC(MASP-3-/-)血清+Mg++/EGTAに加えて活性完全長rMASP-1
B因子のMASP-3依存性活性化を分析するために、5%血清(正常ヒト血清または3MC患者血清のいずれか)と組換えタンパク質との様々な混合物を上記のようにアッセイした。各反応混合物から20μLを取り出し、タンパク質試料添加緩衝液に加えた。試料を70℃で10分間加熱し、SDS-PAGEゲルに添加した。B因子ポリクローナル抗体(R&D Systems)を使用してウェスタンブロット分析を実施した。B因子の活性化は、高めの分子量のプロB因子タンパク質に由来する低めの分子量の2つの切断産物(BbおよびBa)の形成によって明らかであった。
MASP-3依存性B因子活性化/切断のための最小要件を決定するために以下のアッセイ法を実施した。
図37は、B因子切断が分析されるクマシー染色SDS-PAGEゲルを示す。レーン1に示すように、B因子切断はC3、MASP-3およびプロD因子の存在において最適である。レーン2に示すように、C3は絶対に必要であるが、レーン4および5に示すように、C3が存在する限り、MASP-3またはプロD因子はいずれもB因子切断を媒介することができる。
この実施例に記載されるように、ヒト血清中の黄色ブドウ球菌におけるAP駆動型C3b沈着にはMASP-3が必要であることが実証された。したがって、実施例15に記載されるように同定された代表的なMASP-3 mAbがMASP-3の活性を阻害することができるかどうかを判定するために以下のアッセイ法を実施した。活性組換えMASP-3(CCP1-CCP2-SP)断片タンパク質(250ng)を3つの異なる濃度(0.5、2および4μM)のアイソタイプ対照mAb、mAb1A5(MASP-3またはMASP-1に結合しないDTLacOプラットフォームから得られた対照)またはmAbD14(MASP-3に結合する)とともに氷上で1時間プレインキュベートした。酵素-mAb混合物を50μLの最終反応量で5% 3MC血清(MASP-3欠損)および5×107個の加熱殺菌黄色ブドウ球菌に曝露した。反応物を37℃で30分間インキュベートしたのち、C3b沈着の検出のために染色した。染色された細菌細胞をフローサイトメーターによって分析した。
要約すると、この実施例の結果は、MASP-3を欠損している血清中のAPの明らかな欠陥を実証する。したがって、B因子活性化およびC3b沈着を機能的終点として使用して、MASP-3がAPに対して非常に重要な寄与を成すことが実証された。さらに、MASP-3の触媒的に活性なC末端部分を含む機能的な組換えMASP-3の添加が、3MC患者からの血清中のB因子活性化およびC3b沈着における欠陥を補正する。逆に、この実施例においてさらに実証されるように、rMASP-3を有する3MC血清中のMASP-3抗体(例えばmAbD14)の添加はAP駆動型C3b沈着を阻害する。B因子活性化、ひいてはAPにおけるMASP-3の直接的な役割が、組換えMASP-3がC3とともに組換えB因子を活性化するのに十分であるという観察によって実証される。
本実施例は、MASP-1およびMASP-3がD因子を活性化することを実証する。
プロD因子の2つの異なる組換えバージョンを切断する能力に関して、組換えMASP-1およびMASP-3を試験した。第一のバージョン(プロD因子His)はN末端タグを欠くが、C末端Hisタグを有する。したがって、プロD因子のこのバージョンは、活性化中に切断によって除去される5アミノ酸プロペプチドを含む。第二のバージョン(STプロD因子His)はN末端上にStrep-TagII配列を有し、したがって、切断されるN末端断片を15アミノ酸に増加させる。STプロD因子はまた、His6タグをC末端に含む。STプロD因子Hisのプロペプチドの長さの増大が、プロD因子HIS形態で可能である分解に比較して、SDS-PAGEによる切断形態と非切断形態との分解を改善する。
図39はプロD因子基質切断のウェスタンブロット分析を示す。図39に示すように、完全長MASP-3(レーン2)およびMASP-1 CCP1-CCP2-SP)断片(レーン5)だけがST-プロD因子His6を切断した。触媒的に不活性な完全長MASP-3(S679A、レーン3)およびMASP-1(S646A、レーン3)はいずれの基質も切断できなかった。プロD因子His6ポリペプチドを用いても同一の結果が得られた(図示せず)。MASP-3に対して過剰モルのMASP-1(CCP1-CCP2-SP)の比較は、少なくとも本明細書に記載される条件下、MASP-3がMASP-1よりも有効なプロD因子切断の触媒であることを示唆する。
実施例15に記載されたように同定された代表的なMASP-3およびMASP-1 mAbの、MASP-3依存性D因子切断に対する阻害効果を判定するために、以下のようにアッセイ法を実施した。活性組換えMASP-3タンパク質(80ng)を代表的なmAb D14、M3M1および対照抗体(MASP-1に特異的に結合するが、MASP-3には結合しない)1μgとともに室温で15分間プレインキュベートした。N末端Strepタグを有するプロD因子(ST-プロD因子-His、70ng)を加え、混合物を37℃で75分間インキュベートした。上記のように反応物を電気泳動させ、ブロッティングし、抗D因子で染色した。
本実施例は、MASP-3欠損がマンナンコーティングされたWTウサギ赤血球の補体媒介性溶解を防ぐことを実証する。
本明細書の実施例5および6に記載されるように、PNHのマウスモデルから採取された血液試料からの赤血球の溶解に対するMASP-2およびMASP-3欠損血清の効果が、PNHに罹患している対象を治療するためのMASP-2阻害および/またはMASP-3阻害の有効性を実証し、また、エクリズマブのようなC5阻害因子による治療を受けているPNH対象においてC3断片媒介血管外溶血の効果を緩和するためのMASP-2の阻害因子および/またはMASP-3の阻害因子(二重または二重特異性MASP-2/MASP-3阻害因子を含む)の使用を裏付ける。
以下のように、3名の異なる3MC患者からMASP-3欠損血清を採取した。
3MC患者1は、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルを含み、この3MC患者の母親および父親からも提供してもらった(両親とも、MASP-3セリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンを機能不全にする突然変異を有するアレルに関してヘテロ接合性)。
3MC患者2は、MASP-1のエキソン12、すなわち、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインをコードするエキソンにC1489T(H497Y)突然変異を有して、非機能的MASP-3を生じさせ、機能的MASP-1タンパク質を生じさせる。
3MC患者3は、MASP-1遺伝子中に確認された欠陥を有し、非機能的MASP-3を生じさせ、機能的MASP-1タンパク質を生じさせる。
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11:291-295 (1981))に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、0.5〜25%の範囲の血清濃度でAPアッセイ法を実施し、時間とともにC3b沈着を測定した。
図41は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、MASP-3欠損対象(3MC)、C4欠損対象およびMBL欠損対象から採取された血清試料中の血清濃度の関数としてグラフで示す。図41に示し、以下の表18にまとめているように、患者2および患者3からのMASP-3欠損患者血清が、高い濃度(25%、12.5%、6.25%血清濃度)での残留AP活性を有し、かつ有意に高いAP50(すなわち、最大C3沈着の50%を達成するために必要な血清の8.2%および12.3%)を有する。
方法:
Ca++の非存在における(すなわちEGTAを使用することによる)ウサギRBCの調製
ウサギ全血(2mL)を、2つの1.5mLエッペンドルフ管に分割し、4℃の冷却エッペンドルフ遠心分離機中、8000rpm(約5.9rcf)で3分間遠心処理した。氷冷BBS/Mg++/Ca++(4.4mMバルビツール酸、1.8mMナトリウムバルビトン、145mM NaCl、pH7.4、5mM Mg++、5mM Ca++)中に再懸濁させたのち、RBCペレットを3回洗浄した。3回目の洗浄後、ペレットをBBS/Mg++/Ca++4mL中に再懸濁させた。上記のように赤血球をペレット化し、RBCをBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++で洗浄した。RBC懸濁液をBBS/0.1%ゼラチン/Mg++/Ca++中、4℃で貯蔵した。次いで、懸濁させたRBC100μlを水1.4mLで希釈し、8000rpm(約5.9rcf)で3分間スピンダウンし、上清のODを541nmで0.7に調節した(541nmで0.7のODは赤血球約109個/mlに相当)。その後、赤血球108個/mlの濃度を達成するために、OD 0.7で再懸濁させたRBC1mLをBBS/Mg++/EGTA 9mlに加えた。試験血清または血漿の希釈物を氷冷BBS、Mg++、EGTA中に調製し、各血清または血漿希釈物100μLを丸底プレートの対応するウェルにピペットで移した。適切に希釈したRBC 100μL(赤血球108個/ml)を各ウェルに加えた。ナノ水を使用して陽性対照(100%溶解)を製造し、血清または血漿なしのBBS/Mg++/EGTAによる希釈物を陰性対照として使用した。次いで、プレートを37℃で1時間インキュベートした。丸底プレートを3750rpmで5分間遠心処理した。次いで、各ウェルからの上清100μLを平底プレートの対応するウェルに移し、415〜490nmでODを読み取った。
図43は、Ca++の非存在下で測定した、正常な対象および2名の3MC患者(患者2および患者3)からの血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率(上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図43に示すように、MASP-3欠損が、正常ヒト血清に比べて、マンナンコーティングされた赤血球の補体媒介性溶解の割合を低下させることが実証される。正常ヒト血清からの2つの曲線と3MC患者からの2つの曲線との間の差は有意である(p=0.013、フリードマン試験)。
方法:
Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol. 11:291-295 (1981))に記載されているような従来のAP特異的条件下(BBS/Mg++/EGTA、Ca++なし、ここで、BBS=スクロースを含有するバルビタール緩衝食塩水)、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上、以下の血清試料中で、APアッセイ法を実施した:(1)完全長活性rMASP-3が0〜20μg/mlの範囲で加えられた3MC患者#2からの5%ヒト血清;(2)完全長活性rMASP-3が0〜20μg/mlの範囲で加えられた3MC患者#2からの10%ヒト血清;および(3)不活性rMASP-3A(S679A)が0〜20μg/mlの範囲で加えられた3MC患者#2からの5%ヒト血清。
図44は、ザイモサンコーティングされたマイクロタイタープレート上のAP駆動型C3b沈着のレベルを、ヒト3MC患者#2(MASP-3欠損)から採取された血清試料に加えられるrMASP-3タンパク質の濃度の関数としてグラフで示す。図44に示すように、活性組換えMASP-3タンパク質は、ザイモサンコーティングされたプレート上にAP駆動型C3b沈着を濃度依存的に再構成する。図44にさらに示すように、不活性rMASP-3(S679A)を含有する3MC血清中ではC3b沈着は認められなかった。
方法:
ウサギRBCを使用して、実験#2で上述された方法を使用して、以下の試験血清を、0〜12%の範囲で用いて溶血アッセイ法を実施した:(1)正常ヒト血清;(2)3MC患者血清;(3)3MC患者血清+活性完全長rMASP-3(20μg/ml);および(4)熱不活化ヒト血清。
図45は、Ca++の非存在において測定された、(1)正常ヒト血清;(2)3MC患者血清;(3)3MC患者血清+活性完全長rMASP-3(20μg/ml);および(4)熱不活化ヒト血清中、一定範囲の血清濃度にわたり、マンナンコーティングされたウサギ赤血球の溶血率(上清への溶解ウサギ赤血球のヘモグロビン放出を測光法によって測定)をグラフで示す。図45に示すように、rMASP-3を含む3MC血清中のウサギRBCの溶解率は、rMASP-3を含まない3MC血清中の溶解率に比べて有意に増大する(p=0.0006)。
方法:
3MC血清がLEA-2を欠損しているかどうかを調べるために、マンナンコーティングされたELISAプレートを使用してC3b沈着アッセイ法を実施した。クエン酸添加血漿を、BBS緩衝液中、連続希釈度(1:80から出発して1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560)に希釈し、マンナンコーティングされたプレート上に固定した。ニワトリ抗ヒトC3bアッセイ法を使用して、沈着したC3bを検出した。マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型C3b沈着(APおよびLEA-1が働くには血漿希釈度が高すぎる)を、正常ヒト対象(NHS)、2名の3MC患者(患者2および患者3)、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清中のヒト血清濃度の関数として評価した。
図47は、正常ヒト対象(NHS)、2名の3MC患者(患者2および患者3)、患者3の両親およびMBL欠損対象からの血清に関して、マンナンコーティングされたELISAプレート上のLEA-2駆動型(すなわち、MASP-2駆動型)C3b沈着のレベルを、BBS緩衝液中に希釈されたヒト血清の濃度の関数としてグラフで示す。これらのデータは患者2がMBL充分であることを示す。しかし、患者3および患者3の母親はMBL欠損であり、したがって、この人たちの血清はLEA-2を介してC3bをマンナン上に沈着させない。これらの血清中のMBLの置換は、患者3(MASP-3欠損を生じさせるSNPに関してホモ接合性である)およびその母親(突然変異MASP-3アレルに関してヘテロ接合性である)の血清中のLEA-2媒介性C3b沈着を回復させる(データ示さず)。この発見は、3MC血清がLEA-2を欠損しているのではなく、むしろ、機能的MASP-2および機能的MASP-1を有すると考えられることを実証する。
これらの結果は、ザイモサンコーティングされたウェル上のC3b沈着の減少およびウサギ赤血球溶解の減少によって証明されるように、ヒト血清中のMASP-3欠損がAP活性の損失を生じさせることを実証する。機能的組換えヒトMASP-3で血清を補充することにより、両アッセイ法においてAPを回復させることができる。
排他的な所有権または特権を主張する本発明の態様は添付の特許請求の範囲で規定される。
発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:8の一部に特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
MASP-1阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記MASP-1阻害物質がMASP-1モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:10の一部に特異的に結合する、本発明1003の方法。
[本発明1005]
MASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:5の一部に特異的に結合する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
MASP-1阻害物質およびMASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記組成物が前記対象において赤血球の生存率を増加させる、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記対象が、(i)正常より低いレベルのヘモグロビン;(ii)正常より低いレベルの血小板;(iii)正常より高いレベルの網状赤血球;および(iv)正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示す、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記対象が、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害因子による治療を以前に受けたことがあるかまたは現在受けている、本発明1001の方法。
[本発明1011]
補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害因子を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記終末補体阻害因子が、ヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記終末補体阻害因子がエクリズマブである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記MASP-3阻害物質が第二経路駆動型C3b沈着を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記MASP-3阻害物質がD因子成熟を阻害する、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-1の一部に特異的に結合する、本発明1003の方法。
[本発明1017]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に特異的に結合する、本発明1003の方法。
[本発明1018]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)の一部にも結合する、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記MASP-3阻害物質が、CUBI-CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記MASP-3阻害物質が、CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)にも結合する、本発明1018の方法。
[本発明1022]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3およびMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-3/MASP-2阻害因子である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445〜682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300〜431)の少なくとも1つにも結合する、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)の一部に結合し、かつMASP-1またはMASP-2を阻害しない、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-3の一部に特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に特異的に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての汎(pan)阻害因子であり、かつ、CUB1-EGF-CUB2ドメイン中の保存領域に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての三重特異性阻害因子である、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1031]
前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1032]
前記組成物がMASP-1抗体ならびにMASP-2抗体およびMASP-3抗体を含む、本発明1007の方法。
[本発明1033]
MASP-2抗体、MASP-1抗体、またはMASP-3抗体の少なくとも1つを含む組成物の同時投与を含む、本発明1007の方法。
[本発明1034]
前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1035]
前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1036]
前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機構を有する抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体またはヒト抗体からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記組成物が全身投与される、本発明1001の方法。
[本発明1038]
前記組成物が、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または吸入剤として投与される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している対象において赤血球の生存率を増加させる方法であって、赤血球の生存率を増加させるのに有効な量のMASP-1阻害物質および/またはMASP-3阻害物質の少なくとも1つを含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1040]
前記組成物がMASP-1阻害物質を含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記組成物がMASP-3阻害物質を含む、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記組成物がMASP-1阻害物質およびMASP-3阻害物質を含む、本発明1039の方法。
[本発明1043]
MASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、本発明1039の方法。
[本発明1044]
前記MASP-1阻害物質がMASP-1モノクローナル抗体である、本発明1040の方法。
[本発明1045]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体である、本発明1041の方法。
[本発明1046]
前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1047]
少なくとも1つの補体経路阻害物質と薬学的に許容される担体とを含み、該少なくとも1つの阻害物質が、MASP-2阻害物質と、MASP-3阻害物質および/またはMASP-1阻害物質の少なくとも1つとを含む、薬学的組成物。
[本発明1048]
前記少なくとも1つの阻害物質が、MASP-3阻害物質である第一の分子とMASP-2阻害物質である第二の分子との組み合わせを含む、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1049]
前記少なくとも1つの阻害物質が、MASP-3阻害物質としての活性と、MASP-2阻害物質としての活性とを含む単一の分子実体を含む、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1050]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体またはその断片である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1051]
前記MASP-2阻害物質がMASP-2抗体またはその断片である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1052]
前記MASP-3阻害物質が、B因子のMASP-3媒介性切断を阻害する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1053]
前記MASP-3阻害物質がD因子成熟を阻害する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1054]
前記MASP-1阻害物質がMASP-1抗体またはその断片である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1055]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-1の一部に特異的に結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1056]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に特異的に結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1057]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1058]
前記MASP-3阻害物質が、CUBI-CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1057の薬学的組成物。
[本発明1059]
前記MASP-3阻害物質が、CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1057の薬学的組成物。
[本発明1060]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)にも結合する、本発明1057の薬学的組成物。
[本発明1061]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1062]
前記MASP-1阻害物質が、MASP-1およびMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-1/MASP-2阻害因子である、本発明1061の薬学的組成物。
[本発明1063]
前記MASP-1阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445〜682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300〜431)の少なくとも1つにも結合する、本発明1061の薬学的組成物。
[本発明1064]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8、完全長)の一部に特異的に結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1065]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-3の一部に特異的に結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1066]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に特異的に結合する、本発明1064の薬学的組成物。
[本発明1067]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1068]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-2およびMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-2/MASP-3阻害因子である、本発明1067の薬学的組成物。
[本発明1069]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445〜682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300〜431)の少なくとも1つにも結合する、本発明1067の薬学的組成物。
[本発明1070]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての汎阻害因子であり、かつ、これら3つのタンパク質のCUB1-EGF-CUB2ドメイン中の保存領域に結合する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1071]
前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての三重特異性阻害因子である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1072]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3抗体であり、かつ前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1073]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3抗体であり、かつ前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1074]
前記MASP-3阻害物質がMASP-3抗体であり、かつ前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1075]
MASP-1抗体ならびにMASP-2抗体およびMASP-3抗体を含む、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1076]
MASP-2抗体をさらに含む、本発明1057の薬学的組成物。
[本発明1077]
MASP-3抗体をさらに含む、本発明1061の薬学的組成物。
[本発明1078]
MASP-1抗体をさらに含む、本発明1067の薬学的組成物。
[本発明1079]
前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機構を有する抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体またはヒト抗体からなる群より選択される、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1080]
前記MASP-1阻害物質がD因子成熟を阻害する、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1081]
全身送達のために製剤化されている、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1082]
皮下への、筋肉内への、静脈内への、動脈内への、または吸入剤としての送達のために製剤化されている、本発明1081の薬学的組成物。
[本発明1083]
MASP-1(SEQ ID NO:10、完全長)の一部に結合しかつMASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合するMASP-3阻害物質と、薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1084]
前記MASP-3阻害物質が二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、本発明1083の組成物。
[本発明1085]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性抗体である、本発明1083の組成物。
[本発明1086]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)にも結合する、本発明1085の組成物。
[本発明1087]
MASP-2(SEQ ID NO:5、完全長)の一部に結合しかつMASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合するMASP-3阻害物質と、薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1088]
前記MASP-3阻害物質が二重MASP-2/MASP-3阻害因子である、本発明1087の組成物。
[本発明1089]
前記MASP-3阻害物質が二重特異性MASP-2/MASP-3抗体である、本発明1087の組成物。
[本発明1090]
MASP-1(SEQ ID NO:10、完全長)の一部に結合しMASP-2(SEQ ID NO:5、完全長)の一部に結合しかつMASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合するMASP-3阻害物質と、薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1091]
前記阻害物質が汎MASP阻害因子である、本発明1090の組成物。
[本発明1092]
前記阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3に対する三重特異性抗体である、本発明1090の組成物。
本明細書に記載される発明のこれらおよび他の局面および態様は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになると考えられる。本明細書において引用される米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物はすべて参照により、それぞれが個々に組み入れられるごとく、全体として本明細書に組み入れられる。
Claims (92)
- 発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している対象においてMASP-3依存性補体活性化を阻害する方法であって、MASP-3依存性補体活性化を阻害するのに有効な量のMASP-3阻害物質を含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:8の一部に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- MASP-1阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質がMASP-1モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:10の一部に特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
- MASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体またはその断片であり、該断片が、SEQ ID NO:5の一部に特異的に結合する、請求項5に記載の方法。
- MASP-1阻害物質およびMASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が前記対象において赤血球の生存率を増加させる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、(i)正常より低いレベルのヘモグロビン;(ii)正常より低いレベルの血小板;(iii)正常より高いレベルの網状赤血球;および(iv)正常より高いレベルのビリルビンからなる群より選択される1つまたは複数の症状を示す、請求項8に記載の方法。
- 前記対象が、補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害因子による治療を以前に受けたことがあるかまたは現在受けている、請求項1に記載の方法。
- 補体タンパク質C5の切断を阻害する終末補体阻害因子を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記終末補体阻害因子が、ヒト化抗C5抗体またはその抗原結合断片である、請求項11に記載の方法。
- 前記終末補体阻害因子がエクリズマブである、請求項12に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が第二経路駆動型C3b沈着を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質がD因子成熟を阻害する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-1の一部に特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に特異的に結合する、請求項3に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)の一部にも結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、CUBI-CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項18に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項18に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)にも結合する、請求項18に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3およびMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-3/MASP-2阻害因子である、請求項22に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445〜682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300〜431)の少なくとも1つにも結合する、請求項22に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)の一部に結合し、かつMASP-1またはMASP-2を阻害しない、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-3の一部に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に特異的に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての汎(pan)阻害因子であり、かつ、CUB1-EGF-CUB2ドメイン中の保存領域に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての三重特異性阻害因子である、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-1抗体ならびにMASP-2抗体およびMASP-3抗体を含む、請求項7に記載の方法。
- MASP-2抗体、MASP-1抗体、またはMASP-3抗体の少なくとも1つを含む組成物の同時投与を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、請求項22に記載の方法。
- 前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機構を有する抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体またはヒト抗体からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が全身投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、皮下に、筋肉内に、静脈内に、動脈内に、または吸入剤として投与される、請求項37に記載の方法。
- 発作性夜間血色素尿症(PNH)に罹患している対象において赤血球の生存率を増加させる方法であって、赤血球の生存率を増加させるのに有効な量のMASP-1阻害物質および/またはMASP-3阻害物質の少なくとも1つを含む組成物を該対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記組成物がMASP-1阻害物質を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-3阻害物質を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記組成物がMASP-1阻害物質およびMASP-3阻害物質を含む、請求項39に記載の方法。
- MASP-2阻害物質を含む組成物を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項39に記載の方法。
- 前記MASP-1阻害物質がMASP-1モノクローナル抗体である、請求項40に記載の方法。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体である、請求項41に記載の方法。
- 前記MASP-2阻害物質がMASP-2モノクローナル抗体である、請求項43に記載の方法。
- 少なくとも1つの補体経路阻害物質と薬学的に許容される担体とを含み、該少なくとも1つの阻害物質が、MASP-2阻害物質と、MASP-3阻害物質および/またはMASP-1阻害物質の少なくとも1つとを含む、薬学的組成物。
- 前記少なくとも1つの阻害物質が、MASP-3阻害物質である第一の分子とMASP-2阻害物質である第二の分子との組み合わせを含む、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記少なくとも1つの阻害物質が、MASP-3阻害物質としての活性と、MASP-2阻害物質としての活性とを含む単一の分子実体を含む、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3モノクローナル抗体またはその断片である、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-2阻害物質がMASP-2抗体またはその断片である、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、B因子のMASP-3媒介性切断を阻害する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質がD因子成熟を阻害する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質がMASP-1抗体またはその断片である、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-1の一部に特異的に結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に特異的に結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、CUBI-CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項57に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、CCP2ドメイン内のコンセンサス領域に結合する二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項57に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)にも結合する、請求項57に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質が、MASP-1およびMASP-2のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-1/MASP-2阻害因子である、請求項61に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445〜682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300〜431)の少なくとも1つにも結合する、請求項61に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3(SEQ ID NO:8、完全長)の一部に特異的に結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1(SEQ ID NO:10)に結合する場合よりも少なくとも10倍大きい親和性でMASP-3の一部に特異的に結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に特異的に結合する、請求項64に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-2(SEQ ID NO:5)の一部にも結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-2およびMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン内の保存領域に結合する二重MASP-2/MASP-3阻害因子である、請求項67に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)に結合し、かつ、MASP-2のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:5のaa445〜682)またはMASP-2のCCP-1-CCP2ドメイン(SEQ ID NO:5のaa300〜431)の少なくとも1つにも結合する、請求項67に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての汎阻害因子であり、かつ、これら3つのタンパク質のCUB1-EGF-CUB2ドメイン中の保存領域に結合する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3についての三重特異性阻害因子である、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3抗体であり、かつ前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3抗体であり、かつ前記組成物がMASP-1抗体をさらに含む、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質がMASP-3抗体であり、かつ前記組成物がMASP-2抗体をさらに含む、請求項47に記載の薬学的組成物。
- MASP-1抗体ならびにMASP-2抗体およびMASP-3抗体を含む、請求項47に記載の薬学的組成物。
- MASP-2抗体をさらに含む、請求項57に記載の薬学的組成物。
- MASP-3抗体をさらに含む、請求項61に記載の薬学的組成物。
- MASP-1抗体をさらに含む、請求項67に記載の薬学的組成物。
- 前記抗体またはその断片が、組換え抗体、低下したエフェクター機構を有する抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体またはヒト抗体からなる群より選択される、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 前記MASP-1阻害物質がD因子成熟を阻害する、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 全身送達のために製剤化されている、請求項47に記載の薬学的組成物。
- 皮下への、筋肉内への、静脈内への、動脈内への、または吸入剤としての送達のために製剤化されている、請求項81に記載の薬学的組成物。
- MASP-1(SEQ ID NO:10、完全長)の一部に結合しかつMASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合するMASP-3阻害物質と、薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重MASP-1/MASP-3阻害因子である、請求項83に記載の組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性抗体である、請求項83に記載の組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性モノクローナル抗体であり、該二重特異性モノクローナル抗体が、MASP-1のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:10のaa449〜694)に結合し、かつ、MASP-3のセリンプロテアーゼドメイン(SEQ ID NO:8のaa450〜711)にも結合する、請求項85に記載の組成物。
- MASP-2(SEQ ID NO:5、完全長)の一部に結合しかつMASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合するMASP-3阻害物質と、薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重MASP-2/MASP-3阻害因子である、請求項87に記載の組成物。
- 前記MASP-3阻害物質が二重特異性MASP-2/MASP-3抗体である、請求項87に記載の組成物。
- MASP-1(SEQ ID NO:10、完全長)の一部に結合しMASP-2(SEQ ID NO:5、完全長)の一部に結合しかつMASP-3(SEQ ID NO:8)の一部にも結合するMASP-3阻害物質と、薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
- 前記阻害物質が汎MASP阻害因子である、請求項90に記載の組成物。
- 前記阻害物質が、MASP-1、MASP-2、およびMASP-3に対する三重特異性抗体である、請求項90に記載の組成物。
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