CN104661676A - 用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿的抑制masp-1、masp-2和/或masp-3的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

通过给予患有阵发性夜间血红蛋白尿的受试者包含一定量的MASP-3抑制剂的组合物而提供在所述受试者中抑制MASP-3-依赖性补体活化的方法和组合物，所述抑制剂的量有效抑制MASP-3-依赖性补体活化。通过给予患有阵发性夜间血红蛋白尿的受试者包含一定量的MASP-1抑制剂和/或MASP-3抑制剂的至少一种的组合物而提供在所述受试者中增加红细胞存活的方法和组合物，所述抑制剂的量有效增加红细胞的存活。可给予所述受试者MASP-2抑制剂和MASP-1抑制剂、MASP-2抑制剂和MASP-3抑制剂、MASP-3抑制剂和MASP-1抑制剂、或MASP-1抑制剂、MASP-2抑制剂和MASP-3抑制剂。

Description

用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿的抑制MASP-1、MASP-2和/或MASP-3的组合物和方法
相关申请的交叉引用
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对于序列表的声明
提供文本格式的本申请相关的序列表以替代纸质拷贝，并通过引用结合到本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是MP_1_0146_PCT_Sequence_20130327_ST25.txt。该文本文件为85 KB；于2013年4月1日创建；并经由EFS-Web与本说明书的文件一起提交。
背景
补体系统为在人和其它脊椎动物中启动、放大和安排针对微生物感染和其它急性损伤的免疫应答提供了早期的作用机制(M.K. Liszewski和J.P. Atkinson, 1993, 载于Fundamental Immunology, 第3版, W.E. Paul编辑, Raven Press, Ltd., New York)。尽管补体活化提供了重要的针对潜在病原体的第一道防线，但是促进保护性免疫应答的补体活性也可以表现出对宿主的潜在威胁(K.R. Kalli等人, Springer Semin. Immunopathol.15:417-431, 1994；B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig.24:219-228, 1994)。例如，C3和C5蛋白水解产物募集并活化嗜中性粒细胞。尽管对于宿主防御是必不可少的，但是活化的嗜中性粒细胞在它们破坏性酶的释放中是不加选择的，并可以导致器官损伤。此外，补体活化可以导致溶胞的补体成分沉积在附近的宿主细胞以及微生物靶上，导致宿主细胞裂解。
补体系统也与许多急性和慢性疾病状态的发病机制有牵连，所述疾病包括：心肌梗塞、中风、ARDS、再灌注损伤、败血性休克、热烧伤之后的毛细血管渗漏、心肺分流术后炎症、移植排斥、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和阿尔茨海默病。在几乎所有的这些病况中，补体都不是病因，而是发病机制所涉及的若干因素之一。尽管如此，补体活化可以是重要的病理机制，并对许多这类疾病状态中的临床控制表现出有效之处。对各种疾病状态中补体介导的组织损伤的重要性的逐渐增加的认识强调了对有效补体抑制药物的需求。迄今为止，Eculizumab (Solaris?)，一种针对C5的抗体，是仅有的已被批准人用的补体靶向药物。然而，C5是位于补体系统“下游”的几个效应物分子之一，并且对C5的阻断并不抑制补体系统的活化。因此，补体活化的起始步骤的抑制剂将具有相对“下游”补体抑制剂的显著优势。
目前，普遍接受的是补体系统可通过三种截然不同的途径被活化：经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径通常是由宿主抗体结合外源颗粒(即抗原)组成的复合物而触发，并且因此需要预先暴露于抗原以产生特异性抗体应答。因为经典途径的活化取决于宿主先前的获得性免疫应答，所以经典途径是获得性免疫系统的一部分。相反，凝集素途径和替代途径两者不依赖于获得性免疫，并且是先天性免疫系统的一部分。
补体系统的活化导致丝氨酸蛋白酶酶原(zymogen)的连续活化。经典途径活化的第一步是特异性识别分子C1q与结合了抗原的IgG和IgM分子的结合。C1q与C1r和C1s丝氨酸蛋白酶酶原结合成称为C1的复合物。当C1q与免疫复合物结合时，C1r的Arg-Ile位点进行自我蛋白水解切割，随后是C1r介导的Cls切割和活化，其从而获得切割C4和C2的能力。C4被切割成两个片段，称为C4a和C4b，并且，类似地，C2被切割成C2a和C2b。C4b片段能够与邻近的羟基或氨基形成共价键，并且通过与活化C2的C2a片段进行非共价相互作用而生成C3转化酶(C4b2b)。C3转化酶(C4b2b)通过蛋白水解切割成C3a和C3b亚成分而活化C3，导致C5转化酶(C4b2a3b)的生成，其通过切割C5导致可以破坏细胞膜导致细胞裂解的膜攻击复合物(结合C6、C7、C8和C9的C5b，也称为“MAC”)的形成。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共价沉积在外源靶表面上，其被多种吞噬细胞上的补体受体所识别。
独立地，补体系统通过凝集素途径活化的第一步也是特异性识别分子的结合，其随后是所结合的丝氨酸蛋白酶酶原的活化。然而，凝集素途径中的识别分子包括一组统称为凝集素的糖结合蛋白(甘露聚糖结合凝集素(MBL)、H-纤维胶凝蛋白(H-ficolin)、M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和C型凝集素CL-11)，而不是通过Clq来结合免疫复合物。参见J. Lu等人, Biochim. Biophys. Acta1572:387-400, (2002)；Holmskov等人, Annu. Rev. Immunol. 21:547-578 (2003)；Teh等人, Immunology101:225-232 (2000))。另见J. Luet等人, Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002)；Holmskov等人, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003)；Teh等人, Immunology 101:225-232 (2000)；Hansen等人, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010)。
Ikeda等人首先证明，与C1q类似，MBL在与酵母甘露聚糖-包被的红细胞结合后可以以依赖C4的方式使补体系统活化(Ikeda等人, J.Biol. Chem.262:7451-7454, (1987))。MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员，是钙依赖性凝集素，其与具有定向于吡喃糖环赤道面上的3-羟基和4-羟基的碳水化合物结合。因此MBL的重要配体是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合这种空间要求的碳水化合物则对MBL没有可检测的亲和性(Weis等人, Nature 360:127-134, (1992))。MBL和单价糖之间的相互作用是相当微弱的，解离常数通常在个位数毫摩尔的范围内。MBL通过亲合力，即通过同时与位置彼此靠近的多个单糖残基相互作用来实现对聚糖配体特异性地紧密结合(Lee等人, Archiv. Biochem. Biophys. 299:129-136, (1992))。MBL识别通常修饰微生物如细菌、酵母、寄生虫和某些病毒的碳水化合物模式。相反，MBL不识别D-半乳糖和唾液酸，即倒数第二位和倒数第一位的糖，它们一般修饰哺乳动物血浆和细胞表面糖蛋白上存在的“成熟”复合糖缀合物。认为这种结合特异性促进“外源”表面的识别和有助于保护免于“自身活化”。然而，MBL确实以高亲和性结合高甘露糖“前体”聚糖簇，这些簇位于被隔离在哺乳动物细胞的内质网和高尔基体内的N-连接的糖蛋白和糖脂上(Maynard等人, J. Biol. Chem.257:3788-3794, (1982))。另外，已经证实MBL可以结合可暴露在坏死的和凋亡的细胞上的多核苷酸、DNA和RNA (Palaniyar等人, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1010:467-470 (2003)；Nakamura等人, J. Leuk. Biol. 86:737-748 (2009))。因此，受损细胞是经由MBL结合的凝集素途径活化的潜在目标。
纤维胶凝蛋白具有与MBL不同类型的凝集素结构域，称为纤维蛋白原-样结构域。纤维胶凝蛋白以不依赖Ca++的方式来结合糖残基。在人中，已经鉴定出三种类型的纤维胶凝蛋白(L-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白)。L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白这两种血清纤维胶凝蛋白共同对N-乙酰-D-葡糖胺具有特异性；然而，H-纤维胶凝蛋白还结合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白、CL-1I和MBL的糖特异性的差异意味着不同的凝集素可以是互补的，尽管有重叠，但是可靶向不同的糖缀合物。这个观点得到了最近报道的支持，即在凝集素途径的已知凝集素中，只有L-纤维胶凝蛋白与脂磷壁酸特异性结合，所述脂磷壁酸是在所有革兰氏阳性菌上发现的一种细胞壁糖缀合物(Lynch等人, J.Immunol. 172:1198-1202, (2004))。除了乙酰化糖部分外，纤维胶凝蛋白还可结合乙酰化氨基酸和多肽(Thomsen等人, Mol. Immunol. 48(4):369-81 (2011))。胶原凝集素(即MBL)和纤维胶凝蛋白在氨基酸序列上没有显著的相似性。然而，这两组蛋白质具有类似的结构域组构，且与C1q类似，装配成寡聚结构，这样就使得多位点结合的可能性最大化。
MBL的血清浓度在健康人群中是高度可变的，这在遗传上是由MBL基因的启动子和编码区二者的多态性/突变所控制。作为急性期蛋白，MBL的表达在炎症期间进一步上调。L-纤维胶凝蛋白在血清中存在的浓度与MBL的浓度类似。因此，凝集素途径的L-纤维胶凝蛋白分支在强度上可能与MBL分支不相上下。MBL和纤维胶凝蛋白还可能作为调理素起作用，其允许吞噬细胞靶向MBL-和纤维胶凝蛋白-修饰的表面(参见Jack等人, J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita和Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi等人, J Immunol, 174(1):418-25(2005))。此调理素作用需要这些蛋白与吞噬细胞受体相互作用(Kuhlman等人, J. Exp. Med. 169:1733, (1989)；Matsushita等人, J. Biol. Chem.271:2448-54, (1996))，这些吞噬细胞受体的身份还未得到确定。
人MBL通过其胶原-样结构域与独特的C1r/C1s-样丝氨酸蛋白酶(称为MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MASP))形成特异性和高亲和性的相互作用。迄今为止已经描述了三种MASP。首先，鉴定出单一的酶“MASP”，并且其特征是作为负责启动补体级联(即切割C2和C4)的酶(Matsushita等人, J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992)；Ji等人, J.Immunol. 150:571-578, (1993))。随后，确定MASP活性实际上是两种蛋白酶MASP-1和MASP-2的混合物(Thiel等人, Nature 386:506-510, (1997))。然而，证明MBL-MASP-2复合物单独就足以使补体活化(Vorup-Jensen等人, J. Immunol.165:2093-2100, (2000))。此外，只有MASP-2以高速切割C2和C4 (Ambrus等人, J.Immunol. 170:1374-1382, (2003))。因此，MASP-2是负责活化C4和C2以产生C3转化酶C4b2a的蛋白酶。这是不同于经典途径中C1复合物的显著差异，在经典途径中两种特异性丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)协同作用导致了补体系统的活化。另外，已经分离出第三种新的蛋白酶MASP-3 (Dahl, M.R.等人, Immunity 15:127-35, 2001)。MASP-1和MASP-3是同一基因的可变剪接产物。
MASP与Cl复合物的酶成分C1r和C1s共享相同的结构域组构(Sim等人, Biochem. Soc. Trans. 28:545, (2000))。这些结构域包括N-末端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(CUB)结构域、表皮生长因子-样结构域、第二CUB结构域、串联的补体调控蛋白结构域和丝氨酸蛋白酶结构域。与在C1蛋白酶中一样，MASP-2的活化通过丝氨酸蛋白酶结构域附近的Arg-I1e键裂解而发生，其将酶分成二硫键连接的A链和B链，后者由丝氨酸蛋白酶结构域构成。
MBL还与MASP-2的可变剪接形式，称为19 kDa MBL相关蛋白(MAp19)或者小MBL相关蛋白(sMAP)缔合，所述蛋白缺乏MASP-2的催化活性(Stover, J. Immunol. 162:3481-90, (1999)；Takahashi等人, Int. Immunol.11:859-863, (1999))。MAp19包括MASP-2的前两个结构域，其后接4个独特氨基酸的额外序列。MAp19的功能尚不清楚(Degn等人, J Immunol. Methods, 2011)。MASP-1基因和MASP-2基因分别位于人的3号和1号染色体上(Schwaeble等人, Immunobiology 205:455-466, (2002))。
若干证据表明存在不同的MBL-MASP复合物，且血清中大部分MASP不与MBL复合(Thiel等人, J. Immunol. 165:878-887, (2000))。H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白都与所有MASP结合，并且活化凝集素补体途径，如MBL所为(Dahl等人, Immunity 15:127-35, (2001)；Matsushita等人, J. Immunol.168:3502-3506, (2002))。凝集素途径和经典途径都形成共同的C3转化酶(C4b2a)，并且这两条途径在这一步会合。
普遍认为凝集素途径在首次用于实验的(na?ve)宿主中的宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL参与宿主防御的强有力证据来自于对功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta1572:401-413, (2002))。这些患者表现出对复发性细菌和真菌感染的易感性。在易损性的表观窗期间，这些症状通常在生命早期是明显的，因为从母体获得的抗体效价降低，但处于完整的抗体应答谱(repertoire)发育之前。这种综合征经常是由于MBL胶原部分的数个位点突变引起的，其干扰了MBL寡聚体的正确形成。然而，由于MBL可以作为不依赖于补体的调理素起作用，所以还不知道对感染的易感性增加的多大程度是由于受损的补体活化所致。
与经典途径和凝集素途径相反，没有发现替代途径中完成识别功能的引发剂，而在其它两种途径中是C1q和凝集素来完成识别功能的。目前普遍接受的是，替代途径自发经历低水平的周转活化(turnover activation)，其可以容易地在外来表面或其它异常表面(细菌、酵母、病毒感染的细胞或者受损组织)上放大，所述表面缺少保持受控的自发补体活化的适当分子元件。有四种血浆蛋白直接参与了替代途径的活化：C3、B因子、D因子和备解素。
尽管大量证据表明经典补体途径和替代补体途径两者都涉及非感染性人类疾病的发病机制，但是对凝集素途径作用的评价才刚刚开始。最近研究提供的证据表明，凝集素途径的活化可能是在缺血/再灌注损伤中补体活化和相关炎症的原因。Collard等人(2000)报告受到氧化应激的培养的内皮细胞结合MBL，且在暴露于人血清时显示出C3沉积(Collard等人, Am. J. Pathol. 156:1549-1556, (2000))。此外，用封闭性抗MBL单克隆抗体处理人血清抑制了MBL结合和补体活化。将这些发现扩展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用对照抗体处理的大鼠，用针对大鼠MBL的封闭性抗体处理的大鼠在冠状动脉闭塞时显示心肌损伤显著较轻(Jordan等人, Circulation 104:1413-1418, (2001))。尚不清楚氧化应激后MBL与血管内皮结合的分子机制；最近的研究表明，氧化应激后凝集素途径的活化可能是由MBL与血管内皮细胞角蛋白结合而介导，而不是与糖缀合物结合而介导(Collard等人, Am. J. Pathol. 159:1045-1054, (2001))。其它研究已表明缺血/再灌注损伤的发病机制中的经典途径和替代途径以及凝集素途径在这种疾病中的作用仍然存在争议(Riedermann, N.C.等人, Am. J. Pathol. 162:363-367, 2003)。
近期的研究显示，MASP-1和MASP-3将替代途径活化酶D因子从其酶原形式转化成其酶活性形式(参见Takahashi M.等人, J Exp Med 207(1):29-37 (2010)；Iwaki等人, J. Immunol. 187:3751-58 (2011))。此过程的生理重要性通过在MASP-1/3-缺陷小鼠的血浆中不存在替代途径功能活性而得以强调。对于替代途径，需要由天然C3蛋白水解生成的C3b发挥作用。由于替代途径C3转化酶(C3bBb)含有C3b作为必需亚基，因此关于经由替代途径的第一个C3b来源的疑问已提出了令人困扰的问题，且促使了相当多的研究工作。
C3属于含有被称为硫酯键的极少的翻译后修饰的蛋白质家族(与C4和α-2巨球蛋白一起)。硫酯基团由谷氨酰胺组成，其末端羰基与距离三个氨基酸外的半胱氨酸的巯基形成共价硫酯连接。该键不稳定，且亲电子的谷氨酰-硫酯可与亲核部分例如羟基或氨基反应并从而与其它分子形成共价键。当被隔离在完整C3的疏水口袋内部时，硫酯键是相当稳定的。然而，C3被蛋白水解切割成C3a和C3b，导致C3b上高反应性的硫酯键暴露出来，并随着通过包括羟基或氨基的邻近部分的亲核攻击，C3b与靶共价结合。除了充分记载的其在C3b与补体靶共价结合中的作用外，还认为C3硫酯具有触发替代途径的关键作用。根据普遍接受的“tick-over理论”，替代途径由液相转化酶iC3Bb的生成所启动，iC3Bb由C3与水解的硫酯(iC3；C3 (H2O))和B因子形成(Lachmann, P.J.等人, Springer Semin. Immunopathol.7:143-162, (1984))。C3b-样C3 (H2O)由天然C3经蛋白质中内部硫酯的缓慢自发水解而产生(Pangburn, M.K.,等人, J. Exp. Med. 154:856-867, 1981)。通过C3(H2O)Bb转化酶的活性，C3b分子沉积在靶表面，从而启动替代途径。
在本文所述的发现之前，对替代途径活化的引发剂的了解甚少。认为活化剂包括酵母细胞壁(酵母聚糖)、许多纯的多糖、兔红细胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞。这些活化剂所共有的唯一特征是碳水化合物的存在，但是碳水化合物结构的复杂性和多样性使得难以确定被识别的共享分子决定子。广泛接受的是替代途径活化通过此途径的抑制性调节成分之间的精细平衡控制，所述成分例如H因子、I因子、DAF和CR１和备解素，后者是替代途径唯一的阳性调节因子(参见Schwaeble W.J.和Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999))。
除了上文所述的明显的未调节的活化机制，替代途径还可以为凝集素/经典途径C3转化酶(C4b2a)提供强力的放大环，因为任何生成的C3b都可以与B因子参与形成额外的替代途径C3转化酶(C3bBb)。替代途径C3转化酶通过结合备解素被稳定化。备解素使替代途径C3转化酶的半衰期延长六到十倍。向替代途径C3转化酶添加C3b导致替代途径C5转化酶的形成。
一直以来认为所有三种途径(即经典、凝集素和替代途径)会合于C5，它被切割形成具有多种促炎作用的产物。会合的途径被称为末端补体途径。C5a是最有效的过敏毒素，引起平滑肌和血管紧张度以及血管通透性的改变。它还是嗜中性粒细胞和单核细胞两者的强有力的趋化因子和活化因子。C5a介导的细胞活化能够通过诱导释放多种另外的炎症介质来显著放大炎症反应，另外的炎症介质包括细胞因子、水解酶、花生四烯酸代谢物和活性氧类。C5裂解导致了C5b-9的形成，它也被称为膜攻击复合物(MAC)。目前强有力的证据表明，亚裂解的MAC沉积除了起到作为裂解的孔-形成复合物的作用外，还可能还在炎症中发挥重要作用。
除了其在免疫防御中的重要作用之外，补体系统还在很多临床病况中导致组织损伤。因此，对开发治疗有效的补体抑制剂以防止这些不良作用而言存在着迫切需要。
简述
一方面，本发明提供在患有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的受试者中抑制MASP-3-依赖性补体活化的方法。所述方法包括给予所述受试者包含一定量的MASP-3抑制剂的组合物的步骤，所述抑制剂有效抑制MASP-3-依赖性补体活化。在某些实施方案中，所述方法进一步包括给予所述受试者包含MASP-2抑制剂的组合物。
另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含至少一种抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述至少一种抑制剂包含MASP-2抑制剂和MASP-3抑制剂。
另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含与MASP-1 (SEQ ID NO: 10：全长)的一部分结合并且还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合的MASP-3抑制剂和药用载体。
另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含与MASP-2 (SEQ ID NO: 5：全长)的一部分结合并且还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合的MASP-3抑制剂和药用载体。
另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含与MASP-1 (SEQ ID NO: 10：全长)的一部分结合并且还与MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分结合的MASP-3抑制剂和药用载体。
另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含与MASP-1 (SEQ ID NO: 10全长)的一部分结合、与MASP-2 (SEQ ID NO: 5：全长)的一部分结合并且还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合的MASP-3抑制剂和药用载体。
如本文所述，本发明的药物组合物可以按照本发明的方法来使用。
参考以下发明详述和附图，本文所述的发明的这些和其它方面和实施方案将会是显而易见的。本说明书涉及到的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物都通过引用以其整体结合到本文中，如同各自单独结合到本文中。
附图描述
通过参考下面的发明详述并结合附图，将更容易理解本发明的前述方面以及许多附带的优势，附图中：
图1说明了对凝集素途径和替代途径的新的理解；
图2是改编自Schwaeble等人, Immunobiol 205:455-466 (2002)的示意图，由Yongqing等人, BBA 1824:253 (2012)修改，表明MASP-2和MAp19蛋白结构域以及编码它们的外显子；
图3是改编自Schwaeble等人, Immunobiol 205:455-466 (2002)的示意图，由Yongqing等人, BBA 1824:253 (2012)修改，表明MASP-1, MASP-3和MAp44蛋白结构域以及编码它们的外显子；
图4显示了MASP-1、MASP-2和MASP-3蛋白质的氨基酸序列的比对并指示了它们之间的共有区；
图5显示了MASP-1、MASP-2和MASP-3 α链的氨基酸序列的比对；
图6显示了MASP-1、MASP-2和MASP-3 β链的氨基酸序列的比对；
图7A显示了MASP-1和MASP-2蛋白酶结构域(β-链)的氨基酸序列的成对比对；
图7B显示了MASP-1和MASP-3蛋白酶结构域(β-链)的氨基酸序列的成对比对；
图7C显示了MASP-2和MASP-3蛋白酶结构域(β-链)的氨基酸序列的成对比对；
图8是卡普兰-迈耶曲线，图示表示在给予2.6 x 107 cfu的感染剂量的脑膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)血清组A Z2491后的MASP-2 KO和WT小鼠的百分比生存率，证明MASP-2缺陷型小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟氏菌诱导的死亡，如实施例1所述；
图9是卡普兰-迈耶曲线，图示表示在给予6 x 106 cfu的感染剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58后的MASP-2 KO和WT小鼠的百分比生存率，证明MASP-2缺陷型小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟氏菌诱导的死亡，如实施例1所述；
图10图示表示在用6x106 cfu脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58 i.p.感染后的不同时间点，从MASP-2 KO和WT小鼠中回收的每毫升血中的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58的log cfu/mL (n=3，在不同的时间点，对于这两组小鼠)，证明尽管MASP-2 KO小鼠用与用于WT小鼠的相同的剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58感染，但与WT相比，MASP-2 KO小鼠具有增高的菌血症清除率，如实施例1所述；
图11图示表示在用6x106 cfu脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58感染后的3、6、12和24小时的MASP-2 KO和WT小鼠的平均疾病评分，证明与WT小鼠相比，MASP-2-缺陷型小鼠在感染后6小时、12小时和24小时显示出低得多的疾病评分，如实施例1所述；
图12是卡普兰-迈耶曲线，图示表示在给予4x106 cfu的感染剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58后，接着在感染后3小时给予抑制性MASP-2抗体(1 mg/kg)或对照同种型抗体的小鼠百分比生存率，证明MASP-2抗体有效治疗和改善感染了脑膜炎奈瑟氏菌的受试者的生存率，如实施例2所述；
图13图示表示在与脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58孵育后的不同时间点采集的如表5所示的人血清样品中的在不同时间点回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58的活菌计数的log cfu/mL，如实施例3所述；
图14图示表示在表7所示的人血清样品中，在不同时间点回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58的活菌计数的log cfu/mL，显示在人20% (v/v)血清中的脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤是MASP-3和MBL-依赖性的，如实施例3所述；
图15图示表示在表9所示的小鼠血清样品中的在不同时间点回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58的活菌计数的log cfu/mL，显示与WT小鼠血清相比，MASP-2 -/- 敲除(knockout)小鼠(称为“MASP-2 -/-“)血清对于脑膜炎奈瑟氏菌具有更高水平的杀菌活性，而相比之下，MASP-1/3 -/-小鼠血清没有任何杀菌活性，如实施例3所述；
图16图示表示在凝集素途径-特异性条件下(1%血浆)，在WT、C4-/-、MASP-1/3-/-、B因子-/-和MASP-2-/-小鼠的血清中的C3活化动力学，如实施例4所述；
图17图示表示在得自MASP-3-缺陷型、C4-缺陷型和MBL-缺陷型人类受试者的血清样品中，在“传统的”替代途径-特异性(AP-特异性)条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的替代途径-驱动的(AP-驱动的) C3b沉积水平随血清浓度的变化，如实施例4所述；
图18图示表示在得自MASP-3-缺陷型、C4-缺陷型和MBL-缺陷型人类受试者的10%人血清样品中，在“传统的”AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随时间的变化，如实施例4所述；
图19A图示表示在得自WT、MASP-2-缺陷型和MASP-1/3-缺陷型小鼠的血清样品中，在“传统的”AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下或在允许凝集素途径和替代途径(AP)两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在甘露聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平随血清浓度的变化，如实施例4所述；
图19B图示表示在得自WT、MASP-2-缺陷型和MASP-1/3-缺陷型小鼠的血清样品中，在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平随血清浓度的变化，如实施例4所述；
图19C图示表示在得自WT、MASP-2-缺陷型和MASP-1/3-缺陷型小鼠的血清样品中，在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在肺炎链球菌(S. pneumoniae) D39-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平随血清浓度的变化，如实施例4所述；
图20A图示表示在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在甘露聚糖-包被的微量滴定板上进行的在高度稀释的血清中的C3b沉积测定结果，使用血清浓度范围为0%至1.25%，如实施例4所述；
图20B图示表示在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上进行的C3b沉积测定结果，使用血清浓度范围为0%至1.25%，如实施例4所述；
图20C图示表示在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在肺炎链球菌D39-包被的微量滴定板上进行的C3b沉积测定结果，使用血清浓度范围为0%至1.25%，如实施例4所述；
图21图示表示在来自MASP-3-/-、热灭活的正常人血清(HI NHS)、MBL-/-、NHS + MASP-2单克隆抗体和NHS对照的血清中，一系列血清稀释度的人血清在生理条件下(即在Ca++存在时)使甘露聚糖-包被的鼠红细胞溶血的水平(通过将溶解的小鼠红细胞(Crry/C3-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测量)，如实施例5所述；
图22图示表示在来自MASP-3-/-、热灭活的(HI) NHS、MBL-/-、NHS + MASP-2单克隆抗体和NHS对照的血清中，一系列血清浓度的人血清在生理条件下(即在Ca++存在时)使甘露聚糖-包被的鼠红细胞溶血的水平(通过将溶解的小鼠红细胞(Crry/C3-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测量)，如实施例5所述；
图23图示表示在来自3MC (MASP-3-/-)、热灭活的(HI) NHS、MBL-/-、NHS + MASP-2单克隆抗体和NHS对照的血清中，一系列血清浓度的人血清在生理条件下(即在Ca++存在时)使非-包被的鼠红细胞溶血的水平(通过将溶解的WT小鼠红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测量)，如实施例5所述；
图24图示表示在来自热灭活的(HI) NHS、MBL-/-、NHS + MASP-2单克隆抗体和NHS对照的血清中，一系列血清浓度的人血清在生理条件下(即在Ca++存在时)使非-包被的鼠红细胞溶血(通过将溶解的小鼠红细胞(CD55/59-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测量)，如实施例5所述；
图25图示表示一系列血清浓度的MASP-1/3-/-小鼠血清和WT对照小鼠血清在生理条件下(即在Ca++存在时)使甘露聚糖-包被的兔红细胞溶血(通过将溶解的兔红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测量)，如实施例6所述；
图26图示表示在AP-特异性条件下进行的C3沉积测定法中，在来自D因子-/-、MASP-2-/-和WT小鼠血清的血清样品中，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平(OD 405 nm)随血清浓度的变化，如实施例7所述；
图27图示表示在生理条件下(在Ca++存在时)进行的C3沉积测定法中，在来自D因子-/-；MASP-2-/-和WT小鼠血清的血清样品中，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平(OD 405 nm)随血清浓度的变化，如实施例7所述；
图28图示表示在生理条件下(在Ca++存在时)进行的C3b沉积测定法中，在得自D因子-/-；B因子-/-；加和减MASP-2单克隆抗体的小鼠血清样品中，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平(OD 405 nm)随血清孵育时间(分钟)的变化，如实施例7所述；
图29A图示表示在经皮下给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后的不同时间点，采自小鼠(n=3小鼠/组)的未稀释的血清样品中离体测定的在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的凝集素途径特异性C4b沉积，如实施例13所述；
图29B图示表示在小鼠中单次腹膜内给予0.6 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后3周内凝集素途径恢复的时间进程，如实施例13所述；
图30A是对于克隆M3J5，MASP-3抗原/抗体结合的FACS直方图，如实施例15所述；
图30B是对于克隆M3M1，MASP-3抗原/抗体结合的FACS直方图，如实施例15所述；
图31图示表示对于MASP-3抗原，克隆M3J5 (克隆5)的饱和结合曲线，如实施例15所述；
图32A是M3J5、M3M1、D14和1E10的VH区与鸡DT40 VH序列的氨基酸序列的比对，其中点表示与DT40序列的氨基酸同一性，横杠表示引入空位以使比对最大化，如实施例15所述；
图32B是M3J5、M3M1、D14和1E10的VL区与鸡DT40 VL序列的氨基酸序列的比对，其中点表示与DT40序列的氨基酸同一性，横杠表示引入空位以使比对最大化，如实施例15所述；
图33是柱状图，显示与测定试剂盒中提供的阳性血清以及同种型对照抗体相比，在Wieslab补体系统筛选MBL途径中mAb1E10的抑制活性，证明mAb1E10部分抑制LEA-2-依赖性活化，(通过抑制MASP-2的MASP-1-依赖性活化)，而同种型对照抗体却非如此，如实施例15所述；
图34图示表示对于1%正常人血清加同种型对照、SGMI-1Fc或SGMI-2Fc，在浓度范围为0.15至1000 nM时的C3b沉积水平，证明SGMI-1Fc和SGMI-2Fc两者在甘露聚糖-包被的ELISA孔中抑制来自正常血清的C3b沉积，IC50值分别为大约27nM和300nM，如实施例16所述；
图35A提供在热灭活的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)上的C3b沉积的流式细胞术分析结果，证明在正常人血清中在EDTA存在时(其已知灭活凝集素和替代途径)，未观察到C3b沉积(图区1)，在用Mg++/EGTA处理的正常人血清中，观察到替代途径-驱动的C3b沉积(图区2)，和如图区3、4和5所示，分别在B因子-耗尽的、D因子-耗尽的和备解素(P因子)-耗尽的血清中，未观察到替代途径驱动的C3b沉积，如实施例17所述；
图35B提供在热灭活的金黄色葡萄球菌上的C3b沉积的流式细胞术分析结果，证明正如在EDTA-处理的正常血清中(图区1)，在3MC血清中在Mg++/EGTA存在时不存在AP-驱动的C3b沉积(图区3)，而图区4和5显示活性全长rMASP-3 (图区4)和活性rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (图区5)两者在3MC血清中的AP-驱动的C3b沉积都恢复到用Mg++/EGTA处理的正常血清中观察到的水平(图区2)，而无活性rMASP-3 (S679A) (图区6)或野生型 rMASP-1 (图区7)在3MC血清中都不能恢复AP-驱动的C3b沉积，如实施例17所述；
图36显示了在响应金黄色葡萄球菌时，在3MC血清中在rMASP-3存在或不存在时测定B因子切割的蛋白质印迹分析结果，证明在相对于在Mg++/EGTA存在时的正常人血清而言(如泳道2 (阳性对照)所示)，EDTA存在时的正常人血清(阴性对照，泳道1)显示出非常少的B因子切割，如泳道3进一步所示，3MC血清在Mg++/EGTA存在时显示出非常少的B因子切割。然而，如泳道4所示，通过将全长、重组MASP-3蛋白加入3MC血清中并预孵育，恢复了B因子切割，如实施例17所述；
图37显示了蛋白凝胶的考马斯染色，其中分析了B因子切割，证明B因子切割在C3、MASP-3和前D因子(pro-factor D)存在时是最佳的(泳道1)；如泳道4和5所示，单用MASP-3或单用前D因子都能介导B因子切割，只要C3存在，如实施例17所述；
图38图示表示在3MC血清中在rMASP-3存在时，得自mAbD14 (其结合MASP-3)、mAb1A5 (阴性对照抗体)和同种型对照抗体的金黄色葡萄球菌的C3b染色平均荧光强度(MFI)对于mAb浓度作图，证明mAbD14以浓度-依赖性方式抑制MASP-3-依赖性C3b沉积，如实施例17所述；
图39显示了前D因子底物切割的蛋白质印迹分析，其中与单用前D因子(泳道1)或无活性全长重组MASP-3 (S679A；泳道3)或MASP-1 (S646A；泳道4)相比，全长野生型重组MASP-3 (泳道2)和MASP-1 (泳道5)完全或部分地切割前D因子，产生成熟D因子，如实施例18所述；
图40是蛋白质印迹，显示与含有仅MASP-3和前D因子的对照反应(无mAb，泳道1)以及含有得自DTLacO文库的mAb (其与MASP-1结合，而不与MASP-3结合)的对照反应(泳道4)相比，MASP-3结合mAbs D14 (泳道2)和M3M1 (泳道3)对MASP-3-依赖性前D因子切割的抑制活性，如实施例18所述；
图41图示表示在得自MASP-3-缺陷型(3MC)、C4-缺陷型和MBL-缺陷型受试者的血清样品中，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随血清浓度的变化，证明来自患者2和患者3的MASP-3-缺乏的血清在高血清浓度(25%、12.5%、6.25%血清浓度)时具有残留的AP活性，但显著更高AP50 (即需要8.2%和12.3%血清以达到50%最大C3沉积)，如实施例19所述；
图42图示表示在得自MASP-3缺陷型、C4-缺陷型和MBL-缺陷型人类受试者的10%人血清样品中，在“传统的”AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随时间的变化，如实施例19所述；
图43图示表示在来自2个正常人类受试者(NHS)和来自2个3MC患者(患者2和患者3)的血清中，在Ca++不存在时测定的一系列血清浓度的甘露聚糖-包被的兔红细胞的溶血百分率(通过使溶解的兔红细胞的血红蛋白释放至上清液中测量，所述上清液按照光度测定法测量)，证明与正常人血清相比，MASP-3缺陷降低了补体-介导的甘露聚糖-包被的红细胞溶解的百分率，如实施例19所述；
图44图示表示在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随加到得自人3MC患者2 (MASP-3-/-)的血清样品中的重组全长MASP-3蛋白的浓度的变化，证明与阴性对照无活性重组MASP-3 (MASP-3A；S679A)相比，活性重组MASP-3蛋白以浓度-依赖性方式重构在酵母聚糖-包被的板上的AP-驱动的C3b沉积，如实施例19所述；
图45图示表示在Ca++不存在时测定的以下血清中一系列血清浓度的甘露聚糖-包被的兔红细胞的溶血百分率(通过使溶解的兔红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测量)：(1)正常人血清(NHS)；(2) 3MC患者血清；(3) 3MC患者血清加活性全长重组MASP-3 (20 μg/ml)；和(4)热灭活的人血清(HIS)；证明与在无重组MASP-3的3MC血清中的溶血百分率相比，兔红细胞的溶血百分率在含有rMASP-3的3MC血清中显著增加(p=0.0006)，如实施例19所述；
图46图示表示在含有浓度范围为0至110 μg/ml的活性重组MASP-3 (在BBS/Mg++/EGTA中)的来自3MC患者2和来自3MC患者3的7%人血清中兔红细胞溶解的百分率，证明兔红细胞溶解百分率以浓度-依赖性方式随重组MASP-3量而增加，如实施例19所述；和
图47图示表示对于来自正常人类受试者(NHS)、来自2个3MC患者(患者2和患者3)、来自患者3的父母和来自MBL-缺陷型受试者的血清，在甘露聚糖-包被的ELISA板上的LEA-2-驱动的C3b沉积水平随在BBS缓冲液中稀释的人血清浓度的变化。
序列表描述
SEQ ID NO:1人MAp19 cDNA
SEQ ID NO:2人MAp19蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:3人MAp19蛋白(成熟)
SEQ ID NO:4人MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5人MASP-2蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:6人MASP-2蛋白(成熟)
SEQ ID NO:7人MASP-3 cDNA
SEQ ID NO:8人MASP-3蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:9人MASP-1 cDNA
SEQ ID NO:10人MASP-1蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:11人MAp44蛋白(w/前导序列)
SEQ ID NO:12大鼠MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:13大鼠MASP-2蛋白(带前导序列)
SEQ ID NO:14编码17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH) (无信号肽)的DNA
SEQ ID NO:15 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646)重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:16 17N16mc重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:17 17D20_dc21N11VL (OMS644)轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:18编码17N16_dc17N9 (OMS641)轻链可变区(VL) (无信号肽)的DNA
SEQ ID NO:19 17N16_dc17N9 (OMS641)轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:20：scFv子克隆(daughter clone) 17N16m_d17N9全长多肽
SEQ ID NO:21：scFv子克隆17D20m_d3521N11全长多肽
SEQ ID NO:22：编码全长多肽(无信号肽)的scFv子克隆17N16m_d17N9 DNA
SEQ ID NO:23：编码全长多肽(无信号肽)的scFv子克隆17D20m_d3521N11 DNA
SEQ ID NO:24：亲代DTLacO重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:25：MASP-3特异性克隆M3J5重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:26：MASP-3特异性克隆M3M1重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:27：亲代DTLacO轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:28：MASP-3特异性克隆M3J5轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:29：MASP-3特异性克隆M3M1轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:30：MASP-3克隆D14重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:31：MASP-3克隆D14轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:32：MASP-1克隆1E10重链可变区(VH)多肽
SEQ ID NO:33：MASP-1克隆1E10轻链可变区(VL)多肽
SEQ ID NO:34 SGMI-1肽
SEQ ID NO:35 SGMI-2肽
SEQ ID NO:36人IgG1-Fc多肽；
SEQ ID NO:37肽接头#1 (12aa)；
SEQ ID NO:38：肽接头#2 (10aa)；
SEQ ID NO:39：编码包含人IL-2-信号序列、SGMI-1、接头#1和人IgG1-Fc的多肽融合物的核酸；
SEQ ID NO:40：包含SGMI-1、接头#1和人IgG1-Fc的成熟多肽融合物(SGMI-1Fc)；
SEQ ID NO:41：编码包含人IL-2-信号序列、SGMI-2、接头#1和人IgG1-Fc的多肽融合物的核酸；
SEQ ID NO:42：包含SGMI-2、接头#1和人IgG1-Fc的成熟多肽融合物(SGMI-2Fc)。
发明详述
I. 定义
除非本文明确规定，否则本文使用的所有术语都具有如本发明领域的普通技术人员所理解的相同含义。当这些术语用于说明书和权利要求书以描述本发明时，提供下列定义以澄清所述术语。
如本文所用，凝集素途径效应物分支(arm) 1 (“LEA-1”)是指由MASP-3所致的B因子和D因子的凝集素-依赖性活化。
如本文所用，凝集素途径效应物分支2 (“LEA-2”)是指MASP-2-依赖性补体活化。
本文所用的术语“MASP-3-依赖性补体活化”包含2部分：(i) B因子和D因子的凝集素MASP-3-依赖性活化，其包括在LEA-1-介导的补体活化中，在Ca++存在时发生，通常导致C3bB转化为C3bBb和前D因子转化为D因子；和(ii) B因子和D因子的凝集素-非依赖性转化，其可以发生在Ca++不存在时，通常导致C3bB转化为C3bBb和前D因子转化为D因子。已经确定LEA-1-介导的补体活化以及B因子和D因子的凝集素-非依赖性转化导致调理作用和/或细胞溶解。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但认为仅当多个C3b分子靠近地缔合和结合时，C3bBb C3转化酶才改变其底物特异性并切割C5为替代途径C5转化酶，即C3bBb(C3b)n。
本文所用的术语“MASP-2-依赖性补体活化”在本文中也称为LEA-2-介导的补体活化，包括MASP-2凝集素-依赖性活化，其在Ca++存在时发生，导致凝集素途径C3转化酶C4b2a的形成和在C3切割产物C3b积累后随之导致C5转化酶C4b2a(C3b)n的形成，其被确定导致调理作用和/或细胞溶解。
本文所用的术语“替代途径的传统理解”也称为“传统的替代途径”是指先于本文所述的发现的替代途径，即例如由以下触发的补体活化：来自真菌和酵母细胞壁的酵母聚糖，来自革兰氏阴性外膜的脂多糖(LPS)，和兔红细胞，以及多种纯的多糖、病毒、细菌、动物肿瘤细胞、寄生虫和受损细胞，并且在传统上一直认为是由自补体因子C3自发蛋白水解产生的C3b而引起的。如本文所用，“传统的替代途径”(在本文中也称为“替代途径”)的活化在Mg++/EGTA缓冲液中(即在Ca++不存在时)测定。
本文所用的术语“凝集素途径”是指通过血清和非血清糖-结合蛋白(包括甘露聚糖-结合凝集素(MBL)、CL-11和纤维胶凝蛋白(H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白))的特异性结合而发生的补体活化。如本文所述，本发明人已经发现凝集素途径被两个效应物分支驱动：凝集素途径效应物分支1 (LEA-1)，其现在已知是MASP-3-依赖性的；和凝集素途径效应物分支2 (LEA-2)，其是MASP-2-依赖性的。如本文所用，凝集素途径的活化使用含有Ca++的缓冲液来评价。
本文所用的术语“经典途径”是指由抗体与外源颗粒结合而触发的并且需要结合识别分子C1q的补体活化。
本文所用的术语“HTRA-1”是指丝氨酸肽酶高温需要丝氨酸蛋白酶A1。
本文所用的术语“MASP-3抑制剂”是指直接或间接抑制MASP-3-依赖性补体活化的任何试剂，包括与MASP-3结合或直接与MASP-3相互作用的试剂，包括MASP-3抗体和其MASP-3结合片段、天然的和合成的肽、竞争性底物、小分子、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，并且也包括与MASP-3竞争性结合在凝集素途径中的另一识别分子(例如MBL、CL-11、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)的肽。在一个实施方案中，MASP-3抑制剂对MASP-3具有特异性，并且不结合MASP-1或MASP-2。直接抑制MASP-3的抑制剂可称为直接MASP-3抑制剂(例如MASP-3抗体)，而间接抑制MASP-3的抑制剂可称为间接MASP-3抑制剂(例如抑制MASP-3活化的MASP-1抗体)。直接MASP-3抑制剂的实例是MASP-3特异性抑制剂，例如特异性地与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合的MASP-3抑制剂，其结合亲和性比补体系统中的其它成分高至少10倍。在一个实施方案中，MASP-3抑制剂间接抑制MASP-3活性，例如，MASP-3活化抑制剂，包括MASP-1-介导的MASP-3活化抑制剂(例如MASP-1抗体或其MASP-1结合片段、天然的和合成的肽、小分子、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，并且也包括与MASP-1竞争性结合到MASP-3的肽)。在另一个实施方案中，MASP-3抑制剂抑制MASP-3-介导的D因子成熟。在另一个实施方案中，MASP-3抑制剂抑制MASP-3-介导的B因子活化。用于本发明方法的MASP-3抑制剂可以降低MASP-3-依赖性补体活化达大于10%、例如大于20%、大于50%或大于90%。在一个实施方案中，MASP-3抑制剂降低MASP-3-依赖性补体活化达大于90% (即导致MASP-3补体活化仅为10%或更低)。预计MASP-3抑制将会全部或部分地阻断LEA-1-相关的细胞溶解和调理作用以及B因子和D因子相关的细胞溶解和调理作用的凝集素-非依赖性转化两者。
本文所用的术语“MASP-1抑制剂”是指与MASP-1结合或直接与MASP-1相互作用并抑制以下至少一项的任何试剂：(i) MASP-3-依赖性补体活化和/或(ii) MASP-2-依赖性补体活化和/或(iii) 凝集素-非依赖性的或凝集素-依赖性MASP-1-介导的D因子成熟，其中D因子的凝集素-依赖性MASP-1成熟涉及到D因子的直接活化，包括MASP-1抗体及其MASP-1结合片段、天然的和合成的肽、小分子、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，并且也包括与MASP-1竞争性结合到凝集素途径中的另一识别分子(例如，MBL、CL-11、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)上的肽。在一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-1抑制剂降低MASP-3-依赖性补体活化达大于10%、例如大于20%、大于50%或大于90%。在一个实施方案中，MASP-1抑制剂降低MASP-3-依赖性补体活化达大于90% (即导致MASP-3补体活化仅为10%或更低)。在另一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-1抑制剂降低MASP-2-依赖性补体活化达大于10%、例如大于20%、大于50%或大于90%。在一个实施方案中，MASP-1抑制剂降低MASP-2-依赖性补体活化达大于90% (即导致MASP-2补体活化仅为10%或更低)。
在另一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-1抑制剂降低MASP-3-依赖性补体活化(LEA-1)、B因子和D因子的凝集素-非依赖性转化、和MASP-2-依赖性补体活化(LEA-2)达大于10%、例如大于20%、大于50%或大于90%。在一个实施方案中，MASP-1抑制剂降低MASP-3-依赖性补体活化(LEA-1)、B因子和D因子的凝集素-非依赖性转化、和MASP-2-依赖性补体活化(LEA-2)达大于90% (即导致MASP-3补体活化仅为10%或更低和MASP-2补体活化仅为10%或更低)。
直接MASP-1抑制剂的实例是MASP-1-特异性抑制剂，例如特异性地与MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分结合的MASP-1抑制剂，其结合亲和性比补体系统中的其它成分高至少10倍。在许多情况下，鉴于MASP-1可以活化MASP-3，并且鉴于MASP-1可以活化MASP-2，预计MASP-1的抑制将有效抑制MASP-3和/或MASP-2。然而，在某些情况下，相对于其它MASP靶的抑制，MASP-1或MASP-3或MASP-2任一的抑制可以是优选的实施方案。例如，在金黄色葡萄球感染的情况下，MASP-3已经证明被活化并在MASP-1不存在时负责金黄色葡萄球菌调理作用(参见Iwaki D.等人, J Immunol 187(7):3751-8 (2011))。因此，在例如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的治疗中，直接抑制MASP-1而不是MASP-3可能是有利的，从而在PNH的LEA-1-抑制性治疗期间降低对金黄色葡萄球菌的可能易感性。
本文所用的术语“MASP-2抑制剂”是指与MASP-2结合或直接与MASP-2相互作用并抑制以下至少一项的任何试剂：(i) MASP-2-依赖性补体活化和/或(ii) MASP-1-依赖性补体活化，包括MASP-2抗体及其MASP-2结合片段、天然的和合成的肽、小分子、表达抑制剂和分离的天然抑制剂，并且也包括与MASP-2竞争性结合到凝集素途径中的另一识别分子(例如，MBL、CL-11、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或L-纤维胶凝蛋白)上的肽。用于本发明方法的MASP-2抑制剂可以降低MASP-2-依赖性补体活化达大于10%、例如大于20%、大于50%或大于90%。在一个实施方案中，MASP-2抑制剂降低MASP-2-依赖性补体活化达大于90% (即导致MASP-2补体活化仅为10%或更低)。直接MASP-2抑制剂的实例是MASP-2-特异性抑制剂，例如特异性地与MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分结合的MASP-2抑制剂，其结合亲和性比补体系统中的其它成分高至少10倍。
本文所用的术语“抗体”包括这样的抗体及其抗体片段：其得自产生抗体的任何哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长类动物)，或得自杂交瘤、噬菌体选择、重组表达或转基因动物(或产生抗体或抗体片段的其它方法)，并与靶多肽(例如MASP-1、MASP-2或MASP-3多肽或其部分)特异性结合。不意欲按照抗体来源或其制备方式(例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物、肽合成等)来限制术语“抗体”。示例性的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体；泛-特异性、多特异性抗体(如双特异性抗体、三特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的小鼠-人、小鼠-灵长类、灵长类-人单克隆抗体；和抗-独特型抗体，并且可以是任何完整的抗体或其片段。本文所用的术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其合成变体、天然存在的变体，包括具有所需特异性的抗原-结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及包含所需特异性的抗原-结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。
“单克隆抗体”是指同质抗体群，其中所述单克隆抗体由在选择结合表位中涉及的氨基酸(天然存在的和非-天然存在的)组成。单克隆抗体对靶抗原是高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(ScFv)、其变体、包括抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、以及包括具有所需特异性和结合表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。不意欲按照抗体来源或其制备方式(例如通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)来限制它。该术语包括完整免疫球蛋白以及按照以上“抗体”定义所描述的片段等。
本文所用的术语“抗体片段”是指是指得自或涉及全长抗体(例如MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体)的一部分，一般包括其抗原结合区或其可变区。抗体片段的说明性实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所用的“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链上。通常，Fv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成所需的抗原结合结构。
本文所用的“嵌合抗体”是含有得自非人物种(如啮齿动物)抗体的可变结构域和互补决定区的重组蛋白，而抗体分子的其余部分来源于人抗体。
本文所用的“人源化抗体”是包含符合源自非人免疫球蛋白的特异性互补决定区的最小序列的嵌合抗体，该特异性互补决定区被植入人抗体构架中。人源化抗体通常是其中只有抗体互补决定区是非人来源的重组蛋白(包括从噬菌体展示或酵母中产生的抗体)。
本文所用的术语“甘露聚糖-结合凝集素”("MBL")等同于甘露聚糖-结合蛋白(“MBP”)。
本文所用的“膜攻击复合物”(“MAC”)是指插入并破坏膜的末端5种补体成分(C5b以及C6、C7、C8和C9)的复合物(也称为C5b-9)。
本文所用的“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、狗、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿动物。
本文所用的氨基酸残基的缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
从最广意义上看，天然存在的氨基酸可根据各个氨基酸侧链的化学特性来分组。“疏水”氨基酸是指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro的任一个。“亲水”氨基酸是指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His的任一个。氨基酸的这种分组可进一步细分如下。“不带电荷的亲水”氨基酸是指Ser、Thr、Asn或Gln的任一个。“酸性”氨基酸是指Glu或Asp的任一个。“碱性”氨基酸是指Lys、Arg或His的任一个。
本文所用的术语“保守氨基酸置换”通过下面每组中氨基酸之间的置换来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷胺酰胺和天冬酰胺；和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
本文所用的术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。该术语还包括由天然存在的核苷酸、糖和核苷酸间(骨架)共价键所组成的寡核苷酸碱基以及具有非天然存在的修饰的寡核苷酸。
本文所用的“表位”是指在蛋白(例如人MASP-3蛋白)上的与抗体结合的位点。“重叠表位”包括至少一个(例如2、3、4、5或6个)共同氨基酸残基，包括线性和非线性表位。
本文所用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，是指氨基酸的任何肽-连接的链，不管长度或翻译后修饰如何。本文所述的MASP蛋白(MASP-1、MASP-2或MASP-3)可含有或可以是野生型蛋白，或可以是具有不超过50(例如不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50个)保守氨基酸置换的变体。保守置换典型地包括以下组内的置换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯基丙氨酸和酪氨酸。
本文所述的人MASP-1蛋白(如SEQ ID NO:10所示)、人MASP-2蛋白(如SEQ ID NO:5所示)和人MASP-3蛋白(如SEQ ID NO:8所示)还包括所述蛋白的“肽片段”，其比全长和/或未成熟(前-原(pre-pro)) MASP蛋白更短，所包括的MASP蛋白的肽片段包括蛋白的末端以及内部缺失变体。缺失变体可以缺少(两个或更多氨基酸的) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸区段或不连续的单个氨基酸。在某些实施方案中，人MASP-1蛋白可以具有这样的氨基酸序列：其与具有SEQ ID NO: 10给出的氨基酸序列的人MASP-1蛋白具有等于或大于70 (例如71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100) %的同一性。
在某些实施方案中，人MASP-3蛋白可以具有这样的氨基酸序列：其与具有SEQ ID NO: 8给出的氨基酸序列的人MASP-3蛋白具有等于或大于70 (例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100) %的同一性。
在某些实施方案中，人MASP-2蛋白可以具有这样的氨基酸序列：其与具有SEQ ID NO: 5给出的氨基酸序列的人MASP-2蛋白具有等于或大于70 (例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100) %的同一性。
在某些实施方案中，肽片段的长度可以是至少6 (例如，至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500或600或更多)个氨基酸残基(例如SEQ ID NO: 5、8或10的任一个的至少6个连续氨基酸残基)。在某些实施方案中，人MASP蛋白的抗原性肽片段的长度为少于500 (例如，少于450、400、350、325、300、275、250、225、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7或6)个氨基酸残基(例如SEQ ID NO: 5、8或10的任一个的少于500个连续氨基酸残基)。
在某些实施方案中，在产生结合MASP-1、MASP-2和/或MASP-3的抗体的情况下，肽片段是抗原性的，并保留全长蛋白在哺乳动物中诱导抗原性反应的能力的至少10% (例如，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、或100%或更多) (参见以下“产生抗体的方法”)。
氨基酸序列同一性的百分率(%)定义为在比对序列和引入缺口(如果必要)以实现最大百分率序列同一性后，与参考序列中的氨基酸相同的候选序列中的氨基酸的百分率。为确定序列同一性百分率的比对可以以本领域技术内的多种方式来实现，例如，使用公众可得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)软件。用于测定比对的合适参数，包括实现跨越待比较的序列全长的最大比对所需的任何算法，可以通过已知方法来确定。
在代表性的实施方案中，人MASP-1蛋白(SEQ ID NO:10)由SEQ ID NO:9给出的cDNA序列编码；人MASP-2蛋白(SEQ ID NO:5)由SEQ ID NO:4给出的cDNA序列编码；和人MASP-3蛋白(SEQ ID NO:8)由SEQ ID NO:7给出的cDNA序列编码。本领域技术人员将知道，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7中公开的cDNA序列分别表示人MASP-1、MASP-2和MASP-3的单个等位基因，并且预期发生等位变异和可变剪接。SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的等位变体，包括含有沉默突变的那些和其中突变导致氨基酸序列改变的那些，都在本发明范围内。可按照标准程序，通过探测来自不同个体的cDNA或基因组文库，克隆MASP-1、MASP-2或MASP-3序列的等位变体，或者可通过含有所述信息的数据库的同源性比较搜索(例如，BLAST搜索)来鉴定MASP-1、MASP-2或MASP-3序列的等位变体。
II. 凝集素途径：新的理解
i. 概述：凝集素途径已被重新定义
如本文所述，本发明人已经作出惊人发现：补体的凝集素途径具有激活补体的两个效应物分支，两者都被由碳水化合物识别成分(MBL、CL-11和纤维胶凝蛋白)所形成的凝集素途径活化复合物驱动：i)由凝集素途径-相关丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-3所形成的效应物分支，在本文中称为“凝集素途径效应物分支1”或“LEA-1”；和(ii) MASP-2驱动的活化效应物分支，在本文中称为“凝集素途径效应物分支2”或“LEA-2”。LEA-1和LEA-2都可以起到细胞溶解和/或调理作用的效果。
还已确定，MASP-3所致的B因子的凝集素-非依赖性转化以及HTRA-1、MASP-1和MASP-3所致的D因子的凝集素-非依赖性转化(这两者可在Ca++不存在时发生)通常导致C3bB转化为C3bBb和前D因子转化为D因子。因此，抑制MASP-3可以同时抑制LEA-1和B因子和/或D因子的凝集素-非依赖性活化，这可导致对细胞溶解和/或调理作用的抑制。
图1说明了对补体活化途径的这一新的理解。如图1所示，LEA-1被凝集素-结合的MASP-3所驱动，其可将D因子酶原活化为其活性形式和/或切割C3b-或C3b(H20)-结合的B因子，导致C3bB酶原复合物转化为其酶促活性形式C3bBb。MASP-3所产生的活化的D因子也可将C3bB或C3b(H20)酶原复合物转化为其酶促活性形式。MASP-1能够快速自我活化，而MASP-3不能。在许多情况下，MASP-1是MASP-3的活化剂。
尽管在许多实例中，凝集素(即MBL、CL-11或纤维胶凝蛋白)可将活性指向细胞表面，图1也概述了MASP-3、MASP-1和HTRA-1在B因子活化和/或D因子成熟中的凝集素-非依赖性功能。正如在LEA-1中的MASP-3的凝集素-相关形式，MASP-3的凝集素-非依赖性形式能够介导将C3bB或C3b(H20)转化为C3bBb (另见图36和37)和将前D因子转化为D因子(参见图39)。MASP-1(另见图39)和非-MASP-相关蛋白HTRA-1也可活化D因子(Stanton等人, Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration, 在2011年5月4日的The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011会议上提交)，其方式无需凝集素成分。
因此，MASP-1 (经由LEA-1和凝集素-非依赖性形式)、MASP-3 (经由LEA-1和凝集素-非依赖性形式)和HTRA-1 (仅凝集素-非依赖性)能够在沿着MASP-3-D因子-B因子轴上的一点或多点上直接或间接活化。在这种情况下，它们产生C3bBb (替代途径的C3转化酶)和它们刺激C3b的产生并在微生物表面上沉积。C3b沉积在调理作用中起到关键性作用，标记微生物表面以便被宿主吞噬细胞(例如巨噬细胞)破坏。作为本文的一个实例(图35)，MASP-3对于金黄色葡萄球菌的调理作用是至关重要的。C3b沉积在暴露给人血清的金黄色葡萄球菌上以MASP-3-依赖性方式快速发生(图35)。
然而，LEA-1和MASP-3、MASP-1或HTRA-1的凝集素-非依赖性功能的贡献不限于调理作用。如图1所示，这3种成分还可通过B因子的间接或直接活化而引起细胞溶解，和C3b的产生。这些成分形成复合物，其产生替代途径C5转化酶，C3bBb(C3b)n。正如本文中进一步描述的，在脑膜炎奈瑟氏菌的细胞溶解中(参见图13、14和15)对MASP-3和MBL而不是MASP-2 (并且，因此在此实例中不是LEA-2)的需要，证明了LEA-1在细胞溶解中的作用。总之，得自金黄色葡萄球菌研究的调理作用结果和在脑膜炎奈瑟氏菌研究中观察到的细胞溶解结果支持LEA-1在这两个过程中的作用(如图1所示)。此外，这些研究证明调理作用和细胞溶解作用两者都可来自C3bB或C3b(H20)的转化和/或前D因子向D因子的转化；因此，这两个过程可能是MASP-3、MASP-1或HTRA-1的凝集素-非依赖性作用的结果。因此，在图1中的本发明人开发的模型支持主要使用MASP-3的抑制剂，以及MASP-1和/或HTRA-1的抑制剂，以阻断调理作用和/或细胞溶解和治疗这些过程的失调所致的病理学。
1. 凝集素途径效应物分支(LEA-1)
凝集素途径的第一效应物分支LEA-1是由凝集素途径-相关丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-3所形成。如本文所述，本发明人现在已经证明，在MASP-3不存在时和在MASP-1存在时，在表面结构上不有效活化替代途径。这些结果证明MASP-3在启动替代途径中起到先前未公开的作用，并且使用得自患有稀有3MC常染色体隐性病症的患者的MASP-3-缺乏的3MC血清证实了这一点(Rooryck C,等人, Nat Genet. 43(3):197-203 (2011))，所述患者具有使MASP-3丝氨酸蛋白酶结构域功能失调的突变。基于这些新发现，预期涉及替代途径的补体活化，正如常规定义的，是MASP-3-依赖性的。事实上，MASP-3，及其LEA-1活化，可以代表至今未搞清楚的替代途径的引发剂。
如本文的实施例1-4中进一步描述，在MASP-2-缺乏的血清中，本发明人观察到更高活性的凝集素-依赖性替代途径活化，其导致针对脑膜炎奈瑟氏菌的更高杀菌活性(即细胞溶解活性)。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，认为在MASP-2不存在时，带有MASP-1的碳水化合物识别复合物更可能紧密结合到带有MASP-3的碳水化合物识别复合物上，以活化MASP-3。已知在许多情况下，MASP-3的活化依赖于MASP-1活性，因为MASP-3不是自我活化的酶并且常常需要MASP-1的活性以便从其酶原形式转化为其酶促活性形式。MASP-1 (如同MASP-2)是自我活化的酶，而MASP-3不是自我活化的，并且在许多情况下，需要MASP-1的酶促活性以便转化为其酶促活性形式。参见Zundel S,等人, J Immunol., 172(7):4342-50 (2004)。在MASP-2不存在时，所有凝集素途径识别复合物都装载有MASP-1或MASP-3。因此，MASP-2不存在促进了MASP-1-介导的MASP-3向其酶促活性形式的转化。一旦MASP-3被活化，活化的MASP-3通过MASP-3-介导的C3bB向C3bBb的转化和/或前D因子向D因子的转化而启动替代途径活化(现在称为“LEA-1”活化)。C3bBb，也称为替代途径C3转化酶，切割额外的C3分子，得到调理素的C3b分子的沉积。如果若干C3b片段靠近而结合到C3bBb转化酶复合物上，则这导致形成替代途径C5转化酶C3bBb(C3b)n，其促进MAC形成。另外，C3b分子沉积在表面，形成B因子结合的新位点，其现在可以被D因子和/或MASP-3切割而形成额外位点，在此可以形成替代途径C3和C5转化酶复合物。需要后一过程以便有效溶解细胞，并且当已经发生起初的C3b沉积后，不需要凝集素。近期出版物(Iwaki D.等人, J Immunol 187(7):3751-8 (2011))以及本发明人得到的数据(图37)证明，替代途径C3转化酶酶原复合物C3bB通过活化MASP-3而转化为其酶促活性形式。本发明人现在已经发现，MASP-3-介导的B因子的切割代表新描述的LEA-1的亚成分，其促进替代途径C3转化酶C3bBb的凝集素-依赖性形成。
2. 凝集素途径效应物分支(LEA-2)
凝集素途径的第二效应物分支LEA-2，是由凝集素途径-相关丝氨酸蛋白酶MASP-2所形成。当识别成分与其各自模式结合后，MASP-2被活化，并且也可被MASP-1活化，随后切割补体成分C4为C4a和C4b。当切割产物C4b与血浆C2结合后，C4b-结合的C2变为第二MASP-2-介导的切割步骤的底物，其将C4b-结合的C2转化为酶促活性复合物C4bC2a和小C2b切割片段。C4b2a是凝集素途径的C3-转化的C3转化酶，将丰富的血浆成分C3转化为C3a和C3b。C3b经由硫酯键结合到靠近的任何表面上。如果若干C3b片段靠近而结合到C3转化酶复合物C4b2a上，则该转化酶改变其特异性，将C5转化为C5b和C5a，形成C5转化酶复合物C4b2a(C3b)n。尽管该C5转化酶可以启动MAC的形成，但该过程被认为自身不能有效促进细胞溶解。而是，由LEA-2所产生的起初的C3b调理素形成核，用于形成新的替代途径C3转化酶和C5转化酶位点，其最终导致大量MAC形成和细胞溶解。这后一事件是由与LEA-2-形成的C3b相关的B因子的D因子活化所介导，因此由于MASP-1在D因子成熟中的必要作用而依赖于LEA-1。亦存在MASP-2-依赖性C4-旁路活化途径，以在C4不存在时活化C3，这在缺血-再灌注损伤的病理生理学中起到重要作用，因为C4-缺陷型小鼠不能保护自身免于缺血-再灌注损伤，而MASP-2-缺陷型小鼠却可以(Schwaeble等人, PNAS, 2011 supra)。LEA-2还涉及到凝血途径，包括将凝血酶原切割为凝血酶(共同途径)并还切割XII因子(接触因子)以转化为其酶促活性形式XIIa。XIIa因子反过来将XI因子切割为XIa因子(固有途径)。凝血级联的固有途径活化导致纤维蛋白形成，其对于血栓形成是至关重要的。
图1基于本文提供的结果，说明了对凝集素途径和替代途径的新的理解。图1描绘了LEA-2在调理作用和细胞溶解两者中的作用。尽管MASP-2在生理性的多个凝集素-依赖性环境中是“下游”C3b沉积(和所导致的调理作用)的引发剂(图20A、20B、20C)，但它在血清-敏感性细菌的细胞溶解中也起作用。如图1所示，对于血清-敏感性病原体例如脑膜炎奈瑟氏菌，所提出的负责MASP-2-缺乏的或MASP-2-耗尽的血清/血浆的杀菌活性增加的分子机制是，对于细菌的细胞溶解而言，与MASP-1和MASP-3缔合的凝集素途径识别复合物必须彼此靠近地结合到细菌表面上，从而允许MASP-1切割MASP-3。与MASP-1和MASP-2相反，MASP-3不是自我活化的酶，但是在许多情况下，需要被MASP-1活化/切割而转化为其酶促活性形式。
进一步如图1所示，活化的MASP-3然后可以切割病原体表面上的C3b-结合的B因子，通过分别形成酶促活性替代途径C3和C5转化酶C3bBb和C3bBb(C3b)n而启动替代活化级联。携带MASP-2的凝集素-途径活化复合物不参与MASP-3活化，并且，在MASP-2不存在时或耗尽后，所有凝集素途径活化复合物将装载有MASP-1或MASP-3。因此，在MASP-2不存在时，在微生物表面上携带MASP-1和MASP-3的凝集素-途径活化复合物将彼此靠近的可能性明显增加，导致更多MASP-3被活化，从而导致更高速率的MASP-3-介导的C3b-结合的B因子切割，在微生物表面上形成替代途径C3和C5转化酶C3bBb和C3bBb(C3b)n。这导致末端活化级联C5b-C9的活化，形成膜攻击复合物，其由表面-结合的C5b与C6缔合、C5bC6与C7缔合、C5bC6C7与C8缔合和C5bC6C7C8组成，导致C9聚合，其插入到细菌表面结构并在细菌壁中形成小孔，其将导致补体-靶向的细菌的渗透压杀伤。
这一新概念的核心就是本文提供的数据清楚地显示了凝集素途径活化复合物驱动以下两个不同的活化途径，如图1所示：
i) LEA-1：MASP-3-依赖性活化途径，其通过在活化剂表面上的B因子的最初切割和活化而产生替代途径转化酶C3bBb，来启动和驱动补体活化，然后催化C3b沉积和替代途径转化酶C3bBb的形成。MASP-3-驱动的活化途径在调理作用和微生物细胞溶解中起到重要作用，并驱动在细菌表面上的替代途径，导致最佳活化速率，产生膜攻击复合物；和
ii) LEA-2：MASP-2-依赖性活化途径，导致凝集素途径C3转化酶C4b2a的形成，并且在C3切割产物C3b积累后，随之形成C5转化酶C4b2a(C3b)n。在补体C4不存在时，MASP-2可以形成替代C3转化酶复合物，其包括C2和凝血因子XI。
除了在细胞溶解中的作用外，MASP-2-驱动的活化途径还在细菌调理作用中起重要作用，导致微生物被共价结合的C3b及其切割产物(即iC3b和C3dg)所包被，这将是携带C3受体的吞噬细胞(例如粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、小胶质细胞)和网状内皮系统的摄取和杀伤的靶标。这是抵抗补体细胞溶解的细菌和微生物的清除的最有效途径。这些包括大部分革兰氏阳性菌。
除了LEA-1和LEA-2外，对于MASP-3、MASP-1和/或HTRA-1所致的D因子的凝集素-非依赖性活化存在可能性，并且对于MASP-3所致的B因子的凝集素-非依赖性活化也存在可能性。
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，认为(i) LEA-1，(ii) LEA-2和(iii) B因子和/或D因子的凝集素-非依赖性活化中的每一种导致调理作用和/或伴有所导致的细胞溶解的MAC形成。
ii. MASP-1、MASP-2和MASP-3的背景
3种甘露聚糖-结合凝集素-相关丝氨酸蛋白酶(MASP-1、MASP-2和MASP-3)目前已知与具有甘露聚糖-结合凝集素(MBL)的人血清有关。甘露聚糖-结合凝集素在最近的文献中也称为“甘露糖-结合蛋白”或“甘露糖-结合凝集素”。MBL-MASP复合物通过MBL与多种微生物上存在的碳水化合物结构结合而在先天免疫中起到重要作用。MBL与特定排列的碳水化合物结构的相互作用导致MASP前酶(proenzyme)活化，其反过来又通过切割补体成分C4和C2形成C3转化酶C4b2b而活化补体(Kawasaki等人, J. Biochem 106:483-489 (1989)；Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176:1497-1502 (1992)；Ji等人, J. Immunol 150:571-578 (1993))。
MBL-MASP前酶复合物直到最近都被认为含有仅仅一类蛋白酶(MASP-1)，但目前很清楚的是有2种其它不同的蛋白酶(即MASP-2和MASP-3)与MBL有关(Thiel等人, Nature 386:506-510 (1997)；Dahl等人, Immunity 15:127-135 (2001))，以及19 kDa的另外的血清蛋白，称为“MAp19”或“sMAP” (Stover等人, J. Immunol 162:3481-3490 (1999)；Stover等人, J. Immunol 163:6848-6859 (1999)；Takahashi等人, Int. Immunol 11:859-63 (1999))。
MAp19是MASP-2的结构基因的可变剪接的基因产物并缺乏MASP-2的4个C-末端结构域，包括丝氨酸内肽酶结构域。MASP-2基因的可变剪接/聚腺苷酸化事件产生了编码MAp19的大量表达的截短的mRNA转录本。通过类似机制，MASP-1/3基因导致3种主要基因产物：2种丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-3和称为“MAp44”的44 kDa的截短的基因产物(Degn等人, J. Immunol 183(11):7371-8 (2009)；Skjoedt等人, J Biol Chem 285:8234-43 (2010))。
MASP-1首次被描述为血清Ra-反应因子的P-100蛋白酶成分，其现在被认为是由MBL加MASP组成的复合物(Matsushita等人, Collectins and Innate Immunity, (1996)；Ji等人, J Immunol 150:571-578 (1993)。MBL-MASP复合物内的MBL-相关内肽酶以与补体经典途径的C1q-(Clr)2-(Cls)2复合物内的C1s酶明显相同的方式作用于补体成分C4和C2的能力表明，存在功能类似于C1q-(C1r)2-(C1s)2复合物的MBL-MASP复合物。通过C1q与免疫复合物中存在的抗体IgG或IgM的Fc区相互作用而活化C1q-(C1r)2-(C1s)2复合物。这导致C1r前酶的自我活化，其反过来又活化C1s前酶，后者再作用于补体成分C4和C2。
MBL-MASP复合物的化学计量学不同于C1q-(C1r)2-(C1s)2复合物中发现的化学计量学之处在于，不同的MBL寡聚物看来与不同比例的MASP-1/MAp19或MASP-2/MASP-3相关(Dahl等人, Immunity 15:127-135 (2001)。血清中存在的大部分MASP和MAp19不与MBL复合(Thiel等人, J Immunol 165:878-887 (2000))并且可以部分地与纤维胶凝蛋白缔合，纤维胶凝蛋白是目前描述的一组凝集素，其具有纤维蛋白原-样结构域，能够结合到微生物表面的N-乙酰基葡糖胺残基上(Le等人, FEBS Lett 425:367 (1998)；Sugimoto等人, J. Biol Chem 273:20721 (1998))。这其中，人L-纤维胶凝蛋白、H-纤维胶凝蛋白和M-纤维胶凝蛋白与MASP以及与MAp19缔合，并且在结合到纤维胶凝蛋白所识别的特异性碳水化合物结构上后可以活化凝集素途径(Matsushita等人, J Immunol 164:2281-2284 (2000)；Matsushita等人, J Immunol 168:3502-3506 (2002))。除了纤维胶凝蛋白和MBL外，MBL-样凝集素胶原凝集素(称为CL-11)已被识别为凝集素途径识别分子(Hansen等人，J Immunol 185:6096-6104 (2010)；Schwaeble等人，PNAS 108:7523-7528 (2011))。具有非常明确的证据表明这些替代碳水化合物识别分子的生理重要性，因此重要的是理解MBL不是凝集素活化途径的仅有的识别成分和MBL缺陷不被误认为是凝集素-途径缺陷。与MBL结构相关的一组替代碳水化合物-识别复合物的可能的存在可以拓宽经由补体活化而起始先天免疫系统的直接响应的微生物结构谱。
所有凝集素途径识别分子的特征在于在其胶原-同源茎区内的特异性MASP-结合基序(Wallis等人，J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004))。在MBL、CL-11和纤维胶凝蛋白中的MASP-结合位点的特征在于在该结构域内的独特基序：Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Pro，其中Hyp是羟脯氨酸和Xaa通常是脂肪族残基。该序列中的点突变破坏了MASP结合。
1. 各自的结构、序列、染色体定位和剪接变体
图2是示意图，表明MASP-2多肽(SEQ ID NO:5)和MAp19多肽(SEQ ID NO:2)的结构域结构以及编码它们的外显子。图3是示意图，表明MASP-1多肽(SEQ ID NO:10)、MASP-3多肽(SEQ ID NO:8)和MAp44多肽(SEQ ID NO:11)的结构域结构以及编码它们的外显子。如图2和3所示，丝氨酸蛋白酶MASP-1、MASP-2和MASP-3由6个独特结构域组成，其排列如同在C1r和C1s中所见；即(I) N-末端 C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(或CUBI)结构域；(II)表皮生长因子(EGF)-样结构域；(III)第二CUB结构域(CUBII)；(IV和V) 2种补体对照蛋白(CCP1和CCP2)结构域；和(VI)丝氨酸蛋白酶(SP)结构域。
人和小鼠MASP-1的cDNA-衍生的氨基酸序列(Sato等人, Int Immunol 6:665-669 (1994)；Takada等人, Biochem Biophys Res Commun 196:1003-1009 (1993)；Takayama等人, J. Immunol 152:2308-2316 (1994))；人、小鼠和大鼠MASP-2的cDNA-衍生的氨基酸序列(Thiel等人, Nature 386:506-510 (1997)；Endo等人, J Immunol 161:4924-30 (1998)；Stover等人, J. Immunol 162:3481-3490 (1999)；Stover等人, J. Immunol 163:6848-6859 (1999))；以及人MASP-3的cDNA-衍生的氨基酸序列(Dahl等人, Immunity 15:127-135 (2001))表明，这些蛋白酶是在其推定催化结构域中具有His、Asp和Ser残基的特征性三联体的丝氨酸肽酶(Genbank检索号：人MASP-1：BAA04477.1；小鼠MASP-1：BAA03944；大鼠MASP-1：AJ457084；人MASP-3：AAK84071；小鼠MASP-3：AB049755，正如2/15/2012访问的Genbank，其各自通过引用结合到本文中)。
进一步如图2和3所示，当酶原转化为活性形式后，重链(α或A链)和轻链(β或B链)分裂而得到二硫键连接的A-链和代表丝氨酸蛋白酶结构域的较小的B-链。单链前酶MASP-1通过切割位于第二CCP结构域(结构域V)和丝氨酸蛋白酶结构域(结构域VI)之间的Arg-Ile键而被活化(像前酶C1r和C1s)。前酶MASP-2和MASP-3被认为是以类似于MASP-1的方式而活化。每种MASP蛋白形成同型二聚体并以Ca++-依赖性方式分别与MBL和纤维胶凝蛋白缔合。
2. MASP-1/3
人MASP-1多肽(SEQ ID NO:10)和MASP-3多肽(SEQ ID NO:8)来自一个结构基因(Dahl等人, Immunity 15:127-135 (2001)，其已被作图到3号染色体长臂的3q27-28区(Takada等人, Genomics 25:757-759 (1995))。MASP-3和MASP-1的mRNA转录本是通过可变剪接/聚腺苷酸化过程而产生自初级转录本。MASP-3翻译产物是由α链(其是MASP-1和MASP-3共有的)和β链(丝氨酸蛋白酶结构域)(其是MASP-3独有的)组成。如图3所示，人MASP-1基因包括18个外显子。人MASP-1 cDNA (如SEQ ID NO:9给出)是由外显子2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14、15、16、17和18所编码。进一步如图3所示，人MASP 3基因包括12个外显子。人MASP-3 cDNA (如SEQ ID NO:7给出)是由外显子2、3、4、5、6、7、8、10、11和12所编码。可变剪接产生被称为MBL-相关蛋白44 (“MAp44”)的蛋白(如SEQ ID NO:11给出)，来自外显子2、3、4、5、6、7、8和9。
人MASP-1多肽(来自Genbank BAA04477.1的SEQ ID NO: 10)具有699个氨基酸残基，其包括19个残基的前导肽。当前导肽省略时，MASP-1的计算分子量为76,976 Da。如图3所示，MASP-1氨基酸序列含有4个N-连接的糖基化位点。人MASP-1蛋白结构域(参照SEQ ID NO:10)见图3并且包括N-末端C1r/C1s/海胆VEFG/骨形成蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:10的aa 25-137)、表皮生长因子-样结构域(SEQ ID NO:10的aa 139-181)、第二CUB结构域(CUBII) (SEQ ID NO:10的aa 185-296)、以及串联的补体对照蛋白(SEQ ID NO:10的CCP1 aa 301-363和CCP2 aa 367-432)结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)。
人MASP-3多肽(SEQ ID NO:8，来自Genbank AAK84071)具有728个氨基酸残基，其包括19个残基的前导肽。当前导肽省略时，MASP-3的计算分子量为81,873 Da。如图3所示，在MASP-3中有7个N-连接的糖基化位点。人MASP-3蛋白结构域(参照SEQ ID NO:8)见图3并且包括N-末端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:8的aa 25-137)、表皮生长因子-样结构域(SEQ ID NO:8的aa 139-181)、第二CUB结构域(CUBII) (SEQ ID NO:8的aa 185-296)、以及串联的补体对照蛋白(SEQ ID NO:8的CCP1 aa 301-363和CCP2 aa 367-432)结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)。
MASP-3翻译产物是由α链(重链) (α链：SEQ ID NO:8的aa 1-448)和轻链(β链：SEQ ID NO:8的aa 449-728)组成；所述α链含有CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2结构域，其是MASP-1和MASP-3两者共有的，所述轻链含有丝氨酸蛋白酶结构域，其是MASP-3和MASP-1是独有的。
3. MASP-2
人MASP-2基因位于染色体1p36.3-2上(Stover等人, Cytogenet and Cell Genet 84:148-149 (1999)和包括12个外显子，如图2所示。MASP-2 (SEQ ID NO:5)和MAp19 (SEQ ID NO:2)是由通过可变剪接/聚腺苷酸化而产生的单个结构基因的转录本所编码的(Stover等人, Genes and Immunity 2:119-127 (2001))。人MASP-2 cDNA (SEQ ID NO:4)是由外显子2、3、4、6、7、8、9、10、11和12所编码。20 kDa蛋白，称为MBL-相关蛋白19 ("MAp19",也称为"sMAP") (SEQ ID NO:2)，由(SEQ ID NO:1)所编码，产生自外显子2、3、4和5。MAp19是非酶蛋白，含有MASP-2的N-末端CUB1-EGF区与衍生自外显子5的4个额外残基(EQSL)，如图2所示。
MASP-2多肽(SEQ ID NO:5)具有686个氨基酸残基，其包括15个残基的前导肽，其在分泌后被切掉，产生人MASP-2的成熟形式(SEQ ID NO:6)。如图2所示，MASP-2氨基酸序列不含任何N-连接的糖基化位点。MASP-2多肽具有类似于MASP-1、MASP-3和C1r和C1s (C1补体系统的蛋白酶)的分子结构。人MASP-2蛋白结构域(按照SEQ ID NO:5编号)见图2并且包括N-末端C1r/C1s/海胆VEGF/骨形成蛋白(CUBI)结构域(SEQ ID NO:5的aa 24-136)、表皮生长因子-样结构域(SEQ ID NO:5的aa 138-180)、第二CUB结构域(CUBII) (SEQ ID NO:5的aa 184-295)、以及串联的补体对照蛋白(SEQ ID NO:5的CCP1 aa 300-359和CCP2 aa 364-431)结构域和丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)。
如图2所示，MASP-2多肽具有含有CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2结构域的α链(重链) (α链：SEQ ID NO:5的aa 1-443)和含有丝氨酸蛋白酶结构域的β链(轻链) (β链：aa 444-686)。CUB-1、EGF和CUB-2的结构域是二聚化所需的并且CUB-1、EGF、CUB-2和CCP-1的结构域含有MBP结合位点。正如Wallis等人, J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004)所述，每个MASP-2二聚体结合到2个MBL亚单位上。
4. MASP-1、MASP-2和MASP-3的氨基酸序列的比较
图4是MASP-1 (SEQ ID NO:10)、MASP-2 (SEQ ID NO:6)和MASP-3 (SEQ ID NO:8)的蛋白质序列的氨基酸比对，显示CUBI、EGF、CUBII、CCP1、CCP2结构域和丝氨酸蛋白酶(SP)结构域中的保守催化三联体残基(H、D、S)。符号“.”表示相同的氨基酸序列。
图5是MASP-1 (α链：SEQ ID NO:10的aa 1-447)、MASP-2 (α链：SEQ ID NO:5的aa 1-443)和MASP-3 (α链：SEQ ID NO:8的aa 1-448)的α链序列的氨基酸比对，包括CUBI-EGF-CUBII-CCP1-CCP2。在CUBI、EGF和CUBII结构域中有多个同一性补位(patch)，如图5中的虚线框所示。CCP1和CCP2结构域由黑色阴影框表示。人MASP1/3和人MASP-2的α链间的总体%同一性在下表1中提供。
图6是MASP-1 (β链：SEQ ID NO:10的aa 448-699)、MASP-2 (β链：SEQ ID NO:5的aa 444-686)和MASP-3 (β链：SEQ ID NO:8的aa 449-728)的β链序列(包括丝氨酸蛋白酶结构域)的氨基酸比对。图7A显示了MASP-1 (β链：SEQ ID NO:10的aa 448-699)和MASP-2 (β链：SEQ ID NO:5的aa 444-686)的β链序列之间的成对氨基酸比对。图7B显示了MASP-1 (β链：SEQ ID NO:10的aa 448-699)和MASP-3 (β链：SEQ ID NO:8的aa 449-728)的β链序列之间的成对氨基酸比对。图7C显示了MASP-2 (β链：SEQ ID NO:5的aa 444-686)和MASP-3 (β链：SEQ ID NO:8的aa 449-728)的β链序列之间的成对氨基酸比对。图5-7中的同一性区显示为围绕相同氨基酸(显示为“.”符号)的虚线框。
人MASP-1、MASP-2和MASP-3蛋白的α和β链之间的百分比同一性在下表1中提供。
表1：人MASP蛋白之间的百分比同一性
对于α链(重链)，如上表1所示，MASP-1和MASP-3的α链是相同的(除了3’末端的15个氨基酸序列)。MASP-2和MASP-3的α链间的总体%同一性为45.4%，在CUBI-EGF-CUBII结构域中有多个同一性补位，如图5所示。
对于β链(轻链)，3种β链间的总体百分比同一性很低，范围为27%至28%，然而，尽管3种B-链之间的总体同一性低，但有多个同一性补位，如图6所示。进一步如图7A-C所示，序列的相同补位在MASP-2和3之间比在1和2之间或1和3之间分布更广泛。
在MASP-2、MASP-3、C1r和C1s中存在的所有半胱氨酸残基与MASP-1中的相当残基比对；然而，MASP-1有2个半胱氨酸残基(在L链中的位置465和481)，其是MASP-2、MASP-3、C1r和C1s中不存在的。在MASP-1中的这2个半胱氨酸残基在预计的位置上，用于形成“组氨酸-环”二硫桥，正如在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶中所见。这表明MASP-2、MASP-3、C1r和C1s可能通过基因复制和趋异，自MASP-1而进化(Nonaka & Miyazawa, Genome Biology 3 Reviews 1001.1-1001.5 (2001))。
5. 各自的生物功能/活性，包括相关的人类遗传数据
MBL/纤维胶凝蛋白-MASP复合物在先天免疫中的作用是经由以下结合而介导：经由C-型凝集素结构域(在MBL分子中存在)与酵母、细菌、病毒和真菌上存在的碳水化合物结构的钙-依赖性结合，或经由纤维蛋白原-样结构域(在纤维胶凝蛋白分子中存在)与酵母、细菌、病毒和真菌上存在的碳水化合物结构的结合。这种识别阶段导致前酶MASP-2活化，其随后模拟C1q-(C1r)2-(C1s)2复合物内的活化的C1s的作用，通过切割C4和C2而形成C3转化酶C4b2b。这允许C4b和C3b沉积在靶病原体上并因此通过吞噬作用而促进杀伤和清除。
近期文献中的证据表明，凝集素途径活化复合物仅需要MASP-2活性，以切割C4和C2：i)使用重组MBL和重组表达的MASP-2的最低凝集素-途径活化复合物的重构显然足以在体外有效切割C4和C2两者(Vorup-Jensen等人, J. Immunol 165:2093-2100 (2000)；Rossi等人, J Biol Chem 276:40880-40887 (2001)；Ambrus等人, J Immunol 170:1374-1382 (2003)；Gál等人, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005))；同时ii)具有MASP-2的基因-靶向缺陷的小鼠血清缺乏任何凝集素途径功能活性(Schwaeble等人, PNAS 108:7523-7528 (2011))。最近描述了MASP-2的遗传确定的缺陷(Stengaard-Pedersen等人, New Eng. J. Med. 349:554-560, (2003))。单核苷酸突变导致CUB1结构域中的Asp-Gly交换并使MASP-2不能与MBL结合。
另外，同时缺乏MASP-1和MASP-3的小鼠血清的功能表征显示当在生理条件下比较野生型和MASP-1/MASP-3敲除(MASP-1/3-/-)小鼠的血清时，凝集素途径活性减慢，但并非没有(Takahashi等人, J. Immunol 180:6132-6138 (2008)；Schwaeble等人, PNAS (2011))。这些研究表明与经典途径效应物内肽酶C1s相反，MASP-2的活化不一定涉及或需要任何其它MBL-相关丝氨酸内肽酶(即MASP-1或MASP-3)的活性并且MASP-2的蛋白水解活性足以将凝集素途径的碳水化合物识别分子(即MBL、纤维胶凝蛋白或CL-11)的结合转化为补体活化。然而，新近的研究已经证明尽管MASP-2具有自我活化能力，但MASP-2酶原的MASP-1活化的催化速率超过其自身酶原形式的MASP-2切割的速率大约85,000倍(Héja等人, PNAS 106:10498-503 (2011)；Megyeri等人, J. Biol. Chem. 288(13):8922-34 (2013))。因此，在生理环境中，很可能MASP-2的主要活化物是MASP-1。根据所产生的C4片段大小和所产生的功能性C3转化酶活性来判断，似乎可能的是活化MASP-2以与活化C1s所进行的相同方式切割C4和C2，即，在C4的α-链内的单个精氨酰键上(Arg76 Ala77)和在C2的前酶链内的单个精氨酰键上(Arg223 Lys224)。还已报道，小鼠MASP (以小鼠MBL-MASP复合物形式，称为Ra-反应因子)，不同于C1s，可切割补体成分C3的α-链，得到生物活性片段C3a和C3b (Ogata等人, J. Immunol 154:2351-2357 (1995))。如果这在人体系统中发生，它将需要切割C3的α-链内的单个精氨酰键(Arg77 Ser78)。活化MASP-2，如同活化C1s，不能切割补体成分C5。MASP-1和MASP-2的蛋白水解活性被C1-抑制剂抑制(Matsushita等人, J Immunol 165:2637-2642 (2000)，而C1-抑制剂不与MASP-3反应(Dahl等人, Immunity 15:127-135 (2001)；Zundel等人, J Immunol 172:4342-4350 (2004))。
MASP-l和MASP-3的生物学功能一直在缓慢发现。MASP-1的底物特异性和生理作用自发现以来一直是争论对象。近年来已经鉴定了大量可能底物。已经提出MASP-1可以缓慢切割天然C3，并且这种对C3的直接切割可能启动补体级联，也许借助于替代途径(Matsushita等人, J Immunol 165:2637-2642 (2000))。随后证明重组MASP-1切割无活性(硫酯水解的)形式的C3，这对于启动补体级联而言是徒劳无益的(Ambrus等人, J Immunol 170:1374-1382 (2003))。MASP-2-缺陷型小鼠的血清稀释液中的凝集素途径活性的缺乏明确证明了MASP-1-驱动的C3-旁路机制不存在(Schwaeble等人, PNAS 108:7523-7528 (2011))。被MASP-1以显著效率切割的补体成分是C2 (Rossi等人, J Biol Chem 276:40880-40887 (2001)；Ambrus等人, J Immunol 170:1374-1382 (2003))和D因子的酶原形式(Takahashi等人, J Exp Med 207:29-37 (2010))。正如对于MASP-1切割C2的能力，似乎可能因此MASP-1可以经由C2切割而扩大MASP-2的C3-转化酶(C4b2a)-形成能力。这一建议得到以下观点的支持：在MASP-1-耗尽的人血清中和在MASP-1/3-缺陷型小鼠血清中，凝集素途径的活性减少(Takahashi等人, J Immunol 180:6132-6138 (2008))，所述观点也表明MASP-1在活化MASP-2中起作用。此外，尽管通过MBL-MASP复合物沉积的每个C4b都可形成C4b2a转化酶，但通过经典途径C1复合物沉积的4个C4b中仅有1个可以如此形成(Rawal等人, J Biol Chem 283 (12):7853-63 (2008))。
MASP-1还切割MASP-2和MASP-3 (Megyeri M.,等人, J Biol Chem. 2013 Mar 29；288(13):8922-34)。近期实验表明，尽管MASP-2可以自我活化，但MASP-1是酶原MASP-2的主要活化物。在MASP-1敲除小鼠血清中，MASP-2的活化被延迟(Takahashi等人, J Immunol 180: 6132-6138 (2008))，并且在正常人血清中当MASP-1活性被特异性抑制剂阻断时也观察到类似结果(Kocsis等人, J Immunol 185(7):4169-78 (2010))。此外，Degn等人，(J. Immunol. 189(8): 3957-69 (2012))发现在人血清中，MASP-1对于MASP-2活化和随后的C4切割是至关重要的。酶原MASP-2转化为活性MASP-2的催化速率比MASP-2可自我活化的速率大85,000倍以上(Megyeri等人, J. Biol. Chem. 288:8922–8934 (2013)；Héja等人, J. Biol. Chem. 287(24):20290-300 (2012)；Héja等人, PNAS 109:10498-503 (2012))。
近期研究还将MASP-1与替代途径相关联。MASP-1可将酶原D因子转化为其酶促活性形式(图39；Takahashi等人, J Exp Med 207:29-37 (2010))。此外，MASP-1活化MASP-3的酶原形式(Megyeri等人, J. Biol. Chem. 288:8922–8934 (2013)；Degn等人，J. Immunol. 189(8): 3957-69 (2012))，其自身可以活化酶原D因子(图39)以及将B因子(其是替代途径的另一必要成分)切割为其活性形式(Iwaki等人, J. Immunol. 187:3751-58 (2011))。然而，前D因子和前B因子的转化可能是独立于LEA-2的活化状态并且可通过非-复合物-结合的MASP-1而发生。
若干条证据表明，MASP-1是凝血酶-样酶和在凝血途径的活化中是重要的。MASP-1可以切割凝血酶的若干底物，包括纤维蛋白原(Hajela K.等人, Immunobiology 205(4-5):467-75 (2002))、XIII因子(Krarup等人, Biochim Biophys Acta 1784(9):1294-1300 (2008))和蛋白酶-活化受体4 (PAR4) (Megyeri等人, J Immunol 183(5):3409-16 (2009))。此外，在肝素存在时的抗凝血酶是比C1-抑制剂更有效的MASP-1抑制剂(Dobó等人, J Immunol 183:1207-1214 (2009))。以下观察结果也强调了补体和凝血途径之间的联系：MASP-2能够活化凝血酶原(Krarup A.等人, PLoS One 2(7):e623 (2007))。当纤维蛋白凝块阻止入侵病原体的扩散时，有限的凝血代表古老类型的先天免疫。释放的血纤维蛋白肽B具有促炎活性。MASP-1-介导的PAR4切割活化内皮细胞-启动的炎性反应(Megyeri等人, J Immunol 183(5):3409-16 (2009))。
MASP-3对C4、C2或C3底物没有蛋白水解活性。相反，MASP-3据报道起到凝集素途径的抑制剂的作用(Dahl等人, Immunity 15:127-135 (2001))。得出该结论可能是因为与MASP-1和MASP-2相反，MASP-3不是自我活化的酶(Zundel S.等人, J Immunol 172:4342-4350 (2004)；Megyeri等人, J. Biol. Chem. 288:8922–8934 (2013)。
最近，使用组合MASP-1和MASP-3缺陷的小鼠菌株，从转基因小鼠研究中得到MASP-1和MASP-3的可能的生理功能的证据。尽管MASP-1/3-敲除小鼠具有功能性凝集素途径(Schwaeble等人, PNAS 108:7523-7528 (2011))，但它们看来缺乏替代途径活性(Takahashi等人, JEM 207(1):29-37(2010))。替代途径活性的缺乏看来是因为补体D因子的加工缺陷，补体D因子是替代途径活性所必需的。在MASP-1/3敲除小鼠中，所有D因子以蛋白水解的无活性前形式(pro-form)循环，而在正常小鼠血清中，几乎所有D因子都呈活性形式。生化分析表明MASP-1可以能够将补体D因子从其酶原形式转化为其酶促活性形式(图39；Takahashi等人, JEM 207(1):29-37(2010))。MASP-3在体外也切割前D因子酶原和产生活性D因子(图39；Takahashi等人, JEM 207(1):29-37(2010))。D因子以活性酶形式存在于正常个体的循环中，并且MASP-1和MASP-3、以及HTRA-1，可能负责该活化。此外，具有组合MBL和纤维胶凝蛋白缺陷的小鼠仍然产生正常水平的D因子并具有完全功能性替代途径。因此，MASP-1和MASP-3的这些生理功能不一定涉及凝集素，并因此与凝集素途径无关。重组小鼠和人MASP-3还看来在体外切割B因子和支持C3沉积在金黄色葡萄球菌上(图36；Iwaki D.等人, J Immunol 187(7):3751-8(2011))。
从3MC综合征(先前称为Carnevale、Mingarelli、Malpuech和Michels综合征；OMIM # 257920)患者的近期研究中发现MASP-3的一个意外生理作用。这些患者表现出严重发育异常，包括腭裂、唇裂、颅骨畸形和智力迟钝。遗传学分析鉴定了功能失调的MASP-3基因为纯合子的3MC患者(Rooryck等人, Nat Genet. 43(3):197-203 (2011))。发现另一组3MC患者是MASP-1基因中的突变的纯合子，所述突变导致功能性MASP-1和MASP-3蛋白的不存在。再一组3MC患者缺乏功能性CL-11基因(Rooryck等人, Nat Genet. 43(3):197-203 (2011))。因此，CL-11 MASP-3轴看来在胚胎发育期间起作用。该发育途径的分子机制尚不清楚。然而，这不太可能是由常规补体-驱动的过程介导，因为常见补体成分C3缺陷的个体并不出现这种综合征。因此，在本发明人的发现之前，如本文所述，MASP-3在凝集素-依赖性补体活化中的功能性作用在先前并未确定。
通过X射线晶体学已经确定了MASP-1和MASP-2催化片段的结构。MASP-1蛋白酶结构域与其它补体蛋白酶的结构比较揭示出其不严格的底物特异性的基础(Dobó等人, J. Immunol 183:1207-1214 (2009))。尽管MASP-2的底物结合沟的可达性受到表面环的限制(Harmat等人, J Mol Biol 342:1533-1546 (2004))，但MASP-1具有开放的底物结合口袋，其类似于胰蛋白酶而非其它补体蛋白酶。MASP-1结构的凝血酶-样性质是不寻常的大的60个氨基酸环(环B)，其可以与底物相互作用。MASP-1结构的另一吸引人的性质是S1 Asp189和Arg224之间的内部盐桥。在D因子的底物结合口袋中可以发现类似的盐桥，其可以调节其蛋白酶活性。C1s和MASP-2具有几乎相同的底物特异性。令人吃惊的是，与C1s的相比，决定底物特异性的MASP-2的8个表面环中的一些具有完全不同的构象。这意味着这2种功能相关的酶以不同方式与相同底物相互作用。酶原MASP-2的结构显示了具有被破坏的氧阴离子洞和底物结合口袋的无活性蛋白酶结构域(Gál等人, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005))。令人吃惊的是，酶原MASP-2在大蛋白底物C4上显示了相当大的活性。很可能酶原MASP-2的结构相当柔韧，使得无活性和活性形式之间的转换成为可能。反映在结构中的这种柔韧性在自我活化过程中可能起作用。
蛋白质印迹分析指出肝脏是MASP-1和MASP-2 mRNA的主要来源。使用针对MASP-1的5'特异性cDNA探针，可见大MASP-1转录本在4.8 kb和小的在大约3.4 kb，这两者存在于人和小鼠肝脏内(Stover等人, Genes Immunity 4:374-84 (2003))。MASP-2 mRNA (2.6 kb)和MAp19 mRNA (1.0 kb)在肝组织中大量表达。MASP-3在肝脏中表达，并且也在许多其它组织包括神经组织中表达(Lynch N. J.等人, J Immunol 174:4998-5006 (2005))。
发现具有感染和慢性炎性疾病史的患者具有MASP-2的突变形式，其不能形成活性MBL-MASP复合物(Stengaard-Pedersen等人, N Engl J Med 349:554-560 (2003))。一些研究人员已经确定MBL缺陷导致对儿童频繁感染的倾向(Super等人, Lancet 2:1236-1239 (1989)；Garred等人, Lancet 346:941-943 (1995)和对HIV感染的抵抗性增加(Nielsen等人, Clin Exp Immunol 100:219-222 (1995)；Garred等人, Mol Immunol 33 (增刊1):8 (1996))。然而，其它研究没有证明低MBL水平与增加的感染之间的显著相关(Egli等人, PLoS One. 8(1):e51983(2013)；Ruskamp等人, J Infect Dis. 198(11):1707-13 (2008)；Isra?ls等人, Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 95(6):F452-61 (2010))。尽管文献是混合的，但MASP的缺陷或无用性可能对个体产生针对某些病原体的直接非-抗体-依赖性防御的能力具有不良效应。
iii. 新的理解的支持数据，强调缺乏Ca++的传统测定条件和使用包括Ca++的更生理性的条件设置而得到的结果。
本文提供了若干条独立的有力实验证据，指出补体的凝集素途径活化途径经由以下2种独立的效应物机制而活化补体的结论：i) LEA-2：MASP-2-驱动的路径，其介导补体-驱动的调理作用、趋化作用(Schwaeble等人, PNAS 108:7523-7528 (2011))和细胞溶解，和ii) LEA-1：新的MASP-3-依赖性活化途径，其启动补体活化，即通过经活化剂表面上的B因子的切割和活化而产生替代途径转化酶C3bBb，其然后催化C3b沉积和形成替代途径转化酶C3bBb，其可导致细胞溶解以及微生物调理作用。另外，如本文所述，由MASP-1、MASP-3或HTRA-1或任何这3者的组合所致的B因子和/或D因子的单独的凝集素-非依赖性活化，也可经由替代途径导致补体活化。
替代途径的凝集素途径-依赖性MASP-3-驱动的活化看来有助于已充分确定的C3b-结合的B因子的D因子-介导的切割，以通过末端活化级联而达到补体-依赖性细胞溶解的最佳活化率，通过在细胞表面上形成C5b-9膜攻击复合物(MAC)而溶解细菌细胞(图14-15)。这种限速事件看来需要最佳协调，因为在MASP-3功能活性不存在时以及在D因子功能活性不存在时是有缺陷的。如本文的实施例1-4所述，本发明人在脑膜炎奈瑟氏菌感染的实验小鼠模型中研究MASP-2缺陷和MASP-2抑制的表型时，发现该MASP-3-依赖性凝集素途径功能。用基于抗体的MASP-2抑制剂治疗的基因-靶向的MASP-2-缺陷型小鼠和野生型小鼠对实验性脑膜炎奈瑟氏菌感染具有高度抗性(参见图8-12)。当将感染剂量调节至野生型同窝出生幼崽(littermate)达到大约60%死亡率时，所有MASP-2-缺乏的或MASP-2-耗尽的小鼠清除感染并且存活(参见图8和图12)。在MASP-2-缺乏的或MASP-2-耗尽的小鼠血清中血清杀菌活性显著增高反映了这种极高程度的抗性。进一步实验表明该杀菌活性依赖于替代途径-驱动的细菌溶解。缺乏B因子或D因子或C3的小鼠血清显示出无针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌活性，表明替代途径对于驱动末端活化级联而言是必要的。令人吃惊的结果是缺乏MBL-A和MBL-C(这两者是识别脑膜炎奈瑟氏菌的凝集素-途径识别分子)的小鼠血清以及缺乏凝集素途径-相关丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-3的小鼠血清失去所有针对脑膜炎奈瑟氏菌的溶菌活性(图15)。最近的论文(Takahashi M.等人,  JEM 207: 29-37 (2010))和本文给出的工作(图39)证明MASP-1可以将D因子酶原形式转化为其酶促活性形式并且可以部分地解释通过这些血清中的酶促活性D因子的不存在而丧失细胞溶解活性。这未解释MBL-缺陷型小鼠中的杀菌活性的缺乏，因为这些小鼠具有正常酶促活性D因子(Banda等人, Mol Imunol 49(1-2):281-9 (2011))。值得注意的是，当测试来自稀有3MC常染色体隐性病症的患者(所述患者具有使MASP-3丝氨酸蛋白酶结构域功能失调的突变)的人血清(Rooryck C,等人, Nat Genet. 43(3):197-203)，未检测到针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌活性(注意：这些血清具有MASP-1和D因子，但没有MASP-3)。
人血清需要凝集素途径-介导的MASP-3-依赖性活性以发展杀菌活性的假说得到以下观察结果的进一步支持：MBL-缺陷型人血清也不能溶解脑膜炎奈瑟氏菌(图13-14)。MBL是结合到该病原体上的仅有的人凝集素-途径识别分子。因为MASP-3不是自我活化的，所以本发明人假设可以通过MASP-3经由MASP-1的有利活化解释MASP-2-缺乏的血清中细菌溶解活性更高，因为在MASP-2不存在时，结合到细菌表面上的所有凝集素-途径活化复合物都将装载有MASP-1或MASP-3。因为活化MASP-3在体外同时切割D因子(图39)和B因子，产生其各自的酶促活性形式(图37和Iwaki D.,等人, J. Immunol.187(7):3751-3758 (2011))，所以MASP-3最可能的功能是促进替代途径C3转化酶(即C3bBb)的形成。
尽管凝集素-依赖性作用的数据是引人注意的，但多个实验表明MASP-3和MASP-1在与凝集素分子的复合物中不一定具有功能。例如图35B所示的实验证明，在其中与凝集素的复合物不存在的条件下(即EGTA存在时) MASP-3活化替代途径的能力(正如C3b沉积在金黄色葡萄球菌所证明的)。图35A证明在这些条件下的沉积依赖于B因子、D因子和P因子，所有这些都是替代途径的关键成分。另外，MASP-3和MASP-1所致的D因子活化(图39)和MASP-3所致的B因子活化(图37)可以在体外在凝集素不存在时发生。最后，在人血清存在时的小鼠红细胞的溶血研究证明MBL和MASP-3两者对于细胞溶解的清楚作用。然而，MBL的缺陷不完全重现MASP-3缺陷的严重性，与如果所有功能性MASP-3都与MBL复合时所预计的相反。因此，本发明人不希望受到以下概念的限制：本文证明的MASP-3 (和MASP-1)的所有作用可以仅归因于与凝集素相关的功能。
对凝集素途径的2个效应物分支以及MASP-1、MASP-3和HTRA-1的可能的凝集素-非依赖性功能的鉴定，呈现有效治疗指定人类病理学的治疗干预的新机遇，所述病理学是在微生物病原体或改变的宿主细胞或代谢沉积物的存在下由过度补体活化所致。如本文所述，本发明人现在已经发现，在MASP-3不存在时和在MASP-1存在时，在表面结构上不活化替代途径(参见图17-18、35B、41-42、45-46)。因为替代途径在驱动导致细菌溶解以及细胞溶解的限速事件中是重要的(Mathieson PW,等人, J Exp Med 177(6):1827-3 (1993))，所以我们的结果证明活化MASP-3在补体的细胞溶解活性中起到重要作用。如图14-15、21-23、43-44和46-47所示，在缺乏MASP-3而非MASP-1的3MC患者血清中，补体的细胞溶解的末端活化级联是有缺陷的。图14和15所示的数据证明了在MASP-3和/或MASP-1/MASP-3功能活性不存在时损失溶菌活性。同样，在MASP-3-缺陷型人血清中的溶血活性的损失(图21-23、43-44和46-47)，以及通过加入重组MASP-3而重构溶血的能力(图46-47)，强烈支持以下结论：在靶表面上的替代途径的活化(其是驱动补体-介导的细胞溶解必不可少的)依赖于活化MASP-3的存在。根据以上详述的凝集素途径的新理解，靶表面的替代途径活化因此依赖于LEA-1和/或B因子和/或D因子的凝集素-非依赖性活化(其也由MASP-3介导)，并且因此，阻断MASP-3-依赖性补体活化的试剂将阻止靶表面上的替代途径活化。
MASP-3-依赖性启动对替代途径活化的必要作用的公开内容暗示了替代途径并非补体活化的独立的、单一途径，正如基本上对补体的所有现有医学教科书和近期综述文章所述。现有的和广泛持有的科学概念是，替代途径通过自发的“tick-over”C3活化的放大而在某些特定靶(微生物、酵母聚糖和兔红细胞)的表面上活化。然而，在MASP-1和MASP-3双重-缺陷型小鼠血清中和人3MC患者血清中在酵母聚糖-包被的板上和2种不同细菌(脑膜炎奈瑟氏菌和金黄色葡萄球菌)上的任何替代途径活化的不存在，和来自人和小鼠的MASP-3-缺乏的血清中红细胞溶血的减少，都表明在这些表面上的替代途径活化的启动需要功能性MASP-3。MASP-3的所需作用可以是凝集素-依赖性的或凝集素-非依赖性的，并且分别导致替代途径C3转化酶和C5转化酶复合物即C3bBb和C3bBb(C3b)n的形成。因此，本发明人在此公开了对于替代途径而言存在先前难以捉摸的启动途径。该启动途径依赖于(i) LEA-1，一种新发现的凝集素途径的活化分支，和/或(ii)蛋白质MASP-3、MASP-1和HTRA-1的凝集素-非依赖性作用。
III. MASP-2和MASP-3在阵发性夜间血红蛋白尿中的作用以及使用masp-2和MASP-3抑制剂的治疗方法
i. PNH的概述
阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，有时也称为Marchiafava-Micheli综合征，是一种获得性的、可能危及生命的血液病。PNH可以自发产生，称为“原发性PNH”或在其它骨髓病症例如再生障碍性贫血的情况下发生，称为“继发性PNH”。大部分病例都是原发性PNH。PNH的特征在于补体-诱导的红细胞破坏(溶血)、低的红细胞计数(贫血)、血栓形成和骨髓衰竭。PNH的实验室发现显示与血管内溶血性贫血相符的变化：在作为可能诱因的自身反应性RBC-结合抗体不存在时，低的血红蛋白、升高的乳酸脱氢酶、升高的网织红细胞计数(由骨髓释放的不成熟的红细胞以置换被破坏的细胞)、升高的胆红素(血红蛋白的降解产物)。
PNH的标志是由在循环RBC表面上的未经调节的末端补体成分的活化所致的慢性补体-介导的溶血，所述补体成分包括膜攻击复合物。PNH RBC因在它们表面上的补体调节剂CD55和CD59不存在，而经历不受控制的补体活化和溶血(Lindorfer, M.A.,等人, Blood 115(11):2283-91 (2010), Risitano,等人, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011))。CD55和CD59在正常RBC上大量表达并控制补体活化。CD55作为替代途径的阴性调节剂起作用，抑制替代途径C3转化酶(C3bBb)复合物的装配并加速预先形成的转化酶的衰退，因此阻断膜攻击复合物(MAC)的形成。CD59直接通过结合C5b678复合物并阻止C9的结合和聚合而抑制补体膜攻击复合物。
尽管溶血和贫血是PNH的主要临床特性，但该病是复杂的血液学病症，其进一步包括血栓形成和骨髓衰竭，作为临床发现的一部分(Risitano等人, MiniReviews in Med Chem11:528-535 (2011))。在分子水平上，PNH是由缺乏功能性PIG A基因的造血干细胞的异常克隆扩增所致。PIG A是编码糖基化-磷脂酰肌醇转移酶的伴X基因，所述酶是GPI-锚定的A类糖蛋白(包括CD55和CD59)的稳定的表面表达所需。为了目前尚在研究的原因，作为自发体细胞突变的结果的具有功能失调的PIG A基因的造血干细胞可以经过克隆扩增到它们的后代构成相当大部分的外周造血细胞池的那一点。尽管突变干细胞克隆的红细胞和淋巴细胞的后代缺乏CD55和CD59，但当它们进入循环后，仅有RBC经历明显的溶血。
PNH的目前治疗包括对付贫血的输血，对付血栓形成的抗凝，和使用单克隆抗体eculizumab (Soliris?)，其保护血细胞免于因抑制补体系统所致的免疫破坏(Hillmen P.等人, N. Engl. J. Med. 350(6):552-559 (2004))。eculizumab (Soliris?)是人源化单克隆抗体，其靶向补体成分C5，封闭其被C5转化酶切割，从而阻止C5a的产生和MAC的装配。用eculizumab治疗PNH患者，在大约半数患者中导致血管内溶血减少(经乳酸脱氢酶(LDH)测定)，导致血红蛋白稳定化和输血非依赖性(Risitano等人, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11(6) (2011))。尽管经历eculizumab治疗的几乎所有患者都达到正常或几乎正常的LDH水平(因为控制了血管内溶血)，但仅有大约三分之一的患者的血红蛋白值达到大约11gr/dL，其余接受eculizumab的患者以大约相同比例继续表现出中度至严重(即输血-依赖性的)贫血(Risitano A.M.等人, Blood 113:4094-100 (2009))。正如Risitano等人, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)所述，已经证明接受eculizumab的PNH患者含有与他们PNH红细胞结合的大量C3片段(而未经治疗的患者则没有)。该发现导致以下的认识：在Soliris治疗的PNH患者中，因为C5阻断所致的不再被溶血的PNH RBC，现在可以积累大量的膜-结合的C3片段，其作为调理素起作用，导致它们通过特异性C3受体而被网罗到网状内皮细胞中并且随后导致血管外溶血。因此，尽管阻止了血管内溶血和所得结果，但eculizumab治疗仅仅是将这些RBC的处置从血管内转移到血管外溶血，在许多患者中导致大量剩余的未经治疗的贫血(Risitano A.M.等人, Blood 113:4094-100 (2009))。因此，对于发生C3-片段-介导的血管外溶血的患者，需要除了使用eculizumab之外的治疗策略，因为他们继续需要输入红细胞。这样的C3片段靶向方法已经在实验系统中证明了用途(Lindorfer等人, Blood 115:2283-91, 2010)。
ii. 在PNH中的补体-启动机制
在PNH中的负面补体调节剂CD55和CD59的缺陷的表面表达之间的因果关系，以及eculizumab在预防血管内溶血中的有效性，清楚地定义了PNH为补体系统所介导的病况。尽管这一范例被广泛接受，但启动补体活化事件的性质，和所涉及的补体活化途径仍然有待解决。因为CD55和CD59负面地调节所有补体启动途径共有的补体级联中的末端放大步骤，所以这些分子的缺陷将会导致膜攻击复合物的过量形成和膜整合，无论补体活化是否被凝集素途径、被经典途径或被替代途径的自发更新所启动。因此，在PNH患者中，导致C3b沉积在RBC表面的任何补体活化事件都可以触发随后的放大和病理性溶血(血管内和/或血管外)和促成溶血危象。对于在PNH受试者中触发溶血危象的分子事件的明确机制的理解，仍然是难以捉摸的。因为在经历溶血危象的PNH患者中没有补体启动事件是明显的，因此主流的观点是PNH中的补体活化可因替代途径的低水平“tick-over”活化而自发发生，其随后通过因缺乏CD55和CD59所致的末端补体活化的不适当控制而被放大。
然而，重要的是注意到在其自然史中，PNH通常在某些事件例如感染或损伤后发生或恶化(Risitano, Biologics 2:205-222 (2008))，已经证明所述事件触发补体活化。这样的补体活化反应不依赖于宿主针对刺激病原体的先前的免疫力，并且因此可能不涉及到经典途径。而是，看起来这样的补体活化反应是由凝集素结合到在微生物作用物或受损宿主组织的表面上表达的外源或“自身改变的”碳水化合物模式而启动。因此，在PNH中促使溶血危象的事件与经由凝集素启动的补体活化是密切相关的。这使以下事实变为可能：凝集素活化途径提供启动的触发，其最终导致PNH患者中的溶血。
使用经由凝集素而活化补体的明确的病原体作为实验模型，以便在分子水平上分析活化级联，我们证明了根据刺激的微生物，补体活化可以被LEA-2或LEA-1启动，导致调理作用和/或细胞溶解。对于凝集素启动事件的双重反应(即调理作用和/或细胞溶解)的相同原理也可能适用于其它类型的感染物，或适用于在宿主组织损伤后的凝集素所致的补体活化，或可促成PNH的其它凝集素-驱动的补体活化事件。根据凝集素途径中的这种双重性，我们推断在PNH患者中，LEA-2-和/或LEA-1-启动的补体活化促进调理作用和/或通过C3b的RBC的溶解以及随后的血管外和血管内溶血。因此，在PNH的情况下，同时抑制LEA-1和LEA-2预计解决血管内和血管外溶血两者，提供了优于C5抑制剂eculizumab的明显优势。
已经确定，肺炎链球菌暴露优先触发LEA-2的凝集素-依赖性活化，其导致通过C3b的该微生物的调理作用。因为肺炎链球菌对MAC-介导的细胞溶解具有抗性，所以将其从循环中清除掉通过C3b的调理作用而发生。该调理作用和随后从循环中的清除是LEA-2-依赖性的，正如在MASP-2-缺陷型小鼠和在用MASP-2单克隆抗体(PLOS Pathog.,8: e1002793. (2012))治疗的小鼠中暴露的细菌对照所示。
在研究LEA-2在对微生物作用物的先天宿主反应中的作用时，我们测试了额外的病原体。当研究脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)作为模式生物时观察到极为不同的结果。脑膜炎奈瑟氏菌也经由凝集素活化补体，并且补体活化对于在首次用于实验的宿主中的脑膜炎奈瑟氏菌感染而言是必需的。然而，LEA-2在这种反应中没有起到宿主保护功能的作用：如图8和9所示，通过MASP-2的遗传消融的LEA-2阻断在脑膜炎奈瑟氏菌感染后不降低生存率。相反，在这些研究中，通过MASP-2消融的LEA-2阻断显著地提高了生存率(图8和9)以及疾病评分(图11)。通过给予MASP-2抗体所致的LEA-2阻断得到同样结果(图12)，在敲除-小鼠品系中消除了作为可能的原因的次级或补偿效应。在LEA-2-消融的动物中的这些有利结果与脑膜炎奈瑟氏菌从血液中更快速清除有关(图10)。另外，如本文所述，将脑膜炎奈瑟氏菌与正常人血清一起孵育杀伤脑膜炎奈瑟氏菌(图13)。加入阻断LEA-2的人MASP-2特异性的功能性单克隆抗体，但不给予同种型对照单克隆抗体，可以增强其杀伤反应。但是，该过程取决于凝集素和至少部分功能性补体系统，因为MBL-缺乏的人血清或热灭活的人血清不能杀伤脑膜炎奈瑟氏菌(图13)。总之，这些新发现表明在功能性补体系统存在时脑膜炎奈瑟氏菌感染受到补体活化的凝集素-依赖性的但LEA-2-非依赖性的途径的控制。
使用来自一个3MC患者的血清标本，测试了LEA-1可能是负责脑膜炎奈瑟氏菌的凝集素-依赖性杀伤的补体途径的假设。该患者是MASP-1/3基因的外显子12中的无义突变的纯合体。结果，该患者缺乏功能性MASP-3蛋白，但其它补体足够(外显子12对MASP-3转录本是特异性的；该突变对MASP-1功能或表达水平无作用) (参见Nat Genet 43(3):197-203 (2011))。正常人血清有效杀伤脑膜炎奈瑟氏菌，但缺乏MBL (凝集素途径的一种识别分子)的热灭活血清和MASP-3-缺乏的血清不能杀伤脑膜炎奈瑟氏菌(图14)。因此，LEA-1看来介导脑膜炎奈瑟氏菌杀伤。使用来自敲除小鼠品系的血清样品而证实了该发现。尽管含有补体的正常小鼠血清容易杀伤脑膜炎奈瑟氏菌，但MBL-缺陷型或MASP-1/3-缺陷型小鼠血清与缺乏功能性补体的热灭活的血清一样无效(图15)。相反，MASP-2-缺乏的血清表现出对脑膜炎奈瑟氏菌的有效杀伤。
这些发现通过揭示凝集素-依赖性补体活化的单独的LEA-2和LEA-1途径的存在，提供了凝集素途径中迄今未知的双重性的证据。在以上详述的实例中，LEA-2和LEA-1是非-冗余的并介导不同的功能性结果。数据表明某些类型的凝集素途径活化剂(包括但不限于肺炎链球菌)经由LEA-2而优先启动补体活化，导致调理作用，而其它(以脑膜炎奈瑟氏菌为例)经由LEA-1而优先启动补体活化并促进细胞溶解过程。然而，数据不一定将LEA-2限制在调理作用和将LEA-1限制在细胞溶解过程，因为在其它情况下这两个途径可以介导调理作用和/或细胞溶解。
在脑膜炎奈瑟氏菌所致的凝集素-依赖性补体活化的情况下，LEA-2和LEA-1分支看来彼此竞争，因为LEA-2的阻断在体外增强了LEA-1-依赖性的生物体的细胞溶解破坏(图15)。如以上详述的，该发现可以解释如下：在MASP-2不存在时，凝集素MASP-1复合物靠近凝集素MASP-3复合物滞留的可能性增加，这将增强LEA-1活化和因此促进脑膜炎奈瑟氏菌的更有效的细胞溶解。因为脑膜炎奈瑟氏菌的细胞溶解在首次进行实验的宿主中是主要的保护机制，所以LEA-2的阻断在体内增加了脑膜炎奈瑟氏菌的清除并导致增加的杀伤。
尽管上述实例说明了LEA-2和LEA-1对于脑膜炎奈瑟氏菌感染后的结果的相反作用，但也可能存在其它情况，其中LEA-2和LEA-1两者可协同产生某种结果。如下详述，在经由凝集素(例如在PNH中存在的那些)的病理性补体活化的其它情况下，LEA-2-和LEA-1-驱动的补体活化可以以协同方式合作促进PNH的总体病理学。另外，如本文所述，MASP-3也促进B因子和D因子的凝集素-非依赖性转化，其可在Ca++不存在时发生，通常导致C3bB转化为C3bBb和前D因子转化为D因子，其可进一步促进PNH病理学。
iii. PNH中的生物学和预期的功能活性
本部分描述了在PNH体外模型中LEA-2和LEA-1阻断对于溶血的抑制作用。所得发现支持使用LEA-2-阻断剂(包括但不限于，与MASP-2结合并阻断其功能的抗体)和LEA-1-阻断剂(包括但不限于，与MASP-3结合并阻断MASP-3的MASP-1-介导的活化的功能、阻断MASP-3的功能或同时阻断这两者的抗体)，以治疗患有PNH的一个或多个方面的受试者，并且还使用LEA-2和/或LEA-1的抑制剂、和/或MASP-3-依赖性的、凝集素-非依赖性补体活化的抑制剂(包括MASP-2抑制剂、MASP-3抑制剂和双重-或双特异性MASP-2/MASP-3或MASP-1/MASP-2抑制剂、和泛特异性MASP-1/MASP-2/MASP-3抑制剂)，以便在经历C5-抑制剂例如eculizumab治疗的PNH患者中改善C3-片段-介导的血管外溶血的作用。
iv. MASP-2抑制剂通过网状内皮系统阻断调理作用和PNH RBC的血管外溶血
如上详述，PNH患者因为RBC从循环中清除的以下两种不同的机制而贫血：经由膜攻击复合物(MAC)的活化所致的血管内溶血，以及在C3b的调理作用和通过网状内皮系统的补体受体结合和摄取后的后续清除后的血管外溶血。当用eculizumab治疗患者时，极大地阻止了血管内溶血。因为eculizumab阻断末端溶解效应物机制(其发生在补体-启动的活化事件以及随后的调理作用的下游)，因此eculizumab不阻断血管外溶血(Risitano A.M.等人, Blood 113:4094-100 (2009))。而是，在未经治疗的PNH受试者中将经历溶血的RBC在其表面上现在可以积累活化的C3b蛋白，其加大了网状内皮系统的摄取和加大了它们的血管外溶血。因此，eculizumab治疗有效地将RBC的处置从血管内溶血转移到可能的血管外溶血。结果，某些eculizumab-治疗的PNH患者仍然贫血。因此，阻断补体活化上游和阻止PNH RBC的调理作用的试剂可特别适合阻断用eculizumab偶然可见的血管外溶血。
本文给出的微生物数据表明LEA-2通常是凝集素-依赖性调理作用的主要途径。此外，当在3种原型凝集素活化表面(甘露聚糖，图19A；酵母聚糖，图19B，和肺炎链球菌；图19C)上评价凝集素-依赖性调理作用(测量为C3b沉积)时，LEA-2看来在生理条件(即在Ca++存在时，其中所有补体途径是有效的)下是凝集素-依赖性调理作用的主要途径。在这些实验条件下，与WT血清相比，MASP-2-缺乏的血清(其缺乏LEA-2)在调理测试表面中实质上效果更差。MASP-1/3-缺陷型血清(其缺乏LEA-1)也是缺损的，尽管与缺乏LEA-2的血清相比，该效果更不明显得多。LEA-2和LEA-1对凝集素-驱动的调理作用的贡献的相对量在图20A–20C中有进一步显示。尽管已经报道了在凝集素途径或经典途径不存在时，补体的替代途径支持凝集素活化表面的调理作用(Selander等人, J Clin Invest 116(5):1425-1434 (2006))，但在隔离中(在无Ca++的测定条件下测定)的替代途径看来比本文所述的LEA-2-和LEA-1-启动的过程实质上更加无效。通过外推，这些数据表明PNH RBC的调理作用也可被LEA-2优先启动，和在较小程度上被LEA-1 (可能被替代途径扩增环扩大)启动，而不是凝集素-非依赖性替代途径活化的结果。因此，可以预计LEA-2抑制剂在限制调理作用和预防PNH的血管外溶血中最有效。然而，认识到以下事实：凝集素而非MBL (例如纤维胶凝蛋白)结合到非-碳水化合物结构(例如乙酰化蛋白)上，并且MASP-3优先与H-纤维胶凝蛋白缔合(Skjoedt等人, Immunobiol. 215:921-931, 2010)，也使LEA-1在PNH-相关RBC调理作用中的重要作用的可能性悬而未决。因此，预计LEA-1抑制剂具有额外的抗调理作用，而且预计LEA-1和LEA-2抑制剂的组合是最佳的并在PNH患者中在限制调理作用和血管外溶血中介导最有力的治疗益处。这一概念进一步得到图28中所示的调理作用数据的支持：与WT血清相比，D因子-缺陷型小鼠血清(其在液相中缺乏活化替代途径的能力，但具有功能性经典途径以及功能性LEA-1和LEA-2途径)显示了在调理作用中无缺陷。B因子-缺乏的血清(其缺乏LEA-1)显示了减少的调理作用，而用MASP-2单克隆抗体治疗以阻断LEA-2-介导的补体活化的D因子-缺乏的血清却得到对调理作用的更有力的抑制(图28)。重要的是，将MASP-2单克隆抗体加入到B因子-缺乏的血清抑制调理作用比单用MASP-2阻断或D因子阻断更有效。因此，LEA-2和LEA-1叠加或协同作用，以促进调理作用，并且预计交叉反应性或双特异性LEA-1/LEA-2抑制剂在PNH中在阻断调理作用和血管外溶血中最有效。
v. MASP-3抑制剂在PNH中的作用
使用PNH的体外模型，我们证明了在PNH中的补体活化和所得溶血的确是由LEA-2和/或LEA-1活化而启动，并且它不是替代途径的非依赖性功能。这些研究使用不同小鼠品系的甘露聚糖-敏化的RBC，包括来自Crry-缺陷型小鼠(小鼠的末端补体途径的一种重要的负面调节剂)的RBC，以及来自CD55/CD59-缺陷型小鼠(其缺乏在PNH患者中不存在的所述补体调节剂)的RBC。当将甘露聚糖-敏化的Crry-缺陷型RBC暴露给补体-足够的人血清时，在血清浓度3%时，RBC有效溶血(图21和22)，而补体-缺乏的血清(HI：热灭活的)却不溶血。值得注意的是，补体-足够的血清(其中通过加入MASP-2抗体而阻断LEA-2)具有降低的溶血活性，并且为了有效溶血，需要6%血清。当测试CD55/CD59-缺陷型RBC时得到类似的观察结果(图24)。补充了MASP-2单克隆抗体的补体-足够的人血清(即其中LEA-2被抑制的血清)在支持溶血方面比未经处理的血清而言有效性大约低2倍。此外，与未经处理的血清相比，需要更高浓度的LEA-2-阻断血清(即经抗MASP-2单克隆抗体处理的)以促进未经处理的WT RBC的有效溶血(图23)。
甚至更令人吃惊的是，来自功能失调的MASP-3蛋白为纯合子的3MC患者的血清(并因此缺乏LEA-1)完全不能使甘露聚糖-敏化的Crry-缺陷型RBC溶血(图22和图23)。当使用未敏化的正常RBC时观察到类似结果：如图23所示，分离自3MC患者的LEA-1-缺乏的血清在介导溶血中完全无效。总之，这些数据表明尽管LEA-2明显地促进血管内溶血反应，但LEA-1是导致溶血的主要的补体-启动途径。因此，尽管预计LEA-2阻断剂在PNH患者中显著地降低RBC的血管内溶血，但预计LEA-1阻断剂具有更深远的作用并且大量消除补体-驱动的溶血。
应当注意，当在常规替代途径测定条件下测试时，在该研究中使用的LEA-1-缺陷型3MC患者的血清具有减少了的但有功能的替代途径(图17)。这一发现表明与替代途径活性相比，LEA-1在溶血上具有较大贡献，正如在PNH的该实验环境中常规定义的那样。经过推断，这表明LEA-1-阻断剂与替代途径的其它方面的阻断剂在预防或治疗PNH患者的血管内溶血中至少一样有效。
vi. MASP-2抑制剂在PNH中的作用
本文给出的数据表明PNH中的贫血的以下发病机制：因末端补体成分的未经调节的活化和MAC形成所致的RBC溶血所致的血管内溶血，其主要是由(但并非唯一) LEA-1来启动；以及因通过C3b的RBC的调理作用所致的血管外溶血，其看来是主要由LEA-2来启动。尽管LEA-2在启动补体活化和促进MAC形成和溶血中的可识别的作用是显而易见的，但该过程看来比LEA-1-启动的补体活化而导致溶血的效果明显更差。因此，预计LEA-2-阻断剂在PNH患者中显著地降低血管内溶血，尽管预计该治疗活性仅仅是部分的。通过比较，对于LEA-1-阻断剂而言，预计在PNH患者中的血管内溶血更显著降低。
血管外溶血(尽管不显著，但仍然是导致PNH中的贫血的RBC破坏的同样重要的机制)，主要是C3b的调理作用的结果，其看来主要是由LEA-2介导。因此，可预计LEA-2-阻断剂优先阻断在PNH中的RBC调理作用和随后的血管外溶血。预计LEA-2-阻断剂的这一独特治疗活性对于所有PNH患者提供重要的治疗益处，因为目前并无对经历这种病理过程的PNH患者的治疗方法。
vii. LEA-2抑制剂作为LEA-1抑制剂或末端补体阻断剂的辅助治疗
本文给出的数据详述了RBC清除和PNH中的贫血的两种发病机制，可以通过不同类型的治疗药分别或联合靶向这两种机制：主要是由(但并非唯一) LEA-1启动并因此预计通过LEA-1-阻断剂可有效预防的血管内溶血；以及主要由LEA-2驱动的C3b调理作用所致，并因此通过LEA-2-阻断剂有效预防的血管外溶血。
有文件充分表明血管内和血管外溶血机制两者在PNH患者中导致贫血(Risitano等人, Blood 113:4094-4100 (2009))。因此，预计预防血管内溶血的LEA-1-阻断剂和主要预防血管外溶血的LEA-2阻断剂的联用，比单用任一所述试剂更有效预防PNH患者中发生的贫血。事实上，预计LEA-1-和LEA-2-阻断剂的联用预防在PNH中的补体启动的所有相关机制并因此阻断PNH中的所有贫血症状。
还已知道C5-阻断剂(例如eculizumab)有效阻断血管内溶血，但不干扰调理作用。这留下了一些经抗C5-治疗的PNH患者，其患有因LEA-2介导的未被治疗的血管外溶血所致的大量残余的贫血。因此，预计预防血管内溶血的C5-阻断剂(例如eculizumab)与降低血管外溶血的LEA-2阻断剂的联用，比单用任一所述试剂更有效预防PNH患者中发生的贫血。
阻断补体系统的末端扩增环而导致C5活化和MAC沉积的其它试剂(包括但不限于阻断备解素、B因子或D因子或者增强I因子、H因子或其它补体抑制性因子的抑制活性的试剂)预计也抑制血管内溶血。然而，这些试剂在PNH患者中预计不干扰LEA-2-介导的调理作用。这留下了一些经所述试剂治疗的PNH患者，其患有因LEA-2介导的仍未被治疗的血管外溶血所致的大量残余的贫血。因此，预计用预防血管内溶血的所述试剂的治疗与使血管外溶血最小化的LEA-2阻断剂的联用，比单用任一所述试剂更有效预防PNH患者中发生的贫血。事实上，预计所述试剂和LEA-2-阻断剂的联用预防在PNH中的RBC破坏的所有相关机制并因此阻断PNH中的所有贫血症状。
viii. 使用LEA-1和LEA-2的多种双特异性或泛特异性抗体以治疗PNH
如上详述，预计分别阻断LEA-1和LEA-2并因此联合阻断介导血管内以及血管外溶血的所有补体活化事件的药物试剂的组合使用，为PNH患者提供了最佳临床结果。通过例如共同给予具有LEA-1-阻断活性的抗体以及具有LEA-2-阻断活性的抗体，可以达到这一结果。在某些实施方案中，将LEA-1-和LEA-2-阻断活性合并到一个分子实体中，并且具有合并的LEA-1-和LEA-2-阻断活性的这类实体将有效阻断血管内以及血管外溶血并在PNH中预防贫血。这类实体可包含这样的双特异性抗体或由这样的双特异性抗体组成：其中一个抗原-结合位点特异性地识别MASP-1和阻断LEA-1和减少LEA-2，而第二抗原-结合位点特异性地识别MASP-2和进一步阻断LEA-2。或者，这类实体可以由这样的双特异性单克隆抗体组成：其中一个抗原-结合位点特异性地识别MASP-3和因此阻断LEA-1，第二抗原-结合位点特异性地识别MASP-2和阻断LEA-2。这类实体可以最好由这样的双特异性单克隆抗体组成：其中一个抗原-结合位点特异性地识别MASP-1和MASP-3两者和因此阻断LEA-1和减少LEA-2，而第二抗原-结合位点特异性地识别MASP-2和进一步阻断LEA-2。根据总蛋白序列和结构中的相似性，还可预计可以开发具有两个相同结合位点的常规抗体，其以功能性方式特异性地结合到MASP-1和MASP-2和MASP-3上，因此达到功能性阻断LEA-1和LEA-2。预计这种具有泛-MASP抑制活性的抗体同时阻断血管内以及血管外溶血和因此在PNH患者中有效治疗贫血。
IV. MASP抑制剂
随着对补体的凝集素途径是由两个主要的补体活化分支(LEA-1和LEA-2)组成以及还存在凝集素-非依赖性补体活化分支的认识，逐渐认识到高度需要特异性地抑制导致PNH相关病理学的这些效应物分支的一个或多个，而不完全关闭补体的免疫防御能力(即留下完整的经典途径)。这将留下完整的C1q-依赖性补体活化系统，以进行免疫复合物的加工和有助于针对感染的宿主防御。
i. 抑制LEA-1-介导的补体活化的组合物
如本文所述，本发明人已经意外地发现导致细胞溶解的LEA-1的活化是MASP-3-依赖性的。正如本文进一步所述，在生理条件下，MASP-3-依赖性LEA-1活化还促进调理作用，从而提供具有LEA-2-介导的补体活化的附加效应。正如实施例7所示，在Ca++存在时，不需要D因子，因为MASP-3在D因子-/-血清中可以驱动LEA-1活化。MASP-3、MASP-1和HTRA-1能够将前D因子转化为活性D因子。同样，MASP-3活化在许多情况下看来依赖于MASP-1，因为MASP-3 (与MASP-1和MASP-2相反)不是自我活化酶并且在没有MASP-1的帮助下不能转化为其活性形式(Zundel, S.等人, J.Immunol. 172: 4342-4350 (2004)；Megyeri等人, J. Biol. Chem. 288:8922–8934 (2013)。因为MASP-3不是自我活化的，并且在许多情况下需要MASP-1活性以转化为其酶促活性形式，所以替代途径C3转化酶C3Bb的MASP-3-介导的活化可以通过靶向MASP-3酶原或已被活化的MASP-3而被抑制，或通过靶向MASP-3的MASP-1-介导的活化而被抑制，或通过以上两者而被抑制，因为在许多情况下，在MASP-1功能活性不存在时，MASP-3保持其酶原形式，不能通过直接形成替代途径C3转化酶(C3bBb)而驱动LEA-1。
因此，在本发明的一方面，在特异性地抑制LEA-1的治疗药的开发中作为目标的优选蛋白成分是MASP-3的抑制剂(包括MASP-1-介导的MASP-3活化的抑制剂(例如抑制MASP-3活化的MASP-1抑制剂))。
依据前述，一方面，本发明提供在患有PNH或处于发展PNH的风险中的受试者中抑制LEA-1的不良反应(即溶血和调理作用)的方法，包括给予所述受试者药物组合物，所述药物组合物包含有效抑制MASP-3-依赖性补体活化的一定量的MASP-3抑制剂和药学上可接受的载体。
在患有PNH或处于发展PNH的风险中的活的受试者中以有效抑制MASP-3-依赖性补体活化的量给予MASP-3抑制剂。在本发明该方面的实践中，代表性的MASP-3抑制剂包括：抑制MASP-3生物活性的分子，包括抑制以下至少一项或多项的分子：B因子的凝集素MASP-3-依赖性活化，前D因子的凝集素MASP-3-依赖性活化，B因子的MASP-3-依赖性的、凝集素-非依赖性活化，和前D因子的MASP-3-依赖性的、凝集素-非依赖性活化(例如小分子抑制剂、MASP-3抗体及其片段或与MASP-3相互作用或干扰蛋白-蛋白相互作用的阻断肽)；和降低MASP-3表达的分子(例如MASP-3反义核酸分子、MASP-3特异性RNAi分子和MASP-3核酶)。MASP-3抑制剂可以有效地阻断MASP-3蛋白与蛋白的相互作用，干扰MASP-3二聚化或装配，阻断Ca++结合，干扰MASP-3丝氨酸蛋白酶活性位点，或降低MASP-3蛋白表达，从而阻止MASP-3免于活化LEA-1-介导的补体活化或凝集素-非依赖性的补体活化。MASP-3抑制剂可以单独用作主要治疗，或作为辅助治疗与其它治疗药联用以增强其它药物治疗的治疗益处，如本文进一步所述。
在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分上，其结合亲和性比补体系统中的其它成分高至少10倍。在另一个实施方案中，MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分上，其结合亲和性比补体系统中的其它成分高至少100倍。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)上和抑制MASP-3-依赖性补体活化，前提条件是所述抑制剂不结合MASP-1 (SEQ ID NO:10)的丝氨酸蛋白酶结构域，并且它不结合MASP-2 (SEQ ID NO:5)的丝氨酸蛋白酶结构域。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂是MASP-3单克隆抗体或其片段，其特异性地结合到MASP-3上。
在另一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分上，其结合亲和性比补体系统中的其它成分高至少10倍，并抑制MASP-3的MASP-1-介导的活化。在另一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分上，其结合亲和性比补体系统的其它成分(即多肽或其片段)高至少100倍，并抑制MASP-3的MASP-1-介导的活化。在某些实施方案中，所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)上和抑制MASP-3的MASP-1-介导的活化，前提条件是所述抑制剂不结合MASP-2 (SEQ ID NO:5)的丝氨酸蛋白酶结构域，并且它不结合MASP-3 (SEQ ID NO:8)的丝氨酸蛋白酶结构域。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂是MASP-1单克隆抗体或其片段，其特异性地结合到MASP-1上和抑制MASP-3的MASP-1-介导的活化。在某些实施方案中，结合到MASP-1上的所述MASP-3抑制剂抑制MASP-3的MASP-1-介导的活化和进一步抑制MASP-1-介导的D因子成熟。
在另一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂结合到MASP-3 (SEQ ID ON:8)的一部分上并且还结合到MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分上，前提条件是所述抑制剂不结合MASP-2 (SEQ ID NO:5)或MAp19 (SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂结合到MASP-3 (SEQ ID ON:8)的一部分上并且还结合到MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分上，前提条件是所述抑制剂不结合MASP-2 (SEQ ID NO:5)或MAp19 (SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂结合到MASP-3 (SEQ ID ON:8)的一部分上并且还结合到MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分上，前提条件是所述抑制剂不结合MASP-2 (SEQ ID NO:5)、MAp19 (SEQ ID NO:3)或MAp44 (SEQ ID NO:11)，从而因缺乏与MAp44的结合而允许较低有效剂量以抑制MASP-3-依赖性补体活化，该MAp44在人血清中以高浓度存在。
在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂是MASP-1/MASP-3双重抑制剂，其结合到在MASP-1和MASP-3之间保守的氨基酸区内的表位上，所述区例如CUBI-CCP2结构域(SEQ ID NO:10的aa 25-432)，如图3-5所示。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂是MASP-1/MASP-3双重抑制剂，其结合到在MASP-1和MASP-3之间保守的氨基酸区内的表位上，前提条件是所述抑制剂不结合MAp44，例如CCP结构域(SEQ ID NO:10的aa 367-432)。在另一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂是双特异性抑制剂，例如双特异性单克隆抗体，其特异性地结合到MASP-3蛋白(SEQ ID NO:8)上的表位和MASP-1蛋白(SEQ ID NO:10)上的表位。在某些实施方案中，所述MASP-3抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)并且还结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)。
所述MASP-3抑制剂的结合亲和性可以使用合适的结合测定法来检测。
对MASP-3-依赖性补体活化的抑制的特征在于作为按照本发明方法给予MASP-3抑制剂的结果而发生的补体系统的成分的以下变化中的至少一项：LEA-1-介导的补体活化的抑制(溶血和/或调理作用的抑制)；B因子的凝集素-非依赖性转化的抑制；D因子的凝集素-非依赖性转化的抑制；MASP-3丝氨酸蛋白酶底物-特异性切割的抑制；溶血的减少(例如如实施例5中所述而测定)；或C3切割和C3b沉积的减少(例如如实施例4和实施例11中所述而测定)。
在某些实施方案中，所述MASP-3抑制剂选择性地抑制MASP-3-依赖性补体活化(即LEA-1-介导的补体活化和/或B因子的凝集素-非依赖性转化和/或D因子的凝集素-非依赖性转化)，而留下功能完整的C1q-依赖性补体活化系统。
在某些实施方案中，所述MASP-3抑制剂是抗体或其片段，包括MASP-3抗体和其MASP-3结合片段、MASP-1抗体及其片段、天然的和合成的肽、或小分子。在某些实施方案中，所述MASP-3抑制剂是小分子蛋白酶抑制剂，其对于MASP-1是选择性的，或对于MASP-3是选择性的，或对于MASP-1和MASP-3是选择性的。
ii. 抑制LEA-2活化的组合物
如本文所述，LEA-2-介导的补体活化是MASP-2-依赖性的，导致调理作用和/或细胞溶解。因此，在特异性地抑制LEA-2凝集素-依赖性补体系统的治疗药的开发中作为目标的优选蛋白成分是MASP-2。若干蛋白质已证明通过蛋白与蛋白相互作用而结合到或干扰MASP-2。例如，MASP-2已知结合到凝集素蛋白质MBL、H-纤维胶凝蛋白和L-纤维胶凝蛋白和胶原凝集素-11上，并与之形成钙-依赖性复合物。Ma Y.,等人, J Innate Immun. Epub  Dec 4 (2012)。每种MASP-2/凝集素复合物都已证明通过蛋白质C4和C2的MASP-2-依赖性切割而活化补体(Ikeda, K.,等人, J. Biol. Chem. 262:7451-7454, (1987)；Matsushita, M.,等人, J. Exp. Med.176:1497-2284, (2000)；Matsushita, M.,等人, J.Immunol. 168:3502-3506, (2002))。研究已经表明MASP-2的CUB1-EGF结构域对于MASP-2与MBL缔合是必不可少的(Thielens, N.M.,等人, J.Immunol. 166:5068, (2001))。还已证明CUB1EGFCUBII结构域介导MASP-2的二聚化，这是形成活性MBL复合物所必需的(Wallis, R.,等人, J. Biol. Chem.275:30962-30969, 2000)。因此，可以鉴定MASP-2抑制剂，其结合到或干扰已知对MASP-2-依赖性补体活化具有重要性的MASP-2靶区。
依据前述，一方面，本发明提供在患有PNH或处于发展PNH的风险中的受试者中抑制LEA-2-介导的补体活化的不良反应的方法，包括给予所述受试者药物组合物，所述药物组合物包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的一定量的MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体。
在患有PNH或处于发展PNH的风险中的活的受试者中以有效抑制MASP-2-依赖性LEA-2的量给予MASP-2抑制剂。在本发明该方面的实践中，代表性的MASP-2抑制剂包括：抑制MASP-2生物活性的分子(例如小分子抑制剂、MASP-2抗体、或与MASP-2相互作用或干扰蛋白-蛋白相互作用的阻断肽)和降低MASP-2表达的分子(例如MASP-2反义核酸分子、MASP-2特异性RNAi分子和MASP-2核酶)，从而阻止MASP-2以免活化LEA-2。
MASP-2抑制剂可以有效地阻断MASP-2蛋白与蛋白相互作用，干扰MASP-2二聚化或装配，阻断Ca++结合，干扰MASP-2丝氨酸蛋白酶活性位点，或可以降低MASP-2蛋白表达，从而阻止MASP-2以免活化LEA-2。MASP-2抑制剂可以单独用作主要治疗，或作为辅助治疗与其它治疗药联用以增强其它药物治疗的治疗益处，如本文进一步所述。
在一个实施方案中，所述MASP-2抑制剂特异性地结合到MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分上，其结合亲和性比补体系统的其它抗原高至少10倍。在另一个实施方案中，所述MASP-2抑制剂特异性地结合到MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分上，其结合亲和性比补体系统的其它抗原高至少100倍。在一个实施方案中，所述MASP-2抑制剂特异性地结合到以下的至少一个上：(i) CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa 300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)，并抑制MASP-2-依赖性补体活化，前提条件是所述抑制剂不结合MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10)，并且它不结合MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，所述MASP-2抑制剂是MASP-2单克隆抗体或其片段，其特异性地结合到MASP-2上。
所述MASP-2抑制剂的结合亲和性可以使用合适的结合测定法来检测。
对MASP-2-依赖性补体活化的抑制特征在于作为按照本发明方法给予MASP-2抑制剂的结果而发生的补体系统的成分的以下变化中的至少一项：抑制MASP-2-依赖性补体-活化-系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)的产生或生产(例如如美国专利号7,919,094的实施例2中所述而测定)，减少C4切割和C4b沉积(例如如实施例8或实施例9中所述而测定)，或减少C3切割和C3b沉积(例如如实施例11中所述而测定)。
在某些实施方案中，所述MASP-2抑制剂选择性地抑制MASP-2补体活化(即LEA-2)，而留下功能完整的C1q-依赖性补体活化系统。
在某些实施方案中，所述MASP-2抑制剂是抗体或其片段，包括MASP-2抗体和其MASP-2结合片段、天然的和合成的肽、或小分子。在某些实施方案中，所述MASP-2抑制剂是小分子蛋白酶抑制剂，其对于MASP-2是选择性的。
iii. 抑制LEA-1-介导的补体活化和LEA-2-介导的补体活化的组合物
另一方面，本发明提供在患有PNH的一个或多个方面或处于发展PNH的风险中的受试者中抑制LEA-1的不良作用和抑制LEA-2的不良作用的方法。
在一个实施方案中，本发明的该方面涉及在患有PNH的受试者中增加红细胞存活的方法，包括给予所述受试者组合物，所述组合物包含有效增加红细胞存活的一定量的MASP-1抑制剂和/或MASP-3抑制剂中的至少一种。
在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-1抑制剂。在一个实施方案中，所述MASP-1抑制剂抑制MASP-3-介导的补体活化并且还抑制MASP-2-介导的补体活化。
在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-3抑制剂。在一个实施方案中，所述MASP-3抑制剂抑制以下至少一个：B因子的凝集素MASP-3-依赖性活化；D因子的凝集素MASP-3-依赖性活化；B因子的MASP-3-依赖性的、凝集素-非依赖性活化；和/或D因子的MASP-3-依赖性的、凝集素-非依赖性的活化。
在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-1抑制剂和MASP-3抑制剂。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括给予所述受试者组合物，所述组合物包含MASP-2抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明的该方面包括给予患有PNH的受试者药物组合物，所述药物组合物包含有效抑制MASP-2-依赖性补体活化的一定量的MASP-2抑制剂和有效抑制MASP-3-依赖性补体活化的一定量的MASP-3抑制剂和药学上可接受的载体。
在某些实施方案中，所述组合物包含抑制LEA-1和LEA-2两者的单一试剂(即双重MASP-2/MASP-3抑制剂、双重MASP-1/MASP-2抑制剂、双特异性MASP-2/MASP-3抑制剂、双特异性MASP-1/MASP-2抑制剂、或泛-MASP-1/2/3抑制剂或三特异性MASP-1/2/3抑制剂)。在某些实施方案中，所述组合物包含LEA-1和LEA-2抑制剂的组合，例如，双重抑制剂加单一抑制剂的组合，双特异性抑制剂加单一抑制剂的组合，或本文所述的MASP-1、MASP-2和/或MASP-3抑制剂的任意组合，其组合抑制LEA-1和LEA-2两者，如本文进一步描述。
在一个实施方案中，本发明提供抑制LEA-1和LEA-2两者的药物组合物，其包含至少一种MASP-3抑制剂和至少一种MASP-2抑制剂和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述药物组合物包含第一分子和第二分子的组合，所述第一分子是MASP-3抑制剂，所述第二分子是MASP-2抑制剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含单一分子实体，其包括作为MASP-3抑制剂的活性和作为MASP-2抑制剂的活性(即抑制MASP-2-介导的LEA-2活化和MASP-3-介导的LEA-1活化两者的抑制剂)。在一个实施方案中，所述抑制剂是MASP-2/MASP-3双重抑制剂，其结合到在MASP-2 (SEQ ID NO:5)和MASP-3 (SEQ ID NO:8)之间保守的氨基酸区内的表位上，所述区例如丝氨酸蛋白酶结构域，例如β链的N-末端区(例如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的β链的N-末端区的前150 aa)，如图4、6和7C所示。在一个实施方案中，所述抑制剂是双特异性抑制剂，例如双特异性单克隆抗体，其特异性地结合到MASP-2蛋白(SEQ ID NO:5)上的表位和MASP-3蛋白(SEQ ID NO:8)上的表位上。在某些实施方案中，所述抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-2的CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa 300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)的至少一个上并且还结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶(SEQ ID NO:8的aa 450-711)中的表位上。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制LEA-1和LEA-2两者的组合物，其包含抑制MASP-2-介导的LEA-2活化和MASP-3的MASP-1-介导的活化从而抑制MASP-3-介导的LEA-1活化两者的抑制剂(和任选地还抑制MASP-1-介导的D因子成熟)。在一个实施方案中，所述抑制剂是MASP-1/MASP-2双重抑制剂，其结合到在MASP-1 (SEQ ID NO:10)和MASP-2 (SEQ ID NO:5)之间保守的氨基酸区内的表位上，所述区例如丝氨酸蛋白酶结构域，如图4、6和7A所示。在一个实施方案中，所述抑制剂是双特异性抑制剂，例如双特异性单克隆抗体，其特异性地结合到MASP-1蛋白(SEQ ID NO:10)的表位上和MASP-2蛋白(SEQ ID NO:5)的表位上。在某些实施方案中，所述抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)并且还结合到MASP-2的CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa 300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)的至少一个上。
在另一个实施方案中，本发明提供抑制LEA-1和LEA-2两者的组合物，其包含抑制MASP-2-介导的LEA-2活化、通过直接结合到MASP-3上而抑制MASP-3-介导的LEA-1活化、并且还抑制MASP-3的MASP-1-介导的活化从而抑制MASP-3-介导的LEA-1活化的抑制剂(和任选地还抑制MASP-1-介导的D因子成熟)。在一个实施方案中，所述抑制剂是泛-MASP抑制剂，其结合到在MASP-1 (SEQ ID NO:10)、MASP-2 (SEQ ID NO:5)和MASP-3 (SEQ ID NO:8)之间保守的氨基酸区，例如在CUBI-EGF-CUB2结构域中的保守区，如图4和5所示。如图4和5所示，在CUBI-EGF-CUBII结构域中存在MASP-1、MASP-2和MASP-3之间共有的多个同一性补位，从而允许产生泛特异性MASP抗体。在某些实施方案中，所述泛特异性MASP抗体可以结合到MASP-1的CUB2结构域(SEQ ID NO:10的aa 185-296)、MASP-2的CUB2结构域(SEQ ID NO:5的aa 184-295)和MASP-3的CUB2结构域(SEQ ID NO:8的aa 185-296)内的表位上。要注意的是，结合到MASP-1、MASP-2和MASP-3的CUBI-EGF上的泛特异性MASP抑制剂还会结合到MAp19和MAp44上，因此这类抑制剂的有效治疗剂量将被调节到更高水平以补偿这类结合。还要注意的是，结合到MASP-1、MASP-2和MASP-3的CUBII结构域上的泛特异性MASP抑制剂也会结合到MAp44上，因此这类抑制剂的有效治疗剂量将被调节到更高水平以补偿这类结合。
在一个实施方案中，所述抑制剂是三特异性MASP-1/2/3抑制剂，其结合到MASP-1蛋白(SEQ ID NO:10)上的表位上、MASP-2蛋白(SEQ ID NO:5)上的表位上和MASP-3蛋白(SEQ ID NO:8)上的表位上。在某些实施方案中，所述抑制剂是三特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)上，结合到MASP-2的CCP1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa 300-431)或MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)中的至少一个上，并且还结合到MASP-3丝氨酸蛋白酶(SEQ ID NO:8的aa 450-711)中的表位上。
抑制LEA-1、LEA-2或LEA-1和LEA-2的示例性的抑制剂描述于下表2。
表2: MASP抑制剂
*对于表2中给出的交叉反应性一栏，指定的MASP抑制剂结合到抑制剂结合结构域上，其结合亲和性比列为“不”结合的其它补体成分(即多肽或其片段)高至少10倍(例如至少20倍、至少50倍或至少100倍)。
在某些实施方案中，所述组合物包含LEA-1和LEA-2的抑制剂的组合，例如如上所述和表2所示的单一抑制剂的组合。例如，在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-1抗体和MASP-2抗体的组合。在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-1抗体和MASP-3抗体的组合。在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-2抗体和MASP-3抗体的组合。在一个实施方案中，所述组合物包含MASP-1和MASP-2和MASP-3抗体的组合。在某些实施方案中，本发明的方法包括给予单一组合物，所述组合物包含抑制剂的组合。在其它实施方案中，本发明的方法包括共同给予分开的组合物。
在某些实施方案中，所述组合物包含双重抑制剂加单一抑制剂(即MASP-2/3双重抑制剂加MASP-1抑制剂；MASP-1/3双重抑制剂加MASP-2抑制剂；或MASP-1/2双重抑制剂加MASP-3抑制剂)的组合。在其它实施方案中，本发明的方法包括共同给予分开的组合物，所述组合物包含双重抑制剂和单一抑制剂。
在某些实施方案中，所述组合物包含双特异性抑制剂加单一抑制剂(即MASP-2/3双特异性抑制剂加MASP-1抑制剂；MASP-1/3双特异性抑制剂加MASP-2抑制剂；或MASP-1/2双特异性抑制剂加MASP-3抑制剂)的组合。在其它实施方案中，本发明的方法包括共同给予分开的组合物，所述组合物包含双特异性抑制剂和单一抑制剂。
依据本发明的不同实施方案，要注意的是，与必须定位到作用位点的C5抗体相比，MASP-3抑制剂和/或MASP-2抑制剂和/或MASP-1抑制剂将用于从血浆中清除靶蛋白。
V. MASP抗体
在本发明的该方面的某些实施方案中，MASP抑制剂包含MASP抗体(例如MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体)，其抑制LEA-1和/或LEA-2补体活化途径的至少一个。用于本发明该方面的MASP抗体包括得自产生抗体的任何哺乳动物的多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体并且可以是多特异性抗体(如双特异性或三特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、完整人抗体、抗独特型抗体和抗体片段。抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv片段、scFv片段和单链抗体，如本文进一步描述。
可以使用本文所述的测定法，筛选MASP抗体抑制LEA-1或LEA-2-依赖性补体活化系统的能力。在文献中已经描述了若干MASP-1、MASP-2和MASP-3的抗体，有些是新产生的，它们中的一些列于下表3。可以使用本文所述的测定法，筛选这些示例性的MASP抗体抑制LEA-1-和/或LEA-2-依赖性补体活化系统的能力。例如，如本文的实施例11-13中所述，已经鉴定了抗大鼠MASP-2 Fab2抗体，其阻断MASP-2-依赖性补体活化。进一步如实施例14所述，已经鉴定了完整人MASP-2 scFv抗体，其阻断MASP-2-依赖性补体活化。进一步如实施例15所述，已经产生了MASP-3抗体。一旦鉴定出作为LEA-1或LEA-2的抑制剂起作用的MASP抗体，它可用于本文所述的药物组合物，并且它还可用于产生双特异性和三特异性抑制剂，如表2所示和本文进一步所述(参见例如实施例8)。
表3：MASP-1、MASP-2和MASP-3的特异性抗体
i. 效应物功能降低的MASP抗体
在本发明该方面的某些实施方案中，为了减少可由经典补体途径活化所致的炎症，本文所述的MASP抗体降低了效应物功能。IgG分子触发经典补体途径的能力已被证明是在分子的Fc部分内(Duncan, A.R.,等人, Nature332:738-740 (1988))。分子的Fc部分被酶切割除去的IgG分子缺乏这种效应物功能(参见Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)。因此，通过具有使效应物功能减到最低的遗传改造Fc序列，或者成为人IgG2或IgG4同种型，由于缺少分子的Fc部分，可产生效应物功能降低的抗体。
可对IgG重链的Fc部分进行标准分子生物学操作来产生效应物功能降低的抗体，如Jolliffe等人, Int'l Rev. Immunol. 10:241-250, (1993)和Rodrigues等人, J. Immunol. 151:6954-6961, (1998)中所述。效应物功能降低的抗体还包括人IgG2和IgG4同种型，其活化补体和/或与Fc受体相互作用的能力降低(Ravetch, J.V.,等人, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, (1991)；Isaacs, J.D.,等人, J. Immunol.148:3062-3071, 1992；van de Winkel, J.G.,等人, Immunol. Today 14:215-221, (1993))。包含IgG2或IgG4同种型的人MASP-1、MASP-2或MASP-3特异性的人源化或全长人抗体(包括双重、泛、双特异性或三特异性抗体)可以通过本领域普通技术人员已知的若干方法之一来产生，如Vaughan, T.J.,等人, Nature Biotechnical 16:535-539, (1998)所述。
ii. MASP抗体的产生
使用MASP-1、MASP-2或MASP-3多肽(例如全长MASP-1、MASP-1或MASP-3)或使用携带抗原性MASP-1、2或3表位的肽(例如MASP-2多肽的一部分)，可以产生MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体。免疫原性肽可以少至5个氨基酸残基。例如，可以使用包括SEQ ID NO:5全部氨基酸序列的MASP-2多肽来诱导用于本发明方法的MASP-2抗体。使用本领域众所周知的方法，可以将已知参与蛋白-蛋白相互作用的特定MASP结构域(例如CUBI和CUBIEGF结构域以及包括丝氨酸蛋白酶活性位点的区域，例如表2所给出的)表达为重组多肽并用作抗原。另外，包含MASP-1多肽(SEQ ID NO:10)或MASP-2多肽(SEQ ID NO:5)或MASP-3多肽(SEQ ID NO:8)的至少6个氨基酸的部分的肽也分别用于诱导MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体。用于产生抗体的MASP肽和多肽可作为天然多肽、或者重组肽或合成肽以及无催化活性的重组多肽而被分离。用于产生抗MASP抗体的抗原还包括融合多肽，例如MASP多肽或其部分与免疫球蛋白多肽或者与麦芽糖结合蛋白的融合物。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是半抗原样的，则所述部分可有利地结合或连接到大分子载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)上用于免疫。
iii. 多克隆抗体
可通过使用本领域普通技术人员熟知的方法，用MASP-1、MASP-2或MASP-3多肽或其免疫原性部分免疫动物来制备抗MASP-1、MASP-2或MASP-3的多克隆抗体。参见例如，Green等人, "Production of Polyclonal Anti sera," 载于Immunochemical Protocols (Manson编辑)。可通过使用佐剂来增加MASP多肽的免疫原性，所述佐剂包括无机凝胶(例如氢氧化铝)或弗氏佐剂(完全或不完全)、表面活性剂(例如溶血卵磷脂)、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、油乳液、KLH和二硝基苯酚。多克隆抗体一般由例如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或绵羊等动物产生。或者，用于本发明的MASP抗体也可得自近似人类的灵长类。在狒狒中产生诊断用和治疗用抗体的通用技术可参见例如Goldenberg等人, 国际专利公布号WO 91/11465，和Losman, M.J.,等人, Int. J. Cancer 46:310, (1990)。然后采用本领域众所周知的标准方法，从这些被免疫过的动物的血液中获得含有免疫活性抗体的血清。
iv. 单克隆抗体
在某些实施方案中，LEA-2抑制剂是MASP-2单克隆抗体和/或LEA-1抑制剂是MASP-3单克隆抗体或MASP-1单克隆抗体。如上所述，在某些实施方案中，MASP-1、MASP-2和MASP-3的单克隆抗体是高度特异性的，针对单一MASP-1、MASP-2或MASP-3表位。本文所用的修饰语“单克隆”是指获自基本同源的抗体群的抗体性质，不理解为需要通过任何特定方法来产生抗体。可采用通过培养物中的连续细胞系以提供抗体分子产生的任何技术来获得单克隆抗体，例如Kohler, G.,等人, Nature256:495, (1975)中所述的杂交瘤方法，或者可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体(参见例如Cabilly的美国专利号4,816,567)。还可以采用Clackson, T.,等人, Nature 352:624-628, (1991)和Marks, J.D.,等人, J. Mol. Biol. 222:581-597, (1991)中所述的技术，从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。这些抗体可以具有任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。
例如，可通过将包含MASP-1多肽、MASP-2多肽或MASP-3多肽或其部分的组合物注射给合适的哺乳动物(例如BALB/c小鼠)而获得单克隆抗体。在预定时间之后，从小鼠中取出脾细胞，使之悬浮于细胞培养基中。然后将脾细胞与无限增殖细胞系融合形成杂交瘤。将形成的杂交瘤在细胞培养基中培养，对它们产生抗MASP-1、MASP-2或MASP-3的单克隆抗体的能力进行筛选。(另见Current Protocols in Immunology, 第1卷, John Wiley & Sons, 第2.5.1-2.6.7页, 1991.)。
可通过使用转基因小鼠来获得人单克隆抗体，所述转基因小鼠已被工程改造以在响应抗原攻击时产生特异性人抗体。在这种技术中，将人免疫球蛋白重链和轻链基因座元件引入得自胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有被定向破坏的内源免疫球蛋白重链和轻链基因座。该转基因小鼠可合成对人抗原(例如本文所述MASP-2抗原)特异性的人抗体，可使用该小鼠来产生分泌人MASP-2抗体的杂交瘤，具体方法是通过采用常规Kohler-Milstein技术，将来自所述动物的B细胞与合适的骨髓瘤细胞系融合。自转基因小鼠获得人抗体的方法例如描述于Green, L.L.,等人, Nature Genet. 7:13, 1994；Lonberg, N.,等人, Nature 368:856, 1994；和Taylor, L.D.,等人, Int. Immun.6:579, 1994。
可通过各种已确立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括用A蛋白琼脂糖凝胶的亲和色谱、大小排阻色谱和离子交换色谱(参见例如，Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页；Baines等人, " Purification of Immunoglobulin G (IgG)," 载于Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., 第10卷, 第79-104页, 1992)。
多克隆抗体、单克隆抗体或得自噬菌体的抗体一旦产生后，首先要测试其对MASP-1、MASP-2或MASP-3结合的特异性，或者如有需要，测试其对双重MASP-1/3、MASP-2/3或MASP-1/2结合的特异性。测定抗体是否结合到蛋白抗原上和/或抗体对蛋白抗原的亲和性的方法是本领域已知的。例如，可使用各种技术来测定和/或定量测定抗体与蛋白抗原的结合，所述技术例如但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、等离子体表面共振方法(例如BIAcore系统；Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden和Piscataway, NJ)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。参见例如Harlow和Lane (1988) " Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.；Benny K. C. Lo (2004) " Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921)；Borrebaek (1992) " Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY；Borrebaek (1995) " Antibody Engineering," 第2版, Oxford University Press, NY, Oxford；Johne等人(1993), Immunol. Meth. 160:191-198；Jonsson等人 (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26；和Jonsson等人(1991) Biotechniques 11:620-627。另见美国专利号6,355,245。
本领域普通技术人员可以容易地测定MASP单克隆抗体的亲和性(参见例如Scatchard, A., NY Acad. Sci.51:660-672, 1949)。在一个实施方案中，用于本发明方法的MASP-1、MASP-2或MASP-3的单克隆抗体与MASP-1、MASP-2或MASP-3结合，其结合亲和性<100 nM，优选地<10 nM和最优选地<2 nM。
一旦特异性地结合到MASP-1、MASP-2或MASP-3上的抗体被鉴定后，在若干功能测定法之一中测试MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体作为LEA-1抑制剂或LEA-2抑制剂的能力，例如如表2所述。例如，在若干功能测定法之一中测试经鉴定特异性地结合到MASP-2上的抗体作为LEA-2抑制剂的能力，例如如表2所述(例如，凝集素-特异性C4切割测定法(例如实施例8或实施例9中所述的测定法)，或C3b沉积测定法(例如实施例4或实施例11中所述的测定法))。作为再一个实例，在若干功能测定法之一中测试经鉴定特异性地结合到MASP-1或MASP-3上的抗体作为LEA-1抑制剂的能力，例如如表2所述(例如溶血的减少(例如如实施例5中所述而测定)或C3切割和C3b沉积的减少(例如如实施例4和实施例11中所述而测定))。
v. 嵌合/人源化抗体
用于本发明方法的单克隆抗体包括嵌合抗体以及这些抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与得自特定物种的抗体的相应序列相同或同源，或者属于特定抗体类别或亚类，而链的其余部分与得自另一物种的抗体的相应序列相同或同源，或者属于另一抗体类别或亚类(Cabilly的美国专利号4,816,567；和Morrison, S.L.,等人, Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 81:6851-6855, (1984))。
用于本发明的一种形式的嵌合抗体是人源化单克隆MASP-1、MASP-2或MASP-3抗体。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是嵌合抗体，其含有得自非人免疫球蛋白的最小序列。通过将非人(例如小鼠)互补决定区(CDR)从小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移到人可变结构域，从而产生人源化单克隆抗体。然后，典型的做法是将人抗体的其余部分代入非人对应部分的构架区。此外，人源化抗体可包括受体抗体或供体抗体中不存在的残基。这些修饰被用来进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一种、通常两种可变结构域的基本全部，其中所有或基本上所有的超变环都对应于非人免疫球蛋白的超变环，所有或基本上所有的Fv构架区都是人免疫球蛋白序列的Fv构架区。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc) (通常为人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。更多详情可参见Jones, P.T.,等人, Nature 321:522-525, (1986)；Reichmann, L.,等人, Nature 332:323-329, (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, (1992)。
用于本发明的人源化抗体包括至少含有MASP-1、MASP-2或MASP-3结合CDR3区的人单克隆抗体。此外，可以替换Fc部分以便产生IgA或IgM以及人IgG抗体。这样的人源化抗体将具有特定的临床效用，因为它们特异性地识别人MASP-1、MASP-2或MASP-3，但是却不会引起人体对抗体本身的免疫应答。因此它们更适用于人体的体内给药，尤其是必须重复或长期给药的时候。
产生人源化单克隆抗体的技术还描述于例如Jones, P.T.,等人, Nature 321:522, (1986)；Carter, P.,等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:4285, (1992)；Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech. 12:437, (1992)；Singer, I.I.,等人, J. Immun. 150:2844, (1993)；Sudhir (编著), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995)；Kelley, " Engineering Therapeutic Antibodies," 载于Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland等人(编著), John Wiley & Sons, Inc., 第399-434页, (1996)；和Queen的美国专利号5,693,762, 1997。此外，还有从特定鼠抗体区合成人源化抗体的商业公司，例如Protein Design Labs (Mountain View, CA)。
vi. 重组抗体
还可使用重组方法制备MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体。例如，可使用人免疫球蛋白表达文库(可获自例如Stratagene, Corp., La Jolla, CA)来制备人抗体，以产生人抗体片段(VH、VL、Fv、D因子、Fab或F(ab')2)。然后使用类似于产生嵌合抗体的技术，将这些片段用以构建完整的人抗体。
vii. 抗独特型抗体
一旦鉴定出具有所需抑制活性的MASP-1、MASP-2或MASP-3的抗体，便可采用本领域众所周知的技术将这些抗体用来产生类似于MASP-1、MASP-2或MASP-3的一部分的抗独特型抗体。参见例如Greenspan, N.S.等，FASEB J. 7:437, (1993)。例如，结合MASP-2并竞争性抑制补体活化所需的MASP-2蛋白的相互作用的抗体可用来产生类似于MASP-2蛋白上的MBL结合位点的抗独特型抗体，从而结合并中和MASP-2的结合配体，例如MBL。
viii. 免疫球蛋白片段
用于本发明方法的MASP-2和MASP-3的抑制剂不仅包括完整的免疫球蛋白分子，而且还包括众所周知的片段，包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2和Fv片段、scFv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性(例如双特异性和三特异性)抗体。
本领域众所周知的是，抗体分子的仅小部分即互补位(paratope)参与抗体与其表位的结合(参见例如Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., NY, 1986)。抗体的pFc’区和Fc区是经典补体途径的效应物，但不参与抗原结合。其中pFc’区已被酶切割的抗体，或者所产生的没有pFc’区的抗体被称为F(ab’)2片段，它保留了完整抗体的抗原结合位点中的两个。分离的F(ab’)2片段由于有两个抗原结合位点而被称为二价单克隆片段。类似地，其中Fc区已被酶切割的抗体，或者所产生的没有Fc区的抗体被称为Fab片段，它保留了完整抗体分子的抗原结合位点中的一个。
抗体片段可通过蛋白水解而获得，例如通过常规方法经胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体。例如，可通过用胃蛋白酶进行酶切割抗体来产生抗体片段，从而提供称为F(ab')2的5S片段。该片段可再使用硫醇还原试剂切割，得到3.5S Fab'单价片段。任选可使用二硫键裂解产生的巯基的封闭基团来进行裂解反应。作为替代方法，使用胃蛋白酶的酶切割直接产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如，Goldenberg的美国专利号4,331,647；Nisonoff, A.,等人, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, (1960)；Porter, R.R., Biochem. J.73:119, (1959)；Edelman,等人, 载于Methods in Enzymology1:422, Academic Press, (1967)；和Coligan的第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
在一些实施方案中，优选使用缺乏Fc区的抗体片段以避免Fc结合Fcγ受体时启动的经典补体途径的活化。有几种方法可产生避免与Fcγ受体相互作用的单克隆抗体。例如，单克隆抗体的Fc区可通过使用蛋白水解酶部分消化(例如无花果蛋白酶消化)，从而用化学法去除，因此产生例如结合抗原的抗体片段，例如Fab或F(ab)2片段(Mariani, M.,等人, Mol. Immunol.28:69-71, (1991))。或者，可以在构建本文所述的人源化抗体期间使用不结合Fcγ受体的人γ4 IgG同种型。还可使用本文所述的重组技术来工程改造缺少Fc结构域的抗体、单链抗体和抗原结合结构域。
ix. 单链抗体片段
或者，可以建立对MASP-1、MASP-2或MASP-3特异性的单一肽链结合分子，其中重链和轻链Fv区相连接。Fv片段可通过肽接头相连，形成单链抗原结合蛋白(scFv)。通过构建包含编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白，所述DNA序列通过寡核苷酸连接。将这些结构基因插入表达载体中，随后将其引入宿主细胞(例如大肠杆菌)中。重组宿主细胞合成了由接头肽桥接两个V结构域的单一多肽链。scFv的制备方法描述于例如Whitlow,等人, "Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, (1991)；Bird,等人, Science 242:423, (1988)；Ladner的美国专利号4,946,778；Pack, P.,等人, Bio/Technology11:1271, (1993)。
举例来说，可通过将淋巴细胞体外暴露于MASP-3多肽，并在噬菌体或类似载体中选择抗体展示文库(例如通过使用固定化的或标记的MASP-3蛋白或肽)，获得MASP-3特异性scFv。可通过对噬菌体或细菌(如大肠杆菌)上展示的随机肽文库进行筛选而获得编码具有可能的MASP-3多肽结合结构域的多肽的基因。这些随机肽展示文库可用于筛选与MASP-3相互作用的肽。构建和筛选这些随机肽展示文库的技术是本领域众所周知的(Lardner的美国专利号5,223,409,；Lardner的美国专利号4,946,778；Lardner的美国专利号5,403,484；Lardner的美国专利号5,571,698；和Kay等人, Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996)，随机肽展现文库和用于筛选这些文库的试剂盒是市售可得的，例如来自CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.)、Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.)、New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)和Pharmacia LKB Bio technology Inc. (Piscataway, N.J.)。
用于本发明这个方面的MASP-3抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽，其结合MASP-3抗原上的表位并抑制MASP-3依赖性补体活化(即LEA-1)。用于本发明这个方面的MASP-1抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽，其结合MASP-1抗原上的表位并抑制MASP-3依赖性补体活化(即LEA-1)。用于本发明这个方面的MASP-2抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽，其结合MASP-2抗原上的表位并抑制MASP-2依赖性补体活化(即LEA-2)。
可通过构建编码目标抗体CDR的基因而获得CDR肽(“最小识别单元”)。例如通过使用聚合酶链式反应从抗体生成细胞的RNA合成可变区，从而制备这些基因(参见例如，Larrick等人, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991)；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," 载于Monoclonal Antibodies: Production, Engineeringand Clinical Application, Ritter等人 (编著), 第166页, Cambridge University Press, (1995)；和Ward等人, " Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," 载于Antibodies: Principles and Applications, Birch等人 (编著), 第137页, Wiley-Liss, Inc., 1995)。
将本文所述的MASP抗体给予有需要的受试者以抑制LEA-1、LEA-2或者LEA-1和LEA-2组合的补体活化。在一些实施方案中，MASP抑制剂是效应物功能降低的高亲和性人或人源化单克隆MASP-1、MASP-2或MASP-3抗体。
x. 双特异性抗体
用于本发明方法的MASP-2和MASP-3的抑制剂包括多特异性(即双特异性和三特异性)抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选地为人或人源化抗体，所述抗体对至少两种不同抗原具有结合特异性。如上所述和如表2所示，在一个实施方案中，所述方法包括双特异性抗体的使用，所述抗体包含对MASP-2的结合特异性(例如，结合到MASP-2的CCP1-CCP2或丝氨酸蛋白酶结构域的至少一个)和对MASP-3的结合特异性(例如结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域)。在另一个实施方案中，所述方法包括双特异性抗体的使用，所述抗体包含对MASP-1的结合特异性(例如结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域)和对MASP-2的结合特异性(例如结合到MASP-2的CCP1-CCP2或丝氨酸蛋白酶结构域的至少一个)。在另一个实施方案中，所述方法包括双特异性抗体的使用，所述抗体包含对MASP-1的结合特异性(例如结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域)和对MASP-3的结合特异性(例如结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域)。在另一个实施方案中，所述方法包括三特异性抗体的使用，所述抗体包含对MASP-1的结合特异性(例如结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域)、对MASP-2的结合特异性(例如结合到MASP-2的CCP1-CCP2或丝氨酸蛋白酶结构域的至少一个)和对MASP-3的结合特异性(例如结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域)。
制备双特异性抗体的方法在本领域技术人员能力范围之内。传统上，双特异性抗体的重组产生是根据两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Milstein和Cuello, Nature 305:537-539 (1983))。具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合物优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包括至少部分的铰链区、CH2区和CH3区。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如有必要)免疫球蛋白轻链的DNA插入到分开的表达载体中，然后共转染到合适宿主生物体中。对于产生双特异性抗体的说明性的现有已知方法的更多细节参见例如Suresh等人, Methods in Enzymology 121:210 (1986)；WO96/27011；Brennan等人, Science 229:81 (1985)；Shalaby等人, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)；Kostelny等人, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)；Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993)；Gruber等人, J. Immunol. 152:5368 (1994)；和Tutt等人, J. Immunol. 147:60 (1991)。双特异性抗体还包括交联的或异型缀合的抗体(heteroconjugate antibodies)。可使用任何常规交联方法制备异型缀合的抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的并公开于美国专利号4,676,980以及许多交联技术。
还已经描述了直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，使用亮氨酸拉链，已经制备了双特异性抗体。(参见例如Kostelny等人，J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992))。Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993)所述的“双抗体”技术已经提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，所述接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH结构域和VL结构域被迫与另一片段的互补VL结构域和VH结构域配对，从而形成2个抗原-结合位点。与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可能是特别有用的，因为它们可以被容易地构建和在大肠杆菌中表达。使用噬菌体展示(WO94/13804)，可从文库中容易地选择具有合适的结合特异性的双抗体(和许多其它多肽例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以构建文库，其中另一臂不同并选择具有合适特异性的抗体。
还已报道了通过使用单链Fv (scFv)二聚体而制备双特异性抗体片段的另一策略(参见例如Gruber等人，J. Immunol., 152:5368 (1994))。或者，抗体可以是“线性抗体”，例如描述于Zapata等人, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)。简要描述，这些抗体包含一对串联的D因子区段(VH-CHI-VH-CHI)，其形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。本发明的方法还包括使用双特异性抗体的变体形式，例如Wu等人, Nat Biotechnol 25:1290-1297 (2007)所述的四价双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子。之所以称为DVD-Ig分子，是因为来自两个不同母体抗体的2个不同的轻链可变区(VL)通过重组DNA技术直接或经由短接头而串联连接，接着是轻链恒定区。从两个母体抗体产生DVD-Ig分子的方法进一步描述于例如WO08/024188和WO07/024715，其各自的公开内容通过引用以其整体结合到本文中。
VI. 非-肽抑制剂
在某些实施方案中，所述MASP-3或MASP-2抑制剂是MASP-3或MASP-2或MASP-1的抑制性肽或者MASP-3或MASP-2或MASP-1的非-肽抑制剂。可将非-肽MASP抑制剂系统地给予受试者，例如通过动脉内、静脉内、肌内、皮下或其他肠胃外给药，或通过口服给药。可在延长的时间期限中定期给予MASP抑制剂以治疗或控制慢性病症，或者可以在急性创伤或损伤之前、期间或之后的一段时间内通过单次或重复给予。
VII. 药物组合物和递送方法
剂量
另一方面，本发明提供在患有溶血疾病例如PNH的受试者中抑制MASP-3依赖性补体活化的不良作用的组合物，包括给予所述受试者组合物，所述组合物包含有效抑制MASP-3-依赖性补体活化的一定量的MASP-3抑制剂和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述方法进一步包括给予组合物，其包含MASP-2抑制剂。可将治疗有效剂量的MASP-3和MASP-2的抑制剂给予有需要的受试者，以治疗或改善与MASP-3-依赖性补体活化(LEA-1)相关的病况和任选还与MASP-2-依赖性补体活化(LEA-2)相关的病况。治疗有效剂量是指MASP-3抑制剂或MASP-3抑制剂和MASP-2抑制剂的组合足以导致改善所述病况的症状的量。
可通过标准药学方法，使用实验动物模型来测定MASP-3和MASP-2的抑制剂的毒性和治疗功效。使用这些动物模型，可使用标准方法来确定NOAEL (无明显不良作用水平)和MED (最小有效剂量)。NOAEL和MED效应之间的剂量比是治疗比率，用NOAEL/MED之比表示。最优选的是治疗比率或指数高的MASP-3抑制剂和MASP-2抑制剂。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用来制定用于人体的剂量范围。MASP-3抑制剂和MASP-2抑制剂的剂量优选在循环浓度的范围之内，包括几乎无毒性或没有毒性的MED。剂量可在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和所使用的给药途径。
对于任何化合物制剂来说，可使用动物模型来评价治疗有效剂量。例如，可在动物模型中配制达到包括MED在内的循环血浆浓度范围的剂量。还可通过例如高效液相色谱法来测量血浆中MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂的定量水平。
除了毒性研究之外，还可根据活的受试者中存在的靶MASP蛋白的量以及MASP-3或MASP-2的抑制剂的结合亲和性来估计有效剂量。
已报道在正常人类受试者血清中存在的MASP-1水平在1.48至12.83 μg/mL的范围内(Terai I.等人, Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997)；Theil等人, Clin. Exp. Immunol. 169:38 (2012))。已报道正常人类受试者的平均血清MASP-3浓度在大约2.0至12.9 μg/mL的范围内(Skjoedt M等人, Immunobiology 215(11):921-31 (2010)；Degn等人, J. Immunol Methods, 361-37 (2010)；Csuka等人, Mol. Immunol. 54:271 (2013)。已经证实正常人类受试者血清中存在的MASP-2水平在500ng / ml的低水平范围内，可使用以下文献所述的MASP-2定量测定法来测定具体受试者的MASP-2水平：Moller-Kristensen M.,等人, J. Immunol. Methods282:159-167 (2003)和Csuka等人, Mol. Immunol. 54:271 (2013)。
通常，包含MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂的组合物的给药剂量根据例如受试者年龄、体重、身高、性别、一般疾病状况和病史等因素而变化。举例来说，可在大约0.010至100.0 mg/kg、优选地0.010至10 mg/kg、优选地0.010至1.0 mg/kg、更优选地0.010至0.1 mg/kg受试者体重的剂量范围内给予MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂(例如MASP-3抗体、MASP-1抗体或MASP-2抗体)。在某些实施方案中，给予MASP-2抑制剂(例如MASP-2抗体)的剂量范围为大约优选地0.010至10 mg/kg，优选地0.010至1.0 mg/kg，更优选地0.010至0.1 mg/kg的受试者体重。在某些实施方案中，给予MASP-1抑制剂(例如MASP-1抗体)或MASP-3抑制剂(例如MASP-3抗体)的剂量范围为大约0.010至100.0 mg/kg，优选地0.010至10 mg/kg，优选地0.010至1.0 mg/kg，更优选0.010至0.1 mg/kg的受试者体重。
根据本领域技术人员众所周知的补体测定法，可以测定在指定受试者中的MASP-3抑制性组合物(任选与MASP-2抑制性组合物组合)或MASP-1抑制性组合物(任选与MASP-2抑制性组合物组合)以及本发明方法的治疗功效和合适剂量。补体产生多种特定产物。在最近十年中，对于这些活化产物的大部分，已经开发出灵敏而专一的测定法并且是市售可得的，所述活化产物包括小的活化片段C3a、C4a和C5a和大的活化片段iC3b、C4d、Bb和sC5b-9。大多数的这类测定法都利用了与暴露在片段而不是暴露在其所形成的天然蛋白上的新抗原(neoantigen)起反应的单克隆抗体，这使得这些测定法非常简单而专一。大多数都依赖于ELISA技术，尽管有时放射免疫测定法仍用于C3a和C5a。放射免疫测定法测定未经加工的片段及其“脱Arg”片段两者，这些片段是存在于循环中的主要形式。未经加工的片段和C5adesArg通过结合细胞表面受体而被迅速清除掉，因而以极低浓度存在，而3adesArg则不结合细胞，并在血浆中蓄积。测定C3a提供了补体活化灵敏的、不依赖途径的标志物。可通过测定Bb片段和/或测定D因子活化来评价替代途径活化。检测膜攻击途径活化的液相产物sC5b-9，提供了补体被完全激活的证据。因为凝集素途径和经典途径都产生同样的活化产物C4a和C4d，所以测定这两种片段并不提供有关这两条途径中哪一条途径产生了所述活化产物的任何信息。
对MASP-3-依赖性补体活化的抑制特征在于作为按照本发明方法给予MASP-3抑制剂的结果而发生的补体系统的成分的以下变化中的至少一项：抑制LEA-1-介导的补体活化(抑制溶血和调理作用)；抑制MASP-3丝氨酸蛋白酶底物-特异性切割；减少溶血(例如如实施例5中所述而测定)；或减少C3切割和C3b沉积(例如如实施例4或实施例11中所述而测定)。
对MASP-2-依赖性补体活化的抑制特征在于作为按照本发明方法给予MASP-2抑制剂的结果而发生的补体系统的成分的以下变化中的至少一项：抑制MASP-2-依赖性补体活化系统产物C4b、C3a、C5a和/或C5b-9 (MAC)的产生或生产(例如如美国专利号7,919,094实施例2中所述而测定)；减少C4切割和C4b沉积(例如如实施例8或实施例9中所述而测定)；或减少C3切割和C3b沉积(例如如实施例11中所述而测定)。
i. 药用载体和递送媒介物
一般而言，本发明的MASP-3抑制剂组合物和MASP-2抑制剂组合物或包含MASP-2和MASP-3的抑制剂的组合的组合物，可以与任何其它所选治疗药组合，并适宜地包含在药学上可接受的载体中。载体是无毒的、生物相容的并且可被选择以便不会有害影响MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂(和与其组合的任何其它治疗药)的生物学活性。用于肽的示例性药学可接受的载体描述于Yamada的美国专利号5,211,657。如本文所述，用于本发明的MASP抗体可以配制成固体、半固体、凝胶、液体或气体形式的制备物，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、吸入剂和注射剂，供口服、胃肠外或外科施用。本发明还包括通过将组合物涂敷在医疗装置上进行局部施用等。
用于经由注射、输注或冲洗的胃肠外递送和局部递送的合适载体包括蒸馏水、磷酸盐缓冲生理盐水、标准林格氏液或乳酸盐林格氏液、葡萄糖溶液、Hank氏溶液或丙二醇。此外，无菌不挥发油可用作溶剂或悬浮介质。对于此目的，可采用任何生物相容性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可用于注射剂的制备中。可将载体和试剂配制成为液体制剂、混悬剂、可聚合或不可聚合的凝胶剂、糊剂或药膏。
载体还可包括递送媒介物以使一种或多种试剂的递送持续(即延长、延缓或调节)，或者增强一种或多种治疗药的递送、摄取、稳定性或药代动力学。这种递送媒介物以非限制性实例的方式可包括：由蛋白质、脂质体、碳水化合物、合成有机化合物、无机化合物、聚合水凝胶或共聚水凝胶和聚合物胶束组成的微粒、微球、纳米球、纳米粒。合适的水凝胶和胶束递送系统包括WO 2004/009664 A2中公开的PEO:PHB:PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物和美国专利申请公布号2002/0019369 A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。这些水凝胶可局部注射到预期作用部位，或者皮下或肌内注射以形成缓释贮库(depot)。
本发明的组合物可配制成用于皮下、肌内、静脉内、动脉内递送或作为吸入剂递送。
对于关节内递药，MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂可被装载于上述可注射的液体或凝胶载体、上述可注射的缓释递药媒介物、或者透明质酸或透明质酸衍生物中。
对于非肽能药物的口服给药，MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂可被装载于惰性填充物或稀释剂例如蔗糖、玉米淀粉或纤维素中。
对于局部给药，MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂可装载于软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体制剂或粉剂中，或者经由透皮贴剂的凝胶或微胶囊递送系统中。
各种经鼻和经肺的递送系统正在研发中，包括气雾器、剂量吸入器、干粉吸入器和雾化器，可分别适于在气雾剂、吸入剂或雾化递药溶媒中的本发明的递送。
对鞘内(IT)或脑室内(ICV)递送，合适的无菌递送系统(例如液体制剂；凝胶剂、混悬剂等)可用来给予本发明。
本发明的组合物还可包括生物相容性赋形剂，例如分散剂或润湿剂、助悬剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、矫味剂(用于口服给药)。
ii. 抗体和肽的药用载体
至于本文所述的MASP抗体，更具体地讲，示例性的制剂可以按注射剂量的所述化合物的溶液剂或混悬剂经胃肠外给予，所述化合物包含在生理上可接受的稀释剂与药用载体内，药用载体可以是无菌液体，例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，包含MASP抗体的组合物中可存在例如润湿剂或乳化剂、表面活性剂、PH缓冲物质等辅助物质。药物组合物的其外组分包括石油(petroleum) (例如动物、植物或合成来源的石油)，例如大豆油和矿物油。一般而言，二元醇例如丙二醇或聚乙二醇是用于注射溶液剂的优选液体载体。
还能以储库注射制剂或植入制剂的形式给予MASP抗体，这些制剂可按允许活性剂缓释或脉冲释放的方式来配制。
VIII. 给药方式
可以多种方式给予包含MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂的药物组合物，这取决于是局部还是全身性给药方式最适于待治疗的病况。此外，本发明的组合物可通过将组合物涂布或掺入可植入的医疗装置上面或里面而递送。
i. 系统递送
如本文所用，术语“系统递送”和“系统给药”意图包括但不限于口服和胃肠外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、经皮、经鼻、直肠、阴道和其它给药途径，它们将所递送的药物有效地分散到预期治疗作用的一个或多个部位。用于本发明组合物的系统递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下、动脉内和吸入。应当理解，对于用于本发明具体组合物中所选用的药物，确切的系统给药途径将部分地考虑药物对与特定给药途径相关的代谢转化途径的敏感性加以确定。例如，肽能药物可能最适于通过口服以外的途径给药。
可通过任何合适的方法将本文所述的MASP抑制性抗体递送到有需要的受试者中。递送MASP抗体和多肽的方法包括经口服、肺部、胃肠外(例如肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(例如经由微细粉制剂)、经皮、经鼻、阴道、直肠或者舌下给药途径，并且可将其配制成适于各自给药途径的剂型。
举例来说，可以通过将MASP抑制性抗体和肽应用到能够吸收所述多肽的身体膜上，例如鼻膜、胃肠膜和直肠膜，而将其引入活体内。通常将多肽和渗透促进剂一起应用到可吸收膜上(参见例如Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 5:69, (1988)；Lee, V.H.L., J. Controlled Release13:213, (1990)；Lee, V.H.L.主编, Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, New York (1991)；DeBoer, A.G.,等人, J. Controlled Release13:241, (1990)。例如，STDHF是梭链孢酸的合成衍生物，是结构上类似于胆盐的甾类表面活性剂，已被用作经鼻递送的渗透促进剂(Lee, W.A., Biopharm. 22, 1990年11/12月)。
可以引入与其它分子(例如脂质)缔合的本文所述的MASP抑制性抗体，以保护多肽不被酶降解。例如，共价结合的聚合物、尤其是聚乙二醇(PEG)已被用来保护某些蛋白质不被体内的酶水解，从而延长半寿期(Fuertges, F.,等人, J. Controlled Release11:139, (1990))。已经报道了许多用于蛋白质递送的聚合物系统(Bae, Y.H.,等人, J. Controlled Release9:271, (1989)；Hori, R.,等人, Pharm. Res. 6:813, (1989)；Yamakawa, I.,等人, J. Pharm. Sci. 79:505, (1990)；Yoshihiro, I.,等人, J. Controlled Release10:195, (1989)；Asano, M.,等人, J. Controlled Release9:111, (1989)；Rosenblatt, J.,等人, J. Controlled Release9:195, (1989)；Makino, K., J. Controlled Release12:235, (1990)；Takakura, Y.,等人, J. Pharm. Sci. 78:117, (1989)；Takakura, Y.,等人, J. Pharm. Sci. 78:219, (1989))。
最近，开发出血清稳定性和循环半寿期得到改进的脂质体(参见例如Webb的美国专利号5,741,516)。而且，对脂质体和脂质体样制备物作为可能的药物载体的各种方法进行了综述(参见例如Szoka的美国专利号5,567,434；Yagi的美国专利号5,552,157；Nakamori的美国专利号5,565,213；Shinkarenko的美国专利号5,738,868以及Gao的美国专利号5,795,587)。
对于经皮应用，可将本文所述的MASP抑制性抗体与其它合适的成分(例如载体和/或佐剂)混合。对这些其它成分的性质没有限制，只是对于其预期给药来说必须是药学上可接受的，并且不能降低组合物中活性成分的活性。合适溶媒的实例包括含或不含纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或混悬液。MASP抑制性抗体还可被浸渍到透皮贴剂、膏药和绷带中，优选以液体或半液体形式。
可以在为维持治疗效果所需水平而确定的间隔的周期性基础上，系统给予本发明的组合物。例如，可按每2-4周或者以更低频率的间隔给予组合物(例如经皮下注射)。给药方案将由医师考虑可能影响药物联用的作用的各种因素来确定。这些因素包括待治疗疾病的进展程度、受试者年龄、性别和体重和其它临床因素。各独立药物的剂量将随组合物中所包含的MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂以及任何递药溶媒(例如缓释递送溶媒)的存在和性质而变化。此外，可在考虑给药频率和所递送药物的药代动力学行为的变化后对剂量进行调整。
ii. 局部递送
本文所用术语“局部”包括药物在预期局部化作用部位上或其周围的应用，可包括例如局部递送到皮肤或其它受累组织；眼部递药；鞘内(IT)、脑室内(ICV)、关节内、腔内、颅内或肺泡内给药、安置或冲洗。可优选能够给予较低剂量的局部给药以避免全身性不良作用，以及更精确地控制递药时间和局部递药部位的活性剂浓度。不论患者之间在新陈代谢、血流等方面的变化，局部给药都在目标部位提供已知的浓度。通过直接递药方式亦提供改进的剂量控制。
MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂的局部递送可在手术方法的情况下实现以治疗疾病或病况，例如在动脉旁路术、经皮腔内斑块旋切术、激光手术、超声波手术、气囊血管成形术以及支架安置等手术期间。例如，可将MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂与气囊血管成形手术结合起来给予受试者。气囊血管成形手术包括将连有已排气的气囊的导管插入动脉内。将已排气的气囊置于动脉粥样硬化斑块附近，给气囊充气使得斑块向血管壁挤压。结果，气囊表面与血管表面的血管内皮细胞层接触。可以按允许药物在动脉粥样硬化斑块部位释放的方式，将MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂附着到气囊血管成形术导管上。可按照本领域已知标准方法将药物附着在气囊导管上。例如，可将药物保存在气囊导管的隔室中直到气囊充气，此时药物被释放到局部环境中。或者，可将药物浸渍在气囊表面，使得当气囊充气时，药物就接触到动脉壁的细胞。还可在多孔气囊导管中递送药物，例如Flugelman, M.Y.,等人, Circulation85:1110-1117, (1992)中公开的那些。另见已公开的PCT申请WO 95/23161中对于将治疗用蛋白附着到气囊血管成形术导管上的示例性方法。同样地，可将MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂包入应用于支架上的凝胶或聚合涂层材料中，或者可将其掺入支架材料中，使得支架在血管安置之后将MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂洗脱出来。
用于治疗关节炎和其它肌肉骨骼疾病的MASP-3抑制剂或MASP-2抑制剂可通过关节内注射来局部递送。这样的组合物可适当地包括缓释递药溶媒。作为其中可能需要局部递药的另一个实例，用于治疗泌尿生殖病况的MASP-2抑制性组合物可适当地滴入膀胱内或者其它泌尿生殖结构中。
IX. 治疗方案
在预防性应用中，将药物组合物给予易患PNH或否则处于患有PNH的风险中的受试者，其量足以消除或降低疾病症状发展的风险。在治疗性应用中，以足以缓解或至少部分减少疾病症状的治疗有效量，将药物组合物给予疑似患有或已经患有PNH的受试者。
在一个实施方案中，所述受试者的红细胞在组合物不存在时被C3片段调理，将所述组合物给予所述受试者，在受试者中增加红细胞存活。在一个实施方案中，所述受试者在组合物不存在时表现出选自以下的一种或多种症状：(i)血红蛋白低于正常水平，(ii)血小板低于正常水平；(iii)网织红细胞高于正常水平，和(iv)胆红素高于正常水平，并且将组合物给予受试者改善至少一种或多种症状，导致(i)增加、正常或几乎正常水平的血红蛋白(ii)增加、正常或几乎正常水平的血小板，(iii)减少、正常或几乎正常水平的网织红细胞，和/或(iv)减少、正常或几乎正常水平的胆红素。
在预防兼治疗方案中，可以给予包含MASP-3抑制剂和任选MASP-2抑制剂的组合物若干剂，直到在受试者中获得充分的治疗结果。在本发明的一个实施方案中，MASP-3和/或MASP-2的抑制剂包含MASP-1抗体、MASP-2抗体或MASP-3抗体，其可适宜地给予成年患者(例如平均成年体重70 kg)，剂量为0.1 mg至10,000 mg，更适宜地为1.0 mg至5,000 mg，更适宜地为10.0 mg至2,000 mg，更适宜地为10.0 mg至1,000 mg和还更适宜地为50.0 mg至500 mg，或10至200 mg。对于儿科患者，可按照患者体重的比例来调节剂量。
本发明的MASP-3抑制性组合物和任选的MASP-2抑制性组合物的施用可通过单次给予组合物(例如包含MASP-2和MASP-3的抑制剂、或双特异性或双重抑制剂的单一组合物，或共同给予分开的组合物)，或有限的给予顺序来进行，用于治疗PNH。或者，在治疗PNH的延长的时间周期内，可以定期间隔给予组合物，例如每天、每周两次、每周、每隔一周、每月或每月两次。
在某些实施方案中，将包含至少一种MASP-3抑制剂的第一组合物和包含至少一种MASP-2抑制剂的第二组合物给予PNH受试者。在一个实施方案中，将包含至少一种MASP-3抑制剂的第一组合物和包含至少一种MASP-2抑制剂的第二组合物同时给予(即在不超过大约15分钟更短、例如不超过10、5或1分钟的任一种的间隔时间内)。在一个实施方案中，将包含至少一种MASP-3抑制剂的第一组合物和包含至少一种MASP-2抑制剂的第二组合物序贯给予(即在给予第二组合物之前或之后给予第一组合物，其中给药的间隔时间超过15分钟)。在某些实施方案中，将包含至少一种MASP-3抑制剂的第一组合物和包含至少一种MASP-2抑制剂的第二组合物并发给予(即第一组合物的给予时间与第二组合物的给予时进重叠)。例如，在某些实施方案中，给予第一组合物和/或第二组合物达至少1、2、3或4周或更长的时间周期。在一个实施方案中，至少一种MASP-3抑制剂和至少一种MASP-2抑制剂在单位剂型中混合。在一个实施方案中，将包含至少一种MASP-3抑制剂的第一组合物和包含至少一种MASP-2抑制剂的第二组合物一起包装在药盒中，用于治疗PNH。
在某些实施方案中，PNH受试者先前已经经历、或目前正经历用抑制补体蛋白C5切割的末端补体抑制剂的治疗。在某些实施方案中，所述方法包含给予所述受试者本发明的组合物，所述组合物包含MASP-3和任选MASP-2的抑制剂；和进一步给予所述受试者抑制补体蛋白C5切割的末端补体抑制剂。在某些实施方案中，所述末端补体抑制剂是人源化抗C5抗体或其抗原-结合片段。在某些实施方案中，所述末端补体抑制剂是eculizumab。
X. 实施例
下面的实施例仅举例说明目前预期的用于实施本发明的最佳方式，但是不应解释为限制本发明。本文所引用的所有文献都通过引用明确地予以结合。
实施例1
本实施例说明了用脑膜炎奈瑟氏菌血清组A或脑膜炎奈瑟氏菌血清组B感染后，MASP-2缺陷型小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟氏菌诱导的死亡。
方法：
如US 7,919,094的实施例1所述，产生MASP-2敲除小鼠(MASP-2 KO小鼠)，所述文献通过引用结合到本文中。10周龄MASP-2 KO小鼠(n=10)和野生型(WT) C57/BL6小鼠(n=10)经腹膜内(i.p.)注射接种剂量为2.6 x 107 CFU、体积为100 μl的脑膜炎奈瑟氏菌血清组A Z2491。将感染剂量连同右旋糖酐铁给予小鼠，终浓度为400 mg/kg。在72小时时间周期内，监测感染后的小鼠生存率。
在不同的实验中，10周龄MASP-2 KO小鼠(n=10)和WT C57/BL6小鼠(n=10)经i.p.注射接种剂量为6 x 106 CFU、体积为100 μl的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58。将感染剂量连同右旋糖酐铁给予小鼠，终剂量为400 mg/kg。在72小时时间周期内，监测感染后的小鼠生存率。在感染后72小时时间周期中，根据下表4所述的疾病评分参数，还对WT和MASP-2 KO小鼠测定疾病评分，所述参数是基于略加修改的Fransen等人(2010)的方案。
表4：在感染小鼠中与临床体征相关的疾病评分
体征 评分
正常 0
稍微皱缩的皮毛 1
皱缩的皮毛，迟钝和发粘的眼睛 2
皱缩的皮毛，昏睡和闭眼 3
严重生病和刺激后不动 4
死亡 5
感染后按照每小时间隔从小鼠采集血液样品并分析，以测定脑膜炎奈瑟氏菌的血清水平(log cfu/mL)，以证实感染和测定细菌从血清中的清除率。
结果：
图8是卡普兰-迈耶曲线，图示表示在给予2.6 x 107 cfu的感染剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组A Z2491后的MASP-2 KO和WT小鼠的百分比生存率。如图8所示，100% MASP-2 KO小鼠在感染后72小时周期内生存。相比之下，仅80%的WT小鼠(p=0.012)在感染后24小时仍生存，仅50%的WT小鼠在感染后72小时仍生存。这些结果证明MASP-2-缺陷型小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟氏菌血清组A Z2491-诱导的死亡。
图9是卡普兰-迈耶曲线，图示表示在给予6 x 106 cfu的感染剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58后的MASP-2 KO和WT小鼠的百分比生存率。如图9所示，90%的MASP-2 KO小鼠在感染后72小时周期内生存。相比之下，仅20%的WT小鼠(p=0.0022)在感染后24小时仍生存。这些结果证明MASP-2-缺陷型小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58-诱导的死亡。
图10图示表示在i.p.感染6x106 cfu脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58后，从MASP-2 KO和WT小鼠在不同时间点采集的血液样品中回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58的log cfu/mL (n=3，在不同的时间点，对于这两组小鼠)。结果表示为平均值±SEM。如图10所示，在WT小鼠中，血液中的脑膜炎奈瑟氏菌水平在感染后24小时达到大约6.0 log cfu/mL的峰值，并在感染后36小时降至大约4.0 log cfu/mL。相比之下，在MASP-2 KO小鼠中，脑膜炎奈瑟氏菌水平在感染后12小时达到大约4.0 log cfu/mL的峰值，并在感染后36小时降至大约1.0 log cfu/mL (符号“*”表示p<0.05；符号“**”表示p=0.0043)。这些结果证明尽管MASP-2 KO小鼠用与用于WT小鼠的相同的剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58感染，但与WT相比，MASP-2 KO小鼠具有增高的菌血症清除率。
图11图示表示在感染6x106 cfu脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58后的3、6、12和24小时的MASP-2 KO和WT小鼠的平均疾病评分。如图11所示，MASP-2-缺陷型小鼠显示出对感染的高抗性，与WT小鼠相比，其在感染后6小时(符号“*”表示p=0.0411)、12小时(符号“**”表示p=0.0049)和24小时(符号“***”表示p=0.0049)具有低得多的疾病评分。图11中的结果表示为平均值±SEM。
总之，本实施例的结果证明在脑膜炎奈瑟氏菌血清组A或脑膜炎奈瑟氏菌血清组B感染后，MASP-2-缺陷型小鼠受到保护免于脑膜炎奈瑟氏菌-诱导的死亡。
实施例2
本实施例说明了在脑膜炎奈瑟氏菌感染后给予MASP-2抗体增加了脑膜炎奈瑟氏菌感染小鼠的生存率。
背景/原理：
如美国专利7,919,094的实施例24所述(通过引用结合到本文中)，大鼠MASP-2蛋白用于淘选Fab噬菌体展示文库，从中鉴定出Fab2 #11为功能活性抗体。从Fab2 #11产生大鼠IgG2c和小鼠IgG2a同种型的全长抗体。表征了小鼠IgG2a同种型的全长MASP-2抗体的药效动力学参数(如美国专利7,919,094的实施例38所述)。
在该实施例中，在脑膜炎奈瑟氏菌感染的小鼠模型中分析来自Fab2 #11的小鼠的MASP-2全长抗体。
方法：
在脑膜炎奈瑟氏菌感染的小鼠模型中，如下测试如上产生的来自Fab2 #11的小鼠IgG2a全长MASP-2抗体同种型。
1. 感染后给予小鼠-MASP-2单克隆抗体(MoAb)
在i.p.注射高剂量(4x106 cfu)脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58后3小时，9周龄C57/BL6 Charles River小鼠用抑制性小鼠MASP-2抗体(1.0 mg/kg) (n=12)或对照同种型抗体(n=10)治疗。
结果：
图12是卡普兰-迈耶曲线，图示表示在给予4x106 cfu的感染剂量的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58，接着在感染后3小时给予抑制性MASP-2抗体(1.0 mg/kg)或对照同种型抗体后的小鼠百分比生存率。如图12所示，用MASP-2抗体治疗的小鼠的90%在感染后72小时周期内生存。相比之下，用同种型对照抗体治疗的小鼠的仅50%在感染后72小时周期内生存。符号“*”表示p=0.0301，如通过两条生存曲线的比较而测定。
这些结果证明给予MASP-2抗体有效治疗和改善感染了脑膜炎奈瑟氏菌的受试者的生存率。
如本文所证明，当在感染后3小时内给予时，在感染脑膜炎奈瑟氏菌的受试者的治疗中使用MASP-2抗体是有效的，并且预期在感染后24小时至48小时内有效。脑膜炎球菌性疾病(脑膜炎球菌血症或脑膜炎)是医学急症，并且如果怀疑脑膜炎球菌性疾病(即在脑膜炎奈瑟氏菌被明确鉴定为病原之前)，通常将会立即启动治疗。
考虑到实施例1中给出的MASP-2 KO小鼠的结果，认为在脑膜炎奈瑟氏菌感染之前给予MASP-2抗体也将有效预防或改善感染的严重程度。
实施例3
本实施例证明在人血清中的脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤是MASP-3-依赖性的。
原理：
功能性MBL血清水平降低的患者对复发性细菌和真菌感染的敏感性增加(Kilpatrick等人, Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002))。已知脑膜炎奈瑟氏菌被MBL识别，和已经证实MBL-缺乏的血清不溶解脑膜炎奈瑟氏菌。
考虑到实施例1和2中所述的结果，进行了一系列实验以确定在补体-缺乏的和对照人血清中给予MASP-2抗体治疗脑膜炎奈瑟氏菌感染的功效。在高浓度血清(20%)中进行实验以保护补体途径.
方法：
1. 在不同补体-缺乏的人血清和在用人MASP-2抗体处理的人血清中的血清杀菌活性
以下补体-缺乏的人血清和对照人血清用于本实验：
表5：所测试的人血清样品(如图13所示)
样品 血清类型
A 正常人血清(NHS) +人MASP-2 Ab
B NHS + 同种型对照Ab
C MBL -/-人血清
D NHS
E 热灭活的(HI) NHS
针对人MASP-2的重组抗体分离自组合抗体文库(Knappik, A.,等人, J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000))，使用重组人MASP-2A作为抗原(Chen, C.B.和Wallis, J. Biol. Chem. 276:25894-25902 (2001))。在人血浆中强力抑制C4和C3的凝集素途径-介导的活化(IC50~20 nM)的抗人scFv片段被鉴定并转化为全长人IgG4抗体。
在37℃并伴随振荡，将脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58与表5所示的不同血清(各自的血清浓度为20%)一起孵育，加或不加抑制性人MASP-2抗体(3 μg在100 μl 总体积中)。在以下时间点采集样品：0-、30-、60-和90-分钟间隔，倒平板(plated out)，然后测定活菌计数。热灭活的人血清用作阴性对照。
结果：
图13图示表示在表5所示的人血清样品中，在不同时间点回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株MC58的活菌计数的log cfu/mL。表6提供图13的Student's t-检验结果。
表6：图13的Student's t-检验结果(时间点60分钟)
  平均差(Log) 显著性? P<0.05? P值概述
A vs B -0.3678 是 ***(0.0002)
A vs C -1.1053 是 ***(p<0.0001)
A vs D -0.2111 是 **(0.0012)
C vs D  1.9 是 ***(p<0.0001)
如图13和表6所示，通过加入人MASP-2抑制性抗体而显著增强了在人20%血清中的脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤。
2. 在不同补体-缺乏的人血清中的血清杀菌活性
以下补体-缺乏的人血清和对照人血清用于本实验：
表7：所测试的人血清样品(如所示图14)
样品 血清类型
A 正常人血清(NHS)
B 热灭活的NHS
C MBL -/-
D MASP-3 -/- (MASP-1 +)
注意：在样品D中的MASP-3 -/- (MASP-1 +)血清是采自3MC综合征受试者，3MC综合征是覆盖Carnevale、Mingarelli、Malpuech和Michels综合征的统一术语。正如实施例4的进一步描述，MASP-1/3基因的外显子12中的突变使MASP-3 (而非MASP-1)的丝氨酸蛋白酶结构域功能失调。还已知D因子在3MC血清中是完整的。
在37℃并伴随振荡，将脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58与不同补体-缺乏的人血清(各自的血清浓度为20%)一起孵育。在以下时间点采集样品：0-、15-、30-、45-、60-、90-和120-分钟间隔，倒平板，然后测定活菌计数。热灭活的人血清用作阴性对照。
结果：
图14图示表示在表7所示的人血清样品中，在不同时间点回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58的活菌计数的log cfu/mL。如图14所示，WT (NHS)血清对脑膜炎奈瑟氏菌具有最高水平的杀菌活性。相比之下，MBL -/-和MASP-3 -/- (其是MASP-1-足够的)人血清不具有任何杀菌活性。这些结果表明在人20% (v/v)血清中的脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤是MASP-3-和MBL-依赖性的。表8提供图14的Student's t-检验结果。
表8：图14的Student's t-检验结果
比较 时间点(min) 平均差(Log) 显著性? P<0.05? P值概述
A vs B 60 -0.8325 是 ***(p<0.0001)
A vs B 90 -1.600 是 ***(p<0.0001)
A vs C 60 -1.1489 是 ***(p<0.0001)
A vs C 90 -1.822 是 ***(p<0.0001)
A vs D 60 -1.323 是 ***(0.0005)
A vs D 90 -2.185 是 ***(p<0.0001)
总之，图14和表8所示结果表明在20%人血清中的脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤是MASP-3-和MBL-依赖性的。
3. 在缺乏MASP-2、MASP-1/3或MBL A/C的20% (v/v)小鼠血清中，脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤。
以下补体-缺乏的小鼠血清和对照小鼠血清用于本实验：
表9：所测试的小鼠血清样品(如图15所示)
样品 血清类型
A WT
B MASP-2 -/-
C MASP-1/3 -/-
D MBL A/C -/-
E WT热灭活的(HIS)
在37℃并伴随振荡，脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58与不同的补体-缺乏的小鼠血清(各自的血清浓度为20%)一起孵育。在以下时间点采集样品：0-、15-、30-、60-、90-和120-分钟间隔，倒平板，然后测定活菌计数。热灭活的人血清用作阴性对照。
结果：
图15图示表示在表9所示的小鼠血清样品中，在不同时间点回收的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B-MC58的活菌计数的log cfu/mL。如图15所示，MASP-2 -/-小鼠血清与WT小鼠血清相比，对脑膜炎奈瑟氏菌具有更高水平的杀菌活性。相比之下，MASP-1/3 -/-小鼠血清没有任何杀菌活性。符号“**”表示p=0.0058，符号“***”表示p=0.001。表10提供图15的Student's t-检验结果。
表10：图15的Student's t-检验结果
比较 时间点 平均差(LOG) 显著性? (p<0.05)? P值概述
A vs. B 60 min. 0.39 是 ** (0.0058)
A vs. B 90 min. 0.6741 是 *** (0.001)
总之，本实施例的结果证明与WT血清相比，MASP-2 -/-血清对脑膜炎奈瑟氏菌具有更高水平的杀菌活性，并且20%血清中的脑膜炎奈瑟氏菌的补体-依赖性杀伤是MASP-3-和MBL-依赖性的。
实施例4
本实施例描述了一系列实验，进行这些实验以确定在如实施例1-3所述的MASP-2 KO小鼠中观察到的针对脑膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-3-依赖性抵抗的机制。
原理：
为了测定在MASP-2 KO小鼠中观察到的针对脑膜炎奈瑟氏菌感染的MASP-3-依赖性抵抗(在以上实施例1-3中所述)的机制，如下进行了一系列实验。
1. MASP-1/3-缺陷型小鼠不缺乏凝集素途径功能活性(也称为“LEA-2”)
方法：
为了测定MASP-1/3-缺陷型小鼠是否缺乏凝集素途径功能活性(也称为LEA-2)，进行测定以检测在凝集素活化途径-特异性测定条件(1%血浆)下测定的在来自不同补体-缺陷型小鼠品系的血清中的C3转化酶活性的动力学，例如描述于Schwaeble W.等人, PNAS第108(18)卷:7523-7528 (2011)，通过引用结合到本文中。
测试来自WT、C4-/-、MASP-1/3-/-；B因子-/-和MASP-2-/-小鼠的血浆，如下所述。
为了测定C3活化，用含甘露聚糖(1 μg/孔)、酵母聚糖(1 μg/孔)的包被缓冲液(15 mM Na2Co3, 35 mM NaHCO3)或免疫复合物包被微量滴定板，所述免疫复合物通过用含1%人血清白蛋白(HSA)的包被缓冲液来包被，然后加入含绵羊抗HAS血清(2 μg/mL)的TBS (10mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4)和0.05% Tween 20和5 mM Ca++原位产生。将各板用含0.1% HAS的TBS封闭并用TBS/Tween 20/ Ca++洗涤3次。血浆样品在4 mM巴比妥、145 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2 (pH 7.4)中稀释，加入到各板并在37℃孵育1.5 h。洗涤后，使用兔抗人C3c (Dako)、接着是碱性磷酸酶-缀合的山羊抗兔IgG和磷酸对硝基苯酯，测定结合的C3b。
结果：
在凝集素途径-特异性条件下的C3活化动力学(通过C3b沉积在甘露聚糖-包被的板上而测定，用1%血清)见图16。在MASP-2-/-血浆中未见C3切割。B因子-/- (B因子-/-)血浆以WT血浆的一半的速率切割C3，可能是因为扩增环的缺乏。在C4-/-中(T1/2=33min)以及在MASP-1/3-/-缺乏的血浆(T1/2=49 min)中，在C3向C3b的凝集素途径-依赖性转化中观察到明显延迟。这种在MASP-1/3 -/-血浆中的C3活化的延迟已被证明是MASP-1-依赖性的，而非MASP-3-依赖性的(参见Takahashi M.等人, J Immunol 180:6132-6138 (2008))。这些结果证明MASP-1/3-缺陷型小鼠不缺乏凝集素途径功能活性(也称为“LEA-2”)。
2. 遗传性MASP-3缺陷对替代途径活化的影响。
原理：
通过测定MASP-3-缺乏的3MC综合征(因编码MASP-3丝氨酸蛋白酶的外显子中的移码突变所致)患者的血清，测定遗传性MASP-3缺陷对替代途径活化的影响。3MC综合征是覆盖Carnevale、Mingarelli、Malpuech和Michels综合征的统一术语。这些罕见的常染色体隐性病症表现出发育特征谱，包括特征性面部畸形、唇裂和/或腭裂、颅缝早闭、学习障碍以及生殖器、肢体和膀胱肾异常。Rooryck等人, Nature Genetics 43:197-203 (2011)研究了11个3MC综合征家族并鉴定了2个突变基因：COLEC11和MASP-1。MASP-1基因中的突变使得编码MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域的外显子而非编码MASP-1的丝氨酸蛋白酶的外显子功能失调。因此，在编码MASP-3的丝氨酸蛋白酶的外显子中具有突变的3MC患者缺乏MASP-3，但MASP-1却足够。
方法：
MASP-3-缺乏的血清得自3MC患者、3MC患者的父母(两者是携带突变的等位基因的杂合体，所述突变使编码MASP-3丝氨酸蛋白酶结构域的外显子功能失调)以及得自C4-缺陷型患者(在两种人C4基因中缺陷)和MBL-缺陷型受试者。如Bitter-Suermann等人, Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981))所述，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上，在0.5至25%血清浓度范围内，在传统的AP-特异性条件(BBS/Mg++/EGTA, 无Ca++, 其中BBS =含有蔗糖的巴比妥缓冲盐水)下进行替代途径测定，并且随时间测定C3b沉积。
结果：
图17图示表示在得自MASP-3-缺陷型、C4-缺陷型和MBL-缺陷型受试者的血清样品中，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的替代途径-驱动的C3b沉积水平随血清浓度的变化。如图17所示，MASP-3-缺陷型患者血清在高血清浓度(25%、12.5%、6.25%血清浓度)时具有残留的替代途径(AP)活性，但显著更高的AP50 (即需要9.8%血清以达到50%最大C3沉积)。
图18图示表示在得自MASP-3-缺陷型、C4-缺陷型和MBL-缺陷型人类受试者的10%人血清样品中，在“传统的”替代途径-特异性(AP-特异性)条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的替代途径-驱动的C3b沉积水平随时间的变化。
下表11概述了图17所示的AP50结果和图18所示的C3b沉积的一半时间。
表11：图17和18中所示结果的概述
血清类型 AP50 (%) T1/2 (min)
MASP-3-缺陷型(3MC患者) 9.8 37.4
3MC受试者的母亲(杂合子) 4.3 17.2
3MC受试者的父亲(杂合子) 4.3 20.9
C4-缺陷型 4.0 11.6
MBL-缺陷型 4.8 11.0
注意：在BBS/Mg++/EGTA缓冲液中，凝集素途径-介导的作用缺乏，因为在该缓冲液中缺乏Ca++。
尽管不希望受到任何特定理论的束缚，认为在MASP-3-缺乏的血清中所见的较低的替代途径活性是因为3MC患者在其血清中具有活性D因子所致，并且因为该患者仍然表达MASP-1和HTRA1，所以前D因子的转化在MASP-3不存在时仍然可以发生，尽管在较低水平。
3. 在缺乏MASP-2或MASP-1/3的小鼠血清中，测定在甘露聚糖、酵母聚糖和肺炎链球菌D39上的C3b沉积。
方法：
在甘露聚糖、酵母聚糖和肺炎链球菌D39-包被的微量滴定板上测定C3b沉积，使用得自MASP-2-/-、MASP-1/3-/-和WT小鼠的浓度范围0%至20%的小鼠血清。在“传统的”替代途径-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)，或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(即BBS/Mg++/Ca++)下，进行C3b沉积测定。
结果：
图19A图示表示在得自WT、MASP-2-缺陷型和MASP-1/3-缺陷型小鼠的血清样品中，在传统的替代途径-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在甘露聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平随血清浓度的变化。图19B图示表示在得自WT、MASP-2-缺陷型和MASP-1/3-缺陷型小鼠的血清样品中，在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平随血清浓度的变化。图19C图示表示在得自WT、MASP-2-缺陷型和MASP-1/3-缺陷型小鼠的血清样品中，在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在肺炎链球菌D39-包被的微量滴定板上的C3b沉积水平随血清浓度的变化。
图20A图示表示在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，在甘露聚糖-包被的微量滴定板上进行的在高度稀释的血清中的C3b沉积测定结果，使用血清浓度范围为0%至1.25%。图20B图示表示在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/EGTA/Mg++/Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上进行的C3b沉积测定结果，使用血清浓度范围为0%至1.25%。图20C图示表示在传统的AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/EGTA/Mg++/Ca++)下，在肺炎链球菌D39-包被的微量滴定板上进行的C3b沉积测定结果，使用血清浓度范围为0%至1.25%。
如图20A-C所示，还在传统的替代途径-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)或在允许凝集素途径和替代途径两者起作用的生理条件(BBS/Mg++/Ca++)下，进行C3b沉积测定，使用更高稀释度范围为0%至1.25%血清，在甘露聚糖-包被的板(图20A)；酵母聚糖-包被的板(图20B)和肺炎链球菌D39-包被的板上(图20C)。在更高血清稀释度下替代途径逐渐消失，使得在Ca++存在时在MASP-1/3-缺乏的血清中观察到的活性是MASP-2-介导的LP活性，并且在Ca++存在时在MASP-2-缺乏的血清中的活性是MASP-1/3-介导的AP残留活化。
讨论：
本实施例中所述的结果表明，MASP-2抑制剂(或MASP-2 KO)通过促进MASP-3-驱动的替代途径活化而提供免于脑膜炎奈瑟氏菌感染的显著保护作用。小鼠血清溶菌测定和人血清溶菌测定的结果进一步证明，通过监测针对脑膜炎奈瑟氏菌的血清杀菌活性，在MBL-缺陷型(小鼠MBL A和MBL C双重-缺陷型和人MBL-缺陷型血清)中，针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌活性不存在。
图1基于本文提供的结果，说明了对凝集素途径和替代途径的新的理解。图1描绘了LEA-2在调理作用和细胞溶解中的作用。尽管MASP-2在多个生理性的凝集素-依赖性环境中是“下游”C3b沉积(和所导致的调理作用)的引发剂(图20A、20B、20C)，但它在血清-敏感性细菌的溶菌中也起作用。如图1所示，对于血清-敏感性病原体例如脑膜炎奈瑟氏菌，所提出的负责MASP-2-缺乏的或MASP-2-耗尽的血清/血浆的增加的杀菌活性的分子机制就是，对于细菌的溶菌，与MASP-1和MASP-3缔合的凝集素途径识别复合物必须彼此靠近地结合到细菌表面上，从而允许MASP-1切割MASP-3。与MASP-1和MASP-2相反，MASP-3不是自我活化的酶，但是在许多情况下，需要被MASP-1活化/切割而转化为其酶促活性形式。
进一步如图1所示，活化的MASP-3然后可以切割病原体表面上的C3b-结合的B因子，通过分别形成酶促活性替代途径C3和C5转化酶C3bBb和C3bBb(C3b)n而启动替代活化级联。携带MASP-2的凝集素-途径活化复合物不参与MASP-3活化，并且，在MASP-2不存在时或耗尽后，所有凝集素途径活化复合物将会装载MASP-1或装载MASP-3。因此，在MASP-2不存在时，在微生物表面携带MASP-1和MASP-3的凝集素-途径活化复合物将彼此靠近的可能性明显增加，导致更多MASP-3被活化，从而导致MASP-3-介导的C3b-结合的B因子切割的更高速率，在微生物表面形成替代途径C3和C5转化酶C3bBb和C3bBb(C3b)n。这导致末端活化级联C5b-C9的活化，形成膜攻击复合物，其是由表面-结合的C5b与C6缔合、C5bC6与C7缔合、C5bC6C7与C8缔合和C5bC6C7C8组成，导致C9聚合，其插入到细菌表面结构并在细菌壁中形成小孔，其将导致补体-靶向的细菌的渗透压杀伤。
这一新概念的核心就是本文提供的数据清楚地显示了凝集素途径活化复合物驱动以下两个不同的活化途径，如图1所示。
实施例5
本实施例表明MASP-2缺乏和/或MASP-3缺乏对得自阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)小鼠模型的血液样品的红细胞溶解的抑制性作用。
背景/原理：
阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)，也称为Marchiafava-Micheli综合征，是一种获得性的、可能危及生命的血液病，特征在于补体-诱导的血管内溶血性贫血。PNH的标志是慢性补体-介导的血管内溶血，这是PNH红细胞上缺乏补体调节剂CD55和CD59所致的补体替代途径的未经调节的活化的结果，随后是血红蛋白尿和贫血。Lindorfer, M.A.,等人, Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011)。PNH中的贫血是因为血流中的红细胞破坏所致。PNH的症状包括血尿(因尿中可见血红蛋白)、背痛、疲劳、呼吸短促和血栓形成。PNH可以自发产生，称为“原发性PNH”或在其它骨髓病症例如再生障碍性贫血的情况下发生，称为“继发性PNH”。PNH的治疗包括对付贫血的输血，对付血栓形成的抗凝，和使用单克隆抗体eculizumab (Soliris?)，该抗体保护血细胞免于因抑制补体系统所致的免疫破坏(Hillmen P.等人, N. Engl. J. Med. 350(6):552-9 (2004))。eculizumab (Soliris?)是人源化单克隆抗体，其靶向补体成分C5，封闭其被C5转化酶切割，从而阻止C5a的产生和MAC的装配。用eculizumab治疗PNH患者，在大约半数患者中导致血管内溶血减少(经乳酸脱氢酶(LDH)测定)，导致血红蛋白稳定化和输血非依赖性(Hillmen P,等人, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011))。尽管经历eculizumab治疗的几乎所有患者都达到正常或几乎正常的LDH水平(因为控制了血管内溶血)，但仅有大约三分之一的患者的血红蛋白值达到大约11gr/dL，接受eculizumab的其余患者以大约相同比例继续表现出中度至严重(即输血-依赖性的)贫血(Risitano A.M.等人, Blood 113:4094-100 (2009))。正如Risitano等人, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011)所述，已经证明接受eculizumab的PNH患者含有与他们的大部分PNH红细胞结合的C3片段(而未经治疗的患者则没有)，导致以下结论：膜-结合的C3片段作为调理素对PNH红细胞起作用，导致它们通过特异性C3受体而被网罗到网状内皮细胞中并且随后导致血管外溶血。因此，对于发生C3-片段-介导的血管外溶血的那些患者，需要除了使用eculizumab之外的治疗策略，因为他们继续需要输入红细胞。
本实施例描述了评价MASP-2-和MASP-3-缺乏的血清对得自PNH小鼠模型的血液样品的红细胞溶解的作用的方法，并且证明了MASP-2抑制和/或MASP-3抑制对治疗PNH受试者的功效，并且还支持在经历C5抑制剂例如eculizumab治疗的PNH受试者中使用MASP-2抑制剂和/或MASP-3抑制剂(包括双重或双特异性MASP-2/MASP-3抑制剂)以改善C3片段-介导的血管外溶血的作用。
方法：
PNH动物模型:
血液样品得自具有Crry和C3缺陷(Crry/C3-/-)的基因靶向小鼠和CD55/CD59-缺陷型小鼠。这些小鼠丢失了其红细胞上的各自的表面补体调节剂，因此这些红细胞易于发生自发补体自我溶解，如同PNH人红细胞那样。
为了进一步敏化这些红细胞，使用这些细胞，用或不用甘露聚糖包被，然后在WT C56/BL6血浆、无MBL血浆、MASP-2 -/-血浆、MASP-1/3 -/-血浆、人NHS、人MBL -/-血浆和用人MASP-2抗体处理的NHS中测试其溶血。
1. 在MASP-2-缺乏的/耗尽的血清和对照中，Crry/C3和CD55/CD59双重-缺陷型鼠红细胞的溶血测定
第一天。鼠RBC的制备(±甘露聚糖包被)。
材料包括：新鲜小鼠血液，BBS/Mg++/Ca++ (4.4 mM巴比妥酸、1.8 mM巴比妥钠、145 mM NaCl、pH 7.4, 5mM Mg++、5mM Ca++)、氯化铬、CrCl3·6H20 (0.5mg/mL在BBS/Mg++/ Ca++中)和甘露聚糖，100 μg/mL在BBS/Mg++/Ca++中。
在4℃冷冻离心机中在2000xg将全血(2 mL)离心1-2 min。吸去血浆和血沉棕黄层。然后通过将RBC沉淀物重悬于2 mL冰冷的BBS/明胶/Mg++/Ca++中并重复离心步骤，将样品洗涤3次。第3次洗涤后，将沉淀物重悬于4 mL BBS/Mg++/Ca++中。将2 mL等分试样的RBC留出，作为未包被对照。向剩余的2 mL中加入2 mL CrCl3和2 mL 甘露聚糖，并将样品在室温下孵育并温和搅拌5min。反应通过加入7.5 mL BBS/明胶/Mg++/Ca++而终止。将样品如上所述地离心，重悬于2 mL BBS/明胶/Mg++/Ca++和如上所述地再洗涤2次，然后贮存于4℃。
第二天。溶血测定
材料包括BBS/明胶/Mg++/Ca++ (如上)、测试血清、96-孔圆底和平底板和分光光度计，其在410-414 nm处阅读96孔板。
首先测定RBC浓度并将细胞调整至109/mL，并在此浓度下贮存。使用前，将细胞在测定缓冲液中稀释至108/mL，然后使用100 ul每孔。在410-414 nm处(允许比541nm更高的灵敏度)测定溶血。在冰冷的BBS/明胶/Mg++/Ca++中制备测试血清稀释液。将100μl每种血清稀释液移入圆底板中。加入100 μl适当稀释的RBC制备物(即108/mL)，在37℃孵育大约1小时，并观察溶血。(此时可对各板拍照。)然后将板在最大速率离心5分钟。吸出100 μl液相，移至平底板中，并在410-414 nm处记录OD。保留RBC沉淀物(这些可以在随后用水溶解，以得到相反结果)。
实验#1
新鲜血液得自CD55/CD59双重-缺陷型小鼠，并且如以上方案详述，制备Crry/C3双重-缺陷型小鼠的血液和红细胞。将细胞分开，一半细胞用甘露聚糖包被，另一半不处理，调节终浓度至108/mL，其中100 μl用于溶血测定，所述测定如上所述地进行。
实验#1的结果: 在PNH动物模型中，凝集素途径参与红细胞溶解
在初步实验中，已经确定非-包被的WT小鼠红细胞在任何小鼠血清中都不溶解。进一步确定了甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞在WT小鼠血清中缓慢溶解(在37度时超过3小时)，但它们在无MBL血清中不溶解(数据未显示)。
已经确定甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞在人血清中快速溶解，但在热灭活的NHS中不溶解。重要的是，甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞在稀释至1/640的NHS中溶解(即1/40、1/80、1/160、1/320和1/640稀释度中全都溶解) (数据未显示)。在这一稀释度中，替代途径不起作用(AP功能活性在低于8%血清浓度中显著降低)。
实验#1的结论
甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞在具有MBL的高度稀释的人血清中溶解得非常好，但在无MBL的高度稀释的人血清中不溶解。在所测的各个血清浓度中的有效溶解暗示替代途径不参与这种溶解或这种溶解无需替代途径。MBL-缺乏的小鼠血清和人血清不能溶解甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞，表明经典途径对所观察的溶解也不起作用。因为需要凝集素途径识别分子(即MBL)，所以这种溶解是由凝集素途径介导。
实验#2
新鲜血液得自Crry/C3和CD55/CD59双重-缺陷型小鼠，并且在如上所述的溶血测定中，在以下人血清存在时，分析甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞：MASP-3 -/-；无MBL；WT；用人MASP-2抗体预处理的NHS；和热灭活的NHS作为对照。
实验#2的结果：在PNH动物模型中，MASP-2抑制剂和MASP-3缺陷阻止红细胞溶解
将甘露聚糖-包被的Crry-/-小鼠红细胞与以下一起孵育：在稀释至1/640的NHS稀释液中(即1/40、1/80、1/160、1/320和1/640)、人MBL-/-血清、人MASP-3-缺乏的血清(来自3MC患者)和用MASP-2 mAb预处理的NHS、和热灭活的NHS作为对照。
离心ELISA微量滴定板并在圆孔板底部收集非-溶解的红细胞。收集各孔的上清液，并通过在ELISA读板器中读取OD415 nm而测定从溶解的红细胞中释放的血红蛋白量。
观察到MASP-3-/-血清完全不溶解甘露聚糖-包被的小鼠红细胞。在对照热灭活的NHS (阴性对照)中，正如所料，未见溶解。MBL-/-人血清在1/8和1/16稀释度溶解甘露聚糖-包被的小鼠红细胞。MASP-2-抗体-预处理的NHS在1/8和1/16稀释度溶解甘露聚糖-包被的小鼠红细胞，而WT人血清在低至1/32稀释度溶解甘露聚糖-包被的小鼠红细胞。
图21图示表示在来自MASP-3-/-、热灭活的(HI) NHS、MBL-/-、用MASP-2抗体预处理的NHS和NHS对照的血清中，一系列血清稀释度的人血清使甘露聚糖-包被的鼠红细胞溶血(通过溶解的小鼠红细胞(Crry/C3-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)。
图22图示表示在来自MASP-3-/-、热灭活的(HI) NHS、MBL-/-、用MASP-2抗体预处理的NHS和NHS对照的血清中，一系列血清浓度的人血清使甘露聚糖-包被的鼠红细胞溶血(通过溶解的小鼠红细胞(Crry/C3-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)。
根据图21和22所示的结果，证明了抑制MASP-3将会阻止任何补体-介导的敏化红细胞的溶解，所述红细胞缺乏来自自体补体活化的保护作用。MASP-2抗体对MASP-2的抑制显著地改变了CH50并在某种程度上具有保护性，但MASP-3抑制更有效。
实验#3
在如上所述的溶血测定中，在以下血清存在时分析得自Crry/C3和CD55/CD59双重-缺陷型小鼠的新鲜血液的非-包被的Crry-/-小鼠红细胞：MASP-3-/-；MBL-/-；WT；用人MASP-2抗体预处理的NHS；和热灭活的NHS作为对照。
结果：
图23图示表示在一系列血清浓度的来自3MC (MASP-3-/-)患者、热灭活的(HI) NHS、MBL-/-,用MASP-2抗体预处理的NHS和NHS对照的人血清中，非-包被的鼠红细胞的溶血(通过溶解的WT小鼠红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)。如图23所示和表12所概述的，证明了抑制MASP-3抑制补体-介导的非-敏化的WT小鼠红细胞的溶解。
图24图示表示在来自热灭活的(HI) NHS、MBL-/-、用MASP-2抗体预处理的NHS和NHS对照的人血清中，一系列血清浓度的人血清使非-包被的鼠红细胞溶血(通过溶解的小鼠红细胞(CD55/59-/-)的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)。如图24所示和表12所概述的，证明了抑制MASP-2在有限程度上具有保护性。
表12：表示为血清浓度的CH50值
血清 WT CD55/59 -/-
3MC患者 不溶解 不溶解
热灭活的NHS 不溶解 不溶解
MBL AO/XX供体(MBL缺陷型) 7.2% 2.1%
NHS + MASP-2抗体 5.4% 1.5%
NHS 3.1% 0.73%
注意：“CH50”是补体-介导的溶血达到50%的点。
总之，本实施例的结果证明了抑制MASP-3阻止任何补体的敏化和非-敏化红细胞的溶解，所述红细胞缺乏来自自体补体活化的保护作用。MASP-2抑制在某种程度上也具有保护性。因此，MASP-2和MASP-3的抑制剂单独或联用(即共同给予、序贯给予)或MASP-2/MASP-3双特异性或双重抑制剂可以用于治疗PNH受试者，并且还可用于在经历用C5抑制剂例如eculizumab (Soliris?)的治疗的PNH患者中改善(即抑制、阻止或降低其严重程度)血管外溶血。
实施例6
本实施例描述了溶血测定，在WT或MASP-1/3-/-小鼠血清存在时测定了甘露聚糖-包被的兔红细胞的溶解。
方法：
1. 在小鼠MASP-1/3-缺陷型血清和WT对照血清中对兔RBC (甘露聚糖包被的)的溶血测定
第一天。兔RBC的制备。
材料包括：新鲜兔血、BBS/ Mg++/Ca++ (4.4 mM巴比妥酸、1.8 mM巴比妥钠、145 mM NaCl、pH 7.4、5 mM Mg++、5 mM Ca++)、含0.1%明胶的BBS/ Mg++/Ca++、含氯化铬的缓冲液即CrCl3.6 H2O (0.5 mg /mL在BBS/ Mg++/Ca++中)和甘露聚糖，100 μg/mL在BBS/ Mg++/Ca++中。
1. 将兔全血(2 mL)分到2个1.5 mL微量离心管中并在4℃冷冻微量离心机中在8000 rpm (大约 5.9 rcf)离心3分钟。重悬于冰冷的BBS/Mg++/Ca++后，将RBC沉淀物洗涤3次。第3次洗涤后，将沉淀物重悬于4 mL BBS/Mg++/Ca++中。将2 mL该等分试样加入到15-mL falcon管中，用作未包被对照。将剩余的2 mL RBC等分试样在2 mL CrCl3缓冲液中稀释，加入2 mL甘露聚糖溶液并将悬液在室温下孵育5分钟，同时温和搅拌。通过向该混合物中加入7.5 mL BBS/0.1%明胶/Mg++/Ca++而终止反应。将红细胞沉淀，并如上所述地用BBS/0.1%明胶/Mg++/Ca++将RBC洗涤2次。将RBC悬液在4℃贮存于BBS/0.1%明胶/ Mg++/Ca++中。
2. 100 μl悬浮的RBC用1.4 mL水稀释并在8000 rpm (大约 5.9 rcf)离心3分钟，将上清液在541nm处的OD调节至0.7 (在541nm处的OD为0.7，相当于大约109红细胞/mL)。
3. 将重悬的RBC用BBS/0.1%明胶/Mg++/Ca++稀释至浓度为108 /mL。
4. 在冰冷的BBS/明胶/Mg++/Ca++中制备测试血清稀释液，并将100μl每种血清稀释液移入圆底板的相应孔中。加入100 μl适当稀释的RBC (即108/mL)到各孔中。作为完全溶解的对照，将纯净水(100 μL)与稀释RBC (100 μL)混合，导致100%溶解，而BBS/0.1%明胶/ Mg++/Ca++无血清(100 μL)用作阴性对照。然后将板在37℃孵育1小时。
5. 将圆底板在3250 rpm离心5分钟。将来自各孔的上清液(100 μL)移至平底板的相应孔中并在ELISA读板器中在415-490处读取OD。结果报告为在415 nm处的OD与在490 nm处的OD之比。
结果：
图25图示表示在来自MASP-1/3-/-和WT对照的血清中，一系列血清浓度的小鼠血清使甘露聚糖-包被的兔红细胞溶血(通过溶解的兔红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)。如图25所示，证明了抑制MASP-3阻止补体-介导的甘露聚糖-包被的WT兔红细胞的溶解。这些结果进一步支持使用MASP-3抑制剂来治疗如实施例5所述的PNH的一个或多个方面。
实施例7
本实施例说明了在D因子-缺乏的血清中在Ca++存在时替代途径被活化。
实验#1：在替代途径特异性条件下，C3b沉积测定
方法：
在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的C3b沉积测定，在替代途径-特异性条件(BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下进行，使用以下小鼠血清的递增稀释度：D因子-/-；MASP- -/-；和WT。
结果：
图26图示表示在替代途径特异性条件下进行的C3沉积测定中，在来自D因子-/-；MASP-2 -/-；和WT小鼠血清的血清样品中，C3b沉积水平(OD 405 nm)随血清浓度的变化。如图26所示，在这些条件下，D因子-/-小鼠血清完全不活化C3并且替代途径不起作用。MASP-2-/-血清显示了替代途径以与WT血清类似的速率而活化。这些结果证实，在Ca++不存在时，D因子是C3b沉积所需的。这与MASP-3在这些条件下不能转化为其酶促活性形式的证据是相符的，因为MASP-1、MASP-3活化酶和MASP-3与其各自的碳水化合物识别成分的相互作用是Ca++-依赖性的。
实验#2：在生理条件下的C3b沉积测定
方法：
在生理条件下(BBS/Ca++/Mg++) (同时允许LP和AP起作用)进行C3b沉积测定，使用以下小鼠血清的递增稀释度：D因子-/-；MASP-2 -/-；和WT。
结果：
图27图示表示在生理条件下(在Ca++存在时)进行的C3b沉积测定中，使用来自D因子-/-；MASP-2-/-和WT小鼠血清的样品，C3b沉积水平(OD 405 nm)随血清浓度的变化。如图27所示，D因子-/-小鼠血清同时经由凝集素和替代途径而活化C3，与指定血清稀释度的WT血清相比无差异。MASP- -/-血清显示了在较低血清稀释度中，仅通过替代途径(即MASP-3-驱动的替代途径活化)的C3的周转。这些结果表明在Ca++存在时，鉴于MASP-3可以驱动替代途径活性，D因子是不需要的。
实验#3：使用B因子或D因子缺乏的小鼠血清，在MASP-2 mAb存在或不存在时的C3b沉积测定
方法：
在生理条件下(BBS/Ca++/Mg++)，在甘露聚糖包被的微量滴定板上如下所述地进行C3b沉积测定：
1. 微量滴定ELISA板用含甘露聚糖(1 μg/mL)的包被缓冲液(15 mM Na2CO3、35 mM NaHCo3、0.02%叠氮化钠，pH 9.6)在4℃包被过夜。
2. 次日，剩余蛋白结合位点用含0.1% HSA的BBS (4 mM 巴比妥、145 mM NaCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2，pH 7.4)以250 μl/孔，在室温下封闭2小时。
3. 用洗涤缓冲液(含0.05% Tween 20和5 mM CaCl2的TBS)将各板洗涤3次。
4. 在指定时间点，将在BBS中1:10稀释的血清样品加入到各孔。仅加入缓冲液的孔作为阴性对照。将板在37℃孵育至多40分钟。
5. 然后各板用洗涤缓冲液洗涤3次。
6. 然后将在洗涤缓冲液中1:5000稀释的100 μl兔抗人C3c (Dako)加入孔中并将各板在37℃孵育90分钟。
7. 用洗涤缓冲液洗涤3次后，将在洗涤缓冲液中1:5000稀释的100 μl 碱性磷酸酶-缀合的抗兔加入孔中，然后在室温下孵育90分钟。
8. 洗涤后，通过加入100 μl底物溶液来检测碱性磷酸酶。
9. 孵育15分钟后，在OD 405 nm测量光密度。
结果：
图28图示表示在生理条件下(在Ca++存在时)进行的C3b沉积测定中，在得自D因子-/-或B因子-/-小鼠的小鼠血清样品中，在MASP-2 mAb存在或不存在时，C3b沉积水平(OD 405 nm)随血清孵育时间(分钟)的变化。如图28所示，在WT和D因子-/-血清中，C3b沉积量没有差异，为以下结论提供强烈支持：MASP-3可以启动替代途径活化，甚至在D因子不存在时。认为所观察到的信号是因为凝集素途径和替代途径同时活化所致。进一步如图28所示，D因子-/-加MASP-2 mAb显示了仅MASP-3-介导的替代途径活化。B因子-/-加MASP-2 mAb仅是背景(数据未显示)。热灭活的血清用作背景对照值，其与D因子-/-以及B因子-/-和MASP-2相同(数据未显示)。
总之，本实施例的结果证明，仅在非-生理条件下(即当在BBS/EGTA/ Mg++ 中在Ca++不存在时测定替代途径活化时)才需要D因子。相比之下，当在生理条件下(在Ca++存在时)测试替代途径活化时(其允许经由MASP-3活化替代途径)，与WT对照相比，D因子-缺乏的血清完全不缺乏替代途径活性。因此，在生理条件下，D因子是过剩的，所以替代途径活化的启动是由MASP-3驱动。这些结果支持以下结论：凝集素途径通过MASP-3-依赖性活化事件而指导AP活化。
实施例8
本实施例描述了生产针对人MASP-1、MASP-2或MASP-3多肽的鼠单克隆抗体的示例性方法，以及产生双重、双特异性或泛特异性MASP抗体的示例性方法。
1. 产生MASP抗体的方法
雄性A/J小鼠(Harlan, Houston, Tex.)，8至12周龄，经皮下注射在200 μl磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4中的完全弗氏佐剂(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)中的100 μg人全长多肽：rMASP-1 (SEQ ID NO:10)、rMASP-2 (SEQ ID NO:5)或rMASP-3 (SEQ ID NO:8)或例如表2中所示的其抗原片段。2周后，小鼠经皮下注射在不完全弗氏佐剂中的50 μg所述人多肽。在第6周，给小鼠注射在PBS中的50 μg所述人多肽，并在4天后融合。
对于每次融合，从经免疫的小鼠脾脏制备单细胞悬液，用于与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。将5x108 Sp2/0和5x108脾细胞在含有50%聚乙二醇(分子量1450) (Kodak, Rochester, N.Y.)和5%二甲亚砜(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)的培养基中进行融合。然后将细胞调节到每200 μl的Iscove培养基(Gibco, Grand Island, N.Y.)悬液1.5x105脾细胞的浓度，所述培养基中补充有10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100 μg/mL链霉素、0.1mM次黄嘌呤、0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷。将200微升细胞悬液加到大约二十个96孔微量培养板的各孔中。大约10天后，取出培养上清液，用于在ELISA测定法中筛选与靶纯化抗原(MASP-1、MASP-2或MASP-3或表2的抗原片段)的反应性。
ELISA测定法(参照MASP-2描述)：通过加入50 μl纯化的hMASP-2 (50 ng/mL)后在室温下过夜，包被Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.)微量测定板的各孔。用于包被的低浓度MASP-2使得能够选择高亲和性抗体。在轻轻拍打培养板除去包被溶液后，将200 μl的BLOTTO (脱脂奶粉)的PBS溶液加到各孔中达1小时以封闭非特异性位点。1小时后，各孔用缓冲液PBST (含有0.05% Tween 20的PBS)洗涤。将来自各融合孔的培养物上清液(50 uL)与50 μl的BLOTTO混合，然后加到微量试验板的MASP-2-包被的各孔中。温育1小时后，各孔用PBST洗涤，然后通过加入辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗小鼠IgG (Fc特异性) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.)检测结合MASP-2的抗体。将HRP-缀合的抗小鼠IgG在BLOTTO中适当稀释以提供合适的信噪比，然后加入到每个含样品的孔中。洗涤后，用过氧化物酶底物溶液检测结合的HRP-缀合的抗体。将含有0.1% 3,3,5,5四甲基联苯胺(Sigma, St. Louis, Mo.)和0.0003%过氧化氢(Sigma)的过氧化物酶底物溶液加入孔中，显色30分钟。每孔加入50 μl 2M H2SO4终止反应，用BioTek ELISA读板器(BioTek Instruments, Winooski, Vt.)测量反应混合物在450nn的光密度。
结合测定法(参照MASP-2描述)：
在上述MASP-2 ELISA测定法中测试为阳性的培养上清液可在结合测定中进行测定，以测定MASP-2抑制剂对MASP-2的结合亲和性。也可使用类似测定法来确定抑制剂是否结合补体系统中的其它抗原。
用含MASP-2 (20ng/100μl/孔，Advanced Research Technology, San Diego, CA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS) (pH7.4)在4℃下过夜，包被聚苯乙烯微量滴定板的各孔(96孔培养基结合板，Coming Costar, Cambridge, MA)。吸出MASP-2溶液后，各孔用含有1%牛血清白蛋白(BSA; Sigma Chemical)的PBS在室温下封闭2小时。无MASP-2包被的孔用作背景对照。将在BSA PBS封闭溶液中不同浓度的杂交瘤上清液或已纯化的MASP-2 MoAb的等分溶液加到各孔中。在室温下孵育2小时之后，各孔用PBS充分漂洗。通过加入在封闭溶液中的过氧化物酶-缀合的山羊抗小鼠IgG (Sigma Chemical)并在室温下温育1小时，来检测MASP-2-结合的MASP-2 MoAb。该板用PBS再次充分漂洗后，加入100 μl 3,3',5,5' -四甲基联苯胺(TMB)底物(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)。通过加入100μl 1 M磷酸来猝灭TMB的反应，将板在微量板读板器(SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)中在450nm处读数。
然后测定来自阳性孔的培养物上清液在功能测定法(例如本文实施例9所述的C4裂解测定法)中抑制补体活化的能力。然后经有限稀释克隆阳性孔中的细胞。再在上述ELISA测定法中测定MoAb与hMASP-2的反应性。使选出的杂交瘤在转瓶中生长，收集耗尽培养物的上清液，通过A蛋白亲和色谱纯化抗体。
在C4切割测定法(例如实施例9所述)中，可以测定MASP-2抗体的LEA-2抑制活性。
尽管上述ELISA和结合测定参照MASP-2而描述，但本领域技术人员将会理解，可以使用MASP-1或MASP-3多肽和其抗原片段(例如表2所述)，进行相同的ELISA和结合测定。在C3b沉积测定(例如实施例4所述)中，在溶血测定(例如实施例5所述)中，可以测定MASP-3抗体对MASP-3底物的MASP-3丝氨酸蛋白酶切割的抑制和对LEA-1的抑制活性。在C3b沉积测定(例如实施例4所述)中和在溶血测定(例如实施例5所述)中，可以测定MASP-1抗体对MASP-1底物的MASP-1丝氨酸蛋白酶切割的抑制，对MASP-3活化的抑制和对LEA-1的抑制活性。
2. 产生双重-MASP抗体的方法
MASP-2/3双重抑制性抗体：如图4、6和7C所示，在丝氨酸蛋白酶结构域中存在MASP-2和MASP-3之间的保守区，所述丝氨酸蛋白酶结构域被SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8的β链编码。因此，可以如下产生双重MASP-2/3抗体：使用包含MASP-2 (或MASP-3)的丝氨酸蛋白酶结构域例如SEQ ID NO:5 (或SEQ ID NO:8)的β链的抗原，以产生如上所述的单克隆抗体，或者，这些抗原可以用于筛选噬菌体文库中能特异性地结合这些抗原的克隆，接着筛选与MASP-3 (或MASP-1)的双重结合。然后在功能测定(例如表2所述)中，筛选双重MASP-2/3抗体的抑制活性。
MASP-1/3双重抑制性抗体：如图3-5所示，MASP-1和MASP-3在CUBI-CCP2结构域(SEQ ID NO:10的aa 25-432)中共享相同的保守区，其也被MAp44共享。如图3所示，MAp44不含CCP2结构域。因此，如下产生双重MASP-1/3抗体(包括MAp44在内)：使用包含MASP-1 (或MASP-3)的CUBI-CCP-2结构域的抗原或由MASP-1 (或MASP-3)的CUBI-CCP-2结构域组成的抗原以产生如上所述的单克隆抗体，或者，该抗原用于筛选噬菌体文库中特异性地结合该抗原的克隆，接着筛选与MASP-3 (或MASP-1)的双重结合。使用包含MASP-1 (或MASP-3)的CCP2结构域的抗原或者由MASP-1 (或MASP-3)的CCP2结构域组成的抗原，以类似方式产生双重MASP-1/3抗体(不包括MAp44)。然后在功能测定(例如表2所述)中，筛选双重MASP-1/3抗体的抑制活性。
MASP-1/2双重抑制性抗体：如图4、6和7A所示，MASP-1和MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域含有保守区。因此，如下产生双重MASP-1/2抗体：使用包含MASP-1 (或MASP-2)的丝氨酸蛋白酶结构域的抗原或者由MASP-1 (或MASP-2)的丝氨酸蛋白酶结构域组成的抗原以产生如上所述的单克隆抗体，或者，该抗原用于筛选噬菌体文库中特异性地结合该抗原的克隆，接着筛选与MASP-2 (或MASP-1)的双重结合。然后在功能测定(例如表2所述)中，筛选双重MASP-1/2抗体的抑制活性。
3. 产生泛特异性MASP抗体的方法：
α链：在MASP-2和MASP-1/3之间的多个同一性补位表明，有可能产生与MASP-1/3和MASP-2结合的单克隆抗体。具体地讲，大部分同一性位于CUB1-EGF-CUB2结构域内，如图5所示。按照以下文献鉴定图5所示的不同结构域：Yongqing,等人, Biochemica et Biophysica Acta 1824:253-262 (2012)；Teillet等人, J. Biol. Chem. 283:25715-25724 (2008)；和Marchler-Bauer等人, Nucleic Acids Res. 39:D225-229 (2011)。
β链：在MASP-2和MASP-1/3之间的多个同一性补位，如图6所示，将会允许产生泛特异性MASP-1/2/3抑制剂。
方法：
泛特异性MASP抑制性抗体(即抑制MASP-1、2和3活性的抗体)产生如下：
1. 针对MASP-1/3和MASP-2 α-链CUB1-EGF-CUB2结构域来筛选文库并选择同时与MASP-1/3和MASP-2交叉反应的克隆。
2. 筛选克隆的抑制功能活性的能力，例如如表2所述。
3. 使用DTLacO亲和性/功能性成熟技术(Yabuki等人, PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))，以同时优化与所有三种蛋白的结合和抑制性功能。
4. 如表2所述，泛-MASP抑制剂可用于抑制LEA-1-和LEA-2-介导的补体活化。
4. 产生双特异性MASP-2/3抗体的方法
双特异性MASP-2/3抑制性抗体产生如下：
1. 已经鉴定了与CCP1结构域结合和抑制MASP-2-依赖性补体活化的示例性的MASP-2特异性抑制性抗体，如实施例11-14所述。
2. 通过针对MASP-3多肽而筛选文库和鉴定MASP-3抗体，产生MASP-3特异性抑制性抗体，如实施例15所述，接着在功能测定(例如表2所述)中测定所述抗体的LEA-1抑制活性。示例性的MASP-3抗体描述于实施例15。
3. 将对MASP-2和MASP-3具有特异性的抗原结合区克隆到框架中，以产生双特异性抗体。已经描述了多种双特异性抗体形式，包括免疫球蛋白G-样形式以及不同融合蛋白和单链可变片段结构(Holmes, Nature Reviews, Drug Discovery 10:798-800 (2011), Müller和Kontermann, Biodrugs 24:89-98 (2010))。在一个实例中，通过使表达针对两种不同抗原的抗体的两个杂交瘤融合，可以产生双特异性抗体，导致不同重链和轻链配对，其百分率包含对一种抗原具有特异性的重链和轻链，其与对另一种抗原具有特异性的重链和轻链配对(Milstein和Cuello, Nature 305:537-539 (1983))。可通过共表达2种免疫球蛋白重链/轻链对，重组产生类似的双特异性抗体，其中两条重链具有不同的特异性。具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域(例如实施例11-14所述的MASP-2抗体，实施例15所述的MASP-3抗体)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合优选与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，其包括铰链、CH2区和CH3区的至少一部分。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如有必要)免疫球蛋白轻链的DNA插入到分开的表达载体中，然后共转染到合适宿主生物体中。
除了配对的免疫球蛋白重链和轻链，对2种不同靶具有特异性的单链可变片段的连接在Kipriyanov等人, J. Mol. Biol. 293:41 (1999))中举例说明。在该实例中，将单一多核苷酸表达构建体设计为编码被接头肽间隔的两对重链和轻链的可变区，每一对分别对不同蛋白靶具有特异性。一旦表达后，该多肽以这样的结构装配：其中对一种靶具有特异性的重链和轻链对形成该蛋白的一个抗原-结合表面，而另一对形成分开的抗原-结合表面，产生称为单链双抗体的分子。根据中间的重链和轻链可变区对之间的接头长度，多肽也可被迫二聚化，导致形成串联的双抗体。
例如，可将编码以下免疫球蛋白多肽的DNA插入到一个或多个载体中并在合适宿主生物中表达，以产生以下双特异性抗体的说明性的、非限制性实例。
MASP-2/3双特异性抗体
在一个实施方案中，提供双特异性抗体，其与人MASP-2和人MASP-3结合并且包含：
(I) MASP-2特异性结合区，包含以下的至少一个或多个：a)重链可变区，包含：i)重链CDR1，包含SEQ ID NO:21的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR2，包含SEQ ID NO:21的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR3，包含SEQ ID NO:21的95-102的氨基酸序列；和/或以下的至少一个或多个：b)轻链可变区，包含：i)轻链CDR1，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR2，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR3，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的89-97的氨基酸序列；和
(II) MASP-3特异性结合区，任选MASP-3特异性结合区包含以下的至少一个：a)重链可变区，包含：i)重链CDR1，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR2，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR3，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的95-102的氨基酸序列；和
b)轻链可变区，包含：i)轻链CDR1，包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR2，包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR3，包含SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的89-97的氨基酸序列。
MASP-1/2双特异性抗体
在一个实施方案中，提供双特异性抗体，其与人MASP-1和人MASP-2结合并且包含：
(I) MASP-2特异性结合区，包含以下的至少一个或多个：a)重链可变区，包含：i)重链CDR1，包含SEQ ID NO:21的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR2，包含SEQ ID NO:21的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR3，包含SEQ ID NO:21的95-102的氨基酸序列；和/或以下的至少一个或多个：b)轻链可变区，包含：i)轻链CDR1，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR2，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR3，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的89-97的氨基酸序列；和
(II) MASP-1特异性结合区。
4. 进行针对MASP-2和/或MASP-3的功能性抑制活性的测试，例如如表2所述，和进一步如本文所述。
实施例9
本实施例描述了体外C4切割测定，用作功能性筛选，以鉴定能够经由L-纤维胶凝蛋白/P35、H-纤维胶凝蛋白、M-纤维胶凝蛋白或甘露聚糖而阻断MASP-2-依赖性补体活化的MASP-2抑制剂。
C4切割测定：C4切割测定已经描述于Petersen, S.V.,等人, J. Immunol. Methods 257:107, 2001，其检测了由结合到L-纤维胶凝蛋白的金黄色葡萄球菌上的脂磷壁酸(LTA)所致的凝集素途径活化。
试剂：福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(DSM20233)制备如下：将细菌在胰胨大豆血培养基(tryptic Soy blood medium)中于37℃培养过夜，用PBS洗涤3次，然后在室温下在PBS / 0.5%福尔马林中固定1小时，再用PBS洗涤3次后，重悬浮于包被缓冲液(15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3, pH 9.6)中。
测定：Nunc MaxiSorb微量滴定板(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)的各孔用以下成分包被：100 μl福尔马林固定的金黄色葡萄球菌DSM20233 (OD550=0.5)的包被缓冲液与1μg L-纤维胶凝蛋白的包被缓冲液。孵育过夜后，各孔用0.1%人血清白蛋白(HSA)的TBS溶液(10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4)封闭，然后用含有0.05% Tween 20和5mM CaCl2的TBS溶液(洗涤缓冲液)洗涤。将人血清样品稀释于20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4中，这防止了内源C4的活化，并使Cl复合物(由Clq、Clr和Cls组成)解离。将不同浓度的MASP-2抑制剂(包括MASP-2 MoAb)加到血清样品中。将稀释的样品加到板中，在4℃下孵育过夜。24小时后，各板用洗涤缓冲液充分洗涤，然后向各孔中加入0.1μg溶于100μl 4 mM 巴比妥、145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4中的经纯化的人C4 (按照Dodds, A.W., Methods Enzymol. 223:46, 1993所述获得)。在37℃ 1.5小时后，各板再次经洗涤，使用碱性磷酸酶-缀合的鸡抗人C4c (获自Immunsystem, Uppsala, Sweden)，检测C4b沉积，并使用比色底物磷酸对硝基苯酯进行测定。
在甘露聚糖上的C4测定：在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和甘露聚糖包被测定板，修改上述测定法以测定经由MBL的凝集素途径活化。
在H-纤维胶凝蛋白(Hakata Ag)上的C4测定：在加入与各种MASP-2抑制剂混合的血清之前，通过用LSP和H-纤维胶凝蛋白包被测定板，修改上述测定法以测定经由H-纤维胶凝蛋白的凝集素途径活化。
实施例10
下面的测定法用来通过在经典途径被免疫复合物启动的条件下分析MASP-2抑制剂的作用，从而检测MASP抑制剂是否阻断了经典途径。
方法：为了测试MASP抑制剂对补体活化条件(其中经典途径被免疫复合物启动)的影响，在10 μg/mL免疫复合物或PBS存在时，将一式三份的含有90% NHS的50 μl样品在37℃孵育，并且还包括平行的一式三份的样品(+/-免疫复合物)，其在37℃孵育期间含有200 nM抗备解素单克隆抗体。在37℃孵育2小时后，将13 mM EDTA加到所有样品中终止进一步的补体活化，并立即将样品冷却到5℃。再将样品保存于-70℃，然后按照生产商的说明书，使用ELISA试剂盒(Quidel，目录号A015和A009)进行补体活化产物(C3a和sC5b-9)的测定。
实施例11
本实施例描述了阻断MASP-2活性的高亲和性MASP-2 Fab2抗体片段的鉴定。
背景和原理：MASP-2是具有许多独立功能结构域的复杂蛋白质，包括：MBL和纤维胶凝蛋白的结合位点、丝氨酸蛋白酶催化位点、蛋白水解底物C2的结合位点、蛋白水解底物C4的结合位点、MASP-2酶原自身活化的MASP-2切割位点和两个Ca++结合位点。鉴定出与MASP-2高亲和性结合的Fab2抗体片段，并在功能测定法中测定所鉴定的Fab2片段，以确定它们是否能够阻断MASP-2功能活性。
为了阻断MASP-2功能活性，抗体或Fab2抗体片段必须结合并干扰MASP-2功能活性所需要的MASP-2上的结构表位。因此，许多或所有的高亲和性结合MASP-2 Fab2不能抑制MASP-2功能活性，除非它们结合直接参与MASP-2功能活性的MASP-2上的结构表位。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法被用来评价MASP-2 Fab2的“阻断活性”。已知MASP-2在凝集素途径中的主要生理作用是产生凝集素介导的补体途径的下一个功能成分，即凝集素途径C3转化酶。凝集素途径C3转化酶是蛋白水解切割C3成为C3a和C3b的关键酶复合物(C4bC2a)。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；然而，需要MASP-2功能活性以产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)。此外，为了使MASP-2产生凝集素途径C3转化酶，似乎需要所有上述MASP-2的独立功能活性。出于这些原因，认为用于评价抗MASP-2 Fab2的“阻断活性”优选的测定法是测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法。
高亲和性Fab2的产生：应用人可变轻链和重链抗体序列的噬菌体展示文库以及用于鉴定与所选出的目标配体反应的Fab2的自动抗体筛选技术，来产生抗大鼠MASP-2蛋白(SEQ ID NO: 13)的高亲和性Fab2。利用已知量的大鼠MASP-2 (~1 mg，纯度>85%)蛋白进行抗体筛选。利用三轮扩增以选出具有最高亲和性的抗体。挑选约250个不同的表达抗体片段的目标(hit)用于ELISA筛选。随后对高亲和性目标进行测序以确定不同抗体的独特性。
将50个独特的MASP-2抗体纯化，将250μg各经纯化的Fab2抗体用于表征MASP-2结合亲和性和补体途径功能测定，更详述如下。
用于评价MASP-2 Fab2抑制(封闭)活性的测定法
1. 测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法：
背景：凝集素途径C3转化酶是蛋白水解切割C3成为两个有效促炎片段过敏毒素C3a和调理素C3b的酶复合物(C4bC2a)。C3转化酶的形成似乎是在介导炎症方面的凝集素途径中的关键步骤。MASP-2不是凝集素途径C3转化酶(C4bC2a)的结构成分；因此，MASP-2抗体(或Fab2)不会直接抑制之前已存在的C3转化酶的活性。然而，为了产生组成凝集素途径C3转化酶的两个蛋白质成分(C4b、C2a)，MASP-2丝氨酸蛋白酶活性是必需的。因此，抑制MASP-2功能活性的MASP-2Fab2 (即阻断性MASP-2Fab2)抑制凝集素途径C3转化酶从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构的部分。在该测定法中当C3转化酶切割C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的MASP-2 Fab2抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1μg/50 μl/孔在5℃下孵育过夜。过夜孵育后，各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，在室温下孵育1小时并温和搅动。然后各孔用200μl PBS洗涤3次。在5℃，将MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB 缓冲液(4.0 mM 巴比妥，141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)至选定浓度。在5℃，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔依次用200μl PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，再用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl /孔的1: 10,000稀释的第一抗体(兔抗人C3c，DAKO A0062)，该抗体溶于含有2.0mg / ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的1:10,000稀释的第二抗体(过氧化物酶-缀合的山羊抗兔IgG, American Qualex A102PU)，该抗体溶于含有2.0mg / ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育10分钟。通过加入100 μl/孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，测定OD450。
2. 测量抑制MASP-2-依赖性C4切割的测定法
背景：MASP-2的丝氨酸蛋白酶活性是高度特异性的，仅鉴定出用于MASP-2的两种蛋白质底物：C2和C4。C4裂解产生C4a和C4b。MASP-2 Fab2可结合直接参与C4切割的MASP-2的结构表位(例如C4的MASP-2结合位点；MASP-2丝氨酸蛋白酶催化位点)，从而抑制MASP-2的C4裂解功能活性。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定MASP-2的C4切割活性的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的大鼠血清在37℃下孵育30分钟以激活凝集素途径。因为用于该ELISA测定法中的第一抗体仅识别人C4，所以稀释的大鼠血清还补充了人C4 (1.0 μg/mL)。然后洗涤各孔，采用标准ELISA方法测定固定在孔中的人C4b。在该测定法中所产生的C4b的量可衡量MASP-2-依赖性C4切割活性。在该测定法中，测定选定浓度的MASP-2 Fab2抑制C4切割的能力。
方法：将96孔Costar培养基结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 μl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的1%牛血清白蛋白的PBS溶液封闭，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤3次。在5℃，将MASP-2 Fab2样品稀释于含Ca++和Mg++的GVB 缓冲液(4.0 mM 巴比妥，141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)至选定浓度。1.0 μg/mL人C4 (Quidel)也包括在这些样品中。在5℃，将0.5%大鼠血清加到上述样品中，将100μl转移到各孔。将板盖上，在37℃水浴中孵育30分钟以允许补体活化。将板从37℃水浴转移装有冰-水混合物的容器中终止反应。各孔用200 μl PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20的PBS溶液)洗涤5次，然后各孔再用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl /孔的1:700稀释的生物素-缀合的鸡抗人C4c (Immunsystem AB, Uppsala, Sweden)，该抗体溶于含有2.0mg / ml牛血清白蛋白的PBS中，在室温下轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的0.1 μg/mL过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素(Pierce Chemical #21126)，其溶于含有2.0mg / ml BSA的PBS中，在室温下在振荡器中轻轻搅动孵育1小时。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)，在室温下孵育16分钟。通过加入100 μl /孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，并测定OD450。
3. 抗大鼠MASP-2 Fab2与“天然”大鼠MASP-2的结合测定法
背景：MASP-2通常作为还包括特异性凝集素分子(甘露糖-结合蛋白(MBL)和纤维胶凝蛋白)的MASP-2二聚体复合物存在于血浆中。因此，如果有兴趣研究MASP-2 Fab2与MASP-2生理相关形式的结合，则重要的是开发出结合测定法，其中利用的是Fab2与血浆中的“天然”MASP-2之间，而不是与纯化的重组MASP-2之间的相互作用。在该结合测定法中，先将得自10%大鼠血清的“天然”MASP-2-MBL复合物固定在甘露聚糖包被的孔内。然后采用标准ELISA方法，对各种MASP-2 Fab2与固定化“天然”MASP-2的结合亲和性进行了研究。
方法：将96孔Costar高结合板与稀释于50 mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)的甘露聚糖以1 μg/50 μl/孔在5℃下孵育过夜。各孔用200 μl PBS洗涤3次。然后各孔用100μl/孔的0.5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween 20的PBS)封闭，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液(Tris-缓冲盐水, 0.05% Tween 20, 含有5.0 mM CaCl2, pH 7.4)洗涤3次。在冰上制备10%大鼠血清的高盐结合缓冲液(20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v)牛血清白蛋白, pH 7.4)。加入100 μl/孔并在5℃孵育过夜。各孔用200 μl TBS/Tween/Ca++洗涤缓冲液洗涤3次。然后，各孔用200 μl PBS洗涤2次。加入100 μl/孔的稀释于含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM 巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)的选定浓度的MASP-2 Fab2，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入在2.0 mg/mL牛血清白蛋白的PBS中1:5000稀释的100 μl/孔的HRP-缀合的山羊抗Fab2 (Biogenesis Cat No 0500-0099)，并在室温下孵育1小时并温和搅动。各孔用200 μl PBS洗涤5次。加入100 μl/孔的过氧化物酶底物TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories)并在室温下孵育70分钟。通过加入100 μl /孔1.0 M H3PO4终止过氧化物酶反应，并测定OD450。
结果：
挑选了与大鼠MASP-2蛋白进行高亲和性反应的约250个不同的Fab2用于ELISA筛选。对这些高亲和性Fab2进行了测序以确定不同抗体的独特性，对50个独特的MASP-2抗体进行纯化，用于进一步分析。250 μg各经纯化的Fab2抗体用来表征MASP-2结合亲和性及补体途径功能测定。该分析的结果见下表13。
表13：阻断凝集素途径补体活化的MASP-2 FAB2
Fab2抗体# C3转化酶(IC50 (nM) Kd (nM) C4切割IC50 (nM)
88 0.32 4.1 ND
41 0.35 0.30 0.81
11 0.46 0.86 <2 nM
86 0.53 1.4 ND
81 0.54 2.0 ND
66 0.92 4.5 ND
57 0.95 3.6 <2 nM
40 1.1 7.2 0.68
58 1.3 2.6 ND
60 1.6 3.1 ND
52 1.6 5.8 <2 nM
63 2.0 6.6 ND
49 2.8 8.5 <2 nM
89 3.0 2.5 ND
71 3.0 10.5 ND
87 6.0 2.5 ND
67 10.0 7.7 ND
如上表13所示，在所测的50个MASP-2 Fab2中，17个被鉴定为MASP-2-阻断性Fab2，其有效抑制C3转化酶形成，IC50等于或小于10 nM Fab2 (34%阳性命中率)。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50范围为纳摩尔以下。此外，表13中所示的所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。因为甚至当各MASP-2分子被Fab2结合时，“阻断性”Fa2仅可能微弱地抑制MASP-2功能，这在理论是可能的，因此要慎重考虑。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是在大鼠血清存在的抗甘露聚糖抗体也可能激活经典途径，并且通过经典途径C3转化酶产生C3b，这在理论上是可能的。然而，在本实施例所列的17个阻断性MASP-2 Fab2中的每一个都有效地抑制了C3b产生(>95 %)，因此证明了该测定法对于凝集素途径C3转化酶的特异性。
为了计算各个Fab2的表观Kd，对所有17个阻断性Fab2都进行结合测定。对于6个阻断性Fab2，抗大鼠MASP-2 Fab2与天然大鼠MASP-2的结合测定的结果也见表13。对于其它Fab2也进行了类似的结合测定，其结果见表13。一般而言，对于6个Fab2的每一个结合“天然”MASP-2所获得的表观Kd与在C3转化酶功能测定中Fab2的IC50恰好适当对应。有证据表明，在激活其蛋白酶活性时，MASP-2经历了从“无活性”到“活性”形式的构象变化(Feinberg等人, EMBO J 22:2348-59 (2003)；Gal等人, J. Biol. Chem. 280:33435-44 (2005))。在用于C3转化酶形成测定法的正常大鼠血浆中，MASP-2主要以“无活性”酶原构象存在。相比之下，在结合测定法中，MASP-2作为与MBL (其结合到固定化甘露聚糖)的复合物的组成部分而存在；因此，MASP-2可能为“活性”构象(Petersen等人, J. Immunol Methods 257:107-16, 2001)。因此，对于这两个功能测定法中所测定的17个阻断性Fab2的每一个，可能不必预期IC50和Kd之间确切的对应性，因为在各个测定法中，Fab2可能结合不同构象形式的MASP-2。尽管如此，除了Fab2#88以外，对于两种测定法中所测的其它16个Fab2的每一个，IC50和表观Kd之间看似有相当密切的对应性(参见表13)。
对抑制MASP-2-介导的C4切割，评价若干个阻断性Fab2。如表13所示，发现所有测试的Fab2都抑制C4切割，IC50类似于C3转化酶测定法中所获得的IC50。
尽管甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂，但是大鼠血清中抗甘露聚糖抗体的存在理论上也可能激活经典途径，从而通过Cls介导的C4切割而产生C4b。然而，已经鉴定出有效抑制C4b产生(>95%)的若干MASP-2 Fab2，因此证明了该测定法对于MASP-2-介导的C4切割的特异性。C4，如同C3一样，含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当通过MASP-2切割C4时，C4b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上羟基或氨基形成共价键，因此有利于在ELISA测定法中检测C4b。
这些研究清楚表明，大鼠MASP-2蛋白的高亲和性FAB2的产生，功能性地阻断C4和C3转化酶活性，从而防止了凝集素途径活化。
实施例12
本实施例描述了对若干按照实施例11所述方法产生的阻断性抗大鼠MASP-2 Fab2抗体进行的表位作图。
方法：
使用pED4载体，在CHO细胞中表达下列所有具有N端6个His标签的蛋白质：
大鼠MASP-2A，一种全长MASP-2蛋白，通过活性中心上的丝氨酸改变为丙氨酸(S613A)而失活；
大鼠MASP-2K，经改变降低了自身活化的全长MASP-2蛋白(R424K)；
CUBI-II，一种仅含有CUB1、EGF样和CUBII结构域的大鼠MASP-2的N端片段；和
CUBI/EGF样，一种仅含有CUBI和EGF样结构域的大鼠MASP-2的N端片段。
按照前述方法将这些蛋白质通过镍-亲和层析从培养上清液中纯化出来(Chen等人, J. Biol. Chem. 276:25894-02 (2001))。
采用pTrxFus (Invitrogen)，使含有CCPII和大鼠MASP-2丝氨酸蛋白酶结构域的C端多肽(CCPII-SP)，在大肠杆菌中表达成为硫氧还蛋白融合蛋白。用Thiobond亲和树脂将蛋白质从细胞裂解物中纯化出来。硫氧还蛋白融合物配偶体由pTrxFus空载体表达作为阴性对照。
将所有重组蛋白透析到TBS缓冲液中，通过测量OD (280nm)，测得其浓度。
斑点印迹分析:
将连续稀释的上述5个重组MASP-2多肽(以及硫氧还蛋白多肽作为CCPII-丝氨酸蛋白酶多肽的阴性对照)点在硝酸纤维素膜上。蛋白质的点样量在5重步骤中的范围为100 ng至6.4 pg。在稍后的实验中，蛋白质的点样量再次在5重步骤中的范围由50 ng降至16 pg。该膜用5%脱脂奶粉的TBS溶液(封闭缓冲液)封闭，然后与1.0 μg/mL MASP-2 Fab2的封闭缓冲液(含有5.0 mM Ca++)一起温育。用HRP-缀合的抗人Fab (AbD /Serotec ；1/10,000稀释)和ECL检测试剂盒(Amersham)检测结合的Fab2。一块膜与作为阳性对照的多克隆兔抗人MASP-2Ab (参见Stover等人, J Immunol 163:6848-59 (1999))一起温育。在这种情况下，用HRP-缀合的山羊抗兔IgG (Dako；1/2,000稀释)，检测结合的Ab。
MASP-2结合测定法:
ELISA板用1.0 μg /孔的重组MASP-2A或CUBI-II多肽的碳酸盐缓冲液(pH9.0)在4℃下包被过夜。各孔用1% BSA的TBS溶液封闭，然后加入连续稀释的MASP-2 Fab2的TBS溶液(含有5.0mM Ca++)。将所述板在室温下孵育1小时。用TBS /Tween/ Ca++洗涤3次后，加入按1/10,000稀释于TBS/Ca++的HRP-缀合的抗人Fab (AbD / Serotec)，将所述板再次在室温下孵育1小时。用TMB过氧化物酶底物试剂盒(Biorad)检测结合的抗体。
结果：
斑点印迹法分析的结果表明了Fab2与下表14中提供的各种MASP-2多肽的反应性。表14提供的数值表明，所需要的蛋白质点样量提供大约最大信号强度的一半。如表所示，所有多肽(仅硫氧还蛋白融合物配偶体例外)均被阳性对照Ab (多克隆抗人MASP-2血清，在兔中产生)识别。
表14：斑点印迹法中与不同重组大鼠MASP-2多肽的反应性
Fab2抗体# MASP-2A CUBI-II CUBI/EGF-样 CCPII-SP 硫氧还蛋白
40 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
41 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
11 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
49 0.16 ng NR NR >20 ng NR
52 0.16 ng NR NR 0.8 ng NR
57 0.032 ng NR NR NR NR
58 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
60 0.4 ng 0.4 ng NR NR NR
63 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
66 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
67 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
71 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
81 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
86 0.4 ng NR NR 10 ng NR
87 0.4 ng NR NR 2.0 ng NR
阳性对照 <0.032 ng 0.16 ng 0.16 ng <0.032 ng NR
NR =无反应。阳性对照抗体是在兔中产生的多克隆抗人MASP-2血清。
所有Fab2均与MASP-2A以及MASP-2K反应(数据未显示)。大多数Fab2识别CCPII-SP多肽但不识别N端片段。Fab2#60和Fab2#57是两个例外。Fab2#60识别MASP-2A和CUBI-II片段，但不识别CUBI / EGF样多肽或CCPII-SP多肽，提示它结合CUBII的表位，或者跨越CUBII和EGF样结构域。Fab2#57识别MASP-2A但不识别任何所测试的MASP-2片段，可能表明该Fab2识别CCP1的表位。Fab2#40和#49仅结合完整的MASP-2A。在ELISA结合测定法中，Fab2#60还结合CUBI-II多肽，虽然只具有略微较低的表观亲和性(数据未显示)。
这些发现表明对于MASP-2蛋白多个区域的独特阻断性Fab2的鉴定。
实施例13
本实施例描述了如实施例11所述而鉴定的代表性的高亲和性MASP-2 Fab2抗体的药效动力学分析。
背景/原理：
如实施例11所述，为了鉴定阻断大鼠凝集素途径的高亲和性抗体，大鼠MASP-2蛋白用于淘选噬菌体展示文库。该文库经设计以提供高免疫多样化，并使用完整人免疫球蛋白基因序列来构建。如实施例11所示，通过ELISA筛选鉴定了大约250个单个噬菌体克隆，其以高亲和性与大鼠MASP-2蛋白结合。对这些克隆测序，鉴定了50个编码独特MASP-2抗体的噬菌体。从这些克隆中表达Fab2蛋白，纯化并分析MASP-2结合亲和性和凝集素补体途径功能性抑制。
如实施例11表13所示，该分析的结果是鉴定了17个具有功能阻断活性的MASP-2 Fab2 (34%命中率，对于阻断性抗体)。Fab2对凝集素补体途径的功能性抑制在C4沉积水平上是明显的，其是MASP-2对C4切割的直接度量。重要的是，当评价C3转化酶活性时，抑制同样明显，表明凝集素补体途径的功能性阻断。如实施例11所述鉴定的17个MASP-2封闭性Fab2有效抑制C3转化酶形成，IC50等于或小于10 nM。所鉴定的17个Fab2中有8个的IC50值的范围为纳摩尔以下。此外，如实施例11表13所概述，所有17个MASP-2阻断性Fab2在凝集素途径C3转化酶测定法中基本上完全抑制C3转化酶形成。此外，表13所示的17个阻断性MASP-2 Fab2的每一个有效抑制C3b产生(>95%)，因此证明了该测定法对凝集素途径C3转化酶的特异性。
大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全长抗体同种型变体衍生自Fab2 #11。本实施例描述了在体内对这些同种型的药效动力学参数的表征。
方法：
如实施例11所述，大鼠MASP-2蛋白用于淘选Fab噬菌体展示文库，从中鉴定出Fab2 #11。大鼠IgG2c和小鼠IgG2a全长抗体同种型变体衍生自Fab2 #11。在体内表征了大鼠IgG2c和小鼠IgG2a两者全长抗体同种型的药效动力学参数如下。
在小鼠中的体内研究：
在小鼠中进行药效动力学研究，以调查MASP-2抗体剂量在体内对血浆凝集素途径活性的作用。在本研究中，在凝集素途径测定法中，在经皮下(sc)和腹膜内(ip)给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb (衍生自Fab2#11的小鼠IgG2a全长抗体同种型)之后的不同时间点，离体测定C4沉积。
图29A图示表示在经皮下给予0.3 mg/kg或1.0 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后的不同时间点，采自小鼠(n=3小鼠/组)的未稀释的血清样品中离体测定的在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的凝集素途径特异性C4b沉积。在给予抗体前采自小鼠的血清样品作为阴性对照(100%活性)，在体外补充100 nM所述阻断性MASP-2抗体的血清用作阳性对照(0%活性)。
图29A所示的结果表明在经皮下给予1.0 mg/kg剂量的小鼠MASP-2 MoAb后对C4b沉积的快速和完全的抑制。在经皮下给予0.3 mg/kg剂量的小鼠MASP-2 MoAb后见到对C4b沉积的部分抑制。
在小鼠中，在单次ip给予0.6 mg/kg小鼠MASP-2 MoAb后，接着是3周的凝集素途径恢复的时间进程。如图29B所示，在给予抗体后，发生凝集素途径活性的急剧下降，接着是在i.p.给予后持续大约7天的完全的凝集素途径抑制。在第二和第三周观察到凝集素途径活性的缓慢恢复，在MASP-2 MoAb给予后17天，在小鼠中观察到完全的凝集素途径回复。
这些结果证明衍生自Fab2 #11的小鼠MASP-2 Moab当系统性递送时以剂量-反应方式抑制小鼠的凝集素途径。
实施例14
本实施例描述了通过使用噬菌体展示对全长人scFv抗体的鉴定，所述抗体与MASP-2结合并抑制凝集素-介导的补体活化(LEA-2)，同时保留免疫系统的经典(C1q-依赖性的)途径成分的完整性。
概述：
通过筛选噬菌体展示文库，鉴定了全长人、高亲和性MASP-2抗体。所述抗体的可变的轻链和重链片段同时以scFv形式和以全长IgG形式而分离。人MASP-2抗体可用于抑制凝集素途径-介导的替代补体途径活化相关的细胞损伤，同时保留完整的免疫系统的经典(C1q-依赖性的)途径成分。在某些实施方案中，所测的MASP-2抑制性抗体具有以下特征：(a)对人MASP-2的高亲和性(例如KD为10 nM更低)，和(b)在90%人血清中抑制MASP-2-依赖性补体活性，IC50为30 nM或更低。
方法：
全长无催化活性的MASP-2的表达：
将编码具有前导序列的人MASP-2多肽(SEQ ID NO:5)的人MASP-2的全长cDNA序列(SEQ ID NO: 4)亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-Neo (Promega)中，所述载体在CMV增强子/启动子区的控制下驱动真核表达(描述于Kaufman R.J.等人, Nucleic Acids Research19:4485-90, 1991；Kaufman, Methods in Enzymology, 185:537-66 (1991))。
为了产生无催化活性的人MASP-2A蛋白，按照US2007/0172483 (其通过引用结合到本文中)所述，进行定点诱变。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳和条带制备后被纯化，使用标准加尾方法产生单腺苷重叠。然后将加腺苷尾的MASP-2A克隆到pGEM-T easy载体中，再转化到大肠杆菌中。将人MASP-2A进一步亚克隆到哺乳动物表达载体pED或pCI-Neo中。
将上述MASP-2A表达构建体转染到DXB1细胞，使用标准磷酸钙转染程序(Maniatis等人, 1989)。在无血清培养基中产生MASP-2A，以确保制备物不被其它血清蛋白污染。每隔一天从汇集细胞中收获培养基(共4次)。重组MASP-2A水平平均为大约1.5 mg/升培养基。MASP-2A (上述Ser-Ala突变体)通过亲和色谱在MBP-A-琼脂糖柱上纯化。
在经淘选/scFv转化和过滤筛选而鉴定的ScFv侯选克隆上的MASP-2A ELISA
对人免疫球蛋白轻链-和重链-可变区序列的噬菌体展示文库进行抗原淘选，接着经过自动化抗体筛选和选择，以鉴定针对人MASP-2蛋白的高亲和性scFv抗体。进行了针对HIS-标记的或生物素标记的MASP-2A的scFv噬菌体文库的三轮淘选。第三轮淘选先用MBL洗脱，再用TEA (碱性)洗脱。为了监测噬菌体展示scFv片段对靶MASP-2A的特异性富集，进行了针对固定化MASP-2A的多克隆噬菌体ELISA。将来自3轮淘选的scFv基因克隆到pHOG表达载体中并进行小规模过滤筛选，以寻找针对MASP-2A的特定克隆。
挑出含有编码来自第三轮淘选的scFv片段的质粒的细菌菌落，点在硝基纤维素膜上并在非诱导性培养基中培养过夜以产生母板。从第三轮淘选中共挑出并分析了18,000个菌落，半数来自竞争性洗脱，半数来自随后的TEA洗脱。淘选针对MASP-2A的scFv噬菌粒文库，接着scFv转化和过滤筛选，得到137个阳性克隆。108/137克隆在ELISA测定法中对MASP-2结合呈阳性(数据未显示)，其中进一步分析了其中的45个克隆在正常人血清中阻断MASP-2活性的能力。
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的测定法
测定抑制凝集素途径C3转化酶形成的功能测定法用于评价MASP-2 scFv候选克隆的“阻断活性”。为了产生包含凝集素途径C3转化酶的两种蛋白成分(C4b、C2a)，需要MASP-2丝氨酸蛋白酶活性。因此，抑制MASP-2功能活性的MASP-2 scFv (即阻断性MASP-2 scFv)将抑制凝集素途径C3转化酶的从头形成。C3含有独特的高反应性硫酯基团作为其结构部分。在该测定法中当C3转化酶切割C3时，C3b上的硫酯基团可与通过酯键或酰胺键固定在塑料孔底部的大分子上的羟基或氨基形成共价键，从而有利于在ELISA测定法中检测出C3b。
酵母甘露聚糖是凝集素途径的已知激活剂。在测定C3转化酶形成的下列方法中，将用甘露聚糖包被的塑料孔与稀释的人血清孵育以激活凝集素途径。然后洗涤各孔，并采用标准ELISA方法测定固定在孔中的C3b。在该测定法中所产生的C3b的量直接反映了从头形成的凝集素途径C3转化酶。在该测定法中测定选定浓度的MASP-2 scFv克隆抑制C3转化酶形成和随后C3b产生的能力。
方法：
将如上所述地鉴定的45个候选克隆表达、纯化并稀释至相同的储液浓度，再将其稀释在含Ca++和Mg++的GVB缓冲液(4.0 mM 巴比妥, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1%明胶, pH 7.4)中，以确保所有克隆都具有相同量的缓冲液。以一式三份，测定浓度为2 μg/mL的每个scFv克隆。阳性对照是OMS100 Fab2并以0.4 μg/mL来测定。在有和没有scFv/IgG克隆存在时监测C3c形成。
将甘露聚糖在50mM碳酸盐缓冲液(15mM Na2CO3 + 35mM NaHCO3 + 1.5 mM NaN3, pH 9.5)中稀释至浓度20 μg/mL (1 μg/孔)并包被在ELISA板上，在4℃过夜。次日，将甘露聚糖-包被的板用200 μl PBS洗涤3次。再将100 μl 1% HSA封闭溶液加入各孔并在室温下孵育1小时。将各板用200 μl PBS洗涤3次，并贮存在冰上在200 μl PBS中，直到加入样品。
将正常人血清在CaMgGVB缓冲液中稀释至0.5%，并以一式三份，向该缓冲液中加入scFv克隆或OMS100 Fab2阳性对照，浓度为0.01 μg/mL、1 μg/mL (仅OMS100对照)和10 μg/mL，并在冰上预孵育45分钟，然后加入到封闭的ELISA板上。通过在37℃孵育1小时启动反应，并通过将各板移至冰浴而终止反应。用兔α-小鼠C3c抗体，接着是山羊α-兔HRP来检测C3b沉积。阴性对照是无抗体缓冲液(无抗体= 最大C3b沉积)，阳性对照是含EDTA的缓冲液(无C3b沉积)。通过进行同样的测定法来检测背景，除了各孔中无甘露聚糖之外。将无甘露聚糖板的背景信号从含甘露聚糖的孔的信号中减去。截止标准设置为仅无关scFv克隆(VZV)和缓冲液的活性的一半。
结果：基于截止标准，发现共13个克隆阻断MASP-2的活性。选择所有产生> 50%途径抑制的13个克隆并测序，获得10个独特的克隆。发现所有10个克隆具有相同的轻链亚类λ3，但有三个不同的重链亚类VH2、VH3和VH6。在功能测定法中，使用0.5%人血清，10个候选scFv克隆中有5个的IC50 nM值小于25 nM靶标准。
为了鉴定具有改善的效力的抗体，对如上所述鉴定的3个母scFv克隆进行轻链重排(shuffling)。此过程涉及由每个母克隆的VH配对来自六个健康供体的首次用于实验的人类λ轻链(VL)的文库组成的组合文库的生成。然后筛选此文库具有改善的结合亲和性和/或功能性的scFv克隆。
表15：前导子克隆和它们各自的母克隆(都以scFv形式)的IC50 (nM)的功能效力的比较
以下给出的是上表15所示的和下表16A-F所列的母克隆和子克隆的重链可变区(VH)序列。
Kabat CDR (31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3))以黑体表示；Chothia CDR (26-32 (H1)、52-56 (H2)和95-101 (H3))以下划线表示。
17D20_35VH-21N11VL重链可变区(VH) (SEQ ID NO:15，由SEQ ID NO:14编码)
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEKSYRTSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS
d17N9重链可变区(VH) (SEQ ID NO:16)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVTVSS
重链可变区
表16A：重链(aa 1-20)
表16B：重链(aa 21-40)
表16C：重链(aa 41-60)
表16D：重链(aa 61-80)
表16E：重链(aa 81-100)
表16F：重链(aa 101-118)
以下给出的是下表17A-F所列的母克隆和子克隆的轻链可变区(VL)序列。
Kabat CDR (24-34 (L1)；50-56 (L2)；和89-97 (L3)以黑体表示；Chothia CDR (24-34 (L1)；50-56 (L2)和89-97 (L3)以下划线表示。这些区域是相同的，无论按照Kabat或Chothia系统编号。
17D20m_d3521N11轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:17)
QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL
17N16m_d17N9轻链可变区(VL) (SEQ ID NO:19，由SEQ ID NO:18编码)
SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPDRFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIATDHVVFGGGTKLTVLAAAGSEQKLISE
表17A：轻链(aa 1-20)
表17B：轻链(aa 21-40)
表17C：轻链(aa 41-60)
表17D：轻链(aa 61-80)
表17E：轻链(aa 81-100)
表17F：轻链(aa 101-120)
通过斑点印迹分析，对于表位结合，分析了MASP-2抗体OMS100和MoAb_d3521N11VL，这两者已证明以高亲和性与人MASP-2结合并具有阻断功能性补体活性的能力。结果表明d3521N11和OMS100抗体对MASP-2是高特异性，而不与MASP-1/3结合。抗体既不与MAp19结合，也不与不含MASP-2的CCP1结构域的MASP-2片段结合，导致以下结论：结合位点包含CCP1。
因此，在一个实施方案中，用于要求保护的本发明的组合物和方法中的MASP-2抑制剂包含人抗体，所述抗体与由人MASP-2 (SEQ ID NO:3)组成的多肽结合，其中所述抗体包含：
I) a)重链可变区，包含：i)重链CDR1，包含SEQ ID NO:21的31-35的氨基酸序列；和ii)重链CDR2，包含SEQ ID NO:21的50-65的氨基酸序列；和iii)重链CDR3，包含SEQ ID NO:21的95-102的氨基酸序列；和
b)轻链可变区，包含：i)轻链CDR1，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的24-34的氨基酸序列；和ii)轻链CDR2，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的50-56的氨基酸序列；和iii)轻链CDR3，包含SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的89-97的氨基酸序列；或
II) 其变体，其与所述可变区相同，除了在所述重链可变区的所述CDR区内最多组合共有6个氨基酸置换以及在所述轻链可变区的所述CDR区内最多组合共有6个氨基酸置换之外，其中所述抗体或其变体抑制MASP-2-依赖性补体活化。
实施例15
本实施例描述了MASP-1和MASP-3的单克隆抗体的产生，使用包含修饰的DT40细胞系DTLacO的体外系统。
背景/原理：
使用包含修饰的DT40细胞系DTLacO的体外系统，产生针对人MASP-1和MASP-3的抗体，所述系统允许特定多肽的多样化的可逆诱导，如WO2009029315和US2010093033中的进一步描述。DT40是已知在培养中其重链和轻链免疫球蛋白(Ig)基因发生组成型突变的鸡B细胞系。正如其它B细胞，该组成型诱变将突变靶向Ig基因的V区，和因此，所表达抗体分子的CDR。DT40细胞中的组成型诱变是通过基因转化而发生，使用作为供体序列的位于各功能性V区上游的一组非-功能性V基因区段(假-V基因；ψV)。先前已经证明ψV区的缺失引起多样化机制的转换(从基因转化到体细胞超变)，所述机制通常可见于人B细胞。已经证明DT40鸡B细胞淋巴瘤细胞系对于离体的抗体进化而言是有希望的起点(Cumbers, S.J.等人，Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002)；Seo, H.等人，Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005))。DT40细胞在培养中稳定增殖，倍增时间为8-10小时(与人B细胞系的20-24 hr相比)，它们支持非常有效的同源基因打靶(Buerstedde, J.M.等人，Embo J 9, 921-927 (1990))。鉴于DT40细胞可以进入多样化、基因转化和体细胞超变的2种独特的生理途径，其分别产生模板化和非模板化的突变，因此DT40细胞控制大量潜在的V区序列多样化(Maizels, N. Annu Rev Genet 39, 23-46 (2005))。多样化的重链和轻链免疫球蛋白(Ig)以细胞表面展示的IgM的形式表达。表面IgM具有双价形式，结构上类似于IgG分子。可以通过与固定的可溶性的或膜展示的抗原形式结合，而分离展示对特定抗原具有特异性的IgM的细胞。然而，对于抗体进化，使用DT40细胞在实践中是受限的，因为正如在其它转化的B细胞系中，多样化以小于1%生理比率而发生。
在用于本实施例的系统中，正如WO2009029315和US2010093033所述，DT40细胞经改造以加速Ig基因多样化率，而不牺牲进一步进行遗传修饰的能力或者基因转化和体细胞超变以促进诱变的潜力。对DT40进行了两个关键性修饰，以增加多样化率，并因此在我们的细胞文库中增加结合特异性的复杂性。首先，在强效大肠杆菌乳糖操纵子/阻遏物调节性网络的控制之下进行Ig基因多样化。将由强效大肠杆菌乳糖操纵子的大约100个聚合重复单位组成的多聚物(PolyLacO)插入到通过同源基因打靶而重排和表达的Igλ和IgH基因的上游。然后可将融合到乳糖阻遏蛋白(LacI)上的调节因子与LacO调节元件相连，以调控多样化，利用乳糖阻遏物对操纵子DNA的高亲和性(kD=10-14 M)。与进行任何改造之前的亲代DT40细胞相比，DT40 PolyLacO-λR细胞(其中PolyLacO仅在Igλ整合)在Ig基因多样化率上表现出5倍的增加(Cummings, W.J.等人，PLoS Biol 5, e246 (2007))。在经改造而携带同时靶向Igλ和IgH基因的PolyLacO的细胞(“DTLacO”)中，多样化进一步升高。相对于亲代DT40 PolyLacO-λR LacI-HP1系的2.8%特征，DTLacO细胞已证明其多样化率升高了2.5-至9.2-倍。因此，相对于DT40亲代细胞系，将PolyLacO元件靶向重链和轻链基因，加速了多样化达21.7倍。将调节因子与Ig基因座相连，不仅改变了诱变频率，而且可改变诱变途径，产生独特序列变化的更大的集合(Cummings等人，2007；Cummings等人，2008)。第二，产生了序列起点的多样化集合，用于连接的因子-加速的Ig基因多样化。通过将重排的Ig重链可变区(分离自2月龄鸡)靶向重链基因座，将这些多样化序列起点加到DTLacO。这些重链可变区的加入产生了107个新起点谱(repertoire)，用于抗体多样化。将这些新起点构建到DTLacO细胞系中，允许鉴定与特定靶结合的克隆，并随之允许通过连接的因子所致的快速亲和性成熟。亲和性成熟后，通过将成熟的、重排的重链-和轻链-可变序列(VH和Vλ；包括鸡构架区和互补决定区或CDR)克隆到含有人IgG1和λ恒定区的表达载体中，产生全长、重组嵌合IgG。这些重组mAb适于体外和体内应用，并且它们可用作人源化的起点。
方法：
对MASP-1和MASP-3抗原结合的选择
通过结合DTLacO群体，进行初步选择，所述群体是通过以下方式而多样化：通过基因靶向到与人MASP-1 (SEQ ID NO:10)和MASP-3抗原(SEQ ID NO:8)复合的珠；并且随后通过FACS选择，使用荧光标记的可溶性抗原(Cumbers, S.J.等人，Nat Biotechnol20, 1129-1134 (2002)；Seo, H.等人，Nat Biotechnol23, 731-735 (2005)。因为MASP-1和MASP-3之间共享的α链中的保守氨基酸序列(见图5)和独特的β链序列(见图6)，进行了MASP-1和MASP-3的结合剂的单独的、平行的筛选，以鉴定MASP-1特异性mAb、MASP-3特异性mAb以及能够与MASP-1和MASP-3两者结合的(双重-特异性) mAb。2种形式的抗原用于选择和筛选结合剂。首先，将与Fc结构域融合的重组MASP-1或MASP-3 (全长或片段)与Dynal磁性蛋白G珠结合或用于基于FACS的选择，使用PECy5-标记的抗人IgG(Fc)第二抗体。或者，将重组形式的MASP-1或MASP-3蛋白用Dylight粉直接标记并用于选择和筛选。
结合和亲和性
通过将PCR扩增的V区克隆到支持人IgG1在293F细胞中表达的载体中，产生重组抗体(Yabuki等人, PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012))。通过用不同浓度的荧光-标记的可溶性抗原染色表达结合MASP-1或MASP-3的抗体的DTLacO细胞，来测定饱和结合动力学。分别如实施例17和18所述，进行用于MASP-3特异性活性(包括MASP-3-依赖性C3b沉积和MASP-3-依赖性D因子切割)的功能测定法。如下所述，进行MASP-1-特异性活性(即抑制MASP-1-依赖性C3b沉积)的功能测定法。
结果：
所用上述方法，产生多种MASP-1和MASP-3的结合抗体。如FACS分析所示，对于在MASP-3结合剂的筛选中分离的代表性的克隆M3J5和M3M1，描述了结合。
图30A是对于DTLacO克隆M3J5，MASP-3抗原/抗体结合的FACS直方图。图30B是对于DTLacO克隆M3M1，MASP-3抗原/抗体结合的FACS直方图。在图30A和30B中，灰色填充曲线是IgG1-染色的阴性对照，黑色曲线是MASP-3-染色。
图31图示表示对于MASP-3抗原，克隆M3J5 (克隆5)的饱和结合曲线。如图31所示，M3J5抗体对MASP-3的表观结合亲和性为大约31 nM。
使用标准方法，对已鉴定的克隆进行序列分析。将所有克隆与共同的(DT40) VH和VL的序列比较并且彼此比较。提供两个前述克隆M3J5和M3M1的序列，与2个额外代表性的克隆D14和1E10进行比对，后两者分别是在MASP-1和MASP-3的CCP1-CCP2-SP片段的筛选中鉴定出来的。D14和1E10与MASP-1和MASP-3两者共有的区域结合。
图32A是M3J5、M3M1、D14和1E10的VH区与鸡DT40 VH序列的氨基酸序列的比对。
图32B是M3J5、M3M1、D14和1E10的VL区与鸡DT40 VL序列的氨基酸序列的比对。
每个克隆的VH和VL的氨基酸序列提供如下。
重链可变区(VH)序列
图32A显示了亲代DTLacO (SEQ ID NO: 24)、MASP-3-结合克隆M3J5 (SEQ ID NO: 25)以及M3M1 (SEQ ID NO: 26)和MASP-1/MASP-3双重结合克隆D14 (SEQ ID NO:30)和1E10的重链可变区(VH)序列的氨基酸比对。
以下VH序列中的Kabat CDR位于以下氨基酸位置：H1:aa 31-35；H2:aa 50-62；和H3:aa 95-102。
以下VH序列中的Chothia CDR位于以下氨基酸位置：H1:aa 26-32；H2: aa 52-56；和H3: aa 95-101。
亲代DTLacO VH (SEQ ID NO:24)
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSNAMGWVRQAPGKGLEWVAGIDDDGSGTRYAPAVKGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDTGTYYCTKCAYSSGCDYEGGYIDAWGHGTEVIVSS
克隆M3J5 VH: (SEQ ID NO:25)
AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLEYVAGIRSDGSFTLYATAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCTRSGNVGDIDAWGHGTEVIVSS
克隆M3M1 VH: (SEQ ID NO:26)
AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFDFSSYQMNWIRQAPGKGLEFVAAINRFGNSTGHGAAVKGRVTISRDDGQSTVRLQLSNLRAEDTATYYCAKGVYGYCGSYSCCGVDTIDAWGHGTEVIVSS
克隆D14 VH: (SEQ ID NO:30)
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYKSGAGTNYAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKTTGSGCSSGYRAEYIDAWGHGTEVIVSS
克隆1E10 VH: (SEQ ID NO:32)
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYDMVWVRQAPGKGLEFVAGISRNDGRYTEYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARDAGGSAYWFDAGQIDAWGHGTEVIVSS
轻链可变区(VL)序列
图32B显示了亲代DTLacO (SEQ ID NO:27)和MASP-3-结合克隆M3J5 (SEQ ID NO:28)和M3M1 (SEQ ID NO:29)和MASP-1/MASP-3双重结合克隆D14 (SEQ ID NO:31)和1E10 (SEQ ID NO: 33)的轻链可变区(VL)序列的氨基酸比对。
亲代DTLacO VL (SEQ ID NO:27):
ALTQPASVSANLGGTVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNDKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
克隆M3J5 VL (SEQ ID NO:28):
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGYSGYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
克隆M3M1 VL (SEQ ID NO:29):
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
克隆D14 VL: (SEQ ID NO:31)
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
克隆1E10 VL: (SEQ ID NO:33)
ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL
LEA-2 (MASP-2-依赖性的)功能测定
MASP-1经由其活化MASP-2的能力而有助于LEA-2 (参见图1)。Wieslab?补体系统筛选MBL测定法(Euro Diagnostica, Malm?, Sweden)在分离LEA-2-依赖性活化(即传统的凝集素途径活性)的条件下测定了C5b-C9沉积。按照制造商的说明书进行该测定法，用代表性的克隆1E10，其终浓度经测定为400 nM。
图33是柱状图，显示与测定试剂盒中提供的阳性血清以及同种型对照抗体比较的mAb 1E10的抑制活性。如所示图33，mAb 1E10证明部分抑制LEA-2-依赖性活化(通过抑制MASP-2的MASP-1-依赖性活化)，而同种型对照抗体却不。在DTLacO系统中使用连接的因子，通过对MASP-1结合的该抗体的持续亲和性成熟，应该达到更强烈的抑制。
对代表性的mAb的LEA-1 (MASP-3-依赖性的)功能测定法描述于以下实施例17和18。
结果概述：
以上结果表明DTLacO平台允许快速离体发现具有对LEA-1(如以下实施例17和18所示)和对LEA-2 (如本实施例所示)的抑制性质的MASP-1和MASP-3单克隆抗体。
实施例16
本实施例描述了MASP-1和MASP-2的多肽抑制剂的产生。
原理：
MASP-1和MASP-2的特异性抑制剂即SGMI-1和SGMI-2的产生，描述于Heja等人, J Biol Chem 287:20290 (2012)和Heja等人, PNAS 109:10498 (2012)，其各自通过引用结合到本文中。SGMI-1和SGMI-2各自是36个氨基酸肽，其是从沙漠蝗(Schistocerca gregaria )蛋白酶抑制剂2的变体的噬菌体文库中选择出来的，其中蛋白酶结合环的8个位置中的6个是完全随机化的。随后的体外进化得到单特异性抑制剂，具有个位数的nM KI值 (Heja等人, J. Biol. Chem. 287:20290, 2012)。结构研究揭示出优化的蛋白酶结合环形成第一结合位点，其限定了这两种抑制剂的特异性。延长的第二和内部结合区的氨基酸序列对于这两种抑制剂是共有的并促成接触界面(Heja等人, 2012. J. Biol. Chem. 287:20290)。从机制上看，SGMI-1和SGMI-2都阻断补体活化的凝集素途径，而不影响经典或替代途径(Heja等人, 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. 109:10498)。
SGMI-1和SGMI-2抑制剂的氨基酸序列如下：
SGMI-1-全长: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQ (SEQ ID NO:34)
SGMI-2-全长: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:35)
SGMI-1和SGMI-2分别是MASP-1和MASP-2的高特异性抑制剂。然而，作为肽，它们在用于生物研究中具有有限的可能性。为了解决这些限制，我们将这些生物活性肽氨基酸序列移植到人IgG1 Fc区的氨基端，以产生Fc-融合蛋白。
方法：
为了表达SGMI-IgG1 Fc融合蛋白，合成了编码SGMI-1 (SEQ ID NO:34)和SGMI-2 (SEQ ID NO:35)肽的多核苷酸(DNA 2.0)并将其插入到表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen)中的编码IL-2信号序列和人IgG1 Fc区的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)之间。柔性多肽接头(例如SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38)被包括在SGMI肽和IgG1 Fc区之间。
柔性多肽接头序列：
GTGGGSGSSSRS (SEQ ID NO:37)
GTGGGSGSSS (SEQ ID NO:38)
所得构建体描述如下：
编码包含人IL-2信号序列、SGMI-1、接头和人IgG1-Fc的多肽融合物(pFUSE-SGMI-1Fc)的多核苷酸，如SEQ ID NO:39所示，其编码成熟多肽融合物，包含SGMI-1 (下划线)、接头区(斜体)和人IgG1-Fc (并称为“SGMI-1Fc”)，如SEQ ID NO:40所示。
SEQ ID NO:40 
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQ GTGGGSGSSSRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
编码包含人IL-2信号序列、SGMI-2、接头和人IgG1-Fc的多肽融合物(pFUSE-SGMI-2Fc)的多核苷酸，如SEQ ID NO:41所示，其编码成熟多肽融合物，包含SGMI-2 (下划线)、接头区(斜体)和人IgG1-Fc (并称为“SGMI-2Fc”)，如SEQ ID NO:42所示。
SEQ ID NO:42
LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ GTGGGSGSSSRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
重组蛋白的产生：
按照供应商的方案，用两个表达质粒(pFUSE-SGMI-1Fc (SEQ ID NO:39)和pFUSE-SGMI-2Fc (SEQ ID NO:41))中的一个，瞬时转染Freestyle 293-F或Expi293F细胞(Invitrogen)。在37℃孵育4天后，收获培养基。Fc-融合蛋白经A蛋白亲和色谱而纯化。
测定凝集素途径活化的测定法
在甘露聚糖-包被的96孔板上测试SGMI-1Fc和SGMI-2Fc融合蛋白抑制C3b从1%血清中沉积的能力，其是凝集素途径活性的度量。在冰上将SGMI-1Fc和SGMI-2Fc与1%正常人血清预孵育1小时，然后加入到包被甘露聚糖的孔中(2 μg/孔)。如Schwaeble等人，PNAS 108:7523, 2011所述，通过ELISA测定C3b沉积。
图34图示表示对于1%正常人血清加同种型对照、SGMI-1Fc或SGMI-2Fc，在浓度范围为0.15至1000 nM时的C3b沉积水平。如图34所示，在甘露聚糖-包被的ELISA孔中，SGMI-1Fc和SGMI-2Fc两者都抑制C3b从正常血清中沉积下来，IC50值分别为大约27nM和300nM。
这些结果证明SGMI肽的MASP-1和MASP-2的抑制性功能在SGMI-1Fc和SGMI-2Fc融合蛋白中被保留下来。
实施例17
在3MC血清中用金黄色葡萄球菌分析补体途径。
背景/原理：
已经确定，在正常人血清存在或不存在时，通过暴露给非-固定化的液相甘露聚糖、酵母聚糖A或N-乙酰基半胱氨酸，MASP-3不被活化。然而，已经确定，在有和没有正常人血清(NHS)或热灭活的人血清(HIS)存在时，重组和天然MASP-3在热灭活的金黄色葡萄球菌表面上活化(数据未显示)。也已确定，在正常人血清存在时，C3b沉积发生在金黄色葡萄球菌表面上，并可以使用流式细胞术监测沉积。因此，按照本实施例所述，测定响应金黄色葡萄球菌的替代途径(AP)，作为评价MASP-3对LEA-1的贡献的方式。
方法：
重组MASP-3: 将编码全长重组人MASP-3、截短的丝氨酸蛋白酶(SP)活性形式的MASP-3 (CCP1-CCP2-SP)、和SP-灭活形式的MASP-3 (S679A)的多核苷酸序列克隆到pTriEx7哺乳动物表达载体(Invivogen)中。所得表达构建体编码具有氨基-末端Strep标签和羧基-末端His6标签的全长MASP-3或CCP1-CCP2-SP片段。按照制造商提供的方案，将表达构建体转染到Freestyle 293-F或Expi293F细胞(Invitrogen)中。在5%CO2中在37℃培养3-4天后，重组蛋白用Streptactin亲和色谱来纯化。
重组MASP-1: 如以上对于重组MASP-3所述，产生全长或截短的CCP1-CCP2-SP形式的重组MASP-1，其有或无稳定化的R504Q (Dobo等人, J. Immunol 183:1207, 2009)或SP灭活(S646A)突变并携带氨基-末端Step标签和羧基-末端His6标签。
1. 在3MC (人)血清中，在金黄色葡萄球菌上的C3b沉积和B因子切割。
进行初步试验，以证明流式细胞术测定法能够如下检测AP-驱动的C3b沉积(AP-C3b)的存在或不存在。将5%的以下血清：正常人血清、B因子(B因子)-耗尽的人血清、D因子-耗尽的人血清和备解素-耗尽的人血清(得自Complement Technology, Tyler, Texas, USA)与测试抗体一起，在Mg++/EGTA缓冲液或EDTA中混合，在4℃过夜。将热灭活的金黄色葡萄球菌(108/反应)加入到每种混合物中至总体积100 μL并在37℃旋转40分钟。在洗涤缓冲液中洗涤细菌，将细菌沉淀物重悬于洗涤缓冲液中，分析每种样品的80 μL等分试样在细菌表面上的C3b沉积，并使用流式细胞术，用抗人C3c (Dako, UK)对其进行测定。
C3b的流式细胞术检测结果见图35A。如图35A图面1所示，在EDTA存在时在正常人血清中(其已知不活化AP)，未见C3b沉积(阴性对照)。在用Mg++/EGTA处理的正常人血清中，仅凝集素-非依赖性补体途径可以起作用。在图面2中，使用Mg++/EGTA缓冲液，因此AP是有活性的，并观察到AP-驱动的C3b沉积(阳性对照)。如图面3、4和5所示，分别在B因子-耗尽的、D因子-耗尽的和备解素-耗尽的血清中，不出所料，未见替代途径驱动的C3b沉积。这些结果证明该测定法能够测定AP-依赖性C3b沉积。
如上所述，进行C3b在金黄色葡萄球菌上沉积的测定法，以评价重组MASP-3在人3MC血清中重构AP (LEA-1)的能力，所述血清缺乏MASP-3 (Rooryck C,等人, Nat Genet. 43(3):197-203 (2011))。测试了以下试剂组合。
1. 5%正常人血清+EDTA
2. 5%正常人血清+Mg/EGTA
3. 5%人3MC (MASP-3-/-)血清+ Mg++/EGTA
4. 5%人3MC (MASP-3-/-)血清+ Mg++/EGTA加活性全长rMASP-3
5. 5%人3MC (MASP-3-/-)血清+ Mg++/EGTA加截短的活性rMASP-3 (CCP1/CCP2/SP)
6. 5%人3MC (MASP-3-/-)血清+ Mg++/EGTA加无活性rMASP-3 (S679A)
7. 5%人3MC (MASP-3-/-)血清+ Mg++/EGTA加活性全长rMASP-1
将上述的5%血清和重组蛋白(各5 μg)的不同混合物在指定缓冲液条件(Mg++ /EGTA缓冲液或EDTA)中在4℃孵育过夜。孵育过夜后，将108热灭活的金黄色葡萄球菌加入到各混合物中，总体积100 μL，并在37℃旋转40分钟。细菌经洗涤并重悬于洗涤缓冲液中，通过FACS分析每种样品的80 μL等分试样的C3b沉积。每种样品的剩余20 μL等分试样用于通过蛋白质印迹来测定B因子切割，使用下述的抗B因子抗体。
C3b的流式细胞术检测结果见图35B。图面编号对应于以上概述的每种试剂组合的编号。阴性对照(图面1)和阳性对照(图面2)显示C3b沉积不存在和存在，正如所料。图面3显示了在3MC血清中，AP-驱动的C3b沉积不存在。图面4和5显示活性全长rMASP-3 (图面4)和活性rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (图面5)两者在3MC血清中都恢复了AP-驱动的C3b沉积。图面6显示了无活性rMASP-3 (S679A)在3MC血清中不恢复AP-驱动的C3b沉积。图面7显示了rMASP-1在3MC血清中不恢复AP-驱动的C3b沉积。
总之，这些结果证明MASP-3是在人血清中的AP-驱动的C3b沉积在金黄色葡萄球菌上所需要的。
2. B因子的MASP-3-依赖性活化
为了分析B因子的MASP-3-依赖性活化，如上所述地测定上述的5%血清(正常人血清或3MC患者血清)和重组蛋白的不同混合物。从各反应混合物中，取出20 μL并加入到蛋白样品装载缓冲液中。将样品在70℃加热10分钟并装载到SDS-PAGE凝胶上。进行蛋白质印迹分析，使用B因子多克隆抗体(R&D Systems)。通过形成两个较低分子量切割产物(Bb和Ba)(衍生自较高分子量前-B因子蛋白)，B因子的活化是明显的。
图36显示了在响应金黄色葡萄球菌时，在3MC血清中在rMASP-3存在或不存在时测定B因子切割的蛋白质印迹分析结果。如泳道1所示，在EDTA存在时的正常人血清(阴性对照，泳道1)显示出非常少的B因子切割，相对于在Mg++/EGTA存在时的正常人血清而言，如泳道2 (阳性对照)所示。如泳道3所示，3MC血清在Mg++/EGTA存在时显示出非常少的B因子切割。然而，如泳道4所示，通过将全长、重组MASP-3蛋白(5 μg)加入3MC血清中并预孵育，恢复了B因子切割。
3. 在B因子/C3(H2O)切割中，检测rMASP-3对前D因子的作用的测定法
进行以下测定法，以确定B因子的MASP-3-依赖性活化/切割的最低要求。
将C3(H2O) (200ng)、纯化的血浆B因子(20 μg)、重组前D因子(200 ng)和重组人MASP-3 (200 ng)以不同组合而混合在一起(如图37所示)，总体积为在BBS/Ca++/ Mg++中的100 μL，并在30℃孵育30分钟。通过加入含有5% 2-巯基乙醇的25 uL SDS装载染料而终止反应。在振摇(300 rpm)下在95℃煮沸10分钟后，将混合物在1400 rpm离心5分钟，然后将20 uL上清液装载到10% SDS凝胶上并分离。凝胶用考马斯亮蓝染色。
结果：
图37显示了考马斯染色的SDS-PAGE凝胶，其中分析了B因子切割。如泳道1所示，B因子切割在C3、MASP-3和前D因子存在时是最佳的。如泳道2所示，绝对需要C3；然而，如泳道4和5所示，MASP-3或前D因子都能介导B因子切割，只要C3存在。
4. 对MASP-3 mAb抑制MASP-3-依赖性AP-驱动的C3b沉积的能力的分析
如本实施例所述，已经证明了在人血清中，MASP-3是AP-驱动的C3b沉积在金黄色葡萄球菌上所需要的。因此，进行以下测定法，以确定如实施例15中所述而鉴定的代表性的MASP-3 mAb是否能抑制MASP-3活性。在冰上，将有活性的、重组MASP-3 (CCP1-CCP2-SP)片段蛋白(250 ng)与同种型对照mAb、mAb1A5 (得自DTLacO平台的对照，其不与MASP-3或MASP-1结合)、或mAbD14 (与MASP-3结合)以3种不同浓度(0.5、2和4 μM)预孵育1小时。将酶-mAb混合物暴露给5% 3MC血清(缺乏MASP-3)和5x107热灭活的金黄色葡萄球菌，最终反应体积50 μL。将反应物在37℃孵育30分钟，然后染色，用于检测C3b沉积。通过流式细胞术分析染色后的细菌细胞。
图38图示表示在3MC血清中在rMASP-3存在时，得自3种抗体的C3b染色的平均荧光强度(MFI)对于mAb浓度作图。如图38所示，mAbD14表现出以浓度-依赖性方式抑制C3b沉积。相比之下，对照mAbs都不抑制C3b沉积。这些结果证明mAbD14能够抑制MASP-3-依赖性C3b沉积。在DTLacO系统中使用连接的因子，通过对MASP-3结合的该抗体的持续亲和性成熟后，预期mAbD14的改进的抑制活性。
结果概述：
总之，本实施例的结果表明在缺乏MASP-3的血清中明显缺乏AP。因此，MASP-3已被证明对AP作出关键性贡献，使用B因子活化和C3b沉积作为功能终点。此外，加入功能性的、重组MASP-3 (包括MASP-3的催化活性C-末端部分)，纠正了在来自3MC患者的血清中的B因子活化和C3b沉积的缺陷。相反，如本实施例进一步证明的，在含有rMASP-3的3MC血清中加入MASP-3抗体(例如mAbD14)，抑制AP-驱动的C3b沉积。以下观察结果证明了MASP-3在B因子活化中和因此在AP活化中的直接作用：重组MASP-3以及C3，足以活化重组B因子。
实施例18
本实施例说明了MASP-1和MASP-3活化D因子。
方法：
测试了重组MASP-1和MASP-3切割2种不同重组形式的前D因子的能力。第一种形式(前D因子-His)缺乏N-末端标签，但具有C-末端His标签。因此，这种形式的前D因子含有5个氨基酸前肽，其在活化期间被切割而除去。第二种形式(ST-前D因子-His)在N端具有Strep-TagII序列，因此将切割的N-末端片段增加至15个氨基酸。ST-前D因子在C末端也含有His6标签。ST-前D因子-His的前肽的长度增加，与前D因子-HIS形式的可能分辨率相比，改善了切割和未切割形式的SDS-PAGE的分辨率。
将重组MASP-1或MASP-3蛋白(2 μg)加入到前D因子-His或ST-前D因子-His底物(100 ng)中并在37℃孵育1小时。将反应物在12% Bis-Tris凝胶上进行电泳，以分离前D因子和活性D因子切割产物。将分离的蛋白质移至PVDF膜上并通过蛋白质印迹，通过用生物素化D因子抗体(R&D Systems)检测来分析。
结果：
图39显示了前D因子底物切割的蛋白质印迹分析。如图39所示，仅全长MASP-3 (泳道2)和MASP-1 (CCP1-CCP2-SP)片段(泳道5)才切割ST-前D因子-His6。无催化活性的全长MASP-3 (S679A；泳道3)和MASP-1 (S646A；泳道3)不能切割任一种底物。用前D因子-His6多肽得到相同结果(未显示)。摩尔过量的MASP-1 (CCP1-CCP2-SP)相对于MASP-3的比较表明，与MASP-1相比，MASP-3是前D因子切割的更有效的催化剂，至少在本文所述的条件下如此。
结论：MASP-1和MASP-3两者都能切割和活化D因子。这一活性将LEA-1与AP活化直接联系起来。更具体地讲，MASP-1或MASP-3对D因子的活化，将会导致B因子活化、C3b沉积和可能的调理作用和/或细胞溶解。
1. 用MASP-3抗体抑制MASP-3-依赖性的前D因子切割的测定法
如下进行测定法，以测定如实施例15中所述而鉴定的代表性的MASP-3和MASP-1 mAb对MASP-3-依赖性D因子切割的抑制作用。将活性重组MASP-3蛋白(80 ng)与1 μg代表性的mAb D14、M3M1和对照抗体(其与MASP-1特异性结合，但不与MASP-3结合)在室温下预孵育15分钟。加入具有N-末端Strep-标签的前D因子(ST-前D因子-His，70 ng)并将混合物在37℃孵育75分钟。然后将反应物电泳，印迹和用抗D因子染色，如上所述。
图40是蛋白质印迹，显示mAb D14和M3M1的部分抑制活性，与含有仅MASP-3和ST-前D因子-His的对照反应物(无mAb，泳道1)以及含有得自DTLacO文库的mAb (其与MASP-1结合，而不与MASP-3结合)的对照反应物(泳道4)相比。如图40所示，在抑制性抗体不存在时，MASP-3将大约50%前D因子切割成D因子(泳道1)。对照MASP-1特异性抗体(泳道4)不改变前D因子与D因子的比率。相比之下，如泳道2和3所示，mAb D14和mAb M3M1两者都抑制MASP-3-依赖性的前D因子切割为D因子，导致所产生的D因子的减少。
结论：这些结果证明MASP-3 mAb D14和M3M1不能抑制MASP-3-依赖性D因子切割。在DTLacO系统中使用连接的因子，通过对MASP-3结合的这些抗体的持续亲和性成熟后，预期mAbD14和mAb M3M1的改进的抑制活性。
实施例19
本实施例说明了MASP-3缺乏阻止了补体-介导的甘露聚糖-包被的WT兔红细胞的溶解。
背景/原理：
如本文的实施例5和6所述，MASP-2-和MASP-3-缺乏的血清对得自PNH小鼠模型的血液样品的红细胞溶解的作用，证明了MASP-2抑制和/或MASP-3抑制在治疗PNH受试者中的功效，并且也支持了使用MASP-2抑制剂和/或MASP-3抑制剂(包括双重或双特异性MASP-2/MASP-3抑制剂)以在经历用C5抑制剂例如eculizumab治疗的PNH受试者中改善C3片段-介导的血管外溶血的效果。
如本实施例所述，在来自额外3MC患者的MASP-3缺乏的血清中进行了C3b沉积实验和溶血实验，证实了实施例5和6中获得的结果。另外，进行了实验，证明了将rMASP-3加入到3MC血清中，能够重构C3b沉积和溶血活性。
方法：
MASP-3-缺乏的血清得自以下3个不同的3MC患者：
3MC患者1：含有携带突变的等位基因，所述突变使编码MASP-3丝氨酸蛋白酶结构域的外显子功能失调，其是由3MC患者的父母提供(两者是携带突变的等位基因的杂合体，所述突变使编码MASP-3丝氨酸蛋白酶结构域的外显子功能失调)，
3MC患者2：在MASP-1外显子12、编码MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域的外显子中具有C1489T (H497Y)突变，导致非功能性MASP-3，但导致功能性MASP-1蛋白。
3MC患者3：在MASP-1基因中具有经证实的缺陷，导致非功能性MASP-3，但导致功能性MASP-1蛋白。
实验#1 ：C3b沉积测定
如Bitter-Suermann等人, Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981))所述，在传统的AP-特异性条件(BBS/ Mg++/EGTA无Ca++，其中BBS= 含蔗糖的巴比妥缓冲盐水)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上，进行AP测定法，血清浓度范围为0.5至25%，并且测定C3b沉积随时间的变化。
结果：
图41图示表示在得自MASP-3-缺陷型(3MC)、C4-缺陷型和MBL-缺陷型受试者的血清样品中，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随血清浓度的变化。如图41所示和如下表18所述，来自患者2和患者3的MASP-3-缺陷型患者血清在高浓度(25%、12.5%、6.25%血清浓度)时具有残留的AP活性，但显著更高AP50 (即需要8.2%和12.3%血清以达到50% 最大C3沉积)。
图42图示表示在得自MASP-3缺陷型、C4-缺陷型和MBL-缺陷型人类受试者的10%人血清样品中，在“传统的”AP-特异性条件(即BBS/EGTA/Mg++无Ca++)下，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随时间的变化。
下表18概述了图41所示的AP50结果和图42所示的C3b沉积的一半时间。
表18：图41和42中所示结果的概述
血清类型 AP50 (%) T1/2 (min)
正常 4.5 26.3
MBL-缺陷型(MBL-/-) 5.7 27.5
C4-缺陷型(C4-/-) 5.1 28.6
3MC (患者3) 8.2 58.2
3MC (患者2) 12.3 72.4
注意：在BBS/Mg++/EGTA缓冲液中，凝集素途径-介导的作用缺乏，因为该缓冲液中缺乏Ca++。
实验#2： 测定甘露聚糖-包被的兔红细胞在人正常或3MC血清存在时(在Ca ++ 不存在时)细胞溶解的溶血测定法
方法：
在Ca++不存在时制备兔RBC (即通过使用EGTA)
将兔全血(2 mL)分到2个1.5 mL微量离心管中并在4℃冷冻微量离心机中在8000 rpm (大约5.9 rcf)离心3分钟。重悬于冰冷的BBS/Mg++/Ca++ (4.4 mM巴比妥酸、1.8 mM巴比妥钠、145 mM NaCl, pH 7.4, 5 mM Mg++, 5 mM Ca++)后，将RBC沉淀物洗涤3次。第3次洗涤后，将沉淀物重悬于4 mL BBS/Mg++/Ca++中。沉淀红细胞，并将RBC用BBS/0.1%明胶/Mg++/Ca++洗涤，如上所述。将RBC悬液在4℃贮存于BBS/0.1%明胶/ Mg++/Ca++中。然后，100 μl悬浮的RBC用1.4 mL水稀释并在8000 rpm (大约5.9 rcf)离心3分钟，将上清液在541 nm处的OD调节至0.7 (在541 nm处的OD为0.7相当于大约109红细胞/mL)。然后，将1 mL重悬的RBC (OD 0.7)加入到9 ml BBS/Mg++/EGTA中，以达到108红细胞/ml的浓度。在冰冷的BBS、Mg++、EGTA中制备测试血清或血浆的稀释液，并将100μl每种血清或血浆稀释液移入圆底板的相应孔中。加入100 μl适当稀释的RBC (108红细胞/mL)到各孔中。Nano-water用于产生阳性对照(100%细胞溶解)，而BBS/Mg++/EGTA无血清或血浆的稀释液用作阴性对照。然后将板在37℃孵育1小时。将圆底板在3250 rpm离心5分钟。将来自各孔的上清液(100 μL)移至平底板的相应孔中并在415-490处读取OD。
结果：
图43图示表示在来自正常受试者和来自2个3MC患者(患者2和患者3)的血清中，在Ca++不存在时测定的一系列血清浓度使甘露聚糖-包被的兔红细胞的溶血的百分率(通过溶解的兔红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)。如图43所示，证明与正常人血清相比，MASP-3缺陷降低了补体-介导的甘露聚糖-包被的红细胞溶解的百分率。来自正常人血清的两条曲线和来自3MC患者的两条曲线之间的差异是显著的(p=0.013，Friedman检验)。
下表19概述了图43所示的AP50结果。
表19：图43所示的结果概述
血清类型 AP50 (%)
正常人血清#1 7.1
正常人血清#2 8.6
3MC患者#2 11.9
3MC患者#3 14.3
注意：当将表19所示的血清样品合并时，正常人血清的AP50值= 7.9，3MC血清的AP50值= 12.8 (p=0.031, Wilcox配对符号秩检验)。
实验#3： 由重组MASP-3重构的人3MC血清恢复在酵母聚糖包被板上的AP-驱动的C3b沉积
方法：
如Bitter-Suermann等人, Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981))所述，在酵母聚糖-包被的微量滴定板上，在传统的AP-特异性条件(BBS/Mg++/EGTA无Ca++，其中BBS=含有蔗糖的巴比妥缓冲盐水)下，在以下血清样品中进行AP测定：(1)来自3MC患者#2的5%人血清并加入范围为0至20 μg/ml的全长活性rMASP-3；(2)来自3MC患者#2的10%人血清并加入范围为0至20 μg/ml的全长活性rMASP-3；和(3)来自3MC患者#2的5%人血清并加入范围为0至20 μg/ml的无活性rMASP-3A (S679A)。
结果：
图44图示表示在酵母聚糖-包被的微量滴定板上的AP-驱动的C3b沉积水平随加到得自人3MC患者2 (MASP-3缺陷型)的血清样品中的rMASP-3蛋白的浓度的变化。如图44所示，活性重组MASP-3蛋白以浓度-依赖性方式重构在酵母聚糖-包被板上的AP-驱动的C3b沉积。如图44进一步所示，在含无活性rMASP-3 (S679A)的3MC血清中未见C3b沉积。
实验#4： 由重组MASP-3重构人的3MC血清在3MC患者血清中恢复溶血活性
方法：
使用兔RBC，使用以上实验#2中所述的方法进行溶血测定法，使用范围为0至12%血清的以下测试血清：(1)正常人血清；(2) 3MC患者血清；(3) 3MC患者血清加活性全长rMASP-3 (20 μg/ml)；和(4)热灭活的人血清。
结果：
图45图示表示在以下血清中，在Ca++不存在时测定的一系列血清浓度使甘露聚糖-包被的兔红细胞的溶血的百分率(通过溶解的兔红细胞的血红蛋白释放至上清液中来测量，所述上清液按照光度测定法测定)：(1)正常人血清；(2) 3MC患者血清；(3) 3MC患者血清加活性全长rMASP-3 (20 μg/ml)；和(4)热灭活的人血清。如图45所示，兔红细胞的溶血百分率在含有rMASP-3的3MC血清中显著增加，与在无重组MASP-3的3MC血清中的溶血百分率相比(p=0.0006)。
图46图示表示在含有浓度范围为0至110 μg/ml的活性rMASP-3 (在BBS/ Mg++/EGTA中)的来自3MC患者2和来自3MC患者3的7%人血清中，兔红细胞溶解的百分率。如图46所示，一定量的rMASP-3以浓度-依赖性方式使兔RBC溶解百分率恢复至最多100%活性。
实验#5 ：MASP-3缺陷型(CMC)患者血清具有功能性MASP-2，如果MBL存在的话
方法：
使用甘露聚糖-包被的ELISA板进行C3b沉积测定法，以检测3MC血清是否缺乏LEA-2。将柠檬酸盐血浆在BBS缓冲液中系列稀释(开始于1:80、1:160、1: 320、1:640、1:1280、1:2560)并铺板到甘露聚糖-包被板上。使用鸡抗人C3b测定法检测沉积的C3b。在来自正常人类受试者(NHS)、来自2个3MC患者(患者2和患者3)、来自患者3的父母和来自MBL-缺陷型受试者的血清中，评价在甘露聚糖-包被的ELISA板上的LEA-2驱动的C3b沉积(血浆稀释液高到使AP和LEA-1可起作用)随人血清浓度的变化。
结果：
图47图示表示对于来自正常人类受试者(NHS)、来自2个3MC患者(患者2和患者3)、来自患者3的父母和来自MBL-缺陷型受试者的血清，在甘露聚糖-包被的ELISA板上的LEA-2-驱动的(即MASP-2-驱动的) C3b沉积水平随在BBS缓冲液中稀释的人血清浓度的变化。这些数据表明患者2是MBL足够的。然而，患者3和患者3的母亲是MBL缺陷型，因此他们的血清不能经由LEA-2将C3b沉积在甘露聚糖上。在这些血清中替换MBL，在患者3 (其是SNP纯合体，导致MASP-3缺陷)和他的母亲(其对于突变的MASP-3等位基因是杂合体)的血清中恢复了LEA-2介导的C3b沉积(数据未显示)。该发现说明了3MC血清不缺乏LEA-2，而是看来具有功能性MASP-2和功能性MASP-1。
总概述和结论：
这些结果证明在人血清中的MASP-3缺陷导致AP活性的损失，正如在酵母聚糖-包被的孔上的C3b沉积减少和兔红细胞溶解减少所证明的那样。在这两种测定法中通过给血清补充功能性的重组人MASP-3可恢复AP。
尽管已经说明和描述了本发明的优选实施方案，但是应理解，其中可以进行多种改变，只要不偏离本发明的精神和范围。

Claims (92)

1. 在患有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的受试者中抑制MASP-3-依赖性补体活化的方法，包括给予所述受试者包含一定量的MASP-3抑制剂的组合物，所述抑制剂有效抑制MASP-3-依赖性补体活化。
2. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-3单克隆抗体或其片段，其特异性地与SEQ ID NO:8的一部分结合。
3. 权利要求1的方法，进一步包括给予所述受试者包含MASP-1抑制剂的组合物。
4. 权利要求3的方法，其中所述MASP-1抑制剂是MASP-1单克隆抗体或其片段，其特异性地与SEQ ID NO:10的一部分结合。
5. 权利要求1的方法，进一步包括给予所述受试者包含MASP-2抑制剂的组合物。
6. 权利要求5的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2单克隆抗体或其片段，其特异性地与SEQ ID NO:5的一部分结合。
7. 权利要求1的方法，进一步包括给予所述受试者包含MASP-1抑制剂和MASP-2抑制剂的组合物。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述组合物在所述受试者中增加红细胞存活。
9. 权利要求8的方法，其中所述受试者表现出选自以下的一种或多种症状：(i)血红蛋白低于正常水平，(ii)血小板低于正常水平，(iii)网织红细胞高于正常水平，和(iv)胆红素高于正常水平。
10. 权利要求1的方法，其中所述受试者先前已经经历或目前正经历用末端补体抑制剂治疗，所述末端补体抑制剂抑制补体蛋白C5的切割。
11. 权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括给予所述受试者抑制补体蛋白C5切割的末端补体抑制剂。
12. 权利要求11的方法，其中所述末端补体抑制剂是人源化抗C5抗体或其抗原-结合片段。
13. 权利要求12的方法，其中所述末端补体抑制剂是eculizumab。
14. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂抑制替代途径驱动的C3b沉积。
15. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂抑制D因子成熟。
16. 权利要求3的方法，其中所述MASP-1抑制剂特异性地与MASP-1的一部分结合，其亲和性比其与MASP-3 (SEQ ID NO:8)结合高至少10倍。
17. 权利要求3的方法，其中所述MASP-1抑制剂特异性地与MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)结合。
18. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂还与MASP-1 (SEQ ID NO:10)的一部分结合。
19. 权利要求18的方法，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-1/MASP-3抑制剂，其结合到CUBI-CCP2结构域内的共有区上。
20. 权利要求18的方法，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-1/MASP-3抑制剂，其结合到CCP2结构域内的共有区上。
21. 权利要求18的方法，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)并且还结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)。
22. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂还与MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分结合。
23. 权利要求22的方法，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-3/MASP-2抑制剂，其结合到MASP-3和MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域内的保守区上。
24. 权利要求22的方法，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa450-711)上并且还结合到MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)或MASP-2的CCP-1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa300-431)的至少一个上。
25. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂结合到MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分上，并且不抑制MASP-1或MASP-2。
26. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-3的一部分上，其亲和性比其与MASP-1 (SEQ ID NO:10)结合高至少10倍。
27. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)上。
28. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-1、MASP-2和MASP-3的泛抑制剂并且结合到CUB1-EGF-CUB2结构域内的保守区上。
29. 权利要求1的方法，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-1、MASP-2和MASP-3的三特异性抑制剂。
30. 权利要求2的方法，其中所述组合物进一步包含MASP-2抗体。
31. 权利要求2的方法，其中所述组合物进一步包含MASP-1抗体。
32. 权利要求7的方法，其中所述组合物包含MASP-1抗体和MASP-2抗体和MASP-3抗体。
33. 权利要求7的方法，其中所述方法包括共同给予包含MASP-2抗体、MASP-1抗体或MASP-3抗体的至少一种的组合物。
34. 权利要求18的方法，其中所述组合物进一步包含MASP-2抗体。
35. 权利要求22的方法，其中所述组合物进一步包含MASP-1抗体。
36. 权利要求1的方法，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应物功能降低的抗体、嵌合抗体和人源化抗体或人抗体。
37. 权利要求1的方法，其中所述组合物经系统给予。
38. 权利要求37的方法，其中所述组合物经皮下、肌内、静脉内、动脉内给予或作为吸入剂给予。
39. 在患有阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的受试者中增加红细胞存活的方法，包括给予所述受试者包含一定量的MASP-1抑制剂和/或MASP-3抑制剂的至少一种的组合物，所述抑制剂有效增加红细胞存活。
40. 权利要求39的方法，其中所述组合物包含MASP-1抑制剂。
41. 权利要求39的方法，其中所述组合物包含MASP-3抑制剂。
42. 权利要求39的方法，其中所述组合物包含MASP-1抑制剂和MASP-3抑制剂。
43. 权利要求39的方法，进一步包括给予所述受试者包含MASP-2抑制剂的组合物。
44. 权利要求40的方法，其中所述MASP-1抑制剂是MASP-1单克隆抗体。
45. 权利要求41的方法，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-3单克隆抗体。
46. 权利要求43的方法，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2单克隆抗体。
47. 药物组合物，包含至少一种补体途径抑制剂，其中所述至少一种抑制剂包含MASP-2抑制剂、和MASP-3抑制剂和/或MASP-1抑制剂的至少一种、以及药学上可接受的载体。
48. 权利要求47的药物组合物，其中所述至少一种抑制剂包含第一分子和第二分子的组合，所述第一分子是MASP-3抑制剂，所述第二分子是MASP-2抑制剂。
49. 权利要求47的药物组合物，其中所述至少一种抑制剂包含单一分子实体，其包括作为MASP-3抑制剂的活性和作为MASP-2抑制剂的活性。
50. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-3单克隆抗体或其片段。
51. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-2抑制剂是MASP-2抗体或其片段。
52. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂抑制MASP-3-介导的B因子切割。
53. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂抑制D因子成熟。
54. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂是MASP-1抗体或其片段。
55. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂特异性地与MASP-1的一部分结合，其亲和性比其与MASP-3 (SEQ ID NO:8)结合高至少10倍。
56. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂特异性地结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)上。
57. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合。
58. 权利要求57的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-1/MASP-3抑制剂，其结合到CUBI-CCP2结构域内的共有区上。
59. 权利要求57的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-1/MASP-3抑制剂，其结合到CCP2结构域内的共有区上。
60. 权利要求57的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)上并且还结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)上。
61. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂还与MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分结合。
62. 权利要求61的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂是双重MASP-1/MASP-2抑制剂，其结合到MASP-1和MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域内的保守区上。
63. 权利要求61的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa449-694)上并且还结合到MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)或MASP-2的CCP-1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa300-431)的至少一个上。
64. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂特异性地与MASP-3 (SEQ ID NO:8：全长)的一部分结合。
65. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂特异性地与MASP-3的一部分结合，其亲和性比其与MASP-1 (SEQ ID NO:10)结合高至少10倍。
66. 权利要求64的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂特异性地结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)上。
67. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂还与MASP-2 (SEQ ID NO:5)的一部分结合。
68. 权利要求67的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-2/MASP-3抑制剂，其结合到MASP-2和MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域内的保守区上。
69. 权利要求67的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa450-711)上并且还结合到MASP-2的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:5的aa 445-682)或MASP-2的CCP-1-CCP2结构域(SEQ ID NO:5的aa300-431)的至少一个上。
70. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-1、MASP-2和MASP-3的泛抑制剂，并且结合到这3种蛋白的CUB1-EGF-CUB2结构域内的保守区上。
71. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-1、MASP-2和MASP-3的三特异性抑制剂。
72. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-3抗体，和其中所述组合物进一步包含MASP-2抗体。
73. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-3抗体，和其中所述组合物进一步包含MASP-1抗体。
74. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-3抑制剂是MASP-3抗体，和其中所述组合物进一步包含MASP-2抗体。
75. 权利要求47的药物组合物，其中所述组合物包含MASP-1抗体和MASP-2抗体和MASP-3抗体。
76. 权利要求57的药物组合物，其中所述组合物进一步包含MASP-2抗体。
77. 权利要求61的药物组合物，其中所述组合物进一步包含MASP-3抗体。
78. 权利要求67的药物组合物，其中所述组合物进一步包含MASP-1抗体。
79. 权利要求47的药物组合物，其中所述抗体或其片段选自重组抗体、效应物功能降低的抗体、嵌合抗体和人源化抗体或人抗体。
80. 权利要求47的药物组合物，其中所述MASP-1抑制剂抑制D因子成熟。
81. 权利要求47的药物组合物，其中所述组合物配制成用于系统递送。
82. 权利要求81的药物组合物，其中所述组合物配制成用于皮下、肌内、静脉内、动脉内递送或作为吸入剂递送。
83. 药物组合物，包含MASP-3抑制剂和药用载体，所述抑制剂与MASP-1 (SEQ ID NO:10：全长)的一部分结合并且还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合。
84. 权利要求83的组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-1/MASP-3抑制剂。
85. 权利要求83的组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性抗体。
86. 权利要求85的组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性单克隆抗体，其结合到MASP-1的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:10的aa 449-694)上并且还结合到MASP-3的丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:8的aa 450-711)上。
87. 药物组合物，包含MASP-3抑制剂和药用载体，所述抑制剂与MASP-2 (SEQ ID NO: 5：全长)的一部分结合并且还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合。
88. 权利要求87的组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双重MASP-2/MASP-3抑制剂。
89. 权利要求87的组合物，其中所述MASP-3抑制剂是双特异性MASP-2/MASP-3抗体。
90. 药物组合物，包含MASP-3抑制剂和药用载体，所述抑制剂与MASP-1 (SEQ ID NO: 10全长)的一部分结合，与MASP-2 (SEQ ID NO: 5：全长)的一部分结合并且还与MASP-3 (SEQ ID NO:8)的一部分结合。
91. 权利要求90的组合物，其中所述抑制剂是泛-MASP抑制剂。
92. 权利要求90的组合物，其中所述抑制剂是三特异性MASP-1、MASP-2和MASP-3抗体。
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