ES2628973T3 - Mutagénesis inducible de genes diana - Google Patents

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Abstract

Una célula B modificada para inducir reversiblemente la diversificación de un gen diana, comprendiendo la célula B: (a) un elemento regulador cis unido operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una región codificadora; y (b) un constructo de fusión que codifica un factor de fijación fusionado a un factor de diversificación, en el que el factor de fijación se une específicamente al elemento regulador cis de (a) y el factor de diversificación induce reversiblemente la diversificación de la región codificadora.

Description

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DESCRIPCION
Mutagenesis inducible de genes diana CAMPO TECNICO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere en general a la mutagenesis de genes diana que aprovecha las capacidades mutagenicas naturales de las celulas B y mejora dichas capacidades al poner bajo control el proceso de diversificacion. La invencion proporciona un metodo para generar rapida e inductivamente mutaciones puntuales y otros tipos de diversificacion en genes expresados, tales como genes de anticuerpos. Este metodo puede acoplarse con una seleccion para identificar clones de celulas B que producen, por ejemplo, anticuerpos de alta afinidad o especificidad. El proceso de diversificacion puede ser modulado, acelerado, detenido, conmutado entre metodos de mutagenesis y similares. La modulacion de la diversificacion de acuerdo con la invencion es inducible y reversible. La invencion proporciona un medio de desarrollo rapido y factible de un repertorio de variantes de inmunoglobulinas y otros polipeptidos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Los anticuerpos son moleculas que proporcionan una defensa clave contra la infeccion en seres humanos. Se utilizan como terapeutica en el tratamiento de una variedad de enfermedades, desde enfermedades infecciosas hasta cancer. Tambien se utilizan como reactivos de diagnostico en una gran variedad de pruebas realizadas diariamente en laboratorios clrnicos y de investigacion.
La especificidad y la afinidad de los anticuerpos se modifican in vivo por procesos de mutacion, dirigidos a regiones espedficas dentro de los genes que codifican anticuerpos. Los anticuerpos son codificados por dos genes, denominados genes de cadena pesada y liviana de inmunoglobulina (Ig). Las cadenas pesadas y livianas de polipeptidos codificados por los genes Ig interaction para formar una molecula tetramerica que se expresa sobre la superficie celular como un receptor. Las moleculas de anticuerpo son bifuncionales: un dominio reconoce el antfgeno, el otro promueve la eliminacion del antfgeno del cuerpo. El dominio de reconocimiento, denominado region variable (V), se crea tras la interaccion de los polipeptidos de cadena pesada y liviana en anticuerpos naturales. De hecho, es variable en secuencia de un anticuerpo a otro. La variabilidad en la secuencia primaria de la region V (y por lo tanto la estructura tridimensional y la especificidad del antfgeno) es el resultado de procesos que alteran la secuencia de la region V causando cambios geneticos irreversibles. Estos cambios se programan durante el desarrollo de celulas B, y tambien pueden ser inducidos en el cuerpo en respuesta a las senales ambientales que activan las celulas B. Varios mecanismos geneticos contribuyen a esta variabilidad. Dos subvfas del mismo mecanismo conducen a dos resultados mutagenicos diferentes, denominados hipermutacion somatica y conversion genica (revisado (Maizels, 2005)). La hipermutacion somatica inserta mutaciones puntuales. La hipermutacion somatica proporciona la ventaja de permitir que se produzca esencialmente cualquier mutacion, de modo que una coleccion de regiones V mutadas ha muestreado esencialmente una gran variedad de posibles mutaciones. La conversion de genes inserta mutaciones que son "moldeadas" por secuencias relacionadas pero no identicas. La conversion genica proporciona la ventaja de crear un repertorio basado en informacion ya almacenada en el genoma, que puede optimizarse mediante la seleccion evolutiva.
El receptor de antfgeno modificado es el objetivo para la seleccion. La Ig se expresa en la superficie celular, lo que permite la seleccion clonal de celulas B con la especificidad o afinidad deseada en un contexto fisiologico o dentro de celulas cultivadas. La Ig de superficie celular se puede detectar facilmente mediante citometna de flujo de celulas tenidas con anti-Ig. La union de moleculas de Ig a compuestos espedficos puede detectarse como interaccion con derivados fluorescentes de dichos compuestos, analizados por citometna de flujo; y las celulas B que se unen a compuestos espedficos tambien se pueden recuperar tras la clasificacion por citometna de flujo. Tambien se pueden seleccionar celulas B que se unen a compuestos espedficos en soportes solidos que llevan dichos compuestos. Por el contrario, la union a soporte solido tambien permite la eliminacion de celulas B con especificidades de union no deseadas. Los ciclos repetitivos de union y liberacion permiten el enriquecimiento para una union de alta afinidad.
La mutacion y la orientacion genica se producen en la lrnea de celulas DT40 B. DT40 es una lrnea de celulas B de pollo que prolifera facilmente en cultivo. La DT40 se ha documentado ampliamente por llevar a cabo la mutagenesis constitutiva de sus genes de inmunoglobulina de cadena pesada y liviana (Reynaud et al., 1987, Thompson and Neiman, 1987, Reynaud et al., 1989). La mutagenesis se dirige a las regiones V. Las mutaciones se modelan normalmente copiando segmentos de genes V no funcionales relacionados, denominados genes "pseudo-V", que estan presentes en una disposicion lineal corriente arriba de cada region V funcional. El modelado es evidente como tramos de secuencia compartidos entre el objetivo V mutado y uno de los genes pseudo-V. Se ha demostrado que las alteraciones geneticas de DT40 causan un cambio de mutagenesis modelada a mutagenesis no modelada, lo que da como resultado una hipermutacion somatica, por una via esencialmente identica a la hipermutacion somatica que altera las secuencias de regiones V en celulas B humanas (Sale et al., 2001). La DT40 tambien ha sido ampliamente documentada por apoyar la recombinacion homologa muy eficiente, o la orientacion genica
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(Buerstedde et al., 2002, Sale, 2004). Esto permite la creacion de derivados en los que genes espedficos o regiones genomicas se han modificado o seccionado; o en los que una region genetica ha sido sustituida por otra.
El documento WO03/061363 describe un metodo para la induccion de mutaciones en genes expresados en celulas eucariotas, que pueden ser utiles para producir anticuerpos con mayor afinidad o especificidad para antigenos expresando un gen de citidina desaminasa inducido por activacion en las celulas.
La EP1568765 describe celulas B geneticamente modificadas con actividad de conversion de genes de inmunoglobulina, capaces de diversificacion genetica dirigida y selectiva de un acido nucleico diana mediante hipermutacion o por hipermutacion y conversion genica.
El documento WO01/59092 describe un metodo para fabricar bacterias hipermutables.
El documento WO02/100998 describe un metodo para preparar una lmea celular capaz de hipermutacion constitutiva dirigida de una region de acido nucleico diana.
Los documentos WO96/01313 y WO94/29442 se dirigen en general al sistema de expresion genica controlado con tetraciclina.
El documento WO96/01313 describe una protema de fusion del activador transcripcional que se une a las secuencias del operador tet y estimula la transcripcion de un gen unido al operador tet en presencia, pero no en ausencia, de la tetraciclina.
El documento WO94/29442 describe animales transgenicos que portan dos transgenes, codificando el primero para una protema fusion de transactivador que comprende un represor tet y un polipeptido que se activa directa o indirectamente en celulas eucariotas y el segundo que comprende un gen unido operativamente a al menos una secuencia operadora tet.
Debido a las limitaciones y desaffos planteados por los enfoques actualmente disponibles para la mutagenesis dirigida, existe una necesidad en la tecnica para el desarrollo de metodos y construcciones alternativos. La presente invencion satisface esta necesidad, y proporciona ademas otras ventajas relacionadas.
RESUMEN DE LA INVENCION
El objeto para el que se busca proteccion es como se define en las reivindicaciones.
En particular, la invencion proporciona una celula B modificada para inducir reversiblemente la diversificacion de un gen diana, comprendiendo la celula B:
(a) un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una region codificadora; y
(b) un constructo de fusion que codifica un factor de fijacion fusionado a un factor de diversificacion, en el que el factor de fijacion se une espedficamente al elemento regulador cis de (a) y el factor de diversificacion induce reversiblemente la diversificacion de la region codificadora.
La invencion satisface estas necesidades y otras proporcionando materiales y metodos para la diversificacion de secuencias diana. La invencion proporciona una celula B modificada para permitir la induccion reversible de la diversificacion de un gen diana. La celula comprende un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana de interes. Un factor que modula la diversificacion puede entonces fusionarse con un factor de fijacion que se une al elemento regulador cis, uniendo asf el factor de diversificacion a la region que controla la expresion del gen diana. La celula B puede ser una celula B de DT40 de pollo u otra celula B de vertebrado, con una celula B humana o una celula B de DT40 de pollo que contiene genes de inmunoglobulina (Ig) humanizados (en los que IgH e IgL humanos reemplazan IgH e IgL de pollo) preferido para algunas realizaciones.
Tfpicamente, el gen diana comprende un promotor y una region codificadora. En una realizacion, el gen diana comprende un gen de inmunoglobulina (Ig), en el que el gen Ig comprende una region potenciadora y codificante del gen Ig. El gen Ig puede ser todo o parte de un gen IgL y/o IgH. La region codificadora puede ser nativa del gen Ig, o un gen heterologo. En algunas realizaciones, el gen diana es o contiene un dominio diana no Ig para la diversificacion, asf como dominios que permiten la visualizacion del producto genico sobre la superficie de la celula B, incluyendo un dominio transmembrana y una cola citoplasmica. La region codificadora del gen diana en la celula B de la invencion no necesita comprender una region codificadora completa. En algunas realizaciones, una region o dominio particular se dirige para la diversificacion, y la region codificadora puede codificar opcionalmente solamente una parte que incluye la region o dominio de interes.
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El elemento regulador cis proporciona una almohadilla de aterrizaje en la region que controla la diversificacion y/o expresion del gen diana. Esta almohadilla de aterrizaje es un lugar al que un factor de fijacion puede unirse de una manera espedfica de secuencia a esta region del ADN. En una realizacion tipica, el elemento regulador cis es un operador de lactosa polimerizado (LacO). En una realizacion, el elemento comprende aproximadamente 80-100 repeticiones de LacO. En otra realizacion, el elemento regulador cis es un operador de tetraciclina unico o multimerizado (TetO). Se puede usar una variedad de moleculas como un elemento regulador cis, siempre y cuando el elemento sirva a la funcion de almohadilla de aterrizaje de proporcionar un lugar al cual un factor de fijacion (una protema de union a ADN espedfica de secuencia) puede unirse al ADN y traer un factor de diversificacion, fusionado al factor de fijacion, en suficiente proximidad de la region codificadora de manera que la diversificacion de la region codificadora sea capaz de una regulacion reversible.
Un factor de fijacion es aquel que se une al elemento regulador cis de una manera espedfica de secuencia. En las realizaciones en las que LacO actua como un elemento regulador cis, el represor de Lac, LacI, puede servir como factor de conexion, y su union al elemento regulador cis, LacO, puede regularse mediante isopropil-p-D-tio- galactosida (IPTG). En ausencia de IPTG, Lacl se une a LacO y la diversificacion se acelera (o se regula de otro modo) por la presencia del factor de diversificacion. Se puede anadir IPTG en el caso de que se desee detener o reducir la actividad del factor de diversificacion. En realizaciones en las que TetO actua como elemento regulador cis, TetR puede ser un factor de fijacion adecuado, y la actividad del factor de diversificacion puede ser regulada por tetraciclina o doxiciclina.
En algunas realizaciones, el factor de diversificacion es un regulador transcripcional, una protema asociada a la heterocromatina, una chaperona de histonas, un remodelador de cromatina, un componente del complejo de poros nucleares, un regulador genico o una combinacion de los mismos. Otras moleculas que pueden servir como un factor de diversificacion incluyen, pero no se limitan a, un factor de reparacion del ADN, un factor de replicacion del ADN, una resolvasa, una helicasa, un regulador del ciclo celular, un factor de ubquitilacion, un factor de sumoilacion o una combinacion de los mismos. En una realizacion, el regulador transcripcional es VP16 o E47 (codificado por E2A). Una protema tfpica asociada a la heterocromatina para su uso como factor de diversificacion es HP1. Un representante de histona chaperona es HIRA.
Tambien se proporciona un metodo para producir un repertorio de polipeptidos que tienen secuencias variantes de un polipeptido de interes a traves de la diversificacion de secuencias de polinucleotidos que codifican el polipeptido. Tfpicamente, el metodo comprende cultivar la celula B de la invencion en condiciones que permiten la expresion del factor de diversificacion, en el que el gen diana de la celula B contiene la region codificadora del polipeptido de interes, permitiendo de este modo la diversificacion de la region codificadora. El metodo puede comprender ademas mantener el cultivo en condiciones que permitan la proliferacion de la celula B hasta que se obtenga una pluralidad de polipeptidos variantes y el repertorio deseado.
En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para producir celulas B que producen un polipeptido optimizado de interes. El metodo comprende cultivar una celula B de la invencion en condiciones que permiten la expresion del factor de diversificacion, en el que el gen diana de la celula B contiene la region codificadora del polipeptido de interes y en el que la celula B expresa el polipeptido de interes en su superficie. El metodo comprende ademas seleccionar celulas del cultivo que expresan el polipeptido de interes en la superficie de celulas B seleccionando celulas que se unen a un ligando que se une espedficamente al polipeptido de interes. Estas etapas de cultivo y seleccion pueden repetirse hasta que se seleccionen celulas que tengan una afinidad deseada para el ligando que se une espedficamente al polipeptido de interes. En las realizaciones en las que el polipeptido de interes es una Ig, tal como una IgL, IgH o ambas, el ligando puede ser un polipeptido, producido por medios recombinantes u otros, que representa un antfgeno. El ligando puede unirse o enlazarse a un soporte solido para facilitar la seleccion, por ejemplo, mediante la seleccion de celulas activadas magneticamente (MACS). En otro ejemplo, el ligando puede enlazarse o unirse a una etiqueta fluorescente, para permitir la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS).
Los metodos de la invencion pueden comprender adicionalmente la adicion de una molecula reguladora al cultivo, en donde la molecula reguladora modula la union del factor de fijacion al elemento regulador cis, modulando asf la diversificacion de la region codificadora. En los ejemplos discutidos anteriormente, IPTG, tetraciclina y doxiciclina sirven como moleculas reguladoras. Los expertos en la tecnica son conscientes de otras moleculas reguladoras que pueden usarse con un factor de fijacion particular para regular la actividad de diversificacion.
La molecula reguladora puede modular la diversificacion de la region codificadora en una variedad de formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molecula reguladora se anade al cultivo para efectuar la modulacion y la modulacion puede resultar en la reduccion o detencion de la diversificacion, o en la mejora o aceleracion de la diversificacion, dependiendo de si la molecula reguladora particular es una que aumenta o disminuye el enlazamiento del factor de fijacion al elemento regulador cis y si este cambio particular en la union tiene el efecto de aumentar o disminuir la actividad de diversificacion. En otras realizaciones, la modulacion, ya sea reduccion, parada o mejora o aceleracion de la modulacion, se efectua extrayendo o eliminando la molecula reguladora del cultivo. Del mismo modo, la modulacion de la diversificacion puede efectuarse anadiendo un gen o eliminando un gen de la celula B, o aumentando o disminuyendo la expresion de un gen en la celula B. Un experto en la tecnica puede
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apreciar facilmente todas las permutaciones disponibles expuestas anteriormente, cada una de las cuales tiene el efecto de alterar el nivel o presencia de una molecula reguladora en la celula B y, a su vez, alterar la fijacion del factor de diversificacion al elemento cis-regulador y alterando as^ la actividad de diversificacion.
Tambien se proporciona un kit que se puede usar para llevar a cabo los metodos de la invencion. El kit comprende una celula B de la invencion y construcciones de fusion que expresan los correspondientes factores de fijacion y diversificacion. Por ejemplo, la celula B comprende un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una region codificadora. El kit comprende ademas uno o mas recipientes, con una o mas construcciones de fusion almacenadas en los recipientes. Cada constructo de fusion comprende un polinucleotido que puede expresarse en la celula B y que codifica un factor de fijacion fusionado a un factor de diversificacion, en el que el factor de fijacion se une espedficamente al elemento cis regulador de la celula B. La celula B puede incluir una pluralidad de elementos reguladores cis para uso con una pluralidad de construcciones de fusion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Ilustracion esquematica de la hipermutacion somatica de anticuerpos. Panel superior: las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un antfgeno de contacto de molecula de Ig. Panel inferior: las mutaciones se concentran en las regiones genomicas que codifican las CDR.
Figura 2. Grafico de barras que muestra el efecto de los reguladores cis atados sobre la diversificacion de genes de Ig en celulas de PoliLacO A DT40. Las tasas de diversificacion clonal se compararon en presencia y ausencia de IPTG.
Figura 3. Ilustracion esquematica de como evolucionan las especificidades de anticuerpos durante la expansion de un clon de celulas B. El anticuerpo se expresa en la superficie celular. La seleccion de una poblacion que inicialmente expresa multiples especificidades (superior izquierda) se enriquece sucesivamente para una especificidad deseada (drculos dobles delgados, centro) y mayor afinidad (drculos gruesos, abajo a la derecha).
Figura 4A-B. Demostracion de que E2A se asocia con el locus de IgA reordenado. Figura 4A: Esquema de los loci de IgA reordenados y no reordenados en la lmea de linfoma de celulas B de pollo, DT40. Se muestran las regiones promotora (P), lfder (L), variable (V), uniendose (J) y constante (CA); la region putativa de union a la matriz (M) en el intron J-C; el potenciador 3' (E-3'); y el mas proximal (^V1) y distal (^V25) de las regiones pseudo-variables no funcionales de arriba que son plantillas para la conversion genica. Los alelos reordenados y no reordenados se pueden distinguir facilmente por PCR, usando cebadores indicados por flechas. Figura 4B: Analisis de ChIP del enriquecimiento de E2A en los AR reordenados y los locus AU no reordenados en celulas DT40, con respecto al amplicon de control genico de ovoalbumina (Ova). El enriquecimiento en dobles se muestra a continuacion. NTC, ningun control de plantilla.
Figura 5A-F. E2A actua en cis para regular la diversificacion de genes IgA. Figura 5A: Esquema del locus de IgA reordenado marcado con PoliLacO. PoliLacO esta integrado entre ^V17-20; Otras nociones como en la figura 4A.
Figura 5B: Perfil de ciclo celular de celulas DT40 y DT40 PoliLacO-AR. Figura 5C: Acumulacion de variantes de perdida de slgM por celulas DT40 y DT40 PoliLacO-XR. Las frecuencias de las variantes de perdida de slgM en 24 subclones de cada lmea se cuantificaron mediante citometna de flujo despues de 6 semanas de expansion clonal. Las frecuencias mostradas se normalizaron a DT40; las frecuencias medias de perdidas de slgM fueron 0.8% y 0.9%, respectivamente. Figura 5D: Perfil del ciclo celular de las celulas PoliLacO-AR GFP-LacI y DT40 PoliLacO-AR E47-LacI de DT40. Figura 5E: Analisis por RT-PCR de la expresion de ARNm de IgA, AID o p-actina en DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl y DT40 PoliLacO-AR E47-LacI transfectantes. Los triangulos indican 30, 10, 3 y 1x concentraciones relativas de plantillas de cDNA. Figura 5F: Perdida media de slgM de los transfectantes DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl (n=13) y DT40 PoliLacO-AR E47-LacI (n=19), cultivados durante 3 semanas en ausencia o presencia de IPTG 100 |jM. Los valores se normalizaron a DT40 PoliLacO-AR GFP-LacI celulas cultivadas sin IPTG.
Figura 6A-B. El radio nuclear se correlaciona con el ciclo celular. Figura 6A: Imagenes representativas de celulas enriquecidas en G1 y G2/M. Las celulas G1 (izquierda) y G2/M (derecha) se tineron con Hoechst 33342 (10 jM, Molecular Probes) y luego se clasificaron en base al contenido de ADN. Barra, 10 jm. Figura 6B: Perfil de ciclo celular representativo de celulas PoliLacO-AR de DT40. Radios medios ± s.d. se muestran como barras horizontales dentro del perfil representativo. Las lmeas verticales punteadas indican los puntos de corte para G1 y G2 utilizados en los analisis experimentales: G1, r <4 jm; G2, r >5.2 jm.
Figura 7A-D. E2A se localiza en AR en la fase G1 del ciclo celular. Figura 7A: Imagen representativa de colocalizacion de AR y E2A en celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl. El penmetro nuclear determinado por tincion con DAPI se delinea mediante la lmea blanca discontinua. Barra, 5 jm. Figura 7B: Fraccion de colocalizaciones de AR/E2A que se producen en cada fase del ciclo celular en celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-LacI. Figura 7C: Imagen representativa de colocalizacion de AR y Pol II activa (P*-Pol II) en celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI. Notaciones
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como en 7A. Figura 7D: Fraccion de colocalizaciones de AR/P*-Pol II que se producen en cada fase del ciclo celular en celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-Lacl.
Figura 8A-F. La expresion de Id1 inhibe AR/E2A colocalizaciones en fase G1. Figura 8A: Transferencia Western que ensaya la expresion de Id1 en celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI (izquierda) y DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI Id1 (derecha). Tamanos del polipeptido marcador (kDa) a la izquierda. Figura 8B: Perfil del ciclo celular de las celulas Id1 de PoliLacO-AR RFP-Lacl DT40 y DT40 PoliLacO-AR RFPLacl. Figura 8C: Perdida media de slgM de los transfectantes DT40 PoliLacO-AR RFP-Lacl Id1 clonales independientes (n=6), cultivados durante 6 semanas. Los valores se normalizaron a celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI. Figura 8D: La expresion de Id1 no altera los niveles de transcripcion de IgA o AID. Analisis por RT-PCR de la expresion de ARNm de control de IgA, AID o p-actina en celulas RFP-LacI de DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI y DT40 PoliLacO-AR RFP-Lacl Id1. Figura 8E: Efecto de la expresion de Id1 sobre la dependencia del ciclo celular de colocalizaciones de AR/E2A en celulas RFP-LacI de PoliLacO-AR de DT40 y un derivado que expresa de forma estable Id1 (Id1 - y +, respectivamente). El porcentaje de colocalizaciones en cada etapa del ciclo celular se muestra. Figura 8F: Efecto de la expresion de Id1 sobre la dependencia del ciclo celular de colocalizaciones de colocalizaciones de AR/P*-Pol II y en celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-Lacl y un derivado que expresa de forma estable Id1. Detalles como en 8E.
Figura 9A-B. Modificacion de la cromatina en el locus IgA de DT40. Figura 9A: Diagrama esquematico del locus de IgA de pollo reordenado, mostrando las regiones de 25 ^VA y el gen de VAR reordenado (lfder, region variable de L, region constante de VA-JA, region de CA) Figura 9B: Resumen de un experimento representativo de transferencia de cromatina, ensayando la acetilacion N-terminal de las histonas H3 y H4 (AcH3 y AcH4). Los sitios interrogados fueron: una region aproximadamente 1 kb corriente arriba de la matriz ^VA (flanco), la region entre ^VA5 y VA, ^VA1, ^VA5, ^VA13, ^VA18; W124; ^VA25 y los alelos VAR reordenados y no reordenados. La barra indica la desviacion estandar.
Figura 10A-B. Fijacion reversible de GFP-LacI a la matriz ^VA en DT40 PoliLacO-AR. Figura 10A: Diagrama esquematico del locus de IgA de pollo reordenado en DT40, con operador de lactosa polimerizado (PoliLacO) insertado entre ^VA17-20. Notaciones como en la Figura 9. Figura 10B: Imagenes fluorescentes de transfectantes DT40 GFP-LacI y DT40 PoliLacO-VAR GFP-LacI transfectantes cultivados en ausencia de IPTG (izquierda); o en presencia de IPTG 100 pM durante la noche (derecha).
Figura 11A-C. El HP1 atado disminuye las modificaciones caractensticas de la cromatina activa. Figura 11A: Imagenes fluorescentes representativas de transfectantes DT40 PoliLacO-VAR LacI-HP1 unicos, tenidos con anticuerpos anti-LacI (izquierda); DAPI (centro); o imagen fusionada (derecha). Figura 11B: Enriquecimiento de H3 (AcH3) y H4 (AcH4) acetilado en ^VA17R en transfectantes LacL-HP1 de PoliLacO-VAR GFP-LacI y DT40 PoliLacO- VAR de DT40. Despues de ChIP, duplex PCR se llevo a cabo con cebadores OVA y ^VA17R. El enriquecimiento se expresa en relacion con el control total de entrada de ADN, ± desviacion estandar de cuatro amplificaciones separadas de cantidades crecientes de ADN plantilla. Figura 11C: Histograma que muestra el enriquecimiento de AcH3 y AcH4 en ^VA17R (del panel B) y el promotor pol £ en los transfectantes LacL-HP1 de PoliLacO-VAR GFP- LacI y DT40 PoliLacO-VAR de DT40. Las barras indican la desviacion estandar.
Figura 12A-C. El HP1 atado no afecta a la expresion de IgA. Figura 12A: Enriquecimiento relativo de AcH3 y AcH4 a VAR en DT40 PoliLacO-VAR GFP-LacI y DT40 PoliLacO-VAR LacI-HP1 transfectantes. Los valores de enriquecimiento se normalizaron con el control DT40 PoliLacO-VAR GFP-LacI. Las barras indican la desviacion estandar de cuatro amplificaciones independientes de cantidades crecientes de ADN plantilla. Figura 12B: Intensidad relativa de la expresion de IgM de superficie celular (slgM) en los transfectantes PoliLacO-AR GFP-LacI (GFP-Lacl) y DT40 PoliLacO-AR LacI-HP1 (Lacl-HP1) DT40 cultivados en presencia y ausencia de IPTG 250 pM. Los niveles de slgM se cuantificaron midiendo la intensidad de la tincion con anticuerpo IgM de raton antipollo y normalizandose al nivel en los transfectantes DT40 PoliLacO-AR GFP-LacI. Detalles como en 12A. Figura 12C: Niveles relativos de los transcritos VAR en los transfectantes de PoliLacO-AR GFP-LacI (GFPLacI) DT40 y DT40 PoliLacO-AR LacI-HP1 (LacI-HP1). Los niveles de transcripcion se cuantificaron mediante RT-PCR y se normalizaron al nivel en transfectantes DT40 PoliLacO-AR GFP-LacI. Detalles como en 12A.
Figura 13A-B. El HP1 atado disminuye la acetilacion de histona a traves de la matriz ^VA. Figura 13A: Resumen de un experimento de transferencia de cromatina, ensayando la acetilacion N-terminal de la histona H3 en cromatina de la lmea celular DT40 PoliLacO-VAR LacI-HP1 cultivada durante 3 dfas en presencia y ausencia de IPTG 250 pM. Los valores de enriquecimiento CHIP (vease el Ejemplo 4) se normalizaron a los valores obtenidos a partir de un analisis paralelo de cromatina a partir de celulas PoliLacO-VAR GFP-Lacl de DT40. Las barras indican la desviacion estandar de cuatro amplificaciones independientes de cantidades crecientes de ADN plantilla. Figura 13B: Resumen de un experimento de transferencia de cromatina, ensayando la acetilacion con N-terminal de las histonas H4 en cromatina de la lmea celular DT40 PoliLacO-VAR LacI-HP1 cultivada durante 3 dfas en presencia y ausencia de IPTG 250 pM. Detalles como en 13A.
Figura 14A-E. Mutacion no planificada y con plantilla promovida por HP1 atado. Figura 14A: ensayo de fluctuacion de perdidas de slgM de paneles de DT40 PoliLacO-VAR GFP-Lacl (n=27) independiente y DT40 PoliLacO-VAR LacI- HP1 (n=16). La figura muestra datos combinados de al menos dos transfectantes independientes para cada
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constructo de fusion. Las tasas medias de diversificacion se muestran a continuacion. Figura 14B: Resumen del analisis de secuencias de regiones VA que llevan mutaciones unicas, a partir de los transfectantes PoliLacO-VAR GFP-LacI (n=78) y DT40 PoliLacO-VAR LacI-HP1 (n=36), analizados por PCR de celula unica. Se reunieron las secuencias de dos transfectantes independientes.
Figura 15. Alineacion de secuencia de clones de LacI-HP1 de PoliLacO-AR DT40 Mutadas. Secuencias de 14 regiones VA unicas, mutadas a partir de celulas LacL-HP1 de PoliLacO-AR DT40 diversificadas. Las cajas de color azul describen las secciones de conversion de genes; los drculos rojos denotan mutaciones puntuales; las cajas punteadas negras indican inserciones no planificadas; los triangulos anaranjados denotan eliminaciones. Se presenta la secuencia madre de la region DT40 (SEQ ID NO: 31), indicandose los lugares de mutacion.
Figura 16A-E. La conversion de genes Ig es acelerada por VP16 atada a la matriz ^VA. Figura 16A: Diagrama esquematico del locus de IgA de pollo reordenado en DT40, con operador de lactosa polimerizado (PoliLacO) insertado entre ^VA17-20. Lfder, L; region variable reordenada, VA-JA; region constante, CA. Figura 16B: Analisis de transferencia Western de expresion de GFP-LacI o GFP-LacI-VP16 en los transfectantes indicados. La expresion se ensayo mediante transferencia con anticuerpos anti-Lacl, en relacion con el control de la p-accion. Figura 16C: Perfil del ciclo celular de los transfectantes PoliLacO-A GFP-Lacl DT40 y DT40 PoliLacO-A GFP-LacI-VP16. Figura 16D: Cuantificacion de la comparacion de RT-PCR de los niveles de transcripcion de VA en DT40 PoliLacO-A GFP-LacI y DT40 PoliLacO-A GFP-LacI-VP16 transfectante, normalizado a DT40 PoliLacO-A GFP-LacI. Figura 16E: Imagen fluorescente de transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-LacI-VP16. Las flechas indican GFP-LacI-VP16 unido a IgA. Los nucleos se contrastaron con DAPI (azul).
Figura 17A-C. Los niveles de AcH3 y AcH4 se incrementan y la conversion de genes Ig es acelerado por VP16 atado a la matriz ^VA. Figura 17A: Enriquecimiento de H3 (AcH3) acetilado a IgA en transfectantes de PoliLacO-A GFP- LacI-VP16 de DT40. Despues de ChIP, duplex PCR se llevo a cabo con cebadores OVA y ^VA17R. El enriquecimiento se expresa en relacion con el control total de entrada de ADN, ± desviacion estandar de cuatro amplificaciones separadas de cantidades crecientes de ADN plantilla. Figura 17B: Enriquecimiento de H4 (AcH4) acetilado a IgA en transfectantes de PoliLacO-A GFP-LacI-VP16 de DT40. Notaciones como en 17A. Figura 17C: Perdida mediana de slgM en paneles de transfectantes independientes DT40 PoliLacO-A GFP-LacI-VP16, normalizados a los transfectantes DT40 PoliLacO-VA GFP-LacI. La figura muestra datos combinados de al menos dos transfectantes independientes para cada constructo de fusion. A continuacion se muestra el aumento de pliegue con respecto a los transfectantes DT40 PoliLacOVA GFP-LacI de control.
Figura 18A-B. La variante de histona H3.3 se enriquece en el locus IgA de DT40. Figura 18A: Diagrama esquematico del locus de IgA de pollo reordenado en DT40. Notaciones como en la Figura 16A. Figura 18B: Resumen de un experimento de transferencia de cromatina representativo, ensayando la variante de histona H3.3. Los sitios interrogados fueron: una region aproximadamente 1 kb corriente arriba de la matriz ^VA (flanco); La region entre YVA5 y VA; WA1; ^VA5; WA13; ^VA18; ^VA24; WA25; y el alelo VAR reordenado. Las barras indican la desviacion estandar.
Figura 19A-E. La conversion del gen Ig es acelerada por HIRA atada a la matriz ^VA. Figura 19A: Analisis de transferencia Western de expresion de GFP-LacI o HIRA-Lacl en los transfectantes indicados. La expresion se ensayo mediante transferencia con anticuerpos anti-Lacl, en relacion con el control de la p-accion. Figura 19B: Perfil del ciclo celular de los transfectantes PoliLacO-A GFP-LacI de DT40 y DT40 PoliLacO-A HIRA-LacI. Figura 19C: Cuantificacion de la comparacion de RT-PCR de los niveles de transcripcion de VA en los transfectantes PoliLacO-A GFP-LacI de DT40 y DT40 PoliLacO-A HIRA-LacI, normalizados a DT40 PoliLacO-A GFP-LacI. Figura 19E: Imagen fluorescente de los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-LacI-VP16. Las flechas indican GFP-LacI-VP16 unido a IgA. Los nucleos se contrastaron con DAPI (azul).
Figura 20A-C. La variante de histona H3.3 se enriquece y la conversion de genes se acelera por HIRA anclada en DT40 PoliLacO-A. Figura 20A: Enriquecimiento de H3.3 (verde) y pan H3 (azul) en ^VA17R en celulas DT40 PoliLacO-A y DT40 PoliLacO-A HIRA-LacI que expresan H3.3-FLAG. Se muestran los resultados para dos lmeas independientes de DT40 PoliLacO-A HIRALacI. El enriquecimiento de DT40 PoliLacO-A se normaliza a un valor de "1". Las barras se muestran con ± desviaciones estandar de cuatro amplificaciones independientes de cantidades crecientes de ADN plantilla. Figura 20B: Citometna de flujo de celulas slgM+ en poblaciones representativas de celulas PoliLacO-GFP-LacI de DT40 y celulas PoliLacO-A HIRA-LacI de DT40. Figura 20C: Perdida mediana de slgM en paneles de transfectantes independientes DT40 PoliLacO-A HIRA-LacI y DT40 HIRA, normalizados a los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl. La figura muestra datos combinados de al menos dos transfectantes independientes para cada constructo de fusion. A continuacion se muestra el aumento de pliegues con respecto a los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-LacI de control.
Figura 21A-B. Distintos efectos de la cromatina de HIRA y VP16. Figura 21A: Analisis de transferencia Southern de la region PoliLacO en los transfectantes PoliLacO-A GFP-LacI, DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16 y DT40 PoliLacO-A HIRALacI de DT40, despues de la digestion de la cromatina con nucleasa micrococcica (MNasa). No MNasa, (-). Los numeros a la derecha denotan multfmeros nucleosomicos. Figura 20B: Modelo de como la deposicion elevada de histonas podna ser responsable de un patron de “escalamiento” acentuado de la cromatina. Las puntas de flecha
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indican posibles sitios de escision de MNasa. Las puntas de flecha oscura indican un rango restringido de ADN escindible, y las puntas de flecha gris sugieren una amplia gama de ADN escindible para generar desviaciones del producto predicho de division de ~150 pb.
Figura 22. Secuencias de regiones V mutadas a partir de celulas DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16. Las regiones V se amplificaron a partir de celulas slgM individuales y luego se secuenciaron. Las casillas azules claras describen los eventos de conversion genica de largo tracto; las cajas con sombreado azul describen los eventos de conversion genica de tracto corto; drculos rojos denotan mutaciones puntuales; las cajas punteadas negras indican las inserciones; los quilates denotan supresiones.
Figura 23. Secuencias de regiones V mutadas a partir de celulas DT40 PoliLacO-A HIRA-Lacl. Notaciones como en la Figura 22.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion se basa en el desarrollo de lmeas de celulas B en las que la mutagenesis de un gen de inmunoglobulina diana es inducible. La inmunoglobulina se expresa en la superficie celular, permitiendo la seleccion de clones que expresan moleculas de inmunoglobulina con especificidades particulares, afinidades incrementadas, y/o nuevas actividades. Esto puede llevarse a cabo con genes de inmunoglobulina y tambien no inmunoglobulina en el sitio diana.
DEFINICIONES
Todos los terminos cientificos y tecnicos usados en esta solicitud tienen significados comunmente usados en la tecnica a menos que se especifique lo contrario. Tal como se utiliza en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.
Tal como se usa en el presente documento, "polipeptido" incluye protemas, fragmentos de protemas y peptidos, ya sea aislados de fuentes naturales, producidos por tecnicas recombinantes o sintetizados qmmicamente. Los peptidos de la invencion tipicamente comprenden al menos aproximadamente 6 aminoacidos.
Como se usa en el presente documento, la "diversificacion" de un gen diana significa un cambio o mutacion en secuencia o estructura del gen diana. La diversificacion incluye los procesos biologicos de hipermutacion somatica, la conversion genica y la recombinacion de conmutacion de clase, que pueden dar como resultado mutacion puntual, eliminacion del ADN de mutacion con plantilla e insercion de ADN. Los factores de diversificacion de la invencion pueden inducir, mejorar o regular cualquiera de estos metodos de diversificacion.
Una "mutacion" es una alteracion de una secuencia polinucleotfdica, caracterizada por una alteracion en una o mas bases de nucleotidos, o por una insercion de uno o mas nucleotidos en la secuencia, o por una eliminacion de uno o mas nucleotidos de la secuencia, o una combinacion de estos.
Como se usa en el presente documento, un "elemento regulador cis" es una secuencia de ADN posicionada en una region que controla la expresion o diversificacion de un gen. Un factor de fijacion se une de una manera espedfica de secuencia a esta region del ADN. Los elementos cis-reguladores representativos incluyen, pero no se limitan a, LacO y TetO.
Tal como se usa en el presente documento, un “factor de fijacion” es una molecula que se une al elemento regulador cis de una manera espedfica de la secuencia. Un ejemplo de un factor de fijacion es un "represor", una protema que es sintetizada por un gen regulador y se une a un locus del operador, bloqueando la transcripcion de ese operon. Ejemplos de factores de fijacion incluyen, pero no se limitan a, Lacl y TetR.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "factor de diversificacion" se refiere a una molecula que acelera o regula la diversificacion o la hipermutacion. Los factores de diversificacion representativos incluyen algunos identificados inicialmente como reguladores transcripcionales (por ejemplo, VP16 o E47), una protema asociada a heterocromatina (por ejemplo, HP1), una chaperona de histonas (HIRA), un remodelador de cromatina, un componente del complejo de poros nucleares (NUP153), un regulador genico o una combinacion de los mismos. Otras moleculas que pueden servir como un factor de diversificacion incluyen, pero no se limitan a, un factor de reparacion del ADN, un factor de replicacion del ADN, una resolvasa, una helicasa, un regulador del ciclo celular, un factor de ubiquitilacion, un factor de sumoilacion o una combinacion de los mismos.
Como se usa en el presente documento, "promotor" significa una region de ADN, generalmente corriente arriba (5') de una region codificadora, que controla al menos en parte la iniciacion y el nivel de transcripcion. La referencia en este documento a un "promotor" debe tomarse en su contexto mas amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genomico clasico, incluyendo una caja TATA o un promotor de caja no TATA, asf como elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresion genica en respuesta a estfmulos de desarrollo y/o ambientales, o de una manera espedfica de tejido o de
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tipo celular. Un promotor esta normalmente, pero no necesariamente, situado corriente arriba o 5', de un gen estructural, cuya expresion regula. Ademas, los elementos reguladores que comprenden un promotor se situan habitualmente dentro de los 2 kb del sitio de inicio de la transcripcion del gen, aunque tambien pueden estar a muchos kb de distancia. Los promotores pueden contener elementos reguladores espedficos adicionales, situados mas distales al sitio de inicio para mejorar adicionalmente la expresion en una celula, y/o para alterar el tiempo o la inducibilidad de la expresion de un gen estructural al que esta conectado operativamente.
Tal como se usa en el presente documento, "conectado operativamente" o "unido operativamente" y similares significa un enlace de elementos polinucleotidicos en una relacion funcional. Un acido nucleico esta "unido operativamente" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia codificante. Unida operativamente significa que las secuencias de acido nucleico que estan unidas son tfpicamente contiguas y, cuando es necesario unirse a dos regiones codificadoras de protemas, contiguas y en el marco de lectura. Por "union operativa" de un promotor a un polinucleotido transcriptible se entiende colocar el polinucleotido transcriptible (por ejemplo, la protema que codifica el polinucleotido u otro transcrito) bajo el control regulador de un promotor, que controla entonces la transcripcion y opcionalmente la traduccion de ese polinucleotido.
El termino "acido nucleico" o "polinucleotido" se refiere a un polfmero de desoxirribonucleotido o ribonucleotido en forma de cadena sencilla o doble, y a menos que se limite de otro modo, abarca analogos conocidos de nucleotidos naturales que se hibridan con acidos nucleicos de una manera similar a nucleotidos naturales.
Tal como se utiliza en el presente documento, "un" o "una" significa al menos uno, a menos que se indique claramente lo contrario.
Celulas B
La invencion proporciona una celula B modificada para permitir la induccion reversible de la diversificacion de un gen diana. La celula comprende un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana de interes. Un factor que modula la diversificacion puede fusionarse entonces con un factor de fijacion que se une al elemento regulador cis, uniendo asf el factor de diversificacion a la region que controla la expresion del gen diana. La celula B puede ser una celula B de DT40 de pollo u otra celula B de vertebrado, con una celula B humana o una celula B de DT40 de pollo que contiene genes de inmunoglobulina (Ig) humanizados (en los que IgH e IgL humanos reemplazan IgH e IgL de pollo) preferido para algunas realizaciones.
Las celulas B son productores naturales de anticuerpos, haciendolas una celula atractiva para la produccion de anticuerpos mejorados y protemas y polipeptidos no inmunoglobulinas mejoradas. Las celulas DT40 B son un punto de partida efectivo para la evolucion de anticuerpos espedficos y de alta afinidad por ciclos iterativos de hipermutacion y seleccion (Cumbers et al., 2002; Seo et al., 2005). Las celulas DT40 tienen varias ventajas sobre otros vehmulos probados para este proposito. DT40 diversifica constitutivamente sus genes de Ig en cultivo, y se dirige a mutaciones a las CDR de las moleculas de anticuerpo expresadas. DT40 prolifera mas rapidamente que las lmeas de celulas B humanas (tiempo de generacion de 10-12 h, en comparacion con las 24 h); las poblaciones clonales pueden aislarse facilmente debido a que las celulas son facilmente clonadas por dilucion limitante, sin adicion de factores especiales o capas de alimentacion; y DT40 lleva a cabo la identificacion de genes homologos eficientes (Sale, 2004), por lo que se pueden reemplazar loci espedficos a voluntad, permitiendo manipular factores que regulan la hipermutacion.
La invencion proporciona una nueva plataforma para generar anticuerpos de alta afinidad. En una realizacion, el vehmulo para la evolucion de anticuerpos es una lmea de celulas B, DT40, que produce anticuerpos de manera natural, y que ha sido modificada geneticamente para hacer acelerar e inducir la hipermutacion del gen de la inmunoglobulina. Al igual que otras celulas B, DT40 expresa anticuerpos en la superficie celular, permitiendo la seleccion clonal conveniente para alta afinidad y especificidad optimizada, por fluorescencia o clasificacion de celulas activadas magneticamente. En la lmea celular DT40, la hipermutacion se lleva a cabo por la misma via que se ha perfeccionado durante millones de anos de evolucion de vertebrados a la hipermutacion del gen Ig en un contexto fisiologico. Esta via altamente conservada se dirige a las mutaciones preferentemente (aunque no exclusivamente) a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), los subdominios de las regiones variables (V) que hacen contacto con el antfgeno (Figura 1).
Hasta ahora, el uso de DT40 (y otras lmeas de celulas B cultivadas) para la seleccion de anticuerpos ha sido limitado debido a que la velocidad de hipermutacion es muy lenta, aproximadamente 0.1%-1% de la hipermutacion fisiologica. Para acelerar la hipermutacion, los principales sitios y factores reguladores han sido manipulados, aprovechando nuestra sofisticada comprension actual de los mecanismos moleculares de la hipermutacion.
Aunque las celulas B de DT40 de pollo ofrecen muchas ventajas, en algunas realizaciones puede ser deseable utilizar celulas B humanas. Alternativamente, se pueden emplear genes Ig humanizados con las celulas B DT40 de pollo. Mediante la humanizacion de los genes de la inmunoglobulina DT40, la utilidad de esta plataforma para
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terapeutica puede ampliarse, ya que los anticuerpos generados en la plataforma DT40 podnan usarse directamente para el tratamiento.
Existe una amplia documentacion sobre la utilidad de los genes de anticuerpos humanizados y varios enfoques validados para la humanizacion, tal como se ha revisado recientemente (Waldmann y Morris, 2006; Almagro y Fransson, 2008). La humanizacion se efectua mediante la sustitucion de los genes Ig humanos por los genes Ig de pollo, y esto se hace facilmente en DT40 aprovechando el alto rendimiento de la direccion genica homologa. Las sustituciones se llevan a cabo por procedimientos analogos a los descritos en los ejemplos a continuacion para insertar elementos reguladores cis, pero utilizando diferentes construcciones de orientacion que estan disenadas para modificar partes distintas de los loci de cadena pesada y liviana. La sustitucion podna producir derivados de DT40 que generan anticuerpos completamente humanizados, intercambiando regiones V(D)J y C; o anticuerpos quimericos (regiones C humanizadas pero no regiones V). Estos reemplazos no alteraran los elementos cis- reguladores adyacentes ni afectaran su capacidad para acelerar la hipermutacion. Los mecanismos conservados que promueven la hipermutacion dirigiran la mutagenesis a las CDR de las secuencias humanizadas. La lmea humanizada puede usarse asf para el desarrollo acelerado de monoclonales humanos en cultivo celular, proporcionando una plataforma doble para la produccion rapida de anticuerpos utiles para propositos terapeuticos o diagnosticos.
Ademas, se puede optimizar la funcion efectora del anticuerpo mediante la sustitucion de la region C. La inmunoterapia basada en anticuerpos es un enfoque poderoso para la terapia, pero este enfoque hasta ahora ha sido limitado en parte por la disponibilidad de anticuerpos espedficos con propiedades efectoras utiles (Hung et al., 2008; Liu et al., 2008). La region constante (C) de un anticuerpo determina la funcion efectora. Pueden prepararse sustituciones de regiones C humanas nativas o modificadas por ingeniena genetica mediante la orientacion de genes homologos en el vehmulo DT40 para generar anticuerpos con la funcion efectora deseada.
Genes diana
Tfpicamente, el gen diana comprende un promotor y una region codificadora. La region codificadora del gen diana en la celula B de la invencion puede ser aquella que codifica cualquier protema o peptido de interes, y no necesita comprender una region codificadora completa. En algunas realizaciones, una region o dominio particular se dirige para la diversificacion, y la region codificadora puede codificar opcionalmente solo una porcion que incluye la region o dominio de interes.
En una realizacion, el gen diana comprende un gen de inmunoglobulina (Ig), en el que el gen Ig comprende una region potenciadora y codificadora del gen Ig. El gen Ig puede ser todo o parte de un gen IgL y/o IgH. La region codificadora puede ser nativa del gen Ig, o un gen heterologo. En algunas realizaciones, el gen diana es o contiene un dominio diana no Ig para la diversificacion, asf como dominios que permiten la visualizacion del producto genico sobre la superficie de la celula B, incluyendo un dominio transmembrana y una cola citoplasmica.
Elemento cis-regulador
El elemento regulador cis proporciona una almohadilla de aterrizaje en la region que controla la expresion del gen diana. Esta almohadilla de aterrizaje proporciona un lugar al que un factor de fijacion puede unirse de una manera espedfica de secuencia a esta region del ADN. Se puede utilizar una variedad de moleculas como elementos reguladores cis, siempre y cuando el elemento sirva a la funcion de almohadilla de aterrizaje de proporcionar un lugar al cual un factor de fijacion (una protema de union a ADN espedfica de secuencia) puede unirse al ADN y aportar una diversificacion, fusionado al factor de fijacion, en suficiente proximidad de la region codificadora de manera que la diversificacion de la region codificadora sea capaz de una regulacion reversible. En una realizacion tfpica, el elemento regulador cis es un operador de lactosa polimerizado (LacO). En una realizacion, el elemento comprende aproximadamente 80-100 repeticiones de LacO. En otra realizacion, el elemento regulador cis es un operador de tetraciclina (TetO).
Factores de fijacion y diversificacion
Un factor de fijacion es aquel que se une al elemento regulador cis de una manera espedfica de la secuencia. En algunas realizaciones, la regulacion de la diversificacion se logra utilizando un factor de fijacion caracterizado por la union regulable al elemento regulador cis. En las realizaciones en las que LacO actua como un elemento regulador cis, el represor de Lac, LacI, puede servir como factor de conexion, y su union al elemento regulador cis, LacO, puede regularse mediante isopropil-p-D-tio-galactosida (IPTG). En ausencia de IPTG, LacI se une a LacO y la diversificacion se acelera (o se regula de otro modo) por la presencia del factor de diversificacion. IPTG puede ser anadido en el caso de que una suspension o reduccion de la actividad del factor de diversificacion se desea, por lo que el proceso de mutagenesis es reversible. En realizaciones en las que TetO actua como elemento regulador cis, TetR puede ser un factor de fijacion adecuado, y la actividad del factor de diversificacion puede ser regulada por tetraciclina o doxiciclina.
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Un factor de diversificacion es aquel que permite la modulacion de la mutagenesis en la celula B. Los ejemplos a continuacion describen los efectos del atar y liberar varios factores reguladores. Uno, la protema heterocromatina HP1, hipermutacion acelerada 5.6 veces (Ejemplo 4); otro, E47-LacI (E47 es una isoforma del regulador E2A, cntica para el desarrollo de celulas B), hipermutacion acelerada 4.5 veces (Ejemplo 3); y otros dos modificadores de estructura de cromatina de hipermutacion acelerada 8.4 veces y 11.0 veces (Figura 2). Ademas, se ha dirigido un sitio de fijacion al locus de cadena pesada de Ig expresado. La doble regulacion de la hipermutacion en IgH e IgL puede acelerar la hipermutacion de 25 a 100 veces, permitiendo la produccion rapida de nuevos anticuerpos.
Diversificacion de genes de inmunoglobulina se mueven dentro del nucleo en el curso del ciclo celular, y este movimiento se correlaciona con y es necesario para la diversificacion. La union a los poros nucleares mediante la expresion de NP153-LacI en celulas DT40 PoliLacO-A (utilizando metodos descritos en los ejemplos a continuacion) acelera la diversificacion 5.7 veces. Este resultado predice que otros factores que regulan la posicion del gen tambien regulan la diversificacion, incluyendo otras protemas de poros nucleares y otros factores que determinan o regulan la posicion del gen en el nucleo.
La estructura de cromatina regula la diversificacion tambien. Los datos del Ejemplo 4 muestran que la expresion de la protema heterocromatina HP1 fusionada a LacI acelera la diversificacion y que este efecto es reversible por IPTG. Este hallazgo se ha extendido a la histona chaperona, HIRA.
Los reguladores de la expresion o funcion genica tambien sirven como factores de diversificacion. El Ejemplo 3 siguiente muestra que la expresion del factor regulador E2A (expresado como la isoforma E47, como una fusion Lacl) acelera la diversificacion, y que este efecto es reversible por IPTG. El dominio regulador VP16 del virus del herpes acelera la diversificacion, y que este efecto es reversible por IPTG.
La desaminacion tambien acelera la mutagenesis, pero no es inducible. La AID es la desaminasa de ADN espedfica de celulas B que inicia la diversificacion de genes de Ig. El Ejemplo 2 siguiente muestra que la union de AID (AID- LacI) en DT40 PoliLacO-A promueve la mutagenesis, pero que IPTg no supera este efecto. Por lo tanto, parece que los efectos mutagenicos son de todo el genoma, haciendo este factor inadecuado, sin mas modificaciones.
En algunas realizaciones, el factor de diversificacion es un regulador transcripcional, una protema asociada a la heterocromatina, una chaperona de histonas, un remodelador de cromatina, un componente del complejo de poro nuclear, un regulador de gen o una combinacion de los mismos. Otras moleculas que pueden servir como un factor de diversificacion incluyen, pero no se limitan a, un factor de reparacion del ADN, un factor de replicacion del ADN, una resolvasa, una helicasa, un regulador del ciclo celular, un factor de ubquitilacion, un factor de sumoilacion o una combinacion de los mismos. En una realizacion, el regulador transcripcional es VP16 o E47 (codificado por E2A). Una protema tfpica asociada a la heterocromatina para su uso como factor de diversificacion es HP1. Un representante de histona chaperona es HIRA.
Tabla 1: Factores de diversificacion representativos
Activadores transcripcionales
VP16
NeuroD TFIIB A13, B1,
E47
NPAS TFIID B2, B3
E12
OLIG TFIIE B4, B5, B6,
Myc
TAL1 TFIIF B7,
c-Fos
Twist TFIIH B8, B9, B13,
c-Jun
USF1 GFI1 C4,
BACH
MAX HIC C5, C6, C8,
BATF
MITF HIVEF C9,
BLZF1
MNT IKZF C10, C11,
C/EBP
MLX ILF C13, D1, D3
CREB
MXI1 KLF D4, D8, D9
CREM
SREBP MTF1 D10, D11,
DBP AP-2 MYT1 D12, D13
DDIT3 CAR OSR1 HOPX
5
GABPA FXR Sp1 MEIS
HLF LXR Zbtb7 MEOX2
MAF PPAR ZB1 MNX1
10
NFE PXR HIVEP1 MSX
NRL RAR AIRE NANOG
15
NRF1 ROR DIDO1 NKX
XBP1 Rev-ErbA GRLF1 PHF
ATOH1 HNF4 ING POU dominio
20
AhR PNR JARID protemas
AHRR RXR JMJD1B OTX
25
ARNT NUR ARX PDX
ASCL1 GCNF CDX PAX
BHLHB2 DAX1 CRX E2F (1-5)
30
BMAL GATA CUTL1 protemas FOX
CLOCK ATBF1 DLX HSF
35
EPAS1 CTCF EMX2 ELF
HAND E4F1 EN EGF
HES EGR FHL ELK
40
HEY ERV3 ESX1 ERF
HIF ATBF1 HHEX ERG
45
ID BCL HLX ETS
LYL1 CTCF Homobox ETV
MXD4 E4F1 (A1, A3, A4, FLI1
50
MYCL1 EGR A5, MYB
MYCN ERV3 A7, A9, A10 MYBL2
55
MyoD TFIIA A11 NF-kB
NFAT SRY RBL2 NFI
STAT SSRP1 Apetala 2 NFY
60
CSDA EREBP Rho/Sigma
Mef2 YBX1 B3 R-SMAD
65
SRF CBF ARID
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HNF (1A, 1B)
HMGA CAP
HBP1 IFI
LEF1
Rb MLL
SOX
RBL1 MNDA
Protemas asociadas a la heterocromatina Chaperonas de histona0
Protemas Polycomb Cromatina
HP1a
HP1a
Protemas Trithorax Remodeladores
HP1b
HIRA Nucleolin
HP1c
ASF1a Rtt106
ASFb NAP1
CAF1 NAP2
Spt6
Reparacion del ADN
XRCC2 HAP1 CSB
BRG1
DMC1 APE1 XPV
BAF
RAD52 ADN EndoV
PBAF
RecA polimerasa MSH2
BRM
RecB b MSH3
Rdh54
RecC ADN Ligasa MSH5
XRCC3
RecD I MSH6
FANCD2
MRE11 XRCC1 MLH1
FANCI
RAD50 PARP PMS2
CtIP
XRS2/NBS1 XPA EXO1
Rad54
KU70 XPB POLH
Rad51
KU80 XPC POLI
BRCA1
SAE2 XPD REV1
BRCA2
DNA-PK XPE POLQ
RAD51 B
DNA Ligasa XPF
RAD51C
iV XPG
RAD51 D
UNG CSA
Replicacion del ADN
Resolvasas y Helicasas Reguladores del ciclo celular
PCNA
RPA RuvC CHK1
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Smc1
RusA CHK2
Smc3
RuvB p53
Rad21/Mcd1/Scc1
RuvC p27
Estromalina/Scc3
RecQ
Scc2
hRECQ5
Scc4
WRN
Pds5
BLM
Eco1
Srs2
Rec8
hRECQ1/L
RTS/hRECQ4
Gen
HASPIN MLL3 SET1A
Regulacion
MLL1 MLL4 SET1 B
CARM1
MLL2 MLL5 SET7/9
ASH1
JMD2A/JHDM NSD1 Sc ESA1
LSD/BHC110
3A MYD2 SIRT2
PRMT5
JMJD2B SET2 SIR2
SUV39H1
JMJD2C/GAS JHDM1a SUV4-20H1
SUV39H2
C1 JHDMIb SUV4-20H2
SETDB1/ESE
JMJ2D2D Sc RTT109 PR-SET7/8
T
JHDM2a DOT1 SET9
EuHMT-asa/GL
JHDM2b CKII Bmi/Anillo 1A
P
AuroraB PRMT4 MST1
G9a
CBP/p300 PRMT5 RNF20/RNF40
CLL8
EZH2 HBO1 UbcH6
RIZ1
MSK1 Sc HAT1
PCAF
MSK2 TIP60
GCN5
FPR4 HOB1
Complejo de poros nucleares
Nup153
Nup98
CRM1
otros componentes de poros estables y dinamicos Ubiquitilacion IAP
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E1
Cdc34
E2
Rbx1 Sumoilacion
E3
NEDD8/Rub1 Ubc9
26S proteasoma
SCF/Grr1 SAE1/Aos1
E6
SCF/Met30 SAE2/Uba2
VHL
SCF/Fbw7/hCdc4 SUMOE2
MDM2
Cuelp PIAS
BAP1
Ubc7p UIp1
BARD1
Ubclp Siz1
CBL
CHIP Siz2
SCF/Skp2
Hsp/c70/90 SUMO E1
Skp1
Parkin SUMO E3
Cul1/Cdc53
NEDD4-2 Nse2 (Mms21)
DUB
Csn5 UIp2
Constructos de fusion
La fijacion de un factor de diversificacion al elemento regulador cis se consigue mediante la fusion del factor de diversificacion con un factor de fijacion. Los constructos de fusion que codifican esta combinacion de factores pueden estar presentes y ser expresadas por la celula B de la invencion y tambien pueden proporcionarse separadamente para anadirse a la celula B en el momento deseado y al seleccionar los factores deseados para un objetivo particular.
Los constructos de fusion se pueden preparar generalmente usando tecnicas estandar. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican los componentes peptidicos pueden ser ensambladas por separado, y ligadas en un vector de expresion apropiado. Las secuencias de ADN ligadas estan unidas operativamente a elementos reguladores transcripcionales o de traduccion adecuados. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente peptfdico se liga, con o sin un enlazante peptfdico, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente peptfdico de manera que los marcos de lectura de las secuencias estan en fase. Esto permite la traduccion en una unica protema de fusion que retiene la actividad biologica de ambos peptidos componentes.
Se puede emplear una secuencia enlazante peptfdica para separar el primer y el segundo componentes peptfdicos a una distancia suficiente para asegurar que cada peptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias. Dicha secuencia enlazante peptfdica se incorpora en la protema de fusion usando tecnicas estandar bien conocidas en la tecnica. Las secuencias enlazantes peptfdicas adecuadas pueden elegirse basandose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformacion extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con regiones funcionales sobre el primer y segundo peptidos; y (3) la falta de residuos hidrofobos o cargados que podnan reaccionar con las regiones funcionales peptfdicas. Las secuencias enlazantes peptfdicas preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. Otros aminoacidos casi neutrales, tales como Thr y Ala tambien pueden usarse en la secuencia enlazante.
Metodos y usos de la invencion
La invencion proporciona un metodo para producir un repertorio de polipeptidos que tienen secuencias variantes de un polipeptido de interes a traves de la diversificacion de secuencias de polinucleotidos que codifican el polipeptido. Tfpicamente, el metodo comprende cultivar la celula B de la invencion en condiciones que permiten la expresion del factor de diversificacion, en el que el gen diana de la celula B contiene la region codificadora del polipeptido de interes, permitiendo de este modo la diversificacion de la region codificadora. El metodo puede comprender ademas mantener el cultivo en condiciones que permitan la proliferacion de la celula B hasta que se obtenga una pluralidad de polipeptidos variantes y el repertorio deseado. Debido a que las celulas B expresan los polipeptidos en la superficie externa, se puede determinar la naturaleza y extension del repertorio. El repertorio puede utilizarse entonces para la seleccion de polipeptidos que tienen propiedades deseadas.
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En otra realizacion, la invencion proporciona un metodo para producir celulas B que producen un polipeptido optimizado de interes. El metodo comprende cultivar una celula B de la invencion en condiciones que permiten la expresion del factor de diversificacion, en el que el gen diana de la celula B contiene la region codificadora del polipeptido de interes y en el que la celula B expresa el polipeptido de interes en su superficie. El metodo comprende ademas seleccionar celulas del cultivo que expresan el polipeptido de interes en la superficie de celulas B seleccionando celulas que se unen a un ligando que se une espedficamente al polipeptido de interes. Estas etapas de cultivo y seleccion pueden repetirse hasta que se seleccionen celulas que tengan una afinidad deseada para el ligando que se une espedficamente al polipeptido de interes. La evolucion de las especificidades de anticuerpos durante la expansion de un clon de celulas B se ilustra en la Figura 3. La seleccion de una poblacion que expresa inicialmente multiples especificidades (superior izquierda) enriquece sucesivamente para una especificidad deseada (centro) y afinidad superior (abajo a la derecha).
En las realizaciones en las que el polipeptido de interes es una Ig, tal como una IgL, IgH o ambas, el ligando puede ser un polipeptido, producido por medios recombinantes u otros, que representa un antigeno. El ligando puede unirse o enlazarse a un soporte solido para facilitar la seleccion, por ejemplo, mediante la seleccion de celulas activadas magneticamente (MACS). En otro ejemplo, el ligando puede unirse o enlazarse a una etiqueta fluorescente, para permitir la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Los expertos en la tecnica aprecian que otros metodos de etiquetado y seleccion de celulas son conocidos y pueden usarse en este metodo.
Los metodos de la invencion pueden comprender adicionalmente la adicion de una molecula reguladora al cultivo, en donde la molecula reguladora modula la union del factor de fijacion al elemento regulador cis, modulando asf la diversificacion de la region codificadora. En los ejemplos discutidos anteriormente, IPTG, tetraciclina y doxiciclina sirven como moleculas reguladoras. Los expertos en la tecnica son conscientes de otras moleculas reguladoras que pueden usarse con un factor de fijacion particular para regular la actividad de diversificacion.
La molecula reguladora puede modular la diversificacion de la region codificadora de una variedad de maneras. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la molecula reguladora se anade al cultivo para efectuar la modulacion y la modulacion puede resultar en la reduccion o detencion de la diversificacion, o en la mejora o aceleracion de la diversificacion, dependiendo de si la molecula reguladora particular es una que aumenta o disminuye la union del factor de fijacion al elemento regulador cis y si este cambio particular en la union tiene el efecto de aumentar o disminuir la actividad de diversificacion. En otras realizaciones, la modulacion, ya sea reduccion, parada, mejora o aceleracion de la modulacion, se efectua retirando o eliminando la molecula reguladora del cultivo. Del mismo modo, la modulacion de la diversificacion puede efectuarse anadiendo un gen o eliminando un gen de la celula B, o aumentando o disminuyendo la expresion de un gen en la celula B. Un experto en la tecnica puede apreciar facilmente todas las permutaciones disponibles expuestas anteriormente, cada una de las cuales tiene el efecto de alterar el nivel o presencia de una molecula reguladora en la celula B y, a su vez, alterar la fijacion del factor de diversificacion al elemento cis-regulador y alterando asf la actividad de diversificacion.
Usos adicionales de los metodos de la invencion incluyen hipermutacion inducible de dianas de genes de Ig en IgA. La lmea de celulas DT40 PoliLacO-A LacI-HP1 (vease el Ejemplo 4 a continuacion) puede usarse para alterar la secuencia de cualquier gen de Ig corriente abajo de la matriz pseudo-V de VA. La estructura genomica en los loci Ig ha evolucionado para promover la mutagenesis de la region V, pero no la region constante de una molecula de Ig.
La alteracion de la secuencia del gen Ig en el contexto de un locus de Ig aprovecha eso para asegurar que el producto de mutagenesis retiene una region constante funcional. La facilidad de la sustitucion de genes en DT40 permite cambios utiles en ese gen. Por ejemplo, el gen de pollo (region variable y constante) podna ser reemplazado por un gen de anticuerpo humano (ya sea cadena pesada o liviana), para generar anticuerpos con aplicacion terapeutica. Esto tambien se puede usar para generar anticuerpos terapeuticos para otras especies. Esto proporcionara un sistema rapido para la mutagenesis de una unica cadena de un anticuerpo heterodimerico; o para la cadena unica de anticuerpos de cadena unica.
Los usos de este enfoque incluyen: hipermutacion para generar clones de celulas B que producen Ig de alta afinidad; hipermutacion para alterar la reactividad cruzada de anticuerpos, manteniendo al mismo tiempo el reconocimiento de un epftopo espedfico; hipermutacion para identificar secuencias de la region V con alta afinidad por compuestos espedficos. Esto se puede hacer en un unico locus de Ig, o en ambos.
La hipermutacion inducible tambien puede realizarse en IgH. El locus IgH en DT40 es un sitio eficiente de mutagenesis, al igual que IgA. Las lmeas celulares derivadas, hechas por tecnicas paralelas, permiten la mutagenesis tanto en IgH como en IgA, o en cada alelo por separado. La insercion de PoliLacO en IgH, para crear el derivado DT40 PoliLacO-A PoliLacO-H LacI-HP1, permite la hipermutacion en ambos genes de cadena H y L. La adicion de IPTG al medio de cultivo libera algunos de los efectos inhibitorios que disminuyen los eventos con plantilla y aumentan la hipermutacion no planificada. De este modo, variando la presencia y ausencia de IPTG, se puede alternar entre mutagenesis templada y no planificada de los genes que codifican ambas cadenas de un anticuerpo.
Se puede hacer un derivado que combine la regulacion con IPTG de Lac Repressor (LacI) en un alelo con tetraciclina de la represion de Tet (TetR) en el otro alelo. Este derivado TetR permitira la regulacion independiente de
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la diversificacion en los alelos IgH e IgL; y utilizando diferentes mecanismos simultaneamente para regular la diversificacion en el locus IgL e IgH.
La invencion tambien proporciona un vehmulo para la seleccion de receptores de celulas T. La inmunoterapia basada en celulas T tiene un gran potencial (Blattman and Greenberg, 2004). La especificidad y afinidad del receptor de celulas T se rige por los contactos CDR (Chlewicki et al., 2005). La seleccion inducible acelerada para la especificidad o receptores de celulas T de alta afinidad puede llevarse a cabo en un vehmulo DT40 PoliLacO, que ha sido modificado por sustitucion de receptores de celulas T (regiones V o genes enteros) para los loci Ig.
La produccion de Igs catalfticas es otro aspecto de la invencion. Los metodos relacionados con Ig de la invencion no se limitan simplemente a la produccion de Ig para la union y el reconocimiento, ya que la Ig diana tambien podna usarse para la catalisis. Despues del desarrollo de una molecula estable que imita el estado de transicion de una reaccion enzimatica, las celulas DT40 PoliLacO-A LacI-HP1 pueden usarse para desarrollar un anticuerpo que se une y estabilice el estado de transicion qmmica real. Despues de identificar clones que producen una Ig capaz de unirse al intermedio, el sistema puede usarse de nuevo para cribar la actividad catalftica de Igs sobre el sustrato real en cultivo. Una vez que se ha demostrado cierta actividad en este sistema, la optimizacion de la actividad puede proceder por una evolucion ulterior de los loci Ig a traves de mutagenesis. Por lo tanto, la invencion no requiere inmunizacion animal (un paso lento), inmortalizacion por tecnologfa de hibridoma, y la ineficiencia de tener que cribar hibridomas posteriormente para detectar anticuerpos que demuestran actividad catalftica.
La hipermutacion inducible de dianas genicas no Ig en IgA o IgH es otro aspecto de la invencion. La estructura genomica en los loci Ig ha evolucionado para promover la mutagenesis de 1-1.5 kb corriente abajo del promotor. Este sistema puede ser aprovechado para mutar regiones cortas de genes. La seleccion clonal basada en la expresion de la protema superficial puede incorporarse por fusion de la region de interes a una porcion de un gen que expresa elementos que median la expresion superficial. Ejemplos de elementos para la expresion superficial incluyen una peptida serial, un dominio transmembrana y una cola citoplasmica a partir de una protema expresada en la superficie de las celulas B (Chou et al., 1999; Liao et al., 2001).
La invencion tambien se puede utilizar para la produccion de matrices de reconocimiento. La capacidad de desarrollar celulas que albergan receptores con afinidades para un amplio espectro de antfgenos permite el desarrollo de matrices de reconocimiento. La combinacion de esta tecnologfa con las respuestas intracelulares/senalizacion de la estimulacion del receptor en DT40 (como la medicion de Ca2+ por aequorina (Rider et al., 2003) o el uso de la transcripcion de genes reportero) creana un biosensor util. Clones diversificados se manchan en arreglos o placas de 96 pozos, y se exponen a las muestras. Cada muestra producina una "huella digital" de estimulacion. Las matrices permitinan comparaciones cualitativas de muestras biologicas/medicas, ambientales y qmmicas. El analisis no necesita estar limitado al analisis de protemas, como es el caso de las tecnicas comparativas como los geles 2D, ya que todas las formas de compuestos pueden tener propiedades antigenicas. Ademas, las matrices conducinan a la identificacion de componentes sin conocimiento de su presencia de antemano.
Kits
En un aspecto, se proporciona un kit que comprende
(a) una celula B modificada para inducir reversiblemente la diversificacion de un gen diana, comprendiendo la celula B un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una region codificadora; y
(b) uno o mas recipientes; y
(c) uno o mas constructos de fusion almacenados en un contenedor de (b), en el que cada constructo de fusion es expresable en la celula B y codifica un factor de fijacion fusionado a un factor de diversificacion, en el que el factor de fijacion se une espedficamente al elemento regulador cis de (a) y el factor de diversificacion induce reversiblemente la diversificacion de la region codificadora.
Para uso en los metodos descritos en el presente documento descriptiva, los kits tambien estan dentro del alcance de la invencion. Dichos kits pueden comprender un portador, envase o recipiente que esta compartimentado para recibir uno o mas recipientes tales como viales, tubos y similares, cada uno de los recipientes que comprende uno de los elementos separados (por ejemplo, celulas, constructos) para utilizar en el metodo.
Tfpicamente, el kit comprende una celula B de la invencion y construcciones de fusion que expresan los correspondientes factores de fijacion y diversificacion. Por ejemplo, la celula B comprende un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una region codificadora. El kit comprende ademas uno o mas recipientes, con una o mas construcciones de fusion almacenadas en los recipientes. Cada constructo de fusion comprende un polinucleotido que puede expresarse en la celula B y que codifica un factor de fijacion fusionado a un factor de diversificacion, en el que el factor de fijacion se une
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espedficamente al elemento regulador cis de la celula B. La celula B puede incluir una pluralidad de elementos reguladores cis para uso con una pluralidad de construcciones de fusion.
El kit de la invencion comprendera tipicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o mas recipientes que comprenden materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas e insertos de paquete con instrucciones de uso. Ademas, se puede proporcionar una etiqueta en el recipiente para indicar que la composicion se usa para una aplicacion terapeutica o no terapeutica espedfica, y tambien puede indicar instrucciones de uso. Direcciones u otra informacion tambien se pueden incluir en un inserto que se incluye con el kit.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invencion y para ayudar a un experto en la fabricacion y uso de la misma.
Ejemplo 1: Mutacion y direccionamiento en la lmea de celulas DT40 B Este ejemplo ilustra una realizacion de la invencion, preparada en dos etapas.
(1) DT40 PoliLacO-A. Primero se construyo este derivado de la lmea de celulas B de pollo DT40 que contiene un elemento genetico que permite la regulacion en cis en el locus IgA. En DT40 PoliLacO-A, se inserta un operador de lactosa polimerizado (LacO) justo corriente arriba de la matriz pseudo-VA en el lugar de la cadena liviana IgA. Esta es una extension de un sistema desarrollado por Straight y Belmont, en el que PoliLacO consta de aproximadamente 80 repeticiones del sitio de union LacO de 20 pb (Straight et al., 1996; Belmont, 2001). Hemos demostrado que esto no afecta al proceso normal de mutagenesis plantilla. El constructo de DT40PoliLacO-A se describe en detalle en el Ejemplo 2 siguiente.
LacO esta unido por un represor de la lactosa (LacI) con una afinidad muy alta: <10'3 * * * * * * * * 12 M. Este mecanismo regula la expresion del operon para el metabolismo de la lactosa en E. coli, y tambien puede usarse en una variedad de contextos celulares. Hemos demostrado que Lacl se une a PoliLacO en DT40 PoliLacO-A, mediante la generacion de transfectantes estables que expresan Lacl fusionado a la protema fluorescente (GFP, RFP, YFP o CFP), y mostrando por microscopfa de inmunofluorescencia que la protema atada puede ser visualizada como una sola mancha en el nucleo de DT40 PoliLac que prolifera normalmente que expresa de manera estable GFP-LacI, RFP- LacI, YFP-LacI o CFP-LacI.
IPTG es una molecula pequena que causa la liberacion de LacI de LacO, tanto in vitro como en celulas cultivadas. El cultivo de DT40 PoliLacO-A GFP-LacI con un IPTG de poco mas de 10 pM causa la liberacion de GFP-LacI de PoliLacO. El cultivo con IPTG no afecta a la proliferacion celular.
(2) DT40 PoliLacO-A LacI-HP1. A continuacion construimos este derivado de DT40 PoliLacO-A, en el que se produce un cambio a la hipermutacion somatica cuando Drosophila melanogaster HP1 (de L. Wallrath, Universidad de Iowa), un modificador de la estructura de la cromatina, esta atado a PoliLacO. El fijacion se consiguio utilizando el par muy bien caracterizado de cis y trans-reguladores, E. coli LacO/LacI. El HP1 es una protema heterocromatina no histona bien caracterizada que funciona en el silenciamiento genico heterocromatico y en la diseminacion de heterocromatina, y en LacI HP1 atado con Drosophila se ha demostrado que promueve una estructura de cromatina cerrada y la inactivacion de genes informadores vecinos a una repeticion laco (Li et al., 2003; Danzer and Wallrath, 2004). Hemos demostrado que sujetar HP1 causa una transicion de las secuencias de donante de un abierto a no estado de permiso, medida por ChIP; y causo VA a sufrir mutagenesis por hipermutacion somatica en lugar de la conversion genica. Esto es funcionalmente equivalente a la eliminacion de la matriz pseudo-VA, que se ha demostrado que causa un cambio de mutagenesis plantilla a hipermutacion somatica (Arakawa et al., 2004). La caracterizacion adicional de DT40 PoliLacO-A LacI-HP1 se documenta en el Ejemplo 4 siguiente.
(3) DT40 PoliLacO-A VP16-LacI. Seguidamente utilizamos el plasmido de expresion p3'ss-EGFP-VP16 (de A.
Belmont, Universidad de Illinois) para unir VP16-LacI a PoliLacO. VP16 es un fuerte activador de la transcripcion, y
se ha demostrado que reclutar complejos de histona acetiltransferasa (Tumbar et al., 1999). Hemos demostrado que
la fijacion de VP16 creo una estructura mas permisiva de la cromatina, medida por ChIP; y causo VA para someterse
a mutagenesis por una estimulacion de la conversion genica sobre los niveles de tipo salvaje.
Ejemplo 2: Aceleracion de la mutagenesis mediante fijacion de genes al poro nuclear
Descubrimos que la diversificacion de los genes de la inmunoglobulina se mueve dentro del nucleo en el transcurso
del ciclo celular, que este movimiento se correlaciona con los pasos de la ruta de diversificacion y que la
diversificacion se inicia en la periferia nuclear. La desaminasa inducida por activacion (AID), la enzima que inicia la diversificacion, lleva una senal de exportacion nuclear y es transportada constantemente fuera del nucleo a traves del poro nuclear, por lo que sus concentraciones pueden ser mas altas en la periferia del nucleo. Esto sugirio que
podna ser posible acelerar la diversificacion al aumentar la proximidad genetica al poro nuclear. Hemos demostrado
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que este es el caso mediante el uso de una fusion de la protema de poro nuclear, Nup153, Lac repressor (LacI) para atar el locus IgH en DT40PoliLacO al poro nuclear. Se encontro que esto acelero la tasa de diversificacion clonal 5.7 veces. Los experimented de control mostraron que el sujetar a PoliLacO era cntico para la aceleracion de la mutagenesis. Este metodo es general y depende de la senal de exportacion nuclear de AID y localizacion de genes para promover la mutagenesis de una diana. Por lo tanto, este metodo puede ampliarse para promover la mutagenesis de genes no Ig en celulas B, sujetandolos al poro; y se amplfa adicionalmente para promover la mutagenesis de genes en celulas no B, expresando AID en esas celulas.
Ejemplo 3: E2A actua en cis en la fase G1 del ciclo celular para promover la diversificacion del gen Ig
Este ejemplo describe la regulacion dependiente del ciclo celular de la diversificacion del gen Ig en el nucleo. Los genes Ig reorganizados experimentan diversificacion en secuencia y estructura iniciada por la desaminase de ADN, AID. Los genes Ig deben ser transcritos para que se produzca la diversificacion, pero no se ha establecido si hay requisitos adicionales para la activacion cis. Este ejemplo muestra, por transferencia de cromatina, que el factor regulador E2A se asocia con el gen de IgAR reordenado en la lmea de celulas DT40 B de pollo, que lleva a cabo la diversificacion constitutiva de genes de Ig. Mediante la obtencion directa de imagenes de un derivado de DT40 en el que el operador de lactosa polimerizado marca el gen AR reordenado, mostramos que las colocalizaciones de AR/E2A son mas prominentes en la fase G1 del ciclo celular. Demostramos ademas que la expresion del antagonista de E2A Id1 previene las colocalizacion de AR/E2A en la fase G1 e impide la diversificacion pero no la transcripcion de AR (a continuacion, el gen IgAR se denomina a veces IgA o A). Por lo tanto, E2A actua en cis para promover la diversificacion de genes Ig, y la fase G1 es la ventana cntica para la accion E2A.
Los cambios regulados en la secuencia genomica y la estructura que tienen lugar en los loci de Ig reflejan tanto el direccionamiento al ADN del dano a estos genes como el escape de la reparacion fiel. La hipermutacion somatica, la recombinacion de conmutacion de clase y la conversion genetica son iniciadas por la enzima espedfica de celulas B, la desaminasa inducida por activacion (AID) (5-8). La AID desamina la citosina en uracilo, con clara preferencia por el ADN monocatenario (9-11). La transcripcion es un requisito previo para la diversificacion, que puede reflejar la preferencia de la AID para sustratos monocatenarios. El uracilo en el ADN es una lesion comun, que puede ser reparada fielmente por vfas altamente conservadas y eficientes (12). Sin embargo, los loci Ig pueden escapar de la reparacion fiel y someterse a la reparacion por vfas propensas a error (13).
E2A, un miembro de la familia E de las protemas bHLH, es un regulador cntico de muchos aspectos del desarrollo de linfocitos (14-17). Las protemas E dimerizan para unirse al motivo de la caja E, CANNTg, y su funcion es antagonizada por las protemas Id, que se heterodimerizan con las protemas E para prevenir la union al ADN. E2A es inducida en celulas B murinas activadas, donde regula la recombinacion por conmutacion de clase (18), asf como la expresion del gen que codifica AID (19). En las celulas B de pollo, la inactivacion del gen E2A perjudica la diversificacion del gen IgA pero no la transcripcion (20, 21); mientras que, a la inversa, la expresion ectopica de E47 (una de dos isoformas funcionalmente equivalentes codificadas por e2a) promueve la diversificacion del gen de IgA, pero no afecta los niveles de transcripcion de IgA (22).
La posibilidad de que E2A pudiera regular la diversificacion del gen Ig mediante la union a sitios en cis se sugirio primero por la evidencia de que las cajas E multimerizadas estimulan la hipermutacion pero no la transcripcion de un transgen de Ig en ratones (23). Esta posibilidad ha sido apoyada por la demostracion de que las cajas E multimerizadas pueden promover la diversificacion de genes Ig pero no la transcripcion en las celulas B de pollo (24). Sin embargo, la resolucion clara de la cuestion de si E2A actua directamente en los genes Ig para promover la diversificacion ha sido difteil, por varias razones. E-cajas funcionan como sitios para la regulacion E2A-dependiente solo en contextos espedficos, por lo que la presencia de una Caja E no garantiza la funcion E2A en un sitio; el consenso suelto y la aparicion frecuente de motivos E de Caja impide el analisis mutacional de cada sitio individual; y en algunos loci E2A es reclutado por protema-protema en lugar de interaccion protema-ADN, por lo que una Caja Eno es siempre requisito previo para la regulacion E2A-dependiente (25).
Se ha establecido ahora que E2A actua en cis en los genes Ig para promover la diversificacion, en experimentos que aprovechan los derivados de la lmea de celulas B de pollo de diversificacion constitutivamente, DT40, en la que el alelo de IgA reordenado esta marcado con el operador de lactosa polimerizada (DT40 PoliLacO-AR). Por transferencia de cromatina (ChIP), mostramos que E2A se asocia con el alelo de IgA reordenado pero no sin reordenar en la lmea parental, DT40. Este ejemplo demuestra que, en celulas PoliLacO-AR de DT40, la diversificacion se acelera tras la expresion de una protema de fusion E47-LacI, que efectivamente enlaza E47 a AR; y que el efecto estimulador de la expresion de E47-LacI no es evidente en celulas cultivadas con IPTG, por lo que la union en cis es necesaria para promover la diversificacion. Mediante la obtencion de imagenes directas del gen AR reordenado en celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-LacI, se muestra que las colocalizacion de AR/E2A predominan en la fase G1; y que la expresion del antagonista de E2A, Id1, dificulta la diversificacion y disminuye las colocalizacion de AR/E2A espedficamente en la fase G1, pero no afecta a los niveles de transcripcion A o la localizacion de AR a las fabricas de transcripcion activas. Estos resultados muestran que E2A actua en cis en la fase G1 para promover la diversificacion de genes Ig.
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Materiales y metodos
Cultivo celular, transfeccion, ensayo de perdida de slgM y analisis del ciclo celular
La lmea de linfoma de bursal de pollo DT40 y su derivado DT40 PoliLacO-AR se mantuvieron y transfectaron como se describe (26, 27). El constructo de expresion de E47-LacI se genero por subclonacion de ADNc E47 a partir del plasmido S003 E47 (28) (proporcionado por Cornelis Murre, Universidad de California, San Diego, California) en el plasmido p3'SS-GFP-LacI (proporcionado por Andrew Belmont, Universidad de Illinois, Urbana, Illinois). El constructo de expresion Id1 (29) fue proporcionado por Barbara Christy (Universidad de Texas, San Antonio, Texas). El ensayo de perdida de slgM se llevo a cabo como se describe (26, 30), y los resultados se compararon utilizando la prueba U de Mann-Whitney con el paquete de software R (
http://www.r-project.org). Para los perfiles de ciclo celular basados en el contenido de ADN, se suspendieron 1 x 106 celulas que crecen exponencialmente en Triton X- 100 al 0.1%, se trataron con 200 pg/ml de RNasa A y 50 pg/ml de yoduro de propidio y se analizaron como se describe (26).
Analisis de ChIP
Se preparo cromatina y se inmunoprecipito como se describe (27, 31, 32); usando anticuerpo anti-E2A (ab11176; Abcam) o IgG de control. Se realizo PCR semicuantitativa con ADN polimerasa Taq de FastStart (Roche), utilizando cebadores previamente descritos para VAr y VAu (27); y los cebadores 5'-ATTGCGCATTGTTATCCACA-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-TAAGCCCTGCCAGTTCTCAT-3' (SeQ iD No: 2) para la ovoalbumina (Ova). Los productos de PCR se cuantificaron con el software Image-Quant (Amersham). El enriquecimiento se calculo como la relacion del amplicon de interes al amplicon de Ova, normalizado a la relacion de IgG de control, por ejemplo: Enriquecimiento VAr = (anti- E2A [VAR/Ova])/(IgG[VAR/Ova]).
RT-PCR y transferencia Western
Para los ensayos de RT-PCR, la AID y la b-actina se amplificaron con cebadores como se describe (7); y transcritos de IgA con los cebadores 5'-GTCAGCAAACCCAGGAGAAAC-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'- AATCCACAGTCACTGGGCTG-3' (SEQ ID NO: 4). Para la transferencia Western, se resolvieron lisados de celulas enteras (50 pg) de DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI y DT40 PoliLacO-AR RFPLacI Id1, y se detecto la protema Id1 con anticuerpo anti-Id1 (JC-FL, Santa Cruz) usando FluorChem HD2 (Alpha Innotech).
Microscopfa de fluorescencia y analisis de imagenes
Para la imagen de PoliLacO, se transfectaron celulas de PoliLacO-IR DT40 con el constructo de expresion de GFP- Lacl, p3'SSGFP-LacI (de Andrew Belmont, Universidad de Illinois, Urbana, Illinois), que codifica Lacl disenado para contener senales de localizacion nuclear SV40 y que carece de una secuencia necesaria para la formacion del tetramero (33); o su derivado, RFP-LacI, en el que GFP se sustituyo por RFP (DsRed-monomero, Clontech). Para la inmunotincion, se depositaron celulas (~3X105) sobre placas de vidrio utilizando Cytospin3 (800 rpm, 4 min., Shandon), se fijaron con paraformaldetHdo al 2% durante 20 minutos y se tineron como se describio anteriormente (26). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-E2A (ab11176, 1:200; Abcam); Dominio anti-Pol II C-terminal fosforilado en Ser5 (ab5131, 1:500; Abcam). Alexa Fluor 488- o 594-conjugado anti-IgG (Molecular Probes) se utilizo como anticuerpos secundarios. Las imagenes fluorescentes se adquirieron utilizando el sistema de microscopfa DeltaVision (Applied Precision) y se procesaron y analizaron con SoftWoRx (Applied Precision) e Imaris softwares (Bitplane). Las senales fluorescentes a veces eran parcial en vez de completamente superpuestas, lo que puede reflejar la considerable distancia (~17 kb) entre el PoliLacO-tag y la region VA; Ambas configuraciones se puntuaron como colocalizacion. La fraccion de colocalizacion se analizo con la prueba x2 de Pearson. Los radios nucleares se calcularon como el promedio de al menos dos mediciones independientes de diametro, divididas por dos. La dependencia del ciclo celular del ciclo celular se determino independientemente para cada lmea celular y resulto ser relativamente invariable. Los valores estandar utilizados para correlacionar el radio nuclear con el ciclo celular fueron: G1, r <4 pm; G2, r > 5.2 pm.
Resultados
E2A se asocia con el gen de IgA reordenado pero no sin reordenar
A pesar de la considerable evidencia de la importancia de E2A en la diversificacion de genes de Ig, no se ha demostrado que este factor se asocie directamente con los genes Ig. Para probar la asociacion de E2A con IgA, se utilizaron anticuerpos anti-E2A para inmunoprecipitar la cromatina de la lmea de celulas DT40 B de pollo. Esta lmea se derivo de un linfoma bursal y lleva a cabo la diversificacion constitutiva de ambos genes Ig cadena pesada y liviana por la conversion de genes. Una busqueda en el locus de la cadena liviana de pollo A de 11 kb identifico mas de 50 coincidencias con el consenso E2A, CANNTG: 17 en la region entre VA y ^VA1, el mas proximal de los pseudogenes corriente arriba; 2 en la region de union a la matriz (MAR) en el intron J-C; y 6 en el potenciador 3'. En las celulas DT40 B, el alelo funcional ha sufrido la recombinacion VJ temprano en el desarrollo de celulas B, que elimina una region de 1.8 kb para unirse a los segmentos V y J, mientras que el alelo A inactivo no esta reorganizado
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(Figura 4A), permitiendo a los dos alelos se puedan distinguir facilmente por PCR. Tras la transferencia de la cromatina (ChlP), la recuperacion de los alelos A reordenados y no reordenados se ensayo en relacion con un gen de control, la ovoalbumina. Esto demostro que E2A fue 17.6 veces enriquecido en el alelo VAR reordenado, pero no enriquecido en el alelo VAU no reordenado (Figura 4B). Por lo tanto, e2a se asocia directamente con el alelo VAR reordenado.
E2A actua en cis para regular la diversificacion de IgA
Para indagar si E2A debe unirse en cis para promover la diversificacion, aprovechamos un derivado de DT40, DT40 PoliLacO-AR, en el que se ha insertado operador de lactosa polimerizada en el ^VA. (Figura 5A), permitiendo que los factores expresados como fusiones con el represor de lactosa (LacI) se ataron al alelo AR reordenado y se liberaron por cultivo con IPTG (27). La distribucion del ciclo celular y las tasas clonales de conversion de genes Ig fueron comparables en DT40 PoliLacO-AR y de tipo salvaje DT40 (Figura 5B, C). Las celulas DT40 PoliLacO-AR se transfectaron establemente con un plasmido que expresaba la isoforma E47 de E2A fusionada a Lacl (E47-LacI), o un plasmido control que expresaba protema fluorescente verde fusionada a Lacl (GFP-LacI). La distribucion del ciclo celular fue comparable en los transfectantes GFP-LacI y E47-Lacl, aunque los cultivos de esta ultima lmea conteman algunas celulas sub-G1 (apoptoticas) (Figura 5D). Los niveles de transcritos IgA no se alteraron en los transfectantes E47-LacI (Figura 5E), confirmando los resultados publicados que muestran que E2A no regula la expresion genica Ig en celulas B de pollo (21, 22). Los niveles de transcripciones de AID fueron aproximadamente tres veces mayores en los transfectantes de E47-Lacl (Figura 5E). Un aumento similar en la expresion de la AID en respuesta a la expresion ectopica de E47 ha sido observado por otros (22).
Para indagar si E2A regula la diversificacion directamente, a traves de la union a IgA, cultivamos E47-Lacl independientes (n=19) o GFP-Lacl (n=13) transfectantes en presencia y ausencia de IPTG, y determino las tasas de diversificacion clonal utilizando el slgM ensayo de fluctuacion de perdidas (26, 27, 30). Este ensayo registra la inactivacion de mutaciones independientemente de si se producen por conversion genica, mutacion puntual, supresion o insercion, y por lo tanto cuantifica los eventos iniciadores independientemente del resultado de la mutagenesis. Este analisis mostro que la tasa clonal de diversificacion era 4.5 veces mayor en los transfectantes de E47-Lacl en relacion con los controles GFP-LacI (P=0.019, prueba U de Mann-Whitney, Figura 5F). Por otra parte, el cultivo con IPTG, que libera E47-LacI de PoliLacO, causo tasas de diversificacion para volver casi a los niveles de fondo en DT40 PoliLacO-AR E47-LacI celulas, pero no tuvo efecto sobre GFP-LacI controles (Figura 5F). Asf, E47- LacI promueve la diversificacion actuando en cis.
E2A localiza a IgAR en la fase G1 del ciclo celular
En las celulas B humanas, la reticulacion del receptor en la fase G1 del ciclo celular puede iniciar la hipermutacion somatica, produciendo mutaciones identificables dentro de 90 minutos (34). Por lo tanto, fue de interes para determinar la etapa de ciclo celular en la que E2A actua en IgA. El gen AR reordenado y diversificado se puede representar facilmente como un punto brillante en celulas PoliLacO-AR de DT40 que expresan GFP-LacI (27). Sin embargo, cuando las celulas se tineron con Hoechst 33342 y se clasificaron por contenido de ADN para enriquecer las celulas en la etapa G1, S o G2/M, la fraccion de celulas que mostraba una senal fluorescente clara del gen marcado disminuyo del 90-95% rutinariamente observado en las celulas no clasificadas a aproximadamente el 45%. Como tal una perdida en la senal podna sesgar los resultados, por lo tanto, determinada etapa del ciclo celular por un enfoque diferente. El analisis de las celulas manchadas y clasificadas por Hoechst 33342 mostro que el tamano nuclear era significativamente menor en la fase G1 que en las celulas de la fase G2/M (por ejemplo, la Figura 6A). Por lo tanto, preguntamos si el radio nuclear (r) podna utilizarse para establecer la etapa del ciclo celular, midiendo los radios nucleares de las celulas G1 (n=55) y las celulas G2 (n=55) de una poblacion DT40 PoliLacO-AR exponencialmente creciente se habfa tenido con Hoechst 33342 y se clasifico basandose en el contenido de ADN. Los radios nucleares medios de las celulas G1 fueron 3.8 ± 0.3 pm; y de celulas G2, 5.4 ± 0.5 pm (Figura 6B). La comparacion de las relaciones de las celulas G1:S:G2 determinadas por el radio nuclear (3: 6: 1) y la tincion (2.7: 5.5:1.7) validaron adicionalmente este enfoque. Asf, las celulas G1 se identificaron experimentalmente como r <4 pm; y celulas G2, r> 5.2 pm.
Las colocalizaciones de AR/E2A se identificaron facilmente mediante analisis microscopico de desconvolucion de celulas PoliLacO-AR GFP-LacI de DT40 tenidas con anticuerpos anti-E2A (por ejemplo, la Figura 7A). Las colocalizacion de AR/E2A fueron evidentes en el 26% de las celulas asmcronas (n=227). El analisis de la distribucion del ciclo celular de colocalizaciones mostro que el 45% de colocalizaciones de AR/E2A ocurrieron en fase G1, 38% en fase S y 17% en celulas en fase G2 (Figura 7B). Por lo tanto, hubo un exceso aparente de colocalizaciones de AR/E2A en la fase G1 (45%) con respecto a la fraccion (25%) de las celulas en fase G1 (P <0.0001, prueba x2). Tambien se determino la dependencia del ciclo celular de la transcripcion AR, identificando las fabricas de transcripcion activa mediante tincion con anticuerpo a Ser5 fosforilado en el dominio C-terminal de la ARN polimerasa II (P*-Pol II), una modificacion caractenstica de las moleculas de Pol II alargadas (35). En las poblaciones de celulas asmcronas de las celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI, se pudieron identificar numerosas fabricas de transcripcion activa a lo largo del nucleo, y se observaron colocalizaciones de AR/P*-Pol II en el 19% de las celulas (n=392); Figura 7C). Analisis de la distribucion del ciclo celular de AR/P*-Pol II colocalizaciones mostraron que el 21% de colocalizaciones se produjeron en la fase G1, 58% en la fase S; y 21% en celulas de fase G2 (Figura
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7D). Esto es comparable con la distribucion del ciclo celular. Por lo tanto, AR se transcribe a lo largo del ciclo celular, pero AR/E2A colocalizaciones predomina en la fase G1.
La expresion de Id1 inhibe la diversificacion de genes Ig y colocalizaciones de AR/E2A en la fase G1.
Para indagar si las colocalizaciones de AR/E2A en fase G1 son cnticas para la diversificacion, determinamos el efecto de la expresion de Id en estas colocalizaciones. Id antagoniza E2A, y la expresion en celulas DT40 B de Id1 o Id3 se ha demostrado anteriormente para disminuir la diversificacion de genes Ig (22). Hemos generado estable DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI Id1 transfectantes, confirmo la expresion de Id1 por transferencia Western (Figura 8A), y mostro que la expresion de Id1 no altero el perfil del ciclo celular (Figura 8B). Verificamos que la expresion de Id1 disminuyo la tasa clonal de diversificacion de genes de Ig (P <0.001, prueba de Mann Whitney U, Figura 8C); pero no afecto a los niveles de IgA o las transcripciones de AID (Figura 8D). Comparamos entonces colocalizaciones de AR/E2A en el derivado que expresa Id1 y en la lmea parental, mediante tincion con anticuerpos anti-E2A. Las colocalizaciones de AR/e2a fueron evidentes en el 13% de las celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI Id1 asmcronas (n=90), en comparacion con el 26% de las celulas RFP-LacI de PoliLacO-AR de DT40 (P = 0.0030, prueba de x2).
Para determinar si la expresion de Id1 afecto colocalizaciones en una etapa espedfica del ciclo celular, las colocalizaciones de AR/E2A en los transfectantes Id1 se cuantificaron con respecto al radio nuclear y al ciclo celular. Esto mostro que, en celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI Id1, el 10% de colocalizaciones ocurrieron en la fase G1; 58% en la fase S; y 32% en celulas de fase G2 (Figura 8E). Por lo tanto, la expresion de Id1 causo una disminucion significativa en la fraccion de colocalizaciones de AR/E2A en la fase G1, del 45% en la lmea parental al 10% en los transfectantes Id1 (P <0.0001, prueba x2; Figura 8E) y el 90% de colocalizaciones de AR/E2A en los transfectantes Id1 se produjeron despues de la fase G1 del ciclo celular. Tomado junto con una diversificacion disminuida evidente en los transfectantes Id1, esto demuestra que la fase G1 es la ventana cntica en la que E2A promueve la diversificacion.
Las colocalizaciones de AR/P*-Pol II se identificaron en 18% de las celulas DT40 PoliLacO-AR RFP-LacI Id1 tenidas con anticuerpos para las fabricas de transcripcion activas (n=290), comparables a la lmea parental (19%, P=0.80, X2 test; Figura 7D). El perfil del ciclo celular de las colocalizaciones de AR/P*-Pol II fue tambien comparable en los transfectantes Id1 y en la lmea parental (Figura 8F). La ausencia de efecto de La expresion de Id1 en AR/P*-Pol II colocalizaciones es coherente con los niveles de transcripcion de IgA no disminuidos en DT40 PoliLacO-AR RFP- LacI Id1 transfectantes (Figura 8D). Por lo tanto, La expresion de Id1 afecta a la distribucion del ciclo celular de colocalizaciones de AR con E2A, pero no con P*-Pol II.
Discusion
Estos resultados muestran que E2A debe actuar en cis para promover la diversificacion de genes de Ig y que la fase G1 es la ventana cntica en la que E2A funciona en este proceso. Los experimentos han examinado A genes etiquetados con PoliLacO y imagenes por la union a GFP-LacI o RFP-LacI. Esto proporciona un poderoso enfoque para estudiar la diversificacion genetica. El locus marcado es visible en >90% de las celulas fijas, lo que permite el analisis de colocalizaciones con factores que intervienen en la diversificacion. La capacidad de fijar los reguladores potenciales y su liberacion por cultivo con IPTG permite estudiar los efectos de un factor en el locus IgA independiente de sus otros objetivos. Esto es especialmente util para un factor como E2A, que funciona en la parte superior de una gran y compleja jerarqrna reguladora (36).
Los resultados establecen que E2A regula directamente la diversificacion del gen Ig por asociacion ffsica con los loci Ig. La ChIP proporciono evidencia clara de asociacion de E2A con el alelo AR reordenado en celulas B de DT40. El hecho de que E2A debe funcionar en cis se establecio mostrando que la aceleracion en la diversificacion resultante de la union de E2A (fusion E47-LacI) con el alelo IgA en celulas PoliLacO-AR de DT40 no fue evidente en celulas cultivadas con IPTG, que libera LacI de LacO.
E2A es mas conocido como un regulador transcripcional, pero la funcion E2A en la diversificacion no refleja la activacion transcripcional a IgA, ya que los niveles de transcritos IgA no se alteraron por la expresion ectopica de E47. Esto confirma los resultados de otros que han examinado los efectos de E2A en la diversificacion en pollo y celulas B murinas (20, 22, 23). Ademas, colocalizaciones de AR con E2A, que son mas prominentes en la fase G1, distinta de la distribucion del ciclo celular de AR a fabricas de transcripcion activa, que es comparable a la distribucion del ciclo celular, lo que sugiere que AR se transcribe a lo largo del ciclo celular. La independencia de la funcion de E2A en la diversificacion y la transcripcion es apoyada por los efectos contrastantes de la expresion Id1 en colocalizaciones de la AR reordenada con E2A y fabricas de transcripcion activa. La expresion de Id1 disminuyo la diversificacion, y tambien disminuyo las colocalizaciones de AR con E2A. Por el contrario, la expresion Id1 no afecto el numero o la distribucion del ciclo celular de localizacion de AR a las fabricas de transcripcion activa. Que E2A no este obligado a reclutar AR a las fabricas de transcripcion es coherente con la ausencia de efecto de la expresion de Id1 en la transcripcion de IgA.
E2A regula la expresion de la AID, y esto indirectamente estimula la diversificacion del gen Ig. Se demostro que el gen AID era un objetivo de regulacion transcripcional por E2A en celulas B murinas (19); y nosotros y otros (22)
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hemos demostrado que la expresion ectopica de E2A aumenta los niveles de transcripcion de AID en celulas B de pollo DT40. Esto puede contribuir o explicar la moderada aceleracion en la diversificacion evidente en las celulas cultivadas con IPTG DT40 PoliLacO-AR E47-LacI. Aunque se ha informado que la ablacion de E2A no disminuye los niveles de transcripcion de AID en las celulas B de pollo (21), los factores redundantes con E2A podnan asegurar un nivel mmimo de expresion de AID en ausencia de E2A.
Los resultados identifican la fase G1 como la ventana crftica en la que E2A funciona en IgA. Se observo un exceso de colocalizaciones de AR/E2A en la fase G1, en relacion con otras etapas del ciclo celular; y mostro que La expresion de Id1 espedficamente disminuye colocalizaciones en G1 fase, y disminuye la tasa de diversificacion. Las protemas Id heterodimerizan con protemas E para inhibir ADN vinculante (14]. Que las colocalizaciones durante G1 fueron afectadas espedficamente por la expresion Id1 puede ser indicativo de distintos modos de asociacion E2A con IgA durante el ciclo celular. En las fases S y G2, E2A puede ser reclutado a traves de interacciones con otras protemas, en lugar de la union directa al ADN.
Otras lmeas de evidencia apoyan la opinion de que la diversificacion se inicia en la fase G1. La hipermutacion somatica en la lmea celular Bl2 humana puede ser inducida por la estimulacion in vitro que tiene lugar solo durante la fase G1, y las mutaciones puntuales se vuelven evidentes a los 90 minutos de la estimulacion, cuando las celulas estan todavfa en G1 (34). En las celulas B murinas activadas para la recombinacion de conmutadores de clase, las colocalizaciones de IgH con NBS1 o Y-H2AX, participates en la ruta de recombinacion de conmutacion, son prominentes en la fase G1 (37); y las rupturas de ADN en las regiones S se pueden detectar en la fase G1 (38). Las rupturas de ADN tambien se han identificado en etapas posteriores del ciclo celular en las lmeas de celulas B humanas hipermutantes (39), pero estas demostraron ser independientes de AID (40).
E2A puede funcionar en la fase G1 para preparar un locus para eventos que ocurren mas tarde en el ciclo celular, o incluso durante un ciclo celular subsiguiente. E2A ha sido implicado recientemente en el mantenimiento de la acetilacion de la histona H4 (21), y es posible que E2A funcione para establecer un ambiente local de la cromatina favorable al ataque por AID o la diversificacion efectiva en las celulas hijas.
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Ejemplo 4: La estructura de la cromatina regula la conversion genica
Este ejemplo ilustra como la estructura de la cromatina contribuye al uso de secuencias homologas como donantes para la reparacion utilizando la lmea de celulas B de pollo DT40 como modelo. En DT40, los genes de la inmunoglobulina se someten a la diversificacion de secuencias reguladas mediante la conversion genica planificada por donantes de pseudogenes. Hemos encontrado que la matriz de pseudogenes VA se caracteriza por modificaciones histonas asociadas con la cromatina activa. Hemos demostrado directamente la importancia de la estructura de la cromatina para la conversion genica, utilizando un sistema experimental regulable en el que la protema heterocromatina, HP1, expresada como una fusion al represor Lac, esta atada a los operadores de lactosa polimerizados integrados en la matriz donadora pseudo-VA. El HP1 atado disminuyo la acetilacion de las histonas dentro de la matriz pseudo-VA, y altero el resultado de la diversificacion VA, de modo que predominaban las mutaciones no planificadas en lugar de las mutaciones con plantilla. Asf, la estructura de la cromatina regula la reparacion dirigida por homologfa. Estos resultados sugieren que las modificaciones de las histonas pueden contribuir al mantenimiento de la estabilidad genomica evitando la recombinacion entre secuencias repetitivas.
Este ejemplo usa las siguientes abreviaturas: AcH3, histona H3 acetilada; AcH4, histona H4 acetilada; AID, deaminasa inducida por activacion; DSB, ruptura de doble filamento; GFP, protema fluorescente verde; Ig, inmunoglobulina; MrN, MRE11/RAD50/NBS1; NHEJ, no-homologos de union final; V, variable; UNG, Uracil DNA glicosilasa; AP, abasico; PoliLacO, operador de lactosa polimerizada; ChIP, transferencia de cromatina; Ova, ovoalbumina; LOH, perdida de heterozigosidad.
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Materiales y metodos
Transferencia de cromatina (ChIP). La ChIP se llevo a cabo como se ha descrito anteriormente [48, 89]. Para todos los experimented se analizaron al menos dos preparaciones de cromatina de al menos dos lmeas transfectadas de forma estable independiente. Las figuras presentan un experimento representativo en el cual los resultados del analisis de cuatro amplificaciones separadas se usaron para calcular una desviacion estandar. Se llevaron a cabo cuatro amplificaciones separadas de diluciones en serie de ADN plantilla, para establecer que las intensidades de producto medidas estaban dentro del intervalo lineal. El enriquecimiento del amplicon experimental se normalizo al enriquecimiento de un amplicon de control interno del gen de la ovoalbumina (Ova), amplificado en el mismo tubo por PCR duplex; y el enriquecimiento en ChIP con anticuerpos espedficos se normalizo a experimentos paralelos en los que se llevo a cabo la ChIP con controles de ADN de entrada total. La inclusion del amplicon de control interno de Ova nos permitio normalizar para la eficiencia IP, el trasvase de fondo y las diferencias en la carga de gel. Enriquecimiento = [(YVA/Ova)Ab]/[(^VA/Ova)Entrada]. Como control adicional, se comparo la relacion de los amplicones experimentales y de control en el control de entrada total con una ChIP de control con IgG poliespedfica; en todos los casos, el enriquecimiento en la entrada y los controles de IgG eran esencialmente iguales. Los datos se presentan para experimentos representativos; las desviaciones estandar se calcularon a partir de cuatro amplificaciones separadas de diluciones en serie de ADN plantilla.
Los anticuerpos utilizados fueron: anti-AcH3 (06-599), anti-AcH4 (06-866), y H3 (K4) dimetilado (07-030) de Upstate (Lake Placid, NY). Los cebadores de PCR para ChIP fueron:
VAR: 5'-GCCGTCACTGATTGCCGTTTTCTCCCCTC-3' y 5'-CGAGACGAGGTCAGCGACTCACCTAGGAC-3'; region entre ^VA1 y VA: 5'-CTGTGGCCTGTCAGTGCTTA-3' y 5'-GCAGGGAACCACAAGAACAT-3'; ^VA1: 5'- GGGACTTGTGTCACCAGGAT-3' y 5'-CGCAGTCACATGTGGAATATC-3'; ^VA5: 5'- GAGCCCCATTTTCTCTCCTC- 3' y 5'-GAGATGTGCAGCAACAAGGA-3'; ^VA13: 5'-CCCTCTCCCTATGCAGGTTC-3' y 5'-
CCCCTATCACCATACCAGGA-3'; ^VA18: 5'-CCATTTTCTCCCCTCTCTCC-3' y 5'-TCACCCTACAGCTTCAGTGC- 3'; yVA24: 5'-CCATTTTCTCCCCTCTCTCC-3' y 5'-CAGCCCATCACTCCCTCTTA-3'; ^VA25: 5'-
TCTGTTGGTTTCAGCACAGC-3' y 5'-GCAGTTCTGTGGGATGAGGT-3'; ^VA flanco corriente arriba: 5'- GGCTCCTGTAGCTGATCCTG-3' y 5'-GTTCTTTGCTCTTCGGTTGC-3'; ^VA17 en el alelo dirigido a PoliLacO: 5'- TAGATAGGGATAACAGGGTAATAGC-3' y 5'-AGGGCTGTACCTCAGTTTCAC-3'; OVA: 5'-
ATTGCGCATTGTTATCCACA-3' y 5'-TAAGCCCTGCCAGTTCTCAT-3'; Pol e: 5'-GGGCTGGCTCATCAACAT-3' y 5'- CTGGGTGGCCACATAGAAGT-3' (SEQ ID NOS: 5-28, respectivamente).
Constructos, transfeccion y cultivo celular. El plasmido de expresion de Lacl-HP1 se creo sustituyendo LacI-HP1a de un constructo proporcionado por L. Wallrath (Universidad de Iowa, Iowa City) para AID en pAIDPuro (de H. Arakawa, Munich, Alemania), para situar LacI-HP1 corriente abajo del promotor p-actina de pollo. El plasmido de expresion GFP-LacI (p3'ss-EGFP-LacI) fue proporcionado por A. Belmont (Universidad de Illinois, Urbana). El cultivo celular y la transfeccion se llevaron a cabo como se describe previamente [47]. DT40 PoliLacO-AR se genero por orientacion genica homologa, utilizando un constructo que lleva aproximadamente 3.8 kb de operador de lactosa polimerizada (PoliLacO) flanqueada por brazos disenados para dirigirse a la region entre ^VA17-^VA20, 17 kb corriente arriba de la VAr transcrita. En resumen, los integrantes homologos fueron identificados por pCr, y el marcador seleccionable eliminado por expresion Cre. El linfoma de la bursa DT40 deriva de celulas B en las que solo se reordena un alelo IgA y en el que los dos cromomas parentales se distinguen por un polimorfismo cerca de ^VA17. Esto nos permitio determinar si el alelo reordenado o no arreglado habfa sido atacado por PCR. Los experimentos de control establecieron que la distribucion del ciclo celular era comparable en las celulas DT40 PoliLacO-AR, DT40 PoliLacO- AR GFPLacI y DT40 PoliLacO-AR LacI-HP1; y que el cultivo de celulas con IPTG hasta 500 |jM durante 7 dfas no afecto la tasa de proliferacion o las modificaciones de la cromatina en ^VA17r en celulas de control DT40 PoliLacO- AR GFP-LacI. Los oligonucleotidos para el analisis de la secuencia VA se han descrito [47].
Imagenes de fluorescencia. Para la obtencion de imagenes de fluorescencia, las celulas (2 x 105) fueron sometidas a Cytospin sobre lkaminasas de vidrio y atadas con paraformaldelddo al 2% durante 20 minutos, permeabilizadas con 0.1% de NP-40 durante 15 minutos y tenidas como se describio anteriormente [90]. La tincion primaria fue con un anticuerpo monoclonal anti-LacI (dilucion 1:500; Upstate); y el anticuerpo secundario fue anticuerpo IgG Alexa Fluor 594 (1: 2000, Molecular Probes, Eugene, OR). Para visualizar el nucleo, las celulas se tineron con DAPI (Sigma, Saint Louis, MO). Las imagenes fluorescentes se adquirieron utilizando el sistema de microscopfa DeltaVision (Applied Precision) y se procesaron con software softWoRx (Applied Precision).
RT-PCR. Se recolecto ARN de celulas utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) y se purifico con una columna PreAnalytiX (Qiagen). Los transcritos de VA se amplificaron despues de la dilucion de la plantilla (1:1300); y la p- actina se amplifico a partir de una muestra no diluida. Los cebadores para la amplificacion de VA fueron 5'- GTCAGCAAACCCAGGAGAAAC-3' (SEQ ID NO: 29) y 5'-AATCCACAGTCACTGGGCTG-3' (SEQ ID NO: 30). Los cebadores para la amplificacion de p-actina ya se han descrito [36].
Cuantificacion de variantes de perdida de sIgM y analisis de secuencias. El ensayo de variante de perdida sIgM, que mide las variantes de perdida de sIgM acumuladas resultantes de mutaciones con desplazamiento de marco o no sentido en regiones V mutadas, se uso para cuantificar la diversificacion de regiones de Ig V [47, 50]. En resumen,
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las celulas sIgM+ se aislaron mediante citometna de flujo seguido por la clonacion de dilucion limitativa, y se expandieron durante 4 semanas. Para cuantificar la fraccion de celulas sIgM-, se tineron aproximadamente 1 x 106 celulas con IgM-RPE anti-pollo (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) y se analizaron en un FACScan con el software CellQuest (BD Biosciences).
El PCR de celula individual y el analisis de secuencias se realizaron como se describe [47]. En resumen, se clasificaron las celulas sIgM-, se dividieron almuotas en pozos individuales, se amplificaron y se secuenciaron regiones VA y sus secuencias se compararon con los donantes ^VA para determinar si las mutaciones fueron con plantilla o sin plantilla. El criterio para una mutacion con plantilla fue que nueve bases consecutivas deben ser una coincidencia exacta en el donante y el receptor. Las secuencias fueron derivadas de dos lmeas transfectadas independientemente. Solo se incluyeron secuencias unicas para la clasificacion de las mutaciones.
Resultados
Estructura de cromatina permisiva en las plantillas de donante VA y ^VA
En celulas B de DT40, el gen VA funcional en un alelo de IgA se reordena y se expresa, y el otro no se reorganiza y no se expresa. Se caracterizo la estructura de la cromatina en los alelos reordenados (VAr) y no reordenados (VAu) y la matriz ^VA por transferencia de cromatina (ChIP). La ChIP se llevo a cabo con anticuerpos espedficos para la acetilacion de lisina en el terminal N de las histonas H3 y H4. El ADN recuperado se amplifico en reacciones de PCR duplex; recuperacion normalizada a un amplicon del gen de la ovoalbumina (Ova), que no se expresa en celulas B; y enriquecimiento normalizado a un control de entrada de ADN total (ver Materiales y Metodos para mas detalles). La estructura genomica distinta de VAr y VAu permiten distinguirlos por PCR con cebadores espedficos. La ChIP demostro un considerable enriquecimiento de las histonas acetiladas H3 y H4 (AcH3 y AcH4) en el gen VAr reordenado. En un experimento tfpico, AcH3 se enriquecio mas de 80 veces a VAr y AcH4 mas de 30 veces (Figura 9B). Por el contrario, en el alelo VAu no reordenado, los niveles de AcH3 y AcH4 eran mucho mas bajos que a VAr (16 veces y 7 veces inferior, respectivamente); y solo unos pocos se enriquecieron en relacion con el ADN de entrada.
Se ensayo la estructura de cromatina dentro de la matriz ^VA por amplificacion con cebadores que interrogaron siete sitios, incluyendo una region entre ^VA1 y el gen VA, ^VA1, ^VA5, ^VA13, ^VA18, ^VA24, ^VA25 y la region flanqueante corriente arriba. (Debido a la escasez de polimorfismos, los arreglos ^VA en los dos alelos IgA en DT40 no se pueden distinguir facilmente por PCR). Sorprendentemente, se observo enriquecimiento considerable de AcH3 y AcH4 a lo largo de la matriz ^VA (Figura 9B). El enriquecimiento no fue proporcional a la distancia del gen VAr transcrita, ya que los sitios distantes de VAr no mostraron consistentemente menores niveles de enriquecimiento que los sitios proximales (Figura 9B). Por lo tanto, el enriquecimiento de histonas acetiladas dentro de la matriz ^VA no representa simplemente una difusion graduada de la modificacion de la cromatina desde el gen VAr transcrito hasta los sitios corriente arriba. La estructura de cromatina no uniforme del locus sugiere la presencia de elementos cis que regulan la estructura de la cromatina en la matriz ^VA.
Fijacion reversible de protemas de fusion de Lacl a la matriz ^VA en DT40 PoliLacO-AR
La modificacion local de la estructura de la cromatina puede conseguirse uniendo los reguladores a los sitios de union al ADN como protemas de fusion apropiadas. Esta estrategia se ha utilizado, por ejemplo, para demostrar que la protema heterocromatina HP1a, expresada como una fusion con el represor de lactosa (Lacl-HP1), promueve una estructura de cromatina cerrada y la inactivacion de los genes informadores vecinos de una repeticion LacO en Drosophila [61, 62]; y para demostrar que la fijacion de la histona metiltransferasa G9a de vertebrados a un sitio de union GAL4 dentro de un minigen V(D)J reportero afecta la recombinacion mediada no homologa de ese constructo [63]. La lmea celular, DT40 PoliLacO-AR, que es un derivado de DT40 en el que se ha insertado el operador de lactosa polimerizado (PoliLacO) mediante un gen homologo dirigido entre ^VA17-^VA20, 17 kb corriente arriba del transcripto VAr (Figura 10A). El inserto PoliLacO es de 3.8 kb de longitud y consta de aproximadamente 100 copias de un operador de 20-mero [64]. Usando esta lmea celular, es posible ensayar los efectos de los factores reguladores atados sobre la recombinacion homologa en un proceso fisiologico dentro de un locus endogeno, evitando la necesidad de un reportero transgenico. Los experimentos de control han demostrado que la etiqueta PoliLacO no afecta a la proliferacion celular, el ciclo celular, o la diversificacion de genes Ig.
En DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl, que expresa de forma estable una protema verde fluorescente mejorada fusionada a un represor de lactosa (GFP-Lacl), el alelo Ar marcado puede ser visualizado directamente por microscopfa de fluorescencia y aparece como un punto distinto en cada celula (Figura 10B, izquierda). El fijacion es reversible, ya que los puntos brillantes no son evidentes tras un cultivo durante la noche con IPTG 100 |jM, lo que impide que Lacl se una a LacO (Figura 10B, derecha).
El HP1 atado disminuye las modificaciones caractensticas de la cromatina activa a ^VA
Para manipular la estructura de la cromatina en la matriz ^VA, generamos transfectantes estables de DT40 PoliLacO-AR que expresan la protema HP1 de Drosophila melanogaster fusionada a Lacl (Lacl-HP1). El HP1 es una
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protema heterocromatina no histona que funciona en el silenciamiento de genes heterocromaticos, la propagacion de heterocromatina y desacetilacion de histonas [58-60]. El HP1 atado ha demostrado promover una estructura cerrada de cromatina en los genes adyacentes [61, 62, 66-68]. La tincion de DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 transfectantes con anticuerpos anti-Lacl mostro que el Lacl-HP1 colocalizado con regiones densas de DAPI correspondientes a la heterocromatina pericentrica (Figura 11A], se comporta como un marcador funcional de heterocromatina [65].
Para indagarse si el Lacl-HP1 atado altero la estructura de la cromatina, se ensayaron modificaciones de la cromatina en ^VA17. Este es el unico sitio en el arreglo ^VA en el que los alelos reordenados y no reordenados pueden distinguirse mediante el uso de cebadores de PCR espedficos, debido a un polimorfismo de secuencia creado durante la construccion de DT40 PoliLacO. Despues de la ChIP, se amplifico el ADN con cebadores de PCR espedficos para el alelo reordenado dirigido (^VA17r). El enriquecimiento de ^VA17r se comparo con el gen de la ovoalbumina no expresada (Ova) como control interno; y normalizado a la relacion de enriquecimiento de ^VA17r: Ova en el ADN de entrada total (ver Material y Metodos). AcH3 y AcH4 se enriquecieron en controles ^vA17r en DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl 2.2 veces y 5.9 veces, respectivamente (Figura 11B, C). Estos niveles de enriquecimiento son comparables a los documentados en DT40 (Figura 9B). (Observese que el analisis de la modificacion en ^VA en la exploracion de la lmea DT40 parental incluye necesariamente ambos alelos, lo que puede subestimar las modificaciones de activacion en el alelo reordenado. Al contrario, en el analisis de las modificaciones en ^VA17r solo interroga el alelo activo.) AcH3 y AcH4 fueron no enriquecidos en ^VA17r en DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 transfectantes (0.6 y 1.0 veces, respectivamente, Figura 11B, C), lo que es compatible con el silenciamiento mediado por HP1. El HP1 puede efectuar el silenciamiento mediante el reclutamiento de una histona metiltransferasa que modifica la lisina 9 de la histona H3 [66-68], pero tambien puede promover el silencio independiente de esta modificacion [61]. La ChIP utilizando anticuerpos contra cualquiera de H3 di- y tri-metilada (K9) no revelo un claro enriquecimiento de la modificacion de H3 K9-Me (datos no presentados). La metilacion de la lisina 4 (diMeK4) de la histona H3 se asocia con la transcripcion y generalmente presenta una distribucion superpuesta con acetilacion [69,70]. Los ensayos de diMeK4 (H3) en ^VA17r demostraron que esta modificacion estaba enriquecida 18.9 veces en celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl, pero a niveles de fondo en celulas LacL-HP1 de PoliLacO-AR DT40 (Figura 11B, C).
El HP1 promueve el mantenimiento y la propagacion de heterocromatina [66]. Para verificar que los cambios en la estructura de la cromatina promovida por HP1 atado no se propagaron a traves del cromosoma, examinamos otro sitio cerca del locus de la cadena liviana A en el cromosoma 15, el gen que codifica la subunidad catalftica de los Pol £ de ADN. Los Pol £ de ADN se expresan de manera omnipresente y esenciales para la replicacion cromosomica en eucariotas [71], y son codificados por un mapeo de genes de aproximadamente 2.1 Mb de IgA. No se encontro diferencia en el enriquecimiento de AcH3 en la region promotora de polo en el DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 transfectantes en relacion a DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl controles (Pol £ /Ova enriquecimiento de 8.5 veces y 8.4 veces, respectivamente, Figura 3C). Del mismo modo, no hubo diferencias en AcH4 en el promotor Pol £ en los transfectantes DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 en relacion con los controles DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl (Pol £/Ova enriquecimiento de 1.9 veces y 1.7 veces, respectivamente, Figura 11C). Por lo tanto, la fijacion de Lacl-HP1 a ^VA causo modificaciones locales en la estructura de la cromatina, disminuyendo las modificaciones AcH3, AcH4 y diMeK4 (H3) caractensticas de la cromatina abierta en ^VA17r, y haciendo que la cromatina adopte un estado menos permisivo.
El HP1 atado no afecta a la expresion genica de VA
Hemos indagado como HT1 atado afecto los niveles de AcH3 y AcH4 en el VAr expresado mediante la comparacion de estas modificaciones en celulas DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 y DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl transfectantes (Figura 12A). El HP1 atado disminuyo los niveles de AcH3 y AcH4 hasta aproximadamente el 40% y el 20% de los niveles de control, respectivamente. Para indagar si esta expresion de genes afectados, se ensayo tanto la expresion IgM (sIgM) de superficie niveles de transcripcion de VA. Las celulas de tincion con IgM anti-pollo de raton mostraron que la expresion de sIgM era comparable en lmeas DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl y DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1, cultivadas en presencia o ausencia de IPTG (Figura 12B). Los niveles de transcripcion de VA se ensayaron mediante RT-PCR cuantitativa de ARN recolectado a partir de celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl y DT40 PoliLacO-AR Lacl- HP1 y normalizaron a p-actina como control (Figura 12C). No se observo diferencia significativa entre los niveles de transcripcion de VA en las dos lmeas celulares, lo que demuestra que la transcripcion no se ve afectada por la vinculacion de HP1 dentro de la matriz ^VA. De este modo el Lacl-HP1 atado no afecto a la expresion del gen Ig descendente, aunque disminuyo los niveles de AcH3 y AcH4 a VAR. Los niveles muy altos de AcH3 y AcH4 caractensticos de VA (Figura 9B, Figura 12A), por lo tanto, no son esenciales para mantener altos niveles de expresion genica.
El HP1 atado altera la estructura de la cromatina local
Para evaluar la amplitud de efectos en la cromatina de Lacl-HP1 fueron examinados los niveles de AcH3 y AcH4 a lo largo de la IgA de locus en la cadena liviana en los mismos amplicones examinados en la Figura 9, incluyendo uno en el flanco, seis en la matriz ^VA, asf como en el VA expresado. Los niveles de modificacion se determinaron comparando las relaciones de ^VA17R:Ova de las condiciones inmunoprecipitadas y de entrada, como en la Figura
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11B. Las modificaciones de AcH3 en los sitios estudiados oscilaron entre el 24% y el 63% de los niveles en los mismos sitios en los controles (Figura 13A, barras oscuras); y el nivel medio de acetilacion de H3 en todos los sitios fue de 38% del control de PoliLacO-AR GFP-Lacl. El cultivo de transfectantes de DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 durante tres dfas con IPTG 250 pM aumento la acetilacion de H3 en los ocho sitios estudiados (Figura 13A, comparacion de barras oscuras y de luz). Los efectos del cultivo de IPTG fueron algo variables, pero en la mayona de los sitios el cultivo de IPTG restauro los niveles de AcH3 hasta al menos el 45% del nivel en las celulas de control DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl; con un promedio de mas del 80%. Por lo tanto, las modificaciones de la cromatina en ^VA17r en celulas DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 resultaron directamente del Lacl-HP1 atado y fueron en gran medida reversibles.
La acetilacion de H4 se estudio en los mismos ocho sitios (Figura 13B, barras oscuras). Se encontro que las modificaciones de AcH4 oscilaban entre 18% y 42% de los niveles de control; y el nivel medio fue de 29% de la lmea celular de control. El cultivo con IPTG durante tres dfas incremento la acetilacion de H4 en los ocho sitios estudiados (Figura 13B, comparacion de barras oscuras y de luz), restableciendo los niveles de acetilacion de H4 hasta al menos 57% del nivel en el control de celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl; con un promedio de mas del 80%. Ademas, IPTG puede revertir al menos parcialmente los efectos de Lacl-HP1.
Estos resultados muestran que las modificaciones observadas de la cromatina en la matriz ^VA se deben a la fijacion de HP1. Por otra parte, el hecho de que estas modificaciones son reversibles muestra que un mecanismo activo invierte las modificaciones de las histonas impuestas por la fijacion de los factores de modificacion de la cromatina en ^VA.
El HP1 atado impide la mutagenesis por plantilla.
La capacidad para manipular la estructura de la cromatina en ^VA sujetando Lacl-HP1 (Figuras 11-13) nos permitio preguntar directamente si y como la estructura de la cromatina influye en la conversion del gen Ig. Se utilizo el ensayo de variante de perdida de sIgM para determinar si Lacl-HP1 atado afectaba la velocidad clonal de diversificacion de secuencias del gen VAr reordenado. Este ensayo de fluctuacion mide la fraccion de las celulas variantes que ya no expresan sIgM estructuralmente intacto, y por lo tanto la puntuacion de los eventos de mutacion resultante de la conversion de genes o mutagenesis puntual [47, 50]. Los derivados clonales independientes de DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl y DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 se establecieron limitando la clonacion por dilucion de celulas sIgM+ y la fraccion de celulas sIgM- en cada poblacion determinada por citometna de flujo de celulas cultivadas durante 4 semanas, y luego se tineron con anticuerpo anti-IgM. La mediana de la tasa de perdida sIgM fue de 0.5% para celulas DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl y 2.8% para celulas DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 (Figura 14A). Esto corresponde a una aceleracion de 5.6 veces de las tasas de diversificacion clonal en los transfectantes Lacl-HP1 en relacion con los controles GFP-Lacl.
La diversificacion genetica de Ig en las celulas B de pollo se produce predominantemente mediante la conversion genica (mutacion por plantilla); pero si la conversion genica se ve afectada, por ejemplo, por la ausencia de factores esenciales, la reparacion puede crear una fraccion significativa de mutaciones sin plantilla [50-55]. Esto se acompana tfpicamente de un aumento en la tasa de diversificacion clonal, debido a que las plantillas ^VA para la conversion genica son aproximadamente 80% identicas al gen reordenado y una fraccion significativa de lesiones de ADN reparadas por conversion genica no sufren ninguna alteracion de la secuencia; en contraste, la reparacion por una polimerasa mutagenica es mas probable que altere la secuencia de ADN. Para determinar el grado de diversificacion acelerada de HP1, clasificamos celulas sIgM individuales de los transfectantes PoliLacO-AR GFP-Lacl DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1, regiones VA expresadas amplificadas por PCR de una sola celula y se secuenciaron estas regiones. Los cambios de secuencia fueron categorizados como con plantilla si se encontraban dentro de un tracto que contiene dos o mas mutaciones y el tracto era una coincidencia exacta de al menos 9 pb de una secuencia donante ^VA; y como ambiguo si consistieron en solo un cambio de base unica, pero sf coincidiendo con al menos 9 pb de una secuencia donante ^VA. Tambien se puntuaron los eventos sin plantilla, que consistfan en mutaciones puntuales, eliminaciones e inserciones. En los transfectantes DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl de control, se documentaron 54 eventos con plantilla y 2 eventos ambiguos entre 70 mutaciones unicas; por lo tanto la mayona de los eventos (77%) fueron con plantilla, y una pequena fraccion de eventos (20%) fueron mutaciones puntuales (Figura 14B, izquierda, Figura 15). Sorprendentemente, en las celulas DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 predominaron las mutaciones puntuales (59%), acompanadas de eliminaciones (8%) e inserciones (14%); mientras que solo se documentaron 1 evento claramente templado y 6 eventos ambiguos entre 36 mutaciones unicas (Figura 14B, derecha, Figura 15). Por lo tanto, solo el 3% de las mutaciones fueron claramente con plantilla, e incluso incluyendo la clase ambigua de mutaciones potencialmente con plantilla, las plantillas podnas representar no mas del 19% de las mutaciones. Las comparaciones estadfsticas mostraron que la diferencia entre la fraccion de mutaciones claramente con plantilla en las celulas de control DT40 PoliLacO-AR GFP-Lacl y los transfectantes DT40 PoliLacO-AR Lacl-HP1 (77% comparado con 3%) fue altamente significativa (P=7.1 x 10-7, prueba exacta de Fisher). La diferencia en la fraccion de mutaciones ambiguas, potencialmente con plantilla en las celulas de control (3%) y transfectantes HP1 (17%) tambien es significativa (P=0.05, prueba exacta de Fisher). Esto sugiere que algunas mutaciones en esta categona pueden surgir como resultado de las limitaciones en la longitud de un tracto de conversion de genes impuestas por la cromatina de donante no admisible. Por lo tanto, la fijacion de HP1 acelero las tasas clonales de mutagenesis al afectar la mutacion con plantilla.
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Discusion
La conversion genica en los loci de Ig de pollo utiliza una matriz de donantes ^V corriente arriba como plantillas para la reparacion dirigida por homolog^a de lesiones dirigidas a los genes V reordenados y transcritos. Este ejemplo muestra que en las celulas B de pollo que llevan a cabo la conversion del gen de la Ig activa, la cromatina dentro de la matriz donante ^VA se caracteriza por el enriquecimiento de H3 y H4 acetiladas, modificaciones que se correlacionan con una estructura de cromatina abierta. Demostramos directamente la importancia de la estructura permisiva de la cromatina para la conversion del gen Ig, mostrando que el sujetar la protema heterocromatina HP1 a la matriz donante ^VA causo cambios locales en la estructura de la cromatina, disminuyendo las modificaciones AcH3, AcH4 y diMeK4 (H3) caractensticas de la cromatina abierta. Aunque estos cambios no fueron acompanados por la caractenstica de modificacion Me-K9 (H3) de la cromatina cerrada, hicieron que la region adoptara un estado menos permisivo para la conversion genica. El fijacion de HP1 fue acompanado por un cambio dramatico en el espectro de mutacion de Ig VA, de modo que las mutaciones con plantilla estaban en la minona y las mutaciones puntuales predominaron. Es importante destacar que este efecto sobre la mutagenesis se correlaciono con un cambio en la estructura de la cromatina y no cambios en la expresion del locus. Por lo tanto, la estructura de la cromatina puede determinar si la conversion genica se produce en una lesion de ADN generada endogenamente.
El mecanismo de la conversion genica dentro de un paisaje complejo de la cromatina
La conversion genica en VA resulta del cebado de una nueva smtesis de ADN en el extremo 3' de una ruptura utilizando una region ^VA como plantilla. La conversion genica requiere sinapsis entre el ADN donante y el receptor, asf como el acceso al donante por factores que llevan a cabo la reparacion dirigida por homologfa. Los niveles elevados de acetilacion H3 y H4 caractensticos de la matriz ^VA en DT40 de tipo salvaje son evidencia de una estructura de cromatina relajada que incremental la accesibilidad de los genes ^VA a factores de accion trans y tambien creana una arquitectura tridimensional que es favorable para la sinapsis de la secuencia.
El HP1 atado dentro de la matriz de donantes de ^VA dano la conversion genica en el VAr reordenado, sin afectar la expresion genica de VA. Los cambios cromatograficos causados por HP1 atado pueden perjudicar la conversion genica al impedir el acceso de los factores de reparacion y la cadena invasora a la plantilla donante. El HP1 atado tambien puede contribuir a una arquitectura cromosomica mayor que afecta a la mecanica de las vfas de reparacion del ADN, como el bucle necesario para yuxtaponer las secuencias del donante y receptor. Las mutaciones puntuales que se acumulan en los transfectantes de Lacl-HP1 son tfpicas de la reparacion recombinada frustrada, y son caractensticas de las celulas que carecen de factores trans actores esenciales para la recombinacion [49-55] o algunos o todos de la matriz de donantes ^V [56]. El HP1 regula la estructura de la cromatina y el silenciamiento de genes heterocromaticos de dos maneras, al asociarse con una histona metiltransferasa [66] y el reclutamiento de histona deacetilasas [60]. El HP1 atado causo modificaciones caractensticas de una estructura de cromatina no permisiva dentro de ^VA.
La acetilacion de histona se ha documentado en genes de Ig de mamffero transcritos activamente sometidos a hipermutacion somatica y recombinacion de conmutacion de clase, pero aun no se ha resuelto si la hiperacetilacion contribuye a la focalizacion de la diversificacion [72-76]. Una conexion entre la acetilacion de histonas y la conversion de genes fue sugerida por experimentos que muestran que el tratamiento de las celulas DT40 con el inhibidor de la histona desacetilasa, la tricostatina A, promueve la desacetilacion de la histona en todo el genoma acompanado de un aumento de la conversion genica en VAr[77]. Sin embargo, la interpretacion de estos resultados se complica por el hecho de que los efectos de la tricostatina A son genomicos y no espedficos. La lmea celular DT40 PoliLacO-AR permite la manipulacion local de la estructura de la cromatina, evitando esa complicacion. Ademas, hemos sido capaces de demostrar que los efectos de atar una protema de fusion Lacl-HP1 se invirtieron en gran medida en el cultivo con IPTG, por lo que un mecanismo activo debe determinar la modificacion de la cromatina a ^VA.
Para estudios de recombinacion homologa, la lmea de celulas DT40 PofyLacO-AR B tiene la ventaja adicional de que la conversion genica de Ig es un proceso fisiologico dentro de un locus endogeno, evitando la necesidad de un reportero transgenico.
Estructura de la cromatina, estabilidad del genoma, envejecimiento y terapia genica
La importancia de la estructura de la cromatina para el resultado de la recombinacion homologa tiene implicaciones para comprender los mecanismos que normalmente mantienen la estabilidad genomica. Hay un gran numero de elementos repetitivos distribuidos en todo el genoma de los vertebrados, y la recombinacion entre estos elementos puede conducir a la inestabilidad genomica [78]. En el genoma humano, hay aproximadamente un millon de elementos Alu, y la recombinacion entre los elementos Alu puede causar duplicaciones que conducen a la tumorigenesis y a enfermedades geneticas [79, 80]. Las histonas que llevan modificaciones represivas se enriquecen en elementos repetitivos [81]. Estas modificaciones, indudablemente, mantienen la represion transcripcional; nuestros resultados sugieren que tambien pueden contribuir a la supresion de la recombinacion.
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La perdida de heterozigosidad (LOH) se produce como resultado de la recombinacion mitotica desigual entre homologos en sitios alelicos. El mecanismo de LOH es de particular interes, ya que contribuye a la perdida de la funcion supresora tumoral de del gen conduce a la tumorigenesis [82]. Recientes experimented han demostrado un aumento dependiente de la edad en LOH en S. cerevisiae [83] y en los genes reportero en Drosophila celulas germinales [84]; y un aumento en la recombinacion homologa en celulas pancreaticas de raton [85]. Los mecanismos propuestos para explicar LOH asociado a la edad incluyen elevadas tasas de dano en el ADN, cambios en la distribucion del ciclo celular, y la inactivacion de la homologfa independiente de las vfas de reparacion con el envejecimiento. Los resultados sugieren otra posibilidad, que la relajacion de la estructura de la cromatina puede acompanar el envejecimiento y promover un genoma en todo el aumento de la recombinacion homologa en el envejecimiento de las celulas. Esta posibilidad es apoyada por el reciente analisis de Drosophila [86], asf como por la evidencia reciente de que la mutacion en la lamina A responsable del smdrome de Progeria de Hutchinson-Gilford conduce a una perdida del genoma de metilacion H3 [87].
El hallazgo de que la estructura de la cromatina regula la recombinacion homologa tambien tiene ramificaciones practicas. Un considerable esfuerzo actual esta dirigido hacia el desarrollo de estrategias que aprovechan la capacidad de una celula para la homologfa dependiente de reparacion para promover la terapia genica, proporcionando un gen donante intacto para reemplazar a un gen diana deficiente [88]. Los resultados sugieren que la estructura permisiva en el donante sera un parametro de diseno importante en el desarrollo de genes donantes para aplicaciones terapeuticas.
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Ejemplo 5: Conversion de genes acelerada por modificaciones distintas de la cromatina
Este ejemplo demuestra que la eficiencia de la reparacion esta determinada por la estructura de la cromatina del donante. El analisis aprovecha un sitio de regulacion cis (operadores de lactosa polimerizados, PoliLacO) insertado justo corriente arriba del gen VA transcrito y diversificante en la lmea de celulas DT40 B de pollo. Los datos muestran que el sujetar el activador VP16 o la histona chaperona, HIRA, se altera la estructura de la cromatina local y se acelera la conversion genica aproximadamente 10 veces. Si bien estos dos factores tienen resultados funcionales comparables, tienen efectos distintos sobre la estructura de la cromatina. El fijacion de VP16 aumenta los niveles locales de histonas acetiladas H3 y H4; mientras que la fijacion de HIRA aumenta la densidad de los nucleosomas. Por lo tanto, resultados funcionales comparables pueden lograrse mediante modificaciones de cromatina distintas.
Materiales y metodos
Transferencia de cromatina (ChIP). La ChIP se llevo a cabo como se ha descrito anteriormente (Cummings et al., 2007). Para todos los experimentos se analizaron al menos dos preparaciones de cromatina de al menos dos lmeas transfectadas de forma estable independientes. Las figuras presentan un experimento representativo en el cual los resultados del analisis de cuatro amplificaciones separadas se usaron para calcular una desviacion estandar. Se llevaron a cabo cuatro amplificaciones separadas de diluciones en serie de ADN plantilla, para establecer que las intensidades de producto medidas estaban dentro del intervalo lineal. El enriquecimiento del amplicon experimental se normalizo al enriquecimiento de un amplicon de control interno del gen de la ovoalbumina (Ova), amplificado en el mismo tubo por PCR duplex; y el enriquecimiento en ChIP con anticuerpos espedficos se normalizo a experimentos paralelos en los que se llevo a cabo ChIP con controles de ADN de entrada total. La inclusion del amplicon de control interno de Ova nos permitio normalizar para la eficiencia IP, el trasvase de fondo y las diferencias en la carga de gel. Enriquecimiento = [(^VA/Ova)Ab]/[(^VA/Ova)Entrada]. Como control adicional, se comparo la relacion de los amplicones experimentales y de control en el control de entrada total con una ChIP de control con IgG poliespedfica; En todos los casos, el enriquecimiento en la entrada y los controles de IgG eran esencialmente iguales. Los datos se presentan para experimentos representativos; Las desviaciones estandar se calcularon a partir de cuatro amplificaciones separadas de diluciones en serie de ADN plantilla.
Los anticuerpos utilizados fueron: anti-H3 CT-pan, anti-AcH3 (06-599), anti-AcH4 (06-866) y dimetilado H3(K4) (07-030) de Upstate (Lake Placid, NY).
Los cebadores de PCR para ChIP fueron:
VAr: 5'-GCCGTCACTGATTGCCGTTTTCTCCCCTC-3' y 5'-CGAGACGAGGTCAGCGACTCACCTAGGAC-3'; region promotora entre ^VA1 y VA: 5'-CTGTGGCCTGTCAGTGCTTA-3' y 5'-GCAGGGAACCACAAGAACAT- 3'; ^VA1: 5'- GGGACTTGTGTCACCAGGAT-3' y 5'-CGCAGTCACATGTGGAATATC-3'; ^VA5: 5'- GAGCCCCATTTTCTCTCCTC- 3' y 5'-GAGATGTGCAGCAACAAGGA-3'; ^VA13: 5'-CCCTCTCCCTATGCAGGTTC-3' y 5'-
CCCCTATCACCATACCAGGA-3'; ^VA18: 5'-CCATTTTCTCCCCTCTCTCC-3' y 5'-TCACCCTACAGCTTCAGTGC- 3'; yVA24: 5'-CCATTTTCTCCCCTCTCTCC-3' y 5'-CAGCCCATCACTCCCTCTTA-3'; ^VA25: 5'-
TCTGTTGGTTTCAGCACAGC-3' y 5'-GCAGTTCTGTGGGATGAGGT-3'; ^VA flanco corriente arriba: 5'- GGCTCCTGTAGCTGATCCTG-3' y 5'-GTTCTTTGCTCTTCGGTTGC-3'; ^VA17 en el alelo dirigido a PoliLacO: 5'- TAGATAGGGATAACAGGGTAATAGC-3' y 5'-AGGGCTGTACCTCAGTTTCAC-3'; OVA: 5'-
ATTGCGCATTGTTATCCACA-3' y 5'-TAAGCCCTGCCAGTTCTCAT-3'; Pol £: 5'-GGGCTGGCTCATCAACAT-3' y 5'- CTGGGTGGCCACATAGAAGT-3' (SEQ ID NOS: 5-28, respectivamente).
Digestion con MNasa y transferencia Southern. Se prepararon nucleos y se realizaron digestiones con 0, 3, 7, 15, 30 y 60 unidades de MNasa tal como se describio (Prioleau et al., 1999). Despues de la digestion con MNasa, el ADN se extrajo tres veces con fenol:cloroformo:alcohol isoairnlico y se precipito con etanol. Se cargaron veinte microgramos de ADN en un gel, se resolvieron mediante electroforesis y se transfirieron para hibridacion Southern. La sonda lacO se marco por cebado aleatorio, utilizando como molde un fragmento de aproximadamente 500 pb de longitud que contema repeticiones de polyLacO.
Imagenes de fluorescencia. Para la obtencion de imagenes de fluorescencia, las celulas (2 x 105) fueron sometidas a Cytospin sobre laminas de vidrio y se fijaron con paraformaldeddo al 2% durante 15 minutos. Para visualizar el nucleo, las celulas se tineron con DAPI (Sigma, Saint Louis, MO). Las imagenes fluorescentes se adquirieron utilizando el sistema de microscopfa DeltaVision (Applied Precision) y se procesaron con software softWoRx (Applied Precision).
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RT-PCR. Se recogio ARN de celulas utilizando Reactivo TRIzol (Invitrogen). Los transcritos de VA y p-actina se amplificaron despues de la dilucion de la plantilla. Los cebadores para la amplificacion de VA fueron 5'- GTCAGCAAACCCAGGAGAAAC-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-AATCCACAGTCACTGGGCTG-3' (SEQ ID NO: 4). Se han descrito los cebadores para la amplificacion de la p-actina (Arakawa et al., 2002).
Cuantificacion de variantes de perdida de sIgM y analisis de secuencias. El ensayo de la variante de perdida de sIgM, que mide las variantes de perdida de sIgM acumuladas resultantes de mutaciones de desplazamiento de marco o mutaciones sin sentido en regiones V mutadas, se utilizo para cuantificar la diversificacion de la region de Ig V (Sale et al., 2001; Yabuki et al., 2005; Cummings et al. 2007). En resumen, las celulas sIgM+ se aislaron mediante citometna de flujo seguida por la clonacion de dilucion limitativa, y se expandieron durante 4 semanas. Para cuantificar la fraccion de celulas sIgM-, se tineron aproximadamente 1 x 106 celulas con IgM-RPE anti-pollo (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) y se analizaron en un FACScan con el software CellQuest (BD Biosciences).
La PCR de una sola celula y el analisis de secuencias se realizaron como se describe (Yabuki et al., 2005, Cummings et al., 2007). En resumen, se clasificaron las celulas sIgM-, se dividieron almuotas en pozos individuales, se amplificaron y se secuenciaron regiones VA y sus secuencias se compararon con los donantes ^VA para determinar si las mutaciones fueron con plantilla o sin plantilla. El criterio para una mutacion con plantilla fue que nueve bases consecutivas deben ser una coincidencia exacta en el donante y el receptor. Las secuencias eran derivadas de dos lmeas transfectadas independientemente. Solo se incluyeron secuencias unicas para la clasificacion de las mutaciones.
Resultados
El VP16 atado acelera la conversion de genes
Si la estructura represora de la cromatina del donante perjudica la conversion genica, la activacion de las modificaciones podna promover la conversion genica. Para probar esta posibilidad, aprovechamos la lmea celular PoliLacO-A DT40 construida por nuestro laboratorio. En esta lmea celular, se ha insertado el operador de lactosa polimerizada (PoliLacO) en la matriz ^VA entre ^VA17-^VA20, 17 kb corriente arriba del gen VA expresado (Figura 16A, Ejemplo 4). Esto nos permite analizar los efectos de los factores reguladores atados expresados como fusiones con el represor de la lactosa. Los experimentos de control han demostrado que la etiqueta PoliLacO no afecta a la proliferacion celular, al perfil del ciclo celular o a la diversificacion del gen Ig.
La perdida de acetilacion de histonas dentro de los donadores de ^VA se correlaciona con la disminucion de la conversion genica en VA (Ejemplo 4). Por lo tanto, probamos el efecto de VP16, un potente transactivador derivado del virus herpes, que se ha asociado con la relajacion de la cromatina y el reclutamiento de las histonas acetiltransferasas (Tumbar et al., 1999; Carpenter et al., 2005). Generamos DT40 PoliLacO-AR transfectantes que expresan de forma estable GFP-Lacl-VP16. La transferencia Western confirmo la expresion de la protema (Figura 16B). El perfil del ciclo celular (Figura 16C) y los niveles de transcripcion A (Figura 16D) no se alteraron con respecto a los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl de control. Las imagenes fluorescentes de los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16 mostraron una sola mancha verde dentro del nucleo, evidencia de la expresion de GFP- Lacl-VP16 y union a PoliLacO (Figura 16E).
Se ensayo la acetilacion de histonas en celulas PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16 y control DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl. La matriz ^VA se ensayo por amplificacion con cebadores espedficos para siete sitios, incluyendo la region promotora entre ^VA1 y el gen VA (VApro), ^VA1, ^VA5, ^VA13, ^VA24, ^VA25. (Debido a la ausencia de polimorfismos, los arreglos ^vA en los dos alelos IgA en DT40 no se puede distinguir facilmente por PCR). Ademas, hemos ensayado modificaciones de cromatina en: (1) ^VA17, que debido a una secuencia polimorfismo creado durante la construccion de DT40 PoliLacO-A, es el unico sitio en la ^VA matriz en la que los alelos reordenados y sin reordenar se pueden distinguir mediante el uso de espedficos PCR, (2) el alelo reordenado de VA (VAr), (3) el alelo no reordenado de VA (VAu) y (4) el gen Pol £, un control intracromosomico. La amplificacion de los sitios ^VA se realizo en duplex con el gen de la ovoalbumina no expresada (Ova). Por lo tanto, Ova funciona como un control interno, y la relacion de enriquecimiento de ^VA: Ova de inmunoprecipitaciones se normalizo a ^VA: relacion Ova de ADN de entrada total (ver Material y Metodos). El VP16 atado aumento tanto los niveles de AcH3 (Figura 17A) como los de AcH4 (Figura 17B) en los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16 en relacion con las celulas DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl de control.
Se utilizo el ensayo de variante de perdida de sIgM para indagar si el la fijacion de VP16 altero la tasa clonal de diversificacion de secuencia de VA. Este ensayo de fluctuacion mide la fraccion de celulas variantes que ya no expresan sIgM estructuralmente intacto y, de este modo, registra los eventos de mutacion resultantes de la conversion genica, mutacion puntual, insercion o eliminacion (Sale et al., 2001; Yabuki et al., 2005). Mientras que la conversion genica es la via predominante de la diversificacion de genes de Ig en las celulas B de pollo, si la conversion genica se ve afectada (por ejemplo, por la ausencia de factores de recombinacion esenciales (Sale et al., 2001; Niedzwiedz et al., 2004; Hatanaka et al., 2005; Kawamoto et al., 2005; Mcllwraith et al., 2005; Yamamoto et al., 2005), otros resultados de la reparacion, particularmente las mutaciones puntuales, predominan. Por lo que la
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diversificacion es mejor monitorizada por este ensayo de perdida de funcion, en lugar de un ensamblaje slgM- a sIgM+ de ganancia de funcion, que registra solo la conversion genica (Saribasak et al., 2006).
Los derivados clonales independientes de los transfectantes DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl y DT40 PoliLacO-A GFP- Lacl-VP16 se establecieron limitando la clonacion por dilucion de celulas sIgM+ y despues de 4 semanas de cultivo la fraccion de celulas slgM" en cada poblacion determinada por citometna de flujo de celulas tenidas con anticuerpo anti-IgM. La comparacion de los porcentajes medianos de las celulas slgM- mostro que los transfectantes DT40 PoliLacO-GFP-Lacl-VP16 exhi^an un aumento de 8.4 veces en la diversificacion con respecto a las celulas de control DT40 PoliLacO-GFP-Lacl (Figura 17B). El analisis de secuencias de las regiones VA amplificadas por PCR de celula unica mostro que la mayor diversificacion era mediante la conversion genica tanto en celulas de control como en celulas en las que VP16 estaba atada a IgA (Figura 22).
La histona H3.3 se enriquece con los genes donantes ^VA
No solo las modificaciones de histonas, sino tambien los cambios localizados en la composicion de histonas de los nucleosomas pueden contribuir a la regulacion de la estructura de la cromatina. Una variante de histona asociada con la activacion de la cromatina y depositada independientemente de la replicacion es H3.3. La histona H3.3 es la principal variante de tipo H3 que contiene modificaciones postraduccion asociadas a la activacion (McKittrick et al., 2004; Henikoff, 2008), por lo que era interesante preguntar si H3.3 se enriquecio en la matriz ^VA. Para distinguir H3 de H3.3 por ChIP, se genero una derivada DT40 que expresa de forma estable FLAGtagged H3.3 (H3.3-FLAG).
La caracterizacion de la deposicion de H3.3 por ChIP con un anticuerpo anti-FLAG demostro el enriquecimiento de la variante H3.3 en el gen VAr expresado. La estructura de la cromatina dentro de la matriz ^VA se ensayo mediante la amplificacion de los sitios corriente arriba del gen VA reordenado y expresado que incluye ^VA1, ^VA5, ^VA13, ^VA24, ^VA25, ^VA17R, VAr (Figura 18A), asf como el alelo reordenado, VAu; y en otro gen en el mismo cromosoma que IgA, Pol £. En un experimento tfpico, H3.3 se enriquecio mas de 4 veces en relacion con el ADN de entrada a VAR; pero, sorprendentemente, hemos observado enriquecimiento considerable de H3.3 a lo largo de la matriz ^VA, con mayor enriquecimiento a ^VA5 y VApro (Figura 18B). El enriquecimiento de H3.3 dentro de la matriz ^VA no representa simplemente una difusion graduada de la variante del gen VAr transcrita a los sitios corrientes arriba, ya que los sitios proximales no muestran consistentemente mayores niveles de enriquecimiento que los sitios distales. La estructura de cromatina no uniforme del locus sugiere la presencia de elementos cis, particularmente en la region ^VA5, que puede regular la expresion y/o diversificacion del locus.
HIRA atado provoca un aumento local en la deposicion de histonas
HIRA es una chaperona de histona, y una de sus funciones es ensamblar nucleosomas que contienen la variante de histona, H3.3 (Ray-Gallet et al., 2002; Tagami et al., 2004). El enriquecimiento de H3.3 en la matriz ^VA sugirio, por lo tanto, que la vinculacion de HIRA podna acelerar la diversificacion de genes Ig, analoga al efecto de VP16 atado. Para probar esto, se generaron transfectantes DT40 estables PoliLacO-A HIRA-Lacl, se verificaron niveles comparables de expresion de la protema por transferencia Western (Figura 19A), y se demostro que la fijacion no afecto el perfil del ciclo celular (Figura 19B) o los niveles de transcripcion A (Figura 19C). Los ensayos de ChIP de los niveles de AcH3 y AcH4 no mostraron diferencias entre las celulas en las que HIRA o GFP fue atado a IgA.
Para indagar si el HIRA atado aumentaba los niveles de H3.3, se generaron transfectantes DT40 PoliLacO-A FLAG- H3.3 HIRA-Lacl y luego se determino el enriquecimiento de FLAG-H3.3 en ^VA17r, donde un polimorfismo permite el analisis del IgA atado solamente. Estos experimentos mostraron un modesto (1.4 veces) enriquecimiento de FLAG-H3.3 en cada uno de dos HIRA-Lacl transfectantes independientes (Figura 20A) en relacion con una lmea de control. Ademas, un enriquecimiento comparable fue evidente cuando los anticuerpos pan-H3 se utilizaron para ChIP (que detectan H3 y otras variantes, incluyendo H3.3). Por lo tanto, HIRA parecfa causar un enriquecimiento neto de las histonas, incluyendo H3.3, y por lo tanto afectado la densidad de nucleosomas en ^VA.
HIRA atado promueve la conversion de genes Ig
Para indagar si la HIRA atada afecta la tasa clonal de diversificacion de genes de Ig, establecimos derivados clonales independientes de transfectantes DT40 PoliLacO-A HIRA-Lacl limitando la clonacion por dilucion de celulas sIgM+ y despues de 4 semanas de cultivo se determino la fraccion de sIgM- celulas en cada poblacion. La fraccion de celulas sIgM- era claramente mayor en los transfectantes de HIRA-Lacl que en las celulas de control (por ejemplo, la Figura 20B). La comparacion de los porcentajes medianos de celulas slgM- mostro que las celulas dT40 PoliLacO-A HIRA-Lacl exhibfan un aumento de 11 veces en la diversificacion con respecto a las celulas de control DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl (Figura 20C). Esto no solo refleja la sobreexpresion de HIRA, ya que solo una modesta aceleracion en la diversificacion (1.7 veces) fue evidente en los transfectantes de DT40 expresando de forma estable HIRA (Figura 20C). El analisis de secuencias de las regiones VA amplificadas por PCR de celula unica mostro que la mayor diversificacion era mediante la conversion genica en celulas de control y en celulas en las que HIRA estaba atada a IgA (Figura 23).
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La fraccion de las mutaciones con plantilla en el tracto corto se incrementa por VP16 o HIRA atadas
VP16 y la HIRA atadas aceleraron la tasa clonal de diversificacion genica comparativamente (8.4 veces y 11 veces, respectivamente), y la conversion genica predomino en ambas. Para establecer si las diferencias sutiles podnan distinguir los espectros mutacionales, se compararon los eventos mutacionales independientes en los transfectantes DT40 PoliLacO-A HIRA-Lacl y DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16 con los transfectantes de control DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl. Los cambios de secuencia fueron categorizados como la conversion de genes si estaban dentro de un tracto que era una coincidencia exacta de por lo menos 9 pb de un donante ^VA secuencia, y contema uno, dos o mas cambios de base simples de la lmea germinal de la secuencia. Los eventos que conteman una unica diferencia de base y dos o mas diferencias se contabilizaban por separado como conversion de genes de tracto “corto” y “largo”, debido a que algunas mutaciones en la primera clase podfan en principio surgir de mutaciones puntuales que corresponden coincidentemente con secuencias de donadores de AVA. Tambien se puntuaron los eventos sin plantilla, que consistfan en mutaciones, eliminaciones e inserciones puntuales.
En los transfectantes de DT40 PoliLacO-GFP-Lacl-VP16, el 74% de los eventos se planearon, pero una fraccion significativa de eventos con plantilla (39%, o 29% de todos los eventos de mutacion) (Tabla 1, Figura 22). Tambien hubo fracciones significativas de inserciones (13% en comparacion con 0%). Los eventos de conversion genica predominaron de manera similar (87%) entre los eventos analizados en las celulas PoliLacO-AR HIRA-Lacl de DT40 (Tabla 1, Figura 23). La mayona de los eventos de conversion genica fueron de tracto largo, pero una minona significativa (24%, o 21% de todos los eventos de mutacion) fue la conversion de genes de tracto corto. El resto de eventos fueron mutaciones (11%) e inserciones (2%) puntuales. Anteriormente se caracterizaron eventos mutagenicos en el control DT40 PoliLacO-GFP-Lacl transfectantes, y se encontro que la mayona de las mutaciones se debieron a eventos de conversion de genes de tracto largo (77%), mientras que una pequena fraccion (3%) eran bien eventos de conversion de tracto corto o mutaciones puntuales que coincidentemente corresponden con una secuencia donante (Ejemplo 4: resumido en la Tabla 1). Las mutaciones restantes (20%) no corresponden a ninguno de los donantes de pseudogenes y fueron, por lo tanto, mutaciones puntuales claras.
Tabla 1. Efecto de HP1 y VP16 atados en la conversion genica.
Resumen de secuencias de regiones VA que llevan mutaciones unicas de DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl (n=71; (Ejemplo 4), DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl-VP16 (n=31) y DT40 PoliLacO-A HIRA-Lacl (N=137). Datos obtenidos a partir de al menos dos transfecciones independientes.
GFP-Lacl GFP-Lacl-VP16 HIRA-Lacl
Conversion de genes
Largo (2 o mas nt)
77% 45% 66%
Corto (1 nt)
3% 29% 21%
Total
80% 74% 87%
Mutacion puntual
20% 13% 11%
Insercion
0 13% 2%
Por lo tanto, la aceleracion de la diversificacion por VP16 e HIRA atados se debe a un aumento de los niveles de mutacion con plantilla. En ambos casos, la mayona de los tractos con plantilla conteman dos o mas mutaciones; pero cerca de un tercio de los tractos contema solo una mutacion. En contraste, esencialmente todos los eventos de conversion genica en las celulas de control GFP-Lacl conteman al menos dos mutaciones. Esto sugiere que los cambios en la estructura de la cromatina donante pueden no solo acelerar la conversion de genes, sino tambien limitar la extension de los tractos de conversion de genes; o que la conversion acelerada de genes puede titular factores que contribuyen a extender la longitud de los tractos de conversion.
HIRA atada aumenta la densidad de los nucleosomas
Los resultados anteriores muestran que VP16 e HIRA atadas teman efectos comparables sobre el resultado de la diversificacion de genes de Ig, aunque cada una tema diferentes efectos locales: VP16 aumento AcH3 y AcH4, mientras que HIRA aumento H3.3 y la carga de histonas en general. Para establecer como la carga de estos diferentes factores podna afectar a la cromatina, se sondeo la estructura de la cromatina utilizando nucleasa micrococcica (MNasa). Se recolectaron los nucleos, se trataron con cantidades variadas de MNasa, se purifico ADN genomico, se resolvieron y se transfirieron, y despues se probaron con ADN marcado homologo a las repeticiones LacO. El patron de digestion de MNasa de las celulas DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl y DT40 PoliLacO-A GFP-Lacl- VP16 aparecieron comparables por este ensayo (Figura 21). La digestion con altos niveles de MNasa produjo un
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producto de Kmite claro. Esta es la region del ADN (aproximadamente 150 pb) que contacta con el nucleosoma, y por lo tanto se protege de la MNasa. El espaciamiento entre los nucleosomas individuales puede variar, causando una liviana variacion en los tamanos de multfmeros nucleosomicos producidos por digestion parcial, y produciendo bandas caractensticamente borrosas que migran mas lentamente en el gel.
Por el contrario, la digestion con MNasa de la cromatina a partir de celulas DT40 PoliLacO HIRA-Lacl revelo un patron diferente: se observo escalamiento distintivo que no se encontro en el control (Figura 21, derecha). La serie claramente definida de productos de digestion se extendio a partir de los 1-meros producidos en la digestion lfmite hasta 8-meros y mas alla; mientras que la escala se hizo borrosa en tamanos mas grandes que 4-meros en el control y celulas que expresan VP16. Esto sugiere que atar la chaperona HIRA de histona aumento la uniformidad del tamano del enlazante. Esto ocurrina si la densidad de nucleosomas locales se incrementara, consistente con el papel conocido de HIRA como una chaperona de histona, asf como con la evidencia de que el sujetar HIRA incremento el enriquecimiento local de H3.3 y H3 (Figura 18C).
Discusion
Este ejemplo ha mostrado que la conversion genica puede ser acelerada por cambios en la estructura de la cromatina, y que existen al menos dos medios diferentes para este fin. La conversion de genes se acelero en un orden de magnitud al atar ya sea el activador, VP16, o la histona chaperona, HIRA, en la matriz ^VA en la lmea de celulas DT40 B de pollo. El atar VP16 aumento los niveles de AcH3 y AcH4; mientras que atar HIRa no afecto a las marcas de cromatina, pero aumento la densidad de nucleosomas, en parte por la carga H3.3. El hecho de que diferentes cambios en el estado de la cromatina permitan de manera similar la recombinacion homologa muestra que la celula tiene rutas redundantes disponibles para regular los usos del ADN en la recombinacion.
El efecto de atar VP16 e HIRA en la diversificacion de genes de Ig es distinto del de atar la protema de heterocromatina HP1. El atar HP1 causo un aumento de casi 3 veces en las mutaciones puntuales, acompanado de una disminucion en las mutaciones con plantilla (Ejemplo 4). Estas diferencias muestran que la estructura de la cromatina donante puede ser activada o reprimida para la reparacion del ADN dirigida por homologfa, con consecuencias sobre el resultado de la reparacion.
En la actualidad, se cree que la reparacion de homologfa dirigida alelica predomina en fase S y depende de cromatidas hermanas para plantillas. El potencial de alteraciones locales de la estructura de la cromatina para activar las regiones para la reparacion dirigida por la homologfa sugiere que la regulacion puede ser mas compleja y requerir no solo la presencia de un donante homologo sino tambien la estructura de la cromatina que es propicia para la reparacion.
La fijacion de HIRA o VP16 acelero las tasas de diversificacion clonal promoviendo la mutacion con plantilla. En ambos casos, se observo un aumento en la fraccion de mutaciones con plantilla en las que solo un unico cambio de base plantilla fue evidente en el tracto de mutacion. Aunque estas mutaciones de "tracto corto" comprendfan solamente el 29% y el 21% de las mutaciones totales en los transfectantes VP16 y HIR1, respectivamente, esta categona de mutaciones estaba esencialmente ausente (3%) en los transfectantes GFP-Lacl.
Pueden surgir tramos de conversion de genes cortos si los factores necesarios para promover la conversion genica de largo tramo no son suficientemente abundantes para soportar el aumento del gen en celulas en las que VP16 o HIRA esta unido a PoliLacO. Alternativamente, el aumento de las mutaciones en esta categona podna reflejar los cambios en la estructura de la cromatina causada por atar estos factores, lo que podna afectar tanto la posicion del nucleosoma como la longitud del enlazante.
La densidad de nucleosomas se incrementa al atar HIRA. Es probable que este aumento de densidad refleje la disminucion de la longitud del enlazante. Si las regiones de enlazante son plantillas preferidas para la conversion de genes, el acortamiento de esas regiones en los transfectantes de HIRA puede contribuir a la disminucion de la longitud del tracto de conversion genica. El acortamiento de la longitud del nucleosoma puede alternativamente, rehacer la fase de los nucleosomas de modo que, aunque la cromatina este activa para la recombinacion, las regiones no homologas entre el ^V se vuelven menos accesibles.
El papel de HIRA en los pseudogenes es un nuevo ejemplo de como la carga de histonas afecta la reparacion del ADN. El papel de HIRA en los pseudogenes no transcritos es particularmente interesante ya que muchos estudios han encontrado la transcripcion requerida para la deposicion de novo de H3.3 (Ahmad and Henikoff, 2002a, Ahmad and Henikoff, 2002b, Janicki et al, 2004, Wirbelauer et al, 2005). Los resultados sugieren ahora que la transcripcion no es un requisito previo para la carga de H3.3.
Estos resultados aumentan nuestra comprension de las limitaciones ejercidas por las restricciones de la cromatina sobre la recombinacion. Ademas, proporcionan una vision de la necesaria cromatinizacion de moleculas utilizadas para la orientacion genica y/o terapia genica.
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Referencias
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Ejemplo 6: Generacion de anticuerpos de diagnostico para mesotelina y HE4
Este ejemplo ilustra como se puede usar la invencion para desarrollar anticuerpos contra los biomarcadores de cancer de ovario bien confirmados con mesotelina y HE4. Los anticuerpos identificados seran valiosos reactivos de diagnostico nuevos, anadiendo redundancia util a ensayos clmicos. Este ejemplo valida ademas la utilidad de DT40 PoliLacO como una plataforma para la seleccion de anticuerpos de diagnostico que reconocen otros biomarcadores.
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DT40 PoliLacO como veldculo para el desarrollo de anticuerpos: identificacion de nuevos anticuerpos contra dos biomarcadores ovaricos de cancer, mesotelina (Scholler et al., 1999; Frierson et al., 2003) y HE4 (Hellstrom et al., 2003).
La mesotelina es un marcador de diferenciacion epitelial altamente expresado en celulas cancerosas de muchos ongenes, incluyendo el cancer de ovario (Robinson et al., 2003). HE4 (alias WFDC2) es un miembro de la familia de la protema del suero (WAP), cuyos miembros estan secretados en altos niveles y asociados con cancer, aunque la funcion no se entiende (Bouchard et al., 2006). Hemos obtenido mesotelina recombinante y HE4. Estas protemas se expresan en levaduras como fusiones de biotina, lo que facilita la union a perlas o placas con estreptavidina acoplada para seleccion o ensayos ELISA (Scholler et al., 2006). Tambien hemos obtenido anticuerpos de cadena unica (scFv) contra mesotelina y HE4 (Scholler et al., 2008), que proporcionan un estandar para la comparacion inicial de afinidades de anticuerpos recientemente identificados.
Para identificar anticuerpos de alta afinidad para la mesotelina y HE4, se realiza la hipermutacion iterativa y la seleccion clonal para el reconocimiento de cada antigeno recombinante. Los clones se expanden bajo condiciones que aceleran la hipermutacion; son seleccionados para clones que se unen a mesotelina o HE4 con alta afinidad por clasificacion de celulas activadas magneticas; y la afinidad de anticuerpo de sobrenadantes se ensaya mediante un ensayo ELISA. Las poblaciones que producen anticuerpos de alta afinidad se seleccionan adicionalmente para aumentar la afinidad y la especificidad (Figura 3).
La seleccion puede iniciarse en tres poblaciones de 108 celulas cada una (correspondientes a 100 ml de cultivo). Cada poblacion puede ser derivada de una sola celula aislada por dilucion limitante, y luego cultivada bajo condiciones que aceleran la hipermutacion. Para minimizar el enriquecimiento de celulas "pegajosas", que unen a perlas por sf mismas, antes del enriquecimiento para una especificidad deseada, cada poblacion se limpia primero con perlas unidas a biotina. El enriquecimiento para una especificidad deseada se consigue convenientemente por clasificacion de celulas activadas magneticas (MACS). Utilizando MACS, es posible enriquecer muy rapidamente a partir de tamanos de muestra muy grandes (108 celulas), logrando consistentemente un enriquecimiento de 100 veces de poblaciones que comprenden <0.1% de la muestra inicial (Volna et al., 2007). La poblacion seleccionada se amplfa y se vuelve a seleccionar utilizando el mismo protocolo.
Basandose en los resultados de otros (por ejemplo, Cumbers et al., 2002), se preve que las celulas que producen anticuerpos espedficos para cada "antfgeno" se recuperaran en 2-3 ciclos de hipermutacion iterativa y seleccion (2-3 semanas), y probablemente mas temprano. Se puede probar la afinidad de anticuerpos de las agrupaciones de celulas mediante el ensayo ELISA; y cuando la afinidad esta en el intervalo de 1-10 nM, se realiza la clonacion de dilucion limitante y se identifican los clones que identifican el anticuerpo de alta afinidad. La limitacion de la clonacion por dilucion se lleva a cabo en medio que contiene IPTG, que libera el represor del operador para desacelerar la hipermutacion. El anticuerpo producido a partir de estas poblaciones clonales se caracterizara adicionalmente, como se describe a continuacion.
Se pueden utilizar tres criterios para establecer que este enfoque ha tenido exito:
1. Afinidad y especificidad. La eficacia del desarrollo de anticuerpos se valida demostrando que la afinidad de anticuerpos aumenta en el curso de la seleccion. Las afinidades de anticuerpos se miden por primera vez mediante ensayos ELISA de diluciones de sobrenadante de celulas cultivadas durante 48 horas, en presencia de IPTG, para minimizar la hipermutacion adicional, en medio despojado de IgM, para minimizar el fondo en el ELISA. Para asegurar que los anticuerpos reconocen el antfgeno y no el andamio recombinante en el que se muestra, la reactividad se prueba con biotina y estreptavidina. Una comparacion concomitante de los anticuerpos anti- mesotelina y anti-HE4 contra ambos antfgenos recombinantes sirve como una prueba de reactividad cruzada. Las afinidades se comparan con el control de los anticuerpos scFv dirigidos a la mesotelina o HE4. Despues del establecimiento de poblaciones clonales de alta afinidad, se determinara la Kd cuantitativamente por resonancia de plasmon de superficie por Biacore.
2. Segmentacion de la mutagenesis. El mecanismo celular que hipermuta los genes del anticuerpo en el curso de la seleccion clonal concentra las mutaciones en las CDR, los subdominios de las regiones V que contactan con el antfgeno. Se predice que los clones de alta afinidad aislados por hipermutacion acelerada y seleccion concentraran de manera similar las mutaciones en las CDR. Para probar esto, se puede usar PCR de celula unica para amplificar las regiones VH y VL de celulas B individuales despues de la seleccion de afinidad, secuenciar las regiones VH y VL y comparar estas secuencias con las de la poblacion no seleccionada.
3. Mantenimiento de la especificidad y afinidad por cultivo con IPTG. El poder de esta plataforma para la produccion de anticuerpos depende en parte de la capacidad de limitar la hipermutacion cuando se ha generado un clon de alta afinidad. Para probar esto, se pueden cultivar poblaciones clonales en presencia y ausencia de IPTG, y comparar las afinidades medias de cultivos expandidos por citometna de flujo de celulas unidas a mesotelina marcada con fluorescencia o HE4. Se predice que las afinidades permanecen constantes en cultivos que contienen IPTG, pero aumentan o disminuyen en cultivos que carecen de IPTG. De este modo, la distribucion de la senal de fluorescencia sera mas amplia en los cultivos que contienen IPTG.
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Referencias
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A partir de lo anterior, se apreciara que, aunque se han descrito realizaciones espedficas de la invencion para fines ilustrativos, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del alcance de la invencion. Por consiguiente, la invencion no esta limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.
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<210> 1 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> Cebador sintetico <400> 1
attgcgcatt gttatccaca 20
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taagccctgc cagttctcat 20
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gagatgtgca gcaacaagga 20
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cccctatcac cataccagga 20
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tcaccctaca gcttcagtgc 20
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gcagttctgt gggatgaggt 20
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ggctcctgta gctgatcctg 20
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<223> Cebador sintetico <400> 22
gttctttgct cttcggttgc 20
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tagataggga taacagggta atagc 25
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agggctgtac ctcagtttca c 21
<210> 25 <211> 20 <212>ADN
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attgcgcatt gttatccaca 20
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taagccctgc cagttctcat 20
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gggctggctc atcaacat 18
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ctgggtggcc acatagaagt 20
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gtcagcaaac ccaggagaaa c 21
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aatccacagt cactgggctg 20
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Claims (21)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una celula B modificada para inducir reversiblemente la diversificacion de un gen diana, comprendiendo la celula B:
    (a) un elemento regulador cis unido operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una region codificadora; y
    (b) un constructo de fusion que codifica un factor de fijacion fusionado a un factor de diversificacion, en el que el factor de fijacion se une espedficamente al elemento regulador cis de (a) y el factor de diversificacion induce reversiblemente la diversificacion de la region codificadora.
  2. 2. La celula B de la reivindicacion 1, que es una celula B de pollo o una celula B humana DT40.
  3. 3. La celula B de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el elemento regulador cis es un operador de lactosa polimerizado (LacO) y el factor de fijacion es un represor de lactosa (Lacl) o el elemento regulador cis es un operador de tetraciclina (TetO) y el factor de fijacion es el represor de la tetraciclina (TetR).
  4. 4. La celula B de la reivindicacion 3, en la que el factor de diversificacion es un regulador transcripcional, una protema asociada a la heterocromatina, una chaperona de histonas, un remodelador de cromatina, un componente del complejo de poros nucleares, un regulador genico o una combinacion de los mismos.
  5. 5. La celula B de las reivindicaciones 3 o 4, en la que el factor de diversificacion es un factor de reparacion del ADN, un factor de replicacion del ADN, una resolvasa, una helicasa, un regulador del ciclo celular, un factor de ubquitilacion, un factor de sumoilacion o una combinacion de los mismos.
  6. 6. La celula B de la reivindicacion 4, en la que el regulador transcripcional es VP16 o E47 (codificado por E2A), la protema asociada a heterocromatina es Hpl, la chaperona de histona es HIRA y/o el gen diana es un gen Ig humano, por ejemplo, un gen IgL o un gen IgH y/o el gen diana comprende una region codificadora heterologa y regiones que codifican un dominio transmembrana y una cola citoplasmica suficiente para efectuar la visualizacion del producto genico diana sobre la superficie de las celulas B.
  7. 7. Un metodo para producir un repertorio de polipeptidos que tienen secuencias variantes de un polipeptido de interes, comprendiendo el metodo:
    (a) cultivar la celula B de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6 en condiciones que permiten la expresion del factor de diversificacion, en el que el gen diana de la celula B contiene la region codificadora del polipeptido de interes, permitiendo de este modo diversificar la region codificadora; y
    (b mantener el cultivo en condiciones que permitan la proliferacion de la celula B hasta que se obtenga una pluralidad de celulas B y el repertorio deseado.
  8. 8. Un metodo para producir celulas B que producen un polipeptido de interes, comprendiendo el metodo:
    (a) cultivar una celula B de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6 en condiciones que permiten la expresion del factor de diversificacion permitiendo de este modo la diversificacion de la region codificadora del polipeptido de interes, en donde el gen diana de la celula B contiene la region codificadora del polipeptido de interes, y en el que la celula B expresa el polipeptido de interes en la superficie de la celula B;
    (b) seleccionar celulas del cultivo que se unen a un ligando que se une espedficamente al polipeptido de interes expresado en la superficie de las celulas B; y
    (c) repetir las etapas (a) y (b) hasta seleccionar celulas que tienen una afinidad deseada para el ligando que se une espedficamente al polipeptido de interes.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 7 u 8, en el que el polipeptido de interes es una Ig.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 7 u 8, que comprende ademas 1) anadir una molecula reguladora al cultivo, en donde la molecula reguladora modula la union del factor de fijacion al elemento regulador cis, modulando de este modo la diversificacion de la region codificadora, 2) retirar una molecula reguladora del cultivo, en donde la molecula reguladora modula la union del factor de fijacion al elemento regulador cis, modulando asf la diversificacion de la region codificadora y/o 3) modular la expresion de un gen regulador en la celula B, donde el gen regulador regula la diversificacion, modulando asf la diversificacion de la region que codifica el polipeptido de interes.
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  11. 11. Un kit que comprende:
    (a) una celula B modificada para inducir reversiblemente la diversificacion de un gen diana, comprendiendo la celula B un elemento regulador cis ligado operativamente a un gen diana, en el que el gen diana comprende un promotor y una region codificadora; y
    (b) uno o mas recipientes; y
    (c) uno o mas constructos de fusion almacenados en un contenedor de (b), en el que cada constructo de fusion es expresable en la celula B y codifica un factor de fijacion fusionado a un factor de diversificacion, en el que el factor de fijacion se une espedficamente al elemento regulador cis de (a) y el factor de diversificacion induce reversiblemente la diversificacion de la region codificadora.
  12. 12. El kit de la reivindicacion 11, en el que el elemento regulador cis es un operador de lactosa polimerizado (LacO) y el factor de fijacion es un represor de lactosa (Lacl) o el elemento regulador cis es un operador de tetraciclina (TetO) y el factor de fijacion es el represor de la tetraciclina (TetR).
  13. 13. El kit de las reivindicaciones 11 o 12, en el que el factor de diversificacion es un regulador transcripcional, una protema asociada a la heterocromatina, una chaperona de histonas, un remodelador de cromatina, un componente del complejo de poros nucleares, un regulador genico o una combinacion de los mismos.
  14. 14. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que el factor de diversificacion es un factor de reparacion del ADN, un factor de replicacion del ADN, una resolvasa, una helicasa, un regulador del ciclo celular, un factor de ubquitilacion, un factor de sumoilacion o una combinacion de los mismos.
  15. 15. El kit de la reivindicacion 13, en el que el regulador transcripcional es VP16 o E47 (codificado por E2A), la protema asociada a heterocromatina es HP1, la chaperona de histona es HIRA y/o el gen diana es un gen Ig humano, y/o el gen diana comprende una region codificadora heterologa y regiones que codifican un dominio transmembrana y una cola citoplasmatica suficiente para efectuar la visualizacion del producto genico diana sobre la superficie de la celula B.
  16. 16. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 11-15, en el que la celula B es una celula B de pollo o una celula B humana DT40.
  17. 17. El kit de la reivindicacion 15 o 16, en el que el gen Ig humano es un gen IgL o un gen IgH.
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 9, en el que el polipeptido de interes es IgL o IgL o ambos.
    imagen1
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    DT40 DT40
    PoliLacO-!* PoliLacO-;lfi
    GFp-Lacl E47-Laicl
    Recuentos celulares
    Recuentos celulares
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    imagen5
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    II |Od-*d/"T£ VZ3?*X
    DT40 PcIiLacO-Xfl RFP-Lacl
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    Enriquecimiento de pliegue
    imagen9
    frhPtf £H3V
    imagen10
    Cfi
    CD
    imagen11
    Figura12C GFP-Laci Laci-HPi
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    (vmiiNoo) si vynsid
    imagen16
    M-ldH
    EMtH
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    HP1-1Z
    HW-13
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    DT44
    Hfl-1
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    HP1-5
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    HP1-*
    HP1-1&
    HPl-ll
    (fl-12
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    *i-u
    Mt K* J£C tT( JCC JIC CM CCT 6JUS KG CTC JCC T« TIT CGG TCT
    imagen25
    FIGURA 15 [CONTINUACION)
    VWJiactina
    DT40 PoliLacOX
    25 24 23 16 14 13 11 1C 0 0 G 4 3 2 1
    W murn ami
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    imagen26
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    O.
    i—i
    GFP-Lacl
    VP16-UCI
    imagen27
    GFP-Lacl-VPie foco
    i.a
    1.6
    1.4
    1.2
    1
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    imagen28
    CFP-Lntl QFf*-LHcl*VP16
    Figura igd
    Figura 16E
    PT4Q FoliLacOH__
    GFP-Lacl GFP-Lacl-VP1G
    imagen29
    Ambosalelos AcH3 Alelo espeelfico
    CD
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    DT40 PoliLacO
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    GFP^Lacl HIRA-Lacl
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    imagen31
    CD
    cn
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    o
    >
    imagen32
    imagen33
    Enriquecimiento de pliegue
    p p p p 7* ^ r1, ^ p
    O w K>fn oituQ
    imagen34
    EH-ued C CH 5V1d
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    Numero de celula
    imagen36
    a
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    i
    n
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    *QC KC 3£D I TUI
    HOD ogq Kfl 1QOO
    GFP-Lacf
    HIRA-Lacl
    Dispersion trontal
    Figura 20B
    CO
    Figura 20C
    DT-iO
    PT4Q PohLacO-it
    HIRA-Lacl
    GFP-Lael HIRA-Lacl
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    Celula 1
    4 a A6
    Ce u a 2
    4~4 £A .6A
    deposition de nudeosoma
    porHIRA
    Celula 1
    4-4-4 -*-4-4-4
    Figura 218
    150 pb
    imagen38
    Figura 21A
    imagen39
    A tn <n -jtu
    imagen40
    V1HU-7
    tut tat an ut tci clt at ut ca cnc act CK UI ur at wl W am m as ra
    IW-CU-l
    WP1& 012
    PIE tJM
    Pl6-<1i-5
    VPI6-C13-7
    VF16-tl3'3
    HFlS-£H-t
    ■■■ -T-
    VFlt'LlS'W
    GPlE-tlMl
    -- -’i-
    VP1&-C13-13
    — -J-
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    DTw
    vnt-cu-
    PiE-ai-i
    VF15-t 13--+
    YPl&-(ll-5
    PlG-ns-fi
  21. -.......... -i
    Wlb-UJ
    VP16-C13 D
    VPlS-CU-lB
    ^P16-C13-il ----
    VPJfi-tU-li — -
    7P1H13-13
    Ott Kt MI 0tC CC.T -CTC TfiT TTC TCT COG M7T COE Wt UC ACT CCT CO UJ
    KC KC
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    YP1B-C1M -
    VrLB-C.13'2 ■”
    VP16-C13-3 — -----------------
    TrA
    VP16-C11-8
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    VPtt-CU'lfl
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    Vfl6-C3M
    Wli-Cli-i
    WlfrClH
    VP16-QV5
    VPlb-tti'G
    VKG'Cli-7
    W1&-OM
    W1G-ILH
    ■iflfr-cu-ia
    VF1G-CL3-11
    pw-aa-u
    FIGURA 22
    imagen41
    DT44
    int-i
    HIM-2
    HIW-J
    R4IRA-4
    HIM-5
    HIRA-6
    HIRA-7
    HISA-S
    IQU-9
    KIf!A-lfl
    MRA-I1
    HU-12
    HIM-13
    mu-u
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    — -A------1....................-.......- — A- -A- PHjf...........-......................
    imagen43
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    imagen44
    FIGURA 23
    NH^I
    imagen45
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